JP6356120B2 - Ｔｌｒ３結合剤 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年５月３１日に提出された米国仮特許出願第６１／６５３，６５２号明細書、２０１２年７月１１日に提出された米国仮特許出願第６１／６７０，２８９号明細書、及び２０１２年８月６日に提出された米国仮特許出願第６１／６７９，９２３号明細書の利益を請求する。尚、これら出願は全て、全図面を含むその全内容を参照として本明細書に組み込むものとする。
配列表の参照
本出願は、電子フォーマットの配列表と一緒に提出されている。この配列表は、サイズが４６ＫＢの２０１３年５月２９日に作成された「ＰＣＴ配列表ＴＬＲ３−４＿ＳＴ２５」という名称のファイルとして提供される。配列表の電子フォーマット中の情報は、参照として本明細書に組み込むものとする。
本発明は、ＴＬＲ３に結合して、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する抗体（例えば、モノクローナル抗体）、抗体フラグメント、及びその誘導体に関する。本発明はまた、このような抗体を産生する細胞；このような抗体を作製する方法；前記抗体のフラグメント、変異体、及び誘導体；これらを含む医薬組成物；前記抗体を用いて、疾患、例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患などを診断、治療又は予防する方法に関する。
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）トールタンパク質は、背腹パターン化を制御し、原始的な宿主防御機構を呈示すると考えられている。ヒトにおいて、ＴＬＲは、先天性免疫の重要な成分であると考えられている。ヒト及びショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）トールタンパク質配列は、タンパク質鎖の全長にわたって相同性を示す。ヒトトール様受容体のファミリーは、１０の高度に保存された受容体タンパク質、ＴＬＲ１−ＴＬＲ１０から構成される。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）トールと同様に、ヒトＴＬＲは、細胞外ドメインを含むＩ型膜貫通タンパク質であり、上記細胞外ドメインは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識するロイシンリッチ反復（ＬＲＰ）ドメインと、ヒトインターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体の細胞質ドメインと同族の細胞質ドメインから構成される。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）トール及びＩＬ−１受容体の両方についてのシグナル伝達と同様に、ヒトトール様受容体は、ＮＦ−κＢ経路を介してシグナル伝達する。
様々な哺乳動物のＴＬＲは、多くの共通した特徴及びシグナル伝達機構を有するが、それらの生物学的機能は非常に異なっている。これは、一部に、４つの異なるアダプター分子（ＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰ、ＴＲＩＦ及びＴＲＡＦ）が、様々な組合せでＴＬＲと関連して、異なるシグナル伝達経路を媒介するためである。さらに、１つのＴＬＲの様々なリガンドが、異なるシグナル伝達経路を優先的に活性化すると考えられる。さらにまた、様々な造血及び非造血細胞におけるＴＬＲの発現もそれぞれ異なっている。従って、ＴＬＲリガンドに対する応答は、ＴＬＲにより活性化されるシグナル伝達経路だけではなく、個別のＴＬＲが発現される細胞の性質によっても異なる。
ＴＬＲ３シグナル伝達は、炎症性及び自己免疫状態に関連していることから、トール様受容体３（ＴＬＲ３）は、治療標的として相当の関心を集めてきた。特許文献１は、ｈＴＬＲ３タンパク質の核酸及びアミノ酸配列を提供する。非特許文献１は、細胞表面ＴＬＲ３に結合させるための抗ＴＬＲ３抗体の使用を開示している。抗体Ｃ１１３０は、ＴＬＲ３に対して活性であることが示されており、特許文献２に記載されている。ＴＬＲ３を阻害したポリクローナル抗体は、非特許文献２に記載されている。特許文献３及び非特許文献３は、細胞表面ＴＬＲ３に結合して阻害するが、細胞コンパートメントＴＬＲ３には結合せず、又は骨髄細胞系列ＤＣにおいても結合しないことが報告されている抗体クローンＴＬＲ３．７（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）に相当する抗体を記載している。特許文献４は、細胞表面上にＴＬＲ３を発現することが報告されている上皮細胞において、サイトカイン産生を阻害すると報告されている抗体Ｃ１０６８を記載している。特許文献５は、更なる抗ＴＬＲ３抗体を提供する。研究に使用するための他の抗ＴＬＲ３抗体としては、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｒｐ．製のポリクローナル抗ＴＬＲ３抗体、 Ａｂｃａｍ製の抗体４０Ｃ１２８５、並びに抗体６１９Ｆ７、７１３Ｅ４、７１６Ｇ１０、ＩＭＧ−５６３１及び−ＩＭＧ−５３４８（全てＩｍｇｅｎｅｘ Ｃｏｒｐ製）が挙げられる。
しかし、現在入手可能な抗ＴＬＲ３抗体の中で、これらは、例えば、ＴＬＲ３をｉｎ ｖｉｖｏで調節することを目的とする治療薬としての使用に最適とは言えない。例えば、その多くが、効力又はそのエピトープに対する親和性の不足という欠点を有する。従って、ＴＬＲ３に対する改善された抗体を提供することが求められている。
本発明は、ヒトＴＬＲ３に特異的に結合してその機能を阻害するモノクローナル抗体（限定するものではないが、抗体フラグメント、及び誘導体など）を含む新規組成物、およびそれを用いる方法の発見から生まれた。
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏでＴＬＲ３をターゲティングする上で有用な新しい特性を有する抗体を提供する。ＴＬＲ３は、その天然のリガンド（ｄｓＲＮＡ）に結合して、マクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）内のエンドソーム中にのみ（酸性ｐＨで）シグナル伝達することから、抗体は、これまで、シグナル伝達が起こるエンドソームｐＨでの高い親和性に基づいて選択されてきた。しかし、抗ＴＬＲ３抗体が細胞に進入する機構についてはまだほとんどわかっていない。本発明は、細胞表面に、ｐＨ中性環境で、露出したＴＬＲ３に対し強力な結合を有し、ＴＬＲ３阻害に向上した効力を発揮する抗体を提供する。このように、細胞表面に発現したＴＬＲ３の結合の最適化は、細胞による細胞（エンドソーム）取込みのための重要な基準となり得、これにより下流（又は全体）の生物活性を条件付けすることが可能になる。本抗体は、ＴＬＲ３が中性ｐＨ条件で細胞表面にのみ発現されるアッセイにおいて観察されるように、ヒト細胞表面ＴＬＲ３に対する強力な結合を示す。このようにして、向上した細胞表面結合を有する抗体を選択した。従って、抗ＴＬＲ３抗体の阻害活性は、受容体がそのリガンドから分離したら、エンドサイトーシスに関与するエンドソームＴＬＲ３ポリペプチドの細胞表面に再度循環させることにより制御することができる。
本発明の一形態では、本発明は、ＴＬＲ３発現細胞におけるＴＬＲ３媒介シグナル伝達を阻害する抗体を提供し、ここで、この抗体は、任意に中性ｐＨで、細胞の表面にのみ発現されるヒトＴＬＲ３ポリペプチドに特異的に結合する。任意に、抗体は、細胞表面にのみＴＬＲ３を発現する細胞との結合について、０．３μｇ／ｍｌ以下、任意に０．２μｇ／ｍｌ以下、任意に０．１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０を有する。
一形態において、本発明は、少なくとも一部が（又は主として、若しくは排他的に）ＴＬＲ３ポリペプチドのグリカンフリー外側面（ｄｓＲＮＡによって結合される面）上に、並びに任意に、さらに少なくとも部分的にヒトＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端ｄｓＲＮＡ結合部位内で、ＴＬＲ３タンパク質のＮ末端部分に結合する抗体を提供する。任意に、抗体はさらに、少なくとも部分的にＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端部分の骨格内でＴＬＲ３に結合する。
ＴＬＲ３上のいくつかの以前のエピトープは、ＴＬＲ３の有効な阻害に有用であることが明らかにされているが、エピトープは、非ヒト霊長類に必ずしも依然として存在しているわけではない。一形態では、本発明は、ヒトＴＬＲ３タンパク質のＮ末端部分との結合によりＴＬＲ３ポリペプチド活性を阻害し、しかも非ヒト霊長類ＴＬＲ３にも結合する抗体を提供する。一形態では、本発明は、ＴＬＲ３タンパク質のＮ末端部分に結合し、かつ、ヒトＴＬＲ３との結合についてｄｓＲＮＡと競合しない抗体を提供するが、ここで、前記抗体は、非ヒト霊長類ＴＬＲ３ポリペプチドにも結合する（非ヒト霊長類ＴＬＲ３発現細胞において）。一形態では、本発明は、ＴＬＲ３タンパク質のＮ末端部分に結合し、かつ、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端ｄｓＲＮＡ結合部位との結合についてｄｓＲＮＡと競合する抗体を提供するが、ここで、前記抗体は、非ヒト霊長類ＴＬＲ３ポリペプチドにも結合する（非ヒト霊長類ＴＬＲ３発現細胞において）。一実施形態において、少なくとも一部が（又は主として、若しくは排他的に）ＴＬＲ３ポリペプチドのグリカンフリー外側面（ｄｓＲＮＡと結合した面）上の抗体。一実施形態において、抗体は、少なくとも部分的にヒトＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端ｄｓＲＮＡ結合部位内でＴＬＲ３に結合する。一実施形態において、非ヒト霊長類はカニクイザル（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）である。一実施形態において、非ヒト霊長類ＴＬＲ３ポリペプチドは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＡＧ５５０３３（配列番号２）に示すアミノ酸配列を含む。
一形態において、本発明は、特に、配列番号１のヒトＴＬＲ３の残基４１〜２５１、任意に少なくとも部分的に残基４１〜１３９、４１〜１２０又は残基４１〜８９内で、ヒトＴＬＲ３タンパク質のＮ末端部分に結合する抗体を提供する。
一形態において、本発明は、ヒトＴＬＲ３タンパク質のＮ末端部分に結合する抗体を提供し、ここで、前記抗体は、この抗体と配列番号１の野生型ＴＬＲ３ポリペプチド同士の結合に比して、配列番号１の残基４１〜１３９に対応するセグメント内のＮ末端部分に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有する。
任意に、本発明の抗体は、ｄｓＲＮＡとヒトＴＬＲ３ポリペプチドの末端ｄｓＲＮＡ結合部位との結合を妨害する。任意に、抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドとｄｓＲＮＡの結合に関与するＴＬＲ３ポリペプチドのグリカンフリー外側面内の１つ又は複数のアミノ酸残基、及び／又はそれに隣接する残基に結合する。
任意に、抗体は、配列番号１の残基６４及び／又は残基６５を含むエピトープに結合し、及び／又は配列番号１の残基６４及び／又は残基６５に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有する。任意に、抗体は、配列番号１の残基８６及び／又は残基８９を含むエピトープに結合し、及び／又は配列番号１の残基８６及び／又は残基８９に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有する。任意に、抗体は、配列番号１の残基１１７及び／又は残基１２０を含むエピトープに結合し、及び／又は配列番号１の残基１１７及び／又は残基１２０に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有する。任意に、抗体は、配列番号１の残基１３７及び／又は残基１３９を含むエピトープに結合し、及び／又は配列番号１の残基１３７及び／又は残基１３９に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有する。任意に、抗体は、配列番号１の残基１１２、１１３及び／又は残基１１５を含むエピトープに結合し、及び／又は配列番号１の残基１１２、１１３及び／又は１１５に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有する。
一実施形態において、抗体は、配列番号１の残基１１７及び／又は残基１２０に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合、並びに配列番号１の残基１３７及び／又は残基１３９に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有する。任意に、抗体は、配列番号１の残基１１７及び／又は残基１２０に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有し、しかも、配列番号１の残基１３７及び／又は残基１３９に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有さない。
一実施形態において、抗体は、配列番号１の残基６４及び／又は残基６５に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合、並びに配列番号１の残基１３７及び／又は残基１３９に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有する。任意に、抗体は、配列番号１の残基８６及び／又は残基８９に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合、並びに配列番号１の残基１３７及び／又は残基１３９に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有する。任意に、抗体は、配列番号１の残基１１７及び／又は残基１２０に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有さない。任意に、抗体は、配列番号１の残基１１２、１１３及び／又は１１５に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有さない。
任意に、抗体は、配列番号１の残基６４及び／又は残基６５に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチド、配列番号１の残基８６及び／又は残基８９に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチド、配列番号１の残基１３７及び残基１３９に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有する。ＴＬＲ３突然変異体との結合によって証明されるように、抗体は、これまで記載されている抗体とはそのエピトープが異なる。
一実施形態において、抗体は、配列番号１の残基１１２、１１３及び／又は１１５に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合、並びに配列番号１の残基１３７及び／又は残基１３９に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有する。一実施形態において、抗体は、配列番号１の残基１１２、１１３及び／又は１１５に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合、並びに配列番号１の残基１１７及び／又は残基１２０に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有する。一実施形態において、抗体は、配列番号１の残基１１２、１１３及び／又は１１５に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合、配列番号１の残基１１７及び／又は残基１２０に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合、並びに配列番号１の残基１３７及び／又は残基１３９に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有する。一実施形態において、抗体は、配列番号１の残基１１２及び／又は１１３に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合、並びに配列番号１の残基１３７に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有する。任意に、抗体は、配列番号１の残基８６及び／又は残基８９に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有さない。任意に、抗体は、配列番号１の残基６４及び／又は６５に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有さない。
任意に、本明細書に記載する実施形態のいずれかにおいて、抗体は、配列番号１の残基１１６、１４５、１８２、１９６及び／又は１７１に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの結合を維持する（該ＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有さない）。
一形態において、本発明は、ｄｓＲＮＡとヒトＴＬＲ３ポリペプチドとの結合を妨害する抗体を提供する。一形態において、本発明は、ｄｓＲＮＡと、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端ｄｓＲＮＡ結合部位との結合を妨害する抗体を提供する。任意に、抗体は、ヒトＴＬＲ３ポリペプチド、例えば、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドのｄｓＲＮＡ結合部位との結合について、ｄｓＲＮＡと競合する。競合は、標準的方法、例えば、抗体が、ｄｓＲＮＡの存在下で固定化ＴＬＲ３と結合するかどうか、及び／又はｄｓＲＮＡが、酸性条件下、抗体の存在下で固定化ＴＬＲ３と結合するかどうかを評価するＢｉａｃｏｒｅアッセイを用いて、評価することができる。
任意に、以下：（ｉ）抗ＴＬＲ３抗体をＴＬＲ３ポリペプチドと接触させて、ＴＬＲ３ポリペプチドに結合した抗体を取得するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の抗体結合ＴＬＲ３ポリペプチドをｄｓＲＮＡと接触させた後、ｄｓＲＮＡが、ＴＬＲ３ポリペプチドと前記抗体との結合を低減するかどうかを評価するステップを含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドとの結合について抗体をｄｓＲＮＡと競合させるが、ここで、結合が低減していれば、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドに対するｄｓＲＮＡとの競合を示す。任意に、以下：（ｉ）抗ＴＬＲ３ポリペプチドをｄｓＲＮＡと接触させて、ＴＬＲ３ポリペプチドに結合したｄｓＲＮＡを取得するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）のｄｓＲＮＡ結合ＴＬＲ３ポリペプチドを抗ＴＬＲ３抗体と接触させた後、ＴＬＲ３ポリペプチドが、ｄｓＲＮＡ−ＴＬＲ３ポリペプチド複合体と結合するかどうかを評価するステップを含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドとの結合について抗体をｄｓＲＮＡと競合させるが、ここで、実質的結合が欠如していれば、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドに対するｄｓＲＮＡとの競合を示す。任意に、以下：（ｉ）抗ＴＬＲ３抗体を固体支持体に結合させる（例えば、定常ドメインを介して）ステップ、（ｉｉ）前記抗体をＴＬＲ３ポリペプチドと接触させて、ＴＬＲ３ポリペプチドに結合した抗体を取得するステップ、並びに（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の抗体結合ＴＬＲ３ポリペプチドをｄｓＲＮＡと接触させた後、ｄｓＲＮＡが、ＴＬＲ３ポリペプチドと前記抗体との結合を低減するかどうかを評価するステップを含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドとの結合について抗体をｄｓＲＮＡと競合させるが、ここで、結合が低減していれば、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドに対するｄｓＲＮＡとの競合を示す。
本発明の実施形態のいずれかの一形態において、抗体は、細胞の表面で発現されるヒトＴＬＲ３ポリペプチドに結合し、任意に、中性ｐＨ下で細胞表面にのみＴＬＲ３を発現する細胞において評価されるように、ＴＬＲ３を発現する細胞中にインターナライズして、細胞（例えば、ＴＬＲ３発現ヒト樹状細胞）内でのＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する。
一形態において、抗体は、中性の条件下、特に、細胞サイトゾルにみられるものの典型的条件下で、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドに結合する。このような中性条件は、一般に、６．６〜７．４のｐＨ、例えば、細胞サイトゾルに認められる７．２のわずかにアルカリ性のｐＨを特徴とする。任意に、抗体は、中性ｐＨでのＴＬＲ３ポリペプチドとの結合について、１０−９Ｍ以下、任意に１０−１０Ｍ以下、任意に１０−１１Ｍ以下のＫＤを有する。任意に、中性条件での結合は、酸性条件下より優れた親和性のものであり、例えば、酸性条件と比較した中性でのＴＬＲ３との結合についてのＫＤは、少なくとも０．５−、１．０−、１．５−又は２．０−ｌｏｇ１０低い。
本発明は、さらに、これまで報告されている抗体に比して増大した活性を有する特定の抗体を提供する。本発明の実施形態のいずれかの一形態では、抗体は、任意選択により酸性及び／又は中性条件下で、モノクローナル抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４及び３７Ｂ７のいずれか１つ若しくはそのいずれかの組合せと、ＴＬＲ３ポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトＴＬＲ３ポリペプチド）との結合について競合する。一実施形態において、本発明の抗体は、任意選択により酸性及び／又は中性条件下で、配列番号３及び４のＶＨ及びＶＬ領域（１１Ｅ１）、配列番号１４及び１５のＶＨ及びＶＬ領域（３１Ｆ６）、配列番号２５及び２６のＶＨ及びＶＬ領域（３２Ｃ４）、配列番号３６及び３７のＶＨ及びＶＬ領域（３７Ｂ７）又は配列番号４７及び４８のＶＨ及びＶＬ領域（７Ｇ１１）をそれぞれ有する抗体と、ＴＬＲ３ポリペプチドとの結合について競合する。本発明の実施形態のいずれかの一形態では、抗体は、抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４及び３７Ｂ７の１つ、２つ若しくは３つのＣＤＲを有する重鎖及び／又は軽鎖を有してもよい。
一形態において、ＴＬＲ３に特異的に結合する抗体は、以下の特性の１つ又は複数（そのいずれかの組合せ、又はその全部）を有する：
ａ．配列番号１及び／又は２のアミノ酸配列を含むＴＬＲ３ポリペプチドに結合する：
ｂ．細胞の表面にのみ発現されるヒトＴＬＲ３ポリペプチドに特異的に結合し、この際、抗体は、細胞表面にのみＴＬＲ３を発現する細胞との結合について、０．３μｇ／ｍｌ以下、任意に０．２μｇ／ｍｌ以下、任意に０．１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０を有する；
ｃ．その表面にＴＬＲ３を発現する細胞中にインターナライズする；
ｄ．中性ｐＨ、例えば、約ｐＨ７．２のｐＨで、ＴＬＲ３ポリペプチドに対するサブナノモルレベルでの親和性を有する；
ｅ．酸性ｐＨ、例えば、約ｐＨ６．５未満のｐＨ、又は約４．５〜６．５若しくは約ｐＨ５．６で、ＴＬＲ３ポリペプチドに対するサブナノモルレベルでの親和性を有する；
ｆ．ＴＬＲ３リガンドの存在下で、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する；
ｇ．例えば、ＩＦＮαなどの炎症性サイトカインの存在下で、炎症性バックグラウンドにおいてＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する；
ｈ．ＴＬＲ３ポリペプチドとの結合について、抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４又は３７Ｂ７と競合する；
ｉ．ＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端部分との結合についてｄｓＲＮＡと競合する；
ｊ．配列番号１の残基６４及び／若しくは残基６５に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合、並びに／又は配列番号１の残基８６及び／若しくは残基８９に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有する；
ｋ．配列番号１の残基１１７及び／若しくは残基１２０に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合、並びに／又は配列番号１の残基１３７及び／若しくは残基１３９に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有し、並びに／又は配列番号１の残基１１２、１１３及び／若しくは残基１１５に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有する；並びに／又は
ｌ．配列番号１のＴＬＲ３ポリペプチドの残基４１〜２５１、４１〜８９、４１〜１２０若しくは４１〜１３９に対応するセグメントにおける少なくとも１、２、３、４、５、６、７又は８個以上の残基に結合する。
一形態において、本発明は、配列番号１のＴＬＲ３ポリペプチドの残基１〜２５１、任意に４１〜２５１、４１〜８９、４１〜１２０若しくは４１〜１３９に対応するセグメントにおける少なくとも１、２、３、４、５、６、７又は８個以上の残基に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。任意に、抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドによるシグナル伝達を阻害する。任意に、抗体は、配列番号１のＴＬＲ３ポリペプチドの残基１１６、残基１４５及び／又は残基１８２に結合しない。任意に、抗体は、配列番号１のＴＬＲ３ポリペプチドの残基１７１及び／又は残基１９６に結合しない。任意に、抗体と、配列番号１のＴＬＲ３ポリペプチドの残基１１６、１４５、１８２、１９６及び／又は残基１７１に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの結合が、配列番号１の野生型ＴＬＲ３ポリペプチドとの結合と比較して、維持され；好ましくは、前記突然変異は、Ｋ１４５Ｅ、Ｄ１１６Ｒ、Ｋ１８２Ｅ、Ｎ１９６Ａ及び／又はＥ１７１Ａ突然変異である。このような抗体は、さらに、本明細書に記載するいずれかの特性、例えば酸性ｐＨでのＴＬＲ３ポリペプチドに対するサブナノモルレベルの親和性を有し、ＴＬＲ３リガンドの存在下で、若しくは炎症性バックグラウンドにおいて（例えば、ＩＦＮαなどの炎症性サイトカインの存在下で）ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害し、ＴＬＲ３ポリペプチドとの結合について１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７と競合するか；ＴＬＲ３ポリペプチドのＣ末端部位との結合についてｄｓＲＮＡと競合しないか；又は、ＤＣ上でのＩＰ−１０分泌（例えば、ヒト骨髄ＤＣ内の）を阻害する。このような抗体は、さらにまた本発明の方法のいずれかで用いることもできる。
一実施形態において、本発明は、ＴＬＲ３ポリペプチドに結合する抗体を提供し、ここで、抗体は、（ｉ）配列番号５、６若しくは７（ＨＣＤＲ１）、８若しくは９（ＨＣＤＲ２）及び１０（ＨＣＤＲ３）に示す重鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列、並びに（ｉｉ）配列番号１１、１２及び１３にそれぞれ示す軽鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列を含み；前記配列のいずれかにおける１、２、３、４、又は５個以上のアミノ酸を異なるアミノ酸により置換してもよい。一実施形態において、抗体は、（ｉ）配列番号１６、１７若しくは１８（ＨＣＤＲ１）、１９若しくは２０（ＨＣＤＲ２）及び２１（ＨＣＤＲ３）に示す重鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列、並びに（ｉｉ）配列番号２２、２３及び２４にそれぞれ示す軽鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列を含み；前記配列のいずれかにおける１、２、３、４、又は５個以上のアミノ酸を異なるアミノ酸により置換してもよい。一実施形態において、抗体は、（ｉ）配列番号２７、２８若しくは２９（ＨＣＤＲ１）、３０若しくは３１（ＨＣＤＲ２）及び３２（ＨＣＤＲ３）に示す重鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列、並びに（ｉｉ）配列番号３３、３４及び３５にそれぞれ示す軽鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列を含み；前記配列のいずれかにおける１、２、３、４、又は５個以上のアミノ酸を異なるアミノ酸により置換してもよい。一実施形態において、抗体は、（ｉ）配列番号３８、３９若しくは４０（ＨＣＤＲ１）、４１若しくは４２（ＨＣＤＲ２）及び４３（ＨＣＤＲ３）に示す重鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列、並びに（ｉｉ）配列番号４４、４５及び４６にそれぞれ示す軽鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列を含み；前記配列のいずれかにおける１、２、３、４、又は５個以上のアミノ酸を異なるアミノ酸により置換してもよい。一実施形態において、抗体は、（ｉ）配列番号４９、５０若しくは５１（ＨＣＤＲ１）、５２若しくは５３（ＨＣＤＲ２）及び５４（ＨＣＤＲ３）に示す重鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列、並びに（ｉｉ）配列番号５５、５６及び５７にそれぞれ示す軽鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列を含み；前記配列のいずれかにおける１、２、３、４、又は５個以上のアミノ酸を異なるアミノ酸により置換してもよい。
別の実施形態において、本明細書に記載する実施形態のいずれかの抗体は、表面にＴＬＲ３ポリペプチドを発現させる細胞によりインターナライズさせることができる。
一実施形態において、抗体は、キメラ抗体であり、例えば、非マウスの、任意にヒトの定常領域を含む。一実施形態において、抗体は、ヒト抗体であるか、又はヒト化されている。別の実施形態において、抗体は、マウス若しくはラット抗体である（例えば、ラット若しくはラット遺伝子又はラットＩｇ遺伝子座遺伝子セグメント由来のＣＤＲを含む）。別の実施形態において、抗体は、実質的に他のヒトＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ４）に結合しない。
