CN117203320A - 细胞培养基材及其制造方法、多能干细胞的分化诱导方法、以及细胞培养试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种细胞培养基材,其具备基材和覆盖该基材的表面的至少一部分的层厚为5~2000nm的含有亲水性高分子的层,亲水性高分子包含磷酸胆碱基或羟基,所述细胞培养基材具有下述(A)区域及下述(B)区域,(A)区域与(B)区域的边界的凹凸高度为1~500nm。(A)具有细胞粘附性及细胞增殖性的面积为0.001~5mm2的岛状的区域。(B)与前述(A)区域邻接且不具有细胞粘附性或细胞增殖性的区域。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养基材及其制造方法、多能干细胞的分化诱导方法、以及细胞培养试剂盒。
背景技术
胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)等多能干细胞是具有分化成生物体各种组织的能力(分化全能性)的细胞,作为用于再生医疗领域、新药筛选的细胞源引起了极大关注。为了将多能干细胞用于再生医疗、新药筛选,需要由多能干细胞分化成目标细胞,此时需要形成多能干细胞的细胞聚集块。另外已知,多能干细胞虽然能够分化成各种细胞,但是根据分化后的细胞的种类,最佳细胞聚集块的尺寸是不同的,期望控制尺寸、制作尺寸更均匀的细胞聚集块。
作为形成细胞聚集块的方法,以往已知通过使用不粘附多能干细胞的基材而使多能干细胞自发地形成聚集体的方法(例如,参照专利文献1。)。该方法虽然细胞聚集块的量产性优异,但是存在不能得到尺寸均匀的细胞聚集块的问题。
作为形成尺寸均匀的细胞聚集块的方法,已知使用在表面上设有微细凹凸的细胞培养基材的方法(例如,参照专利文献2。)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开平8-140673号公报
专利文献2:日本特开2015-073520号公报
发明内容
发明要解决的问题
专利文献2公开的设有微细凹凸的细胞培养基材缺乏量产性,有不适合于形成大量细胞聚集块的用途的问题。另外,由于将细胞强制聚集在微细凹凸内,因此有细胞聚集块中容易混入死细胞的问题。另外,本发明人们发现了如下课题:使培养基与具有微细凹凸的细胞培养基材接触时,表面的微细凹凸容易摄入气泡,需要在培养开始前进行气泡除去操作。为了除去气泡,通常需要使用移液器反复进行培养基的吸入和吐出,有操作性差的问题。
本发明的课题在于,提供能够形成细胞聚集块且能够提高细胞聚集块中的细胞的生存率、培养时不需要气泡除去操作的细胞培养基材及其制造方法。本发明的另一课题在于,提供向三胚层细胞的分化诱导效率优异的、使用该细胞培养基材的多能干细胞的分化诱导方法。
用于解决问题的方案
本发明涉及细胞培养基材,其具备基材和覆盖该基材的表面的至少一部分的层厚5~2000nm的含有亲水性高分子的层,上述亲水性高分子包含磷酸胆碱基或羟基,所述细胞培养基材具有下述(A)区域及下述(B)区域,(A)区域与(B)区域的边界的凹凸高度为1~500nm。
(A)具有细胞粘附性及细胞增殖性的面积为0.001~5mm2的岛状的区域。
(B)与(A)区域邻接且不具有细胞粘附性或细胞增殖性的区域
本发明另外涉及上述细胞培养基材的制造方法,其具备下述工序:(1)将基材的表面的至少一部分用UV反应性的含有亲水性高分子的组合物覆盖,形成含有亲水性高分子的层的工序;(2)对含有亲水性高分子的层进行UV照射,将含有亲水性高分子的层固定化于基材的表面的工序;及(3)对经固定化的含有亲水性高分子的层的表面的一部分进行等离子体处理,在进行了等离子体处理的部分形成(A)区域的工序。
本发明另外涉及上述细胞培养基材的制造方法,其具备下述工序:(1’)使用由在重复单元中包含芳香族烃基的高分子形成的基材,对上述基材的表面进行等离子体处理,在进行了等离子体处理的部分形成上述(A)区域的工序;(2’)将上述基材的表面的至少一部分用UV反应性的含有亲水性高分子的组合物覆盖,形成上述含有亲水性高分子的层的工序;(3’)对上述含有亲水性高分子的层的一部分进行UV照射,将上述含有亲水性高分子的层的一部分固定化于上述基材的表面的工序;及(4’)用溶剂对上述亲水性高分子进行清洗,将未固定化于表面的亲水性高分子溶解、从上述基材的表面除去的工序。
本发明进一步涉及多能干细胞的分化诱导方法,其包括下述工序:(i)在上述细胞培养基材中播种多能干细胞的工序;(ii)对多能干细胞进行培养,形成高度/直径的比为0.2~0.8的半球状的细胞聚集块的工序;及(iii)对细胞聚集块进行分化诱导,形成三胚层细胞的细胞聚集块的工序。
本发明此外还涉及细胞培养试剂盒,其包含:嵌段共聚物或含有上述嵌段共聚物的涂覆剂、以及上述细胞培养基材,所述嵌段共聚物包含水不溶性嵌段链段及温度响应性嵌段链段。
发明的效果
根据本发明,可以提供能够形成细胞聚集块且能够提高细胞聚集块中的细胞生存率、培养时不需要气泡除去操作的细胞培养基材及其制造方法。根据本发明,另外可以提供使用该细胞培养基材的、多能干细胞的分化诱导方法。
附图说明
图1为一实施方式所涉及的细胞培养基材的示意图(剖视图)。
图2为一实施方式所涉及的制造方法中的工序(1)之后的、在表面形成有含有亲水性高分子的层的基材的示意图(立体图)。
图3为一实施方式所涉及的制造方法中的工序(3)之后的细胞培养基材的示意图(立体图)。
图4为一实施方式所涉及的制造方法中的工序(4)之后的细胞培养基材的示意图(立体图)。
图5为人iPS细胞向肠上皮细胞的分化诱导试验(实施例8)中的“分化第0天”、“分化第43天”及“分化第64天”的细胞的相位差显微镜图像。
具体实施方式
以下对用于实施本发明的方式进行详细说明。需要说明的是,本发明不限于以下实施方式,可以在能得到上述效果的范围内对以下实施方式进行变形而实施。
本说明书中,“细胞聚集块”是指:多个细胞聚集而形成的、细胞的三维聚集块。三维聚集块的形状可以为球状等椭球体的形状,也可以为半球状等形状。这些形状可以是片状的细胞折叠而形成的有间隙的形状,也可以为中空的形状。
本说明书中,“温度响应性”表示:亲水性/疏水性的程度随着温度的改变而发生改变。进而,将亲水性/疏水性的程度发生改变的边界温度记作“响应温度”。
本说明书中,“生物体来源物质”是指:作为存在于生物体内的物质及与该物质同等的物质的、通过化学方式合成的物质。存在于生物体内的物质可以为天然物质,也可以为通过基因重组技术等人工合成的物质。生物体来源物质没有特别限定,可列举例如:作为构成生物体的基本材料的核酸、蛋白质及多糖以及作为这些的构成要素的核苷酸、核苷、氨基酸及各种糖、以及脂质、维生素及激素。
本说明书中,“细胞粘附性”表示:在培养温度下容易粘附于基材或细胞培养基材,“具有细胞粘附性”表示:细胞在培养温度下能够直接或借助于生物体来源物质粘附于基材或细胞培养基材。另外,“不具有细胞粘附性”表示:在培养温度下,细胞不能粘附于基材或细胞培养基材。
本说明书中,“细胞增殖性”表示:在培养温度下细胞容易增殖,“具有细胞增殖性”表示:在培养温度下细胞能够增殖。另外,“不具有细胞增殖性”表示:在培养温度下细胞不能增殖。“细胞增殖性高”表示:以同样的培养周期进行比较时,增殖出更多的细胞。
本说明书中,“三胚层细胞”是指:选自由内胚层细胞、外胚层细胞及中胚层细胞组成的组中的至少一种。
本实施方式所涉及的细胞培养基材具备基材和覆盖基材的表面的至少一部分的层厚5~2000nm的含有亲水性高分子的层。在此,亲水性高分子包含磷酸胆碱基或羟基。另外,本实施方式所涉及的细胞培养基材具有下述(A)区域及下述(B)区域,并且(A)区域与(B)区域的边界的凹凸高度为1~500nm。
(A)具有细胞粘附性及细胞增殖性的面积为0.001~5mm2的岛状的区域。
(B)与(A)区域邻接且不具有细胞增殖性的区域。
图1为一实施方式所涉及的细胞培养基材的示意图(剖视图)。图1所示的细胞培养基材10具备基材1和覆盖基材1的表面的含有亲水性高分子的层2(层厚例如为5~2000nm。)。图1中,A及B分别表示(A)区域及(B)区域。另外,图1中,H表示(A)区域与(B)区域的边界的凹凸高度。需要说明的是,含有亲水性高分子的层2的层厚是指:基材1与含有亲水性高分子的层2相接触的面至(B)区域(图1中B所表示的区域)的表面的距离。另外,图1所示的细胞培养基材10的、(A)区域的表面为含有亲水性高分子的层,但是不限于此,例如(A)区域的表面也可以为基材1。
作为本实施方式所涉及的细胞培养基材中使用的基材,没有特别限定,优选用选自由聚苯乙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、环烯烃聚合物、乙酸纤维素、硝酸纤维素及聚偏氟乙烯组成的组中的至少1种来形成,更优选用选自由聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯及环烯烃聚合物组成的组中的至少1种来形成,进一步优选用选自聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯及聚碳酸酯中的至少1种来形成,最优选用聚苯乙烯或聚碳酸酯来形成。作为环烯烃聚合物的市售品,可列举ZEONEX(日本瑞翁(株)制)、ZEONOR(日本瑞翁(株)制)、ARTON(JSR(株)制)。
从适合于用高倍率的相位差显微镜观察在细胞培养基材上培养的细胞出发,用D射线(波长589nm)测定的基材的折射率优选1.4~1.6,进一步优选1.45~1.6,特别优选1.5~1.55。通过使基材的折射率处于这些范围,能够减小细胞在相位差显微镜观察中的球面相差,能够得到清晰的相位差图像。另外,为了减小球面相差,基材的厚度优选0.5mm以下,进一步优选0.4mm以下,特别优选0.3mm以下,最优选0.2mm以下。另一方面,从适合于抑制在显微镜观察时因基材弯曲而在整个观察范围内失焦出发,基材的厚度优选0.01mm以上,进一步优选0.05mm以上,特别优选0.1mm以上,最优选0.15mm以上。
用D射线(波长589nm)测定的基材的折射率及厚度分别优选1.4~1.6及0.01mm以上且0.5mm以下,分别更优选1.45~1.6及0.05mm以上且0.4mm以下,分别进一步优选1.45~1.55及0.1mm以上且0.3mm以下,特别优选1.5~1.55及0.15mm以上且0.2mm以下。基材的折射率及厚度处于这些范围时,细胞的相位差图像会变得更清晰。
从适合于以高倍率的荧光显微镜观察在细胞培养基材上培养的细胞出发,激发波长350nm、488nm及647nm下的(使具有这些波长的激发光分别进行照射时的)基材的荧光强度(自身荧光强度)优选小于用具有相同激发波长的光激发出的、厚1.2mm的聚苯乙烯板的荧光强度(自身荧光强度),进一步优选厚1.2mm的聚苯乙烯板的荧光强度的80%以下,特别优选厚1.2mm的聚苯乙烯板的荧光强度的50%以下,最优选厚1.2mm的聚苯乙烯板的荧光强度的10%以下。用激发波长350nm、488nm及647nm进行激发的荧光色素广泛用于细胞的荧光观察中。通过使这些波长下的、基材的自身荧光强度为一定值以下,能够得到细胞的清晰的荧光图像。
作为基材的形状,没有特别限制,可以为板、膜之类的平面形状,也可以为纤维、多孔颗粒、多孔膜、中空纤维等形状。另外,基材的形状也可以为通常用于细胞培养等的容器(Petri培养皿等细胞培养皿、烧瓶、板、袋等)的形状。从培养操作的容易性出发,基材的形状优选板、膜之类的平面形状或者作为平膜的多孔膜的形状。
