CN101899471B - 同时表达抗原特异性受体和外源基因的重组逆转录病毒载体、用其修饰的b-淋巴细胞及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种同时表达抗原特异性受体和报告基因或具有治疗作用的基因的重组逆转录病毒载体、所述重组逆转录病毒载体在制备治疗需要进行基因治疗的患者的药物中的用途、利用所述重组逆转录病毒在体外修饰B-淋巴细胞的方法、利用所述方法获得的修改的B-淋巴细胞及使用所述重组逆转录病毒载体治疗B淋巴细胞相关疾病、遗传性疾病、肿瘤或病毒感染性疾病患者的方法。

Description

同时表达抗原特异性受体和外源基因的重组逆转录病毒载体、用其修饰的B-淋巴细胞及其用途

技术领域

本发明涉及同时表达抗原特异性受体和报告基因或具有治疗作用基因的重组逆转录病毒载体、利用该载体体外修饰B-淋巴细胞的方法、该载体修饰的B-淋巴细胞、该载体的制药用途及利用该载体进行基因治疗的方法。

背景技术

基因治疗是指应用基因工程和细胞生物学技术，将一些具有治疗价值的外源基因导入体内，通过修复或补充失去正常功能的某些基因来达到治疗疾病的目的。尽管有关基因治疗的基础研究已经历时多年并广泛展开，少数基因治疗药物还获准在临床使用，但是因为安全性和有效性的问题，当前基因治疗研究的进展缓慢。因此安全和有效是当今基因治疗中共同关注的两大主题。必须在保证安全性的基础上尽可能的提高基因治疗的效率。影响基因治疗安全和效率的两个主要因素是基因转移系统和靶细胞。目前应用于基因治疗的基因转移系统主要有病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体具有高效的优点，因此基因治疗研究广为采用。但是由于安全性问题，目前其应用已受到了很大限制。非病毒载体尽管安全性较高，但其效率较低，离实际应用的要求相差甚远。目前研究提高非病毒载体的效率来提高基因治疗的效率进展缓慢。提高基因治疗效率的另一个可能途径是扩增用于基因治疗的靶细胞，使表达外源治疗基因的细胞数量增加，从而使外源治疗基因表达水平提高，最终提高基因治疗的效率。对于基因治疗的靶细胞来说，造血干细胞(HSC)因为能够自我更新和具有无限制分裂的能力，可以实现导入的外源治疗基因在体内的长期表达，因而成为目前基因治疗中常用的靶细胞。尽管体外培养与扩增可以增加造血干细胞的数量，但是有研究发现经过体外长期的培养导致造血干细胞的端粒酶活性降低甚至不能检测到端粒酶的活性，而端粒酶活性降低或者消失会严重影响干细胞的分裂能力，从而影响外源治疗基因在体内的长期表达。除了造血干细胞以外，脐带血干细胞也是基因治疗使用的一种靶细胞，但脐带血细胞也存在一定的问题，如脐带血中造血干细胞相对数量少。淋巴细胞是另一种常用的基因治疗的靶细胞，与造血干细胞一样，淋巴细胞分化成记忆细胞后也是长寿命的细胞，具有自我更新的能力(Fearon and Manders et al.，2001)，有记忆干细胞之称(Lanzavecchia and Sallusto，2002)。并且勿需骨髓动员，外周血中即有大量的淋巴细胞，可以很方便地从外周血中分离，并且技术成熟，因此与造血干细胞相比具有取材简单的优点。同造血干细胞一样，体外长时间培养与扩增淋巴细胞也非常困难，并且长时间的体外培养往往导致其不能正常归巢(Kishimotoand Jutila et al.，1990；Tedder and Penta et al.，1990)，从而影响淋巴细胞的功能和寿命。但是B淋巴细胞在体内遇到相应的抗原后能够发生克隆增生与扩增，而且激活的B淋巴细胞每秒钟可以合成高达8×10⁴个免疫球蛋白分子(Langman and Cohn，1987)，几天内体内就会有大量针对某种抗原的抗体，因此B淋巴细胞可以看成是能够大量合成蛋白的“加工厂”。这一过程是由抗原与B细胞表面的B细胞受体(BCR，B cell receptor)结合后激活B淋巴细胞(B淋巴细胞激活的详细过程见Fig 1)，并在辅助性T淋巴细胞的作用下引起特异性B淋巴细胞克隆的扩增(Thomas，2006)。

发明内容

在本发明的第一方面提供了一种同时表达抗原特异性受体和报告基因或同时表达抗原特异性受体和具有治疗作用的基因的重组逆转录病毒载体，特别地，所述抗原特异性受体为人汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1或人乙肝病毒表面抗原特异性mIgG1，所述报告基因为EGFP基因，所述具有治疗作用的基因为人EPO基因，所述逆转录病毒载体为pMSCV、pLXSN、pLXIN。

在本发明的第二方面提供了一种用同时表达抗原特异性受体和报告基因或同时表达抗原特异性受体和具有治疗作用的基因的重组逆转录病毒载体在体外修饰B-淋巴细胞的方法，其包含下述步骤：

a)分离培养B-淋巴细胞，

b)以每1×10⁸个细胞用包装好的所述重组逆转录病毒载体体外感染步骤a)中培养的细胞24小时，

其中，所述B-淋巴细胞来源于脾脏切除术切除的脾脏并利用脂多糖刺激获得或采自外周血，利用血细胞分离机获得。

特别地，所述抗原特异性受体为人汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1或人乙肝病毒表面抗原特异性mIgG1，所述报告基因为EGFP基因，所述具有治疗作用的基因为人EPO基因，所述逆转录病毒载体为pMSCV、pLXSN、pLXIN。

在本发明的第三方面提供了一种根据第二方面所述方法获得的B-淋巴细胞，特别地，所述抗原特异性受体为人汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1或人乙肝病毒表面抗原特异性mIgG1，所述报告基因为EGFP基因，所述具有治疗作用的基因为人EPO基因，所述逆转录病毒载体为pMSCV、pLXSN、pLXIN。

在本发明的第四方面提供了一种同时表达抗原特异性受体和具有治疗作用的基因的重组逆转录病毒载体在制备治疗B淋巴细胞相关疾病、遗传性疾病、肿瘤或病毒感染性疾病的药物中的用途。特别地，所述抗原特异性受体为人汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1或人乙肝病毒表面抗原特异性mIgG1，所述报告基因为EGFP基因，所述具有治疗作用的基因为人EPO基因，所述逆转录病毒载体为pMSCV、pLXSN、pLXIN，所述B淋巴细胞相关疾病为腺苷脱氨酶缺乏症，所述遗传性疾病为凝血因子VIII或IX缺乏引起的血友病或脂蛋白脂肪酶缺乏症。

在本发明的第五方面提供了一种使用同时表达抗原特异性受体和具有治疗作用的基因的重组逆转录病毒载体治疗B淋巴细胞相关疾病、遗传性疾病、肿瘤或病毒感染性疾病患者的方法，所述方法包括下述步骤：

a)利用血细胞分离机从患者血液中采集至少1×10⁴个B-淋巴细胞并进行常规培养以扩增细胞数目，

b)以每1×10⁸个细胞用包装好的所述重组逆转录病毒载体体外感染步骤a)中培养的细胞2-24小时，

c)将步骤b)中获得的细胞用无菌PBS重悬，以0.1～100×10⁶个细胞/kg/天的剂量经静脉注射入患者体内。

特别地，所述抗原特异性受体为人汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1或人乙肝病毒表面抗原特异性mIgG1，所述报告基因为EGFP基因，所述具有治疗作用的基因为人EPO基因，所述逆转录病毒载体为pMSCV、pLXSN、pLXIN，所述B淋巴细胞相关疾病为腺苷脱氨酶缺乏症，所述遗传性疾病为凝血因子VIII或IX缺乏引起的血友病或脂蛋白脂肪酶缺乏症。

本发明利用B淋巴细胞受到特异性抗原刺激后能够被激活和扩增的特性成功地在体内扩增了基因修饰的B淋巴细胞。本发明采用了能够表达特异性BCR的载体修饰B淋巴细胞，载体同时携带有外源治疗基因，将这些细胞输入受体鼠体内，在抗原免疫后有明显的扩增。在以EGFP为检测指标的SCID小鼠体内的实验中，汉滩型汉坦病毒核心蛋白抗原免疫后，检测到了表达EGFP的B淋巴细胞的扩增；在以hEPO的表达水平为检测指标的免疫力正常小鼠BALB/c小鼠的体内实验中，乙肝表面抗原免疫后检测到了hEPO表达水平的增高，并且其表达水平的增高基本与机体受到抗原初次免疫后的抗体水平的增加时相吻合(Sedgwick and Holt，1983)。在免疫力正常小鼠BALB/c小鼠的体内实验中，本发明使用了载体pMhE5C31基因修饰供体鼠B淋巴细胞，载体中用于调控hEPO表达的启动子是病毒载体LTR区的调控序列，与淋巴细胞特异性调控序列不同，其活性不受淋巴细胞的激活状态影响，而淋巴细胞特异性调控序列的活性会在淋巴细胞激活后增强(Takacs andDu et al.，2004)。因此，乙肝表面抗原免疫后外源治疗基因hEPO表达水平的增高仅与基因修饰的B淋巴细胞的体内扩增相关，而与调控hEPO表达的调控序列无关。以上这些结果说明，采用既能表达抗原特异性BCR同时又能表达外源治疗基因的载体基因修饰B淋巴细胞，经相应的特异性抗原免疫后能够在体内扩增基因修饰的B淋巴细胞，从而获得相对较高水平的外源治疗基因的表达(Fig 14，Fig15)。通过抗原特异性体内扩增基因修饰的B淋巴细胞可以很好的解决体外培养B淋巴细胞困难的难题，从而达到有较多的基因修饰的B淋巴细胞表达外源治疗基因，最终提高基因治疗的效率。

