TW202229537A

TW202229537A - 培養構件及其用途

Info

Publication number: TW202229537A
Application number: TW110145972A
Authority: TW
Inventors: 江刺家勝弘; 宮廻寛; 河関孝志; 天野仰; 西條任信; 矢内久陽
Original assignee: 日商三井化學股份有限公司
Priority date: 2020-12-23
Filing date: 2021-12-09
Publication date: 2022-08-01
Also published as: JPWO2022138101A1; WO2022138101A1; CN116583595A; EP4269558A1; KR20230079442A

Abstract

本發明提供一種可對細胞等進行培養來形成球狀體的培養構件及培養器具。一種培養構件，為於其培養面上培養細胞、組織或器官的培養構件，所述培養構件包含4-甲基-1-戊烯聚合物（X），所述培養面的水接觸角為大於100°且160°以下，溫度23℃、濕度0%時的氧透過率為4500 cm ³/（m ²×24 h×atm）～90000 cm ³/（m ²×24 h×atm）。

Description

培養構件及其用途

本發明是有關於一種培養構件及其用途。

生物體的器官及組織中，構成該些的細胞彼此三維形成網絡並顯現功能。因此，以充分發揮細胞本來具有的功能為目的，而製作與先前的平面細胞培養不同地三維培養細胞而獲得的球狀體（spheroid）並備受關注。關於球狀體，報告有於細胞的功能評價及藥劑的篩選等中，與平面培養的細胞相比，可獲得更接近生物體的結果，並且於藥物開發中作為填補體外（in vitro）試驗與體內（in vivo）試驗之間的溝的重要工具而被期待。另外，以誘導性富潛能幹細胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）為首的幹細胞作為再生醫療或細胞治療的重要細胞源而被期待，並要求大量製備高品質的細胞。若對幹細胞進行三維培養來形成球狀體，則能夠於維持細胞本來的多潛能（未分化狀態）的狀態下進行高密度培養，因此於再生醫療中，球狀體的有用性亦受到關注。伴隨於此，對於用以大量、穩定且簡單地獲取均勻的形狀或尺寸的細胞球狀體的新的細胞培養技術的要求亦提高。

根據以上所述的情況，而開發有形成球狀體的各種方法。例如如下方法：為了阻礙細胞的黏附而使用對表面進行了加工或處理的培養容器的方法（專利文獻1）；於形成有細胞黏附性低的樹脂層的容器內以浮游狀態進行培養的方法（專利文獻2）；藉由將培養容器的蛋白聚糖（proteoglycan）的吸附量設為特定的數值以上，而使球狀體於附著於培養容器表面上的狀態下形成的方法（專利文獻3）等。特別是，於對非黏附性的細胞進行培養來形成球狀體的情況下，通常進行使細胞不與培養容器的表面黏附的處理（例如，對培養容器的表面進行超親水化處理、設為疏水性、或者設為不易黏附的結構等）。 [現有技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第2020/013345號公報 [專利文獻2]日本專利特開2008-061609號公報 [專利文獻3]日本專利特開2017-77241號公報

[發明所欲解決之課題]

本發明是鑒於所述情況而成，且課題在於提供一種可對細胞等進行培養來形成球狀體的培養構件及培養器具。另外，課題在於提供一種形狀穩定性優異、且可實現適合於培養細胞、組織或器官的氧環境、不發出自發螢光且不損及細胞觀察性、不易吸收藥劑的培養構件及培養器具。進而，課題在於提供一種能夠於分化細胞純度高的狀態下培養特別是幹細胞來源的分化細胞的培養構件及培養器具。 [解決課題之手段]

本發明者等人為了解決所述課題而進行了努力研究。其結果發現藉由具有以下結構的培養構件等而可解決所述課題，從而完成了本發明。本發明例如為以下的〔1〕～〔12〕。〔1〕一種培養構件，為於其培養面上培養細胞、組織或器官的培養構件，所述培養構件包含4-甲基-1-戊烯聚合物（X），所述培養面的水接觸角為大於100°且160°以下，溫度23℃、濕度0%時的氧透過率為4500 cm ³/（m ²×24 h×atm）～90000 cm ³/（m ²×24 h×atm）。〔2〕如〔1〕所述的培養構件，其中，所述4-甲基-1-戊烯聚合物（X）為4-甲基-1-戊烯與選自乙烯及碳數3～20的α-烯烴（4-甲基-1-戊烯除外）中的至少一種的共聚物（x1）。〔3〕如〔1〕或〔2〕所述的培養構件，其中，所述培養面未實施凹凸結構的形成加工。〔4〕如〔1〕至〔3〕中任一項所述的培養構件，用於球狀體形成用途。〔5〕如〔1〕至〔4〕中任一項所述的培養構件，其中，所述細胞、組織或器官包含iPS細胞來源的分化細胞。〔6〕如〔1〕至〔5〕中任一項所述的培養構件，其中，所述細胞、組織或器官包含心肌細胞。〔7〕如〔1〕至〔6〕中任一項所述的培養構件，其中，所述培養構件的形狀為膜狀或片狀。〔8〕一種培養器具，其中，至少培養面由如〔1〕至〔7〕中任一項所述的培養構件形成。〔9〕一種細胞、組織或器官的培養方法，包括：步驟（A），使細胞、組織或器官與如〔1〕至〔7〕中任一項所述的培養構件或如〔8〕所述的培養器具的培養面接觸；以及步驟（B），對與所述培養面接觸的細胞、組織或器官進行培養來形成球狀體。〔10〕如〔9〕所述的細胞、組織或器官的培養方法，更包括誘導所述細胞等的分化的步驟（C），步驟（C）為藉由無蛋白質心肌分化誘導（PFCD）法來誘導iPS細胞向心肌細胞的分化的步驟。〔11〕如〔9〕或〔10〕所述的細胞、組織或器官的培養方法，其中，使心肌純度增加。〔12〕一種球狀體，藉由如〔9〕至〔11〕中任一項所述的培養方法來形成。 [發明的效果]

根據本發明，可提供一種可對細胞等進行培養來形成球狀體的培養構件及培養器具。另外，根據本發明，可提供一種形狀穩定性優異、且可實現適合於培養細胞、組織或器官的氧環境、不發出自發螢光且不損及細胞觀察性、不易吸收藥劑的培養構件及培養器具。進而，根據本發明，可提供一種能夠於分化細胞純度高的狀態下培養特別是幹細胞來源的分化細胞的培養構件及培養器具。另外，本發明的培養構件及培養器具容易使iPS細胞分化為心肌細胞。

與數值範圍相關的「A～B」的記載只要無特別說明，則表示A以上且B以下。例如，「1%～5%」的記載是指1%以上且5%以下。

[培養構件] 本發明的培養構件為於其培養面培養細胞、組織或器官（以下，亦稱為細胞等）的構件，其特徵在於：所述培養構件包含4-甲基-1-戊烯聚合物（X），所述培養面的水接觸角為大於100°且160°以下，溫度23℃、濕度0%時的氧透過率為4500 cm ³/（m ²×24 h×atm）～90000 cm ³/（m ²×24 h×atm）。此處，所謂培養構件是指構成用以培養細胞等的培養器具的至少一部分的構件。於培養構件為所述培養器具的一部分的情況下，至少培養細胞等的培養面由本發明的培養構件構成。此處，所謂培養面是指於培養細胞等時，形成培養基的面、接種細胞等的面或者形成培養基且接種細胞等的面。即，所謂培養面是包含培養基形成預定面及細胞等接種預定面的概念。

於本說明書中，所謂培養是以不僅包含使細胞等增殖、維持的製程，而且亦包含細胞等的接種、繼代、分化誘導、自組織化誘導等製程的廣泛含義使用。

本發明的培養構件的形態並無特別限制，例如可為膜狀、片狀。於所述培養構件為膜狀或片狀的情況下，可適合用作將膜狀或片狀的培養構件的至少一面設為培養面的培養器具。

本發明的培養構件是指於培養面上未塗敷用於成為細胞等的支架的天然高分子材料、合成高分子材料或無機材料的構件。

另外，本發明的培養構件的厚度並無特別限制，較佳為20 μm～500 μm，更佳為25 μm～400 μm，特佳為50 μm～200 μm。若培養構件的厚度為所述範圍內，則可獲得於細胞增殖方面所需的適度的培養基中的氧濃度，容易製作培養構件、特別是培養容器底面不會撓曲且合適的培養器具。

將本發明的培養構件配置於容器底面來製作盤（亦稱為培養皿）、燒瓶、墊（insert）或板等培養器具時的培養構件的厚度並無特別限定，較佳為20 μm～400 μm，更佳為20 μm～300 μm，進而佳為20 μm～200 μm的厚度。培養構件的厚度可根據培養器具的形態而適宜選擇，藉由調整到所述範圍，容易獲得於細胞增殖方面所需的適度的培養基中的氧濃度，容易製作具有充分的強度且合適的培養器具。

關於本發明的培養構件，只要不損及本發明的效果，則亦可對其表面進行加工。作為表面的加工，例如可列舉凹凸結構的形成加工、親水化處理、疏水化處理等表面改質處理。本發明的培養構件即便不對其表面進行加工，細胞亦不易黏附，因此可形成球狀體。因此，本發明的培養構件較佳為未對其表面進行加工，更佳為未實施凹凸結構的形成加工。

表面改質處理中使用的方法並無特別限定，例如可列舉：電暈處理、電漿處理、臭氧處理、紫外線處理等親水化處理；酯化、矽烷化、氟化等疏水化處理；表面接枝聚合；化學蒸鍍；蝕刻；或羥基、胺基、碸基、硫醇基、羧基等特定的官能基加成；矽烷偶合、鈦偶合、鋯偶合等利用特定的官能基進行的處理；利用氧化劑等進行的表面粗糙化；摩擦或噴砂等物理處理等。該些表面改質處理可單獨進行，亦可將兩種以上組合進行。再者，於進行表面改質處理的情況下，較佳為至少於培養面上進行。

本發明的培養構件的製造方法並無特別限制，製造中使用的機器亦不受限制。例如，可形成包含4-甲基-1-戊烯聚合物（X）的膜或片，視需要將該膜或片成形而製成設為所期望的形狀的成形品來製作培養構件。成為培養構件的膜、片或其他成形品亦可藉由利用擠出成形、溶液流延成形、射出成形、吹塑成形等方法直接進行成形來獲得。

作為形成所述膜或片的方法，具體而言，例如可採用通常的充氣成形法、T字模擠出法等。通常進行加溫來進行製造。於採用T字模擠出法的情況下，擠出溫度較佳為100℃～400℃，特佳為200℃～300℃。另外，輥溫度較佳為45℃～75℃，特佳為55℃～65℃。