含有亲水性高分子的层的层厚为5~2000nm。通过使基于亲水性高分子的层的层厚为5~2000nm,能够仅在(A)区域进行细胞的粘附及增殖,另外容易通过细胞游走而使细胞集中在(A)区域,能够提高细胞聚集块的细胞生存率。层厚小于5nm时,在(B)区域也进行细胞增殖,因此不能形成细胞聚集块。层厚超过2000nm时,细胞不能游走,因此细胞聚集块中所含的细胞的生存率下降。在此,基于亲水性高分子的层的“层厚”表示:从基材与基于亲水性高分子的层的界面直至基于亲水性高分子的层的处于与基材相反侧的界面((A)区域除外。)为止的面外方向的长度。层厚超过10nm的范围的情况下,可以使用通过切片机制作的细胞培养基材的超薄切片利用透射型电子显微镜测定截面图像,测定随机选择的10个位置的该距离,求出平均值而计算。另外,层厚为10nm以下的范围时,可以使用椭偏仪进行测定。由于适合于抑制细胞粘附于(B)区域,层厚更优选10nm以上,进一步优选50nm以上,最优选100nm以上。另外,从适合于通过细胞游走而使细胞集中在(A)区域、从而提高细胞聚集块的细胞生存率出发,层厚更优选1000nm以下,进一步优选500nm以下,最优选200nm以下。
亲水性高分子包含磷酸胆碱基或羟基。通过使亲水性高分子包含磷酸胆碱基或羟基,能够使亲水性高分子所覆盖的区域成为不粘附细胞的区域。而且,这种亲水性高分子不需要完全分解除去,因此仅通过进行短时间的弱等离子体处理,就能够使该区域成为具有细胞粘附性及细胞增殖性的区域,细胞中也不易混入亲水性高分子的分解物。除了包含磷酸胆碱基或羟基以外,亲水性高分子的种类没有特别限定,作为市售品,可列举例如Lipidure(R)CM5206(日油(株)制)、Lipidure(R)CM2001(日油(株)制)、BIOSURFINE(R)-AWP(东洋合成工业(株)制)等。另外,作为覆盖有亲水性高分子的市售品基材,可以优选使用PrimeSurface(R)(住友电木公司制)、EZ-BindShut(R)(AGC TECHNO GLASS Co.,Ltd.制)、EZ-BindShutII(R)(AGC TECHNO GLASS Co.,Ltd.制)等。
亲水性高分子优选包含下述通式(1)所示的化合物、下述通式(2)所示的化合物或下述通式(3)所示的化合物。
[通式(1)中,R1及R2各自独立地表示氢原子或甲基,R3表示氢原子或任意的有机基团,m及n各自独立地表示正整数。]
[通式(2)中,R4、R5及R6各自独立地表示氢原子或甲基,R7表示氢原子或任意的有机基团,x、y及z各自独立地表示正整数。]
[通式(3)中,R8R及9各自独立地表示氢原子或甲基,R10表示氢原子或任意的有机基团,a及b各自独立地表示正整数。]
通过使亲水性高分子包含上述通式(1)所示的化合物、上述通式(2)所示的化合物、或上述通式(3)所示的化合物,变得容易粘附细胞及使其增殖,适合于在(A)区域中形成形状均匀的细胞聚集块。关于上述通式(1)、上述通式(2)、或上述通式(3)中的R3R7及R10,从适合于将亲水性高分子固定化于基材出发,分别优选为疏水性基团或UV反应性官能团。作为疏水性基团,优选使用甲基、乙基、丙基、丁基、环己基等直链或环状烷基等。另外,作为UV反应性官能团,可列举叠氮基、丙烯酸酯基、甲基丙烯酸酯基、环氧基等,可以优选使用叠氮基。
(A)区域为具有细胞粘附性及细胞增殖性的面积为0.001~5mm2的岛状的区域。通过为面积0.001~5mm2的岛状的区域,在培养细胞时能够形成粒径均匀的细胞聚集块。另外,从适合形成适合于多能干细胞的分化诱导等用途的细胞聚集块出发,优选面积为0.005~1mm2、更优选面积为0.01~0.5mm2、进一步优选面积为0.015~0.25mm2、最优选面积为0.02~0.2mm2。
(A)区域为岛状的区域表示:(A)区域以相对于(A)区域以外的区域独立的状态存在。通过使(A)区域为具有细胞粘附性及细胞增殖性的岛状,从而能使活细胞集中存在于(A)区域,因此能够制造细胞聚集块。(A)区域不为岛状时、例如为条形结构等时,不能制造细胞聚集块。作为岛状的形状,没有特别限定,可根据作为目标的细胞聚集块的形状适宜设定,例如可列举圆、椭圆、多边形、或由直线及曲线形成的闭合形状等。另外,从适合制造接近球形的细胞聚集块出发,作为岛状的形状,优选圆、椭圆或多边形,更优选圆、椭圆或长方形,进一步优选圆、椭圆或正方形,最优选圆或椭圆。
从适合制造尺寸及形状均匀的细胞聚集块出发,(A)区域的面积的标准偏差/平均面积优选80%以下,更优选50%以下,进一步优选20%以下,最优选5%以下。
从适合制造接近球形的细胞聚集块出发,作为岛状的形状的长宽比,优选5以下,更优选2以下,进一步优选1.5以下,最优选1.1以下。在此,“长宽比”表示:形状的最大直径(长径)与最小直径(短径)之比、即长径/短径。
另外,为了适合于培养多能干细胞而形成适合于向着内胚层细胞或外胚层细胞进行分化诱导的细胞聚集块,优选(A)区域的面积为0.005~0.2mm2、并且以(A)区域及(B)区域的合计面积为基准时(A)区域的数量为200~1000个/cm2,更优选(A)区域的面积为0.01~0.15mm2、并且以(A)区域及(B)区域的合计面积为基准时(A)区域的数量为250~800个/cm2,进一步优选(A)区域的面积为0.02~0.1mm2、并且以(A)区域及(B)区域的合计面积为基准时(A)区域的数量为300~600个/cm2,最优选(A)区域的面积为0.03~0.05mm2、并且以(A)区域及(B)区域的合计面积为基准时(A)区域的数量为300~400个/cm2。
为了适合于培养多能干细胞而形成适合于向着中胚层细胞进行分化诱导的细胞聚集块,优选(A)区域的面积为0.2~2mm2、并且以(A)区域及(B)区域的合计面积为基准时(A)区域的数量为3~15个/cm2,更优选(A)区域的面积为0.3~1.5mm2、并且以(A)区域及(B)区域的合计面积为基准时(A)区域的数量为4~12个/cm2,进一步优选(A)区域的面积为0.4~1mm2、并且以(A)区域及(B)区域的合计面积为基准时(A)区域的数量为5~10个/cm2,最优选(A)区域的面积为0.5~0.7mm2、并且以(A)区域及(B)区域的合计面积为基准时(A)区域的数量为6~8个/cm2。
另外,从适合于提高细胞的周围的氧浓度、提高细胞聚集块的生存率出发,(A)区域彼此间的最小距离优选500~10000μm、更优选1000~8000μm、进一步优选2000~5000μm、最优选3000~4000μm。
(A)区域例如可以如下形成:在基材表面形成含有亲水性高分子的层后,通过电晕处理、UV处理或等离子体处理对含有亲水性高分子的层的表面的一部分进行改性,从而形成。该改性优选通过等离子体处理来进行。通过使(A)区域为通过等离子体处理等对含有亲水性高分子的层的表面进行改性而成的区域,(A)区域成为具有细胞粘附性及细胞增殖性的区域。由于通过短时间的等离子体处理等能够使(A)区域图案化,因此能够提高细胞培养基材的量产性。
另外,(A)区域的测定XPS(X射线光电子能谱法)时的、C1s谱中的287eV的峰强度/285eV的峰强度之比优选比(B)区域的XPS测定的C1s谱中的287eV的峰强度/285eV的峰强度之比大0.05以上。这种情况下,能够增大(A)区域与(B)区域的细胞增殖性的差异,因此能够在(A)区域增殖出更多的细胞,容易在(A)区域中形成均匀的细胞聚集块。从更适合于形成均匀的细胞聚集块出发,(A)区域的XPS测定的C1s谱中的287eV的峰强度/285eV的峰强度之比更优选比(B)区域的XPS测定的C1s谱中的287eV的峰强度/285eV的峰强度之比大0.07以上,进一步优选大0.1以上,最优选大0.15以上。
作为将XPS测定的C1s谱中的287eV的峰强度/285eV的峰强度之比调整到上述范围的方法,没有特别限定,优选仅对形成于基材表面的含有亲水性高分子的层的一部分(预定要成为(A)区域的部分)实施等离子体处理、电晕处理、UV处理等的方法,进一步优选实施等离子体处理或电晕处理的方法,特别优选实施等离子体处理的方法。作为仅对预定要成为(A)区域的部分实施等离子体处理等的方法,可列举如下方法:用通过激光加工而制作的掩模覆盖形成于基材表面的含有亲水性高分子的层,从掩模上方实施等离子体处理等。为了使(A)区域的XPS测定的C1s谱中的287eV的峰强度/285eV的峰强度之比与(B)区域的XPS测定的C1s谱中的287eV的峰强度/285eV的峰强度之比的差收敛到上述范围,可以适当调整等离子体强度、等离子体照射时间等条件,其中,在等离子体处理时使用包含氧及氮的气体作为导入气体的方式更容易收敛到上述范围。
为了适合于剥离所培养的细胞聚集块,(A)区域可以具有温度响应性。(A)区域具有温度响应性时,从在细胞培养基材上培养细胞时能够在接近体温的温度进行细胞培养出发,响应温度优选50℃以下,更优选35℃以下。另外,从适合于在培养中进行培养基交换等操作时抑制细胞剥离出发,响应温度特别优选25℃以下。进而,从能够通过不损伤细胞的温度下的冷却操作来形成细胞聚集块出发,响应温度优选4℃以上,更优选10℃以上,进一步优选15℃以上。
(A)区域具有温度响应性时,例如含有亲水性高分子的层的表面(包含(A)区域及(B)区域的表面)可以还具备层厚1~100nm的含有温度响应性高分子的层。通过具有层厚1~100nm的含有温度响应性高分子的层,能够在不损害形成于含有亲水性高分子的层的表面的(A)区域及(B)区域各自的特性的情况下对(A)区域赋予温度响应性。为了适合于在不损害(A)区域及(B)区域各自的特性的情况下对(A)区域赋予温度响应性,含有温度响应性高分子的层的层厚更优选3~50nm,进一步优选5~40nm,最优选10~35nm。不损害细胞增殖性、进而在培养后能够通过温度响应性剥离细胞并回收的优选的温度响应性高分子的层厚根据所培养的细胞而改变,可在上文例示的层厚范围内适当调整。
温度响应性高分子优选为具有水不溶性嵌段链段及温度响应性嵌段链段的嵌段共聚物。通过使温度响应性高分子为这种嵌段共聚物,能够提高细胞培养基材的量产性且抑制所制造的细胞聚集块中混入温度响应性高分子。关于温度响应性高分子中所含的温度响应性嵌段链段的结构单元比率,从适于从细胞培养基材迅速剥离细胞聚集块出发,优选70wt%以上,进一步优选80wt%以上,特别优选90wt%以上,最优选92wt%以上。
另外,通过使温度响应性高分子为具有水不溶性嵌段链段及温度响应性嵌段链段的嵌段共聚物,从而能够通过向细胞培养基材的表面滴加含有温度响应性高分子的溶液并进行干燥的简便方法对细胞培养基材的表面赋予温度响应性。另外,通过使此时形成的层为前述的优选的温度响应性高分子的层厚,即使在含有亲水性高分子的层的整个表面覆盖温度响应性高分子,也能够进一步减少对上述(A)区域及(B)区域各自的特性的损害。使用含有作为嵌段共聚物的温度响应性高分子或含有上述嵌段共聚物的涂覆剂、以及本发明的细胞培养基材的细胞培养试剂盒时,实施培养的研究者可根据细胞的种类简便地调整温度响应性高分子的层厚。
涂覆剂可以含有溶剂。作为涂覆剂中可包含的溶剂,可列举例如水、有机溶剂或它们的混合液。作为有机溶剂,可列举例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇等醇类;乙腈、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃、1,4-二噁烷、甲乙酮等。从适于使涂覆的膜厚达到均匀出发,优选使用水与醇类的混合溶剂。以涂覆剂的总质量为基准,具有水不溶性嵌段链段及温度响应性嵌段链段的嵌段共聚物的含量可以设为0.1~50重量%、0.2~10重量%、或0.5~5重量%。
