KR20070075006A

KR20070075006A - 줄기세포로부터 배아체를 형성 및 성장시키는 방법 및 장치

Info

Publication number: KR20070075006A
Application number: KR1020060003249A
Authority: KR
Inventors: 김충; 강지윤; 이진우; 채수경; 이강선; 이인혜; 김태송
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2006-01-11
Filing date: 2006-01-11
Publication date: 2007-07-18
Also published as: KR100785049B1

Abstract

본 발명은 줄기세포 분화를 위한 것으로, 균일한 크기와 모양의 배아체(EB, embryoid body) 생성과 생성된 EB의 성장 및 그 후의 세포 분화를 할 수 있도록 하는 세포 배양 방법 및 장치에 관한 것이다.

본 세포 배양 장치는 1.0 내지 2.6mm의 작은 지름을 갖고 상하면이 열려진 원통형 용기 (cylinder)에서 EB (embryoid body)를 균일하고 빠르게 형성시키며, 형성된 배아체의 성장을 위한 배양 용기의 하부 바닥은 미세 다공막층(micro-pore layer)이 접합되어 있어서, 형성된 EB (embryoid body)는 밑바닥으로 통과되지 않는 반면 하부로부터의 배양액의 공급은 원활히 이루어지도록 하며 장시간 동안 세포배양을 할 수 있다. 본 발명을 이용하면 신속하고 정량적으로 배아체 형성 및 세포 분화를 진행 할 수 있다.

배아체, 배아체 형성층, 배양 용기층, 미세 다공막층, 줄기세포, 분화

Description

줄기세포로부터 배아체를 형성 및 성장시키는 방법 및 장치{Method and apparatus for forming and growing embryoid body}

도 1a 내지 도 1h은 본 발명에 의한 줄기세포 분화장치 및 각 구성요소를 나타낸 사시도 및 측면도이다.

도 2는 본 발명에 따른 줄기세포 분화방법을 개략적으로 나타낸 순서도이다.

도 3은 본 발명에 의한 줄기세포 분화방법 중 배아체 형성 단계를 나타낸 사시도이다.

도 4는 본 발명에 의한 줄기세포 분화방법 중 배아체 성장 단계를 나타낸 사시도이다.

도 5는 본 발명에 의한 줄기세포 분화장치 중 미세 다공막의 제조과정을 나타낸 개략도이다.

도 6a는 본 발명에 의한 줄기세포 분화방법에 따라 분화된 세포를 도 6b는 종래의 행잉 드롭 방식(hanging drop method)에 의해 분화된 세포를 촬영한 사진이다.

도 7a는 본 발명에 의한 줄기세포 분화방법에 따라 분화된 세포의 줄기세포 마커를 측정한 결과이다.

도 7b는 본 발명에 의한 줄기세포 분화방법에 따라 분화된 세포의 분화 정도 를 측정한 결과(Device)와 종래의 행잉 드롭 방식에 의해 분화된 세포의 분화정도를 측정한 결과(HD)를 비교하여 나타낸 것이다.

*도면의 주요부분에 대한 설명*

11: 배아체 형성층 12: 배양 용기층

13: 미세 다공막층 14: 바닥 지지층

21: 돌출부 22: 홈

23: 구멍

31: 원통형 용기 32: 보충 용기

33: 배양 용기 34: 반구 형태의 방울

35: 배아체(EB)

41: 피펫

본 발명은 효과적인 줄기세포 분화를 위한 것으로, 빠르고 균일한 EB (embryoid body) 생성, 생성된 EB (embryoid body)의 성장 및 세포 분화를 할 수 있는 세포 배양 방법 및 장치에 관한 것이다.

