CN115551555A - 用于修饰car-t细胞活性的方法、化合物和组合物 - Google Patents

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Abstract

用于降低表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR‑T细胞)的脱靶毒性和/或增强对CAR‑T细胞活化的控制的化合物、组合物和方法，以及治疗受试者和/或修饰患有癌症的受试者中CAR‑T细胞活性的方法。

Description

用于修饰CAR-T细胞活性的方法、化合物和组合物
优先权
本专利申请与2020年3月6日提交的美国临时专利申请号62/986,349相关并要求优先权，该临时专利的内容通过引用的方式整体并入本文。
技术领域
本公开涉及用于治疗患有癌症的受试者并降低表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的脱靶毒性和/或提供对CAR-T细胞活化的增强控制的化合物、组合物和方法。特别地，靶向部分与活性化合物一起与CAR-T细胞疗法联合使用，以定向CAR-T细胞并根据需要修饰其活性。
背景技术
基于将淋巴细胞(例如，T细胞)过继转移到患者体内的免疫疗法是治疗癌症和其他疾病的有价值的疗法。在基于淋巴细胞的过继转移开发免疫疗法方面取得了重要进展。在许多不同类型的免疫治疗剂中，正在开发的最有前途的免疫治疗剂之一是表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)。
T细胞已被基因工程化以在其表面上产生称为嵌合抗原受体或CAR的人工T细胞受体。CAR是允许T细胞识别在靶向肿瘤细胞上发现的特定的、预先选择的蛋白质或抗原的蛋白质。CAR-T细胞可以在实验室进行培养和扩增，然后重新注入自体受试者体内。通过工程化的T细胞受体的定向，CAR-T细胞识别并摧毁在其表面展示特定抗原的癌细胞。
常规CAR包括用于识别肿瘤表达的抗原并与之结合的识别区(例如，衍生自抗体的单链片段可变(scFv)区)。识别区可以融合到T细胞受体的质膜外结构域以增强T细胞与癌细胞的结合。为了促进癌细胞的快速杀伤，可以进一步修饰CAR以包含激活信号传导结构域，该结构域例如可以衍生自CD3ζ、Fc受体γ信号传导结构域或一个或多个共刺激结构域，例如CD28、4-1BB、ICOS、OX40等。
尽管CAR-T细胞已在体外显示出积极的结果，但使用这些基因工程化的T细胞治疗人类癌症已经引入了与控制CAR-T细胞活性相关的挑战。一个这样的挑战(特别是在实体瘤癌症中)是鉴定在整个肿瘤或其他恶性靶标中而不是在正常组织上均匀表达的靶抗原。迄今为止，已在上皮癌上鉴定的具有均匀表达的靶标很少。因此，CAR-T细胞可以通过靶向也在正常组织上表达的肿瘤相关抗原来潜在地损害正常组织。这可能导致可能伤害甚至杀死癌症患者的毒性。这样的毒性可以包括，例如，神经毒性、“在靶/脱肿瘤(on target/offtumor)”识别和过敏反应。
此外，细胞因子相关毒性，也称为“细胞因子风暴”或细胞因子释放综合征(CRS)，是CAR-T细胞疗法的常见且可能致命的并发症。CRS是一种非抗原特异性毒性，可能由于高水平的CAR-T细胞扩增和免疫激活而发生，通常需要使用现代免疫疗法(例如CAR-T细胞转移)来调节临床益处。常规CAR-T细胞与其靶标之间的相互作用导致CAR-T细胞的激活和扩增以及正常细胞和肿瘤细胞两者的裂解。这与几种细胞因子如干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的释放有关。这些信号的组合还触发了单核细胞和巨噬细胞的激活，具有增强的杀肿瘤能力，并分泌高水平的促炎细胞因子(例如，白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1(IL-1)和白细胞介素10(IL-10))和其他介质，例如诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，所有这些都可以促进CRS和其他相关毒性的进展。在大多数患者中，CRS症状通常轻微且类似流感，伴有发烧和肌痛。然而，一些患者会出现严重的炎症综合征，可能导致多器官系统衰竭。
仍然需要为CAR-T细胞疗法提供改进的方法和组合物，特别是消除与这些医学干预相关的毒性。虽然CAR-T细胞作为治疗疾病(例如癌症)的工具显示出巨大的前景，但需要另外的CAR-T细胞疗法来降低脱靶毒性并更精确地控制CAR-T细胞活化。
发明内容
提供了用于降低脱靶毒性并更精确地控制表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的活化的化合物、组合物和方法，其促进CAR-T细胞疗法(例如，治疗癌症)。在这样的疗法中，与第一靶向部分连接(通过第一接头(linker)连接或直接连接)的小分子配体用作一个或多个癌细胞和CAR-T细胞之间的衔接(adaptor)化合物(即桥梁)，在使用中，将CAR-T细胞定向到癌症以治疗癌症。作为衔接化合物的一部分的小分子配体可以是例如叶酸、2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸(DUPA)配体、神经激肽1受体(NK-1R)配体、碳酸酐酶IX(CAIX)配体、γ-谷氨酰转肽酶配体、自然杀伤组2D受体(NKG2D)配体或胆囊收缩素B受体(CCKBR或CCK2)配体，每一种都是特异性结合在某些类型癌细胞上过表达的受体的小分子配体(即，与正常组织和非靶标癌细胞相比，这些配体的受体在靶标癌细胞上过表达)。
在衔接化合物中，小分子配体可以连接到与CAR-T细胞表达的嵌合抗原受体(CAR)结合的第一靶向部分。第一“靶向部分”可以选自例如2,4-二硝基苯酚(DNP)、2,4,6-三硝基苯酚(TNP)、生物素、地高辛、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、NHS-荧光素、五氟苯基酯(PFP)、四氟苯基酯(TFP)、knottin、centyrin和设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)。
第一靶向部分与CAR-T细胞表达的基因工程化的CAR的识别区结合。因此，CAR的识别区(例如，抗体的单链片段可变区(scFv)、Fab、Fv、Fc、(Fab’)2片段等)针对第一靶向部分。因此，包含与第一靶向部分连接的小分子配体的衔接化合物充当癌细胞和CAR-T细胞之间的桥梁，将CAR-T细胞定向到癌症以治疗癌症。因此，这种CAR-T细胞疗法可以降低脱靶毒性，并更精确地控制CAR-T细胞活化，因为衔接化合物中的小分子配体与靶向癌细胞而不是非靶向组织特异性结合，从而导致脱靶毒性降低，并且衔接化合物在循环中的半衰期短，这允许衔接化合物浓度的快速变化以精确控制CAR-T细胞活化。
在某些实施方案中，所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐中的至少一种不是抗体，也不包含抗体片段。
上述疗法还具有可以施用不同肿瘤特异性衔接化合物的混合物(例如，不同小分子配体但相同靶向部分)的优点。因此，由于使用了多种肿瘤特异性衔接化合物，并且当肿瘤发生突变并失去其原发性肿瘤抗原时，不同肿瘤特异性衔接化合物可以充当癌细胞和CAR-T细胞之间的桥梁，因此仍然可以根除已发生突变并失去其原发性肿瘤抗原的异质实体瘤。
衔接化合物的使用还提供了“通用性”，因为具有单一类型识别区的单一类型CAR-T细胞可用于根除多种肿瘤类型。CAR-T细胞具有针对衔接化合物中的第一靶向部分的单一类型识别区，但不同的衔接化合物具有针对多种肿瘤类型的不同小分子配体(即肿瘤靶向配体)。因此，衔接化合物使CAR-T细胞成为“通用的”CAR-T细胞，用于杀死表达不同抗原的肿瘤，因为衔接化合物中的不同小分子配体与不同的肿瘤类型结合，但只使用具有一种类型的识别区的一种类型的CAR-T细胞。
CAR-T细胞疗法面临的其他问题是，在肿瘤微环境中长期暴露于肿瘤抗原或免疫抑制因子(例如骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、调节性T细胞(Treg)和抑制性细胞因子)可能导致CAR-T细胞功能障碍或“耗竭”或增殖减弱。相比之下，CAR-T细胞可能会变得过度活跃，从而导致CAR-T细胞疗法产生不良副作用，例如细胞因子释放综合征(CRS)，这可能对患者致命。为了解决这些问题，在至少一个实施方案中，利用作为CAR的一部分的识别区(例如，scFV片段)的内吞作用将活性修饰化合物或其药学上可接受的盐递送至CAR-T细胞。
活性修饰化合物或其药学上可接受的盐直接或通过第二接头与第二靶向部分连接。在某些实施方案中，第二靶向部分选自由以下组成的组：DNP、TNP、生物素、地高辛、荧光素、FITC、NHS-荧光素、五氟苯基酯、 四氟苯基酯、knottin、centyrin和DARPin。在一些实施方案中，第一靶向部分和第二靶向部分中的一个或两个不包含肽表位。
活性修饰化合物或其药学上可接受的盐可以包括再生化合物(rejuvenatingcompound)或其药学上可接受的盐。再生化合物或其药学上可接受的盐可以是配制为使耗竭的CAR-T细胞再生(例如，通过阻断抑制性信号传导或耗竭的CAR-T细胞、通过不依赖抗原的途径重新激活耗竭的CAR-T细胞、执行上述两者或通过其他方法)的化合物、药物或活性剂。在各种实施方案中，再生化合物或其药学上可接受的盐选自由Toll样受体 (TLR) 激动剂 (例如，TLR1、TLR2、TLR7、TLR8、TLR7/8、TLR9、TLR3、TLR4等)、干扰素基因刺激因子(STING)激动剂、Nod样受体刺激剂(NLR)、黑色素瘤2(AIM2)样受体(ALR)激动剂缺乏、激酶抑制剂靶向激酶如GSK-3β、PI3K等和磷酸酶抑制剂组成的组。在另外的实施方案中，例如当再生化合物或其药学上可接受的盐是TLR7/8激动剂时，所述再生化合物或其药学上可接受的盐具有下式之一：
Figure BDA0003920193670000031
当施用时，再生药物被递送到CAR-T细胞中(例如，通过第二靶向部分和CAR识别区)。通过将再生药物集中在CAR-T细胞内，耗竭或功能障碍的CAR-T细胞可以再生成为功能性和肿瘤杀伤性CAR-T细胞，从而重新根除实体瘤。将再生化合物施用于靶CAR-T细胞可以逆转由肿瘤微环境诱导的CAR-T细胞耗竭或功能障碍。
在一些实施方案中，再生化合物或其药学上可接受的盐具有下式：
Figure BDA0003920193670000032
在一些实施方案中，再生化合物或其药学上可接受的盐具有下式之一的结构：
Figure BDA0003920193670000041
Figure BDA0003920193670000042
其中n＝0至200，或
Figure BDA0003920193670000043
其中n＝0至50。
为允许精确控制CAR-T细胞活性和降低CAR-T细胞活性，活性修饰化合物或其药学上可接受的盐可以包括免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐。免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐可以是配制为降低CAR-T细胞活性的化合物、药物或活性剂。在各种实施方案中，免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐选自由他克莫司、西罗莫司和环孢菌素组成的组。施用时，免疫抑制药物被递送到CAR-T细胞中(例如，通过第二靶向部分和CAR识别区)。通过将免疫抑制药物集中在CAR-T细胞内，可以降低CAR-T细胞活性，从而抑制过度CAR-T细胞活化的不良副作用，例如CRS。
还提供了在患有癌症的受试者中修饰T细胞活性(例如治疗癌症)和/或治疗癌症的方法。所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包含：包含与编码CAR的核酸序列可操作地连接的启动子的载体(例如，慢病毒载体)，或表达CAR的CAR-T细胞，其中CAR针对第一靶向部分、第二靶向部分或第一和第二靶向部分两者；向患者施用一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐，其中每种衔接化合物或其药学上可接受的盐包含与第一靶向部分连接的小分子配体；和向受试者施用与第二靶向部分连接的活性修饰化合物(例如，再生化合物或其药学上可接受的盐，或免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐)。所述方法可以进一步包括在施用所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐之前或在施用CAR-T细胞组合物之前对受试者进行成像。
每种衔接化合物的小分子配体可以通过第一接头与其第一靶向部分连接。独立地，活性修饰化合物可以通过第二接头与第二靶向部分连接。在使用第一接头和第二接头的实施方案中，第一接头和第二接头可以具有相同的结构或不同的结构。第一接头和第二接头可以各自独立地是可释放接头或不可释放接头。在某些实施方案中，第一接头、第二接头或两者可以独立地包含C1-C20烷基、聚乙二醇(PEG)、聚脯氨酸、低聚(4-哌啶羧酸)、低聚哌啶、肽、糖-肽、亲水性氨基酸、糖、非天然肽聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、pluronic F-127或其组合。在一些实施方案中，第一接头或第二接头包含PEG。
在某些实施方案中，所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐各自具有下式：
B-L-T，
其中B代表小分子配体，L代表第一接头，T代表第一靶向部分，L包含具有下式的结构：
Figure BDA0003920193670000051
其中n是0到200的整数。
类似地，在某些实施方案中，第二接头可以具有具有下式的结构：
Figure BDA0003920193670000052
其中n是0到200的整数。
当使用时，所述一种或多种衔接化合物(或其药学上可接受的盐)中的第一接头可以位于小分子配体和第一靶向部分之间。类似地，当使用时，活性修饰化合物中的第二接头可以位于第二靶向部分和活性修饰化合物之间。在某些实施方案中，第一接头和/或第二接头可以各自包含具有独立地选自下式的结构的化学部分：
Figure BDA0003920193670000061
其中n是0到200的整数。
在某些实施方案中，所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐的小分子配体包含具有下式的结构：
Figure BDA0003920193670000071
其中：
X1和Y1各自独立地选自由卤素、R2、OR2、SR3和NR4R5组成的组；
U、V和W代表各自独立地选自由-(R6a)C＝、-N＝、-(R6a)C(R7a)-和-N(R4a)-组成的组的二价部分；
Q选自由C和CH组成的组；
T选自由S、O、N和-C＝C-组成的组；
X2和X3各自独立地选自由氧、硫、-C(Z)-、-C(Z)O-、-OC(Z)-、-N(R4b)-、-C(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)-、-OC(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)O-、-N(R4b)C(Z)N(R5b)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R4a)S(O)2-、-C(R6b)(R7b)-、-N(C≡CH)-、-N(CH2C≡CH)-、C1-C12亚烷基和C1-C12亚烷氧基组成的组，其中Z是氧或硫；
R1选自由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基组成的组；
R2、R3、R4、R4a、R4b、R5、R5b、R6b和R7b各自独立地选自由氢、卤素、C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、C1-C12烷酰基、C1-C12烯基、C1-C12炔基、(C1-C12烷氧基)羰基和(C1-C12烷基氨基)羰基组成的组；
R6和R7各自独立地选自由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基组成的组；或者R6和R7一起形成羰基；
R6a和R7a各自独立地选自由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基组成的组；或者R6a和R7a一起形成羰基；
p、r、s和t各自独立地为0或1；和
如果所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐包含化学部分，则*代表共价键。
在至少一个实施方案中，所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐至少包含：第一组衔接化合物或其药学上可接受的盐，第一组的每种衔接化合物或其药学上可接受的盐包含与第一靶向部分连接的第一小分子配体；和第二组衔接化合物或其药学上可接受的盐，第二组的每种衔接化合物或其药学上可接受的盐包含与第一靶向部分连接的第二小分子配体；其中第一小分子配体对第一种类型的癌细胞上过表达的受体具有特异性，而第二小分子配体对第二种类型的癌细胞上过表达的受体具有特异性。
在某些实施方案中，CAR可以具有包含抗体scFv区的识别区，所述识别区以高亲和力(例如，在亚纳摩尔范围内)与第一靶向部分和/或第二靶向部分结合。例如但不限于，scFv区可以是抗FITC抗体的scFv区。以这种方式，当施用时，将CAR-T细胞的识别区与第二靶向部分结合将与第二靶向部分连接的活性修饰化合物内化到CAR-T细胞中。
CAR可以进一步包含共刺激结构域和/或激活信号传导结构域。在某些实施方案中，共刺激结构域选自由以下组成的组：CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)和CD278(ICOS)。在某些实施方案中，激活信号传导结构域是T细胞CD3ζ链或Fc受体γ。
还提供了使用所公开的组合物、细胞、载体和化合物来治疗已接受CAR-T细胞疗法(例如，通过修饰CAR-T细胞活性)的受试者的方法。在一些实施方案中，治疗受试者中的癌症和/或杀死受试者中的癌细胞的方法包括：向受试者施用一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐，每种衔接化合物或其药学上可接受的盐包含与第一靶向部分连接的小分子配体，其中，在施用步骤之前，受试者已接受至少一个剂量的表达识别第一靶向部分并与其结合的CAR的T细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用与第二靶向部分连接的活性修饰化合物的步骤，其中CAR识别第二靶向部分并与其结合。
还提供了用于修饰T细胞活性的组合(例如，其可以导致治疗癌症)。所述组合包含一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐，其中每种衔接化合物或其药学上可接受的盐包含与第一靶向部分连接的小分子配体；和活性修饰化合物，所述活性修饰化合物包含：再生化合物或其药学上可接受的盐，或免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐。所述一种或多种衔接化合物(或其药学上可接受的盐)和活性修饰化合物可以是本文所述的任何化合物并且分别包括但不限于第一接头和第二接头。
用于在患有癌症的受试者中修饰T细胞活性和/或治疗癌症的其他组合包括一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐，其中每种衔接化合物或其药学上可接受的盐包含与第一靶向部分连接的小分子配体；活性修饰化合物，所述活性修饰化合物包含：再生化合物或其药学上可接受的盐，或免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐；和包含CAR-T细胞的组合物，其中CAR-T细胞包含针对第一靶向部分、第二靶向部分或第一和第二靶向部分两者的CAR。例如，CAR可以具有以高亲和力(例如，在亚纳摩尔范围内)与第一靶向部分和/或第二靶向部分结合的识别区。所述一种或多种衔接化合物(或其药学上可接受的盐)、活性修饰化合物和CAR-T细胞组合物可以是本文所述的任何化合物和组合物。
还提供了用于修饰T细胞活性/治疗癌症的组合，所述组合包含载体组合物。在一些实施方案中，所述组合包含一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐，其中每种衔接化合物或其药学上可接受的盐包含与第一靶向部分连接的小分子配体；活性修饰化合物，所述活性修饰化合物包含：再生化合物或其药学上可接受的盐，或免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐；和载体组合物，所述载体组合物包含与编码CAR的核酸序列可操作地连接的启动子。所述一种或多种衔接化合物(或其药学上可接受的盐)、活性修饰化合物、载体组合物和CAR可以是本文所述的任何化合物、组合物或CAR(视情况而定)，并且分别包括但不限于第一接头和第二接头。载体组合物可以包含慢病毒载体。例如，但不限于，载体组合物可以包含含有核酸载体的慢病毒颗粒。在至少一个实施方案中，载体组合物包含治疗有效量的所公开的病毒颗粒。
还提供了用于使CAR-T细胞再生的化合物。一种用于使CAR-T细胞再生的化合物包括再生化合物或其药学上可接受的盐，其选自由以下组成的组：TLR激动剂、STING激动剂、NLR、ALR激动剂、激酶抑制剂靶向激酶、RLR、RAGE、磷酸酶抑制剂以及位于靶向的CAR-T细胞的核内体或细胞质中的任何其他模式识别受体。
在某些实施方案中，用于使CAR-T细胞再生的化合物或其药学上可接受的盐具有下式的结构：
Figure BDA0003920193670000081
在某些实施方案中，用于使CAR-T细胞再生的化合物或其药学上可接受的盐具有下式的结构：
Figure BDA0003920193670000091
在某些实施方案中，用于使CAR-T细胞再生的化合物或其药学上可接受的盐具有下式之一的结构：
Figure BDA0003920193670000092
Figure BDA0003920193670000093
其中n＝0至200，或
Figure BDA0003920193670000094
其中n＝0至50。
在某些实施方案中，用于使CAR-T细胞再生的化合物或其药学上可接受的盐具有下式：
Figure BDA0003920193670000101
附图说明
实施方案和其他特征、优点和方面以及实现它们的事项将根据以下对各种示例性实施方案的详细描述而变得显而易见。结合附图将更好地理解详细描述。
图1显示了可用于CAR-T细胞转导的构建体的总图。
图2A显示了体外耗竭模型的图示。
图2B显示了抗FITC CAR-T细胞在体外用新鲜的MDA-MB-231细胞刺激两次后变得耗竭，如杀伤作用降低所示，图2C显示了T细胞耗竭标志物(PD-1+Tim3+LAG3+)的表达相应增加。
