KR20230079442A - 배양 부재 및 그 용도 - Google Patents
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Abstract
[과제] 세포 등을 배양하여 스페로이드를 형성시킬 수 있는, 배양 부재 및 배양 기구를 제공한다.
[해결 수단] 세포, 조직, 또는 기관을 그 배양면 상에서 배양하는 배양 부재로서, 상기 배양 부재는 4-메틸-1-펜텐 중합체(X)를 포함하고, 상기 배양면의 수접촉각이 100°보다 크고 160° 이하이며, 온도 23℃, 습도 0%일 때의 산소 투과도가 4500∼90000cm3/(m2×24h×atm)인 배양 부재.
[해결 수단] 세포, 조직, 또는 기관을 그 배양면 상에서 배양하는 배양 부재로서, 상기 배양 부재는 4-메틸-1-펜텐 중합체(X)를 포함하고, 상기 배양면의 수접촉각이 100°보다 크고 160° 이하이며, 온도 23℃, 습도 0%일 때의 산소 투과도가 4500∼90000cm3/(m2×24h×atm)인 배양 부재.
Description
본 발명은, 배양 부재 및 그 용도에 관한 것이다.
생체의 기관 및 조직은, 그들을 구성하는 세포끼리가 삼차원적으로 네트워크를 형성하여 기능을 발현하고 있다. 그 때문에, 세포가 본래 갖는 기능을 충분히 발휘시키는 것을 목적으로 하여, 종래의 평면적인 세포 배양과는 달리, 세포를 삼차원에 배양하여 얻어지는 스페로이드가 제작되어, 주목을 끌고 있다. 스페로이드는, 세포의 기능 평가 및 약제의 스크리닝 등에 있어서, 평면적으로 배양된 세포에 비해 생체에 가까운 결과가 얻어짐이 보고되어 있어, 창약에 있어서 in vitro 시험과 in vivo 시험 사이의 간극을 좁히는 중요한 툴로서 기대되고 있다. 또한, iPS 세포를 비롯한 줄기세포는, 재생 의료나 세포 치료의 중요한 세포 소스로서 기대되어, 고품질인 세포를 대량으로 조제할 것이 요구되고 있다. 줄기세포를 3차원 배양하여, 스페로이드를 형성시키면, 세포의 본래의 다능성(미분화 상태)을 유지한 채로 고밀도 배양이 가능해지므로, 스페로이드는 재생 의료에 있어서도 그 유용성이 주목받고 있다. 그에 따라, 균일한 형상이나 사이즈의 세포 스페로이드를, 대량으로, 안정적으로, 또한 간편하게 입수하기 위한 새로운 세포 배양 기술에 대한 요구도 높아지고 있다.
상기와 같은 사정으로부터, 스페로이드를 형성시키는 여러 가지 방법이 개발되고 있다. 예를 들어, 세포의 접착이 저해되도록 표면이 가공 또는 처리된 배양 용기를 이용하는 방법(특허문헌 1), 세포 접착성이 낮은 수지층을 형성한 용기 내에서 부유 상태에서 배양을 행하는 방법(특허문헌 2), 배양 용기의 프로테오글리칸의 흡착량을 특정의 수치 이상으로 함으로써, 스페로이드를 배양 용기 표면 상에 부착된 상태에서 형성시키는 방법(특허문헌 3) 등이다. 특히, 비접착성의 세포를 배양하여 스페로이드를 형성시키는 경우는, 배양 용기의 표면에 세포가 접착되지 않는 처리(예를 들어, 배양 용기의 표면을 초친수화 처리하거나, 소수성으로 하거나, 또는 접착되기 어려운 구조로 하는 등)가 통상 행해지고 있다.
본 발명은 상기 사정에 비추어 이루어진 것으로, 세포 등을 배양하여 스페로이드를 형성시킬 수 있는, 배양 부재 및 배양 기구를 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 형상 안정성이 우수하고, 또한, 세포, 조직, 또는 기관의 배양에 적합한 산소 환경을 실현할 수 있고, 자가 형광을 발하지 않아 세포 관찰성을 해치지 않고, 약제를 수착(收着)하기 어려운 배양 부재 및 배양 기구를 제공하는 것을 과제로 한다. 더욱이, 특히 줄기세포 유래의 분화 세포를 분화 세포 순도가 높은 상태에서 배양 가능한 배양 부재 및 배양 기구를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토했다. 그 결과, 이하의 구성을 갖는 배양 부재 등에 의해 상기 과제를 해결할 수 있음을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 본 발명은, 예를 들어 이하의 〔1〕∼〔12〕이다.
〔1〕 세포, 조직, 또는 기관을 그 배양면 상에서 배양하는 배양 부재로서, 상기 배양 부재는 4-메틸-1-펜텐 중합체(X)를 포함하고, 상기 배양면의 수접촉각이 100°보다 크고 160° 이하이며, 온도 23℃, 습도 0%일 때의 산소 투과도가 4500∼90000cm3/(m2×24h×atm)인 배양 부재.
〔2〕 상기 4-메틸-1-펜텐 중합체(X)가, 4-메틸-1-펜텐과 에틸렌 및 탄소수 3∼20의 α-올레핀(4-메틸-1-펜텐을 제외한다)으로부터 선택되는 적어도 1종의 공중합체(x1)인, 〔1〕에 기재된 배양 부재.
〔3〕 상기 배양면이, 요철 구조의 형성 가공이 실시되어 있지 않은, 〔1〕 또는 〔2〕에 기재된 배양 부재.
〔4〕 스페로이드 형성용인, 〔1〕∼〔3〕 중 어느 하나에 기재된 배양 부재.
〔5〕 상기 세포, 조직, 또는 기관이, iPS 세포 유래의 분화 세포를 포함하는, 〔1〕∼〔4〕 중 어느 하나에 기재된 배양 부재.
〔6〕 상기 세포, 조직, 또는 기관이, 심근 세포를 포함하는, 〔1〕∼〔5〕 중 어느 하나에 기재된 배양 부재.
〔7〕 상기 배양 부재의 형상이 필름상 또는 시트상인, 〔1〕∼〔6〕 중 어느 하나에 기재된 배양 부재.
〔8〕 적어도 배양면이, 〔1〕∼〔7〕 중 어느 하나에 기재된 배양 부재로 형성된, 배양 기구.
〔9〕 〔1〕∼〔7〕 중 어느 하나에 기재된 배양 부재 또는 〔8〕에 기재된 배양 기구의 배양면에, 세포, 조직 또는 기관을 접촉시키는 공정(A); 및
상기 배양면에 접촉한 세포, 조직 또는 기관을 배양하여 스페로이드를 형성시키는 공정(B);를 포함하는 세포, 조직 또는 기관의 배양 방법.
〔10〕 추가로, 상기 세포 등의 분화를 유도하는 공정(C)를 포함하고, 공정(C)가, 프로틴 프리 심근 분화 유도(PFCD)법에 의해, iPS 세포의 심근 세포에의 분화를 유도하는 공정인, 〔9〕에 기재된 세포, 조직 또는 기관의 배양 방법.
〔11〕 심근 순도를 증가시키는, 〔9〕 또는 〔10〕에 기재된 세포, 조직 또는 기관의 배양 방법.
〔12〕 〔9〕∼〔11〕 중 어느 하나에 기재된 배양 방법에 의해 형성된 스페로이드.
본 발명에 의하면, 세포 등을 배양하여 스페로이드를 형성시킬 수 있는, 배양 부재 및 배양 기구를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, 형상 안정성이 우수하고, 또한, 세포, 조직, 또는 기관의 배양에 적합한 산소 환경을 실현할 수 있고, 자가 형광을 발하지 않아 세포 관찰성을 해치지 않고, 약제를 수착하기 어려운 배양 부재 및 배양 기구를 제공할 수 있다. 더욱이, 본 발명에 의하면, 특히 줄기세포 유래의 분화 세포를 분화 세포 순도가 높은 상태에서 배양 가능한 배양 부재 및 배양 기구를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 배양 부재 및 배양 기구는, iPS 세포를 심근 세포로 분화시키기 쉽다.
[도 1] 도 1은, iPS 세포로부터 심근 세포를 분화 유도하는 실험의 스케줄을 나타내는 도면이다.
[도 2] 도 2는, 심근 분화 유도 12일째의 세포의 형태를 관찰한 사진이다.
[도 3] 도 3은, 심근 분화 유도 19일째의 세포의 형태를 관찰한 사진이다.
[도 4] 도 4는, 실시예 3의 인간 골육종 유래 암 세포(HOF-143B)가 스페로이드를 형성하고 있는 모습을 관찰한 사진이다.
[도 2] 도 2는, 심근 분화 유도 12일째의 세포의 형태를 관찰한 사진이다.
[도 3] 도 3은, 심근 분화 유도 19일째의 세포의 형태를 관찰한 사진이다.
[도 4] 도 4는, 실시예 3의 인간 골육종 유래 암 세포(HOF-143B)가 스페로이드를 형성하고 있는 모습을 관찰한 사진이다.
수치 범위에 관한 「A∼B」라는 기재는, 특별히 예고가 없으면, A 이상 B 이하인 것을 나타낸다. 예를 들어, 「1∼5%」라는 기재는, 1% 이상 5% 이하를 의미한다.
［배양 부재］
본 발명에 따른 배양 부재는, 그 배양면에서 세포, 조직 또는 기관(이하, 세포 등이라고도 한다)을 배양하는 부재이고, 상기 배양 부재는 4-메틸-1-펜텐 중합체(X)를 포함하고, 상기 배양면의 수접촉각이 100°보다 크고 160° 이하이며, 온도 23℃, 습도 0%일 때의 산소 투과도가 4500∼90000cm3/(m2×24h×atm)인 것에 특징이 있다.
여기서, 배양 부재란, 세포 등을 배양하기 위해서 이용되는 배양 기구의 적어도 일부를 구성하는 부재를 의미한다. 배양 부재가 상기 배양 기구의 일부인 경우, 적어도 세포 등을 배양하는 배양면이, 본 발명의 배양 부재에 의해 구성된다. 여기에서 배양면이란, 세포 등을 배양할 때에, 배지가 형성되는 면, 세포 등이 파종되는 면, 또는 배지가 형성되고 또한 세포 등이 파종되는 면을 의미한다. 즉, 배양면이란, 배지 형성 예정면 및 세포 등 파종 예정면을 포함하는 개념이다.
본 명세서에 있어서, 배양이란, 세포 등을 증식, 유지시키는 것뿐만 아니라, 세포 등의 파종, 계대, 분화 유도, 자체 조직화 유도 등의 프로세스도 포함하는 넓은 의미로 이용한다.
본 발명의 배양 부재의 형태는 특별히 제한은 없고, 예를 들어, 필름상, 시트상이어도 된다. 상기 배양 부재가, 필름상이나 시트상인 경우에는, 필름상 또는 시트상의 배양 부재의 적어도 일면을 배양면으로 한, 배양 기구로서 호적하게 이용할 수 있다.
본 발명의 배양 부재는, 배양면에, 세포 등의 토대(anchorage)가 되기 위한 천연 고분자 재료, 합성 고분자 재료, 또는 무기 재료가 코팅되어 있지 않은 것을 의미한다.
본 발명의 배양 부재의 두께는, 특별히 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 배양 부재의 두께는, 특별히 제한되지 않지만, 20∼500μm가 바람직하고, 25∼400μm가 보다 바람직하고, 50∼200μm가 특히 바람직하다. 배양 부재의 두께가 상기 범위 내이면, 세포가 증식하기 위해서 필요한 적당한 배지 중의 산소 농도가 얻어지고, 배양 부재, 특히 배양 용기 저면이 휘지 않고 호적한 배양 기구를 제작하기 쉬워진다.
본 발명의 배양 부재를 용기 저면에 배치하여 디시(샬레라고도 칭한다), 플라스크, 인서트 또는 플레이트 등의 배양 기구를 제작할 때의 배양 부재의 두께는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 20μm∼400μm, 보다 바람직하게는 20μm∼300μm, 더 바람직하게는 20μm∼200μm의 두께이다. 배양 부재의 두께는, 배양 기구의 형태에 따라서 적절히 선택되지만, 상기 범위로 조정함으로써 세포가 증식하기 위해서 필요한 적당한 배지 중의 산소 농도가 얻어지기 쉽고, 충분한 강도를 가지는, 호적한 배양 기구를 제작하기 쉬워진다.