기존의 줄기세포 분화에 있어서, EB 형성을 위해 대부분 행잉 드롭 방식(Hanging drop method)를 사용한다. 이는 세포배양 접시의 두껑 안쪽 면에 세포를 포함한 배양액 방울을 떨어뜨린 후 뒤집어서 중력에 의해서 세포들이 물방울의 끝부분에 모이게 하여 세포와 세포 간 응집(aggregation)시켜 EB라 불리 우는 세포 덩어리 (cell mass)를 만든다. 하지만 이때 생성된 배양액 방울의 크기는 평균 지름이 3mm로 세포에 비해 너무 크고 물방울의 모양들이 균일하지 못하기 때문에 EB 가 형성되는데 걸리는 시간이 적어도 3일 정도가 소요되며 여러 개의 배양액 방울을 떨어뜨려 여러 개의 EB를 얻고자 할 때에도 각각의 EB가 형성되는데 각기 다른 시간들이 소요되며 또한 균일한 크기를 갖는 EB의 형성 또한 기대 할 수 없다. 또한 이러한 과정 중에 3일 이상의 시간 동안 EB를 형성 시키는데 그 동안에 배양액 방울을 교환하기가 용이하지 않기 때문에 시간이 흐름에 따라 배양액 상태가 세포가 배양되기에 좋지 않게 되므로 그 안의 세포들도 좋지 않은 영향을 받게 된다. 그리고, 통상 EB 형성 후 구 형태를 유지하면서 세포들이 디쉬 바닥에 붙지 않고 부유하면서 성장하도록 박테리아 디쉬 (bacteriological dish)에 EB를 넣고 줄기세포로부터 원하는 세포를 분화시키게 된다. 그러나 이것 역시 몇가지 문제점이 있다. EB의 크기(약 200 ~ 300 um)에 비해 너무 큰 디쉬에서 배양을 하게 되므로 필요 없는 많은 양의 세포 배양액의 소모를 가져온다. 그리고 넓은 디쉬 안의 여러 개의 EB 들은 분화를 위한 많은 신호들을 전달하고 받게 되는데 이와 같이 큰 디쉬 안에서는 생체 내 (in vivo)의 마이크로 환경(microenvironment)과 같이 분화에 관련한 신호전달이 과적으로 이루어 질 수 없게 되는 문제점이 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 기존의 행잉 드롭 방법을 수정하여 신속하고 균일하게 EB를 형성시키는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은, 형성된 EB를 세포들 간의 원활한 신호전달이 가능한 조건에서 성장시킴으로써 효율적으로 세포 분화를 수행하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 시간이 경과함에 따라 세포 배양액의 질이 떨어지는 것을 예방함으로써 세포가 보다 건강한 상태로 성장하도록 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, EB의 형성과 형성된 EB의 성장이 하나의 시스템 내에서 효율적으로 이루어지도록 하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 의한 줄기세포로부터 배아체를 형성시키는 방법은, 양 말단이 열려진 원통형 용기를 수직으로 세우고 그 원통형 용기 내에 줄기세포를 포함하는 배양액을 채움으로써 수직으로 세워진 원통형 용기의 끝에 배양액이 반구 형태를 유지하면서 표면장력에 의해 매달려 있도록 하고, 중력에 의해 원통형 용기의 끝에 매달린 반구 형태의 배양액 방울의 끝에 줄기세포들이 모이도록 하여 구 형태의 배아체(Embryoid Body, EB)를 형성하는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 줄기세포로부터 배아체를 형성시키는 방법에 있어서, 상기 원통형 용기의 지름이 1.0 내지 2.6mm인 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 줄기세포로부터 배아체를 형성시키는 방법에 있어서, 상기 원통형 용기는 둘 이상이고 모든 원통형 용기가 동일한 지름을 갖도록 조정하여 형성되는 배아체의 크기를 균일하게 하는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 줄기세포로부터 배아체를 형성시키는 방법에 있어서, 상기 원통형 용기는 둘 이상이고, 그 둘 이상의 원통형 용기가 다양한 지름을 갖도록 조정하여, 형성되는 배아체의 크기를 다양하게 하는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 줄기세포로부터 배아체를 형성시키는 방법에 있어서, 상기 원통형 용기에 배양액을 보충함으로써 상기 원통형 용기로부터 배양액이 증발되어 소실되는 것을 방지하고 세포 대사에 따른 배양액의 열화를 예방하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 줄기세포 분화방법은,

상기한 줄기세포로부터 배아체를 형성시키는 방법에 의해 배아체를 형성시키는 제1단계; 및

상기 제1단계에서 형성된 배아체를 상기 제1단계를 거쳐 배아체가 배양액 방울 끝에 형성된 상태인 원통형 용기를, 배아체 성장을 위한 배양액이 담긴 배양 용기 안으로 넣되, 상기 배양액 방울 끝이 상기 배아체 성장을 위한 배양액과 접촉하도록 하지만 상기 배양 용기 바닥과는 접촉하지 않는 높이로 넣음으로써, 상기 배아체가 배아체 성장을 위한 배양액과의 접촉에 의해 배아체 성장을 위한 배양액 내로 배아체를 떨어뜨리고 떨어진 배아체를 배양 용기 바닥에 부착시킨 상태에서 배아체를 성장시키는 제2단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 줄기세포 분화방법에 있어서, 상기 제2단계는 지름이 2.0 내지 4.0mm인 배양 용기 내에서 배아체를 성장시키는 것을 특징으로 한다.

한편, 본 발명에 의한, 줄기세포로부터 배아체를 형성시키는 장치는, 양 말단이 열려진 원통형 용기가 수직으로 다수개 설치되어 있어, 수직으로 세워진 원통형 용기의 끝에 배양액이 반구 형태를 유지하면서 표면장력에 의해 매달려 있도록 하고, 중력에 의해 원통형 용기의 끝에 매달린 반구 형태의 배양액 방울의 끝에 줄기세포들이 모이도록 하여 구 형태의 배아체(Embryoid Body, EB)를 형성하는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 배아체 형성장치에 있어서, 상기 원통형 용기는 지름이 1.0 내지 2.6mm의 범위에 속하는 것이 바람직하다.

상기한 본 발명에 의한 배아체 형성장치에 있어서, 상기 원통형 용기는 모두 동일한 지름을 갖거나, 다양한 지름을 가짐으로써 형성되는 배아체의 크기를 조절하는 것이 바람직하다.

