CN112041429B - 用于产生心脏类器官的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了从培养的多能干细胞体外生产心脏类器官的方法，该心脏类器官可重复地具有特定心脏细胞层的结构。
Description
本发明涉及使用多能干细胞(PSC)，优选人PSC体外产生心脏类器官的方法，涉及可通过该方法获得的心脏类器官，以及涉及通过以下方法分析测试化合物对心脏细胞活性的方法：在其生产过程中将PSC暴露于测试化合物和/或将至少一种可通过其生产方法获得的心脏类器官暴露于测试化合物，并分析类器官，例如与PSC和/或并行处理但不存在测试化合物的心脏类器官比较。
所述方法和心脏类器官的优点是可在培养的多能干细胞的基础上获得，并且优点是提供包含不同心脏细胞或由不同心脏细胞组成的邻接层，任选地包括非心脏细胞，这些层由纯体外方法培养，并提供了邻接的心脏组织层(任选地包括非心脏细胞)的体外模型。已经发现这些组织层结构良好并包含细胞类型，这些层和细胞类型是早期胚胎心脏的典型特征。心脏类器官可以保存在静态或搅拌(例如摇动)，的培养容器中的细胞培养基中，例如没有定向的流体流动，没有血液流动，并且自由地悬浮，即没有机械固定。
现有技术
已知培养心肌细胞以获得粘附在培养容器表面的这些细胞层。
已知商标Matrigel(Corning Life Sciences and BD Bioscience)命名了由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白混合物。
Richards等人，Biomaterials 112-123(2017)描述了通过在琼脂糖模具中沉积心肌细胞、心脏心室成纤维细胞、脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人脂肪来源的微血管内皮细胞(HAMEC)以及人脂肪来源的干细胞(hADSC)，以首先产生球形微组织，然后将其组装成球状体来制造心脏类器官。
Elliott等(2011)“NKX2-5(eGFP/w)hESCs for isolation of human cardiacprogenitors and cardiomyocytes”,Nature methods 8(12),S.1037–1040.DOI:10.1038/nmeth.1740描述了hESC3 NKX2.5-eGFP细胞的产生。
US 2017/0198256 A1描述了将hiPSC培养和收获为单细胞或细胞团块，将其与液体可交联的PEG纤维蛋白原前体溶液组合以产生单个hiPSC或hiPSC团块在可交联溶液中的统计分布，所述可交联溶液以一定形式交联，得到宽度为6mm、厚度为200μm的圆柱体。在将这些圆柱体培养3天后，更换培养基以诱导hiPSC的分化，产生心肌细胞。
US 2016/0271183 A1描述了悬浮的人胚干细胞在含有基质胶(Matrigel)以及BMP4、Rho激酶抑制剂、激活素A和IWR-1的培养基中向心肌细胞的分化。
WO 2018/035574 A1描述了一种96孔培养板，在每个孔中具有两个间隔开的直立柱。心肌细胞成熟培养基中接种的祖细胞应形成附着在两个柱上的收缩组织。
Pashmforoush等人，Nkx2-5 Pathways and Congenital Heart Disease:Loss ofVentricular Myocyte Lineage Specification Leads to Progressive Cardiomyopathyand Complete Heart Block,Cell 2004,117,373–386描述了NKX2.5遗传缺陷的体内结构缺陷。
Ng ES，Azzola L，Bruveris FF，Calvanese V，Phipson B，Vlahos K等人，Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+hemogenic vasculaturethat resembles the aorta-gonad-mesonephros.Nature Biotechnology2016,34(11)描述了造血细胞特异性基因RUNX1C(Runt相关转录因子1c)。
Guibentif C，Lang S，Saxena S，Soneji S等人，Single-Cell Analysis Identifies Distinct Stages of Human Endothelial-to-Hematopoietic Transition.Cell Reports 2017,19,10–19，描述了Wiskott-Aldrich综合征的造血细胞特异性基因WAS。
Kasahara等人，“Progressive atrioventricular conduction defects andheart failure in mice expressing a mutant Csx/Nkx2.5 homeoprotein”,2001；J.Clin.Invest.108:189–201，描述了具有心室受限的NKX2.5-KO的小鼠胚胎和新生小鼠含有与野生型小鼠心肌细胞相似且组织良好的肌节的心肌细胞。
Davis等人，“Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of humanembryonic stem cells identifies human primitive streak–like cells and enablesisolation of primitive hematopoietic precursors”,Blood 2008,111:1876-1884描述了HES3 MIXL1-GFP报告物细胞系。
Anderson DJ等人.“NKX2-5 regulates human cardiomyogenesis via a HEY2dependent transcriptional network”,Nature Communications 2018,9:1373描述了人类胚胎干细胞系HES3 NKX2.5eGFP/eGFP的生产。
发明目的
本发明的目的是提供一种用于在体外方法中产生心脏组织的替代方法，该心脏组织应形成至少两层，所述至少两层包含不同的细胞或由不同的细胞组成，所述不同的细胞可以是心脏细胞，任选地与其他细胞类型组合。
发明内容
本发明通过权利要求书的特征，特别是通过用于体外产生心脏类器官的方法以及通过该方法可获得的心脏类器官来实现该目的，该方法包括以下顺序的步骤或由以下顺序的步骤组成：
a)在第一容器中的第一培养基的悬浮液中提供培养的多能干细胞(PSC)，优选仅提供PSC，其中PSC优选是人PSC，例如以至少50个或至少100个或至少1000个细胞的细胞数，例如多达200,000或多达100,000个细胞，例如4,000至10,000个细胞，优选5000个细胞，
b)在具有U形底部的第一容器中离心PSC，以使PSC位于在第一容器的底部，
c)在细胞培养条件下，在第一培养基中温育位于第一容器底部的PSC，以形成一个PSC聚集物，
d)任选地从位于第一容器底部的PSC聚集物中除去第一培养基，
e)将PSC的聚集物包埋在水凝胶中，优选通过将一定体积的水凝胶置于第二容器中，并将位于第一容器底部的PSC聚集物转移到一定体积的水凝胶中，