在记忆B细胞的形成过程中通常伴随着免疫球蛋白重链恒定区的不可逆重排，最常见的是由mIgM、mIgD型BCR转变为mIgG1型BCR，但仍然保留其抗原特异性，这一过程被称之为Ig类别转换。mIgM和mIgD型其胞内区仅有三个氨基酸，其信号转导由与之共价结合的Igα/β介导(Reth，1992)。而mIgG1尽管也与Igα/β共价结合，但是其高度保守的胞内区较长，在细胞信号传导中起重要作用(Reth，1992)，当突变掉mIgG的胞内区后引起初次和二次免疫应答IgG和IgE抗体水平降低10到20倍(Kaisho and Schwenk et al.，1997)。mIgG1型胞内区BCR的转基因鼠初次免疫应答的抗体滴度高于mIgM型胞内区BCR的转基因鼠，而且其初次免疫应答中浆细胞的形成是mIgM型BCR转基因鼠的10到50倍(Martin andGoodnow，2002)，尽管引起这种巨大差异的确切机制目前还不太清楚，但是比较明确的是mIgG1型的BCR会减少此种类型浆细胞的凋亡，从而有较多的浆细胞分泌抗体(Martin and Goodnow，2002)。进一步的研究发现，mIgG1型BCR相对mIgM型BCR能引起较强的细胞内钙信号，并且不受抑制性辅助受体CD22的影响(Wakabayashi and Adachi et al.，2002；Horikawa and Martin et al.，2007)。因此采用mIgG1型BCR相对mIgM型BCR的细胞信号传导会有更有效的增加外源治疗基因的表达。另外采用mIgG1型胞内区的BCR相对mIgM型胞内区的BCR在小鼠脾的MZ区有较多的细胞存在(Martin and Goodnow，2002)，而此区域主要是记忆B细胞存在的区域，因此采用mIgG1型BCR相对mIgM型BCR的细胞信号传导有可能会增加记忆B细胞的形成。在本发明中采用mIgG1的cDNA构建载体，经此载体基因修饰的B淋巴细胞输入体内后，经抗原免疫可能就会获得持续高水平的外源治疗基因的表达。

本发明构建的载体除了有治疗基因hEPO的表达之外同时还有特异性mIgG1的表达，因此经此载体修饰的脾B淋巴细胞除了表达hEPO外还有抗原特异性的BCR的表达，这些细胞受到特异性抗原刺激会在体内被扩增，从而有大量的B淋巴细胞表达外源治疗基因hEPO，并且在本发明的实施例中也检测到了抗原免疫后hEPO表达水平的增高。本发明采用了效率高、能整合到基因组的逆转录病毒载体，而不是非病毒载体作为研究工具，证明能够通过采用特异性抗原来体内扩增基因修饰的靶细胞从而获得较高的外源治疗基因的表达。

随着人类功能基因组学的不断发展，特别是对人类基因组中非编码DNA功能的不断研究，将为基因治疗技术中的载体设计带来新的思路。结合安全有效的载体，采用B淋巴细胞作为基因治疗的靶细胞有较为广泛的应用前景，有可能应用于B细胞相关疾病，例如腺苷脱氨酶缺乏症的治疗(Anderson，1992；Miller，1992)。因为B淋巴细胞表达的治疗蛋白能够直接分泌入血，从而治疗相关的遗传性疾病，例如凝血因子VIII或IX缺乏引起的血友病(Miller 1992)和脂蛋白脂肪酶缺乏症的治疗。由于B淋巴细胞是抗原提呈细胞，可以用来表达肿瘤或病毒相关抗原，能够激活机体的抗肿瘤抗病毒免疫反应，从而在肿瘤和病毒感染性疾病的治疗中发挥作用。

换言之，本发明充分利用了B淋巴细胞受到特异性抗原刺激后能够被激活和扩增的特性，通过在体外用同时表达抗原特异性受体和具有治疗作用的基因的重组逆转录病毒载体转染分离的脾细胞或血液B-淋巴细胞并将转染所述重组逆转录病毒载体的B-淋巴细胞输回体内，成功地在体内扩增了基因修饰的B淋巴细胞，由于基因修饰的B淋巴细胞的数目的大幅增加，即使单个基因修饰的B淋巴细胞中外源基因表达的水平未提高，总的外源基因的表达量也大幅增加，因此为克服基因治疗过程中经常遇到的表达外源治疗性基因的载体效率低下的问题提供了一种有益的解决方式。特别地，本发明构建了表达汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1的逆转录病毒表达载体和表达乙肝病毒表面抗原特异性mIgG1的逆转录病毒表达载体，分别携带EGFP报告基因和EPO治疗基因，在体外用上述逆转录病毒表达载体转染B-淋巴细胞后，进行体外实验和体内实验，结果表明，经汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1逆转录病毒表达载体基因修饰的B淋巴细胞同时表达EGFP，输入SCID小鼠体内经抗原免疫后流式细胞仪检测确定其能够在SCID鼠体内扩增，经乙肝病毒表面抗原特异性mIgG1逆转录病毒表达载体基因修饰的B淋巴细胞携带和表达外源治疗基因hEPO，输入BALB/c小鼠体内在抗原免疫后检测到体内外源治疗基因hEPO表达水平的增高。因此，通过将能刺激B-淋巴细胞增殖的抗原特异性受体与具有治疗作用的外源表达基因共同重组于逆转录病毒表达载体中并利用该载体体外修饰B-淋巴细胞，该基因修饰的B-淋巴细胞回输体内后，由于其表达的抗原特异性受体的刺激，B-淋巴细胞大量增殖，从而大幅度提高了具有治疗作用的外源表达基因的表达量，为需要该外源表达基因的基因治疗提供了更多的治疗剂。

附图说明

图1：显示了载体pMEGFP的载体图。

图2：显示了载体pMELHCP1的载体图。

图3：显示了载体pME5C3LH1的载体图。

图4：显示了载体pMhE5C31的载体图。

图5：显示了汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性膜型免疫球蛋白IgG1能与其抗原相结合，用载体pMELHCP1(表达EGFP以及汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1)转染293A细胞，转染后48小时用红色荧光标记的汉滩型汉坦病毒核心蛋白检测该蛋白是否能够与细胞特异性结合，图中为同一视野，分别用绿色荧光和红色荧光激发，从图中可以看出被转染了的293A细胞表达绿色荧光蛋白(左图)，并且此细胞能与红色荧光标记的汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性结合(右图)。

图6：显示了汉滩型汉坦病毒核心蛋白引起表达汉滩型汉坦病毒核心蛋白抗原特异性BCR细胞的体外扩增。用逆转录病毒载体pMELHCP1(表达EGFP以及汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1)感染小鼠原代脾B淋巴细胞，然后在第二活化信号CD40 Ligand的存在下加入能与载体表达的mIg特异性结合的汉滩型汉坦病毒核心蛋白，培养48小时后流式细胞仪检测EGFP阳性细胞比例。如图所示，在CD40Lignad提供第二活化信号的作用下，给予汉滩型汉坦病毒核心蛋白组绿色荧光细胞比例明显增高(A)，接近不给于抗原组的两倍，而仅给予PBS组绿色荧光细胞比例未见增高(B)，等于未处理组(C)。

图7：显示了没有特异性膜型免疫球蛋白的表达不能引起淋巴细胞的体外扩增。用逆转录病毒载体pMEGFP(与上述实验中所用载体不同，此载体仅有EGFP的表达而没有特异性mIgG1的表达)感染小鼠脾B淋巴细胞，在第二活化信号CD40 Ligand的存在下加入汉滩型汉坦病毒核心蛋白，培养48小时后流式细胞仪检测EGFP阳性细胞比例。从图中可以看出在CD40Ligand提供第二活化信号的作用下，给予汉滩型汉坦病毒核心蛋白抗原组(A)和仅给予PBS组(B)的EGFP阳性细胞比例没有明显差异，都等于未处理组(C)。