상기한 본 발명에 의한 배아체 형성장치는, 상기 원통형 용기의 상부를 둘러싸는 용기로서 원통형 용기에 배양액을 보충 공급하는 보충 용기를 더 포함하는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명에 의한 줄기세포를 분화시키는 장치는, 상기한 배아체 형성장치를 포함하는 배아체 형성층을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 줄기세포 분화장치는, 상기 배아체 형성층 아래에 적층되며, 상기 배아체 형성층에서 형성된 배아체의 성장을 위한 배양 용기를 상기 원통형 용기와 동일한 개수로 포함하는 배양 용기 층으로서 상기 배양 용기는 상하 가 열려진 튜브 형태인 것을 특징으로 하는 배양 용기 층을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 줄기세포 분화장치는, 상기 배양 용기 층 아래에 적층되며, 상기 배양 용기와 접촉되는 미세 다공막으로 구성된 미세 다공막 층으로서, 상기 배아체 형성층에서 형성된 배아체를 부착시키고 하부로부터 배양액을 통과시키기 위한 것임을 특징으로 하는 미세 다공막 층을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 줄기세포 분화장치에 있어서, 상기 배양 용기 층의 배양 용기는 지름이 2.0 내지 4.0mm인 것이 바람직하다.

상기한 본 발명에 의한 줄기세포 분화장치에 있어서, 상기 배아체 형성층의 원통형 용기와 상기 배양 용기 층의 배양 용기가 서로 겹쳐지는 높이로 배치되도록 배아체 형성층과 배양 용기 층이 적층된 것이 바람직하다.

상기한 본 발명에 의한 줄기세포 분화장치는, 상기 미세 다공막 층 아래에 적층되며, 상기 배양 용기 층과 상기 미세 다공막 층을 결합시키며 상기 미세 다공막층을 보호하는 바닥 지지층을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 줄기세포 분화장치에 있어서, 상기 미세 다공막 층의 미세 다공막은 ECM 코팅됨으로써 배아체의 부착능이 개선된 것이 바람직하다.

이하에서, 본 발명에 의한 방법 및 장치에 대해 상세하게 살펴본다.

도 1a 내지 도 1g는 본 발명에 의한 줄기세포 분화 장치 및 각 구성요소를 나타낸 그림이다. 도 1a는 배아체 형성층(EB formation layer)(11), 도 1b는 배양 용기층(culture well layer)(12), 도 1c는 미세 다공막층(micro-hole membrane)(13), 도 1d는 바닥 지지층(bottom layer)(14)을 나타낸다. 도 1e에 따르면 본 발명에 의한 줄기세포 분화 장치는, 배아체 형성층(EB formation layer)(11), 배양 용기층(culture well layer)(12) 및 미세 다공막층(micro-hole membrane)(13)이 순서대로 적층되어 있으며, 선택적으로 미세 다공막층 하부에 바닥 지지층(bottom layer)(14)이 더 적층되도록 구성된다. 배아체 형성층(11)과 배양 용기층(12) 간의 접합을 위해서 배아체 형성층의 양끝 중앙에 있는 돌출부(21)가 배양 용기층(12)의 양끝 중앙에 있는 홈(22)에 삽입되어 고정된다. 배양 용기층(12), 미세 다공막층(13) 및 바닥 지지층(14)의 접합을 위해서는 각 층의 모서리에 존재하는 4개의 구멍(23)에 아크릴 나사를 넣어 고정시킨다.

도 1f는 배아체 형성층(11)의 사시도(내부 구조를 점선으로 표시)이다. 보충 용기(32)가 원통형 용기(31)의 상부 주위를 둘러싸고 있다. 양쪽 끝 중앙에는 배양 용기층과의 접합을 위한 돌출부(21)가 있다.

도1g는 배아체 형성층(12)의 측면도(내부 구조를 점선으로 표시)이다. 다수개의 원통형 용기(31)가 설치되어 있고, 그 상부 주위에 원통형 용기와 동일한 개수의 보충 용기(32)가 설치되어 있다. 또한, 원통형 용기(31)는 배양 용기층(12)의 배양 용기(33)와 겹쳐진 상태가 되도록 배아체 형성층(11)과 배양 용기층(12)이 적층되게 된다.

도 3에는 배아 형성층(11)이 더 상세하게 도시되어 있다. 도 3의 배아 형성 층에는 EB를 형성시키는 총 25개의 원통형 용기(31)가 설치되어 있고, 각 원통형 용기 상부를 보충 용기(32)가 둘러싸고 있다. 보충 용기(32)는 원통형 용기(31) 내의 배양액이 증발되는 것을 방지하고 배양액을 보충하는 역할을 한다. 보충 용기(32)는 맨 위의 지름이 3 내지 5mm, 바람직하게는 약 4 mm이고, 깊이가 1 내지 3 mm, 바람직하게는 약 2mm이다. 보충 용기(32)는 EB를 형성하는 원통형 용기로부터 배양액이 외부로 증발되는 것을 방지하며 EB 형성 실린더의 배양액 양이 매우 소량인 점에 기인하여 배양액의 상태가 나빠지는 것을 방지하기 위해 배양액을 보충하는 역할을 한다. 보충 용기(32)로부터 공급되는 배양액에 의해 EB를 EB 형성 원통형 용기(31) 내에서 장기간 동안 배양이 가능하게 된다. 배아 형성층(11)과 보충 용기(32)는 서로 일체의 형태일 수 있다.

