KR20230156412A - 세포 배양 기재 및 그 제조 방법, 다능성 줄기 세포의 분화 유도 방법, 그리고 세포 배양 키트 - Google Patents

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Abstract

기재와, 그 기재의 표면의 적어도 일부를 피복하는 층두께 5 ∼ 2000 ㎚ 의 친수성 고분자를 함유하는 층을 구비하고, 친수성 고분자는, 포스포릴콜린기 또는 수산기를 포함하고, 하기 (A) 영역 및 하기 (B) 영역을 가지며, (A) 영역과 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이는 1 ∼ 500 ㎚ 인, 세포 배양 기재.
(A) 세포 접착성 및 세포 증식성을 갖는 면적 0.001 ∼ 5 ㎟ 의 섬형의 영역
(B) 상기 (A) 영역에 인접하며, 세포 접착성 또는 세포 증식성을 갖지 않는 영역

Description

세포 배양 기재 및 그 제조 방법, 다능성 줄기 세포의 분화 유도 방법, 그리고 세포 배양 키트
본 발명은, 세포 배양 기재 및 그 제조 방법, 다능성 줄기 세포의 분화 유도 방법, 그리고 세포 배양 키트에 관한 것이다.
배성 줄기 세포 (ES 세포) 나 인공 다능성 줄기 세포 (iPS 세포) 등의 다능성 줄기 세포는, 생체의 다양한 조직으로 분화되는 능력 (분화 만능성) 을 가진 세포로서, 재생 의료 분야나 창약 스크리닝을 위한 세포 소스로서 큰 주목이 모아지고 있다. 다능성 줄기 세포를 재생 의료나 창약 스크리닝에 응용하기 위해서는, 다능성 줄기 세포로부터 목적하는 세포로 분화시킬 필요가 있지만, 그 때, 다능성 줄기 세포의 세포 응집 덩어리를 형성할 필요가 있다. 또한, 다능성 줄기 세포는 다양한 세포로 분화할 수 있지만, 분화 후 세포의 종류에 따라 최적의 세포 응집 덩어리의 사이즈가 달라지는 것이 알려져 있으며, 사이즈를 제어하고, 또한 사이즈가 균일한 세포 응집 덩어리를 제작하는 것이 바람직하다.
세포 응집 덩어리를 형성하는 방법으로서 종래에 다능성 줄기 세포가 접착되지 않은 기재를 사용함으로써 다능성 줄기 세포에 자발적으로 응집체를 형성시키는 방법이 알려져 있다 (예를 들어, 특허문헌 1 참조.). 이 방법은 세포 응집 덩어리의 양산성이 우수하기는 하지만, 균일한 사이즈의 세포 응집 덩어리를 얻을 수 없다는 문제가 있었다.
사이즈가 균일한 세포 응집 덩어리를 형성하는 방법으로서 표면에 미세한 요철을 형성한 세포 배양 기재를 사용하는 방법이 알려져 있다 (예를 들어, 특허문헌 2 참조.).
일본 공개특허공보 평8-140673호 일본 공개특허공보 2015-073520호
특허문헌 2 에 개시된 바와 같은 미세한 요철을 형성한 세포 배양 기재는 양산성이 부족하며, 대량의 세포 응집 덩어리를 형성하는 용도에는 적합하지 않다는 문제가 있었다. 또한, 미세한 요철 내에서 세포를 강제적으로 응집시키므로, 사 (死) 세포가 세포 응집 덩어리 안에 혼입되기 쉽다는 문제가 있었다. 또한, 미세 요철을 갖는 세포 배양 기재에 배지를 접촉시켰을 때에, 표면의 미세 요철에 기포가 들어가기 쉬워, 배양을 개시하기 전에 기포의 제거 작업이 필요하다는 과제가 있음을 본 발명자들은 알아내었다. 기포를 제거하기 위해서는 통상적으로 피페터를 사용하여 배지의 흡인과 토출을 반복할 필요가 있어, 작업성이 열등하다는 문제가 있었다.
본 발명의 과제는, 세포 응집 덩어리를 형성할 수 있음과 함께, 세포 응집 덩어리 안의 세포의 생존률을 높게 할 수 있고, 배양 시의 기포 제거 작업을 필요 없게 하는 세포 배양 기재 및 그 제조 방법을 제공하는 것에 있다. 본 발명의 다른 과제는, 3 배엽 세포로의 분화 유도 효율이 우수한, 그 세포 배양 기재를 사용한 다능성 줄기 세포의 분화 유도 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명은, 기재와, 그 기재의 표면의 적어도 일부를 피복하는 층두께 5 ∼ 2000 ㎚ 의 친수성 고분자를 함유하는 층을 구비하고, 상기 친수성 고분자는, 포스포릴콜린기 또는 수산기를 포함하고, 하기 (A) 영역 및 하기 (B) 영역을 가지며, (A) 영역과 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이는 1 ∼ 500 ㎚ 인, 세포 배양 기재에 관한 것이다.
(A) 세포 접착성 및 세포 증식성을 갖는 면적 0.001 ∼ 5 ㎟ 의 섬형의 영역
(B) (A) 영역에 인접하며, 세포 접착성 또는 세포 증식성을 갖지 않는 영역
또한 본 발명은, (1) 기재의 표면의 적어도 일부를 UV 반응성의 친수성 고분자를 함유하는 조성물로 피복하고, 친수성 고분자를 함유하는 층을 형성하는 공정, (2) 친수성 고분자를 함유하는 층에 UV 조사를 실시하고, 친수성 고분자를 함유하는 층을 기재의 표면에 고정화시키는 공정, 및 (3) 고정화된 친수성 고분자를 함유하는 층의 표면의 일부에 플라즈마 처리를 실시하고, 플라즈마 처리를 실시한 부분에 (A) 영역을 형성하는 공정을 구비하는, 상기 세포 배양 기재의 제조 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은, (1') 반복 단위에 방향족 탄화수소기를 포함하는 고분자로 형성되는 기재를 사용하며, 상기 기재의 표면에 플라즈마 처리를 실시하고, 플라즈마 처리를 실시한 부분에 상기 (A) 영역을 형성하는 공정, (2') 상기 기재의 표면의 적어도 일부를 UV 반응성의 친수성 고분자를 함유하는 조성물로 피복하고, 상기 친수성 고분자를 함유하는 층을 형성하는 공정, (3') 상기 친수성 고분자를 함유하는 층의 일부에 UV 조사를 실시하고, 상기 친수성 고분자를 함유하는 층의 일부를 상기 기재의 표면에 고정화시키는 공정, 및 (4') 상기 친수성 고분자를 용매로 세정하고, 표면에 고정화되어 있지 않은 친수성 고분자를 용해시켜 상기 기재의 표면으로부터 제거하는 공정을 구비하는, 상기 세포 배양 기재의 제조 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은, (i) 상기 세포 배양 기재에 다능성 줄기 세포를 파종하는 공정, (ii) 다능성 줄기 세포를 배양하여, 높이/직경의 비가 0.2 ∼ 0.8 인 반구형의 세포 응집 덩어리를 형성하는 공정, 및 (iii) 세포 응집 덩어리를 분화 유도하여, 3 배엽 세포의 세포 응집 덩어리를 형성하는 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포의 분화 유도 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 상기 세포 배양 기재와, 수불용성 블록 세그먼트 및 온도 응답성 블록 세그먼트를 포함하는 블록 공중합체 또는 상기 블록 공중합체를 함유하는 코팅제를 포함하는, 세포 배양 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 세포 응집 덩어리를 형성할 수 있음과 함께, 세포 응집 덩어리 안의 세포의 생존률을 높게 할 수 있고, 배양 시의 기포 제거 작업을 필요 없게 하는 세포 배양 기재 및 그 제조 방법을 제공할 수 있다. 또한 본 발명에 따르면, 그 세포 배양 기재를 사용한 다능성 줄기 세포의 분화 유도 방법을 제공할 수 있다.
도 1 은, 일 실시형태에 관련된 세포 배양 기재의 모식도 (단면도) 이다.
도 2 는, 일 실시형태에 관련된 제조 방법에 있어서의 공정 (1) 후의 표면에 친수성 고분자를 함유하는 층이 형성된 기재의 모식도 (사시도) 이다.
도 3 은, 일 실시형태에 관련된 제조 방법에 있어서의 공정 (3) 후의 세포 배양 기재의 모식도 (사시도) 이다.
도 4 는, 일 실시형태에 관련된 제조 방법에 있어서의 공정 (4) 후의 세포 배양 기재의 모식도 (사시도) 이다.
도 5 는, 인간 iPS 세포의 장 상피 세포로의 분화 유도 시험 (실시예 8) 에 있어서의 "분화 0 일째", "분화 43 일째" 및 "분화 64 일째" 의 세포의 위상차 현미경 화상이다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태에 대해서 상세하게 설명한다. 또, 본 발명은, 이하의 실시형태에 한정되는 것이 아니라, 상기 서술한 효과가 얻어지는 범위 내에서 이하의 실시형태를 변형하여 실시할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「세포 응집 덩어리」란, 복수의 세포가 모여서 형성되는 세포의 3 차원 응집 덩어리를 의미한다. 3 차원 응집 덩어리의 형상은, 구형 등의 타원체의 형상이어도 되고, 반구형 등의 형상이어도 된다. 이들 형상은, 시트형의 세포가 절첩됨으로써 형성되는 간극이 있는 형상이어도 되고, 중공 (中空) 의 형상이어도 된다.
본 명세서에 있어서, 「온도 응답성」이란, 온도 변화에 따라 친수성/소수성의 정도가 변화하는 것을 나타낸다. 또한, 친수성/소수성의 정도가 변화하는 경계 온도를 「응답 온도」로 표기한다.
본 명세서에 있어서, 「생체 유래 물질」이란, 생물의 체내에 존재하는 물질, 및 당해 물질과 동등한 물질로서, 화학적으로 합성된 물질을 의미한다. 생물의 체내에 존재하는 물질은, 천연물이어도 되고, 유전자 재조합 기술 등으로 인공적으로 합성한 것이어도 된다. 생체 유래 물질에 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 생체를 구성하는 기본 재료인 핵산, 단백질 및 다당, 및 이것들의 구성 요소인 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 아미노산, 및 각종의 당, 그리고 지질, 비타민 및 호르몬을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「세포 접착성」이란, 배양 온도에 있어서 기재 또는 세포 배양 기재에 접착되기 쉬운 것을 나타내고, 「세포 접착성을 갖는다」함은, 세포가 배양 온도에 있어서 기재 또는 세포 배양 기재에 직접 또는 생체 유래 물질을 개재하며 접착될 수 있는 것을 나타낸다. 또한, 「세포 접착성을 갖지 않는다」함은, 배양 온도에 있어서 세포가 기재 또는 세포 배양 기재에 접착될 수 없는 것을 나타낸다.
본 명세서에 있어서, 「세포 증식성」이란, 배양 온도에 있어서 세포가 증식하기 쉬운 것을 나타내고, 「세포 증식성을 갖는다」함, 배양 온도에 있어서 세포가 증식할 수 있는 것을 나타낸다. 또한, 「세포 증식성을 갖지 않는다」함은, 배양 온도에 있어서 세포가 증식할 수 없는 것을 나타낸다. 「세포 증식성이 높다」함은, 동일한 배양 기간에서 비교했을 때에 더 많은 세포로 증식하는 것을 나타낸다.
본 명세서에 있어서, 「3 배엽 세포」란, 내배엽 세포, 외배엽 세포 및 중배엽 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 의미한다.
본 실시형태에 관련된 세포 배양 기재는, 기재와, 기재의 표면의 적어도 일부를 피복하는 층두께 5 ∼ 2000 ㎚ 의 친수성 고분자를 함유하는 층을 구비한다. 여기서, 친수성 고분자는, 포스포릴콜린기 또는 수산기를 포함한다. 또한, 본 실시형태에 관련된 세포 배양 기재는, 하기 (A) 영역 및 하기 (B) 영역을 가지며, 또한 (A) 영역과 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이가 1 ∼ 500 ㎚ 이다.
(A) 세포 접착성 및 세포 증식성을 갖는 면적 0.001 ∼ 5 ㎟ 의 섬형의 영역
(B) (A) 영역에 인접하며, 세포 증식성을 갖지 않는 영역
도 1 은, 일 실시형태에 관련된 세포 배양 기재의 모식도 (단면도) 이다. 도 1 에 나타내는 세포 배양 기재 (10) 는, 기재 (1) 와, 기재 (1) 의 표면을 피복하는 친수성 고분자를 함유하는 층 (2) (층두께는, 예를 들어 5 ∼ 2000 ㎚ 이다.) 을 구비한다. 도 1 중, A 및 B 는, 각각 (A) 영역 및 (B) 영역을 나타낸다. 또한, 도 1 중, H 는 (A) 영역과 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이를 나타낸다. 또, 친수성 고분자를 함유하는 층 (2) 의 층두께란, 기재 (1) 와 친수성 고분자를 함유하는 층 (2) 이 접하는 면에서부터 (B) 영역 (도 1 중, B 로 나타내는 영역) 의 면까지의 거리를 의미한다. 또한, 도 1 에 나타내는 세포 배양 기재 (10) 는, (A) 영역의 표면이 친수성 고분자를 함유하는 층으로 되어 있지만, 이것에 한정되는 것이 아니라, 예를 들어, (A) 영역의 표면이 기재 (1) 로 되어 있어도 된다.
본 실시형태에 관련된 세포 배양 기재에 사용되는 기재로서는, 특별히 한정은 없지만, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리카보네이트, 시클로올레핀폴리머, 셀룰로오스아세테이트, 니트로셀룰로오스 및 폴리불화비닐리덴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종류로 형성되는 것인 것이 바람직하고, 폴리스티렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리카보네이트 및 시클로올레핀폴리머로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종류로 형성되는 것인 것이 보다 바람직하고, 폴리스티렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트 및 폴리카보네이트에서 선택되는 적어도 1 종류로 형성되는 것인 것이 더욱 바람직하고, 폴리스티렌 또는 폴리카보네이트로 형성되는 것인 것이 가장 바람직하다. 시클로올레핀폴리머의 시판품으로는, ZEONEX (닛폰 제온 (주) 제조), ZEONOR (닛폰 제온 (주) 제조), ARTON (JSR (주) 제조) 을 들 수 있다.
세포 배양 기재 위에서 배양한 세포를 고배율의 위상차 현미경으로 관찰하는 데에 적합하므로, D 선 (파장 589 ㎚) 으로 측정한 기재의 굴절률은 1.4 ∼ 1.6 이 바람직하고, 1.45 ∼ 1.6 이 더욱 바람직하고, 1.5 ∼ 1.55 가 특히 바람직하다. 기재의 굴절률이 이들 범위에 있음으로써 세포의 위상차 현미경 관찰에 있어서의 구면 수차를 작게 할 수 있으며, 명료한 위상차 이미지를 얻을 수 있다. 또한, 구면 수차를 작게 하기 위해, 기재의 두께는 0.5 ㎜ 이하가 바람직하고, 0.4 ㎜ 이하가 더욱 바람직하고, 0.3 ㎜ 이하가 특히 바람직하고, 0.2 ㎜ 이하가 가장 바람직하다. 한편, 현미경 관찰 시에 기재가 휨으로써 관찰 범위 전체에 핀트가 맞지 않게 되는 것을 억제하는 데에 적합하므로, 기재의 두께는 0.01 ㎜ 이상이 바람직하고, 0.05 ㎜ 이상이 더욱 바람직하고, 0.1 ㎜ 이상이 특히 바람직하고, 0.15 ㎜ 이상이 가장 바람직하다.
D 선 (파장 589 ㎚) 으로 측정한 기재의 굴절률 및 두께는, 각각 1.4 ∼ 1.6및 0.01 ㎜ 이상 0.5 ㎜ 이하인 것이 바람직하고, 각각 1.45 ∼ 1.6 및 0.05 ㎜ 이상 0.4 ㎜ 이하인 것이 보다 바람직하고, 각각 1.45 ∼ 1.55 및 0.1 ㎜ 이상 0.3 ㎜ 이하인 것이 더욱 바람직하고, 1.5 ∼ 1.55 및 0.15 ㎜ 이상 0.2 ㎜ 이하인 것이 특히 바람직하다. 기재의 굴절률 및 두께가 이들의 범위에 있으면, 세포의 위상차 이미지가 보다 명료해진다.
세포 배양 기재 위에서 배양한 세포를 고배율의 형광 현미경으로 관찰하는 데에 적합하므로, 여기 파장 350 ㎚, 488 ㎚ 및 647 ㎚ 에 있어서의 (이들의 파장을 갖는 여기 광을 각각 조사한 경우의) 기재의 형광 강도 (자가 형광 강도) 가, 동일한 여기 파장을 갖는 광에 의해 여기된 두께 1.2 ㎜ 의 폴리스티렌 판의 형광 강도 (자가 형광 강도) 보다 작은 것인 것이 바람직하고, 두께 1.2 ㎜ 의 폴리스티렌 판의 형광 강도의 80 ％ 이하가 더욱 바람직하고, 두께 1.2 ㎜ 의 폴리스티렌 판의 형광 강도의 50 ％ 이하가 특히 바람직하고, 두께 1.2 ㎜ 의 폴리스티렌 판의 형광 강도의 10 ％ 이하가 가장 바람직하다. 여기 파장 350 ㎚, 488 ㎚ 및 647 ㎚ 에서 여기되는 형광 색소는 세포의 형광 관찰에 있어서 자주 사용된다. 이들 파장에 있어서의 기재의 자가 형광 강도가 일정값 이하임으로써, 세포의 명료한 형광 이미지를 얻을 수 있다.
