WO2023074850A1 - 細胞剥離液及び細胞剥離方法、細胞保存方法 - Google Patents

細胞剥離液及び細胞剥離方法、細胞保存方法 Download PDF

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cell
cell detachment
detachment solution
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信介 望月
舞 加藤
圭一郎 椿
史子 戸松
文生 山内
健吾 金崎
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キヤノン株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a cell detachment solution, a cell detachment method, and a cell preservation method.
  • the cells of interest are obtained through the steps of culturing the cells on a culture substrate such as a polystyrene dish, detaching the cells from the substrate, collecting and washing the cells. .
  • a so-called passaging operation is performed in which a portion of the obtained cells is transferred to a new base material and cultured.
  • the detachment step of detachment of cells from the substrate is a barrier to efficient and stable supply of cells.
  • Patent Document 1 discloses a method of peeling off cells from a cell-attached surface by turning a culture vessel to which cells cultured using a medium are attached and applying ultrasonic vibration to the culture vessel from the outer surface of the culture vessel.
  • Patent Document 2 discloses a cell detachment device that applies ultrasonic waves to a container holding cells and a medium or liquid to detach at least part of the cells from the container.
  • the present inventors have found a problem with the above prior art. That is, when handling cells that are difficult to detach, such as cells that have a strong adsorption force to a container, detachment under ultrasonic vibration conditions with a high detachment efficiency may reduce the viability of the cells.
  • the present invention provides a cell detachment solution that is used for cell detachment using ultrasonic waves and that increases both the survival rate and detachment rate of cells, a cell detachment method using the same, and a cell preservation method. intended to provide
  • the cell detachment solution according to the present invention is a cell detachment solution used for detaching cells from a substrate by applying ultrasonic vibrations to the cells provided on the substrate.
  • the cell detachment solution has a polymer containing a polyalkylene glycol structure.
  • the cell detachment solution according to the present invention not only increases both the survival rate and detachment rate of cells during cell detachment using ultrasonic waves, It is possible to provide a cell preservation method for simply and effectively preserving .
  • FIG. 4 is a flow chart showing an example of the flow of a method for preserving cells according to the present embodiment.
  • 1 is a conceptual diagram of a cell storage device according to this embodiment; FIG.
  • a cell detachment solution according to an embodiment of the present invention will be described below.
  • the detachment liquid according to the present embodiment is a cell detachment liquid used for detaching cells provided on a substrate from a substrate by vibrating the cells with ultrasonic waves.
  • the cell detachment liquid has a polymer containing a polyalkylene glycol structure.
  • the cell detachment rate and the cell survival rate can be increased when the cells are detached by applying ultrasonic vibration.
  • the cells to be detached may be single cells, aggregates of a plurality of cells, or cells cultured in a sheet (cell sheet) (hereinafter the same).
  • the cell detachment solution according to the present embodiment contains a polymer containing a polyalkylene glycol structure, it is possible to increase the viability of cells. The possible reasons for this are described in detail.
  • the vibrations are applied to the cells, and the cells may be damaged.
  • the polymer containing the polyalkylene glycol structure in the cell detachment solution is adsorbed to the cell membrane, part of the vibrational energy is transmitted to the polymer, and large vibrations can be prevented from being transmitted to the cells.
  • a polymer containing a polyalkylene glycol structure is hydrophilic (it can also be called a hydrophilic polymer) because it contains a polyalkylene glycol structure, and oxygen in the polyalkylene glycol structure easily adsorbs to cell membranes. Therefore, it is speculated that as a result, the effect of protecting cells increases.
  • polymers containing a polyalkylene glycol structure include polyethylene glycol, polypropylene glycol, polybutylene glycol, copolymers containing these as partial structures, polyethylene glycol dimethyl ether, polyethylene glycol lauryl ether, and polypropylene glycol butyl ether. and derivatives such as When the polymer is a copolymer, the content of the polyalkylene glycol structure is preferably 90% by mass or more.
  • polyethylene glycol is more preferably used.
  • polyethylene glycol may be referred to as PEG (polyethylene glycol).
  • a polymer containing a polyalkylene glycol structure may be linear or have a branched structure.
  • the polymer containing a polyalkylene glycol structure used in the present embodiment preferably has a peak molecular weight Mp of 800 or more and 50,000 or less, more preferably 1,200 or more and 20,000 or less, as measured by gel permeation chromatography. This is because when the Mp of the polymer is 800 or more, the polymer does not permeate into cells, and when it is 50,000 or less, there is little repulsion between polymer molecules and the polymer can stably exist around the cell membrane.
  • a method for adjusting the molecular weight of the polymer a known method can be used. Specifically, the molecular weight can be arbitrarily adjusted by adjusting the charge ratio of each monomer, the polymerization time, the selection of the catalyst, and the like.
  • the amount of polymer relative to the total mass of the cell detachment solution is preferably 0.03% by mass or more and 20.0% by mass or less, and is preferably 0.05% by mass or more and 5.0% by mass or less. more preferred. This is because when the amount is 0.03% by mass or more, a sufficient cell-protecting effect is obtained, and when the amount is 20.0% by mass or less, aggregation between cells is less likely to occur.
  • the cell detachment solution in this embodiment preferably does not substantially contain protease.
  • substantially free of protease means that the amount of protease relative to the total mass of the cell detachment solution is 0.0005% by mass or less. More preferably, it does not contain proteolytic enzymes. The reason is described below.
  • proteolytic enzymes such as trypsin are widely used for cell detachment.
  • a proteolytic enzyme is allowed to act to degrade the proteins involved in the binding between the cells and the substrate, and then the cells are completely detached by operations such as tapping and pipetting.
  • operations such as tapping and pipetting vary greatly depending on the skill level of the person, and there is a problem in terms of stable supply. That is, it can be said that proteolytic enzymes decompose a part of the cells, so that the exfoliation rate can be increased, but on the other hand, there is a possibility that the quality of the cells is decreased (cell viability is decreased).
  • the cell detachment solution in this embodiment preferably does not substantially contain divalent cations.
  • substantially free of divalent cations means that the concentration of divalent cations in the cell detachment solution is 0.05 ⁇ M or less. More preferably, the cell detachment solution according to this embodiment does not contain divalent cations. This is to weaken the action of divalent cation-dependent adhesive proteins such as integrins, thereby making it easier to increase the detachment rate.
  • it preferably contains a chelating agent in order to actively remove the divalent cation from the adhesive protein.
  • the content of the chelating agent is preferably 0.01 mM or more and 5.0 mM or less. Within this range, a chelating effect can be easily obtained, and a decrease in activity due to the presence of an excessive amount of the chelating agent can be reduced.
  • the pH of the cell detachment solution in this embodiment is preferably in the neutral range. This is because the neutral region is suitable for cell culture and can stably maintain a high cell viability.
  • the pH can be appropriately adjusted with hydrochloric acid, sodium hydroxide, or the like.
  • Various buffers are preferably used to keep the pH stable.
  • the viscosity of the cell detachment solution in this embodiment is preferably 1.80 mPa ⁇ s or less. This is because the flow of the stripping liquid generated by the ultrasonic vibration is not hindered and the stripping rate can be kept high.
  • the viscosity of the cell detachment solution can be appropriately adjusted depending on the molecular weight of the polymer, the amount added, and the like.
  • the protease is, for example, a substance that decomposes a part of cells to make it easier to detach the cells from the base material.
  • examples include trypsin, accutase, collagenase, natural protease, chymotrypsin, elastase, papain, pronase, or recombinants thereof.
  • Divalent cations in this embodiment include Ca 2+ , Mg 2+ , Zn 2+ , Co 2+ , Ni 2+ , Mn 2+ and the like.
  • Adhesive proteins such as integrins are particularly highly dependent on Ca 2+ and Mg 2+ , so the cell detachment solution according to this embodiment preferably does not substantially contain Ca 2+ and Mg 2+ .
  • substantially free means that the concentration of Ca 2+ and Mg 2+ in the cell detachment solution is 0.05 ⁇ M or less. More preferably, the cell detachment solution according to this embodiment does not contain Ca 2+ and Mg 2+ .
  • the buffer solution in this embodiment can be used without limitation as long as it can maintain a neutral region.
  • Tris buffer such as Tris-HCl buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, citric acid-phosphate buffer, glycylglycine-sodium hydroxide buffer, Britton-Robinson buffer, GTA buffer, etc. is mentioned.
  • a phosphate buffer close to the in vivo environment is preferable, and a phosphate buffered saline (PBS) adjusted to be isotonic with the intracellular fluid is more preferably used as the phosphate buffer.
  • PBS phosphate buffered saline
  • PBS(-) that does not contain divalent cations such as Ca 2+ and Mg 2+ .
  • the chelating agent in the present embodiment is not particularly limited. Dicarboxymethylglutamic acid, ethylenediamine disuccinic acid, etidronic acid, citric acid, gluconic acid, phosphonobutanetriacetic acid and the like can be mentioned. Among these, a chelating agent that forms a chelate with a divalent cation is preferred, a chelating agent that forms a chelate with Ca 2+ and Mg 2+ is particularly preferred, and ethylenediaminetetraacetic acid is most preferred.
  • the pH of the cell detachment solution is preferably 7.0 or more and 8.0 or less. This is because the chelating ability of ethylenediaminetetraacetic acid can be enhanced and the detachment rate can be further increased by having a higher pH in the neutral region where the cell viability can be kept high. .
  • the chelating agent may be used singly or in combination of two or more.
  • the substrate in the present embodiment may be any material as long as it is chemically stable and capable of culturing desired cells.
  • Examples include polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polystyrene, polyvinyl chloride, nylon, polyurethane, polyurea, and polylactic acid. , polyglycolic acid, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, poly(meth)acrylic acid, poly(meth)acrylic acid derivatives, polyacrylonitrile, poly(meth)acrylamide, poly(meth)acrylamide derivatives, polysulfone, cellulose, cellulose derivatives, Examples include polysilicone, polymethylpentene, glass, and metal. Among these, polystyrene is preferred. Note that the base material is sometimes called a dish.
  • the cells in this embodiment are not particularly limited as long as they can be adherently cultured on a cultureware in vitro.