도 1h는 원통형 용기(31)와 보충 용기(32)가 결합된 일예가 도시되어 있다. 배양액이 가득 찬 원통형 용기(31)에 더하여 배양 용기(32)에도 배양액을 채움으로써 원통형 용기(31)로부터 배양액이 증발되는 것을 방지하며 세포의 성장에 따라 배양액이 열화되는 것을 완화시켜 줄 수 있다.

EB 형성 원통형 용기(31)는 지름이 1.0 내지 2.6mm인 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 1.2 내지 2.0mm이다. 가장 바람직하게는 약 1.6 mm이다. 지름이 1.0mm 미만이면 원통형 용기 내에 배양액의 양이 적어져서 단시간 내에 증발해 버릴 우려가 있으며, 지름이 2.6mm를 초과하면 원통형 용기 끝에 매달리는 반구 형태의 방울 크기가 지나치게 커져서 EB 형성이 지연되는 문제가 발생한다. 한편, 원통형 용기의 높이는 대략 1 내지 3mm, 바람직하게는 약 2 mm이다. 높이가 1mm 미만이 면 적은양의 미디엄이 들어가 미디엄 증발을 초래하고, 높이가 3mm를 초과하면 용기안의 미디엄의 무게에 의해 방울이 벽면의 표면 장력을 이기고 무너질 문제점이 있으며 디바이스가 지나치게 높아진다. 위와 같은 크기를 갖는 원통형 용기에 줄기세포를 포함하는 배양액을 채움으로써 기존의 행잉 드롭 방식(hanging drop method)의 문제점, 즉 방울의 크기가 세포에 비해 너무 크고 생성되는 방울형태 역시 불규칙적이기 때문에 발생하는 균일하지 못한 문제점과, EB 형성 속도가 느린 문제점을 해결할 수 있다. 다시 말해, 약 지름 1.6 mm의 좁은 공간에 의해 세포들끼리 빠르게 응집할 수 있으며 장치 내의 모든 원통형 용기의 지름이 동일하므로 끝에 맺히는 방울 역시 모두 동일한 모양과 크기를 만들게 된다. 그렇기 때문에 모든 실린더 내에서 균일한 EB의 형성이 가능하게 된다.

배양 용기층(12), 미세 다공막층(13) 및 바닥 지지층(14)은 배아체 형성층(11)에서 형성된 EB를 부착시켜 배양하기 위한 장소이다. 배양 용기(33)는 지름이 2 내지 4mm인 것이 바람직하며 더 바람직하게는 약 3 mm이다. 지름이 2mm 미만이면 원통형 용기를 수용하기가 어렵고, 지름이 4mm를 초과하면 EB의 크기에 비해 지나치게 커지기 때문에 세포 간 신호전달이 원활하지 못하게 된다. 배양 용기(33)의 높이는 2 내지 3mm가 바람직하고 더 바람직하게는 2.5mm이다. 높이가 2mm 미만이면 배양 능력이 떨어지고 3mm를 초과하면 세포 간 신호전달이 원활하지 못하게 된다. 위와 같은 협소한 배양 용기(33) 내에서 각각의 EB들은 자신이 보내는 분화신호들을 원활히 받을 수 있다. 다른 EB에서 보낸 신호는 미세 다공막층(14)을 통해 받을 수 있다. 미세 다공막(micro-hole membrane)의 또 다른 역할은 형성된 EB는 통과시 키지 않으면서 하부로부터 상부로의 배양액의 이동은 원활하도록 하는 기능을 가지고 있다. 미세 다공막의 홀(hole)의 지름은 25 내지 35㎛인 것이 바람직하고 가장 바람직하게는 약 30㎛이다. 지름이 25㎛ 미만이면 미디엄 교환이 용이하지 않고 35㎛를 초과하면 지름이 너무 크기 때문에 EB가 부착하기에 용이하지 않기 때문이다. 홀(hole)과 홀간의 거리는 5 내지 15㎛가 바람직하고 가장 바람직하게는 약10㎛이다. 거리가 5㎛ 미만이면 너무 홀간의 거리가 좁아서 EB가 부착하기에 좋지 않으며 15㎛를 초과하면 위에서 언급했듯이 홀의 숫자가 줄어들어 미디엄 교환이 좋지 않아지기 때문이다. 미세 다공막은 윗면이 ECM (extracellular matrix)으로 코팅된 것이 바람직하다. 코팅을 통하여 세포부착 기능이 향상된다. 미세 다공막의 재료는 투명하며 ECM이 코팅하기에 용이한 것 중에서 선택된 것일 수 있다. 가장 바람직한 미세 다공막의 재료는 가공성이 좋으며 투명하며 코팅이 용이한 negative photoresist SU-8 (Microchem Inc)이다.