기재의 형상으로는, 특별히 제한은 없으며, 판, 필름과 같은 평면 형상이어도 되고, 파이버, 다공질 입자, 다공질 막, 중공사의 형상이어도 된다. 또한, 기재의 형상은, 일반적으로 세포 배양 등에 사용되는 용기 (페트리 접시 등의 세포 배양 접시, 플라스크, 플레이트, 백 등) 의 형상이어도 된다. 배양 조작의 용이성 면에서, 기재의 형상은, 판, 필름과 같은 평면 형상, 또는 평막의 다공질 막의 형상인 것이 바람직하다.
친수성 고분자를 함유하는 층의 층두께는 5 ∼ 2000 ㎚ 이다. 친수성 고분자에 의한 층의 층두께가 5 ∼ 2000 ㎚ 임으로써, (A) 영역에만 세포를 접착 및 증식시킬 수 있고, 또한, 세포의 유주 (遊走) 에 의해 (A) 영역에 세포를 모으기 쉬워, 세포 응집 덩어리의 세포 생존률을 높일 수 있다. 층두께가 5 ㎚ 미만인 경우, (B) 영역에도 세포가 증식하기 때문에, 세포 응집 덩어리를 형성할 수 없다. 층두께가 2000 ㎚ 를 초과하는 경우, 세포가 유주할 수 없기 때문에, 세포 응집 덩어리에 포함되는 세포의 생존률이 저하된다. 여기서, 친수성 고분자에 의한 층의 「층두께」란, 기재와 친수성 고분자에 의한 층의 계면에서부터 친수성 고분자에 의한 층의 기재와는 반대측인 계면 ((A) 영역을 제외한다.) 까지의 면외 방향의 길이를 나타낸다. 층두께가 10 ㎚ 를 초과하는 범위에서는 마이크로톰에 의해 제작된 세포 배양 기재의 초박절편을 사용하여 단면 이미지를 투과형 전자 현미경에 의해 측정하고, 무작위로 선택한 10 지점의 그 거리를 측정하고, 평균냄으로써 산출할 수 있다. 또한, 층두께가 10 ㎚ 이하인 범위에서는 엘립소미터를 사용하여 측정할 수 있다. (B) 영역에 세포가 접착되는 것을 억제하는 데에 적합하기 때문에, 층두께가 10 ㎚ 이상인 것이 보다 바람직하고, 50 ㎚ 이상인 것이 더욱 바람직하고, 100 ㎚ 이상인 것이 가장 바람직하다. 또한, 세포의 유주에 의해 (A) 영역에 세포를 모음으로써 세포 응집 덩어리의 세포 생존률을 높이는 데에 적합하므로, 층두께가 1000 ㎚ 이하인 것이 보다 바람직하고, 500 ㎚ 이하인 것이 더욱 바람직하고, 200 ㎚ 이하인 것이 가장 바람직하다.
친수성 고분자는, 포스포릴콜린기 또는 수산기를 포함한다. 친수성 고분자가 포스포릴콜린기 또는 수산기를 포함함으로써, 친수성 고분자가 피복된 영역을 세포가 접착되지 않는 영역으로 하는 것이 가능하다. 또한, 이와 같은 친수성 고분자는 완전히 분해 제거될 필요가 없으므로, 단시간의 약한 플라즈마 처리를 실시하는 것만으로 그 영역을 세포 접착성 및 세포 증식성을 갖는 영역으로 할 수 있고, 세포에 친수성 고분자의 분해물이 혼입되기 어렵다. 포스포릴콜린기 또는 수산기를 포함하는 것 이외에, 친수성 고분자의 종류에 특별히 한정은 없지만, 시판품으로는 예를 들어, Lipidure(R) CM5206 (니치유 (주) 제조), Lipidure(R) CM2001 (니치유 (주) 제조), BIOSURFINE(R)-AWP (토요 고세이 공업 (주) 제조) 등을 들 수 있다. 또한, 친수성 고분자가 피복이 완료된 시판품의 기재로서는, PrimeSurface(R) (스미토모 베이크라이트 (주) 제조), EZ-BindShut(R) (AGC 테크노 글래스 (주) 제조), EZ-BindShutII(R) (AGC 테크노 글래스 (주) 제조) 등을 적합하게 사용할 수 있다.
친수성 고분자는 하기 일반식 (1) 로 나타내는 화합물, 하기 일반식 (2) 로 나타내는 화합물, 또는 하기 일반식 (3) 으로 나타내는 화합물을 포함하는 것이 바람직하다.
[화학식 1]
[일반식 (1) 중, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸기를 나타내고, R3 은 수소 원자 또는 임의의 유기기를 나타내고, m 및 n 은 각각 독립적으로 양의 정수를 나타낸다.]
[화학식 2]
[일반식 (2) 중, R4, R5 및 R6 은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸기를 나타내고, R7 은 수소 원자 또는 임의의 유기기를 나타내고, x, y 및 z 는 각각 독립적으로 양의 정수를 나타낸다.]
[화학식 3]
[일반식 (3) 중, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸기를 나타내고, R10 은 수소 원자 또는 임의의 유기기를 나타내고, a 및 b 는 각각 독립적으로 양의 정수를 나타낸다.]
친수성 고분자가 상기 일반식 (1) 로 나타내는 화합물, 상기 일반식 (2) 로 나타내는 화합물, 또는 상기 일반식 (3) 으로 나타내는 화합물을 포함함으로써, 세포를 접착 및 증식시키기 쉬워져, (A) 영역에 있어서 균일한 형상의 세포 응집 덩어리를 형성시키는 데에 적합하다. 상기 일반식 (1), 상기 일반식 (2), 또는 상기 일반식 (3) 에 있어서, R3, R7 및 R10 은, 친수성 고분자를 기재에 고정화시키는 데에 적합하므로, 각각 소수성기 또는 UV 반응성의 관능기인 것이 바람직하다. 소수성기로서는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기, 시클로헥실기 등의 직사슬 또는 고리형 알킬기 등을 적합하게 사용할 수 있다. 또한, UV 반응성의 관능기로서는, 아지드기, 아크릴레이트기, 메타크릴레이트기, 에폭시기 등을 들 수 있고, 아지드기를 적합하게 사용할 수 있다.
(A) 영역은, 세포 접착성 및 세포 증식성을 갖는 면적 0.001 ∼ 5 ㎟ 의 섬형의 영역이다. 면적 0.001 ∼ 5 ㎟ 의 섬형의 영역임으로써, 세포를 배양했을 때에, 균일 입경의 세포 응집 덩어리를 형성할 수 있다. 또한, 다능성 줄기 세포의 분화 유도 등의 용도에 적합한 세포 응집 덩어리를 형성하는 데에 적합하므로, 면적 0.005 ∼ 1 ㎟ 가 바람직하고, 면적 0.01 ∼ 0.5 ㎟ 가 보다 바람직하고, 면적 0.015 ∼ 0.25 ㎟ 가 더욱 바람직하고, 면적 0.02 ∼ 0.2 ㎟ 가 가장 바람직하다.
(A) 영역이 섬형의 영역인 것은, (A) 영역이 (A) 영역 이외의 영역으로부터 독립된 상태로 존재하고 있는 것을 나타낸다. (A) 영역이 세포 접착성 및 세포 증식성을 갖는 섬형임으로써, (A) 영역에 생세포가 집중되어 존재하게 되기 때문에, 세포 응집 덩어리를 제조할 수 있다. (A) 영역이 섬형이 아닌 경우, 예를 들어, 스트라이프 구조 등인 경우, 세포 응집 덩어리를 제조할 수 없다. 섬형의 형상으로는 특별히 한정은 없고, 목적으로 하는 세포 응집 덩어리의 형상에 따라 적절히 설정할 수 있지만, 예를 들어, 원, 타원, 다각형, 또는 직선 및 곡선으로 형성되는 폐쇄된 형상 등을 들 수 있다. 또한, 구에 가까운 형상의 세포 응집 덩어리를 제조하는 데에 적합하므로, 섬형의 형상으로서 원, 타원 또는 다각형이 바람직하고, 원, 타원 또는 장방형이 보다 바람직하고, 원, 타원 또는 정방형이 더욱 바람직하고, 원 또는 타원이 가장 바람직하다.
균일한 사이즈 및 형상의 세포 응집 덩어리를 제조하는 데에 적합하므로, (A) 영역의 면적의 표준 편차/평균 면적이 80 ％ 이하인 것이 바람직하고, 50 ％ 이하인 것이 보다 바람직하고, 20 ％ 이하인 것이 더욱 바람직하고, 5 ％ 이하인 것이 가장 바람직하다.
구에 가까운 형상의 세포 응집 덩어리를 제조하는 데에 적합하므로, 섬형의 형상의 애스펙트비로서는 5 이하가 바람직하고, 2 이하가 보다 바람직하고, 1.5 이하가 더욱 바람직하고, 1.1 이하가 가장 바람직하다. 여기서, 「애스펙트비」란, 형상의 최대 직경 (장경) 과 최소 직경 (단경) 의 비인 장경/단경을 나타낸다.
또한, 다능성 줄기 세포를 배양하여 내배엽 세포 또는 외배엽 세포로 분화 유도하는 데에 적합한 세포 응집 덩어리의 형성에 적합하기 위해서, (A) 영역의 면적이 0.005 ∼ 0.2 ㎟ 이고, 또한 (A) 영역의 수가, (A) 영역 및 (B) 영역의 합계 면적을 기준으로 하여 200 ∼ 1000 개/㎠ 인 것이 바람직하고, (A) 영역의 면적이 0.01 ∼ 0.15 ㎟ 이고, 또한 (A) 영역의 수가, (A) 영역 및 (B) 영역의 합계 면적을 기준으로 하여 250 ∼ 800 개/㎠ 인 것이 보다 바람직하고, (A) 영역의 면적이 0.02 ∼ 0.1 ㎟ 이고, 또한 (A) 영역의 수가, (A) 영역 및 (B) 영역의 합계 면적을 기준으로 하여 300 ∼ 600 개/㎠ 인 것이 더욱 바람직하고, (A) 영역의 면적이 0.03 ∼ 0.05 ㎟ 이고, 또한 (A) 영역의 수가, (A) 영역 및 (B) 영역의 합계 면적을 기준으로 하여 300 ∼ 400 개/㎠ 인 것이 가장 바람직하다.
다능성 줄기 세포를 배양하여 중배엽 세포로 분화 유도하는 데에 적합한 세포 응집 덩어리의 형성에 적합하기 위해서, (A) 영역의 면적이, 0.2 ∼ 2 ㎟ 이고, 또한 (A) 영역의 수가, (A) 영역 및 (B) 영역의 합계 면적을 기준으로 하여 3 ∼ 15 개/㎠ 인 것이 바람직하고, (A) 영역의 면적이 0.3 ∼ 1.5 ㎟ 이고, 또한 (A) 영역의 수가, (A) 영역 및 (B) 영역의 합계 면적을 기준으로 하여 4 ∼ 12 개/㎠ 인 것이 보다 바람직하고, (A) 영역의 면적이 0.4 ∼ 1 ㎟ 이고, 또한 (A) 영역의 수가, (A) 영역 및 (B) 영역의 합계 면적을 기준으로 하여 5 ∼ 10 개/㎠ 인 것이 더욱 바람직하고, (A) 영역의 면적이 0.5 ∼ 0.7 ㎟ 이고, 또한 (A) 영역의 수가, (A) 영역 및 (B) 영역의 합계 면적을 기준으로 하여 6 ∼ 8 개/㎠ 인 것이 가장 바람직하다.
또한, 세포 주위의 산소 농도를 높이고, 세포 응집 덩어리의 생존률을 높이는 데에 적합하므로, (A) 영역끼리의 최소 거리가, 500 ∼ 10000 ㎛ 인 것이 바람직하고, 1000 ∼ 8000 ㎛ 인 것이 보다 바람직하고, 2000 ∼ 5000 ㎛ 인 것이 더욱 바람직하고, 3000 ∼ 4000 ㎛ 인 것이 가장 바람직하다.
(A) 영역은, 예를 들어, 기재 표면에 친수성 고분자를 함유하는 층을 형성한 후, 친수성 고분자를 함유하는 층의 표면의 일부를 코로나 처리, UV 처리 또는 플라즈마 처리에 의해 개질함으로써 형성할 수 있다. 당해 개질은, 플라즈마 처리에 의해 실시하는 것이 바람직하다. (A) 영역이, 친수성 고분자를 함유하는 층의 표면이 플라즈마 처리 등에 의해 개질된 영역임으로써, (A) 영역은, 세포 접착성 및 세포 증식성을 갖는 영역이 된다. 단시간의 플라즈마 처리 등으로 (A) 영역을 패터닝할 수 있기 때문에, 세포 배양 기재의 양산성을 높일 수 있다.
또한, (A) 영역에 대한 XPS (X 선 광전자 분광법) 를 측정했을 때의, C1s 스펙트럼에 있어서의 287 eV 의 피크 강도/285 eV 의 피크 강도의 비가, (B) 영역에 대한 XPS 측정의 C1s 스펙트럼에 있어서의 287 eV 의 피크 강도/285 eV 의 피크 강도의 비보다 0.05 이상 큰 것인 것이 바람직하다. 이 경우, (A) 영역과 (B) 영역의 세포 증식성의 차이를 크게 할 수 있기 때문에, (A) 영역에서 많은 세포를 증식시킬 수 있고, (A) 영역에 있어서 균일한 세포 응집 덩어리를 형성하기 쉬워진다. 균일한 세포 응집 덩어리를 형성하는 데에 더 적합하므로, (A) 영역에 대한 XPS 측정의 C1s 스펙트럼에 있어서의 287 eV 의 피크 강도/285 eV 의 피크 강도의 비가, (B) 영역에 대한 XPS 측정의 C1s 스펙트럼에 있어서의 287 eV 의 피크 강도/285 eV 의 피크 강도의 비보다 0.07 이상 큰 것이 보다 바람직하고, 0.1 이상 큰 것이 더욱 바람직하고, 0.15 이상 큰 것이 가장 바람직하다.
XPS 측정의 C1s 스펙트럼에 있어서의 287 eV 의 피크 강도/285 eV 의 피크 강도의 비를 상기 서술한 범위로 조정하는 방법으로는, 특별히 한정은 없지만, 기재 표면에 형성된 친수성 고분자를 함유하는 층의 일부 ((A) 영역이 될 예정의 부분) 에만 플라즈마 처리, 코로나 처리, UV 처리 등을 실시하는 방법이 바람직하고, 플라즈마 처리 또는 코로나 처리를 실시하는 방법이 더욱 바람직하고, 플라즈마 처리를 실시하는 방법이 특히 바람직하다. (A) 영역이 될 예정의 부분에만 플라즈마 처리 등을 실시하는 방법으로는, 레이저 가공으로 제작한 마스크로 기재 표면에 형성된 친수성 고분자를 함유하는 층을 피복하고, 마스크 위에서부터 플라즈마 처리 등을 실시하는 방법을 들 수 있다. (A) 영역에 대한 XPS 측정의 C1s 스펙트럼에 있어서의 287 eV 의 피크 강도/285 eV 의 피크 강도의 비와, (B) 영역에 대한 XPS 측정의 C1s 스펙트럼에 있어서의 287 eV 의 피크 강도/285 eV 의 피크 강도의 비의 차이가 상기 서술한 범위에 포함되도록, 플라즈마 강도, 플라즈마 조사 시간 등의 조건을 적절히 조정하는 것이 가능하지만, 플라즈마 처리의 경우, 도입 가스로서 산소 및 질소를 함유하는 기체를 사용함으로써, 상기 서술한 범위에 포함되기 쉬워진다.
(A) 영역은, 배양된 세포 응집 덩어리를 박리하기 위해서 적합하므로, 온도 응답성을 가지고 있어도 된다. (A) 영역이 온도 응답성을 갖는 경우, 세포 배양 기재 위에서 세포를 배양할 때에, 체온에 가까운 온도에서 세포를 배양할 수 있으므로, 응답 온도 50 ℃ 이하가 바람직하고, 35 ℃ 이하가 보다 바람직하다. 또한, 배양 중에 배지 교환 등의 작업을 실시할 때에 세포가 박리되어 버리는 것을 억제하는 데에 적합하므로, 응답 온도는, 25 ℃ 이하가 특히 바람직하다. 또한, 세포에 대미지를 주지 않는 온도에서의 냉각 조작에 의해 세포 응집 덩어리를 형성하는 것이 가능하므로, 응답 온도는, 4 ℃ 이상이 바람직하고, 10 ℃ 이상이 보다 바람직하고, 15 ℃ 이상이 더욱 바람직하다.