图8：显示了pMELHCP1载体基因修饰的脾B淋巴细胞在SCID受体鼠体内能够被抗原汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性扩增。逆转录病毒载体pMELHCP1(表达EGFP以及汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1)体外感染小鼠脾细胞。感染24小时后，将感染后的脾细胞与新鲜分离的C57BL/6小鼠脾细胞按3∶1比例混合后尾静脉注射至实验动物SCID鼠体内，每只鼠注射1.31×107个感染后的脾细胞及0.44×107个新鲜分离的脾细胞，注射的细胞中EGFP阳性细胞比列为0.4％。共注射4只，并把这4只SCID鼠分为两组，每组2只，第一组于细胞注射后24小时腹腔注射汉滩型汉坦病毒核心蛋白50ug/只，第二组(■)腹腔注射PBS作为实验对照组(注：其中第一组中的一只SCID鼠注射了两次抗原，分别于细胞注射后第1天和第26天注射，抗原用量分别为50ug和15ug；另一只SCID鼠仅在细胞注射后第1天注射抗原50ug)。分别于细胞注射后18天和28天取鼠脾细胞，流式细胞仪检测EGFP阳性细胞比例。流式细胞仪检测时每只小鼠计数50000个脾细胞。

图9：显示了外源治疗基因人促红细胞生成素(hEPO)体内表达水平的抗原反应性增高。逆转录病毒载体pMhE5C31(此载体即表达hEPO又表达乙型肝炎病毒表面抗原特异性mIgG1)感染BALB/c小鼠脾B细胞，感染24小时后把感染后的脾细胞输入受体鼠BALB/c小鼠体内。细胞受体鼠分为三组，第一组共2只小鼠，为抗原预免疫组(■)，于细胞注射前6天腹腔注射乙肝疫苗安在时5ug/只，并于细胞注射后24小时腹腔注射乙肝疫苗安在时10ug/只；第二组共3只小鼠，为抗原非预免疫组于细胞注射后24小时腹腔注射乙肝疫苗安在时10ug/只；第三组共4只小鼠，为实验对照组(□)，于细胞注射后24小时腹腔注射等体积的PBS。分别于细胞注射后第5、7、9天取不同的小鼠割尾取血200微升，ELISA法检测hEPO的表达水平。

具体实施方式

下面本发明将参考下述非限制性实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例

实施例1：实验材料及方法

菌株

大肠杆菌DH5α(遗传型supE44ΔlacU169

lacZΔM15)hsdR17recA1endA1gyrA96 thi-1 relA1)，JM109(遗传型recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thiΔ(lac-proAB)F′[traD36proAB⁺lacI^q lacZ ΔM15]购自鼎国生物。

细胞系

293T细胞、PT67细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。

限制性内切酶及其它酶类

限制性内切酶分别购自TaKaRa公司、New England Biolabs公司；热启动高保真DNA聚合酶(PrimeSTAR HS DNA Polymerase)购自TaKaRa公司。

载体

逆转录病毒载体pMSCVneo由中国医学科学院基础医学研究所免疫学系曹伟博士惠赠，质粒pEGFP-C1、病毒包装辅助MD质粒及PV质粒购自CLONTECH，。pGEM T easy载体购自Promega公司。

特异性抗体序列及抗原

汉滩型汉坦病毒核心蛋白抗体L13F3可变区DNA序列及其抗原蛋白由中国疾病控制中心病毒病预防控制所梁米芳教授惠赠。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)单克隆抗体5C3可变区序列查自The international ImMunoGeneTics informationsystem http://imgt.cines.fr/(Affinity constant：4×10¹⁰M^-1)(zu and Skerra et al.，1999)，其抗原乙型病毒性肝炎疫苗购自北京市东城区疾病控制中心，为上海葛兰素史克生物制品有限公司产品。通用名：重组(酵母)乙型肝炎疫苗；商品名：安在时；主要成分：剂量(1.0ml)含有20微克重组乙肝病毒表面抗原(S蛋白)。

实验动物

C57BI/6、BALB/c、SCID Beige购自北京维通利华实验动物技术有限公司(VitalRiver)，雌性或雄性8-10周龄。

主要试剂及试剂盒

RPMI 1640培养基、Opti-MEM无血清培养基、胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)为Hyclone公司产品；DMSO为Sigma公司产品；丙酮酸钠、2巯基乙醇、NEAA、谷胺酰胺购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心；LPS(055：B5)购自鼎国昌盛生物技术有限公司，为Sigma公司产品；TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒、TIANgel Midi Purification Kit凝胶回收试剂盒均为天根生化科技(北京)有限公司产品；Trizl抽提液、SuperScript II RNaseH^-Reverse Transcriptase反转录试剂盒为Gibco公司产品；PCR片段纯化回收试剂盒为天为时代公司产品；DNA分子量Marker为TaKaRa公司产品；转染试剂Vigofect购自威格拉斯生物技术有限公司；抗原荧光标记试剂盒为日本同仁化学产品；CD40Ligand为Perprotech公司产品；hEPO检测试剂盒，Human Epo Immunoassay为R&DSystems，Inc.产品；EZ-Sep^TM Mouse 1X淋巴细胞分离液以及200目尼龙网(裁成90mm*90mm正方形)为达科为生物技术有限公司产品。所有试剂及试剂盒均按照厂商说明书进行使用。

主要仪器

紫外分光光度计(DU-65)为Beckman产品；超速离心机(L7-65)为Beckman公司产品；酶标仪为Bio-Rad公司产品；超纯水制备器为Milipore公司产品；细胞培养箱(NAPCO5410)为Precision Scientific公司产品；PCR热循环仪(DNA ThermalCycler)为MJ公司及德国Bio-metra公司产品；流式细胞仪(FACSC alibur)为BectonDickinson公司产品。所有仪器均按厂商说明书进行操作。

实验方法

除非另外指明，本发明实施例中涉及的酶切反应、DNA片段回收、DNA连接反应、感受态大肠杆菌细胞制备、细菌质粒转化、小量及大量质粒DNA制备、RT-PCR、PCR等操作均按照“分子克隆实验指南(第三版)”(科学出版社，2002[美]J.萨姆布鲁克D.W拉塞尔著，黄培堂等译)及厂商说明书进行，细胞培养、脾细胞分离、细胞传代、细胞复苏及冻存、细胞转染及病毒载体包装、免疫荧光测定等操作均按照“动物细胞培养--基本技术指南(第四版)”(科学出版社，2000，[英]弗雷谢尼(R.I.)著，章静波等译)及厂商说明书进行操作。

实施例2：载体构建

逆转录病毒载体pMEGFP的构建

以质粒pEGFP-C1为模板，以引物

up：5’GGAATTCGTCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3’(下划线为EcoRI酶切位点，SEQ ID NO：1)，

down：5’-GAAGATCTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’(下划线为BglII酶切位点，SEQ ID NO：2)，

退火温度为68℃，PCR扩增EGFP cDNA，PCR产物酶切后克隆入pMSCVneo载体的EcoRI和BglII位点，测序以保证其序列准确。此载体表达EGFP，无抗原特异性膜型免疫球蛋白的表达(mIg)。其载体图谱见图1。

逆转录病毒载体pMELHCP1的构建

小鼠mIgG1重链恒定区cDNA PCR扩增

小鼠mIgG1恒定区cDNA序列(SEQ ID NO：3)信息查自http://imgt.cines.fr/及参考文献(Tyler and Cowman et al.，1982)。RT-PCR法扩增小鼠mIgG1恒定区5’端缺失46个碱基的小鼠mIgG1重链恒定区cDNA。在测序正确的基础上以此为模板，以P1引物与P3引物扩增延伸5’端，再以此产物为模板用P2与P8引物继续延伸5’端得到完整的小鼠mIgG1恒定区cDNA序列，退火温度为63℃。然后，SOE(Gene splicing by over lap extension)法扩增与拼接汉滩型汉坦病毒单克隆抗体L13F3重链V区cDNA与mIgG1重链恒定区cDNA，得完整的汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1重链cDNA，含有信号肽，序列如SEQ ID NO：11所示。所用引物如下：

P1：CACCCCCATC TGTCTATCCA CTGGCCCCTG GATCTGCTGCCCAAACTAAC TCCATGGTG(SEQ ID NO：4)

P2：CAAGGCACCA TTCTCACAGT CTCCTCAGCC AAAACGACACCCCCATCTGT CTATCCACT(SEQ ID NO：5)

P3：CTAGGGCGCTTGCCCAATCATG(SEQ ID NO：6)

P4：TAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGG- GGAGGCTTAGTG(SEQ ID NO：7(退火温度为63℃))

P5：GGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTAATTTTAAAAGGTGTCCAGTG TGAAGTGC(SEQ ID NO：8(退火温度为65℃))

P6：CCGCTCGAGATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTC(SEQID NO：9(含Xho I，退火温度为63℃))

P7：TCGTTTTGGCTGAGGAGACTGTGAGAATGGTGC(SEQ ID NO：10退火温度为65℃)

P8：CCGACGCGTCTAGGGCGCTTGCCCAATCATG(SEQ ID NO：11(含Mlu I，退火温度为65℃))

说明：划横线部分为引物与模板的结合区。P4、P5、P6分别依次延伸5’端，P7为下游引物，P7与恒定区有部分重合。

PCR过程为，先用P4与P7分别作为上下游引物，以汉滩型汉坦病毒单克隆抗体L13F3重链V区为模板PCR扩增，再以此产物为模板以P5与P7分别为上下游引物扩增，再以此轮产物为模板用P6与P7分别为上下游引物扩增，最后所得PCR产物再和mIgG1重链恒定区cDNA进行SOE法拼接，所用引物为P6和P8。最终所得片段克隆入pGEM T easy载体，经测序检测序列完全正确。

汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性轻链cDNA(κ型)PCR扩增

最终所得为完整的汉滩型汉坦病毒特异性mIgG1轻链cDNA(κ型)，含有信号肽。序列如SEQ ID NO：12所示。所用引物如下：

Pa：CCTTGTCCTAATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGATGTTGTGATGA CCCAGTCTCC ACTCA(SEQ ID NO：13)(退火温度为63℃)

Pb：

ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTAATTT TAAAAGGTGTC(SEQ ID NO：14)(含Xba I，Kozak，退火温度为63℃)

Pc：TTATTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTC(SEQ ID NO：15)(含NotI，退火温度为65℃)

说明：划横线为引物与模板结合区，阴影部分为保护碱基及酶切位点，Pb引物中斜体部分为Kozak序列。Pa，Pb分别依次延伸5’端，所用下游引物均为Pc，即Pa与Pc分别为上下游引物以汉滩型汉坦病毒单克隆抗体L13F3轻链cDNA为模板PCR扩增，再以此PCR产物为模板，以Pb与Pc分别为上下游引物扩增得完整的汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性轻链cDNA(κ型)。所得DNA片段克隆入pGEM T easy载体，经测序完全正确。

汉滩型汉坦病毒核心蛋白轻链(κ型)cDNA及膜型重链mIgG1cDNA分别与 其启动子SOE法拼接

上述所得汉坦病毒核心蛋白轻链cDNA及膜型重链mIgG1cDNA分别与CMV(巨细胞病毒)启动子及PGK(磷酸甘油酸酯激酶，phosphoglycerate kinase)启动子SOE法拼接。

扩增PGK启动子引物：

PGKBgl2：

AATTCTACCGGGTAGGGGAGG(SEQ ID NO：16)(含保护碱基及BglII位点，退火温度为61℃)

PGKMlu1：

TGCAGGTCGA AAGGCCCGGA(SEQ ID NO：17)(含保护碱基及Mlu I位点，退火温度为61℃)

扩增CMV启动子引物：

CMVSal1：

AGTTATTAATAGTAATCAATTACGGG(SEQ IDNO：18)(含保护碱基及Sal I位点，退火温度为61℃)

CMVNot1：

ACCGGTAGCG CTAGCGGATC(SEQID NO：19)(含保护碱基及Not I位点，退火温度为61℃)

PGK启动子序列见SEQ ID NO：20。CMV启动子(无KOZAK)序列见SEQID NO：21。

PCR扩增PGK启动子，所用的模板为pMSCVneo质粒，扩增产物与完整重链基因SOE法拼接。PGK启动子与重链基因间有Mlu I酶切位点，重链基因下游酶切位点为Sal I，重链基因下游无polyA。

PCR扩增CMV启动子，所用的模板为pEGFP-C1质粒，扩增产物与完整轻链基因SOE法拼接。CMV启动子与重链基因间有Not I酶切位点，轻链基因下游酶切位点有Hind III酶切位点，轻链基因下游无polyA。

SOE法最终所得片段为CMV启动子+轻链，这两者间有酶切位点Not I；PGK启动子+重链，这两者间有酶切位点Mlu I，所得这两个片段分别克隆入pGEM Teasy载体，经测序检测所扩增的DNA序列完全正确。

逆转录病毒载体pMELHCP1构建

上述所得CMV启动子+轻链从pGEM T easy载体酶切后克隆入pMEGFP的SalI、HindIII位点；PGK启动子+重链从pGEM T easy载体酶切后克隆入pMEGFP的BglII、Sal I位点，得到逆转录病毒载体pMELHCP1，此载体既表达EGFP又表达汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性的mIgG1。在CMV启动子和轻链间有Not I酶切位点，PGK启动子和重链间有Mlu I酶切位点，以方便后续载体轻重链的更换。

此载体既表达EGFP又表达汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1。汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1可变区序列由中国疾病控制中心病毒病预防控制所梁米芳老师惠赠，恒定区序列由RT-PCR法扩增小鼠脾细胞提取的总RNA而来，可变区与恒定区采用SOE法拼接分别获得完整汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1重链、轻链，而后在分别与启动子拼接后插入载体，获得pMELHCP1。

逆转录病毒载体pME5C3LH1的构建

采用引物搭桥的方法合成乙型病毒性肝炎表面抗原单克隆抗体5C3重链V区：引物如下：

H1：ggtctggagtggctgggagtaatatgggctggtggaatcacaaattataattcggctct(SEQ ID NO：22)

H2：agctatggtgtacactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggagt(SEQ ID NO：23)

H3：ctgtccatcacttgcactgtctctgggttttcattaaccagctatggtgtacactgggt(SEQ ID NO：24)

H4：ctgcatcagtctggggctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacttgcactgt(SEQ IDNO：25)

H1R：TCTTGAAATTGTCTTTCCTGATGCTCAGTCTGGACATGAGAGCCGAATTATAATTTGTG(SEQ ID NO：26)

H2R：CATCATTTTGCAGACTGTTCATTTTTAAGAAAACTTGGCTCTTGAAATTGTCTTTCCTG(SEQ ID NO：27)

H3R：AGACTCCTCCTCCTCTGGCACAGTAGTACATGGCTGTGTCATCATTTTGCAGACTGTTC(SEQ ID NO：28)

H4R：GACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAGTAGTCCATAGCATAGTTGATACCATAGTAGACTCCTCCTCCTCTGGC(SEQ ID NO：29)

先用H1和H1R分别为上下游引物PCR 10个循环，再以此PCR产物为模板以H2和H2R分别为上下游引物PCR 10个循环，再依次类推，最后的循环数为30个循环，退火温度设为50℃。合成的序列见SEQ ID NO：30，该序列信息查自http://imgt.cines.fr/和参考文献(zu and Skerra et al.，1999)。所得DNA片段克隆入pGEM T easy载体，经测序后确认基因合成的序列正确。

采用引物搭桥的方法合成抗乙型病毒性肝炎表面抗原单克降抗体5C3轻链V 区

引物如下：

L1：aaaccaggacagccacccaaactcctcatctatgctgcatccaacgtagaacctggggt(SEQ ID NO：31)

L2：gaatattatggcacaagtttaatgcagtggtaccaacagaaaccaggacagccacccaa(SEQ ID NO：32)

L3：gagagccaccatctcctgcagagccagtgaaagtgttgaatattatggcacaagtttaa(SEQ ID NO：33)

L4：gagctcacccagactccagtctccctggctgtgtctctagggcagagagccaccatctcctgca(SEQ IDNO：34)

L1R：GAAGTCTGTCCCAGACCCACTGCCACTAAACCTGGCAGGGACCCCAGGTTCTACGTTGG(SEQ ID NO：35)

L2R：TGCAATATCATCCTCCTCCACAGGCTGGATGTTGAGGCTGAAGTCTGTCCCAGACCCAC(SEQ ID NO：36)

L3R：CGTCCAAGGAACATTCCTACTTTGCTGACAGAAATACATTGCAATATCATCCTCCTCCA(SEQ ID NO：37)

L4R：CTCGAGCTTGGTCCCTCCTCCGAACGTCCAAGGAACATTCCTAC(SEQ ID NO：38)

合成所得序列如SEQ ID NO：39，其序列信息查自http://imgt.cines.fr/参考文献(zu and Skerra et al.，1999)。合成过程同重链。

设计引物SOE(Gene splicing by over lap extension)法扩增与拼接乙型肝炎病 毒表面抗原单克隆抗体5C3重链V区与mIgG1恒定区得完整的重链

合成过程同SOE法扩增与拼接汉坦病毒单克隆抗体L13F3重链V区与膜型IgG1恒定区。完整重链的序列如SEQ ID NO：40所示，其序列信息查自zu and Skerraet al.，1999，并根据NCBI网站做了部分碱基的改动。最终所得PCR产物克隆入pGEM T easy载体经测序验证序列正确。

设计引物SOE法扩增与拼接乙型病毒肝炎表面抗原单克隆抗体5C3轻链V 区与轻链恒定区(κ型)得完整的轻链

完整轻链的序列如SEQ ID NO：41所示，其序列信息查自zu and Skerra et al.，1999，并根据NCBI网站做了部分碱基的改动。最终所得PCR产物克隆入pGEM Teasy载体经测序验证序列正确。

逆转录病毒载体pME5C3LH1构建

5C3完整轻链克隆入pMELHCP1的Not I、HindIII位点，5C3完整重链克隆入pMEGFP、Mlu I和Sal I位点，得到逆转录病毒载体pME5C3LH1，在CMV启动子和轻链间有Not I酶切位点，PGK启动子和重链间有Mlu I酶切位点，以方便后续载体轻重链的更换。