涂覆剂可以含有除具有水不溶性嵌段链段及温度响应性嵌段链段的嵌段共聚物及溶剂以外的其它成分。作为其它成分,可列举用于提高细胞粘附性的成分,例如可列举仅包含水不溶性嵌段链段的高分子。
作为构成温度响应性嵌段链段的单体单元,可列举例如丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺等(甲基)丙烯酰胺化合物;N,N-二乙基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N-正丙基丙烯酰胺、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-环丙基丙烯酰胺、N-环丙基甲基丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、N-乙氧基乙基丙烯酰胺、N-乙氧基乙基甲基丙烯酰胺、N-四氢糠基丙烯酰胺、N-四氢糠基甲基丙烯酰胺等N-烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物;N,N-二甲基(甲基)丙烯酰胺、N,N-乙基甲基丙烯酰胺、N,N-二乙基丙烯酰胺等N,N-二烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物;1-(1-氧代-2-丙烯基)-吡咯烷、1-(1-氧代-2-丙烯基)-哌啶、4-(1-氧代-2-丙烯基)-吗啉、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-吡咯烷、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-哌啶、4-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-吗啉等具有环状基团的(甲基)丙烯酰胺衍生物;甲基乙烯基醚等乙烯基醚;N-脯氨酸甲酯丙烯酰胺等脯氨酸衍生物,从适合于将响应温度设为0~50℃出发,优选N,N-二乙基丙烯酰胺、N-正丙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-乙氧基乙基丙烯酰胺、N-四氢糠基丙烯酰胺、N-四氢糠基甲基丙烯酰胺,进一步优选N-正丙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺,特别优选N-异丙基丙烯酰胺。另外,在培养操作中的培养基交换时使用室温的培养基的情况下,从适合于将嵌段共聚物的响应温度设为比室温低的温度出发,优选N-正丙基丙烯酰胺、N-脯氨酸甲酯丙烯酰胺。
作为构成水不溶性嵌段链段的单体单元,可列举例如丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸正丁酯、丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸异丁酯、丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、丙烯酸正己酯、甲基丙烯酸正己酯、丙烯酸正辛酯、甲基丙烯酸正辛酯、丙烯酸正癸酯、甲基丙烯酸正癸酯、丙烯酸正十二烷基酯、甲基丙烯酸正十二烷基酯、丙烯酸正十四烷基酯、甲基丙烯酸正十四烷基酯等。另外,为了将嵌段共聚物牢固地固定化于基材,优选具有反应性基团者,可列举例如丙烯酸4-叠氮苯酯、甲基丙烯酸4-叠氮苯酯、丙烯酸2-((4-叠氮苯甲酰)氧基)乙酯、甲基丙烯酸2-((4-叠氮苯甲酰)氧基)乙酯等。进而,从适合于提高细胞增殖性出发,优选具有芳香环的结构,可列举例如丙烯酸2-羟基苯酯、甲基丙烯酸2-羟基苯酯、丙烯酸3-羟基苯酯、甲基丙烯酸3-羟基苯酯、丙烯酸4-羟基苯酯、甲基丙烯酸4-羟基苯酯、N-(2-羟基苯基)丙烯酰胺、N-(2-羟基苯基)甲基丙烯酰胺、N-(3-羟基苯基)丙烯酰胺、N-(3-羟基苯基)甲基丙烯酰胺、N-(4-羟基苯基)丙烯酰胺、N-(4-羟基苯基)甲基丙烯酰胺、苯乙烯等。
水不溶性嵌段链段另外可以包含控制嵌段共聚物的响应温度的重复单元。作为控制嵌段共聚物的响应温度的重复单元,可列举亲水性或疏水性的成分,没有特别限定,可列举例如丙烯酸2-二甲基氨基乙酯、甲基丙烯酸2-二甲基氨基乙酯、丙烯酸2-二乙基氨基乙酯、甲基丙烯酸2-二乙基氨基乙酯、N-[3-(二甲基氨基)丙基]丙烯酰胺等具有氨基者;N-(3-磺丙基)-N-甲基丙烯酰氧基乙基-N,N-二甲基铵甜菜碱、N-甲基丙烯酰氧基乙基-N、N-二甲基铵-α-N-甲基羧基甜菜碱等具有甜菜碱者;丙烯酸羟基乙酯、甲基丙烯酸羟基乙酯、N-(2-羟基乙基)丙烯酰胺、聚乙二醇单丙烯酸酯、聚乙二醇单甲基丙烯酸酯、聚丙二醇单丙烯酸酯、聚丙二醇单甲基丙烯酸酯、甲氧基聚乙二醇单丙烯酸酯、甲氧基聚乙二醇单甲基丙烯酸酯、二乙二醇单甲醚丙烯酸酯、二乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯、二乙二醇单乙基醚丙烯酸酯、二乙二醇单乙基醚甲基丙烯酸酯、丙烯酸2-甲氧基乙酯、甲基丙烯酸2-甲氧基乙酯、丙烯酸2-乙氧基乙酯、甲基丙烯酸2-乙氧基乙酯、丙烯酸3-丁氧基乙酯、甲基丙烯酸3-丁氧基乙酯、3-丁氧基乙基丙烯酰胺、丙烯酸糠酯、甲基丙烯酸糠酯、丙烯酸四氢糠酯、甲基丙烯酸四氢糠酯等具有聚乙二醇基、甲氧基乙基者;丙烯酸甲氧基甲酯、甲基丙烯酸甲氧基甲酯、丙烯酸2-乙氧基甲酯、甲基丙烯酸2-乙氧基甲酯、丙烯酸3-丁氧基甲酯、甲基丙烯酸3-丁氧基甲酯、3-丁氧基甲基丙烯酰胺等具有丙烯酸酯基者;2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱、2-丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱、3-(甲基)丙烯酰氧基丙基磷酸胆碱、4-(甲基)丙烯酰氧基丁基磷酸胆碱、6-(甲基)丙烯酰氧基己基磷酸胆碱、10-(甲基)丙烯酰氧基癸基磷酸胆碱、ω-(甲基)丙烯酰基(聚)氧亚乙基磷酸胆碱、2-丙烯酰胺乙基磷酸胆碱、3-丙烯酰胺丙基磷酸胆碱、4-丙烯酰胺丁基磷酸胆碱、6-丙烯酰胺己基磷酸胆碱、10-丙烯酰胺癸基磷酸胆碱、ω-(甲基)丙烯酰胺(聚)氧亚乙基磷酸胆碱等具有磷酸胆碱基者。
(B)区域与(A)区域邻接且不具有细胞粘附性或细胞增殖性。(B)区域为与(A)区域邻接且不具有细胞增殖性的区域时,在培养细胞时能够形成仅在(A)区域形成细胞聚集块、在(A)区域的周围的一部分或全部不存在细胞的状态。另外,从适合于使制造的细胞聚集块的尺寸及形状均匀化出发,(B)区域优选不仅不具有细胞增殖性、而且不具有细胞粘附性。
作为(B)区域的形状,除了与(A)区域邻接以外没有限定,从适合于制造尺寸及形状均匀的细胞聚集块出发,优选与(A)区域的边界线中的20%以上的长度是与(B)区域邻接的,更优选50%以上,进一步优选80%以上,最优选(A)区域的周围全部为(B)区域。另外,从适合于提高细胞培养基材的量产性出发,优选(A)区域为岛状、(B)区域为海状的海岛结构。
作为(A)区域与(B)区域的面积比,没有特别限定,从适合于提高细胞培养基材的每单位面积能制造的细胞聚集块的数量出发,(A)区域的面积相对于(A)区域及(B)区域的面积的合计优选为10%以上,更优选30%以上,进一步优选50%以上,最优选70%以上。另外,从适合于在多个(A)区域之间设置足够的距离、抑制多个(A)区域的细胞聚集块融合而成为不均匀的形状出发,(B)区域的面积相对于(A)区域及(B)区域的面积的合计优选为20%以上,更优选40%以上,进一步优选60%以上,最优选80%以上。
(A)区域与(B)区域的边界的凹凸高度((A)区域的面与(B)区域的面的面外方向的距离)为1~500nm。通过使凹凸高度为500nm以下,能够抑制被凹凸捕捉的死细胞的数量、降低细胞聚集块中混入的死细胞的数量。由此,能够提高细胞聚集块的细胞生存率。另外,凹凸高度为500nm以下时,凹凸部分不易附着气泡。由此,无需为了除去气泡而进行脱气、或使用移液器反复进行培养基的吐出和吸入,操作性提高。通过使凹凸高度为1nm以上,在细胞培养基材上自发性移动(游走)的活细胞会聚集在(A)区域,因此能够提高细胞聚集块的细胞生存率。从适合于提高形成的细胞聚集块的细胞生存率出发,凹凸高度更优选400nm以下,进一步优选100nm以下,最优选50nm以下。
细胞培养基材可以根据需要在表面具备含有生物体来源物质的层。含有生物体来源物质的层可以存在于细胞培养基材的整个表面,也可以仅存在于(A)区域的表面。作为生物体来源物质,没有特别限定,可列举例如基质胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白等。
这些生物体来源物质可为天然物质,也可以为通过基因重组技术等人工合成的,还可以为用限制酶等切割而成的片段、将与这些生物体来源物质同等的物质通过化学方式合成而得的合成蛋白或合成肽等。
作为基质胶,从入手容易性出发,可以优选使用市售品中的Matrigel(CorningIncorporated制)、Geltrex(Thermo Fisher Scientific制)等。
层粘连蛋白的种类没有特别限定,例如可以使用据报道对人iPS细胞的表面所表达的α6β1整合素显示出高活性的层粘连蛋白511、层粘连蛋白521、层粘连蛋白511-E8片段等。层粘连蛋白可以是天然物质,也可以是通过基因重组技术等人工合成的,另外还可以是将与层粘连蛋白同等的物质通过化学方式合成而得的合成蛋白或合成肽。从入手容易性出发,例如可以优选使用作为市售品的iMatrix-511(Nippi,Inc制)等。
玻连蛋白可以是天然物质,也可以是通过基因重组技术等人工合成的,另外还可以是将与玻连蛋白同等的物质通过化学方式合成而得的合成蛋白或合成肽。从入手容易性出发,可以优选使用作为市售品的玻连蛋白,人血浆来源(和光纯药工业(株)制)、synthemax(Corning Incorporated制)、Vitronectin(VTN-N)(Thermo Fisher Scientific制)等。
纤连蛋白可以是天然物质,也可以是通过基因重组技术等人工合成的,另外还可以是将与纤连蛋白同等的物质通过化学方式合成而得的合成蛋白或合成肽。从入手容易性出发,可以优选使用作为市售品的玻连蛋白溶液,人血浆来源(和光纯药工业(株)制)、Retronectin(宝生物(株)制)等。
胶原蛋白的种类没有特别限定,例如可以使用I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白等。胶原蛋白可以是天然物质,也可以是通过基因重组技术等人工合成的,另外还可以是将与胶原蛋白同等的物质通过化学方式合成而得的合成肽。从入手容易性出发,可以优选使用作为市售品的人胶原蛋白I(Corning Incorporated制)、人胶原蛋白IV(CorningIncorporated制)等。
从能够抑制生物体来源物质的变性、能够提高细胞增殖性的观点出发,优选生物体来源物质通过非共价键固定化于细胞培养基材上。此处,“非共价键”表示静电相互作用、疏水性相互作用(日文原文:水不溶性相互作用)、氢键、π-π相互作用、偶极-偶极相互作用、伦敦色散力、其它范德华相互作用等源自分子间力的共价键以外的结合力。生物体来源物质在嵌段共聚物上的固定化可以是由单一的结合力所引起的,也可以是多种的组合。
生物体来源物质的固定化方法没有特别限定,例如可以适宜使用如下方法:通过在细胞培养基材上涂布生物体来源物质的溶液规定时间而使其固定化的方法;在培养细胞时,在培养液中添加生物体来源物质而使生物体来源物质吸附至细胞培养基材的固定化方法。