图3显示了TLR7激动剂-FITC缀合物的结构。
图3B显示了TLR7激动剂-FITC缀合物在耗竭模型中体外对耗竭的抗FITC CAR-T细胞的再生作用，显示为杀伤作用增加；FITC-AF647对抗FITC CAR-T细胞的Kd＝8.03nM；
图4A显示了在KB异种移植模型中FITC-TLR7激动剂缀合物的再生作用，显示为肿瘤大小减小。
图4B和图4C显示了在KB异种移植模型中FITC-TLR7激动剂缀合物的再生作用，显示为耗竭标志物(PD-1+Tim3+)的表达降低。
图4D显示了CAR T细胞群的变化。
图4E显示了小鼠体重的变化。
在可行和方便的情况下，在附图和描述中使用相似的附图标记来指代相同或相似的部分或步骤。附图是简化的形式而不是精确的比例。尽管本公开易于进行各种修改和易于有替代形式，但其示例性实施方案在附图中示出并被详细描述。
序列表的简要说明
SEQ ID NO:1是用于编码嵌合抗原受体(CAR)的示例性核酸序列；
SEQ ID NO:2是由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3编码的示例性CAR氨基酸序列；和
SEQ ID NO:3是用于编码CAR的示例性核酸序列。
上述序列在下面的序列表部分中列出，并且还以计算机可读形式提供，其编码在与本文一起提交的文件中并且通过引用的方式并入本文。根据37C.F.R.§1.821(f)，以计算机可读形式记录的信息与本文提供的书面序列表相同。
具体实施方式
本公开涉及与常规的CAR-T细胞疗法相比，在向受试者施用表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)后降低脱靶毒性倾向的化合物和组合物的制备和用途。术语“脱靶毒性”是指器官或组织损伤或受试者体重减轻，这对于治疗受试者的医师来说是不希望的，或指对治疗医生来说是潜在不利指标的对受试者的任何其他影响，例如B细胞发育不全、发烧、血压下降或肺水肿。术语“治疗”(关于疾病或病症)是用于获得有益或期望结果(包括且优选临床结果)的方法，包括但不限于以下一项或多项：改善与疾病相关的状况、治愈疾病、减轻疾病的严重程度、延缓疾病的进展、减轻与疾病相关的一种或多种症状、提高患有疾病的人的生活质量、延长生存期和/或预防性治疗。特别是关于癌症，术语“治疗”可以另外意指减小肿瘤的大小、完全或部分去除肿瘤(例如，完全或部分反应)、导致疾病稳定、防止癌症的进展(例如，无进展生存期)或对癌症的任何其他影响，这些影响会被医生认为是癌症的治疗性或预防性治疗。
在各种实施方案中，组合物包含基因工程化的CAR-T细胞和至少一种衔接化合物。衔接化合物可以对一种或多种靶向癌细胞具有特异性，并且适于通过靶向部分与CAR-T细胞的嵌合抗原受体(CAR)结合，使得当施用时，衔接化合物在靶向癌细胞和CAR-T细胞之间形成桥梁。在至少一个实施方案中，CAR-T细胞的CAR针对衔接化合物的靶向部分，从而使其特异性结合，从而降低脱靶毒性和其他相互作用。以这种方式，CAR-T细胞可以与衔接化合物结合，并且当如此结合时，衔接化合物可以将CAR-T细胞定向到靶向癌细胞以治疗癌症。
制定各种实施方案以在向受试者施用CAR-T细胞后增强对体内CAR-T细胞活化的控制。例如，此类组合物的实施方案可以包含基因工程化的CAR-T细胞和至少一种活性修饰化合物(例如，再生化合物、免疫抑制化合物或上述任一种的药学上可接受的盐)。CAR-T细胞可以包含针对活性修饰化合物的靶向部分的CAR，使得当将CAR-T细胞和活性修饰化合物施用于受试者时，CAR-T细胞连接(例如，具有特异性)至与活性修饰化合物偶联的靶向部分。在至少一个实施方案中，CAR的识别区可以另外用于将活性修饰化合物递送到CAR-T细胞中。此类实施方案可用于代替衔接化合物或与衔接化合物结合使用。
如本文所用，“CAR-T细胞”是指已通过分子生物学方法修饰以在T细胞表面表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞或其群体。CAR是对所需靶标具有预定结合特异性的多肽，并且与T细胞活化结构域的细胞内部分可操作地连接(例如，作为融合物、通过一个或多个二硫键连接的单独链等)。通过绕过MHC I类和II类限制，可以招募CD8+和CD4+亚群的CAR工程化的T细胞用于重定向靶细胞识别。
如以下进一步详细描述的，CAR包含如本文进一步定义的识别区。在某些实施方案中，CAR可以另外包括激活信号传导结构域，例如，该激活信号传导结构域可以衍生自T细胞CD3ζ链、Fc受体γ信号传导结构域或Fc受体γ，或一种或多种共刺激结构域，例如CD28、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)或CD134(OX40)。
某些CAR是结合功能性(例如，作为源自单克隆抗体的单链可变片段(scFv))与CD3ζ跨膜和胞内域的融合。此类分子导致响应于其靶标的识别受体结合功能性的识别而传递ζ信号。然而，有许多替代方案。作为非限制性实例，来自天然T细胞受体(TCR)α和β单链的抗原识别结构域可用作结合功能性。替代地，可以使用受体胞外域(例如，CD4胞外域)。结合功能性所需要的只是它可以以特定方式以高亲和力结合给定的靶标。
此外，当提及配体/受体、识别区/靶向部分、核酸/互补核酸、抗体/抗原或其他结合对时，“以特异性结合”、“以高亲和力结合”、或“特异性”或“选择性”结合表示决定蛋白质在蛋白质和其他生物制品的异质群体中的存在的结合反应。因此，在指定的条件下，指定的配体或识别区分别与特定受体(例如存在于癌细胞上的受体)或靶向部分结合，并且不会与样品中存在的其他蛋白质(例如与正常、健康细胞相关的蛋白质)大量结合。特异性结合或以高亲和力结合还可以指，例如，预期方法的结合化合物、配体、抗体或源自抗体的抗原结合位点的结合组合物以比与任何其他结合化合物的亲和力经常至少大25％、更经常至少大50％、最经常至少大100％(2倍)、通常至少大10倍、更通常至少大20倍、最通常至少大100倍的亲和力与其靶标结合。
在典型的实施方案中，如所确定的，例如通过Scatchard分析，特异性结合靶标的分子将具有至少约106L/mol(KO＝10～6M)，并且优选地至少约10L/mol的亲和力。本领域技术人员认识到，一些结合化合物可以与多于一种靶标特异性结合，例如抗体与其抗原特异性结合，通过抗体的寡糖与凝集素结合，和/或通过抗体的Fc区与Fc受体结合。
现在将详细描述所述化合物、组合物和方法。为了促进对本文提出的原理的理解，参考附图中所示的实施方案并且将使用特定语言来描述该实施方案。然而应当理解，这些实施方案的描述不旨在限制范围。相反，本公开旨在覆盖可包括在由所附权利要求限定的本申请的精神和范围内的替代方案、修改和等效物。如前所述，虽然可以在一个或多个优选实施方案中说明和描述该技术，但其组合物、化合物和方法可以包括许多不同的设置、形式、物质和附件。
如上所述，某些化合物包含至少一种衔接化合物(或其药学上可接受的盐)，其适于在癌细胞和CAR-T细胞之间形成桥梁，其中CAR-T细胞包含针对衔接化合物的靶向部分的CAR。因此，CAR-T细胞可以与衔接化合物的靶向部分结合，并且当如此结合时，衔接化合物可以将CAR-T细胞定向到癌症以治疗癌症。
衔接化合物
在至少一个实施方案中，衔接化合物(或其药学上可接受的盐)是通过第一接头或其他方式与第一靶向部分连接的小分子配体。所述小分子配体可以是以特异性与癌细胞类型结合的任何小分子配体(即，与正常组织或其他非靶向癌症类型相比，这种配体的受体在靶向癌细胞上过表达)。如本文所用，“配体”是连接到化合物的中心原子或离子(例如药物)的分子、离子或原子。“配体”还包括不是激动剂或拮抗剂并且不具有激动剂或拮抗剂特性的结合剂。此外，术语“过表达的”、“过表达”及其构词(当与受体表达等结合使用时)具有相关领域普通技术人员所赋予的含义，包括(但不限于)与正常组织或其他非靶向类型的细胞相比，靶细胞(例如肿瘤细胞)上特定受体的存在增加。
在至少一个实施方案中，衔接化合物的小分子配体是叶酸、碳酸酐酶IX(CAIX)配体、2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸(DUPA)配体、神经激肽1受体(NK-1R)配体、γ-谷氨酰转肽酶配体、自然杀伤组2D受体(NKG2D)配体或胆囊收缩素B受体(CCKBR或CCK2)配体。上述每一种都是与在某种癌细胞类型上过表达的受体特异性结合的小分子配体(即，与这些配体中每一种的受体在正常组织上或者可能在未经历靶向癌症类型的病变组织中的表达相比，此类受体在癌症上过表达)。事实上，CAIX配体的受体存在于例如肾癌、卵巢癌、外阴癌和乳腺癌中；NK-1R配体的受体存在于例如结肠癌和胰腺癌中；DUPA配体是PSMA阳性人类前列腺癌细胞和其他癌细胞类型结合的配体；NKG2D配体的受体存在于例如肺癌、结肠癌、肾癌、前列腺癌以及T细胞和B细胞淋巴瘤中；CCKBR配体的受体存在于甲状腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、脑癌、胃癌、胃肠道间质癌和结肠癌等中；并且转肽酶在例如卵巢癌、结肠癌、肝癌、星形胶质细胞瘤、黑色素瘤和白血病中过表达。
在其他实施方案中，衔接化合物或其药学上可接受的盐不是抗体，并且不包含抗体片段。在又一个实施方案中，第一靶向部分不包含肽表位。
在一个实施方案中，小分子配体可以具有小于约10,000道尔顿、小于约9,000道尔顿、小于约8,000道尔顿、小于约7,000道尔顿、小于约6,000道尔顿、小于约5,000道尔顿、小于约4,500道尔顿、小于约4,000道尔顿、小于约3,500道尔顿、小于约3,000道尔顿、小于约2,500道尔顿、小于约2,000道尔顿、小于约1,500道尔顿、小于约1,000道尔顿或小于约500道尔顿的质量。在另一个实施方案中，小分子配体可以具有约1道尔顿至约10,000道尔顿、约1道尔顿至约9,000道尔顿、约1道尔顿至约8,000道尔顿、约1道尔顿至约7,000道尔顿、约1道尔顿至约6,000道尔顿、约1道尔顿约5,000道尔顿、约1道尔顿至约4,500道尔顿、约1道尔顿至约4,000道尔顿、约1道尔顿至约3,500道尔顿、约1道尔顿至约3,000道尔顿、约1道尔顿至约2,500道尔顿、约1道尔顿至约2,000道尔顿、约1道尔顿至约1,500道尔顿、约1道尔顿至约1,000道尔顿或约1道尔顿至约500道尔顿的质量。在其他实施方案中，这些质量也可以适用于靶向部分。
在一个实施方案中，DUPA衍生物可以是与衔接化合物或其药学上可接受的盐中的第一靶向部分连接的小分子配体的配体。此类DUPA衍生物描述于国际公开号WO 2015/057852中，关于其相同的教导通过引用的方式整体并入本文。
在至少一个实施方案中，小分子配体是叶酸。“叶酸”可以是叶酸、叶酸类似物或另一种叶酸受体结合分子，包括例如叶酸的类似物和衍生物，例如但不限于亚叶酸(例如甲酰四氢叶酸)、蝶酰聚谷氨酸、蝶酰-D-谷氨酸和叶酸受体结合蝶啶，例如四氢蝶呤、二氢叶酸、四氢叶酸及其脱氮和双脱氮类似物。
关于肽、多肽或蛋白质，“类似物”或“衍生物”是指具有与原始肽、多肽或蛋白质相似或相同的功能但不一定包含原始肽、多肽或蛋白质的相似或相同的氨基酸序列或结构的肽、多肽或蛋白质。类似物优选满足以下至少一项：(a)具有与原始氨基酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列的蛋白质物质；(b)由在严格条件下与编码原始氨基酸序列的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的蛋白质物质；或(c)由与编码原始氨基酸序列的核苷酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列编码的蛋白质物质。
术语“脱氮”和“双脱氮”类似物是指在天然存在的叶酸结构或其类似物或衍生物中具有取代一个或两个氮原子的碳原子的本领域公认的类似物。例如，脱氮类似物可以包括叶酸、亚叶酸、蝶酰聚谷氨酸和叶酸受体结合蝶啶如四氢蝶呤、二氢叶酸和四氢叶酸的1-脱氮、3-脱氮、5-脱氮、8-脱氮和10-脱氮类似物。双脱氮类似物包括例如1,5-双脱氮、5,10-双脱氮、8,10-双脱氮和5,8-双脱氮类似物。前述叶酸类似物通常被称为“叶酸”，反映了它们与叶酸受体结合的能力。其他叶酸受体结合类似物包括氨蝶呤、氨甲蝶呤(甲氨蝶呤)、N10-甲基叶酸、2-脱氨基-羟基叶酸、脱氮类似物(例如1-脱氮甲氨蝶呤或3-脱氮甲氨蝶呤)和3’,5’-二氯-4-氨基-4-脱氧-N10-甲基蝶酰谷氨酸(二氯甲氨蝶呤)。
前述类似物和/或衍生物也被称为“叶酸”，反映了它们与叶酸受体结合的能力。此类分子在与外源分子缀合时可有效增强跨膜转运，例如通过叶酸介导的内吞作用。前述可用于本文所述的叶酸受体结合配体。
在另一个实施方案中，其衔接化合物的小分子配体可以具有下式：
Figure BDA0003920193670000131
其中：
X1和Y1各自独立地选自由卤素、R2、OR2、SR3和NR4R5组成的组；
U、V和W代表各自独立地选自由-(R6a)C＝、-N＝、-(R6a)C(R7a)-和-N(R4a)-组成的组的二价部分；
Q选自由C和CH组成的组；
T选自由S、O、N和-C＝C-组成的组；
X2和X3各自独立地选自由氧、硫、-C(Z)-、-C(Z)O-、-OC(Z)-、-N(R4b)-、-C(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)-、-OC(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)O-、-N(R4b)C(Z)N(R5b)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R4a)S(O)2-、-C(R6b)(R7b)-、-N(C≡CH)-、-N(CH2C≡CH)-、C1-C12亚烷基和C1-C12亚烷氧基组成的组，其中Z是氧或硫；
R1选自由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基组成的组；
R2、R3、R4、R4a、R4b、R5、R5b、R6b和R7b各自独立地选自由氢、卤素、C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、C1-C12烷酰基、C1-C12烯基、C1-C12炔基、(C1-C12烷氧基)羰基和(C1-C12烷基氨基)羰基组成的组；
R6和R7各自独立地选自由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基组成的组；或者R6和R7一起形成羰基；
R6a和R7a各自独立地选自由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基组成的组；或者R6a和R7a一起形成羰基；
p、r、s和t各自独立地为0或1；和
如果任何另外的化学部分是叶酸的一部分或与叶酸偶联，则*代表与缀合物的其余部分的任选共价键。
在一方面，癌症可以过表达(与正常组织或细胞或另一种类型的癌症相比)小分子配体的受体。在一个说明性实施方案中，衔接化合物包含与小分子配体连接的异硫氰酸荧光素(FITC)。在另一方面，例如，细胞毒性T细胞或另一种类型的T细胞可以被转化以表达包含抗FITC scFv的CAR。在这方面，由于衔接化合物中的小分子配体与癌症结合，CAR可以靶向修饰癌症的FITC。因此，可以避免对正常、非靶细胞的毒性。在这个实施方案中，当表达抗FITC CAR的T细胞结合FITC时，CAR-T细胞被激活并且癌症得到治疗。
衔接化合物与第一靶向部分连接(直接或例如通过第一接头)。衔接化合物的第一靶向部分被设置为与由CAR-T细胞群表达的基因工程化的CAR的识别区结合。例如但不限于，第一靶向部分可以包含2,4-二硝基苯酚(DNP)、2,4,6-三硝基苯酚(TNP)、生物素、地高辛、荧光素、FITC、NHS-荧光素、五氟苯基酯、四氟苯基酯、knottin、centyrin、DARPin、亲和体(affibody)、affilin、anticalin、atrimer、avimer、双环肽、FN3支架、cys-knot、fynomer、Kunitz结构域或Obody。下文描述了可用靶向部分的各种实施方案，并且这些实施方案中的任何一个都可以与衔接化合物的第一靶向部分一起使用。
在至少一个实施方案中，小分子配体通过第一接头与第一靶向部分连接并且包含以下结构：
B-L-T，
其中B代表小分子配体，L代表第一接头，T代表第一靶向部分。下文描述了可用接头的各种实施方案，并且这些实施方案中的任何一个都可以与衔接化合物的第一接头一起使用。
当施用于受试者时，与第一靶向部分连接(例如，通过第一接头)的小分子配体充当靶癌细胞和CAR-T细胞之间的桥梁，并将CAR-T细胞定向到癌症以用于治疗癌症。在各种实施方案中，癌细胞和CAR-T细胞之间的桥梁(即衔接化合物或其药学上可接受的盐)可以是本文所述或实施例中所示的任何衔接化合物。
在至少一个实施方案中，衔接化合物(或其药学上可接受的盐)是一种有机小分子，因此可以在施用后快速实现从血流中的清除(即，在约20分钟或更短的时间内)。
将与至少一种衔接化合物一起施用的CAR-T细胞群包含具有定向到第一靶向部分的识别区(例如，抗体的scFv、Fab片段、可变区(Fv)、Fc区、(Fab’)2片段等)的CAR。在某些实施方案中，例如，当衔接化合物的第一靶向部分是FITC抗体时，CAR的识别区是抗FITC抗体的scFv区。
在至少一个实施方案中，CAR的识别区以高亲和力(例如在亚纳摩尔范围内)与第一靶向部分结合。因此，当施用时，CAR-T细胞将与衔接化合物(或其药学上可接受的盐)的靶向部分结合，并且CAR-T细胞反应可以仅靶向那些表达“桥梁”的小分子配体部分的受体的癌细胞，从而减少对正常组织的脱靶毒性。事实上，小分子配体可以以特异性将与其连接的任何CAR-T细胞定向到靶细胞。
至少一种衔接化合物(或其药学上可接受的盐)的使用提供了“通用性”，因为具有单一类型识别区的单一类型的CAR-T细胞可以与多种衔接化合物一起使用以消除多种肿瘤类型。说明性地，CAR-T细胞识别的每种衔接化合物的靶向部分可以保持不变，因此可以使用一种类型的CAR-T细胞构建体，而与癌症结合的小分子配体可以在衔接化合物之间改变以允许靶向多种癌症。例如并且不限于，可以将第一组和第二组衔接化合物施用于受试者，其中第一组包含与第一靶向部分连接的第一小分子配体，第二组包含与第一靶向部分连接的第二小分子配体。在这样的实施方案中，第一小分子配体对在第一类型的癌细胞上过表达的受体具有特异性(与这种受体在健康组织或不同类型的癌细胞(统称为“非靶向细胞”)上的基线表达相比)，第二小分子配体对在第二类型的癌细胞上过表达的受体具有特异性(与这种受体在非靶向细胞上的基线表达相比)。虽然两组衔接化合物(或其药学上可接受的盐)都与相同的靶向部分(即，第一靶向部分)连接，使得CAR被定向与其结合，但是应当理解，不同的小分子配体靶向并且可用于治疗不同的癌细胞类型。因此，衔接化合物使CAR-T细胞成为“通用的”CAR-T细胞，用于杀死表达不同抗原的肿瘤，因为衔接化合物中的不同小分子配体与不同的肿瘤类型结合，但只需要使用具有一种类型的识别区的一种类型的CAR-T细胞。
在某些实施方案中，通过第一接头(即，“桥梁”或衔接化合物)与第一靶向部分连接的小分子配体可以具有以下任何结构：
Figure BDA0003920193670000151
Figure BDA0003920193670000161
Figure BDA0003920193670000171
Figure BDA0003920193670000181
活性修饰化合物
传统CAR-T细胞疗法面临的一个常见问题是CAR-T细胞可能变得功能障碍或“耗竭”，从而在长期暴露于肿瘤微环境中的肿瘤抗原或免疫抑制因子(例如，骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、调节性T细胞(Treg)和抑制性细胞因子)时导致增殖减少。T细胞耗竭的定义是效应物功能差、抑制性受体持续表达以及与功能性效应物或记忆T细胞不同的转录状态。耗竭会阻止对肿瘤的最佳控制，减少T细胞耗竭可以改善临床反应。
相反，CAR-T细胞也可能变得过度活跃，从而导致常规CAR-T细胞疗法的不想要的副作用，例如细胞因子释放综合征(CRS)和其他毒性，这对患者来说可能是致命的。这些情况可能是由高水平的CAR-T细胞扩增和免疫激活引起的，这最终导致正常细胞和肿瘤细胞的裂解以及多种细胞因子如干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的释放。这些信号的组合还触发了单核细胞和巨噬细胞的激活，具有增强的杀肿瘤能力，并分泌高水平的促炎细胞因子(例如，白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1(IL-1)和白细胞介素10(IL-10))和其他介质，如诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，所有这些都可以促进CRS和其他相关毒性的进展。
为了解决CAR-T细胞疗法的不想要的副作用，本文的某些化合物和组合物包含活性修饰化合物或其药学上可接受的盐，用于在与CAR-T细胞联合施用时靶向和修饰CAR-T细胞的活性。例如，活性修饰化合物包括用于使CAR-T细胞再生的再生化合物、用于降低CAR-T细胞活性的免疫抑制化合物或前述任一种的药学上可接受的盐。
此外，可以修饰CAR-T细胞的CAR的识别区(例如，scFv片段)，以利用内吞作用并促进活性修饰化合物内化到CAR-T细胞中。在一个实施方案中，免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐可以以这种方式内化到CAR-T细胞中，使得免疫抑制化合物浓缩在CAR-T细胞中，结果，CAR-T细胞活化减少，从而控制过度CAR-T细胞活化的不良副作用，例如CRS。以这种方式，免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐可以与CAR-T细胞组合物一起使用以靶向CAR-T细胞并且可以降低CAR-T细胞活化。
类似地，再生化合物或其药学上可接受的盐可以通过CAR的识别区内化到CAR-T细胞中。通过在CAR-T细胞内浓缩再生化合物(或者，如果适用，其活性组分)，耗竭或功能障碍的CAR-T细胞可以再生为功能性和肿瘤杀伤性CAR-T细胞，从而重新根除肿瘤。因此，再生化合物或其药学上可接受的盐可以与CAR-T细胞组合物一起使用以靶向CAR-T细胞并且可以逆转由肿瘤微环境诱导的CAR-T细胞的耗竭或功能障碍。
活性修饰化合物(或其药学上可接受的盐)可以与第二靶向部分连接，并且CAR-T细胞的CAR的识别区的至少一部分定向到第二靶向部分。下文描述了可用靶向部分的各种实施方案，并且这些实施方案中的任何一个都可以与活性修饰化合物的第二靶向部分一起使用。因此，CAR-T细胞可以以高亲和力结合与活性修饰化合物的第二靶向部分结合。
在至少一个实施方案中，活性修饰化合物通过第二接头与第二靶向部分连接。衔接化合物中的第一接头和活性修饰化合物中的第二接头可以具有相同的结构或不同的结构。在一个实施方案中，活性修饰化合物或其药学上可接受的盐中的第二接头可以是可释放的接头或不可释放的接头，并且衔接化合物或其药学上可接受的盐中的第一接头可以是不可释放的接头。下文描述了可用接头的各种实施方案，并且这些实施方案中的任何一个都可以与活性修饰化合物的第二接头一起使用。