另外，所述膜或片亦可利用如下溶液流延法來製造：將4-甲基-1-戊烯聚合物（X）溶解於溶劑中，流到樹脂或金屬上，一邊調平一邊緩慢晾乾並加以膜化（片化）。所使用的溶劑並無特別限制，可使用環己烷、己烷、癸烷、甲苯等烴溶劑。另外，考慮到4-甲基-1-戊烯聚合物（X）的溶解性或乾燥效率，溶劑亦可混合兩種以上。可藉由利用台塗佈（table coat）、旋塗、浸塗、模塗、噴塗、棒塗、輥塗、幕式流塗（curtain flow coat）等方法來塗佈聚合物溶液，並加以乾燥、剝離，從而加工成膜或片。

本發明的培養構件較佳為球狀體形成用培養構件，更佳為球狀體形成用細胞培養構件。

[4-甲基-1-戊烯聚合物] 於本發明中，將4-甲基-1-戊烯均聚物及4-甲基-1-戊烯與其他單體的共聚物加以統稱而稱為「4-甲基-1-戊烯聚合物（X）」。關於作為4-甲基-1-戊烯聚合物的一例的、4-甲基-1-戊烯與其他單體的共聚物，可為無規共聚物、交替共聚物、嵌段共聚物、接枝共聚物的任一種。作為4-甲基-1-戊烯與其他單體的共聚物，4-甲基-1-戊烯與選自乙烯及碳數3～20的α-烯烴（4-甲基-1-戊烯除外）中的至少一種烯烴的共聚物的強度高，即便用作構件，亦不易破損亦不易破裂且撓曲亦少，因此較佳。

作為4-甲基-1-戊烯聚合物，較佳為選自4-甲基-1-戊烯均聚物、以及4-甲基-1-戊烯與選自乙烯及碳數3～20的α-烯烴（4-甲基-1-戊烯除外）中的至少一種烯烴的共聚物中的至少一種聚合物，更佳為4-甲基-1-戊烯與選自乙烯及碳數3～20的α-烯烴（4-甲基-1-戊烯除外）中的至少一種烯烴的共聚物。

作為所述烯烴，例如可列舉：乙烯、丙烯、1-丁烯、1-己烯、1-庚烯、1-辛烯、1-癸烯、1-十四烯、1-十六烯、1-十七烯、1-十八烯、1-二十烯。所述烯烴可根據培養構件所需的物性來適宜選擇。例如，作為所述烯烴，就適度的氧透過率與優異的剛性的觀點而言，較佳為碳數8～18的α-烯烴，更佳為選自1-辛烯、1-癸烯、1-十二烯、1-十四烯、1-十六烯、1-十七烯及1-十八烯中的至少一種。若烯烴的碳數處於所述範圍內，則有聚合物的加工性變得更良好，不易產生由裂紋或端部的破裂引起的培養構件的外觀不良的傾向。另外，培養構件的不良品發生率變低。

所述烯烴可使用一種或兩種以上。就材料的強度的觀點而言，碳數較佳為2以上，進而佳為碳數10以上。於組合不同的兩種以上的α-烯烴的情況下，特佳為將選自1-十四烯及1-十六烯中的至少一種與選自1-十七烯及1-十八烯中的至少一種加以組合。

所述4-甲基-1-戊烯聚合物中的由4-甲基-1-戊烯衍生的結構單元的含量較佳為60莫耳%～100莫耳%，更佳為80莫耳%～98莫耳%。另外，於4-甲基-1-戊烯聚合物為4-甲基-1-戊烯與選自乙烯及碳數3～20的α-烯烴（4-甲基-1-戊烯除外）中的至少一種烯烴的共聚物的情況下，該共聚物中的由選自乙烯及碳數3～20的α-烯烴（4-甲基-1-戊烯除外）中的至少一種烯烴衍生的結構單元的含量較佳為0莫耳%～40莫耳%，更佳為2莫耳%～20莫耳%。再者，關於該些結構單元的含量，將4-甲基-1-戊烯聚合物中的全部重複結構單元量設為100莫耳%。若結構單元的含量處於所述範圍內，則加工性優異且可獲得均質的培養面，而且膜的韌性與強度的平衡良好，因此撓曲亦變少。

所述4-甲基-1-戊烯聚合物亦可於不損及本發明的效果的範圍內具有由4-甲基-1-戊烯衍生的結構單元以及由所述乙烯及碳數3～20的α-烯烴衍生的結構單元以外的結構單元（以下亦稱為「其他結構單元」）。其他結構單元的含量例如為0莫耳%～10.0莫耳%。於所述4-甲基-1-戊烯聚合物具有其他結構單元的情況下，其他結構單元可為一種亦可為兩種以上。

作為衍生出其他結構單元的單體，例如可列舉：環狀烯烴、芳香族乙烯基化合物、共軛二烯、非共軛聚烯、官能乙烯基化合物、含羥基的烯烴、鹵化烯烴。作為環狀烯烴、芳香族乙烯基化合物、共軛二烯、非共軛聚烯、官能乙烯基化合物、含羥基的烯烴及鹵化烯烴，例如可使用日本專利特開2013-169685號公報的段落[0035]～段落[0041]中記載的化合物。

所述4-甲基-1-戊烯聚合物可單獨使用一種，亦可將兩種以上組合使用。

作為4-甲基-1-戊烯聚合物，亦可使用市售品。具體而言，可列舉三井化學（股）製造的TPX MX001、MX002、MX004、MX0020、MX021、MX321、RT18、RT31或DX845（均為商標）等。另外，即便是由其他製造商製造，只要是滿足所述要件的4-甲基-1-戊烯聚合物，則亦可較佳地使用。該些市售品可單獨使用一種，亦可將兩種以上組合使用。

4-甲基-1-戊烯聚合物通常熔點為200℃～240℃，耐熱性高。另外，由於不產生水解且耐水性、耐沸水性、耐蒸汽性優異，因此包含4-甲基-1-戊烯聚合物的培養器具等的培養構件能夠進行高壓蒸汽滅菌處理。另外，4-甲基-1-戊烯聚合物具有可見光線透過率高（通常為90%以上）且不發出自發螢光的特徵，因此包含4-甲基-1-戊烯聚合物的培養器具容易進行培養細胞的觀察。進而，對大部分藥品顯示出優異的耐藥品性，不易吸收藥劑，因此亦適合用於藥物開發篩選用途或診斷用途。4-甲基-1-戊烯聚合物能夠進行熱封，不僅容易進行本材料彼此的熱熔接，而且亦容易進行與其他材料的熱黏附。另外，由於能夠進行熱成形，因此容易成形為任意形狀的培養器具，亦容易進行使用例如壓印法或嵌入法（insert method）的成形。

4-甲基-1-戊烯聚合物的、藉由以標準聚苯乙烯為基準物質的凝膠滲透層析法（Gel Permeation Chromatography，GPC）而測定的重量平均分子量（Mw）較佳為10000～2000000，更佳為20000～1000000，進而佳為30000～500000。此處，GPC測定時的試樣濃度例如可設為1.0 mg/ml～5.0 mg/ml。另外，4-甲基-1-戊烯聚合物的分子量分佈（Mw/Mn）較佳為1.0～30，更佳為1.1～25，進而佳為1.1～20。GPC中所使用的溶劑可較佳地使用鄰二氯苯。另外，作為測定條件的一例，可列舉後述的實施例中所示的條件，但並不限定於該測定條件。

藉由將重量平均分子量（Mw）設為所述上限以下，於後述的4-甲基-1-戊烯聚合物的成形法中，利用熔融成形製作的膜容易抑制凝膠等不良狀況的發生，容易進行表面均勻的製膜。另外，於利用溶液流延法進行製作時，使於溶劑中的溶解性更良好，容易抑制膜的凝膠等不良狀況，容易進行表面均勻的製膜。

另外，藉由將重量平均分子量（Mw）設為所述下限以上，有培養構件的強度變得充分的傾向。進而，藉由將分子量分佈設為所述範圍內，容易抑制所製作的培養構件表面的發黏，且有培養構件的韌性亦變得充分的傾向，容易抑制成形時的彎曲或裁斷時的裂紋的發生等。

關於所述4-甲基-1-戊烯聚合物的重量平均分子量（Mw）及分子量分佈（Mw/Mn），於使用兩種以上的聚合物作為4-甲基-1-戊烯聚合物的情況下，只要各自的Mw及Mw/Mn處於所述範圍內即可。

4-甲基-1-戊烯聚合物由於具有如以上般的優異的特性，並且由於至少培養面由本發明的培養構件形成的培養器具亦不會對培養造成不良影響，而且穩定性、光透過性、成形加工性良好，且可進行滅菌處理，因此作為培養構件的材料非常優異。

[4-甲基-1-戊烯聚合物的製造方法] 製造所述4-甲基-1-戊烯聚合物的方法只要使4-甲基-1-戊烯、烯烴、其他單體聚合，則可為任意方法。另外，為了控制分子量或分子量分佈，亦可使鏈轉移劑、例如氫共存。製造中使用的機器亦不受限制。聚合法可為公知的方法，亦可為氣相法、漿料法、溶液法、整體（bulk）法。較佳為漿料法、溶液法。另外，聚合法亦可為單段聚合法、或兩段等多段聚合法即於聚合體系中摻合分子量不同的多種聚合物的方法。不論是單段、多段聚合法的哪一種，於使用氫作為鏈轉移劑的情況下，均可一併投入，亦可分批投入、例如於聚合初期、中期、末期投入。聚合可於常溫下進行，亦可視需要進行加溫，就聚合的效率的觀點而言，較佳為於20℃～80℃下進行，特佳為於40℃～60℃下進行。製造中使用的觸媒亦不受限制，就聚合的效率的觀點而言，較佳為使用例如國際公開公報2006/054613中所記載的固體狀鈦觸媒成分（I）或國際公開公報2014/050817中所記載的含有過渡金屬化合物（A）的烯烴聚合用觸媒（茂金屬觸媒）。

再者，於培養構件由包含4-甲基-1-戊烯聚合物（X）的組成物形成的情況下，於培養構件100質量%中，4-甲基-1-戊烯聚合物（X）較佳為90質量%以上且未滿100質量%，更佳為95質量%以上且未滿100質量%，特佳為99質量%以上且未滿100質量%。若大量包含4-甲基-1-戊烯聚合物（X）以外的成分，則不僅導致氧透過率降低，而且亦導致透明性降低或強度降低。