本实施方式所涉及的细胞培养基材可以根据需要通过在基材上设置隔板(例如具有面内方向的截面积为0.05~100cm2的贯通孔的板)等来设置用于区分各细胞聚集块的结构。
本实施方式所涉及的细胞培养基材可以实施了灭菌。灭菌的方法没有特别限定,可以使用高压蒸汽灭菌、UV灭菌、γ射线灭菌、环氧乙烷气体灭菌等。从抑制嵌段共聚物的变性的观点出发,优选高压蒸汽灭菌、UV灭菌、环氧乙烷气体灭菌。从抑制基材变形的观点出发,进一步优选UV灭菌或环氧乙烷气体灭菌。从量产性优异的观点出发,优选环氧乙烷气体灭菌。
作为使用本实施方式所涉及的细胞培养基材培养的细胞,只要是能够在通过降低温度来赋予刺激之前粘附于表面的细胞则没有特别限定。除了可列举例如中国仓鼠卵巢来源CHO细胞、小鼠结缔组织L929、人胚肾来源HEK293细胞、人宫颈癌来源HeLa细胞等各种细胞系化细胞之外,还可以列举例如:作为构成生物体内的各组织、器官的上皮细胞、内皮细胞;显示出收缩性的骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞;构成神经系统的神经元细胞、胶质细胞、成纤维细胞;参与生物体的代谢的肝实质细胞、肝非实质细胞、脂肪细胞;作为具有分化能力的细胞的间充质干细胞、骨髄细胞、Muse细胞那样存在于各种组织中的干细胞、进而ES细胞、iPS细胞等具有分化多能性的干细胞(多能干细胞)、由这些细胞分化诱导的细胞等。从一实施方式所涉及的细胞培养基材中的细胞的增殖性及剥离性的观点出发,优选干细胞或多能干细胞,更优选间充质干细胞或多能干细胞,进一步优选多能干细胞,最优选iPS细胞。
本实施方式所涉及的细胞培养基材如后述实施例所记载那样可以适宜地用于由多能干细胞向着三胚层细胞的分化诱导。本实施方式所涉及的细胞培养基材另外可以适宜地用于由多能干细胞向肠上皮细胞的分化诱导。因此,本实施方式所涉及的细胞培养基材可以用于由多能干细胞向着三胚层细胞的分化诱导,可以用于由多能干细胞向肠上皮细胞的分化诱导。
本实施方式所涉及的细胞培养基材例如可以通过具备下述工序(1)、工序(2)及工序(3)的制造方法来制造。该制造方法的量产性优异。需要说明的是,工序(3)中也可以进行电晕处理或UV处理来代替等离子体处理。
工序(1):将基材的表面的至少一部分用含有UV反应性的亲水性高分子的组合物覆盖,形成含有亲水性高分子的层的工序。
工序(2):对含有亲水性高分子的层进行UV照射,将含有亲水性高分子的层通过化学反应固定化于基材的表面的工序。
工序(3):对经固定化的含有亲水性高分子的层的表面的一部分进行等离子体处理,在进行了等离子体处理的部分形成(A)区域的工序。
本实施方式所涉及的细胞培养基材另外也可以通过具备下述工序(1’)、工序(2’)、工序(3’)及工序(4‘)的制造方法来制造。
工序(1’):使用由在重复单元中包含脂环式烃基或芳香族烃基的高分子形成的基材,对基材的表面进行等离子体处理,在进行了等离子体处理的部分形成上述(A)区域的工序。
工序(2’):将基材的表面的至少一部分用含有UV反应性的亲水性高分子的组合物覆盖,形成上述含有亲水性高分子的层的工序。
工序(3’):对上述含有亲水性高分子的层的一部分进行UV照射,将上述含有亲水性高分子的层的一部分固定化于上述基材的表面的工序。
工序(4’):用溶剂对上述亲水性高分子进行清洗,将未固定化于表面的亲水性高分子溶解、从基材的表面除去的工序。
本实施方式所涉及的制造方法除了具备工序(1)、工序(2)及工序(3)或者具备工序(1’)、工序(2’)、工序(3’)及工序(4’)以外,可以根据需要还具备下述工序(4)。
工序(4):在工序(3)或(4’)之后,将具有面内方向的截面积为0.05~100cm2的贯通孔的板在基材的被含有亲水性高分子的层覆盖的表面侧与基材贴合的工序。
另外,一实施方式所涉及的制造方法可以在工序(3)或(4’)之后还具备下述工序(5)。需要说明的是,实施工序(4)的情况下,优选在工序(3)或(4’)之后且工序(4)之前实施工序(5)。
工序(5):在工序(3)或(4’)之后,用含有温度响应性高分子的组合物覆盖进行了等离子体处理的含有亲水性高分子的层的表面,形成含有温度响应性高分子的层的工序。
工序(1)中,将基材的表面的至少一部分用含有UV反应性的亲水性高分子的组合物覆盖,形成含有亲水性高分子的层。通过形成含有亲水性高分子的层,可以成为不具有细胞粘附性及细胞增殖性的状态。作为形成含有亲水性高分子的层的方法,没有特别限定,可列举例如通过将含有亲水性高分子的组合物涂布于基材的表面的至少一部分而形成的方法。作为含有亲水性高分子的组合物的涂布方法,可以使用例如涂布、刷涂、浸涂、旋涂、棒涂、流涂、喷涂、辊涂、气刀涂布、刮刀涂布、凹版涂布、微凹版涂布、狭缝式涂布等通常已知的各种方法。
图2为工序(1)之后的在表面上形成有含有亲水性高分子的层的基材的示意图(立体图)。图2中,在基材1的表面的整面形成了含有亲水性高分子的层2。
工序(2)中,对含有亲水性高分子的层2进行UV照射,将含有亲水性高分子的层固定化于基材的表面。通过对UV反应性的亲水性高分子进行UV照射,亲水性高分子彼此间或亲水性高分子与基材间发生化学反应,含有亲水性高分子的层被固定化于基材的表面。通过将含有亲水性高分子的层固定化于基材表面,在后述的工序(5)中涂布含有温度响应性高分子的组合物时,能够不使含有亲水性高分子的层变形且形成含有温度响应性高分子的层。另外,通过将含有亲水性高分子的层固定化于基材表面,在后述的工序(3)中,还能够使形成于含有亲水性高分子的层的表面的一部分的(A)区域保持形状。
工序(3)中,对经固定化的含有亲水性高分子的层的表面的一部分进行等离子体处理,在进行了等离子体处理的部分形成(A)区域。优选的等离子体处理方法可根据所使用的亲水性高分子的种类、层厚来适当调整,等离子体照射时间优选5秒~30分钟,进一步优选5秒~10分钟,特别优选10秒~5分钟,最优选15秒~1分钟。另外,作为(A)区域的图案化的方法,没有特别限定,可列举出如下方法:在用金属掩模、硅掩模、表面保护膜等覆盖的状态下进行等离子体处理,由此对期望的部分(未被遮挡的部分)进行等离子体处理。
图3为工序(3)之后的细胞培养基材的示意图(立体图)。图3所示的细胞培养基材10中,以等间隔配置的圆形的区域(A所示的区域。例如,该区域的面积为0.001~5mm2。)相当于进行了等离子体处理的部分。A所示的区域通过利用等离子体处理使含有亲水性高分子的层2的表面改性,从而变得具有细胞粘附性及细胞增殖性。另外,圆形的区域以外的区域(B所示的区域。)例如相当于通过被金属掩模等保护而未进行等离子体处理的部分。B所示的区域由于表面为含有亲水性高分子的层2,因此不具有细胞粘附性或细胞增殖性。
工序(1’)中,使用由在重复单元中包含脂环式烃基或芳香族烃基的高分子基材,对基材的表面进行等离子体处理,在进行了等离子体处理的部分形成上述(A)区域。通过对包含脂环式烃基或芳香族烃基的高分子基材的表面进行等离子体处理,从而能够使基材表面变成适合于细胞培养的结构。作为等离子体处理的条件,优选使用空气、氮或氧作为导入气体、1~30帕斯卡的气压、1秒~10分钟,进一步优选1秒~5分钟,特别优选1秒~1分钟。作为脂环式烃基,可列举环烷基,更具体而言可列举环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基等。芳香族烃基是指:从芳香族烃上除去1个以上直接键合在构成环的碳原子上的氢原子而成的基团。作为芳香族烃基,可列举:从作为单环式芳香族烃的苯、作为多环式芳香族烃的萘等中除去1个以上直接键合在构成环的碳原子上的氢原子而成的基团。
另外,也可以代替上述工序(1’)而将适合于细胞培养的成分涂覆在基材表面。作为适合于细胞培养的成分,可以优选使用聚羧基苯乙烯等高分子材料。
工序(2’)中,将基材的表面的至少一部分用含有UV反应性的亲水性高分子的组合物覆盖,形成上述含有亲水性高分子的层。作为涂布方法,可以优选使用与前述工序(1)同样的方法。
工序(3’)中,对上述含有亲水性高分子的层的一部分进行UV照射,将上述含有亲水性高分子的层的一部分固定化于上述基材的表面。通过对层的一部分区域进行UV照射,从而仅将含有亲水性高分子的层的经UV照射的区域固定化于基材的表面。作为对含有亲水性高分子的层的一部分进行UV照射的方法,可列举如下方法:将以期望图案通过铬蒸镀等形成有不具有UV透过性的区域的石英掩模等放在基材上,从其方法进行UV照射。
工序(4’)中,用溶剂对上述亲水性高分子进行清洗,将未固定化于表面的亲水性高分子溶解、从基材的表面除去。通过除去未固定化的亲水性高分子,从而基材表面露出,可以形成(A)区域。作为工序(4’)中使用的溶剂,从适合于除去通过UV反应性的亲水性高分子的自反应而副产的化合物、例如包括叠氮基来源的氮宾的化合物等出发,优选含有水和醇。通过使用水与醇的混合溶剂进行清洗,能够减少(A)区域中残留的亲水性高分子来源成分,能够提高(A)区域的细胞粘附性及细胞增殖性。作为上述醇,优选低级醇,例如优选甲醇、乙醇、2-丙醇、叔丁醇、异丁醇、戊醇、己醇,进一步优选甲醇或乙醇。另外,作为上述醇的含量,优选50~95%,进一步优选50~90%,特别优选60~90%,最优选70~90%。
工序(4)中,在工序(3)或(4’)之后,将具有面内方向的截面积为0.05~100cm2的贯通孔的板在基材的被含有亲水性高分子的层覆盖的表面侧与基材贴合。通过将具有面内方向的截面积为0.05~100cm2的贯通孔的板与基材贴合,能够以高量产性制作具有用于装入培养基的空间的板。图4为工序(4)之后的细胞培养基材的示意图(立体图)。图4所示的细胞培养基材11例如在图3所示的细胞培养基材10等上贴合有隔板20(具有面内方向的截面积为0.05~100cm2的贯通孔的板)。
工序(5)中,在工序(3)或(4’)之后,用含有温度响应性高分子的组合物覆盖进行了等离子体处理的含有亲水性高分子的层的表面,形成含有温度响应性高分子的层。此时,以100nm以下的层厚来形成含有温度响应性高分子的层,从而温度响应性高分子的分子链容易以稀疏的状态覆盖工序(3)或(4’)中形成的(A)区域的表面,适合于在维持(A)区域的功能(具有细胞粘附性及细胞增殖性的)的情况下赋予温度响应性。另外,通过将含有温度响应性高分子的层的层厚设为1nm以上,能够制造赋予充分的温度响应性、能够迅速地进行细胞聚集块的形成的细胞培养基材,是优选的。
作为用含有温度响应性高分子的组合物进行覆盖的方法,可以优选使用与前述的含有亲水性高分子的组合物的涂布方法同样的方法。
作为用含有温度响应性高分子的组合物进行覆盖的方法,另外优选在细胞培养基材的整面覆盖温度响应性物质。在覆盖含有温度响应性高分子的组合物时,通过不进行图案化、而是用通常使用的涂覆方法进行覆盖,能够提高细胞培养基材的量产性。另外,通过在细胞培养基材的整面覆盖含有温度响应性高分子的组合物,在对(A)区域赋予温度响应性的同时,在(B)区域上也覆盖温度响应性高分子。通过在(B)区域上覆盖温温度响应性高分子,能够降低(B)区域的细胞粘附性。
本发明此外还涉及多能干细胞的分化诱导方法。
本实施方式所涉及的分化诱导方法包括以下的(i)~(iii)工序。本实施方式所涉及的分化诱导方法优选用于由多能干细胞向着三胚层细胞的分化诱导。
(i)在本发明的细胞培养基材中播种多能干细胞的工序。
(ii)对播种的多能干细胞进行培养,形成高度/直径的比为0.2~0.8的半球状的细胞聚集块的工序。
(iii)对上述细胞聚集块进行分化诱导,形成三胚层细胞的细胞聚集块的工序。
