JPWO2017043605A1 - 網膜色素上皮細胞の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
すなわち、本発明は以下に関する。
(1)多能性幹細胞を、FGF受容体阻害物質及び/又はMEK阻害物質を含む培地で、30日を超えない期間培養する第一工程、及び
(2)第一工程で得られた細胞を、Nodalシグナル伝達経路阻害物質及び/又はWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下において培養し、網膜色素上皮細胞を形成させる第二工程。
[2]第一工程が、無血清条件下で行われる、上記[1]に記載の製造方法。
[3]第一工程が、フィーダー細胞非存在下で行われる、上記[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4]第一工程における培地が、さらに未分化維持因子を含む、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の製造方法。
[5]未分化維持因子が、FGFシグナル伝達経路作用物質である、上記[4]に記載の製造方法。
[6]FGFシグナル伝達経路作用物質が、bFGFである、上記[5]に記載の製造方法。
[7]FGF受容体阻害物質が、PD173074及びSU5402からなる群から選択される少なくとも1種である、上記[1]〜[6]のいずれかに記載の製造方法。
[8]MEK阻害物質が、PD0325901、PD184352、U0126、TAK-733、及びAZD-8330からなる群から選択される少なくとも1種である、上記[1]〜[7]のいずれかに記載の製造方法。
[9]Nodalシグナル伝達経路阻害物質が、ALK4,5,又は7阻害物質である、上記[1]〜[8]のいずれかに記載の製造方法。
[10]ALK4,5,又は7阻害物質が、SB431542である、上記[9]に記載の製造方法。
[11]Wntシグナル伝達経路阻害物質が、CKI-7である上記[1]〜[10]のいずれかに記載の製造方法。
[12]多能性幹細胞が、霊長類多能性幹細胞である上記[1]〜[11]のいずれかに記載の製造方法。
[13]多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である上記[1]〜[12]のいずれかに記載の製造方法。
[14]第一工程における培地が、さらにBMP受容体阻害物質を含む、上記[1]〜[13]のいずれかに記載の製造方法。
[15]BMP受容体阻害物質が、ALK2/3阻害物質である上記[14]に記載の製造方法。
[16]ALK2/3阻害物質が、LDN193189である上記[15]に記載の製造方法。
[17]第一工程における培地が、さらにソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む上記[1]〜[16]のいずれかに記載の製造方法。
[18]ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が、SAGである上記[17]に記載の製造方法。
[19]第一工程における培地が、さらにPKC阻害物質を含む上記[1]〜[18]のいずれかに記載の製造方法。
[20]PKC阻害物質が、Go6983である上記[19]に記載の製造方法。
[21’]第一工程において、培養期間が、眼形成転写因子の少なくとも1つの遺伝子発現を誘導するのに十分でありかつ30日を超えない期間である、上記[1]〜[20]のいずれかに記載の製造方法。
[22’]第一工程において、培養期間が、PAX6、LHX2及びSIX3の少なくとも1つの遺伝子発現を誘導するのに十分でありかつ30日を超えない期間である、上記[1]〜[20]のいずれかに記載の製造方法。
[21]第一工程において、培養期間が2日間〜13日間である、上記[1]〜[20]、[21’]及び[22’]のいずれかに記載の製造方法。
[22]第一工程において、培養期間が4日間〜6日間である、上記[1]〜[21]、[21’]及び[22’]のいずれかに記載の製造方法。
[23]上記[1]〜[22]、[21’]及び[22’]のいずれかに記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞を含有してなる、被験物質の毒性・薬効評価用試薬。
[24]上記[1]〜[22]、[21’]及び[22’]のいずれかに記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞に被験物質を接触させ、該物質が該細胞に及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法。
[25]上記[1]〜[22]、[21’]及び[22’]のいずれかに記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞を含有してなる、網膜色素上皮細胞の障害に基づく疾患の治療薬。
[26]上記[1]〜[22]、[21’]及び[22’]のいずれかに記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞の有効量を、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜色素上皮細胞の障害に基づく疾患の治療方法。
[27]網膜色素上皮細胞の障害に基づく疾患の治療における使用のための、上記[1]〜[22]、[21’]及び[22’]のいずれかに記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞。
[28]上記[1]〜[22]、[21’]及び[22’]のいずれかに記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞を有効成分として含有する、医薬組成物。
本発明において「多能性幹細胞」とは、自己複製能と多能性を有する細胞であり、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、三胚葉(外胚葉、中胚葉、内胚葉)に属する細胞系列すべてに分化しうる能力(多能性(pluripotency))を有する幹細胞をいう。
人工多能性幹細胞は、2006年、山中らによりマウス細胞で初めて樹立され(Cell, 2006, 126(4) pp.663-676)、2007年にはヒト線維芽細胞でも樹立された(Cell, 2007, 131(5) pp.861-872;Science, 2007, 318(5858) pp.1917-1920;Nat. Biotechnol., 2008, 26(1) pp.101-106)。人工多能性幹細胞の誘導方法についてはその後も様々な改良が行われており、具体的な製造方法は、例えば、マウス人工多能性幹細胞については、Cell. 2006 Aug 25;126(4):663-76、ヒト人工多能性幹細胞については、Cell. 2007 Nov 30;131(5):861-72等に記載されている。
人工多能性幹細胞として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加などにより体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる(Science, 2013, 341 pp. 651-654)。
また、株化された人工多能性幹細胞を入手する事も可能であり、例えば、京都大学で樹立された201B7細胞、201B7-Ff細胞、253G1細胞、253G4細胞、1201C1細胞、1205D1細胞、1210B2細胞又は1231A3細胞等のヒト人工多能性細胞株が、京都大学又はiPSアカデミアジャパン株式会社より入手可能である。また、株化された人工多能性幹細胞として、例えば、京都大学で樹立されたFf-I01細胞、Ff-I14細胞及びQHJI01細胞が、京都大学より入手可能である。
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション法やPCR法等があげられる。
「接着培養」とは、細胞又は細胞の凝集体を培養器材等に接着させる条件で行われる培養をいう。この場合、細胞が接着するとは、細胞または細胞の凝集体と培養器材の間に、強固な細胞-基質間結合ができることをいう。すなわち、接着培養とは、細胞または細胞の凝集体と培養器材等との間に強固な細胞-基質間結合を作らせる条件での培養をいう。
浮遊培養中の細胞の凝集体では、細胞と細胞が面接着(plane attachment)する。浮遊培養中の細胞の凝集体では、細胞-基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。一部の態様では、浮遊培養中の細胞の凝集体では、内在の細胞-基質間結合が凝集塊の内部に存在するが、細胞-基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。細胞と細胞が面接着するとは、細胞と細胞が面で接着することをいう。より詳細には、細胞と細胞が面接着するとは、ある細胞の表面積のうち別の細胞の表面と接着している割合が、例えば、1%以上、好ましくは3%以上、より好ましくは5%以上であることをいう。細胞の表面は、膜を染色する試薬(例えばDiI)による染色や、細胞接着因子(例えば、E-cadherinやN-cadherin)の免疫染色により、観察できる。
血清の濃度は、網膜色素上皮細胞を効率的に分化誘導しうる濃度であれば特に限定されないが、例えば約0.5%〜30%(v/v)の範囲から適宜設定できる。また、当該濃度は一定でもよく、段階的に変化させてもよい。
「無血清条件」とは、無調整又は未精製の血清を含まない条件、具体的には、無血清培地を使用する条件を意味する。
例えば、「FGFシグナル伝達経路作用物質を含む培地」とは、外来性のFGFシグナル伝達経路作用物質が添加された培地または外来性のFGFシグナル伝達経路作用物質を含む培地である。
本発明の製造方法は、下記工程(1)〜(2)を含む、網膜色素上皮細胞の製造方法である:
(1)多能性幹細胞を、FGF受容体阻害物質及び/又はMEK阻害物質を含む培地で、30日を超えない期間培養する第一工程、及び
(2)第一工程で得られた細胞を、Nodalシグナル伝達経路阻害物質及び/又はWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下において培養し、網膜色素上皮細胞を形成させる第二工程。
第一工程における好ましい多能性幹細胞として、人工多能性幹細胞、更に好ましくはヒト人工多能性幹細胞が挙げられる。ここで人工多能性幹細胞の製造方法には特に限定はなく、上述のとおり当業者に周知の方法で製造することができるが、人工多能性幹細胞の作成工程(すなわち、体細胞を初期化し多能性幹細胞を樹立する工程)もフィーダーフリーで行うことが望ましい。
当業者に汎用されている未分化維持因子としては、プライムド多能性幹細胞(Primed pluripotent stem cells)(例えば、ヒトES細胞やヒトiPS細胞)の場合、FGFシグナル伝達経路作用物質、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質等を挙げることができる。FGFシグナル伝達経路作用物質として具体的には、線維芽細胞増殖因子(例えば、bFGF、FGF4やFGF8)が挙げられる。また、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質としては、TGFβシグナル伝達経路作用物質(例えばTGFβ1、TGFβ2)、Nodal/Activinシグナル伝達経路作用物質(例えばNodal、Activin A、Activin B)が挙げられる。ヒト多能性幹細胞(ヒトES細胞、ヒトiPS細胞)を培養する場合、未分化維持因子は好ましくはbFGFである。
細胞保護剤添加処理に用いられる細胞保護剤としては、ヘパリン、血清、又は血清代替物を挙げることができる。また、分散により誘導される細胞死(特に、ヒト多能性幹細胞の細胞死)を抑制するために、分散の際に、ROCK阻害物質を添加してもよい。ROCK阻害物質としては、Y-27632、Fasudil(HA1077)、H-1152等を挙げることができる。
細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、DNase又はパパイン等の酵素類や、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤のいずれかを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えば、TrypLE Select (Life Technologies社製)やTrypLE Express (Life Technologies社製)を用いることもできる。
機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。