本発明の実施形態のいずれかの一形態において、抗体のアイソタイプは、ＩｇＧ、任意にＩｇＧ１又はＩｇＧ３である。一実施形態において、抗体は、Ｆｃドメインを含むか、又はＦｃγＲが結合したアイソタイプのものである。
本発明の実施形態のいずれかの一形態において、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、一本鎖抗体フラグメント、又は複数の異なる抗体フラグメントを含む多重抗体から選択される抗体フラグメントである。本発明の実施形態のいずれかの一形態において、抗体は、Ｆｃドメインを含まないかまたはＦｃγＲが実質的に結合していないアイソタイプ（例えば、ヒトＣＤ１６）のものである。一実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ４又はＩｇＧ２アイソタイプのものである。そのＦｃγＲ結合を低減するように修飾されたヒトＩｇＧ４アイソタイプ又は他のＩｇＧアイソタイプは、例えば、ＤＣにおいて、細胞死を誘導することなく、ＴＬＲ３シグナル伝達を調節しながら、血清半減期などの有利な薬学的特性のために用いることができる。本発明の実施形態のいずれかの一形態において、抗ＴＬＲ３抗体は、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害し、ヒトＩｇＧ４又はＩｇＧ２アイソタイプの定常領域を含む。本発明の実施形態のいずれかの一形態において、抗ＴＬＲ３抗体は、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害し、ＦｃγＲＩＩＩａに実質的に結合しない定常領域（重鎖定常領域）を含む。
好ましい実施形態において、抗ＴＬＲ３抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプの重鎖を含む。一実施形態において、抗ＴＬＲ３抗体は、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域を含み、ＥＵインデックス（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，５ｔｈ ｅｄ．，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＬ，１９９１）に従う２２８位に対応する残基２４１にセリンからプロリンへの突然変異を含む。このような抗体を含む組成物は、ＩｇＧ４「半抗体」（単一の重鎖／軽鎖対を含む）の約１５％未満、例えば、約１０％未満（例えば、約５％以下、約４％以下、約３％以下、あるいは約１％以下）を有することを特徴とするものでよい。このようなＩｇＧ４「半抗体」副産物は、分泌されたヒトＩｇＧ４の一部におけるヒンジ領域での重鎖間ジスルフィド架橋の異種性によって形成される（ＩｇＧ４「半抗体」、Ｓ２４１Ｐ突然変異、及び関連する原理については、Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３０（１）：１０５−１０８，１９９３を参照）。この作用は、典型的に、変性、非還元条件下でのみ検出可能である。
別の実施形態において、抗体は、検出可能な、又は有毒部分にコンジュゲートさせるか、又は共有結合させる。
一形態において、抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドの主要（すなわち、Ｃ末端）ｄｓＲＮＡ結合部位に対するｄｓＲＮＡ ＴＬＲ３リガンドの結合を阻止することなく、任意選択によりＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する。
一形態において、抗体はまた、酸性条件下、特に、細胞の酸性化細胞内コンパートメント（例えば、エンドソーム、リソソームのエンドサイトーシス経路のコンパートメント）にみられるものに典型的な条件下でも、ヒトＴＬＲ３に結合する。このような酸性条件は、一般に、約ｐＨ６．５未満のｐＨ、又は約ｐＨ４．５〜６．５若しくはｐＨ５．６を特徴とする。
本発明の実施形態のいずれかの一形態において、抗体は、細胞の酸性化細胞内コンパートメント（例えば、エンドソーム、リソソームのエンドサイトーシス経路のコンパートメント）において、ＴＬＲ３シグナル伝達を調節し、任意に阻害する。
本発明の実施形態のいずれかの一形態において、抗体は、樹状細胞（ＤＣ）（例えば、骨髄ＤＣ、単球細胞由来のＤＣ）におけるＴＬＲ３シグナル伝達を調節し、任意に阻害する。
本明細書の実施形態のいずれかの他の形態において、中性及び／又は酸性条件下でのＴＬＲ３抗体の二価結合親和性は、任意に約１００、５０、１０、５、若しくは１ナノモル以下（すなわち、これらより優れた親和性）、好ましくは、ナノモル未満、又は任意に約５００、２００、１００若しくは１０ピコモル以下の平均ＫＤを特徴とし得る。
本発明に記載する実施形態のいずれかの他の形態において、抗体は、ＴＬＲ３リガンドとＴＬＲ３ポリペプチドの結合を少なくとも部分的に（又は完全に）阻止することにより、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する。ＴＬＲ３リガンドは、一般に抗ＴＬＲ３抗体以外のリガンドであり、天然又は非天然のＴＬＲ３リガンド、任意にｄｓＲＮＡベースのリガンド、例えば、ｐｏｌｙＡＵ（ポリアデニル酸：ポリウリジン酸）又はｐｏｌｙＩＣ（ポリイノシン酸：ポリシチジル酸）であってよい。
別の形態において、哺乳動物被験者においてＴＬＲ３ポリペプチドに特異的に結合し、これを阻害する抗体を同定し、スクリーニング及び／又は生成する方法を提供し、前記方法は、ａ）任意に、ＴＬＲ３ポリペプチドを含む免疫原で非ヒト哺乳動物を免疫することを含む方法により、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドに結合する複数の抗体を用意するステップと、（ｂ）細胞表面にのみヒトＴＬＲ３を発現する細胞において、ＴＬＲ３ポリペプチドに対する前記抗体の結合親和性を評価するステップを含む。任意に、本方法はさらに、前記複数の抗体から、細胞表面にのみヒトＴＬＲ３を発現する細胞との結合について、０．３μｇ／ｍｌ以下、任意に０．２μｇ／ｍｌ以下、任意に０．１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０を有する抗体を選択するステップをさらに含む。
本発明の方法のいずれかは、特に「発明を実施するための形態」に記載のものを含む）本出願に記載するいずれかのステップを含むことをさらに特徴とする。本発明はさらに、本方法のいずれかにより取得が可能な抗体に関する。本発明はさらに、本発明の抗体の医薬又は診断用製剤にも関する。本発明はさらに、任意に、第２治療薬（例えば、コルチコイド、ＤＭＡＲＤ、抗サイトカイン又は抗サイトカイン受容体薬剤、抗ＴＮＦα剤など）と併用して、治療又は診断で抗体を用いる方法にも関する。
前記及びそれ以外の有利な態様及び特徴が、本明細書のいずれかにさらに記載されている場合もある。
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄは、それぞれ抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、及び３２Ｃ４について、ＴＬＲ３ ＥＣＤ構築物で一時的にトランスフェクトし、細胞表面にのみヒトＴＬＲ３を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞との結合に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ用量作用を示す。各抗体を標準抗体３１Ｃ３と比較する；細胞表面ＴＬＲ３との結合は、抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３２Ｃ４及び３１Ｆ６について向上している。 図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ及び２Ｅは、ヒト抗ＴＬＲ３抗体による２９３ＴヒトＴＬＲ３ルシフェラーゼアッセイを用いたＴＬＲ３シグナル伝達の用量依存的阻害を示す。各抗体を標準抗体３１Ｃ３と比較する；ｄｓＲＮＡ誘導ＴＬＲ３シグナル伝達の阻害は、抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３２Ｃ４、３１Ｆ６及び３７Ｂ７について向上している。 図２Ｆ、２Ｇ及び２Ｈは、ＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端の図を示し、これらは、黒色で表示する突然変異したアミノ酸残基と、灰色で、主要エピトープの一部を形成する残基に隣接する残基を示している。図２Ｆは、図の右側にＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端を有するＴＬＲ３ポリペプチドのグリカンフリー外側面の図を示し；図２Ｇは、ＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端が前景（図の左側）にある、ＴＬＲ３ポリペプチド及び骨格のグリカンフリー外側面の図を示す。図２Ｈは、ＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端が前景（図の右側）にある、ＴＬＲ３ポリペプチド及び骨格のグリカンフリー外側面の図を示す。 リウマチ様関節炎マウスモデルの結果を示す。図３Ａは、予防的リウマチ様関節炎マウスモデルの結果を示す。図３Ｂは、治癒的リウマチ様関節炎マウスモデルの結果を示す。図３Ｃは、マウスをＰＢＳ、対照抗体、２８Ｇ７及び抗ＴＮＦα抗体（Ｈｕｍｉｒａ（商標））で処置したときの治癒的リウマチ様関節炎マウスモデルの結果を示す。 マウス大腸炎モデルの結果を示す。図４Ａは、食塩水（黒い丸）、ＴＮＢＳのみ（黒い四角）、抗ＴＮＦα抗体とＴＮＢＳ（黒い三角）、２８Ｇ７とＴＮＢＳ（白い丸）、及び対照ＡｂとＴＮＢＳ（白い四角）で処置したマウスの肉厚測定値を示す。図４Ｂは、食塩水（黒い丸）、ＴＮＢＳのみ（黒い四角）、抗ＴＮＦα抗体とＴＮＢＳ（黒い三角）、２８Ｇ７とＴＮＢＳ（白い丸）、及び対照ＡｂとＴＮＢＳ（白い四角）で処置したマウスの肉眼での損傷スコアを示す。本発明の抗ＴＬＲ３抗体は、緊縮条件下で疾患の発症を改善する（食塩水に対し＊ｐ＜０．０５、＊ｐ＜０．００１）。 ＣＯＰＤマウスモデルの結果を示す。図５Ａは、マクロファージ、好酸球、好中球及びリンパ球についてのＢＡＬ細胞分画（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｓ）を示す。抗ＴＬＲ３抗体は、気道への好中球の浸潤を強力に低減したが、マクロファージ、好酸球又はリンパ球には実質的に影響を与えなかった。図５Ｂは、ＬＰＳ／エラスターゼ単独、及び抗ＴＬＲ３抗体又はロフルミラストと併用したＬＰＳ／エラスターゼの各々についての静脈血飽和酸素（％）を示す。図５Ｃは、ＢＡＬ液（ＢＡＬＦ）中のＩＬ１７Ａを示し、ここで、抗ＴＬＲ３抗体は、ＩＬ１７Ａ（ｐｇ／ｍｌ）を実質的に減少させ、しかもロフルミラストと同程度であった。図５Ｄは、ＢＡＬＦ中のＩＰ−１０を示し、ここで、−ＴＬＲ３抗体は、ＩＰ−１０（ｐｇ／ｍｌ）を実質的に減少させた。図５Ｅは、抗ＴＬＲ３抗体（２８Ｇ７）、ロフルミラスト（Ｒｏｆｕ）及びロフルミラストと抗ＴＬＲ３抗体との併用薬（ｃｏｍｂｏ）を比較する第２試験のためのマクロファージ、好中球及びリンパ球のＢＡＬ細胞分画（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｓ）を示す。 ＣＬＰ（盲腸結紮穿刺−敗血症）マウスモデルの結果を示す。この急性モデルでは、マウスは、敗血症性ショックによく似た急性感染を呈する。 図７Ａ及び７Ｂは、それぞれデキサメタゾン又はＨｕｍｉｒａ（登録商標）と組み合わせて抗ヒトＴＬＲ３ｍＡｂ（標識ＩＰＨ３３．１）を含む薬剤併用の結果を示す。抗体は各々、デキサメタゾン又はＨｕｍｉｒａ（登録商標）と併用すると、さらに、ｐｏｌｙＩＣに応答したＰＢＭＣによるＩＰ−１０産生をｉｎ ｖｉｔｒｏで実質的に低減する。
概論
本発明は、少なくとも部分的に、ＴＬＲ３シグナル伝達経路を特異的かつ有効的に阻害する高親和性モノクローナル抗体の発見に基づくものである。本発明はまた、抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４及び／又は３７Ｂ７により認識されるエピトープなどのヒトＴＬＲ３上に存在する新規エピトープも提供し、これらは、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害すると共に、ＴＬＲ３リガンドによる刺激に応答するサイトカイン放出を阻害する上で特に有効である。
本抗体は、治療を必要とする被験者における自己免疫又は炎症性疾患を治療するのに用いることができる。本発明はまた、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する抗ＴＬＲ３抗体を用いて、治療を必要とする被験者における炎症性又は自己免疫疾患の過程で起こる再発、発作、又は急性期を治療するための方法も提供する。本発明はまた、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する抗ＴＬＲ３抗体を用いて、治療を必要とする被験者における定着した炎症性又は自己免疫疾患を治療するための新規の方法も提供する。本発明はまた、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する抗ＴＬＲ３抗体を用いた治療を必要とする被験者における炎症性又は自己免疫疾患の治療に使用することができる治療法及び／又は併用治療も提供する。
酸性及び中性条件下でＴＬＲ３に結合する本発明の抗体は、一般に、ＴＬＲ３をターゲティング（例えば、調節）するのが有用なあらゆる状況（例えば、疾患の治療又は予防）に有用となるように、高い親和性で細胞表面ＴＬＲ３及びエンドソームＴＬＲ３の両方に結合する。ＴＬＲ３は、炎症のいくつかの症例で、マクロファージの表面上に認められているが、エンドソーム酸性化をクロロキンで中和してＴＬＲ３を阻止すると、ある程度の抗炎症作用を呈示した（Ｃａｖａｓｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．２００８、前掲）。しかし、本発明の抗体は、サイトゾル（例えば、エンドソーム）コンパートメント内のＴＬＲ３によるシグナル伝達の調節（例えば、阻害）が有用又は必要である疾患の治療又は予防において他の抗体に対し最も優れた利点を有するものであり、このようなコンパートメントＴＬＲ３のシグナル伝達を調節することの相対的重要性は、疾患に応じて変わり得る。このような疾患の一例として、リウマチ様関節炎があり；エンドソーム酸化の阻害剤であるクロロキンによる治療は、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害し、リウマチ様関節炎を有する患者由来の滑液培養物からの炎症性サイトカインの産生を阻害することから、エンドソームコンパートメント発現ＴＬＲ３は、リウマチ様関節炎において重要な役割を果たすと考えられる（Ｓａｃｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：８００２−８００９）。ＤＣ（例えば、髄質ＤＣ）が疾患の追発に関与するいくつかの他の疾患において、エンドソームコンパートメント発現ＴＬＲ３は、重要な役割を果たすと考えられる。というのは、ｍＤＣは、急性炎症中の組織壊死時などのアポトーシス又は壊死細胞からの抗原を取り込む能力を有する（これは文献に詳細に記載されている）ためである。
本抗体は、ＴＬＲ３に特異的であるため、ＴＬＲ３又はＴＬＲ３発現細胞の精製、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、若しくはｉｎ ｖｉｖｏでのＴＬＲ３受容体の調節（例えば、活性化若しくは阻害）、ｉｎ ｖｉｖｏでの破壊のためのＴＬＲ３発現細胞のターゲティング、又はｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＬＲ３の特異的な標識／結合などの他の目的にも用いることができ、これらは、免疫ブロッティング、ＩＨＣ解析、すなわち凍結生検、ＦＡＣＳ分析、及び免疫沈降などの方法に用いられる。
定義
本明細書で用いる「ＴＬＲ３リガンド」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、若しくはｉｎ ｖｉｖｏでＴＬＲ３に特異的に結合して、その活性を改変することができる任意の化合物を指す。この化合物は、天然に存在するリガンド、例えば、一般にｄｓＲＮＡ若しくはウイルス性ｄｓＲＮＡ、又はｐｏｌｙＩＣ若しくはｐｏｌｙＡＵなどの合成リガンドであってよい。化合物は、無機若しくは有機化合物又は要素などの任意のタイプの分子であってよく、例えば、タンパク質（抗体など）、核酸、炭水化物、脂質、又はその他の分子実体がある。さらに、このような化合物は、活性化若しくは阻害などの任意の方式で、並びに天然のリガンドと同様に、受容体との結合、及び活性のトリガー若しくは停止などの任意の機構により、又は受容体との結合及び他のリガンドへの接近の阻止により、ＴＬＲ３受容体を調節することができる。好ましくは、リガンドは受容体を活性化するため、このようにしてＴＬＲ３発現細胞によりサイトカインの産生を誘導するのに用いることができる。
本明細書で用いる「抗体」という用語は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を指す。重鎖における定常ドメインの種類に応じて、抗体は５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭのうちの１つに割り当てられる。これらのいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのサブクラス又はアイソタイプにさらに区分される。例示的免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同じ対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を画定する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖及び重鎖を指す。様々なクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ「α」、「δ」、「ε」、「γ」及び「μ」と呼ばれる。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元配置がよく知られている。ＩｇＧ及び／又はＩｇＭは、生理学的状況において最も一般的な抗体であり、実験室環境で最も容易に作製されるため、本発明で使用される好ましいクラスの抗体であり、ＩｇＧが特に好ましい。好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。特に、ヒト化、キメラ、ヒト、又は他のヒトに好適な抗体が好ましい。「抗体」はまた、本明細書に記載する抗体の任意のフラグメント又は誘導体も含む。
「〜に特異的に結合する」という用語は、タンパク質のいずれかの組換え形態、その中のエピトープ、又は単離した標的細胞の表面上に存在するネイティブタンパク質を用いて評価されるように、ある抗体が、好ましくは競合的結合アッセイにおいて、結合パートナー、例えば、ＴＬＲ３に結合することができることを意味する。特異的結合を決定するための競合的結合アッセイ及び他の方法は、以下に詳しく説明され、また当分野においても公知である。
抗体が、特定のモノクローナル抗体（例えば、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７）又はその他のＴＬＲ３リガンド（例えば、ｄｓＲＮＡ）と「競合する」と言うとき、組換えＴＬＲ３分子又は表面発現ＴＬＲ３分子のいずれかを用いた結合アッセイにおいて、前記抗体が、モノクローナル抗体（又は他のＴＬＲ３リガンド）と競合することを意味する。例えば、試験抗体が、結合アッセイにおいて、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７とＴＬＲ３ポリペプチド又はＴＬＲ３発現細胞との結合を低減する場合、前記抗体は、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７と「競合する」と言う。
本明細書で用いる「親和性」という用語は、抗体とエピトープの結合の強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］ｘ［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］として定義される解離定数ＫＤによって示されるが、ここで、［Ａｂ−Ａｇ］は、抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は、非結合抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は、非結合抗原のモル濃度である。親和定数Ｋａは、１／Ｋｄによって定義される。ｍＡｂの親和性を決定する好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８）、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３），Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９−６０１（１９８３）に記載されており、これらの参照文献は、全体を参照として本明細書に組み込む。ｍＡｂの親和性を決定する上で公知の好ましく、かつ標準的な一方法は、Ｂｉｃｏｒｅ計器の使用である。
本発明に関連する限り、「決定基」は、ポリペプチド上の相互作用部位又は結合部位を意味する。
「エピトープ」という用語は、抗原決定基として定義され、抗体が結合する抗原上の区画又は領域である。タンパク質エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基、並びに特定の抗原結合抗体又はペプチドによって有効に阻止されるアミノ酸残基、すなわち、抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含んでよい。これは、例えば、抗体又は受容体と結合することができる複合抗原分子上の最も単純な形態、又は最小の構造区画である。エピトープは、直線状又は立体的／構造的であってよい。「直線状エピトープ」は、アミノ酸の直線状配列上の連続したアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される（一次構造）。「立体的又は構造的エピトープ」は、全てが連続的ではなく、従って、分子のフォールディングにより互いに近接した位置に置かれるアミノ酸の直線状配列の分離した部分を表す（二次、三次及び／又は四次構造）アミノ酸から構成されるエピトープとして定義される。立体的エピトープは、三次元構造に応じて異なる。従って、「立体的」という用語は、往々にして「構造的」と置換え可能に用いられる。
「免疫原性断片」とは、本明細書において、以下：（ｉ）前記断片に結合する、及び／又は前記断片を含む分子（膜結合受容体及びそれに由来する突然変異体）の任意の形態に結合する抗体の産生、（ｉｉ）ＭＨＣ分子を含む二分子複合体及び前記断片由来のペプチドに対して反応するＴ細胞に関連するＴ細胞応答の刺激、（ｉｉｉ）哺乳動物免疫グロブリンをコードする遺伝子を発現するバクテリオファージ又は細菌などのトランスフェクトしたビヒクルの結合などの免疫応答を誘発することができるいずれかのポリペプチド又はペプチド断片を意味する。あるいは、免疫原性断片はまた、上に定義した免疫応答を誘発することができるあらゆる構築物を指し、このようなものとして、例えば、共有結合により担体タンパク質に結合したペプチド断片、アミノ酸配列中の前記ペプチド断片を含むキメラ組換えポリペプチド構築物などがあり、特に、配列が前記フラグメントをコードする部分を含むｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞が挙げられる。
「ヒトに好適な」抗体は、例えば、本明細書に記載する治療方法のためにヒトにおいて安全に用いることができるあらゆる抗体、誘導体化抗体、又は抗体フラグメントを指す。ヒに好適な抗体は、あらゆる種類のヒト化、キメラ、若しくは完全なヒト抗体、又は抗体の少なくとも一部がヒトに由来するか、あるいは、ネイティブ非ヒト抗体を用いた場合に一般に引き起こされる免疫応答を回避するように修飾されたあらゆる抗体を包含する。
本発明の目的のために、「ヒト化」又は「ヒト」抗体は、１つ又は複数のヒト免疫グロブリンの定常及び可変フレームワーク領域は、動物免疫グロブリンの結合領域、例えば、ＣＤＲと融合する。このような抗体は、結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性を維持するが、非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するように設計されている。このような抗体は、抗原の攻撃に応答して特定のヒト抗体を産生するように「改変」されたトランスジェニックマウス又は他の動物から得ることができる（例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ ７：１３；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎ ６：５７９を参照；尚、これらの全教示内容は、参照として本明細書に組み込まれる）。完全なヒト抗体はまた、遺伝子又は染色体トランスフェクション方法、並びにファージディスプレイ技術により構築することも可能であり、これらは全て当分野において公知である（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３を参照）。また、ヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞により産生することも可能である（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号明細書及び同第５，２２９，２７５号明細書を参照；尚、これらは、その全体が参照として本明細書に組み込まれる）。
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、キメラ抗体に新しい特性を付与する別の、若しくは改変されたクラス、エフェクター機能及び／又は種、又は完全に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物など）と連結されるように、定常領域、又はその部分が改変、置換又は交換されているか；あるいは（ｂ）可変領域、又はその部分が、別の、若しくは改変された抗原特異性を有する可変領域で改変、置換又は交換されている、抗体分子である。
「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」、及び「Ｆｃ領域」は、例えば、アミノ酸（ａａ）２３０前後〜ａａ４５０前後のヒトγ（γ）重鎖又は他のタイプの抗体重鎖（例えば、ヒト抗体の場合、α、δ、ε及びμ）内のその対応部分配列、あるいは、それらの天然に存在するアロタイプからの、抗体重鎖のＣ末端断片を指す。特に記載のない限り、本開示全体を通して、一般に受け入れられているＫａｂａｔアミノ酸番号付け（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照）が用いられる。
「単離された」、「精製された」又は「生物学的に純粋な」という用語は、ネイティブな状態で見出されるようなそれに通常付随する成分を実質的に、又はほとんど含まない物質を指す。純度及び等質性は、典型的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィーなどの解析化学技術を用いて決定する。調製物中に存在する主要な種であるタンパク質を実質的に精製する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では置換え可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、並びに天然のアミノ酸ポリマー及び非天然のアミノ酸ポリマーに適用する。
「組換え」という用語は、例えば、細胞、又は核酸、タンパク質、又はベクターに関して用いられる場合、細胞、核酸、タンパク質若しくはベクターが、異種核酸若しくはタンパク質の導入又はネイティブ核酸若しくはタンパク質の改変によって修飾されているか、あるいは、細胞がそのように修飾された細胞に由来するものであることを示す。従って、例えば、組換え細胞は、細胞のネイティブ（非組換え）形態内で見出されない遺伝子を発現するか、又は他の場合には異常に発現される、過小発現されるか、若しくは全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。
本発明に関連する限り、共通の決定基に「結合する」抗体という用語は、特異性及び／又は親和性で、前記決定基に結合する抗体を意味する。
抗ＴＬＲ３抗体の生成
本発明の方法に好適な抗体は、特異的にＴＬＲ３に結合する。本発明の抗体は、さらに、細胞表面に認められるものに相当する条件下、高い親和性でＴＬＲ３に結合する。本発明の抗体は、ＴＬＲ３シグナル伝達経路を阻害することができる。阻害抗体が、ＴＬＲ３シグナル伝達経路を特異的に阻害する能力のために、抗体は、様々な用途、特に、ＴＬＲ３シグナル伝達経路の阻害が望ましい疾患を治療又は予防する、すなわち、本明細書に記載するように、それ以上のサイトカイン及びケモカイン分泌、並びに細胞活性化を回避する上で有用となる。
一実施形態において、本発明は、ヒトＴＬＲ３に結合し、しかも、ヒトＴＬＲ３との結合について、モノクローナル抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７と競合する抗体を用いる方法を提供する。
置き換え可能に用いられる「ＴＬＲ３」、「ＴＬＲ３ポリペプチド」及び「ＴＬＲ３受容体」は、本明細書において、トール様受容体（ＴＬＲ）ファミリーのメンバーであるトール様（Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ）受容体３を指す。ヒトＴＬＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００３２５６、その開示は、参照として本明細書に組み込む）に示されている。ヒトＴＬＲ３ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００３２６５に記載されている。ヒトＴＬＲ３配列は、ＰＣＴ特許公開：国際公開第９８／５０５４７号パンフレットにも記載されており、その開示は、参照として本明細書に組み込む。非ヒト霊長類（カニクイザル（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））ＴＬＲ３アミノ酸配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＡＧ５５０３３（配列番号２）に示されている。
一態様において、本発明は、モノクローナル抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７と競合し、モノクローナル抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７と実質的に若しくはほぼ同じ、又は同じエピトープ若しくは「エピトープ性部位」をＴＬＲ３分子上で認識して、結合するか、又はこれに対する免疫特異性を有する抗体を提供する。他の実施形態では、モノクローナル抗体は、抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７から成るか、又はその誘導体若しくは断片である。