f)温育包埋在水凝胶中的PSC聚集物以固化水凝胶，例如至少10分钟，例如10至90分钟或45分钟，或45至90分钟，
g)用第二细胞培养基覆盖包埋在固化的水凝胶中的细胞的聚集物，并在细胞培养条件下温育，优选1天至3天、例如36至60小时；
h)从细胞中除去第二培养基，并添加含有具有诱导WNT途径的活性的第一分化因子的第三细胞培养基，并在细胞培养条件下温育至少6小时，例如多达3天，优选12至48小时，例如24小时，
i)从细胞中除去第三培养基，并添加不含第一分化因子或含有中和第一分化因子活性的试剂的第四细胞培养基，并在细胞培养条件下温育至少6小时，例如多达3天，优选12至48小时，例如24小时，
j)从细胞中除去培养基，并添加含有具有抑制WNT途径的活性的第二分化因子的第五细胞培养基，并在细胞培养条件下温育至少1天或至少2天，优选46至50小时，例如48小时，
k)从细胞中除去第五培养基，并添加不含胰岛素且不含具有诱导或抑制WNT途径活性的分化因子的第六培养基，并在细胞培养条件下温育至少1天或至少2天，优选2天；
l)从细胞中除去第六培养基，并添加含有胰岛素的第七细胞培养基，并在细胞培养条件下温育至少1天或至少2天，优选2天；
m)然后至少每2天将第七培养基更换为新鲜细胞培养基。
作为替代，PSC可以被万能(omnipotent)或全能(totipotent)干细胞替代。因此，在该方法中，干细胞可以任选地至少是多能干细胞。通常优选地，不使用人类胚胎产生PSC。优选地，PSC是人PSC(hPCS)，例如诱导型PSC(iPSC)，例如从诸如血液或组织样品的哺乳动物细胞样品产生，尤其是人诱导的PSC(hiPSC)或胚胎干细胞系(ESC)(优选非人类)或人胚胎干细胞系(hESC)。通常，PSC或ESC不是使用人类胚胎生成的。
培养的多能干细胞(PSC)优选以存在标志物Tra-1-60和SSEA4为特征。
优选地，步骤a)中提供的培养的多能干细胞(PSC)是悬浮的单细胞。
第一容器优选地具有低附着表面，优选地是超低附着表面，其防止PSC附着至容器。第一容器可以例如包含在微量滴定板中，例如在96孔板中。第二容器优选地具有低附着表面，优选地是超低附着表面，其防止PSC附着至容器。第二容器可以具有平的或U形的底部。第一容器和第二容器可以具有相同的形状和/或表面性质。
通常，第一和第二培养容器的U形底部可以是逐渐变细的凹形底部，例如圆形或阶梯状或具有倾斜表面，例如具有凹金字塔形或V形。
第一培养基优选为具有DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸镁(64mg/L)、硒酸钠(14μg/L)、FGF2(100μg/L)、胰岛素(19.4mg/L)，NaHCO3(543mg/L)和转铁蛋白(10.7mg/L)、TGFβ1(2μg/L)或NODAL(100μg/L)的组成的E8培养基。为了提供ESC的多能性，将所有培养基的渗透压调节至在pH 7.4下340mOsm。优选地，第一培养基补充有ROCK抑制剂，例如10μM ROCK抑制剂(Rho相关激酶抑制剂)。
每5000个细胞，每种培养基的体积可以在100μL至300μL的范围内，尤其是150μL至250μL。
步骤b)中的离心，例如在温度控制到4℃的离心机中以300×g离心两次，以将PSC定位在第一容器的底部，例如以收集PSC。离心后，在基本上不使第一培养基相对于第一容器移动的情况下将第一容器放置在培养箱中，以保持PSC局部紧密靠近。同样在步骤c)中，第一培养基留在第一容器中。
在步骤c)中，在细胞培养条件下并且没有搅拌的情况下，温育位于第一容器底部的PSC。这种培养，例如持续24小时，导致PSC形成一个细胞聚集物。
当在步骤f)将细胞的聚集物转移到水凝胶时，在步骤d)中从细胞的聚集物中去除第一培养基的作用是减小或避免将第一培养基转移到步骤e)中位于第二容器的U形底部的水凝胶中。可以例如使用具有宽开口的移液器完成在步骤e)中转移细胞的聚集物，以避免剪切细胞的聚集物。
水凝胶用于细胞培养，例如对于溶解的氧气是可渗透的，对于培养基组分是可渗透的，并且对于代谢产物优选是可渗透的，例如对于扩散是可渗透的。优选地，水凝胶是基于动物细胞的基底膜的细胞外基质。水凝胶可以基于层粘连蛋白和/或巢蛋白和/或胶原蛋白和/或纤连蛋白和/或PEG，任选地基于PEG(聚乙二醇)，例如与纤连蛋白组合。水凝胶优选具有凝胶状结构。优选的水凝胶是基质胶。
水凝胶，例如基质胶优选具有9.7至10.1mg/mL的蛋白质浓度。在步骤e)中，将优选体积为15至30μL，优选为20μL的基质胶放置在第二容器的U形底部，并将PSC的聚集物放置在基质胶中，以将PSC的聚集物包埋到基质胶中。第二容器优选地具有低附着表面，优选地具有超低附着表面。第二容器可以具有与第一容器相同的规格。优选地，水凝胶是不可交联的，例如在方法期间不含交联的反应性基团，并因此该方法优选地没有交联水凝胶的步骤。较不优选的是，水凝胶可以是可交联的，例如含有可交联基团，并且该方法包括使水凝胶交联的步骤。
步骤f)的温育，例如在细胞培养条件下45至60分钟，用于在步骤g)中添加第二培养基前使水凝胶固化。
在步骤g)中，第二培养基可以具有与第一培养基相同的组成，例如培养基E8。在步骤g)中第二培养基的体积可以是80至150μL，例如100μL。步骤g)中温育至少1天或至少2天，优选多达3天，优选36至60小时。
在步骤i)中去除第二培养基并添加含有第一分化因子的第三培养基，用于激活WNT途径。具有诱导WNT途径活性的第一分化因子优选是GSK3β(糖原合酶激酶3β)的抑制剂，并且优选对CDK(细胞周期蛋白依赖性激酶)没有作用或交叉反应。优选的第一分化因子是CHIR99021(CHIR，6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-氰基吡啶)，例如以7.5μM，例如每第二容器使用200μL的第三培养基。第三培养基优选地是含有无胰岛素的B27补充剂的RPMI培养基，并且它另外含有第一分化因子。
优选地，在步骤h)后，在步骤i)中除去含有第一分化因子的第三培养基，优选在步骤j)中添加该第三培养基后的24小时，并添加不含有分化因子(例如无第一分化因子)的第四细胞培养基，并在细胞培养条件下温育，例如1天。当该方法包括步骤i)时，当前认为这是减小第一分化因子诱导的WNT活化。第四培养基优选不含胰岛素，例如含有无胰岛素的B27补充剂的RPMI培养基。通常优选地，在该方法中，尤其是在步骤h)中，仅添加仅具有激活WNT途径活性的第一分化因子，例如包含在第三细胞培养基中，并且该方法，特别是在步骤h)中，不添加具有激活除WNT途径之外的另一分化途径的活性的分化因子，例如不添加BMP4、Rho激酶抑制剂、激活素A和IWR-1。
在步骤j)中，从细胞的聚集物中除去培养基，并添加含有抑制WNT2途径的第二分化因子的第五细胞培养基，并且优选地第五培养基不包含胰岛素。第五培养基可以是含有无胰岛素的B27补充剂的RPMI培养基。第二分化因子优选是WNT途径激活剂Porcupine的抑制剂，例如IWP2(WNT产生抑制剂2，CAS号686770-61-6)，例如处于每第二容器5μM的浓度，例如使用100μL至300μL，例如至多200μL培养基。