分散された多能性幹細胞を、新たな培養容器に播種し、第一工程に供することができる。
分散により誘導される細胞死(特に、ヒト多能性幹細胞の細胞死)を抑制するために、多能性幹細胞を、新たな培養容器に播種した後に、ROCK阻害物質存在下で維持培養を継続し、その後第一工程を開始してもよい。ROCK阻害物質処理の期間は、分散により誘導される細胞死が抑制できる限り特に限定されないが、通常、12〜24時間程度である。
本発明の方法により網膜色素上皮細胞を製造可能な範囲であれば、当該濃度は第一工程を通して一定でもよく、段階的に変化させてもよい。
培地交換操作に用いる道具は特に限定されないが、例えば、ピペッター、マイクロピペット、マルチチャンネルマイクロピペット、連続分注器、などが挙げられる。例えば、培養容器として96ウェルプレートを用いる場合、マルチチャンネルピペットマンを使ってもよい。
所定の培養条件において所与の培養期間が「少なくとも1つの眼形成初期のマーカー、具体的には眼形成転写因子の発現を誘導するのに十分な期間」または「PAX6、LHX2及びSIX3の少なくとも1つの遺伝子発現を誘導するのに十分な期間」であるか否かは、当該条件における当該期間の培養後の細胞集団において、無処理対照と比べてこれらの少なくとも1つの遺伝子発現が有意に検出されるかどうかを確認することにより決定することができる。当業者であれば、例えば、ノザンブロット、RT-PCR、マイクロアレイ等の手法により、これらの遺伝子の発現を検出する事ができる。
(1)眼形成転写因子の少なくとも1つの遺伝子発現を誘導するのに十分な期間、多能性幹細胞を、FGF受容体阻害物質及び/又はMEK阻害物質を含む培地で培養する第一工程、及び
(2)第一工程で得られた細胞を、Nodalシグナル伝達経路阻害物質及び/又はWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下において培養し、網膜色素上皮細胞を形成させる第二工程。
(1)PAX6、LHX2及びSIX3の少なくとも1つの遺伝子発現を誘導するのに十分な期間、多能性幹細胞を、FGF受容体阻害物質及び/又はMEK阻害物質を含む培地で培養する第一工程、及び
(2)第一工程で得られた細胞を、Nodalシグナル伝達経路阻害物質及び/又はWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下において培養し、網膜色素上皮細胞を形成させる第二工程。
第一工程で得られた細胞を、Nodalシグナル伝達経路阻害物質及び/又はWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下において培養し、網膜色素上皮細胞を形成させる第二工程について説明する。
本発明の方法により網膜色素上皮細胞を製造可能な範囲であれば、当該濃度は第二工程を通して一定でもよく、段階的に変化させてもよい。
培地交換操作に用いる道具は特に限定されないが、例えば、ピペッター、マイクロピペット、マルチチャンネルマイクロピペット、連続分注器、などが挙げられる。例えば、培養容器として96ウェルプレートを用いる場合、マルチチャンネルピペットを使ってもよい。
また、当業者であれば、細胞マーカー(RPE65(網膜色素上皮細胞)、Mitf(網膜色素上皮細胞)BEST1(網膜色素上皮細胞)、CRALBP(網膜色素上皮細胞)など)の発現や、メラニン顆粒の存在(黒褐色)、細胞間のタイトジャンクション、多角形・敷石状の特徴的な細胞形態などにより、網膜色素上皮細胞の生成を確認する事が可能であり、これらを確認する事で培養期間を設定する事も可能である。
基礎培地としては、上記定義の項で記載したようなものである限り特に限定されない。血清は、ウシ、ヒトなどの哺乳動物に由来する血清を使用できる。本発明においては、目的の細胞の品質管理上の観点から血清代替物を使用する事が好ましく、特に神経細胞培養用血清代替物であるB27が好適である。その他の成分としては、例えば、L-glutamine、ペニシリンナトリウム、硫酸ストレプトマイシン等が挙げられる。
第二工程において、網膜色素上皮細胞を接着培養により製造した場合、網膜色素上皮細胞は互いに接着しシート状構造を採り得る。従って、患者に移植可能な網膜色素上皮細胞のシートを製造する事が可能である。この網膜色素上皮細胞のシートは、網膜疾患を治療する細胞移植治療薬として用いる細胞集団として特に有用である。また、接着培養により製造された網膜色素上皮細胞を、上記方法で剥離させ、網膜色素上皮細胞を独立した単独の細胞として回収し、これらを生理的な水性溶媒(生理食塩水、緩衝液、無血清培地等)に懸濁させることにより、懸濁液として調製する事も可能である。
本発明の製造方法により製造された網膜色素上皮細胞は、健常および疾患のモデル細胞として、網膜系疾患治療薬および糖尿病など他の合併症の疾患治療薬、またはその予防薬のスクリーニング・薬効評価、化学物質等の安全性試験、ストレス試験、毒性試験、副作用試験、感染・混入試験に活用が可能である。一方、網膜細胞特有の光毒性、網膜興奮毒性等の毒性研究、毒性試験等に活用することも可能である。その評価方法としては、アポトーシス評価などの刺激・毒性試験のほか、前駆細胞から網膜色素上皮細胞および視細胞への正常分化に及ぼす影響を評価する試験(各種遺伝子マーカーのRT-PCR、サイトカインのELISAなどによる発現タンパク質解析、貪食能試験)、光毒性などの毒性試験、視機能に対する網膜電位や経上皮電気抵抗、自己免疫反応に起因する細胞傷害試験などがある。また、これらの試験の為の細胞材料としては、網膜色素上皮細胞のみならず、その前駆細胞も用いることが可能で、例えば、細胞を播種接着したプレート、細胞懸濁液、そのシートまたは成形体を提供することができる。これは、ヒトおよび動物試験の外挿試験として用いることができる。
本発明は、本発明の製造方法により製造される網膜色素上皮細胞の有効量を含む医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物は、本発明の製造方法により製造される網膜色素上皮細胞を、適切な生理的な水性溶媒で懸濁することにより、懸濁液として製造することができる。必要であれば、凍結保存剤を添加して、液体窒素等により凍結保存し、使用時に解凍し、緩衝液で洗浄し、移植医療に用いても良い。
本発明の製造方法で得られる網膜色素上皮細胞を、ピンセット等を用いて適切な大きさに細切し、シート剤とすることもできる。
また、本発明の製造方法で得られる細胞は、分化誘導を行う第二工程で接着培養を行うことにより、シート状の細胞に成形し、シート剤とすることもできる。
本発明の製造方法により製造された網膜色素上皮細胞(上記濃縮及び増幅操作等を経た網膜色素上皮細胞を含む。)は、懸濁液やシート形状により生体へ移植して網膜疾患を治療する細胞移植治療薬として用いることができる。また、本発明は当該治療薬を患者に投与することを含む治療方法も提供する。ここで網膜疾患とは、網膜に関わる眼科疾患であって、糖尿病など他の疾患による合併症も含まれる。本発明における網膜疾患としては、網膜色素上皮細胞の障害に基づく疾患が挙げられ、例えば、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症又は網膜剥離等が挙げられる。すなわち、患者における網膜色素上皮細胞の損傷部位に、本発明の製造方法により製造された網膜色素上皮細胞を補充することができる。
即ち、好ましい態様において、本発明の方法において、多能性幹細胞として、レシピエントと免疫が適合する他者の体細胞から樹立した多能性幹細胞から、アロの網膜色素上皮細胞又はこれを含む組織を製造し、これが当該レシピエントに移植される。または、レシピエントの体細胞から樹立した多能性幹細胞(例、誘導多能性幹細胞)を用いることにより、当該レシピエントについて免疫学的自己の網膜色素上皮細胞又はこれを含む組織を製造し、これが当該レシピエントに移植される。
ヒトiPS細胞(201B7株及び1231A3株)のフィーダーフリー条件下での未分化維持培養は、「Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594」に記載の方法に従い行った。培地は「StemFit(登録商標)」AK03培地(味の素)(以下、AK03培地)、又は、Essential 8培地(Life Technologies)を使用した。
MEK阻害物質処理工程を含む網膜色素上皮(RPE)細胞の製造は以下の通り行った。未分化維持培養していたiPS細胞を0.5 x TrypLE select(TrypLE select(Life Technologies)と0.5 mM EDTA/PBS(-)を等量混合)で処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(ニッピ)(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり1.2 x 104細胞播種し、ROCK阻害物質[10 μM Y-27632(和光純薬)]含有AK03培地、又は、Essential 8培地で、37℃、5% CO2条件下で培養した。播種翌日、MEK阻害物質としてPD0325901(SIGMA)を、AK03培地に最終濃度1 μM、又は、Essential 8培地に最終濃度0.03 μMになるよう添加し(第一工程開始)、6日間暴露した(第一工程終了)。その後、細胞を0.5 x TrypLE selectで処理し、セルスクレーパーを用いて剥離、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり、AK03培地使用時には2.0 x 105細胞、Essential 8培地使用時には5.0 x 105細胞播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した(第二工程開始)。培養1日目は、Y-27632(最終濃度10 μM)、Nodalシグナル伝達経路阻害物質としてSB-431542(和光純薬)(最終濃度5 μM)、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてCKI-7(SIGMA)(最終濃度3 μM)を添加したAK03培地、又は、Essential 8培地を使用し、培養2日目から5日目は、20% KSR(Life Technologies)、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542 (最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地[GMEM培地(SIGMA)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(Life Technologies)、1 mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(和光純薬)、2 mM L-glutamine(SIGMA)、100 U/ml ペニシリン-100 μg/ml ストレプトマイシン(Life Technologies)]、培養6日目から9日目は、15% KSR、 Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養10日目から13日目は、10% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養14日目から30日目は、10% KSRのみを添加した基礎培地、培養31日目以降は、RPE維持培地 [67% DMEM low glucose(SIGMA)、29% F12(SIGMA)、1.9% B-27 supplement(Life Technologies)、1.9 mM L-glutamine、96 U/ml ペニシリン-96 μg/mlストレプトマイシン]を使用した。培地は毎日、全量交換した。
培養38日目から42日目に培養プレートを観察した結果、AK03培地、及び、Essential 8培地の両培地使用時、201B7株、1231A3株の両株において、黒褐色を呈する細胞集団の広範囲に及ぶ出現を確認できた(図1)。顕微鏡観察により、それら細胞は、黒褐色、多角、敷石状形態といったRPE細胞の典型的な特徴を示していた(図2)。
ヒトiPS細胞(201B7株及び1231A3株)のフィーダーフリー条件下での未分化維持培養は、「Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594」に記載の方法に従い行った。培地は「StemFit(登録商標)」AK03培地(味の素)(以下、AK03培地)、又は、Essential 8培地(Life Technologies)を使用した。