形成本發明的培養構件的材料亦可包含4-甲基-1-戊烯聚合物（X）以外的成分。作為4-甲基-1-戊烯聚合物（X）以外的成分，可列舉：耐熱穩定劑、耐光穩定劑、加工助劑、塑化劑、抗氧化劑、潤滑劑、消泡劑、抗黏連劑、著色劑、改質劑、抗菌劑、防黴劑、防霧劑等添加劑。

[水接觸角] 本發明的培養構件的培養面的水接觸角為大於100°且160°以下。所述水接觸角較佳為大於100°且150°以下，更佳為大於100°且130°以下，進而佳為大於105°且130°以下。若培養構件的培養面的水接觸角為100°以下，則細胞等會與培養構件黏附，難以形成球狀體。另外，若培養構件的培養面的水接觸角大於160°，則培養面與培養基的接觸變得不充分，對培養基內的供氧效率會降低。

水接觸角的測定方法並無特別限制，可使用公知的方法，較佳為靜滴法。水接觸角例如可利用如下方法來測定：依據日本工業標準JIS-R3257（基板玻璃表面的潤濕性試驗方法），於25±5℃、50±10%的恆溫恆濕條件下，將水滴的形狀被視為球形的4 μL以下的容量的水滴滴加至使用培養構件或與培養構件相同的材料所製作的測定樣品的表面，藉由靜滴法來測量水滴剛剛接觸測定樣品表面後至1分鐘以內的測定樣品與水滴的接觸界面的角度。

[氧透過率] 本發明的培養構件的溫度23℃、濕度0%時的氧透過率為4500 cm ³/（m ²×24 h×atm）～90000 cm ³/（m ²×24 h×atm），較佳為4500 cm ³/（m ²×24 h×atm）～67500 cm ³/（m ²×24 h×atm），更佳為4500 cm ³/（m ²×24 h×atm）～47000 cm ³/（m ²×24 h×atm），進而佳為4500 cm ³/（m ²×24 h×atm）～45000 cm ³/（m ²×24 h×atm）。

若培養構件的氧透過率過低，則培養基中的氧濃度變低，細胞不會充分增殖。另一方面，若氧透過率過高，則培養基中的氧濃度變得過高，因氧應激而細胞功能降低。於氧透過率為所述上下限的範圍的情況下，細胞可保持良好的形態，並與培養期間相應地高效地增殖。

針對使用培養構件或與培養構件相同的材料所製作的測定樣品，藉由差壓式氣體透過率測定法來測定溫度23℃、濕度0%下的氧透過係數[cm ³×mm/（m ²×24 h×atm）]，將用氧透過係數除以培養構件的厚度（μm）所得的值作為氧透過率[cm ³/（m ²×24 h×atm）]。測定中使用的機器只要是使用差壓式氣體透過率測定法的機器，則並無特別限制，例如可列舉東洋精機製作所製造的差壓式氣體透過率測定裝置MT-C3。測定樣品例如是自厚度50 μm的膜切出90 mm×90 mm的試驗片來製作，測定部徑較佳為設為70 mm（透過面積為38.46 cm ²）。由於氧透過率大，因此更佳為預先對樣品施加鋁遮罩而將實際透過面積設為5.0 cm ²。用於測定氧透過率的使用培養構件或與培養構件相同的材料所製作的測定樣品可進行微細加工、表面改質處理，亦可不進行，較佳為不進行任意處理。

[細胞、組織或器官] 於本說明書中，細胞、組織或器官亦簡稱為「細胞等」。細胞等的來源並無特別限定，可為動物、植物、昆蟲、菌、原生生物、細菌等所有生物，較佳為動物或植物，進而佳為動物，特佳為哺乳動物。本發明的培養構件可避免細胞等的黏附地進行培養，且氧透過性亦優異，因此細胞等較佳為非黏附性者。

本發明中的細胞並無特別限制，例如可列舉植物細胞、動物細胞、昆蟲細胞等，較佳為動物細胞，更佳為哺乳動物細胞。作為哺乳動物細胞，較佳為人、猴子、小鼠、大鼠、豬、狗、綿羊、貓、山羊來源的細胞，更佳為人來源的細胞。細胞可為二維培養的細胞，亦可為三維培養的細胞，包含培養細胞而獲得的球狀體。本發明中的細胞亦可使用經凍結或再凍結的細胞。另外，本發明的細胞亦可使用經繼代的細胞，繼代次數並無特別限制。作為動物細胞，可使用正常細胞、癌細胞及雜種細胞（hybridoma）等融合細胞等，亦可為進行了基因導入等人工處理的細胞。動物細胞可為原代培養細胞或經株化繼代的細胞的任一種。動物細胞可為浮游性細胞，亦可為黏附性細胞。作為動物細胞，例如可列舉：未分化的多潛能幹細胞、多潛能幹細胞來源的分化細胞（包含開始分化誘導並已經處於分化過程中的多潛能幹細胞）、未分化的成體幹細胞、成體幹細胞來源的分化細胞（包含開始分化誘導並已經處於分化過程中的成體幹細胞）及來源於動物組織的分化細胞。

於本發明中，分化細胞並不限定於成熟至分化的最終階段的細胞（最終分化的成熟細胞）。作為所述分化細胞，可為自外胚層分化成熟的細胞，亦可為自中胚層分化成熟的細胞，還可為自內胚層分化成熟的細胞。

所謂多潛能幹細胞是指具有可分化為構成生物體的所有細胞的多分化能力（多能性（pluripotency））、與即便經過細胞分裂亦可維持其多分化能力的自我複製能力的細胞。多潛能幹細胞包含：胚胎幹細胞（Embryonic stem cells：ES細胞）、胚胎生殖幹細胞（Embryonic germ stem cells：EG細胞）、人工多潛能幹細胞（Induced pluripotent stem cells：iPS細胞）、Muse細胞（多系分化應激持久細胞（Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell））、胚胎癌腫細胞（embryonic carcinoma cell：EC細胞）、滋養層幹細胞（trophoblast stem cell：TS細胞）、外胚層幹細胞（epiblast stem cell：EpiS細胞）。多潛能幹細胞較佳為ES細胞或iPS細胞，更佳為iPS細胞。

ES細胞可藉由自哺乳動物的受精卵的胚胞中取出內細胞團，並於成纖維細胞的飼養層（feeder）上培養內細胞團來建立。另外，基於繼代培養的細胞的維持可使用添加了白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor（LIF））、鹼性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor（bFGF））等物質的培養液來進行。關於人及猴子的ES細胞的建立與維持的方法，例如於USP5, 843, 780；JA湯姆森等人（Thomson JA, et al.）（1995）,美國國家科學院院報（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，Proc Natl. Acad. Sci. U S A.）92：7844-7848；JA湯姆森等人（Thomson JA, et al.）（1998）,科學（Science）. 282：1145-1147；H.季盛等人（H. Suemori et al.）（2006）,生物化學與生物物理研究通訊（Biochemical and Biophysical Research Communications，Biochem. Biophys. Res. Commun.）, 345：926-932；M.上野等人（M. Ueno et al.）（2006）,美國國家科學院院報（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）, 103：9554-9559；H.季盛等人（H. Suemori et al.）（2001）,發育動力學（Developmental Dynamics，Dev. Dyn.）, 222：273-279；H.川崎等人（H. Kawasaki et al.）（2002）,美國國家科學院院報（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）, 99：1580-1585；克利曼斯卡婭I等人（Klimanskaya I, et al.）（2006）,自然（Nature）. 444：481-485等中有記載。另外，關於人ES細胞株，例如WA01（H1）及WA09（H9）能夠自Wicell研究所（WiCell Reserch Institute）獲取，KhES-1、KhES-2及KhES-3能夠自京都大學再生醫學科學研究所（京都、日本）獲取。

iPS細胞可藉由將特定的初期化因子以去氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）或蛋白質的形態導入體細胞中來製作（K.高橋與S.山中（K. Takahashi and S. Yamanaka）（2006）細胞（Cell）, 126：663-676；K.高橋等人（K. Takahashi et al.）（2007）,細胞（Cell）, 131：861-872；J.余等人（J. Yu et al.）（2007）,科學（Science）, 318：1917-1920；M.中川（Nakagawa, M.[M. Nakagawa]）等人,自然生物技術（Nature Biotechnology，Nat. Biotechnol.）26：101-106（2008）；國際公開WO 2007/069666）。

所述體細胞是指除卵子、卵母細胞、ES細胞等生殖系列細胞或分化全能性細胞以外的所有動物細胞（較佳為包含人在內的哺乳動物細胞），亦包含胎兒（胚胎）的體細胞、新生兒（幼仔）的體細胞及成熟健全或病性的體細胞的任一種，另外，亦包含原代培養細胞、繼代細胞及株化細胞的任一種。作為所述體細胞，例如可列舉：神經幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、牙髓幹細胞等組織幹細胞（成體幹細胞）；組織前驅細胞；淋巴球、上皮細胞、內皮細胞、肌肉細胞、成纖維細胞、毛細胞、肝細胞、胃黏膜細胞、腸細胞、脾細胞、胰細胞、腦細胞、肺細胞、腎細胞及脂肪細胞等已分化的細胞等。

所述初期化因子可包含在ES細胞中特異性表達的基因、該基因產物或非編碼核糖核酸（non-coding Ribonucleic Acid，non-coding RNA）或對ES細胞的未分化維持起到重要作用的基因、該基因產物或非編碼（non-coding）RNA或低分子化合物。作為初期化因子中所含的基因，例如可列舉Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、β-連環蛋白（beta-catenin）、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis1等，該些初期化因子可單獨使用一種，亦可將兩種以上組合使用。

成體幹細胞是指具有可分化為特定的細胞的受限定的分化能力、與即便經過細胞分裂亦可維持該受限定的分化能力的自我複製能力的細胞。成體幹細胞包含間葉系幹細胞、造血幹細胞、神經幹細胞等。

作為來源於動物的組織的分化細胞，例如可列舉：包含各種前驅細胞的、脂肪細胞、肝細胞、腎細胞、胰臟細胞、乳腺細胞、內皮細胞、上皮細胞、平滑肌細胞、成肌細胞、心肌細胞、神經細胞、神經膠質細胞、樹狀細胞、軟骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、骨細胞、成纖維細胞、各種血液系細胞、視網膜細胞、角膜來源的細胞、生殖腺來源的細胞、各種線細胞等。

