CN111849916B

CN111849916B - 一种免疫细胞及其制剂与应用

Info

Publication number: CN111849916B
Application number: CN202010704308.XA
Authority: CN
Inventors: 谢海涛; 薛卫巍; 马丽雅
Original assignee: Guangdong Xiankangda Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Xiankangda Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-07-21
Filing date: 2020-07-21
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2040-07-21
Also published as: CN111849916A

Abstract

本发明涉及生物细胞技术领域，尤其涉及一种免疫细胞及其制剂与应用，该免疫细胞表达CAR；所述CAR的表达被调控依赖于一段氨基酸序列。本发明提供一种可调控的CAR的设计方案及一种工程化的免疫细胞，将此设计方案设计出的CAR转入T细胞后，T细胞在遇到靶细胞时，CAR的表达才会上升，识别肿瘤表面标记物，行驶杀伤功能，当无靶细胞存在时，CAR的表达会自动下调，从而减少CAR‑T细胞的耗竭，使其在体内行驶功能的时间更持久。

Description

一种免疫细胞及其制剂与应用

技术领域

本发明涉及生物细胞技术领域，特别是涉及可以调控表达CAR的免疫细胞，优化CAR的设计，及该免疫细胞的制剂与应用。

背景技术

2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。免疫细胞治疗是采集患者外周静脉血，在GMP实验室内分离外周血单个核细胞，在多种细胞因子诱导下，大量扩增出具有高效抗瘤活性的免疫效应细胞，再通过静脉、皮内注射、介入等回输到患者体内，达到增强患者免疫功能和杀伤肿瘤细胞的目的，常用的免疫细胞治疗手段包括CIK、DC、TIL、DC+CIK 细胞等。

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)通常是scFv(single-chain variablefragment)，跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体(CAR)。CARs的胞外段scFv可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起T细胞的活化、增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。

CAR-T细胞治疗技术由于其治疗优势治疗更精准、多靶向更精准，杀瘤范围更广、更持久越来越受到人们的重视，其在血液瘤上也取得了令人瞩目的临床效果。

然而CAR-T治疗还存在一些问题，CAR-T细胞治疗实体瘤的效果一直都不如血液瘤，其一个重要的原因是CAR-T细胞的耗竭导致其在体内存活时间短且杀伤力低。 CAR的表达多少会影响CAR-T细胞的激活程度，当T细胞表面的CAR的表达增高时，CAR的胞外区scFv之间形成的聚体结构概率大大增加，聚体的形成会使T细胞激活增加，从而加速耗竭。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种免疫细胞，其具有年轻、持久性强、特异性好、副作用小的特性。

一种免疫细胞，表达CAR；CAR的表达被调控依赖于一段氨基酸序列。

有益效果：本发明提供一种可调控的CAR的设计方案及一种工程化的免疫细胞，将此设计方案设计出的CAR转入T细胞后，T细胞在遇到靶细胞时，CAR的表达才会上升，识别肿瘤表面标记物，行驶杀伤功能，当无靶细胞存在时，CAR的表达会自动下调，从而减少CAR-T细胞的耗竭，使其在体内行驶功能的时间更持久。

在其中一个实施例中，免疫细胞为外周血T、TIL、NK、NKT、gamma-deltaT中的一种或几种。

在其中一个实施例中，免疫细胞是可以靶向任何靶点的第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR、第四代CAR或者双CAR。

在其中一个实施例中，所述免疫细胞是在CAR的序列中添加一段氨基酸序列，所述氨基酸序列为：NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQL。

在其中一个实施例中，所述氨基酸序列在CAR的跨膜区域前面或者跨膜区域后面。

本发明还提供了一种制剂，该制剂含有上述任一项所述的免疫细胞。

在其中一个实施例中，所述制剂为药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明免疫细胞可用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