MEK阻害物質処理工程を含まない網膜色素上皮(RPE)細胞の製造は以下の通り行った。未分化維持培養していたiPS細胞を0.5 x TrypLE selectで処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(ニッピ)(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり、AK03培地使用時には2.0 x 105細胞、Essential 8培地使用時には5.0 x 105細胞播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した。培養1日目は、ROCK阻害物質としてY-27632(和光純薬)(最終濃度10 μM)、Nodalシグナル伝達経路阻害物質としてSB-431542(和光純薬)(最終濃度5 μM)、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてCKI-7(SIGMA)(最終濃度3 μM)を添加したAK03培地、又は、Essential 8培地を使用し、培養2日目から5日目は、20% KSR(Life Technologies)、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542 (最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地[GMEM培地(SIGMA)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(Life Technologies)、1 mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(和光純薬)、2 mM L-glutamine(SIGMA)、100 U/ml ペニシリン-100 μg/ml ストレプトマイシン(Life Technologies)]、培養6日目から9日目は、15% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542 (最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養10日目から13日目は、10% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542 (最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養14日目から30日目は、10% KSRのみを添加した基礎培地、培養31日目以降は、RPE維持培地 [67% DMEM low glucose(SIGMA)、29% F12(SIGMA)、1.9% B-27 supplement(Life Technologies)、1.9 mM L-glutamine、96 U/ml ペニシリン-96 μg/mlストレプトマイシン]を使用した。培地は毎日、全量交換した。
培養38日目から42日目に培養プレートを観察した結果、黒褐色、多角、敷石状形態といったRPE細胞の典型的な特徴を示す細胞の出現は、わずかしか確認できなかった(図3)。
ヒトiPS細胞(201B7株及び1231A3株)のフィーダーフリー条件下での未分化維持培養は、「Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594」に記載の方法に従い行った。培地は「StemFit(登録商標)」AK03培地(味の素)(以下、AK03培地)、又は、Essential 8培地(Life Technologies)を使用した。
FGF受容体阻害物質処理工程を含む網膜色素上皮(RPE)細胞の製造は以下の通り行った。未分化維持培養していたiPS細胞を0.5 x TrypLE select(TrypLE select(Life Technologies)と0.5 mM EDTA/PBS(-)を等量混合)で処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(ニッピ)(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり1.2 x 104細胞播種し、ROCK阻害物質[10 μM Y-27632(和光純薬)]含有AK03培地、又は、Essential 8培地で、37℃、5% CO2条件下で培養した。播種翌日、FGF受容体阻害物質としてPD173074(SIGMA)を最終濃度100 nMになるようAK03培地、又は、Essential 8培地に添加し(第一工程開始)、6日間暴露した(第一工程終了)。一例においては、未分化維持因子(bFGF)を含まない培地におけるFGF受容体阻害物質の効果を検討するために、bFGFを添加しないStemSure hPSC Medium Δ(和光純薬)(以降、StemSure hPSC Medium Δ w/o bFGF)を使用した。すなわち、StemSure hPSC Medium Δ w/o bFGFに、FGF受容体阻害物質としてPD173074(SIGMA)を最終濃度100 nMになるように添加し(第一工程開始)、6日間暴露した(第一工程終了)。その後、細胞を0.5 x TrypLE selectで処理し、セルスクレーパーを用いて剥離、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり、AK03培地、又は、StemSure hPSC Medium Δ w/o bFGF使用時には2.0 x 105細胞、Essential 8培地使用時には5.0 x 105細胞播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した(第二工程開始)。培養1日目は、ROCK阻害物質としてY-27632(和光純薬)(最終濃度10 μM)、Nodalシグナル伝達経路阻害物質としてSB-431542(和光純薬)(最終濃度5 μM)、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてCKI-7(SIGMA)(最終濃度3 μM)を添加したAK03培地、Essential8培地、又は、StemSure hPSC Medium Δ w/o bFGFを使用し、培養2日目から5日目は、20% KSR(Life Technologies)、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542 (最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地[GMEM培地(SIGMA)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(Life Technologies)、1 mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(和光純薬)、2 mM L-glutamine(SIGMA)、100 U/ml ペニシリン-100 μg/ml ストレプトマイシン(Life Technologies)]、培養6日目から9日目は、15% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542 (最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養10日目から13日目は、10% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542 (最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養14日目から30日目は、10% KSRのみを添加した基礎培地、培養31日目以降は、RPE維持培地 [67% DMEM low glucose(SIGMA)、29% F12(SIGMA)、1.9% B-27 supplement(Life Technologies)、1.9 mM L-glutamine、96 U/ml ペニシリン-96 μg/mlストレプトマイシン]を使用した。培地は毎日、全量交換した。
培養38日目から42日目に培養プレートを観察した結果、AK03培地、Essential 8培地、又は、StemSure hPSC Medium Δ w/o bFGF使用時において、201B7株、及び/又は、1231A3株において、黒褐色を呈する細胞集団の広範囲に及ぶ出現を確認できた(図4)。顕微鏡観察により、それら細胞は、黒褐色、多角、敷石状形態といったRPE細胞の典型的な特徴を示していた(図5)。
ヒトiPS細胞(201B7株及び1231A3株)のフィーダーフリー条件下での未分化維持培養は、「Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594」に記載の方法に従い行った。「StemFit(登録商標)」AK03培地(味の素)(以下、AK03培地)、又は、Essential 8培地(Life Technologies)を使用した。
FGF受容体阻害物質処理工程を含まない網膜色素上皮(RPE)細胞の製造は以下の通り行った。未分化維持培養していたiPS細胞、又は、StemSure hPSC Medium Δ w/o bFGF(和光純薬)で6日間培養したiPS細胞を0.5 x TrypLE selectで処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(ニッピ)(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり、AK03培地、又は、StemSure hPSC Medium Δ w/o bFGF使用時には2.0 x 105細胞、Essential 8培地使用時には5.0 x 105細胞播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した。培養1日目は、ROCK阻害物質としてY-27632(和光純薬)(最終濃度10 μM)、Nodalシグナル伝達経路阻害物質としてSB-431542(和光純薬)(最終濃度5 μM)、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてCKI-7(SIGMA)(最終濃度3 μM)を添加したAK03培地、Essential 8培地、又は、StemSure hPSC Medium Δw/o bFGFを使用し、培養2日目から5日目は、20% KSR(Life Technologies)、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542 (最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地[GMEM培地(SIGMA)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(Life Technologies)、1 mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(和光純薬)、2 mM L-glutamine(SIGMA)、100 U/ml ペニシリン-100 μg/ml ストレプトマイシン(Life Technologies)]、培養6日目から9日目は、15% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542 (最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養10日目から13日目は、10% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542 (最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養14日目から30日目は、10% KSRのみを添加した基礎培地、培養31日目以降は、RPE維持培地 [67% DMEM low glucose(SIGMA)、29% F12(SIGMA)、1.9% B-27 supplement(Life Technologies)、1.9 mM L-glutamine、96 U/ml ペニシリン-96 μg/mlストレプトマイシン]を使用した。培地は毎日、全量交換した。
培養38日目から42日目に培養プレートを観察した結果、黒褐色、多角、敷石状形態といったRPE細胞の典型的な特徴を示す細胞の出現は、わずかしか確認できなかった(図6)。
ヒトiPS細胞(201B7株及び1231A3株)のフィーダーフリー条件下での未分化維持培養は、「Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594」に記載の方法に従い行った。培地は「StemFit(登録商標)」AK03培地(味の素)(以下、AK03培地)を使用した。