  • Chinese hamster ovary-derived CHO cells mouse connective tissue L929 cells, mouse skeletal muscle myoblasts (C2C12 cells), human fetal lung-derived normal diploid fibroblasts (TIG-3 cells), human embryonic kidney-derived cells (HEK293 cells), human alveolar basal epithelial adenocarcinoma-derived A549 cells, human cervical carcinoma-derived HeLa cells, and various other cultured cell lines, for example, epithelial cells and endothelial cells that make up each tissue and organ in vivo, contractility skeletal muscle cells, smooth muscle cells, cardiomyocytes, neuronal cells that make up the nervous system, glial cells, fibroblasts, hepatic parenchymal cells, non-hepatic non-parenchymal cells and adipocytes that are involved in the metabolism of the body, and have differentiation potential
  • the type of medium is not particularly limited, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Ham's Nutrient Mixture F12, DMEM/F12 medium, McCoy 5A medium (McCoy 's 5A medium), Eagle MEM medium (Eagles's Minimum Essential Medium; EMEM), ⁇ MEM medium (alpha Modified Eagles's Minimum Essential Medium; ⁇ MEM), MEM medium (Minimum Essential M edium), RPMI1640 medium, Iscove's modified Dulbecco's medium (Iscove's Modified Dulbecco's Medium; IMDM), MCDB131 medium, William medium E, IPL41 medium, Fischer's medium, StemSpan H3000 (manufactured by Stem Cell Technology), StemSpan SFEM (manufactured by Stem Cell Technology), Stemline II (Sigma Aldrich) ), Endothelial Cell Growth Medium 2 Kit (manufactured by DMEM), Ham
  • a medium suitable for culturing each cell For example, Ham's F12 medium is preferably used for CHO cell culture, and DMEM/F12 medium is preferably used for C2C12 cells.
  • Serum and antibiotics may be added to the above medium.
  • serum examples include fetal bovine serum (FBS), fetal bovine serum, adult bovine serum, horse serum, sheep serum, goat serum, pig serum, chicken serum, rabbit serum, and human serum.
  • FBS is commonly used due to its availability. It may also be a serum-free medium containing purified blood-derived components or animal tissue-derived components (growth factors, etc.) without containing untreated or unpurified serum.
  • antibiotics added to the medium include penicillin, streptomycin, ampicillin, carbenicillin, tetracycline, bleomycin, actinomycin, kanamycin, actinomycin D, amphotericin B, and the like.
  • Cell culture conditions can be appropriately selected according to the cells to be cultured. In general, an appropriate medium is added to the dish, cells are seeded there at about 1.0 ⁇ 10 1 to 5.0 ⁇ 10 4 cells/cm 2 , and the culture is performed at 37° C. under a CO 2 concentration of 5%. Cultivate under environmental conditions. At this time, it is preferable to culture until the cell occupied area ratio in the base material reaches about 70 to 80%, that is, a so-called subconfluent state.
  • ultrasonic vibrations may be vibrations having a frequency of about 10 kHz to 1 MHz, as described in International Publication No. 2016-047368.
  • the vibration generating means can be used without particular limitation as long as it is a means capable of applying ultrasonic vibrations to cells.
  • an ultrasonic oscillator such as lead zirconate titanate (PZT) can be mentioned.
  • a vibrator can be brought into direct contact with the outer surface of a sealed culture container filled with a medium to vibrate the culture container.
  • an ultrasonic transmitter is placed between the ultrasonic irradiation means and the area to be treated. can be interposed to allow ultrasonic waves to enter cells to be detached.
  • the cell detachment method in this embodiment includes at least the following steps.
  • First step> A step of preparing a base material provided with cells and a cell detachment solution provided in contact with the cells and the base material.
  • ⁇ Second step exfoliating the cells from the base material by applying ultrasonic vibrations to the cells
  • the cell detachment method according to the present embodiment may include a step of applying an external stimulus such as convection to the culture solution in addition to the above steps.
  • an external stimulus such as convection
  • Examples of methods for generating convection in the culture solution include pipetting, using a pump, and stirring blades.
  • the environmental temperature during the second step is preferably 30.0° C. or higher and 37.5° C. or lower. This is because the temperature at the time of detachment is close to the temperature at the time of culture, the influence of temperature change on the cells can be reduced, and the survival rate can be kept high.
  • a stripping solution having a divalent cation concentration of 0.05 ⁇ M or less the divalent cations bound to the adhesive protein are easily detached due to the above temperature range, and the stripping rate increases.
  • the cell detachment method according to this embodiment may include a step of preserving cells in addition to the above steps.
  • the cell preservation method in this embodiment includes at least the following steps.
  • Step 1 is a step of contacting the cells with a cell detachment solution that does not substantially contain degrading enzymes according to the present embodiment.
  • a cell detachment solution that does not substantially contain degrading enzymes By contacting the cells with a cell detachment solution that does not substantially contain degrading enzymes, the bonding between cells and the adhesive force between cells and substrates are reduced.
  • Step 2 is a step of exfoliating the cells from the substrate by applying ultrasonic vibrations to the cells.
  • Step 3 is a step of preserving the cells detached in step 2 in the cell detachment solution.
  • preserving the cells means that the cells are present in the cell detachment solution in a living state, and the cells are left alive for at least 1 hour or more, and then It means an act performed with the intention of using the cell again.
  • the method for preserving cells of this embodiment is characterized by detaching cells by applying ultrasonic vibration to the cells using a cell detachment solution, and then preserving the cells in the cell detachment solution. That is, the cells can be stored as they are after being detached, but various additives can be added to the cell detachment solution after detachment to enhance the preservation effect. Additives that enhance the preservation effect include at least one selected from the group consisting of sugars, serum, and antibiotics.
  • Cells in this embodiment can be preserved by suspending them in a cell detachment solution.
  • the cell concentration during storage can be appropriately selected depending on conditions such as cell type, cell size, and storage period of cells.
  • the number of cells can be in the range of 100000000 or less, and can be 100000 or more and 10000000 or less.
  • the storage period of cells according to the cell storage method of the present embodiment depends on conditions such as cell type, storage temperature, composition of cell detachment solution, and cell concentration, but is preferably in the range of about 1 hour or more and 10 days or less. 6 hours or more and 7 days or less.
  • the cell storage temperature in the cell storage method of the present embodiment is a non-freezing temperature, specifically, a temperature higher than 0 ° C. and 30 ° C. or lower, from the viewpoint that living cells can be stored and reused for culturing as they are.
  • a range is preferred. Preferably, it is in the range of 1°C or higher and 10°C or lower.
  • a cryoprotectant may be added to the cell detachment solution after detaching the cells.
  • a storage temperature of 2° C. or higher and 8° C. or lower is particularly preferable in terms of suppressing the metabolic activity of cells during storage.
  • the cell storage temperature in the present embodiment can be the set temperature of the refrigerator for storing the cells.
  • a specific example of preservation is the method of preservation when transporting adherent cells from a culture facility to a medical institution.
  • the storage period is 2 to 3 days, and the temperature is in the range of 2 to 8°C.
  • a known container can be used depending on the cell type, storage temperature, usage of the cells after storage, and the like.
  • Polypropylene or polyethylene tubes are preferably used from the viewpoints of airtightness, cytotoxicity, sterility, and the like.
  • the device for cell preservation is not particularly limited as long as it can stably set the container for cell preservation and achieve the above preservation temperature.
  • Examples include an incubator and a refrigerator. be able to.
  • This embodiment includes a method of culturing cells using a normal cell growth medium using cells that have been preserved in a cell detachment solution.
  • the cells stored according to the above can be redispersed in a normal cell growth medium, seeded on a culture substrate, and cultured. good. Cultivation can also be performed by seeding the cell detachment solution containing cells as it is in a normal cell growth medium.
  • the cell concentration for resuming culture varies depending on the cell type, but can be, for example, the cell concentration at the time of cell passage.
  • a cell storage device is a cell storage device that removes, collects, and stores adherent cells cultured on a base material, and includes a medium exchange unit, an ultrasonic irradiation unit, and a cell storage unit. have.
  • the replacement part is configured to add a cell detachment solution to the base material to which the cells are adhered so as to bring the cells and the cell detachment solution into contact with each other.
  • the ultrasonic irradiation unit is configured to apply ultrasonic vibrations to the cells.
  • the cell storage unit is configured to store the cells separated from the base material at a constant temperature.
  • FIG. 1 shows an example of the flow of the cell preservation method according to this embodiment.
  • the above step 1 includes a step S10 of adding a cell detachment solution (also a cell preservation solution) to the culture vessel, and incubating and maintaining the cells for a predetermined time while the cells are in contact with the cell detachment solution (also a cell preservation solution). including step S20.
  • the step 2 includes a step S30 of applying ultrasonic vibrations to detach cells from the substrate, and further recovering a cell detachment solution (also a cell preservation solution) containing cells detached from the substrate.
  • a step S40 may be included.
  • step 3 includes S50 of storing a cell detachment solution (also a cell preservation solution) containing detached cells.
  • the flow of the cell preservation method according to this embodiment may further include a step of observing the state of the cells.
  • a cell storage device is a cell storage device that removes, collects, and stores adherent cells cultured on a base material, and includes a medium exchange unit, an ultrasonic irradiation unit, and a cell storage unit. have.
  • the replacement part is configured to add a cell detachment solution (cumulative cell preservation solution) to the base material to which the cells are adhered so that the cells and the cell detachment solution (cumulative cell preservation solution) are brought into contact with each other.
  • the ultrasonic irradiation unit is configured to apply ultrasonic vibrations to the substrate and the cells.
  • the cell storage unit is configured to store the cells separated from the base material at a constant temperature.
  • the culture substrate movement control section 40 is a unit that holds and moves the culture substrate 44 .
  • the culture substrate movement control unit 40 may include a heat insulator for controlling the temperature and humidity of the environment in which the cells are detached from the substrate. A unit and a humidification unit are illustrated. An XYZ motorized stage, for example, is used to move the culture substrate 44 .
  • the culture substrate movement control unit 40 horizontally moves the culture substrate 44 between positions P4, P5, and P6. At position P4, an image of cells cultured within the culture substrate 44 can be acquired. At the position P5, the inside of the culture substrate 44 is irradiated with ultrasonic waves by the ultrasonic irradiation unit 1S. Also, at position P6, the pipetting unit 45 collects the solution in the culture substrate 44 or adds various solutions to the culture substrate 44 .