此CAR的设计方法是在CAR的跨膜区前面或者后面加入一段氨基酸序列。如下8种CAR的结构：

抗原结合位点是指可以与靶抗原结合的任意形式的抗体，例如scFv、anti-Fab等抗体形式；也可以是和靶抗原结合的天然受体或其他分子；或者是与中间体结合的抗体。

TM是任意跨膜区域，包括但不限于CD8跨膜区域、CD28跨膜区域等。

Hinge是铰链区，本发明所保护的序列包括含有hinge区域的和不含有hinge区域的序列。

Costimulator是指共刺激区域，包括且不限于4-1BB、CD28、ICOS等共刺激区域的一个或者多个的组合。

CD3e是指CD3e刺激区域。

K是指和CAR一同表达的任意蛋白、细胞因子或者趋化因子等的一种或者多种的组合。

本发明所保护的序列指K和CAR以P2A、T2A等形式相连，或者以IRES相连，或者是以多个启动子分别表达。

本发明免疫细胞序列中的K和CAR可以分别表达在不同的载体上，包括双CAR的表达，多CAR的表达，也可以在同一个载体或者不同的载体上。

免疫细胞选自下组：嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)；或CAR-gamma-delta T细胞、CAR-TIL。

本发明免疫细胞起调控作用的氨基酸序列为如下所示的氨基酸序列：NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQL，也可以是其中一部分：

例如：NO1: NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQ;

NO2: NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFS;

NO3: NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFF;

NO4: NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKF;

NO5: NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSK;

NO6: NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPS;

NO7: NCRNTGPWLKKVLKCNTPDP;

NO8: NCRNTGPWLKKVLKCNTPD;

NO9: NCRNTGPWLKKVLKCNTP;

NO10: NCRNTGPWLKKVLKCNT;

NO11: NCRNTGPWLKKVLKCN;

NO12: NCRNTGPWLKKVLKC;

NO13: NCRNTGPWLKKVLK;

根据免疫细胞表达靶向不同靶点的CAR，可选用以上合适的氨基酸序列。

上述氨基酸序列NO1，不同于目前市面上说的安全开关，其原理和目的均不一样。此氨基酸序列来自IL-2受体中氨基酸序列，不会产生对机体的毒性，可自动对靶抗原做出反应,调控CAR的表达，不依赖于外界的药物。且此氨基酸序列的存在不影响CAR-T细胞的功能。

在另一优选例中，提供了本发明第一方面所述的免疫细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：卵巢癌、间皮瘤、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌或其组合。

附图说明

图1为实施例1 的CAR的结构；

图2为实施例1 的CAR-T细胞的扩增曲线；

图3为实施例1 的CAR-T细胞的扩增曲线；

图4为实施例1培养第6天的T细胞的CAR阳性率；

图5为实施例1培养第13天的T细胞的CAR阳性率；

图6为实施例1培养第6、9天的T细胞的CAR阳性率；

图7为实施例1的T细胞在不同条件下的CD69表达；

图8为实施例1的CAR-T细胞体外杀伤实验；

图9为实施例1的CAR-T细胞与不同肿瘤细胞共培养或者独自培养6h后CAR的表达；

图10为实施例1的CAR-T细胞与不同肿瘤细胞以效靶比1：1共培养6h后IL-2的分泌；

图11为实施例1的CAR-T细胞与不同肿瘤细胞以效靶比1：1共培养6h后INF-gamma的分泌；

图12为单独培养CAR-T细胞的扩增曲线；

图13为CAR-T细胞与GPC3+肿瘤细胞长时间共培养的扩增曲线。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明以CAR-T细胞为例，代表性地对本发明的免疫细胞进行详细说明。本发明的免疫细胞不限于上下文所述的CAR-T细胞，本发明的免疫细胞具有与上下文所述的CAR-T细胞相同或类似的技术特征和有益效果。具体地，当免疫细胞表达嵌合抗原受体CAR时，NK细胞、NKT细胞、TIL、gamma-delta T细胞等同于T细胞(或T细胞可替换NK细胞)。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语CAR：嵌合抗原受体CARs的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CARs，并且还有在同一个细胞上表达靶向2个靶点或者多个靶点的双CAR或者多CAR等

本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括抗原结合结构域。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和CD3ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。