(A) 영역이 온도 응답성을 갖는 경우, 예를 들어, 친수성 고분자를 함유하는 층의 표면 ((A) 영역 및 (B) 영역을 포함하는 표면) 에, 층두께 1 ∼ 100 ㎚ 의 온도 응답성 고분자를 함유하는 층을 추가로 구비하고 있어도 된다. 층두께 1 ∼ 100 ㎚ 의 온도 응답성 고분자를 함유하는 층을 가짐으로써, 친수성 고분자를 함유하는 층의 표면에 형성된 (A) 영역 및 (B) 영역의 각각의 특성을 저해하지 않고, (A) 영역에 온도 응답성을 부여할 수 있다. (A) 영역 및 (B) 영역 각각의 특성을 저해하지 않고, (A) 영역에 온도 응답성을 부여하는 데에 적합하기 때문에, 온도 응답성 고분자를 함유하는 층의 층두께는, 3 ∼ 50 ㎚ 인 것이 보다 바람직하고, 5 ∼ 40 ㎚ 인 것이 더욱 바람직하고, 10 ∼ 35 ㎚ 인 것이 가장 바람직하다. 세포 증식성을 저해하지 않고, 또한 배양 후에 세포를 온도 응답성에 의해 박리하여 회수할 수 있는 적합한 온도 응답성 고분자의 층두께는, 배양하는 세포에 따라서도 변화하고, 위에서 예시한 층두께의 범위에서 적절히 조정하는 것이 가능하다.
온도 응답성 고분자는, 수불용성 블록 세그먼트 및 온도 응답성 블록 세그먼트를 갖는 블록 공중합체인 것이 바람직하다. 온도 응답성 고분자가 이와 같은 블록 공중합체임으로써, 세포 배양 기재의 양산성을 높임과 함께, 제조되는 세포 응집 덩어리에 대한 온도 응답성 고분자의 혼입을 억제할 수 있다. 온도 응답성 고분자에 포함되는 온도 응답성 블록 세그먼트의 구성 단위 비율은, 세포 배양 기재로부터 세포 응집 덩어리를 신속하게 박리하는 데에 적합하므로, 70 wt％ 이상이 바람직하고, 80 wt％ 이상이 더욱 바람직하고, 90 wt％ 이상이 특히 바람직하고, 92 wt％ 이상이 가장 바람직하다.
또한, 온도 응답성 고분자가 수불용성 블록 세그먼트 및 온도 응답성 블록 세그먼트를 갖는 블록 공중합체임으로써, 세포 배양 기재의 표면에 온도 응답성 고분자를 함유하는 용액을 적하하고 건조시킨다는 간편한 수법으로 세포 배양 기재의 표면에 온도 응답성을 부여할 수 있다. 또한, 이 때 형성된 층이 전술한 바람직한 온도 응답성 고분자의 층두께임으로써, 친수성 고분자를 함유하는 층의 표면 전체에 온도 응답성 고분자를 피복해도, 상기 (A) 영역 및 (B) 영역의 각각의 특성을 저해하는 것이 더 적어진다. 본 발명의 세포 배양 기재와, 블록 공중합체인 온도 응답성 고분자 또는 상기 블록 공중합체를 함유하는 코팅제를 갖는 세포 배양 키트를 사용하는 경우에는, 배양을 실시하는 연구자가 세포의 종류에 따라, 간편하게 온도 응답성 고분자의 층두께를 조정할 수 있다.
코팅제는, 용매를 함유하고 있어도 된다. 코팅제에 함유될 수 있는 용매로서는, 예를 들어, 물, 유기 용매 또는 이것들의 혼합액을 들 수 있다. 유기 용매로서는, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 1-부탄올 등의 알코올류 ; 아세토니트릴, 포름아미드, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 테트라하이드로푸란, 1,4-디옥산, 메틸에틸케톤 등을 들 수 있다. 코팅의 막두께를 균일하게 하는 데에 적합하므로, 물과 알코올류의 혼합 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 코팅제의 전체 질량을 기준으로 한, 수불용성 블록 세그먼트 및 온도 응답성 블록 세그먼트를 갖는 블록 공중합체의 함유량은, 0.1 ∼ 50 중량％, 0.2 ∼ 10 중량％, 또는 0.5 ∼ 5 중량％ 로 할 수 있다.
코팅제는, 수불용성 블록 세그먼트 및 온도 응답성 블록 세그먼트를 갖는 블록 공중합체 및 용매 이외의, 그 밖의 성분을 함유하고 있어도 된다. 그 밖의 성분으로는, 세포 접착성을 높이기 위한 성분을 들 수 있고, 예를 들어, 수불용성 블록 세그먼트만으로 이루어지는 고분자를 들 수 있다.
온도 응답성 블록 세그먼트를 구성하는 단량체 단위로서는 예를 들어, 아크릴아미드, 메타크릴아미드 등의 (메트)아크릴아미드 화합물 ; N,N-디에틸아크릴아미드, N-에틸아크릴아미드, N-n-프로필아크릴아미드, N-n-프로필메타크릴아미드, N-이소프로필아크릴아미드, N-이소프로필메타크릴아미드, N-시클로프로필아크릴아미드, N-시클로프로필메타크릴아미드, N-t-부틸아크릴아미드, N-에톡시에틸아크릴아미드, N-에톡시에틸메타크릴아미드, N-테트라하이드로푸르푸릴아크릴아미드, N-테트라하이드로푸르푸릴메타크릴아미드 등의 N-알킬 치환 (메트)아크릴아미드 유도체 ; N,N-디메틸(메트)아크릴아미드, N,N-에틸메틸아크릴아미드, N,N-디에틸아크릴아미드 등의 N,N-디알킬 치환 (메트)아크릴아미드 유도체 ; 1-(1-옥소-2-프로페닐)-피롤리딘, 1-(1-옥소-2-프로페닐)-피페리딘, 4-(1-옥소-2-프로페닐)-모르폴린, 1-(1-옥소-2-메틸-2-프로페닐)-피롤리딘, 1-(1-옥소-2-메틸-2-프로페닐)-피페리딘, 4-(1-옥소-2-메틸-2-프로페닐)-모르폴린 등의 고리형 기를 갖는 (메트)아크릴아미드 유도체 ; 메틸비닐에테르 등의 비닐에테르 ; N-프롤린메틸에스테르아크릴아미드 등의 프롤린 유도체를 들 수 있고, 응답 온도를 0 ∼ 50 ℃ 로 하는 데에 적합하므로, N,N-디에틸아크릴아미드, N-n-프로필아크릴아미드, N-이소프로필아크릴아미드, N-n-프로필메타크릴아미드, N-에톡시에틸아크릴아미드, N-테트라하이드로푸르푸릴아크릴아미드, N-테트라하이드로푸르푸릴메타크릴아미드가 바람직하고, N-n-프로필아크릴아미드, N-이소프로필아크릴아미드가 더욱 바람직하고, N-이소프로필아크릴아미드가 특히 바람직하다. 또한, 배양 조작에 있어서의 배지 교환 시에 실온의 배지를 사용하는 경우에 있어서는, 블록 공중합체의 응답 온도를 실온보다 낮은 온도로 하는 데에 적합하므로, N-n-프로필아크릴아미드, N-프롤린메틸에스테르아크릴아미드가 바람직하다.
수불용성 블록 세그먼트를 구성하는 단량체 단위로서는, 예를 들어, n-부틸아크릴레이트, n-부틸메타크릴레이트, 이소부틸아크릴레이트, 이소부틸메타크릴레이트, t-부틸아크릴레이트, t-부틸메타크릴레이트, n-헥실아크릴레이트, n-헥실메타크릴레이트, n-옥틸아크릴레이트, n-옥틸메타크릴레이트, n-데실아크릴레이트, n-데실메타크릴레이트, n-도데실아크릴레이트, n-도데실메타크릴레이트, n-테트라데실아크릴레이트, n-테트라데실메타크릴레이트 등을 들 수 있다. 또한, 블록 공중합체를 기재에 강고하게 고정화시키기 위해서 적합하므로, 반응성기를 갖는 것이 바람직하고, 예를 들어, 4-아지드페닐아크릴레이트, 4-아지드페닐메타크릴레이트, 2-((4-아지드벤조일)옥시)에틸아크릴레이트, 2-((4-아지드벤조일)옥시)에틸메타크릴레이트 등을 들 수 있다. 또한, 세포 증식성을 높이는 데에 적합하므로, 방향 고리를 갖는 구조가 바람직하고, 예를 들어, 2-하이드록시페닐아크릴레이트, 2-하이드록시페닐메타크릴레이트, 3-하이드록시페닐아크릴레이트, 3-하이드록시페닐메타크릴레이트, 4-하이드록시페닐아크릴레이트, 4-하이드록시페닐메타크릴레이트, N-(2-하이드록시페닐)아크릴아미드, N-(2-하이드록시페닐)메타크릴아미드, N-(3-하이드록시페닐)아크릴아미드, N-(3-하이드록시페닐)메타크릴아미드, N-(4-하이드록시페닐)아크릴아미드, N-(4-하이드록시페닐)메타크릴아미드, 스티렌 등을 들 수 있다.
또한 수불용성 블록 세그먼트는, 블록 공중합체의 응답 온도를 제어하는 반복 단위를 포함하고 있어도 된다. 블록 공중합체의 응답 온도를 제어하는 반복 단위로서는, 친수성 또는 소수성의 성분을 들 수 있고, 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 2-디메틸아미노에틸아크릴레이트, 2-디메틸아미노에틸메타크릴레이트, 2-디에틸아미노에틸아크릴레이트, 2-디에틸아미노에틸메타크릴레이트, N-[3-(디메틸아미노)프로필]아크릴아미드 등의 아미노기를 갖는 것 ; N-(3-술포프로필)-N-메타크로일옥시에틸-N,N-디메틸암모늄베타인, N-메타크릴로일옥시에틸-N,N-디메틸암모늄-α-N-메틸카르복시베타인 등의 베타인을 갖는 것 ; 하이드록시에틸아크릴레이트, 하이드록시에틸메타크릴레이트, N-(2-하이드록시에틸)아크릴아미드, 폴리에틸렌글리콜모노아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜모노메타크릴레이트, 폴리프로필렌글리콜모노아크릴레이트, 폴리프로필렌글리콜모노메타크릴레이트, 메톡시폴리에틸렌글리콜모노아크릴레이트, 메톡시폴리에틸렌글리콜모노메타크릴레이트, 디에틸렌글리콜모노메틸에테르아크릴레이트, 디에틸렌글리콜모노메틸에테르메타크릴레이트, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르아크릴레이트, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르메타크릴레이트, 2-메톡시에틸아크릴레이트, 2-메톡시에틸메타크릴레이트, 2-에톡시에틸아크릴레이트, 2-에톡시에틸메타크릴레이트, 3-부톡시에틸아크릴레이트, 3-부톡시에틸메타크릴레이트, 3-부톡시에틸아크릴아미드, 푸르푸릴아크릴레이트, 푸르푸릴메타크릴레이트, 테트라하이드로푸르푸릴아크릴레이트, 테트라하이드로푸르푸릴메타크릴레이트 등의 폴리에틸렌글리콜기, 메톡시에틸기를 갖는 것 ; 메톡시메틸아크릴레이트, 메톡시메틸메타크릴레이트, 2-에톡시메틸아크릴레이트, 2-에톡시메틸메타크릴레이트, 3-부톡시메틸아크릴레이트, 3-부톡시메틸메타크릴레이트, 3-부톡시메틸아크릴아미드 등의 아크릴레이트기를 갖는 것 ; 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린, 2-아크릴로일옥시에틸포스포릴콜린, 3-(메트)아크릴로일옥시프로필포스포릴콜린, 4-(메트)아크릴로일옥시부틸포스포릴콜린, 6-(메트)아크릴로일옥시헥실포스포릴콜린, 10-(메트)아크릴로일옥시데실포스포릴콜린, ω-(메트)아크릴로일(폴리)옥시에틸렌포스포릴콜린, 2-아크릴아미드에틸포스포릴콜린, 3-아크릴아미드프로필포스포릴콜린, 4-아크릴아미드부틸포스포릴콜린, 6-아크릴아미드헥실포스포릴콜린, 10-아크릴아미도데실포스포릴콜린, ω-(메트)아크릴아미드(폴리)옥시에틸렌포스포릴콜린 등의 포스포릴콜린기를 갖는 것을 들 수 있다.
(B) 영역은, (A) 영역에 인접하며, 세포 접착성 또는 세포 증식성을 갖지 않는다. (B) 영역이, (A) 영역에 인접하며, 세포 증식성을 갖지 않는 영역이면, 세포를 배양했을 때에, (A) 영역에만 세포 응집 덩어리를 형성하고, (A) 영역의 일부 또는 전부의 주위에 세포가 존재하지 않는 상태를 형성하는 것이 가능하다. 또한, 제조되는 세포 응집 덩어리의 사이즈 및 형상을 균일화하는 데에 적합하므로, (B) 영역이 세포 증식성뿐만 아니라 세포 접착성도 갖지 않는 것인 것이 바람직하다.
(B) 영역의 형상으로는, (A) 영역에 인접하는 것 이외에 한정은 없지만, 균일한 사이즈 및 형상의 세포 응집 덩어리를 제조하는 데에 적합하므로, (A) 영역의 경계선의 20 ％ 이상의 길이에 (B) 영역이 인접하고 있는 것이 바람직하고, 50 ％ 이상이 보다 바람직하고, 80 ％ 이상이 더욱 바람직하고, (A) 영역의 주위가 전부 (B) 영역인 것이 가장 바람직하다. 또한, 세포 배양 기재의 양산성을 높이는 데에 적합하므로, (A) 영역이 섬형이고 (B) 영역이 바다형인 해도 (海島) 구조인 것이 바람직하다.
(A) 영역 및 (B) 영역의 면적비로서는, 특별히 한정은 없지만, 세포 배양 기재의 단위 면적당 제조할 수 있는 세포 응집 덩어리의 수량을 높이는 데에 적합하므로, (A) 영역의 면적이, (A) 영역 및 (B) 영역의 면적의 합계에 대하여 10 ％ 이상인 것이 바람직하고, 30 ％ 이상이 보다 바람직하고, 50 ％ 이상이 더욱 바람직하고, 70 ％ 이상이 가장 바람직하다. 또한, 복수의 (A) 영역의 사이에 충분한 거리를 설정하고, 복수의 (A) 영역의 세포 응집 덩어리가 융합되어 불균일한 형상이 되는 것을 억제하는 데에 적합하므로, (B) 영역의 면적이, (A) 영역 및 (B) 영역의 면적의 합계에 대하여 20 ％ 이상인 것이 바람직하고, 40 ％ 이상이 보다 바람직하고, 60 ％ 이상이 더욱 바람직하고, 80 ％ 이상이 가장 바람직하다.
(A) 영역과 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이 ((A) 영역의 면과 (B) 영역의 면의 면외 방향의 거리) 는 1 ∼ 500 ㎚ 이다. 요철 높이가 500 ㎚ 이하임으로써, 요철에 의해 포착되는 사세포의 수를 억제하고, 세포 응집 덩어리에 혼입되는 사세포의 수를 저감시킬 수 있다. 이에 따라, 세포 응집 덩어리의 세포 생존률을 높이는 것이 가능하다. 또한, 요철 높이가 500 ㎚ 이하이면, 요철 부분에 기포가 부착되기 어렵다. 이에 따라, 기포를 제거하기 위해서 탈기를 실시하거나 피페터를 사용하여 배지의 토출과 흡인을 반복하거나 할 필요가 없어져, 조작성이 향상된다. 요철 높이가 1 ㎚ 이상임으로써, 세포 배양 기재 위에서 자발적으로 이동 (유주) 한 생세포가 (A) 영역에 모이기 때문에, 세포 응집 덩어리의 세포 생존률을 높이는 것이 가능하다. 형성되는 세포 응집 덩어리의 세포 생존률을 높이는 데에 적합하므로, 요철 높이 400 ㎚ 이하가 보다 바람직하고, 100 ㎚ 이하가 더욱 바람직하고, 50 ㎚ 이하가 가장 바람직하다.
세포 배양 기재는, 필요에 따라 생체 유래 물질을 함유하는 층을 표면에 구비하고 있어도 된다. 생체 유래 물질을 함유하는 층은, 세포 배양 기재의 표면 전체에 존재하고 있어도 되고, (A) 영역의 표면에만 존재하고 있어도 된다. 생체 유래 물질로는 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 마트리겔, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐 등을 들 수 있다.
이들 생체 유래 물질은, 천연물이어도 되고, 유전자 재조합 기술 등으로 인공적으로 합성한 것이어도 되고, 제한 효소 등으로 절단한 단편이나, 이들 생체 유래 물질과 동등한 물질을 화학적으로 합성한 합성 단백질 또는 합성 펩티드 등이어도 된다.
마트리겔로는, 입수 용이성 면에서, 시판품인 Matrigel (Corning Incorporated 제조), Geltrex (Thermo Fisher Scientific 제조) 등을 적합하게 사용할 수 있다.