(i)工序使用上述的本发明的细胞培养基材,为在该细胞培养基材中播种多能干细胞的工序。“播种细胞”表示:将分散有细胞的培养基(以下记作“细胞悬浮液”。)涂布于细胞培养基材上或注入细胞培养基材中等,由此使细胞悬浮液与细胞培养基材接触。通过使用具有细胞增殖性区域的细胞培养基材,可以在后述的(ii)工序中对细胞进行培养。细胞培养基材不具有细胞增殖性区域时,在(ii)工序中不能对细胞进行培养。
上述(i)工序中,在有助于维持多能干细胞的未分化性的条件下实施培养。作为有助于维持未分化性的条件,没有特别限制,可列举例如:将培养开始时的多能干细胞的密度设为作为下述播种时的细胞密度而记载的优选范围、在合适的液体培养基存在下进行等。作为有助于维持多能干细胞的未分化性的培养基,可以优选使用例如添加了作为用于维持多能干细胞的未分化性的因子而众所周知的胰岛素、转铁蛋白、硒、抗坏血酸、碳酸氢钠、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β(TGF-β)、CCL2、活化素、2-巯基甲醇中的1种以上的培养基。从特别适合于维持多能干细胞的未分化性出发,更优选使用含有胰岛素、转铁蛋白、硒、抗坏血酸、碳酸氢钠、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β(TGF-β)的培养基,最优选使用添加了碱性成纤维细胞生长因子的培养基。
作为上述添加了碱性成纤维细胞生长因子的培养基的种类,没有特别限制,例如作为市售品,可列举DMEM(Sigma-Aldrich Co.LLC制)、Ham’s F12(Sigma-Aldrich Co.LLC制)、D-MEM/Ham’s F12(Sigma-Aldrich Co.LLC制)、Primate ES Cell Medium((株)REPROCELL制)、StemFit AK02N(味之素(株)制)、StemFit AK03(味之素(株)制)、mTeSR1(STEMCELL TECHNOLOGIES制)、TeSR-E8(STEMCELL TECHNOLOGIES制)、ReproNaive((株)REPROCELL制)、ReproXF((株)REPROCELL制)、ReproFF((株)REPROCELL制)、ReproFF2((株)REPROCELL制)、NutriStem(BiologicalIndustries Ltd.制)、iSTEM(宝生物(株)制)、GS2-M(宝生物(株)制)、hPSC Growth Medium DXF(PromoCell(株)制)等。从适合于维持多能干细胞的未分化状态出发,优选Primate ES Cell Medium((株)REPROCELL制)、StemFit AK02N(味之素(株)制)或StemFit AK03(味之素(株)制),更优选StemFit AK02N(味之素(株)制)或StemFit AK03(味之素(株)制),特别优选StemFit AK02N(味之素(株)制)。
上述(i)工序中,多能干细胞的播种方法没有特别限制,例如可以通过向细胞培养基材中注入细胞悬浮液来进行。播种时的细胞密度没有特别限制,为了能够维持多能干细胞且使其增殖,优选1.0×102~1.0×106个细胞/cm2,更优选5.0×102~5.0×105个细胞/cm2,进一步优选1.0×103~2.0×105个细胞/cm2,最优选1.2×103~1.0×105个细胞/cm2。
作为上述(i)工序中使用的培养基,另外从适合于维持多能干细胞的生存出发,优选使用在添加了上述碱性成纤维细胞生长因子的培养基中还添加有Rho结合激酶抑制剂的培养基。特别是在使用人多能干细胞时,在人多能干细胞的细胞密度低的状态下,添加Rho结合激酶抑制剂时有时有助于维持人多能干细胞的生存。作为Rho结合激酶抑制剂,可以使用例如(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-氨基乙基)-环己烷甲酰胺二盐酸一水合物(和光纯药工业(株)制Y-27632)、1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪盐酸盐(和光纯药工业(株)制HA1077)。作为添加于培养基的Rho结合激酶抑制剂的浓度,为有助于维持人多能干细胞的生存且不影响人多能干细胞的未分化状态的范围,优选1μM~50μM,更优选3μM~20μM,进一步优选5μM~15μM,最优选8μM~12μM。
上述(i)工序开始不久,多能干细胞就开始粘附于细胞培养基材。
(ii)工序中,对播种的多能干细胞进行培养,形成高度/直径的比为0.2~0.8的半球状的细胞聚集块。“高度”例如可以为细胞培养基材的基材面外方向的细胞直径的最大值。“直径”例如可以为细胞培养基材的基材面内方向的细胞直径的最大值。
关于(ii)工序中的培养,从适合于维持多能干细胞的增殖能力、生理活性、功能出发,作为培养温度,优选30~42℃、更优选32~40℃、进一步优选36~38℃、最优选37℃。
优选在(ii)工序开始起22~26小时后进行首次培养基交换。优选在(ii)工序开始起48~72小时后进行第2次培养基交换,并且每隔24~48小时进行培养基交换。期间,多能干细胞增殖,形成被称为集落的扁平的细胞块。集落为细胞二维地粘附于细胞培养基材的状态。持续培养至集落的大小达到(A)区域的尺寸程度再继续进行培养则形成三维的细胞聚集块。三维的细胞聚集块的形状优选高度/直径的比为0.2~0.8的半球状。高度/直径的比通过利用显微镜观察多个细胞聚集块、计算出值并取平均来求出。通过形成高度/直径的比为0.2~0.8的半球状的细胞聚集块,能够高效地由多能干细胞向着三胚层细胞进行分化诱导。另外,从适合于提高向着三胚层细胞的分化诱导效率出发,高度/直径的比更优选0.3~0.7,进一步优选0.4~0.6。
(iii)工序中,对上述细胞聚集块(多能干细胞的细胞聚集块)进行分化诱导,形成三胚层细胞的细胞聚集块。需要说明的是,(iii)工序可以在(ii)工序之后进行,也可以与(ii)工序并行进行。即,在所播种的多能干细胞粘附于细胞培养基材后,可以立即开始(ii)工序及(iii)工序,一边形成细胞聚集块一边进行分化诱导。需要说明的是,三胚层细胞表示内胚层细胞、中胚层细胞、外胚层细胞中的任意者。(iii)工序中在包含分化诱导因子的培养基中对细胞进行培养。
为了提高向内胚层细胞的分化诱导效率,(iii)工序中的分化诱导因子优选含有内胚层诱导因子。作为内胚层诱导因子,为了提高向胚状体的分化诱导效率,优选选自由Wnt蛋白质、骨形成蛋白(BMP)、胰岛素样生长因子及活化素组成的组中的一种或多种分化诱导因子,特别优选含有Wnt3a、BMP4、IGFI、活化素A中的任意种。
为了提高向中胚层细胞的分化诱导效率,(iii)工序中的分化诱导因子优选含有中胚层诱导因子。作为中胚层诱导因子,为了提高向胚状体的分化诱导效率,优选选自由GSK3β抑制剂、骨形成蛋白(BMP)及活化素组成的组中的一种或多种分化诱导因子,特别优选含有活化素A、CHIR99021(GSK3β抑制剂)、BMP4中的任意种。
为了提高向外胚层细胞的分化诱导效率,(iii)工序中的分化诱导因子优选含有外胚层诱导因子。作为上述外胚层诱导因子,优选含有Noggin(BMP抑制剂)、多索吗啡(dorsomorphin,BMP抑制剂)、SB431542(TGF-β抑制剂)、活化素抑制剂中的任意种,更优选含有BMP抑制剂及TGF-β抑制剂。
关于分化诱导因子在培养基中的添加浓度,没有特别限定,为了提高向三胚层细胞的分化诱导效率,优选1000~500ng/mL,更优选500~100ng/mL,最优选100ng/mL以下。
为了充分进行分化诱导,优选在培养中每隔24小时进行包含分化诱导因子的培养基的交换。通过在24小时以内进行培养基交换,可以防止培养基中的分化诱导因子不足、均匀地使全部多能干细胞分化。
本实施方式所涉及的多能干细胞的分化诱导方法可以还具有以下的(iv)工序。包括(iv)工序时的分化诱导方法优选用于由多能干细胞向肠上皮细胞的分化诱导。
(iv)在包含选自由Wnt蛋白质、骨形成蛋白(BMP)、胰岛素样生长因子及活化素组成的组中的至少一种分化诱导因子的培养基中培养细胞聚集块,表达肠上皮细胞所具有的标志物的工序。
肠上皮细胞优选具有肠细胞、杯细胞、肠管内分泌细胞、潘氏细胞(Paneth cell)及肠上皮干细胞中的任一种或多种细胞,更优选包含肠细胞、杯细胞、肠管内分泌细胞、潘氏细胞及肠上皮干细胞全部。肠上皮细胞具有特有的标志物。例如,作为肠细胞标志物,可列举CDX2及VIL1,作为杯细胞标志物,可列举MUC2,作为肠管内分泌细胞标志物,可列举CGA、作为潘氏细胞标志物,可列举DEFA6,作为肠上皮干细胞标志物,可列举LGR5。
本发明的细胞培养基材由于表面不具有基材面外方向的高度高的凹凸结构,因此接触培养基时,气泡不易附着在细胞培养基材表面。本发明的细胞培养基材的气泡附着数相对于(A)区域的数量例如优选10%以下、更优选5%以下、进一步优选3%以下、最优选1%以下。
使用本发明的细胞培养基材形成的细胞聚集块与利用以往的微细凹凸结构的细胞聚集块形成相比,粘附着的细胞会自发聚集,因此具有高的细胞生存率。例如,使用生存率为50%的细胞时,作为形成的细胞聚集块的细胞生存率,优选70%以上,更优选80%以上,进一步优选85%以上,最优选90%以上。
实施例
以下基于实施例更具体地说明本发明。但是,本发明不受以下实施例限定。需要说明的是,只要没有特别声明,试剂使用市售品。
<(A)区域的面积的测定>
使用激光显微镜(基恩士(株)制、制品名VK-X200)获得细胞培养基材的表面的图像。使用得到的图像,在分析软件VK-X Viewer上求出20个(A)区域的面积,对它们的面积取平均,作为(A)区域的面积。
<(A)区域与(B)区域的边界的凹凸高度的测定>
使用激光显微镜(基恩士(株)制、制品名VK-X200),通过激光扫描模式测定细胞培养基材的面外方向的厚度,由此测定边界处的凹凸高度。
<气泡附着评价>
向细胞培养基材中加入培养基StemFitAK02N(味之素(株)制),用显微镜观察,由此确认有无气泡附着。
<细胞聚集块的评价>
(细胞聚集块的培养)
以0.2mL/cm2向细胞培养基材中加入培养基StemFitAK02N(味之素(株)制),以2.5μL/mL的浓度加入iMatrix-511溶液(Nippi,Inc制)。使用通过混入死细胞而将活细胞相对于全部细胞的比例(细胞生存率)调整为50%的人iPS细胞201B7株,以达到15000个(活细胞及死细胞的合计细胞数)/cm2的方式进行播种,在37℃、CO2浓度5%的环境下培养。另外,细胞播种起24小时后,向培养基中添加Y-27632(和光纯药工业(株)制)(浓度10μM)。培养开始起1天后或2天后确认是否形成细胞聚集块。
(基于冷却的细胞聚集块的剥离)
确认形成细胞聚集块后,在室温下冷却30分钟,确认细胞聚集块的剥离。
(细胞生存率的评价)
确认形成细胞聚集块后,用TrypLE-EDTA溶液(TrypLE select(ThermoFisher制)与0.5mM EDTA溶液(Invitrogen公司制)的1:1混合物)对细胞进行处理后,使用细胞刮刀,将细胞以单细胞来剥离回收,通过利用台盼蓝进行染色来确定细胞生存率。
<亲水性高分子及温度响应性高分子的层厚的测定>
覆盖在基材上的聚合物(亲水性高分子及温度响应性高分子)的层厚如下求出:由基材的表面积、溶液中的高分子的浓度、滴加到基材上的溶液体积,将高分子的比重设为1而计算每单位面积的覆盖量,由此求出。
<温度响应性高分子的组成的测定>
