CN112522292A - 一种用于构建先天性黑蒙症克隆猪核供体细胞的CRISPR/Cas9系统及其应用 - Google Patents

一种用于构建先天性黑蒙症克隆猪核供体细胞的CRISPR/Cas9系统及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于构建先天性黑蒙症克隆猪核供体细胞的CRISPR/Cas9系统及其应用。猪RPE65基因的gRNA，序列如SEQ ID NO.23所示。一种用于猪RPE65基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含本发明所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体。所述的Cas9表达载体为pU6gRNA eEF1a‑mNLS‑hSpCas9‑EGFP‑PURO。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体提高100％以上。本发明为先天性黑蒙症猪模型的制备奠定了坚实的基础，对于针对该病的治疗及病理研究具有重大应用价值。

Description

一种用于构建先天性黑蒙症克隆猪核供体细胞的CRISPR/ Cas9系统及其应用
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，涉及一种用于猪RPE65基因编辑的CRISPR/Cas9系统及其应用,具体涉及猪RPE65基因的gRNA靶点和CRISPR/Cas9系统，及其在构建RPE65基因敲除或插入的先天性黑蒙症克隆猪核供体细胞中的应用。
背景技术
先天性黑蒙症(Leber congenital amaurosis,LCA)，又称遗传性先天性视网膜病、
Figure BDA0002749338700000011
-Olsen综合征等，是发生最早、最严重的遗传性视网膜病变，占遗传性视网膜病变的5％以上，是导致儿童先天性盲的主要疾病(占10％-20％)，每10万名新生儿中有2至3名患病，大多为常染色体隐性遗传性疾病。
通过基因组扫描、候选基因技术和连锁分析等方法确认了20余种与先天性黑蒙症相关的致病基因，其中RPE65基因研究的最为深入。RPE65基因编码类视黄醇异构水解酶(Retinoid isomerohydrolase)，此酶的主要功能是结合全反式视黄酯，使之转化为11-顺-视黄醛，进而合成为视紫红质来维持视网膜色素再循环的过程。因此，当RPE65基因失去功能，视网膜的光感受细胞就会因缺乏视紫红质而不能对光发生反应，导致视力丧失。在所有的先天性黑蒙症病例中，RPE65基因突变导致的病例大约占15％，而传统医疗手段对此类遗传性疾病没有作用，因此迫切需要与人类疾病相似的动物模型开展新的治疗方法研究。猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，且猪体型大小和生理功能与人类近似，是理想的人类疾病模型动物。
基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的胚胎干细胞注射到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。如在小鼠模型制作中采用的受精卵显微注射基因编辑材料后再进行胚胎移植的方法，因其直接获得纯合突变后代的概率非常低(低于5％)，需要进行后代的杂交选育，这不太适用于妊娠期较长的大动物 (如猪)模型制作。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供猪RPE65基因的gRNA靶点、gRNA，及gRNA 表达载体。
本发明的另一目的是提供一种用于猪RPE65基因编辑的CRISPR/Cas9系统。
本发明的又一目的是提供该CRISPR/Cas9系统在构建RPE65基因敲除或插入的先天性黑蒙症模型猪重组细胞中的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
猪RPE65基因的gRNA靶点，序列如SEQ ID NO.17所示。
本发明所述的猪RPE65基因靶点的gRNA序列，由SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示互补DNA oligo组成。
猪RPE65基因的gRNA，序列如SEQ ID NO.29所示。
一种针对猪RPE65基因的gRNA表达载体，该表达载体表达本发明所述的gRNA。
作为本发明的一种优选，该表达载体含有本发明所述的gRNA序列。
作为本发明的进一步优选，该表达载体的载体骨架为pKG-U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示。
一种用于猪RPE65基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含本发明所述的gRNA表达载体和Cas9 表达载体。
作为本发明的一种优选，所述的Cas9表达载体为pU6gRNA- eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称pKG-GE3)，质粒全序列如SEQ ID NO.1所示。
为了增加Cas9质粒的基因编辑能力，我们在购自addgene(Plasmid#42230，fromZhang Feng lab)pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称PX330)载体的基础上进行改造得到 pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称粒pKG-GE3)。PX330的图谱如图1，改造方式如下：
1)去除原载体gRNA骨架中多余无效的序列；
2)改造启动子：将原有启动子(chickenβ-actin启动子)改造为具更高表达活性的EF1a 启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；
3)增加核定位信号：在Cas9的N端及C端均增加核定位信号编码序列(NLS)，增加Cas9 的核定位能力；
4)增加双筛选标记：原载体无任何筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，在Cas9 的C端，插入P2A-EGFP-T2A-PURO，赋予载体荧光和抗性筛选能力；
5)插入WPRE和3’LTR等调控基因表达的序列：在基因读码框最后插入WPRE、3’LTR等序列，可增强Cas9基因的蛋白翻译能力。
改造后载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称pKG-GE3)及改造位点如图2，质粒全序列如SEQ ID NO：1所示；pKG-GE3的主要元件有：
1)gRNA表达元件：U6gRNA scaffold；
2)启动子：EF1a启动子和CMV增强子；
3)含多个NLS的Cas9基因：含N端和C端多核定位信号(NLS)的Cas9基因；
4)筛选标记基因：荧光和抗性双筛选标记元件P2A-EGFP-T2A-PURO；
5)增强翻译的元件：WPRE和3’LTR增强Cas9及筛选标记基因的翻译效率；
6)转录终止信号：bGH polyA signal；
7)载体骨架：包括Amp抗性元件和ori复制子等。
质粒pKG-GE3中，具有特异融合基因；所述特异融合基因编码特异融合蛋白；
所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括如下元件：两个核定位信号(NLS)、Cas9蛋白、两个核定位信号、自剪切多肽P2A、荧光报告蛋白、自裂解多肽T2A、抗性筛选标记蛋白；
质粒pKG-GE3中，由EF1a启动子启动所述特异融合基因的表达；
质粒pKG-GE3中，所述特异融合基因下游具有WPRE序列元件、3’LTR序列元件和bGHpoly(A) signal序列元件。