라미닌의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간 iPS 세포의 표면에 발현되어 있는 α6β1 인테그린에 대하여 고활성을 보이는 것이 보고되어 있는 라미닌 511, 라미닌 521, 라미닌 511-E8 프래그먼트 등을 사용할 수 있다. 라미닌은, 천연물이어도 되고, 유전자 재조합 기술 등으로 인공적으로 합성한 것이어도 되고, 또한, 라미닌과 동등한 물질을 화학적으로 합성한 합성 단백질 또는 합성 펩티드여도 된다. 입수 용이성 면에서, 시판품인 iMatrix-511 ((주) 니피 제조) 등을 적합하게 사용할 수 있다.
비트로넥틴은, 천연물이어도 되고, 유전자 재조합 기술 등으로 인공적으로 합성한 것이어도 되고, 또한, 비트로넥틴과 동등한 물질을 화학적으로 합성한 합성 단백질 또는 합성 펩티드여도 된다. 입수 용이성 면에서, 시판품인 비트로넥틴, 인체 혈장 유래 (와코 순약 공업 (주) 제조), synthemax (Corning Incorporated 제조), Vitronectin (VTN-N) (Thermo Fisher Scientific 제조) 등을 적합하게 사용할 수 있다.
피브로넥틴은, 천연물이어도 되고, 유전자 재조합 기술 등으로 인공적으로 합성한 것이어도 되고, 또한, 피브로넥틴과 동등한 물질을 화학적으로 합성한 합성 단백질 또는 합성 펩티드여도 된다. 입수 용이성 면에서, 시판품인 피브로넥틴 용액, 인체 혈장 유래 (와코 순약 공업 (주) 제조), Retronectin (다카라 바이오 (주) 제조) 등을 적합하게 사용할 수 있다.
콜라겐의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, type I 콜라겐이나 type IV 콜라겐 등을 사용할 수 있다. 콜라겐은, 천연물이어도 되고, 유전자 재조합 기술 등으로 인공적으로 합성한 것이어도 되고, 또한, 콜라겐과 동등한 물질을 화학적으로 합성한 합성 펩티드여도 된다. 입수 용이성 면에서, 시판품인 콜라겐 I, 인체 (Corning Incorporated 제조), 콜라겐 IV, 인체 (Corning Incorporated 제조) 등을 적합하게 사용할 수 있다.
생체 유래 물질의 변성을 억제할 수 있고, 세포 증식성을 높일 수 있다는 관점에서, 생체 유래 물질은 비공유 결합에 의해 세포 배양 기재 위에 고정화되어 있는 것이 바람직하다. 여기서, 「비공유 결합」이란, 정전 상호 작용, 수불용성 상호 작용, 수소 결합, π-π 상호 작용, 쌍극자-쌍극자 상호 작용, 런던 분산력, 그 밖의 반데르발스 상호 작용 등, 분자간력에서 유래하는 공유 결합 이외의 결합력을 나타낸다. 생체 유래 물질의 블록 공중합체에 대한 고정화는, 단일의 결합력에 의한 것이어도 되고, 복수의 조합이어도 된다.
생체 유래 물질의 고정화 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 세포 배양 기재에 생체 유래 물질의 용액을 소정 시간 도포함으로써 고정화시키는 방법이나, 세포를 배양할 때에 배양액 중에 생체 유래 물질을 첨가함으로써 생체 유래 물질을 세포 배양 기재에 흡착시켜 고정화시키는 방법을 적합하게 사용할 수 있다.
본 실시형태에 관련된 세포 배양 기재는, 필요에 따라 기재 위에 칸막이판(예를 들어, 면내 방향의 단면적이 0.05 ∼ 100 ㎠ 인 관통 구멍을 갖는 판) 을 형성하거나 함으로써, 각 세포 응집 덩어리를 구분하기 위한 구조를 형성해도 된다.
본 실시형태에 관련된 세포 배양 기재는, 멸균이 실시되어 있어도 된다. 멸균의 방법에 특별히 한정은 없지만, 고압 증기 멸균, UV 멸균, γ 선 멸균, 에틸렌옥사이드 가스 멸균 등을 사용할 수 있다. 블록 공중합체의 변성을 억제한다는 관점에서는, 고압 증기 멸균, UV 멸균, 에틸렌옥사이드 가스 멸균이 바람직하다. 기재의 변형을 억제한다는 관점에서는, UV 멸균 또는 에틸렌옥사이드 가스 멸균이 더욱 바람직하다. 양산성이 우수하다는 관점에서는, 에틸렌옥사이드 가스 멸균이 바람직하다.
본 실시형태에 관련된 세포 배양 기재를 사용하여 배양되는 세포로서는, 온도 강하에 의한 자극 부여 전의 표면에 접착될 수 있는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 유래 CHO 세포나 마우스 결합 조직 L929, 인간 태아 신장 유래 HEK293 세포나 인간 자궁 경부암 유래 HeLa 세포 등의 다양한 주화 세포에 추가하고, 예를 들어 생체 내의 각 조직, 장기를 구성하는 상피 세포나 내피 세포, 수축성을 보이는 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 신경계를 구성하는 뉴런 세포, 글리아 세포, 섬유아 세포, 생체의 대사에 관여하는 간 실질 세포, 간 비실질 세포나 지방 세포, 분화능을 갖는 세포로서 간엽계 줄기 세포, 골수 세포, Muse 세포와 같이 각종의 조직에 존재하는 줄기 세포, 또한 ES 세포, iPS 세포 등의 분화 다능성을 갖는 줄기 세포 (다능성 줄기 세포), 그것들로부터 분화 유도된 세포 등을 들 수 있다. 일 실시형태에 관련된 세포 배양 기재에 있어서의 세포의 증식성 및 박리성의 관점에서, 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포가 바람직하고, 간엽계 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포가 보다 바람직하고, 다능성 줄기 세포가 더욱 바람직하고, iPS 세포가 가장 바람직하다.
본 실시형태에 관련된 세포 배양 기재는, 후술하는 실시예에 기재하는 바와 같이, 다능성 줄기 세포로부터 3 배엽 세포로의 분화 유도에 적합하게 사용할 수 있다. 또한 본 실시형태에 관련된 세포 배양 기재는, 다능성 줄기 세포로부터 장 상피 세포로의 분화 유도에 적합하게 사용할 수 있다. 따라서, 본 실시형태에 관련된 세포 배양 기재는, 다능성 줄기 세포로부터 3 배엽 세포로의 분화 유도용이어도 되고, 다능성 줄기 세포로부터 장 상피 세포로의 분화 유도용이어도 된다.
본 실시형태에 관련된 세포 배양 기재는, 예를 들어, 하기 공정 (1), 공정 (2) 및 공정 (3) 을 구비하는 제조 방법에 의해 제조할 수 있다. 이 제조 방법은, 양산성이 우수하다. 또, 공정 (3) 에서는, 플라즈마 처리 대신에 코로나 처리 또는 UV 처리를 실시할 수도 있다.
공정 (1) 기재의 표면의 적어도 일부를 UV 반응성의 친수성 고분자 함유하는 조성물로 피복하고, 친수성 고분자를 함유하는 층을 형성하는 공정.
공정 (2) 친수성 고분자를 함유하는 층에 UV 조사를 실시하고, 친수성 고분자를 함유하는 층을, 화학 반응에 의해 기재의 표면에 고정화시키는 공정.
공정 (3) 고정화된 친수성 고분자를 함유하는 층의 표면의 일부에 플라즈마 처리를 실시하고, 플라즈마 처리를 실시한 부분에 (A) 영역을 형성하는 공정.
또한 본 실시형태에 관련된 세포 배양 기재는, 하기 공정 (1'), 공정 (2'), 공정 (3') 및 공정 (4') 를 구비하는 제조 방법에 의해서도 제조할 수 있다.
공정 (1') 반복 단위에 지환식 탄화수소기 또는 방향족 탄화수소기를 포함하는 고분자로 형성되는 기재를 사용하며, 기재의 표면에 플라즈마 처리를 실시하고, 플라즈마 처리를 실시한 부분에 상기 (A) 영역을 형성하는 공정.
공정 (2') 기재의 표면의 적어도 일부를 UV 반응성의 친수성 고분자를 함유하는 조성물로 피복하고, 상기 친수성 고분자를 함유하는 층을 형성하는 공정.
공정 (3') 상기 친수성 고분자를 함유하는 층의 일부에 UV 조사를 실시하고, 상기 친수성 고분자를 함유하는 층의 일부를 상기 기재의 표면에 고정화시키는 공정.
공정 (4') 상기 친수성 고분자를 용매로 세정하고, 표면에 고정화되어 있지 않은 친수성 고분자를 용해시켜 기재의 표면으로부터 제거하는 공정.
본 실시형태에 관련된 제조 방법은, 공정 (1), 공정 (2) 및 공정 (3), 또는 공정 (1'), 공정 (2'), 공정 (3') 및 공정 (4') 에 추가하고, 필요에 따라 하기 공정 (4) 를 추가로 구비하는 것이어도 된다.
공정 (4) 공정 (3) 또는 (4') 후에, 면내 방향의 단면적이 0.05 ∼ 100 ㎠ 인 관통 구멍을 갖는 판을, 기재의 친수성 고분자를 함유하는 층으로 피복한 면측에서 기재와 첩합시키는 공정.
또한, 일 실시형태에 관련된 제조 방법은, 공정 (3) 또는 (4') 후에, 하기 공정 (5) 를 추가로 구비하고 있어도 된다. 또, 공정 (4) 를 실시하는 경우에는, 공정 (5) 는, 공정 (3) 또는 (4') 후, 또한 공정 (4) 전에 실시하는 것이 바람직하다.
공정 (5) 공정 (3) 또는 (4') 후에, 플라즈마 처리를 실시한 친수성 고분자를 함유하는 층의 표면을, 온도 응답성 고분자를 함유하는 조성물로 피복하고, 온도 응답성 고분자를 함유하는 층을 형성하는 공정.
공정 (1) 에서는, 기재의 표면의 적어도 일부를 UV 반응성의 친수성 고분자를 함유하는 조성물로 피복하고, 친수성 고분자를 함유하는 층을 형성한다. 친수성 고분자를 함유하는 층을 형성함으로써, 세포 접착성 및 세포 증식성을 갖지 않는 상태로 할 수 있다. 친수성 고분자를 함유하는 층을 형성하는 방법으로는, 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 친수성 고분자를 함유하는 조성물을 기재의 표면의 적어도 일부에 도포함으로써 형성하는 방법을 들 수 있다. 친수성 고분자를 함유하는 조성물의 도포 방법으로는, 예를 들어, 도포, 브러시 도장, 딥 코팅, 스핀 코팅, 바 코딩, 흘림 도장, 스프레이 도장, 롤 도장, 에어 나이프 코팅, 블레이드 코팅, 그라비어 코팅, 마이크로 그라비어 코팅, 슬롯 다이 코팅 등 통상 알려져 있는 각종의 방법을 사용할 수 있다.
도 2 는, 공정 (1) 후의 표면에 친수성 고분자를 함유하는 층이 형성된 기재의 모식도 (사시도) 이다. 도 2 에서는, 기재 (1) 의 표면의 일면 전부에 친수성 고분자를 함유하는 층 (2) 이 형성되어 있다.
공정 (2) 에서는, 친수성 고분자를 함유하는 층 (2) 에 UV 조사를 실시하고, 친수성 고분자를 함유하는 층을 기재의 표면에 고정화시킨다. UV 반응성의 친수성 고분자에 UV 조사를 실시함으로써, 친수성 고분자끼리, 또는 친수성 고분자와 기재의 화학 반응이 일어나, 친수성 고분자를 함유하는 층이 기재의 표면에 고정화된다. 친수성 고분자를 함유하는 층이 기재 표면에 고정화됨으로써, 후술하는 공정 (5) 에서 온도 응답성 고분자를 함유하는 조성물을 도포했을 때에, 친수성 고분자를 함유하는 층을 변형시키지 않고, 온도 응답성 고분자를 함유하는 층을 형성할 수 있다. 또한, 친수성 고분자를 함유하는 층이 기재 표면에 고정화됨으로써, 후술하는 공정 (3) 에서 친수성 고분자를 함유하는 층의 표면의 일부에 형성된 (A) 영역의 형상을 유지할 수도 있다.
공정 (3) 에서는, 고정화된 친수성 고분자를 함유하는 층의 표면의 일부에 플라즈마 처리를 실시하고, 플라즈마 처리를 실시한 부분에 (A) 영역을 형성한다. 바람직한 플라즈마 처리 방법은, 사용하는 친수성 고분자의 종류나 층두께에 따라 적절히 조정할 수 있지만, 플라즈마 조사 시간은, 5 초 ∼ 30 분이 바람직하고, 5 초 ∼ 10 분이 더욱 바람직하고, 10 초 ∼ 5 분이 특히 바람직하고, 15 초 ∼ 1 분이 가장 바람직하다. 또한, (A) 영역의 패터닝의 방법으로는, 특별히 한정은 없지만, 메탈 마스크나 실리콘 마스크, 표면 보호 필름 등으로 피복한 상태에서 플라즈마 처리를 실시함으로써, 원하는 부분 (마스크되어 있지 않은 부분) 에 플라즈마 처리를 실시하는 방법을 들 수 있다.
도 3 은, 공정 (3) 후의 세포 배양 기재의 모식도 (사시도) 이다. 도 3 에 나타내는 세포 배양 기재 (10) 에서는, 등간격으로 배치된 원 형상의 영역 (A 로 나타낸 영역. 예를 들어, 당해 영역의 면적은 0.001 ∼ 5 ㎟ 이다.) 이 플라즈마 처리를 실시한 부분에 해당한다. A 로 나타낸 영역은, 친수성 고분자를 함유하는 층 (2) 의 표면이 플라즈마 처리에 의해 개질됨으로써, 세포 접착성 및 세포 증식성을 갖게 된다. 또한, 원 형상의 영역 이외의 영역 (B 로 나타낸 영역.) 은, 예를 들어, 메탈 마스크 등에 의해 보호됨으로써 플라즈마 처리가 실시되어 있지 않은 부분에 해당한다. B 로 나타낸 영역은, 표면이 친수성 고분자를 함유하는 층 (2) 이기 때문에, 세포 접착성 또는 세포 증식성을 갖지 않는다.
공정 (1') 에서는, 반복 단위에 지환식 탄화수소기 또는 방향족 탄화수소기를 포함하는 고분자 기재를 사용하며, 기재의 표면에 플라즈마 처리를 실시하고, 플라즈마 처리를 실시한 부분에 상기 (A) 영역을 형성한다. 지환식 탄화수소기 또는 방향족 탄화수소기를 포함하는 고분자 기재의 표면에 플라즈마 처리를 실시함으로써, 기재 표면을 세포의 배양에 적합한 구조로 변화시킬 수 있다. 플라즈마 처리의 조건으로는, 도입 가스로서 공기, 질소 또는 산소를 사용하며, 1 ∼ 30 파스칼의 가스압에 있어서, 1 초 ∼ 10 분이 바람직하고, 1 초 ∼ 5 분이 더욱 바람직하고, 1 초 ∼ 1 분이 특히 바람직하다. 지환식 탄화수소기로서는, 시클로알킬기를 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기, 시클로헵틸기, 시클로옥틸기, 시클로노닐기 등을 들 수 있다. 방향족 탄화수소기는, 방향족 탄화수소로부터 고리를 구성하는 탄소 원자에 직접 결합되는 수소 원자를 1 개 이상 제거한 기를 의미한다. 방향족 탄화수소기로서는, 단고리형 방향족 탄화수소인 벤젠, 다고리형 방향족 탄화수소인 나프탈렌 등으로부터 고리를 구성하는 탄소 원자에 직접 결합되는 수소 원자를 1 개 이상 제거한 기를 들 수 있다.
또한, 상기 공정 (1') 로 변경하고, 세포의 배양에 적합한 성분을 기재 표면에 코팅해도 된다. 세포의 배양에 적합한 성분으로는, 폴리카르복시스티렌 등의 고분자 재료를 적합하게 사용할 수 있다.
공정 (2') 에서는, 기재의 표면의 적어도 일부를 UV 반응성의 친수성 고분자를 함유하는 조성물로 피복하고, 상기 친수성 고분자를 함유하는 층을 형성한다. 도포 방법으로는, 전술한 공정 (1) 과 동일한 방법을 적합하게 사용할 수 있다.
공정 (3') 에서는, 상기 친수성 고분자를 함유하는 층의 일부에 UV 조사를 실시하고, 상기 친수성 고분자를 함유하는 층의 일부를 상기 기재의 표면에 고정화시킨다. 층의 일부 영역에 UV 조사를 실시함으로써, 친수성 고분자를 함유하는 층의 UV 조사된 영역만이 기재의 표면에 고정화된다. 친수성 고분자를 함유하는 층의 일부에 UV 조사를 실시하는 방법으로는, 원하는 패턴으로 크롬 증착 등에 의해 UV 투과성을 갖지 않는 영역을 형성한 석영 마스크 등을 기재 위에 두고, 그 위에서부터 UV 조사하는 방법을 들 수 있다.