所述細胞可單獨使用一種，亦可將兩種以上組合使用。

就適合於形成球狀體的方面而言，動物細胞較佳為多潛能幹細胞及多潛能幹細胞來源的分化細胞，更佳為iPS細胞及iPS細胞來源的分化細胞，進而佳為iPS細胞來源的心肌細胞，特佳為iPS細胞來源的人心肌細胞。或者，就適合於形成球狀體的方面而言，動物細胞較佳為成體幹細胞，更佳為間葉系幹細胞。或者，就適合於形成球狀體的方面而言，動物細胞較佳為癌細胞。或者，就使細胞的狀態更接近具有立體結構的生物體內的狀態的方面而言，動物細胞較佳為通常要求進行三維培養的細胞，更佳為形成球狀體的細胞、例如肝細胞、神經細胞、心肌細胞、胰β細胞、血管內皮細胞、脂肪細胞、脂肪來源的幹細胞、軟骨細胞、間葉系幹細胞、毛囊上皮細胞、毛乳頭細胞、皮膚成纖維細胞、皮膚角化細胞、成骨細胞。

於動物細胞為多潛能幹細胞來源的分化細胞的情況下，該細胞可自多潛能幹細胞藉由公知的分化誘導法來製作。或者，多潛能幹細胞來源的分化細胞亦可使用能夠商業性獲取者。於動物細胞為成體幹細胞的情況下，可使用自動物採取者，亦可使用能夠商業性獲取者。

多潛能幹細胞來源的分化細胞較佳為iPS細胞來源的心肌細胞。

iPS細胞來源的心肌細胞例如可藉由公知的無蛋白質心肌分化誘導（PFCD）法來製作（參照國際公開第2015/182765號）。由於無蛋白質心肌分化誘導（PFCD）法可達成高的心肌分化效率，因此藉由該方法而製作的iPS細胞來源的心肌細胞可達成高的心肌細胞純度。

於本發明中，所謂球狀體是指細胞彼此聚集成團而成者，亦可換種說法而稱為細胞凝聚體或細胞團等。球狀體可為包含心肌細胞般的單一細胞的球狀體，亦可為包含各種成纖維細胞或血管內皮細胞等與心肌細胞般的兩種以上的不同的細胞種類的球狀體。作為可使用的細胞，可列舉所述各種細胞。使用本發明的培養構件或培養器具所形成的球狀體較佳為包含多潛能幹細胞的球狀體及包含多潛能幹細胞來源的分化細胞的球狀體，更佳為包含iPS細胞的球狀體或包含iPS細胞來源的分化細胞的球狀體，進而佳為包含iPS細胞來源的心肌細胞的球狀體。

球狀體具有較佳為10%以上、更佳為13%以上、進而佳為15%以上、進而更佳為20%以上、特佳為30%以上的分化細胞純度（分化細胞數/構成球狀體的細胞數×100）。於以心肌細胞為目標細胞來分化誘導iPS細胞並形成球狀體的情況下，所述球狀體以較佳為10%以上、更佳為20%以上、進而佳為30%以上的心肌細胞純度包含iPS細胞來源的心肌細胞。所述分化細胞數可藉由公知的方法來求出，例如可藉由如下方式來求出：使用針對作為心肌標誌物的心肌肌鈣蛋白T（cTnT）、肌鈣蛋白（Troponin）、肌球蛋白調節輕鏈2（Myosin regulatory light chain 2，MYL2）、肌球蛋白調節輕鏈7（Myosin regulatory light chain 7，MYL7）等的抗體，利用流式細胞分析技術（flow cytometry）進行分析。構成所述球狀體的細胞數可藉由公知的方法來求出，例如可藉由如下方式來求出：對球狀體進行胰蛋白酶（Trypsin）處理來單細胞化，並對單細胞的細胞數進行測量。

於使多潛能幹細胞分化而獲得分化細胞的情況下，最終所獲得的球狀體除了包含目標分化細胞以外，還會包含很多未分化的細胞或進行了目標分化以外的分化的細胞。因此，若分化細胞純度處於所述範圍內，則將分化細胞的球狀體用於各種檢查時的資料的可靠性容易變高，而且，再現性亦容易變高。

球狀體的大小並無特別限制。球狀體的大小雖根據形成球狀體的細胞種類、細胞數、培養基、培養天數等而不同，但平均直徑較佳為例如10 μm～10000 μm，更佳為10 μm～8000 μm，進而佳為10 μm～5000 μm。球狀體的直徑可藉由例如於顯微鏡下進行觀察並於所拍攝的照片上測量直徑的方法、或者使用粒度分佈計的方法來求出。

構成球狀體的細胞數並無特別限制。雖根據形成球狀體的細胞種類、培養基、培養天數等而不同，但每1個球狀體亦可包含例如1×10 ¹個以上、1×10 ²個以上、1×10 ³個以上、1×10 ⁴個以上、1×10 ⁵個以上、1×10 ⁶個以上、1×10 ⁷個以上、1×10 ⁸個以上、1×10 ⁹個以上。另外，其上限並無特別設定。構成球狀體的細胞數例如可根據基於螢光試劑的細胞染色後的螢光強度、細胞數與螢光強度的校準曲線來算出。

細胞培養中使用的培養基只要根據細胞來適宜選擇即可。培養基的種類並無特別限定，例如可使用任意的細胞培養基礎培養基或分化培養基、原代培養專用培養基等。具體而言，可列舉艾森塔魯（Essential）8、伊格爾極限必需培養基（Eagle's Minimum Essential Medium，EMEM）、達爾伯克改良伊格爾培養基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM）、α-極限必需培養基（α-Minimum Essential Medium，α-MEM）、格拉斯哥極限必需培養基（Glasgow's Minimum Essential Medium，GMEM）、伊斯科夫改良達爾伯克培養基（Iscove's modified Dulbecco's medium，IMDM）、洛斯維帕克紀念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）1640、哈姆（Ham's）F-12、MCDB培養基、威廉姆斯（William's）培養基E、肝細胞解凍培養基（Hepatocyte thaw medium）及該些的混合培養基等，但並不限定於該些，只要是包含細胞的增殖或分化所需的成分的培養基，則可使用。進而，亦可使用添加了血清、各種生長因子、分化誘導因子、抗生素、激素、胺基酸、糖、鹽類等的培養基。培養溫度亦無特別限制，通常於25℃～40℃左右進行。培養基的量並無特別限制，培養基的高度較佳為3 mm～30 mm，更佳為3 mm～25 mm，進而佳為4 mm～20 mm。

所謂本發明中的組織是類似的細胞聚集而起到相同的作用者的含義，且是與球狀體不同的概念。所述組織並無特別限定，例如可列舉：上皮組織、結締組織、肌肉組織、神經組織等。所述組織較佳為包含形成球狀體的細胞的組織，作為此種組織，例如可列舉：包含神經細胞的神經組織、包含心肌細胞的心肌組織、包含脂肪細胞或脂肪來源幹細胞的脂肪組織、包含軟骨細胞的軟骨組織、包含成骨細胞的骨組織等。該些中，就氧需求性高的方面而言，所述組織較佳為神經組織、心肌組織，進而佳為心肌組織。另外，就適合於形成球狀體的方面而言，所述組織較佳為包含成體幹細胞的組織。

所謂本發明中的器官是所述組織聚集而進行有目的的共同工作者的含義。所述器官並無特別限定，例如為肺、心臟、肝臟、腎臟、脾臟、胰臟、膽囊、食道、胃、皮膚、腦等。所述器官較佳為包含形成球狀體的細胞的器官，作為此種器官，例如可列舉：包含肝細胞的肝臟、包含胰β細胞的胰臟、包含血管內皮細胞的血管、包含間葉系幹細胞的骨髓、包含毛囊上皮幹細胞或毛乳頭細胞的毛囊、腎臟、包含皮膚成纖維細胞或皮膚角化細胞的皮膚等。該些中，就氧需求性高的方面而言，所述器官較佳為皮膚、腎臟、肝臟、胰臟、心臟、毛囊，進而佳為心臟。另外，就適合於形成球狀體的方面而言，所述器官較佳為包含成體幹細胞的器官。

[培養器具] 於本發明中，所謂培養器具是指細胞等的培養中使用的所有器具。所述培養器具的至少一部分由所述培養構件構成。所述培養器具可其全部由所述培養構件構成，亦可僅其一部分由所述培養構件構成。於所述培養器具的僅一部分由所述培養構件構成的情況下，至少培養細胞等的培養面由本發明的培養構件構成。

所述培養器具通常於培養箱、大量培養裝置或灌流培養裝置等裝置內使用。

作為所述培養器具，可使用公知的各種培養器具，形狀或大小並無特別限制。作為所述培養器具，例如除了盤、燒瓶、板、瓶、袋、管等培養容器以外，亦可列舉墊、杯、中墊、載玻片等，較佳為培養容器。

所述培養器具可為具有至少一個孔（well）的培養器具或具有至少一個孔的培養容器。所謂具有至少一個孔的培養容器例如是具有至少一個孔的板，更具體而言為具有6孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔、1536孔等孔的板。通常而言，底面具有如孔般的凹陷形狀的培養器具為了使底面的複雜形狀穩定而需要增厚底面，難以充分地進行對細胞等的氧供給。若使用本發明的培養構件，則即便是具有1孔、6孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔、1536孔等孔的板，形狀亦穩定，且對細胞等的氧供給亦充分。

為了保持或貯存培養基，所述培養器具較佳為將底面設為培養面的器具。於所述培養器具為盤、燒瓶、墊或板的情況下，由於底面為培養面，因此本發明的培養構件較佳為構成該些的底面、側面、上表面中的至少底面的一部分或全部。若至少底面（培養面）由本發明的培養構件構成，則可經由所述培養構件而更有效率地將氧供給至培養基中，可更有效率地使處於培養基中的細胞等增殖。另外，可於保持細胞的功能的狀態下，以更高的密度進行培養。

所述培養器具的底面的形狀並無特別限制，可列舉：平底、圓底（U字底）、平底（F字底）、圓錐底（V字底）、平底+曲邊等。於加工成圓底（U字底）、平底（F字底）、圓錐底（V字底）、平底+曲邊等的情況下，可藉由通常的射出成形或壓製成形而一次性進行加工，亦能夠預先製作膜或片，並藉由真空成形或壓縮空氣成形等而進行二次加工來製作。底面的形狀可根據培養的目的來選擇，於對細胞等進行二維培養時，通常理想為平底，於進行三維培養時，通常理想為圓底（U字底）或圓錐底（V字底）。

培養器具的所述培養構件以外的部分亦可由所述培養構件以外的材料構成。所述培養構件以外的材料並無特別限制，可使用公知的材料。作為所述材料，例如可列舉：聚苯乙烯、聚二甲基矽氧烷（Poly Dimethyl Siloxane，PDMS）、環狀烯烴聚合物、環狀烯烴共聚物、玻璃等。