MEK阻害物質及び/又はFGF受容体阻害物質と、各種阻害物質、シグナル伝達経路阻害物質又はシグナル伝達経路作用物質との組み合わせ処理工程を含む網膜色素上皮(RPE)細胞の製造は以下の通り行った。未分化維持培養していたiPS細胞を0.5 x TrypLE selectで処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(ニッピ)(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり1.2 x 104細胞播種し、ROCK阻害物質[10 μM Y-27632(和光純薬)]含有AK03培地で、37℃、5% CO2条件下で培養した。細胞播種翌日、MEK阻害物質としてPD0325901(SIGMA)(最終濃度1 μM)、FGF受容体阻害物質としてPD173074(SIGMA)(最終濃度100 nM)、BMP受容体阻害物質としてLDN193189(STEMGENT)(最終濃度100 nM)、Shhシグナル伝達経路作用物質としてSAG(Enzo Life Sciences)(最終濃度30 nM)、PKC阻害物質としてGo6983(SIGMA)(最終濃度2 μM)を図7に示す組み合わせで培地に添加し(第一工程開始)、6日間暴露した(第一工程終了)。その後、細胞を0.5 x TrypLE selectで処理し、セルスクレーパーを用いて剥離、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(0.5μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり2.0 x 105細胞播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した(第二工程開始)。培養1日目は、ROCK阻害物質としてY-27632(和光純薬)(最終濃度10 μM)、Nodalシグナル伝達経路阻害物質としてSB-431542(和光純薬)(最終濃度5 μM)、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてCKI-7(SIGMA)(最終濃度3 μM)を添加したAK03培地を使用し、培養2日目から5日目は、20% KSR(Life Technologies)、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542 (最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地[GMEM培地(SIGMA)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(Life Technologies)、1 mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(和光純薬)、2 mM L-glutamine(SIGMA)、100 U/ml ペニシリン-100 μg/ml ストレプトマイシン(Life Technologies)]、培養6日目から9日目は、15% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542 (最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養10日目から13日目は、10% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542 (最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養14日目から30日目は、10% KSRのみを添加した基礎培地、培養31日目以降は、RPE維持培地 [67% DMEM low glucose(SIGMA)、29% F12(SIGMA)、1.9% B-27 supplement(Life Technologies)、1.9 mM L-glutamine、96 U/ml ペニシリン-96 μg/mlストレプトマイシン]を使用した。培地は毎日、全量交換した。同時に、MEK阻害物質処理工程を含む実施例1、MEK阻害物質処理工程を含まない比較例1、FGF受容体阻害物質処理工程を含む実施例2、および、FGF受容体阻害物質処理工程を含まない比較例2の条件でも実験を実施した。
培養38日目から47日目に培養プレートを観察した結果、比較例1及び比較例2の条件では、黒褐色、多角、敷石状形態といったRPE細胞の典型的な特徴を示す細胞の出現がわずかであった(図7、無処理)。それに対し、実施例1のMEK阻害物質処理工程を含む製造条件、実施例2のFGF受容体阻害物質処理工程を含む製造条件、及び、MEK阻害物質及び/又はFGF受容体阻害物質と、各種阻害物質、シグナル伝達経路阻害物質又はシグナル伝達経路作用物質との組み合わせ処理工程を含む製造条件では、黒褐色、多角、敷石状形態といったRPE細胞の典型的な特徴を示すRPE細胞の広範囲な出現を確認できた(図7)。ウェル全体に占めるRPE細胞の割合を目視で判定し、割合に応じて0から5の6段階に分けた場合(図8A)、図8B及び8Cに示す全ての化合物組み合わせ処理条件において、無処理よりも高い割合のRPE細胞の出現を確認できた(図8B及び8C)。
ヒトiPS細胞(Ff-I01株及びQHJI01株)のフィーダーフリー条件下での未分化維持培養は、「Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594」に記載の方法に従い行った。培地は「StemFit(登録商標)」AK03N培地(味の素)(以下、AK03N培地)を使用した。
MEK阻害物質又はFGF受容体阻害物質処理工程を含む網膜色素上皮(RPE)細胞の製造は以下の通り行った。未分化維持培養していたiPS細胞を0.5 x TrypLE select(TrypLE select(Life Technologies)と0.5 mM EDTA/PBS(-)を等量混合)で処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(ニッピ)(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり2.0 x 104細胞播種し、ROCK阻害物質[10 μM Y-27632(和光純薬)]含有AK03N培地で、37℃、5% CO2条件下で培養した。播種翌日、MEK阻害物質としてPD0325901(SIGMA)(最終濃度1 μM)、又は、FGF受容体阻害物質としてPD173074(SIGMA)(最終濃度100 nM)をAK03N培地に添加し(第一工程開始)、6日間暴露した(第一工程終了)。その後、細胞を0.5 x TrypLE selectで処理し、セルスクレーパーを用いて剥離、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり2.0 x 105細胞播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した(第二工程開始)。培養1日目から4日目は、20% KSR(Life Technologies)、Y-27632(最終濃度10 μM)、Nodalシグナル伝達経路阻害物質としてSB-431542(和光純薬)(最終濃度5 μM)、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてCKI-7(SIGMA)(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地[GMEM培地(SIGMA)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(Life Technologies)、1 mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(和光純薬)、2 mM L-glutamine(SIGMA)、100 U/ml ペニシリン-100 μg/ml ストレプトマイシン(Life Technologies)]、培養5日目から8日目は、15% KSR、 Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養9日目から12日目は、10% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養13日目から30日目は、10% KSRのみを添加した基礎培地、培養31日目以降は、RPE維持培地 [67% DMEM low glucose(SIGMA)、29% F12(SIGMA)、1.9% B-27 supplement(Life Technologies)、1.9 mM L-glutamine、96 U/ml ペニシリン-96 μg/mlストレプトマイシン]を使用した。培地は毎日、全量交換した。同時に、MEK阻害物質処理工程を含まない比較例1(ただし、AK03培地はAK03N培地に変更)、及び、FGF受容体阻害物質処理工程を含まない比較例2の条件(ただし、AK03培地はAK03N培地に変更)でも実験を実施した。
培養43日目に培養プレートを観察した結果、比較例1及び比較例2の条件では、黒褐色、多角、敷石状形態といったRPE細胞の典型的な特徴を示す細胞の出現はほぼ見られなかった(図9、無処理)。一方、MEK阻害物質及びFGF受容体阻害物質で暴露した場合、Ff-I01株、QHJI01株の両株において、黒褐色を呈する細胞集団の広範囲な出現を確認できた(図9、MEKi、FGFRi)。
ヒトiPS細胞(QHJI01株)のフィーダーフリー条件下での未分化維持培養は、「Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594」に記載の方法に従い行った。培地は「StemFit(登録商標)」AK03N培地(味の素)(以下、AK03N培地)を使用した。
MEK阻害物質又はFGF受容体阻害物質処理工程を含む網膜色素上皮(RPE)細胞の製造は以下の通り行った。未分化維持培養していたiPS細胞を0.5 x TrypLE select(TrypLE select(Life Technologies)と0.5 mM EDTA/PBS(-)を等量混合)で処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(ニッピ)(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり2.0 x 104細胞播種し、ROCK阻害物質[10 μM Y-27632(和光純薬)] 含有AK03N培地で、37℃、5% CO2条件下で培養した。播種翌日、2日後、3日後、4日後、5日後、又は、6日後に、MEK阻害物質としてPD0325901(SIGMA)(最終濃度1 μM)、又は、FGF受容体阻害物質としてPD173074(SIGMA)(最終濃度100 nM)をAK03N培地に添加し(第一工程開始)、6日間、5日間、4日間、3日間、2日間、又は、1日間暴露した(第一工程終了)。その後、細胞を0.5 x TrypLE selectで処理し、セルスクレーパーを用いて剥離、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり2.0 x 105細胞播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した(第二工程開始)。培養1日目から4日目は、20% KSR(Life Technologies)、Y-27632(最終濃度10 μM)、Nodalシグナル伝達経路阻害物質としてSB-431542(和光純薬)(最終濃度5 μM)、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてCKI-7(SIGMA)(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地[GMEM培地(SIGMA)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(Life Technologies)、1 mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(和光純薬)、2 mM L-glutamine(SIGMA)、100 U/ml ペニシリン-100 μg/ml ストレプトマイシン(Life Technologies)]、培養5日目から8日目は、15% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養9日目から12日目は、10% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養13日目から30日目は、10% KSRのみを添加した基礎培地、培養31日目以降は、RPE維持培地 [67% DMEM low glucose(SIGMA)、29% F12(SIGMA)、1.9% B-27 supplement(Life Technologies)、1.9 mM L-glutamine、96 U/ml ペニシリン-96 μg/mlストレプトマイシン]を使用した。培地は毎日、全量交換した。