质粒pKG-GE3中，依次具有如下元件：CMV增强子、EF1a启动子、所述特异融合基因、WPRE 序列元件、3’LTR序列元件、bGH poly(A)signal序列元件。
所述特异融合蛋白中，Cas9蛋白上游的两个核定位信号为SV40核定位信号，Cas9蛋白下游的两个核定位信号为nucleoplasmin核定位信号。
所述特异融合蛋白中，荧光报告蛋白具体可为EGFP蛋白。
所述特异融合蛋白中，抗性筛选标记蛋白具体可为Puromycin蛋白。
自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”(发生自剪切的断裂位置为C 端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。
自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”(发生自裂解的断裂位置为C 端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。
特异融合基因具体如SEQ ID NO：1中第911-6706位核苷酸所示。
CMV增强子如SEQ ID NO：1中第395-680位核苷酸所示。
EF1a启动子如SEQ ID NO：1中第682-890位核苷酸所示。
WPRE序列元件如SEQ ID NO：1中第6722-7310位核苷酸所示。
3’LTR序列元件如SEQ ID NO：1中第7382-7615位核苷酸所示。
bGH poly(A)signal序列元件如SEQ ID NO：1中第7647-7871位核苷酸所示。
作为本发明的一种优选，所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为1～3:1，进一步优选3:1。
本发明所述的CRISPR/Cas9系统在构建猪RPE65基因敲除或插入的先天性黑蒙症模型猪重组细胞中的应用。
一种重组细胞，由本发明所述的CRISPR/Cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。
本发明所述的重组细胞在构建RPE65基因敲除的克隆猪中的应用。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
(1)本发明针对猪RPE65基因设计了四个gRNA，从中筛选高效gRNA后再进行预设靶点的敲除，可有效降低后期鉴定筛选的工作量，并可直接用PCR产物测序来检测基因编辑效率。
(2)本发明中经过实验验证改造的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体相对改造前的pX330载体，更换了更强的启动子及添加了增强蛋白翻译的元件，提高了Cas9的表达，并且增加了核定位信号个数，提高了Cas9蛋白的核定位能力，具有更高的基因编辑效率。本发明还在载体中加入了荧光标记及抗性标记，使其更方便运用于载体阳性转化细胞的筛选及富集。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体提高100％以上。
(3)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。大小鼠等啮齿类动物不论从生理、病理及体型上，均与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。灵长类动物扩繁速度慢、数量少、成本高，动物保护及伦理等方面的要求也较高。而猪就没有上述缺点，同时猪的克隆技术非常成熟，饲养及克隆成本较灵长类低得多。因此猪是非常适合作为人类疾病模型的动物。
(4)采用本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑，通过靶标基因PCR产物测序结果可分析出所获细胞的基因型(纯合突变包括双等位基因相同突变和双等位基因不同突变、杂合突变或野生型)，获得纯合突变的概率为30％～50％，优于使用胚胎注射技术的模型制备方法(即受精卵注射基因编辑材料)中获得纯合突变的概率(低于5％)。
(5)利用本发明所得到的纯合突变单克隆细胞株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到含靶标基因纯合突变的克隆猪，并且该纯合突变可稳定遗传。
本发明采用技术难度大、挑战性高的原代细胞体外编辑并筛选阳性编辑单克隆细胞的方法，后期再通过体细胞核移植动物克隆技术直接获得相应疾病模型猪，可大大缩短模型猪制作周期并节省人力、物力、财力。
基于RPE65基因突变制作的先天性黑蒙症猪模型可用于进行药物筛选、疾病病理、基因及细胞治疗等研究，为进一步的临床应用提供有效的实验数据，也为成功治疗人类先天性黑蒙症提供有力的实验手段。
附图说明
图1为质粒pX330的结构示意图。
图2为质粒pU6gRNACas9的结构示意图。
图3为pU6gRNA-eEF1a Cas9载体的结构图谱。
图4为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体图谱。
图5为质粒pKG-GE3的结构示意图。
图6为质粒pKG-U6gRNA的结构示意图。
图7为将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA 的示意图。
图8为实施例2中步骤2.3.3的测序峰图。
图9为实施例2中步骤2.4.3的测序峰图。
图10为实施例3中步骤3.2.3以猪的基因组DNA为模板分别采用 RPE65-E5g-F3/RPE65-E5g-R389(组1)、RPE65-E5g-F3/RPE65-E5g-R453(组2)、 RPE65-E5g-F4/RPE65-E5g-R389(组3)、RPE65-E5g-F4/RPE65-E5g-R453(组4)组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
图11为实施例3中步骤3.2.4以18只猪的基因组DNA为模板采用 RPE65-E5g-F3/RPE65-E5g-R453组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
图12为实施例4中步骤4.3.4以基因组DNA为模板采用RPE65-E5g-F3/RPE65-E5g-R453 组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
图13为实施例5中步骤5.4.4以基因组DNA为模板采用RPE65-E5g-F3/RPE65-E5g-R453 组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
图14为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为野生型的示例性测序峰图。
图15为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为双等位相同突变的示例性测序峰图。
图16为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为杂合突变的示例性测序峰图。
图17为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为双等位不同突变的示例性测序峰图。
具体实施方式
实施例1 Cas9高效表达载体的构建及pKG-U6gRNA载体的构建
1.1 pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(Cas9高效表达载体)的构建
(1)去除gRNA骨架中多余无效的序列
pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称pX330，图1)用BbsI、XbaI酶切，回收载体片段(约8313bp左右)，利用多片段重组法合成插入片段175bp(SEQ ID NO：31)，与回收后载体片段重组得到pU6gRNACas9载体(图2)。
(2)改造启动子及增强子