공정 (4') 에서는, 상기 친수성 고분자를 용매로 세정하고, 표면에 고정화되어 있지 않은 친수성 고분자를 용해시켜 기재의 표면으로부터 제거한다. 고정화되어 있지 않은 친수성 고분자를 제거함으로써 기재 표면을 노출시키고, (A) 영역을 형성할 수 있다. 공정 (4') 에서 사용하는 용매로서는, UV 반응성의 친수성 고분자의 자기 반응에 의해 부생되는 화합물, 예를 들어 아지드기 유래의 니트렌을 함유하는 화합물 등을 제거하는 데에 적합하므로, 물과 알코올을 함유하는 것이 바람직하다. 물과 알코올의 혼합 용매를 사용하여 세정함으로써, (A) 영역에 잔류하는 친수성 고분자 유래 성분을 저감시킬 수 있고, (A) 영역의 세포 접착성 및 세포 증식성을 높일 수 있다. 상기 알코올로는 저급 알코올이 바람직하고, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, t-부탄올, 이소부탄올, 펜탄올, 헥산올이 바람직하고, 메탄올 또는 에탄올이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 알코올의 함유량으로는, 50 ∼ 95 ％ 가 바람직하고, 50 ∼ 90 ％ 가 더욱 바람직하고, 60 ∼ 90 ％ 가 특히 바람직하고, 70 ∼ 90 ％ 가 가장 바람직하다.
공정 (4) 에서는, 공정 (3) 또는 (4') 후에, 면내 방향의 단면적이 0.05 ∼ 100 ㎠ 인 관통 구멍을 갖는 판을, 기재의 친수성 고분자를 함유하는 층으로 피복한 면측에서 기재와 첩합시킨다. 면내 방향의 단면적이 0.05 ∼ 100 ㎠ 인 관통 구멍을 갖는 판을 기재와 첩합시킴으로써, 배지를 넣기 위한 공간을 갖는 플레이트를 높은 양산성으로 제작할 수 있다. 도 4 는, 공정 (4) 후의 세포 배양 기재의 모식도 (사시도) 이다. 도 4 에 나타내는 세포 배양 기재 (11) 는, 예를 들어, 도 3 에 나타내는 세포 배양 기재 (10) 등에 칸막이판 (20) (면내 방향의 단면적이 0.05 ∼ 100 ㎠ 인 관통 구멍을 갖는 판) 을 첩합시킨 것이다.
공정 (5) 에서는, 공정 (3) 또는 (4') 후에, 플라즈마 처리를 실시한 친수성 고분자를 함유하는 층의 표면을, 온도 응답성 고분자를 함유하는 조성물로 피복하고, 온도 응답성 고분자를 함유하는 층을 형성한다. 이 때, 온도 응답성 고분자를 함유하는 층의 층두께를 100 ㎚ 이하로 형성함으로써, 공정 (3) 또는 (4') 에서 형성한 (A) 영역의 표면에 온도 응답성 고분자의 분자 사슬이 드문드문한 상태로 피복되기 쉽고, (A) 영역의 기능 (세포 접착성 및 세포 증식성을 갖는다) 을 유지하면서 온도 응답성을 부여하는 데에 적합하다. 또한, 온도 응답성 고분자를 함유하는 층의 층두께를 1 ㎚ 이상으로 함으로써, 충분한 온도 응답성을 부여하고, 세포 응집 덩어리의 형성을 신속하게 실시할 수 있는 세포 배양 기재를 제조할 수 있어 바람직하다.
온도 응답성 고분자를 함유하는 조성물로 피복하는 방법으로는, 전술한 친수성 고분자를 함유하는 조성물의 도포 방법과 동일한 방법을 적합하게 사용할 수 있다.
또한 온도 응답성 고분자를 함유하는 조성물로 피복하는 방법으로는, 세포 배양 기재의 전체면에 온도 응답성 물질을 피복하는 것이 바람직하다. 온도 응답성 고분자를 함유하는 조성물의 피복 시에, 패터닝을 실시하지 않고, 통상 사용되는 도공 방법을 사용하여 피복함으로써, 세포 배양 기재의 양산성을 높일 수 있다. 또한, 세포 배양 기재의 전체면에 온도 응답성 고분자를 함유하는 조성물을 피복함으로써, (A) 영역에 온도 응답성을 부여함과 함께, (B) 영역에도 온도 응답성 고분자가 피복된다. (B) 영역에 온도 응답성 고분자가 피복됨으로써, (B) 영역의 세포 접착성을 저하시킬 수 있다.
또한 본 발명은, 다능성 줄기 세포의 분화 유도 방법에도 관한 것이다.
본 실시형태에 관련된 분화 유도 방법은, 이하의 (i) ∼ (iii) 공정을 포함한다. 본 실시형태에 관련된 분화 유도 방법은, 다능성 줄기 세포로부터 3 배엽 세포로의 분화 유도에 적합하게 사용된다.
(i) 본 발명에 관련된 세포 배양 기재에 다능성 줄기 세포를 파종하는 공정.
(ii) 파종된 다능성 줄기 세포를 배양하여, 높이/직경의 비가 0.2 ∼ 0.8 인 반구형의 세포 응집 덩어리를 형성하는 공정.
(iii) 상기 세포 응집 덩어리를 분화 유도하여, 3 배엽 세포의 세포 응집 덩어리를 형성하는 공정.
(i) 공정은, 상기 서술한 본 발명에 관련된 세포 배양 기재를 사용하는 것으로, 당해 세포 배양 기재에 다능성 줄기 세포를 파종하는 공정이다. 「세포를 파종한다」함은, 세포가 분산된 배지 (이하, 「세포 현탁액」으로 표기한다.) 를 세포 배양 기재 위에 도포, 또는 세포 배양 기재에 주입하거나 함으로써, 세포 현탁액과 세포 배양 기재를 접촉시키는 것을 나타낸다. 세포 증식성의 영역을 갖는 세포 배양 기재를 사용함으로써, 후술하는 (ii) 공정에서 세포를 배양할 수 있다. 세포 배양 기재가 세포 증식성의 영역을 갖지 않는 경우, (ii) 공정에서 세포를 배양할 수 없다.
상기 (i) 공정에 있어서는, 다능성 줄기 세포의 미분화성을 유지시키는 데에 유효한 조건에서 배양이 실시된다. 미분화성을 유지시키는 데에 유효한 조건으로는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 배양 개시 시의 다능성 줄기 세포의 밀도를 하기 파종 시의 세포 밀도로서 기재한 바람직한 범위로 하는 것, 적절한 액체 배지의 존재 하에서 실시하는 것 등을 들 수 있다. 다능성 줄기 세포의 미분화성을 유지시키는 데에 유효한 배지로서는, 예를 들어, 다능성 줄기 세포의 미분화성을 유지하기 위한 인자로서 알려져 있는, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 아스코르브산, 탄산수소나트륨, 염기성 섬유아 세포 증식 인자, 트랜스포밍 증식 인자 β (TGFβ), CCL2, 액티빈, 2-메르캅토메탄올 중 1 개 이상을 첨가한 배지를 적합하게 사용할 수 있다. 다능성 줄기 세포의 미분화성을 유지하는 데에 특히 적합하므로, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 아스코르브산, 탄산수소나트륨, 염기성 섬유아 세포 증식 인자, 트랜스포밍 증식 인자 β (TGFβ) 를 함유하는 배지를 사용하는 것이 보다 바람직하고, 염기성 섬유아 세포 증식 인자를 첨가한 배지를 사용하는 것이 가장 바람직하다.
상기 염기성 섬유아 세포 증식 인자를 첨가한 배지의 종류에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 시판품으로는, DMEM (Sigma-Aldrich Co. LLC 제조), Ham's F12 (Sigma-Aldrich Co. LLC 제조), D-MEM/Ham's F12 (Sigma-Aldrich Co. LLC 제조), Primate ES Cell Medium ((주) REPROCELL 제조), StemFit AK02N (아지노모토 (주) 제조), StemFit AK03 (아지노모토 (주) 제조), mTeSR1 (STEMCELL TECHNOLOGIES 제조), TeSR-E8 (STEMCELL TECHNOLOGIES 제조), ReproNaive ((주) REPROCELL 제조), ReproXF ((주) REPROCELL 제조), ReproFF ((주) REPROCELL 제조), ReproFF2 ((주) REPROCELL 제조), NutriStem (바이오로지컬 인더스트리즈사 제조), iSTEM (다카라 바이오 (주) 제조), GS2-M (다카라 바이오 (주) 제조), hPSC Growth Medium DXF (PromoCell (주) 제조) 등을 들 수 있다. 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지하는 데에 적합하므로, Primate ES Cell Medium ((주) REPROCELL 제조), StemFit AK02N (아지노모토 (주) 제조) 또는 StemFit AK03 (아지노모토 (주) 제조) 이 바람직하고, StemFit AK02N (아지노모토 (주) 제조) 또는 StemFit AK03 (아지노모토 (주) 제조) 이 보다 바람직하고, StemFit AK02N (아지노모토 (주) 제조) 가 특히 바람직하다.
상기 (i) 공정에 있어서, 다능성 줄기 세포의 파종 방법에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 세포 배양 기재에 세포 현탁액을 주입함으로써 실시할 수 있다. 파종 시의 세포 밀도는 특별히 제한은 없지만, 다능성 줄기 세포를 유지할 수 있으며, 또한 증식시킬 수 있도록 1.0 × 102 ∼ 1.0 × 106 세포/㎠ 가 바람직하고, 5.0 × 102 ∼ 5.0 × 105 세포/㎠ 가 보다 바람직하고, 1.0 × 103 ∼ 2.0 × 105 세포/㎠ 가 더욱 바람직하고, 1.2 × 103 ∼ 1.0 × 105 세포/㎠ 가 가장 바람직하다.
또한 상기 (i) 공정에서 사용하는 배지로서는, 다능성 줄기 세포의 생존을 유지하는 데에 적합하므로, 상기 염기성 섬유아 세포 증식 인자를 첨가한 배지에 추가로 Rho 결합 키나아제 저해제를 첨가한 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 특히 인간의 다능성 줄기 세포를 사용하는 경우로서, 인간의 다능성 줄기 세포의 세포 밀도가 낮은 상태에 있어서, Rho 결합 키나아제 저해제가 첨가되어 있으면, 인간의 다능성 줄기 세포의 생존 유지에 효과적인 경우가 있다. Rho 결합 키나아제 저해제로서는, 예를 들어 (R)-(＋)-trans-N-(4-pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide·2HCl·H2O (와코 순약 공업 (주) 제조 Y-27632), 1-(5-Isoquinolinesulfonyl)homopiperazine Hydrochloride (와코 순약 공업 (주) 제조 HA1077) 를 사용할 수 있다. 배지에 첨가되는 Rho 결합 키나아제 저해제의 농도로서는, 인간의 다능성 줄기 세포의 생존 유지에 유효한 범위로서 인간의 다능성 줄기 세포의 미분화 상태에 영향을 미치지 않는 범위이고, 바람직하게는 1 μM ∼ 50 μM 이며, 보다 바람직하게는 3 μM ∼ 20 μM 이며, 더욱 바람직하게는 5 μM ∼ 15 μM 이며, 가장 바람직하게는 8 μM ∼ 12 μM 이다.
상기 (i) 공정을 개시하면 곧, 다능성 줄기 세포는 세포 배양 기재에 접착되기 시작한다.
(ii) 공정에서는, 파종된 다능성 줄기 세포를 배양하여, 높이/직경의 비가 0.2 ∼ 0.8 인 반구형의 세포 응집 덩어리를 형성한다. 「높이」는, 예를 들어, 세포 배양 기재의 기재 면외 방향에 있어서의 세포 직경의 최대값이어도 된다. 「직경」은, 예를 들어, 세포 배양 기재의 기재 면내 방향에 있어서의 세포 직경의 최대값이어도 된다.
(ii) 공정에서의 배양은, 다능성 줄기 세포의 증식능이나 생리 활성, 기능 유지에 적합하므로, 배양 온도로서는, 바람직하게는 30 ∼ 42 ℃, 보다 바람직하게는 32 ∼ 40 ℃, 더욱 바람직하게는 36 ∼ 38 ℃, 가장 바람직하게는 37 ℃ 이다.
(ii) 공정을 개시하고 22 ∼ 26 시간 후에, 최초의 배지 교환을 실시하는 것이 바람직하다. 그 48 ∼ 72 시간 후에 2 번째의 배지 교환을 실시하고, 그 후, 24 ∼ 48 시간마다 배지 교환을 실시하는 것이 바람직하다. 그 동안, 다능성 줄기 세포는 증식하여, 콜로니라고 불리는 평평한 세포 덩어리를 형성한다. 콜로니는 세포 배양 기재에 세포가 2 차원적으로 접착된 상태이다. 콜로니의 크기가 (A) 영역의 사이즈 정도가 될 때까지 배양을 계속시키고, 추가로 배양을 계속함으로써, 3 차원적인 세포 응집 덩어리를 형성한다. 3 차원적인 세포 응집 덩어리의 형상은, 높이/직경의 비가 0.2 ∼ 0.8 인 반구형인 것이 바람직하다. 높이/직경의 비는, 현미경에 의해 복수의 세포 응집 덩어리를 관찰하여 값을 산출하고, 평균냄으로써 구해진다. 높이/직경의 비가 0.2 ∼ 0.8 인 반구형의 세포 응집 덩어리를 형성함으로써, 다능성 줄기 세포로부터 3 배엽 세포로의 분화 유도를 효율적으로 실시할 수 있다. 또한, 3 배엽 세포로의 분화 유도 효율을 높이는 데에 적합하므로, 높이/직경의 비가 0.3 ∼ 0.7 인 것이 보다 바람직하고, 0.4 ∼ 0.6 이 더욱 바람직하다.
(iii) 공정에서는, 상기 세포 응집 덩어리 (다능성 줄기 세포의 세포 응집 덩어리) 를 분화 유도하여, 3 배엽 세포의 세포 응집 덩어리를 형성한다. 또, (iii) 공정은, (ii) 공정 후에 실시해도 되고, (ii) 공정과 병행하며 실시해도 된다. 즉, 파종된 다능성 줄기 세포가 세포 배양 기재에 접착 후, 곧바로 (ii) 공정 및 (iii) 공정을 개시하고, 세포 응집 덩어리를 형성하면서 분화 유도를 실시해도 된다. 또, 3 배엽 세포란, 내배엽 세포, 중배엽 세포, 외배엽 세포 중 어느 것을 나타낸다. (iii) 공정에서는, 분화 유도 인자를 포함하는 배지 중에서 세포를 배양한다.
내배엽 세포로의 분화 유도 효율을 높이는 데에 적합하기 때문에, (iii) 공정에 있어서의 분화 유도 인자가, 내배엽 유도 인자를 함유하는 것이 바람직하다. 내배엽 유도 인자로서는, 배양체 (胚樣體) 로의 분화 유도 효율을 높이는 데에 적합하기 때문에, Wnt 단백질, 골 형성 단백질 (Bone morphogenetic protein, BMP), 인슐린 유사 성장 인자 및 액티빈으로 이루어지는 군에서 선택되는 단일 또는 복수의 분화 유도 인자인 것이 바람직하고, 특히 Wnt3a, BMP4, IGFI, 액티빈 A 중 어느 것을 함유하는 것이 바람직하다.
중배엽 세포로의 분화 유도 효율을 높이는 데에 적합하기 때문에, (iii) 공정에 있어서의 분화 유도 인자가, 중배엽 유도 인자를 함유하는 것이 바람직하다. 중배엽 유도 인자로서는, 배양체로의 분화 유도 효율을 높이는 데에 적합하기 때문에, GSK3β 저해제, 골 형성 단백질 (Bone morphogenetic protein, BMP) 및 액티빈으로 이루어지는 군에서 선택되는 단일 또는 복수의 분화 유도 인자인 것이 바람직하고, 특히 액티빈 A, CHIR99021 (GSK3β 저해제), BMP4 중 어느 것을 함유하는 것이 바람직하다.
외배엽 세포로의 분화 유도 효율을 높이는 데에 적합하기 때문에, (iii) 공정에 있어서의 분화 유도 인자가, 외배엽 유도 인자를 함유하는 것이 바람직하다. 상기 외배엽 유도 인자로서는, Noggin (BMP 저해제), dorsomorphin (BMP 저해제), SB431542 (TGF-β 저해제), 액티빈 저해제 중 어느 것을 함유하는 것이 바람직하고, BMP 저해제 및 TGF-β 저해제를 함유하는 것이 보다 바람직하다.
분화 유도 인자의 배지에 대한 첨가 농도에 대해서는 특별히 한정되지 않지만, 3 배엽 세포로의 분화 유도 효율을 높이는 데에 적합하기 때문에, 바람직하게는 1000 ∼ 500 ng/mL 이며, 보다 바람직하게는 500 ∼ 100 ng/mL 이며, 가장 바람직하게는 100 ng/mL 이하이다.
분화 유도 인자를 포함하는 배지는, 충분히 분화 유도를 진행시키기 위해서, 배양 중에는 24 시마다 교환하는 것이 바람직하다. 24 시간 이내에 배지를 교환함으로써, 배지 중의 분화 유도 인자가 부족하는 것을 방지하여, 균일하게 모든 다능성 줄기 세포를 분화시킬 수 있다.