在步骤l)中，优选在步骤k)温育2天后，除去第五培养基，并将不含有第一抑制剂和第二抑制剂的第六培养基添加到聚集物中。第六培养基优选不包含胰岛素。第六培养基可以例如是含有无胰岛素的B27补充剂的RPMI培养基。在步骤k)中，第六培养基的体积可以例如为每第二容器100μL至300μL，例如150至250μL，优选200μL。RPMI培养基是RPMI1640(无机盐：硝酸钙*4H2O(0.1g/L)、硫酸镁(0.04884g/L)、氯化钾(0.4g/L)、碳酸氢钠(2g/L)、氯化钠(6g/L)、磷酸氢二钠(0.8g/L)；氨基酸：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(0g/L)、L-精氨酸(0.2g/L)、L-天冬酰胺(0.05g/L)、L-天冬氨酸(0.02g/L)、L-胱氨酸*2HCl(0.0652g/L)、L-谷氨酸(0.02g/L)、甘氨酸(0.01g/L)、L-组氨酸(0.015g/L)、羟基-L-脯氨酸(0.02g/L)、L-异亮氨酸(0.05g/L)，L-亮氨酸(0.05g/L)、L-赖氨酸*HCl(0.04)、L-甲硫氨酸(0.015g/L)、L-苯丙氨酸(0.015g/L)、L-脯氨酸(0.02g/L)、L-丝氨酸(0.03g/L)、L-苏氨酸(0.02g/L)、L-色氨酸(0.005g/L)、L-酪氨酸*2Na*2H2O(0.02883g/L)、L-缬氨酸(0.02g/L)；维生素：D-生物素(0.0002g/L)、氯化胆碱(0.003g/L)、叶酸(0.001g/L)、肌醇(0.035g/L)、烟酰胺(0.001g/L)、对氨基苯甲酸(0.001g/L)、D-泛酸(半钙)(0.00025g/L)、吡哆醇*HCl(0.001g/L)、核黄素(0.0002g/L)、硫胺素*HCl(0.001g/L)、维生素B12(0.000005g/L)；
D-葡萄糖(2g/L)、谷胱甘肽(0.001g/L)、酚红*Na(0.0053g/L)、L-谷氨酰胺(0.3g/L)、碳酸氢钠(0g/L))。
在步骤1)中，除去第六培养基，并用含有胰岛素的第七培养基代替，例如，添加含有具有胰岛素的B27补充剂的RPMI培养基。
在步骤m)中，将步骤1)的第七培养基替换为新鲜的细胞培养基，优选新鲜的第七培养基，其优选包含添加的胰岛素。
优选地，在步骤c)至m)中，优选在步骤c)至h)中的温育是在静态条件下进行的，例如不摇动或移动容器。任选地，从步骤m)开始的温育是在温和的搅拌下进行的，例如在轨道摇动下，最好在较大体积的培养基中，并在容器中用于伴有轨道摇动的细胞培养。
产生心脏类器官的方法的优点是仅一种类型的细胞，即PSC，例如iPSC或ESC可用于该方法中，以及在该方法期间PSC(例如iPSC或ESC)分化并自组织成包含邻接层的三维结构，该邻接层包含不同的心脏细胞类型或由不同的心脏细胞类型组成，例如在未将细胞机械地操纵成特定的分层结构，且在未最初提供不同的心脏细胞类型的情况下。
在本文中，由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白混合物通常称为基质胶。
通常，所有培养基都可以含有抗细菌剂，例如用于预防细菌污染的青霉素和/或链霉素。
为了分析测试化合物的效果，可以在该方法的任何步骤中添加测试化合物。为了分析测试化合物的效果，可以在步骤e)至m)，例如步骤i)至m)中的至少一个中，优选在步骤i)后总共10至13天之后，将测试化合物添加至培养基。
生产心脏类器官的方法的优点在于可再现地产生一种结构的心脏类器官，例如具有0.5至5mm或至多3或至多2.5mm，例如1.2mm至3mm或至多2.5mm的外径。心脏类器官的结构包含第一层、第二层和第三层或由第一层、第二层和第三层组成，该第一层包含内皮细胞和前肠内胚层细胞或基本上由内皮细胞和前肠内胚层细胞组成，该第一层形成内部并具有腔，该腔优选包含造血内皮细胞和/或前肠内胚层细胞，第二层与第一层直接相邻并仅包围第一层的一部分，第二层形成致密的心肌以及任选的心内膜，第二层包含或基本上由NKX2.5阳性心肌细胞组成，以及与第一层相对的第三层仅直接与第二层相邻且仅包围第二层的一部分，该第三层形成心外膜并且包含心外膜细胞和心肌细胞或基本上由心外膜细胞和心肌细胞组成，第三层具有血管样结构并由心外膜细胞和心肌细胞形成疏松组织，其中第三层可以被直接相邻的成纤维细胞层覆盖。其中，优选地，第一层完全包围一个或多个腔，即第一层在周向上闭合，并且第二层仅部分地包围第一层，使得第一层的一部分未被另一层覆盖。第三层例如仅部分地包围第二层，例如第三层覆盖第二层直至第二层的环形段(ring-shaped section)，该第二层的环形段未被覆盖，该环形段与第一层的未覆盖部分相邻。造血内皮可以例如位于心脏类器官的内部，尤其是至少部分内部腔，例如在仅一部分内腔中，而另一部分腔内没有造血内皮，其可以是前肠内胚层细胞。腔具有造血内皮的部分可以具有沿着腔的造血内皮层，其中内部由前肠内胚层细胞形成。没有造血内皮的腔的部分仅由前肠内胚层细胞形成。心脏类器官的内部可以由前肠内胚层细胞形成，其中单独的腔可以由前肠内胚层细胞形成，衬有造血内皮和/或包含血管。
例如，从一个角度看，心脏类器官的结构包含被第二层的环形段包围第一层的至少一个未覆盖部分或由被第二层的环形段包围第一层的至少一个未覆盖部分组成，其中第二层被与第一层相对的相邻第三层覆盖，并且第二层的环形段不被第三层覆盖。心脏类器官的结构优选具有至少一个表面区域，该表面区域由以下形成：第一层的未覆盖部分、与第一层的第一未覆盖部分直接相邻的第二层的环形段以及直接邻近第二层的环形段，覆盖并包围第二层的第三层，邻接第二层的环形段的第三层，以及优选地第四层，例如疏松的心脏成纤维细胞的第四层，仅与第三层相邻。任选地，第一层在其未覆盖部分正下方的部分含有比被第二层覆盖的部分较少的腔，或者没有腔。在心脏类器官的结构中，至少一个表面区域可以由第二层的环形段形成，该环形段包围第一层的未覆盖部分并且与第一层的未覆盖部分相对，由包围第二层的环形段的第三层形成，其中第三层优选完全覆盖第二层并邻接第二层的环形段。
由于产生心脏类器官的方法可再现地产生具有这种结构的心脏类器官，因此例如通过测定与不添加测试化合物而产生的心脏类器官的结构差异，可以分析在该方法期间添加的测试化合物或对具有预定大小的心脏类器官的作用。
心脏类器官的结构具有以下优点：允许从指向第一层的未覆盖部分和/或第二层的环形段的角度直接观察所有的层。因此，本发明提供了具有特定结构的心脏类器官，该心脏类器官可通过方法获得。此外，本发明提供了分析方法，其中在产生心脏类器官的方法的至少一个步骤中，将要测试的化合物添加到至少一种培养基中，或者其中将要测试的化合物添加到方法生产的心脏类器官，例如具有本文结构的心脏类器官，然后分析心脏类器官。
任选地，可以提供心脏类器官的一段，例如其至少一层，用作组织植入物以用于植入患者体内，例如提供作为组织植入物，例如作为缺陷组织的替代物或填充物。
任选地，多能干细胞源自患者，例如来自取自患者的组织样品。可以诊断患者患有疾病或可以怀疑患者患有疾病，并且可以使用产生心脏类器官的方法来分析测试化合物对心脏类器官的作用，例如在其发展到预定大小的过程中或之后，其中测试化合物可以是用于治疗疾病的药物化合物。此类方法可以用于在向患者施用化合物之前分析药物化合物的作用。替代地或另外地，根据本发明的方法由源自患者的多能干细胞产生的心脏类器官可以用于产生心脏类器官，以将其至少一层用作患者缺损组织的替代物。
任选地，PSC可以具有遗传畸变，例如选自异常的，例如杂合或纯合存在的功能异常的基因的遗传缺陷。遗传畸变可以例如是一个功能异常的基因，选自NKX2.5组的基因，其功能异常至少纯合性地导致先天性心脏病，其结构缺陷包括肌肉过度生长和心脏传导缺陷，例如GATA4或TBX5等因子的功能障碍，其导致先天性心脏缺陷。