对构建好的pU6gRNACas9载体，用XbaI和AgeI内切酶去除启动子(chickenβ-actin启动子)及增强子序列(CMV增强子)，回收线性载体序列约7650bp，并利用多片段重组法合成554bp的包含CMV增强子及EF1a启动子的序列(SEQ ID NO：32)，与酶切后载体pU6gRNACas9 重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9载体(图3)。
(3)Cas9基因N端增加NLS序列
将构建好的载体pU6gRNA-eEF1a Cas9使用AgeI、BglII酶切，回收7786bp载体序列，并将增加了NLS的序列补充到酶切位点，即利用多片段重组法合成447bp的包括2个核定位信号及部分切除的Cas9编码序列(SEQ ID NO：33)，重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体(图4)。
(4)Cas9基因C端加入NLS、P2A-EGFP-T2A-PURO、WPRE-3’LTR-bGH polyA signals
以上构建好的载体命名为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS，使用FseI、SbfI酶切，回收载体序列7781bp，利用多片段重组法合成2727bp的包括 NLS-P2A-EGFP-T2A-PURO-WPRE-3’LTR-bGH polyA signals(SEQ ID NO：34)的序列，与载体片段重组得到载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，简称pKG-GE3，质粒图谱如图5，碱基序列(SEQ ID NO：1)。
改造后载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO主要元件：
1)gRNA表达元件：U6-gRNA scaffold。
2)启动子：EF1a启动子和CMV增强子。
3)含多个NLS的cas9基因：含N端和C端多核定位信号(NLS)的Cas9基因。
4)筛选标记基因：荧光和抗性双筛选标记元件P2A-EGFP-T2A-PURO。
5)增强翻译的元件：WPRE和3’LTR，增强cas9及筛选标记基因的翻译。
6)转录终止信号：bGH polyA signal。
7)载体骨架：包括Amp抗性元件和ori复制子等。
1.2构建pKG-U6gRNA载体
来源pUC57载体，通过EcoRV酶切位点，连接pKG-U6gRNA插入序列(含U6启动子、BbsI 酶切位点和sgRNA骨架序列的DNA片段，序列如SEQ ID NO.2所示)，反向插入到pUC57载体，得到pKG-U6gRNA载体全序列(SEQ ID NO.3)，所构建的pKG-U6gRNA载体图谱如图6。
实施例2质粒配比优化以及质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较
2.1 gRNA靶点设计及构建
2.1.1使用Benchling对RAG1基因进行gRNA靶点设计
RAG1-gRNA4：AGTTATGGCAGAACTCAGTG(SEQ ID NO.4)
合成的RAG1基因共2个靶点的插入序列互补DNA oligo如下：
RAG1-gRNA4S：caccgAGTTATGGCAGAACTCAGTG(SEQ ID NO.5)
RAG1-gRNA4A：aaacCACTGAGTTCTGCCATAACTc(SEQ ID NO.6)
RAG1-gRNA4S、RAG1-gRNA4A均为单链DNA分子。
2.1.2设计用于扩增包含RAG1gRNA靶点片段的引物
RAG1-nF126：CCCCATCCAAAGTTTTTAAAGGA(SEQ ID NO.7)
RAG1-nR525：TGTGGCAGATGTCACAGTTTAGG(SEQ ID NO.8)
2.1.3将gRNA序列克隆到pKG-U6gRNA骨架载体上的方法
1)用限制性内切酶BbsI消化1ug pKG-U6gRNA质粒；
2)酶切的pKG-U6gRNA质粒跑琼脂糖凝胶(琼脂糖凝胶浓度1％，即1g琼脂糖凝胶加入到 100mL电泳缓冲液中)分离，用胶回收试剂盒(Vazyme)纯化回收酶切产物；
3)将2.1.1所述靶点合成的2条互补DNA oligo，通过以下退火程序形成与pKG-U6gRNA 载体BbsI酶切后粘性末端互补的DNA双链，示意如图7：
95℃，5min然后以5℃/min的速率降至25℃；
4)按照以下体系启动连接反应：室温反应10min
Figure BDA0002749338700000071
Figure BDA0002749338700000081
37℃反应60min；
5)转化
按照感受态细胞(Vazyme)说明书进行操作。
2.1.4 gRNA载体构建
1)将合成的RAG1-gRNA4S和RAG1-gRNA4A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA 分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)将会表达SEQ ID NO.9所示的RAG1-gRNA4。
2.1.5 gRNA载体鉴定
从LB平板上挑取单克隆置入加有相应抗生素的LB培养液内，37℃恒温摇床内培养12-16h 后小提质粒后送通用公司测序，经序列比对确认RAG1-gRNA4载体构建成功。
2.2猪原代成纤维细胞制备
2.2.1取初生从江香猪耳组织0.5g，去除外部组织，75﹪酒精浸泡30-40s；
2.2.2用含5％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)的PBS洗涤5次，不含P/S的PBS 洗一次；
其中5％P/S的PBS配方为：5％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+95％PBS，5％、 95％为体积百分比。
2.2.3用剪刀将组织剪碎，加入5mL1％的胶原酶(Sigma)溶液，37℃摇床消化1h；
2.2.4 500g离心5min，去上清，将沉淀用1mL完全培养基重悬，铺入含10mL完全培养基并已用0.2％明胶(VWR)封盘的10cm细胞培养皿中。
其中，细胞完全培养基的配方为：15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基
(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio)，15％、83％、 1％、1％为体积百分比。
2.2.5置于37℃，5％CO2(体积百分比)、5％O2(体积百分比)的恒温培养箱中进行培养；
2.2.6将细胞培养至长满皿底60％左右时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶将细胞消化下来，然后加入完全培养基终止消化，将细胞悬液转入15mL离心管中，400g离心4min，弃去上清，使用1mL完全培养基重悬细胞以备下一步核转染实验。
2.3质粒配比优化
2.3.1共转染分组情况
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.44μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.56μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为1：1。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.72μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.28μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为2：1。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为3：1.