본 실시형태에 관련된 다능성 줄기 세포의 분화 유도 방법은, 이하의 (iv) 공정을 추가로 가지고 있어도 된다. (iv) 공정을 포함하는 경우의 분화 유도 방법은, 다능성 줄기 세포로부터 장 상피 세포로의 분화 유도에 적합하게 사용된다.
(iv) Wnt 단백질, 골 형성 단백질 (BMP), 인슐린 유사 성장 인자 및 액티빈으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 분화 유도 인자를 포함하는 배지 중에서 세포 응집 덩어리를 배양하여, 장 상피 세포가 갖는 마커를 발현시키는 공정.
장 상피 세포는, 장 세포, 배 (杯) 세포, 장관 내분비 세포, 파네이트 세포 및 장 상피 줄기 세포 중 어느 하나 또는 복수의 세포를 갖는 것이 바람직하고, 장 세포, 배상 세포, 장관 내분비 세포, 파네이트 세포 및 장 상피 줄기 세포를 전부 포함하는 것이 보다 바람직하다. 장 상피 세포는 특유한 마커를 갖는다. 예를 들어, 장 세포 마커로서 CDX2 및 VIL1, 배 세포 마커로서 MUC2, 장관 내분비 세포 마커로서 CGA, 파네이트 세포 마커로서 DEFA6, 장 상피 줄기 세포 마커로서 LGR5 를 들 수 있다.
본 발명에 관련된 세포 배양 기재는, 기재 면외 방향의 높이가 높은 요철 구조를 표면에 갖지 않으므로, 배지를 접촉시켰을 때에 기포가 세포 배양 기재 표면에 부착되기 어렵다. 본 발명에 관련된 세포 배양 기재는, 예를 들어, 기포의 부착 수가, (A) 영역의 수에 대하여 10 ％ 이하가 바람직하고, 5 ％ 이하가 보다 바람직하고, 3 ％ 이하가 더욱 바람직하고, 1 ％ 이하가 가장 바람직하다.
본 발명에 관련된 세포 배양 기재를 사용하여 형성되는 세포 응집 덩어리는, 종래의 미세 요철 구조를 이용한 세포 응집 덩어리 형성과 비교하여, 접착된 세포가 자발적으로 집합되므로, 높은 세포 생존률을 갖는다. 예를 들어, 생존률 50 ％ 세포를 사용한 경우, 형성되는 세포 응집 덩어리의 세포 생존률로서 70 ％ 이상이 바람직하고, 80 ％ 이상이 보다 바람직하고, 85 ％ 이상이 더욱 바람직하고, 90 ％ 이상이 가장 바람직하다.
실시예
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 본 발명은, 이하의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 또, 언급이 없는 한, 시약은 시판품을 사용하였다.
＜(A) 영역의 면적의 측정＞
레이저 현미경 (키엔스 (주) 제조, 제품명 VK-X200) 을 사용하여, 세포 배양 기재의 표면의 화상을 취득하였다. 얻어진 화상을 사용하여, 해석 소프트 VK-X Viewer 위에서 20 지점의 (A) 영역의 면적을 구하고, 그것들의 면적을 평균내어 (A) 영역의 면적으로 하였다.
＜(A) 영역과 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이의 측정＞
레이저 현미경 (키엔스 (주) 제조, 제품명 VK-X200) 을 사용하여 레이저 주사 모드에 의해 세포 배양 기재의 면외 방향의 두께를 측정함으로써, 경계에 있어서의 요철 높이를 측정하였다.
＜기포 부착 평가＞
세포 배양 기재에 배지 StemFitAK02N (아지노모토 (주) 제조) 을 첨가하고, 현미경으로 관찰함으로써 기포의 부착 유무를 확인하였다.
＜세포 응집 덩어리의 평가＞
(세포 응집 덩어리의 배양)
세포 배양 기재에 배지 StemFitAK02N (아지노모토 (주) 제조) 을 0.2 mL/㎠ 첨가하고, iMatrix-511 용액 ((주) 니피 제조) 을 2.5 μL/mL 의 농도로 첨가하였다. 사세포를 혼합함으로써 전체 세포에 대한 생존 세포의 비율 (세포 생존률) 이 50 ％ 가 되도록 조정한 인간 iPS 세포 201B7 주를 사용하며, 15000 개 (생세포 및 사세포의 합계 세포 수)/㎠ 가 되도록 파종하고, 37 ℃, CO2 농도 5 ％ 의 환경 하에서 배양하였다. 또한, 세포를 파종하고 나서 24 시간 후까지는 배지에 Y-27632 (와코 순약 공업 (주) 제조) (농도 10 μM) 를 첨가하였다. 배양 개시부터 1 일 후 또는 2 일 후에 세포 응집 덩어리의 형성 유무를 확인하였다.
(냉각에 의한 세포 응집 덩어리의 박리)
세포 응집 덩어리의 형성을 확인 후, 실온에서 30 분간 냉각시킴으로써 세포 응집 덩어리의 박리를 확인하였다.
(세포 생존률의 평가)
세포 응집 덩어리의 형성을 확인 후, TrypLE-EDTA 용액 (TrypLE select (ThermoFisher 제조) 과 0.5 mM EDTA 용액 (Invitrogen 사 제조) 의 1 : 1 혼합물) 으로 세포를 처리한 후에 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 싱글 셀로 박리 회수하고, 트리판 블루에 의해 염색함으로써 세포 생존률을 측정하였다.
＜친수성 고분자 및 온도 응답성 고분자의 층두께의 측정＞
기재에 피복된 중합체 (친수성 고분자 및 온도 응답성 고분자) 의 층두께는, 기재의 표면적, 용액 중의 고분자의 농도, 기재에 적하된 용액 체적으로부터, 고분자의 비중을 1 로 하고 단위 면적당의 피복량을 계산함으로써 구하였다.
＜온도 응답성 고분자의 조성의 측정＞
온도 응답성 고분자의 조성은, 핵자기 공명 측정 장치 (니혼 전자 (주) 제조, 상품명 JNM-GSX400) 를 사용한 프로톤 핵자기 공명 분광 (1H-NMR) 스펙트럼 분석, 또는 핵자기 공명 측정 장치 (브루커 제조, 제품명 AVANCEIIIHD500) 를 사용한 카본 핵자기 공명 분광 (13C-NMR) 스펙트럼 분석으로부터 구하였다.
＜온도 응답성 고분자의 분자량 및 분자량 분포의 측정＞
중량 평균 분자량 (Mw), 수 평균 분자량 (Mn) 및 분자량 분포 (Mw/Mn) 는, 겔·퍼미에이션·크로마토그래피 (GPC) 에 의해 측정하였다. GPC 장치는 토소 (주) 제조 HLC-8320GPC 를 사용하며, 칼럼은 토소 (주) 제조 TSKgel Super AWM-H 를 2 개 사용하여, 칼럼 온도를 40 ℃ 로 설정하고, 용리액은 10 mM 트리플루오로아세트산나트륨을 함유하는 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-이소프로판올, 또는 10 mM 브롬화리튬을 포함하는 N,N-디메틸포름아미드를 사용하여 측정하였다. 측정 시료는 1.0 mg/mL 로 조제하여 측정하였다. 분자량의 검량선은, 분자량이 이미 알려진 폴리메타크릴산메틸 (Polymer Laboratories Ltd. 제조) 을 사용하였다.
＜기재의 자가 형광 강도 평가＞
기재에 대해 노광 시간 0.4 초로 350 ㎚, 488 ㎚ 및 647 ㎚ 의 여기 파장을 각각 갖는 광을 조사하고, 형광 화상을 촬영하였다. 이들 화상의 RGB 값을 구하고, 여기 파장 350 ㎚ 에서는 R 값, 여기 파장 488 ㎚ 에서는 G 값, 여기 파장 647 ㎚ 에서는 B 값을 형광 강도로 하였다. 두께 1.2 ㎜ 의 폴리스티렌 판에서 동일한 측정을 실시하고, 두께 1.2 ㎜ 의 폴리스티렌 판에서의 값에 대한 상대값을, 각 기재의 형광 강도로서 표 4 에 나타냈다.
[실시예 1]
친수성 고분자로서 아지드기를 갖는 폴리비닐알코올 (BIOSURFINE(R)-AWP, 토요 고세이 공업 (주) 제조) 을 고형분 농도 0.06 wt％ 로 함유하는 물/에탄올 용액을, 직경 3.5 ㎝ 의 폴리스티렌 (PS) 디쉬 (기재) 에 0.8 mL 적하하고, 실온에서 감압 건조시킨 후, UV 조사함으로써 친수성 고분자를 경화시켜, 친수성 고분자의 층을 형성하였다. 직경 0.2 ㎜ 의 원형의 구멍을 복수 갖는 메탈 마스크를, 친수성 고분자의 층 위에 두고, 플라즈마 조사 장치 ((주) 진공 디바이스 제조, 상품명 플라즈마 이온 봄바디어 PIB-20) 를 사용하여 메탈 마스크 위에서부터 플라즈마 처리 (20 Pa 가스압 하, 도전 전류 20 mA, 조사 시간 30 초간) 를 실시함으로써, 플라즈마 처리한 부분에 세포 접착성 및 세포 증식성을 갖는 영역 ((A) 영역) 을 형성하였다. 또한, 메탈 마스크로 마스크한 부분에 (B) 영역을 형성하였다.
제작된 세포 배양 기재의 구성 및 평가 결과를 표 2 에 나타낸다. 제작된 세포 배양 기재는 친수성 고분자의 층의 층두께가 600 ㎚, (A) 영역의 면적이 0.03 ㎟, (A) 영역과 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이가 32 ㎚ 였다.
이 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시하고, 배양 개시부터 2 일 후에 세포 응집 덩어리의 형성을 확인하였다. 육안 판정에서는, 형성된 세포 응집 덩어리의 사이즈는 균일하였다. 세포 응집 덩어리의 높이/직경의 비는 0.5 로 추정되었다. 또한, 세포 응집 덩어리에 포함되는 세포의 생존률은 89 ％ 로, 높은 세포 생존률이었다. 또한, 배지 첨가 시에 기포는 세포 배양 기재에 부착되지 않았다.
[실시예 2]
실시예 1 에 있어서의 플라즈마 조사 시간을 10 분간으로 변경한 것 이외에는 실시예 1 과 동일하게 하여 세포 배양 기재를 제작하였다.
제작된 세포 배양 기재의 구성 및 평가 결과를 표 2 에 나타낸다. 제작된 세포 배양 기재는 친수성 고분자의 층의 층두께가 600 ㎚, (A) 영역의 면적이 0.03 ㎟, (A) 영역과 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이가 85 ㎚ 였다.
이 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시하고, 배양 개시부터 2 일 후에 세포 응집 덩어리의 형성을 확인하였다. 육안 판정에서는, 형성된 세포 응집 덩어리의 사이즈는 균일하였다. 세포 응집 덩어리의 높이/직경의 비는 0.5 로 추정되었다. 또한, 세포 응집 덩어리에 포함되는 세포의 생존률은 91 ％ 로, 높은 세포 생존률이었다. 또한, 배지 첨가 시에 기포는 세포 배양 기재에 부착되지 않았다.
[실시예 3]
실시예 1 에 있어서의 플라즈마 처리의 가스압을 13 Pa 로 변경한 것, 및 플라즈마 조사 시간을 20 분간으로 변경한 것 이외에는 실시예 1 과 동일하게 하여 세포 배양 기재를 제작하였다.
제작된 세포 배양 기재의 구성 및 평가 결과를 표 2 에 나타낸다. 제작된 세포 배양 기재는 친수성 고분자의 층의 층두께가 600 ㎚, (A) 영역의 면적이 0.03 ㎟, (A) 영역과 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이가 452 ㎚ 였다.
이 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시하고, 배양 개시부터 2 일 후에 세포 응집 덩어리의 형성을 확인하였다. 육안 판정에서는, 형성된 세포 응집 덩어리의 사이즈는 균일하였다. 세포 응집 덩어리의 높이/직경의 비는 0.5 로 추정되었다. 또한, 세포 응집 덩어리에 포함되는 세포의 생존률은 78 ％ 로, 높은 세포 생존률이었다. 또한, 배지 첨가 시에 기포는 세포 배양 기재에 부착되지 않았다.
[실시예 4]
친수성 고분자로서 포스포릴콜린기를 함유하는 폴리머 (Lipidure-CM5210, 니치유 (주) 제조) 를 고형분 농도 0.01 wt％ 로 함유하는 에탄올 용액을, 직경 3.5 ㎝ 의 폴리스티렌 디쉬 (기재) 에 0.08 mL 적하하고, 실온에서 감압 건조시켜, 친수성 고분자의 층을 형성하였다. 직경 0.2 ㎜ 의 원형의 구멍을 복수 갖는 메탈 마스크를, 친수성 고분자의 층 위에 두고, 플라즈마 조사 장치 ((주) 진공 디바이스 제조, 상품명 플라즈마 이온 봄바디어 PIB-20) 를 사용하여 메탈 마스크 위에서부터 플라즈마 처리 (20 Pa 가스압 하, 도전 전류 20 mA, 조사 시간 30 초간) 를 실시함으로써, 플라즈마 처리한 부분에 세포 접착성 및 세포 증식성을 갖는 영역 ((A) 영역) 을 형성하였다. 또한, 메탈 마스크로 마스크한 부분에 (B) 영역을 형성하였다.
제작된 세포 배양 기재의 구성 및 평가 결과를 표 2 에 나타낸다. 제작된 세포 배양 기재는 친수성 고분자의 층의 층두께가 10 ㎚, (A) 영역의 면적이 0.03 ㎟, (A) 영역과 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이가 23 ㎚ 였다.
이 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시하고, 배양 개시부터 2 일 후에 세포 응집 덩어리의 형성을 확인하였다. 육안 판정에서는, 형성된 세포 응집 덩어리의 사이즈는 균일하였다. 세포 응집 덩어리의 높이/직경의 비는 0.5 로 추정되었다. 또한, 세포 응집 덩어리에 포함되는 세포의 생존률은 87 ％ 로, 높은 세포 생존률이었다. 또한, 배지 첨가 시에 기포는 세포 배양 기재에 부착되지 않았다.
[실시예 5]
친수성 고분자의 고형분 농도를 0.05 wt％ 로 변경한 것 이외에는 실시예 4 와 동일하게 하여 세포 배양 기재를 제작하였다.
제작된 세포 배양 기재의 구성 및 평가 결과를 표 2 에 나타낸다. 제작된 세포 배양 기재는 친수성 고분자의 층의 층두께가 50 ㎚, (A) 영역의 면적이 0.03 ㎟, (A) 영역과 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이가 21 ㎚ 였다.
이 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시하고, 배양 개시부터 2 일 후에 세포 응집 덩어리의 형성을 확인하였다. 육안 판정에서는, 형성된 세포 응집 덩어리의 사이즈는 균일하였다. 세포 응집 덩어리의 높이/직경의 비는 0.5 로 추정되었다. 또한, 세포 응집 덩어리에 포함되는 세포의 생존률은 92 ％ 로, 높은 세포 생존률이었다. 또한, 배지 첨가 시에 기포는 세포 배양 기재에 부착되지 않았다.
[실시예 6]
친수성 고분자의 고형분 농도를 0.15 wt％ 로 변경한 것 이외에는 실시예 1 과 동일하게 하여 세포 배양 기재를 제작하였다.
제작된 세포 배양 기재의 구성 및 평가 결과를 표 2 에 나타낸다. 제작된 세포 배양 기재는 친수성 고분자의 층두께가 1500 ㎚, (A) 영역의 면적이 0.03 ㎟, (A) 영역과 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이가 34 ㎚ 였다.
이 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시하고, 배양 개시부터 2 일 후에 세포 응집 덩어리의 형성을 확인하였다. 육안 판정에서는, 형성된 세포 응집 덩어리의 사이즈는 균일하였다. 세포 응집 덩어리의 높이/직경의 비는 0.5 로 추정되었다. 또한, 세포 응집 덩어리에 포함되는 세포의 생존률은 85 ％ 로, 높은 세포 생존률이었다. 또한, 배지 첨가 시에 기포는 세포 배양 기재에 부착되지 않았다.
[실시예 7]
직경 3.5 ㎝ 의 폴리스티렌 (PS) 디쉬 대신에, 막두께 188 ㎛ 의 폴리에틸렌테레프탈레이트 (PET) 필름 (루미러, 토레이 (주) 제조) (기재) 을 사용한 것 이외에는 실시예 1 과 동일하게 하여 세포 배양 기재를 제작하였다. 또, 배양은 제작된 세포 배양 기재를 잘라낸 것을 샬레 안에 고정화시켜 실시하였다.
제작된 세포 배양 기재의 구성 및 평가 결과를 표 2 에 나타낸다. 제작된 세포 배양 기재는 친수성 고분자의 층두께가 600 ㎚, (A) 영역의 면적이 0.03 ㎟, (A) 영역과 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이가 38 ㎚ 였다.