바닥 지지층(14)은 미세 다공막이 깨지지 않고 유지될 수 있도록 보호하는 역할을 한다.

이하에서는 본 발명에 의한 줄기세포 분화방법, 즉 EB 형성 방법 및 그 형성된 EB의 성장 방법에 관하여 상세히 설명하고자 한다. 본 발명에 의한 줄기세포 분화방법은 크게 EB 형성 단계와 EB 성장단계로 나눌 수 있다.

도 2는 세포 분화를 위한 전체 세포 배양 과정을 나타낸 것이다. 먼저 EB 형성 원통형 용기 안에 줄기세포가 포함된 배양액을 주입한다 [S21]. 그 후 평균 1일 내에 EB가 형성된다[S22]. 배양액이 담긴 일반 배양 접시에 본 발명에 의한 세포 분화 장치를 담근다[S23]. 배양 접시로부터 배양액이 미세 다공막층(13)을 통해 배양 용기(33) 내로 들어오고 들어온 배양액과의 접촉에 의해 원통형 용기(31) 끝에 매달린 배아체가 떨어져 미세 다공막층(13)에 부착되어 성장을 하게 된다[S24].

도 3은 EB 형성 단계를 나타낸다. 소형 피펫(41)을 사용하여 각각의 EB 형성 원통형 용기(31) 안에 줄기세포가 포함된 배양액을 주입하여 원통형 용기를 채운다. 원통형 용기(31) 맨 밑부분에 배양액은 표면장력에 의해 밑으로 떨어지지 않고 반구 형태를 유지하면서 매달려 있게 된다. 그리고 EB 형성 원통형 용기(31)의 배양액이 증발되지 않고 신선한 상태를 유지하게 하기 위해 보충 용기(32) 안에 배양액을 채운다. 퍼져있던 세포들은 중력에 의해 반구 형태의 방울(34) 끝으로 모이게 되고 1일안에 구 형태의 EB 가 생성(35)된다.

도 4는 EB 성장 단계를 나타낸다. 형성된 EB를 분화가 되기까지 성장시키기 위해 배양액이 담긴 일반 배양 접시에 도 1에 도시된 본 발명의 장치를 절반 정도 담근다. 그러면 배양 접시 안의 배양액이 미세 다공막층(13)을 통해 배양 용기(33)안으로 들어가게 되고 배양액은 EB가 형성된 곳까지 올라간다. 배양 용기(33)의 배양액이 EB 형성 원통형 용기에 매달린 EB(35)와 접촉하게 되면 순간적으로 EB는 배양 용기(33) 안으로 떨어지게 된다. 떨어진 EB 는 ECM이 코팅된 미세 다공막 위에 부착하여 성장하게 된다.

이하에서는, 본 발명의 일실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

1. 미세 다공막의 제조

먼저, 도 2에 도시된 미세 다공막(micro-hole membrane)의 제작과정에 따라 미세 다공막을 제조하였다. 먼저, 웨이퍼(wafer) 세척(cleaning)을 수행하였다(1). 4인치 소라라임 유리 웨이퍼(4인치의 원형 디스크 형태)를 D.W(탈이온수, 멸균수) 300 ml로 세척(cleaning) 하고 N₂ 블로우어(blower)로 1분동안 드라이시켰다. 그런 다음 SU-8 negative photoresist 코팅을 수행하였다(2). 100 um 두께의 SU-8 층을 만들기 위해 SU-8 100 시리즈(Microchem. Inc)를 glass wafer 위에 도포한 후 3000 rpm으로 회전코팅(spin coating)하였다. SU-8이 코팅된 웨이퍼를 65℃ 핫플레이트(hotplate)에서 10분 동안 굽고 95℃ 핫플레이트(hotplate)에서 30분 동안 구웠다. 그런 다음 자외선 노광 과정을 수행하였다(3). 리소그라피(lithography) 장비(MA6)를 이용하여 21.5초 동안 노광하여 패터닝(patterning)하였다. 그 후 SU-8 현상(development)과정을 수행하였다(4). SU-8 현상액(developer)(Microchem. Inc)이 담긴 그릇에 10분 동안 웨이퍼을 담그면 현상(development)이 마무리된다. 웨이퍼에 코팅된 SU-8을 미세 다공층(micro-pore layer)으로 사용하기 위해 웨이퍼로부터 분리해야 한다. 따라서, 그 다음에는 SU-8 층을 웨이퍼로부터 분리시키기 위한 과정을 수행하였다(5). 웨이퍼와 SU-8과의 부착력을 감소시켜 완벽하게 분리시키기 위해 D.W(탈이온수) 300 ml에 웨이퍼를 담그고 30초 동안 초음파를 가하였다. 그리고 IPA(2-propanol) 250 ml에 10초 동안 담근 후 얇고 투명한 SU-8 층을 웨이퍼 로부터 깨끗하게 분리할 수 있었다.