본 발명의 배양 부재는, 본 발명의 효과를 해치지 않으면, 그 표면을 가공해도 된다. 표면의 가공으로서는, 예를 들어, 요철 구조의 형성 가공, 친수화 처리, 소수화 처리 등의 표면 개질 처리를 들 수 있다.
본 발명의 배양 부재는, 그 표면을 가공하지 않아도, 세포가 접착되기 어렵기 때문에, 스페로이드를 형성시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 배양 부재는, 그 표면을 가공되어 있지 않은 것이 바람직하고, 요철 구조의 형성 가공이 행해지지 않은 것이 보다 바람직하다.
표면 개질 처리에 이용하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 코로나 처리, 플라즈마 처리, 오존 처리, 자외선 처리 등의 친수화 처리, 에스터화, 실릴화, 불화 등의 소수화 처리, 표면 그래프트 중합, 화학 증착, 에칭, 또는, 하이드록실기, 아미노기, 설폰기, 싸이올기, 카복실기 등의 특정의 작용기 부가, 실레인 커플링, 타이타늄 커플링, 지르코늄 커플링 등의 특정의 작용기에 의한 처리, 산화제 등에 의한 표면 조화(粗化), 러빙이나 샌드 블래스트 등의 물리적 처리 등을 들 수 있다. 이들 표면 개질 처리는, 단독으로 행해도 되고, 2종 이상을 조합하여 행해도 된다. 한편, 표면 개질 처리를 행하는 경우에는, 적어도 배양면에 행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 부재의 제조 방법은, 특별히 제한되지 않고, 제조에 이용하는 기기도 제한되지 않는다. 예를 들어, 4-메틸-1-펜텐 중합체(X)를 포함하는 필름 또는 시트를 형성하고, 필요에 따라서 그 필름 또는 시트를 성형하여 소망의 형상으로 한 성형품으로서 배양 부재를 제작할 수 있다. 배양 부재가 되는 필름, 시트 또는 그 외의 성형품은, 압출 성형, 용액 캐스트 성형, 사출 성형, 블로 성형 등의 방법에 의해, 직접 성형하는 것에 의해서도 얻어진다.
상기 필름 또는 시트를 형성하는 방법으로서는, 구체적으로는, 예를 들어, 통상의 인플레이션법, T-다이 압출법 등이 채용된다. 제조는 통상 가온하여 행한다. T-다이 압출법을 채용하는 경우, 압출 온도는 100℃∼400℃가 바람직하고, 200℃∼300℃가 특히 바람직하다. 또한, 롤 온도는 45℃∼75℃가 바람직하고, 55℃∼65℃가 특히 바람직하다.
또한, 상기 필름 또는 시트는 4-메틸-1-펜텐 중합체(X)를 용제에 용해하고, 수지나 금속 상에 흘리고, 레벨링하면서 천천히 건조시켜 필름화(시트화)하는 용액 캐스트법으로 제조해도 된다. 이용되는 용제는 특별히 제한 없지만, 사이클로헥세인, 헥세인, 데케인, 톨루엔 등의 탄화수소 용제를 이용해도 된다. 또한, 용제는, 4-메틸-1-펜텐 중합체(X)의 용해성이나 건조 효율을 고려하여 2종류 이상을 혼합해도 된다. 테이블 코팅, 스핀 코팅, 딥 코팅, 다이 코팅, 스프레이 코팅, 바 코팅, 롤 코팅, 커튼 플로 코팅 등의 방법으로 폴리머 용액을 도포하고, 건조, 박리함으로써 필름 또는 시트로 가공할 수 있다.
본 발명의 배양 부재는, 바람직하게는 스페로이드 형성용 배양 부재이며, 보다 바람직하게는 스페로이드 형성용 세포 배양 부재이다.
［4-메틸-1-펜텐 중합체］
본 발명에 있어서는, 4-메틸-1-펜텐 단독중합체, 및 4-메틸-1-펜텐과 다른 모노머의 공중합체를 총칭하여 「4-메틸-1-펜텐 중합체(X)」라고 칭한다.
4-메틸-1-펜텐 중합체의 일례인, 4-메틸-1-펜텐과, 다른 모노머의 공중합체로서는, 랜덤 공중합체, 교대 공중합체, 블록 공중합체, 그래프트 공중합체의 어느 것이어도 된다. 4-메틸-1-펜텐과, 다른 모노머의 공중합체로서는, 4-메틸-1-펜텐과, 에틸렌 및 탄소수 3∼20의 α-올레핀(4-메틸-1-펜텐을 제외한다)으로부터 선택되는 적어도 1종의 올레핀의 공중합체가, 강도가 높고, 부재로서 이용해도 깨지기 어렵고 균열되기 어렵고, 휨도 적기 때문에 바람직하다.
4-메틸-1-펜텐 중합체로서는, 4-메틸-1-펜텐 단독중합체 및, 4-메틸-1-펜텐과, 에틸렌 및 탄소수 3∼20의 α-올레핀(4-메틸-1-펜텐을 제외한다)으로부터 선택되는 적어도 1종의 올레핀의 공중합체로부터 선택되는 적어도 1종의 중합체인 것이 바람직하고, 4-메틸-1-펜텐과, 에틸렌 및 탄소수 3∼20의 α-올레핀(4-메틸-1-펜텐을 제외한다)으로부터 선택되는 적어도 1종의 올레핀의 공중합체인 것이 보다 바람직하다.
상기 올레핀으로서는, 예를 들어, 에틸렌, 프로필렌, 1-뷰텐, 1-헥센, 1-헵텐, 1-옥텐, 1-데센, 1-테트라데센, 1-헥사데센, 1-헵타데센, 1-옥타데센, 1-에이코센을 들 수 있다. 상기 올레핀은, 배양 부재에 필요한 물성에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 상기 올레핀으로서는, 적당한 산소 투과도와, 우수한 강성이라고 하는 관점에서는, 탄소수 8∼18의 α-올레핀이 바람직하고, 1-옥텐, 1-데센, 1-도데센, 1-테트라데센, 1-헥사데센, 1-헵타데센 및 1-옥타데센으로부터 선택되는 적어도 1종이 보다 바람직하다. 올레핀의 탄소수가 상기 범위에 있으면, 중합체의 가공성이 보다 양호해져, 크랙이나 단부의 균열에 의한 배양 부재의 외관 불량이 생기기 어려워지는 경향이 있다. 또한, 배양 부재의 불량품 발생률이 낮아진다.
상기 올레핀은, 1종 또는 2종 이상을 이용할 수 있다. 재료의 강도의 관점에서, 탄소수는 2 이상이 바람직하고, 더 바람직하게는 탄소수 10 이상이 더 바람직하다. 상이한 2종 이상의 α-올레핀을 조합하는 경우에는, 1-테트라데센 및 1-헥사데센으로부터 선택되는 적어도 1종과, 1-헵타데센 및 1-옥타데센으로부터 선택되는 적어도 1종을 조합하는 것이 특히 바람직하다.
상기 4-메틸-1-펜텐 중합체에 있어서의 4-메틸-1-펜텐으로부터 유도되는 구성 단위의 함유량은, 바람직하게는 60∼100몰%, 보다 바람직하게는 80∼98몰%이다.
또한, 4-메틸-1-펜텐 중합체가, 4-메틸-1-펜텐과, 에틸렌 및 탄소수 3∼20의 α-올레핀(4-메틸-1-펜텐을 제외한다)으로부터 선택되는 적어도 1종의 올레핀의 공중합체인 경우는, 그 공중합체에 있어서의 에틸렌 및 탄소수 3∼20의 α-올레핀(4-메틸-1-펜텐을 제외한다)으로부터 선택되는 적어도 1종의 올레핀으로부터 유도되는 구성 단위의 함유량은, 바람직하게는 0∼40몰%, 보다 바람직하게는 2∼20몰%이다. 한편, 이들 구성 단위의 함유량은, 4-메틸-1-펜텐 중합체 중의 전체 반복 구성 단위량을 100몰%로 한다. 구성 단위의 함유량이 상기 범위 내에 있으면, 가공성이 우수하고 균질한 배양면이 얻어지고, 또한 필름의 인성과 강도의 균형이 좋기 때문에, 휨도 적어진다.
상기 4-메틸-1-펜텐 중합체는, 본 발명의 효과를 해치지 않는 범위에서, 4-메틸-1-펜텐으로부터 유도되는 구성 단위 및 상기 에틸렌 및 탄소수 3∼20의 α-올레핀으로부터 유도되는 구성 단위 이외의 구성 단위(이하 「그 외의 구성 단위」라고도 한다)를 가져도 된다. 그 외의 구성 단위의 함유량은, 예를 들어 0∼10.0몰%이다. 상기 4-메틸-1-펜텐 중합체가 그 외의 구성 단위를 갖는 경우, 그 외의 구성 단위는, 1종이어도 2종 이상이어도 된다.
그 외의 구성 단위를 유도하는 모노머로서는, 예를 들어, 환상 올레핀, 방향족 바이닐 화합물, 공액 다이엔, 비공액 폴리엔, 작용 바이닐 화합물, 수산기 함유 올레핀, 할로젠화 올레핀을 들 수 있다. 환상 올레핀, 방향족 바이닐 화합물, 공액 다이엔, 비공액 폴리엔, 작용 바이닐 화합물, 수산기 함유 올레핀 및 할로젠화 올레핀으로서는, 예를 들어, 일본 특허공개 2013-169685호 공보의 단락［0035］∼［0041］에 기재된 화합물을 이용할 수 있다.
상기 4-메틸-1-펜텐 중합체는, 1종 단독으로 이용해도 되고, 2종 이상을 조합하여 이용해도 된다.
4-메틸-1-펜텐 중합체로서는 시판품을 사용할 수도 있다. 구체적으로는, 미쓰이 화학(주)제의 TPX MX001, MX002, MX004, MX0020, MX021, MX321, RT18, RT31 또는 DX845 모두 상표) 등을 들 수 있다. 또한, 그 외의 메이커제여도 상기의 요건을 만족시키는 4-메틸-1-펜텐 중합체이면, 바람직하게 사용할 수 있다. 이들 시판품은 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 배합하여 사용할 수도 있다.
4-메틸-1-펜텐 중합체는, 통상, 융점 200℃∼240℃이며 내열성이 높다. 또한 가수분해를 일으키지 않고, 내수성, 내비수(沸水)성, 내스팀성이 우수하기 때문에, 4-메틸-1-펜텐 중합체를 포함하는 배양 기구 등의 배양 부재는 고압 증기 멸균 처리가 가능하다. 4-메틸-1-펜텐 중합체는, 또한 가시광선 투과율이 높고(통상 90% 이상), 자가 형광을 발하지 않는 특징을 가지므로, 4-메틸-1-펜텐 중합체를 포함하는 배양 기구는 배양 세포의 관찰을 하기 쉽다. 더욱이, 대부분의 약품에 우수한 내약품성을 나타내어, 약제를 수착하기 어렵기 때문에, 창약 스크리닝 용도나 진단 용도에도 호적하게 이용된다. 4-메틸-1-펜텐 중합체는, 히트 실링이 가능하고, 자재끼리의 열융착뿐만 아니라 다른 재료와의 열접착도 용이하다. 또한, 열성형이 가능하기 때문에, 임의의 형상의 배양 기구로 성형하는 것이 용이하고, 예를 들어 임프린트법이나 인서트법을 이용한 성형도 용이하다.
4-메틸-1-펜텐 중합체의, 표준 폴리스타이렌을 기준 물질로 한 겔 퍼미에이션 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정되는, 중량 평균 분자량(Mw)은, 바람직하게는 10000∼2000000, 보다 바람직하게는 20000∼1000000, 더 바람직하게는 30000∼500000이다. 여기에서, GPC 측정 시의 시료 농도는, 예를 들어 1.0∼5.0mg/ml로 할 수 있다. 또한, 4-메틸-1-펜텐 중합체의 분자량 분포(Mw/Mn)는, 바람직하게는 1.0∼30, 보다 바람직하게는 1.1∼25, 더 바람직하게는 1.1∼20이다. GPC에서 이용되는 용제는, 오쏘다이클로로벤젠이 바람직하게 이용된다. 또한, 측정 조건의 일례로서는, 후술하는 실시예에 나타낸 조건을 들 수 있지만, 해당 측정 조건으로 한정되는 것은 아니다.