再生化合物
“使CAR-T细胞再生”是指激活CAR-T细胞、增加CAR-T细胞的增殖、阻断耗竭或功能障碍的CAR-T细胞的抑制性信号传导、通过抗原非依赖性途径重新激活CAR-T细胞或以其他方式增加CAR-T细胞的功能。当活性修饰化合物包含再生化合物(或其药学上可接受的盐)时，本发明化合物的实施方案可特别用于防止或逆转由肿瘤微环境诱导的T细胞耗竭或功能障碍、增殖减少等状况。
再生化合物或其药学上可接受的盐可以包含可以使T细胞再生的任何药物或其他化合物，例如Toll样受体(TLR)激动剂(例如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR7/8、TLR9等的激动剂)、干扰素基因刺激因子(STING)激动剂、Nod样受体(NLR)刺激剂、黑色素瘤2(AIM2)样受体(ALR)激动剂缺乏、靶向激酶如GSK-3β、PI3K等的激酶抑制剂和/或磷酸酶抑制剂。
在某些实施方案中，再生化合物或其药学上可接受的盐包含视黄酸诱导基因-I(RIG-I)样受体(RLR)、晚期糖基化终产物受体(RAGE)或任何其他位于细胞的核内体或细胞质中的模式识别受体。
如本文所用，“模式识别受体”是指在白细胞的膜上表达并能够结合激活受体并最终导致先天免疫反应的特异性配体的任何免疫受体。此外，TLR是一类在先天免疫系统中起关键作用的蛋白质，是模式识别受体的一个实例。TLR通常是单一的跨膜受体，其识别源自微生物的结构保守分子，并通常在包括树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、适应性免疫细胞(即T淋巴细胞和B淋巴细胞)和非免疫细胞(上皮细胞和内皮细胞以及成纤维细胞)在内的白细胞的膜上表达。
在至少一个实施方案中，再生化合物或其药学上可接受的盐具有下式之一的结构：
Figure BDA0003920193670000201
在一些实施方案中，再生化合物或其药学上可接受的盐具有下式之一的结构：
Figure BDA0003920193670000202
Figure BDA0003920193670000211
其中n＝0至200，和
Figure BDA0003920193670000212
其中n＝0至50。
免疫抑制化合物
在另一个实施方案中，活性修饰化合物包括免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐，其可以靶向并降低CAR-T细胞的活性。CAR-T细胞的“降低活性”是指抑制CAR-T细胞的任何活性、杀死CAR-T细胞、减少CAR-T细胞的数量或者阻止或减少CAR-T细胞的增殖。这样的组合物可用于治疗或防止CRS或其他毒性。
免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐可以包括能够降低T细胞活性的任何药物或其他化合物，例如他克莫司、西罗莫司、环孢菌素和/或其他免疫抑制化合物。
药学上可接受的盐
考虑了与第一靶向部分(即衔接化合物)连接的小分子配体或与第二靶向部分连接的活性修饰化合物(即再生化合物或免疫抑制化合物)的“药学上可接受的盐”。术语“药学上可接受的盐”是指其抗衡离子可用于药物的那些盐。在各种实施方案中，此类盐包括但不限于1)酸加成盐，其可以通过母体化合物的游离碱与无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、硫酸和高氯酸等反应获得，或与有机酸如乙酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、马来酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸等反应获得；或2)当存在于母体化合物中的酸质子被金属离子如碱金属离子、碱土离子或铝离子取代时形成的盐；或与有机碱如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三甲胺、N-甲基葡糖胺等配位。药学上可接受的盐是本领域技术人员熟知的，并且结合本文所述的实施方案考虑任何这样的药学上可接受的盐。
在各种实施方案中，合适的酸加成盐由形成无毒盐的酸形成。说明性实例包括乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐(camsylate)、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、海苯酸盐(hibenzate)、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘酸盐(naphthylate)、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、糖酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。
在各种实施方案中，合适的碱盐由形成无毒盐的碱形成。说明性实例包括精氨酸盐、苄星青霉素(benzathine)盐、钙盐、胆碱盐、二乙胺盐、二乙醇胺盐、甘氨酸盐、赖氨酸盐、镁盐、葡甲胺盐、乙醇胺盐、钾盐、钠盐、氨丁三醇盐和锌盐。也可以形成酸和碱的半盐，例如半硫酸盐和半钙盐。
靶向部分
第一或第二靶向部分的同一性仅限于各自应被CAR识别和结合，优选具有特异性，具有相对低的分子量，并以高亲和力(例如并且不限于，在亚纳摩尔范围内)与CAR结合。
在各种实施方案中，衔接化合物中的第一靶向部分和活性修饰化合物中的第二靶向部分具有相同的结构。在其他实施方案中，第一靶向部分和第二靶向部分具有不同的结构。
与CAR-T细胞表达的CAR结合的所述一种或多种衔接化合物(或其药学上可接受的盐)的第一靶向部分和活性修饰化合物中的第二靶向部分的实例可以包括例如DNP、TNP、生物素、地高辛、荧光素、FITC、NHS-荧光素、五氟苯基酯、四氟苯基酯、knottin、centyrin、DARPin、亲和体(affibody)、affilin、anticalin、atrimer、avimer、双环肽、FN3支架、cys-knot、fynomer、Kunitz结构域或Obody。在各个方面，示例性的第一或第二靶向部分是半抗原，包括小分子量有机分子。
本文的第一和第二靶向部分可以具有相同或不同的结构。在活性修饰化合物包含再生化合物的至少一个实施方案中，所述一种或多种衔接化合物(或其药学上可接受的盐)中的第一靶向部分和活性修饰化合物中的第二靶向部分具有相同的结构。在活性修饰化合物包含免疫抑制化合物的另一个实施方案中，所述一种或多种衔接化合物(或其药学上可接受的盐)中的第一靶向部分和活性修饰化合物中的第二靶向部分具有相同的结构。
在至少一个说明性实施方案中，第一和/或第二靶向部分可以具有以下说明性结构：
Figure BDA0003920193670000221
其中：
X是氧、氮或硫，其中X连接到接头L；
Y是ORa、NRa 2或NRa 3 +；Y’是O、NRa或NRa 2 +；
每个R在每种情况下独立地选自H、氟、磺酸、磺酸酯/盐及其盐等；和
Ra是氢或烷基。
接头
如上所述，衔接化合物和活性修饰化合物都可以分别具有第一接头和第二接头。第一和第二接头可以具有相同或不同的结构。
术语“接头”包括在生物功能上适于与衔接化合物或活性修饰化合物(各自为“活性化合物”)的小分子配体和/或靶向部分(例如，第一或第二靶向部分)形成化学键并连接分子的两个或更多个部分以形成化合物的原子链。说明性地，原子链可以选自碳(C)、氮(N)、氧(O)、硫(S)、硅(Si)和磷(P)，或C、N、O、S，和P、C、N、O和S。原子链可以共价连接不同的功能能力，例如小分子配体和靶向部分。接头(例如，第一或第二接头)可以包含多种连接，例如在连续主链中约2个至约2,000个原子的范围内，并可包含可释放或不可释放的接头。
在接头的上下文中，术语“可释放的”是指包含至少一个在生理条件下例如通过还原剂不稳定、pH不稳定、酸不稳定、碱不稳定、氧化不稳定、代谢不稳定、生化不稳定、酶不稳定或基于对氨基苄基的多价可释放键可以断裂(例如，化学或酶水解)的键的接头。应当理解，导致键断裂的生理条件不一定包括生物或代谢过程，而是可以包括标准化学反应，例如水解反应，例如在生理pH下或作为分区成细胞器(例如核内体)的结果，具有比细胞溶质pH低的pH。如本文所述，可裂解键可以连接可释放接头内的两个相邻原子和/或连接其他接头部分或靶向部分和/或活性组分，例如，在可释放接头的任一端或两端。在一些情况下，可释放接头断裂成两个或更多个片段。在一些情况下，可释放接头与靶向部分分离。
相反，在接头的上下文中，术语“不可释放的”是指包含至少一个在生理条件下不易或不快速断裂的键的接头。在一些实施方案中，不可释放的接头包含在生理条件下稳定的主链(例如，主链对水解(例如，水水解或酶促水解)不敏感)。在一些实施方案中，本文提供的包含不可释放接头的活性修饰化合物或衔接化合物不从靶向部分释放。在一些实施方案中，不可释放的接头在主链中缺少二硫键(例如，S-S)或酯。在一些实施方案中，化合物包含靶向部分和通过主链连接的活性组分，所述主链在化合物循环的整个持续时间内基本稳定。不可释放的接头可以包括：酰胺、酯、醚、胺和/或硫醚(例如，硫代马来酰亚胺)。尽管本文提供了具体实例，但应理解，任何分子都可用于不可释放的接头中，前提是形成至少一个在生理条件下不易或不快速断裂的键。
可释放和不可释放的接头都可以根据本领域公知的或下文开发的方法学(例如通过PEG化等)被工程化以优化生物分布、生物利用度和PK/PD(例如，相应化合物的)和/或增加摄取(例如，相应化合物的)到靶向细胞中。
每种衔接化合物(或其药学上可接受的盐)中的第一接头或活性修饰化合物(或其药学上可接受的盐)中的第二接头可以包含C1-C20烷基、聚乙二醇(PEG)、聚脯氨酸、低聚(4-哌啶)羧酸、低聚哌啶、肽、糖-肽、亲水性氨基酸、糖、非天然肽聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、pluronic F-127或其组合。在另一个实施方案中，接头不包含肽表位。此外，接头可以进一步包含小分子配体和第一靶向部分之间的化学部分。
在本文的某些实施方案中，衔接化合物(或其药学上可接受的盐)的第一接头(L)和/或活性修饰化合物(或其药学上可接受的盐)的第二接头包含具有下式的结构：
Figure BDA0003920193670000241
其中n是0到200的整数。在另一个实施方案中，n可以是0到150、0到110、0到100、0到90、0到80、0到70、0到60、0到50、0到40、0到30、0到20、0到15、0到14、0到13、0到12、0到11、0到10、0到9、0到8、0到7、0到6、0到5、0到4、0到3、0到2、0到1、15到16、15到17、15到18、15到19、15到20、15到21、15到22、15到23、15到24、15到25、15到26、15到27、15到28、15到29、15到30、15到31、15到32、15到33、15到34、15到35、15到36、15到37、15到38、15到39、15到40、15到50、15到60、15到70、15到80、15到90、15到100、15到110、15到120、15到130、15到140、15到150，或者n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100、108、110、120、130、140或150。
衔接化合物或其药学上可接受的盐中的第一接头和/或活性修饰化合物或其药学上可接受的盐中的第二接头可以是直接连接(例如，FITC的异硫氰酸酯基团和衔接化合物的小分子配体的游离胺基团之间的反应)，或者所述连接可以通过中间接头。在一个实施方案中，如果存在，中间接头可以是本领域已知的任何生物相容性接头，例如二价接头。在一个说明性实施方案中，二价接头可以包含约1个至约30个碳原子。在另一个说明性实施方案中，二价接头可以包含约2个至约20个碳原子。在其他实施方案中，使用较低分子量的二价接头(即，具有约30道尔顿至约300道尔顿的近似分子量的二价接头)。在另一个实施方案中，合适的接头长度包括但不限于具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个或更多个原子的接头。
在另一个实施方案中，第一或第二接头可以是可以包括一个或多个接头的二价接头。说明性接头显示在下表中，其中*表示与衔接化合物的小分子配体、衔接化合物的第一靶向部分、活性修饰化合物的第二靶向部分、再生化合物、免疫抑制化合物或其他二价第一或第二接头部分的连接点。
表1.接头结构式
Figure BDA0003920193670000242
Figure BDA0003920193670000251
在另一个实施方案中，衔接化合物或其药学上可接受的盐中的第一接头或活性修饰化合物(再生化合物或免疫抑制化合物)或其药学上可接受的盐中的第二接头可以各自包含具有选自下式的结构的接头部分：
Figure BDA0003920193670000261
Figure BDA0003920193670000271
其中n是0到200的整数。
可以通过本领域技术人员实施的常规有机合成方法制备化合物(例如，衔接化合物、活性修饰化合物及其药用盐)。化合物的描述受到本领域技术人员已知的化学键合原理的限制。因此，当一个基团可以被多个取代基中的一个或多个取代时，选择这样的取代以符合化学键合的原理并得到本质上不是不稳定的和/或本领域普通技术人员已知在环境条件(例如水性、中性和几种已知的生理条件)下可能不稳定的化合物。例如，根据本领域技术人员已知的化学键合原理，杂环烷基或杂芳基通过环杂原子连接到分子的其余部分，从而避免固有的不稳定化合物。
在某些实施方案中，衔接化合物、活性修饰化合物和/或前述任一种的药学上可接受的盐可以包含一个或多个手性中心，或者可以作为多种立体异构体存在。因此，各种实施方案包括纯立体异构体以及立体异构体的混合物，例如对映异构体、非对映异构体和富含对映异构体或非对映异构体的混合物。
此外，在至少一个实施方案中，衔接化合物、活性修饰化合物和/或前述任一种的药学上可接受的盐可以作为几何异构体存在。因此，各种实施方案可以包括化合物的纯几何异构体或几何异构体的混合物。
衔接化合物、活性修饰化合物和/或前述任一种的药学上可接受的盐也可以以非溶剂化形式以及溶剂化形式(包括水合形式)存在。通常，溶剂化形式等同于非溶剂化形式并且包含在本公开的范围内。
CAR-T细胞组合物
所述组合物和方法可以包括工程化的CAR-T细胞组合物。在至少一个实施方案中，T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞)被工程化以表达识别并结合到桥梁(即，衔接化合物或其药学上可接受的盐)的第一靶向部分(例如，FITC、DNP或TNP)或活性修饰化合物的第二靶向部分的CAR。
在至少一个实施方案中，CAR包含三个结构域，包括：1)识别区(例如，抗体的scFv区、Fab片段等)，其以特异性识别并结合到第一或第二靶向部分，2)共刺激结构域，其增强T淋巴细胞的增殖和存活，和3)激活信号传导结构域，其产生T淋巴细胞激活信号。
当CAR的识别区包含scFv区时，所述scFv区可以由以下制备：(i)本领域已知的结合第一或第二靶向部分的抗体，(ii)使用选择的第一或第二靶向部分(例如半抗原)新制备的抗体，和(iii)衍生自此类抗体的scFv区的序列变体，例如与衍生它们的scFv区的氨基酸序列具有至少约80％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性的scFv区。
关于提及多肽序列的“百分比(％)序列同一性”被定义为候选序列中与参考序列中的残基相同的氨基酸或核酸残基的百分比，如果需要，在比对序列和引入空位(gap)后，以实现最大百分比的序列同一性，并且不考虑将任何保守替换作为序列同一性的一部分。用于确定百分比序列同一性目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件。例如，可以确定序列之间的百分比同一性或相似性，例如，通过使用GAP程序(Genetics Computer Group，软件；现在可通过http://www.accelrys.com上的Accelrys获得)，并且可以使用例如ClustalW算法(VNTI软件，InforMax Inc.)完成比对。此外，可以使用目的核酸或氨基酸序列来搜索序列数据库。用于数据库搜索的算法通常基于BLAST软件(Altschul等人，1990)，但本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所要比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。在一些实施方案中，百分比同一性可以沿核酸或氨基酸序列的全长确定。
在某些实施方案中，CAR的共刺激结构域可用于在CAR与第一或第二靶向部分结合后增强细胞毒性T淋巴细胞的增殖和存活。合适的共刺激结构域包括但不限于CD28、CD137(4-1BB)、肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员、CD134(OX40)、受体的TNFR超家族的成员、CD27、CD30、CD150、10KDa的DNAX激活蛋白(DAP10)、NKG2D和CD278(ICOS)、在活化的T细胞上表达的CD28超家族共刺激分子或其组合。熟练的技术人员将理解，可以使用这些共刺激结构域的序列变体而不会对本发明产生不利影响，其中所述变体具有与它们所建模的结构域相同或相似的活性。在各种实施方案中，此类变体可具有与它们所源自的结构域的氨基酸序列至少约80％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性。
在说明性的实施方案中，激活信号传导结构域用于在CAR与第一或第二靶向部分结合后激活T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞)。合适的激活信号传导结构域包括但不限于T细胞CD3ζ链、CD3δ受体蛋白、mbl受体蛋白、B29受体蛋白和Fc受体γ。熟练的技术人员将理解，这些激活信号传导结构域的序列变体可以在所述变体具有与它们所建模的结构域相同或相似的活性的情况下使用。在各种实施方案中，变体具有与它们所源自的结构域的氨基酸序列至少约80％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性。
可以使用基因工程技术制备编码CAR的构建体。Sambrook等人，“MolecularCloning:A Laboratory Manual”，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,(2001)以及Green和Sambrook，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第4版，ColdSpring Harbor Laboratory Press,(2012)中详细描述了此类技术，两者均通过引用的方式整体并入本文(统称为“方案”)。
作为非限制性实例，可以制备质粒或病毒表达载体(例如，慢病毒载体、逆转录病毒载体、睡美人(sleeping beauty)和piggyback(包括非病毒介导的CAR基因递送系统的转座子/转座酶系统))，其编码融合蛋白，该融合蛋白包含识别区、一个或多个共刺激结构域和激活信号传导结构域，在框内并以5’至3’方向连接。
其他构造也是可接受的并且包括识别区、激活信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。
术语“载体”是指具有携带、容纳或表达目的核酸的功能的任何核酸。核酸载体可以具有专门的功能，例如表达、包装、假型包装(pseudotyping)或转导。如果适合用作克隆或穿梭载体，载体也可以具有操纵功能。载体的结构可以包括任何可制造且适合特定用途的所需形式。这样的形式可以包括例如环状形式，例如质粒和噬菌粒，以及线性或分支形式。核酸载体可以由例如DNA或RNA组成，以及部分或全部包含核苷酸衍生物、类似物或模拟物。此类载体可以从天然来源获得、重组产生或化学合成。
融合蛋白中识别区的放置通常使得实现该区域在细胞外部的展示。如果需要，CAR还可以包括另外的元件，例如，信号肽(例如，CD8α信号肽)以确保融合蛋白正确输出到细胞表面，跨膜结构域(例如，CD8α跨膜结构域、CD28跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域)以确保融合蛋白保持为完整的膜蛋白，和赋予识别区灵活性并允许与靶向部分强结合的铰链结构域(例如，CD8α铰链)。
示例性CAR的示意图显示在图1中，其中融合蛋白序列被整合到慢病毒表达载体中，并且其中“SP”是信号肽，CAR是抗FITC CAR，并且存在CD8α铰链和CD8α跨膜结构域，共刺激结构域是4-1BB，激活信号传导结构域是CD3ζ。CAR插入物的示例性核酸序列作为SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:3提供，编码的氨基酸序列作为SEQ ID NO:2提供。在又一个实施方案中，SEQ ID NO:2可以包含人源化氨基酸序列或人类氨基酸序列，或由人源化氨基酸序列或人类氨基酸序列组成。
在至少一个实施方案中，CAR具有包含抗FITC抗体的scFv区的识别区、共刺激结构域和激活信号传导结构域，并且所述共刺激结构域是CD137(4-1BB)，所述激活信号传导结构域是T细胞CD3ζ链。本领域技术人员熟知抗FITC scFv和抗荧光素scFv是等同术语。
T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞)可以通过用编码CAR构建体的表达载体转染T淋巴细胞群来进行基因工程化以表达CAR构建体。用于制备表达所选CAR构建体的转导的T淋巴细胞群的合适方法是本领域技术人员熟知的并且至少在方案中进行了描述。
在至少一个实施方案中，使用包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核酸的CAR-T细胞。在另一个实施方案中，使用包含SEQ ID NO:2的多肽的CAR-T细胞。在另一方面，使用包含SEQ ID NO:1或3的慢病毒载体。在又一个实施方案中，SEQ ID NO:2可以包含人源化氨基酸序列或人类氨基酸序列，或由人源化氨基酸序列或人类氨基酸序列组成。
在这些实施方案的每一个中，可以使用与SEQ ID NO:1-3具有至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性的变体核酸序列或氨基酸序列。在另一个实施方案中，核酸序列可以是与SEQ ID NO:1或SEQID NO:2具有至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性的变体氨基酸序列，只要变体序列编码SEQ ID NO:2的多肽。在另一个实施方案中，核酸序列或氨基酸序列可以是沿着一段200个核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或者沿着一段200个氨基酸与SEQ ID NO:2具有至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的序列同一性的变体核酸或氨基酸序列。