所述培養器具亦可於利用天然高分子材料、合成高分子材料或無機材料塗敷其培養面及/或培養面以外的部分後來使用。若利用天然高分子材料、合成高分子材料或無機材料塗敷培養器具的培養面，則細胞等的增殖性更優異，但細胞等容易黏附於培養面。有無對培養面的塗敷可根據細胞等的種類來決定，通常較佳為不進行塗敷。

為了防止污染，本發明的培養器具亦可實施消毒或滅菌處理。作為消毒或滅菌處理的方法，並無特別限制，可列舉：流通蒸汽法、煮沸法、間歇法、紫外線法等物理消毒法；使用臭氧等氣體、乙醇等消毒劑的化學消毒法；高壓蒸汽法、乾熱法等加熱滅菌法；伽馬射線法、電子束法、高頻法等照射滅菌法；氧化乙烯氣體法、過氧化氫氣體電漿法等氣體滅菌法等。其中，就操作簡便、可充分進行滅菌的方面而言，較佳為乙醇消毒法、高壓蒸汽滅菌法、伽馬射線滅菌法、電子束滅菌法或氧化乙烯氣體滅菌法。該些消毒或滅菌處理可單獨進行一種，亦可將兩種以上組合進行。

本發明的培養器具的製造方法並無特別限制，於培養器具全部由所述培養構件構成的情況下，可利用與培養構件的製造方法相同的方法來製造。於培養器具的一部分由所述培養構件形成的情況下，可藉由將培養構件與其他構件適宜接合來獲得培養器具。作為接合的方法，並無特別限制，可將培養構件與其他構件一體地形成，亦可經由黏附劑或黏著劑進行密接。

本發明的培養器具較佳為球狀體形成用培養器具，更佳為球狀體形成用細胞培養器具。

[培養方法] 本發明的細胞等的培養方法為包括步驟（A）及步驟（B）的細胞、組織或器官的培養方法，所述步驟（A）是使細胞、組織或器官與如下培養構件或至少培養面由所述培養構件形成的培養器具的培養面接觸，所述步驟（B）是對與所述培養面接觸的細胞、組織或器官進行培養來形成球狀體，所述培養構件為於其培養面上培養細胞、組織或器官的培養構件，所述培養構件包含4-甲基-1-戊烯聚合物（X），所述培養面的水接觸角為大於100°且160°以下，溫度23℃、濕度0%時的氧透過率為4500 cm ³/（m ²×24 h×atm）～90000 cm ³/（m ²×24 h×atm）。

關於本發明的培養方法，若於所述培養構件或所述培養器具的培養面上培養細胞等，則細胞等可高效地形成球狀體。另外，根據本發明，多潛能幹細胞容易高效地分化為分化細胞。

[步驟（A）] 使細胞等與培養構件或培養器具的培養面接觸的方法只要可使細胞等與培養構件或培養器具的培養面接觸，則並無特別限制，例如，可列舉於培養構件或培養器具的培養面上接種細胞等。更具體而言，例如，利用移液管（pipet）等將懸浮於培養基中的細胞等添加於培養容器內，視需要搖動該培養容器而使細胞均等地分散於培養容器內，然後於培養箱內靜置。

關於接種細胞等的密度，只要細胞等可增殖及分化，則並無特別限制。於細胞等為未分化的多潛能幹細胞或多潛能幹細胞來源的分化細胞的情況下，接種的密度較佳為0.1×10 ⁵cells/cm ²～10.0×10 ⁵cells/cm ²，更佳為0.3×10 ⁵cells/cm ²～5.0×10 ⁵cells/cm ²，進而佳為0.5×10 ⁵cells/cm ²～3.0×10 ⁵cells/cm ²。若細胞接種密度為所述範圍，則與為所述範圍外的情況相比，細胞的增殖及分化可更高效地進行，因此較佳。

接種中使用的培養基只要是細胞等可生存的培養基，則並無特別限制，只要根據所使用的細胞等來適宜選擇即可。接種中使用的培養基可為後述的步驟（B）中使用的培養基。於細胞等為未分化的多潛能幹細胞或多潛能幹細胞來源的分化細胞的情況下，接種中使用的培養基例如為任意的細胞培養基礎培養基或分化培養基、原代培養專用培養基等，具體而言，可列舉：艾森塔魯（Essential）8、斯特姆菲特（StemFit）培養基、ReproFF2培養基、斯特姆帕特納（Stem-Partner）SF、伊格爾極限必需培養基（EMEM）、達爾伯克改良伊格爾培養基（DMEM）、α-MEM、格拉斯哥MEM（GMEM）、IMDM、RPMI1640、哈姆（Ham's）F-12、MCDB培養基、威廉姆斯（William's）培養基E及該些的混合培養基等。進而，亦可使用添加了血清、各種生長因子、分化誘導因子、抗生素、激素、胺基酸、糖、鹽類、礦物質、金屬、維生素等的培養基。

接種中使用的培養基的量並無特別限制，於添加於培養容器中的狀態下，培養基的高度較佳為3 mm～30 mm，更佳為3 mm～25 mm，進而佳為4 mm～20 mm。培養溫度亦無特別限制，通常於25℃～40℃左右進行。

[步驟（B）] 對與培養面接觸的細胞等進行培養來形成球狀體的方法只要可向與培養面接觸的細胞等供給氧、營養等來培養細胞等而形成球狀體，則並無特別限制，例如可列舉向放入了添加有培養基的培養器具的培養箱供給氧，經由培養構件而向細胞等供給氧並於一定期間內保持為37℃。

細胞培養中使用的培養基只要根據細胞來適宜選擇即可。培養基的種類並無特別限定，例如可使用任意的細胞培養基礎培養基或分化培養基、原代培養專用培養基等。具體而言，可列舉艾森塔魯（Essential）8、伊格爾極限必需培養基（EMEM）、達爾伯克改良伊格爾培養基（DMEM）、α-MEM、格拉斯哥MEM（GMEM）、IMDM、RPMI1640、哈姆（Ham's）F-12、MCDB培養基、威廉姆斯（William's）培養基E、肝細胞解凍培養基（Hepatocyte thaw medium）及該些的混合培養基等，但並不限定於該些，只要是包含細胞的增殖或分化所需的成分的培養基，則可使用。進而，亦可使用添加了血清、各種生長因子、分化誘導因子、抗生素、激素、胺基酸、糖、鹽類等的培養基。培養溫度亦無特別限制，通常於25℃～40℃左右進行。培養基的量並無特別限制，培養基的高度較佳為3 mm～30 mm，更佳為3 mm～25 mm，進而佳為4 mm～20 mm。

培養期間只要根據細胞及要形成的球狀體的種類、大小、分化的程度等來適宜選擇即可。於形成包含iPS細胞來源的心肌細胞的球狀體的情況下，培養期間較佳為7天～30天，更佳為10天～25天，進而佳為11天～20天。

[步驟（C）] 本發明的細胞等的培養方法亦可更包括誘導所述細胞等的分化的步驟（C）。誘導所述細胞等的分化的方法並無特別限制，只要可依據公知的實驗手冊（protocol）來進行向所期望的目標分化細胞的分化誘導即可，亦可使用市售的分化誘導培養基或分化試劑盒。

分化誘導的條件並無特別限制，可根據使用細胞種類及目標分化細胞種類等來適宜設定。通常，藉由將規定的細胞介素（cytokine）、增殖因子或其他化合物以規定濃度添加於培養液中來進行培養，從而可誘導分化。

於本發明的細胞等的培養方法包括步驟（C）的情況下，所述細胞等較佳為未分化的多潛能幹細胞、多潛能幹細胞來源的分化細胞（包含開始分化誘導並已經處於分化過程中的多潛能幹細胞）、未分化的成體幹細胞、成體幹細胞來源的分化細胞（包含開始分化誘導並已經處於分化過程中的成體幹細胞），更佳為未分化的多潛能幹細胞或多潛能幹細胞來源的分化細胞，進而佳為未分化的iPS細胞或iPS細胞來源的分化細胞。

所述目標分化細胞並無特別限制，可為所有分化細胞。所述目標分化細胞包含各種前驅細胞，例如為脂肪細胞、肝細胞、腎細胞、胰臟細胞、乳腺細胞、內皮細胞、上皮細胞、平滑肌細胞、成肌細胞、心肌細胞、神經細胞、神經膠質細胞、樹狀細胞、軟骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、骨細胞、成纖維細胞、各種血液系細胞、視網膜細胞、角膜來源的細胞、生殖腺來源的細胞、各種線細胞等。

所述目標分化細胞較佳為形成球狀體的細胞，更佳為氧需求性高的細胞。所述目標分化細胞較佳為肝細胞、神經細胞、心肌細胞、胰β細胞、血管內皮細胞、脂肪細胞、脂肪來源的幹細胞、軟骨細胞、間葉系幹細胞、毛囊上皮幹細胞、毛乳頭細胞、皮膚成纖維細胞、皮膚角化細胞、成骨細胞及造血前驅細胞等，更佳為心肌細胞、神經細胞、肝細胞，進而佳為心肌細胞。

步驟（C）較佳為誘導多潛能幹細胞向心肌細胞的分化的步驟，更佳為誘導iPS細胞向心肌細胞的分化的步驟。

誘導多潛能幹細胞向心肌細胞的分化的方法並無特別限制。作為誘導自多潛能幹細胞向心肌細胞的分化的方法，已知有各種方法（例如伯里奇等人（Burridge et al.）,細胞幹細胞（Cell Stem Cell.）2012年1月6日（2012 Jan 6）；10（1）：16-28；卡特曼等人（Kattman et al.）,細胞幹細胞（Cell Stem Cell）2011；8：228-240；張等人（Zhang et al.）,循環研究（Circulation Research，Circ Res）2012；111：1125-1136；連等人（Lian et al.）,自然實驗手冊（Nature Protocol，Nat Protoc）2013；8：162-175；WO 2016/076368；WO 2013/111875；南等人（Minami et al.）,細胞報告（Cell Reports，Cell Rep.）2012, 2（5）：1448-1460等），例如可列舉基於胚狀體形成的方法、基於單層分化培養的方法、基於強制凝聚的方法等。於任一方法中，均可藉由使中胚層誘導因子（例如，活化素A、骨形成蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMP）4、bFGF、血管內皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）、幹細胞因子（Stem Cell Factor，SCF）等）、心臟決定因子（例如，VEGF、DKK1、Wnt信號抑制劑（例如，IWR-1、IWP-2、IWP-4等）、BMP信號抑制劑（例如，頭蛋白（NOGGIN）等）、轉化生長因子（Transforming Growth Factor，TGF）β/活化素/NODAL信號抑制劑（例如，SB431542等）、維甲酸信號抑制劑等）、心臟分化因子（例如，VEGF、bFGF、DKK1等）等依次發揮作用，來提高誘導效率。