중량 평균 분자량(Mw)을 상기 상한 이하로 하는 것에 의해, 후술하는 4-메틸-1-펜텐 중합체의 성형법에 있어서, 용융 성형으로 제작한 필름은, 겔 등의 문제의 발생을 억제하기 쉬워, 표면이 균일한 제막을 하기 쉬워진다. 또한, 용액 캐스트법으로 제작할 때는 용제에 대한 용해성을 보다 양호하게 하여, 필름의 겔 등의 문제를 억제하기 쉬워, 표면 균일한 제막이 하기 쉬워진다.
또한, 중량 평균 분자량(Mw)을 상기 하한 이상으로 하는 것에 의해, 배양 부재는 강도가 충분해지는 경향이 있다. 더욱이, 분자량 분포를 상기의 범위 내로 함으로써, 제작한 배양 부재 표면의 끈적거림을 억제하기 쉽고, 배양 부재의 인성도 충분해지는 경향이 있어, 성형 시의 굽어짐이나 재단 시의 크랙의 발생 등을 억제하기 쉬워진다.
상기 4-메틸-1-펜텐 중합체의 중량 평균 분자량(Mw) 및 분자량 분포(Mw/Mn)는, 4-메틸-1-펜텐 중합체로서, 2종 이상을 이용했을 경우에는, 각각의, Mw 및 Mw/Mn가, 상기 범위에 있으면 된다.
4-메틸-1-펜텐 중합체는 이상과 같이 우수한 특성을 갖고 있으므로, 적어도 배양면이 본 발명의 배양 부재로 형성된 배양 기구는, 배양에 나쁜 영향을 주는 경우도 없고, 또한 안정성, 광투과성, 성형 가공성이 양호하고, 멸균 처리를 행할 수 있으므로, 배양 부재의 재료로서 매우 우수하다.
［4-메틸-1-펜텐 중합체의 제조 방법］
상기 4-메틸-1-펜텐 중합체를 제조하는 방법은, 4-메틸-1-펜텐, 올레핀, 그 외의 모노머를 중합시킬 수 있으면, 어느 방법이어도 된다. 또한, 분자량이나 분자량 분포를 제어하기 위해서 연쇄 이동제, 예를 들어 수소를 공존시켜도 된다. 제조에 이용하는 기기도 제한되지 않는다. 중합법은 공지된 방법이어도 되고, 기상법, 슬러리법, 용액법, 벌크법이어도 된다. 바람직하게는 슬러리법, 용액법이다. 또한, 중합법은 단단(單段) 중합법, 또는 2단 등의 다단 중합법으로, 분자량이 상이한 복수의 중합체를 중합계 중에 블렌드하는 방법이어도 된다. 단단, 다단 중합법의 어느 것이어도, 연쇄 이동제로서 수소를 이용하는 경우에는, 일괄 투입해도, 분할 투입, 예를 들어 중합 초기, 중기, 종기에 투입해도 된다. 중합은 상온에서 행해도 되고, 필요에 따라서 가온해도 되지만, 중합의 효율의 관점에서, 20℃∼80℃에서 행하는 것이 바람직하고, 40℃∼60℃에서 행하는 것이 특히 바람직하다. 제조에 이용하는 촉매도 제한되지 않지만, 중합의 효율의 관점에서, 예를 들어 국제 공개 공보 2006/054613에 기재되는 고체상 타이타늄 촉매 성분(I)이나, 국제 공개 공보 2014/050817에 기재되는 전이 금속 화합물(A)를 함유하는 올레핀 중합용 촉매(메탈로센 촉매)를 이용하는 것이 바람직하다.
한편, 배양 부재가 4-메틸-1-펜텐 중합체(X)를 포함하는 조성물로부터 형성되는 경우에는, 배양 부재 100질량% 중에, 4-메틸-1-펜텐 중합체(X)가, 바람직하게는 90질량% 이상 100질량% 미만이고, 보다 바람직하게는 95질량% 이상 100질량% 미만이며, 특히 바람직하게는 99질량% 이상 100질량% 미만이다. 4-메틸-1-펜텐 중합체(X) 이외의 성분을 다량으로 포함하면, 산소 투과도의 저하뿐만 아니라, 투명성의 저하나 강도의 저하를 초래한다.
본 발명의 배양 부재를 형성하는 재료는, 4-메틸-1-펜텐 중합체(X) 이외의 성분이 포함되어 있어도 된다. 4-메틸-1-펜텐 중합체(X) 이외의 성분으로서는, 내열 안정화제, 내광 안정화제, 가공 조제, 가소제, 산화 방지제, 활제, 소포제, 안티블록제, 착색제, 개질제, 항균제, 항미제, 방담제 등의 첨가제를 들 수 있다.
［수접촉각］
본 발명의 배양 부재는, 그 배양면의 수접촉각이 100°보다 크고 160° 이하이다. 상기 수 접촉각은, 바람직하게는 100°보다 크고 150° 이하이며, 보다 바람직하게는 100°보다 크고 130° 이하이며, 더 바람직하게는 105°보다 크고 130° 이하이다. 배양 부재의 배양면의 수접촉각이 100° 이하이면, 세포 등이 배양 부재와 접착되어 버려, 스페로이드를 형성하기 어렵다. 또한, 배양 부재의 배양면의 수접촉각이 160°보다 크면 배양면과 배지의 접촉이 불충분해져, 배지 내에의 산소 공급 효율이 저하되어 버린다.
수접촉각의 측정 방법은 특별히 제한되지 않고, 공지된 방법을 이용할 수 있지만, 바람직하게는 정적법이다. 수접촉각은, 예를 들어, 일본공업규격 JIS-R3257(기판 유리 표면의 젖음성 시험 방법)에 준하여, 25±5℃, 50±10%의 항온항습 조건하에서 수적(水滴)의 형상을 구형으로 간주할 수 있는 4μL 이하의 용량의 수적을, 배양 부재 혹은 배양 부재와 동일한 재료를 이용하여 제작된 측정 샘플의 표면에 적하하고, 정적법에 의해, 측정 샘플 표면에 수적이 접촉한 직후부터 1분 이내의 측정 샘플과 수적의 접촉 계면의 각도를 계측하는 방법으로 측정할 수 있다.
［산소 투과도］
본 발명의 배양 부재의 온도 23℃, 습도 0%일 때의 산소 투과도는, 4500∼90000cm3/(m2×24h×atm)이고, 바람직하게는 4500∼67500cm3/(m2×24h×atm)이며, 보다 바람직하게는 4500∼47000cm3/(m2×24h×atm)이고, 더 바람직하게는 4500∼45000cm3/(m2×24h×atm)이다.
배양 부재의 산소 투과도가 지나치게 낮으면 배지 중의 산소 농도가 낮아져, 세포는 충분히 증식하지 않는다. 한편으로, 산소 투과도가 지나치게 높으면 배지 중의 산소 농도가 지나치게 높아져 산소 스트레스에 의해 세포 기능이 저하된다. 산소 투과도가 상기 상하한의 범위인 경우, 세포는 양호한 형태를 유지하고 배양 기간에 따라서 효율 좋게 증식할 수 있다.
배양 부재 혹은 배양 부재와 동일한 재료를 이용하여 제작된 측정 샘플에 대해, 차압식 가스 투과율 측정법에 의해, 온도 23℃, 습도 0%에서의 산소 투과 계수［cm3×mm/(m2×24h×atm)］를 측정하고, 산소 투과 계수를 배양 부재의 두께(μm)로 나눈 값을 산소 투과도［cm3/(m2×24h×atm)］로 한다. 측정에 이용하는 기기는 차압식 가스 투과율 측정법을 이용한 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 도요 세이키 제작소제의 차압식 가스 투과율 측정 장치 MT-C3을 들 수 있다. 측정 샘플은, 예를 들어 두께 50μm의 필름으로부터 90×90mm의 시험편을 절출하여 제작하고, 측정부 지름은 70mm(투과 면적은 38.46cm2)로 하면 바람직하다. 산소 투과도가 크기 때문에, 미리 샘플에 알루미늄 마스크를 씌워, 실투과 면적을 5.0cm2로 하는 것이 보다 바람직하다. 산소 투과도의 측정에 이용하는 배양 부재 또한 배양 부재와 동일한 재료를 이용하여 제작된 측정 샘플은, 미세 가공, 표면 개질 처리를 행한 것이어도 되고, 행하고 있지 않은 것이어도 되지만, 아무런 처리도 행하지 않은 것이 바람직하다.
［세포, 조직, 또는 기관］
본 명세서에 있어서, 세포, 조직, 또는 기관은, 간단히 「세포 등」이라고도 칭한다. 세포 등의 유래는, 특별히 한정되지 않고, 동물, 식물, 곤충, 균, 원생생물, 세균 등 어떤 생물이어도 되지만, 동물, 또는 식물이 바람직하고, 동물이 더 바람직하고, 특히 포유동물이 바람직하다. 본 발명의 배양 부재는, 세포 등의 접착을 피해 배양할 수 있고, 산소 투과성도 우수하므로, 세포 등은 비접착성의 것인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 세포는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 식물 세포, 동물 세포, 곤충 세포 등을 들 수 있지만, 동물 세포인 것이 바람직하고, 포유동물 세포인 것이 보다 바람직하다. 포유동물 세포로서는, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 양, 고양이, 염소 유래의 세포가 바람직하고, 인간 유래의 세포가 보다 바람직하다. 세포는, 2차원에서 배양되는 세포여도 되고, 3차원에서 배양되는 세포여도 되고, 세포를 배양하여 얻어지는 스페로이드를 포함한다. 본 발명에 있어서의 세포는, 동결이나 재동결한 것을 이용해도 된다. 또한, 본 발명에 있어서의 세포는, 계대한 것을 이용해도 되고, 계대 횟수는 특별히 제한되지 않는다.
동물 세포로서는, 정상 세포, 암 세포, 및 하이브리도마 등의 융합 세포 등을 사용할 수 있고, 유전자 도입 등의 인공적 처리가 이루어진 세포여도 된다. 동물 세포는, 초대 배양 세포 혹은 주화 계대된 세포의 어느 것이어도 된다. 동물 세포는, 부유성 세포여도 되고, 접착성 세포여도 된다. 동물 세포로서는, 예를 들어, 미분화의 다능성 줄기세포, 다능성 줄기세포 유래의 분화 세포(분화 유도를 개시하여, 이미 분화의 과정에 있는 다능성 줄기세포를 포함한다), 미분화의 체성 줄기세포, 체성 줄기세포 유래의 분화 세포(분화 유도를 개시하여, 이미 분화의 과정에 있는 체성 줄기세포를 포함한다), 및 동물의 조직에서 유래하는 분화 세포를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 분화 세포는, 분화의 최종 스테이지까지 성숙시킨 세포(최종 분화한 성숙 세포)로 한정되는 것은 아니다. 상기 분화 세포로서는, 외배엽으로부터 분화 성숙하는 세포여도 되고, 중배엽으로부터 분화 성숙하는 세포여도 되고, 내배엽으로부터 분화 성숙하는 세포여도 된다.
다능성 줄기세포란, 생체를 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 다능화능(pluripotency)과, 세포 분열을 거쳐도 그 다능화능을 유지할 수 있는 자기 복제능을 갖는 세포를 의미한다. 다능성 줄기세포에는, 배성 줄기세포(Embryonic stem cells: ES 세포), 배성 생식 줄기세포(Embryonic germ cells: EG 세포), 인공 다능성 줄기세포(Induced pluripotent stem cells: iPS 세포), 뮤즈 세포(Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell), 배성 암종 세포(embryonic carcinoma cell: EC 세포), 영양아 줄기세포(trophoblast stem cell: TS 세포), 에피블라스트 줄기세포(epiblast stem cell: EpiS 세포)가 포함된다. 다능성 줄기세포는, 바람직하게는, ES 세포 또는 iPS 세포, 보다 바람직하게는 iPS 세포이다.
ES 세포는, 포유동물의 수정란의 배반포로부터 내부 세포괴를 취출하여, 내부 세포괴를 섬유아세포의 피더 상에서 배양하는 것에 의해 수립할 수 있다. 또한, 계대 배양에 의한 세포의 유지는, 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor(LIF)), 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor (bFGF)) 등의 물질을 첨가한 배양액을 이용하여 행할 수 있다. 인간 및 원숭이의 ES 세포의 수립과 유지의 방법에 대해서는, 예를 들어 USP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848; Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147; H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932; M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559; H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279; H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585; Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485 등에 기재되어 있다.