ＴＬＲ３、限定的ではないが、好ましくはヒトＴＬＲ３のあらゆる断片、又はＴＬＲ３断片のあらゆる組合せを、抗体を増殖する免疫原として用いることができ、本発明の抗体は、本明細書に記載するように、ＭｄＤＣ又はＭｏＤＣなどのＴＬＲ３発現細胞上でそれが可能である限り、ＴＬＲ３ポリペプチド内の任意の位置でエピトープを認識することができる。一実施形態では、認識されたエピトープは、細胞表面上、すなわち細胞の外側に存在する抗体に接触可能である。最も好ましくは、エピトープは、抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７によって具体的に認識されるエピトープである。さらに、ＴＬＲ３内の個別のエピトープを認識する抗体は、例えば、様々な個体間の最大の有効性及び最大の範囲で、ＴＬＲ３ポリペプチドに結合させるために、組み合わせて用いることができる。
本発明の抗体は、当分野では公知の様々な技術によって生成することができる。典型的に、これらは、ＴＬＲ３ポリペプチド、好ましくは、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドを含む免疫原で、非ヒト動物、好ましくはマウスを免疫することにより生成される。ＴＬＲ３ポリペプチドは、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドの完全長配列、又はその断片若しくは誘導体、典型的には免疫原性断片、すなわちＴＬＲ３ポリペプチドを発現する細胞の表面に露出したエピトープを含むポリペプチドの一部を含んでもよく、好ましくは、上記エピトープは、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７抗体によって認識される。このような断片は、典型的に、成熟ポリペプチド配列の少なくとも約７個の連続したアミノ酸、さらに好ましくはその少なくとも約１０個の連続したアミノ酸を含む。断片は、典型的に、受容体の細胞外ドメインにほぼ由来する。好ましい実施形態では、免疫原は、典型的に細胞の表面で、脂質膜内に野生型ヒトＴＬＲ３ポリペプチドを含む。具体的実施形態では、免疫原は、インタクトな細胞、特に、インタクトなヒト細胞を含み、これは、任意に処理又は溶解させる。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、組換えＴＬＲ３ポリペプチドである。
抗原で非ヒト哺乳動物を免疫するステップは、マウスにおける抗体の産生を刺激するために、公知の方法で実施してよい（例えば、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ及びＤ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）、これらの全開示内容は、参照として本明細書に組み込まれる）。免疫原は、任意に、完全又は不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと共に、バッファー中に懸濁又は溶解させる。免疫原の量、バッファーの種類及びアジュバントの量を決定する方法は、当業者には周知であり、本発明に関して全く限定的ではない。これらのパラメータは、様々な免疫原で違い得るが、容易に解明される。
同様に、抗体の産生を刺激するのに十分な免疫の位置及び頻度も当分野では公知である。典型的免疫プロトコルでは、非ヒト動物に対し第１日に抗原を腹腔内注射し、約１週間後に再度注射する。これに続き、任意に、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと共に、第２０日前後に抗原のリコール注射を実施する。リコール注射を静脈内に実施し、これを連続して数日にわたり繰り返してもよい。続いて、典型的にアジュバントなしで、静脈内又は腹腔内のいずれかで、第４０日に追加免疫注射を実施する。このプロトコルにより、約４０日後に抗原特異的抗体産生Ｂ細胞の生産が起こる。免疫に用いる抗原に対する抗体を発現Ｂ細胞の生産をもたらすものである限り、他のプロトコルを用いてもよい。
ポリクローナル抗体の調製のために、免疫した非ヒト動物から血清を取得し、そこに存在する抗体を公知の技術により単離する。固体支持体に連結した前述の免疫原のいずれかを用いて血清をアフィニティ精製することにより、ＴＬＲ３ポリペプチドと反応する抗体を取得し得る。
別の実施形態において、非免疫非ヒト哺乳動物からのリンパ球を単離し、ｉｎ ｖｉｖｏで増殖させた後、細胞培養物中の免疫原に暴露する。次に、リンパ球を回収し、以下に記載する融合ステップを実施する。
好ましいモノクローナル抗体のために、次のステップは、免疫した非ヒト哺乳動物由来の脾細胞を単離した後、これら脾細胞と、不死化細胞を融合することにより、抗体産生ハイブリドーマを形成することである。非ヒト哺乳動物からの脾細胞の単離は、当分野では公知であり、典型的に、麻酔した非ヒト哺乳動物から脾臓を摘出するステップ、これを細片に切断するステップ、及び細胞ストレイナーのナイロンメッシュを通して脾膜から脾細胞を適切なバッファー中に絞り出し、単細胞懸濁液を生成するステップを含む。細胞を洗浄し、遠心分離して、バッファー中に再懸濁させるが、このバッファーは全ての赤血球を溶解させる。溶液を再度遠心分離し、ペレット中に残るリンパ球を新鮮なバッファー中に最終的に再懸濁させる。
一旦単離して、単細胞懸濁液中に存在させたら、リンパ球を不死化細胞株と融合させることができる。これは、典型的に、マウス骨髄腫細胞株であるが、ハイブリドーマを作出するのに有用な多くの他の不死化細胞株が当分野では公知である。好ましいマウス骨髄腫株としては、限定するものではないが、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ａ．から入手可能なＸ６３ Ａｇ８６５３及びＳＰ−２細胞が挙げられる。融合は、ポリエチレングリコールなどを用いて実施する。次いで、得られたハイブリドーマを、融合させていない親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１種又は複数の物質を含有する選択培地中で増殖させる。例えば、もし親骨髄腫細胞に、酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）が欠如していれば、ハイブリドーマ用の培地は、典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻止する。
ハイブリドーマは、典型的に、マクロファージの支持細胞層上に増殖させる。マクロファージは、好ましくは、脾細胞を単離するのに用いられる非ヒト哺乳動物の同腹仔に由来し、典型的に、ハイブリドーマを平板培養する数日前に不完全フロイントアジュバント等で初回免疫する。融合方法は、Ｇｏｄｉｎｇ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，”ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）に記載されており、その開示内容は、参照として本明細書に組み込む。
コロニー形成及び抗体産生に十分な時間をかけて、細胞を選択培地中で増殖させる。これは、通常、約７〜約１４日である。
次に、ＴＬＲ３ポリペプチド遺伝子産物、任意に抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７によって特異的に認識されるエピトープに特異的に結合する抗体の産生について、ハイブリドーマコロニーをアッセイする。アッセイは典型的に、比色ＥＬＩＳＡタイプのアッセイであるが、ハイブリドーマを増殖するウェルに適合させることができる任意のアッセイを用いてもよい。他のアッセイとして、放射性免疫アッセイ又は蛍光活性化細胞選別が挙げられる。要望される抗体の産生について陽性のウェルを調べることにより、１つ又は複数のコロニーが存在するかどうかを決定する。２つ以上のコロニーが存在する場合には、単細胞だけが、要望される抗体を産生するコロニーを形成することを確実にするように、細胞を再クローン化し、増殖させる。典型的には、以下に説明するように、パラフィン包埋組織切片中のＴＬＲ３ポリペプチド、例えば、ＴＬＲ３発現細胞に結合する能力についても抗体を試験する。
本発明のモノクローナル抗体を産生することが確認されたハイブリドーマは、ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０などの適切な培地中でさらに多量に増殖させることができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を動物における腹水腫瘍としてｉｎ ｖｉｖｏで増殖することもできる。
要望されるモノクローナル抗体を産生するのに十分に増殖させた後、モノクローナル抗体を含む増殖培地（又は腹水）を細胞から分離し、そこに存在するモノクローナル抗体を精製する。精製は、典型的に、ゲル電気泳動、透析、プロテインＡ又はプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたクロマトグラフィー、又はアガロース若しくはＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズなどの固体支持体に結合させた抗マウスＩｇにより達成する（全て、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．１８−１０３７−４６，Ｅｄｉｔｉｏｎ ＡＣに記載されており、その開示内容は、参照として本明細書に組み込む）。結合抗体は、典型的に、抗体含有画分の即時中和による低ｐＨバッファー（ｐＨ３．０以下のグリシン又は酢酸バッファー）を用いることにより、プロテインＡ／プロテインＧカラムから溶出させる。これらの画分をプール、透析した後、必要に応じて濃縮する。
単一の明瞭なコロニーを含む陽性ウェルを典型的には再クローン化し、再アッセイすることにより、ただ１つのモノクローナル抗体が検出され、産生されることを確実にする。
例えば、（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３４１（１９８９）ｐ．５４４、その全開示内容は、参照として本明細書に組み込む）に開示されるように、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択により、抗体を生成してもよい。
ＴＬＲ３、特に、モノクローナル抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７と実質的に、又はほぼ同じエピトープに結合する１つ又は複数の抗体の同定は、抗体競合を評価することができる様々な免疫学的スクリーニングアッセイのいずれか１つを用いて、容易に決定することができる。多くのこうしたアッセイは常用的に実施されており、当分野では公知である（例えば、１９９７年８月２６日に発行された米国特許第５，６６０，８２７号明細書を参照；これは、参照として本明細書に明示的に組み込む）。本明細書に記載のモノクローナル抗体と実質的に、又はほぼ同じエピトープに結合する抗体を同定するために、本明細書に記載の抗体が結合するエピトープを実際に決定することは全く必要ではないことは理解されよう。
例えば、調べようとする試験抗体を様々な供給源の動物から取得するか、あるいはこれらが異なるＩｇアイソタイプである場合、簡単な競合アッセイを用いてもよく、このアッセイでは、対照（例えば、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７）と試験抗体を混合し（又は事前に吸着させ）、ＴＬＲ３ポリペプチドを含むサンプルに塗布する。ウェスタンブロッティングに基づくプロトコル、及びＢＩＡＣＯＲＥ分析はこのような競合試験での使用に好適である。
特定の実施形態において、対照抗体（例えば、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７）を様々な量の試験抗体（例えば、約１：１０又は約１：１００）と、一定の時間をかけて予め混合した後、ＴＬＲ３抗原サンプルに塗布する。別の実施形態では、対照と様々な量の試験抗体は、ＴＬＲ３抗原サンプルへの暴露中に単純に混合することができる。遊離抗体から結合抗体を識別する（例えば、非結合抗体を排除するための分離又は洗浄技術を用いることにより）と共に、試験抗体から１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７を識別する（例えば、種特異的若しくはアイソタイプ特異的二次抗体を用いることにより、又は検出可能な標識で１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７を特異的に標識することにより）ことができる限り、試験抗体が、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７と抗原との結合を低減するかどうかを決定することができ、これは、試験抗体が、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７と実質的に同じエピトープを認識することを示している。完全に無関係な抗体の非存在下での（標識）対照抗体の結合は、対照の高い値として役立てることができる。対照の低い値は、全く同じタイプの非標識抗体（１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７）と一緒に、標識（１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７）抗体をインキュベートすることにより取得することができ、ここで、競合が起こり、標識抗体の結合を低減する。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下で標識抗体の反応性が有意に低減すれば、実質的に同じエピトープを認識する試験抗体、すなわち標識（１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７）抗体と「交差反応する」か、又は競合する抗体を示している。約１：１０〜約１：１００の範囲の任意の１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７：試験抗体比で、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７とＴＬＲ３抗原の結合を少なくとも５０％、例えば、少なくとも約６０％、又はより好ましくは少なくとも約８０％若しくは９０％（例えば、約６５〜１００％）低減するあらゆる試験抗体が、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７と実質的に同じエピトープ又は決定基に結合する抗体であると考えられる。好ましくは、このような試験抗体は、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７とＴＬＲ３抗原の結合を少なくとも約９０％（例えば、約９５％）低減する。
競合はまた、例えば、フローサイトメトリー試験によって評価することもできる。このような試験では、所与のＴＬＲ３ポリペプチドを担持する細胞をまず、例えば１１Ｅ１とインキュベートした後、蛍光色素又はビオチンで標識する試験抗体と一緒にインキュベートする。飽和量の１１Ｅ１を用いたプレインキュベーションで得られる結合が、１１Ｅ１とのプレインキュベーションなしに抗体により得られた結合（蛍光を用いて測定）の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％以下（例えば、約３０％、２０％若しくは１０％）であれば、結合抗体は、１１Ｅ１と競合すると言える。あるいは、飽和量の試験抗体と一緒にプレインキュベートした細胞上での標識１１Ｅ１抗体（蛍光色素又はビオチンによる）を用いて得られる結合が、試験抗体とのプレインキュベーションなしに得られた結合の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％、又は４０％未満（例えば、約３０％、２０％若しくは１０％）であれば、結合抗体は、１１Ｅ１と競合すると言える。
試験抗体を予め吸着させ、これを飽和濃度で、ＴＬＲ３抗原が固定化された表面に塗布する簡単な競合アッセイも使用することができる。簡単な競合アッセイにおける表面は、好ましくはＢＩＡＣＯＲＥチップ（又は表面プラズモン共鳴分析に適した他の媒体）である。次に、対照抗体（例えば、１１Ｅ１）をＴＬＲ３飽和濃度で前記表面と接触させ、対照抗体のＴＬＲ３及び表面結合を測定する。対照抗体の結合を、試験抗体の非存在下での対照抗体とＴＬＲ３含有表面との結合と比較する。試験アッセイでは、試験抗体の存在下で、対照抗体によるＴＬＲ３含有表面の結合が有意に低減すれば、試験抗体が、対照抗体と実質的に同じエピトープを認識し、これにより試験抗体が、対照抗体と「交差反応する」ことを示す。対照抗体（例えば、１１Ｅ１）とＴＬＲ３抗原の結合を少なくとも約３０％以上、好ましくは約４０％低減する試験抗体はすべて、対照（例えば、１１Ｅ１）と実質的に同じエピトープ又は決定基に結合する抗体であるとみなすことができる。好ましくは、このような試験抗体は、対照抗体（例えば、１１Ｅ１）とＴＬＲ３抗原の結合を少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又はそれ以上）低減する。対照及び試験抗体の順序を逆にしてもよい：すなわち、まず対照抗体を表面に結合させてから、試験抗体を競合アッセイにおいて表面と接触させることができることは理解されよう。好ましくは、第２抗体（抗体は、交差反応すると仮定する）について認められる結合の低減の程度がより大きくなると予想されることから、ＴＬＲ３抗原に対し高い親和性を有する抗体をまず表面と結合させる。こうしたアッセイの別の例は、例えば、Ｓａｕｎａｌ（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３：３３−４１に記載されており、その開示内容は、本明細書に参照として組み込む。
エピトープ領域内で抗体が結合するかどうかの決定は、当業者には公知の方法で実施することができる。このようなマッピング／特性決定方法の一例として、ＴＬＲ３タンパク質中の露出したアミン／カルボキシルの化学修飾を用いたエピトープ「フットプリント法」により、抗ＴＬＲ３抗体に対するエピトープ領域を決定してもよい。こうしたフットプリントの具体的一例は、ＨＸＭＳ（質量分析法により検出される水素−重水素交換）の使用であり、この場合、受容体及びリガンドタンパク質アミドプロトンの水素−重水素交換、結合及び逆交換が起こり、タンパク質結合に参加する骨格アミン基は、逆交換から保護されるため、重水素化したまま残る。この時点で関連領域を消化性タンパク質分解、高速マイクロボア高性能液体クロマトグラフィー分離、及び／又はエレクトロスプレーイオン化質量分析法により同定することができる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ Ｈ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６７（２）ｐｐ．２５２−２５９（１９９９）Ｅｎｇｅｎ，Ｊ．Ｒ．及びＳｍｉｔｈ，Ｄ．Ｌ．（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３，２５６Ａ−２６５Ａを参照。好適なエピトープ同定方法の別の例は、核磁気共鳴エピトープマッピング（ＮＭＲ）であり、この場合、典型的に、遊離抗原と、抗体などの抗原結合ペプチドと複合体化した抗原の２次元ＮＭＲスペクトルにおけるシグナルの位置を比較する。典型的に、ＮＭＲスペクトルにおいて、抗原に対応するシグナルだけが認められ、抗原結合ペプチドからのシグナルは全く認められないように、抗原を１５Ｎで選択的に同位体的に標識する。抗原結合ペプチドとの相互作用に関与するアミノ酸に由来する抗原シグナルは、典型的に、遊離抗原のスペクトルと比較して、複合体のスペクトルに位置をシフトするため、結合に関与するアミノ酸をこのようにして同定することができる。例えば、Ｅｒｎｓｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｒｅｓ Ｆｏｕｎｄ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ．２００４；（４４）：１４９−６７；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２８１（１）ｐｐ．６１−６７（１９９８）；Ｓａｉｔｏ及びＰａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９６ Ｊｕｎ；９（３）：５１６−２４を参照されたい。
また、質量分析法を用いて、エピトープマッピング／特性決定を実施することもできる。例えば、Ｄｏｗｎａｒｄ，Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．（２０００）３５（４）：４９３−５０３、並びにＫｉｓｅｌａｒ及びＤｏｗｎａｒｄ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．（１９９９）７１（９）：１７９２−８０１を参照されたい。エピトープマッピング及び同定に関連して、プロテアーゼ消化法も有用となり得る。抗原決定基関連領域／配列は、プロテアーゼ消化（例えば、ＴＬＲ３に対し約１：５０の比でトリプシン、又はｐＨ７〜８でｏ／ｎ消化を用いることにより）の後、ペプチド同定のための質量分析法（ＭＳ）解析により、決定することができる。続いて、抗ＴＬＲ３結合剤によるトリプシン切断から保護されるペプチドを、トリプシン消化に付したサンプルと、抗体と一緒にインキュベートした後、例えば、トリプシンによる消化に付したサンプルとを比較して、同定することができる（これによって結合剤のフットプリントを明らかにする）。加えて、又は上記に代わり、キモトリプシン、ペプシンなどの他の酵素を同様のエピトープ特性決定法に用いることもできる。さらは、酵母消化は、有望な抗原決定基配列が、表面に暴露されていない、従って、免疫原性／抗原性に関して関連しない可能性が非常に高いＴＬＲ３ポリペプチドの領域内にあるかどうかを分析するための迅速な方法を提供することができる。同様の技術の考察について、例えば、Ｍａｎｃａ，Ａｎｎ １ｓｔ Ｓｕｐｅｒ Ｓａｎｉｔａ．１９９１；２７：１５−９を参照されたい。
部位指定突然変異誘発は、結合エピトープの解明に有用な別の技術である。例えば、「アラニンスキャニング」において、タンパク質セグメント内の各残基をアラニン残基で置換し、結合親和性の結果を測定する。突然変異によって、結合親和性に有意な低減が起これば、これは結合に関与している可能性が非常に高い。構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体（すなわち、変性タンパク質に結合しない抗体）を用いて、アラニン置換が、タンパク質の折り畳み全体に影響を与えないことを確認することができる。例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ及びＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５；２６７：３８３−３８６；並びにＷｅｌｌｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９６；９３：１−６を参照されたい。
また、エピトープ「フットプリント法」のために電子顕微鏡観察を用いることもできる。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９２；３５５：２７５−２７８は、ネイティブのササゲ（ｃｏｗｐｅａ）モザイクウイルスのキャプシド表面上のＦａｂフラグメントの物理的フットプリントを決定するために、低温電子顕微鏡観察、３次元画像再構成、及びＸ線結晶学の協調的適用を用いている。
エピトープ評価のための「無標識」アッセイの他の形態としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、ＢＩＡＣＯＲＥ）及び反射型干渉分光法（ＲｉｆＳ）が挙げられる。例えば、以下を参照されたい：Ｆａｇｅｒｓｔａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ １９９０；３：２０８−１４；Ｎｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ−ｔｏｇｒ．１９９３；６４６：１５９−１６８；Ｌｅｉｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．１９９８；３７：３３０８−３３１１；Ｋｒｏｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ２００２；１７：９３７−９４４。
本発明のエピトープと同じか、又は実質的に同じエピトープに結合抗体は、本明細書に記載する例示的競合アッセイの１つ又は複数において同定することができることにも留意すべきである。
ＴＬＲ３と結合することができる、及び／又は他の要望される特性を備えることができる抗体を同定したら、典型的には、非関連ポリペプチド及び他のＴＬＲファミリーメンバー（例えば、ヒトＴＬＲ１、２、又は４〜１０）などの他のポリペプチドに結合するその能力について、本明細書に記載のものを含む標準方法を用いて、これらの抗体を評価する。理想的には、抗体は、実質的な親和性で、ＴＬＲ３、例えば、ヒトＴＬＲ３にのみ結合し、非関連ポリペプチド又は他のＴＬＲファミリーメンバー（例えば、ヒトＴＬＲ２又はＴＬＲ４；アミノ酸残基１〜２３にシグナルペプチドを含むヒト前駆体ＴＬＲ４のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿６１２５６４に見出され、この開示内容は、参照として本明細書に組み込む）には有意なレベルで結合しない。しかし、ＴＬＲ３に対する親和性が、他のＴＬＲファミリーメンバー（又は他の非関連ポリペプチド）に対するものより実質的に高い（例えば、５ｘ、１０ｘ、５０ｘ、１００ｘ、５００ｘ、１０００ｘ、１０，０００ｘ、又はそれ以上）限り、抗体は、本発明での使用に適していると認識される。
抗体とＴＬＲ３発現細胞との結合は、非ヒト霊長類、例えば、アカゲザル若しくはカニクイザル、又はマウスなどの他の哺乳動物において評価することができる。従って、本発明は、抗体、並びにそのフラグメント及び誘導体を提供し、前記抗体、フラグメント又は誘導体は、ＴＬＲ３に特異的に結合し、これらはさらに、非ヒト霊長類、例えば、アカゲザル若しくはカニクイザル由来のＴＬＲ３、配列番号２のＴＬＲ３ポリペプチドに結合する。任意に、ＴＬＲ３ポリペプチドが発現される細胞及び／又は細胞コンパートメントに容易に取り込まれる抗体を選択するために、細胞の取込み又は局在化、任意にエンドサイトーシス経路などの細胞内コンパートメント内での局在化を評価する。細胞取込み又は局在化は、一般に、抗体にその活性を及ぼそうとする、又は及ぼすと考えられる細胞、例えば、ＤＣにおいて測定する。細胞取込み又は局在化は、標準的方法、例えば、検出可能な部分（例：蛍光部分）で標識した抗体を用いた共焦点染色などにより評価することができる。
脊椎動物又は細胞における免疫及び抗体の産生後、特定の選択ステップを実施して、特許請求の範囲に記載する抗体を単離してもよい。これに関して、特定の実施形態において、本発明は、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する抗体を生成する方法にも関し、この方法は、（ａ）複数の抗体を用意するステップ；及び（ｂ）細胞表面にのみ発現されるＴＬＲ３ポリペプチドに高い親和性で結合することができる、ステップ（ａ）から得た抗体を選択するステップを含む。抗体を中性条件下でＴＬＲ３との結合について試験することができる。一実施形態において、ステップ（ａ）は、（ｉ）ＴＬＲ３ポリペプチドを含む免疫原で、非ヒト哺乳動物を免疫すること；及び（ｉｉ）前記免疫動物から抗体を調製することを含む。一実施形態において、ステップ（ａ）は、抗体配列のライブラリーを作製する（例えば、ファージディスプレイを用いて）ことを含む。
酸性条件下でヒトＴＬＲ３に対する抗体の二価結合親和性を決定することができる。抗体は、例えば約１００、６０、１０、５、若しくは１ナノモル、好ましくはサブモル、又は任意に約３００、２００、１００若しくは１０ピコモル以下の平均ＫＤ（すなわち、これより優れた親和性）により特性決定することができる。ＫＤは、例えば、組換え生成したヒトＴＬＲ３タンパク質をチップ表面上に固定化した後、例えば、実施例に示すように、溶液状の試験対象の抗体を塗布することにより決定することができる。酸性及び中性条件下で同様の結合を維持する抗体を選択するために、中性ｐＨ（例えば、７．２）及び酸性ｐＨ（例えば、４．５〜６．５の範囲内のｐＨ）での結合の間に観察される差を最小限にしようとしてもよく、例えば、この場合、酸性ｐＨでの結合親和性は、非酸性ｐＨで観察されるものより実質的に低く、例えば、ＴＬＲ３に対する結合のＫＤは、０．２−、０．３−、０．５−、１．０−、又は１．５−ｌｏｇ１０以下で低減する。一実施形態において、本方法は、さらに、ＴＬＲ３との結合について、抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７と競合することができるか、又はＴＬＲ３との結合について、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｐｏｌｙＡＵ）と競合することができる（若しくは競合することができない）、（ｂ）からの抗体を選択するステップ（ｄ）も含む。
実施形態のいずれかの一形態において、本方法に従い調製された抗体は、モノクローナル抗体である。別の形態では、本発明の方法に従い抗体を生成するのに用いられる非ヒト動物は、げっ歯類（例えば、ラット）、ウシ、ブタ、家禽、ウマ、ウサギ、ヤギ、又はヒツジなどの哺乳動物である。本発明の抗体は、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４及び３７Ｂ７を包含する。しかし、本明細書に記載する方法を用いて他の抗体を得ることもでき、従って、本発明の抗体は、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４及び３７Ｂ７以外の抗体であってもよい。さらに、本発明の抗体は、任意に、以下に挙げるもののいずれか以外の抗体であると指定することもできる：国際公開第２０１１／００４０２８号パンフレットに開示されている抗体３１Ｃ３、２９Ｈ３、２３Ｃ８、２８Ｆ１１若しくは３４Ａ３、又は番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１８７（２９Ｈ３．７）及びＣＮＣＭ Ｉ−４１８６（３１Ｃ３．１）で寄託された抗体（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ、２５ ｒｕｅ ｄｅ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２４ Ｐａｒｉｓ、２００９年７月３日）、抗体ＴＬＲ３．７（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、国際公開第０６／０６０５１３号パンフレットに記載の抗体Ｃ１０６８、国際公開第２００７／０５１１６４号パンフレットに記載の抗体Ｃ１１３０、国際公開第２０１０／０５１４７０号パンフレットに開示されている抗体のいずれか、例えば、抗体１〜１９及びＦ１７〜Ｆ１９、並びに１５ＥＶＱ及び１２ＱＶＱ／ＱＳＶなどのその変異体、抗体４０Ｃ１２８５（Ａｂｃａｍ）、又は抗体６１９Ｆ７、７１３Ｅ４、７１６Ｇ１０、ＩＭＧ−５６３１、ＩＭＧ−３１５若しくはＩＭＧ−５３４８（全てＩｍｇｅｎｅｘ．Ｃｏｒｐ．製）又はこれら抗体の誘導体、例えば、抗原結合領域を全部又は一部含む誘導体。上に挙げた開示内容の各々は、参照として本明細書に組み込むものとする。
別の実施形態によれば、ＴＬＲ３ポリペプチドに存在するエピトープに結合する抗体をコードするＤＮＡを本発明のハイブリドーマから単離し、適切な宿主へのトランスフェクションのための適切な発現ベクター内に導入する。次に、宿主を抗体、又はその変異体、例えば、そのモノクローナル抗体のヒト化形態、抗体の活性フラグメント、抗体の抗原認識部分を含むキメラ抗体、又は検出可能な部分を含む形態の組換え生成のために用いる。