在一个实施方案中，本文所述方法中使用的T淋巴细胞(例如，用于制备CAR-T细胞的细胞毒性T淋巴细胞)可以是自体细胞，尽管也可以使用异源细胞，例如当被治疗的患者已接受大剂量化疗或放疗以破坏患者的免疫系统。在一个实施方案中，可以使用同种异体细胞。
T淋巴细胞可以通过本领域熟知的方式从受试者获得。例如，可以通过从受试者收集外周血、将血液进行Ficoll密度梯度离心然后使用阴性T细胞分离试剂盒(例如EasySepTMT细胞分离试剂盒)从外周血中分离出T细胞群来获得T细胞(例如，细胞毒性T细胞)。
在某些实施方案中，T淋巴细胞(例如，细胞毒性T细胞)群不需要是纯的并且可以包含其他细胞，例如其他类型的T细胞(例如，在细胞毒性T细胞的情况下)、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和B细胞。此外，在至少一个实施方案中，被收集的群体可以包含至少约90％的所选细胞类型，至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的所选细胞类型。
通常，在获得T淋巴细胞之后，在促进细胞活化的条件下培养细胞。在至少一个实施方案中，培养条件为使得可以将细胞施用于受试者而不用担心与培养基组分的反应性。例如，培养条件可能不包括牛血清产品，例如牛血清白蛋白。在一方面，可以通过将已知的活化剂引入培养基中来实现活化，例如在细胞毒性T细胞的情况下是抗CD3抗体。其他合适的活化剂通常是已知的并且包括例如抗CD28抗体。例如，淋巴细胞群可以在促进活化的条件下培养约1天至约4天。适当的活化水平可以通过由流式细胞术确定的细胞大小、增殖率或活化标志物来确定。
在至少一个实施方案中，在促进活化的条件下培养T淋巴细胞群后，用编码CAR的表达载体转染细胞。上文描述了用于各种实施方案的合适载体和转染方法。转染后，可以立即将细胞施用于患者，或者可以将细胞培养一段时间以使细胞有时间从转染中恢复，例如至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18天或更多天，或约5天至约12天、约6天至约13天、约7天至约14天或约8天至约15天。在一方面，合适的培养条件可以类似于培养细胞以进行活化的条件，其中有或没有用于促进活化的试剂。
因此，如上所述，本文所述的治疗方法可以进一步包括：1)获得自体或异源T淋巴细胞(例如，用于制备CAR-T细胞的细胞毒性T淋巴细胞)群，2)在促进细胞活化的条件下培养T淋巴细胞，以及3)用编码CAR的表达载体转染淋巴细胞以形成CAR-T细胞。
当细胞已被转染和活化时，可以制备包含CAR-T细胞的组合物并将其施用于受试者。在至少一个实施方案中，缺乏任何动物产品如牛血清的培养基可用于培养CAR-T细胞。在另一个实施方案中，可以使用本领域技术人员通常用来避免细菌、真菌和支原体污染的组织培养条件。在某些实施方案中，在施用于患者之前，将细胞(例如，CAR-T细胞)沉淀、洗涤并重悬于药学上可接受的载体或稀释剂中。
包含表达CAR的T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞)的示例性组合物包括在无菌290mOsm盐水中、在可输液低温介质(infusible cryomedia)(含有血浆-Lyte A、葡聚糖、氯化钠注射液、人血清白蛋白和DMSO)中、在含有2％人血清白蛋白的0.9％NaCl中或在任何其他无菌290mOsm可输液物质中包含细胞的组合物。替代地，在另一个实施方案中，取决于培养基的特性，CAR-T细胞可以作为组合物在培养基中施用，或在施用前浓缩并重悬于培养基中。在各种实施方案中，CAR-T细胞组合物可以通过任何合适的方式施用于受试者，例如肠胃外施用，例如皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内或鞘内。
在一方面，施用于患者的组合物中的CAR-T细胞总数和细胞浓度将取决于许多因素而变化，所述因素包括所使用的T淋巴细胞的类型(例如，细胞毒性T淋巴细胞)，CAR的结合特异性，第一或第二或第三靶向部分和小分子配体、再生化合物或免疫抑制化合物的特性，癌症的特性，癌症在患者中的位置，用于将组合物施用于患者的方式，以及被治疗的患者的健康状况、年龄和体重。在各种实施方案中，包含转导的CAR-T细胞的合适组合物包括具有约0.1ml至约200ml和约0.1ml至约125ml体积的那些。
载体组合物
所述组合物和方法的某些实施方案可以包括载体组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含载体，所述载体包含与编码本文所述的CAR构建体的核酸序列(例如但不限于SEQ ID NO:1或3)可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，载体组合物包含携带编码本文所述的CAR的核酸序列的慢病毒颗粒。在一些实施方案中，载体组合物包含治疗有效量的此类慢病毒颗粒。
慢病毒是可以使用的载体系统的非限制性实例。慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因Gag、Pol和Env之外，还包含其他具有调节或结构功能的基因。更高的复杂性使病毒能够调节其生命周期，就像在潜伏性感染过程中一样。慢病毒的一些实例包括人类免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)和猿免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒载体是通过多重减弱HIV毒力基因产生的，例如基因Env、Vif、Vpr、Vpu和Nef被删除，使载体在生物学上是安全的。
慢病毒载体为基因治疗提供了许多优势。除非被设计成非整合的，否则慢病毒载体会稳定地整合到靶细胞的染色体中，从而允许递送的转基因长期表达。此外，它们不转移病毒基因，因此避免了产生可被细胞毒性T细胞破坏的转导细胞的问题。此外，它们具有相对较大的克隆能力，足以满足大多数设想的临床应用。在逆转录病毒中，慢病毒具有将其基因组整合到非分裂细胞的染色质中的独特能力。这在组织的基因治疗的背景下尤其重要，例如，在造血系统、大脑、肝脏、肺和肌肉中。例如，源自HIV-1的载体允许转基因在神经元、肝细胞和肌细胞等细胞中的有效体内和离体递送、整合和稳定表达(Blomer等人，1997；Kafri等人，1997；Naldini等人，1996；Naldini等人，1998)。
慢病毒载体是本领域已知的。例如，参见Naldini等人(1996)Science 272:263-267；Zufferey等人(1998)J.Virol.72:9873-9880；Dull等人(1998)J.Virol.72:8463-8471；美国专利号6,013,516；美国专利号5,994,136。通常，这些载体被设置为携带必需序列，用于选择含有该载体的细胞，用于将外源核酸掺入慢病毒颗粒中，以及用于将核酸转移到靶细胞中。
常用的慢病毒载体系统是所谓的第三代系统。第三代慢病毒载体系统可以包括四种质粒。“转移质粒”编码由慢病毒载体系统递送至靶细胞的多核苷酸序列。转移质粒通常具有一个或多个目的转基因序列，其两侧是长末端重复(LTR)序列，这有助于将转移质粒序列整合到宿主基因组中。出于安全原因，通常设计转移质粒以使所得载体无法复制。例如，转移质粒缺乏在宿主细胞中产生感染性颗粒所必需的基因元件。此外，转移质粒可以被设计为删除3’LTF，使病毒“自我失活”(SIN)。参见Dull等人(1998)J.Virol.72:8463-8471；Miyoshi等人(1998)J.Virol.72:8150-8157。
第三代系统通常还包括两个“包装质粒”和一个“包膜质粒”。“包膜质粒”通常编码与启动子可操作地连接的Env基因。在第三代系统的至少一个实施方案中，Env基因是VSV-G并且启动子是CMV启动子。第三代系统使用两种包装质粒，一种编码Gag和Pol，另一种编码Rev作为进一步的安全特性——对所谓的第二代系统的单一包装质粒的改进。虽然更安全，但第三代系统使用起来更麻烦，并且由于添加了另外的质粒，导致病毒滴度更低。示例性包装质粒包括但不限于pMD2.G、pRSV-rev、pMDLG-pRRE和pRRL-GOI。
在一些情况下，慢病毒载体系统依赖于“包装细胞系”的使用。通常，包装细胞系是当将转移质粒、包装质粒和包膜质粒引入细胞时其细胞能够产生感染性慢病毒颗粒的细胞系。可以使用将质粒引入细胞的各种方法，包括转染或电穿孔。在一些情况下，包装细胞系适用于将慢病毒载体系统高效包装成慢病毒颗粒。
如本文所用，术语“慢病毒载体”是指编码基因组包装所需的慢病毒顺式核酸序列的核酸。慢病毒载体还可以编码有利于基因递送的其他顺式核酸序列，包括例如逆转录、前病毒整合或基因组转录所需的顺式序列。慢病毒载体执行慢病毒载体的转导功能。因此，载体基因组的确切组成将取决于希望引入靶细胞的遗传物质。因此，载体基因组可以编码，例如，除了包装、逆转录、整合或转录所需的多肽或功能之外的其他多肽或功能。此类功能通常包括编码目的核酸表达所需的顺式元件。慢病毒顺式序列或元件可以来源于慢病毒基因组或其他病毒或载体基因组，只要慢病毒载体基因组可以通过包装细胞系包装成慢病毒颗粒并引入靶细胞。在一些实施方案中，慢病毒载体的靶细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，靶免疫细胞是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，靶免疫细胞存在于肿瘤微环境中。
产生的慢病毒颗粒通常包括RNA基因组(例如，源自转移质粒)、Env蛋白嵌入其中的脂质双层包膜和包括整合酶、蛋白酶和基质蛋白在内的其他辅助蛋白。如本文所用，术语“慢病毒颗粒”是指包括包膜、具有慢病毒的一种或多种特征并且能够侵入靶宿主细胞(例如，T细胞或NK细胞)的病毒颗粒。这样的特征可以包括，例如，感染非分裂宿主细胞，转导非分裂宿主细胞，感染或转导宿主免疫细胞，包含包括gag结构多肽p7、p24和p17中的一种或多种的慢病毒病毒体，包含包括env编码的糖蛋白p41、p120和p160中的一种或多种的慢病毒包膜，包含包括一种或多种在复制、前病毒整合或转录中起作用的慢病毒顺式作用序列的基因组，包含编码慢病毒蛋白酶、逆转录酶或整合酶的基因组，或包含编码调节活性如Tat或Rev的基因组。慢病毒载体和慢病毒颗粒的详细描述在国际公开号WO 2019/200056中提供，该专利通过引用的方式整体并入本文。
慢病毒载体可用于编码T细胞活化受体。“T细胞活化受体”是指一种或多种跨膜蛋白，其被设置为在转导细胞的细胞表面上表达，使得T细胞活化受体向转导细胞提供促有丝分裂信号。使用T细胞活化受体是因为靶细胞在大多数情况下是T细胞。通过使用在另一种细胞类型中保留活性的活化受体，本发明的方法可以适用于与其他细胞类型一起使用。本文有用的T细胞活化受体可以包括信号传导结构域，其是细胞因子受体信号传导结构域、共刺激受体信号传导结构域、T细胞受体亚基信号传导结构域、生长因子受体信号传导结构域等(例如，如前结合CAR组合物进行描述)。
在一些情况下，提供一种将转导细胞靶向特定细胞或组织的方法可能是有利的。因此，慢病毒载体可以包含(代替其他基因或除了其他基因之外)编码本文所述的CAR的多核苷酸(例如，定向到第一和/或第二靶向部分的那些，并且例如诱导性地使与之连接的小分子配体或化合物二聚化)。
如已知的，慢病毒载体可以进一步包含对T细胞特异性的启动子和/或增强子。在一些情况下，启动子可用于控制T细胞活化受体的表达。此外，慢病毒载体可以包括融合糖蛋白(例如，用于假型包装目的)。参见，例如，Joglekar等人(2017)Human Gene TherapyMethods 28:291-301。在某些实施方案中，假型包装融合糖蛋白或其功能变体有助于靶向特定细胞类型(包括但不限于T细胞)的转导。
在某些实施方案中，其载体可以包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wPRE)或与wPRE基本相同的核酸序列。参见美国专利号6,136,597；Lee等人(2005)Exp Physiol.90:33-37。具有减小尺寸的wPRE元件的变体在本领域中是已知的。wPRE-O是指中等尺寸的wPRE变体。在一些实施方案中，wPRE序列增加由此类病毒载体递送的基因的表达。
在一些情况下，慢病毒载体可以包含编码2A肽的多核苷酸序列。术语“2A肽”是指被设置为从单个开放阅读框产生两种或更多种蛋白质的自切割肽。2A肽是18-22个残基长的病毒寡肽，其在真核细胞翻译过程中介导多肽的“切割”。“2A肽”可以指具有多种氨基酸序列的肽。Szymczak-Workman等人(2012)Cold Spring Harb.Protoc.2012:199-204提供了设计和使用2A肽的详细方法学。
在一些实施方案中，将载体组合物直接施用于受试者。在一些实施方案中，载体组合物与T细胞联合施用。在一些实施方案中，单独施用载体组合物和T细胞。在一些实施方案中，通过施用的载体组合物在体内激活和转导T细胞。
用于治疗癌症的组合、组合物和方法
还提供了用于治疗癌症的组合和组合物。如本文所用，术语“组合”通常是指包含多于一种成分的任何产品，包括一种或多种本文所述的化合物(例如，衔接化合物、活性修饰化合物(例如，再生化合物或免疫抑制化合物)或前述的药学上可接受的盐)。应当理解，本文所述的组合物可以由分离的化合物或由盐、溶液、水合物、溶剂化物和其他形式的化合物制备。应当理解，某些官能团，例如羟基、氨基等基团，可以以化合物的各种物理形式与水和/或各种溶剂形成复合物。还应理解，在某些情况下，化合物(和包含该化合物的组合物)可以由化合物的各种无定形、非无定形、部分结晶、结晶和/或其他形态形式制备，并且所述组合物可以由化合物的各种水合物和/或溶剂化物制备。因此，列举本文所述化合物的药物组合物包括化合物的各种形态形式和/或溶剂化物或水合物形式中的每一种或任何组合或单独形式。
用于修饰患有癌症的受试者的T细胞活性和/或治疗癌症的组合包含一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐，还提供了活性改变化合物(例如，再生化合物、免疫抑制化合物或上述任一种的药学上可接受的盐)。这样的化合物可以是任何类似的化合物，并且在至少一个实施方案中，每种衔接化合物包含通过第一接头与第一靶向部分连接的小分子配体，并且活性修饰化合物包括通过第二接头与第二靶向部分连接的再生化合物或免疫抑制化合物。此外，在至少一个实施方案中，所述组合可以进一步包含一种组合物，该组合物包含表达CAR的CAR-T细胞或包含与编码CAR的核酸序列(例如，SEQ ID NO:1或3)可操作地连接的启动子的载体，其中CAR定向到第一靶向部分、第二靶向部分或第一和第二靶向部分两者。
在又一个实施方案中，提供了用于治疗癌症(例如，通过修饰受试者的T细胞活性)的组合。所述组合包含一种或多种本公开的化合物和组合物。
化合物和组合物可以以单位剂型和/或含有一种或多种药学上可接受的载体、佐剂、稀释剂、赋形剂和/或溶媒(vehicle)及其组合的组合物的形式施用。术语“施用”及其形成词通常是指将本文所述的化合物和组合物(例如，CAR-T细胞组合物、衔接化合物或其药学上可接受的盐和/或活性修饰化合物)引入受试者的细胞、组织、器官或生物体液中的任何和所有方式。
以盐的形式施用化合物和组合物可能是合适的。可接受的盐的实例包括但不限于碱金属(例如，钠、钾或锂)或碱土金属(例如，钙)盐；然而，当施用于被治疗的受试者时，通常无毒且有效的任何盐是可接受的。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，优选人，但它也可以是非人动物(包括但不限于实验动物、农业动物、家养动物或野生动物)。因此，本文所述的方法、化合物和组合物适用于人类和兽医疾病及应用。在各个方面，受试者可以是实验动物，例如啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠等)、兔子、猴子、黑猩猩；家养动物，例如狗、猫或兔子；农业动物，例如牛、马、猪、绵羊或山羊；或圈养的野生动物，例如熊、熊猫、狮子、老虎、豹、大象、斑马、长颈鹿、大猩猩、海豚或鲸鱼。在某些实施方案中，受试者是“患者”，即正在接受针对疾病或病症的医疗护理的活的人或动物，其包括正在评估病理体征的没有明确疾病的人或动物。在某些实施方案中，可以使用本文方法解决的受试者包括被鉴定或选择为患有癌症或有患癌症风险的受试者。这种鉴定和/或选择可以通过临床或诊断评估来进行。
可以将化合物和组合物配制成药物组合物和/或以适合所选择的施用途径的多种形式施用于受试者，例如人类患者。事实上，可以使用本领域已知的任何合适的方法向受试者施用衔接化合物或其药学上可接受的盐、或活性修饰化合物或其药学上可接受的盐、或CAR-T细胞组合物、或载体组合物(包括，例如，本文的慢病毒颗粒)。在一方面，可以以单位剂型和/或含有常规无毒药学上可接受的载体、佐剂和溶媒的制剂的形式施用本文所述的衔接化合物或其药学上可接受的盐、或再生化合物或其药学上可接受的盐、或免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐。
此外，本文所述的衔接化合物或其药学上可接受的盐、或再生化合物或其药学上可接受的盐、或免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐、或CAR-T细胞组合物、或载体组合物可以直接施用到血流中、肌肉中或内部器官中。在各种实施方案中，此类肠胃外施用的合适途径包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、硬膜外、脑室内、尿道内、胸骨内、颅内、肿瘤内、肌肉内和皮下递送。在一个实施方案中，用于肠胃外施用的方式包括针头(包括微针)注射器、无针注射器和输注技术。应当理解，本文的化合物和组合物也可以配制用于所需的施用方式。
例如，肠胃外制剂通常是水溶液并且可以包含载体或赋形剂，例如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选为3至9的pH)，但也可以在合适的情况下配制成无菌的非水溶液或作为干燥形式与合适的溶媒如无菌、无热原水或无菌盐水一起使用。在其他实施方案中，本文所述的任何液体制剂可适用于肠胃外施用。在无菌条件下通过冻干产生用于肠胃外制剂的无菌冻干粉剂的制备可以使用本领域技术人员熟知的标准制药技术容易地完成。在一个实施方案中，可以通过使用适当的制剂技术(例如加入溶解度增强剂)来增加肠胃外制剂制备中使用的衔接化合物或其药学上可接受的盐、或再生化合物或其药学上可接受的盐、或免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐、或活性修饰化合物或其药学上可接受的盐的溶解度。
适用于注射或输注的衔接化合物和/或活性修饰化合物的药物剂型可以包括无菌水溶液或分散体或无菌粉剂，其包含适用于无菌可注射或可输注溶液或分散体的临时制备的活性成分，任选封装在脂质体中。在所有情况下，最终剂型在制造和储存条件下都应该是无菌的、流动的和稳定的。液体载体或溶媒可以是溶剂或液体分散介质，包括例如但不限于水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体PEG等)、植物油、无毒甘油酯和/或其合适的混合物。在至少一个实施方案中，适当的流动性可以通过脂质体的形成、在分散体的情况下通过保持所需的粒度或通过使用表面活性剂来保持。通过添加各种抗细菌剂、抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，可以防止微生物的作用。在某些情况下，可能需要包括一种或多种等渗剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。可以通过掺入经配制以延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收。
可以通过将活性组分与一种或多种上述其他成分(根据需要)掺入所需量的适当溶剂中，然后通过过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上先前无菌过滤溶液中存在的任何其他所需成分的粉剂。
可以通过在动物模型中比较它们的体外活性和体内活性来确定化合物的有用剂量。将小鼠和其他动物中的有效剂量外推至人类受试者的方法是本领域已知的。事实上，化合物的剂量可以根据受试者的状况、所治疗的癌症类型、病理进展程度、化合物的施用途径和组织分布以及与其他治疗性治疗(例如放疗或联合疗法中的其他药物)共同使用的可能性而显著变化。用于治疗所需的组合物和/或化合物的量(例如，治疗或预防有效量或剂量)不仅随特定应用而变化，而且随所选盐(如果适用)和受试者的特征(例如，年龄、状况、性别、受试者的体表面积和/或质量、对药物的耐受性)而变化，最终将由主治医生、临床医生或其他人自行决定。“治疗有效量”或“预防有效量”定义为足以诱导对编码的异源抗原特异的所需免疫反应或在受试者中显示出益处(即，引起被治疗的病症的症状的减少、预防或治疗)的试剂或药物组合物的量。
在各种实施方案中，向受试者施用的转导的CAR-T细胞可以包含约1×105至约1×1015或1×106至约1×1015个转导的CAR-T细胞。在各种实施方案中，可以向受试者施用约1×105至约1×1010、约1×106至约1×1010、约1×106至约1×109、约1×106至约1×108、约1×106至约2×107、约1×106至约3×107、约1×106至约1.5×107、约1×106至约1×107、约1×106至约9×106、约1×106至约8×106、约1×106至约7×106、约1×106至约6×106、约1×106至约5×106、约1×106至约4×106、约1×106至约3×106、约1×106至约2×106、约2×106至约6×106、约2×106至约5×106、约3×106至约6×106、约4×106至约6×106、约4×106至约1×107、约1×106至约1×107、约1×106至约1.5×107、约1×106至约2×107、约0.2×106至约1×107、约0.2×106至约1.5×107、约0.2×106至约2×107或约5×106个CAR-T细胞。在一方面，在本文所述的任何实施方案中，可以向受试者施用单剂量或多剂量的CAR-T细胞。在本段所述的任何实施方案中，CAR-T细胞剂量可以是每千克受试者体重的CAR-T细胞数量。在本文所述的任何实施方案中，可以在衔接化合物或其药学上可接受的盐之前或之后施用CAR-T细胞。
在其他实施方案中，在CAR-T细胞组合物中向受试者施用的CAR-T细胞的剂量选自由约100万、约200万、约300万、约400万、约500万、约600万、约700万、约800万、约900万、约1000万、约1100万、约1200万、约1250万、约1300万、约1400万和约1500万CAR-T细胞组成的组。在这些实施方案中，CAR-T细胞剂量可以是每千克受试者体重的CAR-T细胞数量。