또한, 인간 ES 세포주는, 예를 들어 WA01(H1) 및 WA09(H9)는, WiCell Reserch Institute로부터, KhES-1, KhES-2 및 KhES-3은, 교토 대학 재생의과학 연구소(교토, 일본)로부터 입수 가능하다.
iPS 세포는, 특정의 초기화 인자를, DNA 또는 단백질의 형태로 체세포에 도입하는 것에 의해 제작할 수 있다(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M. 등, Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008); 국제 공개 WO 2007/069666).
상기 체세포는, 난자, 난모세포, ES 세포 등의 생식 계열 세포 또는 분화 전능성 세포를 제외한 모든 동물 세포(바람직하게는, 인간을 포함하는 포유동물 세포)를 의미하고, 태아(새끼)의 체세포, 신생아(새끼)의 체세포, 및 성숙한 건전한 혹은 질환성의 체세포의 어느 것도 포함하고, 또한, 초대 배양 세포, 계대 세포, 및 주화 세포의 어느 것도 포함한다. 상기 체세포로서는, 예를 들어, 신경 줄기세포, 조혈 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 치수 줄기세포 등의 조직 줄기세포(체성 줄기세포); 조직 전구 세포; 림프구, 상피 세포, 내피 세포, 근육 세포, 섬유아세포, 모(毛) 세포, 간 세포, 위점막 세포, 장 세포, 비 세포, 췌 세포, 뇌 세포, 폐 세포, 신장 세포 및 지방 세포 등의 분화한 세포 등을 들 수 있다.
상기 초기화 인자는, ES 세포에 특이적으로 발현하고 있는 유전자, 그 유전자 산물 혹은 non-coding RNA 또는 ES 세포의 미분화 유지에 중요한 역할을 하는 유전자, 그 유전자 산물 혹은 non-coding RNA, 혹은 저분자 화합물에 의해 구성되어도 된다. 초기화 인자에 포함되는 유전자로서, 예를 들어, Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 또는 Glis1 등을 들 수 있고, 이들 초기화 인자는, 1종 단독으로 이용해도 되고, 2종 이상을 조합하여 이용해도 된다.
체성 줄기세포는, 특정의 세포로 분화할 수 있는 한정된 분화능과, 세포 분열을 거쳐도 그 한정된 분화능을 유지할 수 있는 자기 복제능을 갖는 세포를 의미한다. 체성 줄기세포에는, 간엽계 줄기세포, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포 등이 포함된다.
동물의 조직에서 유래하는 분화 세포로서는, 예를 들어, 각종 전구 세포를 포함하는, 지방 세포, 간 세포, 신장 세포, 췌장 세포, 유선 세포, 내피 세포, 상피 세포, 평활근 세포, 근아세포, 심근 세포, 신경 세포, 글리아 세포, 수상 세포, 연골 세포, 골아세포, 파골 세포, 골 세포, 섬유아세포, 각종 혈액계 세포, 망막 세포, 각막 유래 세포, 생식선 유래 세포, 각종 선(線; glandular) 세포 등을 들 수 있다.
상기 세포는 1종 단독으로 이용해도 되고, 2종 이상을 조합하여 이용해도 된다.
동물 세포는, 스페로이드 형성에 호적하므로, 바람직하게는 다능성 줄기세포 및 다능성 줄기세포 유래의 분화 세포, 보다 바람직하게는 iPS 세포 및 iPS 세포 유래의 분화 세포, 더 바람직하게는 iPS 세포 유래의 심근 세포, 특히 바람직하게는 iPS 세포 유래의 인간 심근 세포이다. 혹은, 동물 세포는, 스페로이드 형성에 호적하므로, 바람직하게는 체성 줄기세포, 보다 바람직하게는 간엽계 줄기세포이다. 혹은, 스페로이드 형성에 호적하므로, 동물 세포는, 바람직하게는 암 세포이다. 혹은, 세포 상태를, 입체 구조를 가지는 생체 내에서의 상태에 따라 접근할 수 있으므로, 동물 세포는, 바람직하게는 일반적으로 삼차원 배양을 행하는 것이 요구되고 있는 세포이고, 보다 바람직하게는 스페로이드를 형성하는 세포이며, 예를 들어, 간 세포, 신경 세포, 심근 세포, 췌β 세포, 혈관 내피 세포, 지방 세포, 지방 유래 줄기세포, 연골 세포, 간엽계 줄기세포, 모낭 상피 줄기세포, 모유두 세포, 피부 섬유아세포, 피부 각화 세포, 골아세포이다.
동물 세포가, 다능성 줄기세포 유래의 분화 세포인 경우, 해당 세포는, 다능성 줄기세포로부터 공지된 분화 유도법에 의해 제작할 수 있다. 혹은, 다능성 줄기세포 유래의 분화 세포는, 상업적으로 입수 가능한 것을 이용해도 된다. 동물 세포가 체성 줄기세포인 경우, 동물로부터 채취된 것을 이용해도 되고, 상업적으로 입수 가능한 것을 이용해도 된다.
다능성 줄기세포 유래의 분화 세포는, iPS 세포 유래의 심근 세포인 것이 바람직하다.
iPS 세포 유래의 심근 세포는, 예를 들어 공지된 프로틴 프리 심근 분화 유도(PFCD)법에 의해 제작할 수 있다(국제 공개 제2015/182765호를 참조). 프로틴 프리 심근 분화 유도(PFCD)법은, 높은 심근 분화 효율을 달성할 수 있기 때문에, 해당 방법에 의해 제작된 iPS 세포 유래의 심근 세포는, 높은 심근 세포 순도를 달성할 수 있다.
본 발명에 있어서, 스페로이드란, 세포끼리가 모여 덩어리가 된 것을 말하고, 세포 응집체 또는 세포괴 등으로 바꿔 말할 수 있다. 스페로이드는 심근 세포와 같은 단일한 세포를 포함하는 스페로이드여도, 각종 섬유아세포나 혈관 내피 세포 등과 심근 세포와 같은 2종 이상의 상이한 세포종을 포함하는 스페로이드여도 된다. 사용할 수 있는 세포로서는, 상기의 각종 세포를 들 수 있다. 본 발명의 배양 부재 또는 배양 기구를 이용하여 형성되는 스페로이드는, 바람직하게는 다능성 줄기세포를 포함하는 스페로이드 및 다능성 줄기세포 유래의 분화 세포를 포함하는 스페로이드이고, 보다 바람직하게는 iPS 세포를 포함하는 스페로이드 또는 iPS 세포 유래의 분화 세포를 포함하는 스페로이드이며, 더 바람직하게는 iPS 세포 유래의 심근 세포를 포함하는 스페로이드이다.
스페로이드는, 바람직하게는 10% 이상, 보다 바람직하게는 13% 이상, 더 바람직하게는 15% 이상, 더 바람직하게는 20% 이상, 특히 바람직하게는 30% 이상의 분화 세포 순도(분화 세포수/스페로이드를 구성하는 세포수×100)를 갖는다. 심근 세포를 목적 세포로 하고, iPS 세포를 분화 유도하여, 스페로이드를 형성하는 경우, 상기 스페로이드는, iPS 세포 유래의 심근 세포를, 바람직하게 10% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상, 더 바람직하게는 30% 이상의 심근 세포 순도로 포함한다. 상기 분화 세포수는, 공지된 방법에 의해 구할 수 있고, 예를 들어, 심근 마커인 심근 트로포닌 T(cTnT), Troponin, MYL2(Myosin regulatory light chain 2), MYL7(Myosin regulatory light chain 7) 등에 대한 항체를 이용하여 플로 사이토메트리로 해석하는 것에 의해 구할 수 있다. 상기 스페로이드를 구성하는 세포수는, 공지된 방법에 의해 구할 수 있고, 예를 들어, 스페로이드를 Trypsin 처리하여 싱글 셀화하고, 싱글 셀의 세포수를 계측하는 것에 의해 구할 수 있다.
다능성 줄기세포를 분화시켜, 분화 세포를 얻는 경우에는, 최종적으로 얻어진 스페로이드에는, 목적하는 분화 세포 이외에도, 미분화의 세포나, 목적하는 분화 이외의 분화를 한 세포가 적잖이 포함되어 버린다. 그 때문에, 분화 세포 순도가 상기 범위 내에 있으면, 분화 세포의 스페로이드를 각종 검사에 이용했을 경우의 데이터의 신뢰성이 높아지고, 또한, 재현성도 높아지기 쉽다.
스페로이드의 크기는 특별히 제한되지 않는다. 스페로이드를 형성하는 세포종, 세포수, 배지, 배양일수 등에 따라서 상이하지만, 스페로이드의 크기는 평균 직경이 예를 들어 10∼10000μm인 것이 바람직하고, 10∼8000μm인 것이 보다 바람직하고, 10∼5000μm인 것이 더 바람직하다. 스페로이드의 직경은, 예를 들어, 현미경하에서 관찰하여, 촬영한 사진 상에서 직경을 계측하는 방법, 또는, 입도 분포계를 이용하는 방법에 의해, 구할 수 있다.
스페로이드를 구성하는 세포수는 특별히 제한되지 않는다. 스페로이드를 형성하는 세포종, 배지, 배양일수 등에 따라서 상이하지만, 스페로이드 1개당, 예를 들어 1×101개 이상, 1×102개 이상, 1×103개 이상, 1×104개 이상, 1×105개 이상, 1×106개 이상, 1×107개 이상, 1×108개 이상, 1×109개 이상 포함하고 있어도 된다. 또한 그 상한은 특별히 설정되지 않는다. 스페로이드를 구성하는 세포수는, 예를 들어, 형광 시약에 의한 세포 염색 후의 형광 강도와, 세포수와 형광 강도의 검량선으로부터 산출할 수 있다.
세포 배양에 이용하는 배지는, 세포에 맞추어 적절히 선택하면 된다. 배지의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 임의의 세포 배양 기본 배지나 분화 배지, 초대 배양 전용 배지 등을 이용할 수 있다. 구체적으로는, Essential 8, 이글(Eagle's) 세소(minimum) 필수 배지(EMEM), 덜베코 개변 이글 배지(DMEM), α-MEM, 글래스고 MEM(GMEM), IMDM, RPMI1640, 햄 F-12, MCDB 배지, 윌리엄스 배지 E, Hepatocyte thaw medium, 및 이들의 혼합 배지 등을 들 수 있지만, 이들에는 한정되지 않고, 세포의 증식이나 분화에 필요한 성분이 포함되는 배지이면 이용할 수 있다. 더욱이, 혈청, 각종 성장 인자, 분화 유도 인자, 항생 물질, 호르몬, 아미노산, 당, 염류 등을 첨가한 배지를 사용해도 된다. 배양 온도도 특별히 제한되지 않지만, 통상은 25∼40℃ 정도에서 행한다.
배지의 양은 특별히 제한되지 않지만, 배지의 높이는 바람직하게는 3∼30mm, 보다 바람직하게는 3∼25mm, 더 바람직하게는 4∼20mm이다.
본 발명에 있어서의 조직이란, 유사한 세포가 모여 동일한 작용을 하는 것의 의미이며, 스페로이드와는 상이한 개념이다. 상기 조직은, 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 상피 조직, 결합 조직, 근 조직, 신경 조직 등을 들 수 있다. 상기 조직은, 스페로이드를 형성하는 세포를 포함하는 조직이 바람직하고, 그와 같은 조직으로서는, 예를 들어, 신경 세포를 포함하는 신경 조직, 심근 세포를 포함하는 심근 조직, 지방 세포 또는 지방 유래 줄기세포를 포함하는 지방 조직, 연골 세포를 포함하는 연골 조직, 골아세포를 포함하는 골 조직 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 산소 요구성이 높으므로, 상기 조직은, 신경 조직, 심근 조직인 것이 바람직하고, 심근 조직이 더 바람직하다. 또한, 상기 조직은, 스페로이드 형성에 호적하므로, 체성 줄기세포를 포함하는 조직인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 기관이란, 상기 조직이 모여 목적을 가진 공동의 일을 하는 것의 의미이다. 상기 기관은, 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 폐, 심장, 간장, 신장, 비장, 췌장, 담낭, 식도, 위, 피부, 뇌 등이다. 상기 기관은, 스페로이드를 형성하는 세포를 포함하는 기관이 바람직하고, 그와 같은 기관으로서는, 예를 들어, 간 세포를 포함하는 간장, 췌β 세포를 포함하는 췌장, 혈관 내피 세포를 포함하는 혈관, 간엽계 줄기세포를 포함하는 골수, 모낭 상피 줄기세포 또는 모유두 세포를 포함하는 모낭, 신장, 피부 섬유아세포 또는 피부 각화 세포를 포함하는 피부 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 산소 요구성이 높으므로, 상기 기관은, 피부, 신장, 간장, 췌장, 심장, 모낭인 것이 바람직하고, 심장이 더 바람직하다. 또한, 상기 기관은, 스페로이드 형성에 호적하므로, 체성 줄기세포를 포함하는 기관인 것이 바람직하다.