  • the culture substrate 44 When it is time to culture the cells on the culture substrate 44 and detach the cells, the culture substrate 44 is placed at the position P6.
  • the culture substrate movement control unit 40 can be used to appropriately place the culture substrate 44 at the position P4, and the state of the cells can be observed by the cell observation unit 43 . Cells adhere to the culture substrate 44 placed at the position P6.
  • the medium in the culture substrate 44 is recovered by the pipetting unit 45 at the position P6.
  • the collected culture medium is discarded to the waste liquid collecting section 47 at position P9.
  • Various media are stocked in a washing medium 50 , a culture medium 51 , and a cell detachment solution (cumulative cell preservation solution) 52 , and transported to the pipetting part 45 by the liquid transport control part 53 .
  • the pipetting part 45 can be moved vertically to access the culture substrate 44 .
  • the cell storage device 2 may have an opening and closing system for the lid of the culture substrate 44 .
  • the cells adhering to the culture substrate 45 can be washed as appropriate.
  • the washing medium 50 is transported to the pipetting section 45 by the liquid transport control section 53, and the washing medium 50 is added into the culture substrate 44 by the pipetting section 45 at the position P6.
  • the liquid transport control unit 53 transports the cell detachment/cell preservation solution 52 to the pipetting unit 45 .
  • the pipetting unit 45 adds a cell detachment solution (also serving as a cell preservation solution) 52 into the culture substrate 44 .
  • the culture substrate movement control section 40 moves the culture substrate 44 to position P5.
  • the culture substrate 44 is set in the ultrasonic irradiation unit 1S.
  • a conventionally known configuration can be used as the ultrasonic irradiation unit 1S.
  • the configuration including the ultrasonic irradiation unit 1S includes an ultrasonic peeling unit 54 having the ultrasonic irradiation unit 1S, and a function generator 42 and an amplifier 41 for inputting an arbitrary frequency and voltage to the ultrasonic peeling unit 54. is exemplified.
  • the culture substrate 44 is irradiated with ultrasonic waves from the ultrasonic irradiation unit 1S, and the cells adhering to the culture substrate 44 are detached.
  • the culture substrate movement controller 40 moves the culture substrate 44 to position P6.
  • the pipetting unit 45 collects the cell detachment solution (and cell preservation solution) containing the cells detached from the culture substrate 44 in the culture substrate 44 .
  • the cell detachment solution (cumulative cell preservation solution) containing cells is passed through a mesh filter F2 (which may not be used if the cells are sufficiently dispersed), and placed in the cell storage unit 55.
  • the cells are collected in the exfoliated cell storage container (tube) 49 .
  • the cell storage unit 55 has a temperature control mechanism, and can keep (cold) the cell detachment solution (which also serves as the cell storage solution) containing cells at a constant temperature. Cells can be stored in this state.
  • the cell storage device 2 may have a system for opening and closing the lid of the detached cell storage container (tube) 49 .
  • part of the detached cells may be seeded on the detached cell collection unit 48, for example, a new cell culture substrate installed at position P7.
  • a new cell culture substrate installed at position P7.
  • Cells can be reused after a certain storage period (such as re-culturing).
  • the pipetting unit 45 collects the cells stored in the detached cell storage container (tube) 49 .
  • the cell detachment solution (and cell preservation solution) containing cells is passed through a mesh filter F2 (which may not be used if the cells are sufficiently dispersed).
  • the cells can be cultured again by seeding the exfoliated cell collection unit 48, for example, on a new cell culture substrate installed at the position P7.
  • the cell storage device 2 may perform an operation such as adding a culture medium to the exfoliated cell collection unit 48 in advance.
  • the cells detached from the culture substrate 44 contain cell clusters.
  • a single cellization treatment may be performed.
  • a single cell conversion treatment can be performed by passing a cell detachment solution (also a cell preservation solution) containing cells through the mesh filter F2.
  • the cell storage device 2 may have a cell observation unit 43 that acquires an image of the cells cultured in the culture substrate 44, so that the state of cell detachment and the state of cell recovery can be confirmed.
  • the cell preservation device 2 may have a controller that controls the above cell preservation process.
  • the controller is means for controlling the operation of each part in the cell storage device 2 .
  • the control unit may be configured by a computer having an arithmetic processing unit such as a CPU, a memory such as a RAM, and a storage unit such as a hard disk drive.
  • the control unit may include an operation unit.
  • the operation unit may have a display unit, an input unit, and the like.
  • the display unit can display image data output from the control unit and various information related to the operation of the cell preservation device 2 .
  • a liquid crystal display is used for the display unit.
  • the input unit receives various instruction inputs from the user.
  • a keyboard and a mouse are used as the input unit.
  • Both the function of the display unit and the function of the input unit may be a single unit such as a touch panel display.
  • the molecular weight (peak molecular weight, etc.) of the polymer was measured by gel permeation chromatography (GPC) as follows. First, the polymer was dissolved in methanol for 48 hours at room temperature. Then, the resulting solution was filtered through a solvent-resistant membrane filter “Myshoridisc H-25-2” (manufactured by Tosoh Corporation) having a pore diameter of 0.2 ⁇ m to obtain a sample solution. The sample solution was prepared so that the concentration of methanol-soluble components was about 1.0% by mass. Using this sample solution, measurements were made under the following conditions to obtain a molecular weight distribution.
  • GPC gel permeation chromatography
  • Apparatus Waters APC system (detector: RI) (manufactured by Waters) Column: ACQUITY APC XT900, XT200, XT125, XT45 connected (manufactured by Waters) Eluent: Methanol Flow rate: 0.4 ml/min Column temperature: 40.0°C Sample injection volume: 0.01 ml
  • the viscosity of the stripping solution was measured using an E-type viscometer RE-80L (manufactured by Toki Sangyo Co., Ltd.).
  • the measurement method 3 mL of stripping solution was placed in a measurement container, and measurement was performed under the condition of a shear rate of 100 rpm with a standard rotor.
  • the measurement temperature was set to 37° C. by connecting a circulation constant temperature bath.
  • Stripping solutions 2 to 18 were prepared in the same manner as for stripping solution 1, except that the type of polymer used, mass % of polymer, peak molecular weight Mp, molar concentration of ethylenediaminetetraacetic acid, pH, and viscosity were changed as shown in Table 1. bottom. Ethylenediaminetetraacetic acid was not added to stripping solution 13, and polyethylene glycol and ethylenediaminetetraacetic acid were not added to stripping solution 18.
  • stripper 20 Polyvinyl alcohol having a peak molecular weight Mp of 10500 measured by GPC (manufactured by Sigma-Aldrich ) was added to 1.0% by mass, and ethylenediaminetetraacetic acid was added to a concentration of 0.1 mmol/L, and dissolved completely.
  • Example 1 Cell culture CHO (Chinese Hamster Ovary) cells were seeded in a ⁇ 60 polystyrene dish (manufactured by Corning) at a density of 10000 cells/cm 2 and cultured at 37° C. under a CO 2 concentration of 5%.
  • the medium used was Ham's F12 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (manufactured by Sigma-Aldrich) and 1% penicillin-streptomycin (10000 U/ml, manufactured by Thermo Fisher Scientific). board. After culturing for 48 hours, cells were observed under a phase-contrast microscope to confirm cell adhesion and proliferation. The cell occupied area ratio of the dish was about 80%.
  • Example 2 to 18 and Comparative Examples 1, 3, 4 Stripping and evaluation were performed in the same manner as in Example 1, except that the type of stripping solution and the environmental temperature were changed. Table 2 shows the results.
  • C2C12 cells which are a mouse skeletal muscle myoblast cell line, were seeded in a ⁇ 60 polystyrene dish (manufactured by Corning) at a density of 5000 cells/cm 2 and cultured at 37° C. in a CO 2 concentration of 5%.
  • the medium was DMEM/F12 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (manufactured by Sigma-Aldrich) and 1% penicillin-streptomycin (10000 U/ml, manufactured by Thermo Fisher Scientific). was used. After culturing for 48 hours, cells were observed under a phase-contrast microscope to confirm cell adhesion and proliferation. The cell occupied area ratio of the dish was about 80%. Subsequent cell detachment and evaluation were carried out in the same manner as in Example 1. Table 2 shows the results.
  • A549 cells which are human alveolar basal epithelial adenocarcinoma cells, were seeded on a ⁇ 60 polystyrene dish (manufactured by Corning) at a density of 10,000 cells/cm 2 and cultured at 37° C. under a CO 2 concentration of 5%.
  • the medium used was DMEM (manufactured by Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (manufactured by Sigma-Aldrich) and 1% penicillin-streptomycin (10000 U/ml, manufactured by Thermo Fisher Scientific). board.
  • HUVEC Human Umbilical Vein Endothelial Cells
  • a ⁇ 60 polystyrene dish manufactured by Corning
  • Endothelial Cell Growth Medium 2 Kit manufactured by Promocell
  • the cell occupied area ratio of the dish was about 80%. Subsequent cell detachment and evaluation were carried out in the same manner as in Example 1. Table 2 shows the results.
  • hMSC Human Mesenchymal Stem Cells
  • hMSC Human Mesenchymal Stem Cells
  • a ⁇ 60 polystyrene dish manufactured by Corning
  • MSCGM Bullet Kit manufactured by Lonza
  • the medium was exchanged after 96 hours of culture, and culture was continued for up to 168 hours.
  • Cells were observed under a phase-contrast microscope to confirm cell adhesion and proliferation. Subsequent cell detachment and evaluation were carried out in the same manner as in Example 1.
  • the cell occupied area ratio of the dish was about 80%. Table 2 shows the results.
  • the present invention it is possible to provide a cell detachment solution and a cell detachment method that increase both the survival rate and the detachment rate of cells during cell detachment using ultrasonic waves.
  • hMSC Human Mesenchymal Stem Cells
  • Example 5 The detached cells were stored in a refrigerator in the same manner as in Example 23, except that trypsin was used as a detachment solution instead of ultrasonic vibration to detach the cells from the substrate, and the cell survival rate for the storage period of the cells was evaluated. Examined. After detachment from the base material using trypsin, the trypsin was neutralized with serum medium, centrifuged, and the cells were redispersed with PBS(-) to obtain a preservation solution. As a result, the cell viability after 1 day of storage was 77.1%. Cell viability after 3 days of storage was 41.3%. Compared to Example 23, the cell viability after 3 days of storage was greatly reduced.