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の方法（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドのプローブの使用により）を用いて、容易に単離し、配列決定することができる。一旦単離したら、ＤＮＡを発現ベクター中に導入することができ、次に、これらを、他の場合には免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトすることにより、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を達成する。本明細書の他所に記載するように、このようなＤＮＡ配列は、多くの目的のいずれか、例えば、抗体のヒト化、フラグメント若しくは誘導体の生成の目的、又は例えば、抗体の結合特異性を最適化するために、抗原結合部位における抗体の配列を修飾する目的のために、修飾することができる。
抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現は、当分野において公知である（例えば、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，ｐｐ．２５６（１９９３）；及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０，ｐ．１５１（１９９２）を参照）。
ＴＬＲ３シグナル伝達を調節する抗体の能力の評価
特定の実施形態において、本発明の抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドを調節し（例えば、ＴＬＲ３ポリペプチドによるシグナル伝達を阻害する）、これによって、ＴＬＲ３発現細胞の活性又は挙動を調節することができる。例えば、抗体は、ＴＬＲ３発現細胞の活性化を阻害し得るが、例えば、これらは、任意に、ｄｓＲＮＡなどの天然又は内性リガンドのＴＬＲ３との結合を阻止することにより、ＴＬＲ３シグナル伝達経路を阻害することができ；任意に、これらは、ＴＬＲ３タンパク質が、ＴＬＲ３リガンドの存在下でホモ二量体を形成する能力を阻止し、これにより、シグナル伝達カスケードの開始を阻止し得る。従って、これらの抗体は、「中和」又は「阻害性」又は「阻止」抗体と呼ばれる。このような抗体は、中でも、ＴＬＲ３発現免疫細胞の活性の低減、例えば、過剰のＴＬＲ３発現細胞活性若しくは細胞数を伴う状態、又はＴＬＲ３発現細胞活性の低減により、上記の状態又はその症状を軽減、予防、排除、あるいは、幾分か改善することができる状態の治療若しくは予防に有用である。
多様な細胞アッセイを用いて、抗体がＴＬＲ３シグナル伝達を調節する能力を評価することができる。分子、細胞モデル、及び動物モデルを含む多数のアッセイのいずれかを用いて、抗ＴＬＲ３抗体がＴＬＲ３発現細胞活性を調節する能力を評価することができる。例えば、細胞アッセイを用いることができ、この場合、ＴＬＲ３を発現する細胞をｄｓＲＮＡ、ウイルスｄｓＲＮＡ、ｐｏｌｙＩＣ、若しくはｐｏｌｙＡＵ、又は別のＴＬＲ３リガンドに暴露した後、抗体が、リガンドの結合又は受容体の刺激を破壊する能力（例えば、本明細書で対象とするＴＬＲ３細胞活性、例えば、インターフェロン発現、ＮＦｋＢ活性、ＮＫ細胞活性化などのいずれかを調べることにより測定される）を評価する。アッセイで用いるＴＬＲ３リガンドは、限定するものではないが、精製リガンド組成物として、非ＴＬＲ３リガンドとの混合物中、天然に存在する組成物中、細胞中若しくは細胞の表面上、又は細胞（例えば、リガンドを産生する細胞をアッセイに用いる）による分泌物として、溶液中又は固体支持体上などの任意の好適な形態であってよい。
ＴＬＲ３発現細胞の活性はまた、細胞を抗体自体に暴露し、細胞の活性又は挙動のあらゆる形態に対するその作用を評価することにより、リガンドの非存在下で評価することもできる。こうしたアッセイでは、ＴＬＲ３発現細胞の活性（例えば、サイトカイン産生、増殖など、以下参照）のベースラインレベルをリガンドの非存在下で取得し、抗体又は化合物が、ベースライン活性レベルを改変する能力を検出する。こうした一実施形態において、ハイスループットスクリーニング手法を用いて、受容体の活性化に影響を与えることができる化合物を同定する。
ＴＬＲ３活性を表すいずれかの好適な生理学的変化を用いて、試験抗体又は抗体誘導体を評価することができる。例えば、遺伝子発現（例えば、ＮＦｋＢ応答遺伝子）、タンパク質分泌（例えば、インターフェロン）、細胞成長、細胞増殖、ｐＨ，細胞内第２メッセンジャー、例えば、Ｃａ２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、若しくはｃＡＭＰ、又はＮＫ細胞を活性化する能力の変化などの様々な作用を測定することができる。一実施形態では、受容体の活性は、サイトカイン、例えば、ＴＬＲ３応答性サイトカイン、炎症性サイトカインの産生を検出することにより、評価する。
ＴＬＲ３調節は、いくつかの考えられる読み取りシステムのいずれかを用いて評価することができ、そのほとんどが、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路（例えば、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＫＫε及び／又はＴＢＫ１を含むＭｙＤ８８非依存性／ＴＲＩＦ依存性シグナル伝達経路など）に基づくものである（Ａｋｉｒａ及びＴａｋｅｄａ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：４９９−５１１）。これらの経路は、ＫＢキナーゼ複合体などのキナーゼを活性化する。ＴＬＲ３活性化は、ＴＬＲシグナル伝達のいずれかの形態を調べることにより、評価することができる。例えば、ＴＬＲシグナル伝達の活性化は、タンパク質−タンパク質結合（例えば、ＴＲＩＦとＴＢＫ及び／又はＩＫＫε）、タンパク質の細胞内局在化（例えば、ＮＦ−ｋＢの核内への移動）、並びに遺伝子発現（例えば、ＮＦ−ｋＢ感受性遺伝子の発現）、及びサイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＰ１０、ＭＣＰ−１の産生及び分泌）における改変をトリガーする。いずれかのこうした改変を検出して、ＴＬＲ３活性化を検出するのに用いることができる。一実施形態において、１８〜２０時間の培養後に上澄みを回収し、サンドイッチＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＰ−１０及び／又はＭＣＰ−１のレベルを測定することにより、ＴＬＲ３刺激を検出する。別の実施形態では、１８〜２０時間の培養後に上澄みを回収し、サンドイッチＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＰ−１０及び／又はＭＣＰ−１のレベルを測定することにより、ＴＬＲ３刺激を検出する。
一実施形態において、天然でＴＬＲ３を発現する細胞、例えば、ＤＣ（例：骨髄ＤＣ又は単球由来のＤＣ）を用いる。別の実施形態では、ＴＬＲ３刺激時に検出可能な遺伝子産物の発現並びに、その結果としてのシグナル伝達経路の活性化を引き起こすレポーター構築物を含む細胞を用いる。アッセイに特に有用なレポーター遺伝子及びレポーター遺伝子構築物としては、例えば、ＮＦ−ｋＢに対して感受性であるプロモーター、又は特に、ＴＲＩＦ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＫＫε、ＴＢＫ１により媒介されるシグナル伝達に作動可能に連結されたレポーター遺伝子が挙げられる。こうしたプロモーターの例として、限定しないが、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１２ｐ４０、ＩＰ−１０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＴＮＦ−αに対するプロモーターが挙げられる。ＴＬＲ感受性プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子としては、限定しないが、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）など）、生物発光マーカ（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、例えば、米国特許第５，４９１，０８４号明細書）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、例えば、米国特許第６，４８６，３８２号明細書）など）、表面発現分子（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ８０、ＣＤ８６）、及び分泌分子（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１２ｐ４０、ＴＮＦ−α）を挙げることができる。例えば、Ｈｃｋｅｒ Ｈ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊ．１８：６９７３−８２；Ｍｕｒｐｈｙ ＴＬ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５：５２５８−６７（その開示内容は、参照として本明細書に組み込む）を参照されたい。使用に適したレポータープラスミドは市販されている（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。一実施形態において、アッセイは、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドを発現するように作製された宿主細胞において、試験組成物が、ＴＬＲ３シグナル伝達に対して応答性のプロモーター（例えば、ＩＳＲＥ、ＩＦＮ刺激応答エレメント）の制御下で、ルシフェラーゼ発現（又は他のレポーター）を誘導するかどうかを決定することを含む。
酵素活性読み取りを利用するアッセイにおいて、基質はアッセイの一部として供給することができ、検出は、化学発光、蛍光、発色、放射性標識の組込み、薬物耐性、光学密度、又は酵素活性の他のマーカの測定を含み得る。分子の表面発現を利用するアッセイの場合、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析又は機能的アッセイを用いて、検出を達成することができる。分泌された分子は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）又はバイオアッセイを用いて検定することができる。前記又は他の好適な読み取りシステムの多くは、当分野において公知であり、市販のものを入手できる。好ましくは、レポーター系は、どれを用いても、定量可能である。
別の実施形態において、ＴＬＲ３発現細胞に対する抗体の作用は、非ヒト霊長類においてｉｎ ｖｉｖｏで評価することができる。例えば、本発明の抗ＴＬＲ３抗体を含む医薬組成物を、健康であるか、又は例えば、自己免疫疾患又は炎症などの病態に罹患した非ヒト霊長類に投与し、霊長類におけるＴＬＲ３発現細胞の数若しくは活性、サイトカインの存在及び／若しくはレベル、又は病態の進行に対する投与の作用を評価する。これらＴＬＲ３関連パラメータのいずれかにおける検出可能な変化に作用する、あらゆる抗体又は抗体誘導体若しくはフラグメントは、本明細書に記載の方法に用いられる候補である。
本明細書に記載のアッセイのいずれにおいても、細胞におけるＴＬＲ３刺激による活性の任意の検出可能な尺度の５％、１０％、２０％、好ましくは３０％、４０％、５０％、極めて好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はそれを超える増大又は低減が、本発明おける使用に好適である。
阻害性抗ＴＬＲ３抗体を評価する場合、炎症又は自己免疫に関連する任意のパラメータを改変するように、抗体を有利に選択することができる。例えば、細胞における活性化、特に炎症性サイトカインの産生を抑制するように抗体を選択することができる。細胞は、例えば、炎症性又は自己免疫疾患を患っている個体から取得した細胞であってよい。
抗体
本発明の抗体は、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドに結合する。一実施形態において、抗体は、アンタゴニストＴＬＲ３抗体である。別の実施形態では、抗体は、ヒトＴＬＲ３により誘導されるシグナル伝達を阻止する。
抗体は、任意選択により、酸性ｐＨ、すなわち約５．６のｐＨで、１０−９Ｍ未満、好ましくは１０−１０Ｍ未満の親和性（ＫＤ）を有する。別の実施形態では、抗体は、中性ｐＨ、すなわち約７．２のｐＨで、１０−９Ｍ未満、好ましくは１０−１０Ｍ未満の親和性（ＫＤ）を有する。別の実施形態では、抗体は、酸性ｐＨ、すなわち約５．６のｐＨ、及び中性ｐＨ、すなわち約７．２のｐＨで、１０−９Ｍ未満、好ましくは１０−１０Ｍ未満の親和性（ＫＤ）を有する。親和性は、例えば、ＴＬＲ３に対する一価又は二価結合であってよい。
別の実施形態では、抗体は、ＴＬＲ３リガンド、すなわちｄｓＲＮＡ（ｐｏｌｙＡＵ、ｐｏｌｙＩＣ）の存在下で、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害することができる。別の実施形態では、抗体は、ＴＬＲ３リガンドの後に投与されると、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害することができる。別の実施形態では、抗体は、ＴＬＲ３リガンドの前に投与されると、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害することができる。別の実施形態では、抗体は、ＴＬＲ３リガンドと同時に投与されると、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害することができる。
別の実施形態では、抗体は、ｄｓＲＮＡと、ＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端ｄｓＲＮＡ結合部位との結合について競合する。別の実施形態では、抗体は、ｄｓＲＮＡと、ＴＬＲ３ポリペプチドのＣ末端ｄｓＲＮＡ結合部位との結合について競合する。
抗体エピトープ
別の実施形態において、抗体は、抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７と実質的に同じエピトープに結合する。一実施形態において、エピトープの全基本残基は、配列番号１のＴＬＲ３ポリペプチドの残基１〜２５１に対応するセグメントである。一実施形態では、抗体は、配列番号１のＴＬＲ３ポリペプチドの残基１〜２５１（又は４１〜１３９、４１〜１１５、４１〜１２０若しくは４１〜２５１）に対応するセグメントにおける１、２、３、４、５、６、７又は８個以上の残基を含むエピトープに結合する。別の実施形態では、抗体は、本発明の抗ＴＬＲ３抗体が結合するエピトープ内にＴＬＲ３ポリペプチドの表面上に存在する１個又は複数個のアミノ酸に結合し、任意に、抗体は、配列番号１の４１、４３、６０、６１、６２、６４、６５、６６、６７、６８、８６、８８、８９、９１、９２、９３、９６、９７、１０８、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１７、１２０、１２１、１３２、１３４、１３７及び残基１３９からなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７又は８個以上の残基に結合する。
任意に、抗体は、少なくとも一部が（又は主として）ヒトＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端部分のグリカンフリー外側面上に結合する。任意に、抗体は、少なくとも一部が（又は主として）ヒトＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端部分の骨格上に結合する。任意に、抗体は、少なくとも一部が（又は主として）ヒトＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端部分のグリカンフリー外側面上に結合すると共に、一部がヒトＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端部分の骨格上に結合する。任意に、抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドとｄｓＲＮＡとの結合に関与するＴＬＲ３ポリペプチドのグリカンフリー外側面内の１つ又は複数のアミノ酸残基、及び／又はそれに隣接する残基に結合する。任意に、抗体は、配列番号１の残基４１及び／又は残基４３を含むエピトープに結合する。任意に、抗体は、配列番号１の残基６０、６１、６２、６４、６５、６７及び／又は残基６８の１、２、３、４、５、６若しくは７個を含むエピトープに結合する。任意に、抗体は、配列番号１の残基８６、８８及び／又は残基８９の１、２、若しくは３個を含むエピトープに結合する。任意に、抗体は、配列番号１の残基９１、９２、９３、９６、９７及び／又は残基１２１の１、２、３、４、５若しくは６個を含むエピトープに結合する。任意に、抗体は、残基１０８、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１２０の１、２、３、４、５、６、７又は８個以上を含むエピトープに結合する。任意に、抗体は、配列番号１の残基１３２、１３４、１３７及び／又は残基１３９の１、２、３若しくは４個を含むエピトープに結合する。任意に、抗体は、残基１１２、１１３、１１５、１１７、１２０、１３７及び１３９の１、２、３、若しくは４個を含むエピトープに結合する。任意に、抗体は、残基１１７と、残基１３７及び／又は１３９を含むエピトープに結合する。任意に、抗体は、残基１２０と、残基１３７及び／又は１３９を含むエピトープに結合する。任意に、抗体は、残基１１７及び／又は１２０を含むが、残基１３７及び／又は１３９は含まないエピトープに結合する。任意に、抗体は、残基Ｒ６４、Ｒ６５、Ｔ８６とＫ８９、Ｋ１３７及びＫ１３９の１、２、３、４、５若しくは６個を含むエピトープに結合する。任意に、抗体は、残基６４と、残基１３７及び／又は１３９を含むエピトープに結合する。任意に、抗体は、残基６５と、残基１３７及び／又は１３９を含むエピトープに結合する。任意に、抗体は、残基８６と、残基１３７及び／又は１３９を含むエピトープに結合する。任意に、抗体は、残基８９と、残基１３７及び／又は１３９を含むエピトープに結合する。一実施形態において、ＴＬＲ３ポリペプチドとｄｓＲＮＡとの結合に関与するＴＬＲ３ポリペプチドのグリカンフリー外側面内のアミノ酸残基、及び／又はそれに隣接する残基は、配列番号１の４１、４３、６０、６１、６２、６４、６５、６７、６８、８６、８８、８９、１０８、１１０、１１２、１１３、１１４、１３２、１３４、１３７及び残基１３９からなる群から選択される。任意に、抗体は、配列番号１の残基１１２、１１３及び１３７の１、２、３、若しくは４個を含むエピトープに結合する。一実施形態では、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端部分の骨格内のアミノ酸残基は、配列番号１の残基９１、９２、９３、９６、９７、１１７、１２０及び１２１からなる群から選択される。任意に、抗体は、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端部分のグリカン含有外側面上に結合しないか、又は主として結合しない。
任意に、いずれかの実施形態において、抗体は、任意選択により、配列番号１の成熟ＴＬＲ３ポリペプチドの残基１７４〜１９１、残基４６５〜６１９、又は残基１１６、１４５及び／若しくは１８２に対応するセグメント内の１、２、３、又は４個以上の残基に実質的に結合しないことをさらに特徴としてもよい。別の実施形態では、抗体は、配列番号１のＴＬＲ３ポリペプチドの残基１７７〜１９１、２２４〜２４３、２８０〜２８６、２９５〜３７４、３７９〜３９１、４２８〜４５９、４６１〜４８７、５２４〜５２９、５３３〜５４２、５４６〜５６９、５７５〜５８１、５８３〜６０５、６０７〜６２３、６４１〜６５７及び／若しくは６７０〜７０５に対応するセグメント内の１個又は複数個の残基を含むエピトープに結合するか、又は任意選択により結合しない。
本明細書の実施例の項では、一連の突然変異ヒトＴＬＲ３ポリペプチドの構築について記載する。抗ＴＬＲ３抗体と、ＴＬＲ３突然変異体でトランスフェクトした細胞との結合を測定し、抗ＴＬＲ３抗体が野生型ＴＬＲ３ポリペプチド（配列番号１）に結合する能力と比較した。本明細書で用いる場合、抗ＴＬＲ３抗体と突然変異体ＴＬＲ３ポリペプチドとの結合の低減は、結合親和性の低減（例えば、特定の突然変異体を発現する細胞のＦＡＣＳ試験、又は突然変異ポリペプチドに対する結合のＢｉａｃｏｒｅ試験などの公知の方法により測定される）及び／又は抗ＴＬＲ３抗体の総結合能力の低減（例えば、ポリペプチド濃度に対する抗ＴＬＲ３抗体濃度のグラフにおけるＢｍａｘの低下により証明される）があることを意味する。結合の有意な低減は、突然変異した残基が、抗ＴＬＲ３抗体との結合に直接関与しているか、又は抗ＴＬＲ３抗体がＴＬＲ３に結合している場合、結合タンパク質に極めて近接していることを示している。従って、抗体エピトープは、このような残基を含むことが好ましく、こうした残基に隣接する追加残基を含んでもよい。
ある実施形態において、結合の有意な低減は、抗ＴＬＲ３抗体と突然変異体ＴＬＲ３ポリペプチド同士の結合親和性及び／又は結合能力が、抗ＴＬＲ３抗体と野生型ＴＬＲ３ポリペプチド（例えば、配列番号１に示すポリペプチド）同士の結合に対して、４０％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超又は９５％超低減していることを意味する。特定の実施形態では、結合は、検出限界を下回る。ある実施形態では、抗ＴＬＲ３抗体と突然変異体ＴＬＲ３ポリペプチド同士の結合が、抗ＴＬＲ３抗体と野生型ＴＬＲ３ポリペプチド（例えば、配列番号１に示す細胞外ドメイン）同士の場合に観察される結合の５０％を下回る（例えば、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％又は１０％を下回る）とき、結合の有意な低減が証明される。このような結合測定は、当分野では公知の様々な結合アッセイを用いて実施することができる。このようなアッセイの具体例を実施例の項に記載する。
ある実施形態において、抗ＴＬＲ３抗体は、野生型ＴＬＲ３ポリペプチド（配列番号１）の残基が置換された突然変異体ＴＬＲ３ポリペプチドに対し有意に低い結合を呈示する抗ＴＬＲ３抗体を提供する。本明細書で用いる簡潔な表記では、その構成は、以下：野生型残基：ポリペプチドにおける位置：突然変異体残基のようにし、残基の番号付けは、配列番号１に示される通りとする。
任意に、抗体は、配列番号１の残基４１、４３、６０、６１、６２、６４、６５、６７、６８、８６、８８、８９、９１、９２、９３、９６、９７、１０８、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１７、１２０、１２１、１３２、１３４、１３７及び／又は残基１３９に置換を有するＴＬＲ３ポリペプチドに対し、低減した結合を有する。
ある実施形態において、抗ＴＬＲ３抗体は、配列番号１の配列を有する野生型ＴＬＲ３ポリペプチドに結合するが、以下の突然変異：Ｒ６４Ｑ、Ｒ６５Ｑ、Ｔ８６Ｓ、Ｋ８９Ｑ、Ｋ１１７Ｑ、Ａ１２０Ｖ、Ｋ１３７Ｓ及び／又はＫ１３９Ａ（配列番号１に関して）の１つ又は複数（例えば、１、２、３若しくは４つ）を有する突然変異体ＴＬＲ３ポリペプチドに対し、低減した結合を有する。好ましくは、突然変異体ＴＬＲ３に対する結合は、野生型ＴＬＲ３との結合と比較して有意に低減している。
別の実施形態において、抗体は、骨髄樹状細胞（ＭｄＤＣ）におけるサイトカイン（例えば、ＩＰ−１０）分泌を阻害することができる。別の実施形態では、抗体は、ＴＬＲ３発現細胞に迅速かつ有効にインターナライズすることができる。別の実施形態では、抗体は、ｈＴＬＲ３の下方制御を誘導することなく、又はこれを必要とせずにインターナライズすることができる。
抗体ＣＤＲ配列
本発明の実施形態のいずれかの一態様において、抗体は、式（Ｉ）〜（ＶＩＩ）から選択されるそれぞれの式に従うＣＤＲ１、２及び／又は３配列を有する重鎖及び／又は軽鎖を含んでもよい。本明細書に記載のいずれかの実施形態において、特定のＬＣＤＲ１若しくはＬＣＤＲ２又はＨＣＤＲ１若しくはＨＣＤＲ２は、式（Ｉ）〜（ＶＩＩ）の配列を有するものとして指定してもよい。本明細書に記載のいずれかの実施形態において、特定のＬＣＤＲ１〜３又はＨＣＤＲ１〜３は、式（Ｉ）〜（ＶＩＩ）の配列を有するものとして指定してもよい。好ましい一実施形態では、前記抗体は、３つのＬＣＤＲを含む軽鎖と、３つのＨＣＤＲを含む重鎖を含む。任意に、軽鎖及び／又は重鎖可変領域のいずれかが、ＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、任意にヒト定常領域、任意にＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４アイソタイプに融合した抗体が提供される。
一実施形態において、ＬＣＤＲ１は、式（Ｉ）：
Ｘａａ１−Ａ−Ｓ−Ｅ−Ｘａａ２−Ｉ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｌ−Ａ（Ｉ）（配列番号５８）
の配列を含み、
式中、Ｘａａ１〜Ｘａａ５は、保存的若しくは非保存的置換又は欠失若しくは挿入であってよく、好ましくは、Ｘａａ１は、Ｌｅｕ若しくはＧｌｎであってよく、及び／又はＸａａ２は、Ａｓｐ若しくはＧｌｙであってよく、及び／又はＸａａ３は、Ｓｅｒ若しくはＴｙｒであってよく、及び／又はＸａａ４は、Ａｓｎ若しくはＳｅｒであってよく、及び／又はＸａａ５は、Ａｓｐ、Ｔｙｒ若しくはＧｌｙであってよい。
一実施形態において、ＬＣＤＲ２は、式（ＩＩ）：
Ａ−Ａ−Ｘａａ６−Ｒ−Ｌ−Ｘａａ７−Ｄ（ＩＩ）（配列番号５９）
の配列を含み、
式中、Ｘａａ６〜Ｘａａ７は、保存的若しくは非保存的置換又は欠失若しくは挿入であってよく、好ましくは、Ｘａａ６は、Ｓｅｒ若しくはＡｓｎであってよく、及び／又はＸａａ７は、Ｇｌｕ若しくはＧｌｎであってよい。
一実施形態において、ＬＣＤＲ３は、式（ＩＩＩ）：
Ｘａａ８−Ｑ−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｐ−Ｘａａ１３−Ｔ（ＩＩＩ）（配列番号６０）
の配列を含み、
式中、Ｘａａ８〜Ｘａａ１３は、保存的若しくは非保存的置換又は欠失若しくは挿入であってよく、好ましくは、Ｘａａ８は、Ｌｅｕ若しくはＧｌｎであってよく、及び／又はＸａａ９は、Ｓｅｒ、Ａｓｎ若しくはＧｌｙであってよく、及び／又はＸａａ１０は、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ若しくはＶａｌであってよく、及び／又はＸａａ１１は、Ｌｙｓ若しくはＧｌｕであってよく、及び／又はＸａａ１２は、Ｐｈｅ若しくはＴｙｒであってよく、及び／又はＸａａ１３は、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ若しくはＶａｌであってよい。
一実施形態において、ＨＣＤＲ１は、式（ＩＶ）：
Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｙ−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７（ＩＶ）（配列番号６１）
の配列を含み、
式中、Ｘａａ１４〜Ｘａａ１７は、保存的若しくは非保存的置換又は欠失若しくは挿入であってよく、好ましくは、Ｘａａ１４は、Ｔｙｒ又はＳｅｒであってよく、及び／又はＸａａ１５は、Ｔｈｒ若しくはＡｓｎであってよく、及び／又はＸａａ１６は、Ｍｅｔ若しくはＩｌｅであってよく、及び／又はＸａａ１７は、Ｔｙｒ若しくはＨｉｓであってよい。
一実施形態において、ＨＣＤＲ１は、式（Ｖ）：
Ｇ−Ｙ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｘａａ２１（Ｖ）（配列番号６２）
の配列を含み、
式中、Ｘａａ１８〜Ｘａａ２１は、保存的若しくは非保存的置換又は欠失若しくは挿入であってよく、好ましくは、Ｘａａ１８は、Ｔｈｒ若しくはＡｓｎであってよく、及び／又はＸａａ１９は、Ｐｈｅ若しくはＩｌｅであってよく、及び／又はＸａａ２０は、Ａｒｇ、Ｔｒｐ若しくはＴｈｒであってよく；及び／又はＸａａ２１は、Ｔｙｒ若しくはＳｅｒであってよい。
一実施形態において、ＨＣＤＲ２は、式（ＶＩ）：
Ｘａａ２２−Ｉ−Ｘａａ２３−Ｐ−Ｘａａ２４−Ｘａａ２５−Ｇ（ＶＩ）（配列番号６３）
の配列を含み、
式中、Ｘａａ２２〜Ｘａａ２５は、保存的若しくは非保存的置換又は欠失若しくは挿入であってよく、好ましくは、Ｘａａ２２は、Ａｒｇ若しくはＴｒｐであってよく、及び／又はＸａａ２３は、Ａｓｐ若しくはＰｈｅであってよく、及び／又はＸａａ２４は、Ａｌａ若しくはＧｌｙであってよく，及び／又はＸａａ２５は、Ａｓｎ若しくはＡｓｐであってよい。任意に、式ＶＩのＨＣＤＲは、さらに配列−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｘａａ２８を含み、式中、Ｘａａ２６〜Ｘａａ２８は、保存的若しくは非保存的置換又は欠失若しくは挿入であってよく、好ましくは、Ｘａａ２６は、Ａｓｐ若しくはＡｓｎであってよく、及び／又はＸａａ２７は、Ｔｈｒ若しくはＳｅｒであってよく，及び／又はＸａａ２８は、Ａｓｎ若しくはＩｌｅであってよい。
一実施形態において、ＨＣＤＲ３は、配列番号２１、３２、４３若しくは５４、又は式（ＶＩＩ）：
Ｇ−Ｘａａ２９−Ｘａａ３０−Ｘａａ３１−Ｙ−Ｆ−Ｄ（ＶＩＩ）（配列番号６４）
の配列を含み、
式中、Ｘａａ２９〜Ｘａａ３１は、保存的若しくは非保存的置換又は欠失若しくは挿入であってよく、好ましくは、Ｘａａ２９は、欠失若しくはＧｌｕであってよく、及び／又はＸａａ３０は、Ｐｈｅ若しくはＡｓｐであってよく、及び／又はＸａａ３１は、Ａｓｐ若しくはＴｒｐであってよい。
一実施形態において、本発明の抗体は、以下を含む軽鎖を含んでもよい：
ａ．配列番号２２、３３、４４、５５及び５８から選択される軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）アミノ酸配列；及び／又は
ｂ．配列番号２３、３４、４５、５６及び５９から選択される軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）アミノ酸配列；及び／又は
ｃ．配列番号２４、３５、４６、５７及び６０から選択される軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列。
一実施形態において、本発明の抗体は、以下を含む重鎖を含んでもよい：
ａ．配列番号１６〜１８、２７〜２９、３８〜４０、４９〜５１及び６１〜６２から選択される重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）アミノ酸配列；及び／又は
ｂ．配列番号１９、２０、３１、４１、４２、５２、５３及び６３から選択される重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）アミノ酸配列；及び／又は
ｃ．配列番号２１、３２、４３、５４及び６４から選択される重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列。
抗体１１Ｅ１