此载体既表达EGFP又表达乙型肝炎病毒表面抗原特异性的mIgG1。乙型肝炎病毒表面抗原特异性的mIgG1可变区序列查自文献(zu and Skerra et al.，1999)，表达的乙型肝炎病毒表面抗原特异性mIgG1的亲和力为亲和力常数(Affinityconstant)：4×¹⁰10M^-1，属于高亲和力型mIg。其轻重链可变区采用引物搭桥的方法基因合成，轻重链可变区与逆转录病毒载体pMELHCP1构建中获得的轻重链恒定区采用SOE法拼接，而后分别克隆入载体pMELHCP1。

逆转录病毒载体pMhE5C31的构建

提取L02细胞总RNA，反转录为人肝细胞总cDNA，以反转录产物为模板，设计引物PCR法扩增人hEPO(人促红细胞生成素，human Erythropoietin)cDNA。

hEPO29：ATGGGGGTGC ACGAATGTCC TGCCTGGCT(SEQ ID NO：42)

hEPO28：TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGGCCTCC(SEQ ID NO：43)

退火温度64℃。

所得hEPO cDNA序列如SEQ ID NO：44所示。

克隆入pGEM-T easy载体测序确认序列正确后，设计下列引物加酶切位点：

hEPOEcoR1：CGGAATTC ATGGGGGTGC ACGAATGTCC TGCCT(SEQ IDNO：45，含保护碱基及EcoR I位点，退火温度为60℃)

hEPOBgl2：GAAGATCT TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGGC(SEQ ID NO：46，含保护碱基及BglII位点，退火温度为60℃)

产物克隆入pGEM-T easy载体测序确认序列正确后，再克隆入pME5C3LH1的EcoR I和Bgl II位点，得逆转录病毒载体pMhE5C31，此载体既表达hEPO又表达乙型病毒性肝炎病毒表面抗原特异性mIgG1。

在构建此载体时本研究采用hEPO作为载体表达的外源治疗基因，小鼠不表达hEPO。在后续的ELISA法的检测过程中，检测试剂可以区分hEPO和小鼠的EPO(mEPO)，两者没有交叉反应，因此检测到的hEPO来自载体的表达。

此载体除了表达hEPO外，还表达乙型肝炎病毒表面抗原特异性mIgG1(Fig8)。表达的乙型肝炎病毒表面抗原特异性mIgG1的亲和力为Affinity constant：4×10¹⁰M^-1，属于高亲和力型mIg。(zu and Skerra et al.，1999)。构建过程为，提取L02细胞总RNA，反转录为人肝细胞总cDNA，以反转录产物为模板，设计引物PCR法扩增人hEPO(human Erythropoietin)cDNA。所得PCR产物经测序确认正确后克隆入pME5C3LH1的EcoR I和Bgl II位点，得逆转录病毒载体pMhE5C31。

实施例3：细胞转染及病毒载体包装

(1)转染前一天，293T细胞以合适密度传代细胞于直径10cm培养皿，加入7ml培养液，在37℃、5％CO₂条件下培养18-24小时至细胞完全贴壁，使密度为大约90％融合。

(2)转染前一小时吸出2ml培养液，剩余培养液5ml。

(3)吸取6μl转染试剂vigofect至496μl OPTI-MEM无血清培养中混匀，室温静置5分钟。

(4)吸取质粒DNA共25μg(其中逆转录病毒载体12.5μg，辅助质粒MD9.375μg，PV 3.125μg)，加入OPTI-MEM无血清培养基中至总量500μl，混匀。

(5)把(3)中液体滴入(4)中，混匀，室温静置15分钟。

(6)把上步中液体滴入培养皿中，于37℃，5％CO₂培养。培养6小时后补液5ml DMEM完全培养基。转染后24小时换新鲜DMEM培养基5ml，至转染后36小时收集上清病毒液，并加新鲜DMEM培养基5ml，如此每12小时收集一次，共收集4次，至转染后72小时止。收集的病毒液置于4℃保存，最后一次收集后，4℃500g离心5分钟，吸取上清0.45μm滤膜过滤备用或-70℃冻存。

(7)PT67细胞培养于35mm培养皿中，贴壁6小时后细胞密度大约为40％融合，加1ml上步中制备的病毒液，并加polybrene至终浓度6μg/ml。感染3小时后弃上清，加入新鲜DMEM完全培养基，继续培养大于12小时后，加胰酶消化细胞，并铺于60mm培养皿中，贴壁6小时后再次感染，反复感染4次后，铺细胞于100mm培养皿，细胞持续生长，并至细胞100％融合，加入含有终浓度10μg/ml丝裂霉素的DMEM培养基，培养3小时后，用无血清无丝裂霉素的RPMI1640培养基清洗细胞5遍待用。

实施例4：pMELHCP1载体表达的汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1能够与抗原汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性结合

构建的膜型IgG1表达载体其IgG1恒定区后含有穿膜区及胞内区，因此与分泌型免疫球蛋白不同，膜型免疫球蛋白分子在穿膜的过程中驻留于细胞表面(Tylerand Cowman et al.，1982；Yamawaki-Kataoka and Nakai et al.，1982)，为了证实构建的载体能表达膜型IgG1，而且能够与抗原特性结合设计了免疫荧光实验来验证。

过程如下：

(1)在24孔板中放入无菌小圆玻片，将适量的293A细胞接种于24孔板中。

(2)转染细胞，方法如实施例3所述。实验组转pMELHCP1，对照组转pMEGFP，转染量均为0.2ug/孔，每组平行转2孔，同时两孔不转作为空白对照。

(3)转染48h后弃去培养基，绿色荧光下观察转染情况后，用冷的PBS漂洗细胞3次。

(4)每孔加200ul 4％的多聚甲醛固定20分钟。

(5)预冷的PBS漂洗3次，每次5分钟。

(6)每孔加0.5％Triton X-100处理10分钟。

(7)预冷PBS漂洗3次，每次5分钟。

(8)每孔加3％BSA室温封闭1小时。

(9)每孔加200ul 1∶1000稀释的带TRITC荧光标记的山羊抗小鼠二抗，室温避光放置一小时。

(10)预冷的PBS漂洗5次，每次5分钟。

(11)每孔加200ul的Hoechst室温处理5分钟染核。

(12)预冷PBS漂洗3次，每次5分钟。最后用蒸馏水漂洗一次，5分钟。

(13)在新的洁净的载玻片上滴一滴防淬灭剂，将小圆玻片从培养板的孔里拿出来，倒扣在防淬灭剂液滴上封片。

(14)荧光显微镜下观察。

结果见图5。图中为同一视野，分别用绿色荧光和红色荧光激发，从图中可以看出被转染了的293A细胞表达绿色荧光蛋白，并且此细胞能与红色荧光标记的汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性结合。

实施例5：与包装细胞系PT67共培养法感染原代小鼠脾B淋巴细胞

按照EZ-Sep^TM Mouse 1X的说明书(即达科为方法)分离小鼠脾细胞，分离的脾细胞培养于RPMI1640培养基中，每100毫升培养液中加入10ml胎牛血清，1毫升双抗、1mM丙酮酸钠、50μM的2巯基乙醇、NEAA、2mM谷胺酰胺，LPS50μg/ml。培养条件为37℃，5％CO₂，及饱和湿度，细胞密度为5×10⁶/ml。培养16至20小时后，细胞悬液加入50ml离心管中，并加入4倍体积的无血清RPMI1640培养基，4℃，300g离心10分钟，弃上清，细胞用RPMI1640培养基(每100毫升培养液中加入10ml胎牛血清，1毫升双抗、1mM丙酮酸钠、50μM的2巯基乙醇、NEAA、2mM谷胺酰胺，LPS 50μg/ml)重悬，缓慢吹打细胞至无细胞团快，调整细胞密度为5×10⁶/ml-8×10⁶/ml，延培养皿壁缓慢加入丝裂霉素处理过的PT67包装细胞系培养皿中，37℃，5％CO₂，及饱和湿度培养至24小时。吸取细胞悬液加入新的培养皿中，培养3小时，以便脱落的包装细胞系贴壁。之后吸取细胞悬液加入50ml离心管中，并加入4倍体积的无血清RPMI1640培养基，4℃，300g离心10分钟，弃上清，仔细吸弃管壁上的残留液体后加入D-Hanks液重悬细胞，调整细胞密度为1.5×10⁸/ml-2.5×10⁸/ml，置于冰上待用。

实施例6：pMELHCP1载体基因修饰的B淋巴细胞能够被抗原汉滩型汉坦病毒核心蛋白在体外特异性扩增

上述实验证实载体pMELHCP1表达的mIgG1能够与特异性抗原特异性结合，理论上抗原结合BCR后会引起BCR在B淋巴细胞表面的交联，从而引起细胞信号传导，引发一系列的细胞反应，激活B淋巴细胞(Wang and Clark，2003)。B细胞经由BCR识别抗原后，由Igα/Igβ把抗原结合BCR的第一活化信号传入细胞内(Wang and Clark，2003)，在第二活化信号CD40 Ligand的存在下B细胞发生增殖与分化。在没有第二活化信号存在时，仅有第一信号将会引起B细胞的凋亡(Wang andKarras et al.，1995)。因此基于B淋巴细胞的活化增殖需要双信号，设计了体外实验来验证BCR是否能够传导第一活化信号，并且在第二活化信号CD40 Ligand的存在下引起B细胞的增殖。首先用逆转录病毒载体pMELHCP1(表达EGFP以及汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1)感染小鼠原代脾B淋巴细胞，然后在第二活化信号CD40 Ligand的存在下加入能与载体表达的mIg特异性结合的汉滩型汉坦病毒核心蛋白，培养48小时后流式细胞仪检测EGFP阳性细胞比例。如图(Fig12)所示，在CD40Lignad提供第二活化信号的作用下，给予汉滩型汉坦病毒核心蛋白组绿色荧光细胞比例明显增高，接近不给于抗原组的两倍，而仅给予PBS组绿色荧光细胞比例未见增高，等于未处理组。