  • Example 24 In Example 23, the cells that had been refrigerated for 3 days were seeded on a polystyrene multiplate (manufactured by Corning) at a density of 4000 cells/cm 2 and cultured at 37° C. in a CO 2 concentration of 5%. As a result of observing the proliferation of the cultured cells under a microscope, it was found that the cells exhibited the same proliferative property as before storage. From this result, it was shown that the cells obtained by the method for preserving cells of the present invention maintained the cell proliferation ability even after being preserved in the detachment solution 1, and the cell culture could be continued.
  • a cell detachment method for detaching cells provided on a base material A first step of preparing a substrate provided with the cells and a cell detachment solution provided in contact with the cells and the substrate; a second step of exfoliating the cells from the substrate by applying ultrasonic vibrations to the cells;
  • the cell detachment method wherein the cell detachment solution contains a polymer, and the polymer is a polymer containing a polyalkylene glycol structure.
  • a method for preserving cells provided on a substrate comprising: (1) Step 1 of contacting the cells with the cell detachment solution according to configurations 1 to 14; (2) step 2 of exfoliating the cells from the substrate by applying ultrasonic vibration to the cells; and (3) preserving the cells exfoliated in step 2 in the cell exfoliation solution. step 3;
  • a method for preserving cells comprising:
  • [Configuration 20] A method for culturing cells by seeding cells preserved by the method for preserving cells according to any one of Structures 17 to 19 in a cell growth medium.
  • a cell preservation device for preserving cells provided on a substrate, A medium exchange unit that adds the cell detachment solution according to configurations 1 to 14 to the base material to which the cells are adhered and brings the cells into contact with the cell detachment solution; an ultrasonic irradiation unit for applying ultrasonic vibrations to the cells; a cell storage unit that stores the cells detached from the base material;

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Abstract

基材の上に設けられた細胞を、前記細胞に対して超音波による振動を与えることによって、前記基材から剥離する際に用いられる細胞剥離液であって、前記細胞剥離液はポリアルキレングリコール構造を含むポリマーを有する細胞剥離液。

Description

細胞剥離液及び細胞剥離方法、細胞保存方法
　本発明は、細胞剥離液及び細胞剥離方法、細胞保存方法に関するものである。
　細胞医薬・再生医療の分野においては、大量の細胞が必要であり、特に、生体組織の多くを占める接着性細胞を効率的かつ安定的に供給することが求められている。
　接着性細胞の培養においては、例えばポリスチレンディッシュのような培養基材上での細胞の培養、基材からの細胞の剥離、細胞の回収及び洗浄の各工程を経て、目的とする細胞を取得する。細胞をさらに増やす際には、取得した細胞の一部をまた新たな基材に移して培養する、いわゆる継代操作を行なう。この一連の工程の中でも、基材から細胞を剥離する剥離工程は、細胞の効率的かつ安定的な供給への障壁となっている。
　一方、超音波を用いた細胞剥離方法が提案されている。特許文献１には、培地を用いて培養した細胞が付着した培養容器を天地し、培養容器の外面から当該培養容器に超音波振動を与えることにより、細胞を細胞付着面から剥離させる方法の開示がある。特許文献２には、細胞と、培地又は液体とを保持する容器に対して超音波を照射し、細胞の少なくとも一部を容器から剥離させる細胞剥離装置の開示がある。
　本発明者らは上記先行技術について課題を見出した。すなわち、容器に対する吸着力が大きい細胞のように、剥離が困難な細胞を取り扱う場合などに、より剥離効率が強い超音波振動条件で剥離を行うと細胞の生存率が低下する場合がある。
特開２００６－３１４２０４号公報 国際公開第２０１６－０４７３６８号明細書
　そこで本発明は、超音波を用いた細胞剥離で用いられる剥離液であって、細胞の生存率と剥離率がともに高くなるような細胞剥離液、及びそれを用いた細胞剥離方法ならびに細胞保存方法を提供することを目的とする。
　本発明に係る細胞剥離液は、基材の上に設けられた細胞を、前記細胞に対して超音波による振動を与えることによって、前記基材から剥離する際に用いられる細胞剥離液であって、前記細胞剥離液はポリアルキレングリコール構造を含むポリマーを有する。
　本発明によれば、本発明に係る細胞剥離液は、超音波を用いた細胞剥離の際に、細胞の生存率と剥離率をともに高くするのみならず、その後、前記細胞剥離液中で細胞を簡便かつ効果的に保存する細胞保存方法を提供することができる。
本実施形態に係る細胞の保存方法の流れの例を示すフローチャートである。 本実施形態に係る細胞保存装置の概念図である。
　以下、本発明の実施形態に係る細胞剥離液について説明する。
　本実施形態に係る剥離液は、基材の上に設けられた細胞を、その細胞に対して超音波による振動を与えることによって、基材から剥離する際に用いられる細胞剥離液である。そして、細胞剥離液はポリアルキレングリコール構造を含むポリマーを有する。細胞剥離液がポリアルキレングリコール構造を含むポリマーを有することにより、超音波による振動を与えることによって細胞を剥離する際の細胞の剥離率及び細胞の生存率を高くすることができる。以下詳細に説明する。ここで、剥離する対象となる細胞は、単独の細胞、複数の細胞が凝集した凝集体、シート状に培養された細胞（細胞シート）のいずれであってもよい（以下、同じ）。
　（作用効果）
　本実施形態に係る細胞剥離液はポリアルキレングリコール構造を含むポリマーを含むため、細胞の生存率を高くすることができる。その理由として考えられることについて詳細を述べる。超音波による振動を与えることで細胞を基材から剥離しようとすると、振動が細胞に付加され、細胞がダメージを負うことがある。一方、細胞剥離液の中のポリアルキレングリコール構造を含むポリマーが細胞膜に吸着すると、振動のエネルギーの一部がそのポリマーに伝わり、大きな振動が細胞に伝わらないようにできる。ポリアルキレングリコール構造を含むポリマーは、ポリアルキレングリコール構造を含むために親水性であり（親水性ポリマーと呼ぶこともできる）、ポリアルキレングリコール構造中の酸素が細胞膜に吸着しやすい。そのため、結果として細胞を保護する効果が高くなると推察している。
　（ポリアルキレングリコール構造を含むポリマー）
　本実施形態において、ポリアルキレングリコール構造を含むポリマーの具体例として、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコールや、これらを部分構造として含む共重合体、ポリエチレングリコールジメチルエーテル、ポリエチレングリコールラウリルエーテル、ポリプロピレングリコールブチルエーテルのような誘導体、などが挙げられる。ポリマーが共重合体である場合、ポリアルキレングリコール構造の含有割合が９０質量％以上であることが好ましい。
　上記具体例の中でも末端基がＯＨ基かつポリアルキレングリコール構造中の炭素鎖の炭素数が５以下のものが高い親水性をもつために好ましく、その中でもポリエチレングリコールがより好適に用いられる。なお、本明細書においてポリエチレングリコールをＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ）と呼ぶことがある。
　なお、ポリアルキレングリコール構造を含むポリマーは、直鎖でも分岐構造を有していても良い。
　本実施形態に用いられるポリアルキレングリコール構造を含むポリマーは、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより測定されるピーク分子量Ｍｐが８００以上５００００以下であることが好ましく、１２００以上２００００以下であることがさらに好ましい。ポリマーのＭｐが８００以上であると細胞内にポリマーが浸透することがなく、５００００以下であるとポリマー分子同士の反発が少なく、細胞膜の周りにポリマーが安定に存在できるためである。なお、ポリマーの分子量の調整方法としては公知の方法が使用可能であり、具体的には各モノマーの仕込み比や重合時間、触媒の選択等により任意に調整可能である。
　本実施形態におけるポリマーの分子量の測定方法については後述する。
　（細胞剥離液）
　本実施形態において、細胞剥離液の全質量に対するポリマーの量が０．０３質量％以上２０．０質量％以下であることが好ましく、０．０５質量％以上５．０質量％以下であることがより好ましい。０．０３質量％以上であると細胞保護効果が十分に得られ、２０．０質量％以下であると細胞同士の凝集が生じにくいためである。
　本実施形態における細胞剥離液は、タンパク質分解酵素を実質的に含まないことが好ましい。ここで、タンパク質分解酵素を実質的に含まないとは、細胞剥離液の全質量に対するタンパク質分解酵素の量は０．０００５質量％以下であるという意味である。タンパク質分解酵素を含まないことがより好ましい。その理由を以下に述べる。