培養48日目に培養プレートを観察した結果、MEK阻害物質及びFGF受容体阻害物質の両処理において、暴露日数2日間以上で黒褐色を呈する細胞集団の増加が見られ、暴露日数6日間までの間、暴露日数の増加に伴いウェル全体に占める呈色細胞の割合が増加した(図10)。特に暴露日数4日間〜6日間で黒褐色を呈する細胞集団の顕著な増加が見られた。
ヒトiPS細胞(1231A3株)のフィーダーフリー条件下での未分化維持培養は、「Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594」に記載の方法に従い行った。培地は「StemFit(登録商標)」AK03培地(味の素)(以下、AK03培地)を使用した。
MEK阻害物質処理工程を含む網膜色素上皮(RPE)細胞の製造は以下の通り行った。未分化維持培養していたiPS細胞を0.5 x TrypLE select(TrypLE select(Life Technologies)と0.5 mM EDTA/PBS(-)を等量混合)で処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(ニッピ)(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり1.2 x 104細胞播種し、ROCK阻害物質[10 μM Y-27632(和光純薬)]を含むAK03培地で、37℃、5% CO2条件下で培養した。播種翌日、4日後、又は、6日後に、MEK阻害物質としてPD0325901(SIGMA)(最終濃度1 μM)をAK03培地に添加し(第一工程開始)、6日間、3日間、又は、1日間暴露した(第一工程終了)。また、MEK阻害物質6日間暴露した細胞を0.5 x TrypLE selectで処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(ニッピ)(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり0.8 x 104細胞播種し、Y-27632(最終濃度10 μM)、及び、PD0325901(最終濃度1 μM)含有AK03培地で、37℃、5% CO2条件下で更に7日間培養することで、13日間 MEK阻害物質で暴露した(第一工程終了)。その後、細胞を0.5 x TrypLE selectで処理し、セルスクレーパーを用いて剥離、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり1.2 x 106細胞播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した(第二工程開始)。培養1日目は、Y-27632(最終濃度10 μM)、Nodalシグナル伝達経路阻害物質としてSB-431542(和光純薬)(最終濃度5 μM)、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてCKI-7(SIGMA)(最終濃度3 μM)を添加したAK03培地を使用し、培養2日目から5日目は、20% KSR(Life Technologies)、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542 (最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地[GMEM培地(SIGMA)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(Life Technologies)、1 mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(和光純薬)、2 mM L-glutamine(SIGMA)、100 U/ml ペニシリン-100 μg/ml ストレプトマイシン(Life Technologies)]、培養6日目から9日目は、15% KSR、 Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養10日目から13日目は、10% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養14日目から30日目は、10% KSRのみを添加した基礎培地、培養31日目以降は、RPE維持培地 [67% DMEM low glucose(SIGMA)、29% F12(SIGMA)、1.9% B-27 supplement(Life Technologies)、1.9 mM L-glutamine、96 U/ml ペニシリン-96 μg/mlストレプトマイシン]を使用した。培地は毎日、全量交換した。同時に、MEK阻害物質処理工程を含まない比較例1の条件でもRPE細胞の製造を実施した。
培養37日目に培養プレートを観察した結果、比較例1の条件、及び、MEK阻害物質暴露1日間では、黒褐色、多角、敷石状形態といったRPE細胞の典型的な特徴を示す細胞の出現はほぼ見られなかった(図11、無処理、MEKi 1日間)。一方、MEK阻害物質暴露3日間、6日間では、黒褐色を呈する細胞集団の広範囲な出現を確認でき(図11、MEKi 3日間、6日間)、暴露日数13日間においても同様に、十分な呈色細胞集団の出現が確認された(図11、MEKi 13日間)。
ヒトiPS細胞(Ff-I01株及びQHJI01株)のフィーダーフリー条件下での未分化維持培養は、「Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594」に記載の方法に従い行った。培地は「StemFit(登録商標)」AK03N培地(味の素)(以下、AK03N培地)を使用した。
MEK阻害物質又はFGF受容体阻害物質処理工程を含む網膜色素上皮(RPE)細胞の製造は以下の通り行った。未分化維持培養していたiPS細胞を0.5 x TrypLE select(TrypLE select(Life Technologies)と0.5 mM EDTA/PBS(-)を等量混合)で処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(ニッピ)(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり2.0 x 104細胞播種し、ROCK阻害物質[10 μM Y-27632(和光純薬)]含有AK03N培地で、37℃、5% CO2条件下で培養した。播種翌日、又は、4日後にMEK阻害物質としてPD0325901(SIGMA)(最終濃度1 μM)、又は、FGF受容体阻害物質としてPD173074(SIGMA)(最終濃度100 nM)をAK03N培地に添加し(第一工程開始)、6日間、又は、3日間暴露した(第一工程終了)。その後、細胞を0.5 x TrypLE selectで処理し、セルスクレーパーを用いて剥離、ピペッティングで単一分散後、第二工程に移す細胞分以外はマイクロアレイ用検体としてRNA抽出に使用し、第二工程移行分の細胞は、iMatrix-511(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり2.0 x 105細胞播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した(第二工程開始)。培養1日目は、Y-27632(最終濃度10 μM)、Nodalシグナル伝達経路阻害物質としてSB-431542(和光純薬)(最終濃度5 μM)、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてCKI-7(SIGMA)(最終濃度3 μM)を添加したAK03培地、又は、20% KSR(Life Technologies)、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(和光純薬)(最終濃度5 μM)、CKI-7(SIGMA)(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地[GMEM培地(SIGMA)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(Life Technologies)、1 mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(和光純薬)、2 mM L-glutamine(SIGMA)、100 U/ml ペニシリン-100 μg/ml ストレプトマイシン(Life Technologies)]を使用した。培養1日目にAK03培地(Y-27632、SB-431542、及び、CKI-7含有)を使用した場合、培養2日目から5日目は、20% KSR(Life Technologies)、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(和光純薬)(最終濃度5 μM)、CKI-7(SIGMA)(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地[GMEM培地(SIGMA)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(Life Technologies)、1 mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(和光純薬)、2 mM L-glutamine(SIGMA)、100 U/ml ペニシリン-100 μg/ml ストレプトマイシン(Life Technologies)]、培養6日目から9日目は、15% KSR、 Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養10日目から13日目は、10% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養14日目から30日目は、10% KSRのみを添加した基礎培地、培養31日目以降は、RPE維持培地 [67% DMEM low glucose(SIGMA)、29% F12(SIGMA)、1.9% B-27 supplement(Life Technologies)、1.9 mM L-glutamine、96 U/ml ペニシリン-96 μg/mlストレプトマイシン]を使用した。培養1日目に基礎培地(20%KSR、Y-27632、SB-431542、及び、CKI-7含有)を使用した場合、培養2日目から4日目は、20% KSR(Life Technologies)、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542 (最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養5日目から8日目は、15% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542 (最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養9日目から12日目は、10% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542 (最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養13日目から30日目は、10% KSRのみを添加した基礎培地、培養31日目以降は、RPE維持培地を使用した。培地は毎日、全量交換した。同時に、MEK阻害物質処理工程を含まない比較例1の条件(AK03培地はAK03N培地に変更)でもマイクロアレイ用検体の回収とRPE細胞の製造を実施した。
RNA抽出にはRNeasy Mini Kit(QIAGEN)を使用し、GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array(Affymetrix)を用いてマイクロアレイ解析を実施した。マイクロアレイ解析は倉敷紡績株式会社の受託解析を利用した。
培養43日目の培養プレートの観察像を元に、図8Aに従い、ウェル全体に占めるRPE細胞の割合を目視判定した結果(RPE細胞の割合に応じて0から5の6段階にスコア化)と、マイクロアレイ解析の結果である第一工程終了時における眼形成初期マーカーPAX6、LHX2、SIX3の発現値(Signal)、及び、フラグ(Detection)を表にまとめた(図12)。フラグは発現値の信頼性を表しており、Pは信頼性が高く、Aは信頼性が低いことを意味する。この結果から、ウェル全体に占めるRPE細胞の割合と、第一工程終了時におけるPAX6、LHX2、SIX3の発現値の間に相関関係が認められた。従って、第二工程への移行時期を、これら遺伝子の発現に基づき決定できる事が判明した。