为了进一步证明上述实验中EGFP阳性细胞的体外增殖是通过抗原与BCR的特异性结合所引起，而不是抗原等其它因素引起的增殖，设计了下述实验来验证。上述制备之感染后的脾细胞(用表达EGFP的逆转录载体感染)，加入RPMI1640培养基中，每100毫升培养液中加入10ml胎牛血清，1毫升双抗、1mM丙酮酸钠、50μM 2巯基乙醇、NEAA、2mM谷胺酰胺。培养条件为37℃，5％CO₂，及饱和湿度，细胞密度为1×10⁶/ml，加入24孔板中1ml/孔，共加九孔，其中三孔加入终浓度为100ng/ml的CD40Ligand及15微克汉滩型汉坦病毒核心蛋白；另三孔加入终浓度为100ng/ml的CD40Ligand及等量的PBS，最后三孔不作处理。培养48小时后流式细胞仪检测EGFP阳性细胞比例。结果见图7，从图中可以看出在CD40Ligand提供第二活化信号的作用下，给予汉滩型汉坦病毒核心蛋白抗原组和仅给予PBS组的EGFP阳性细胞比例没有明显差异，都等于未处理组。

从上述结果中可以得出结论，构建的汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1表达载体pMELHCP1基因修饰小鼠脾B淋巴细胞后，能够与汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性结合，并且能够传导第一活化信号至细胞内，并在第二活化信号的作用下在体外引起小鼠脾B淋巴细胞增殖。

实施例7：pMELHCP1载体基因修饰的脾B淋巴细胞在SCID受体鼠体内能够被抗原汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性扩增

上述的实验已证实构建的逆转录病毒载体pMELHCP1(表达EGFP以及汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1)感染小鼠脾B淋巴细胞后能够表达EGFP和汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性BCR。细胞水平的实验证实特异性抗原汉滩型汉坦病毒核心蛋白结合BCR后引发B淋巴细胞激活与增殖的第1信号后，在第二活化信号CD40L的存在下引起B淋巴细胞的体外增殖。因为，在体外只能短期培养与扩增B淋巴细胞，本研究的实验设计的初衷是要验证基因修饰的B淋巴细胞能否在体内发生抗原特异性扩增，因此进一步设计了SCID鼠的动物实验。在实验设计中首先采用SCID鼠作为细胞移植的受体鼠，此品系小鼠的T淋巴细胞和B淋巴细胞功能均缺如，因此基因修饰的淋巴细胞输入其体内后，仅有输入的淋巴细胞能够与抗原发生特异性反应，没有小鼠内源淋巴细胞的参与和竞争(下述)；另一方面EGFP具有较强的抗原性(Stripecke and Carmen et al.，1999)，因此首先采用免疫功能缺陷的SCID鼠作为细胞移植的受体鼠。

细胞移植与受体鼠抗原免疫

(1)上述实施例5中制备之感染后的脾细胞悬液，尾静脉注射入受体鼠，0.2ml/只。

(2)细胞注射后24小时，实验组受体鼠抗原免疫，汉滩型汉坦病毒核心蛋白50μg溶于200μl PBS中腹腔注射；或乙型肝炎病毒疫苗安在时10μg/只腹腔注射，对照组仅注射等量PBS或氢氧化铝。

FACS定量分析表达绿色荧光蛋白细胞的比例

(1)确定病毒载体感染效率

脾细胞感染后48小时，300g离心10分钟，弃上清，PBS冲洗细胞，离心管中，吸管反复吹打分散细胞，离心沉淀细胞，PBS重悬，再离心沉淀，反复洗两遍，400目钢网过滤使细胞呈单细胞悬液，流式细胞仪分析。

(2)SCID小鼠脾细胞中绿色荧光蛋白细胞的扩增检测

同前述取小鼠脾细胞，400目钢网过滤使细胞呈单细胞悬液，流式细胞仪分析。

BALB/c小鼠取血检测hEPO的表达水平

分别于适当的时间点割尾采血200μl左右检测hEPO的表达水平，采用ELISA法检测，该试剂能特异性检测人的EPO，取血200微升后一周再次取血未见有小鼠EPO的交差反应。详细过程见R&D公司说明书，简要过程如下：

(1)首先从4℃冰箱中取出试剂盒，待恢复到室温(20-25℃)后使用

(2)取走微孔板上多余的孔，放置于袋中保存并封口。

(3)每孔中加入100μl of Epo Assay Diluent

(4)每孔中加入100μl of standard，control，or specimen并轻拍微孔板1分钟至混匀，并用提供的封条封住各孔以防液体蒸发。室温静置2hours±5minutes。

(5)吸净微孔中的液体，并于滤纸上拍打微孔板，注意不要洗板。

(6)每孔加入200μl的Epo Conjugate，并用提供的封条封住各孔以防液体蒸发。室温静置2hours±5minutes

(7)吸净微孔中的液体，加入Wash Buffer(400μl)反复冲洗4遍，确保冲洗完全

(8)每孔加入200L Substrate Solution。注意：Substrate Solution在配置后15分钟内使用.室温静置20-25minutes

(9)每孔加入100μl的Stop Solution，并轻拍微孔板。

(10)使用酶标仪读取450nm处的optical density(O.D.)值，校正波长设为570nm

(11)绘制标准曲线计算hEPO值。

简而言之，分离培养C57BL/6小鼠脾细胞，脂多糖(LPS)刺激16小时后，逆转录病毒载体pMELHCP1(表达EGFP以及汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1)体外感染。因为LPS为B细胞丝裂原，仅引起脾细胞中的B淋巴细胞分裂增殖，所以此逆转录病毒载体仅能感染B淋巴细胞而不能感染T淋巴细胞。感染24小时后，将感染后的脾细胞与新鲜分离的C57BL/6小鼠脾细胞(为了提供新鲜的T细胞，因为T细胞在体外培养时会影响其活力)按3∶1比例混合后尾静脉注射至实验动物SCID鼠体内，每只鼠注射1.31×10⁷个感染后的脾细胞及0.44×10⁷个新鲜分离的脾细胞，注射的细胞中EGFP阳性细胞比列为0.4％。共注射4只，并把这4只SCID鼠分为两组，每组2只，第一组于细胞注射后24小时腹腔注射汉滩型汉坦病毒核心蛋白50ug/只，第二组腹腔注射PBS作为实验对照组(注：其中第一组中的一只SCID鼠注射了两次抗原，分别于细胞注射后第1天和第26天注射，抗原用量分别为50ug和15ug；另一只SCID鼠仅在细胞注射后第1天注射抗原50ug)。分别于细胞注射后18天和28天取鼠脾细胞，流式细胞仪检测EGFP阳性细胞比例。流式细胞仪检测时每只小鼠计数50000个脾细胞，检测结果见图8。从图中可以看出，抗原注射组EGFP阳性细胞所占脾细胞的比例明显高于PBS对照组，前者EGFP阳性细胞最高达到0.07％，而后者最高仅有0.01％。图中抗原注射两次的小鼠其EGFP阳性细胞扩增效果与仅注射一次的小鼠相比未见增高，可能与二次抗原注射后在较短的时间(两天)内就进行检测有关。从上述结果中可以得出结论，经表达抗原特异性mIgG1的载体基因修饰的B淋巴细胞能够在SCID鼠体内发生抗原特异性扩增。