［배양 기구］
본 발명에 있어서, 배양 기구란, 세포 등의 배양에 이용하는 기구 모두를 의미한다. 상기 배양 기구는, 적어도 그 일부가 상기 배양 부재로 구성된다. 상기 배양 기구는, 그 전부가 상기 배양 부재로 구성되어도 되고, 그 일부만이 상기 배양 부재로 구성되어도 된다. 상기 배양 기구의 일부만이 상기 배양 부재로 구성되는 경우, 적어도 세포 등을 배양하는 배양면이, 본 발명의 배양 부재에 의해 구성된다.
상기 배양 기구는 통상, 인큐베이터, 대량 배양 장치, 또는 관류 배양 장치 등의 장치 내에서 이용한다.
상기 배양 기구로서는, 공지된 각종의 배양 기구를 이용할 수 있고, 형상이나 크기는 특별히 제한되지 않는다. 상기 배양 기구로서는, 예를 들어, 디시, 플라스크, 플레이트, 보틀, 백, 튜브 등의 배양 용기 외에, 인서트, 컵, 라이너(liner), 슬라이드 등을 들 수 있고, 바람직하게는 배양 용기이다.
상기 배양 기구는, 적어도 1개의 웰을 갖는 배양 기구 또는 적어도 1개의 웰을 갖는 배양 용기여도 된다. 적어도 1개의 웰을 갖는 배양 용기란, 예를 들어, 적어도 1개의 웰을 갖는 플레이트이며, 보다 구체적으로는, 6웰, 12웰, 24웰, 48웰, 96웰, 384웰, 1536웰 등의 웰을 갖는 플레이트이다. 일반적으로 웰과 같이 오목한 형상을 저면에 갖는 배양 기구는, 저면의 복잡한 형상을 안정시키기 위해서 저면을 두껍게 할 필요가 있어, 세포 등에의 산소 공급이 충분히 행해지기 어렵다. 본 발명의 배양 부재를 이용하면, 1웰, 6웰, 12웰, 24웰, 48웰, 96웰, 384웰, 1536웰 등의 웰을 갖는 플레이트여도, 형상이 안정되어 있어, 세포 등에의 산소 공급도 충분하다.
상기 배양 기구는, 배지를 보지(保持) 혹은 저류하기 위해, 저면을 배양면으로 하는 기구인 것이 바람직하다. 상기 배양 기구가, 디시, 플라스크, 인서트, 또는 플레이트인 경우, 저면이 배양면이므로, 본 발명의 배양 부재는, 이들의 저면, 측면, 상면 중, 적어도 저면의 일부 또는 전부를 구성하는 것이 바람직하다. 적어도 저면(배양면)이 본 발명의 배양 부재로 구성되어 있으면, 상기 배양 부재를 개재시켜 배지 중에 산소를 보다 효율적으로 공급할 수 있어, 배지 중에 있는 세포 등을 보다 효율적으로 증식시킬 수 있다. 또한, 세포의 기능을 유지한 채로, 보다 고밀도로 배양할 수 있다.
상기 배양 기구의 저면의 형상은 특별히 제한되지 않고, 평저, 환저(U바닥), 평저(F바닥), 원추저(V바닥), 평저＋커브 에지 등을 들 수 있다. 환저(U바닥), 평저(F바닥), 원추저(V바닥), 평저＋커브 에지 등으로 가공하는 경우에는, 일반적인 사출 성형이나 프레스 성형으로 한 번에 가공해도 되고, 필름 또는 시트를 제작해 두고, 진공 성형이나 압공 성형 등으로 2차 가공을 행하여 제작하는 것도 가능하다. 저면의 형상은 배양의 목적에 따라 선택되지만, 세포 등을 2차원 배양할 때에는, 평저인 것이 통상은 바람직하고, 3차원 배양할 때에는 환저(U바닥) 또는 원추저(V바닥)인 것이 통상은 바람직하다.
배양 기구의 상기 배양 부재 이외의 부분은, 상기 배양 부재 이외의 재료로 구성해도 된다. 상기 배양 부재 이외의 재료는 특별히 제한되지 않고, 공지된 재료를 이용할 수 있다. 이러한 재료로서는, 예를 들어, 폴리스타이렌, 폴리다이메틸실록세인(PDMS), 환상 올레핀 폴리머, 환상 올레핀 코폴리머, 유리 등을 들 수 있다.
상기 배양 기구는, 그 배양면 및/또는 배양면 이외의 부분을 천연 고분자 재료, 합성 고분자 재료, 또는 무기 재료로 코팅하고 나서 이용해도 된다.
배양 기구의 배양면을 천연 고분자 재료, 합성 고분자 재료, 또는 무기 재료로 코팅하면, 세포 등의 증식성이 보다 우수하지만, 세포 등이 배양면에 접착되기 쉬워진다.
배양면에의 코팅의 유무는, 세포 등의 종류에 따라서 결정할 수 있지만, 통상, 코팅하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 기구는, 컨테미네이션 방지를 위해서, 소독 또는 멸균 처리를 실시해도 된다. 소독 또는 멸균 처리의 방법으로서는, 특별히 제한되지 않고, 유통 증기법, 자비법, 간헐법, 자외선법 등의 물리적 소독법, 오존 등의 기체, 에탄올 등의 소독약을 이용하는 화학적 소독법; 고압 증기법, 건열법 등의 가열 멸균법; 감마선법, 전자선법, 고주파법 등의 조사 멸균법; 산화 에틸렌 가스법, 과산화 수소 가스 플라즈마법 등의 가스 멸균법 등을 들 수 있다. 그 중에서도 조작이 간편하고, 충분히 멸균이 행해지므로, 에탄올 소독법, 고압 증기 멸균법, 감마선 멸균법, 전자선 멸균법, 또는 산화 에틸렌 가스 멸균법이 바람직하다. 이들 소독 또는 멸균 처리는, 1종 단독으로 행해도 되고, 2종 이상을 조합하여 행해도 된다.
본 발명의 배양 기구의 제조 방법은, 특별히 제한되지 않고, 배양 기구의 전부가 상기 배양 부재로 구성되는 경우에는, 배양 부재의 제조 방법과 마찬가지의 방법으로 제조할 수 있다. 배양 기구의 일부가 상기 배양 부재로 형성되는 경우에는, 배양 부재와 그 외의 부재를, 적절히 접합하는 것에 의해 배양 기구를 얻을 수 있다. 접합하는 방법으로서는 특별히 제한은 없고, 배양 부재와 그 외의 부재를 일체로 형성해도 되고, 접착제나 점착제를 개재시켜 밀착시켜도 된다.
본 발명의 배양 기구는, 바람직하게는 스페로이드 형성용 배양 기구이며, 보다 바람직하게는 스페로이드 형성용 세포 배양 기구이다.
［배양 방법］
본 발명의 세포 등의 배양 방법은, 세포, 조직, 또는 기관을 그 배양면 상에서 배양하는 배양 부재로서, 상기 배양 부재는 4-메틸-1-펜텐 중합체(X)를 포함하고, 상기 배양면의 수접촉각이 100°보다 크고 160° 이하이며, 온도 23℃, 습도 0%일 때의 산소 투과도가 4500∼90000cm3/(m2×24h×atm)인 배양 부재, 또는 적어도 배양면이, 상기 배양 부재로 형성된 배양 기구의 배양면에, 세포, 조직 또는 기관을 접촉시키는 공정(A); 및 상기 배양면에 접촉한 세포, 조직 또는 기관을 배양하여 스페로이드를 형성시키는 공정(B);를 포함하는 세포, 조직 또는 기관의 배양 방법이다.
본 발명의 배양 방법은, 상기 배양 부재 또는 상기 배양 기구의 배양면에서 세포 등을 배양하면, 세포 등이 효율 좋게 스페로이드를 형성할 수 있다고 하는 것이다. 또한, 본 발명에 의하면, 다능성 줄기세포가 분화 세포로 효율적으로 분화하기 쉽다.
[공정(A)]
배양 부재 또는 배양 기구의 배양면에, 세포 등을 접촉시키는 방법은, 배양 부재 또는 배양 기구의 배양면에 세포 등을 접촉시킬 수 있으면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 배양 부재 또는 배양 기구의 배양면에 세포 등을 파종하는 것을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들어, 배지에 현탁한 세포 등을 피펫 등으로 배양 용기 내에 첨가하고, 필요에 따라서 해당 배양 용기를 요동시켜 배양 용기 내에 세포를 균등하게 분산시킨 후, 인큐베이터 내에서 정치한다.
세포 등을 파종하는 밀도는, 세포 등이 증식 및 분화할 수 있으면 특별히 제한되지 않는다. 세포 등이 미분화의 다능성 줄기세포, 또는 다능성 줄기세포 유래의 분화 세포인 경우, 파종하는 밀도는, 바람직하게는 0.1×105cells/cm2∼10.0×105cells/cm2이고, 보다 바람직하게는 0.3×105cells/cm2∼5.0×105cells/cm2이며, 더 바람직하게는 0.5×105cells/cm2∼3.0×105cells/cm2이다.
세포 파종 밀도가 상기의 범위이면, 상기 범위 외의 경우와 비교하여, 세포의 증식 및 분화가 보다 효율 좋게 행해지기 때문에 바람직하다.
파종에 이용하는 배지는, 세포 등이 생존할 수 있는 배지이면 특별히 제한되지 않고, 사용하는 세포 등에 맞추어 적절히 선택하면 된다. 파종에 이용하는 배지는, 후술하는 공정(B)에서 이용하는 배지여도 된다.
세포 등이 미분화의 다능성 줄기세포, 또는 다능성 줄기세포 유래의 분화 세포인 경우, 파종에 이용하는 배지는, 예를 들어, 임의의 세포 배양 기본 배지나 분화 배지, 초대 배양 전용 배지 등 , 구체적으로는, Essential 8, StemFit 배지, ReproFF2 배지, Stem-PartnerSF, 이글 세소 필수 배지(EMEM), 덜베코 개변 이글 배지(DMEM), α-MEM, 글래스고 MEM(GMEM), IMDM, RPMI1640, 햄 F-12, MCDB 배지, 윌리엄스 배지 E 및 이들의 혼합 배지 등을 들 수 있다. 더욱이, 혈청, 각종 성장 인자, 분화 유도 인자, 항생 물질, 호르몬, 아미노산, 당, 염류, 미네랄, 금속, 비타민 등을 첨가한 배지를 사용해도 된다.
파종에 이용하는 배지의 양은 특별히 제한되지 않지만, 배양 용기에 첨가한 상태에서, 배지의 높이는 바람직하게는 3∼30mm, 보다 바람직하게는 3∼25mm, 더 바람직하게는 4∼20mm이다.
배양 온도도 특별히 제한되지 않지만, 통상은 25∼40℃ 정도에서 행한다.
[공정(B)]
배양면에 접촉한 세포 등을 배양하여 스페로이드를 형성시키는 방법은, 배양면에 접촉한 세포 등에 산소, 영양 등을 공급하여, 세포 등을 배양하여 스페로이드를 형성할 수 있으면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 배지를 첨가한 배양 기구를 넣은 배양 인큐베이터에 산소를 공급하고, 배양 부재를 개재시켜 세포 등에 산소를 공급하여, 일정 기간 37℃로 유지하는 것을 들 수 있다.
세포 배양에 이용하는 배지는, 세포에 맞추어 적절히 선택하면 된다. 배지의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 임의의 세포 배양 기본 배지나 분화 배지, 초대 배양 전용 배지 등을 이용할 수 있다. 구체적으로는, Essential 8, 이글 세소 필수 배지(EMEM), 덜베코 개변 이글 배지(DMEM), α-MEM, 글래스고 MEM(GMEM), IMDM, RPMI1640, 햄 F-12, MCDB 배지, 윌리엄스 배지 E, Hepatocyte thaw medium, 및 이들의 혼합 배지 등을 들 수 있지만, 이들에는 한정되지 않고, 세포의 증식이나 분화에 필요한 성분이 포함되는 배지이면 이용할 수 있다. 더욱이, 혈청, 각종 성장 인자, 분화 유도 인자, 항생 물질, 호르몬, 아미노산, 당, 염류 등을 첨가한 배지를 사용해도 된다. 배양 온도도 특별히 제한되지 않지만, 통상은 25∼40℃ 정도에서 행한다.