１１Ｅ１の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号３として記載され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４として記載される。具体的実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体１１Ｅ１とほぼ同じエピトープ又は決定基に結合する抗体を提供し；任意に、抗体は、抗体１１Ｅ１の抗原結合領域を含む。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、抗体１１Ｅ１は、そのアミノ酸配列及び／又はそれをコードする核酸配列を特徴とするものでよい。好ましい一実施形態において、モノクローナル抗体は、１１Ｅ１のＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２部分を含む。また、１１Ｅ１の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。一実施形態によれば、モノクローナル抗体は、１１Ｅ１の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。また、１１Ｅ１の可変軽鎖可変領域、又は１１Ｅ１の軽鎖可変領域のＣＤＲの１つ、２つ若しくは３つをさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意に、前記軽鎖又は重鎖ＣＤＲのいずれか１つ又は複数は、１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つのアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を含んでもよい。任意に、抗体１１Ｅ１の抗原結合領域の一部若しくは全部を含む軽鎖及び／又は重鎖可変領域のいずれかが、ＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、任意にヒト定常領域、任意にヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４アイソタイプと融合した抗体が提供される。別の好ましい実施形態では、抗体は、１１Ｅ１である。
別の態様では、本発明は、抗体、又は抗体をコードする精製ポリヌクレオチドを提供し、ここで、抗体は、以下を含む：１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号５、６若しくは７に記載のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号８若しくは９に記載のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域。
別の態様では、本発明は、ヒトＴＬＲ３に結合する抗体を提供し、この抗体は、以下を含む：
ａ．１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号３の重鎖可変領域；又は
ｂ．１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号４の軽鎖可変領域；又は
ｃ．１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列番号３の重鎖可変領域と；１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号４の軽鎖可変領域；又は
ｄ．１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号５〜１０に示される重鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列；又は
ｅ．１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号１１〜１３に示される軽鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列；又は
ｆ．１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号５〜１０に示される重鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列と；１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号１１〜１３に示される軽鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列；又は
ｇ．各々が、配列番号３のアミノ酸配列を有する可変領域のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％同一のＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列を有し、１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、重鎖可変領域；又は
ｈ．各々が、配列番号４のアミノ酸配列を有する可変領域のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％同一のＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列を有し、１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、軽鎖可変領域。
本明細書に記載する実施形態のいくつかの別の態様では、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、２及び３のいずれかは、対応する配列番号に記載される特定のＣＤＲ又はＣＤＲのセットと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することを特徴としてもよい。
別の態様では、本発明は、ＴＬＲ３との結合について、上の（ａ）〜（ｈ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。
抗体３１Ｆ６
３１Ｆ６の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１４として記載され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１５として記載される。具体的実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体３１Ｆ６とほぼ同じエピトープ又は決定基に結合する抗体を提供し；任意に、抗体は、抗体３１Ｆ６の抗原結合領域を含む。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、抗体３１Ｆ６は、そのアミノ酸配列及び／又はそれをコードする核酸配列を特徴とするものでよい。好ましい一実施形態において、モノクローナル抗体は、３１Ｆ６のＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２部分を含む。また、３１Ｆ６の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。一実施形態によれば、モノクローナル抗体は、３１Ｆ６の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。また、３１Ｆ６の可変軽鎖可変領域、又は３１Ｆ６の軽鎖可変領域のＣＤＲの１つ、２つ若しくは３つをさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意に、前記軽鎖又は重鎖ＣＤＲのいずれか１つ又は複数は、１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つのアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を含んでもよい。任意に、抗体３１Ｆ６の抗原結合領域の一部若しくは全部を含む軽鎖及び／又は重鎖可変領域のいずれかが、ＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、任意にヒト定常領域、任意にヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４アイソタイプと融合した抗体が提供される。別の好ましい実施形態では、抗体は、３１Ｆ６である。
別の態様では、本発明は、抗体、又は抗体をコードする精製ポリヌクレオチドを提供し、ここで、抗体は、以下を含む：１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号１６、１７若しくは１８に記載のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号１９若しくは２０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域。
別の態様では、本発明は、ヒトＴＬＲ３に結合する抗体を提供し、この抗体は、以下を含む：
ａ．１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号１４の重鎖可変領域；又は
ｂ．１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号１５の軽鎖可変領域；又は
ｃ．１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列番号１４の重鎖可変領域と；１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号１５の軽鎖可変領域；又は
ｄ．１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号１６〜２１に示される重鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列；又は
ｅ．１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号２２〜２４に示される軽鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列；又は
ｆ．１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号１６〜２１に示される重鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列と；１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号２２〜２４に示される軽鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列；又は
ｇ．各々が、配列番号１４のアミノ酸配列を有する可変領域のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％同一のＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列を有し、１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、重鎖可変領域；又は
ｈ．各々が、配列番号１５のアミノ酸配列を有する可変領域のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％同一のＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列を有し、１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、軽鎖可変領域。
本明細書に記載する実施形態のいくつかの別の態様では、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、２及び３のいずれかは、対応する配列番号に記載される特定のＣＤＲ又はＣＤＲのセットと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することを特徴とするものでもよい。
別の態様では、本発明は、ＴＬＲ３との結合について、上の（ａ）〜（ｈ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。
抗体３２Ｃ４
３２Ｃ４の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２５として記載され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２６として記載される。具体的実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体３２Ｃ４とほぼ同じエピトープ又は決定基に結合する抗体を提供し；任意に、抗体は、抗体３２Ｃ４の抗原結合領域を含む。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、抗体３２Ｃ４は、そのアミノ酸配列及び／又はそれをコードする核酸配列を特徴とするものでよい。好ましい一実施形態において、モノクローナル抗体は、３２Ｃ４のＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２部分を含む。また、３２Ｃ４の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。一実施形態によれば、モノクローナル抗体は、３２Ｃ４の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。また、３２Ｃ４の可変軽鎖可変領域、又は３２Ｃ４の軽鎖可変領域の１つ、２つ若しくは３つのＣＤＲをさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意に、前記軽鎖又は重鎖ＣＤＲのいずれか１つ又は複数は、１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つのアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を含んでもよい。任意に、抗体３２Ｃ４の抗原結合領域の一部若しくは全部を含む軽鎖及び／又は重鎖可変領域のいずれかが、ＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、任意にヒト定常領域、任意にヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４アイソタイプに融合された抗体が提供される。別の好ましい実施形態では、抗体は、３２Ｃ４である。
別の態様では、本発明は、抗体、又は抗体をコードする精製ポリヌクレオチドを提供し、ここで、抗体は、以下を含む：１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号２７、２８若しくは２９に記載のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号３０若しくは３１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域。
別の態様では、本発明は、ヒトＴＬＲ３に結合する抗体を提供し、この抗体は、以下を含む：
ａ．１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号２５の重鎖可変領域；又は
ｂ．１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号２６の軽鎖可変領域；又は
ｃ．１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列番号２５の重鎖可変領域と；１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号２６の軽鎖可変領域；又は
ｄ．１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号２７〜３２に示される重鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列；又は
ｅ．１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号３３〜３５に示される軽鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列；又は
ｆ．１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号２７〜３２に示される重鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列と；１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号３３〜３５に示される軽鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列；又は
ｇ．各々が、配列番号２５のアミノ酸配列を有する可変領域のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％同一のＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列を有し、１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、重鎖可変領域；又は
ｈ．各々が、配列番号２６のアミノ酸配列を有する可変領域のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％同一のＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列を有し、１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、軽鎖可変領域。
本明細書に記載する実施形態のいくつかの別の態様では、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、２及び３のいずれかは、対応する配列番号に記載される特定のＣＤＲ又はＣＤＲのセットと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することを特徴とするものでもよい。
別の態様では、本発明は、ＴＬＲ３との結合について、上の（ａ）〜（ｈ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。
抗体３７Ｂ７
３７Ｂ７の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号３６として記載され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３７として記載される。具体的実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体３７Ｂ７とほぼ同じエピトープ又は決定基に結合する抗体を提供し；任意に、抗体は、抗体３７Ｂ７の抗原結合領域を含む。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、抗体３７Ｂ７は、そのアミノ酸配列及び／又はそれをコードする核酸配列を特徴とするものでよい。好ましい一実施形態において、モノクローナル抗体は、３７Ｂ７のＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２部分を含む。また、３７Ｂ７の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。一実施形態によれば、モノクローナル抗体は、３７Ｂ７の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。また、３７Ｂ７の可変軽鎖可変領域、又は３７Ｂ７の軽鎖可変領域のＣＤＲの１つ、２つ若しくは３つをさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意に、前記軽鎖又は重鎖ＣＤＲのいずれか１つ又は複数は、１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つのアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を含んでもよい。任意に、抗体３７Ｂ７の抗原結合領域の一部若しくは全部を含む軽鎖及び／又は重鎖可変領域のいずれかが、ＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、任意にヒト定常領域、任意にヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４アイソタイプと融合した抗体が提供される。別の好ましい実施形態では、抗体は、３７Ｂ７である。
別の態様では、本発明は、抗体、又は抗体をコードする精製ポリヌクレオチドを提供し、ここで、抗体は、以下を含む：１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号３８、３９若しくは４０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号４１若しくは４２に記載のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号４６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域。
別の態様では、本発明は、ヒトＴＬＲ３に結合する抗体を提供し、この抗体は、以下を含む：
ａ．１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号３６の重鎖可変領域；又は
ｂ．１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号３７の軽鎖可変領域；又は
ｃ．１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列番号３６の重鎖可変領域と；１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号３７の軽鎖可変領域；又は
ｄ．１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号３８〜４３に示される重鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列；又は
ｅ．１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号４４〜４６に示される軽鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列；又は
ｆ．１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号３８〜４３に示される重鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列と；１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号４４〜４６に示される軽鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列；又は
ｇ．各々が、配列番号３６のアミノ酸配列を有する可変領域のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％同一のＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列を有し、１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、重鎖可変領域；又は
ｈ．各々が、配列番号３７のアミノ酸配列を有する可変領域のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％同一のＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列を有し、１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、軽鎖可変領域。
本明細書に記載する実施形態のいくつかの別の態様では、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、２及び３のいずれかは、対応する配列番号に記載される特定のＣＤＲ又はＣＤＲのセットと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することを特徴とするものでもよい。
別の態様では、本発明は、ＴＬＲ３との結合について、上の（ａ）〜（ｈ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。
抗体７Ｇ１１
７Ｇ１１の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４７として記載され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４８として記載される。具体的実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体７Ｇ１１とほぼ同じエピトープ又は決定基に結合する抗体を提供し；任意に、抗体は、抗体７Ｇ１１の抗原結合領域を含む。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、抗体７Ｇ１１は、そのアミノ酸配列及び／又はそれをコードする核酸配列を特徴とするものでよい。好ましい一実施形態において、モノクローナル抗体は、７Ｇ１１のＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２部分を含む。また、７Ｇ１１の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。一実施形態によれば、モノクローナル抗体は、７Ｇ１１の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。また、７Ｇ１１の可変軽鎖可変領域、又は７Ｇ１１の軽鎖可変領域のＣＤＲの１つ、２つ若しくは３つをさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意に、前記軽鎖又は重鎖ＣＤＲのいずれか１つ又は複数は、１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つのアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入若しくは欠失）を含んでもよい。任意に、抗体７Ｇ１１の抗原結合領域の一部若しくは全部を含む軽鎖及び／又は重鎖可変領域のいずれかが、ＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、任意にヒト定常領域、任意にヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４アイソタイプと融合した抗体が提供される。別の好ましい実施形態では、抗体は、７Ｇ１１である。
別の態様では、本発明は、抗体、又は抗体をコードする精製ポリヌクレオチドを提供し、ここで、抗体は、以下を含む：１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号４９、５０若しくは５１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号５２若しくは５３に記載のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域；１個又は複数個のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号５７に記載のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域。
別の態様では、本発明は、ヒトＴＬＲ３に結合する抗体を提供し、この抗体は、以下を含む：
ａ．１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号４７の重鎖可変領域；又は
ｂ．１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号４８の軽鎖可変領域；又は
ｃ．１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列番号４７の重鎖可変領域と；１、２、３又は４個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号４８の軽鎖可変領域；又は
ｄ．１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号４９〜５４に示される重鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列；又は
ｅ．１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号５５〜５７に示される軽鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列；又は
ｆ．１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号４９〜５４に示される重鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列と；１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、配列番号５５〜５７に示される軽鎖ＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列；又は
ｇ．各々が、配列番号４７のアミノ酸配列を有する可変領域のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％同一のＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列を有し、１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、重鎖可変領域；又は
ｈ．各々が、配列番号４８のアミノ酸配列を有する可変領域のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％同一のＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列を有し、１、２、３、４、５又は６個以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、軽鎖可変領域。
本明細書に記載する実施形態のいくつかの別の態様では、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、２及び３のいずれかは、対応する配列番号に記載される特定のＣＤＲ又はＣＤＲのセットと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することを特徴とするものでもよい。
別の態様では、本発明は、ＴＬＲ３との結合について、上の（ａ）〜（ｈ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。
抗体７Ｇ１１及び３２Ｃ４のＣＤＲ配列は、軽鎖及び重鎖それぞれについて、ラットＩＧＫＶ１２ｓ３０＊０１及びＩＧＨＶ１ｓ６＊０１遺伝子のＶＬ及びＶＨ遺伝子再構成に由来する。抗体３１Ｆ６の重鎖のＣＤＲ配列は、ラットＩＧＨＶ１ｓ６＊０１遺伝子のＶＨ遺伝子再構成に由来し、軽鎖ＣＤＲ配列は、ラットＩＧＫＶ１２ｓ８＊０遺伝子のＶＬ遺伝子再構成に由来する。本発明の一態様では、本発明の一抗体の軽鎖は、Ｖ遺伝子に関し、ＩＧＫＶ１２ｓ３０＊０１及びＩＧＫＶ１２ｓ８＊０から選択されるＶＬ遺伝子再構成に由来する核酸配列から得られるか、又はこの核酸配列によりコードされる。本発明の一態様において、本発明の一抗体の重鎖は、Ｖ遺伝子に関し、ＩＧＨＶ１ｓ６＊０１から選択されるＶＨ遺伝子再構成に由来する核酸配列から得られるか、又はこの核酸配列によりコードされる。