在上述实验中pMELHCP1(表达EGFP以及汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1)载体基因修饰的B淋巴细胞在SCID鼠体内能够在抗原的免疫下特异性扩增，因此进一步考虑在免疫力正常的BALB/c小鼠体内是否也能经抗原免疫来特异性扩增基因修饰的靶细胞。考虑到EGFP有较强的免疫原性(Stripecke and Carmen etal.，1999)，把检测指标换为人促红细胞生成素(hEPO)，检测其表达水平能否在抗原特异性免疫后增高。又因为汉滩型汉坦病毒核心蛋白与构建的载体表达的汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1的亲和力不明，考虑到抗原与BCR结合的亲和力会影响基因修饰的靶细胞的扩增效果(下述)，把汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1更换为亲和力较高的能与乙型肝炎病毒表面抗原特异性结合的mIgG1(Affinity constant：4×10¹⁰M^-1)。首先用逆转录病毒载体pMhE5C31(此载体即表达hEPO又表达乙型肝炎病毒表面抗原特异性mIgG1)感染BALB/c小鼠脾B细胞，感染24小时后把感染后的脾细胞输入受体鼠BALB/c小鼠体内。细胞受体鼠分为三组，第一组共2只小鼠，为抗原预免疫组，于细胞注射前6天腹腔注射乙肝疫苗安在时5ug/只，用于提前激活与扩增乙肝病毒表面抗原特异性的辅助性T淋巴细胞(Th cell)，此组动物于细胞注射后24小时腹腔注射乙肝疫苗安在时10ug/只；第二组共3只小鼠，为抗原非预免疫组，于细胞注射后24小时腹腔注射乙肝疫苗安在时10ug/只；第三组共4只小鼠，为实验对照组，于细胞注射后24小时腹腔注射等体积的PBS。分别于细胞注射后第5、7、9天取不同的小鼠割尾取血200微升(因为取血量较大不能短时间内连续取血，所以在不同的时间点取血的小鼠不同)，ELISA法检测hEPO的表达水平(该检测试剂盒能特异性检测人的EPO，与小鼠的EPO没有交叉反应)。如图9所示，在抗原免疫后第5天抗原预免疫组与抗原非预免疫组以及实验对照组hEPO的表达水平均无明显差异，第7天时抗原预免疫组hEPO的表达水平是对照组的3倍，抗原非预免疫组是对照组的1.5倍，第9天时差异最为明显，抗原非预免疫免疫组hEPO的表达水平至少是对照组的5倍(因为抗原预免疫组仅有两只小鼠并且均已于第5和第7天采血检测，此时没有抗原预免疫组的小鼠可供采血检测)。并且抗原免疫后第7天和第9天hEPO表达水平的增高基本与机体受到抗原初次免疫后的抗体水平的增高时相吻合(Sedgwickand Holt，1983)。从上述结果中可以得出结论：表达乙肝表面抗原特异性mIgG1以及同时表达外源治疗基因hEPO的载体基因修饰的B淋巴细胞输入BALB/c小鼠体内后，外源治疗基因hEPO的表达水平可经乙肝表面抗原的特异性刺激而增高。

序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>同时表达抗原特异性受体和外源基因的重组逆转录病毒载体、用其修饰的B-淋巴细胞及其用途

<130>890057CG

<160>46

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物up

<400>1

ggaattcgtc gccaccatgg tgagcaagg         29

<210>2

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物down

<400>2

gaagatcttt acttgtacag ctcgtccatg ccg    33

<210>3

<211>1182

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>基因

<222>(1)..(1182)

<223>mIgG1恒定区cDNA

<400>3

gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac    60

tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc    120

tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac    180

ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc    240

acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg    300

gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc    360

cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg    420

gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag    480

gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc    540

agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc    600

aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg    660

aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc    720

agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg    780

aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct    840

tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc    900

acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac    960

tctcctgggc tgcaactgga cgagacctgt gctgaggccc aggacgggga gctggacggg    1020

ctctggacga ccatcaccat cttcatcagc ctcttcctgc tcagcgtgtg ctacagcgct    1080

gctgtcacac tcttcaaggt aaagtggatc ttctcctcgg tggtggagct gaagcagaca    1140

ctggttcctg aatacaagaa catgattggg caagcgccct ag                       1182

<210>4

<211>59

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P1

<400>4

cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac tccatggtg    59

<210>5

<211>59

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P2

<400>5

caaggcacca ttctcacagt ctcctcagcc aaaacgacac ccccatctgt ctatccact    59

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P3

<400>6

ctagggcgct tgcccaatca tg                                            22

<210>7

<211>53

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P4

<400>7

taaaaggtgt ccagtgtgaa gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtg    53

<210>8

<211>54

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P5

<400>8

ggctcagctt gattttcctt gtcctaattt taaaaggtgt ccagtgtgaa gtgc   54

<210>9

<211>42

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P6

<400>9

ccgctcgaga tgaacttcgg gctcagcttg attttccttg tc                42

<210>10

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P7

<400>10

tcgttttggc tgaggagact gtgagaatgg tgc                          33

<210>11

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P8

<400>11

ccgacgcgtc tagggcgctt gcccaatcat g                            31

<210>12

<211>1587

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含信号肽的汉滩型汉坦病毒特异性mIgG1轻链cDNA

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)..(57)

<220>

<221>根据NCBI Ig search添加的序列

<222>(58)..(72)

<220>

<221>汉滩型汉坦病毒单克隆抗体L13F3重链V区

<222>(73)..(405)

<220>

<221>mIgG1恒定区

<222>(406)..(1587)

<400>12

atgaacttcg ggctcagctt gattttcctt gtcctaattt taaaaggtgt ccagtgtgaa  60

gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc  120

tgtgcagcct ctggattcac tttcagtacc tatgccatgt cttgggttcg ccagactccg  180

gagaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtagtgatg gtacttacac ctcctatcca  240

gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg  300

caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcaag acgaggtaac  360

ccccttgact actggggcca aggcaccatt ctcacagtct cctcagccaa aacgacaccc  420

ccatctgtct atccactggc ccctggatct gctgcccaaa ctaactccat ggtgaccctg  480

ggatgcctgg tcaagggcta tttccctgag ccagtgacag tgacctggaa ctctggatcc  540

ctgtccagcg gtgtgcacac cttcccagct gtcctgcagt ctgacctcta cactctgagc  600

agctcagtga ctgtcccctc cagcacctgg cccagcgaga ccgtcacctg caacgttgcc  660

cacccggcca gcagcaccaa ggtggacaag aaaattgtgc ccagggattg tggttgtaag  720

ccttgcatat gtacagtccc agaagtatca tctgtcttca tcttcccccc aaagcccaag  780

gatgtgctca ccattactct gactcctaag gtcacgtgtg ttgtggtaga catcagcaag  840

gatgatcccg aggtccagtt cagctggttt gtagatgatg tggaggtgca cacagctcag  900

acgcaacccc gggaggagca gttcaacagc actttccgct cagtcagtga acttcccatc  960

atgcaccagg actggctcaa tggcaaggag ttcaaatgca gggtcaacag tgcagctttc  1020

cctgccccca tcgagaaaac catctccaaa accaaaggca gaccgaaggc tccacaggtg  1080

tacaccattc cacctcccaa ggagcagatg gccaaggata aagtcagtct gacctgcatg  1140

ataacagact tcttccctga agacattact gtggagtggc agtggaatgg gcagccagcg  1200

gagaactaca agaacactca gcccatcatg gacacagatg gctcttactt cgtctacagc  1260

aagctcaatg tgcagaagag caactgggag gcaggaaata ctttcacctg ctctgtgtta  1320

catgagggcc tgcacaacca ccatactgag aagagcctct cccactctcc tgggctgcaa  1380

ctggacgaga cctgtgctga ggcccaggac ggggagctgg acgggctctg gacgaccatc  1440

accatcttca tcagcctctt cctgctcagc gtgtgctaca gcgctgctgt cacactcttc  1500

aaggtaaagt ggatcttctc ctcggtggtg gagctgaagc agacactggt tcctgaatac  1560

aagaacatga ttgggcaagc gccctag                                      1587

<210>13

<211>59

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物Pa

<400>13

ccttgtccta attttaaaag gtgtccagtg tgatgttgtg atgacccagt ctccactca    59

<210>14

<211>68

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物Pb

<400>14

gctctagagc cgccaccatg aacttcgggc tcagcttgat tttccttgtc ctaattttaa   60

aaggtgtc                                                            68

<210>15

<211>44

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物Pc

<400>15

ataagaatgc ggccgcttat taacactcat tcctgttgaa gctc                    44

<210>16

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物PGKBgl2

<400>16

gaagatctaa ttctaccggg taggggagg                                     29

<210>17

<211>28

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物PGKMlu1

<400>17

cgacgcgttg caggtcgaaa ggcccgga                                      28

<210>18

<211>36

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物CMVSal1

<400>18

acgcgtcgac agttattaat agtaatcaat tacggg        36

<210>19

<211>36

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物CMVNotl

<400>19

ataagaatgc ggccgcaccg gtagcgctag cggatc        36

<210>20

<211>516

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PGK启动子序列

<400>20

aattctaccg ggtaggggag gcgcttttcc caaggcagtc tggagcatgc gctttagcag    60

ccccgctggg cacttggcgc tacacaagtg gcctctggcc tcgcacacat tccacatcca    120

ccggtaggcg ccaaccggct ccgttctttg gtggcccctt cgcgccacct tctactcctc    180

ccctagtcag gaagttcccc cccgccccgc agctcgcgtc gtgcaggacg tgacaaatgg    240

aagtagcacg tctcactagt ctcgtgcaga tggacagcac cgctgagcaa tggaagcggg    300

taggcctttg gggcagcggc caatagcagc tttgctcctt cgctttctgg gctcagaggc    360

tgggaagggg tgggtccggg ggcgggctca ggggcgggct caggggcggg gcgggcgccc    420

gaaggtcctc cggaggcccg gcattctgca cgcttcaaaa gcgcacgtct gccgcgctgt    480

tctcctcttc ctcatctccg ggcctttcga cctgca                              516

<210>21

<211>605

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>无Kozak序列的CMV启动子序列

<400>21

tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg    60

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt    120

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca    180

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc    240

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta    300

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac    360

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg    420

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg    480

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt    540

acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta    600

ccggt                                                                605

<210>22

<211>59

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物H1

<400>22

ggtctggagt ggctgggagt aatatgggct ggtggaatca caaattataa ttcggctct    59

<210>23

<211>59

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物H2

<400>23

agctatggtg tacactgggt tcgccagcct ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagt    59