誘導iPS細胞向心肌細胞的分化的方法並無特別限制，例如可使用公知的無蛋白質心肌分化誘導（PFCD）法（參照國際公開第2015/182765號）。無蛋白質心肌分化誘導（PFCD）法可達成高的心肌分化效率，因此步驟（C）較佳為藉由無蛋白質心肌分化誘導（PFCD）法來誘導iPS細胞向心肌細胞的分化的步驟。

步驟（C）可於步驟（A）之後且步驟（B）之前進行，亦可與步驟（B）同時進行，還可僅於進行步驟（B）的期間的一部分期間內進行。就可更高效地進行多潛能幹細胞的分化誘導的方面而言，步驟（C）較佳為與步驟（B）同時進行。

步驟（C）中的分化誘導期間可根據使用細胞種類及目標分化細胞種類、分化的程度、分化誘導方法等來適宜設定。於誘導iPS細胞向心肌細胞的分化的情況下，分化誘導期間較佳為7天～30天，更佳為10天～25天，進而佳為11天～20天。

[培養方法的特性] 本發明的細胞等的培養方法較佳為iPS細胞或iPS細胞來源的分化細胞的培養方法，更佳為iPS細胞來源的心肌細胞的培養方法。

本發明的細胞等的培養方法較佳為使心肌純度增加的方法。所謂所述增加是指以如下情況時的心肌純度為比較對象，與該比較對象相比，心肌純度高，所述情況是於代替所述培養構件或所述培養器具而使用聚苯乙烯製的培養構件或培養器具、且其以外的條件與本發明的細胞等的培養方法相同的實驗條件下，將多潛能幹細胞分化為心肌細胞。較佳為與所述比較對象相比，心肌純度高1.3倍以上，更佳為心肌純度高2倍以上，進而佳為心肌純度高3倍以上。

所述心肌純度是自多潛能幹細胞分化的心肌細胞數於來源於多潛能幹細胞的分化細胞總數中所佔的比例（%）。測定所述心肌純度的方法並無特別限制，例如，可於經過分化誘導的規定期間後，測定細胞總數與表達心肌細胞標誌物的細胞數，並算出比例。於細胞形成球狀體的情況下，可藉由公知的方法而將球狀體單細胞化，並將構成球狀體的總細胞數設為細胞總數。於細胞數的測量中，例如可使用血球計算板、螢光激發細胞分選儀（Fluorescence Activated Cell Sorter，FACS）等。

所述心肌細胞標誌物並無特別限制，例如可列舉：心肌肌鈣蛋白C（cTnC）、心肌肌鈣蛋白I（cTnI）、心肌肌鈣蛋白T（cTnT）、肌球蛋白輕鏈、α輔肌動蛋白（Actinin）、NKX2.5、KCNQ1、HERG1b、Cav1.2、Nav1.5等。所述心肌細胞標誌物較佳為心肌肌鈣蛋白T（cTnT）。表達心肌細胞標誌物的細胞數的測定例如可使用針對心肌細胞標誌物的抗體並利用FACS來進行。所述心肌純度較佳為可利用cTnT陽性細胞數/構成球狀體的總細胞數×100來算出。

本發明的細胞等的培養方法較佳為使心肌細胞的肌球蛋白調節輕鏈2（Myosin regulatory light chain 2，MYL2）基因的表達增加的方法。所謂所述增加是指以如下情況時的心肌細胞的MYL2基因的表達量為比較對象，與該比較對象相比，MYL2基因的表達量高，所述情況是於代替所述培養構件或所述培養器具而使用聚苯乙烯製的培養構件或培養器具、且其以外的條件與本發明的細胞等的培養方法相同的實驗條件下，將多潛能幹細胞分化為心肌細胞。較佳為與所述比較對象相比，MYL2基因的表達量高2倍以上，更佳為MYL2基因的表達量高3倍以上。 MYL2基因的表達量可利用公知的方法來測定，例如可列舉定量反轉錄酶-聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法。

本發明的細胞等的培養方法較佳為使心肌細胞的搏動數增加的方法。所謂所述增加是指以如下情況時的心肌細胞的搏動數為比較對象，與該比較對象相比，搏動數高，所述情況是於代替所述培養構件或所述培養器具而使用聚苯乙烯製的培養構件或培養器具且其以外的條件與本發明的細胞等的培養方法相同的實驗條件下，將多潛能幹細胞分化為心肌細胞。較佳為與所述比較對象相比，心肌細胞的搏動數高2倍以上，更佳為心肌細胞的搏動數高3倍以上。心肌細胞的搏動數可藉由公知的方法來測定，例如可拍攝心肌細胞的動態影像來測定任意的心肌細胞的一分鐘內的搏動數（Beat Per Minute，BPM）。

[球狀體] 藉由所述培養方法，可形成本發明的球狀體。本發明的球狀體由於在培養時進行供氧直至細胞內部，因此特徵在於有大小及形狀的均勻性高的傾向。另外，本發明的球狀體中所含的細胞保有正常的功能，其細胞純度亦高，因此將球狀體用於各種檢查時的資料的可靠性容易變高，而且，再現性亦容易變高。本發明的球狀體可適合用作細胞的功能評價及藥劑的篩選、以及再生醫療或細胞治療的細胞源。 [實施例]

其次，示出實施例對本發明進行更詳細的說明，但本發明並不由該些限定。

[重量平均分子量（Mw）及分子量分佈（Mw/Mn）的測定] 藉由凝膠滲透層析法（GPC）來測定實施例中使用的4-甲基-1-戊烯聚合物的重量平均分子量Mw及分子量分佈（Mw/Mn）。具體而言，於下述條件下，利用標準聚苯乙烯校正分子量，來測定溶解於鄰二氯苯中的聚合物的重量平均分子量（Mw）及數量平均分子量（Mn）。 ·裝置：凝膠滲透層析儀HLC-8321 GPC/HT型（東曹公司製造） ·資料分析軟體：Empower3（沃特世（Waters）公司製造） ·檢測器：示差折射計 ·串聯連結管柱：TSKgel GMH6-HT（2根）及TSKgel GMH6-HTL（2根） ·管柱溫度：140℃ ·流量：1.0 ml/分鐘 ·試樣濃度：1.5 mg/ml

[下垂距離的測定] 自製造例的膜或比較例的培養容器，以縱×橫為100 mm×10 mm的尺寸切出試驗片，以相對於該試驗片的縱尺寸自試驗台的水平上表面向水平方向伸出50 mm的狀態固定於試驗台上，固定3分鐘後，對自試驗台伸出的試驗片的前端自包含試驗台的上表面在內的水平面向鉛垂下方下垂的距離進行測定。自所述固定至測定為止為室溫23℃。將結果示於表1中。

[撓曲的有無] 於分化誘導第19天，自培養箱中取出培養容器，自橫向窺視容器底面，觀察培養環境中的膜有無下垂。將與容器製作時相比，無變化，且未發現膜下垂的情況評價為「無撓曲」，將與培養容器製作時相比，有變化，且發現膜下垂的情況評價為「有撓曲」。

[水接觸角的測定] 水接觸角的測定是依據日本工業標準JIS-R3257（基板玻璃表面的潤濕性試驗方法）來進行。於25±5℃、50±10%的恆溫恆濕條件下，將水滴的形狀被視為球形的4 μL以下的容量的水滴滴加至測定樣品的表面，藉由靜滴法來測定水滴剛剛接觸測定樣品表面後至1分鐘以內的測定樣品與水滴的接觸界面的角度。

[氧透過率的測定] 針對測定樣品，使用東洋精機製作所製造的差壓式氣體透過率測定裝置MT-C3，於溫度23℃、濕度0%的環境下測定氧透過係數。測定部徑為70 mm（透過面積為38.46 cm ²）。由於預想到氧透過係數大，因此預先對樣品施加鋁遮罩而將實際透過面積設為5.0 cm ²。用所測定的氧透過係數[cm ³×mm/（m ²×24 h×atm）]的值除以膜（培養構件）的厚度（μm）來算出氧透過率[cm ³/（m ²×24 h×atm）]。

[製造例1]培養構件的製造使用作為4-甲基-1-戊烯聚合物的TPX（註冊商標）（三井化學股份有限公司製造：分子量（Mw）=428000、分子量分佈（Mw/Mn）=4.1），投入至擠出基材層的包括全螺紋型螺桿的帶有T字模的擠出機中，將擠出溫度設定為270℃，將輥溫度設定為60℃，改變輥旋轉速度的條件來進行擠出成形，藉此獲得厚度50 μm的膜。對所獲得的所述膜測定水接觸角及氧透過率。將結果示於表1中。

[製造例2]培養容器的製作以8 cm×12 cm尺寸切割所述膜，經由醫療用黏著劑（3M製造）而與聚苯乙烯（亦稱為PS）製24孔容器框的底面密接，從而製作24孔的培養板。然後，包裝於耐伽馬射線袋中並照射10 kGy的伽馬射線來滅菌。

[實施例1]自iPS細胞向心肌細胞的分化誘導使用製造例2中製作的培養容器，藉由後述的方法來誘導自iPS細胞向心肌細胞的分化，從而形成球狀體。培養基是以培養基高度成為5 mm的方式使用（培養基量：1 mL）。

[實施例2] 除了與實施例1相比，增多培養基的量而將培養基高度設為10 mm以外，與實施例1同樣地進行培養（培養基量：1.8 mL）。

[比較例1] 除了使用培養面的厚度為1000 μm的超低黏附面PS製培養容器（康寧（Corning）公司製造、科斯塔（Costar） ^TM3473、1孔的培養面的內徑為15 mm、24孔板）以外，利用與實施例1相同的方法進行培養。該超低黏附面PS製培養容器是將市售的PS製培養容器（水接觸角61°）親水化處理後的容器。將測定水接觸角所得的結果示於表1中。