本発明の抗体、例えば、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７のいずれかにおいて、記載される可変領域及びＣＤＲ配列は、保存的配列修飾を含んでいてもよい。保存的配列修飾は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響しないか、又はこれらを有意に改変しないアミノ酸修飾を指す。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加及び欠失を含む。修飾は、部位指定突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当分野では公知の標準的技術により本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、典型的に、１つのアミノ酸残基が、類似の物理化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。記載される可変領域及びＣＤＲ配列は、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上のアミノ酸挿入、欠失若しくは置換を含んでもよい。置換を実施する場合、好ましい置換は、保存的修飾である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。従って、本明細書に開示のアッセイを用いて、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１つ又は複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換することができ、保持される機能（すなわち、本明細書に記載する特性）について改変抗体を試験することができる。
「同一性」又は「同一の」という用語は、２つ以上のポリペプチドの配列同士の関係について用いられる場合、ポリペプチド同士の配列関係性の程度を指し、これは、２つ以上のアミノ酸残基の鎖同士の一致の数によって決定する。「同一性」は、ギャップアラインメントにより２つ以上の配列のより小さいもの同士の完全な一致（もしあれば）の割合（％）を計るもので、これは、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって処理される。関連ポリペプチド同士の同一性は、公知の方法により容易に計算することができる。このような方法として、限定しないが、以下に記載されているものが挙げられる：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．、及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；並びにＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）。
同一性を決定するための好ましい方法は、試験対象の配列同士の最大の一致をもたらすように設計される。同一性を決定する方法は、一般に入手可能なコンピュータプロフラムに記載されている。２つの配列同士の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージがあり、以下のものが挙げられる：ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及び他の供給源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、前掲）から一般に入手可能である。また、公知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて、同一性を決定することもできる。
ＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデル化ソフトウェア定義）、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ定義システムに従い、本発明の抗体のＣＤＲの配列を以下の表１及び２にまとめた。本明細書に記載のアミノ酸配列は、ＡｂＭ、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムに従って番号付けする。任意の好適な番号付けシステムを用いてＣＤＲ領域を示してよいが、他の表示がない場合、Ａｂｍ番号付けを用いることができる。このような番号付けは、以下の表示を用いて、確立されている：ＣＤＲ−Ｌ１：開始：ほぼ残基２４、前の残基：常にＣｙｓ、後ろの残基：常にＴｒｐ（典型的にはＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎであるが、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕの場合もある）、長さ：１０〜１７残基；ＣＤＲ−Ｌ２：開始：常にＬ１の末端から１６残基後、前の残基：一般に、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（しかし、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ、Ｉｌｅ−Ｐｈｅの場合もある）、長さ：常に７残基；ＣＤＲ−Ｌ３、開始：常にＬ２の末端から３３残基後、前の残基：常にＣｙｓ、後ろの残基：常にＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙ、長さ７〜１１残基；ＣＤＲ−Ｈ１、開始：ほぼ残基２６（常にＣｙｓの４残基後）（Ｃｈｏｔｈｉａ／ＡｂＭ定義、Ｋａｂａｔ定義では、５残基後に開始）、前の残基：常にＣｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ、後ろの残基：常にＴｒｐ（典型的には、Ｔｒｐ−Ｖａｌだが、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ、Ｔｒｐ−Ａｌａの場合もある）、長さ：１０〜１２残基（ＡｂＭ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義では、最後の４残基を排除する）；ＣＤＲ−Ｈ２、開始：常に、ＣＤＲ−Ｈ１のＫａｂａｔ／ＡｂＭ定義の末端から１５残基後、前の残基：典型的には、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（しかし、Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａ後の残基など、いくつかの変形がある）、長さ：Ｋａｂａｔ定義で１６〜１９残基；ＡｂＭ（及びＣｈｏｔｈｉａ）定義では、７残基早く終了；ＣＤＲ−Ｈ３、開始：常に、ＣＤＲ−Ｈ２の末端から３３残基後（常にＣｙｓから２残基後）、前の残基：常にＣｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ（典型的に、Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ）、後ろの残基：常にＴｒｐ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙ、長さ：３〜２５残基。
一実施形態において、本発明の抗体は、ヒトまたはマウスＩｇＧ１アイソタイプのものである。別の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプのものである。別の実施形態では、本発明の抗体は、その結合及び／又は機能的特性を保持する抗体フラグメントである。
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本モノクローナル抗体のフラグメント及び誘導体
本発明の抗体のフラグメント及び誘導体（特に記載されないか、または文面と明らかに矛盾しない限り、本出願で用いられる「抗体」または「（複数の）抗体」という用語により包含される）、好ましくは、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７様抗体は、当分野において公知の技術により生成することができる。「フラグメント」は、インタクトな抗体の一部、一般に抗原結合部位または可変領域を含む。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；連続したアミノ酸残基の非分断配列から構成される一次構造を有するポリペプチド（本明細書では、「一本鎖抗体フラグメント」又は「一本鎖ポリペプチド」と呼ぶ）であるあらゆる抗体フラグメントが挙げられ、限定しないが、以下のものを含む：（１）一本鎖Ｆｖ分子、（２）関連重鎖部分を含まず、１つの軽鎖可変ドメインのみ含有する一本鎖ポリペプチド、又は軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するその断片、並びに（３）関連軽鎖部分を含まず、１つの重鎖可変領域のみ含有する一本鎖ポリペプチド、または重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するその断片；並びに抗体フラグメントから形成される多重特異的抗体。中でも、ナノボディ、ドメイン抗体、シングルドメイン抗体又は「ｄＡｂ」が含まれる。
本抗体のフラグメントは、標準的方法を用いて、取得することができる。例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２フラグメントは、従来の技術に従い、単離された抗体のプロテアーゼ消化により生成してよい。公知の方法を用いて、免疫反応性フラグメントを修飾できることは理解されよう。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスを緩徐にして、より望ましい薬物動態学的プロフィールを得るために、フラグメントをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾してもよい。ＰＥＧをＦａｂ’フラグメントと連結して、部位特異的に結合させるための方法は、例えば、Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ，１６（３）：１０６−１１９（２００１）及びＤｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７３（２）：１７５−１８２（１９９６）に記載されており、その開示内容は、参照として本明細書に組み込む。
あるいは、本発明の抗体、好ましくは、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７様抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡを、本発明のフラグメントをコードするように修飾してもよい。次いで、修飾されたＤＮＡを発現ベクターに挿入し、これを用いて、適切な細胞を形質転換又はトランスフェクトすれば、この細胞は、要望されるフラグメントを発現する。
特定の実施形態において、本発明の抗体、好ましくは、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７様抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡは、発現ベクターに挿入する前に、例えば、相同性非ヒト配列をヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列で置換する（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ｐｐ．６８５１（１９８４））ことにより、又は免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることにより、修飾することができる。この方法で、元の抗体の結合特異性を有する「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体が調製される。典型的に、このような非免疫グロブリンポリペプチドで、本発明の抗体の定常ドメインを置換する。
従って、実施形態によれば、本発明の抗体、好ましくは、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７様抗体をヒト化する。本発明の抗体の「ヒト化」形態は、マウス又はラット免疫グロブリン由来の最小配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖若しくはそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は抗体の他の抗原結合サブ配列）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、元の抗体の要望される特異性、親和性、及び能力を維持しながら、元の抗体（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
あるケースでは、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を、対応する非ヒト残基により置換してもよい。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又は移入ＣＤＲ若しくはフレームワーク配列のいずれかに存在しない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに改善及び最適化するために実施する。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、これらのドメインにおいて、ＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部は、元の抗体のものと一致し、ＦＲ領域の全部又は実質的に全部は、ヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意に、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部も含み得る。さらに詳細については、以下を参照されたい：Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，ｐｐ．５２２（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，ｐｐ．３２３（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２，ｐｐ．５９３（１９９２）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，ｐｐ．１５３４；米国特許第４，８１６，５６７号明細書（これらの全開示内容は、参照として本明細書に組み込む）。本発明の抗体をヒト化する方法は、当分野では公知である。
ヒト化抗体を作製するのに用いるヒト可変ドメイン（軽鎖及び重鎖の両方）の選択は、抗原性を低減する上で非常に重要である。いわゆる「最良適合」法によれば、本発明の抗体の可変ドメインの配列を公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。マウスの配列に最も近いヒト配列がヒトフレームワーク（ＦＲ）として容認されている（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，ｐｐ．２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．１９６，１９８７，ｐｐ．９０１）。別の方法では、特定の亜群の軽鎖又は重鎖の全ヒト抗体の共通配列由来の特定のフレームワークを用いる。複数の異なるヒト化抗体のために同じフレームワークを用いることができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８９，ｐｐ．４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１，Ｐ．２６２３（１９９３））。
さらに、抗体は、ＴＬＲ３受容体に対する高い親和性及び他の生物学的特性を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するために、好ましい方法によれば、親配列及びヒト化配列の３次元モデルを用いて、親配列と様々な概念上のヒト化産物の分析方法により、ヒト化抗体を調製する。３次元免疫グロブリンモデルは市販されており、当業者には周知である。選択した候補免疫グロブリン配列の予想される３次元構造を描き、ディスプレイするコンピュータプログラムが入手可能である。これらのディスプレイを詳しく調べることにより、候補免疫グロブリンの機能における残基の推定役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析が可能になる。このように、標的抗原に対する高い親和性などの要望される抗体特性が達成されるように、共通及び移入配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響をもたらす上で直接、かつ最も実質的に関与している。
「ヒト」モノクローナル抗体を作製する別の方法は、免疫に用いられるマウスとしてＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用するものである。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、本発明のマウス宿主であり、その免疫グロブリン遺伝子は、機能性免疫ヒトグロブリン遺伝子で置換されている。従って、このマウスにより、又はこのマウスのＢ細胞由来のハイブリドーマ中に産生される抗体は、ヒト（又は既にヒト化された）抗体である。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、米国特許第６，１６２，９６３号明細書（これは、その全体を参照として本明細書に組み込む）に記載されている。
ヒト抗体は、様々な他の技術に従って、例えば、免疫のためには、ヒト抗体レパトアを発現するように改変された他のトランスジェニック動物（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ ｅｔ Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５）、ファージディスプレイ方法を用いた抗体レパトアの選択により、生成することもできる。こうした技術は、当業者には公知であり、本出願で開示したモノクローナル抗体から出発して実施する。
本発明の抗体、好ましくは、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４若しくは３７Ｂ７様抗体は、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）に誘導体化してもよく、ここで、これらが、要望される生物学的活性及び結合特異性を呈示する限り、重鎖／軽鎖の一部は、元の抗体における対応する配列と同じか、又は相同的であり、また、鎖の残りの部分は、別の種に由来するか、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体、並びにそのような抗体のフラグメントにおける対応する配列と同じか、又は相同的である（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、前掲；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｐｐ．６８５１（１９８４））。
投与計画
抗ＴＬＲ３抗体を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏ実験中に収集した効力データに基づき、本発明者らは、１００μｇ／マウスという低い用量が、治療効果を生み出すことを確認した。このような用量は、マウスでは４ｍｇ／ｋｇに相当し、従って、ヒト被験者では、０．５ｍｇ／ｋｇに相当する。従って、本発明の方法において、抗ＴＬＲ３抗体は、ヒトの場合、０．０５〜２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｋｇ（約２５ｍｇ〜５００ｍｇの単位用量）の用量で投与することができる。
例示的治療計画は、週２回、週１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、１ヵ月に１回、２〜３ヵ月に１回、又は３〜６ヵ月に１回の投与を含む。抗ＴＬＲ３抗体の例示的投与計画としては、静脈内投与又は皮下注射による０．０５〜２０ｍｇ／ｋｇ（体重）（好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｋｇ）が挙げられ、抗体は、以下の投与スケジュールの１つを用いて投与される：（ｉ）ほぼ１、２、３若しくは４週毎に複数回（例えば、２〜４回投与）の投与後、１ヵ月〜３ヵ月毎の投与；（ｉｉ）１ヵ月に１回〜２ヵ月に１回；（ｉｉｉ）１〜２週間毎、又はいずれか他の最適な投与。
抗ＴＬＲ３抗体は、任意に、実質的に完全なＴＬＲ３受容体飽和（９０％、任意に９５％受容体飽和）、例えば、標的細胞において発現されたＴＬＲ３ポリペプチドの飽和を誘導するのに好適な量を投与する。ＴＬＲ３受容体は、シグナル伝達の前に二量体化すると考えられることから、完全な飽和より少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％低い受容体飽和の阻害が疾患の治療に有用であろう。一実施形態において、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、９０％若しくは９５％の受容体飽和をもたらす抗ＴＬＲ３抗体の量を毎週約２回から毎月約１回まで投与する。用量は、例えば、少なくとも３回、少なくとも６回、又は７回以上投与することができる。例えば、この方法は、少なくとも約２週間、１ヵ月、６ヵ月、９ヵ月若しくは１２ヵ月にわたって標的細胞に対し、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、９０％若しくは９５％のＴＬＲ３受容体飽和を達成する用量及び投与頻度で、抗ＴＬＲ３抗体を投与することを含んでもよい。１つの好ましい実施形態において、ある投与計画は、実質的に完全な受容体飽和の持続をもたらす。実質的に完全な受容体飽和をもたらす抗ＴＬＲ３抗体の用量は、少なくとも約１週間、２週間若しくは１ヵ月の期間にわたり実質的に完全な受容体飽和をもたらす抗ＴＬＲ３抗体の用量が投与される。
標識細胞が存在するヒトサンプル（例えば、全血液、炎症部位であるいずれかの組織、滑液）について受容体占有度を評価することができる。ＴＬＲ３受容体は細胞内に存在することから、ＴＬＲ３受容体の飽和度（％）は、公知の方法を用いたＦＡＣＳ分析により分析することができる。あるいは、飽和の割合は、患者から得られる単核細胞（好ましいＰＢＭＣ）中のｄｓＲＮＡ（すなわち、ｐｏｌｙＡＵ）などのＴＬＲ３リガンドに応答するサイトカイン阻害分泌プロフィールを用いて、決定することができる。効率的なサイトカイン阻害は、効率的な治療効果と相関するため、投与量は各患者について適合させることができる。このアッセイで測定することができるサイトカインは、例えば、ＩＰ−１０又はＩＰ−６である。別の実施形態では、受容体飽和は、例えば、遊離部位及び結合部位アッセイを実施することにより、受容体占有度として評価する。手短には、遊離及び結合ＴＬＲ３受容体レベルは、抗ＴＬＲ３抗体で処置した個体から得た生体サンプルからの標的細胞について評価し、この場合、遊離部位アッセイは、個体に投与された抗ＴＬＲ３抗体のＰＥ結合形態を用いた染色により、非結合ＴＬＲ３を評価する。結合部位アッセイは、ＴＬＲ３ポリペプチドに結合した抗ＴＬＲ３抗体を認識するＰＥ結合マウス抗ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体（抗ＴＬＲ３抗体がヒトＩｇＧ４アイソタイプである場合）を用いた染色により、抗ＴＬＲ３抗体によって占有されるＴＬＲ３ポリペプチドを評価する。一実施形態において、本発明はさらに、個体を治療する方法を提供し、この方法は、以下（ａ）抗ＴＬＲ３抗体を個体に投与するステップと、（ｂ）個体におけるＴＬＲ３受容体を決定し、任意に、個体に投与すべき抗ＴＬＲ３抗体の用量をさらに決定するステップを含む。
投与形態
本発明に従い用いるアンタゴニストの治療製剤は、要望される純度を有するアンタゴニストと、任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤若しくは安定剤を凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で混合することにより、貯蔵用に調製する。製剤に関する一般的情報については、例えば、以下を参照されたい：Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ Ｅｄ．（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）；Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０）；Ａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３）；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０）；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０）；及びＷａｌｔｅｒｓ（ｅｄ．），Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），Ｖｏｌ １１９（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００２）。
許容される担体、賦形剤若しくは安定剤は、使用される用量及び濃度で受容体に対し非毒性であり、以下を含む：リン酸、クエン酸、及びその他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンなどの酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化物；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース若しくはデキストリンなどの他の炭水化物；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、亜鉛−タンパク質複合体）；及び／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、若しくはＰＥＧなどのノニオン性界面活性剤。
例示的抗体製剤は、例えば、国際公開第１９９８／５６４１８号パンフレットに記載されており、これは、抗ＣＤ２０抗体の液体複数回用量製剤を記載し、この製剤は、４０ｍｇ／ｍＬのリツキシマブ、２５ｍＭ酢酸塩、１５０ｍＭトレハロース、０．９％ベンジルアルコール、及び２〜８℃で２年貯蔵の最小貯蔵寿命を有するｐＨ５．０の０．０２％ポリソルベート（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）２０（商標）を含む。対象となる別の抗ＣＤ２０製剤は、９．０ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬのポリソルベート（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）８０（商標）、及び滅菌注射用蒸留水、ｐＨ６．５中に１０ｍｇ／ｍＬのリツキシマブを含む。
皮下投与に適合させた凍結乾燥製剤は、例えば、米国特許第６，２６７，９５８号明細書（Ａｎｄｙａ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。このような凍結乾燥製剤は、好適な希釈剤を用いて、高タンパク質濃度に再構成することができ、再構成した製剤を本明細書において治療しようとする哺乳動物に皮下投与することができる。
アンタゴニストの結晶化形態も考慮される。例えば、米国特許第２００２／０１３６７１９Ａ１号明細書（Ｓｈｅｎｏｙ ｅｔ ａｌ．）を参照されたい。
本明細書の製剤はまた、１種以上の活性化合物（前述した第２薬剤）、好ましくは、互いに有害に作用しない相補的活性を有するものを含んでもよい。このような薬剤の種類及び有効量は、例えば、製剤に存在するＢ細胞アゴニストの量及び種類、被験者の臨床パラメータに応じて異なる。こうした好ましい第２薬剤については上に記載している。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合により調製したマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに閉じ込めてもよく、それぞれ、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）又はマクロエマルションを用いて実施する。こうした技術は、例えば、前掲のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに開示されている。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例として、アンタゴニストを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセルなどの造形品の形態をしている。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩、非分解性エチレン−酢酸ビニル、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドから構成される注射用ミクロスフィア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために用いられる製剤は無菌でなければならない。これは、細菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。これらの組成物に用いることができる薬学的に許容される担体としては、限定しないが、以下のものが挙げられる：イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などのバッファー物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩又は電解物、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂。本発明の抗体は、患者におけるＴＬ３発現細胞の活性を調節、例えば、阻害する方法に用いることができる。この方法は、患者を前記組成物と接触させる（例えば、患者に前記組成物を投与する）ステップを含む。このような方法は、予防及び治療目的の両方に有用である。
製剤は、鼻内又は吸入経路に適合させてもよい。製剤は、薬学的に許容される鼻内担体を含んでもよい。鼻内送達の場合、点鼻薬、鼻内スプレー、鼻内液体又は粉末エアゾル、カプセル又は鼻内挿入物などのあらゆる公知の送達方法を用いることができる。エアゾル送達の場合、ネブライザー、吸入器、噴霧器、エアゾル投与器、ミスト噴霧器、乾燥粉末吸入器、計測用量吸入器、計測用量スプレー、計測用量ミスト噴霧器、計測用量噴霧器などの、任意の公知の送達方法、又はその他の好適な送達装置を用いることができる。
本発明の別の形態及び利点は、以下の実験の項で開示するが、これは、例示的なものとしてみなすべきであり、本出願の範囲を限定するものではない。
疾患の治療
本発明は、自己免疫又は炎症性疾患を有する個体の治療のための方法であって、この方法は、本発明の抗ＴＬＲ３抗体を個体に投与することを含む。抗体は、薬学的に許容される担体をさらに含む組成物に含有させてもよい。このような組成物は、本発明の「抗体組成物」とも呼ばれる。一実施形態では、本発明の抗体組成物は、前述の抗体実施形態に開示した抗体を含む。