向受试者施用的一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐、或再生化合物或其药学上可接受的盐、或免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐、或活性修饰化合物或其药学上可接受的盐的量可以取决于被治疗的癌症、所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐或所述再生化合物或其药学上可接受的盐的施用途径以及组织分布而显著变化。向受试者施用的量可以基于体表面积、质量和医生评估。
在各种实施方案中，待施用的量可以在例如约0.05mg至约30mg、0.05mg至约25.0mg、约0.05mg至约20.0mg、约0.05mg至约15.0mg、约0.05mg至约10.0mg、约0.05mg至约9.0mg、约0.05mg至约8.0mg、约0.05mg至约7.0mg、约0.05mg至约6.0mg、约0.05mg至约5.0mg、约0.05mg约4.0mg、约0.05mg至约3.0mg、约0.05mg至约2.0mg、约0.05mg至约1.0mg、约0.05mg至约0.5mg、约0.05mg至约0.4mg、约0.05mg至约0.3mg、约0.05mg至约0.2mg、约0.05mg至约0.1mg、约0.01mg至约2mg、约0.3mg至约10mg、约0.1mg至约20mg、或约0.8mg至约3mg的范围内。本领域技术人员将容易理解，所述剂量可以基于上述因素在上述提供的各种范围内变化，并且可以由医生自行决定。
在其他实施方案中，一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐、或再生化合物或其药学上可接受的盐、或免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐、或活性修饰化合物或其药学上可接受的盐的剂量可以在例如约50nmoles/kg至约3,000nmoles/kg受试者体重、约50nmoles/kg至约2,800nmoles/kg、约50nmoles/kg至约2,600nmoles/kg、约50nmoles/kg至约2,400nmoles/kg、约50nmoles/kg至约2,200nmoles/kg、约50nmoles/kg至约2,100nmoles/kg、约50nmoles/kg至约2,000nmoles/kg、约50nmoles/kg至约1,000nmoles/kg、约50nmoles/kg至约900nmoles/kg、约50nmoles/kg至约800nmoles/kg、约50nmoles/kg至约700nmoles/kg、约50nmoles/kg至约600nmoles/kg、约50nmoles/kg至约500nmoles/kg、约50nmoles/kg至约400nmoles/kg、约50nmoles/kg至约300nmoles/kg、约50nmoles/kg至约200nmoles/kg、约50nmoles/kg至约100nmoles/kg、约100nmoles/kg至约300nmoles/kg、约100nmoles/kg至约500nmoles/kg、约100nmoles/kg至约1,000nmoles/kg、约100nmoles/kg至约2,000nmoles/kg受试者体重的范围内。在其他实施方案中，所述剂量可以是约1nmoles/kg、约5nmoles/kg、约10nmoles/kg、约20nmoles/kg、约25nmoles/kg、约30nmoles/kg、约40nmoles/kg、约50nmoles/kg、约60nmoles/kg、约70nmoles/kg、约80nmoles/kg、约90nmoles/kg、约100nmoles/kg、约150nmoles/kg、约200nmoles/kg、约250nmoles/kg、约300nmoles/kg、约350nmoles/kg、约400nmoles/kg、约450nmoles/kg、约500nmoles/kg、约600nmoles/kg、约700nmoles/kg、约800nmoles/kg、约900nmoles/kg、约1000nmoles/kg、约2,000nmoles/kg、约2,500nmoles/kg或约3,000nmoles/kg受试者体重。在其他实施方案中，所述剂量可以是约0.1nmoles/kg、约0.2nmoles/kg、约0.3nmoles/kg、约0.4nmoles/kg、或约0.5nmoles/kg、约0.1nmoles/kg至约1000nmoles/kg、约0.1nmoles/kg至约900nmoles/kg、约0.1nmoles/kg至约850nmoles/kg、约0.1nmoles/kg至约800nmoles/kg、约0.1nmoles/kg至约700nmoles/kg、约0.1nmoles/kg至约600nmoles/kg、约0.1nmoles/kg至约500nmoles/kg、约0.1nmoles/kg至约400nmoles/kg、约0.1nmoles/kg至约300nmoles/kg、约0.1nmoles/kg至约200nmoles/kg、约0.1nmoles/kg至约100nmoles/kg、约0.1nmoles/kg至约50nmoles/kg、约0.1nmoles/kg至约10nmoles/kg、或约0.1nmoles/kg至约1nmoles/kg受试者体重。在其他实施方案中，所述剂量可以是约0.3nmoles/kg至约1000nmoles/kg、约0.3nmoles/kg至约900nmoles/kg、约0.3nmoles/kg至约850nmoles/kg、约0.3nmoles/kg至约800nmoles/kg、约0.3nmoles/kg至约700nmoles/kg、约0.3nmoles/kg至约600nmoles/kg、约0.3nmoles/kg至约500nmoles/kg、约0.3nmoles/kg至约400nmoles/kg、约0.3nmoles/kg至约300nmoles/kg、约0.3nmoles/kg至约200nmoles/kg、约0.3nmoles/kg至约100nmoles/kg、约0.3nmoles/kg至约50nmoles/kg kg、约0.3nmoles/kg至约10nmoles/kg、或约0.3nmoles/kg至约1nmoles/kg受试者体重。
在各种其他实施方案中，一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐、或再生化合物或其药学上可接受的盐、或免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐、或活性修饰化合物或其药学上可接受的盐的剂量可以在例如约10nmoles/kg至约10,000nmoles/kg、约10nmoles/kg至约5,000nmoles/kg、约10nmoles/kg至约3,000nmoles/kg、约10nmoles/kg至约2,500nmoles/kg、约10nmoles/kg至约2,000nmoles/kg、约10nmoles/kg至约1,000nmoles/kg、约10nmoles/kg至约900nmoles/kg、约10nmoles/kg至约800nmoles/kg、约10nmoles/kg至约700nmoles/kg、约10nmoles/kg至约600nmoles/kg、约10nmoles/kg至约500nmoles/kg、约10nmoles/kg至约400nmoles/kg、约10nmoles/kg至约300nmoles/kg、约10nmoles/kg至约200nmoles/kg、约10nmoles/kg至约150nmoles/kg、约10nmoles/kg至约100nmoles/kg、约10nmoles/kg至约90nmoles/kg、约10nmoles/kg至约80nmoles/kg、约10nmoles/kg至约70nmoles/kg、约10nmoles/kg至约60nmoles/kg、约10nmoles/kg至约50nmoles/kg、约10nmoles/kg至约40nmoles/kg、约10nmoles/kg至约30nmoles/kg、约10nmoles/kg至约20nmoles/kg、约200nmoles/kg至约900nmoles/kg、约200nmoles/kg至约800nmoles/kg、约200nmoles/kg至约700nmoles/kg、约200nmoles/kg至约600nmoles/kg、约200nmoles/kg至约500nmoles/kg、约250nmoles/kg至约600nmoles/kg、约300nmoles/kg至约600nmoles/kg、约300nmoles/kg至约500nmoles/kg、或约400nmoles/kg至约600nmoles/kg的范围内。
在各种其他实施方案中，一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐、或再生化合物或其药学上可接受的盐、或免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐、或活性修饰化合物或其药学上可接受的盐的剂量可以在例如约1nmoles/kg至约10,000nmoles/kg、约1nmoles/kg至约5000nmoles/kg、约1nmoles/kg至约3000nmoles/kg、约1nmoles/kg至约2500nmoles/kg、约1nmoles/kg至约2000nmoles/kg、约1nmoles/kg至约1000nmoles/kg、约1nmoles/kg至约900nmoles/kg、约1nmoles/kg至约800nmoles/kg、约1nmoles/kg至约700nmoles/kg、约1nmoles/kg至约600nmoles/kg、约1nmoles/kg至约500nmoles/kg、约1nmoles/kg至约400nmoles/kg、约1nmoles/kg至约300nmoles/kg、约1nmoles/kg至约200nmoles/kg、约1nmoles/kg至约150nmoles/kg、约1nmoles/kg至约100nmoles/kg、约1nmoles/kg至约90nmoles/kg、约1nmoles/kg至约80nmoles/kg、约1nmoles/kg至约70nmoles/kg、约1nmoles/kg至约60nmoles/kg、约1nmoles/kg至约50nmoles/kg、约1nmoles/kg至约40nmoles/kg、约1nmoles/kg至约30nmoles/kg、或约1nmoles/kg至约20nmoles/kg的范围内。
在另一个实施方案中，可以向受试者施用约20μg/kg体重至约3mg/kg体重的衔接化合物或其药学上可接受的盐、或再生化合物或其药学上可接受的盐、或免疫抑制剂化合物或其药学上可接受的盐、或活性修饰化合物或其药学上可接受的盐。在另一方面，量可以是约0.2mg/kg体重至约0.4mg/kg体重或可以是约50μg/kg体重。
除非另有说明，否则在本文阐述的所有剂量实施方案中，“kg”是受试者体重的千克数。
可以向受试者施用单剂量或多剂量的一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐、或再生化合物或其药学上可接受的盐、或免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐、或活性修饰化合物或其药学上可接受的盐。
CAR-T细胞和与第一靶向部分连接的小分子(即衔接化合物或其药学上可接受的盐)的施用之间的时序可以根据包括使用的CAR-T的类型、CAR的结合特异性、第一靶向部分和小分子配体的身份、癌症的身份、癌症在受试者中的位置、用于向受试者施用CAR-T细胞和衔接化合物或其药学上可接受的盐的方式以及受试者的健康、年龄和体重在内的因素而广泛变化。
在至少一个实施方案中，可以在CAR-T细胞(或其组合物)之前或之后，例如在约3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48或51小时内，或在约0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天内施用与第一靶向部分连接的小分子配体(即，衔接化合物或其药学上可接受的盐)。在另一个实施方案中，所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐可以与CAR-T细胞组合物同时施用于受试者，但是在不同的制剂中，或在相同的制剂中。
本领域已知的任何适用的给药方案可用于施用衔接化合物或其药学上可接受的盐、活性修饰化合物或其药学上可接受的盐(例如，再生化合物或其药学上可接受的盐、或免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐)，或用于CAR-T细胞组合物。例如，可以使用每天一次给药(又名qd)、每天两次给药(又名bid)、每天三次给药(又名tid)、每周两次给药(又名BIW)、每周三次给药(又名TIW)、每周一次给药等。在一方面，选择的给药方案可以考虑所施用的化合物/组合物的浓度(包括，例如，所施用的CAR-T细胞的数量)以调节CAR-T细胞组合物的细胞毒性并控制任何潜在的不良影响(例如，CRS)。
还提供了一种通过修饰受试者的CAR-T细胞的活性来促进癌症治疗和/或杀死癌细胞的方法，包括向受试者施用任何前述实施方案的系统。
在一些实施方案中，使用本文阐述的任何化合物和组合物提供治疗癌症的方法。在本文所述的方法中，可以在向受试者施用衔接化合物或其药学上可接受的盐或CAR-T细胞组合物之前对癌症进行另外成像。例如，可以通过正电子发射断层扫描(PET)成像、磁共振成像(MRI)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)/计算机断层扫描(CT)成像来进行成像。成像方法可以是本领域已知的任何合适的成像方法。在一个实施方案中，成像方法可以涉及使用本文所述的小分子配体(例如，衔接化合物或其盐)，但与适用于本文所述的成像类型的成像剂连接。
在至少一个实施方案中，修饰CAR-T细胞活性(例如，治疗癌症)的方法包括向受试者施用包含CAR-T细胞的组合物，所述CAR-T细胞包含被定向到第一靶向部分、第二靶向部分或第一和第二靶向部分两者的CAR；向受试者施用一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐，每种衔接化合物包含与第一靶向部分连接的小分子配体；和向受试者施用与第二靶向部分连接的活性修饰化合物。
在某些实施方案中，修饰CAR-T细胞的活性和/或治疗癌症的方法包括向受试者施用包含载体的组合物，所述载体包含与编码CAR的核酸序列可操作地连接的启动子，所述CAR被定向到第一靶向部分、第二靶向部分或第一和第二靶向部分两者，其中在施用步骤之前、期间或之后，受试者接受一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐的剂量，每种衔接化合物包含与第一靶向部分连接的小分子配体。此外，在一些实施方案中，在载体组合物的施用步骤之前、期间或之后，受试者接受与第二靶向部分连接的活性修饰化合物的剂量。
这样的载体组合物可以包含含有编码至少本文所述的CAR的核酸载体的载体(例如，包含该载体的慢病毒颗粒)。在一些实施方案中，载体组合物包含治疗有效量的根据任何前述实施方案的慢病毒颗粒。
载体组合物可以通过任何途径施用，包括口服、鼻腔、静脉内、动脉内、肌内或腹膜内途径。在一些情况下，载体组合物通过静脉内注射或通过瘤内注射施用。
所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐中的每一种可以通过第一接头与第一靶向部分连接，并且活性修饰化合物可以通过第二接头与第二靶向部分连接。第一和第二接头可以包含本文所述的任何接头并且可以具有相同或不同的结构。类似地，第一和第二靶向部分可以包含本文所述的任何靶向部分并且可以具有相同或不同的结构。在另一个实施方案中，第一和第二靶向部分具有相同的结构，而第一和第二接头具有相同或不同的结构。此外，活性修饰化合物可以包含本文所述的任何活性修饰化合物，包括例如再生化合物或免疫抑制化合物。
“癌症”在根据本说明书阅读时具有其简单和普通的含义，并且可以包括但不限于涉及异常细胞生长并可能侵入或扩散到身体其他部位的一组疾病。可以使用本文所述的组合物、化合物和方法治疗多种类型的癌症，包括但不限于癌、肉瘤、骨肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、鼻咽癌、白血病、腺癌和骨髓瘤。可以根据本发明的方法和/或使用本发明的化合物和组合物治疗的癌症的其他并且可能更具体的实例包括但不限于肺癌(包括但不限于非小细胞肺癌)、骨癌(包括但不限于骨肉瘤)、胰腺癌、皮肤癌(包括但不限于皮肤黑色素瘤)、头部癌、颈部癌、眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌、直肠癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、输卵管癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、前列腺癌、白血病(包括但不限于慢性白血病、急性白血病、急性髓细胞白血病、淋巴细胞淋巴瘤、髓细胞白血病、粒单核细胞白血病和毛细胞白血病)、胸膜间皮瘤、膀胱癌、伯基特淋巴瘤、输尿管癌、肾癌(包括但不限于肾细胞癌)、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊髓轴瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤和胃食管交界处腺癌。
在这些实施方案的一些方面，癌症是表达叶酸受体的癌症，例如但不限于表达叶酸受体α的癌症。在其他实施方案中，癌症是表达叶酸受体β的癌症。在这些实施方案的一些方面，癌症是子宫内膜癌、非小细胞肺癌、卵巢癌或三阴性乳腺癌。
被治疗的癌症可以是肿瘤。在另一个实施方案中，癌症可以是恶性的。在另一个实施方案中，癌症是急性髓细胞性白血病，例如癌症表达叶酸受体-β的急性髓细胞性白血病。
用于修饰CAR-T细胞活性和/或治疗癌症的方法的某些实施方案包括：向受试者施用包含CAR-T细胞的组合物，其中CAR-T细胞包含被定向到第一靶向部分、第二靶向部分或第一和第二靶向部分两者的CAR；和向受试者施用一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐，其中每种衔接化合物或其药学上可接受的盐包含通过第一接头与第一靶向部分连接的小分子配体，其中第一接头包含具有公式的结构：
Figure BDA0003920193670000391
其中n是0到200的整数。
在至少一个实施方案中，所述方法可以另外包括向受试者施用与第二靶向部分连接(例如，通过第二接头或直接)的再生化合物或其药学上可接受的盐。在这样的实施方案中，所述再生化合物或其药学上可接受的盐可以例如选自包含TLR激动剂(例如，TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR7/8、TLR9等的激动剂)、STING激动剂、NLR、ALR激动剂、激酶抑制剂靶向激酶、RLR、RAGE、磷酸酶抑制剂和位于靶向细胞的核内体或细胞质中的任何其他模式识别受体的组。
此外，第二接头可以包含具有下式的结构：
Figure BDA0003920193670000392
其中n是0到200的整数。
在用于治疗癌症的方法的至少一个示例性实施方案中，再生化合物或其药学上可接受的盐是具有下式之一的结构的TLR激动剂(例如，TLR7、TLR7/8或TLR8)：
Figure BDA0003920193670000393
在某些其他实施方案中，再生化合物或其药学上可接受的盐具有下式：
Figure BDA0003920193670000394
在此类方法的其他实施方案中，再生化合物具有下式之一的结构：
Figure BDA0003920193670000401
Figure BDA0003920193670000402
其中n＝0至200，和
Figure BDA0003920193670000403
其中n＝0至50。
还提供了治疗已接受CAR-T细胞疗法的受试者的方法。在某些实施方案中，此类方法包括向受试者施用一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐，每种衔接化合物或其药学上可接受的盐包含与第一靶向部分连接的小分子配体；其中，在施用步骤之前，受试者已经接受了CAR-T细胞的剂量，所述CAR-T细胞表达识别并结合到第一靶向部分的CAR。在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括向受试者施用与第二靶向部分连接的活性修饰化合物。CAR-T细胞可以表达本文所述的CAR的一个或多个实施方案(例如，识别并结合到第一靶向部分、第二靶向部分或第一和第二靶向部分两者的CAR)。此类方法的一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐和活性修饰化合物可以包括本文所述的任何实施方案。
在本文所述的任何实施方案中，即使发生对癌症的CAR-T细胞毒性，也可能不会发生导致受试者中的脱靶毒性的细胞因子释放。在本文所述的任何实施方案中，即使发生对癌症的CAR-T细胞毒性，也可能不会在受试者中发生脱靶组织毒性。在本文所述的任何实施方案中，癌症可以包括肿瘤，并且肿瘤大小可以在受试者中减小，即使不发生脱靶毒性。
在本文所述的任何实施方案中，可以减少或防止CRS，并且所述方法可以导致受试者中肿瘤体积的减少。在本文所述的任何实施方案中，可以减少或防止由于CRS引起的体重减轻。在本文所述的任何实施方案中，癌症可以包括肿瘤并且可以获得对肿瘤的完全反应。
在所述化合物、组合物、组合和方法中，衔接化合物或其药学上可接受的盐、活性修饰化合物、CAR-T细胞组合物和载体组合物的所有实施方案都是适用的，包括但不限于靶向部分实施方案和接头实施方案。
本说明书中提及的所有专利、专利申请公开、期刊文章、教科书和其他出版物都表明本公开所属领域的技术人员的技术水平。所有这些出版物都通过引用的方式并入本文，其程度与每个单独的出版物被具体地和单独地指示通过引用的方式并入的程度相同。
在以上描述中，阐述了许多具体细节以提供对本公开的透彻理解。特定实例可以在没有这些具体细节中的一些或全部的情况下实施，并且应当理解，本公开不限于特定的生物系统、特定的癌症或特定的器官或组织，它们当然可以变化但仍然适用于借鉴本文提供的数据。
另外，本公开的各种技术和机制有时描述两个组分之间的连接或链接。诸如附加、链接、偶联、连接和类似术语及其屈折词素的词可以互换使用，除非差异被指出或从上下文中以其他方式明确。这些词和表述不一定表示直接连接，但包括通过中介组分的连接。应该注意的是，两个组分之间的连接并不一定意味着直接的、无阻碍的连接，因为各种其他组分可能存在于两个值得注意的组分之间。因此，除非另有说明，否则连接不一定意味着直接的、无阻碍的连接。