在本发明的一个较佳的实施方案中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向GPC3的抗原结合结构域。本发明的CAR在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性或者蛋白受体结合进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，CAR-T细胞会靶向性裂解肿瘤细胞，导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和CD3ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与CD28/4-1BB/ICOS信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，在其跨膜结构域前或者后加入起调控作用的氨基酸序列，使CAR的表达随靶抗原的浓度而变化。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰。

本发明的CAR中的胞内结构域包括CD28/4-1BB/ICOS的信号传导结构域和CD3ζ的信号传导结构域。

术语“表达框”：在其中一个实施方案中，包括第一表达框和第二表达框。第一表达框包含编码所述CAR的核酸序列。第二表达框包含用于表达其他细胞因子、趋化因子等蛋白的核算序列。在其中一个实施方案中，有第三表达框，表达另一个CAR，即为有两个跨膜区的双CAR，或者多CAR。在一个实施方案中，所述第一表达框、第二表达框和第三表达框分别还包括启动子，所述的第一表达框、第二表达框位于相同或不同的载体上。优选地，所述的第一表达框、第二表达框和第三表达框位于同一载体。

术语“载体”，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统、或其组合。优选地，所述的载体为病毒载体。

载体编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了其中插入本发明的表达框的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体，其特点是长期、稳定的整合目的基因至细胞中；可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞；低免疫原性；安全性高。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列，另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为脂质体转染法。核酸可与脂质相关联，与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

本发明提供了含有如上所述的免疫细胞以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方案中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³ -1×10⁸个细胞/ml，更优地1×10⁴~1×10⁷个细胞/ml。在一个实施方案中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

本发明包括用编码本发明核酸构建物的慢病毒载体转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可引起CAR-介导的T-细胞应答。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞，且CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。且本发明可以提高CAR-T细胞的活力持久性，不易耗竭，长时间维持抗肿瘤活性

在一个实施方案中，本发明的免疫细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，GPC3 CAR-T细胞引起抗表达GPC3的细胞的特异性免疫应答。

尽管本文公开的数据具体公开了包括GPC3的scFv、铰链和跨膜区、和4-1BB/CD28和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。

本发明免疫细胞的CAR-修饰T细胞的离体程序，以下中的至少一项在将细胞施用进入人体前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞人外周血中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰。CAR-修饰的细胞可被施用给接受者，以提供治疗益处。和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

本发明免疫细胞的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或与其他药物、药物组合物、稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

采用本发明免疫细胞制成的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度，并由临床方案确定。当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以1×10⁴~1×10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选1×10⁵ ~1×10⁶个细胞/kg体重的剂量施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

本发明的制剂的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方案中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方案中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方案中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方案中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方案中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方案中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个细胞，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

本发明免疫细胞的主要优点包括1、免疫细胞调控表达CAR，根据靶抗原存在与否调节，无靶抗原存在时，细胞降低或者不表达CAR，减少免疫细胞不必要的自我激活，使细胞更年轻，不易耗竭。2、区别于其他发明利用细胞因子优化培养工艺使细胞保持年轻的方式，此方法成本低，无需另外通过细胞因子优化。3、不需要外源的药物或者分子调节CAR的表达，避免了药物或者分子调节导致的时间滞后性。4、此调节性序列可以和任何靶.抗原的抗原结合区域结合，可用于治疗和预防的疾病范围广，且可和不同的免疫细胞结合，灵活性强。5、由于靶抗原控制CAR的表达，当靶抗原表达量很低时，不能激活CAR-T细胞的CAR的表达，所以申请单位认为此CAR-T可以降低on-target off-tumor毒性，具体结果需要进一步验证。

实施例1

本实施例免疫细胞的制备方法及功能验证包括以下步骤：

步骤一：外周血PBMC的分离和CAR-T细胞的扩增

从供体外周血中分离单核细胞，使用ficol进行密度梯度离心，并用T细胞分选试剂盒富集T细胞(CD3 MicroBeads, human - lyophilized，130-097-043)，使用偶联anti-CD3/anti-CD28的磁珠激活培养和扩增T细胞；培养基使用TexMACS GMP Medium(MiltenyiBiotec，170-076-309），含10％FBS，2mM L-glutamine，100IU/ml rhIL2，所有细胞均置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。