本発明はまた、必要とする患者においてＴＬＲ３発現細胞活性を調節する方法もさらに提供し、この方法は、本発明の組成物を前記患者に投与するステップを含む。この方法は、より具体的には、ＴＬＲ３細胞活性の低減が有益である疾患（例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、ウイルス感染）、又は過剰ＴＬＲ３細胞活性を原因とするか、若しくはこれを特徴とする疾患を有する患者においてＴＬＲ３細胞活性を低減することに関する。一実施形態において、ＴＬＲ３発現細胞の活性が阻害されるが、ここで、患者は、疾患又は障害を有し、このような阻害が、治療効果を促進、増強、及び／若しくは誘導し得る（又は、疾患又は障害、の患者、並びに該患者と実質的に同様の特徴を有する患者の少なくとも実質的割合で、例えば、臨床試験により決定され得るような効果を促進、増強、及び／若しくは誘導する）。
本発明を用いることができる疾患及び障害は、ＴＬＲ３の調節が有益である全ての疾患を包含し、例えば、ＴＬＲ３シグナル伝達により、又は前記ＴＬＲ３シグナル伝達時に産生されるサイトカインにより、部分的に若しくは総じて媒介されるか又は悪化する疾患を含む。特に、ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する抗体を用いる場合、こうした障害は、ＴＬＲ３シグナル伝達により、又は前記ＴＬＲ３シグナル伝達時に産生されるサイトカインにより、部分的に若しくは総じて媒介されるか若しくは悪化するあらゆる障害を含み、中でも、炎症性疾患及び自己免疫疾患などの免疫障害が挙げられる。より具体的には、本発明の方法は、限定しないが、自己免疫、炎症、アレルギー、喘息、感染（例えば、慢性感染、ウイルス感染）及び敗血症などの様々な免疫障害又は他の疾患の治療に使用される。ＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する抗体を用いて治療することができる疾患の例として、限定しないが、関節炎、全身性エリテマトーデス、敗血症、喘息、骨粗鬆症、中枢神経系抗原に対する自己免疫、自己免疫性糖尿病、炎症性腸疾患、自己免疫性心臓炎及び自己免疫性肝炎が挙げられる。
別の実施形態では、ＴＬＲ３ポリペプチドによるシグナル伝達を阻害する本発明の抗ＴＬＲ３抗体は、例えば、移植又は注入での移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の治療又は予防に用いられる。特に、骨髄移植後に、移植片に存在するＴ細胞は、混入物として存在するか、又は意図的に宿主に導入されたかのいずれであっても、宿主組織を抗原として外来であると認識した後、移植片レシピエントの組織を攻撃する。Ｔ細胞は、過剰のサイトカイン、例えば、ＴＮＦ−α及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生する。抗ＴＬＲ３抗体は、特に癌、例えば、白血病の治療における例えば、同種異系骨髄移植などの移植又は移入前、その過程、若しくはその後に投与することができる。抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドのシグナル伝達を阻害するあらゆる抗ＴＬＲ３抗体であってよい。ＧｖＨＤは、主に抗原提示細胞により駆動されると考えられることから、ＤＣにおいてＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する抗ＴＬＲ３抗体が特に有用であると考えられる。
本発明に従いＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する抗ＴＬＲ３抗体を用いて治療が可能な他の免疫障害として、中でも、以下を含む自己免疫障害及び炎症性障害が挙げられるが、これらに限定されるわけではない：クローン病、セリアック病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、再生不良性貧血、自己免疫性肝炎、糖尿病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、エリテマトーデス、脱髄状態、多発性硬化症、重症筋無力症、オプトクローヌス・ミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、視神経炎、オード甲状腺炎、天疱瘡、硬変、乾癬、リウマチ様関節炎、ライター症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎、湿式自己免疫性溶血性貧血、ウェゲナー肉芽腫症、虫垂炎、動脈炎、関節炎、眼瞼炎、細気管支炎、気管支炎、滑液包炎、頸管炎、胆管炎、胆嚢炎、絨毛羊膜炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、涙腺炎、皮膚炎、皮膚筋炎、脳炎、心内膜炎、子宮内膜炎、腸炎、小腸結腸炎、上顆炎、精巣上体炎、筋膜炎、結合組織炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、肝炎、化膿性汗腺炎、回腸炎、虹彩炎、喉頭炎、乳腺炎、髄膜炎、脊髄炎、心筋炎、筋炎、腎炎、臍炎、卵巣炎、精巣炎、骨炎、耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、腹膜炎、喉頭炎、胸膜炎、静脈炎、肺臓炎、直腸炎、前立腺炎、腎盂腎炎、鼻炎、卵管炎、静脈洞炎、口内炎、滑膜炎、腱炎、扁桃炎、ブドウ膜炎、膣炎、脈管炎、及び外陰炎。
本発明の一態様は、ＳＩＲＳ、敗血症、重症敗血症又は敗血症性ショックを治療することができる組成物を提供することである。本発明の別の態様は、敗血症を発症する恐れのある患者の予防的治療のための方法を提供することである。例えば、脾臓を手術により摘出した患者、免疫不全患者（すなわち、化学療法、免疫抑制）、しかしまた、長期ステロイド治療、糖尿病、ＡＩＤＳ、又は硬変、広範囲の熱傷若しくは重症の外傷、肺炎、髄膜炎、腹膜炎、虫垂炎、蜂巣織炎、尿路感染症又は大手術後に起こる感染などの他の原因。
一実施形態において、個体は、かなり以前（例えば、１年以上前）に宣告された自己免疫又は炎症性疾患を有し、進行中若しくは活動性炎症を有し、疾患の身体徴候（例えば、関節膨脹、病変、神経学的症状など）を有し、慢性疾患を有し、重症疾患（適用可能な基準、例えば、リウマチ様関節炎の場合、ＤＡＳ若しくはＡＣＲ基準により評価される）を有するか、又は進行中の疾患を有する。
一実施形態において、本発明は、定着した自己免疫又は炎症性疾患を有する個体の治療方法を提供し、この方法は、抗ＴＬＲ３抗体を個体に投与することを含む。一実施形態では、本発明は、ＴＬＲ３抗体（又は関連組成物）を用いて、自己免疫若しくは炎症性疾患の急性期、又は発作、発症、悪化若しくは再燃を治療するための方法を提供し、好ましくは、自己免疫若しくは炎症性疾患の急性期、又は発作、発症、悪化若しくは再燃の間に、前記抗体を個体に投与する。一実施形態では、疾患は、リウマチ様関節炎、若年性突発性関節炎、多発性硬化症、クローン病若しくは直腸結腸炎、エリテマトーデス、肝炎、慢性閉塞性肺病（ＣＯＰＤ）又は喘息、強直性脊椎炎及び関連疾患からなる群から選択される。一実施形態では、疾患は、ＴＬＲ３リガンド（例えば、細胞外ｄｓＲＮＡ）の存在を特徴とする。一実施形態では、疾患は、検出可能レベルのタンパク質分解酵素、炎症性メディエータ、進行中の炎症のマーカ又は炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α及び／又はインターロイキン−１（ＩＬ−１））を特徴とする。好ましくは、抗体は、任意選択によりさらに酸性条件下で、高い結合親和性で、任意選択によりヒト樹状細胞において、ＴＬＲ３ポリペプチドによるシグナル伝達を阻害する。
治療は、一般に、いずれかの症状若しくは病態が発症若しくは悪化するのを予防する目的で、又は既に発症したそのような症状若しくは病態を阻止（例えば、進行を阻止するか、若しくは遅らせる）、軽減、改善、又は根治（治癒）する目的で、抗ＴＬＲ３抗体を含む有効量の組成物を送達することを含む。疾患の診断、進展及び等級付け（又は病期分類）は、特定のタイプの疾患について、個体が、定着した疾患を有するか、急性期であるか、進行中であるか、慢性であるか、身体症状を有するか、又はある程度の重症度であるか否かを決定するための標準的な医学的基準により確定することができる。同様に、任意の好適な医学的基準により発作、発症、悪化又は再燃も見出すことができる。
一実施形態において、本発明は、疾患の存在、病期、進展又は等級付けを評価するための評価又は試験ステップを実施するステップを含む。従って、一態様では、本発明は、患者における自己免疫又は炎症性疾患の治療方法を提供し、この方法は、（ａ）患者における疾患の評価を実施するステップと；（ｂ）前記患者が、本発明の抗ＴＬＲ３抗体による治療に適した疾患を有している場合、有効量の抗ＴＬＲ３抗体を前記患者に投与するステップを含む。任意に、このような評価ステップは、自己免疫又は炎症性疾患を有することが疑われる患者から生体サンプルを取得することを含んでもよい。疾患を評価（例えば、診断、病期分類）する方法は、当分野では公知の好適な技術、例えば、検査室での試験の実施により、達成することができる。好適な技術の例として、以下のものが挙げられる：ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲアッセイ（例えば、一般に「マーカ」又は「バイオマーカ」と呼ばれる、疾患に関連する核酸又は遺伝子を検出することを目的として）、生検、内視鏡検査、検便、いずれかの非侵襲性検査室試験（例えば、貧血及び感染、肝臓及び胆管障害をスクリーニングするための肝機能試験、細菌、ウイルス及び寄生体感染についての試験）、超音波、ＣＴ、ＭＲＥ、ＭＲＩ及びその他の画像技術、染色体分析、免疫アッセイ／免疫細胞化学的検出技術（例えば、自己抗体の存在）、組織学及び／又は組織病理学的アッセイ、血清タンパク質電気泳動、フローサイトメトリー（例えば、免疫細胞、Ｔ細胞などの検出）、動脈血ガス（ＡＢＧ）分析（喘息若しくはＣＯＰＤの場合）、並びに身体検査技術（例えば、身体症状の場合、滑膜炎を有する関節の数）。一実施形態において、この方法は、自己抗体の存在を検出する、例えば、リウマチ因子（ＲｈＦ）、抗環状シトルリン化ペプチド抗体、抗ｓｓＲＮＡ、抗ｄｓＲＮＡ、抗Ｓｍｉｔｈ、抗リン脂質、抗核及び／又は抗アクチン抗体を検出するステップを含む。一実施形態では、本方法は、タンパク質分解酵素、炎症性メディエータ、進行中の炎症のマーカ又は炎症性サイトカインを評価するステップを含む。一実施形態では、本方法は、ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベル及び／又は赤血球沈殿速度を決定するステップを含む。個体が、異常な結果（疾患、悪化、進行中の炎症などを示す）、例えば、異常レベルのＡＢＧ、自己抗体、ＣＲＰ、いずれかのタンパク質分解酵素、炎症性メディエータ又は進行中の炎症のマーカを有するという決定は、その個体が、抗ＴＬＲ３抗体による治療に適していることを示している。
被験者への抗ＴＬＲ３抗体の送達（直接投与、又はそこでの核酸、例えば、抗ＴＬＲ３抗体コード核酸配列を含むポックスウイルス遺伝子輸送ベクターからの発現のいずれかにより）及び本発明の他の方法の実施を用いて、疾患又は疾患の進行を軽減、治療、予防、あるいはまた改善することができる。本発明の方法は、特に、炎症及び／又は組織損傷、並びにそれらに関するいずれかのパラメータ又は症状（例えば、循環又は特定の組織における炎症のマーカの存在、炎症性細胞の数）の軽減及び／又は改善に有用である。
抗ＴＬＲ３抗体は、定着した疾患を治療するのに有利に用いることができる。「定着した疾患」とは、かなり以前に、例えば、１年以上前に、宣告された自己免疫又は炎症性疾患を指す。具体的疾患に応じて、定着した疾患は、治療の存在又は非存在下で、制御されていない、例えば、依然として進行中であるか、又は患者が寛解を経験していない疾患を意味する。一態様では、本発明は、患者における自己免疫又は炎症性疾患の治療方法を提供し、この方法は、（ａ）前記患者が定着した疾患を有するかどうかを決定するステップと；（ｂ）前記患者が、定着した疾患を有する場合、有効量の抗ＴＬＲ３抗体を前記患者に投与するステップを含む。
抗ＴＬＲ３抗体は、慢性疾患を治療するのに有利に用いることができる。「慢性疾患」とは、長期間にわたり持続する疾患を指す。例えば、慢性疾患は、全米保健医療統計センター（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）によって定義されるように、３ヵ月以上持続する疾患であってよい。一態様では、本発明は、患者における自己免疫又は炎症性疾患の治療方法を提供し、この方法は、（ａ）前記患者が慢性疾患を有するかどうかを決定するステップと；（ｂ）前記患者が、慢性疾患を有する場合、有効量の抗ＴＬＲ３抗体を前記患者に投与するステップを含む。
抗ＴＬＲ３抗体は、発作、発症、悪化又は再燃を有する個体を治療するのに有利に用いることができる。「発作」、「発症」、「悪化」及び「再燃」という用語は、炎症性又は自己免疫疾患に関連する新たな症状のより急速な進展又はそれらに関連する古い症状の増悪を意味する。このような病期は、数ヵ月及び数年にわたって起こる疾患の緩徐な進行とは反対に、数時間又は数日の間持続する。このような発作の間、患者は、発熱、痛み、炎症性症候群（インフルエンザ様症候群）を経験する。ＲＡでは、患者の関節が膨脹し、痛みを伴う。患者は、インフルエンザ様症候群を経験する場合もある。発症は、数時間から数週間にわたって持続し得る。多発性硬化症の場合、急激な再燃は、新たな症状又は既存の症状の増悪を特徴とし得るが、真の悪化と認めるためには少なくとも２４時間の持続を必要とし、急激な再燃は、脳又は脊髄に形成される新たな病変を示し、これは神経伝達を破壊する。ほとんどの急激な再燃は、数日又は数週間持続し、数ヵ月持続する場合もある。作用としては、例えば、以下のものが挙げられる：運動困難又は痙縮、平衡及び協調障害；視野障害、協調性のない眼球運動、視界のぼけ又は複視、再燃の間の翳み目；膀胱及び腸の症状；性的障害、精神的機能の変化：記憶喪失、不注意及び判断力低下又は抑うつ。ＣＯＰＤにおいて、悪化は、「正常な日々の変化を逸脱し、従って、潜在するＣＯＰＤを有する患者の薬剤の変更を正当化し得る、患者のベースライン呼吸困難、咳、及び／又は喀痰の変化を特徴とする疾患の自然な経過でのイベント」として定義することができる。悪化を経験する患者は、以下のうちの１つを有する：咳及び喀痰発生の増加、痰の色及び／又は厚さの変化、喘鳴、胸部圧迫感、発熱。クローン病又は直腸結腸炎の場合、再燃は、主に通常のクローン病症状：下痢、痙攣性腹痛、発熱、食欲喪失の悪化である。一態様では、本発明は、患者における自己免疫又は炎症性疾患の治療方法を提供し、この方法は、（ａ）前記患者が発作、発症、悪化又は再燃を経験しているかどうかを決定するステップと；（ｂ）前記患者が、発症、悪化又は再燃を経験している場合、有効量の抗ＴＬＲ３抗体を前記患者に投与するステップを含む。
抗ＴＬＲ３抗体は、再発を有する個体を治療するのに有利に用いることができる。「再発」という用語は、患者の症状の改善又は安定化を指す。疾患は、患者の健康又は状態が改善するとき、再発する。一態様では、本発明は、患者における自己免疫又は炎症性疾患の治療方法を提供し、この方法は、（ａ）前記患者が再発、発症、悪化又は再燃を経験しているかどうかを決定するステップと；（ｂ）前記患者が、再発を経験している場合、有効量の抗ＴＬＲ３抗体を前記患者に投与するステップを含む。
任意に、抗ＴＬＲ３抗体での処理前に、患者からの細胞（例えば、炎症性細胞、樹状細胞、Ｔ細胞など）でのＴＬＲ３ポリペプチドの発現を評価することを含む、評価ステップを実施することができる。一般に、このステップでは、細胞サンプルを患者から、典型的には生検として採取し、例えば、免疫アッセイを用いて試験することにより、細胞上でのＴＬＲ３ポリペプチドの発現、及び任意に相対的卓立を決定する。一態様では、患者が、ＴＬＲ３ポリペプチドを顕著に発現する細胞を有するという決定は、抗ＴＬＲ３抗体（及び任意に、いずれか別の治療薬）が、前記患者に好適であることを示している。更なるステップでは、続いて、患者を抗ＴＬＲ３抗体で治療することができる。
任意に、一実施形態では、抗ＴＬＲ３抗体での治療の前に、患者におけるＴＬＲ３リガンドの存在を検出することを含む、ＴＬＲ３リガンド検出ステップを実施することができる。一般に、このステップでは、生体サンプルを患者から採取するが、これは、例えば、リウマチ様関節炎患者の場合、滑液のサンプルである。生体サンプルをＴＬＲ３リガンドの存在、例えば、細胞外ｄｓＲＮＡの存在について評価する。生体サンプルが、ＴＬＲ３リガンドの存在について陽性であれば、患者を有利には抗ＴＬＲ３抗体で、好ましくは、ｄｓＲＮＡ ＴＬＲ３リガンドの存在下、ＴＬＲ３発現細胞におけるＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する抗体で治療する。
疾患を有する個体に投与される抗ＴＬＲ３抗体は、ＴＬＲ３ポリペプチドに特異的に結合するあらゆるモノクローナル抗体であってよく、好ましくは、本明細書に記載するように、ＴＬＲ３ポリペプチドによるシグナル伝達を阻害するあらゆる抗体であってよい。例えば、抗ＴＬＲ３抗体は、ＴＬＲ３に特異的に結合する抗体であり、この抗体は、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドとの結合について、酸性条件下で１０−９Ｍ未満のＫＤを有し、また任意選択により、中性条件下でも１０−９Ｍ未満のＫＤをさらに有する。
一実施形態において、抗ＴＬＲ３抗体は、単剤療法（単一の治療薬）として用いる。
別の実施形態によれば、本発明の治療方法は、抗ＴＬＲ３抗体及び第２治療薬を用いた個体の治療をさらに含んでもよく、第２治療薬は、抗体が投与される特定の治療目的のために通常使用されている薬剤を含む。抗ＴＬＲ３抗体及び第２治療薬は、個別に、一緒に、若しくは逐次、又はカクテルとして投与することができる。第２治療薬は、通常、治療対象の特定の疾患又は状態のための単剤療法でその薬剤について典型的に用いられる量で投与する。一実施形態では、第２治療薬は、許容される有効用量より少ない用量で投与する；例えば、様々な実施形態において、一般に許容される有効量の約１０％〜７５％未満の用量を含む組成物を投与する。一実施形態では、第２治療薬は、コルチコステロイド、例えば、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン（Ｃｏｒｔｉｓｏｌ）、酢酸コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デフラザコート、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、パラメタゾン、フルチカゾン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸デオキシコルチコステロン（ＤＯＣＡ）、フルプレドニゾロン、プロピオン酸フルチカゾン、ブデゾニド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、フルニソリド及びトリアムシノロンアセトニドからなる群から選択されるコルチコステロイドである。好ましくは、第２治療薬は、タンパク質分解酵素、炎症性メディエータ、又はＴＮＦ−α及び／若しくはインターロイキン−１（ＩＬ−１）などの炎症性サイトカインを低減する薬剤である。好ましくは、第２治療薬は、ＤＭＡＲＤ又はＤＭＤであり、任意にさらに、第２治療薬は、メトトレキセート（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（商標）、Ｔｒｅｘａｌｌ（商標））、ヒドロキシクロロキン（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ（商標））、スルファサラジン （Ａｚｕｌｆｉｄｉｎｅ（商標））、レフルノミド（Ａｒａｖａ（商標））、腫瘍壊死阻害剤（例えば、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（商標））、及びインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標）））、Ｔ細胞共刺激阻止剤（例えば、アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ（商標））、Ｂ細胞枯渇剤（例えば、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）））、インターロイキン−４（ＩＬ−４）アンタゴニスト療法薬（例えば、抗ＩＬ４抗体又は抗ＩＬ４受容体抗体）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）アンタゴニスト療法薬（例えば、抗ＩＬ５抗体又は抗ＩＬ５受容体抗体）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）アンタゴニスト治療薬（例えば、抗ＩＬ６抗体又は抗ＩＬ６受容体抗体）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体アンタゴニスト治療（アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（商標）））、抗ＢｌｙＳ抗体（Ｂｅｎｌｙｓｔａ（商標））、筋内金剤（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｇｏｌｄ）、又は別の免疫調節若しくは細胞毒性薬（例えば、アザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ（商標）））、シクロホスファミド、又はシクロスポリンＡ（Ｎｅｏｒａｌ（商標）、Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ（商標））である。一実施形態では、呼吸器疾患を治療する場合、第２治療薬は、ＰＤＥ−４阻害剤である。
ある実施形態において、抗ＴＬＲ３抗体は、第２治療薬の投与の前に投与する。例えば、抗ＴＬＲ３抗体は、第２治療薬の投与の約０〜３０日前に投与することができる。ある実施形態では、抗ＴＬＲ３抗体は、第２治療薬の投与の約３０分〜約２週間、約３０分〜約１週間、約１時間〜約２時間、約２時間〜約４時間、約４時間〜約６時間、約６時間〜約８時間、約８時間〜１日、又は約１日〜５日後に投与する。ある実施形態において、抗ＴＬＲ３抗体は、第２治療薬の投与と同時に投与する。ある実施形態において、抗ＴＬＲ３抗体は、第２治療薬の投与後に投与する。例えば、抗ＴＬＲ３抗体は、第２治療薬の投与の約０〜３０日後に投与することができる。ある実施形態では、抗ＴＬＲ３抗体は、第２治療薬の投与の約３０分〜約２週間、約３０分〜約１週間、約１時間〜約２時間、約２時間〜約４時間、約４時間〜約６時間、約６時間〜約８時間、約８時間〜１日、又は約１日〜５日後に投与する。
患者への投与に使用する目的で、患者への投与のための組成物を製剤化する。本発明の組成物は、経口、非経口、吸入スプレー、局部的、直腸内、鼻内、口腔、膣内又は埋め込み型リザーバにより投与してもよい。本発明で用いられるものとして、皮下、静脈内、筋内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、病変内及び頭蓋内注射又は注入法がある。
本抗体は、キットに収容することができる。キットはさらに、任意に任意の数の抗体及び／又は他の化合物、例えば、１、２、３、４、又はそれ以外の数の治療抗体及び／又は化合物（例えば、第２治療薬）を含んでもよい。キットの内容物の記載は何ら限定的ではないことは理解されよう。例えば、キットは、他のタイプの治療化合物を含んでもよい。好ましくは、キットは、例えば、本明細書に記載する方法を詳しく説明した、抗体使用の説明書も含む。
本発明の別の形態及び利点は、以下に示す実施例の節に開示するが、これは例示として考慮すべきであり、本出願の範囲を限定するものとみなすべきではない。
材料及び方法
材料
２９３Ｔヒト胎児由来腎臓細胞（＃ＣＲＬ−１５７３）をＡＴＣＣから購入した。抗体（抗原、供給者、参照）：ＡＰ共役Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ｒｅｆ．１１５−０５６−００３、ＰＥ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＩＭ０５５１ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ：ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（登録商標）フローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ＴＬＲ３リガンド（名称、供給者、参照）：ｐｏｌｙ（ＩＣ）ＨＭＷ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ｒｅｆ．ｔｌｒｌ−ｐｉｃ。ＩＰＨ３１０２とも呼ばれるｐｏｌｙＡＵは、ポリアデニル酸とポリウリジル酸から構成される少なくとも部分的に二本鎖の分子であり、これは、国際公開第２００９／１３０６１６号パンフレット（Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ）に記載のように調製され、その開示内容は、参照として本明細書に組み込む。ｐｏｌｙＡＵは、２０００ｋＤを超えるＭｎ（「数平均分子量」若しくは「平均分子量」とも呼ばれる）、１．４〜１．６のＰＩ、及び熱安定性：６２．３〜６３．２℃、５３〜６０％の高色素性を有する高分子量ｐｏｌｙＡＵである。抗体３１Ｃ３は、ＰＣＴ出願：国際公開第２０１１／００４０２８号パンフレットに記載されており、その開示内容は、参照として本明細書に組み込む。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
一般的Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００手順。２５℃でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＳＰＲ測定を実施した。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験において、ＨＢＳ−ＥＰ＋又はＨＢＳ−Ｐバッファー（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を泳動バッファーとして用い、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１及びＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、センサーグラム（ｓｅｓｏｒｇｒａｍ）を解析した。
二価親和性測定のために、特に記載のない限り、ＴＬＲ３−Ｈｉｓタンパク質をＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（カルボキシメチル化デキストラン層）上にアミンカップリング法で固定化した。抗ＴＬＲ３抗体を泳動バッファーＨＢＳ−ＥＰ＋（中性ｐＨでの親和性のために）又は１０ｍＭ酢酸ｐＨ５．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（酸性ｐＨでの親和性のために）中に一連の濃度（０．０１〜１００ｎＭ）まで希釈し、流量４０μｌ／分で２分間固定化抗原に対し注射し、３分間解離させた後、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＯＨバッファーの５〜３０秒注射により再生させた。得られたセンサーグラムを、適切なモデルを用いたグローバルフィッティングにより解析した。
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
プロモーターとしてＩＳＲＥ（ＩＦＮ刺激応答エレメント）を、レポーター遺伝子およびタンパク質としてルシフェラーゼを用いたレポーター遺伝子アッセイを計画した。Ａ２９３Ｔ細胞株（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ−１５７３）を安定にｐｌＳＲＥ−ｌｕｃプラスミド（＃２１９０８９−Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で安定にトラスフェクトし、さらに、ＩＦＮ−α刺激に対応する最適応答を誘導するものとしてクローニングにより選択したが、これを対照２９３Ｔ−ＩＳＲＥと呼ぶ。細胞株をさらにｐＵＮＯ−ヒトＴＬＲ３プラスミド（＃ｐｕｎｏ−ｈｔｌｒ３−ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ）で安定にトランスフェクトし、これを２９３Ｔ−ＴＬＲ３−ＩＳＲＥと称した。
記載したように効力アッセイを実施した：第０日に、細胞を４×１０５細胞／ｍＬで、９６ウェル培養プレート（１００μｌ／ウェル）中の完全培地に接種した。細胞をまず３７℃で２０時間インキュベートした後、５０μＬの培地を廃棄し、抗ＴＬＲ３抗体の濃度を増加しながら、最終２５μｌ／ウェルの定量のｐｏｌｙＡＵで活性化した。新鮮な培地とインキュベートした細胞をバックグラウンドルシフェラーゼ活性（５０μｌ／ウェル）として用いる。細胞を３７℃で６時間インキュベートする。１００μＬの新しく解凍したＳｔｅａｄｙ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加し、プレートを室温（ＲＴ）の暗所で１０分間インキュベートしてから、各ウェルにおいて発光された光をカウント毎秒（ＣＰＳ）としてγカウンタ（ＴｏｐＣｏｕｎｔ）装置により定量した。
突然変異体ＴＬＲ３構築物Ｋ１４５Ｅ、Ｄ１１６Ｒ、Ｋ１８２Ｅ、Ｎ１９６Ａ及びＥ１７１Ａの作製
ＴＬＲ３突然変異体Ｋ１４５Ｅ、Ｄ１１６Ｒ、Ｋ１８２Ｅ、Ｎ１９６Ａ及びＥ１７１Ａの作製を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ’ｓ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて、製造者の指示に従い実施した。用いるオリゴヌクレオチドを表４Ａに記載する。突然変異誘発は、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに挿入した野生型ヒトＴＬＲ３に対して実施した。配列決定後、突然変異した配列を含むベクターをＭａｘｉｐｒｅｐとして、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍを用いて調製した。次に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて、製造者の指示に従いＨＥＫ−２９３Ｔ細胞トランスフェクションにベクターを用いた。
Figure 0006356120
Ｎ末端突然変異体ＴＬＲ３構造物１〜１９の作製
ＴＬＲ３突然変異体（Ｖ５−ＴＬＲ３−ＣＤ３２構造物）の作製は、ＰＣＲにより実施した（以下の表４Ｂを参照）。Ｍｘ−Ｒプライマーは全て、次の５’プライマー：ＡＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＧ（配列番号１２１）と一緒に用いた。Ｍｘ−Ｆプライマーは全て、次の３’プライマー：ＡＧＣＡＣＡＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＴＧＡＣＡＴＧＧ（配列番号１２２）と一緒に用いた。増幅した配列をアガロースゲル上で泳動させた後、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて精製した。各突然変異体について作製した２つのＰＣＲ産物を、次いで、製造者の指示に従い、ＩｎＦｕｓｉｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、制限酵素ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１ベクターにライゲーションした。
配列決定後、突然変異した配列を含むベクターをＭａｘｉｐｒｅｐとして、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍを用いて調製した。次に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて、製造者の指示に従いＨＥＫ−２９３Ｔ細胞トランスフェクションにベクターを用いた。