分析可以证明，与没有遗传畸变的PSC(即遗传野生型或健康的PSC)产生的心脏类器官相比，该方法中使用的PSC的遗传异常会导致心脏类器官的结构性畸变。
PSC优选是细胞系，例如hESC HES3。
现在参考附图通过实施例更详细地描述本发明，附图中示出：
-图1该方法的优选实施方案的示意图，
-图2示例性PSC细胞系的FACS结果，
-图3在该方法的第14天(d10)获得的心脏类器官的荧光显微照片，
-图4该方法的第14天不同心脏类器官的荧光显微照片，
-图5A在心脏类器官外层的周边使用钙调理蛋白(calponin)阳性肌成纤维细胞进行免疫染色的心脏类器官的荧光显微照片，
-图5B使用抗波形蛋白抗体在全标本免疫荧光染色中的心脏类器官，
-图6WT1仅在心脏类器官的外层表达，6A免疫染色和6B报告物的表达；
-图7在心脏类器官的石蜡切片中使用cTnT的免疫染色的心脏类器官的荧光显微照片；
-图8内皮细胞染色的心脏类器官，在8A中用DAPI染色的NKX2.5-eGFP表达的荧光显微照片，在8B中用CD31和DAPI染色的荧光显微照片，在8C中针对CD31染色且用DAPI染色，具有NKX2.5-eGFP表达的荧光显微照片，
-图9具有针对SOX17的免疫染色的心脏类器官的显微照片，
-图10具有DAPI染色的心脏类器官的石蜡切片的显微照片，
-图11A和11B光学显微照片，图11C大腔的区域中心脏类器官的截面的电子显微照片，
-图12心脏类器官的大腔的截面的电子显微照片，
-图13用Dil-Ac-LDL染色的长期培养后的心脏类器官的显微照片，
-图14A-C通过本发明的方法产生的心脏类器官的结构的示意图，
-图14D从一个心脏类器官的不同角度拍摄的显微照片，
-图15用沙利度胺处理的心脏类器官和未处理的心脏类器官的显微照片，
-图16以图形方式显示了用沙利度胺治疗以及未添加测试化合物的心脏类器官的结构的定量差异，
-图17由遗传异常的PSC或对照产生的心脏类器官的荧光显微照片，
-图18从遗传异常的PSC或对照产生的心脏类器官总面积的测量结果，
-图19和图20对从遗传异常的PSC或对照中产生的心脏类器官的环状组织的紧致度的光学分析的荧光显微照片，
-图21如图19和20中所示的从遗传异常的PSC或对照产生的类器官的环状组织的紧致度的光学分析的测量结果；
-图22在RUNX1C启动子的控制下表达GFP的心脏类器官的荧光显微照片，
-图23在WAS启动子的控制下表达GFP的心脏类器官的荧光显微照片，
-图24a和图24b具有针对内皮细胞的免疫染色的心脏类器官的荧光显微照片的放大截面，
-图25显示了NKX2.5-KO和对照类器官中的心肌细胞中肌节的透射电子显微镜照片，
-图26用抗Ki67抗体染色的由NKX2.5-KO和野生型(对照)PSC产生的心脏类器官的石蜡切片，
-图27从HES MIXL1-GFP报告物细胞系产生的心脏类器官分化的第1天(d1)至第4天(d4)的显微照片。
图1示出了该方法的示意性概图，其中从步骤h)的开始作为第0天计算步骤的顺序。其中，在第4天(d-4)通过以约5000离心在作为第一容器的具有U形底部的96孔微量滴定超低附着板的孔中的人PSC(hPSC)，进行步骤a)，以在步骤b)的U形底部生成PSC聚集物。在步骤c)中，将PSC的聚集物在培养基中温育24小时的优选持续时间，在第3天(d-3)停止。步骤d)和e)的结果是在第2天(d-2)作为步骤e)的结果显示，其是包埋到第二容器底部中水凝胶中的d-3获得的细胞的聚集物。在步骤f)中在细胞培养条件下将包埋在水凝胶中的细胞的聚集物温育1小时，而第二容器中不含有培养基。在步骤g)中，添加第二培养基，并温育2天，直到步骤h)中的第0天(d0)，用含有第一分化因子的第三培养基替代第二培养基，以启动WNT途径，并在第三培养基中温育1天(直到第1天(d1))。第三培养基为200μL，其中每第二容器具有7.5μM的CHIR99021。
在第1天进行以下步骤i)，将第三培养基替换为不含分化因子的第四培养基，并在第四培养基中温育2天，直到第3天(d3)。或者，可以实施步骤i)，其中在细胞培养条件下温育1至2天，优选24小时，并随后直接除去第三培养基，并换成含有5μM WNT途径抑制剂IWP2的第五培养基，步骤j)中每第二容器200μL的培养基。温育持续2天，直到第5天(d5)，当在步骤k)中，除去第五培养基并用不含分化因子并且优选无胰岛素的第六培养基代替，并且温育持续2天直到第7天(d7)。第六培养基被第七培养基替代，该第七培养基通常不含分化因子，并且优选地包含胰岛素，例如B27补充剂，然后温育至少1天，例如至多3天，直到步骤l)的第10天(d10)。在步骤1)之后，步骤m)中将第六培养基换成新鲜的培养基，优选地含有胰岛素，以维持生存力，例如每天至每2天。
在图1中，RB-是含有无胰岛素的B27补充剂的RPMI培养基，RB+是含有具有胰岛素的B27补充剂的RPMI培养基。B27补充剂，例如可以从ThermoFisher Scientific获得，包含生物素、DL-α-生育酚乙酸酯、DL-α-生育酚、维生素A(乙酸盐)、BSA、不含脂肪酸的级分V、过氧化氢酶、人重组胰岛素、人转铁蛋白、超氧化物歧化酶、皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺HCl，谷胱甘肽(还原)、L-肉碱HCl、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺2HCl、亚硒酸钠、T3(三碘-1-甲状腺原氨酸)。B27补充剂的无胰岛素变体是可商购的。
实施例1：仅从PSC体外生产心脏类器官
如参照图1所述实施方法的步骤a)至n)。在细胞培养条件下，使用超低附着96孔微量滴定板，可从Thermo Fisher Scientific获得的Nunclon Sphera96U孔板作为第一容器，在37℃的5％CO2气氛中进行温育。PSC是人胚胎干细胞系hESC3 NKX2.5-eGFP。这些示例性的PSC经过基因操作在早期心肌细胞特异性标志物NKX2.5的控制下表达增强的绿色荧光蛋白(eGFP)作为报告物，以指示心肌细胞的早期分化。
将这些PSC在E8培养基中在细胞培养烧瓶(优选包被有Geltrex)上培养，并从烧瓶中分离以提供悬浮的PSC。在步骤a)中，将5000个PSC悬浮在100μL的第一培养基中，该培养基是补充有10μM ROCK抑制剂(Y-27632，目录号72302，Stemcell Technologies)的E8培养基(DMEM/F12，L-抗坏血酸-2-磷酸镁(64mg/L)、硒酸钠(14μg/L)、FGF2(100μg/L)、胰岛素(19.4mg/L)、NaHCO3(543mg/L)和转铁蛋白(10.7mg/L)、TGFβ1(2μg/L)或NODAL(100μg/L)，调节渗透压至340mOsm(pH7.4))，将其小心地分配到微量滴定板的孔中。以300×g两次离心步骤b)3分钟，其中离心机冷却至4℃。离心的第一容器各自在U形底部包含一个聚集物，并小心地放入细胞培养箱中，以避免干扰位于U形底部的细胞。在不搅拌的情况下温育步骤c)24小时，导致细胞聚集物的形成。为了包埋在作为示例性水凝胶的基质胶中(在冰上融化，蛋白质含量为9.7至10.1mg/mL)，将20μL的基质胶放置在微量滴定板的每个孔中，其孔形成第二容器，该板是与第一相同的超低的附着质量。优选地，从第一容器中包含的细胞的聚集物中除去培养基，然后将细胞的聚集物单独并小心地转移到第二容器中包含的基质胶液滴中。已经发现，为了转移细胞的聚集物，可以使用设置为约3μL并配有具有大开口的尖头的移液管。将第二容器，即第二微量滴定板，重新放置到培养箱中45至60分钟，以使基质胶固化。然后，将不具有ROCK抑制剂的100μL E8培养基分配到每个第二容器中，并且根据步骤h)将第二容器在不搅拌的情况下温育2天。在步骤h)温育后，在第0天，通过完全去除E8培养基并向每个第二容器中添加200μL RPMI培养基(补充有不含胰岛素的B27补充剂并包含7.5μMCHIR99021)来开始分化，并根据步骤h)温育恰24小时。然后，将第三培养基替换为第四培养基，该第四培养基由具有无胰岛素的B27补充剂的RPMI培养基组成，并温育2天。然后，根据步骤k)，在每个第二容器中将第四培养基除去并换成200μL RPMI培养基，RPMI培养基具有无胰岛素的B27补充剂，并包含5μM IWP2作为第二分化因子，其中温育48小时。随后，每2天将培养基换成具有含有胰岛素的B27补充剂的RPMI培养基。