步骤二：细胞系培养

表达GPC3的细胞系：Huh-7(人肝癌细胞)，购自ATCC。

不表达GPC3的细胞系：A549(人非小细胞肺癌细胞)，购自ATCC。

包装用细胞：293T(人胚肾细胞系)，购自ATCC。

培养基培养：Huh-7、A549、293T使用DMEM培养基培养。所有培养基均添加10％(v/v)胎牛血清。

步骤三：CAR结构设计与慢病毒包装

GPC3-CAR结构，即靶向GPC3（磷脂酰肌醇蛋白聚糖3）的CAR结构：

本发明方法构建了第二代CAR及第三代CAR，CAR的核心结构包括分泌信号肽序列；来自anti-GPC3的抗体的scFv(专利号：US 2007/0190599 A1)；CD8/CD28跨膜区。根据胞内段共刺激信号的不同，共构建了3种GPC3-CAR，分别命名为4-1BB-CD3ζ、CD28-CD3ζ、CD28-4-1BB-CD3。其中4-1BB-CD3ζCAR的胞外区结构中带有可调控CAR的序列，其直接与跨膜结构相结合，可调控序列为两种，ILA和ILB；CD28-CD3ζ、CD28-4-1BB-CD3 CAR的胞外区结构中带有可调控CAR的序列，其直接与跨膜结构相结合，可调控序列为ILA，这三种CAR均用没有调控序列的CAR作为对照。如图1所示，为CAR的结构。根据胞内共刺激区域的不同分别命名，具体如表1所示：

表1 CAR-T细胞命名

命名	简称	共刺激区域	保内激活域	序列
					GC33-28z-CAR	GC33-28z	CD28	CD3ζ	5（GenBank: QHQ73567.1）
GC33-ILA-28z-CAR	GC33-ILA-28z	CD28	CD3ζ	1
					GC33-ILB-28z-CAR	GC33-ILB-28z	CD28	CD3ζ	4
GC33-BBz-CAR	GC33-BBz	4-1BB	CD3ζ	6
					GC33-ILA-BBz-CAR	GC33-ILA-BBz	4-1BB	CD3ζ	2
GC33-28BBz-CAR	GC33-28BBz	CD28+4-1BB	CD3ζ	7
					GC33-ILA-28BBz-CAR	GC33-ILA-28BBz	CD28+4-1BB	CD3ζ	3

将7种GPC3-CAR基因克隆至PHBLV慢病毒载体骨架中，置于EF1α(EF-1α)的启动子下，形成PHBLV-EF1α-GPC3-CAR，将PHBLV-EF1α-GPC3-CAR、慢病毒包膜质粒pMD2 .G(Addgene，Plasmid#12259)和慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene Plasmid#12260)三个质粒使用Lipofectamine3000转入293T中制备慢病毒完整表达载体；在48h和72h收集病毒上清，超离进行浓缩(Merck Millipore)；浓缩后的病毒即可用于感染T细胞。结果显示，利用7种GPC3-CAR基因，成功构建了7种慢病毒载体。

起调控作用的序列如下：

ILA:NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQL

ILB:NCRNTGPWLKK

步骤四：CAR-T细胞制备

4 .1慢病毒感染

分离纯化的原代T细胞在激活1天后，利用步骤三包装的7种慢病毒，按MOI(1-10)进行慢病毒载体感染，转移至细胞培养瓶，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。

4 .2细胞增殖及CAR阳性率检测

感染后第6、9、11、13天每天取样检测细胞数量，第6、13天分别检测T细胞的CAR阳性率，每隔1-2天传代补加培养基。

利用7种慢病毒载体，成功构建了7种CAR-T细胞，分别命名为GC33-BBz CAR-T、GC33-ILA-BBz CAR-T、GC33-ILB-BBz CAR-T、GC33-28z CAR-T、GC33-ILA-28z CAR-T、GC33-ILB-28z CAR-T、GC33-28BBz CAR-T、GC33-ILA-28BBz CAR-T、GC33-ILB-28BBz CAR-T，以不感染慢病毒的T细胞为对照（NT）