이 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시하고, 배양 개시부터 2 일 후에 세포 응집 덩어리의 형성을 확인하였다. 육안 판정에서는, 형성된 세포 응집 덩어리의 사이즈는 균일하였다. 세포 응집 덩어리의 높이/직경의 비는 0.5 로 추정되었다. 또한, 세포 응집 덩어리에 포함되는 세포의 생존률은 84 ％ 로, 높은 세포 생존률이었다. 또한, 배지 첨가 시에 기포는 세포 배양 기재에 부착되지 않았다.
[실시예 8]
직경 0.2 ㎜ 의 원형의 구멍을 복수 갖는 메탈 마스크 대신에, 직경 1.5 ㎜ 의 원형의 구멍을 복수 갖는 메탈 마스크를 사용한 것 이외에는 실시예 1 과 동일하게 하여 세포 배양 기재를 제작하였다.
제작된 세포 배양 기재의 구성 및 평가 결과를 표 2 에 나타낸다. 제작된 세포 배양 기재는 친수성 고분자의 층두께가 600 ㎚, (A) 영역의 면적이 1.76 ㎟, (A) 영역과 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이가 35 ㎚ 였다.
이 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시하고, 배양 개시부터 2 일 후에 세포 응집 덩어리의 형성을 확인하였다. 육안 판정에서는, 형성된 세포 응집 덩어리의 사이즈는 균일하였다. 세포 응집 덩어리의 높이/직경의 비는 0.5 로 추정되었다. 또한, 세포 응집 덩어리에 포함되는 세포의 생존률은 89 ％ 로, 높은 세포 생존률이었다. 또한, 배지 첨가 시에 기포는 세포 배양 기재에 부착되지 않았다.
이 세포 배양 기재를 사용하며, 인간 iPS 세포의 장 상피 세포로의 분화 유도를 실시하였다. 세포 배양 기재에 1 ％ Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein 용액 (Gibco 제조) 을 1.0 mL/디쉬 첨가하고, 1 시간, 25 ℃ 에서 정치 (靜置) 시켰다. 1 시간 후 1 ％ VTN 용액을 제거하고, 미분화성 유지 배지인 StemFitAK02N (아지노모토 (주) 제조) 을 2.0 mL/디쉬 첨가하고, 그리고 인간 iPS 세포 201B7 주를 3900 개/㎠ 가 되도록 파종하고, 37 ℃, CO2 농도 5 ％ 의 환경 하에서 배양하였다. 또한, 세포의 파종으로부터 24 시간 후까지는 배지에 Y-27632 (후지필름 와코 순약 (주) 제조) (농도 10 μM) 를 첨가하였다. 위상차 현미경 관찰에 의해, 세포 배양 기재 위에 접착된 복수의 원형의 배양체를 확인하였다.
세포의 파종으로부터 24 시간 후, 하기 분화 유도 배지를 2.0 mL/디쉬 첨가하고, 분화 유도를 개시하였다.
장 상피 세포로의 분화 유도 배지의 조성은, 85 ％ KnockOut DMEM (ThermoFisher 제조), 15 ％ KnockOut Serum Replacement XenoFree (ThermoFisher 제조), 0.1 mM 비필수 아미노산 (시그마·알드리치 제조), 2 mM Gluta Max-I Supplement (ThermoFisher 제조), 20 ng/mL 염기성 섬유아 세포 증식 인자 (bFGF, PEPRO TECH 제조), 50μg/mL L(＋)-아스코르브산 (후지필름 와코 순약 (주)), 10 ng/mL 헤레귤린-β-1 (후지필름 와코 순약 (주)), 200 ng/mL Long (R) R3IGF-I (시그마·알드리치 제조), 1 ％ 페니실린-스트렙토마이신 용액 (×100) (후지필름 와코 순약 (주)) 이다. 분화 유도 배지를 첨가한 시점을 "분화 0 일째" 로 하였다. 그 후, "분화 64 일째" 까지 배양 72 시간 간격으로 분화 유도 배지를 교환하였다.
도 5 는, "분화 0 일째", "분화 43 일째" 및 "분화 64 일째" 의 세포의 위상차 현미경 화상이다. 도 5 에 나타내는 바와 같이, "분화 43 일째" 에 소장 유래의 낭포 형성을 확인하고, 또한, "분화 64 일째" 에 낭포가 세포 배양 기재로부터 박리되었다.
"분화 64 일째" 에 있어서, 디쉬 내의 상기 분화 유도 배지를 제거하고, PBS(-) 를 2.0 mL/디쉬 첨가하고 세정하였다. 세정 후, 디쉬에 세포 박리액을 1.0 mL/디쉬 첨가하고, 37 ℃, CO2 농도 5 ％ 의 환경 하에서 5 분간 정치시켰다. 소정 시간 정치시킨 후에, 세포 박리액을 제거하고, 분화 유도 배지를 1.0 mL/디쉬 첨가하고, 세포를 분산시켰다. 얻어진 세포 현탁액을 회수하고, Luna 자동 세포 계수 장치 (로고스 바이오 시스템즈 제조) 를 사용하여 세포 수를 계측하였다.
장 상피 세포로의 분화 유도를 평가하기 위해서, 하우스키핑 유전자 마커 (GAPDH), 장 세포 마커 (CDX2), 흡수 상피 마커 (VIL1), 장 줄기 세포 마커 (LGR5) 를 채용하고, 장 세포 마커 및 장 줄기 세포 마커의 mRNA 의 상대 발현 레벨을 정량하였다. 양성 대조로서 정상 성인의 소장 조직 (R1234226-50, BioChainInstitute) 을 사용하였다.
세포 수 계측에 의해 회수된 "분화 64 일째" 의 세포를, 1.5 mL 샘플 튜브에 각각 1.0 × 106 개/튜브 분취 (分取) 하였다. 원심 분리 (실온, 800×g, 5 분) 를 실시하여, 상청액을 제거하였다. RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN 사 제조) 를 사용하여, 세포로부터 RNA 를 추출하였다. 추출된 RNA 의 농도를 Qubit4 Fluorometer 로 측정하고, 1 μg/6μL 가 되도록 RNase-free Water (다카라 바이오 (주) 제조) 로 농도 조제하였다. 역전사 반응에는, ReverTra Ace qRT Master Mix with gDNA Remover (토요보 (주) 제조) 를 사용하였다. 1 μL 의 5 배 희석 cDNA (역전사 산물의 1/100 에 상당) 에 대하여, 올리고 dT 프라이머, 하기 표 1 에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 (INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES 사 제조) 및 THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (토요보 (주) 제조) 를 사용하여 리얼타임 PCR 해석을 QuantStudio3 리얼타임 PCR 시스템 (Thermo Fisher Scientific(주) 제조) 로 해석하였다. 그 결과, "분화 64 일째" 의 세포에 있어서 장 조직 유래의 CDX2, VIL1 및 LGR5 가 발현되어 있는 것을 확인하였다.
[실시예 9]
친수성 고분자로서 포스포릴콜린기 및 UV 반응성의 관능기를 함유하는 폴리머 (Lipidure-CM5210, 니치유 (주) 제조) 를 고형분 농도 0.05 wt％ 로 함유하는 에탄올 용액을, 직경 3.5 ㎝ 의 폴리스티렌 디쉬 (기재) 에 0.08 mL 적하하고, 실온에서 감압 건조시켜, 친수성 고분자의 층을 형성하였다. 직경 0.2 ㎜ 의 원형의 구멍을 복수 갖는 메탈 마스크를, 친수성 고분자의 층 위에 두고, 플라즈마 조사 장치 ((주) 진공 디바이스 제조, 상품명 플라즈마 이온 봄바디어 PIB-20) 를 사용하여 메탈 마스크 위에서부터 플라즈마 처리 (20 Pa 가스압 하, 도전 전류 20 mA, 조사 시간 30 초간) 를 실시함으로써, 플라즈마 처리한 부분에 세포 접착성 및 세포 증식성을 갖는 영역 ((A) 영역) 을 형성하였다. 또한, 메탈 마스크로 마스크한 부분에 (B) 영역을 형성하였다.
제작된 세포 배양 기재의 구성 및 평가 결과를 표 2 에 나타낸다. 제작된 세포 배양 기재는 친수성 고분자의 층의 층두께가 50 ㎚, (A) 영역의 면적이 0.03 ㎟, (A) 영역과 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이가 33 ㎚ 였다.
이 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시하고, 배양 개시부터 2 일 후에 세포 응집 덩어리의 형성을 확인하였다. 육안 판정에서는, 형성된 세포 응집 덩어리의 사이즈는 균일하였다. 세포 응집 덩어리의 높이/직경의 비는 0.5 로 추정되었다. 또한, 세포 응집 덩어리에 포함되는 세포의 생존률은 86 ％ 로, 높은 세포 생존률이었다. 또한, 배지 첨가 시에 기포는 세포 배양 기재에 부착되지 않았다.
[실시예 10]
실시예 1 과 동일하게 하여 제작된 세포 배양 기재의 표면 (친수성 고분자를 함유하는 층이 형성되어 있는 측) 을, 수불용성 블록 세그먼트 및 온도 응답성 블록 세그먼트를 갖는 블록 공중합체 (온도 응답성 고분자) 로 피복하고, 세포 배양 기재를 제작하였다. 구체적으로는, 시험관에, 4-시아노-4-[(도데실술파닐티오카르보닐)술파닐]펜타노익애씨드 0.40 g (0.1 mmol), n-부틸메타크릴레이트 7.11 g (50 mmol), 아조비스(이소부티로니트릴) 33 mg (0.2 mmol) 을 첨가하고, 1,4-디옥산 50 mL 에 용해시켰다. 질소 버블링에 의해 30 분 탈기를 실시한 후, 70 ℃ 에서 24 시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응 용매를 로터리 이배퍼레이터로 감압 증류 제거하고, 반응 용액을 농축시켰다. 농축액을 메탄올 250 mL 에 붓고, 석출된 황색 유상 물질을 회수하여 감압 건조시켜, n-부틸메타크릴레이트 중합체를 얻었다.
시험관에, 얻어진 상기 n-부틸메타크릴레이트 중합체 0.9 g (0.3 mmol), N-이소프로필아크릴아미드 8.14 g (72 mmol), 아조비스이소부티로니트릴 5 mg (0.03 mmol) 을 첨가하고, 1,4-디옥산 15 mL 에 용해시켰다. 질소 버블링에 의해 30 분 탈기를 실시한 후, 65 ℃ 에서 17 시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응 용매를 아세톤으로 희석하고, 헥산 500 mL 에 붓고, 석출된 고체를 회수하여 감압 건조시켰다. 또한, 아세톤에 재차 용해시키고, 순수 500 mL 에 붓고, 석출된 고체를 회수하여 감압 건조시켜, N-이소프로필아크릴아미드와 n-부틸메타크릴레이트의 블록 공중합체를 얻었다. 합성된 블록 공중합체를 에탄올에 0.5 wt％ 로 용해시키고, 세포 배양 기재의 표면 (친수성 고분자를 함유하는 층이 형성되어 있는 측) 에 2000 rpm 으로 스핀 코트하였다.
또, 블록 공중합체의 구성 단위 비율은 n-부틸메타크릴레이트 4 wt％, N-이소프로필아크릴아미드 96 wt％ 이고, 블록 공중합체의 수 평균 분자량 (Mn) 은 7.7 만이었다. 블록 공중합체 (온도 응답성 고분자) 층의 층두께는, 폴리스티렌 디쉬 위에 블록 공중합체 (온도 응답성 고분자) 를 직접 피복한 경우의 검량선으로부터 구하였다. 그 결과, 블록 공중합체 (온도 응답성 고분자) 층의 층두께는 25 ㎚ 였다.
제작된 세포 배양 기재의 구성 및 평가 결과를 표 2 에 나타낸다. 제작된 세포 배양 기재는 친수성 고분자의 층의 층두께가 600 ㎚, (A) 영역의 면적이 0.03 ㎟, (A) 영역과 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이가 4 ㎚ 였다.
이 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시하고, 배양 개시부터 2 일 후에 세포 응집 덩어리의 형성을 확인하였다. 육안 판정에서는, 형성된 세포 응집 덩어리의 사이즈는 균일하였다. 세포 응집 덩어리의 높이/직경의 비는 0.5 로 추정되었다. 세포 응집 덩어리는 세포 배양 기재를 냉각시킴으로써 박리되었다. 또한, 세포 응집 덩어리에 포함되는 세포의 생존률은 88 ％ 로, 높은 세포 생존률이었다. 또한, 배지 첨가 시에 기포는 세포 배양 기재에 부착되지 않았다.
[실시예 11]
실시예 1 과 동일하게 하여 제작된 세포 배양 기재의 표면 (친수성 고분자를 함유하는 층이 형성되어 있는 측) 을, 수불용성의 단량체 단위와 온도 응답성의 단량체 단위로 이루어지는 랜덤 공중합체로 피복하고, 세포 배양 기재를 제작하였다. 구체적으로는, 시험관에, 4-시아노-4-[(도데실술파닐티오카르보닐)술파닐]펜타노익애씨드 0.40 g (0.1 mmol), n-부틸메타크릴레이트 7.11 g (50 mmol), 아조비스(이소부티로니트릴) 33 mg (0.2 mmol), N-이소프로필아크릴아미드 5.65 g (50 mmol), 아조비스이소부티로니트릴 5 mg (0.03 mmol) 을 첨가하고, 1,4-디옥산 15 mL 에 용해시켰다. 질소 버블링에 의해 30 분 탈기를 실시한 후, 70 ℃ 에서 24 시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응 용매를 아세톤으로 희석하고, 헥산 500 mL 에 붓고, 석출된 고체를 회수하여 감압 건조시켰다. 또한, 아세톤에 재차 용해시키고, 순수 500 mL 에 붓고, 석출된 고체를 회수하여 감압 건조시켜, N-이소프로필아크릴아미드와 n-부틸메타크릴레이트의 랜덤 공중합체를 얻었다. 얻어진 랜덤 공중합체를 에탄올에 0.5 wt％ 로 용해시키고, 세포 배양 기재의 표면 (친수성 고분자를 함유하는 층이 형성되어 있는 측) 에 2000 rpm 으로 스핀 코트하였다.
또, 랜덤 공중합체의 구성 단위 비율은 n-부틸메타크릴레이트 54 wt％, N-이소프로필아크릴아미드 46 wt％ 이고, 랜덤 공중합체의 수 평균 분자량 (Mn) 은 15.8 만이었다. 랜덤 공중합체 층의 층두께는, 폴리스티렌 디쉬 위에 랜덤 공중합체를 직접 피복한 경우의 검량선으로부터 구하였다. 그 결과, 랜덤 공중합체 층의 층두께는 25 ㎚ 였다. 또, 랜덤 공중합체 층은, 온도 응답성 고분자에 의한 층에는 해당되지 않지만, 표 2 에서는, 편의상, 온도 응답성 고분자에 의한 층의 란에 기재되어 있다.
제작된 세포 배양 기재의 구성 및 평가 결과를 표 2 에 나타낸다. 제작된 세포 배양 기재는 친수성 고분자의 층의 층두께가 600 ㎚, (A) 영역의 면적이 0.03 ㎟, (A) 영역과 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이가 4 ㎚ 였다.
이 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시하고, 배양 개시부터 2 일 후에 세포 응집 덩어리의 형성을 확인하였다. 육안 판정에서는, 형성된 세포 응집 덩어리의 사이즈는 균일하였다. 세포 응집 덩어리의 높이/직경의 비는 0.5 로 추정되었다. 세포 응집 덩어리는 세포 배양 기재를 냉각시키는 것으로는 박리되지 않았다. 또한, 세포 응집 덩어리에 포함되는 세포의 생존률은 85 ％ 로, 높은 세포 생존률이었다. 또한, 배지 첨가 시에 기포는 세포 배양 기재에 부착되지 않았다.
[실시예 12]
막두께 180 ㎛ 의 폴리에틸렌테레프탈레이트 (PET) 필름 (코스모샤인, 토요보 (주) 제조) 에 플라즈마 처리 (20 Pa 가스압 하, 도전 전류 20 mA, 조사 시간 30 초간) 를 실시하였다. 친수성 고분자로서 아지드기를 갖는 폴리비닐알코올 (BIOSURFINE(R)-AWP, 토요 고세이 공업 (주) 제조) 을 고형분 농도 0.1 wt％ 로 함유하는 물/에탄올 용액을, 상기 PET 필름의 플라즈마 처리면에 2000 rpm 으로 스핀 코트하였다. 직경 0.2 ㎜ 의 원형의 크롬 증착 영역을 복수 갖는 석영 마스크를, 친수성 고분자의 층 위에 두고, 고압 수은등을 사용하여 석영 마스크 위에서부터 10 초간 UV 조사를 실시하였다. 물/에탄올＝20/80 의 혼합 용매로 세정하여, UV 미조사의 친수성 폴리머를 용해 제거함으로써, 세포 접착성 및 세포 증식성을 갖는 영역 ((A) 영역) 을 형성하였다. 또한, UV 조사 부분에 (B) 영역을 형성하였다. 이 PET 필름을 바닥면이 뚫려 있는 웰 플레이트 (관통 구멍을 갖는 판) 와 첩합시켰다.