상기 제조된 미세 다공막의 홀의 지름은 30㎛이었고, 홀과 홀 간의 거리는 10㎛이었다.

2. 줄기세포 분화장치의 제조

위와 같이 하여 제조된 미세 다공막을 상기 도 1의 장치 제조에 이용하였다. EB 형성층(11), 배양 용기층(12), 미세 다공막층(13) 및 바닥 지지층(14)을 차례로 적층하여 도 1의 장치를 제조하였다. 본 장치의 전체 크기는 32 X 32 X 7.8 mm 이었다. 본 실시예에서 사용된 장치는 EB 형성층(11)의 EB 형성을 위한 원통형 용기(31)의 지름이 1.6mm, 높이가 2mm이었고, 보충 용기(32)의 지름은 4mm, 높이는 2mm이었다. 원통형 용기(31) 및 보충 용기(32)의 총 개수는 25개로 하였다. 한편, 배양 용기층(12)의 배양 용기(33)의 지름은 3mm, 높이는 2.5mm로 하였다.

3. 줄기세포의 분화 과정 수행

위와 같이 하여 제조된 줄기세포 분화장치를 이용하여, 실제로 줄기세포를 배양하였다.

C3H/He 마우스 균주로부터 유래한 마우스 배아 카시노마 세포주(mouse embryonal carcinoma cell line) 인 P19 EC cells(ATCC number CRL-1825)를 10% 태아 소 혈청(fetal bovine serum) (FBS, Gibco)이 포함된 Dulbeco's modified Eagl's medium (DMEM, Gibco)을(이하, EC medium) 이용하여 세포 배양 접시에서 배양하였다. 배양된 P19EC cell은 0.05% Trypsin-EDTA(sigma)를 1분간 처리하여 세포 배양 접시로부터 분리하였다. 상기 줄기세포 5000개를 7㎕의 EC medium에 등분하여 희석한 후, 세포가 포함된 배양액을 각 원통형 용기에 주입하였다. 24시간이 경과한 후 원통형 용기(31) 끝에 매달린 반구 방울 내에 > 약 0.2mm 정도의 배아체가 형성된 것을 확인 할 수 있었다.

이와 동시에 종래의 행잉 드롭 방식에 의해서도 상기 줄기세포 500개를 10㎕의 EC medium에 등분 하여 희석 한 후, 세포배양 접시의 뚜껑에 세포가 포함된 배양액 물방울을 떨어뜨렸다. 2일 내지 3일 후에 배아체가 형성된 것을 확인할 수 있었다.

상기에서 형성된 각 배아체를 각각 6일까지 더 배양하면서 배아체의 형태를 관찰하였다.

상기에서 줄기세포를 상기 본 발명에 의한 세포 분화장치에 주입하고 24시간 후 배아체가 형성되었을 때, 형성된 배아체는 그대로 1일 동안 부유 상태로 더 배양하였다. 그 후, 배양된 배아체가 포함된 본 발명에 의한 세포 분화장치를 8ml의 EC medium이 분주된 세포배양 접시에 담그고 5일 동안 더 배양하였다.

기존의 행잉 드롭 방식에서의 배아체를 세포배양접시의 뚜껑으로부터 피펫을 이용하여 분리한 후, 4ml의 EC medium이 분주되어있는 60℃ 박테리아 배양 접시에 담그었다. 분리된 배아체는 3일 동안 부유 상태로 더 배양하였다. 그 후 배양된 배아체는 8ml의 EC medium이 분주된 세포배양 접시로 옮겨져서 5일 동안 더 배양하였다.

4. 배아체 형태 관찰

위와 같이 배양된 각 세포를 6일간의 배양시간동안 매일 zoom stereo microscope에서 45배 확대하여 형태를 관찰하였다. 그 결과는 도 6a 및 도 6b에 나타나 있다.

도 6a는 본 발명에 의한 줄기세포 분화장치를 이용하여 형성된 배아체의 변화를 나타내며 도 6b는 종래의 행잉 드롭 방식에 의해 형성된 배아체의 변화를 나타낸다. 도 6a에 나타난 바와 같이 본 발명에 따라 줄기세포를 배양시킨 경우 1일이 지난 시점에서 배아체가 표면이 매끈하고 균일하며 밀도가 높은 원모양으로 형성되었음을 확인할 수 있었다. 이에 반해, 종래의 행잉 드롭 방식에 따라 줄기세포를 배양한 경우 무려 3일이 지나서야 겨우 배아체가 형성되었고 그나마 형성된 배아체도 표면이 울퉁불퉁하고 균일하지 못하고 밀도도 낮은 것을 확인할 수 있었다.