　一般的に細胞の剥離にはトリプシンなどのタンパク質分解酵素が広く用いられている。この方法では、タンパク質分解酵素を作用させることで、細胞と基材間の結合に関与するタンパク質を分解し、その後にタッピングやピペッティングといった操作で完全に細胞を剥離させる。しかしながら、この方法では、タンパク質分解酵素により、同時に多くの細胞表面タンパク質も分解されてしまい、細胞の品質の低下が引き起こされる懸念がある。また、タッピングやピペッティングといった操作は人の熟練度による差が大きく、安定的な供給という面では課題がある。すなわち、タンパク質分解酵素は細胞の一部を分解するため剥離率を高くできる半面、細胞の品質を低下させる（細胞の生存率が低下する）可能性があると言える。
　本実施形態における細胞剥離液は、二価陽イオンを実質的に含まないことが好ましい。ここで、二価陽イオンを実質的に含まないとは、細胞剥離液の二価陽イオンの濃度が０．０５μＭ以下であるという意味である。本実施形態に係る細胞剥離液は二価陽イオンを含まないことがより好ましい。これはインテグリン等の二価陽イオン依存性の接着タンパク質の働きを弱め、より剥離率を高めやすくするためである。さらには、その二価陽イオンを積極的に接着タンパク質から取り除くために、キレート剤を含むことが好ましい。キレート剤の含有量としては０．０１ｍＭ以上５．０ｍＭ以下であることが好ましい。この範囲であることにより、キレート効果が得られやすく、過剰なキレート剤の存在による活性低下も低減することができる。
　本実施形態における細胞剥離液のｐＨは中性領域であることが好ましい。中性領域は細胞培養に適しており、細胞の生存率を安定的に高く保つことができるためである。ｐＨは塩酸や水酸化ナトリウム等で適宜調整可能である。また、ｐＨを安定的に保つために各種緩衝液が好適に用いられる。
　本実施形態における細胞剥離液の粘度は１．８０ｍＰａ・ｓ以下であることが好ましい。これは、超音波振動によって発生する剥離液の流動が妨げられず、剥離率を高く保つことができるためである。細胞剥離液の粘度はポリマーの分子量、添加量などによって適宜調整可能である。
　＜タンパク質分解酵素＞
　本実施形態においてタンパク質分解酵素とは、例えば、細胞の一部を分解し、細胞を基材から剥離しやすくするものである。例えば、トリプシン、アキュターゼ、コラゲナーゼ、天然プロテアーゼ、キモトリプシン、エラスターゼ、パパイン、プロナーゼ、もしくはそれらの組み換え体などが挙げられる。
　＜二価陽イオン＞
　本実施形態における二価陽イオンは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋などが挙げられる。インテグリン等の接着タンパク質は特にＣａ２＋、Ｍｇ２＋の依存性が高いため、本実施形態に係る細胞剥離液はＣａ２＋、Ｍｇ２＋を実質的に含まないことが好ましい。ここで実質的に含まないとは、細胞剥離液のＣａ２＋、Ｍｇ２＋の濃度が０．０５μＭ以下であるという意味である。本実施形態に係る細胞剥離液はＣａ２＋、Ｍｇ２＋を含まないことがより好ましい。
　＜緩衝液＞
　本実施形態における緩衝液は、中性領域を保つことができれば制限なく使用できる。例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸－リン酸緩衝液、グリシルグリシン－水酸化ナトリウム緩衝液、Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液、ＧＴＡ緩衝液等が挙げられる。この中でも、生体内の環境に近いリン酸緩衝液が好ましく、このリン酸緩衝液に、細胞内液と等張になるよう調整したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）がより好適に用いられる。ＰＢＳを用いる場合、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋といった二価陽イオンが含まれないＰＢＳ（－）を用いることが好ましい。
　＜キレート剤＞
　本実施形態におけるキレート剤としては、特に限定はないが、例えば、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ニトリロトリ酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、イミノ二酢酸、ジヒドロキシエチルグリシン、ジカルボキシメチルグルタミン酸、エチレンジアミンジコハク酸、エチドロン酸、クエン酸、グルコン酸、ホスホノブタン三酢酸等を挙げることができる。この中でも二価の陽イオンとキレートを形成するキレート剤が好ましく、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋とキレートを形成するキレート剤が特に好ましく、エチレンジアミン四酢酸が最も好ましい。キレート剤としてエチレンジアミン四酢酸を用いた場合、細胞剥離液のｐＨは７．０以上８．０以下であることが好ましい。これは細胞生存率を高く保つことができる中性領域の中でも高めのｐＨであることにより、エチレンジアミン四酢酸のキレート能を高めることができ、剥離率をより高くすることが可能であるためである。なおキレート剤は単独で用いても、或いは２種類以上を複合して用いてもよい。
　（基材）
　本実施形態における基材は、化学的に安定であり、所望の細胞を培養可能な材質であればよく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリウレタン、ポリウレア、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸誘導体、ポリアクリロニトリル、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリルアミド誘導体、ポリスルホン、セルロース、セルロース誘導体、ポリシリコーン、ポリメチルペンテン、ガラス、金属などが挙げられる。この中でもポリスチレンが好ましい。なお、基材のことをディッシュと呼ぶこともある。
　（細胞）
　本実施形態における細胞としては、インビトロで培養器材に接着培養可能なものであれば特に限定されるものではない。例えばチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞やマウス結合組織Ｌ９２９細胞、マウス骨格筋筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）、ヒト胎児肺由来正常二倍体線維芽細胞（ＴＩＧ－３細胞）、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ２９３細胞）、ヒト肺胞基底上皮腺癌由来Ａ５４９細胞やヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞等の種々の培養細胞株に加え、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関与する肝実質細胞、肝非実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、胚性癌（ＥＣ）細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞等の各種幹細胞、又は各組織の前駆細胞、さらにはそれらから分化誘導した細胞等が挙げられる。本実施形態に係る細胞剥離液は、これらの中でも基材への接着力が高い細胞やトリプシン感受性の高い細胞においても好適に用いられる。
　（培地）
　培地の種類に特に制限はなく、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ　ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅｓ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ‘ｓ培地、ＳｔｅｍＳｐａｎ　Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　２　Ｋｉｔ（プロモセル社製）、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　２（プロモセル社製）、ＭＳＣＧＭ　Ｂｕｌｌｅｔ　Ｋｉｔ（ロンザ社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ或いはリプロＦＦ２（リプロセル社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＭＦ－Ｍｅｄｉｕｍ間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）などが挙げられる。
　これらの中から、それぞれの細胞の培養に適した培地を用いるのが好ましい。例えば、ＣＨＯ細胞の培養にはハムＦ１２培地が、Ｃ２Ｃ１２細胞にはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地がそれぞれ好適に用いられる。
　＜血清＞
　上記の培地には、血清や抗生物質を添加してもよい。血清の例としては、牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、児牛血清、成牛血清、ウマ血清、ヒツジ血清、ヤギ血清、ブタ血清、ニワトリ血清、ウサギ血清、ヒト血清が使用されるが、入手の容易さから一般的にＦＢＳがよく用いられる。また、未処理又は未精製の血清をいずれも含まず、精製された血液由来成分又は動物組織由来成分（増殖因子など）を含有する無血清培地であってもよい。
　＜抗生物質＞
　培地に添加される抗生物質の例としては、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、テトラサイクリン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、カナマイシン、アクチノマイシンＤ、アンホテリシンＢなどが挙げられる。
　（細胞の培養条件）
　細胞の培養条件は、培養する細胞に従って適宜選択し得る。一般的には、ディッシュ内に適切な培地を添加し、そこに１．０×１０１～５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２程度の細胞を播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養する。この際、基材中の細胞占有面積率が７～８割程度、いわゆるサブコンフルエントの状態になるまで培養するのが好ましい。
　（超音波による振動）
　本実施形態において超音波による振動として、国際公開第２０１６－０４７３６８号明細書に記載されているように、１０ｋＨｚないし１ＭＨｚ程度の周波数をもつ振動を例示できる。振動発生手段は、細胞に超音波による振動を与えることができる手段であれば、特に制限なく用いることができる。一例として特開２００８－９２８５７号公報に記載されているように、チタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）等の超音波発振子を挙げることができる。
　ここで、特開２００６－３１４２０４号公報に記載されているように、培地が充填されて密閉された培養容器の外面に、振動子を直接当接されて、培養容器に振動を与えることができる。他には、国際公開第２０１６－０４７３６８号明細書に記載されているように超音波照射手段を直接容器に接触させるのではなく、超音波照射手段と処置対象領域との間に超音波伝達物質を介在させて、超音波を、剥離対象たる細胞に入射させることもできる。
　（細胞剥離方法）
　本実施形態における細胞剥離方法は以下の各工程を少なくとも含む。
　＜第一の工程＞
　細胞と、細胞及び基材に接して設けられる細胞剥離液とが設けられた基材を用意する工程。
　＜第二の工程＞
　細胞に対して超音波による振動を与えることによって、基材から前記細胞を剥離する工程。
　＜その他の工程＞
　本実施形態に係る細胞剥離方法は、上記の工程以外にも培養液への対流等の外部刺激を与える工程を含んでいても良い。培養液への対流を生じさせる方法としては、ピペッティングすることやポンプ、撹拌翼を用いる等が挙げられる。
　＜環境温度＞