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染致猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。
2.3.2共转染操作方法
使用哺乳动物成纤维细胞核转染试剂盒(Neon)与Neon TM transfection system电转仪进行转染实验。
1)按照上述分组配制电转反应液，混匀过程中注意切勿产生气泡；
2)将步骤一制备得到的细胞悬液使用PBS磷酸缓冲液(Solarbio)洗一遍，600g离心6min，弃去上清，使用11μL电转基本溶液Opti-MEM重悬细胞，重悬过程中要避免气泡的产生；
3)吸取10μL细胞悬液，加入步骤1)中的电转反应液中混匀，混匀过程中注意切勿产生气泡；
4)将试剂盒带有的电转杯放置于Neon TM transfection system电转仪杯槽内，加入3mL E Buffer；
5)用电转枪吸取10μL步骤3)得到的混合液，插入点击杯内，选择电转程序(1450V10ms 3pulse)，电击转染后立即在超净台内将电转枪中混合液转入到6孔板中，每孔含3mL15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％ HEPES(Solarbio)的完全培养液；
6)混匀后放置于37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养；
7)电转后6-12h换液，36-48h用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞于1.5mL离心管中。
2.3.3基因编辑效率分析
提取2.3.2中收集的细胞基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行 PCR扩增，将产物进行测序。测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出第一组、第二组、第三组的编辑效率依次为9％、53％、66％，测序结果示例性峰图见图8。分析认定第三组的基因编辑效率最高，即确定gRNA质粒与Cas9质粒最适用量为摩尔比3：1，质粒实际用量为0.92μg：1.08μg。
2.4质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较
2.4.1共转染分组情况
RAG1-330组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pX330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pX330。
RAG1-KG组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。
RAG1-B组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。
2.4.2共转染操作方法
同本实施例中2.3.2。
2.4.3基因编辑效率分析
提取2.4.2中收集的细胞基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行 PCR扩增，将产物进行测序。测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出 RAG1-330组、RAG1-KG组的编辑效率分别为28％、68％，测序结果示例性峰图见图9，结果表明，与采用质粒pX330相比，采用质粒pKG-GE3使得基因编辑效率显著提高。
实施例3 RPE65基因靶点的设计及构建
3.1基因组DNA的提取
使用Vazyme公司FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit(VazymeCat.DC102-01) 分别进行18只猪(雄性A、B、C、D、E、F、G、H雌性1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)耳组织的基因组DNA的柱式提取，使用NanoDrop进行定量，-20℃保存备用。
3.2 RPE65基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析
3.2.1猪RPE65基因信息
编码类视黄醇异构水解酶(Retinoid isomerohydrolase)；位于6号染色体；GeneID 为100516743，Sus scrofa。已有研究结果表明RPE65在骨量调节过程中起核心作用，在猪基因组DNA中，RPE65基因具有14个外显子，其中第5外显子在所有转录本中均占据重要位置 (猪RPE65基因第5外显子序列，含第4外显子、第4内含子和部分第5内含子序列如SEQ ID NO.10所示)。
3.2.2 RPE65基因敲除预设靶点外显子及邻近基因组序列PCR扩增引物设计
根据查到的猪RPE65基因组序列
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010448.4？report＝genbank& from＝144206078&to＝144229471)，设计引物扩增前述18只猪基因组样品RPE65基因外显子5的位点。
使用Oligo7进行引物设计，设计结果如下：
RPE65-E5g-F3：ATCGTCATAACAGAATTTGGC(SEQ ID NO.11)
RPE65-E5g-R453：AGCTAGTAGTTGATGACAAAG(SEQ ID NO.12)
RPE65-E5g-F4：TCCCAGACCCCTGCAAGAATATA(SEQ ID NO.13)
RPE65-E5g-R389：CTTAATCTATCTGGCTTTCAT(SEQ ID NO.14)
3.2.3 RPE65基因组PCR扩增引物筛选
使用猪(雌性1#)耳朵组织提取的基因组为模板，使用设计的两条上游和两条下游组合， Max酶(Vazyme公司货号：P505)进行PCR，产物进行1％琼脂糖凝胶电泳以筛选好的扩增引物，结果如图10，组1：RPE65-E5g-F3/RPE65-E5g-R389；组2：RPE65-E5g-F3/RPE65-E5g-R453；组3：RPE65-E5g-F4/RPE65-E5g-R389；组4：RPE65-E5g-F4/RPE65-E5g-R453，选择RPE65-E5g-F3/RPE65-E5g-R453对目的片段进行扩增。
3.2.4 18只猪RPE65基因片段PCR扩增
分别以18个基因组模板(雄性A、B、C、D、E、F、G、H雌性1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10)，引物RPE65-E5g-F3/RPE65-E5g-R453，Max酶进行RPE65基因组片段的扩增，产物(450bp) 进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图11。
3.2.5 RPE65基因序列保守性分析
以上PCR扩增产物，使用扩增引物进行测序(通用生物公司测序)，将测序结果与公共数据库中的RPE65基因序列进行比对分析。根据比对结果，扩增片段序列相对保守，所设计的引物本身无可能的突变位点。
3.3 gRNA靶点设计及构建
3.3.1使用Benchling进行靶点gRNA设计
设计靶点已避开可能的突变位点，使用Benchling进行靶点gRNA设计：
https://benchling.com/
RPE65基因敲除靶点设计如下：
RPE65-E5-g1：TGTTAATATCTACCCAGTGG(SEQ ID NO.15)
RPE65-E5-g2：CACTGGGTAGATATTAACAA(SEQ ID NO.16)
RPE65-E5-g3：CCTTGTTAATATCTACCCAG(SEQ ID NO.17)
RPE65-E5-g4：AATGAAGTTGGTCTCTGTGC(SEQ ID NO.18)
合成的RPE65基因共4个靶点的插入序列互补DNA oligo如下：
RPE65-E5-g1S：caccgTGTTAATATCTACCCAGTGG(SEQ ID NO.19)
RPE65-E5-g1A：aaacCCACTGGGTAGATATTAACAc(SEQ ID NO.20)
RPE65-E5-g2S：caccgCACTGGGTAGATATTAACAA(SEQ ID NO.21)
RPE65-E5-g2A：aaacTTGTTAATATCTACCCAGTGc(SEQ ID NO.22)
RPE65-E5-g3S：caccgCCTTGTTAATATCTACCCAG(SEQ ID NO.23)
RPE65-E5-g3A：aaacCTGGGTAGATATTAACAAGGc(SEQ ID NO.24)
RPE65-E5-g4S：caccgAATGAAGTTGGTCTCTGTGC(SEQ ID NO.25)
RPE65-E5-g4A：aaacGCACAGAGACCAACTTCATTc(SEQ ID NO.26)
RPE65-E5-g1S、RPE65-E5-g1A、RPE65-E5-g2S、RPE65-E5-g2A、RPE65-E5-g3S、RPE65-E5-g3A、RPE65-E5-g4S、RPE65-E5-g4A均为单链DNA分子。
3.3.2将gRNA序列克隆到pKG-U6gRNA骨架载体上的方法
同实施例2中2.1.3。
3.3.3 gRNA载体构建
1)将合成的RPE65-E5-g1S和RPE65-E5-g1A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链 DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g1)。质粒pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g1)将会表达SEQ ID NO.27所示的 RPE65-E5-gRNA1。
2)将合成的RPE65-E5-g2S和RPE65-E5-g2A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链 DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g2)。质粒pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g2)将会表达SEQ ID NO.28所示的 RPE65-E5-gRNA2。
3)将合成的RPE65-E5-g3-S和RPE65-E5-g3-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g3)。质粒pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g3)将会表达SEQ ID NO.29所示的RPE65-E5-gRNA3。
4)将合成的RPE65-E5-g4-S和RPE65-E5-g4-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g4)。质粒pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g4)将会表达SEQ ID NO.30所示的 RPE65-E5-gRNA4。
3.3.3 gRNA载体鉴定
从LB平板上挑取单克隆置入加有相应抗生素的LB培养液内，37℃恒温摇床内培养12-16h 后小提质粒后送通用公司测序，经序列比对确认pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g1)、pKG-U6gRNA (RPE65-E5-g2)、pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g3)和pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g4)载体均构建成功。
实施例4 RPE65基因不同gRNA靶点的编辑效率比较
4.1猪原代成纤维细胞制备
同实施例2中2.2。
4.2使用构建好的gRNA质粒、CRISPR/Cas9质粒(pKG-GE3)共转染猪原代成纤维细胞。
4.2.1共转染分组情况
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g1)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g1)与pKG-GE3摩尔比为3:1。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g2)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g2)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g2)与pKG-GE3摩尔比为3:1。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g3)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g3)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g3)与pKG-GE3摩尔比为3:1。
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g4)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g4)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g4)与pKG-GE3摩尔比为3:1。
第五组：猪原代成纤维细胞，同等电转参数不加质粒进行电转染操作。
4.2.2共转染操作方法
同实施例2中2.3.2。
4.3 RPE65基因不同gRNA靶点的编辑效率分析
4.3.1分别向步骤4.2中收集在1.5mL离心管中的5组细胞加入10μL KAPA2G裂解液裂解细胞提取细胞基因组DNA。
KAPA2G裂解液配制体系如下：
10X extract Buffer 1μL
Enzyme 0.2μL
ddH2O 8.8μL