温度响应性高分子的组成通过使用核磁共振测定装置(日本电子(株)制、商品名JNM-GSX400)的质子核磁共振(1H-NMR)光谱分析或使用核磁共振测定装置(BRUKER制、制品名AVANCEIIIHD500)的碳核磁共振(13C-NMR)光谱分析来求出。
<温度响应性高分子的分子量及分子量分布的测定>
重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)及分子量分布(Mw/Mn)通过凝胶渗透色谱(GPC)来测定。GPC装置使用东曹(株)制HLC-8320GPC,柱使用2根东曹(株)制TSKgel Super AWM-H,柱温设为40℃,洗脱液使用包含10mM三氟乙酸钠的1,1,1,3,3,3-六氟-2-异丙醇、或包含10mM溴化锂的N,N-二甲基甲酰胺,由此进行测定。测定试样以1.0mg/mL来制备并进行测定。分子量的标准曲线使用分子量已知的聚甲基丙烯酸甲酯(Polymer Laboratories Ltd.制)。
<基材的自身荧光强度评价>
对于基材,以曝光时间0.4秒照射分别具有350nm、488nm及647nm的激发波长的光,拍摄荧光图像。求出这些图像的RGB值,激发波长350nm下将R值作为荧光强度,激发波长488nm下将G值作为荧光强度,激发波长647nm下将B值作为荧光强度。用厚1.2mm的聚苯乙烯板进行同样的测定,将相对于厚1.2mm的聚苯乙烯板的值的相对值作为各基材的荧光强度,示于表4。
[实施例1]
将以固体成分浓度0.06wt%含有作为亲水性高分子的具有叠氮基的聚乙烯醇(BIOSURFINE(R)-AWP、东洋合成工业(株)制)的水/乙醇溶液0.8mL滴加到直径3.5cm的聚苯乙烯(PS)皿(基材)中,在室温下减压干燥后进行UV照射,由此使亲水性高分子固化,形成亲水性高分子的层。将具有多个直径0.2mm的圆形孔的金属掩模置于亲水性高分子的层上,使用等离子体照射装置(Vacuum Device Inc.制、商品名Plasma Ion Bombarder PIB-20)从金属掩模的上方进行等离子体处理(20Pa气压下、导电电流20mA、照射时间30秒),由此在经等离子体处理的部分形成具有细胞粘附性及细胞增殖性的区域((A)区域)。另外,在被金属掩模遮住的部分形成(B)区域。
将制作的细胞培养基材的构成及评价结果示于表2。所制作的细胞培养基材中,亲水性高分子的层的层厚为600nm,(A)区域的面积为0.03mm2,(A)区域与(B)区域的边界的凹凸高度为32nm。
在该细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,在培养开始起2天后,确认形成细胞聚集块。目视判定中,所形成的细胞聚集块的尺寸均匀。细胞聚集块的高度/直径的比推测为0.5。另外,细胞聚集块中所含的细胞的生存率为89%,为高细胞生存率。另外,添加培养基时,气泡未附着于细胞培养基材。
[实施例2]
将实施例1中的等离子体照射时间变更为10分钟,除此以外与实施例1同样地制作细胞培养基材。
将所制作的细胞培养基材的构成及评价结果示于表2。所制作的细胞培养基材中,亲水性高分子的层的层厚为600nm,(A)区域的面积为0.03mm2,(A)区域与(B)区域的边界的凹凸高度为85nm。
在该细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,在培养开始起2天后,确认形成细胞聚集块。目视判定中,所形成的细胞聚集块的尺寸均匀。细胞聚集块的高度/直径的比推测为0.5。另外,细胞聚集块中所含的细胞的生存率为91%,为高细胞生存率。另外,添加培养基时,气泡未附着于细胞培养基材。
[实施例3]
将实施例1中的等离子体处理的气压变更为13Pa且将等离子体照射时间变更为20分钟,除此以外与实施例1同样地制作细胞培养基材。
将所制作的细胞培养基材的构成及评价结果示于表2。所制作的细胞培养基材中,亲水性高分子的层的层厚为600nm,(A)区域的面积为0.03mm2,(A)区域与(B)区域的边界的凹凸高度为452nm。
在该细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,在培养开始起2天后,确认形成细胞聚集块。目视判定中,所形成的细胞聚集块的尺寸均匀。细胞聚集块的高度/直径的比推测为0.5。另外,细胞聚集块中所含的细胞的生存率为78%,为高细胞生存率。另外,添加培养基时,气泡未附着于细胞培养基材。
[实施例4]
将以固体成分浓度0.01wt%含有作为亲水性高分子的含有磷酸胆碱基的聚合物(Lipidure-CM5210、日油(株)制)的乙醇溶液0.08mL滴加到直径3.5cm的聚苯乙烯皿(基材),在室温下减压干燥,形成亲水性高分子的层。将具有多个直径0.2mm的圆形孔的金属掩模置于亲水性高分子的层上,使用等离子体照射装置(Vacuum Device Inc.制、商品名Plasma Ion Bombarder PIB-20)从金属掩模的上方进行等离子体处理(20Pa气压下、导电电流20mA、照射时间30秒),由此在经等离子体处理的部分形成具有细胞粘附性及细胞增殖性的区域((A)区域)。另外,在被金属掩模遮住的部分形成(B)区域。
将所制作的细胞培养基材的构成及评价结果示于表2。所制作的细胞培养基材中,亲水性高分子的层的层厚为10nm,(A)区域的面积为0.03mm2,(A)区域与(B)区域的边界的凹凸高度为23nm。
在该细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,在培养开始起2天后,确认形成细胞聚集块。目视判定中,所形成的细胞聚集块的尺寸均匀。细胞聚集块的高度/直径的比推测为0.5。另外,细胞聚集块中所含的细胞的生存率为87%,为高细胞生存率。另外,添加培养基时,气泡未附着于细胞培养基材。
[实施例5]
将亲水性高分子的固体成分浓度变更为0.05wt%,除此以外与实施例4同样地制作细胞培养基材。
将所制作的细胞培养基材的构成及评价结果示于表2。所制作的细胞培养基材中,亲水性高分子的层的层厚为50nm,(A)区域的面积为0.03mm2,(A)区域与(B)区域的边界的凹凸高度为21nm。
在该细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,在培养开始起2天后,确认形成细胞聚集块。目视判定中,所形成的细胞聚集块的尺寸均匀。细胞聚集块的高度/直径的比推测为0.5。另外,细胞聚集块中所含的细胞的生存率为92%,为高细胞生存率。另外,添加培养基时,气泡未附着于细胞培养基材。
[实施例6]
将亲水性高分子的固体成分浓度变更为0.15wt%,除此以外与实施例1同样地制作细胞培养基材。
将所制作的细胞培养基材的构成及评价结果示于表2。所制作的细胞培养基材中,亲水性高分子的层厚为1500nm,(A)区域的面积为0.03mm2,(A)区域与(B)区域的边界的凹凸高度为34nm。
在该细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,在培养开始起2天后,确认形成细胞聚集块。目视判定中,所形成的细胞聚集块的尺寸均匀。细胞聚集块的高度/直径的比推测为0.5。另外,细胞聚集块中所含的细胞的生存率为85%,为高细胞生存率。另外,添加培养基时,气泡未附着于细胞培养基材。
[实施例7]
使用膜厚为188μm的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜(lumirror、东丽(株)制)(基材)代替直径3.5cm的聚苯乙烯(PS)皿,除此以外与实施例1同样地制作细胞培养基材。需要说明的是,培养是将制作的细胞培养基材冲切后固定化于皿中而实施的。
将所制作的细胞培养基材的构成及评价结果示于表2。所制作的细胞培养基材中,亲水性高分子的层厚为600nm,(A)区域的面积为0.03mm2,(A)区域与(B)区域的边界的凹凸高度为38nm。
在该细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,在培养开始起2天后,确认形成细胞聚集块。目视判定中,所形成的细胞聚集块的尺寸均匀。细胞聚集块的高度/直径的比推测为0.5。另外,细胞聚集块中所含的细胞的生存率为84%,为高细胞生存率。另外,添加培养基时,气泡未附着于细胞培养基材。
[实施例8]
使用具有多个直径1.5mm的圆形孔的金属掩模代替具有多个直径0.2mm的圆形孔的金属掩模,除此以外与实施例1同样地制作细胞培养基材。
将所制作的细胞培养基材的构成及评价结果示于表2。所制作的细胞培养基材中,亲水性高分子的层厚为600nm,(A)区域的面积为1.76mm2,(A)区域与(B)区域的边界的凹凸高度为35nm。
在该细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,在培养开始起2天后,确认形成细胞聚集块。目视判定中,所形成的细胞聚集块的尺寸均匀。细胞聚集块的高度/直径的比推测为0.5。另外,细胞聚集块中所含的细胞的生存率为89%,为高细胞生存率。另外,添加培养基时,气泡未附着于细胞培养基材。
使用该细胞培养基材,进行人iPS细胞向肠上皮细胞的分化诱导。以1.0mL/皿向细胞培养基材中加入1%玻连蛋白(VTN-N)重组人蛋白溶液(Gibco制),在25℃下静置1小时。1小时后除去1%VTN溶液,以2.0mL/皿加入作为未分化性维持培养基的StemFitAK02N(味之素(株)制),再以3900个/cm2的方式播种人iPS细胞201B7株,在37℃、CO 2浓度5%的环境下培养。另外,细胞播种起24小时后,向培养基中添加Y-27632(富士胶片和光纯药(株)制)(浓度10μM)。通过相位差显微镜观察,确认到粘附于细胞培养基材上的多个圆形的胚状体。
细胞播种起24小时后,以2.0mL/皿加入下述分化诱导培养基,开始分化诱导。
向肠上皮细胞分化诱导的分化诱导培养基的组成为:85% KnockOut DMEM(ThermoFisher制)、15%KnockOut Serum Replacement XenoFree(ThermoFisher制)、0.1mM非必需氨基酸(西格玛奥德里奇制)、2mM Gluta Max-I Supplement(ThermoFisher制)、20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF、PEPRO TECH制)、50μg/mL L(+)-抗坏血酸(富士胶片和光纯药(株))、10ng/mL富组氨酸糖蛋白(hereglin)-β-1(富士胶片和光纯药(株))、200ng/mL Long(R)R3IGF-I(西格玛奥德里奇制)、1%青霉素-链霉素溶液(×100)(富士胶片和光纯药(株))。将添加分化诱导培养基的时刻设为“分化第0天”。之后在至“分化第64天”为止每培养72小时进行分化诱导培养基交换。
图5为“分化第0天”、“分化第43天”及“分化第64天”的细胞的相位差显微镜图像。如图5所示,在“分化第43天”确认小肠来源包囊(cyst)形成,另外,在“分化第64天”,包囊从细胞培养基材剥离。
在“分化第64天”,除去皿内的上述分化诱导培养基,以2.0mL/皿加入PBS(-),清洗。清洗后,向皿中以1.0mL/皿加入细胞剥离液,在37℃、CO2浓度5%的环境下静置5分钟。静置规定时间后除去细胞剥离液,以1.0mL/皿加入分化诱导培养基而将细胞分散。回收所得到的细胞悬浮液,使用Luna自动细胞计数装置(Logos Biosystems制)计测细胞数。