如图2和图3所示：9种CAR-T细胞的增殖速率，插入调控序列对于细胞的增值速率无显著影响。

如图4、图5、图6所示，9种CAR-T细胞的CAR阳性率。插入调控序列ILA/ILB对于细胞的CAR阳性率影响显著影响，CAR阳性率降低明显。

如图7所示，6种CAR-T细胞的CD69表达。实验分别检测了不同的CAR-T细胞自培养时，与GPC3+细胞共培养，与GPC3-细胞共培养6h时的CD69的表达，以不转导CAR的T细胞作为对照。

步骤5：细胞体外杀伤

对步骤4获得的6种CAR-T细胞进行体外杀伤实验。LDH法（promega：G1780）检测CAR-T细胞的杀伤效应，并检测CAR的表达。

如图8所示，CAR-T细胞与靶细胞分别以10:1、5:1、2：1、1:1共培养6h后，杀伤效率明显，有调控序列的CAR的杀伤率略有降低；

如图9所示，为CAR-T细胞的CAR表达率，说明有靶抗原时，CAR的表达会增加。

步骤6：细胞因子释放检测

将 CAR-T细胞(步骤4获得)与靶细胞(A549、Huh-7)分别以不同效靶比混合，置于RPMI培养基中，共培养24h，收集上清，离心后取上清检测细胞因子IFN-γ与IL2的释放水平，采用Elisa试剂盒(abbkine，KET6011、KET6014)进行检测。

结果如图10所示，与GPC3+靶细胞共培养后，CAR-T细胞会释放大量IFN-γ与IL-2，与GPC3-靶细胞共培养后，CAR-T细胞只少量分泌IFN-γ与IL-2。表明CAR-T能被肿瘤表面GPC3抗原有效且特异性的激活。

步骤7：长时间体外杀伤实验。

将不同的CAR-T细胞和靶细胞以3:1比例共培养，每隔5天进行细胞计数、流式检测CAR-T细胞的比例、再次补加靶细胞，使CAR-T细胞和靶细胞的比例为3:1，一共进行25天，如图11、12是CAR-T细胞的扩增数量。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广东先康达生物科技有限公司

<120> 一种免疫细胞及其制剂与应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 512

<212> PRT

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290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg

325 330 335

Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro

340 345 350

Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe

355 360 365

Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

370 375 380

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

385 390 395 400

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

405 410 415

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln

420 425 430

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

435 440 445

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

450 455 460

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

465 470 475 480

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

485 490 495

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

500 505 510

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

515 520 525

Claims

1.一种免疫细胞，其特征在于，表达CAR；所述CAR的表达被调控依赖于一段氨基酸序列，所述免疫细胞是在CAR的序列中添加一段氨基酸序列，所述氨基酸序列为NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQL，或者NCRNTGPWLKK，所述氨基酸序列在CAR的跨膜区域后面的结构如以下4种CAR结构中的任意一种：

（1）抗原结合区域—TM—氨基酸序列—costimulator—CD3e；

（2）抗原结合区域—hinge—TM—氨基酸序列—costimulator—CD3e；

（3）抗原结合区域—hinge—TM—氨基酸序列—costimulator—CD3e—K；

（4）抗原结合区域—TM—氨基酸序列—costimulator—CD3e—K；

其中，TM是任意跨膜区域，Hinge是铰链区，Costimulator是指共刺激区域；CD3e是指CD3e刺激区域，K是和CAR一同表达的任意蛋白、细胞因子或者趋化因子的一种或者多种的组合。

2.根据权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞为CAR-T、CAR-TIL、CAR-NK、CAR-NKT、CAR-gamma-deltaT中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞是能够靶向任何靶点的第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR、第四代CAR或者双CAR。

4.根据权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述Costimulator是指CD28、4-1BB和ICOS的一个或者多个的组合。

5.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1至4任一项所述的免疫细胞。

6.一种权利要求1至4任一项所述的免疫细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。