5. 줄기세포 마커의 변화 측정

위와 같이 본 발명에 따른 방법 및 장치에 따라 배양된 세포에 대해 줄기세 포 마커인 Oct3/4의 변화를 측정하였다. 그 결과는 도 7a에 나타나 있다. 도 7a를 보면, 시간이 지날수록 줄기세포 마커인 Oct3/4가 점점 희미해져 감을 알 수 있다. 이는 줄기세포에서 다른 세포로 분화가 이루어지고 있음을 의미하는 것이다.

6. 심근세포와 뉴런세포로의 분화 관찰

상기 본 발명에 의한 방법에 따라 배양된 세포와 종래의 행잉 드롭 방식에 의해 배양된 세포의 분화 양상을 확인하기 위해 RT-PCR을 실시하였다. 상기 실험 수행동안 얻어진 세포로부터 total RNA를 추출하기 위하여, 배양액을 완전히 제거한 세포에 250㎕의 Trizol reagent(invitrogen)을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 용해시킨 세포는 상온에서 5분 동안 방치 후, 50㎕의 클로로포름을 첨가, 보텍싱(vortexing)하고 상온에서 5분간 방치 시켰다. 상기의 시료를 12000g, 4도에서 원심분리 시킨 후, 상층액만 새 용기에 담고 동량의 250㎕의 이소프로판올을 첨가하고, 상온에서 5분동안 방치시켰다. 상기의 시료를 12000g, 상온에서 원심분리 시킨 후 상층액을 제거, 75% Ethanol을 첨가하고, 7500g, 상온에서 원심분리 시켰다. 상층액을 제거하여 완전히 말린 위의 시료는 정량의 DEPC 처리수에 녹여 사용했다. 상기의 시료에 DNA를 제거하기 위하여 RQ1 DNase(Promega) 1U을 처리, 반응 시켰다. DNase가 처리된 2.5㎍의 RNA는 RT system(Promega)에서 제공되는 oligo dT와 revese trascriptase를 통해 cDNA로 합성했다. 세포들의 분화 양상을 확인하기 위해, 상기의 합성된 2.5㎍의 cDNA는 PCR machine(BioRed)에서 줄기세포 특이적 프 라이머인 OCt3/4 (octamer-binding protein 4, 5'-GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTTTC-3', 5'-CTCGAACCACATCCTTCTCT-3'), 심근세포 특이적 프라이머인 Nkx2.5 (NK2 transcription factor related 5, 5'-AGCAACTTCGTGAACTTTG-3' , 5'-CCGGTCCTAGTGTGGA-3'), 뉴런세포 특이적 프라이머인 MAP2 (neuronal microtubule-associated protein 2, 5'-TCAGACTTCCACCGAGCAG-3', 5'-AGTGCTGTACCCTGCTTCC-3'), 세포 RNA양 정량을 위한 프라이머인 GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3', 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3')와 Taq polymerase(제넨메드)를 이용하여 95℃에서 5분 동안 전 변성(pre-denaturation)시키고, 95℃에서 30초, 57.8℃에서 30초, 72℃에서 40초의 조건으로 30 cycle을 증폭한 후, 72℃에서 5분 동안 마지막 증폭과정을 수행하였다. 증폭된 DNA는 1.5% 아가로오스에서 전기영동을 통해 확인하였다.

그 결과는 도 7b에 나타내었다. 도 7b에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 방법에 따라 배양된 세포(Device)가 1일째부터 줄기세포의 성향을 잃어가고 있음을 확인할 수 있었으며, 종래의 행잉 드롭 방식(HD)에 의해 배양된 세포에 비해 세포의 심장근으로의 분화는 3일째부터, 뉴런으로의 분화는 6일째부터 나타나는 것을 확인하였다. 위의 결과로 행잉 드롭 방식에 의해 나타나는 분화보다 본 발명에 의한 세포 분화장치에서의 분화가 더 빨리 진행됨을 확인하였다.

본 발명을 이용하면, 신속하고 균일하게 EB를 형성시킬 수 있으며, 그 형성 된 EB를 세포들 간의 원활한 신호전달이 가능한 상태에서 성장시킴으로써 효율적으로 세포 분화를 수행할 수 있다. 또한, 시간이 경과함에 따라 세포 배양액의 질이 떨어지는 것을 예방함으로써 세포가 보다 건강한 상태로 성장하도록 할 수 있으며, EB의 형성과 형성된 EB의 성장이 하나의 시스템 내에서 효율적으로 이루어지도록 하는 장점이 있다.