为了评价向肠上皮细胞的分化诱导,采用管家基因标志物(GAPDH)、肠细胞标志物(CDX2)、吸收上皮标志物(VIL1)、肠干细胞标志物(LGR5)对肠细胞标志物及肠干细胞标志物的mRNA的相对表达水平进行定量。作为阳性对照,使用健康成人的小肠组织(R1234226-50、BioChainInstitute)。
将在细胞数计测中回收的“分化第64天”的细胞以1.0×106个/管分配到1.5mL样品管中。进行离心分离(室温、800×g、5分钟)除去上清液。使用RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN公司制)从细胞中提取RNA。用Qubit4Fluorometer测定所提取的RNA的浓度,以成为1μg/6μL的方式用无RNase水(宝生物(株)制)进行浓度调整。在逆转录反应中,使用ReverTra Ace qRT Master Mix with gDNA Remover(东洋纺(株)制)。对于1μL的5倍稀释cDNA(相当于逆转录产物的1/100),使用寡聚dT引物、具有下述表1所示的碱基序列的引物(INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES公司制)及THUNDERBIRD Probe qPCR Mix(东洋纺(株)制),利用QuantStudio3实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific(株)制)实施实时PCR分析。其结果是,确认“分化第64天”的细胞中表达了肠组织来源的CDX2、VIL1及LGR5。
[表1]
引物 | 序列号 | 序列(5’→3’) |
GAPDH | 序列号1 | ACATCGCTCAGACACCATGTGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG |
CDX2 | 序列号2 | GCTGGAGAAGGAGTTTCACTACCTTTGCTCTGCGGTTCTGA |
VIL1 | 序列号3 | TTGCCACAATTCCCTGAGATGATGTTGAGAGAGCCTTTGACT |
LGR5 | 序列号4 | GGAATGTTTCAGGCTCAAGATGTCAAGCAGGTGTTCACAGG |
[实施例9]
将以固体成分浓度0.05wt%含有作为亲水性高分子的含有磷酸胆碱基及UV反应性官能团的聚合物(Lipidure-CM5210、日油(株)制)的乙醇溶液0.08mL滴加到直径3.5cm的聚苯乙烯皿(基材)中,在室温下减压干燥,形成亲水性高分子的层。将具有多个直径0.2mm的圆形孔的金属掩模置于亲水性高分子的层上,使用等离子体照射装置(Vacuum DeviceInc.制、商品名Plasma Ion Bombarder PIB-20)从金属掩模的上方进行等离子体处理(20Pa气压下、导电电流20mA、照射时间30秒),由此在经等离子体处理的部分形成具有细胞粘附性及细胞增殖性的区域((A)区域)。另外,在被金属掩模遮住的部分形成(B)区域。
将所制作的细胞培养基材的构成及评价结果示于表2。所制作的细胞培养基材中,亲水性高分子的层的层厚为50nm,(A)区域的面积为0.03mm2,(A)区域与(B)区域的边界的凹凸高度为33nm。
在该细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,在培养开始起2天后,确认形成细胞聚集块。目视判定中,所形成的细胞聚集块的尺寸均匀。细胞聚集块的高度/直径的比推测为0.5。另外,细胞聚集块中所含的细胞的生存率为86%,为高细胞生存率。另外,添加培养基时,气泡未附着于细胞培养基材。
[实施例10]
将与实施例1同样地制作的细胞培养基材的表面(形成有含有亲水性高分子的层的一侧)用具有水不溶性嵌段链段及温度响应性嵌段链段的嵌段共聚物(温度响应性高分子)覆盖,制作细胞培养基材。具体而言,向试管中加入4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊酸0.40g(0.1mmol)、甲基丙烯酸正丁酯7.11g(50mmol)、偶氮双(异丁腈)33mg(0.2mmol),溶解于1,4-二噁烷50mL。通过氮气鼓泡进行30分钟脱气后,在70℃下反应24小时。反应结束后,利用旋转蒸发器将反应溶剂减压馏去,将反应溶液浓缩。将浓缩液注入甲醇250mL中,回收所析出的黄色油状物质,减压干燥,得到甲基丙烯酸正丁酯聚合物。
向试管中加入所得到的上述甲基丙烯酸正丁酯聚合物0.9g(0.3mmol)、N-异丙基丙烯酰胺8.14g(72mmol)、偶氮双异丁腈5mg(0.03mmol),溶解于1,4-二噁烷15mL。通过氮气鼓泡进行30分钟脱气后,在65℃下反应17小时。反应结束后,将反应溶剂用丙酮稀释,注入到己烷500mL中,将析出的固体回收,减压干燥。另外,再次溶解于丙酮,注入到纯水500mL中,将析出的固体回收、减压干燥,得到N-异丙基丙烯酰胺与甲基丙烯酸正丁酯的嵌段共聚物。将合成的嵌段共聚物以0.5wt%溶解于乙醇,以2000rpm旋涂于细胞培养基材的表面(形成有含有亲水性高分子的层的一侧)。
需要说明的是,嵌段共聚物的结构单元比率为甲基丙烯酸正丁酯4wt%、N-异丙基丙烯酰胺96wt%,嵌段共聚物的数均分子量(Mn)为7.7万。嵌段共聚物(温度响应性高分子)层的层厚由在聚苯乙烯皿上直接覆盖嵌段共聚物(温度响应性高分子)时的标准曲线求出。其结果是,嵌段共聚物(温度响应性高分子)层的层厚为25nm。
将所制作的细胞培养基材的构成及评价结果示于表2。所制作的细胞培养基材中,亲水性高分子的层的层厚为600nm,(A)区域的面积为0.03mm2,(A)区域与(B)区域的边界的凹凸高度为4nm。
在该细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,在培养开始起2天后,确认形成细胞聚集块。目视判定中,所形成的细胞聚集块的尺寸均匀。细胞聚集块的高度/直径的比推测为0.5。细胞聚集块通过将细胞培养基材冷却而剥离。另外,细胞聚集块中所含的细胞的生存率为88%,为高细胞生存率。另外,添加培养基时,气泡未附着于细胞培养基材。
[实施例11]
将与实施例1同样地制作的细胞培养基材的表面(形成有含有亲水性高分子的层的一侧)用包含水不溶性的单体单元和温度响应性的单体单元的无规共聚物覆盖,制作细胞培养基材。具体而言,向试管中加入4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊酸0.40g(0.1mmol)、甲基丙烯酸正丁酯7.11g(50mmol)、偶氮双(异丁腈)33mg(0.2mmol)、N-异丙基丙烯酰胺5.65g(50mmol)、偶氮双异丁腈5mg(0.03mmol),溶解于1,4-二噁烷15mL。通过氮气鼓泡进行30分钟脱气后,在70℃下反应24小时。反应结束后,将反应溶剂用丙酮稀释,注入到己烷500mL中,将析出的固体回收,减压干燥。另外,再次溶解于丙酮,注入到纯水500mL中,将析出的固体回收,减压干燥,得到N-异丙基丙烯酰胺与甲基丙烯酸正丁酯的无规共聚物。将得到的无规共聚物以0.5wt%溶解于乙醇,以2000rpm旋涂于细胞培养基材的表面(形成有含有亲水性高分子的层的一侧)。
需要说明的是,无规共聚物的结构单元比率为甲基丙烯酸正丁酯54wt%、N-异丙基丙烯酰胺46wt%,无规共聚物的数均分子量(Mn)为15.8万。无规共聚物层的层厚由在聚苯乙烯皿上直接覆盖无规共聚物时的标准曲线求出。其结果是,无规共聚物层的层厚为25nm。需要说明的是,无规共聚物层不属于基于温度响应性高分子的层,但是在表2中为了方便而记载在基于温度响应性高分子的层一栏中。
将所制作的细胞培养基材的构成及评价结果示于表2。所制作的细胞培养基材中,亲水性高分子的层的层厚为600nm,(A)区域的面积为0.03mm2,(A)区域与(B)区域的边界的凹凸高度为4nm。
在该细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,在培养开始起2天后,确认形成细胞聚集块。目视判定中,所形成的细胞聚集块的尺寸均匀。细胞聚集块的高度/直径的比推测为0.5。细胞聚集块无法通过将细胞培养基材冷却而剥离。另外,细胞聚集块中所含的细胞的生存率为85%,为高细胞生存率。另外,添加培养基时,气泡未附着于细胞培养基材。
[实施例12]
对膜厚180μm的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜(COSMOSHINE、东洋纺(株)制)进行等离子体处理(20Pa气压下、导电电流20mA、照射时间30秒)。将以固体成分浓度0.1wt%含有作为亲水性高分子的具有叠氮基的聚乙烯醇(BIOSURFINE(R)-AWP、东洋合成工业(株)制)的水/乙醇溶液,以2000rpm旋涂于上述PET膜的等离子体处理面。将具有多个直径0.2mm的圆形的铬蒸镀区域的石英掩模置于亲水性高分子的层上,使用高压汞灯从石英掩模的上方进行10秒UV照射。用水/乙醇=20/80的混合溶剂清洗,将UV未照射的亲水性聚合物溶解除去,由此形成具有细胞粘附性及细胞增殖性的区域((A)区域)。另外,在UV照射部分形成(B)区域。将该PET膜与去除了底面的孔板(具有贯通孔的板)贴合。
将所制作的细胞培养基材的构成及评价结果示于表2。所制作的细胞培养基材中,亲水性高分子的层的层厚为50nm,(A)区域的面积为0.03mm2,(A)区域与(B)区域的边界的凹凸高度为50nm。
在该细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,在培养开始起2天后,确认形成细胞聚集块。目视判定中,所形成的细胞聚集块的尺寸均匀。细胞聚集块的高度/直径的比推测为0.5。另外,细胞聚集块中所含的细胞的生存率为90%,为高细胞生存率。另外,添加培养基时,气泡未附着于细胞培养基材。
[参考例1]
作为实施例12的清洗工序中使用的溶剂,使用纯水、水/乙醇=80/20的混合溶剂、水/乙醇=50/50的混合溶剂、乙醇以代替水/乙醇=20/80的混合溶剂,此外与实施例12同样地制作细胞培养基材。
在这些细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,将比较结果示于表3。可知,通过在清洗工序中使用水/乙醇混合溶剂,能够提高(A)区域的细胞粘附性及细胞增殖性。
[参考例2]
作为实施例12的基材,使用厚1.2mm的PS板、厚0.1mm的聚碳酸酯(PC)膜(Iupilon、三菱瓦斯(株)制)、聚乙烯(PE)膜、聚丙烯(PP)膜、Permanox玻片腔室(ThermoScientific制)以代替PET膜,此外与实施例12同样地制作细胞培养基材。
在这些细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,将培养的细胞以放大倍率40倍进行相位差观察。另外,进行荧光染色并观察细胞,将比较的结果示于表4。可知,通过使基材具有在结构单元中包含脂环式烃基或芳香族烃基的高分子,从而(A)区域的细胞增殖性优异。另外可知,通过基材的折射率为1.4~1.6、厚度为0.01~0.5mm,可得到细胞的清晰的相位差图像。进而可知,基材的自身荧光低,从而可得到细胞的清晰的荧光图像。
[比较例1]
将亲水性高分子的固体成分浓度变更为0.003wt%,除此以外与实施例4同样地制作细胞培养基材。