배지의 양은 특별히 제한되지 않지만, 배지의 높이는 바람직하게는 3∼30mm, 보다 바람직하게는 3∼25mm, 더 바람직하게는 4∼20mm이다.
배양 기간은, 세포 및 형성시키고 싶은 스페로이드의 종류, 크기, 분화의 정도 등에 맞추어 적절히 선택하면 된다. iPS 세포 유래의 심근 세포를 포함하는 스페로이드를 형성시키는 경우, 배양 기간은 바람직하게는 7∼30일, 보다 바람직하게는 10∼25일, 바람직하게는 11∼20일이다.
[공정(C)]
본 발명의 세포 등의 배양 방법은, 추가로, 상기 세포 등의 분화를 유도하는 공정(C)를 포함해도 된다.
상기 세포 등의 분화를 유도하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 공지된 프로토콜에 따라 소망의 목적으로 하는 분화 세포에의 분화 유도를 행하면 되고, 시판되는 분화 유도 배지나 분화 키트를 이용해도 된다.
분화 유도의 조건은, 특별히 제한되지 않고, 사용 세포종 및 목적으로 하는 분화 세포종 등에 따라서 적절히 설정할 수 있다. 통상, 소정의 사이토카인, 증식 인자 또는 그 외의 화합물을 배양액 중에 소정 농도 첨가하고 배양을 행하는 것에 의해 분화를 유도할 수 있다.
본 발명의 세포 등의 배양 방법이 공정(C)를 포함하는 경우, 상기 세포 등은, 바람직하게는 미분화의 다능성 줄기세포, 다능성 줄기세포 유래의 분화 세포(분화 유도를 개시하여, 이미 분화의 과정에 있는 다능성 줄기세포를 포함한다), 미분화의 체성 줄기세포, 체성 줄기세포 유래의 분화 세포(분화 유도를 개시하여, 이미 분화의 과정에 있는 체성 줄기세포를 포함한다)이며, 보다 바람직하게는, 미분화의 다능성 줄기세포, 또는 다능성 줄기세포 유래의 분화 세포, 더 바람직하게는, 미분화의 iPS 세포, 또는 iPS 세포 유래의 분화 세포이다.
상기 목적으로 하는 분화 세포는, 특별히 제한되지 않고, 어떤 분화 세포여도 된다. 상기 목적으로 하는 분화 세포는, 각종 전구 세포를 포함하고, 예를 들어, 지방 세포, 간 세포, 신장 세포, 췌장 세포, 유선 세포, 내피 세포, 상피 세포, 평활근 세포, 근아세포, 심근 세포, 신경세포, 글리아 세포, 수상 세포, 연골 세포, 골아세포, 파골 세포, 골 세포, 섬유아세포, 각종 혈액계 세포, 망막 세포, 각막 유래 세포, 생식선 유래 세포, 각종 선 세포 등이다.
상기 목적으로 하는 분화 세포는, 바람직하게는 스페로이드를 형성하는 세포이며, 보다 바람직하게는 산소 요구성이 높은 세포이다. 상기 목적으로 하는 분화 세포는, 바람직하게는 간 세포, 신경 세포, 심근 세포, 췌β 세포, 혈관 내피 세포, 지방 세포, 지방 유래 줄기세포, 연골 세포, 간엽계 줄기세포, 모낭 상피 줄기세포, 모유두 세포, 피부 섬유아세포, 피부 각화 세포, 골아세포, 및 조혈 전구 세포 등이고, 보다 바람직하게는 심근 세포, 신경 세포, 간 세포이며, 더 바람직하게는 심근 세포이다.
공정(C)는, 바람직하게는, 다능성 줄기세포의 심근 세포에의 분화를 유도하는 공정이며, 보다 바람직하게는, iPS 세포의 심근 세포에의 분화를 유도하는 공정이다.
다능성 줄기세포의 심근 세포에의 분화를 유도하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 다능성 줄기세포로부터 심근 세포에의 분화를 유도하는 방법으로서는, 다양한 수법이 알려져 있고(예를 들어, Burridge et al., Cell Stem Cell. 2012 Jan 6;10(1):16-28; Kattman et al., Cell Stem Cell 2011; 8: 228-240; Zhang et al., Circ Res 2012; 111: 1125-1136; Lian et al., Nat Protoc 2013; 8: 162-175; WO 2016/076368; WO 2013/111875; Minami et al., Cell Rep. 2012, 2(5): 1448-1460 등), 예를 들어, 배양체 형성에 의한 방법, 단층 분화 배양에 의한 방법, 강제 응집에 의한 방법 등을 들 수 있다. 어느 방법에 있어서도, 중배엽 유도 인자(예를 들어, 액티빈 A, BMP4, bFGF, VEGF, SCF 등), 심장 결정 인자(예를 들어, VEGF, DKK1, Wnt 시그널 저해제(예를 들어, IWR-1, IWP-2, IWP-4 등), BMP 시그널 저해제(예를 들어, NOGGIN 등), TGFβ/액티빈/NODAL 시그널 저해제(예를 들어, SB431542 등), 레티노산 시그널 저해제 등), 심장 분화 인자(예를 들어, VEGF, bFGF, DKK1 등) 등을, 순차적으로 작용시키는 것에 의해 유도 효율을 높일 수 있다.
iPS 세포의 심근 세포에의 분화를 유도하는 방법은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 공지된 프로틴 프리 심근 분화 유도(PFCD)법을 이용할 수 있다(국제 공개 제2015/182765호를 참조). 프로틴 프리 심근 분화 유도(PFCD)법은, 높은 심근 분화 효율을 달성할 수 있기 때문에, 공정(C)는, 프로틴 프리 심근 분화 유도(PFCD)법에 의해, iPS 세포의 심근 세포에의 분화를 유도하는 공정인 것이 바람직하다.
공정(C)는, 공정(A) 후, 공정(B) 전에 행해도 되고, 공정(B)와 동시에 행해도 되고, 공정(B)를 행하는 기간의 일부의 기간에만 행해도 된다. 다능성 줄기세포의 분화 유도가 보다 효율 좋게 행해지므로, 공정(C)는 공정(B)와 동시에 행하는 것이 바람직하다.
공정(C)에 있어서의 분화 유도 기간은, 사용 세포종 및 목적으로 하는 분화 세포종, 분화의 정도, 분화 유도 방법 등에 따라서 적절히 설정할 수 있다. iPS 세포의 심근 세포에의 분화를 유도하는 경우, 분화 유도 기간은 바람직하게는 7∼30일, 보다 바람직하게는 10∼25일, 더 바람직하게는 11∼20일이다.
[배양 방법의 특성]
본 발명의 세포 등의 배양 방법은, 바람직하게는 iPS 세포 또는 iPS 세포 유래의 분화 세포의 배양 방법이며, 더 바람직하게는 iPS 세포 유래의 심근 세포의 배양 방법이다.
본 발명의 세포 등의 배양 방법은, 심근 순도를 증가시키는 것인 것이 바람직하다.
상기 증가란, 상기 배양 부재 또는 상기 배양 기구 대신에, 폴리스타이렌제의 배양 부재 또는 배양 기구를 이용하고, 그 이외의 조건은 본 발명의 세포 등의 배양 방법과 동일한 실험 조건하에 있어서 다능성 줄기세포를 심근 세포로 분화시켰을 때의 심근 순도를 비교 대조로 하여, 해당 비교 대상보다도 심근 순도가 높은 것을 말한다. 상기 비교 대상보다도 1.3배 이상 심근 순도가 높은 것이 바람직하고, 2배 이상 심근 순도가 높은 것이 보다 바람직하고, 3배 이상 심근 순도가 높은 것이 더 바람직하다.
상기 심근 순도는, 다능성 줄기세포에서 유래하는 분화 세포 총수에서 차지하는, 다능성 줄기세포로부터 분화한 심근 세포수의 비율(%)이다. 상기 심근 순도를 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 분화 유도의 소정의 기간 경과 후에, 세포 총수와 심근 세포 마커를 발현하는 세포수를 측정하여, 비율을 산출할 수 있다. 세포가 스페로이드를 형성하고 있는 경우는, 스페로이드를 공지된 방법에 의해 싱글 셀화하여, 스페로이드를 구성하는 전체 세포수를 세포 총수로 할 수 있다.
세포수의 계측에는, 예를 들어, 혈구 계산판, FACS 등을 이용할 수 있다.
상기 심근 세포 마커는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 심근 트로포닌 C(cTnC), 심근 트로포닌 I(cTnI), 심근 트로포닌 T(cTnT), 미오신 경쇄, αActinin, NKX2.5, KCNQ1, HERG1b, Cav1.2, Nav1.5 등을 들 수 있다. 상기 심근 세포 마커는, 바람직하게는 심근 트로포닌 T(cTnT)이다.
심근 세포 마커를 발현하는 세포수의 측정은, 예를 들어, 심근 세포 마커에 대한 항체를 이용하여 FACS로 행할 수 있다.
상기 심근 순도는, 바람직하게는, cTnT 양성 세포수/스페로이드를 구성하는 전체 세포수×100으로 산출할 수 있다.
본 발명의 세포 등의 배양 방법은, 심근 세포의 MYL2(Myosin regulatory light chain 2) 유전자의 발현을 증가시키는 것인 것이 바람직하다.
상기 증가란, 상기 배양 부재 또는 상기 배양 기구 대신에, 폴리스타이렌제의 배양 부재 또는 배양 기구를 이용하고, 그 이외의 조건은 본 발명의 세포 등의 배양 방법과 동일한 실험 조건하에 있어서 다능성 줄기세포의 심근 세포로 분화시켰을 때의 심근 세포의 MYL2 유전자의 발현량을 비교 대조로 하여, 해당 비교 대상보다도 MYL2 유전자의 발현량이 많은 것을 말한다. 상기 비교 대상보다도 2배 이상 MYL2 유전자의 발현량이 많은 것이 바람직하고, 3배 이상 MYL2 유전자의 발현량이 많은 것이 보다 바람직하다.
MYL2 유전자의 발현량은, 공지된 방법으로 측정할 수 있고, 예를 들어 정량 RT-PCR법을 들 수 있다.
본 발명의 세포 등의 배양 방법은, 심근 세포의 박동수를 증가시키는 것인 것이 바람직하다.
상기 증가란, 상기 배양 부재 또는 상기 배양 기구 대신에, 폴리스타이렌제의 배양 부재 또는 배양 기구를 이용하고, 그 이외의 조건은 본 발명의 세포 등의 배양 방법과 동일한 실험 조건하에 있어서 다능성 줄기세포의 심근 세포로 분화시켰을 때의 심근 세포의 박동수를 비교 대조로 하여, 해당 비교 대상보다도 박동수가 높은 것을 말한다. 상기 비교 대상보다도 2배 이상 심근 세포의 박동수가 높은 것이 바람직하고, 3배 이상 심근 세포의 박동수가 높은 것이 보다 바람직하다.
심근 세포의 박동수는, 공지된 방법으로 측정할 수 있고, 예를 들어, 심근 세포의 동영상을 촬영하여, 임의의 심근 세포의 BPM(1분간에 있어서의 박동수)을 측정할 수 있다.
［스페로이드］
상기 배양 방법에 의해, 본 발명의 스페로이드가 형성된다.
본 발명의 스페로이드는, 배양 시에 세포 내부에까지 산소 공급이 행해지기 때문에, 크기 및 형상의 균일성이 높은 경향이 있는 것이 특징이다. 또한, 본 발명의 스페로이드에 포함되는 세포는, 정상적인 기능을 보유하고 있고, 그 세포 순도도 높기 때문에, 스페로이드를 각종 검사에 이용했을 경우의 데이터의 신뢰성이 높아지고, 또한, 재현성도 높아지기 쉽다.
본 발명의 스페로이드는, 세포의 기능 평가 및 약제의 스크리닝, 더욱이, 재생 의료나 세포 치료의 세포 소스로서 호적하게 이용할 수 있다.
실시예
다음에 본 발명에 대해 실시예를 나타내어 더 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
［중량 평균 분자량(Mw) 및 분자량 분포(Mw/Mn)의 측정］
실시예에 이용한 4-메틸-1-펜텐 중합체의 중량 평균 분자량 Mw, 및, 분자량 분포(Mw/Mn)를 겔 퍼미에이션 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정했다.