ヒトiPS細胞(QHJI01株)のフィーダーフリー条件下での未分化維持培養は、「Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594」に記載の方法に従い行った。培地は「StemFit(登録商標)」AK03N培地(味の素)(以下、AK03N培地)を使用した。
MEK阻害物質又はFGF受容体阻害物質処理工程を含む網膜色素上皮(RPE)細胞の製造は以下の通り行った。未分化維持培養していたiPS細胞を0.5 x TrypLE select(TrypLE select(Life Technologies)と0.5 mM EDTA/PBS(-)を等量混合)で処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(ニッピ)(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり2.0 x 104細胞播種し、ROCK阻害物質[10 μM Y-27632(和光純薬)]含有AK03N培地で、37℃、5% CO2条件下で培養した。播種翌日、MEK阻害物質としてPD0325901(SIGMA)を最終濃度0.25 μM、0.5 μM、1 μM、2 μM、又は、4 μM、FGF受容体阻害物質としてPD173074(SIGMA)を最終濃度25 nM、50 nM、100 nM、200 nM、又は、400 nMになるようAK03N培地に添加し(第一工程開始)、6日間暴露した(第一工程終了)。その後、細胞を0.5 x TrypLE selectで処理し、セルスクレーパーを用いて剥離、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり2.0 x 105細胞播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した(第二工程開始)。培養1日目から4日目は、20% KSR(Life Technologies)、Y-27632(最終濃度10 μM)、Nodalシグナル伝達経路阻害物質としてSB-431542(和光純薬)(最終濃度5 μM)、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてCKI-7(SIGMA)(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地[GMEM培地(SIGMA)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(Life Technologies)、1 mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(和光純薬)、2 mM L-glutamine(SIGMA)、100 U/ml ペニシリン-100 μg/ml ストレプトマイシン(Life Technologies)]、培養5日目から8日目は、15% KSR、 Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養9日目から12日目は、10% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養13日目から30日目は、10% KSRのみを添加した基礎培地、培養31日目以降は、RPE維持培地 [67% DMEM low glucose(SIGMA)、29% F12(SIGMA)、1.9% B-27 supplement(Life Technologies)、1.9 mM L-glutamine、96 U/ml ペニシリン-96 μg/mlストレプトマイシン]を使用した。培地は毎日、全量交換した。同時に、MEK阻害物質処理工程を含まない比較例1(AK03培地はAK03N培地に変更)、及び、FGF受容体阻害物質処理工程を含まない比較例2の条件(AK03培地はAK03N培地に変更)でもRPE細胞の製造を実施した。
培養36日目と49日目に培養プレートを観察した結果、比較例1及び比較例2の条件では、黒褐色、多角、敷石状形態といったRPE細胞の典型的な特徴を示す細胞の出現はほぼ見られなかった(図13、無処理)。一方、検討した全てのMEK阻害物質濃度(0.25〜4 μM)、及び、FGF受容体阻害物質濃度(25〜400 nM)において、黒褐色を呈する細胞集団の広範囲な出現を確認できた(図13、MEKi:0.25〜4 μM、FGFRi:25〜400 nM)。
ヒトiPS細胞(QHJI01株)のフィーダーフリー条件下での未分化維持培養は、「Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594」に記載の方法に従い行った。培地は「StemFit(登録商標)」AK03N培地(味の素)(以下、AK03N培地)を使用した。
MEK阻害物質又はFGF受容体阻害物質処理工程を含む網膜色素上皮(RPE)細胞の製造は以下の通り行った。未分化維持培養していたiPS細胞を0.5 x TrypLE select(TrypLE select(Life Technologies)と0.5 mM EDTA/PBS(-)を等量混合)で処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(ニッピ)(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり2.0 x 104細胞播種し、ROCK阻害物質[10 μM Y-27632(和光純薬)]を含むAK03N培地で、37℃、5% CO2条件下で培養した。播種翌日、MEK阻害物質としてPD0325901(SIGMA)(最終濃度1 μM)、又は、FGF受容体阻害物質としてPD173074(SIGMA)(最終濃度100 nM)をAK03N培地に添加し(第一工程開始)、6日間暴露した(第一工程終了)。その後、細胞を0.5 x TrypLE selectで処理し、セルスクレーパーを用いて剥離、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり0.2、0.4、0.6、1.0、2.0、又は、4.0 x 105細胞(0.2、0.4、0.6、1.0、2.0、又は、4.0 x 104細胞/cm2)播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した(第二工程開始)。培養1日目から4日目は、20% KSR(Life Technologies)、Y-27632(最終濃度10 μM)、Nodalシグナル伝達経路阻害物質としてSB-431542(和光純薬)(最終濃度5 μM)、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてCKI-7(SIGMA)(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地[GMEM培地(SIGMA)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(Life Technologies)、1 mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(和光純薬)、2 mM L-glutamine(SIGMA)、100 U/ml ペニシリン-100 μg/ml ストレプトマイシン(Life Technologies)]、培養5日目から8日目は、15% KSR、 Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養9日目から12日目は、10% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養13日目から30日目は、10% KSRのみを添加した基礎培地、培養31日目以降は、RPE維持培地 [67% DMEM low glucose(SIGMA)、29% F12(SIGMA)、1.9% B-27 supplement(Life Technologies)、1.9 mM L-glutamine、96 U/ml ペニシリン-96 μg/mlストレプトマイシン]を使用した。培地は毎日、全量交換した。
培養49日目に培養プレートを観察した結果、検討した全ての播種細胞数(0.2、0.4、0.6、1.0、2.0、又は、4.0 x 104細胞/cm2)において、黒褐色を呈する細胞集団の広範囲な出現を確認できた(図14)。
ヒトiPS細胞(QHJI01株及び1231A3株)のフィーダーフリー条件下での未分化維持培養は、「Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594」に記載の方法に従い行った。培地は「StemFit(登録商標)」AK03N培地(味の素)(以下、AK03N培地)を使用した。
MEK阻害物質処理工程を含む網膜色素上皮(RPE)細胞の製造は以下の通り行った。未分化維持培養していたiPS細胞を0.5 x TrypLE select(TrypLE select(Life Technologies)と0.5 mM EDTA/PBS(-)を等量混合)で処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(ニッピ)(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり2.0 x 104細胞播種し、ROCK阻害物質[10 μM Y-27632(和光純薬)]を含むAK03N培地で、37℃、5% CO2条件下で培養した。播種翌日、MEK阻害物質としてPD0325901(SIGMA)(最終濃度1 μM)、PD184352(SIGMA)(最終濃度1.5 μM、3 μM、6 μM)、U0126(SIGMA)(最終濃度5 μM、10 μM)、TAK-7331(Selleck)(最終濃度0.3 μM)、又は、AZD-8330(Selleck)(最終濃度0.3 μM)をAK03N培地に添加し(第一工程開始)、6日間暴露した(第一工程終了)。その後、細胞を0.5 x TrypLE selectで処理し、セルスクレーパーを用いて剥離、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり2.0 x 105細胞播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した(第二工程開始)。培養1日目から4日目は、20% KSR(Life Technologies)、Y-27632(最終濃度10 μM)、Nodalシグナル伝達経路阻害物質としてSB-431542(和光純薬)(最終濃度5 μM)、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてCKI-7(SIGMA)(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地[GMEM培地(SIGMA)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(Life Technologies)、1 mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(和光純薬)、2 mM L-glutamine(SIGMA)、100 U/ml ペニシリン-100 μg/ml ストレプトマイシン(Life Technologies)]、培養5日目から8日目は、15% KSR、 Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養9日目から12日目は、10% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養13日目から30日目は、10% KSRのみを添加した基礎培地、培養31日目以降は、RPE維持培地 [67% DMEM low glucose(SIGMA)、29% F12(SIGMA)、1.9% B-27 supplement(Life Technologies)、1.9 mM L-glutamine、96 U/ml ペニシリン-96 μg/mlストレプトマイシン]を使用した。培地は毎日、全量交換した。同時に、MEK阻害物質処理工程を含まない比較例1の条件(AK03培地はAK03N培地に変更)でもRPE細胞の製造を実施した。
培養49日目と50日目に培養プレートを観察した結果、比較例1の条件では、黒褐色、多角、敷石状形態といったRPE細胞の典型的な特徴を示す細胞の出現はほぼ見られなかった(図15、無処理)。一方、検討した全てのMEK阻害物質(PD0325901、PD184352、U0126、TAK-7331、AZD-8330)において、黒褐色を呈する細胞集団の広範囲な出現を確認できた(図15、PD0325901、PD184352、U0126、TAK-733、AZD-8330)。