图2显示了用多能性标志物Tra-1-60(99.9％的细胞阳性)和SSEA4(97.7％的细胞阳性)染色对悬浮的PSC细胞进行FACS分析的结果，证实了在方法开始时细胞的多能性。
图3显示了由报告物hESC系HES3 NKX2.5eGFP产生的典型心脏类器官的荧光显微照片。心脏类器官显示出形成内层1的内部，该内层由NKX2.5-eGFP阴性细胞组成。内层被NKX2.5-eGFP阳性心肌细胞的致密环包围，其也可描述为心肌环。致密环被外层的环状结构包围，外层的环状结构包含NKX2.5-eGFP阳性和NKX2.5-eGFP阴性的细胞两者。外层似乎是疏松组织。
通常观察到，心脏类器官约在方法的11天(第7天)后开始有规律地收缩。
图4描绘了该方法的第14天(d10)不同心脏类器官的荧光显微照片，显示了一批中并行产生的类器官非常相似的结构和的NKX2.5-eGFP表达。该结果表明，该方法可再现地产生具有相似结构的心脏类器官。
图5A描绘了使用Cy5标记的抗钙调理蛋白抗体(钙调理蛋白1抗体(CALP)：sc-58707von Santa Cruz Biotechnology)、DAPI染色和NKX2.5-eGFP的荧光在全标本免疫荧光染色中的心脏类器官。该结果表明，本发明的心脏类器官在外层的周边包含钙调理蛋白阳性的肌成纤维细胞。
图5B显示了使用抗波形蛋白抗体(从abcam获得；ab92547；二抗：Alexa488-AffiniPure驴抗兔IgG(H+L)，从Jackson ImmunoResearch Laboratories获得)以及抗cTnT抗体(从Invitrogen获得的心肌肌钙蛋白T抗体(13-11)；二抗：从Jackson ImmunoResearchLaboratories获得的Cy3-AffiniPure驴抗小鼠IgG(H+L))进行的全标本免疫荧光染色中的心脏类器官。染色显示心脏类器官在外层周边含有波形蛋白阳性成纤维细胞，这是基质细胞的实例。
图6描绘了6A中的石蜡切片中使用Alexa488标记的抗WT1抗体与DAPI染色的具有WT1免疫染色的心脏类器官的显微照片，以及6B中在WT1启动子的控制下表达eGFP的心脏类器官的免疫荧光显微照片(HES3WT1eGFP细胞)。这些结果表明，心脏类器官中的心外膜细胞仅存在于外层中，而不存在于类器官的其他部分。
图7显示了使用Cy3标记的抗cTnT抗体(心肌肌钙蛋白T抗体(13-11)，从Invitrogen获得)及DAPI染色对心肌标志物肌钙蛋白T(cTnT)进行了免疫染色的心脏类器官的石蜡切片。该结果表明，心脏类器官在外层和内部之间包含cTnT阳性细胞的致密环。该致密环可以由cTnT阳性细胞(其是心肌细胞)组成。此外，在外层发现cTnT阳性细胞。
图8显示了使用CY3标记的抗CD31抗体(CD31，内皮细胞(浓缩)克隆JC70A，获自Agilent，Dako)用DAPI染色和针对CD31的免疫荧光染色的表达NKX2.5-eGFP的心脏类器官的全标本荧光显微照片。这表明心脏类器官在其内部含有内皮细胞。
此外，图8示出了在心肌环与内部之间的线，其可以示出内皮细胞的致密层，并且可以显示心内膜。可以将心脏类器官内的内皮细胞的网络结构视为形成原始血管网络。因此，一般而言，心脏类器官特别适合于分析测试化合物对心脏类器官的作用，例如在该方法期间添加测试化合物以分析测试化合物对心脏类器官的发育的影响，例如与在不添加测试化合物的情况下并行产生的心脏类器官比较。还可以就其对心脏类器官的原始血管网络的发育的影响对测试化合物进行测试，例如用于检测和分析测试化合物对血管发育的抑制或刺激作用。
图9显示了使用标记的抗SOX17抗体(获自R&D Systems的人SOX17抗体(AF1924))具有对SOX17进行免疫染色的切片中的心脏类器官的显微照片。本切片显示，心脏类器官内的内皮网络的内皮细胞为SOX17阳性。值得注意的是，SOX17阳性内皮细胞存在于发育中的胚胎的主动脉-性腺-中肾区域。SOX17不仅标记造血内皮，还标记前肠内胚层。在人类胚胎中，心脏靠近前肠内胚层发育，众所周知，前肠内胚层引起肺、肝、胸腺、甲状腺、食道和胃的间叶原基(anlagen)。因此，在心脏类器官中，包含心肌、心外膜和推定的心内膜间叶原基的“心脏”部分非常靠近SOX17阳性内部进行发育，这表明心脏类器官在其内部包含前肠内胚层间叶原基。
图10描绘了具有DAPI染色的心脏类器官的石蜡切片的显微照片。这表明，类器官在其内部的中央具有大的腔(通过绘制框突出显示)，而在外部的疏松组织中则具有小的血管样结构(如箭头所示)。
图11A和图11B的放大图示出了在光学显微镜中用甲苯胺蓝染色的，包埋在环氧树脂中的心脏类器官的半薄切片，而在图11C中通过电子显微镜放大。这些图片表明，在心脏类器官内部的大腔内衬有具有伪足的上皮(由图11C中的箭头指示)。
图12的电子显微照片显示在心脏类器官的大腔内发现的细胞。该细胞具有暗示巨噬细胞表型的形态。该发现支持心脏类器官的内部包含造血内皮。
实施例2：长期培养心脏类器官
在该方法的14天后，即在第10天，将根据实施例1产生的心脏类器官转移至含有PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4)的12孔板的孔中，通过抽吸除去PBS，并根据制造商的说明，通过添加从Corning获得的细胞回收液(Cell Recovery Solution)溶解基质胶。然后，用PBS轻轻洗涤类器官，除去PBS，并向每个孔中添加2mL具有B27补充剂并含有胰岛素的RPMI培养基，然后进一步温育板，其中每3至4天更换为新鲜培养基。将图13中所示的类器官保持在该培养物中直到第146天(即从步骤i开始的146天)，然后用Dil-AC-LDL(从ThermoFisher Scientific获得)染色。染色步骤：将DiI-Ac-LDL直接添加到培养基(RB+)中，终浓度为5μg/mL。在12孔板中以2mL的体积对类器官进行染色。与DiI-Ac-LDL温育：在培养箱中4小时。之后，除去具有DiI-Ac-LDL的培养基，并添加没有染料的新鲜培养基(RB+)。为了成像，用PBS代替培养基。图13的荧光显微照片显示该类器官仍含有内皮细胞并表达NKX2.5-eGFP。直到培养结束，心脏类器官显示为收缩。