此外，将理解的是，以这种方式呈现的本公开仅出于解释性目的，并且本文所述的原理和实施方案可应用于具有不同于本文具体描述的设置的化合物和/或组合物组分。事实上，明确预期本公开的组合物和化合物的组分可以被定制以促进其期望的应用。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与化学和生物学领域的技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的方法和物质相似或等同的任何方法和物质可以用于本申请主题的实践或测试，但本文描述了优选的方法和物质。此外，如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述/该(the)”包括复数指示物，除非内容另有明确规定。因此，例如，当化合物/组合物被“一种”烷基或芳基取代时，该化合物/组合物任选地被至少一种烷基和/或至少一种芳基取代。
当本文使用的范围用于物理性质(例如分子量)或化学性质(例如化学式)时，旨在包含范围的所有组合和子组合以及其中的具体实施方案。
此外，术语“约”在涉及数字或数值或范围(包括例如整数、分数和百分比)时，表示所涉及的数字或数字范围是在实验可变性内的近似值(或在统计实验误差内)，因此数值或范围可以在所述数字或数值范围的1％到15％之间(例如，所列举值的+/-5％-15％)变化，前提是本领域普通技术人员会认为等同于所列举的值(例如，具有相同的功能或结果)。术语“包含(comprising)”(以及相关术语，例如“包含(comprise)”或“包含(comprises)”或“具有”或“包括”)不旨在排除在其他某些实施方案(例如，本文所述的任何化合物、物质的组合物、组合物、方法或过程等的实施方案)中可以“由所描述的特征组成”或“基本上由所描述的特征组成”。术语“基本上”可以允许值或范围内的可变性程度，例如，在规定值或范围的规定限制的90％内、95％内或99％内。
在治疗方法包括向受试者施用多于一种治疗、化合物或组合物的情况下，应当理解，施用的顺序、时序、数量、浓度和体积仅受医学要求和治疗局限性的限制(即，可以向受试者施用两种治疗，例如同时、连续、依次、二者择一或根据任何其他方案)。
此外，在描述代表性实施方案时，本公开可能已经将方法和/或过程呈现为特定的步骤顺序。在所述方法或过程不依赖于本文阐述的特定步骤顺序这一方面来说，所述方法或过程不应限于所描述的特定步骤顺序。如本领域普通技术人员将理解的，其他步骤序列可能是可行的。因此，本文公开的步骤的特定顺序不应被解释为对权利要求的限制。此外，针对方法和/或过程的权利要求不应限于按所写顺序执行它们的步骤，并且本领域技术人员可以容易地理解，可以改变顺序并且仍然保持在本公开的精神和范围内。
因此，本说明书和所附权利要求书旨在涵盖基于本公开的对本领域普通技术人员显而易见的所有修改和变化。
实施例
以下实施例说明了本公开的某些特定实施方案，并不意味着以任何方式限制要求保护的发明的范围。
实施例1
FITC-叶酸的合成
Figure BDA0003920193670000421
在四甲基胍和二异丙胺存在下，在无水二甲基亚砜(DMF)中将叶酸-γ-乙二胺与异硫氰酸荧光素(FITC)异构体I(Sigma-Aldrich)偶联。将粗产物上样到Xterra RP18制备型HPLC柱(Waters)上，并以梯度条件洗脱，从99％5mM磷酸钠(流动相A，pH 7.4)和1％乙腈(流动相B)开始，在10分钟内以20mL/min的流速达到90％A和10％B。
在这些条件下，FITC-叶酸主峰通常在27-50分钟洗脱。FITC-叶酸级分的质量通过带有紫外检测器的分析型反相HPLC进行监测。将纯度大于98.0％(LCMS)的级分冻干以获得最终的FITC-叶酸产物。如本领域所知，具有这种结构的化合物也称为EC17。
实施例2
FITC-PEG12-叶酸的合成
Figure BDA0003920193670000431
将通用聚乙二醇(PEG)Nova TagTM树脂(0.2g)装入肽合成容器中并用异丙醇(i-PrOH)(3×10mL)和二甲基甲酰胺(DMF，3×10mL)洗涤。使用在DMF中的20％哌啶(3×10mL)进行9-芴基甲氧羰基(Fmoc)去保护。进行Kaiser测试以评估反应进程。然后将在DMF中的Fmoc-L-谷氨酸5-叔丁酯(Fmoc-Glu-(O-t-Bu)-OH)(23.5mg)、N,N-二异丙基乙胺(i-Pr2NEt)(4当量)和苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)(2当量)的溶液引入容器中。使用在DMF(3×10mL)中的20％哌啶进行Fmoc去保护。然后将N10-TFA-Pte-OH(22.5mg)、DMF、i-Pr2NEt(4当量)和PyBOP(2当量)的溶液引入容器中。将氩气鼓泡2小时，并用DMF(3×3mL)和i-PrOH(3×3mL)洗涤树脂。在二氯甲烷(DCM)中溶胀树脂后，加入1M羟基苯并三唑(HOBT)在DCM/三氟乙烷(TFE)(1:1)(2×3mL)中的溶液。将氩气鼓泡1小时，除去溶剂，并用DMF(3×3mL)和i-PrOH(3×3mL)洗涤树脂。在DMF中溶胀树脂后，加入在DMF中的Fmoc-NH-(PEG)12-COOH(46.3mg)、i-Pr2NEt(4当量)和PyBOP(2当量)的溶液。将氩气鼓泡2小时，并用DMF(3×3mL)和i-PrOH(3×3mL)洗涤树脂。
使用在DMF中的20％哌啶(3×10mL)进行Fmoc去保护。进行Kaiser测试以评估反应进程。
然后将在DMF中的FITC(Life Technologies 21.4mg)和i-Pr2NEt(4当量)的溶液引入容器中，然后将氩气鼓泡2小时，并用DMF(3×3mL)和i-PrOH(3×3mL)洗涤树脂。然后向容器中加入在DMF中的2％NH2NH2(2×2mL)。使用TFA:H2O:三异丙基硅烷(TIS)(95:2.5:2.5)(裂解溶液)将最终化合物从树脂上裂解下来，并在真空下浓缩。浓缩产物在Et2O中沉淀并在真空下干燥。使用制备型RP-HPLC纯化粗产物(流动相：A＝10mM乙酸铵pH＝7，B＝ACN；方法：在30分钟内以13mL/min从0％B到30％B)。合并纯的级分并冷冻干燥，从而提供FITC-PEG12-叶酸。
实施例3
FITC-PEG20-叶酸的合成
Figure BDA0003920193670000432
将乙二胺、结合聚合物的(200-400目)树脂(50mg)装入肽合成容器中并用DCM(3mL)然后用DMF(3mL)溶胀。然后向容器中引入在DMF中的Fmoc-PEG20-COOH溶液(131mg，1.0当量)、i-Pr2NEt(6.0当量)和PyBOP(4.0当量)。将氩气鼓泡6小时，排出偶联溶液，并用DMF(3×10mL)和i-PrOH(3×10mL)洗涤树脂。进行Kaiser测试以评估反应进程。在每个氨基酸偶联之前，使用在DMF中的20％哌啶(3×10mL)进行Fmoc去保护。重复上述顺序以完成与Fmoc-Glu-OtBu(72mg，2.0当量)和三氟乙酰基蝶酸(Tfa.Pteroic-acid)(41mg，1.2当量)偶联步骤的反应。用在DMF中的2％肼3×10mL洗涤树脂(5分钟)，以裂解蝶酸上的三氟乙酰基保护基团，然后用i-PrOH(3×10mL)洗涤，然后用DMF(3×10mL)洗涤。树脂在氩气下干燥30分钟。使用裂解溶液将叶酸-肽从树脂上裂解下来。引入10mL裂解混合物，将氩气鼓泡1.5小时。将裂解混合物排入干净的烧瓶中。用更多的裂解混合物将树脂洗涤3次。将合并的混合物减压浓缩至较小体积(约5mL)并在乙醚中沉淀。
通过离心收集沉淀物，用乙醚洗涤(3次)并在高真空下干燥。干燥的叶酸-PEG20-EDA(1.0当量)在室温下用DMSO和DIPEA中的FITC(50mg，1.5当量)处理。通过LCMS监测反应进程。8小时后消耗原料得到产物。粗反应混合物通过制备型HPLC纯化(流动相A＝10mM乙酸铵，pH＝7；有机相B＝乙腈；方法：在35分钟内以13mL/min从0％B到30％B)并提供FITC-PEG20-叶酸，产率为60％。
实施例4
FITC-PEG108-叶酸的合成
Figure BDA0003920193670000441
将乙二胺、结合聚合物的(200-400目)树脂(50mg)装入肽合成容器中并用DCM(3mL)随后用DMF(3mL)溶胀。然后向容器中引入在DMF中的Fmoc-PEG36-COOH溶液(161mg，1.0当量)、i-Pr2NEt(6.0当量)和PyBOP(4.0当量)。将氩气鼓泡6小时，排出偶联溶液，并用DMF(3×10mL)和i-PrOH(3×10mL)洗涤树脂。进行Kaiser测试以评估反应进程。在每个氨基酸偶联之前，使用在DMF(3×10mL)中的20％哌啶进行Fmoc去保护。重复上述顺序以完成与2XFmoc-PEG36-COOH(161mg，1.0当量)、Fmoc-Glu-OtBu(72mg，2.0当量)和三氟乙酰基蝶酸(41.0mg，1.2当量)偶联步骤的反应。最后，用在DMF中的2％肼3×10mL洗涤树脂(5分钟)，以裂解蝶酸上的三氟乙酰基保护基团，然后用i-PrOH(3×10mL)洗涤，然后用DMF(3×10mL)洗涤。树脂在氩气下干燥30分钟。使用裂解溶液将叶酸-肽从树脂上裂解下来。引入10mL裂解混合物并将氩气鼓泡1.5小时。将裂解混合物排入干净的烧瓶中。用更多的裂解溶液将树脂洗涤3次。将合并的混合物减压浓缩至较小体积(约5mL)并在乙醚中沉淀。
通过离心收集沉淀物，用乙醚(3X)洗涤并在高真空下干燥。将干燥的叶酸-PEG108-EDA(1.0当量)在室温下用DMSO和DIPEA中的FITC(50mg，1.5当量)处理。通过LCMS监测反应进程。10小时后消耗原料得到产物。粗反应混合物通过制备型HPLC纯化(流动相A＝10mM乙酸铵，pH＝7；有机相B＝乙腈；方法：在35分钟内以13mL/min从0％B到30％B)并提供FITC-PEG108-叶酸，产率为64％。
实施例5
FITC-DUPA的合成
Figure BDA0003920193670000451
DUPA-FITC如下通过固相方法学合成。Universal Nova TagTM树脂(50mg，0.53mM)用DCM(3mL)然后用DMF(3mL)溶胀。将在DMF中的20％哌啶溶液(3×3mL)添加到树脂中，并将氩气鼓泡5分钟。用DMF(3×3mL)和异丙醇(i-PrOH，3×3mL)洗涤树脂。在DMF中溶胀树脂后，加入DUPA-(OtBu)-OH(1.5当量)、HATU(2.5当量)和i-Pr2NEt(4.0当量)在DMF中的溶液。将氩气鼓泡2小时，用DMF(3×3mL)和i-PrOH(3×3mL)洗涤树脂。
在DCM中溶胀树脂后，加入1M HOBt在DCM/TFE(1:1)中的溶液(2×3mL)。将氩气鼓泡1小时，除去溶剂并用DMF(3×3mL)和i-PrOH(3×3mL)洗涤树脂。在DMF中溶胀树脂后，加入Fmoc-Phe-OH(2.5当量)、HATU(2.5当量)和DIPEA(4.0当量)在DMF中的溶液。将氩气鼓泡2小时，然后用DMF(3×3mL)和i-PrOH(3×3mL)洗涤树脂。
对于添加8-氨基辛酸和异硫氰酸荧光素或若丹明B异硫氰酸酯的另外2个偶联步骤重复上述顺序。
使用裂解溶液将最终化合物从树脂上裂解下来并在真空下浓缩。浓缩产物在乙醚中沉淀并在真空下干燥。粗产物使用制备型RP-HPLC[λ＝488nm；溶剂梯度：在25分钟内从1％B到80％B，80％B洗涤30分钟运行；A＝10mM NH4OAc，pH＝7；B＝乙腈(ACN)]。真空除去ACN，将纯化的级分冷冻干燥，得到FITC-DUPA，为棕橙色固体。RP-HPLC：tR＝8.0分钟(A＝10mM NH4OAc，pH＝7.0；B＝ACN，溶剂梯度：在10分钟内从1％B到50％B，80％B洗涤15分钟运行)。1H NMR(DMSO-d6/D2O)：δ0.98-1.27(ms,9H)；1.45(b,3H)；1.68-1.85(ms,11H)；2.03(m,8H)；2.6-3.44(ms,12H)；3.82(b,2H)；4.35(m,1H)；6.53(d,J＝8.1Hz,2H),6.61(dd,J＝5.3,3.5Hz,2H)；6.64(s,2H)；7.05(d,J＝8.2Hz,2H),7.19(m,5H)；7.76(d,J＝8.0Hz,1H)；8.38(s,1H)。HRMS(ESI)(m/z)：C51H59N7O15S的(M+H)+计算值1040.3712，实测值1040.3702。UV/vis：λmax＝491nm。
实施例6
FITC-PEG12-DUPA的合成
Figure BDA0003920193670000461
将1,2-二氨基乙烷三苯甲基树脂(0.025g)装入肽合成容器中并用i-PrOH(3×10mL)洗涤，然后用DMF(3×10mL)洗涤。然后向容器中引入Fmoc-NH-(PEG)12-COOH(42.8mg)在DMF中的溶液、i-Pr2NEt(2.5当量)和PyBOP(2.5当量)。将所得溶液用Ar鼓泡1小时，排出偶联溶液，并用DMF(3×10mL)和i-PrOH(3×10mL)洗涤树脂。进行Kaiser测试以评估反应进程。使用在DMF中的20％哌啶(3×10mL)进行Fmoc去保护。重复该程序以完成所有偶联步骤(在它们各自的偶联步骤的每一个中使用2×1.5当量的Fmoc-Phe-OH和1.5当量的8-氨基辛酸和1.2当量的DUPA)。
在DUPA偶联之后，用DMF(3×10mL)和i-PrOH(3×10mL)洗涤树脂并在减压下干燥。使用裂解溶液将肽从肽合成容器中的树脂上裂解下来。将15mL裂解溶液添加到肽合成容器中，反应在Ar下鼓泡15分钟。用另外两个10mL量的裂解溶液处理树脂，每次5分钟。将裂解混合物浓缩至约5mL并用乙醚沉淀。通过离心收集沉淀物，用乙醚(3X)洗涤，并在高真空下干燥，从而回收粗物质。
在室温下向粗DUPA-(PEG)12-EDA(10mg)和FITC(5.6mg)在二甲基亚砜(DMSO，1mL)中的搅拌溶液中加入i-Pr2NEt(5当量)并在氩气下搅拌6小时。通过LCMS监测反应，并通过制备型HPLC纯化(流动相：A＝10mM乙酸铵pH＝7，B＝ACN；方法：在30分钟内以13mL/min从0％B到50％B)。合并纯化的级分并冷冻干燥，得到FITC-PEG12-DUPA。
实施例7
FITC-PEG11-NK1的合成
Figure BDA0003920193670000462
在室温下在氩气下向NK-1(0.02g，0.0433mmol，1.0当量)、O-(2-氨基乙基)-O'-[2-(Boc-氨基)乙基]十乙二醇(BocNH-PEG11-NH2)(Sigma，0.0336g，0.0521mmol，1.2当量)、苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)(0.027g，0.0521mmol，1.2当量)在干燥的CH2Cl2的搅拌溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(0.076mL，0.4338mmol，10当量)。通过LCMS监测反应进程，并通过制备型RP-HPLC(Waters，XBridgeTM Prep C18，5μm；19×100mm色谱柱，流动相A＝20mM乙酸铵缓冲液，pH 7，B＝乙腈，在30分钟内梯度10-100％B，13mL/min，λ＝220nm，254nm)纯化。收集纯的级分，蒸发所有有机溶剂并将样品冻干48小时以提供NK1-PEG11-NHBoc。产量：40.13mg(97％)。向无水DCM中的NK1-PEG11-NHBoc(0.0165g，0.015mmol)添加三氟乙酸(TFA，20当量)并将反应混合物在室温下搅拌4小时。除去过量的TFA，用水稀释剩余溶液并用CH2Cl2(3×5mL)萃取。用盐水洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)并浓缩。将获得的残余物在真空下干燥并用于下一步骤而无需进一步纯化。在氩气下在室温下将NK1-PEG11-NH2(0.008g，0.0081mmol，1.0eq.)、异硫氰酸荧光素(FITC)(Sigma，0.0037g，0.0097mmol，1.2当量)在无水二甲基亚砜(DMSO，0.3mL)中的搅拌溶液添加到二异丙基乙胺(0.0028mL，0.0162mmol，2.0当量)中。通过LCMS监测反应进程，并通过制备型RP-HPLC(Waters，XBridgeTMPrep C18，5μm；19×100mm柱，流动相A＝20mM乙酸铵缓冲液，pH 7，B＝乙腈，在30分钟内梯度10-100％B，13mL/min，λ＝280nm)纯化产物。收集纯的级分，蒸发所有有机溶剂，并将样品冻干48小时以提供FITC-PEG11-NK1，产率为8.54mg(77％)。
*注：NK-1化合物是通过从碱基配体开始的两步法合成的，所述碱基配体是通过使用文献中的方法制备的。(参考：DESIGN AND DEVELOPMENT OF NEUROKININ-1RECEPTOR-BINDING AGENT DELIVERY CONJUGATES，申请号：PCT/US2015/44229；通过引用的方式并入本文。
实施例8
FITC-PEG2-CA9的合成
Figure BDA0003920193670000471
使用Teflon磁力搅拌棒使CA9配体(53.6mg)在50mL圆底烧瓶中溶解在DMF(2-3mL)中。使用真空去除环境空气并用氮气代替，这在三个循环中完成。将圆底烧瓶保持在恒定氮气下。向烧瓶中加入28.9mg N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，然后加入21.6mg 1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)和18.9μL Boc-PEG2-NH2(Sigma Aldrich)。添加5.4μL三乙胺(TEA)并将反应搅拌过夜。使用HPLC纯化反应混合物并用UHPLC-MS确认(靶标m/z为831)。使用高真空旋转蒸发除去乙腈并将产物冻干。将该化合物与1:1TFA:DCM混合30分钟。使用高真空旋转蒸发除去TFA/DCM，然后在高真空中进行30分钟。然后将该化合物溶解在DMF中并与5摩尔当量的i-Pr2NEt、16mg异硫氰酸荧光素(Life Technologies)混合并搅拌1小时。通过HPLC纯化反应混合物，用UHPLC-MS确认靶标化合物(靶标m/z为1120)。将样品冻干并储存在-20℃。
实施例9
T细胞制备
通过使用Ficoll密度梯度离心(GE Healthcare Lifesciences)从健康供体的全血中分离人外周血单核细胞(PBMC)。然后使用EasySepTM人类T细胞分离试剂盒(STEM CELLtechnologies)从PBMC中分离T细胞。T细胞在含有40-100IU/mL人IL-2(MiltenyiBiotech)、2％人AB型血清和1％青霉素/硫酸链霉素的TexMACS培养基(Miltenyi BiotechInc)中培养。将Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(ThermoFisher Scientific)以1:1的比例添加到T细胞中以激活T细胞。激活后12-24小时，在8μg/mL聚盐水(Santa CruizBiotech)存在下，通过在22-32℃下以1,200g旋转感染90分钟，用FITC-CAR慢病毒颗粒转导T细胞。
在去除活化珠之前，在活化珠的存在下培养包含具有CAR修饰的T细胞(CAR-T)和没有CAR修饰的T细胞(非转化的T)的T细胞混合物6天。荧光激活细胞分选用于根据CAR-T细胞(GFP阳性)和非转化的T细胞(GFP阴性)的GFP表达对其进行分选。将分选的T细胞培养7-15天，然后注射到小鼠体内。当使用T细胞混合物时，CAR-T细胞和未转化的T细胞在小鼠注射前以所需的比例混合。图2-图4E中显示的数据是用通过这些程序制备的T细胞获得的。
实施例10
编码CAR基因的慢病毒载体的产生
重叠PCR方法用于产生包含针对荧光素的scFv的CAR构建体。合成了衍生自抗荧光素(4-4-20)抗体的针对荧光素的scFV，4M5.3(Kd＝270fM，762bp)。如图1所示，通过重叠PCR将编码人CD8α信号肽(SP，63bp)、铰链和跨膜区(249bp)、4-1BB胞质结构域(CD137，141bp)和CD3ζ链(336bp)的序列与抗荧光素scFV融合。将得到的CAR构建体(1551bp)插入到EcoRI/NotI切割的慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-(PGK-GFP)中(图1，System Biosciences)。慢病毒载体中CAR构建体的序列通过DNA测序得到证实。除非本文另有说明，否则用于产生实施例数据的CAR构建体具有SEQ ID NO:1的核酸序列和SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
示例性CAR核酸编码序列可以包含SEQ ID NO:1，其中第一个ATG是起始密码子。
示例性CAR氨基酸序列可以包含SEQ ID NO:2。
示例性插入片段可以包含SEQ ID NO:3，其中第一个GCCACC序列可以包含限制酶切割位点，随后是ATG起始密码子。在某些实施方案中，由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3编码的氨基酸序列可以包含SEQ ID NO:2。
实施例11
用于人T细胞转导的含有CAR基因的慢病毒的生产
为了制备含有抗荧光素(即，抗FITC)单链片段可变(scFv)CAR的慢病毒，将HEK-293TN包装细胞系与编码抗荧光素scFv CAR的慢病毒载体和第二代慢病毒包装质粒混合物(Cellecta)或ViraPower慢病毒包装混合物(ThermoFisher)共转染。转染24和48小时后，收获含有带有CAR基因的慢病毒的上清液，并通过标准聚乙二醇病毒浓缩法(Clontech)浓缩病毒颗粒，以供将来用人T细胞转导。
实施例12
从人PBMC中分离人T细胞
T细胞通过Ficoll密度梯度离心(GE Healthcare Lifesciences)从人外周血单核细胞(PBMC)中分离。洗去剩余的Ficoll溶液后，使用EasySepTM人T细胞分离试剂盒(STEMCELL technologies)分离T细胞。在人IL-2(100IU/mL，Miltenyi Biotech Inc)存在下，在含有1％青霉素和硫酸链霉素的TexMACSTM培养基(Miltenyi Biotech Inc)中培养纯化的T细胞。在多孔板中以1×106个细胞/mL的密度培养T细胞。每2-3天分裂T细胞并重新饲喂。
实施例13
人T细胞的转导
分离的T细胞在人IL-2(100IU/mL)存在下用与抗CD3/CD28抗体(LifeTechnologies)偶联的Dynabeads活化12-24小时，然后用编码抗荧光素CAR基因的慢病毒转导。72小时后收获细胞，并通过使用流式细胞术测量GFP荧光细胞来鉴定转导的T细胞上CAR的表达。
实施例14
CAR-T细胞耗竭模型(体外和体内)
为了在体外初步完善这一策略，通过在FITC-叶酸衔接化合物存在下将耗竭的CAR-T细胞(104个/孔)连续转移(每12小时)到新鲜的MDA-MB-231细胞(104个/孔)中同时监测耗竭标志物(PD-1+Tim3+LAG3+)的出现和CAR-T细胞细胞毒性的丧失来产生耗竭的CAR-T细胞(104个/孔)。然后记录了非靶向和FITC靶向TLR7激动剂逆转CAR-T细胞耗竭的能力。
为了评估相同的FITC-TLR7激动剂是否可能在体内逆转耗竭/功能障碍，携带KB肿瘤的NSG小鼠用相同的抗FITC CAR-T细胞治疗，直到CAR-T细胞功能障碍/耗竭的上述特征变得显著。在尾静脉注射相同的FITC-TLR7激动剂后，观察到T细胞耗竭/功能障碍标志物被逆转，肿瘤杀伤得以恢复。