　上記第二の工程が行われる際の環境温度は３０．０℃以上３７．５℃以下であることが好ましい。これにより、剥離時の温度が培養時の温度と近く、細胞への温度変化による影響を少なくでき、生存率を高く保つことができるためである。また、二価陽イオンの濃度が０．０５μＭ以下の剥離液中では、上記温度範囲であることにより、接着タンパク質に結合している２価陽イオンが脱離しやすくなり、剥離率も高くなる。
　（細胞の保存方法）
　本実施形態に係る細胞剥離方法は、上記の工程以外にも、細胞を保存する工程を含んでいても良い。
　本実施形態における細胞の保存方法は以下の各工程を少なくとも含む。
　工程１は、細胞を、本実施形態に係る、実質的に分解酵素を含まない細胞剥離液に接触させる工程である。細胞と、実質的に分解酵素を含まない細胞剥離液を接触させることによって、細胞間の結合や細胞と基材との接着力を低減させる。
　工程２は、前記細胞に対して超音波による振動を与えることによって、前記基材から前記細胞を剥離する工程である。
　工程３は、前記工程２で剥離した前記細胞について、前記細胞剥離液中で保存する工程である。
　本実施形態において、細胞を保存するとは、細胞が前記細胞剥離液中に生きた状態で存在しており、その細胞を、少なくとも１時間以上、生きたまま放置しておくことであり、その後、再び細胞を利用することを意図して行われる行為を意味する。
　本実施形態の細胞の保存方法では、細胞剥離液を用いて細胞を、細胞に超音波による振動を付与して剥離し、次いで、その細胞剥離液中で細胞を保存することを特徴としている。すなわち、細胞を剥離した後、そのまま保存することができるが、適宜、剥離後の細胞剥離液に各種の添加剤を加えて保存効果を高めることもできる。保存効果を高める添加剤としては、糖類、血清、及び抗生物質で構成される群から選択される少なくとも１つが挙げられる。
　本実施形態の細胞の保存は、細胞を、細胞剥離液中に懸濁させて行うことができる。保存時の細胞濃度は、細胞種、細胞の大きさ、細胞の保存期間等の条件に依存して適宜選択できるが、例えば、細胞や剥離液を含む細胞懸濁液１ｍＬあたりに、１００００個以上１００００００００個以下の細胞数の範囲とすることでき、１０００００個以上１０００００００個以下とすることができる。
　本実施形態の細胞の保存方法による細胞の保存期間は、細胞種、保存温度、細胞剥離液の組成、細胞濃度等の条件に依存するが、およそ１時間以上１０日以下の範囲で、好ましくは６時間以上７日以下までである。
　本実施形態の細胞の保存方法による細胞の保存温度は、生きた細胞を保存し、そのまま再び培養に用いることができる観点から、非凍結温度、具体的には、０°より大きく３０℃以下の範囲が好ましい。好ましくは、１℃以上１０℃以下の範囲である。０℃以下となると、細胞は凍結保存状態となり、凍結融解時の細胞へのダメージの可能性がある。これを防ぐために、細胞を剥離したのちに、細胞剥離液に凍結防止剤を添加しても良い。保存中の細胞の代謝活性を抑えられる点で、２℃以上８℃以下の保存温度が特に好ましい。なお、本実施形態における細胞の保存温度とは、細胞を保存する冷蔵庫の設定温度とすることができる。
　具体的な保存例としては、例えば、接着性細胞を培養施設から医療機関に輸送する際の保存方法が挙げられる。この場合の保存期間は、２日以上３日以下であり、温度は２℃以上８℃以下の範囲である。
　本実施形態の細胞の保存方法に使用される細胞保存用の容器は、細胞種、保存温度、保存後の細胞の用途等に応じて、公知の容器を用いることができる。好ましくは、気密性、細胞毒性、滅菌性などの観点から、ポリプロピレンやポリエチレンのチューブが使用できる。
　細胞保存のための装置は、上記の細胞保存用の容器を安定に静置できる装置であればよく、かつ上記の保存温度を達成できるものであれば特に制限されないが、例えばインキュベーターや冷蔵庫を挙げることができる。
　（細胞保存後の使用方法の例）
　本実施形態は、細胞剥離液で保存した後の細胞を用いて、通常の細胞増殖用培地を用いた細胞培養を行う方法を含む。
　上記に従って、保存した細胞は、細胞を含む細胞剥離液を遠心分離後、上清を除去した後、通常の細胞増殖用培地に再分散して、培養基材に播種して、培養してもよい。なお、細胞を含む細胞剥離液を、通常の細胞増殖用培地にそのまま播種することでも、培養を行うことができる。培養を再開するための細胞の濃度は、細胞の種類によっても異なるが、例えば細胞継代時の細胞濃度とすることができる。
　（細胞保存装置の構成）
　本実施形態に係る細胞保存装置は、基材の上で培養された接着細胞を剥離回収し、保存する細胞保存装置であって、培地交換部と、超音波照射部と、細胞保存部とを有する。上記交換部は、前記細胞が接着している前記基材に、細胞剥離液を添加して前記細胞と前記細胞剥離液とを接触させるように構成されている。また、上記超音波照射部は前記細胞に対して超音波による振動を与えるように構成されている。また、上記細胞保存部は、前記基材から剥離した前記細胞について、前記細胞を一定温度で保存するように構成されている。
　（本実施形態に係る細胞の保存方法の流れ）
　図１に、本実施形態に係る細胞の保存方法の流れの例を示す。例えば、上記工程１は、培養容器に細胞剥離液（兼細胞保存液）を添加する工程Ｓ１０、および細胞と細胞剥離液（兼細胞保存液）とが接触した状態で所定時間インキュベートさせて維持する工程Ｓ２０を含む。また、例えば、上記工程２は、基材から細胞を剥離するために超音波による振動を与える工程Ｓ３０を含み、さらに基材から剥離した細胞を含む細胞剥離液（兼細胞保存液）を回収する工程Ｓ４０を含んでいても良い。また、例えば、上記工程３は、剥離した細胞を含む細胞剥離液（兼細胞保存液）を保存するＳ５０を含む。本実施形態に係る細胞の保存方法の流れには、細胞の状態を観察する工程がさらに含まれていても良い。
　（細胞保存後の使用方法の例）
　上記に従って、保存した細胞は、細胞を含む細胞剥離液（兼細胞保存液）を遠心分離後、上清を除去した後、通常の細胞増殖用培地に再分散して、培養基材に播種して、培養してもよい。なお、細胞を含む細胞剥離液（兼細胞保存液）を、通常の細胞増殖用培地にそのまま播種することでも、培養を行うことができる。培養を再開するための細胞の濃度は、細胞の種類によっても異なるが、例えば細胞継代時の細胞濃度とすることができる。本実施形態は、細胞剥離液（兼細胞保存液）で保存した後の細胞を用いて、通常の細胞増殖用培地を用いた細胞培養を行う方法を含む。
　（細胞保存装置の構成）
　本実施形態に係る細胞保存装置は、基材の上で培養された接着細胞を剥離回収し、保存する細胞保存装置であって、培地交換部と、超音波照射部と、細胞保存部とを有する。上記交換部は、前記細胞が接着している前記基材に、細胞剥離液（兼細胞保存液）を添加して前記細胞と前記細胞剥離液（兼細胞保存液）とを接触させるように構成されている。また、上記超音波照射部は前記基材および前記細胞に対して超音波による振動を与えるように構成されている。また、上記細胞保存部は、前記基材から剥離した前記細胞について、前記細胞を一定温度で保存するように構成されている。
　本実施形態に係る細胞保存装置２の構成について、図２に示す概念図を用いて説明する。
　培養基材移動制御部４０は、培養基材４４を保持ならびに移動させるユニットである。
　培養基材移動制御部４０は、細胞の基材からの剥離を行う環境の温度や湿度を制御する保温器を備えていても良く、そのような保温器としては、３７℃に保温できる加温ユニットや加湿ユニットが例示される。培養基材４４の移動のために、例えば、ＸＹＺ電動ステージが用いられる。培養基材移動制御部４０は、培養基材４４を、位置Ｐ４、位置Ｐ５、および位置Ｐ６の間で水平移動させる。位置Ｐ４では、培養基材４４内で培養された細胞の画像を取得することができる。位置Ｐ５では、培養基材４４内に対して、超音波照射部１Ｓによる超音波の照射が行われる。また、位置Ｐ６では、ピペッティング部４５により培養基材４４内の溶液が回収、あるいは各種の溶液が培養基材４４に添加される。
　超音波を用いた細胞剥離のプロセスの例でさらに説明する。
　培養基材４４で細胞を培養し、細胞を剥離したいタイミングとなった際、培養基材４４を位置Ｐ６に配置する。適宜、培養基材移動制御部４０を用いて、培養基材４４を位置Ｐ４に配置して、細胞観察部４３で細胞の様子を観察することができる。位置Ｐ６に配置された培養基材４４には、細胞が接着している。
　まず、培地を除去して細胞剥離液（兼細胞保存液）に交換する必要がある。そのため、位置Ｐ６で、ピペッティング部４５により培養基材４４内の培地を回収する。回収した培地は、位置Ｐ９において、廃液回収部４７に捨てられる。各種の培地は、洗浄用培地５０、培養用培地５１、細胞剥離液（兼細胞保存液）５２にストックされており、液体輸送制御部５３により、ピペッティング部４５に輸送される。ピペッティング部４５は上下方向に動くことで、培養基材４４へアクセスすることが可能である。適宜、細胞保存装置２は培養基材４４のフタの開閉システムを有していても良い。
　培地を除去した後、適宜、培養基材４５に接着している細胞を洗浄することもできる。液体輸送制御部５３により、洗浄用培地５０をピペッティング部４５に輸送し、位置Ｐ６で、ピペッティング部４５により培養基材４４内に洗浄用培地５０を添加する。上記の培地除去方法と同様にして洗浄用培地５０を除去した後、液体輸送制御部５３により細胞剥離液兼細胞保存液５２をピペッティング部４５に輸送する。続いて、位置Ｐ６で、ピペッティング部４５により培養基材４４内に細胞剥離液（兼細胞保存液）５２を添加する。
　次に、培養基材移動制御部４０は、培養基材４４を位置Ｐ５に移動させる。ここで、培養基材４４は、超音波照射部１Ｓにセットされる。超音波照射部１Ｓとしては従来公知の構成を使用できる。超音波照射部１Ｓを含む構成としては、超音波照射部１Ｓを有する超音波剥離ユニット５４と、その超音波剥離ユニット５４に任意の周波数および電圧等を入力するためのファンクションジェネレーター４２およびアンプ４１とを組み合わせた形態が例示される。
　本実施形態に係る細胞の保存では、培養基材４４に超音波照射部１Ｓから超音波を照射し、培養基材４４に接着している細胞を剥離させる。培養基材移動制御部４０は、培養基材４４を、位置Ｐ６に移動させる。位置Ｐ６で、ピペッティング部４５により培養基材４４内の、培養基材４４から剥離した細胞を含む細胞剥離液（兼細胞保存液）を回収する。次いで、位置Ｐ１０において、メッシュフィルターＦ２（十分に細胞が分散している場合は用いなくてよい）に細胞を含む細胞剥離液（兼細胞保存液）を通過させて、細胞保存部５５に設置された剥離細胞保存容器（チューブ）４９に回収する。細胞保存部５５は、温度を調節できる機構を備えており、細胞を含む細胞剥離液（兼細胞保存液）を一定の温度に保つ（保冷する）ことが可能である。この状態で、細胞を保存することができる。適宜、細胞保存装置２は剥離細胞保存容器（チューブ）４９のフタの開閉システムを有していても良い。
　細胞保存とは別に、剥離した細胞の一部を、剥離細胞回収部４８、例えば、位置Ｐ７に設置した新しい細胞培養基材に播種してもよい。ここで回収された細胞の一部を、細胞計測等のアッセイに用いることができる。
　細胞は、一定の保存期間の後、再び利用することができる（再び培養するなど）。例えば、位置Ｐ１０において、ピペッティング部４５により剥離細胞保存容器（チューブ）４９内の保存された細胞を回収する。次いで、位置Ｐ１０において、メッシュフィルターＦ２（十分に細胞が分散している場合は用いなくてよい）に細胞を含む細胞剥離液（兼細胞保存液）を通過させる。そして、剥離細胞回収部４８、例えば、位置Ｐ７に設置した新しい細胞培養基材に播種することで、再び細胞を培養することができる。適宜、細胞保存装置２は剥離細胞回収部４８に予め培地を入れておくなどの動作があってもよい。
　培養基材４４に超音波照射部１Ｓから超音波を照射し、培養基材４４に接着している細胞を剥離させた時、培養基材４４から剥離した細胞が細胞塊を含んでいることがある場合は、単一細胞化処理を行っても良い。メッシュフィルターＦ２に細胞を含む細胞剥離液（兼細胞保存液）を通過させることで、単一細胞化処理を行うことができる。
　細胞保存装置２は、培養基材４４内で培養された細胞の画像を取得する細胞観察部４３を有していても良く、細胞剥離の状態や、細胞の回収状態を確認することができる。