[比較例2] 除了與比較例1相比，增多培養基的量而將培養基高度設為10 mm以外，與比較例1同樣地進行培養。

[iPS細胞培養] ＜培養基及試劑的製備＞使用於液氮中凍結保存的人來源的iPS細胞（iPS細胞研究所提供）。使用試劑如下所述。 ·艾森塔魯（Essential）8（製品編號A1517001、格布考（Gibco）） ·依瑪特里克斯（iMatrix）-511西爾克（silk）（製品編號387-10131、尼皮（Nippi）） ·卡魯社休爾（CultureSure） ^TMY-27632（製品編號034-24024、富士軟片和光純藥） ·0.5 mol/L-乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）溶液（pH8.0）（製品編號06894-85、半井股份有限公司（Nacalai Tesque）） ·磷酸鹽緩衝液（Phosphate Buffer Solution）（-）（製品編號166-23555、富士軟片和光純藥） ·2.5%胰蛋白酶（Trypsin）（製品編號15090-046、格布考（Gibco））･台盼藍（Trypan blue）（製品編號145-0022、伯樂（Bio-Rad）） ·甲醛溶液（製品編號064-00406、富士軟片和光純藥） ·抗肌鈣蛋白（anti-Troponin）T-C（CT3）（製品編號SC-20025、聖塔克魯斯（Santacruz）） ·抗小鼠（anti-Mouse）IgG（H+L）亞莉克莎福路（Alexa Fluor）647（製品編號A-21236、賽默飛世爾（Thermo Fisher）） ·來源於大豆的皂苷（Saponin from Soybeans）（製品編號192-08851、富士軟片和光純藥） ·心肌分化誘導培養基（低分子化合物群組A、低分子化合物群組B）：依據國際公開公報2015/182765號公報段落[0064]及段落[0065]的記載。

培養基及試劑的製備如下所述般進行。 ·iPS細胞培養基：艾森塔魯（Essential）8於使用時設為室溫後使用。解凍時與繼代時使用的培養基是以成為3 μM的方式添加卡魯社休爾（CultureSure） ^TMY-27632來使用。 ·心肌分化誘導培養基：於使用時，向心肌分化誘導培養基中混合低分子化合物群組A或低分子化合物群組B，加溫至37℃後使用。 ·剝離液：利用PBS（-）將0.5 mol/L-EDTA溶液（pH8.0）調整為0.5 mM。於使用時，加溫至37℃後使用。 ·Y-27632溶液：利用PBS（-）調整為10 mM。 ·單一化溶液：利用PBS（-）將2.5%胰蛋白酶（Trypsin）調整為0.25%。於使用時，加溫至37℃後使用。 ·皂苷溶液：利用PBS（-）將來源於大豆的皂苷（Saponin from Soybeans）調整為0.1%溶液。 ·保存條件：Y-27632溶液、單一化溶液及其他心肌細胞培養所需的試劑是冷凍保存，培養基及剝離液是冷藏保存。

＜培養日程＞細胞培養是按下述日程進行。關於iPS細胞，將自復蘇起進行5次繼代所得的細胞供於分化誘導。取樣是於整體確認到心肌細胞的搏動的第12天與進一步成熟化的第19天進行。第1天（Day-1）：試劑製備及準備第0天（Day0）：iPS細胞復蘇第3天～（Day3～）：iPS細胞的繼代（第3、6、10、15、19天（day3、6、10、15、19）合計5次繼代）第23天（Day23）：iPS細胞的心肌分化誘導開始（第0天）第45天（Day45）：心肌分化誘導第12天的取樣及單細胞化（FACS、基因表達分析）第39天（Day39）：心肌分化誘導第19天的取樣及單細胞化（FACS、基因表達分析）

＜iPS細胞培養方法＞ iPS細胞的解凍 1）於iPS細胞的解凍前，將10 mL的培養基放入管中，利用37℃水浴進行加溫。 2）凍結iPS細胞管於37℃水浴中成為半溶解狀態，並緩慢移至預先於潔淨台內進行了加溫的放入有10 mL的培養基的管中。 3）以100×g於室溫下離心3分鐘後，去除上清液。 4）加入10 mL的新培養基，輕輕混合，將0.13 μg/cm ²的依瑪特里克斯（iMatrix）-511西爾克（silk）添加於細胞懸浮液中，然後接種於10 cm盤（dish）中，於37℃、5%CO ₂培養箱中進行培養。

iPS細胞的繼代 1）利用相位差顯微鏡觀察細胞的狀態，於1：12-1：20之間決定繼代的分裂比（split ratio）。 2）將培養基上清液回收至管中。利用PBS（-）進行清洗後，添加剝離液，於37℃、5%CO ₂培養箱中反應約5分鐘。 3）反應後，使盤傾斜剝離細胞，使用預先回收的上清液而將細胞回收至管中。 4）以100×g於室溫下離心3分鐘後，去除上清液。 5）加入10 mL的新培養基，輕輕混合，將0.13 μg/cm ²的依瑪特里克斯（iMatrix）-511西爾克（silk）添加於細胞懸浮液中，然後接種於10 cm盤（dish）中，於37℃、5%CO ₂培養箱中進行培養。

＜心肌分化誘導方法＞將實驗日程的概略示於圖1中。藉由無蛋白質心肌分化誘導（PFCD）法來誘導iPS細胞向心肌細胞的分化。第0天：利用剝離液剝離約50%匯合的iPS細胞後，以100×g於室溫下離心3分鐘。於去除上清液後，於新培養基中懸浮，接種於未處理的55 cm ²盤（dish）中，於37℃、5%CO ₂培養箱中靜置4小時。然後，將細胞回收至管中，置換為添加了低分子化合物群組A的心肌分化誘導培養基。於實施例或比較例的24孔板上以2×10 ⁵cells/孔接種細胞，於37℃、5%CO ₂培養箱中進行培養。實驗是以一式三份（triplicate）的方式進行。第3天：將培養基更換為放入有低分子化合物群組B的心肌分化誘導培養基。第5天：將培養基更換為放入有低分子化合物群組B的心肌分化誘導培養基。第7天以後：每3天～4天利用心肌分化誘導培養基進行培養基更換。再者，於分化誘導第3天、第7天的培養基更換時更換孔。

＜細胞團的單細胞化（分化誘導第12天及第19天的取樣）＞ 1）將細胞團（被認為是心肌團）回收至管中，細胞團自然沈降後去除上清液。 2）添加1 mL的單一化溶液，利用37℃水浴加溫30分鐘左右，攪拌至細胞團成為單細胞為止。 3）利用3倍量的PBS（-）3 mL進行稀釋並停止反應。 4）進行細胞懸浮液的細胞計數，並用於後述的FACS或RNA萃取。

＜FACS樣品的製備＞將單一化的細胞1×10 ⁶cells移至管中，以300×g於室溫下離心5分鐘後，去除上清液，於1 mL的PBS（-）中再次懸浮。向細胞懸浮液中加入甲醛（富士軟片和光純藥），以使最終濃度成為4%，於室溫下靜置5分鐘。以300×g於室溫下離心3分鐘，去除上清液後，加入1 mL的皂苷溶液進行懸浮，向2根管中分別各分注0.7 mL（樣品）與0.3 mL（陰性對照（negative control））。再次離心來去除上清液後，向樣品中添加0.5 mL的以1：1000添加了抗肌鈣蛋白（anti-Troponin）T-C（CT3）抗體作為一次抗體的皂苷溶液。向陰性對照中加入0.5 mL的未添加抗體的皂苷溶液，使細胞懸浮，於4℃下使抗體反應一夜。第二天，去除一次抗體，加入0.5 mL的以1：500添加了二次抗體抗小鼠（anti-Mouse）IgG（H+L）亞莉克莎福路（Alexa Fluor）647的皂苷溶液並進行遮光，於室溫下反應1小時。1小時後，將添加了二次抗體的皂苷溶液置換為0.5 mL的PBS（-），利用FACS（阿庫利（Accuri） ^TMCS6 Plus（BD公司製造））進行分析。

＜RNA萃取與RT-qPCR＞將肌鈣蛋白（Troponin）（心肌細胞特異性基因）、MYL2（作為心肌細胞之一的心室肌特異性基因）、MYL7（作為心肌細胞之一的心房肌特異性基因）設為分析對象。

（1）試劑及機器RNA萃取：miRN簡易迷你試劑盒（miRNeasy Mini Kit）（製品編號217004、凱傑（Qiagen）公司製造） cDNA合成：帶有gDNA去除劑的ReverTra Ace（R） qPCR RT主混合物（ReverTra Ace（R）qPCR RT Master Mix with gDNA Remover）（製品編號FSQ-301、東洋紡（TOYOBO）公司製造） qPCR反應：高能SYBR綠主混合物（PowerUp SYBR Green Master Mix）（製品編號A25776、賽默飛世爾（Thermo Fisher）公司製造）昆塔斯德丟6福萊克斯實時PCR系統（QuantStudio 6 Flex Real-time PCR system）（賽默飛世爾（Thermo Fisher）公司製造）奈米光度計（Nanophotometer）分光光度計C40（瓦肯賓技術（Wakenbtech）股份有限公司製造）

（2）RNA萃取去除向心肌細胞的分化誘導第12天與第19天的培養上清液後，添加0.5 mL的恰早露（QIAZOL）（凱傑（Qiagen）公司製造），進行懸浮並溶解細胞，將溶解物回收至1.5 ml管中。以後依據miRN簡易迷你試劑盒（miRNeasy Mini Kit）中附帶的實驗手冊來萃取RNA，利用奈米光度計（Nanophotometer）C40來測定RNA濃度。

（3）RT-qPCR 使用所述萃取的1 μg的RNA，依據高能SYBR綠主混合物（PowerUp SYBR Green Master Mix）中附帶的實驗手冊來進行逆轉錄反應，從而進行cDNA的合成。然後，使用6 ng的cDNA，利用標準方法進行qPCR反應。校準曲線是將10 ng/μL的各cDNA樣品各收集10 μL，自此以1/10進行稀釋來製作5點。

＜心肌特異性基因表達的評價＞使用自分化誘導第12天與第19天的細胞中萃取的RNA，利用昆塔斯德丟6福萊克斯實時PCR系統（QuantStudio 6 Flex Real-time PCR system）進行基因表達量的分析。將所使用的引子的序列示於表2中，將PCR條件示於表3中。基因表達量是用將甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的基因表達量設為1時的相對值表示。將結果示於表4中。

＜細胞數的評價＞將分化誘導第12天與第19天的細胞團單細胞化後，利用台盼藍染色（伯樂（Bio-Rad））進行活細胞的測量（使用TC20全自動細胞計數器、伯樂（Bio-Rad））。根據所述獲得的測定值來算出細胞生存率（%）（測定時的活細胞數/測定時的總細胞數×100）及細胞增殖率（%）（測定時的活細胞數/細胞接種（細胞培養開始）時的細胞數×100）。將結果示於表4中。