对于体外模型，更具体地，抗FITC CAR-T细胞(104个/孔)与MDA-MB-231(104个/孔)以1:1的比例在96孔板中共培养，每12小时向孔中加入新鲜的MDA-MB-231细胞(104个/孔)，总共两次，以使FITC-CAR-T细胞耗竭。对于再生化合物的治疗，在MDA-MB-231细胞刺激2轮后，改为加入mcherry+(MDA-MB-231；104个/孔)细胞，并添加不同浓度的再生化合物。将细胞与耗竭的抗FITC CAR-T细胞共培养16小时。然后每4小时通过Incucyte S3对活的mcherry+(MDA-MB-231)细胞的数量进行计数。通过将16小时的细胞数除以8小时的细胞数并乘以100％来计算杀伤效力。
对于体内模型，更特别地，使用来自Jackson Lab的8-10周龄NSG小鼠(品系号005557)。所有NSG小鼠都维持缺乏叶酸的饮食(TD.95247，Envigo)，以将小鼠的叶酸水平降低到人类的生理水平。然后将1.5×106个KB细胞植入NSG小鼠的侧面。一旦肿瘤达到约30-50mm3，所有小鼠被分为两组：非CAR-T细胞治疗组和CAR-T细胞治疗组。CAR-T细胞治疗组通过静脉注射接受1×107个抗FITC-CAR-T细胞。4小时和24小时后，CAR-T细胞治疗组小鼠给予500nmol/kg FITC-叶酸衔接化合物。CAR-T细胞注射后5天，将所有CAR-T细胞治疗组小鼠分为两个亚组：盐水溶媒对照组和TLR7治疗组。TLR7治疗组的小鼠每周两次接受10nmol/小鼠的FITC-TLR7。对照组每周两次接受等体积的100μl盐水溶媒。所有CAR-T细胞治疗组小鼠继续每周一次给予500nmol/kg的FITC-叶酸。用卡尺对肿瘤体积进行非盲测量，并使用公式(a×b2)/2计算(a是肿瘤的最大直径，b是肿瘤的最小直径)。
实施例15
CAR-T细胞浸润肿瘤的流式细胞术
随后使用MACS试剂盒(Cat#130-095-929)进行肿瘤消化。将单细胞悬液与Fc阻段剂(抗小鼠CD16/CD32)在冰上预孵育10分钟，然后在4℃下与缀合的抗体在黑暗中孵育30分钟。细胞在采集前用FACS缓冲液洗涤两次。使用Fortessa(BD)流式细胞仪进行FACS采集。使用Flowjo分析数据。
实施例16
体外抗FITC CAR-T细胞的耗竭
在该实施例中，使用了如上所述的耗竭的CAR-T细胞模型。简而言之，图2B显示了测定的结果，在该测定中，将MDA-MB-231细胞与抗FITC CAR-T细胞和FITC-叶酸衔接化合物共培养，并且每12小时连续3次将新鲜的MDA-MB-231细胞添加到共培养中。图2B中的结果显示，这些CAR-T细胞在体外被MDA-MB-231细胞刺激2次后变得耗竭，表现为杀伤效力降低，耗竭标志物表达(PD-1+Tim3+Lag3+)增加。
实施例17
具有可释放或不可释放的接头的FITC-TLR7激动剂再生化合物的合成
在该实施例中，显示了具有可释放或不可释放的接头的FITC-TLR7激动剂再生化合物的合成。
Figure BDA0003920193670000501
向化合物1(1当量)在DMF中的搅拌溶液中加入Cs2CO3(2当量)和Boc-溴乙胺(1.5当量)并在70℃下加热5小时。一旦原料被消耗，用水稀释反应混合物并使用HPLC纯化以得到化合物2。为了使-Boc基团去保护，将2溶解在HCl的二恶烷溶液中并搅拌约1小时。然后将其蒸发至干，无需进一步纯化即可用于下一步。将化合物3(1当量)溶解在DMF中并用适当的Fmoc-N-酰胺基-PEGn-酸(1.1当量)、PyBop(1.5当量)、DIPEA(2当量)处理并搅拌约12小时。一旦原料被消耗，用HPLC纯化得到4。化合物4(1当量)用DMF中的三(氨基乙基)胺(10当量)去保护并用HPLC(流动相A＝10mM乙酸铵，pH＝7；有机相B＝乙腈)再次纯化。用FITC(1.1当量)处理纯化的化合物(1当量)以获得中等产率的FITC-PEGn-TLR7不可释放缀合物。
Figure BDA0003920193670000511
在DIPEA(1当量)存在下，向FITC(1当量)在DMSO中的搅拌溶液中加入巯基乙胺(1当量)。将其搅拌约10分钟以获得化合物7。在另一个烧瓶中，将化合物8(1当量)溶解在DMSO中并与适量的中间体7(1当量)混合。将其搅拌约2小时并用LCMS分析。用HPLC(流动相A＝10mM乙酸铵，pH＝7；有机相B＝乙腈)纯化产物以得到中等至良好产率的化合物9。
Figure BDA0003920193670000512
向化合物10(1当量)在DMSO中的搅拌溶液中加入中间体7(1当量)。将其搅拌约2小时并用LCMS分析。用HPLC(流动相A＝10mM乙酸铵，pH＝7；有机相B＝乙腈)纯化产物以得到中等至良好产率的化合物11(FITC-TLR7-3)。
FITC-PEGn-TLR7不可释放缀合物的合成方案
Figure BDA0003920193670000521
向化合物1(1当量)在DMF中的搅拌溶液中加入Cs2CO3(2当量)和Boc-溴胺12(1.5当量)并在70℃下加热5小时。一旦原料被消耗，用水稀释反应混合物并使用HPLC纯化以得到化合物13。为了使-Boc基团去保护，将2溶解在HCl的二恶烷溶液中并搅拌约1小时。然后将其蒸发至干，无需进一步纯化即可用于下一步。用FITC(1.1当量)处理去保护的化合物13(1当量)以获得中等至良好产率的FITC-PEGn-TLR7(14)不可释放缀合物。
实施例18
FITC-TLR7激动剂再生化合物接头的设计
在该实施例中，显示了FITC-TLR7激动剂再生化合物与接头的设计。
Figure BDA0003920193670000531
实施例19
体外抗FITC CAR细胞的再生
在该实施例中，CAR-T细胞耗竭模型中显示了通过与TLR7激动剂(再生化合物)缀合的FITC使抗FITC CAR-T细胞再生。图3A中描述了TLR7激动剂的结构。简而言之，图3B中的数据显示了TLR7激动剂和TLR7-激动剂-FITC缀合物(再生化合物)在耗竭模型中对体外耗竭的抗FITC CAR-T细胞的再生作用，表现为杀伤增加。
实施例20
体内抗FITC CAR细胞的再生
在该实施例中，显示了在如上所述的KB异种移植模型中通过缀合到FITC(再生化合物)的TLR7激动剂使抗FITC CAR-T细胞再生。简而言之，图4显示了FITC-TLR7激动剂缀合物在KB异种移植模型中的再生作用，如肿瘤大小减小(图4A)和耗竭标志物表达(PD-1+Tim3+)减少(图4B和4C)所示。图4D和4E显示了治疗期间CAR T细胞百分比的变化和小鼠体重的变化。
序列表
<110> 普渡研究基金会
<120> 用于修饰CAR-T细胞活性的方法、化合物和组合物
<130> 68951-02
<150> US 62/986,349
<151> 2020-03-06
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1554
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码嵌合抗原受体的核酸序列
<400> 1
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggatgtcg tgatgaccca gacccccctc agcctcccag tgtccctcgg tgaccaggct 120
tctattagtt gcagatccag ccagtccctc gtgcactcta acggtaatac ctacctgaga 180
tggtatctcc agaagcccgg acagagccct aaggtgctga tctacaaagt ctccaaccgg 240
gtgtctggag tccctgaccg cttctcaggg agcggttccg gcaccgactt caccctgaag 300
atcaaccggg tggaggccga agacctcggc gtctatttct gctctcagag tacacatgtg 360
ccctggacct tcggcggagg gaccaagctg gagatcaaaa gctccgcaga cgatgccaag 420
aaagatgccg ctaagaaaga cgatgctaag aaagacgatg caaagaaaga cggtggcgtg 480
aagctggatg aaaccggagg aggtctcgtc cagccaggag gagccatgaa gctgagttgc 540
gtgaccagcg gattcacctt tgggcactac tggatgaact gggtgcgaca gtccccagag 600
aaggggctcg aatgggtcgc tcagttcagg aacaaaccct acaattatga gacatactat 660
tcagacagcg tgaagggcag gtttactatc agtagagacg attccaaatc tagcgtgtac 720
ctgcagatga acaatctcag ggtcgaagat acaggcatct actattgcac aggggcatcc 780
tatggtatgg agtatctcgg tcaggggaca agcgtcacag tcagtttcgt gccggtcttc 840
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 900
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 960
cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 1020
tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaaccacag gaaccgtttc 1080
tctgttgtta aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 1140
ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 1200
ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1260
ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1320
gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1380
gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1440
atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1500
gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctaa 1554
<210> 2
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2编码的嵌合抗原受体氨基酸序列
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
35 40 45
Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
65 70 75 80
Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Lys Ile Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr
100 105 110
Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala
130 135 140
Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly Gly Val
145 150 155 160
Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ala Met
165 170 175
Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Gly His Tyr Trp Met
180 185 190
Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gln
195 200 205
Phe Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
210 215 220
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr
225 230 235 240
Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys
245 250 255
Thr Gly Ala Ser Tyr Gly Met Glu Tyr Leu Gly Gln Gly Thr Ser Val
260 265 270
Thr Val Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr
275 280 285
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
290 295 300
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
305 310 315 320
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
325 330 335
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
340 345 350
Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys
355 360 365
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
370 375 380
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
385 390 395 400
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
405 410 415
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
420 425 430
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
435 440 445
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
450 455 460
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
465 470 475 480
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
485 490 495
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
500 505 510
Ala Leu Pro Pro Arg
515
<210> 3
<211> 1560
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码嵌合抗原受体的核酸序列
<400> 3
gccaccatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct gctccacgcc 60
gccaggccgg atgtcgtgat gacccagacc cccctcagcc tcccagtgtc cctcggtgac 120
caggcttcta ttagttgcag atccagccag tccctcgtgc actctaacgg taatacctac 180
ctgagatggt atctccagaa gcccggacag agccctaagg tgctgatcta caaagtctcc 240
aaccgggtgt ctggagtccc tgaccgcttc tcagggagcg gttccggcac cgacttcacc 300
ctgaagatca accgggtgga ggccgaagac ctcggcgtct atttctgctc tcagagtaca 360
catgtgccct ggaccttcgg cggagggacc aagctggaga tcaaaagctc cgcagacgat 420
gccaagaaag atgccgctaa gaaagacgat gctaagaaag acgatgcaaa gaaagacggt 480
ggcgtgaagc tggatgaaac cggaggaggt ctcgtccagc caggaggagc catgaagctg 540
agttgcgtga ccagcggatt cacctttggg cactactgga tgaactgggt gcgacagtcc 600
ccagagaagg ggctcgaatg ggtcgctcag ttcaggaaca aaccctacaa ttatgagaca 660
tactattcag acagcgtgaa gggcaggttt actatcagta gagacgattc caaatctagc 720
gtgtacctgc agatgaacaa tctcagggtc gaagatacag gcatctacta ttgcacaggg 780
gcatcctatg gtatggagta tctcggtcag gggacaagcg tcacagtcag tttcgtgccg 840
gtcttcctgc cagcgaagcc caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 900
accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 960
gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 1020
gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa ccacaggaac 1080
cgtttctctg ttgttaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt 1140
atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 1200
gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 1260
cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 1320
gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac 1380
cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 1440
attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 1500
agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctaa 1560

Claims (87)

1.一种修饰患有癌症的受试者的T细胞活性和/或治疗癌症的方法，所述方法包括：
向受试者施用组合物，所述组合物包含：
包含与编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列可操作地连接的启动子的载体，或
表达所述CAR的T细胞(CAR-T细胞)，
其中，所述CAR被定向到第一靶向部分、第二靶向部分或第一和第二靶向部分两者；
向所述受试者施用一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐，每种衔接化合物或其药学上可接收的盐包括与所述第一靶向部分连接的小分子配体；和
向所述受试者施用与所述第二靶向部分连接的活性修饰化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述小分子配体通过第一接头与所述第一靶向部分连接。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐至少包含：
第一组衔接化合物或其药学上可接受的盐，第一组的每种衔接化合物或其药学上可接受的盐包括与所述第一靶向部分连接的第一小分子配体；和
第二组衔接化合物或其药学上可接受的盐，第二组的每种衔接化合物或其药学上可接受的盐包括与所述第一靶向部分连接的第二小分子配体；
其中所述第一小分子配体对在第一类型的癌细胞上过表达的受体是特异性的，而所述第二小分子配子对在第二类型的癌细胞上过表达的受体是特异性的。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述活性修饰化合物通过第二接头与所述第二靶向部分连接。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性修饰化合物包括：
再生化合物或其药学上可接受的盐，其配制用于使耗竭的CAR-T细胞再生；或
免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐，其配制用于降低CAR-T细胞的活性。
6.根据权利要求1、2或5所述的方法，其中所述活性修饰化合物或其药学上可接受的盐包括免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐，其选自由他克莫司、西罗莫司及环孢菌素组成的组。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一靶向部分和所述第二靶向部分具有相同的结构。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述小分子配体通过第一接头与所述第一靶向部分连接，所述活性修饰化合物通过第二接头与所述第二靶向部分连接，并且所述第一接头和所述第二接头相同。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述小分子配体通过第一接头与所述第一靶向部分连接，所述活性修饰化合物通过第二接头与所述第二靶向部分连接，并且所述第一接头和所述第二接头不同。