　細胞保存装置２は、上記の細胞保存プロセスを制御する制御部を有していても良い。制御部は、細胞保存装置２内の各部を動作制御するための手段である。例えば、制御部は、ＣＰＵ等の演算処理部、ＲＡＭ等のメモリ、およびハードディスクドライブ等の記憶部を有するコンピュータにより構成されていても良い。制御部は操作部を含んでいても良い。操作部は、表示部および入力部等を有していてもよい。表示部は、制御部から出力される画像データや、細胞保存装置２の動作に関わる種々の情報を表示できる。表示部には、例えば、液晶ディスプレイが用いられる。入力部は、ユーザからの種々の指示入力を受け付ける。入力部には、例えば、キーボードやマウスが用いられる。表示部の機能および入力部の機能の双方が、タッチパネルディスプレイ等の単一のユニットであってもよい。
　以下、本発明に関係する各種測定方法を述べる。
　＜ポリマーの分子量の測定方法＞
　ポリマーの分子量（ピーク分子量等）は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により、以下のようにして測定した。まず、室温で４８時間かけて、ポリマーをメタノールに溶解した。そして、得られた溶液を、ポア径が０．２μｍの耐溶剤性メンブランフィルター「マイショリディスク　Ｈ－２５－２」（東ソー社製）で濾過してサンプル溶液を得た。尚、サンプル溶液は、メタノールに可溶な成分の濃度が約１．０質量％となるように調製した。このサンプル溶液を用いて、以下の条件で測定し、分子量分布を得た。
装置：Ｗａｔｅｒｓ　ＡＰＣシステム（検出器：ＲＩ）（Ｗａｔｅｒｓ製）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ　ＡＰＣ　ＸＴ９００、ＸＴ２００、ＸＴ１２５、ＸＴ４５を連結（Ｗａｔｅｒｓ製）
溶離液：メタノール
流速：０．４ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０．０℃
試料注入量：０．０１ｍｌ
　試料の各種分子量の算出にあたっては、標準ポリエチレングリコール樹脂（例えば、商品名「ＥａｓｉＶｉａｌ　ＰＥＧ」、アジレント・テクノロジー社製）を用いて作成した分子量校正曲線を使用した。
　＜剥離液の粘度の測定方法＞
　剥離液の粘度は、Ｅ型粘度計ＲＥ－８０Ｌ型（東機産業社製）を用いて測定した。測定方法としては、測定容器に剥離液を３ｍＬ入れ、標準ローターでせん断速度１００ｒｐｍの条件で測定した。なお、測定温度は循環恒温槽を接続し、３７℃に設定した。
　以下、実施例、比較例をもって本発明をさらに詳細に説明するが、これは本発明を何ら限定するものではない。
　＜剥離液１の調製例＞
　２価陽イオン不含のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－）、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に、ポリマーとして、ＧＰＣにより測定されるピーク分子量Ｍｐが２０３０であるＰＥＧ２０００（キシダ化学製）を１．０質量％、エチレンジアミン四酢酸を０．１ｍｍｏｌ／Ｌの濃度となるように加え、完全に溶解させた。さらに、塩酸あるいは水酸化ナトリウムでｐＨを７．４に調整し、これを剥離液１として用いた。剥離液１の粘度は１．２２ｍＰａ・ｓであった。
　＜剥離液２～１８の調製例＞
　使用するポリマー種類、ポリマーの質量％、ピーク分子量Ｍｐ、エチレンジアミン四酢酸のモル濃度、ｐＨ、粘度を表１のように変えた以外は、剥離液１と同様の方法で剥離液２～１８を調製した。なお、剥離液１３においてはエチレンジアミン四酢酸を、剥離液１８においてはポリエチレングリコールとエチレンジアミン四酢酸を添加しなかった。
　＜剥離液１９の調製例＞
　２価陽イオン不含のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－）、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に、ポリマーとして、ＧＰＣにより測定されるピーク分子量Ｍｐが１１０００であるポリビニルピロリドンＫ１５（東京化成工業製）を１．０質量％、エチレンジアミン四酢酸を０．１ｍｍｏｌ／Ｌの濃度となるように加え、完全に溶解させた。
　さらに、塩酸あるいは水酸化ナトリウムでｐＨを７．４に調整し、これを剥離液１として用いた。剥離液１の粘度は１．１９ｍＰａ・ｓであった。なお、表１にはポリビニルピロリドンをＰＶＰと記載している。
　＜剥離液２０の調製例＞
　２価陽イオン不含のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－）、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に、ポリマーとして、ＧＰＣにより測定されるピーク分子量Ｍｐが１０５００であるポリビニルアルコール（シグマアルドリッチ製）を１．０質量％、エチレンジアミン四酢酸を０．１ｍｍｏｌ／Ｌの濃度となるように加え、完全に溶解させた。
　さらに、塩酸あるいは水酸化ナトリウムでｐＨを７．４に調整し、これを剥離液１として用いた。剥離液１の粘度は１．３４ｍＰａ・ｓであった。なお、表１にはポリビニルアルコールをＰＶＡと記載している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　［実施例１］
　（細胞の培養）
　ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ）細胞をΦ６０ポリスチレンディッシュ（コーニング社製）に１００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＨａｍ’ｓ　Ｆ１２（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）にＦｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（シグマアルドリッチ製）を１０％、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００００Ｕ／ｍｌ、サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を１％添加したものを用いた。培養は４８時間行ない、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、細胞接着ならびに増殖を確認した。ディッシュの細胞占有面積率は８割程度であった。
　（細胞の剥離）
　ディッシュ内の培地を除去し、ＰＢＳ（－）で細胞を洗浄後、上記剥離液１に３分間浸漬させた。その後、超音波振動子をディッシュに接触させ、環境温度３７℃において３分間スイープ振動（周波数２２－２７ｋＨｚ、スイープ周期１ｓ、電圧２００Ｖ）して、細胞を剥離させた。剥離した細胞は回収した後、血球計算盤を用いて細胞数の測定及びトリパンブルー染色による生死判別法を用いて生存率を算出した。また、超音波剥離後のディッシュに対して、セルスクレーパーを用いて超音波で剥離できなかった細胞も全て剥離し、血球計算盤で細胞数を測定した。超音波で剥離した細胞数とその後セルスクレーパーで剥離した細胞数を合わせて総剥離細胞数とし、総剥離細胞数に対する超音波剥離細胞数の割合を剥離率と定義し、算出した。結果、生存率は９６．０％、剥離率は９８．０％であった。なお、生存率、剥離率ともに９０％以上を良好と判断した。
　［実施例２～１８及び比較例１、３、４］
　剥離液の種類、環境温度を変えた以外は実施例１と同様の方法で剥離、評価した。結果を表２に示す。
　［実施例１９］
　マウス骨格筋筋芽細胞株であるＣ２Ｃ１２細胞Φ６０ポリスチレンディッシュ（コーニング社製）に５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にＦｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（シグマアルドリッチ社製）を１０％、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００００Ｕ／ｍｌ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を１％添加したものを用いた。培養は４８時間行ない、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、細胞接着ならびに増殖を確認した。ディッシュの細胞占有面積率は８割程度であった。以降細胞の剥離と評価に関しては実施例１と同様に行なった。結果を表２に示す。
　［実施例２０］
　ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞であるＡ５４９細胞Φ６０ポリスチレンディッシュ（コーニング社製）に１００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＤＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にＦｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（シグマアルドリッチ社製）を１０％、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００００Ｕ／ｍｌ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を１％添加したものを用いた。培養は４８時間行ない、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、細胞接着ならびに増殖を確認した。ディッシュの細胞占有面積率は８割程度であった。以降細胞の剥離と評価に関しては実施例１と同様に行なった。結果を表２に示す。
　［実施例２１］
　ＨＵＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ　Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　Ｖｅｉｎ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌｓ）細胞をΦ６０ポリスチレンディッシュ（コーニング社製）に１００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　２　Ｋｉｔ（プロモセル社製）を用いた。培養は４８時間行ない、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、細胞接着ならびに増殖を確認した。ディッシュの細胞占有面積率は８割程度であった。以降細胞の剥離と評価に関しては実施例１と同様に行なった。結果を表２に示す。
　［実施例２２］
　ｈＭＳＣ（Ｈｕｍａｎ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ）細胞をΦ６０ポリスチレンディッシュ（コーニング社製）に４０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＭＳＣＧＭ　Ｂｕｌｌｅｔ　Ｋｉｔ（ロンザ社製）を用いた。培養９６時間後に培地交換を行ない、その後１６８時間まで培養を行なった。位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、細胞接着ならびに増殖を確認した。以降細胞の剥離と評価に関しては実施例１と同様に行なった。ディッシュの細胞占有面積率は８割程度であった。結果を表２に示す。
　［比較例２］
　使用する剥離液を剥離液１８に変更する以外は実施例２１と同様に行なった。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明によれば、超音波を用いた細胞剥離の際に、細胞の生存率と剥離率がともに高くなるような、細胞剥離液及び細胞剥離方法を提供することができる。
　［実施例２３］
　（基材上での細胞の培養）