<210>24

<211>59

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物H3

<400>24

ctgtccatca cttgcactgt ctctgggttt tcattaacca gctatggtgt acactgggt    59

<210>25

<211>62

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物H4

<400>25

ctgcatcagt ctggggctgg cctggtggcg ccctcacaga gcctgtccat cacttgcact   60

gt                                                                  62

<210>26

<211>59

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物H1R

<400>26

tcttgaaatt gtctttcctg atgctcagtc tggacatgag agccgaatta taatttgtg    59

<210>27

<211>59

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物H2R

<400>27

catcattttg cagactgttc atttttaaga aaacttggct cttgaaattg tctttcctg    59

<210>28

<211>59

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物H3R

<400>28

agactcctcc tcctctggca cagtagtaca tggctgtgtc atcattttgc agactgttc    59

<210>29

<211>75

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物H4R

<400>29

gacggtgacc gtggtccctt ggccccagta gtccatagca tagttgatac catagtagac   60

tcctcctcct ctggc                                                    75

<210>30

<211>351

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>乙型病毒性肝炎表面抗原单克隆抗体5C3重链V区

<400>30

ctgcatcagt ctggggctgg cctggtggcg ccctcacaga gcctgtccat cacttgcact    60

gtctctgggt tttcattaac cagctatggt gtacactggg ttcgccagcc tccaggaaag    120

ggtctggagt ggctgggagt aatatgggct ggtggaatca caaattataa ttcggctctc    180

atgtccagac tgagcatcag gaaagacaat ttcaagagcc aagttttctt aaaaatgaac    240

agtctgcaaa atgatgacac agccatgtac tactgtgcca gaggaggagg agtctactat    300

ggtatcaact atgctatgga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt c             351

<210>31

<211>59

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物L1

<400>31

aaaccaggac agccacccaa actcctcatc tatgctgcat ccaacgtaga acctggggt    59

<210>32

<211>59

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物L2

<400>32

gaatattatg gcacaagttt aatgcagtgg taccaacaga aaccaggaca gccacccaa    59

<210>33

<211>59

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物L3

<400>33

gagagccacc atctcctgca gagccagtga aagtgttgaa tattatggca caagtttaa    59

<210>34

<211>64

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物L4

<400>34

gagctcaccc agactccagt ctccctggct gtgtctctag ggcagagagc caccatctcc   60

tgca                                                                64

<210>35

<211>59

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物L1R

<400>35

gaagtctgtc ccagacccac tgccactaaa cctggcaggg accccaggtt ctacgttgg    59

<210>36

<211>59

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物L2R

<400>36

tgcaatatca tcctcctcca caggctggat gttgaggctg aagtctgtcc cagacccac    59

<210>37

<211>59

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物L3R

<400>37

cgtccaagga acattcctac tttgctgaca gaaatacatt gcaatatcat cctcctcca    59

<210>38

<211>44

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物L4R

<400>38

ctcgagcttg gtccctcctc cgaacgtcca aggaacattc ctac                    44

<210>39

<211>321

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>抗乙型病毒性肝炎表面抗原单克隆抗体5C3轻链V区

<400>39

gagctcaccc agactccagt ctccctggct gtgtctctag ggcagagagc caccatctcc    60

tgcagagcca gtgaaagtgt tgaatattat ggcacaagtt taatgcagtg gtaccaacag    120

aaaccaggac agccacccaa actcctcatc tatgctgcat ccaacgtaga acctggggtc    180

cctgccaggt ttagtggcag tgggtctggg acagacttca gcctcaacat ccagcctgtg    240

gaggaggatg atattgcaat gtatttctgt cagcaaagta ggaatgttcc ttggacgttc    300

ggaggaggga ccaagctcga g                                              321

<210>40

<211>1599

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>完整的乙型病毒性肝炎表面抗原单克隆抗体5C3重链

<400>40

atgaacttcg ggctcagctt gattttcctt gtcctaattt taaaaggtgt ccagtgtcag    60

gtgcagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcact    120

tgcactgtct ctgggttttc attaaccagc tatggtgtac actgggttcg ccagcctcca    180

ggaaagggtc tggagtggct gggagtaata tgggctggtg gaatcacaaa ttataattcg    240

gctctcatgt ccagactgag catcaggaaa gacaatttca agagccaagt tttcttaaaa    300

atgaacagtc tgcaaaatga tgacacagcc atgtactact gtgccagagg aggaggagtc    360

tactatggta tcaactatgc tatggactac tggggccaag ggaccacggt caccgtcgcc    420

aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc    480

atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg    540

aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc    600

tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc    660

tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat    720

tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat catctgtctt catcttcccc    780

ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta    840

gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg    900

cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt    960

gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac    1020

agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag    1080

gctccacagg tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt    1140

ctgacctgca tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat    1200

gggcagccag cggagaacta caagaacact cagcccatca tggacacaga tggctcttac    1260

ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc    1320

tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct    1380

cctgggctgc aactggacga gacctgtgct gaggcccagg acggggagct ggacgggctc    1440

tggacgacca tcaccatctt catcagcctc ttcctgctca gcgtgtgcta cagcgctgct    1500

gtcacactct tcaaggtaaa gtggatcttc tcctcggtgg tggagctgaa gcagacactg    1560

gttcctgaat acaagaacat gattgggcaa gcgccctag                           1599

<210>41

<211>708

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>完整的乙型病毒性肝炎表面抗原单克隆抗体5C3轻链

<400>41

atgaacttcg ggctcagctt gattttcctt gtcctaattt taaaaggtgt ccagtgtgac    60

attgtgctca cccaatctcc agcttctttg gctgtgtctc tagggcagag agccaccatc    120

tcctgcagag ccagtgaaag tgttgaatat tatggcacaa gtttaatgca gtggtaccaa    180

cagaaaccag gacagccacc caaactcctc atctatgctg catccaacgt agaacctggg    240

gtccctgcca ggtttagtgg cagtgggtct gggacagact tcagcctcaa catccagcct    300

gtggaggagg atgatattgc aatgtatttc tgtcagcaaa gtaggaatgt tccttggacg    360

ttcggaggag ggaccaagct cgagcgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca    420

ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc    480

taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc    540

ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc    600

acgttgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag    660

acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgttag                 708

<210>42

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物hEPO29

<400>42

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggct                                       29

<210>43

<211>28

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物hEPO28

<400>43

tcatctgtcc cctgtcctgc aggcctcc                                        28

<210>44

<211>582

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>基因

<222>(1)..(582)

<223>hEPO cDNA

<400>44

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct    60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag    120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc    180

agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg    240

atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct    300

gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg    360

catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctggga    420

gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc    480

actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg    540

aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat ga                       582

<210>45

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物hEPOEcoR1

<400>45

cggaattcat gggggtgcac gaatgtcctg cct    33

<210>46

<211>32

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物hEPOBgl2

<400>46

gaagatcttc atctgtcccc tgtcctgcag gc     32

Claims (3)

1.一种同时表达抗原特异性受体和报告基因或同时表达抗原特异性受体和具有治疗作用的基因的重组逆转录病毒载体，其中同时表达抗原特异性受体和报告基因的重组逆转录病毒载体的所述抗原特异性受体为人汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1、所述报告基因为EGFP基因、所述逆转录病毒载体为pMSCVneo，同时表达抗原特异性受体和具有治疗作用的基因的重组逆转录病毒载体的所述抗原特异性受体为人乙肝病毒表面抗原特异性mIgG1、所述具有治疗作用的基因为人EPO基因、所述逆转录病毒载体为pMSCVneo。

2.一种用同时表达抗原特异性受体和报告基因或同时表达抗原特异性受体和具有治疗作用的基因的重组逆转录病毒载体在体外修饰哺乳动物或人B-淋巴细胞的方法，其包含下述步骤：

a)分离、培养所述的B-淋巴细胞16-24小时，

b)以每1×10⁸个细胞用包装好的所述重组逆转录病毒载体体外转染步骤a)中培养的细胞24小时，洗涤转染后的细胞，

其中同时表达抗原特异性受体和报告基因的重组逆转录病毒载体的所述抗原特异性受体为人汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1、所述报告基因为EGFP基因、所述逆转录病毒载体为pMSCVneo，同时表达抗原特异性受体和具有治疗作用的基因的重组逆转录病毒载体的所述抗原特异性受体为人乙肝病毒表面抗原特异性mIgG1、所述具有治疗作用的基因为人EPO基因、所述逆转录病毒载体为pMSCVneo。

3.一种根据权利要求2的方法获得的B-淋巴细胞。

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