10.根据权利要求1、2或5中任一权利要求所述的方法，其中所述CAR具有包含以高亲和力与所述第一靶向部分或所述第二靶向部分结合的抗体的单链片段可变(scFv)区的识别区。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐和所述活性修饰化合物各自以亚毫摩尔范围内的亲和力与所述CAR的scFv区结合。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性修饰化合物包含再生化合物或其药学上可接受的盐，并且被配制用于阻断耗竭的CAR-T细胞的抑制性信号传导、通过不依赖抗原的途径重新激活耗竭的CAR-T细胞或两者。
13.根据权利要求10所述的方法，其中将CAR-T细胞的识别区结合到与所述活性修饰化合物连接的所述第二靶向部分将所述活性修饰化合物内化到所述CAR-T细胞中。
14.根据权利要求1、2或5中任一权利要求所述的方法，其中与正常组织或非靶向癌细胞相比，所述一种或多种衔接化合物中的每一种的小分子配体对靶向癌细胞上过表达的受体具有特异性。
15.根据权利要求1、2或5中任一权利要求所述的方法，其中所述小分子配体选自由叶酸、2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸(DUPA)配体、神经激肽1受体(NK-1R)配体、碳酸酐酶IX(CAIX)配体、γ-谷氨酰转肽酶配体、自然杀伤组2D受体(NKG2D)配体和胆囊收缩素B受体(CCKBR或CCK2)配体组成的组。
16.根据权利要求1、2或5中任一权利要求所述的方法，其中所述第一靶向部分和所述第二靶向部分各自独立地选自由2,4-二硝基苯酚(DNP)、2,4,6-三硝基苯酚(TNP)、生物素、地高辛、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、NHS-荧光素、五氟苯基酯、四氟苯基酯、knottin、centyrin和DARPin组成的组。
17.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述第一接头和所述第二接头各自独立地是可释放接头或不可释放接头。
18.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述第一接头、所述第二接头或两者独立地包含C1-C20烷基、聚乙二醇(PEG)、聚脯氨酸、低聚(4-哌啶羧酸)、低聚哌啶、肽、糖-肽、亲水性氨基酸、糖、非天然肽聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、pluronic F-127或其组合。
19.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述第一接头或所述第二接头包括PEG。
20.根据权利要求1、2、5或12中任一权利要求所述的方法，其中所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐各自具有下式：
B-L-T，
其中B代表小分子配体，L代表第一接头，T代表第一靶向部分，L包括具有下式的结构：
Figure FDA0003920193660000031
其中n是0到200的整数。
21.根据权利要求12所述的方法，其中所述再生化合物或其药学上可接受的盐选自由Toll样受体(TLR)激动剂、干扰素基因刺激因子激动剂、磷酸酶抑制剂、Nod样受体刺激剂、黑色素瘤2样受体激动剂缺乏、激酶抑制剂、维甲酸诱导的基因-I样受体和晚期糖基化终产物受体组成的组。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述再生化合物或其药学上可接受的盐是TLR7或TLR7/8激动剂。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述再生化合物具有下式之一：
Figure FDA0003920193660000032
24.根据权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种衔接化合物中的第一接头或其药学上可接受的盐位于所述小分子配体和所述第一靶向部分之间，并且包含具有选自下式的结构的化学部分：
Figure FDA0003920193660000041
Figure FDA0003920193660000051
其中n是0到200的整数。
25.根据权利要求1或24所述的方法，其中所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐的小分子配体包含具有下式的结构：
Figure FDA0003920193660000052
其中：
X1和Y1各自独立地选自由卤素、R2、OR2、SR3和NR4R5组成的组；
U、V和W代表各自独立地选自由-(R6a)C＝、-N＝、-(R6a)C(R7a)-和-N(R4a)-组成的组的二价部分；
Q选自由C和CH组成的组；
T选自由S、O、N和-C＝C-组成的组；
X2和X3各自独立地选自由氧、硫、-C(Z)-、-C(Z)O-、-OC(Z)-、-N(R4b)-、-C(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)-、-OC(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)O-、-N(R4b)C(Z)N(R5b)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R4a)S(O)2-、-C(R6b)(R7b)-、-N(C≡CH)-、-N(CH2C≡CH)-、C1-C12亚烷基和C1-C12亚烷氧基组成的组，其中Z是氧或硫；
R1选自由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基组成的组；
R2、R3、R4、R4a、R4b、R5、R5b、R6b和R7b各自独立地选自由氢、卤素、C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、C1-C12烷酰基、C1-C12烯基、C1-C12炔基、(C1-C12烷氧基)羰基和(C1-C12烷基氨基)羰基组成的组；
R6和R7各自独立地选自由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基组成的组；或者R6和R7一起形成羰基；
R6a和R7a各自独立地选自由氢、卤素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基组成的组；或者R6a和R7a一起形成羰基；
p、r、s和t各自独立地为0或1；和
如果所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐包含化学部分，则*代表共价键。
26.根据权利要求4所述的方法，其中所述第二接头位于所述第二靶向部分和所述活性修饰化合物之间，并且包含具有选自下式的结构的化学部分：
Figure FDA0003920193660000061
其中n是0到200的整数。
27.根据权利要求5、12、21或22中任一权利要求所述的方法，其中所述再生化合物或其药学上可接受的盐具有下式：
Figure FDA0003920193660000071
28.根据权利要求5、12、21或22中任一权利要求所述的方法，其中所述再生化合物或其药学上可接受的盐具有下式之一的结构：
Figure FDA0003920193660000072
Figure FDA0003920193660000073
其中n＝0至200，或
Figure FDA0003920193660000081
其中n＝0至50。
29.根据权利要求1、2、5或21-23中任一权利要求所述的方法，其中以约10nmole/kg受试者体重到约10,000nmole/kg受试者体重的剂量施用所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐或所述活性修饰化合物中的每一种。
30.根据权利要求1、2、5或21-23中任一权利要求所述的方法，其中以约10nmole/kg受试者体重到约2,000nmole/kg受试者体重的剂量施用所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐或所述活性修饰化合物中的每一种。
31.根据权利要求1、2、5或21-23中任一权利要求所述的方法，其中以约10nmole/kg受试者体重到约1,000nmole/kg受试者体重的剂量施用所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐或所述活性修饰化合物中的每一种。
32.根据权利要求1、2、5或21-23中任一权利要求所述的方法，其中以约10nmole/kg受试者体重到约600nmole/kg受试者体重的剂量施用所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐或所述活性修饰化合物中的每一种。
33.根据权利要求1、2、5或21-23中任一权利要求所述的方法，其中以约200nmole/kg受试者体重到约600nmol/kg受试者体重的剂量施用所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐或所述活性修饰化合物中的每一种。
34.根据权利要求1、2、5或21-23中任一权利要求所述的方法，其中以约250nmole/kg受试者体重到约600nmol/kg受试者体重的剂量施用所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐或所述活性修饰化合物中的每一种。
35.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症是肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部癌、颈部癌、皮肤黑色素瘤、眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌、直肠癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、输卵管癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、前列腺癌、白血病、胸膜间皮瘤、膀胱癌、伯基特淋巴瘤、输尿管癌、
肾癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤或胃食管交界处腺癌。
36.根据权利要求1、2、5或21-23中任一权利要求所述的方法，其中所述CAR包含识别区，所述识别区为抗FITC抗体的scFv区。
37.根据权利要求1所述的方法，其中所述CAR进一步包含选自由CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)和CD278(ICOS)组成的组的共刺激结构域。
38.根据权利要求1所述的方法，其中所述CAR进一步包含激活信号传导结构域，所述激活信号传导结构域为T细胞CD3ζ链或Fc受体γ。
39.根据权利要求1、2、5或21-23中任一权利要求所述的方法，进一步包括：
在施用所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐之前或在施用所述CAR-T细胞组合物之前，对所述受试者成像。
40.根据权利要求1、2、5或21-23中任一权利要求所述的方法，其中所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐中的至少一种不是抗体，也不包含抗体片段。
41.根据权利要求1、2、5或21-23中任一权利要求所述的方法，其中所述第一靶向部分和所述第二靶向部分中的一个或两者不包含肽表位。
42.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体包括慢病毒载体。
43.一种治疗已接受CAR-T细胞疗法的受试者的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐，每种衔接化合物或其药学上可接收的盐包括与第一靶向部分连接的小分子配体；
其中在施用步骤之前，所述受试者已接受至少一个剂量的表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，所述嵌合抗原受体识别并结合到所述第一靶向部分。
44.根据权利要求43所述的方法，进一步包括向所述受试者施用与第二靶向部分连接的活性修饰化合物，其中所述CAR识别并结合到所述第二靶位部分。
45.根据权利要求43或44所述的方法，其中每种衔接化合物的小分子配体通过第一接头与所述第一靶向部分连接。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述第一接头包括具有下式的结构：
Figure FDA0003920193660000091
其中n是0到200的整数。
47.根据权利要求44所述的方法，其中所述活性修饰化合物通过第二接头与所述第二靶向部分连接。
48.根据权利要求44或47所述的方法，其中所述活性修饰化合物包括与所述第二靶向部分连接的再生化合物或其药学上可接受的盐，其中所述再生化合物或其药学上可接受的盐选自包含Toll样受体(TLR)激动剂、干扰素基因刺激因子激动剂、磷酸酶抑制剂、Nod样受体刺激剂、黑色素瘤2样受体激动剂缺乏、激酶抑制剂、维甲酸诱导的基因-I样受体和晚期糖基化终产物受体。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述再生化合物或其药学上可接受的盐是其具有下式之一的结构的TLR7激动剂：
Figure FDA0003920193660000101
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述再生化合物或其药学上可接受的盐具有下式：
Figure FDA0003920193660000102
51.根据权利要求48所述的方法，其中所述再生化合物具有下式之一的结构：
Figure FDA0003920193660000103
Figure FDA0003920193660000111
其中n＝0至200，或
Figure FDA0003920193660000112
其中n＝0至50。
52.一种用于修饰患有癌症的受试者的T细胞活性的组合，其中所述组合包含：
一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐，其中每种衔接化合物或其药学上可接收的盐包含与第一靶向部分连接的小分子配体；和
与第二靶向部分连接的活性修饰化合物，所述活性修饰化合物包括：
再生化合物或其药学上可接受的盐，或
免疫抑制化合物或其药学上可接受的盐。
53.根据权利要求52所述的组合，所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐至少包含：
第一组衔接化合物，每种衔接化合物包含与所述第一靶向部分连接的第一小分子配体，与非靶向类型的细胞相比，所述第一小分子配体对在第一类型的癌细胞上过表达的受体具有特异性；和
第二组衔接化合物，每种衔接化合物包含与所述第一靶向部分连接的第二小分子配体，与非靶向类型的细胞相比，所述第二小分子配体对在第二类型的癌细胞上过表达的受体具有特异性。
54.根据权利要求52或53所述的组合，其中所述第一靶向部分和所述第二靶向部分具有相同的结构。
55.根据权利要求52或53所述的组合，其中所述第一靶向部分和所述第二靶向部分具有不同的结构。
56.根据权利要求52所述的组合，其中所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐中的至少一种进一步包含位于所述小分子配体和所述第一靶向部分之间的第一接头。
57.根据权利要求52所述的组合，其中第二接头位于所述第二靶向部分和所述活性修饰化合物之间。
58.根据权利要求56所述的组合，其中第二接头位于所述第二靶向部分和所述活性修饰化合物之间，并且所述第一接头和所述第二接头具有相同的结构或不同的结构。
59.根据权利要求52所述的组合，进一步包括一种组合物，所述组合物包含：
包含与编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列可操作地连接的启动子的载体；或
表达所述CAR的T细胞(CAR-T细胞)；
其中所述CAR被定向到所述第一靶向部分、所述第二靶向部分或第一和第二靶向部分两者。
60.根据权利要求59所述的组合，其中所述CAR具有包含以高亲和力与所述第一靶向部分和所述第二靶向部分结合的抗体的单链片段可变(scFv)区的识别区。
61.根据权利要求60所述的组合，其中所述第一和第二靶向部分以亚纳米范围内的亲和力与scFv区结合。
62.根据权利要求52、53或55-58中任一权利要求所述的组合，其中所述小分子配体选自由以下组成的组：叶酸、2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸(DUPA)配体、神经激肽1受体(NK-1R)配体、碳酸酐酶IX(CAIX)配体、γ-谷氨酰转肽酶配体、自然杀伤组2D受体(NKG2D)配体和胆囊收缩素B受体(CCKBR或CCK2)配体。
63.根据权利要求52、53或55-58中任一权利要求所述的组合，其中所述第一靶向部分、所述第二靶向部分或第一和第二靶位部分两者独立地选自由以下组成的组：2,4-二硝基苯酚(DNP)、2,4,6-三硝基苯酚(TNP)、生物素、地高辛、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、NHS-荧光素、五氟苯基酯、四氟苯基酯、knottin、centyrin和DARPin。
64.根据权利要求58所述的组合，其中所述第一接头和所述第二接头中的至少一个是可释放的接头。
65.根据权利要求58所述的组合，其中所述第一接头和所述第二接头中的至少一个是不可释放的接头。
66.根据权利要求58所述的组合，其中所述第一接头、所述第二接头或第一和第二接头两者各自独立地包含C1-C20烷基、聚乙二醇(PEG)、聚脯氨酸、低聚(4-哌啶羧酸)、低聚哌啶、肽、糖-肽、亲水性氨基酸、糖、非天然肽聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、pluronic F-127或其组合。
67.根据权利要求66所述的组合，其中至少第一接头或第二接头包含PEG。
68.根据权利要求58所述的组合，其中所述第一接头和所述第二接头中的至少一个包含具有下式的结构：
Figure FDA0003920193660000131
其中n是0到200的整数。
69.根据权利要求52所述的组合，其中所述再生化合物或其药学上可接受的盐选自包含Toll样受体(TLR)激动剂、干扰素基因刺激因子激动剂和磷酸酶抑制剂、Nod样受体刺激剂、黑色素瘤2样受体激动剂缺乏、激酶抑制剂、维甲酸诱导的基因-I样受体和晚期糖基化终产物受体的组。
70.根据权利要求69所述的组合，其中所述再生化合物或其药学上可接受的盐是TLR7激动剂。
71.根据权利要求70所述的组合，其中TLR7激动剂具有下式：
Figure FDA0003920193660000132
72.根据权利要求56或58所述的组合，其中所述一种或多种衔接化合物或其药学上可接受的盐中的第一接头位于所述小分子配体和所述第一靶向部分之间，并且包含选自下式的一个或多个结构：
Figure FDA0003920193660000141
Figure FDA0003920193660000151
其中n是0到200的整数。
73.根据权利要求57或58所述的组合，其中所述第二接头位于所述第二靶向部分和所述活性修饰化合物或其药学上可接受的盐之间，并且包含选自下式的一个或多个结构：
Figure FDA0003920193660000152
Figure FDA0003920193660000161
其中n是0到200的整数。
74.根据权利要求52或69-71中任一权利要求所述的组合，其中所述再生化合物或其药学上可接受的盐具有下式：
Figure FDA0003920193660000162
75.根据权利要求52或69-71中任一权利要求所述的组合，其中所述再生化合物或其药学上可接受的盐具有下式之一的结构：
Figure FDA0003920193660000163
Figure FDA0003920193660000171
其中n＝0至200，和
Figure FDA0003920193660000172
其中n＝0至50。
76.根据权利要求60或61所述的组合，其中所述抗体的scFv区是抗FITC抗体的scFv区。
77.根据权利要求59-61中任一权利要求所述的组合，其中所述CAR进一步包含选自由CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)和CD278(ICOS)组成的组的共刺激结构域。
78.根据权利要求59-61中任一权利要求所述的组合，其中所述CAR进一步包含激活信号传导结构域。
79.根据权利要求78所述的组合，其中所述激活信号传导结构域是T细胞CD3ζ链或Fc受体γ。
80.根据权利要求52所述的组合，其中每种衔接化合物或其药学上可接受的盐不是抗体，并且不包含抗体片段。
81.根据权利要求52所述的组合，其中所述第一靶向部分不包含肽表位。
82.一种用于使表达嵌合抗原受体的T细胞再生的化合物，所述化合物包含与靶向部分连接的再生化合物或其药学上可接受的盐，其中所述再生化合物或其药学上可接受的盐选自由Toll样受体(TLR)激动剂、干扰素基因刺激因子激动剂、磷酸酶抑制剂、Nod样受体刺激剂、黑色素瘤2样受体激动剂缺乏、激酶抑制剂、维甲酸诱导的基因-I样受体和晚期糖基化终产物受体。
83.根据权利要求82所述的化合物，其中所述再生化合物或其药学上可接受的盐具有下式的结构：
Figure FDA0003920193660000181
84.根据权利要求82或83所述的化合物，其中所述再生化合物或其药学上可接受的盐具有下式的结构：
Figure FDA0003920193660000182
85.根据权利要求82或83所述的化合物，其中所述再生化合物或其药学上可接受的盐具有下式之一的结构：
Figure FDA0003920193660000183
Figure FDA0003920193660000191
其中n＝0至200，和
Figure FDA0003920193660000192
其中n＝0至50。
86.根据权利要求82所述的化合物，其中所述再生化合物或其药学上可接受的盐具有下式：
Figure FDA0003920193660000193
87.根据权利要求82-86中任一权利要求所述的化合物，其中所述靶向部分选自由2,4-二硝基苯酚(DNP)、2,4,6-三硝基苯酚(TNP)、生物素、地高辛、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、NHS-荧光素、五氟苯基酯(PFP)、四氟苯基酯(TFP)、knottin、centyrin和设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)。
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