图14A-14C示出了可以从分析结果得出的心脏类器官的结构的示意图。通过本发明的方法产生的心脏类器官包含第一层、第二层和第三层或由第一层、第二层和第三层组成，第一层包含或基本上由内皮细胞组成，该第一层首先形成内部并具有腔，该腔优选包含造血内皮和/或SOX17阳性细胞，第二层与第一层直接相邻并仅包围第一层的一部分，第二层形成致密的心肌，任选地也形成心内膜，第二层包含NKX2.5阳性心肌细胞或基本上由NKX2.5阳性心肌细胞组成，且第三层仅直接与第二层相邻且仅包围第二层的一部分，该第三层形成心外膜并包含心外膜细胞和心肌细胞或由心外膜细胞和心肌细胞组成，第三层具有血管样结构并由心外膜细胞和心肌细胞形成疏松组织，其中第三层被直接相邻的成纤维细胞层覆盖。图14D示出了包围其垂直轴旋转的心脏类器官。该类器官用DAPI染色，并在NKX2.5启动子的控制下表达eGFP。图14D表明心脏类器官是径向对称的，这意味着它们具有明显的正面(以0°示出)和背面(以180°示出；侧视图以90°示出)。
实施例3：测试测试化合物对心脏类器官的作用
作为示例性的测试化合物，沙利度胺用于测试其在生产方法期间对心脏类器官的发育的影响。根据实施例1产生心脏类器官，并在第1天(d1)，即在步骤i)中温育1天后，向培养基中添加80μg/mL沙利度胺。图15示出了与沙利度胺(80μg/mL沙利度胺)并行处理的7个心脏类器官的显微照片，以及并行但未添加(对照)测试化合物的三个心脏类器官的显微照片。
沙利度胺处理的心脏类器官与对照的显微照片的比较清楚表明，沙利度胺导致外层不存在任何NKX2.5-eGFP阳性细胞，而沙利度胺处理的心脏类器官的心肌环比对照薄得多。对照心肌环的平均直径为276μm，沙利度胺为165μm，其结果也如图16中所示。
示例性测试化合物上的结果表明，在根据本发明的方法的心脏类器官的发育中也看到了沙利度胺在胚胎发育期间还引起心脏畸形的已知作用。这表明，产生心脏类器官的方法适于体外测定测试化合物的作用，例如关于致畸作用。
实施例4：由遗传异常的PSC体外产生心脏类器官
作为带有遗传异常的PSC的实例，使用了人类胚胎干细胞系HES3NKX2.5eGFP/eGFP，其中两个NKX2.5基因均功能异常(敲除，NKX2.5-KO)，并且不表达功能性NKX2.5蛋白，但在NKX2.5启动子的控制下表达eGFP(增强型绿色荧光蛋白)作为标志物。如Anderson DJ等人“NKX2-5 regulates human cardiomyogenesis via a HEY2 dependent transcriptionalnetwork”,Nature Communications 2018,9:1373所述生产该细胞系。
为了进行比较(对照)，通过相同的方法从表达正常水平的NKX2.5蛋白且另外含有在NKX2.5启动子下编码eGFP的表达盒的细胞系中产生心脏类器官。
通过本发明的方法产生来自遗传异常的NKX2.5-KO PSC以及来自对照的心脏类器官，如实施例1中所述。图17至21示出了与对照心脏类器官相比的NKX2.5-KO心脏类器官的分析结果，二者均在NKX2.5启动子的控制下表达eGFP。
图17描绘了NKX2.5-KO和对照的三个示例性心脏类器官的荧光显微照片(比例尺为500μm)，显示了携带NKX2.5-KO的心脏类器官比对照心脏类器官大。使用ImageJ软件从图片中定量测量出心脏类器官所占的总面积。测量结果示于图18中，表明NKX2.5-KO的心脏类器官明显更大。
图19和20描绘了在光学分析期间用于确定致密性表型的荧光显微照片中的示例性心脏类器官。如图19中所示，光学隔离心肌环，并且如图20中所示，确定环区域中eGFP阳性的面积。将eGFP阳性环区域的面积除以确定的心肌环的总面积，结果如图21中所示。使用ImageJ软件(Wayne Rasband)进行定量光学分析。图21中描绘的结果表明，与NKX2.5-KO心脏类器官的心肌环相比，对照心脏类器官的心肌环显得更紧密和密实。使用GraphPadPrism 7软件应用学生t检验对图21的结果进行统计分析，心脏类器官：对照组n＝5，NKX2.5-KO n＝5。
这些结果强烈地让人联想到在小鼠和人类中针对NKX2.5缺陷所描述的肌肉过度生长和缺乏心肌组织紧实，这表明根据本发明由PSC生产的心脏类器官具有遗传畸变，其非常类似于体内观察到的心脏发育，并显示出与体内遗传变异观察到的结构畸变相似的结构畸变。
实施例5：体外产生心脏类器官
通过本发明的方法，使用两种不同的报告细胞系产生心脏类器官，其中通过表达GFP作为报告物揭示了源自造血内皮的造血细胞的形成，其表达受造血细胞特异性细胞标志物基因RUNX1C(Runt相关转录因子1c)的控制，细胞系HES3 RUNX1C-GFP或WAS(Wiskott-Aldrich综合征)，iPS细胞系WAS-GFP。
图22的荧光显微镜图描绘了在步骤h)中添加分化培养基(d5)后第5天的示例性心脏类器官，该图是在RUNX1C启动子的控制下由表达GFP的PSC产生的。
图23的荧光显微照片描绘了在步骤h)中添加分化培养基后第3天(d3)和第5天(d5)的示例性心脏类器官，该图是在WAS启动子的控制下由表达GFP的PSC产生。
对于这两种细胞系，GFP的在心脏类器官的内部的表达表明在本发明的方法期间在心脏类器官的内部中包含有造血内皮。这表明通过本发明的方法产生的心脏类器官在其内部含有造血内皮，其由最初用于该方法的PSC发育而来。已知造血内皮是造血的起源。
实施例6：体外产生心脏类器官以及分析内皮细胞
如实施例1中所述产生心脏类器官，并分析内皮细胞的存在。用内皮细胞特异性抗CD31抗体(CD31，从Agilent，Dako获得的克隆JC70A；二抗：从Jackson ImmunoResearchLaboratories获得的Cy3-AffiniPure驴抗小鼠IgG(H+L))染色石蜡包埋的心脏类器官。图24示出了该分析的荧光显微照片，其中图24a的虚线包围了固定的示例性心脏类器官的正面部分。图24b描绘了图24a中突出显示的正方形的放大。在该实施例中，不是所有的腔都衬有CD31阳性细胞。在图24b中，实线箭头指向衬有内皮细胞的腔，而虚线箭头表示没有CD31阳性染色的其他腔。
内皮细胞的阳性染色(由亮白色染色的细胞表示)支持了以下发现：本发明的心脏类器官含有类似于血管样结构的内皮内衬的腔。
后来发现，使用从eBioscience获得的标记抗CD144抗体人CD144抗体BMS158对内皮标志物血管内皮钙粘蛋白(VE钙粘蛋白或CD144)进行免疫染色的初始检测不仅检测血管样结构，而且还提供假阳性信号。
如实施例1所述，由NKX2.5-KO PSC和野生型PSC(对照)生产心脏类器官。图25(完全比例尺为1000nm)显示了NKX2.5-KO和对照类器官中心肌细胞中肌节的透射电子显微镜照片。根据Kasahara等人(2001，上述引用文中)的发现，例如对于小鼠胚胎和新生小鼠，由NKX2.5-KO细胞产生的本发明的心脏类器官以及由野生型PSC产生的对照类器官含有组织良好的(黑色箭头)以及杂乱无章的肌节。
图26显示了用抗Ki67抗体(Thermo Scientific)染色的由NKX2.5-KO和野生型(对照)PSC产生的心脏类器官的石蜡切片。抗Ki67抗体标记增殖细胞。Ki67阳性细胞显示为黑点，而阴性细胞显示为浅灰色。结果表明，在NKX2.5-KO和对照类器官中，内部(ip)和外部(op)的细胞均具有增殖性，而心肌环(mr)的大多数细胞均不增殖(Ki67阴性)。值得注意的是，NKX2.5-KO类器官表现出明显的高度增殖性外部，表明与对照相比，这些类器官的直径增大(例如相对于图18中的定量评估，其至少部分地是由于外部明显的细胞增殖引起的，其中以钙调理蛋白和波形蛋白阳性的成纤维细胞(也见图5和图25)、心肌细胞和心外膜细胞(图6A，图7)为主。