제작된 세포 배양 기재의 구성 및 평가 결과를 표 2 에 나타낸다. 제작된 세포 배양 기재는 친수성 고분자의 층의 층두께가 50 ㎚, (A) 영역의 면적이 0.03 ㎟, (A) 영역과 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이가 50 ㎚ 였다.
이 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시하고, 배양 개시부터 2 일 후에 세포 응집 덩어리의 형성을 확인하였다. 육안 판정에서는, 형성된 세포 응집 덩어리의 사이즈는 균일하였다. 세포 응집 덩어리의 높이/직경의 비는 0.5 로 추정되었다. 또한, 세포 응집 덩어리에 포함되는 세포의 생존률은 90 ％ 로, 높은 세포 생존률이었다. 또한, 배지 첨가 시에 기포는 세포 배양 기재에 부착되지 않았다.
[참고예 1]
실시예 12 의 세정 공정에서 사용하는 용매로서 물/에탄올＝20/80 의 혼합 용매 대신에, 순수, 물/에탄올＝80/20 의 혼합 용매, 물/에탄올＝50/50 의 혼합 용매, 에탄올을 사용하고, 그 외에는 실시예 12 와 동일하게 하여 세포 배양 기재를 제작하였다.
이들 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시하여 비교한 결과를 표 3 에 나타낸다. 세정 공정에서 물/에탄올 혼합 용매를 사용함으로써 (A) 영역의 세포 접착성 및 세포 증식성을 높일 수 있음을 알 수 있었다.
[참고예 2]
실시예 12 의 기재로서 PET 필름 대신에 두께 1.2 ㎜ 의 PS 판, 두께 0.1 ㎜ 의 폴리카보네이트 (PC) 필름 (이우필론, 미츠비시 가스 (주) 제조), 폴리에틸렌 (PE) 필름, 폴리프로필렌 (PP) 필름, 퍼머녹스 슬라이드 챔버 (ThermoScientific 제조) 를 사용하고, 그 외에는 실시예 12 와 동일하게 하여 세포 배양 기재를 제작하였다.
이들 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시하고, 배양된 세포를 확대 배율 40 배로 위상차 관찰하였다. 또한, 형광 염색하여 세포를 관찰하고, 비교한 결과를 표 4 에 나타낸다. 기재가 지환식 탄화수소기 또는 방향족 탄화수소기를 구성 단위에 포함하는 고분자를 가짐으로써 (A) 영역의 세포 증식성이 우수한 것을 알 수 있었다. 또, 기재의 굴절률이 1.4 ∼ 1.6, 두께가 0.01 ∼ 0.5 ㎜ 임으로써, 세포의 명료한 위상차 이미지가 얻어지는 것을 알 수 있었다. 또한, 기재의 자가 형광이 낮음으로써, 세포의 명료한 형광 이미지가 얻어지는 것을 알 수 있었다.
[비교예 1]
친수성 고분자의 고형분 농도를 0.003 wt％ 로 변경한 것 이외에는 실시예 4 와 동일하게 하여 세포 배양 기재를 제작하였다.
제작된 세포 배양 기재의 구성 및 평가 결과를 표 2 에 나타낸다. 제작된 세포 배양 기재는 친수성 고분자의 층의 층두께가 3 ㎚, 플라즈마 처리한 영역의 면적이 0.03 ㎟, 플라즈마 처리한 영역과 플라즈마 처리하지 않은 영역의 경계에 있어서의 요철 높이가 25 ㎚ 였다.
이 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시했지만, 세포 배양 기재의 전체면에서 세포가 접착 및 증식하여, 세포 응집 덩어리는 형성되지 않았다.
[비교예 2]
친수성 고분자의 고형분 농도를 3 wt％ 로 변경한 것 이외에는 실시예 4 와 동일하게 하여 세포 배양 기재를 제작하였다.
제작된 세포 배양 기재의 구성 및 평가 결과를 표 2 에 나타낸다. 제작된 세포 배양 기재는 친수성 고분자의 층의 층두께가 3000 ㎚, 플라즈마 처리한 영역의 면적이 0.03 ㎟, 플라즈마 처리한 영역과 플라즈마 처리하지 않은 영역의 경계에 있어서의 요철 높이가 38 ㎚ 였다.
이 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시했지만, 세포는 접착 및 증식하지 않았기 때문에, 세포 응집 덩어리는 형성되지 않았다.
[비교예 3]
직경 3.5 ㎝ 의 폴리스티렌 (PS) 디쉬의 내면을 플라즈마 조사 장치 ((주) 진공 디바이스 제조, 상품명 플라즈마 이온 봄바디어 PIB-20) 를 사용하여 플라즈마 처리 (20 Pa 가스압 하, 도전 전류 20 mA, 조사 시간 30 초간) 하였다. 친수성 고분자로서 아지드기를 갖는 폴리비닐알코올 (BIOSURFINE(R)-AWP, 토요 고세이 공업 (주) 제조) 을 고형분 농도 0.08 wt％ 로 함유하는 에탄올 용액을, 플라즈마 처리한 PS 디쉬에 0.8 mL 적하하고, 실온에서 감압 건조시켜, 친수성 고분자의 막을 형성하였다. 직경 0.2 ㎜ 의 원형의 흑색 패턴을 복수 갖는 크롬 마스크를 친수성 고분자의 막 위에 두고, UV 조사함으로써 친수성 고분자의 일부를 경화시켰다. 이어서, 순수로 복수 회 세정함으로써 미경화의 친수성 고분자를 제거하였다. 제작된 세포 배양 기재의 구성 및 평가 결과를 표 2 에 나타낸다.
이 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시하고, 배양 개시부터 1 일 후에 세포 응집 덩어리의 형성을 확인했지만, 세포 응집 덩어리에 포함되는 세포의 생존률은 65 ％ 로, 세포 생존률이 낮은 것이었다.
[비교예 4]
직경 3.5 ㎝ 의 폴리스티렌 (PS) 디쉬의 내면을 플라즈마 조사 장치 ((주) 진공 디바이스 제조, 상품명 플라즈마 이온 봄바디어 PIB-20) 를 사용하여 플라즈마 처리 (20 Pa 가스압 하, 도전 전류 20 mA, 조사 시간 30 초간) 하였다. 표면 보호 필름 (닛토 덴코 (주) 제조, E-MASK) 에 레이저 가공에 의해 직경 0.2 ㎜ 의 원형의 구멍을 복수 형성하고, 이 표면 보호 필름을 플라즈마 처리한 PS 디쉬의 내면에 첩부시켰다.
제작된 세포 배양 기재의 구성 및 평가 결과를 표 2 에 나타낸다. 제작된 세포 배양 기재는 친수성 고분자의 층을 갖지 않으며, 플라즈마 처리한 영역 (표면 보호 필름으로 피복되어 있지 않은 영역) 의 면적이 0.03 ㎟, 플라즈마 처리한 영역 (표면 보호 필름으로 피복되어 있지 않은 영역) 과 표면 보호 필름으로 피복되어 있는 영역의 경계에 있어서의 요철 높이가 약 58 ㎛ 였다.
이 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시하고, 배양 개시부터 1 일 후에 세포 응집 덩어리의 형성을 확인했지만, 세포 응집 덩어리에 포함되는 세포의 생존률은 53 ％ 로, 세포 생존률이 낮은 것이었다. 또한, 배지 첨가 시에 세포 배양 기재에 기포가 부착되어 있었다.
[비교예 5]
플라즈마 처리를 실시하지 않은 것 이외에는 실시예 1 과 동일하게 하여 세포 배양 기재를 제작하였다. 제작된 세포 배양 기재의 구성 및 평가 결과를 표 2 에 나타낸다. 이 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시했지만, 세포는 접착 및 증식하지 않았기 때문에, 세포 응집 덩어리는 형성되지 않았다.
[비교예 6]
친수성 고분자를 사용하지 않은 것 (친수성 고분자의 층을 형성하지 않은 것) 이외에는 실시예 1 과 동일하게 하여 세포 배양 기재를 제작하였다. 제작된 세포 배양 기재의 구성 및 평가 결과를 표 2 에 나타낸다. 이 세포 배양 기재 위에서 인간 iPS 세포의 배양 평가를 실시했지만, 세포 배양 기재의 전체면에서 세포가 접착 및 증식하여, 세포 응집 덩어리는 형성되지 않았다.
Figure pct00005
Figure pct00006
A…(A) 영역
B…(B) 영역
H…(A) 영역과 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이
1…기재
2…친수성 고분자를 함유하는 층
10, 11…세포 배양 기재
20…칸막이판
SEQUENCE LISTING <110> TOSOH CORPORATION <120> CELL CULTURE SUBSTRATE, METHOD FOR PRODUCING THE SAME, METHOD FOR INDUCING DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT STEM CELL AND KIT FOR CELL CULTURE <130> FP22-0321-00 <150> P2021-075266 <151> 2021-04-27 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 acatcgctca gacaccatgt gtagttgagg tcaatgaagg g 41 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gctggagaag gagtttcact acctttgctc tgcggttctg a 41 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ttgccacaat tccctgagat gatgttgaga gagcctttga ct 42 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ggaatgtttc aggctcaaga tgtcaagcag gtgttcacag g 41

Claims (21)

  1. 기재와, 상기 기재의 표면의 적어도 일부를 피복하는 층두께 5 ∼ 2000 ㎚ 의 친수성 고분자를 함유하는 층을 구비하고,
    상기 친수성 고분자는, 포스포릴콜린기 또는 수산기를 포함하고,
    하기 (A) 영역 및 하기 (B) 영역을 가지며,
    상기 (A) 영역과 상기 (B) 영역의 경계에 있어서의 요철 높이는 1 ∼ 500 ㎚ 인, 세포 배양 기재.
    (A) 세포 접착성 및 세포 증식성을 갖는 면적 0.001 ∼ 5 ㎟ 의 섬형의 영역
    (B) 상기 (A) 영역에 인접하며, 세포 접착성 또는 세포 증식성을 갖지 않는 영역
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 친수성 고분자가, 하기 일반식 (1) 로 나타내는 화합물, 하기 일반식 (2) 로 나타내는 화합물, 또는 하기 일반식 (3) 으로 나타내는 화합물을 포함하는, 세포 배양 기재.

    [일반식 (1) 중, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸기를 나타내고, R3 은 수소 원자 또는 임의의 유기기를 나타내고, m 및 n 은 각각 독립적으로 양의 정수를 나타낸다.]

    [일반식 (2) 중, R4, R5 및 R6 은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸기를 나타내고, R7 은 수소 원자 또는 임의의 유기기를 나타내고, x, y 및 z 는 각각 독립적으로 양의 정수를 나타낸다.]

    [일반식 (3) 중, R8 및 R9 는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸기를 나타내고, R10 은 수소 원자 또는 임의의 유기기를 나타내고, a 및 b 는 각각 독립적으로 양의 정수를 나타낸다.]
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 친수성 고분자가, UV 반응성의 관능기 또는 UV 반응 후의 잔기를 갖는 단량체 단위를 포함하는, 세포 배양 기재.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (A) 영역에 대한 XPS 측정의 C1s 스펙트럼에 있어서의 287 eV 의 피크 강도/285 eV 의 피크 강도의 비가, 상기 (B) 영역에 대한 XPS 측정의 C1s 스펙트럼에 있어서의 287 eV 의 피크 강도/285 eV 의 피크 강도의 비보다 0.05 이상 큰, 세포 배양 기재.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 친수성 고분자를 함유하는 층의 표면에, 층두께 1 ∼ 100 ㎚ 의 온도 응답성 고분자를 함유하는 층을 추가로 구비하고,
    상기 온도 응답성 고분자는, 수불용성 블록 세그먼트 및 온도 응답성 블록 세그먼트를 포함하는 블록 공중합체인, 세포 배양 기재.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 수불용성 블록 세그먼트 및 상기 온도 응답성 블록 세그먼트의 총 중량에 대한 상기 온도 응답성 블록 세그먼트의 중량의 비율이 90 중량％ 초과인, 세포 배양 기재.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기재의 굴절률이 1.4 ∼ 1.6 이며, 또한 상기 기재의 두께가 0.01 ∼ 0.5 ㎜ 인, 세포 배양 기재.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기 파장 350 ㎚, 488 ㎚ 및 647 ㎚ 에서 각각 여기된 상기 기재의 형광 강도가, 동일한 여기 파장에서 여기된, 두께 1.2 ㎜ 의 폴리스티렌 판의 형광 강도보다 작은, 세포 배양 기재.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (A) 영역의 면적이, 0.005 ∼ 0.2 ㎟ 이고,
    상기 (A) 영역의 수가, 상기 (A) 영역 및 상기 (B) 영역의 합계 면적을 기준으로 하여 200 ∼ 1000 개/㎠ 인, 세포 배양 기재.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (A) 영역의 면적이, 0.2 ∼ 2 ㎟ 이고,
    상기 (A) 영역의 수가, 상기 (A) 영역 및 상기 (B) 영역의 합계 면적을 기준으로 하여 3 ∼ 15 개/㎠ 인, 세포 배양 기재.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (A) 영역끼리의 최소 거리가, 500 ∼ 10000 ㎛ 인, 세포 배양 기재.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    다능성 줄기 세포로부터 3 배엽 세포로의 분화 유도용인, 세포 배양 기재.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기재가 폴리카보네이트 또는 시클로올레핀폴리머로 형성되는, 세포 배양 기재.
  14. (1) 기재의 표면의 적어도 일부를 UV 반응성의 친수성 고분자를 함유하는 조성물로 피복하고, 상기 친수성 고분자를 함유하는 층을 형성하는 공정,
    (2) 상기 친수성 고분자를 함유하는 층에 UV 조사를 실시하고, 상기 친수성 고분자를 함유하는 층을 상기 기재의 표면에 고정화시키는 공정, 및
    (3) 고정화된 상기 친수성 고분자를 함유하는 층의 표면의 일부에 플라즈마 처리를 실시하고, 플라즈마 처리를 실시한 부분에 상기 (A) 영역을 형성하는 공정을 구비하는, 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 배양 기재의 제조 방법.
  15. (1') 반복 단위에 지환식 탄화수소기 또는 방향족 탄화수소기를 포함하는 고분자로 형성되는 기재를 사용하며, 상기 기재의 표면에 플라즈마 처리를 실시하고, 플라즈마 처리를 실시한 부분에 상기 (A) 영역을 형성하는 공정,
    (2') 상기 기재의 표면의 적어도 일부를 UV 반응성의 친수성 고분자를 함유하는 조성물로 피복하고, 상기 친수성 고분자를 함유하는 층을 형성하는 공정,
    (3') 상기 친수성 고분자를 함유하는 층의 일부에 UV 조사를 실시하고, 상기 친수성 고분자를 함유하는 층의 일부를 상기 기재의 표면에 고정화시키는 공정, 및
    (4') 상기 친수성 고분자를 용매로 세정하고, 표면에 고정화되어 있지 않은 친수성 고분자를 용해시켜 상기 기재의 표면으로부터 제거하는 공정을 구비하는, 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 배양 기재의 제조 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 공정 (4') 에서 사용하는 용매가, 물 및 알코올을 함유하는, 세포 배양 기재의 제조 방법.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (4) 상기 공정 (3) 또는 (4') 후에, 면내 방향의 단면적이 0.05 ∼ 100 ㎠ 인 관통 구멍을 갖는 판을, 상기 기재의 상기 친수성 고분자를 함유하는 층으로 피복한 면측에서 상기 기재와 첩합시키는 공정을 추가로 구비하는, 제조 방법.
  18. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (5) 상기 공정 (3) 또는 (4') 후에, 플라즈마 처리를 실시한 상기 친수성 고분자를 함유하는 층의 표면을, 온도 응답성 고분자를 함유하는 조성물로 피복하고, 상기 온도 응답성 고분자를 함유하는 층을 형성하는 공정을 추가로 구비하는, 제조 방법.
  19. (i) 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 배양 기재에 다능성 줄기 세포를 파종하는 공정,
    (ii) 상기 다능성 줄기 세포를 배양하여, 높이/직경의 비가 0.2 ∼ 0.8 인 반구형의 세포 응집 덩어리를 형성하는 공정, 및
    (iii) 상기 세포 응집 덩어리를 분화 유도하여, 3 배엽 세포의 세포 응집 덩어리를 형성하는 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포의 분화 유도 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    하기 (iv) 에 나타내는 공정을 추가로 구비하는, 다능성 줄기 세포의 분화 유도 방법.
    (iv) Wnt 단백질, 골 형성 단백질 (Bone morphogenetic protein), 인슐린 유사 성장 인자 및 액티빈으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 분화 유도 인자를 포함하는 배지 중에서 세포 응집 덩어리를 배양하여, 장 상피 세포가 갖는 마커를 발현시키는 공정
  21. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 배양 기재와, 수불용성 블록 세그먼트 및 온도 응답성 블록 세그먼트를 포함하는 블록 공중합체 또는 상기 블록 공중합체를 함유하는 코팅제를 포함하는, 세포 배양 키트.
KR1020237035105A 2021-04-27 2022-04-20 세포 배양 기재 및 그 제조 방법, 다능성 줄기 세포의 분화 유도 방법, 그리고 세포 배양 키트 KR20230156412A (ko)

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