＜心肌純度的評價＞將分化誘導第12天與第19天的細胞團單細胞化後，藉由FACS來算出cTnT陽性率（cTnT陽性細胞數/構成細胞團的總細胞數×100），並作為心肌純度（%）。將結果示於表4中。

＜搏動數的評價＞拍攝分化誘導第19天的細胞的動態影像，並算出任意的球狀體的BPM（1分鐘內的搏動數、拍/分鐘）。將結果示於表4中。

[表1]

	實施例1	實施例2	比較例1	比較例2
容器底面材質	TPX	TPX	TCPS	TCPS
Mw×10000（Mw/Mn）	42.8 （4.1）	42.8 （4.1）	-	-
下垂距離（mm）	0	0	0	0
撓曲的有無	無	無	無	無
水接觸角（°）	110	110	40	40
容器底面的厚度（mm）	0.05	0.05	1	1
容器底面的氧透過係數（cm ³×mm/（m ²×24 h×atm））	1912	1912	203	203
容器底面的氧透過率（cm ³/（m ²×24 h×atm））	38240	38240	203	203
培養基高度（mm）	5	10	5	10

[表2]

基因名	方向	序列（5'-3'）	序列編號
GAPDH	Fw	ATTGCCCTCAACGACCACTTTG	1
	Rv	TCTTCCTCTTGTGCTCTTGCTG	2
MYL2	Fw	AGGCTCCGGGTCCAATTAAC	3
	Rv	TTGCCTTCAGGGTCAAACAC	4
MYL7	Fw	TCAGCTGTATCGACCAGAATCG	5
	Rv	AGGAAGACGGTGAAGTTGATGG	6

[表3]

步驟	溫度	持續時間	循環數
脲嘧啶-DNA糖基化酶（Uracil-DNA Glycosylase，UDG）活性化	50℃	2分鐘	保持
Dual Lock DNA聚合酶	95℃	2分鐘	保持
改質	95℃	15秒	40
退火/伸長	60℃	1分鐘

[表4]

	實施例1	實施例2	比較例1	比較例2
分化誘導第12天的細胞生存率（%）	69.0	63.5	80.3	74.1
分化誘導第12天的細胞增殖率（%）	1000	1250	270	650
分化誘導第12天的心肌純度（%）	15.3	53.2	1.4	29.9
分化誘導第12天的肌鈣蛋白（Troponin）基因表達量	2.7	5.5	0.3	2.2
分化誘導第12天的MYL2基因表達量	0.15	0.48	0.02	0.12
分化誘導第12天的MYL7基因表達量	9.4	18.1	0.73	6.5
分化誘導第19天的細胞生存率（%）	73.5	69.1	78.8	67.8
分化誘導第19天的細胞增殖率（%）	1430	2790	540	820
分化誘導第19天的心肌純度（%）	13.2	42.6	2.4	16.5
分化誘導第19天的肌鈣蛋白（Troponin）基因表達量	1.5	4.0	0.6	1.1
分化誘導第19天的MYL2基因表達量	0.72	8.50	0.15	0.34
分化誘導第19天的MYL7基因表達量	1.50	3.90	0.26	0.80
心肌搏動數BPM（拍/分鐘）	59.8	61.6	18	43.6

＜形態觀察＞使用相位差顯微鏡觀察各個細胞形成球狀體的情形。將結果示於圖2、圖3中。

＜結果＞於分化誘導第12天，與比較例1、比較例2相比，實施例1、實施例2由於培養底面的氧透過率高，因此細胞增殖率高，特別是於培養基高度為10 mm的情況下高。於第19天亦發現相同的傾向。另外，於分化誘導第12天、第19天，與比較例1、比較例2相比，實施例1、實施例2的心肌純度高。進而，將心肌特異性基因肌鈣蛋白（Troponin）、MYL2、MYL7的表達加以比較，結果與比較例1、比較例2相比，實施例1、實施例2中任一基因的表達量均多，特別是於培養基高度為10 mm的情況下多。於分化誘導第19天，與比較例1、比較例2相比，實施例1、實施例2的搏動數高，且與液深度為5 mm相比，液深度為10 mm的搏動數高。另外，形態觀察的結果是明確：與比較例1、比較例2相比，於實施例1、實施例2中形成大小及形狀均勻的多個球狀體。另外，明確：與比較例1、比較例2相比，於實施例1、實施例2中iPS細胞高效地分化為心肌細胞。

[實施例3]人骨肉瘤來源的癌細胞（HOF-143B）的培養使用製造例2中製作的培養容器，藉由後述的方法來培養人骨肉瘤來源的癌細胞（HOF-143B），從而形成球狀體。

[比較例3] 除了使用培養面的厚度為1000 μm的市售的TCPS培養容器（培養面的內徑為16 mm、24孔板、康寧（Corning）公司製造、聚苯乙烯（PS）製）以外，利用與實施例3相同的方法進行培養。

[比較例4] 除了使用培養構件的厚度為350 μm的市售的聚二甲基矽氧烷（PDMS）製培養容器（培養面的內徑為15 mm、24孔板、製品名G-plate、貝塞爾（VECELL）公司製造、型號V24WGPB）作為高氧透過容器以外，利用與實施例3相同的方法進行培養。

[人骨肉瘤來源的癌細胞（HOF-143B）的培養] ＜細胞的接種＞向放入了包含人骨肉瘤來源的癌細胞的細胞懸浮液的離心管（50 ml）中加入培養基。培養基是加入5 mL的胎牛血清（Fetal Bovine Serum、FBS、富士軟片和光純藥）、0.5 mL的200 mM的L-麩醯胺酸溶液（富士軟片和光純藥）、0.05 mL的1.5 mg/mL的溴化去氧脲嘧啶（Bromo-Deoxy Uridine，BUdR）、0.5 mL的非必需胺基酸（Non Essential Amino Acid）（富士軟片和光純藥）、43.95 mL的E-MEM培養基（含有10 mg/mL酚紅、2200 mg/mL的碳酸氫鈉、培養用、富士軟片和光純藥）來製備。細胞密度的調整是利用對包含人骨肉瘤來源的癌細胞的細胞懸浮液的細胞數進行調整的方法來實施，若以細胞懸浮液0.5 mL/孔進行接種，則以細胞密度成為1.0×10 ⁴cells/cm ²的方式製備細胞懸浮液。

＜細胞的培養＞利用微移液管將包含人骨肉瘤來源的癌細胞的細胞懸浮液接種於培養面，並帶入培養箱中，於37℃、5%CO ₂下開始培養。培養進行了7天。於細胞接種後的第3天與第6天，進行培養基的更換。培養基的更換是藉由如下方式來實施：靜置培養容器，於球狀體充分沈降的狀態下去除上清液，追加與所去除的量相應的培養基。

＜形態觀察及評價＞於培養第7天，使用相位差顯微鏡觀察細胞的形態，按以下基準進行評價。 A：形成了球狀體 B：細胞黏附，未形成球狀體將觀察實施例3而得的結果示於圖4中。另外，將評價結果示於表5中。

[表5]

	實施例3	比較例3	比較例4
容器底面的材質	TPX	TCPS	PDMS
容器底面的厚度（mm）	0.05	1	0.35
形態評價	A	B	B

＜結果＞於比較例3、比較例4中，細胞黏附於培養容器，未形成球狀體，但於實施例3中，細胞形成了球狀體。 [產業上之可利用性]

根據以上的結果而明確：若使用本發明的培養構件，則可形成保持有正常功能的細胞的球狀體。進而，明確：若使用本發明的培養構件，則iPS細胞高效地分化為心肌細胞。即，本發明的培養構件容易形成球狀體，而且容易使多潛能幹細胞分化。因此，本發明的培養構件亦適合用於藥物開發篩選用途或診斷用途、再生醫療用途。

無

圖1是表示自iPS細胞分化誘導心肌細胞的實驗的日程的圖。圖2是觀察心肌分化誘導第12天的細胞的形態而得的照片。圖3是觀察心肌分化誘導第19天的細胞的形態而得的照片。圖4是觀察實施例3的人骨肉瘤來源的癌細胞（HOF-143B）形成了球狀體的情形而得的照片。

                         序列表
          <![CDATA[<110>  三井化學股份有限公司(MITSUI CHEMICALS, INC.)]]>
          <![CDATA[<120>  培養構件及其用途]]>
          <![CDATA[<130>  2021P00553WO0]]>
          <![CDATA[<160>  6     ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
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          attgccctca acgaccactt tg                                                22
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          tcttcctctt gtgctcttgc tg                                                22
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          aggaagacgg tgaagttgat gg                                                22

Claims

一種培養構件，為於其培養面上培養細胞、組織或器官的培養構件，所述培養構件包含4-甲基-1-戊烯聚合物（X），所述培養面的水接觸角為大於100°且160°以下，溫度23℃、濕度0%時的氧透過率為4500 cm ³/（m ²×24 h×atm）～90000 cm ³/（m ²×24 h×atm）。
如請求項1所述的培養構件，其中，所述4-甲基-1-戊烯聚合物（X）為4-甲基-1-戊烯與選自乙烯及碳數3～20的α-烯烴（4-甲基-1-戊烯除外）中的至少一種的共聚物（x1）。
如請求項1或請求項2所述的培養構件，其中，所述培養面未實施凹凸結構的形成加工。
如請求項1至請求項3中任一項所述的培養構件，用於球狀體形成用途。
如請求項1至請求項4中任一項所述的培養構件，其中，所述細胞、組織或器官包含源自誘導性富潛能幹細胞的分化細胞。
如請求項1至請求項5中任一項所述的培養構件，其中，所述細胞、組織或器官包含心肌細胞。
如請求項1至請求項6中任一項所述的培養構件，其中，所述培養構件的形狀為膜狀或片狀。
一種培養器具，其中，至少培養面由如請求項1至請求項7中任一項所述的培養構件形成。
一種細胞、組織或器官的培養方法，包括：步驟（A），使細胞、組織或器官與如請求項1至請求項7中任一項所述的培養構件或如請求項8所述的培養器具的培養面接觸；以及步驟（B），對與所述培養面接觸的細胞、組織或器官進行培養來形成球狀體。
如請求項9所述的細胞、組織或器官的培養方法，更包括誘導所述細胞等的分化的步驟（C），步驟（C）為藉由無蛋白質心肌分化誘導（PFCD）法來誘導誘導性富潛能幹細胞向心肌細胞的分化的步驟。
如請求項9或請求項10所述的細胞、組織或器官的培養方法，其中，使心肌純度增加。
一種球狀體，藉由如請求項9至請求項11中任一項所述的培養方法來形成。