此外，根据本发明的方法从HES3 MIXL1-GFP报告细胞系生产心脏类器官。在该细胞系中(先前由Davis等人描述，Blood 2008)，GFP在标定中内胚层(mesendodermal)祖细胞的MIXL1基因启动子的控制下表达。本发明的这些心脏类器官表明，在分化早期(第1天至第4天)很容易通过MIXL1-GFP类器官的GFP模式反映出环状结构，其对于HES3 NKX2.5-eGFP报告细胞系生成的心脏类器官而言是典型的(另见图3)。如图27中所示的分化的第1天(d1)、第2天(d2)、第3天(d3)和第4天(d4)的显微分析(比例尺500μm)表明心脏类器官中MIXL1-GFP的表达在分化的第2天达到最大，且此后下降。MIXL1-GFP阳性细胞的环状结构在分化的第1天和第2天覆盖类器官的外部。在分化的第3天和第4天，MIXL1-GFP阳性细胞的环状结构受到外部和内部核心中MIXL-GFP阴性细胞的限制。
Claims (24)
1.一种体外产生心脏类器官的方法，包括
a)提供在第一培养基的悬浮液中培养的多能干细胞(PSC)，其中所述第一培养基是补充有10μM ROCK抑制剂的E8培养基，
b)在具有U形底部的第一容器中离心所述PSC，以使所述PSC位于所述第一容器的底部，
c)在细胞培养条件下并且没有搅拌的情况下，在所述第一培养基下温育所述位于所述第一容器底部的所述PSC 24小时，以形成一个细胞聚集物，
d)任选地从位于所述第一容器底部的所述PSC中除去所述第一培养基，
e)将所述PSC的聚集物包埋在水凝胶内，
f)温育包埋在所述水凝胶内的所述PSC以固化所述水凝胶，
g)用第二细胞培养基覆盖包埋在所述固化的水凝胶中的所述细胞，并在细胞培养条件下进行温育，其中所述第二细胞培养基是不具有ROCK抑制剂的E8培养基，
h)从所述细胞中去除所述第二培养基，并添加第三细胞培养基，并在细胞培养条件下温育24小时，其中所述第三培养基是含有无胰岛素的B27补充剂的RPMI培养基，且另外含有具有诱导WNT途径的活性的第一分化因子，并且所述第一分化因子是CHIR99021，
i)从所述细胞中除去所述第三培养基，并添加第四细胞培养基，并在细胞培养条件下温育2天，其中所述第四细胞培养基是含有无胰岛素的B27补充剂的RPMI培养基，
j)从所述细胞中除去所述培养基，并添加第五细胞培养基，并在细胞培养条件下温育48小时，其中所述第五细胞培养基是含有无胰岛素的B27补充剂的RPMI培养基，并含有具有抑制WNT途径的活性的第二分化因子，并且所述第二分化因子是IWP-2，
k)从所述细胞中除去所述第五培养基，并添加不含胰岛素且不含具有诱导或抑制WNT途径的活性的分化因子的第六培养基，并在细胞培养条件下温育2天，
l)从所述细胞中去除所述第六培养基，并添加第七细胞培养基，并在细胞培养条件下温育至少1天到至多3天，其中所述第七细胞培养基是含有添加胰岛素的B27补充剂的RPMI培养基，
m)并且然后至少每2天将所述第七培养基换为新鲜细胞培养基，其中所述新鲜细胞培养基是新鲜的第七细胞培养基。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤a)至m)中的温育在基本静态的条件下。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，在步骤e)中，将水凝胶置于第二容器中，并将聚集的PSC从所述第一容器转移到所述水凝胶中，以将PSC的聚集物包埋在所述水凝胶内。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，在步骤g)中，将包埋在所述固化的水凝胶中的所述PSC与第二细胞培养基一起温育2天。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于在以下步骤的至少一个中：步骤h)中所述第三培养基含有无胰岛素的B27补充剂，步骤i)中所述第四培养基含有无胰岛素的B27补充剂，步骤j)中所述第五培养基含有无胰岛素的B27补充剂，步骤k)中所述第六培养基含有无胰岛素的B27补充剂，和步骤1)中所述第七培养基含有包含胰岛素的B27补充剂。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于在步骤h)后至少1天之后，将至少一种测试化合物添加到所述培养基中，并且在温育之后，分析所述类器官，并与不添加所述测试化合物并行处理的类器官进行比较。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于在步骤1)或m)之一之后溶解所述水凝胶。
8.根据权利要求1的方法，其特征在于，将测试化合物添加到所述方法的至少一种培养基中，并与在不添加所述测试化合物的情况下进行的并行方法中产生的心脏类器官相比分析所述心脏类器官。
9.根据权利要求8的方法，其中分析所述心脏类器官的细胞类型的结构和/或位置。
10.根据权利要求8或9的方法，其中分析所述心脏类器官内的内皮细胞的网络结构。
11.根据权利要求1的方法，其特征在于所述PSC具有遗传畸变。
12.通过根据前述权利要求中任一项的方法能获得的心脏类器官，其特征在于，所述类器官具有形成内部并具有腔的第一层，所述第一层至少部分地被包含内皮细胞和心肌细胞的第二层包围，所述第二层至少部分地被包含心肌细胞和心外膜细胞的第三层包围，所述第三层至少部分地被包含成纤维细胞的第四层包围。
13.根据权利要求12的心脏类器官，其特征在于，所述第一层完全包围所述腔并且在周向上闭合，所述第二层仅部分包围所述第一层，并且所述第三层仅包围所述第二层，并且所述第四层仅包围所述第三层。
14.根据权利要求12或13的心脏类器官，其特征在于，所述内皮细胞形成心内膜。
15.根据权利要求12的心脏类器官，其特征在于，所述心肌细胞形成心肌。
16.根据权利要求12的心脏类器官，其特征在于，所述内部的腔含有前肠内胚层、血管和造血内皮。
17.根据权利要求12的心脏类器官，其特征在于，其含有造血内皮。
18.根据权利要求12的心脏类器官，其特征在于，其含有前肠内胚层。
19.根据权利要求12的心脏类器官，其特征在于，其含有血管。
20.根据权利要求12的心脏类器官，其特征在于，其通常具有球形，其中所述外表面由所述第一层的一部分、所述第二层的一部分以及整个第三层和/或第四层形成。
21.根据权利要求12的心脏类器官，其特征在于，其具有范围为1.2mm至2.5mm的外径。
22.根据权利要求12的心脏类器官，其用作治疗患者的植入物。
23.用于分析至少一种测试化合物对心脏细胞的生物学作用的方法，所述方法包括使根据权利要求12至21中任一项的心脏类器官与所述测试化合物接触，在所述测试化合物的存在下温育所述心脏类器官，并分析所述心脏类器官。
24.根据权利要求23的方法，其中分析所述心脏类器官的细胞类型的结构和/或位置。
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| US20230101335A1 (en) | 2021-05-06 | 2023-03-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Ex vivo tissue explant and graft platform and uses thereof |