75℃15min—95℃5min—4℃，反应结束后基因组DNA于-20℃保存；
4.3.2采用前述针对RPE65基因E5引物RPE65-E5g-F3/RPE65-E5g-R453进行检测突变， PCR目的产物长度为450bp；
4.3.3使用常规PCR反应扩增RPE65靶点基因；
4.3.4将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，如图12，将目的产物及其附近产物切胶回收后送测序公司进行测序，然后将测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出RPE65-E5-g1、RPE65-E5-g2、RPE65-E5-g3、RPE65-E5-g4不同靶点的编辑效率依次为31％、 26％、43％、23％。结果表明，RPE65-E5-g3编辑效率最高，为最优靶点。
实施例5利用体细胞克隆的方法创制RPE65基因敲除的从江香猪细胞
5.1猪原代成纤维细胞制备
同实施例2中2.2。
5.2使用构建好的pKG-U6gRNA(RPE65-E5-g3)质粒、pKG-GE3质粒共转染猪原代成纤维细胞
同实施例2中2.3.2，但不使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞于1.5mL离心管中。
5.3 RPE65基因敲除单克隆细胞株的筛选
5.3.1将步骤5.2所得电转48h的群体细胞，使用胰蛋白酶进行消化，完全培养基中和， 500g离心5min，去上清，将沉淀用200μL完全培养基重悬，并适当稀释，用口吸管挑取单克隆转移到100μL完全培养基的96孔板中；
5.3.2 37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养，每2～3天换一次细胞培养基，期间用显微镜观察每孔细胞生长情况，排除无细胞及非单克隆细胞的孔；
5.3.3待96孔板的孔中细胞长满孔底，使用胰蛋白酶消化并收集细胞，其中2/3细胞接种到含有完全培养基的6孔板中，剩余的1/3的细胞收集在1.5mL离心管中；
5.3.4待6孔板长至80％汇合度时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。
5.4 RPE65基因敲除的重组细胞鉴定
5.4.1将步骤5.3收集在1.5mL离心管中得到的细胞，然后在细胞中加入10μLKAPA2G 裂解液裂解细胞提取细胞基因组DNA。
KAPA2G裂解液配制体系如下：
10X extract Buffer 1μL
Enzyme 0.2μL
ddH2O 8.8μL
75℃15min—95℃5min—4℃，反应结束后基因组DNA于-20℃保存；
5.4.2采用前述针对RPE65基因E5引物RPE65-E5g-F3/RPE65-E5g-R453进行检测突变， PCR目的产物长度为450bp；
5.4.3使用PCR常规反应扩增RPE65靶点基因；
5.4.4将PCR反应产物进行电泳，电泳结果如图13，泳道编号与单克隆细胞编号一致。回收PCR扩增产物并测序。
5.4.5将测序结果与RPE65靶点信息进行比对，从而判断该重组细胞是否为RPE65基因敲除。
编号为4、14、16、18、19的单克隆细胞的基因型为双等位相同突变型。编号为7、10的单克隆细胞的基因型为双等位不同突变型。编号为1、3、6、11、13的单克隆细胞的基因型为杂合型。编号为2、5、8、9、12、15、17、20的单克隆细胞的基因型为纯合野生型。得到的RPE65基因编辑单克隆细胞的比率为60％。
示例性的测序比对结果如图14至图17，其中图14是克隆号为RPE65-2的正向测序与已公布序列的比对结果，判定为野生型；图15是克隆号为RPE65-16的正向测序与已公布序列的比对结果，判定为双等位相同突变；图16是克隆号为RPE65-1的正向测序与已公布序列的比对结果，判定为杂合突变；图17是克隆号为RPE65-10的正向测序和反向测序同时与已公布序列的比对结果，判定为双等位不同突变。
通过具体序列的分析，RPE65各单细胞克隆基因型如表1：
表1 RPE65基因敲除从江香猪成纤维细胞的单细胞克隆基因鉴定
Figure BDA0002749338700000161
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 南京启真基因工程有限公司
<120> 一种用于构建先天性黑蒙症克隆猪核供体细胞的CRISPR/Cas9系统及其应用
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10476
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc tagcgcgtgc 360
gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccgttac ataacttacg gtaaatggcc 420
cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aatagtaacg ccaataggga 480
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 540
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 600
ggcattgtgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 660
tagtcatcgc tattaccatg ggggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg 720
ggggaggggt cggcaattga tccggtgcct agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa 780
gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg 840
cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggttggac 900
cggtgccacc atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta 960
caaagacgat gacgataaga tggcccccaa aaagaaacga aaggtgggtg ggtccccaaa 1020
gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt acagcatcgg 1080
cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 1140
cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat 1200
cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc 1260
cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa 1320
cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 1380
agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta 1440
ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa 1500
ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt 1560
cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct 1620
ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc 1680
caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca 1740
gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga gcctgggcct 1800
gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa 1860
ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga 1920
cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt 1980
gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat acgacgagca 2040
ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg agaagtacaa 2100
agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg gcggagccag 2160
ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg gcaccgagga 2220
actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg 2280
cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc ggcaggaaga 2340
tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga ccttccgcat 2400
cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa 2460
gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg gcgcttccgc 2520
ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct 2580
gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga ccaaagtgaa 2640
atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga aaaaggccat 2700
cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta 2760
cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag atcggttcaa 2820
cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg acttcctgga 2880
caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac tgtttgagga 2940
cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat 3000
gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa 3060
cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt 3120
cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat 3180
ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg ccaatctggc 3240
cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg acgagctcgt 3300
gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca 3360
gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg aagagggcat 3420
caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa 3480
cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact 3540
ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga gctttctgaa 3600
ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg gcaagagcga 3660
caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc agctgctgaa 3720
cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct 3780
gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac 3840
aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg agaatgacaa 3900
gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa 3960
ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta 4020
cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt 4080
cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 4140
aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact ttttcaagac 4200
cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga caaacggcga 4260
aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga aagtgctgag 4320
catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga 4380
gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg actgggaccc 4440
taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg tggtggccaa 4500
agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg ggatcaccat 4560
catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca agggctacaa 4620
agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg agctggaaaa 4680
cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg aactggccct 4740
gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc 4800
ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact acctggacga 4860
gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg ctaatctgga 4920
caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc aggccgagaa 4980
tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca agtactttga 5040
caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat 5100
ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggcga 5160
caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagg gcggctccaa 5220
gcggcctgcc gcgacgaaga aagcgggaca ggccaagaaa aagaaaggat ccggcgcaac 5280
aaacttctct ctgctgaaac aagccggaga tgtcgaagag aatcctggac cggtgagcaa 5340
gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5400
cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5460
cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5520
cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5580
cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 5640
cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5700
cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5760
caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5820
gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 5880
gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac 5940
ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6000
cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagggct ccggcgaggg 6060
caggggaagt cttctaacat gcggggacgt ggaggaaaat cccggcccaa ccgagtacaa 6120
gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc 6180
cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg 6240
ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg 6300
ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg 6360
ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc 6420
gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct 6480
ggccaccgtc ggagtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct 6540
ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc 6600
ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc 6660
cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgaacgc gttaagtcga 6720
caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 6780
tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 6840
tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 6900
gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac 6960
tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 7020
tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 7080
gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct 7140
cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 7200
caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 7260
tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc gtcgacttta 7320
agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga 7380
ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc tttttgcttg tactgggtct 7440
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 7500
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 7560
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagggcc 7620
cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 7680
cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 7740
aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 7800
ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 7860
gggctctatg gcctgcaggg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt 7920
atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 7980
cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg 8040
ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 8100
taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 8160
aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 8220
ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 8280
tcaaccctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt 8340
ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt 8400
ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc 8460
cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg 8520
cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 8580
caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca 8640
tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 8700
ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 8760
gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 8820
cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 8880
tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 8940
tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 9000
cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 9060
tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 9120
agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 9180
ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 9240
ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 9300
aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 9360
gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga 9420
tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 9480
ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gaagccgcgg tatcattgca gcactggggc 9540
cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 9600
atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt 9660
cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 9720
ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 9780
cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 9840
ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 9900
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taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 10020
caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 10080
agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 10140
gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 10200
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ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 10320
acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 10380
tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 10440
ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt 10476
<210> 2
<211> 410
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gataaacatg tgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 60
ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 120
cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 180
tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 240
tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 300
gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 360
ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccatag 410
<210> 3
<211> 3120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
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ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
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gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
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catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620
agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220
accatgatta cgccaagctt gcatgcaggc ctctgcagtc gacgggcccg ggatccgatg 2280
ataaacatgt gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 2340
tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 2400
gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 2460
ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 2520
gtggaaagga cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag 2580
ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc 2640
tagcgcgtgc gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccataga tctagatgca 2700
ttcgcgaggt accgagctcg aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 2760
accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta 2820
atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 2880
ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt 2940
gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa 3000
cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg 3060
tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 3120
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agttatggca gaactcagtg 20
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccgagtta tggcagaact cagtg 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaaccactga gttctgccat aactc 25
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccccatccaa agtttttaaa gga 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtggcagat gtcacagttt agg 23
<210> 9
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aguuauggca gaacucagug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 10
<211> 1000
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 10
gttcatccgc actgatgctt acgtacgggc aatgactgag aaaaggatcg tcataacaga 60
atttggcacc tgtgctttcc cagacccctg caagaatata ttttccaggt tactgaaatc 120
caactgcatg ttattaaaga cattttacat tagccctttt tctctcatgg ctttaaattt 180
accggactga aaaatccatt tgcttctgca ggtttttttc ttactttcga ggagtagagg 240
taactgacaa tgcccttgtt aatatctacc cagtggggga agattactat gcctgcacag 300
agaccaactt cattacaaag attaatcctg agaccttgga gacaattaag caggtgggac 360
acagtgctca gatgatattg ctcaggaatt taggatttgc aacttggaat taagtcaact 420
gtgctatttg gttggaagaa tatgaaagcc agatagatta agtttcaaat tcctgctttg 480
tcatcaacta ctagctatgt gacatagggc aaactttgtt tttctccttc tgtgaacttt 540
tattaaatat ttattatgtt ggttggagga aaatcatata aaatgcctaa catattcatt 600
tgtagcacaa ctatttattg agtcccttcc atgtaccaga acttatgcta gatgcagaaa 660
atacatcaat gagtaagaac atgatccctg cccttcatta tttttataga ctagcatgga 720
actggcacat ttaatattga aaaccctgca actcatggtt ctaggaaagt atgttgcacc 780
aattttccct tcttatagac acttcttttt ggaaataaag ctatatctta aatgaaaaag 840
catagaaaaa tatcagtaac attagaaagt gacaaatttt gctgagaatt taggcaatct 900
aatatagatc tacattttca accaatattt attaagatgc agctgtttgc aagtcattgt 960
tcttgtcttc aggaagctta atctaggtgg aaaaatcaaa 1000
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atcgtcataa cagaatttgg c 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agctagtagt tgatgacaaa g 21
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcccagaccc ctgcaagaat ata 23
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cttaatctat ctggctttca t 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgttaatatc tacccagtgg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cactgggtag atattaacaa 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccttgttaat atctacccag 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aatgaagttg gtctctgtgc 20
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
caccgtgtta atatctaccc agtgg 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aaacccactg ggtagatatt aacac 25
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caccgcactg ggtagatatt aacaa 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aaacttgtta atatctaccc agtgc 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
caccgccttg ttaatatcta cccag 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aaacctgggt agatattaac aaggc 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
caccgaatga agttggtctc tgtgc 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aaacgcacag agaccaactt cattc 25
<210> 27
<211> 101
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
uuguuaauau cuacccagug gguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60
ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu u 101
<210> 28
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cacuggguag auauuaacaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 29
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccuuguuaau aucuacccag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 30
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aaugaaguug gucucugugc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 31
<211> 175
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 60
gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 120
ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccgtta cataa 175