　ｈＭＳＣ（Ｈｕｍａｎ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ）細胞をΦ６０ポリスチレンディッシュ（コーニング社製）に４０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＭＳＣＧＭ　Ｂｕｌｌｅｔ　Ｋｉｔ（ロンザ社製）を用いた。培養９６時間後に培地交換を行ない、その後１６８時間まで培養を行なった。位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、細胞接着ならびに増殖を確認した。ディッシュの細胞占有面積率は８割程度であった。
　（細胞の基材からの剥離）
　ディッシュ内の培地を除去し、ＰＢＳ（－）で細胞を洗浄後、上記剥離液１に１０分間浸漬させた。その後、超音波振動子をディッシュに接触させ、環境温度３７℃において３分間スイープ振動（周波数２２－２７ｋＨｚ、スイープ周期１ｓ、電圧１００Ｖ）して、細胞を剥離させた。剥離した細胞を回収し、細胞密度を、１．０ｘ１０６個／ｍＬに調整した。
　（細胞の冷蔵保存）
　細胞を含む剥離液１をポリプロピレンチューブ内に入れ、密閉した。この剥離細胞保存容器を４℃の環境下で保存した（冷蔵保存）。細胞を保存したときの保存期間に対する細胞生存率を調べた。細胞生存率はトリパンブルー染色による生死判定にて測定した。保存１日後の細胞生存率は、８０．５％であった。保存３日後の細胞生存率は、６２．１％であった。この結果から、本発明の細胞保存方法は、細胞の冷蔵保存が可能であることが分かった。本発明の細胞保存方法は、簡便かつ効果的であった。
　［比較例５］
　超音波振動ではなく、トリプシンを剥離液として用いて基材から細胞を剥離させたこと以外は、実施例２３と同様に、剥離した細胞の冷蔵保存を行い、細胞の保存期間に対する細胞生存率を調べた。なお、トリプシンを用いて基材から剥離した後は、トリプシンを血清培地で中和し、遠心分離を経て、細胞はＰＢＳ（－）で再分散させて保存液とした。結果として、保存１日後の細胞生存率は、７７．１％であった。保存３日後の細胞生存率は、４１．３％であった。実施例２３と比較して、保存３日後の細胞生存率が大きく低下した。
　［実施例２４］
　実施例２３において、３日間冷蔵保存された細胞を、ポリスチレンマルチプレート（コーニング社製）に４０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。顕微鏡で培養した細胞の増殖を観察した結果、保存前と同等の増殖性を示すことが分かった。この結果より、本発明の細胞の保存方法で得られる細胞は、剥離液１で保存した後においても、細胞増殖能を維持しており、細胞培養を継続できることが示された。
　本明細書における本発明に係る開示は、以下を含む。
　［構成１］
　基材の上に設けられた細胞を、前記細胞に対して超音波による振動を与えることによって、前記基材から剥離する際に用いられる細胞剥離液であって、前記細胞剥離液はポリアルキレングリコール構造を含むポリマーを有する細胞剥離液。
　［構成２］
　前記細胞剥離液の全質量に対する前記ポリマーの量が０．０３質量％以上２０．０質量％以下である、構成１に記載の細胞剥離液。
　［構成３］
　前記細胞剥離液の全質量に対する前記ポリマーの量が０．０５質量％以上５．０質量％以下である、構成１または２に記載の細胞剥離液。
　［構成４］
　ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより測定される前記ポリマーのピーク分子量Ｍｐが８００以上５００００以下である、構成１乃至３のいずれか１項に記載の細胞剥離液。
　［構成５］
　ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより測定される前記ポリマーのピーク分子量Ｍｐが１２００以上２００００以下である、構成１乃至４のいずれか１項に記載の細胞剥離液。
　［構成６］
　前記ポリマーがポリエチレングリコールである、構成１乃至５のいずれか１項に記載の細胞剥離液。
　［構成７］
　前記細胞剥離液はタンパク質分解酵素を実質的に含まない、構成１乃至６のいずれか１項に記載の細胞剥離液。
　［構成８］
　前記タンパク質分解酵素がトリプシンである、構成７に記載の細胞剥離液。
　［構成９］
　前記細胞剥離液は二価陽イオンを実質的に含まない、構成１乃至８のいずれか１項に記載の細胞剥離液。
　［構成１０］
　前記細胞剥離液はＣａ２＋及びＭｇ２＋を実質的に含まない、構成１乃至９のいずれか１項に記載の細胞剥離液。
　［構成１１］
　前記細胞剥離液のｐＨが７．０以上８．０以下である、構成１乃至１０いずれか１項に記載の細胞剥離液。
　［構成１２］
　前記細胞剥離液がキレート剤をさらに含み、前記キレート剤の濃度が０．０１ｍＭ以上５．０ｍＭ以下である、構成１乃至１１のいずれか１項に記載の細胞剥離液。
　［構成１３］
　前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸である、構成１２に記載の細胞剥離液。
　［構成１４］
　前記細胞剥離液の３７℃における粘度が１．８０ｍＰａ・ｓ以下である、構成１乃至１３のいずれか１項に記載の細胞剥離液。
　［構成１５］
　基材の上に設けられた細胞を剥離する細胞剥離方法であって、
　前記細胞と、前記細胞及び前記基材に接して設けられる細胞剥離液とが設けられた基材を用意する第一の工程と、
　前記細胞に対して超音波による振動を与えることによって、前記基材から前記細胞を剥離する第二の工程とを有し、
　前記細胞剥離液はポリマーを含み、前記ポリマーがポリアルキレングリコール構造を含むポリマーである、細胞剥離方法。
　［構成１６］
　前記第二の工程が行われる際の環境温度が３０．０℃以上３７．５℃以下である、構成１５に記載の細胞剥離方法。
　［構成１７］
　基材の上に設けられた細胞の保存方法であって、
（１）細胞を、構成１～１４に記載の細胞剥離液に接触させる工程１と、
（２）前記細胞に対して超音波による振動を与えることによって、前記基材から前記細胞を剥離する工程２と
（３）前記工程２で剥離した前記細胞について、前記細胞剥離液中で保存する工程３と、
　を有する、ことを特徴とする細胞の保存方法。
　［構成１８］
　前記工程３が、非凍結保存である、構成１７に記載の細胞の保存方法。
　［構成１９］
　細胞が、幹細胞である、構成１７～１８に記載の細胞の保存方法。
　［構成２０］
　構成１７～１９のいずれか１項に記載の細胞の保存方法により保存した後の細胞を、細胞増殖用培地に播種することによる細胞の培養方法。
　［構成２１］
　基材の上に設けられた細胞を保存する細胞保存装置であって、
前記細胞が接着している前記基材に、構成１～１４に記載の細胞剥離液を添加して前記細胞と前記細胞剥離液とを接触させる培地交換部と、
前記細胞に対して超音波による振動を与えるための超音波照射部と、
前記基材から剥離した前記細胞を保存する細胞保存部と、
を有する、ことを特徴とする細胞保存装置。
　本発明は上記実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神及び範囲から離脱することなく、様々な変更及び変形が可能である。従って、本発明の範囲を公にするために以下の請求項を添付する。
　本願は、２０２１年１０月２９日提出の日本国特許出願特願２０２１－１７７９１０を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てをここに援用する。

Claims (21)

  1. 　基材の上に設けられた細胞を、前記細胞に対して超音波による振動を与えることによって、前記基材から剥離する際に用いられる細胞剥離液であって、前記細胞剥離液はポリアルキレングリコール構造を含むポリマーを有する細胞剥離液。
  2. 　前記細胞剥離液の全質量に対する前記ポリマーの量が０．０３質量％以上２０．０質量％以下である、請求項１に記載の細胞剥離液。
  3. 　前記細胞剥離液の全質量に対する前記ポリマーの量が０．０５質量％以上５．０質量％以下である、請求項１または２に記載の細胞剥離液。
  4. 　ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより測定される前記ポリマーのピーク分子量Ｍｐが８００以上５００００以下である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の細胞剥離液。
  5. 　ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより測定される前記ポリマーのピーク分子量Ｍｐが１２００以上２００００以下である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の細胞剥離液。
  6. 　前記ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の細胞剥離液。
  7. 　前記細胞剥離液はタンパク質分解酵素を実質的に含まない、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の細胞剥離液。
  8. 　前記タンパク質分解酵素がトリプシンである、請求項７に記載の細胞剥離液。
  9. 　前記細胞剥離液は二価陽イオンを実質的に含まない、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の細胞剥離液。
  10. 　前記細胞剥離液はＣａ２＋及びＭｇ２＋を実質的に含まない、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の細胞剥離液。
  11. 　前記細胞剥離液のｐＨが７．０以上８．０以下である、請求項１乃至１０いずれか１項に記載の細胞剥離液。
  12. 　前記細胞剥離液がキレート剤をさらに含み、前記キレート剤の濃度が０．０１ｍＭ以上５．０ｍＭ以下である、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の細胞剥離液。
  13. 　前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸である、請求項１２に記載の細胞剥離液。
  14. 　前記細胞剥離液の３７℃における粘度が１．８０ｍＰａ・ｓ以下である、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の細胞剥離液。
  15. 　基材の上に設けられた細胞を剥離する細胞剥離方法であって、
    　前記細胞と、前記細胞及び前記基材に接して設けられる細胞剥離液とが設けられた基材を用意する第一の工程と、
    　前記細胞に対して超音波による振動を与えることによって、前記基材から前記細胞を剥離する第二の工程とを有し、
    　前記細胞剥離液はポリマーを含み、前記ポリマーがポリアルキレングリコール構造を含むポリマーである、細胞剥離方法。
  16. 　前記第二の工程が行われる際の環境温度が３０．０℃以上３７．５℃以下である、請求項１５に記載の細胞剥離方法。
  17. 　基材の上に設けられた細胞の保存方法であって、
    　（１）細胞を、請求項１～１４に記載の細胞剥離液に接触させる工程１と、
    　（２）前記細胞に対して超音波による振動を与えることによって、前記基材から前記細胞を剥離する工程２と
    　（３）前記工程２で剥離した前記細胞について、前記細胞剥離液中で保存する工程３と、
    　を有する、ことを特徴とする細胞の保存方法。
  18. 　前記工程３が、非凍結保存である、請求項１７に記載の細胞の保存方法。
  19. 　細胞が、幹細胞である、請求項１７～１８に記載の細胞の保存方法。
  20. 　請求項１７～１９のいずれか１項に記載の細胞の保存方法により保存した後の細胞を、細胞増殖用培地に播種することによる細胞の培養方法。
  21. 　基材の上に設けられた細胞を保存する細胞保存装置であって、
    　前記細胞が接着している前記基材に、請求項１～１４に記載の細胞剥離液を添加して前記細胞と前記細胞剥離液とを接触させる培地交換部と、
    　前記細胞に対して超音波による振動を与えるための超音波照射部と、
    　前記基材から剥離した前記細胞を保存する細胞保存部と、
    　を有する、ことを特徴とする細胞保存装置。
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