구체적으로는, 하기의 조건에서, 오쏘다이클로로벤젠에 용해한 폴리머의 중량 평균 분자량(Mw) 및 수 평균 분자량(Mn)을, 표준 폴리스타이렌에 의해 분자량을 교정하여 측정했다.
· 장치: 겔 침투 크로마토그래프 HLC-8321 GPC/HT형(도소사제)
· 데이터 해석 소프트웨어: Empower3(Waters사제)
· 검출기: 시차 굴절계
· 직렬 연결 칼럼: TSKgel GMH6-HT(2개), 및, TSKgel GMH6-HTL(2개)
· 칼럼 온도: 140℃
· 유량: 1.0ml/분
· 시료 농도: 1.5mg/ml
［늘어짐(sagging) 거리의 측정］
제조예의 필름 또는 비교예의 배양 용기로부터, 세로×가로가 100mm×10mm인 사이즈로 시험편을 절출하여, 해당 시험편의 세로 치수에 대해서 50mm만큼 시험대의 수평한 상면으로부터 수평 방향으로 비어져 나온 상태에서 시험대에 고정하고, 고정으로부터 3분 후에, 시험대로부터 비어져 나온 시험편의 선단이 시험대의 상면을 포함하는 수평면으로부터 연직 하방으로 늘어진 거리를 측정했다. 상기 고정부터 측정까지는 실온 23℃였다. 결과를 표 1에 나타낸다.
［휨의 유무］
분화 유도 19일째에 인큐베이터로부터 배양 용기를 꺼내고, 용기 저면을 횡방향으로부터 들여다 봐서, 배양 환경에 있어서의 필름의 늘어짐의 유무를 관찰했다. 용기 제작 시와 비교하여 변화가 없고, 필름의 늘어짐이 보이지 않는 경우를 「휨 없음」이라고 하고, 배양 용기 제작 시와 비교하여 변화가 있고, 필름의 늘어짐이 보이는 경우를 「휨 있음」이라고 평가했다.
［수접촉각의 측정］
수접촉각의 측정은, 일본공업규격 JIS-R3257(기판 유리 표면의 젖음성 시험 방법)에 준하여 행했다. 25±5℃, 50±10%의 항온항습 조건하에서 수적의 형상을 구형으로 간주할 수 있는 4μL 이하의 용량의 수적을, 측정 샘플의 표면에 적하하고, 정적법에 의해, 측정 샘플 표면에 수적이 접촉한 직후부터 1분 이내의 측정 샘플과 수적의 접촉 계면의 각도를 측정했다.
［산소 투과도의 측정］
측정 샘플에 대해, 도요 세이키 제작소제 차압식 가스 투과율 측정 장치 MT-C3을 이용하여 온도 23℃, 습도 0%의 환경하에서 산소 투과 계수를 측정했다. 측정부 지름은 70mm(투과 면적은 38.46cm2)로 했다. 산소 투과 계수가 클 것이 예상되었기 때문에, 미리 샘플에 알루미늄 마스크를 씌워, 실투과 면적을 5.0cm2로 했다.
측정한 산소 투과 계수［cm3×mm/(m2×24h×atm)］의 값을 필름(배양 부재)의 두께(μm)로 나누어, 산소 투과도［cm3/(m2×24h×atm)］를 산출했다.
［제조예 1］ 배양 부재의 제조
4-메틸-1-펜텐 중합체인 TPX(등록상표)(미쓰이 화학 주식회사제: 분자량(Mw)=428000, 분자량 분포(Mw/Mn)=4.1)를 사용하여, 기재층을 압출하는 풀플라이트형의 스크루를 구비한 T 다이 부가 압출기에 투입하고, 압출 온도를 270℃, 롤 온도를 60℃로 설정하고, 롤 회전 속도의 조건을 바꾸어 압출 성형함으로써, 두께 50μm의 필름을 얻었다. 얻어진 상기 필름에 대해, 수접촉각 및 산소 투과도를 측정했다. 결과를 표 1에 나타낸다.
［제조예 2］ 배양 용기의 제작
상기 필름을 8cm×12cm 사이즈로 커팅하고, 폴리스타이렌(PS라고도 칭한다)제 24웰 용기 프레임의 저면에, 의료용 점착제(스리엠제)를 개재시켜 밀착시켜 24웰의 배양 플레이트를 제작했다. 그 후, 내감마선 백에 포장하고 10kGy의 감마선을 조사하여 멸균했다.
［실시예 1］ iPS 세포로부터 심근 세포에의 분화 유도
제조예 2에서 제작한 배양 용기를 이용하여, 후술하는 방법에 의해 iPS 세포로부터 심근 세포에의 분화를 유도하여, 스페로이드를 형성시켰다. 배지는 배지 높이가 5mm가 되도록 이용했다(배지량: 1mL).
［실시예 2］
실시예 1보다도 배지의 양을 늘려, 배지 높이를 10mm로 한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 하여 배양을 행했다(배지량: 1.8mL).
［비교예 1］
배양면의 두께가 1000μm인 초저(超低) 접착면 PS제 배양 용기(코닝사제, CostarTM3473, 1웰의 배양면의 내경이 15mm, 24웰 플레이트)를 사용한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 배양했다. 해당 초저 접착면 PS제 배양 용기는, 시판되는 PS제 배양 용기(수접촉각 61°)를 친수화 처리한 것이다. 수접촉각을 측정한 결과를 표 1에 나타낸다.
［비교예 2］
비교예 1보다도 배지의 양을 늘려, 배지 높이를 10mm로 한 것 이외에는, 비교예 1과 마찬가지로 하여 배양을 행했다.
［iPS 세포 배양］
＜배지 및 시약의 조제＞
액체 질소 중에서 동결 보존한 인간 유래 iPS 세포(iPS 세포 연구소 제공)를 이용했다.
사용 시약은 이하와 같다.
· Essential 8(제품 번호 A1517001, Gibco)
· iMatrix-511 silk(제품 번호 387-10131, Nippi)
· CultureSureTM Y-27632(제품 번호 034-24024, 후지필름 와코 준야쿠)
· 0.5mol/L-EDTA 용액(pH 8.0)(제품 번호 06894-85, 나카라이 테스크)
· PBS(-)(제품 번호 166-23555, 후지필름 와코 준야쿠)
· 2.5% Trypsin(제품 번호 15090-046, Gibco)
· Trypan blue(제품 번호 145-0022, Bio-Rad)
· 폼알데하이드 용액(제품 번호 064-00406, 후지필름 와코 준야쿠)
· anti-Troponin T-C(CT3)(제품 번호 SC-20025, Santacruz)
· anti-Mouse IgG(H＋L) Alexa Fluor 647(제품 번호 A-21236, Thermo Fisher)
· Saponin from Soybeans(제품 번호 192-08851, 후지필름 와코 준야쿠)
· 심근 분화 유도 배지(저분자 화합물군 A, 저분자 화합물군 B): 국제 공개 공보 2015/182765호 공보 단락［0064］ 및 ［0065］의 기재에 따른다.
배지 및 시약의 조제는 이하와 같이 행했다.
· iPS 세포 배지: Essential 8은 사용 시에 실온으로 하고 나서 사용했다. 해동 시와 계대 시에 사용하는 배지는 CultureSureTM Y-27632를 3μM이 되도록 첨가하여 사용했다.
· 심근 분화 유도 배지: 사용 시에 심근 분화 유도 배지에 저분자 화합물군 A 또는 저분자 화합물군 B를 혼합하고, 37℃로 가온하고 나서 사용했다.
· 박리액: 0.5mol/L-EDTA 용액(pH 8.0)을 PBS(-)로 0.5mm로 조정했다. 사용 시에는 37℃로 가온하고 나서 사용했다.
· Y-27632 용액: PBS(-)로 10mm로 조정했다.
· 싱글화 용액: 2.5% Trypsin을 PBS(-)로 0.25%로 조정했다. 사용 시에는 37℃로 가온하고 나서 사용했다.
· 사포닌 용액: Saponin from Soybeans를 PBS(-)로 0.1% 용액으로 조정했다.
· 보존 조건: Y-27632 용액, 싱글화 용액, 그 외 심근 세포 배양에 필요한 시약은 냉동 보존하고, 배지 및 박리액은 냉장 보존했다.
＜배양 스케줄＞
세포 배양은 하기의 스케줄로 행했다. iPS 세포는 기면(起眠)으로부터 5계대한 세포를 분화 유도에 제공했다. 샘플링은 심근 세포의 박동이 전체적으로 확인되는 12일째와, 보다 성숙화시킨 19일째에서 행했다.
Day-1: 시약 조제 및 준비
Day0: iPS 세포 기면
Day3∼: iPS 세포의 계대(day3, 6, 10, 15, 19 합계 5계대)
Day23: iPS 세포의 심근 분화 유도 개시(0일째)
Day45: 심근 분화 유도 12일째의 샘플링 및 싱글 셀화(FACS, 유전자 발현 해석)
Day39: 심근 분화 유도 19일째의 샘플링 및 싱글 셀화(FACS, 유전자 발현 해석)
＜iPS 세포 배양 방법＞
iPS 세포의 해동
1) iPS 세포의 해동 전에, 튜브에 배지를 10mL 넣고 37℃ 워터 배스로 가온했다.
2) 동결 iPS 세포 튜브는 37℃ 워터 배스에서 반용해 상태로 하고, 클린 벤치 내에서 가온해 둔 배지 10mL가 들어간 튜브에 서서히 옮겼다.
3) 100×g로 실온, 3분간의 원심 후, 상청을 제거했다.
4) 새로운 배지 10mL를 가하여 가볍게 혼화하고, 0.13μg/cm2의 iMatrix-511 silk를 세포 현탁액에 첨가 후, 10cm dish에 파종하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양했다.
iPS 세포의 계대
1) 위상차 현미경으로 세포 상태를 관찰하여, 1:12-1:20의 사이에서 계대의 스플릿비를 결정했다.
2) 배지 상청을 튜브에 회수했다. PBS(-)로 세정 후, 박리액을 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 약 5분간 반응시켰다.
3) 반응 후, 디시를 기울여 세포를 벗기고, 회수해 둔 상청을 사용하여 세포를 튜브에 회수했다.
4) 100×g로 실온, 3분간의 원심 후, 상청을 제거했다.
5) 새로운 배지 10mL를 가하여 가볍게 혼화하고, 0.13μg/cm2의 iMatrix-511 silk를 세포 현탁액에 첨가 후, 10cm dish에 파종하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양했다.
＜심근 분화 유도 방법＞
실험 스케줄의 개략을 도 1에 나타낸다. 프로틴 프리 심근 분화 유도(PFCD)법에 의해, iPS 세포의 심근 세포로의 분화를 유도했다.
0일째: 약 50% 컨플루언트의 iPS 세포를 박리액으로 벗긴 후, 100×g로 실온, 3분간 원심했다. 상청 제거 후에 새로운 배지에서 현탁하고, 미처리의 55cm2 dish에 파종하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 정치했다. 그 후, 세포를 튜브에 회수하고, 저분자 화합물군 A를 첨가한 심근 분화 유도 배지로 치환했다. 실시예 또는 비교예의 24웰 플레이트에 2×105cells/웰로 세포를 파종하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양했다. 실험은 triplicate로 행했다.
3일째: 배지를 저분자 화합물군 B가 들어간 심근 분화 유도 배지로 교환했다.
5일째: 배지를 저분자 화합물군 B가 들어간 심근 분화 유도 배지로 교환했다.
7일째 이후: 3∼4일마다 심근 분화 유도 배지로 배지 교환을 행했다. 한편, 분화 유도 3일째, 7일째의 배지 교환 시에 웰을 교환했다.
＜세포괴의 싱글 셀화(분화 유도 12일째와 19일째의 샘플링)＞
1) 세포괴(심근괴라고 생각된다)를 튜브에 회수하고, 세포괴가 자연 침강되면 상청을 제거했다.
2) 싱글화 용액을 1mL 첨가하고, 37℃ 워터 배스로 30분 전후 가온하고, 세포괴가 싱글 셀이 될 때까지 교반했다.
3) 3배량의 PBS(-) 3mL로 희석하여 반응을 정지했다.
4) 세포 현탁액의 셀 카운트를 행하고, 후술하는 FACS, 또는 RNA 추출에 이용했다.