<210> 32
<211> 554
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tctgcagaca aatggctcta gaggtacccg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg 60
gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaatagt aacgccaata gggactttcc 120
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 180
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 240
gtgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 300
tcgctattac catgggggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag 360
gggtcggcaa ttgatccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg 420
tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag 480
tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggtt ggaccggtgc 540
caccatggac tata 554
<210> 33
<211> 447
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ccagaacaca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 60
ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gcccccaaaa agaaacgaaa 120
ggtgggtggg tccccaaaga agaagcggaa ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga 180
caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac 240
cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag 300
catcaagaag aacctgatcg gagccctgct gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac 360
ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata caccagacgg aagaaccgga tctgctatct 420
gcaagagatc ttcagcaacg agatggc 447
<210> 34
<211> 2727
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa gggcggctcc aagcggcctg 60
ccgcgacgaa gaaagcggga caggccaaga aaaagaaagg atccggcgca acaaacttct 120
ctctgctgaa acaagccgga gatgtcgaag agaatcctgg accggtgagc aagggcgagg 180
agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 240
agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt 300
tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct 360
acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 420
ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact 480
acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga 540
agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca 600
acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca 660
agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 720
cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg 780
ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg 840
ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaaggg ctccggcgag ggcaggggaa 900
gtcttctaac atgcggggac gtggaggaaa atcccggccc aaccgagtac aagcccacgg 960
tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg 1020
ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg 1080
agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg 1140
acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt 1200
tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac 1260
agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg 1320
tcggagtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag 1380
tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc 1440
tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac 1500
cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgaac gcgttaagtc gacaatcaac 1560
ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta 1620
cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt 1680
tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg 1740
ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg 1800
gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca 1860
cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca 1920
ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg 1980
ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag 2040
cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc 2100
gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcgtcgactt taagaccaat 2160
gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg 2220
gctaattcac tcccaacgaa gacaagatct gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt 2280
agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca 2340
ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa 2400
ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcaggg cccgtttaaa 2460
cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 2520
ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 2580
aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 2640
acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta 2700
tggcctgcag gggcgcctga tgcggta 2727

Claims (10)

1.猪RPE65基因的gRNA靶点，其特征在于序列如SEQ ID NO.17所示。
2.权利要求1所述的猪RPE65基因靶点的gRNA序列，其特征在于由SEQ ID NO.23和SEQID NO.24所示互补DNA oligo组成。
3.猪RPE65基因的gRNA，其特征在于序列如SEQ ID NO.29所示。
4.一种针对猪RPE65基因的gRNA表达载体，其特征在于该表达载体表达权利要求3所述的gRNA。
5.根据权利要求4所述的gRNA表达载体，其特征在于该表达载体含有权利要求2所述的gRNA序列。
6.根据权利要求5所述的gRNA表达载体，其特征在于该表达载体的载体骨架为pKG-U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示。
7.一种用于猪RPE65基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其特征在于包含权利要求4～6中任一项所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体；所述的Cas9表达载体优选pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，质粒全序列如SEQ ID NO.1所示；所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比优选1～3:1，进一步优选3:1。
8.权利要求7所述的CRISPR/Cas9系统在构建猪RPE65基因敲除或插入的先天性黑蒙症模型猪重组细胞中的应用。
9.一种重组细胞，其特征在于由权利要求7所述的CRISPR/Cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。
10.权利要求9所述的重组细胞在构建RPE65基因敲除的克隆猪中的应用。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180021458A1 (en) * 2015-02-09 2018-01-25 Ucl Business Plc Optimized RPE65 Promoter and Coding Sequences
CN108103096A (zh) * 2017-06-19 2018-06-01 北京五加和分子医学研究所有限公司 一种先天性黒曚症的基因治疗药物
WO2019066549A2 (ko) * 2017-09-29 2019-04-04 주식회사 툴젠 망막 기능장애 질환 치료를 위한 유전자 조작
CN111118017A (zh) * 2018-11-01 2020-05-08 上海市第一人民医院 治疗Leber先天性黑蒙症的载体及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180021458A1 (en) * 2015-02-09 2018-01-25 Ucl Business Plc Optimized RPE65 Promoter and Coding Sequences
CN108103096A (zh) * 2017-06-19 2018-06-01 北京五加和分子医学研究所有限公司 一种先天性黒曚症的基因治疗药物
WO2019066549A2 (ko) * 2017-09-29 2019-04-04 주식회사 툴젠 망막 기능장애 질환 치료를 위한 유전자 조작
CN111118017A (zh) * 2018-11-01 2020-05-08 上海市第一人民医院 治疗Leber先天性黑蒙症的载体及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONG HYUN JO ET AL: "CRISPR-Cas9–mediated therapeutic editing of Rpe65 ameliorates the disease phenotypes in a mouse model of Leber congenital amaurosis", 《SCI ADV》 *

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