ヒトiPS細胞(QHJI01株及び1231A3株)のフィーダーフリー条件下での未分化維持培養は、「Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594」に記載の方法に従い行った。培地は「StemFit(登録商標)」AK03N培地(味の素)(以下、AK03N培地)を使用した。
FGF受容体阻害物質処理工程を含む網膜色素上皮(RPE)細胞の製造は以下の通り行った。未分化維持培養していたiPS細胞を0.5 x TrypLE select(TrypLE select(Life Technologies)と0.5 mM EDTA/PBS(-)を等量混合)で処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(ニッピ)(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり2.0 x 104細胞播種し、ROCK阻害物質[10 μM Y-27632(和光純薬)]を含むAK03N培地で、37℃、5% CO2条件下で培養した。播種翌日、FGF受容体阻害物質としてPD173074(SIGMA)(最終濃度100 nM)、又は、SU5402(SIGMA)(最終濃度5 μM、10 μM、20 μM)をAK03N培地に添加し(第一工程開始)、6日間暴露した(第一工程終了)。その後、細胞を0.5 x TrypLE selectで処理し、セルスクレーパーを用いて剥離、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり2.0 x 105細胞播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した(第二工程開始)。培養1日目から4日目は、20% KSR(Life Technologies)、Y-27632(最終濃度10 μM)、Nodalシグナル伝達経路阻害物質としてSB-431542(和光純薬)(最終濃度5 μM)、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてCKI-7(SIGMA)(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地[GMEM培地(SIGMA)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(Life Technologies)、1 mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(和光純薬)、2 mM L-glutamine(SIGMA)、100 U/ml ペニシリン-100 μg/ml ストレプトマイシン(Life Technologies)]、培養5日目から8日目は、15% KSR、 Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養9日目から12日目は、10% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養13日目から30日目は、10% KSRのみを添加した基礎培地、培養31日目以降は、RPE維持培地 [67% DMEM low glucose(SIGMA)、29% F12(SIGMA)、1.9% B-27 supplement(Life Technologies)、1.9 mM L-glutamine、96 U/ml ペニシリン-96 μg/mlストレプトマイシン]を使用した。培地は毎日、全量交換した。同時に、FGF受容体阻害物質処理工程を含まない比較例2の条件(AK03培地はAK03N培地に変更)でもRPE細胞の製造を実施した。
培養49日目に培養プレートを観察した結果、比較例2の条件では、黒褐色、多角、敷石状形態といったRPE細胞の典型的な特徴を示す細胞の出現はほぼ見られなかった(図16、無処理)。一方、検討した全てのFGF受容体阻害物質(PD173074、SU5402)において、黒褐色を呈する細胞集団の広範囲な出現を確認できた(図16、PD173074、SU5402)。
ヒトiPS細胞(QHJI01株)のフィーダーフリー条件下での未分化維持培養は、「Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594」に記載の方法に従い行った。培地は「StemFit(登録商標)」AK03N培地(味の素)(以下、AK03N培地)を使用した。
MEK阻害物質処理工程を含む網膜色素上皮(RPE)細胞の製造は以下の通り行った。未分化維持培養していたiPS細胞を0.5 x TrypLE select(TrypLE select(Life Technologies)と0.5 mM EDTA/PBS(-)を等量混合)で処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(ニッピ)(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり2.0 x 104細胞播種し、ROCK阻害物質[10 μM Y-27632(和光純薬)]を含むAK03N培地で、37℃、5% CO2条件下で培養した。播種翌日、MEK阻害物質としてPD0325901(SIGMA)(最終濃度1 μM)をAK03N培地に添加し(第一工程開始)、6日間暴露した(第一工程終了)。その後、細胞を0.5 x TrypLE selectで処理し、セルスクレーパーを用いて剥離、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(0.5 μg/cm2)でコーティングした12穴培養プレートに、1穴あたり0.8 x 105細胞播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した(第二工程開始)。第二工程では以下の3種類の培地を使用した。培養1日目から12日目に、10% KSR(Life Technologies)、Y-27632(最終濃度10 μM)、Nodalシグナル伝達経路阻害物質としてSB-431542(和光純薬)(最終濃度5 μM)、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてCKI-7(SIGMA)(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地[GMEM培地(SIGMA)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(Life Technologies)、1 mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(和光純薬)、2 mM L-glutamine(SIGMA)、100 U/ml ペニシリン-100 μg/ml ストレプトマイシン(Life Technologies)](図17、NODALi+WNTi)、10% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM) 、SB-431542 (最終濃度5 μM) を添加した基礎培地(図17、NODALi)、又は、10% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM) 、CKI-7 (最終濃度3 μM)を添加した基礎培地(図17、WNTi)を使用した。培養13日目から30日目は、10% KSRのみを添加した基礎培地、培養31日目以降は、RPE維持培地 [67% DMEM low glucose(SIGMA)、29% F12(SIGMA)、1.9% B-27 supplement(Life Technologies)、1.9 mM L-glutamine、96 U/ml ペニシリン-96 μg/mlストレプトマイシン]を使用した。培地は毎日、全量交換した。
培養43日目に培養プレートを観察した結果、Nodalシグナル伝達経路阻害物質とWntシグナル伝達経路阻害物質の両処理条件(NODALi+WNTi)、及び、Nodalシグナル伝達経路阻害物質の単剤処理条件(NODALi)で同程度の黒褐色、多角、敷石状形態といったRPE細胞の典型的な特徴を示す細胞の出現が確認された(図17、NODALi+WNTi、NODALi)。また、Wntシグナル伝達経路阻害物質の単剤処理(WNTi)では、ウェル全体に占める黒褐色面積の減少は見られたが、十分な数のRPE細胞の特徴を示す細胞の出現を確認できた(図17、WNTi)。以上の結果から、第二工程では、Nodalシグナル伝達経路阻害物質、又は、Wntシグナル伝達経路阻害物質のどちらか一方が存在していればよいことが確認できた。
ヒトiPS細胞(201B7株)のフィーダーフリー条件下での未分化維持培養は、「Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594」に記載の方法に従い行った。培地は「StemFit(登録商標)」AK03培地(味の素)(以下、AK03培地)を使用した。
MEK阻害物質及びBMP受容体阻害物質処理工程を含む網膜色素上皮(RPE)細胞の製造は以下の通り行った。未分化維持培養していたiPS細胞を0.5 x TrypLE select(TrypLE select(Life Technologies)と0.5 mM EDTA/PBS(-)を等量混合)で処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(ニッピ)(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり1.2 x 104細胞播種し、ROCK阻害物質[10 μM Y-27632(和光純薬)]含有AK03培地で、37℃、5% CO2条件下で培養した。MEK阻害物質を6日間、BMP受容体阻害物質を1日間暴露する場合は、播種翌日、MEK阻害物質としてPD0325901(SIGMA)(最終濃度1 μM)をAK03培地に添加し(第一工程開始)、播種6日後にBMP受容体阻害物質としてLDN193189(STEMGENT)(最終濃度100 nM)をAK03培地に添加することで、MEK阻害物質、BMP受容体阻害物質をそれぞれ6日間、1日間暴露した(第一工程終了)。MEK阻害物質、BMP受容体阻害物質を共に6日間暴露する場合は、播種翌日、PD0325901(最終濃度1 μM)とLDN193189(最終濃度100 nM)をAK03培地に添加し(第一工程開始)、6日間暴露した(第一工程終了)。その後、細胞を0.5 x TrypLE selectで処理し、セルスクレーパーを用いて剥離、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり2.0 x 105細胞播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した(第二工程開始)。培養1日目は、Y-27632(最終濃度10 μM)、Nodalシグナル伝達経路阻害物質としてSB-431542(和光純薬)(最終濃度5 μM)、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてCKI-7(SIGMA)(最終濃度3 μM)を添加したAK03培地を使用し、培養2日目から5日目は、20% KSR(Life Technologies)、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542 (最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地[GMEM培地(SIGMA)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(Life Technologies)、1 mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(和光純薬)、2 mM L-glutamine(SIGMA)、100 U/ml ペニシリン-100 μg/ml ストレプトマイシン(Life Technologies)]、培養6日目から9日目は、15% KSR、 Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養10日目から13日目は、10% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養14日目から30日目は、10% KSRのみを添加した基礎培地、培養31日目以降は、RPE維持培地 [67% DMEM low glucose(SIGMA)、29% F12(SIGMA)、1.9% B-27 supplement(Life Technologies)、1.9 mM L-glutamine、96 U/ml ペニシリン-96 μg/mlストレプトマイシン]を使用した。培地は毎日、全量交換した。同時に、MEK阻害物質処理工程を含まない比較例1の条件でもRPE細胞の製造を実施した。