Claims

줄기세포로부터 배아체를 형성시키는 방법으로서,

양 말단이 열려진 원통형 용기를 수직으로 세우고 그 원통형 용기 내에 줄기세포를 포함하는 배양액을 채움으로써 수직으로 세워진 원통형 용기의 끝에 배양액이 반구 형태를 유지하면서 표면장력에 의해 매달려 있도록 하고, 중력에 의해 원통형 용기의 끝에 매달린 반구 형태의 배양액 방울의 끝에 줄기세포들이 모이도록 하여 구 형태의 배아체(Embryoid Body, EB)를 형성하는 것을 특징으로 하는 줄기세포로부터 배아체를 형성시키는 방법.
제1항에 있어서,

상기 원통형 용기의 지름은 1.0 내지 2.6mm인 것을 특징으로 하는 줄기세포로부터 배아체를 형성시키는 방법.
제2항에 있어서,

상기 원통형 용기는 둘 이상이고, 모든 원통형 용기가 동일한 지름을 갖도록 조정하여, 형성되는 배아체의 크기를 균일하게 하는 것을 특징으로 하는 줄기세포로부터 배아체를 형성시키는 방법.
제2항에 있어서,

상기 원통형 용기는 둘 이상이고, 그 둘 이상의 원통형 용기가 다양한 지름을 갖도록 조정하여, 형성되는 배아체의 크기를 다양하게 하는 것을 특징으로 하는 줄기세포로부터 배아체를 형성시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 원통형 용기에 배양액을 보충함으로써 상기 원통형 용기로부터 배양액이 증발되어 소실되는 것을 방지하고 세포 대사에 따른 배양액의 열화를 예방하는 것을 특징으로 하는 줄기세포로부터 배아체를 형성시키는 방법.
줄기세포를 분화시키는 방법으로서,

제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 배아체를 형성시키는 제1단계; 및

상기 제1단계에서 형성된 배아체를 상기 제1단계를 거쳐 배아체가 배양액 방울 끝에 형성된 상태인 원통형 용기를, 배아체 성장을 위한 배양액이 담긴 배양 용기 안으로 넣되, 상기 배양액 방울 끝이 상기 배아체 성장을 위한 배양액과 접촉하도록 하지만 상기 배양 용기 바닥과는 접촉하지 않는 높이로 넣음으로써, 상기 배아체가 배아체 성장을 위한 배양액과의 접촉에 의해 배아체 성장을 위한 배양액 내로 배아체를 떨어뜨리고 떨어진 배아체를 배양 용기 바닥에 부착시킨 상태에서 배아체를 성장시키는 제2단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분화방법.
제6항에 있어서, 상기 제2단계는 지름이 2.0 내지 4.0mm인 배양 용기 내에서 배아체를 성장시키는 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화방법.
줄기세포로부터 배아체를 형성시키는 장치로서,

양 말단이 열려진 원통형 용기가 수직으로 다수개 설치되어 있어, 수직으로 세워진 원통형 용기의 끝에 배양액이 반구 형태를 유지하면서 표면장력에 의해 매달려 있도록 하고, 중력에 의해 원통형 용기의 끝에 매달린 반구 형태의 배양액 방울의 끝에 줄기세포들이 모이도록 하여 구 형태의 배아체(Embryoid Body, EB)를 형성하는 것을 특징으로 하는 배아체 형성장치.
제8항에 있어서, 상기 원통형 용기는 지름이 1.0 내지 2.6mm의 범위에 속하는 것을 특징으로 하는 배아체 형성장치.
제9항에 있어서, 상기 원통형 용기는 모두 동일한 지름을 갖는 것을 특징으로 하는 배아체 형성장치.
제9항에 있어서, 상기 원통형 용기는 다양한 지름을 갖는 것을 특징으로 하는 배아체 형성장치.
제8항에 있어서, 상기 원통형 용기의 상부를 둘러싸는 용기로서 원통형 용기에 배양액을 보충 공급하는 보충 용기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 배아체 형성장치.
줄기세포를 분화시키는 장치로서,

제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 배아체 형성장치를 포함하는 배아체 형성층을 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화장치.
제13항에 있어서,

상기 배아체 형성층 아래에 적층되며, 상기 배아체 형성층에서 형성된 배아체의 성장을 위한 배양 용기를 상기 원통형 용기와 동일한 개수로 포함하는 배양 용기 층으로서 상기 배양 용기는 상하가 열려진 튜브 형태인 것을 특징으로 하는 배양 용기 층을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화장치.
제14항에 있어서,

상기 배양 용기 층 아래에 적층되며, 상기 배양 용기와 접촉되는 미세 다공막으로 구성된 미세 다공막 층으로서, 상기 배아체 형성층에서 형성된 배아체를 부착시키고 하부로부터 배양액을 통과시키기 위한 것임을 특징으로 하는 미세 다공막 층을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화장치.
제14항에 있어서,

상기 배양 용기 층의 배양 용기는 지름이 2.0 내지 4.0mm인 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화장치.
제14항에 있어서,

상기 배아체 형성층의 원통형 용기와 상기 배양 용기 층의 배양 용기가 서로 겹쳐지는 높이로 배치되도록 배아체 형성층과 배양 용기 층이 적층된 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화장치.
제15항에 있어서,

상기 미세 다공막 층 아래에 적층되며, 상기 배양 용기 층과 상기 미세 다공막 층을 결합시키며 상기 미세 다공막층을 보호하는 바닥 지지층을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화장치.
제15항에 있어서,

상기 미세 다공막 층의 미세 다공막은 ECM 코팅됨으로써 배아체의 부착능이 개선된 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화장치.