＜FACS 샘플의 조제＞
싱글화한 세포 1×106cells를 튜브에 옮기고, 300×g로 실온에서 5분간의 원심 후에 상청을 제거하고 PBS(-) 1mL로 재현탁했다. 세포 현탁액에 폼알데하이드(후지필름 와코 준야쿠)를 종농도 4%가 되도록 가하고 실온에서 5분간 정치했다. 300×g로 실온에서 3분간 원심하고, 상청을 제거 후, 사포닌 용액을 1mL 가하여 현탁하고, 2개의 튜브에 각각 0.7mL(샘플)와 0.3mL(네거티브 컨트롤)씩 분주했다. 재차 원심하고 상청을 제거한 후, 샘플에는 1차 항체로서 anti-Troponin T-C(CT3) 항체를 1:1000으로 첨가한 사포닌 용액 0.5mL를 첨가했다. 네거티브 컨트롤에는 항체를 첨가하고 있지 않은 사포닌 용액 0.5mL를 가하여 세포를 현탁하고, 4℃에서 하룻밤 항체를 반응시켰다. 다음날, 1차 항체를 제거하고, 2차 항체 anti-Mouse IgG(H＋L) Alexa Fluor 647을 1:500으로 첨가한 사포닌 용액 0.5mL를 가하고 차광하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 1시간 후, 2차 항체를 첨가한 사포닌 용액을, PBS(-) 0.5mL로 치환하고, FACS(AccuriTM CS6 Plus(BD사제))로 해석을 행했다.
＜RNA 추출과 RT-qPCR＞
Troponin(심근 세포 특이적 유전자), MYL2(심근 세포의 하나인 심실근 특이적 유전자), MYL7(심근 세포의 하나인 심방근 특이적 유전자)을 해석 대상으로 했다.
(1) 시약 및 기기 RNA 추출: miRNeasy Mini Kit(품번호 217004, 키아겐사제)
cDNA 합성: ReverTra Ace(R) qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(제품 번호 FSQ-301, TOYOBO사제)
qPCR 반응: PowerUp SYBR Green Master Mix(제품 번호 A25776, Thermo Fisher사제)
QuantStudio 6 Flex Real-time PCR system(Thermo Fisher사제)
Nanophotometer 분광 광도계 C40(와켄비테크 주식회사제)
(2) RNA 추출
심근 세포에의 분화 유도 12일째와 19일째의 배양 상청을 제거한 후, QIAZOL(키아겐사제) 0.5mL를 첨가하고, 현탁하여 세포를 용해하고, 용해물을 1.5ml 튜브에 회수했다. 이후는 miRNeasy Mini Kit에 첨부된 프로토콜에 따라 RNA를 추출하고, Nanophotometer C40으로 RNA 농도를 측정했다.
(3) RT-qPCR
상기에서 추출한 RNA 1μg을 이용하여, PowerUp SYBR Green Master Mix에 첨부된 프로토콜에 따라 역전사 반응을 행하여 cDNA의 합성을 행했다. 그 후, 6ng의 cDNA를 이용하여 스탠다드법으로 qPCR 반응을 행했다. 검량선은 10ng/L의 각 cDNA 샘플을 10μL씩 모으고, 거기로부터 1/10 희석하여 5점 제작했다.
＜심근 특이적 유전자 발현의 평가＞
분화 유도 12일째와 19일째의 세포로부터 추출한 RNA를 이용하여, QuantStudio 6 Flex Real-time PCR system으로 유전자 발현량의 해석을 행했다. 사용한 프라이머의 서열을 표 2, PCR 조건을 표 3에 나타낸다. 유전자 발현량은, 글리셀알데하이드-3-인산 데하이드로게나제(GAPDH)의 유전자 발현량을 1로 했을 경우의 상대치로 나타낸다. 결과를 표 4에 나타낸다.
＜세포수의 평가＞
분화 유도 12일째와 19일째의 세포괴를 싱글 셀화한 뒤, 트리판 블루 염색(Bio-Rad)에 의한 생 세포의 계측(TC20 전자동 셀 카운터, Bio-Rad를 사용)을 행했다.
상기에서 얻어진 측정치로부터, 세포 생존율(%)(측정 시의 생 세포수/측정 시의 전체 세포수×100) 및, 세포 증식률(%)(측정 시의 생 세포수/세포 파종(세포 배양 개시) 시의 세포수×100)을 산출했다. 결과를 표 4에 나타낸다.
＜심근 순도의 평가＞
분화 유도 12일째와 19일째의 세포괴를 싱글 셀화한 뒤, FACS에 의해, cTnT 양성률(cTnT 양성 세포수/세포괴를 구성하는 전체 세포수×100)을 산출하여, 심근 순도(%)로 했다. 결과를 표 4에 나타낸다.
＜박동수의 평가＞
분화 유도 19일째의 세포의 동영상을 촬영하여, 임의의 스페로이드의 BPM(1분간에 있어서의 박동수, 박/분)을 산출했다. 결과를 표 4에 나타낸다.
＜형태 관찰＞
위상차 현미경을 사용하여, 각각의 세포가 스페로이드를 형성하고 있는 양상을 관찰했다. 결과를 도 2, 3에 나타낸다.
＜결과＞
분화 유도 12일째에 있어서는, 실시예 1, 2는, 비교예 1, 2에 비해, 배양 저면의 산소 투과도가 높기 때문에, 세포 증식률이 높고, 특히 배지 높이 10mm의 경우에 높았다. 19일째에서도 마찬가지의 경향이 보였다. 또한, 실시예 1, 2는, 분화 유도 12일째, 19일째에 있어서, 비교예 1, 2보다도 심근 순도가 높았다. 더욱이, 심근 특이적 유전자 Troponin, MYL2, MYL7의 발현을 비교한 바, 어느 유전자도 비교예 1, 2에 비해 실시예 1, 2 쪽이 발현량이 많고, 특히 배지 높이 10mm의 경우에 많았다. 실시예 1, 2는, 분화 유도 19일째에 있어서, 비교예 1, 2보다도 박동수가 높고, 액 깊이는 5mm보다도 10mm 쪽이 박동수가 높았다. 또한, 형태 관찰의 결과, 실시예 1, 2에서는, 비교예 1, 2에 비해, 크기 및 형상이 균일한 복수의 스페로이드가 형성됨이 밝혀졌다. 또한, 실시예 1, 2에서는, 비교예 1, 2에 비해, iPS 세포가 심근 세포로 효율 좋게 분화함이 밝혀졌다.
［실시예 3］ 인간 골육종 유래 암 세포(HOF-143B)의 배양
제조예 2에서 제작한 배양 용기를 이용하여, 후술하는 방법에 의해 인간 골육종 유래 암 세포(HOF-143B)를 배양하여, 스페로이드를 형성시켰다.
［비교예 3］
배양면의 두께가 1000μm인 시판되는 TCPS 배양 용기(배양면의 내경이 16mm, 24웰 플레이트, 코닝사제, 폴리스타이렌(PS)제)를 사용한 것 이외에는, 실시예 3과 마찬가지 방법으로 배양했다.
［비교예 4］
고산소 투과 용기로서 배양 부재의 두께가 350μm인 시판되는 PDMS(폴리다이메틸실록세인)제 배양 용기(배양면의 내경이 15mm, 24웰 플레이트, 제품명 G-plate, VECELL사제, 형번 V24WGPB)를 사용한 것 이외에는, 실시예 3과 마찬가지 방법으로 배양했다.
［인간 골육종 유래 암 세포(HOF-143B)의 배양］
＜세포의 파종＞
인간 골육종 유래 암 세포를 포함하는 세포 현탁액을 넣은 원심관(50ml)에 배지를 가했다. 배지는, 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS, 후지필름 와코 준야쿠)을 5mL, 200mm의 L-글루타민 용액(후지필름 와코 준야쿠)을 0.5mL, 1.5mg/mL의 Bromo-deoxy Uridine(BUdR)을 0.05mL, Non Essential Amino Acid(후지필름 와코 준야쿠)를 0.5mL, E-MEM 배지(10mg/mL 페놀 레드, 2200mg/mL 탄산수소 나트륨 함유, 배양용, 후지필름 와코 준야쿠)를 43.95mL 가하여 조제했다. 세포 밀도의 조정은, 인간 골육종 유래 암 세포를 포함하는 세포 현탁액의 세포수를 조정하는 방법으로 실시하여, 세포 현탁액 0.5mL/웰로 파종하면 세포 밀도가 1.0×104cells/cm2가 되도록 세포 현탁액을 조제했다.
＜세포의 배양＞
인간 골육종 유래 암 세포를 포함하는 세포 현탁액을 배양면에 마이크로피펫으로 파종하고, 인큐베이터에 반입하여, 37℃, 5% CO2하에서 배양을 개시했다. 배양은 7일간 행했다. 세포 파종으로부터 3일째와 6일째에, 배지의 교환을 행했다. 배지의 교환은, 배양 용기를 정치하고, 스페로이드가 충분히 침강된 상태에서 상청을 제거하고, 제거한 분량의 배지를 추가하는 것에 의해 실시했다.
＜형태 관찰 및 평가＞
배양 7일째에 위상차 현미경을 이용하여 세포의 형태를 관찰하고, 이하의 기준으로 평가했다.
A: 스페로이드를 형성하고 있다
B: 세포가 접착되어, 스페로이드를 형성하지 않는다
실시예 3을 관찰한 결과를 도 4에 나타낸다. 또한, 평가 결과를 표 5에 나타낸다.
＜결과＞
비교예 3, 4에서는, 세포는 배양 용기에 접착되어, 스페로이드를 형성하지 않았지만, 실시예 3에서는, 세포가 스페로이드를 형성하고 있었다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 배양 부재를 이용하면, 정상적인 기능을 유지한 세포의 스페로이드가 형성됨이 밝혀졌다. 더욱이, 본 발명의 배양 부재를 이용하면, iPS 세포가 심근 세포로 효율 좋게 분화함이 밝혀졌다. 즉, 본 발명의 배양 부재는, 스페로이드를 형성시키기 쉽고, 또한, 다능성 줄기세포를 분화시키기 쉽다. 따라서, 본 발명의 배양 부재는 창약 스크리닝 용도나 진단 용도, 재생 의료 용도에도 호적하게 이용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
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<120> CULTURE MATERIAL AND USE THEREOF
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<223> GAPDH Rv
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<223> MYL7 Rv
<400> 6
aggaagacgg tgaagttgat gg 22
Claims (12)
- 세포, 조직, 또는 기관을 그 배양면 상에서 배양하는 배양 부재로서, 상기 배양 부재는 4-메틸-1-펜텐 중합체(X)를 포함하고, 상기 배양면의 수접촉각이 100°보다 크고 160° 이하이며, 온도 23℃, 습도 0%일 때의 산소 투과도가 4500∼90000cm3/(m2×24h×atm)인 배양 부재.
- 제 1 항에 있어서,
상기 4-메틸-1-펜텐 중합체(X)가, 4-메틸-1-펜텐과 에틸렌 및 탄소수 3∼20의 α-올레핀(4-메틸-1-펜텐을 제외한다)으로부터 선택되는 적어도 1종의 공중합체(x1)인, 배양 부재. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 배양면이, 요철 구조의 형성 가공이 실시되어 있지 않은, 배양 부재. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
스페로이드 형성용인, 배양 부재. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포, 조직, 또는 기관이, iPS 세포 유래의 분화 세포를 포함하는, 배양 부재. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포, 조직, 또는 기관이, 심근 세포를 포함하는, 배양 부재. - 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배양 부재의 형상이 필름상 또는 시트상인, 배양 부재. - 적어도 배양면이, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 배양 부재로 형성된, 배양 기구.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 배양 부재 또는 제 8 항에 기재된 배양 기구의 배양면에, 세포, 조직 또는 기관을 접촉시키는 공정(A); 및
상기 배양면에 접촉한 세포, 조직 또는 기관을 배양하여 스페로이드를 형성시키는 공정(B);를 포함하는 세포, 조직 또는 기관의 배양 방법. - 제 9 항에 있어서,
추가로, 상기 세포 등의 분화를 유도하는 공정(C)를 포함하고, 공정(C)가, 프로틴 프리 심근 분화 유도(PFCD)법에 의해, iPS 세포의 심근 세포에의 분화를 유도하는 공정인, 세포, 조직 또는 기관의 배양 방법. - 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
심근 순도를 증가시키는, 세포, 조직 또는 기관의 배양 방법. - 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 배양 방법에 의해 형성된 스페로이드.
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