培養39日目に観察後、細胞を回収してRNA抽出を行い、リアルタイムRT-PCRを実施した。RNA抽出にはRNeasy Mini Kit(QIAGEN)を使用し、リアルタイムRT-PCRにはQuantiTect Probe RT-PCR Kit(QIAGEN)を使用した。BEST1(Hs00188249_m1)、MITF(Hs01117294_m1)、RAX(Hs00429459_m1)、GAPDH(Hs02758991_g1)のプライマー、プローブはApplied Biosystemsから購入した。各検体のBEST1、MITF、RAXの発現量をGAPDHの発現量で補正し、未分化維持培養条件で培養されていたiPS細胞(未分化)の発現量を1とした時の相対値で表した。
培養39日目の培養プレートの観察像を元に、図8Aに従い、ウェル全体に占めるRPE細胞の割合を目視判定した。その結果、無処理は「1」、MEK阻害物質6日間+BMP受容体阻害物質1日間暴露は「3」、MEK阻害物質6日間+BMP受容体阻害物質6日間暴露は「5」であった(図18上側、細胞写真)。これら検体と未分化維持培養を継続していたiPS細胞(未分化)との間で、網膜色素上皮細胞マーカーであるBEST1、MITF、眼形成初期マーカーであるRAXの発現量をリアルタイムRT-PCR法によって比較した結果、黒褐色細胞の面積と上記マーカー遺伝子の発現量との間に相関関係が認められた(図18下側、グラフ)。以上の結果から、黒褐色を呈している細胞が網膜色素上皮細胞マーカー遺伝子及び眼形成初期マーカー遺伝子を発現していることが示唆された。併せて、本製造法によってRPE細胞が製造された事が遺伝子発現レベルにおいても検証された。
ヒトiPS細胞(1231A3株)のフィーダーフリー条件下での未分化維持培養は、「Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594」に記載の方法に従い行った。培地は「StemFit(登録商標)」AK03N培地(味の素)(以下、AK03N培地)を使用した。
MEK阻害物質又はFGF受容体阻害物質処理工程を含む網膜色素上皮(RPE)細胞の製造は以下の通り行った。未分化維持培養していたiPS細胞を0.5 x TrypLE select(TrypLE select(Life Technologies)と0.5 mM EDTA/PBS(-)を等量混合)で処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(ニッピ)(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり2.0 x 104細胞播種し、ROCK阻害物質[10 μM Y-27632(和光純薬)]含有AK03N培地で、37℃、5% CO2条件下で培養した。播種翌日、MEK阻害物質としてPD0325901(SIGMA)(最終濃度1 μM)、又は、FGF受容体阻害物質としてPD173074(SIGMA)(最終濃度100 nM)をAK03N培地に添加し(第一工程開始)、6日間暴露した(第一工程終了)。その後、細胞を0.5 x TrypLE selectで処理し、セルスクレーパーを用いて剥離、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり2.0 x 105細胞播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した(第二工程開始)。培養1日目から4日目は、20% KSR(Life Technologies)、Y-27632(最終濃度10 μM)、Nodalシグナル伝達経路阻害物質としてSB-431542(和光純薬)(最終濃度5 μM)、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてCKI-7(SIGMA)(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地[GMEM培地(SIGMA)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(Life Technologies)、1 mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(和光純薬)、2 mM L-glutamine(SIGMA)、100 U/ml ペニシリン-100 μg/ml ストレプトマイシン(Life Technologies)]、培養5日目から8日目は、15% KSR、 Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養9日目から12日目は、10% KSR、Y-27632(最終濃度10 μM)、SB-431542(最終濃度5 μM)、CKI-7(最終濃度3 μM)を添加した基礎培地、培養13日目から30日目は、10% KSRのみを添加した基礎培地、培養31日目以降は、RPE維持培地 [67% DMEM low glucose(SIGMA)、29% F12(SIGMA)、1.9% B-27 supplement(Life Technologies)、1.9 mM L-glutamine、96 U/ml ペニシリン-96 μg/mlストレプトマイシン]を使用した。培地は毎日、全量交換した。同時に、MEK阻害物質処理工程を含まない比較例1の条件(AK03培地はAK03N培地に変更)でも実験を実施した。
培養43日目に観察後、細胞を回収してRNA抽出を行い、RT-PCRを実施した。RNA抽出にはRNeasy Micro Kit(QIAGEN)、逆転写反応にはOligo(dT)12-18 Primer(Invitrogen)、SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)、PCRにはBlend Taq -Plus-(TOYOBO)を使用した。RPE65、BEST1、CRLBP、GAPDHのプライマー配列は以下の通りである。RPE65-F: TCCCCAATACAACTGCCACT(配列番号1)、RPE65-R: CCTTGGCATTCAGAATCAGG(配列番号2)、BEST1-F: TAGAACCATCAGCGCCGTC(配列番号3)、BEST1-R: TGAGTGTAGTGTGTATGTTGG(配列番号4)、CRALBP-F: GAGGGTGCAAGAGAAGGACA(配列番号5)、CRALBP-R: TGCAGAAGCCATTGATTTGA(配列番号6)、GAPDH-F: ACCACAGTCCATGCCATCAC(配列番号7)、GAPDH-R: TCCACCACCCTGTTGCTGTA(配列番号8)。PCR反応のサイクル数は、RPE65、BEST1、GAPDHが30サイクル、CRALBPは35サイクルで実施した。PCR産物はアガロースゲル電気泳動によって、RPE65は369 bp付近、BEST1は261 bp付近、CRALBPは341 bp付近、GAPDHは452 bp付近に一本のバンドとして検出された。陽性対照としてprimary human RPE(hRPE)、陰性対照として未分化維持培養条件で培養されていたiPS細胞(未分化iPSC)を使用した。
培養43日目に培養プレートを観察した結果、比較例1の条件では、黒褐色、多角、敷石状形態といったRPE細胞の典型的な特徴を示す細胞の出現は、わずかしか確認できなかった(図19右側、細胞写真、無処理)。一方、MEK阻害物質及びFGF受容体阻害物質で暴露した場合、黒褐色を呈する細胞集団の広範囲な出現を確認できた(図19右側、細胞写真、MEKi、FGFRi)。RT-PCRを実施した結果、比較例1の条件では、網膜色素上皮細胞マーカーであるRPE65、BEST1、CRALBPのバンドが非常に薄かった(図19左側、電気泳動図、無処理)。一方、MEK阻害物質及びFGF受容体阻害物質で暴露した検体では明瞭なバンドを確認できた(図19左側、電気泳動図、MEKi、FGFRi)。以上の結果より、MEK阻害物質及びFGF受容体阻害物質処理工程を含む製法によって、RPE細胞が高効率に製造された事が遺伝子発現レベルにおいても検証された。
Claims (28)
- 以下の工程を含む、網膜色素上皮細胞の製造方法:
(1)多能性幹細胞を、FGF受容体阻害物質及び/又はMEK阻害物質を含む培地で、30日を超えない期間培養する第一工程、及び
(2)第一工程で得られた細胞を、Nodalシグナル伝達経路阻害物質及び/又はWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下において培養し、網膜色素上皮細胞を形成させる第二工程。 - 第一工程が、無血清条件下で行われる、請求項1に記載の製造方法。
- 第一工程が、フィーダー細胞非存在下で行われる、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 第一工程における培地が、さらに未分化維持因子を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製造方法。
- 未分化維持因子が、FGFシグナル伝達経路作用物質である、請求項4に記載の製造方法。
- FGFシグナル伝達経路作用物質が、bFGFである、請求項5に記載の製造方法。
- FGF受容体阻害物質が、PD173074及びSU5402からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の製造方法。
- MEK阻害物質が、PD0325901、PD184352、U0126、TAK-733、及びAZD-8330からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の製造方法。
- Nodalシグナル伝達経路阻害物質が、ALK4,5,又は7阻害物質である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の製造方法。
- ALK4,5,又は7阻害物質が、SB431542である、請求項9に記載の製造方法。
- Wntシグナル伝達経路阻害物質が、CKI-7である請求項1〜10のいずれか1項に記載の製造方法。
- 多能性幹細胞が、霊長類多能性幹細胞である請求項1〜11のいずれか1項に記載の製造方法。
- 多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である請求項1〜12のいずれか1項に記載の製造方法。
- 第一工程における培地が、さらにBMP受容体阻害物質を含む培地である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の製造方法。
- BMP受容体阻害物質が、ALK2/3阻害物質である請求項14に記載の製造方法。
- ALK2/3阻害物質が、LDN193189である請求項15に記載の製造方法。
- 第一工程における培地が、さらにソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む請求項1〜16のいずれか1項に記載の製造方法。
- ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が、SAGである請求項17に記載の製造方法。
- 第一工程における培地が、さらにPKC阻害物質を含む請求項1〜18のいずれか1項に記載の製造方法。
- PKC阻害物質が、Go6983である請求項19に記載の製造方法。
- 第一工程において、培養期間が2日間〜13日間である、請求項1〜20のいずれか1項に記載の製造方法。
- 第一工程において、培養期間が4日間〜6日間である、請求項1〜21のいずれか1項に記載の製造方法。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞を含有してなる、被験物質の毒性・薬効評価用試薬。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞に被験物質を接触させ、該物質が該細胞に及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞を含有してなる、網膜色素上皮細胞の障害に基づく疾患の治療薬。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞の有効量を、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜色素上皮細胞の障害に基づく疾患の治療方法。
- 網膜色素上皮細胞の障害に基づく疾患の治療における使用のための、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞を有効成分として含有する、医薬組成物。
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