将所制作的细胞培养基材的构成及评价结果示于表2。所制作的细胞培养基材中,亲水性高分子的层的层厚为3nm,经等离子体处理的区域的面积为0.03mm2,经等离子体处理的区域与未经等离子体处理的区域的边界处的凹凸高度为25nm。
在该细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,但是细胞在细胞培养基材整面上进行粘附及增殖,未形成细胞聚集块。
[比较例2]
将亲水性高分子的固体成分浓度变更为3wt%,除此以外与实施例4同样地制作细胞培养基材。
将所制作的细胞培养基材的构成及评价结果示于表2。所制作的细胞培养基材中,亲水性高分子的层的层厚为3000nm,经等离子体处理的区域的面积为0.03mm2,经等离子体处理的区域与未等离子体处理的区域的边界的凹凸高度为38nm。
在该细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,细胞未粘附及增殖,因此未形成细胞聚集块。
[比较例3]
对于直径3.5cm的聚苯乙烯(PS)皿的内表面,使用等离子体照射装置进行(VacuumDevice Inc.制、商品名Plasma Ion Bombarder PIB-20)等离子体处理(20Pa气压下、导电电流20mA、照射时间30秒)。将以固体成分浓度0.08wt%含有作为亲水性高分子的具有叠氮基的聚乙烯醇(BIOSURFINE(R)-AWP、东洋合成工业(株)制)的乙醇溶液0.8mL滴加到经等离子体处理的PS皿中,在室温下减压干燥,形成亲水性高分子的膜。将具有多个直径0.2mm的圆形的黑色图案的铬掩模置于亲水性高分子的膜上,进行UV照射,由此使亲水性高分子的一部分固化。接着,用纯水清洗数次,由此除去未固化的亲水性高分子。将制作的细胞培养基材的构成及评价结果示于表2。
在该细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,在培养开始起1天后确认形成细胞聚集块,但是细胞聚集块中所含的细胞的生存率为65%,细胞生存率低。
[比较例4]
对于直径3.5cm的聚苯乙烯(PS)皿的内表面,使用等离子体照射装置(VacuumDevice Inc.制、商品名Plasma Ion Bombarder PIB-20)进行等离子体处理(20Pa气压下、导电电流20mA、照射时间30秒)。通过激光加工在表面保护膜(日东电工(株)制、E-MASK)上形成多个直径0.2mm的圆形孔,将该表面保护膜贴合于经等离子体处理的PS皿的内表面。
将所制作的细胞培养基材的构成及评价结果示于表2。所制作的细胞培养基材不具有亲水性高分子的层,经等离子体处理的区域(未被表面保护膜覆盖的区域)的面积为0.03mm2,经等离子体处理的区域(未被表面保护膜覆盖的区域)与被表面保护膜覆盖的区域的边界的凹凸高度为约58μm。
在该细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,在培养开始起1天后确认形成细胞聚集块,细胞聚集块中所含的细胞的生存率为53%,细胞生存率低。另外,添加培养基时,细胞培养基材上附着了气泡。
[比较例5]
未实施等离子体处理,除此以外与实施例1同样地制作细胞培养基材。将制作的细胞培养基材的构成及评价结果示于表2。在该细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,但是细胞未粘附及增殖,因此未形成细胞聚集块。
[比较例6]
不使用亲水性高分子(未形成亲水性高分子的层),除此以外与实施例1同样地制作细胞培养基材。将制作的细胞培养基材的构成及评价结果示于表2。在该细胞培养基材上进行人iPS细胞的培养评价,但是细胞在细胞培养基材整面上粘附及增殖,未形成细胞聚集块。
[表2]
[表3]
[表4]
附图标记说明
A…(A)区域、B…(B)区域、H…(A)区域与(B)区域的边界的凹凸高度、1…基材、2…含有亲水性高分子的层、10,11…细胞培养基材、20…隔板。
序列表
<110> 东曹株式会社(TOSOH CORPORATION)
<120> 细胞培养基材及其制造方法、多能干细胞的分化诱导方法、以及细胞培养试剂盒
<130> FP22-0321-00
<150> P2021-075266
<151> 2021-04-27
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
acatcgctca gacaccatgt gtagttgagg tcaatgaagg g 41
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
gctggagaag gagtttcact acctttgctc tgcggttctg a 41
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
ttgccacaat tccctgagat gatgttgaga gagcctttga ct 42
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
ggaatgtttc aggctcaaga tgtcaagcag gtgttcacag g 41
Claims (21)
1.一种细胞培养基材,其具备基材和覆盖所述基材的表面的至少一部分的层厚为5~2000nm的含有亲水性高分子的层,
所述亲水性高分子包含磷酸胆碱基或羟基,
所述细胞培养基材具有下述(A)区域及下述(B)区域,
所述(A)区域与所述(B)区域的边界的凹凸高度为1~500nm,
(A)具有细胞粘附性及细胞增殖性的面积为0.001~5mm2的岛状的区域、
(B)与所述(A)区域邻接且不具有细胞粘附性或细胞增殖性的区域。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基材,其中,所述亲水性高分子包含下述通式(1)所示的化合物、下述通式(2)所示的化合物、或下述通式(3)所示的化合物,
通式(1)中,R1及R2各自独立地表示氢原子或甲基,R3表示氢原子或任意的有机基团,m及n各自独立地表示正整数,
通式(2)中,R4、R5及R6各自独立地表示氢原子或甲基,R7表示氢原子或任意的有机基团,x、y及z各自独立地表示正整数,
通式(3)中,R8及R9各自独立地表示氢原子或甲基,R10表示氢原子或任意的有机基团,a及b各自独立地表示正整数。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养基材,其中,所述亲水性高分子包含具有UV反应性官能团或UV反应后的残基的单体单元。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的细胞培养基材,其中,所述(A)区域的XPS测定的C1s谱中的287eV的峰强度/285eV的峰强度之比比所述(B)区域的XPS测定的C1s谱中的287eV的峰强度/285eV的峰强度之比大0.05以上。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的细胞培养基材,其中,
在所述含有亲水性高分子的层的表面还具备层厚为1~100nm的含有温度响应性高分子的层,
所述温度响应性高分子为包含水不溶性嵌段链段及温度响应性嵌段链段的嵌段共聚物。
6.根据权利要求5所述的细胞培养基材,其中,所述温度响应性嵌段链段的重量相对于所述水不溶性嵌段链段及所述温度响应性嵌段链段的总重量的比例超过90重量%。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的细胞培养基材,其中,所述基材的折射率为1.4~1.6,并且所述基材的厚度为0.01~0.5mm。
8.根据权利要求1~7中任一项所述的细胞培养基材,其中,以激发波长350nm、488nm及647nm分别激发出的所述基材的荧光强度小于以相同激发波长激发出的厚度1.2mm的聚苯乙烯板的荧光强度。
9.根据权利要求1~8中任一项所述的细胞培养基材,其中,
所述(A)区域的面积为0.005~0.2mm2,
以所述(A)区域与所述(B)区域的合计面积为基准,所述(A)区域的数量为200~1000个/cm2。
10.根据权利要求1~9中任一项所述的细胞培养基材,其中,
所述(A)区域的面积为0.2~2mm2,
以所述(A)区域与所述(B)区域的合计面积为基准,所述(A)区域的数量为3~15个/cm2。
11.根据权利要求1~10中任一项所述的细胞培养基材,其中,所述(A)区域彼此间的最小距离为500~10000μm。
12.根据权利要求1~11中任一项所述的细胞培养基材,其用于从多能干细胞向三胚层细胞的分化诱导。
13.根据权利要求1~12中任一项所述的细胞培养基材,其中,所述基材由聚碳酸酯或环烯烃聚合物形成。
14.权利要求1~13中任一项所述的细胞培养基材的制造方法,其具备下述工序:
(1)将基材的表面的至少一部分用含有UV反应性的亲水性高分子的组合物覆盖,形成所述含有亲水性高分子的层的工序;
(2)对所述含有亲水性高分子的层进行UV照射,将所述含有亲水性高分子的层固定化于所述基材的表面的工序;及
(3)对经固定化的所述含有亲水性高分子的层的表面的一部分进行等离子体处理,在进行了等离子体处理的部分形成所述(A)区域的工序。
15.权利要求1~13中任一项所述的细胞培养基材的制造方法,其具备下述工序:
(1’)使用由在重复单元中包含脂环式烃基或芳香族烃基的高分子形成的基材,对所述基材的表面进行等离子体处理,在进行了等离子体处理的部分形成所述(A)区域的工序;
(2’)将所述基材的表面的至少一部分用含有UV反应性的亲水性高分子的组合物覆盖,形成所述含有亲水性高分子的层的工序;
(3’)对所述含有亲水性高分子的层的一部分进行UV照射,将所述含有亲水性高分子的层的一部分固定化于所述基材的表面的工序;及
(4’)用溶剂对所述亲水性高分子进行清洗,将未固定化于表面的亲水性高分子溶解、从所述基材的表面除去的工序。
16.根据权利要求15所述的细胞培养基材的制造方法,其中,所述工序(4’)中使用的溶剂含有水及醇。
17.根据权利要求14~16中任一项所述的制造方法,其还具备下述工序:
(4)在所述工序(3)或(4’)之后,将具有面内方向的截面积为0.05~100cm2的贯通孔的板在所述基材的被所述含有亲水性高分子的层覆盖的表面侧与所述基材贴合的工序。
18.根据权利要求14~17中任一项所述的制造方法,其还具备下述工序:
(5)在所述工序(3)或(4’)之后,用含有温度响应性高分子的组合物覆盖进行了等离子体处理的所述含有亲水性高分子的层的表面,形成所述含有温度响应性高分子的层。
19.一种多能干细胞的分化诱导方法,其包括下述工序:
(i)在权利要求1~13中任一项所述的细胞培养基材中播种多能干细胞的工序;
(ii)对所述多能干细胞进行培养,形成高度/直径的比为0.2~0.8的半球状的细胞聚集块的工序;及
(iii)对所述细胞聚集块进行分化诱导,形成三胚层细胞的细胞聚集块的工序。
20.根据权利要求19所述的多能干细胞的分化诱导方法,其还具备下述(iv)所示的工序,
(iv)在包含选自由Wnt蛋白、骨形成蛋白、胰岛素样生长因子及活化素组成的组中的至少一种分化诱导因子的培养基中培养细胞聚集块,表达肠上皮细胞所具有的标志物的工序。
21.一种细胞培养试剂盒,其包含:嵌段共聚物或含有所述嵌段共聚物的涂覆剂、以及权利要求1~13中任一项所述的细胞培养基材,所述嵌段共聚物包含水不溶性嵌段链段及温度响应性嵌段链段。
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