| CN113234668A (zh) * | 2021-05-07 | 2021-08-10 | 华夏源细胞工程集团股份有限公司 | 一种诱导iPS细胞分化的培养基及培养方法 |
| KR102678908B1 (ko) * | 2021-05-10 | 2024-07-01 | (주) 넥셀 | 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법 및 이를 통해 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 |
| KR20230067138A (ko) * | 2021-11-09 | 2023-05-16 | 고려대학교 산학협력단 | 다능성 줄기세포 유래 성숙한 심혈관 오가노이드 제조 방법 |
| CN114958728A (zh) * | 2022-02-17 | 2022-08-30 | 同济大学 | 一种利用自组装肽培养心脏类器官的方法及心脏类器官 |
| CN114438021A (zh) * | 2022-02-18 | 2022-05-06 | 深圳市人民医院 | 一种基于人多能干细胞构建心脏类器官的方法 |
| EP4249585A1 (en) * | 2022-03-25 | 2023-09-27 | Technische Universität München - TUM | Heart tissue models, method of producing heart tissue models and uses of heart tissue models |
| WO2023230603A2 (en) * | 2022-05-26 | 2023-11-30 | Trustees Of Tufts College | Systems and methods for making biological robots |
| WO2023242346A1 (en) | 2022-06-15 | 2023-12-21 | Imba - Institut Für Molekulare Biotechnologie Gmbh | Multiple heart tissue culture fusion |
| EP4310177A1 (en) | 2022-07-19 | 2024-01-24 | Medizinische Hochschule Hannover | Process for producing organoids from mammalian cells |
| WO2024017538A1 (en) | 2022-07-19 | 2024-01-25 | Medizinische Hochschule Hannover | Process for producing organoids from mammalian cells |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170141995A (ko) * | 2016-06-16 | 2017-12-27 | 한국화학연구원 | 세포 외 미세환경 기반의 wnt 신호 조절을 이용한 줄기세포의 심근세포로의 분화방법 |
| WO2018035574A1 (en) * | 2016-08-26 | 2018-03-01 | The University Of Queensland | Cardiomyocyte maturation |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG10201910753RA (en) * | 2013-09-20 | 2020-01-30 | Repairon Gmbh | A method to direct differentiation of pluripotent stem cells into functional heart muscle |
| WO2015058117A1 (en) * | 2013-10-18 | 2015-04-23 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Directed cardiomyocyte differentiation and ventricular specification of stem cells |
| US9587221B2 (en) * | 2013-11-11 | 2017-03-07 | Auburn University | Encapsulation and cardiac differentiation of hiPSCs in 3D PEG-fibrinogen hydrogels |
-
2018
- 2018-03-13 EP EP18161619.4A patent/EP3540046A1/en not_active Withdrawn
-
2019
- 2019-02-20 EP EP19704845.7A patent/EP3765599B1/en active Active
- 2019-02-20 CN CN201980028539.9A patent/CN112041429B/zh active Active
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- 2019-02-20 US US16/980,200 patent/US20210017496A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170141995A (ko) * | 2016-06-16 | 2017-12-27 | 한국화학연구원 | 세포 외 미세환경 기반의 wnt 신호 조절을 이용한 줄기세포의 심근세포로의 분화방법 |
| WO2018035574A1 (en) * | 2016-08-26 | 2018-03-01 | The University Of Queensland | Cardiomyocyte maturation |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Concise Review: Growing Hearts in the Right Place: On the Design of Biomimetic Materials for Cardiac Stem Cell Differentiation;YOHAN FAROUZ等;《Stem Cells》;20141224;第33卷;1021-1035 * |
| Self-organizing human cardiac microchambers mediated by geometric confinement;Zhen Ma等;《Nature Communications》;20150714;第6卷;1-10 * |
| 起源于小鼠诱导性多能干细胞的大脑皮质类器官的建立及其生物学特性;范文娟等;《解剖学报》;20170806(第04期);388-389 * |
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