Figure 0006356120
Figure 0006356120
ＴＬＲ３細胞表面構造物の作製
Ｄｅ Ｂｏｕｔｅｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（４６）：３８１３３−３８１４５により記載されているように、成熟野生型又は突然変異体ＴＬＲ３配列をＣＤ３２膜貫通及び細胞内ドメインと融合させた。ＰＣＲの第１ラウンドを実施して、ＴＬＲ３−ＣＤ３２融合タンパク質のＮ末端位置にＶ５タグを導入し、次いで、第２ラウンドを実施する（テンプレートとして第１ＰＣＲを用いて）ことにより、構築物中にＴＬＲ３リーダーペプチドを導入した。これらのステップに用いたプライマーを以下の表（表５）にまとめた。ＰＣＲ産物をシークエンシングのためｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター中にＴＡクローニングし、最後にＮｈｅＩ及びＮｏｔＩ制限部位を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。
Figure 0006356120
表面にＴＬＲ３＋を発現する細胞への滴定
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を、リポフェクタミン２０００を用い、野生型又は突然変異体ＴＬＲ３ ＥＣＤ−ＣＤ３２構築物で一時的にトランスフェクトした後、特定の用量範囲の１１Ｅ１又は３１Ｃ３と共に４℃で３０分間染色した。結合したｍＡｂは、４℃でさらに２０分間にわたるＰＥ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体の添加により明らかにした。２回の洗浄サイクル後、細胞ＭＦＩをＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩサイトメータで分析した。ｍＡｂ親和性に対するｐＨの作用を試験するために、染色バッファー（０．２％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％アジ化ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ａｚｏｔｕｒｅ）ｐＨ７．４又はクエン酸−酸性化染色バッファーｐＨ５．６中で染色を実施した。
実施例１−ＴＬＲ３特異的モノクローナルマウス及びラット抗ヒト抗体の作製
従来の抗体に比して、向上した効力で、ヒトＴＬＲ３を阻止する様々な抗体を作製するために、一連の免疫を実施した。一次及び二次スクリーンは以下の通りであった。
免疫＃１
一次スクリーン。抗ヒトＴＬＲ３抗体を取得するために、Ｂａｌｂ／ｃマウス（３匹）を組換えヒトＨｉｓタグ付きＴＬＲ３細胞外ドメイン組換えタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、♯１４８７−ＴＲ−０５０）で免疫した。マウスを免疫し、脾細胞を融合した後、照射済み脾細胞の存在下で培養した。マウスは、腹腔内経路で、５０μｇのＴＬＲ３タンパク質及び完全フロイントアジュバントのエマルションによる１回の一次免疫と、腹腔内経路で、５０μｇのＴＬＲ３タンパク質及び不完全フロイントアジュバントのエマルションによる１回の二次免疫を受け、さらに、静脈内経路で、１０μｇのＴＬＲ３タンパク質による追加免疫を受けた。ハイブリドーマを培養プレートで平板培養し、上澄み（ＳＮ）を、ＴＬＲ３との結合の検出のために開発されたＥＬＩＳＡを用いて、ＴＬＲ３結合について一次スクリーンで評価した。手短には、Ｈｉｓタグ付き組換えＴＬＲ３タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、♯１４８７−ＴＲ）をＭａｘｓｏｒｐ（登録商標）ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）上にコーティングした。ハイブリドーマ培養プレートからの上澄みを回収し、ＴＬＲ３を阻害し、Ｃ末端部分内で結合する抗ＴＬＲ３抗体の存在下、ＥＬＩＳＡ上でインキュベートした後、ＡＰ共役Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いて、ＴＬＲ３結合Ｉｇの存在を明らかにした。３８４０のうち３５８のハイブリドーマを二次スクリーンのために選択した。
二次スクリーン；対象となるハイブリドーマの選択。３５８の上澄みを保持し、２９３Ｔ細胞株を一時的に発現するＤ１１６Ｒ突然変異ＴＬＲ３を用いたＦＡＣＳ染色による更なるスクリーンで試験することにより、アミノ酸位置１１６で、突然変異体ＴＬＲ３との結合を喪失しない抗体を識別する。３５８のうち１５１のハイブリドーマが、Ｄ１１６Ｒとの結合を喪失しなかった。ハイブリドーマのアンタゴニスト活性も、２９３Ｔ−ｈｕＴＬＲ３細胞上でのＩＳＲＥ−ルシフェラーゼ遺伝子レポーターアッセイにおいて試験した。６０％を超える阻害作用を有する上澄みからのウェルを更なるクローニングのために選択した。２８のハイブリドーマが、アンタゴニスト活性を有し、２５のクローンが、アンタゴニスト活性及びＤ１１６Ｒとの結合の両方を有していた。
潜在的に対象となるハイブリドーマのクローニング。最初のスクリーニングから潜在的に興味深いハイブリドーマを９６ウェルプレートでの限界希釈法によりクローン化し、クローンをハイブリドーマの場合と同じ二次スクリーンのシリーズで試験した。１３のハイブリドーマ由来のクローンが、アンタゴニスト活性及びＤ１１６Ｒとの結合の両方を有していた。
これら１３のハイブリドーマを本発明者らの標準抗ＴＬＲ３ｍＡｂ（特に、３１Ｃ３）と比較する目的で、１３のハイブリドーマを増幅し、その上澄みを精製した。精製したｍＡｂを遺伝子−レポーターアッセイで試験した。標準抗ＴＬＲ３ｍＡｂと比較したＴＬＲ３シグナル伝達の阻止の能力に基づき、さらなる特性決定のためにハイブリドーマを選択した。
２つのハイブリドーマを突然変異体ＴＬＲ３ Ｋ１４５Ｅ及びＫ１８２Ｅとのエピトープ結合についてさらに評価した（実施例６も参照）。いずれの抗体も、ＴＬＲ３のＫ１４５Ｅ変異体との結合の喪失は一切示さなかったが、そのうちの１つは突然変異体Ｋ１８２Ｅとの結合の喪失を示した。クローン１１Ｅ１は、突然変異Ｋ１４５Ｅ又はＫ１８２Ｅの存在下であってもＴＬＲ３に結合した。
免疫＃２
ＬＯＵ／ｃラットを組換えＨｉｓタグ付きヒトＴＬＲ３、キャリアフリー細胞外ドメイン組換えタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、♯１４８７−ＴＲ）で免疫した。ラットは、第０日に、腹腔内経路で、ＰＢＳ及び完全フロイントアジュバントに希釈した５０μｇのヒトＴＬＲ３タンパク質のエマルションによる１回の一次免疫を、第１４日に、腹腔内経路で、ＰＢＳ及び不完全フロイントアジュバントに希釈した５０μｇのヒトＴＬＲ３タンパク質のエマルションによる１回の二次免疫を受け、さらに、静脈内経路で、ＰＢＳに希釈した２５μｇのヒトＴＬＲ３タンパク質による追加免疫を受けた。免疫脾細胞をＸ６３．Ａｇ８．６５３不死化Ｂ細胞と融合した後、照射済み脾細胞の存在下で培養した。
二次スクリーニングを上の免疫＃１と同様に実施した。潜在的に興味深いハイブリドーマを９６ウェルプレートでの限界希釈法によりクローン化し、クローンをハイブリドーマの場合と同じ二次スクリーンシリーズで試験した。ハイブリドーマを本発明者らの標準抗ＴＬＲ３ｍＡｂと比較する目的で、これらのハイブリドーマを増幅し、その上澄みを精製した。精製したｍＡｂを遺伝子−レポーターアッセイで試験した。標準抗ＴＬＲ３ｍＡｂ ３１Ｃ３と比較したＴＬＲ３シグナル伝達の阻止の能力に基づき、さらなる特性決定のためにハイブリドーマを選択した。ハイブリドーマを、Ｋ１４５Ｅ及びＫ１８２Ｅを有する突然変異体ＴＬＲ３ポリペプチドとのエピトープ結合についてさらに評価した。クローン７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４及び３７Ｂ７は、突然変異Ｋ１４５Ｅ又はＫ１８２Ｅの存在下であってもＴＬＲ３に結合した。
実施例２−ＴＬＲ３特異的モノクローナルラット抗マウス抗体の作製
一次スクリーン。抗ＴＬＲ３抗体を取得するために、ＬＯＵ／ｃラットを組換えＨｉｓタグ付きマウスＴＬＲ３、キャリアフリー細胞外ドメイン組換えタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、♯３００５−ＴＲ）及び組換えＨｉｓタグ付きヒトＴＬＲ３、キャリアフリー細胞外ドメイン組換えタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、♯１４８７−ＴＲ）で免疫した。ラットは、第０日に、腹腔内経路で、ＰＢＳ及び完全フロイントアジュバントに希釈した５０μｇのマウスＴＬＲ３＋５０μｇのヒトＴＬＲ３のエマルションによる１回の一次免疫を、第１４日に、腹腔内経路で、ＰＢＳ及び不完全フロイントアジュバントに希釈した５０μｇのマウスＴＬＲ３＋５０μｇのヒトＴＬＲ３タンパク質のエマルションによる１回の二次免疫を受け、さらに、静脈内で、ＰＢＳに希釈した２５μｇのマウスＴＬＲ３＋２５μｇのヒトＴＬＲ３による追加免疫を受けた。免疫脾細胞をＸ６３．Ａｇ８．６５３不死化Ｂ細胞と融合した後、照射済み脾細胞の存在下で培養した。
４０の培養プレートを取得し、これらを、ＴＬＲ３との結合の検出のために開発されたＥＬＩＳＡを用いて、マウスＴＬＲ３結合について一次スクリーンで評価した。手短には、Ｈｉｓタグ付き組換えマウスＴＬＲ３タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、♯１４８７−ＴＲ−０５０）をＮｉ−ＮＴＡ９６−ウェルプレート（Ｑｉａｇｅｎ）上にコーティングした。ハイブリドーマ培養プレートからの上澄み（ＳＮ）を回収し、ＴＬＲ３−プレート内でインキュベートした後、ヤギ抗マウスＦ（ａｂ）ＩｇＧ−ＨＲＰを用いて、ＴＬＲ３結合Ｉｇの存在を明らかにした。
二次スクリーン：対象となるハイブリドーマの選択。１８１の上澄みを保持し、２９３Ｔ−ｍＴＬＲ３細胞上での阻害試験における更なるスクリーンで試験した。９５％を超える阻害作用を有する上澄みからのウェルを限界希釈による更なるクローニングのために選択した。
潜在的に対象となるハイブリドーマのクローニング。最初のスクリーニングから選択した２７の潜在的に興味深いハイブリドーマを９６ウェルプレートでの限界希釈法によりクローン化し、３７０のサブクローンを、前記と同様にＥＬＩＳＡを用いて、マウスＴＬＲ３結合についてスクリーンで評価した。１７８の陽性クローンを上記と同様に、２９３Ｔ−ｍＴＬＲ３細胞上での阻害試験における更なるスクリーンで試験した。これらのうち、プレート２８からウェルＧ７からの上澄み（２８Ｇ７）であった。
実施例３−細胞表面ＴＬＲ３との結合
ＴＬＲ３が細胞表面に循環され、細胞表面ＴＬＲ３が、阻害性抗ＴＬＲ３抗体のインターナライゼーション及び効力に寄与する可能性を調べるために、標準抗体３１Ｃ３と比較して、細胞表面ＴＬＲ３との結合を試験した。さらに、中性ｐＨでの細胞表面ＴＬＲ３に対する結合（例えば、親和性）は、酸性ｐＨでエンドソームによる発現ＴＬＲ３のそれとは異なると考えられる。ｐＨはＴＬＲ３の立体配座に影響を与えている可能性があることから、中性ｐＨ条件で、細胞表面にのみヒトＴＬＲ３を発現する細胞（ＴＬＲ３／ＣＤ３２発現２９３Ｔ細胞）との結合について、抗体を試験した。中性ｐＨについての結果を抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３２Ｃ４及び３１Ｆ６についてそれぞれ図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄに示す。ＥＣ５０値を表６に示す。抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、及び３２Ｃ４は各々、中性ｐＨで、表面に発現したヒトＴＬＲ３に対し強力な結合を有した。ＴＬＲ３に対する抗体の親和性は、中性ｐＨで、標準抗体３１Ｃ３より強かった。
Figure 0006356120
実施例４−エンドソーム及び中性ｐＨでの二価親和性
ＳＰＲについて記載した方法、条項ｃ）を用いて、抗体１１Ｅ１の結合特性を決定した。中性（ｐＨ７．２）及び酸性（ｐＨ５．６）条件でのＴＬＲ３との結合、及びＫＤ値を計算した。中性ｐＨで、１１Ｅ１は、組換えヒトＴＬＲ３に対する強力な二価親和性（ＫＤ）を示した（ｐＨ７．２での平均ＫＤ（Ｍ）：８．７５＊１０−１１）。ｐＨ５．６での平均ＫＤ（Ｍ）は１＊１０−９であったため、ｐＨ５．６での結合親和性は、抗体１１Ｅ１についてｐＨ７．２での親和性より幾分低かった。
同様に、抗マウスＴＬＲ３抗体のマウスＴＬＲ３に対する結合を中性（ｐＨ７．２）及び酸性（ｐＨ５．６）条件で決定し、ＫＤ値を計算した。中性及び酸性ｐＨで、ｍＡｂ３２Ｄ４、２８Ｇ７及び１３Ｄ１は全て、５００ピコモルより優れた、組換えマウスＴＬＲ３に対する強力かつ類似の二価親和性（ＫＤ）を示した。ｍＡｂ２８Ｇ７の親和性（２又は３回の実験の平均）は、中性ｐＨ（ｐＨ７．２での平均ＫＤ（Ｍ））で７．０５＊１０−１３、また酸性ｐＨ（ｐＨ５．６での平均ＫＤ（Ｍ））では１．２６＊１０−１３であった。
実施例５−ヒトレポーターアッセイ
ルシフェラーゼを用いたレポーター遺伝子活性（２９３Ｔ−ＴＬＲ３−ＩＳＲＥ）におけるＴＬＲ３シグナル伝達の阻害について、抗体を試験した。ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）などのＴＬＲ３−アゴニストを用いたＴＬＲ３受容体の結合は、プロモーターＩＳＲＥを含むタイプＩＦＮ経路を活性化することが報告されている（Ｗｉｅｔｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８（５１），Ｐ５０９２３，２００３）。手短には、ｄｓＲＮＡ ＴＬＲ３アゴニストを用いることにより、抗ＴＬＲ３抗体の存在下でレポーターアッセイにおいてＴＬＲ３シグナル伝達を誘導した後、ＴＬＲ３シグナル伝達を評価した。抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４及び３７Ｂ７は全て、このアッセイにおいて抗体３１Ｃ３より効力を有していた。結果を抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３２Ｃ４、３１Ｆ６及び３７Ｂ７についてそれぞれ図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ及び２Ｅに示すが、これらは、ヒト抗ＴＬＲ３抗体による２９３ＴヒトＴＬＲ３ルシフェラーゼアッセイを用いたＴＬＲ３シグナル伝達の用量依存的阻害を示している。各抗体を標準抗体３１Ｃ３と比較する。
同様に、ラット抗マウスＴＬＲ３抗体を、それらがマウスＴＬＲ３ルシフェラーゼを用いたレポーター遺伝子活性（２９３Ｔ−ｍＴＬＲ３−ＩＳＲＥ）においてＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する能力について、個別の試験で同等に評価した。抗体２８Ｇ７は、２．６μｇ／ｍｌのＩＣ５０で、ＴＬＲ３シグナル伝達の用量依存的阻害を示した。
実施例６−エピトープマッピング
中性ｐＨでのエピトープマッピング。競合アッセイをＨＥＫ２９３Ｔ−ＷＴ ＴＬＲ３ ＥＣＤ／ＣＤ３２細胞でのＦＡＣＳアッセイにより実施した。１つの抗体による結合が、別の抗体のＴＬＲ３との結合を障害したことから、抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４及び３７Ｂ７は、ＴＬＲ３との結合について、事前に取得した抗体３１Ｃ３と競合した。抗体３１Ｃ３は、成熟ＴＬＲ３ポリペプチドの残基１０２〜２０４（特に残基１７４〜１９１及び残基１８２）に対応するＴＬＲ３の領域に少なくとも一部が結合し、ヒトＴＬＲ３との結合について互いに競合する。抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４及び３７Ｂ７は各々、３１Ｃ３と競合したが、競合の程度はまちまちであり、１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４及び３７Ｂ７のエピトープは同じ領域にあるが、互いに差異を有することが示唆される。抗体１１Ｅ１は、抗体７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４及び３７Ｂ７の各々と競合した。抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４及び３７Ｂ７と、抗体３１Ｃ３との競合のプロフィールに基づき、少なくとも１１Ｅ１、３７Ｂ７は互いに異なり、しかも７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４とも異なると思われたことから、少なくとも３つの異なるエピトープビニング（ｂｉｎｓ）を決定した。
実施例７−ＴＬＲ３突然変異体との結合によるエピトープマッピング
抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４及び３７Ｂ７は、ＴＬＲ３との結合について３１Ｃ３と競合する。３１Ｃ３は、ヒトＴＬＲ３のＮ末端内で結合することが判明しており、これは、残基１８２を含むが、残基Ｋ１４５、Ｄ１１６、Ｋ１８２、Ｅ１７１若しくはＮ１９６は含まない抗体の主要なエピトープを有する。従って、抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４及び３７Ｂ７を、ＴＬＲ３突然変異体との結合について試験した。突然変異Ｋ１４５Ｅ、Ｄ１１６Ｒ、Ｋ１８２Ｅ、Ｎ１９６Ａ及びＥ１７１Ａを有するＴＬＲ３突然変異体ポリペプチド（配列番号１を基準として）を「材料及び方法」の項に記載したように調製し、ＴＬＲ３突然変異体ポリペプチドを発現する細胞に対する抗ＴＬＲ３抗体染色をＦＡＣＳにより評価した。抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４及び３７Ｂ７は、非突然変異野生型（ＷＴ）ＴＬＲ３との結合も、Ｋ１４５Ｅ、Ｄ１１６Ｒ、Ｅ１７１Ａ、Ｋ１８２Ｅ若しくはＮ１９６Ａのいずれに対する結合も全く喪失を示さなかった。従って、抗体１１Ｅ１、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４及び３７Ｂ７の主要エピトープは、Ｎ末端領域に位置する場合、残基Ｋ１４５、Ｄ１１６、Ｋ１８２、Ｅ１７１若しくはＮ１９６を含まない。
次に、新しいエピトープを見出すために、ＴＬＲ３のＮ末端部分における突然変異体の別のセットとの結合について抗体を試験した。従って、ＴＬＲ３突然変異体との結合について抗体を試験した。位置Ｑ４４Ｈ及びＶ４５Ｉ、Ｒ６４Ｑ及びＲ６５Ｑ、Ｔ８６Ｓ及びＫ８９Ｑ、Ｋ９７Ｉ及びＭ１００Ｌ、Ｋ１１７Ｑ及びＡ１２０Ｖ、Ｑ１３６Ｈ、Ｎ１４０Ｓ、Ｖ１４４Ｋ及びＫ１４５Ｎ、Ｋ１４７Ａ、Ｋ１６３Ａ、Ｑ１６７Ｇ、Ｑ１８４Ｌ及びＫ１８７Ｒ、Ｑ１８４Ｌ及びＫ１８７Ｑ、Ｄ１９２Ｅ及びＡ１９５Ｇ、Ｑ２０８Ｐ及びＩ２０９Ｌ、Ｈ２１８Ｑ、Ａ２１９Ｔ、Ｇ２３４Ｎ及びＳ２３６Ｈ、Ｌ２４３Ｗ及びＡ２４６Ｓ、Ｓ１１２Ａ、Ｑ１１３Ｓ、及びＳ１１５Ａ、並びにＫ１３７Ｓ及びＫ１３９Ａに突然変異を有するＴＬＲ３突然変異体ポリペプチド（配列番号１を基準として）を「材料及び方法」の項に記載したように調製し、ＴＬＲ３突然変異体ポリペプチドを発現する細胞に対する抗ＴＬＲ３抗体染色をＦＡＣＳにより評価した。抗体１１Ｅ１は、置換Ｒ６４Ｑ及びＲ６５Ｑを有する突然変異体に対する結合、また、より低い程度で恐らく隣接する突然変異体Ｔ８６Ｓ及びＫ８９Ｑに対する結合の喪失を示した。抗体７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４及び３７Ｂ７は、置換Ｋ１１７Ｑ及びＡ１２０Ｖを有する突然変異体に対する結合の喪失を示したが、他の突然変異体については示さなかった。抗体１１Ｅ１及び３７Ｂ７は、置換Ｋ１３７Ｓ及びＫ１３９Ａを有する突然変異体に対する結合の完全な喪失を示したのに対し、抗体７Ｇ１１、３１Ｆ６及び３２Ｃ４は、置換Ｋ１３７Ｓ及びＫ１３９Ａを有する突然変異体に対する結合の部分的喪失を示した。さらに、７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４及び３７Ｂ７抗体の全てが、置換Ｓ１１２、Ｑ１１３及びＳ１１５を有する突然変異体に対する結合の完全な喪失を示した。抗体１１Ｅ１及び３１Ｃ３は、置換Ｓ１１２、Ｑ１１３及びＳ１１５を有する突然変異体に対する結合の喪失を示さなかった。従って、抗体１１Ｅ１の主要エピトープは、残基Ｒ６４及びＲ６５、及び恐らく（より低い程度で）隣接する残基Ｔ８６及びＫ８９、並びに残基Ｋ１３７及びＫ１３９を含む。従って、抗体７Ｇ１１、３１Ｆ６、３２Ｃ４及び３７Ｂ７の主要エピトープは、残基Ｋ１１７及び／又はＡ１２０、並びにＳ１１２、Ｑ１１３及び／又はＳ１１５を含む。加えて、抗体３７Ｂ７の場合、主要エピトープは、残基Ｋ１３７及び／又はＫ１３９をさらに含み、また、抗体７Ｇ１１、３１Ｆ６及び３２Ｃ４の場合、残基Ｋ１３７及びＫ１３９もエピトープ内に存在し得る。特に、残基Ｒ６４Ｑ及びＲ６５Ｑは、ＴＬＲ３のグリカンフリー外側面上のＮ末端ｄｓＲＮＡ結合領域内にあり、また、残基Ｋ１１７及びＡ１２０は、ＴＬＲ３分子の骨格上で部分的ではあるが、Ｎ末端ｄｓＲＮＡ結合領域に隣接している。これらの突然変異した残基に隣接する表面露出残基もまた、抗体のエピトープに寄与すると考えられ、こうした残基として、例えば、Ｎ末端ｄｓＲＮＡ結合領域の領域内のＴＬＲ３の表面に位置する残基４１、４３、６０、６１、６２、６４、６５、６７、６８、８８、９１、９２、９３、９６、９７、１０８、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１２１、１３２、１３４、１３７及び／又は１３９（配列番号１を基準として）が挙げられる。抗体は、このように、ＴＬＲ３に対するｄｓＲＮＡの結合と競合し得る。抗体は、Ｎ末端ｄｓＲＮＡ結合部位内で、及び／又はそれに隣接して結合し得るが、これは任意に、ＴＬＲ３タンパク質の骨格上に延びる残基をさらに含む。
図２Ｆ、２Ｇ、及び２Ｈは、ＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端の図を示し、これらは、黒色で表示する突然変異したアミノ酸残基（Ｑ４４、Ｖ４５、Ｒ６４、Ｒ６５、Ｔ８６、Ｋ８９、Ｋ９７、Ｍ１００、Ｋ１１７、Ａ１２０、Ｑ１３６、Ｎ１４０、Ｖ１４４、Ｋ１４５、Ｋ１４７、Ｋ１６３、Ｑ１６７、Ｑ１８４、Ｋ１８７、Ｑ１８４、Ｋ１８７、Ｄ１９２、Ａ１９５、Ｑ２０８、Ｉ２０９、Ｈ２１８、Ａ２１９、Ｇ２３４及びＳ２３６、Ｌ２４３及びＡ２４６）を示している。また、灰色で、残基８６、８９、１１７及び１２０に隣接する残基（残基４１、４３、６０、６１、６２、６７、６８、８８、９１、９２、９３、９６、１０８、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１２１、１３２、１３４、１３７及び１３９）も示し；このような隣接残基も、表示した抗体に結合され得る。図２Ｆは、ＴＬＲ３のグリカンフリー外側面の図を示し；図２Ｇは、ＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端が前景（図の左側）にある、ＴＬＲ３ポリペプチド及び骨格のグリカンフリー外側面の図を示す。図２Ｈは、ＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端が前景（図の右側）にある、ＴＬＲ３ポリペプチド及び骨格のグリカンフリー外側面の図を示す。
実施例８−ＲＡ予防セッティングの治療のためのｉｎ ｖｉｖｏ効力モデル
手短には、２０匹のマウスに対し、第０日に結核菌（Ｍｙｃｏｃｂａｃｔｅｒ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（２ｍｇ／ｍｌ）で補完したＣＦＡに乳化させた１００μｇのコラーゲンを尾の根本に皮内（ＩＤ）注射して免疫した。第１７日に、マウスにスコア（臨床徴候は、多くの場合、追加免疫前に現れる）を付け、４肢の臨床スコアの合計に応じてマウスを８又は９匹からなる２つのグループに無作為化した後、処置した。第２１日に、コラーゲンのみ（５０μｌ中１００μｇ）のＩＤ投与によりコラーゲン免疫を追加した。
以下のグループを構成した：
−グループ１（ＰＢＳ、ｎ＝９）：２回の２００μｌ／週ＩＰで処置
−グループ２（２８Ｇ７、ｎ＝８）：２回の５００μｇ／週ＩＰで処置
マウスの４肢のスコアリングを３〜４週にわたり週３回評価した。表７に従いスコアリングを評価した。
Figure 0006356120
結果を図３Ａに示す。本実験は、抗ＴＬＲ３抗体が、ＰＢＳと比較して、リウマチ様関節炎（ＲＡ）の治癒治療において統計的に有効である（ダネット検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔ）で＊ｐ＞０．０５、＊ｐ＞０．００５）ことを明らかに示している。
実施例９−ＲＡ治癒セッティングの治療のためのｉｎ ｖｉｖｏ効力モデル
実験＃１：２８Ｇ７、ＰＢＳ、ＭＴＸ
手短には、３０匹のマウスに対し、第０日に結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（２ｍｇ／ｍｌ）で補完したＣＦＡに乳化させた１００μｇのコラーゲンを尾の根本に皮内（ＩＤ）注射して免疫した。２１日後に、コラーゲン単独（５０μｌ／マウス中１００μｇ）のＩＤ投与によりコラーゲン免疫を追加した。第２４日に、４肢の臨床スコアの合計に応じてマウスを１０匹ずつ３つのグループに無作為化した後、処置を開始した。
−グループ１（ＰＢＳ、ｎ＝１０）：２回の２００μｌ／週ＩＰで処置
−グループ２（メトトレキセート−ＭＴＸ、ｎ＝１０）：２回の２．５ｍｇ／週ＩＰで処置
−グループ３（２８Ｇ７、ｎ＝１０）：５００μｇ／マウスを２回／週ＩＰで処置
マウスの４肢のスコアリングを３〜４週にわたり週３回評価した。表７に従いスコアリングを評価した。
結果を図３Ｂに示す。本実験は、抗ＴＬＲ３抗体が、ＰＢＳ及びメトトレキセートと比較して、定着したリウマチ様関節炎（ＲＡ）の治療において統計的に有効である（ダネット検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔ）で＊ｐ＞０．０５）ことを明らかに示している。ＭＴＳは、抗ＴＬＲ３抗体とは異なる作用機構を有するため、２つの薬剤の併用が有益となり得る。
実験＃２：２８Ｇ７、ＰＢＳ、抗ＴＮＦαＨｕｍｉｒａ（商標）
手短には、３５匹のマウスに対し、第０日に結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（２ｍｇ／ｍｌ）で補完したＣＦＡに乳化させた１００μｇのコラーゲンを尾の根本に皮内（ＩＤ）注射して免疫した。２１日後に、コラーゲン単独（５０μｌ／マウス中１００μｇ）のＩＤ投与によりコラーゲン免疫を追加した。第２４日に、４肢の臨床スコアの合計に応じてマウスを４つのグループに無作為化した後、処置を開始した。
−グループ１（ＰＢＳ、ｎ＝９）：２００μｌを２回／週ＩＰで処置
−グループ２（対照Ｉｇ抗体、ｎ＝９）：５００μｌを２回／週ＩＰで処置
−グループ３（２８Ｇ７、ｎ＝９）：５００μｇ／マウスを２回／週ＩＰで処置
−グループ４（Ｈｕｍｉｒａ（商標）、ｎ＝６）：１００μｌを２回／週ＩＰで処置
マウスの４肢のスコアリングを３〜４週にわたり週３回評価した。表７に従いスコアリングを評価した。
結果を図３Ｃに示す。本実験は、抗ＴＬＲ３抗体が、ＰＢＳ及び抗ＴＮＦα抗体Ｈｕｍｉｒａ（商標）と比較して、定着したリウマチ様関節炎（ＲＡ）の治療において有効であることを明らかに示している。抗ＴＮＦαは、抗ＴＬＲ３抗体とは異なる作用機構を有するため、２つの薬剤の併用が有益となり得る。
実施例１０−大腸炎の治療のためのｉｎ ｖｉｖｏ効力モデル
雄マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）１０匹ずつの４つグループをＴＮＢＳ誘導大腸炎のモデルに用い、８匹ずつの別のグループを対照（投薬なし、食塩水の結腸内点滴）として用いた。
処置グループは、以下のように区分した。
−グループ１：１０匹が、抗体２８Ｇ７を受けた（ｉｐ、５００μｇ／マウス）。
−グループ２：１０匹が、非ＴＬＲ３関連抗体の投与を受けた（ｉｐ、５００μｇ／マウス）。
−グループ３：１０匹が、ラット抗マウスＴＮＦ抗体を受けた（ｉｐ、１５ｍｇ／ｋｇ、Ｈｕｍｉｒａ（商標））。
−グループ４：１０匹が、ＰＢＳを受けた（ｉｐ、２００μｇ／マウス）。
注射から１時間後、雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（生後５〜６週間）に、２，４，６−トリニトロベンゼン−スルホン酸（ＴＮＢＳ）（ＴＮＢＳの４０％エタノール中２ｍｇ／マウス）の結腸内点滴により大腸炎を誘導した。グループ１、２及び３では、２８Ｇ７又は非ＴＬＲ３関連抗体又は抗ＴＮＦ抗体のいずれかの注射を第１抗体注射から７２時間後にもう１度実施した。
全てのグループについて、疾患進行のいくつかのパラメータを毎日評価した：体重、糞中の血液の存在、下痢の存在及び重症度。大腸炎の誘導から７日後に組織回収のため全てのマウスを死なせた。結腸組織において肉眼での損傷スコア、肉厚及びミエロペルオキシダーゼ活性（顆粒球浸潤の指数）を測定した。肉眼での損傷スコアは、血便、下痢、出血、癒着、粘液、紅斑、浮腫、潰瘍及び狭窄の取得により評価する。
図４は、実験の結果を示す。図４Ａは、食塩水（黒い丸）、ＴＮＢＳのみ（黒い四角）、抗ＴＮＦα抗体とＴＮＢＳ（黒い三角）、２８Ｇ７とＴＮＢＳ（白い丸）、及び対照ＡｂとＴＮＢＳ（白い四角）で処置したマウスの肉厚測定値を示す。図４Ｂは、食塩水（黒い丸）、ＴＮＢＳのみ（黒い四角）、抗ＴＮＦα抗体とＴＮＢＳ（黒い三角）、２８Ｇ７とＴＮＢＳ（白い丸）、及び対照ＡｂとＴＮＢＳ（白い四角）で処置したマウスの肉眼での損傷スコアを示す。
実施例１１−ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）の治療のためのｉｎ ｖｉｖｏ効力モデル
Ａ．単剤試験
１０匹の雄マウスからなる３つグループを以下のように：
−１０匹の１グループをビヒクルで；
−第０、３、７、１０、１４、１７、２１及び２４日に、１０匹の１グループを抗マウスＴＬＲ３ ２８Ｇ７抗体投与で（ｉｐ、５００μｇ／マウス）；
−１０匹の１グループを陽性対照ロフルミラスト（Ｄａｘａｓ（商標）として承認済み；ＰＤＥ−４のアンタゴニスト）（経口、１５ｍｇ／ｋｇ、週５回）で
処置した。
第０、７、１４及び２１日に、全てのマウスをエラスチン及びＬＰＳ（ｉ．ｎ．）で処置して、ＣＯＰＤを誘導した。第２８日に、分析のためにマウスを死なせた。
第２８日に、細胞分画（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｓ）による気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液の分析によって、気道中への細胞浸潤物を測定した。第２８日に、ガス定量により静脈血の酸化を測定した。ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１７Ａ及びＩＰ−１０のタンパク質レベルの分析によるＢＡＬＦ中の炎症性メディエータのレベルは、マルチプレックスアッセイにより実施した。結果を図５に示す。これらの図は、抗ＴＬＲ３抗体が、好中球気道浸潤、静脈血酸素飽和及び炎症性サイトカインの低減などのＣＯＰＤの治療においてきわめて有効であることを示している。統計分析は全データについて、スチューデント検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔｅｓｔ）：（＊）ｐ＜０．０５、（＊＊）ｐ＜０．００５、（＊＊＊）ｐ＜０．０００５）を用いて実施した。
図５Ａは、マクロファージ、好酸球、好中球及びリンパ球についてのＢＡＬ細胞分画（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｓ）を示す。抗ＴＬＲ３抗体は、気道への好中球の浸潤を強力に低減したが、マクロファージ、好酸球又はリンパ球には実質的に影響を与えなかった。ＣＯＰＤは、マクロファージ又は好酸球ではなく（また、ここで対照として用いられたリンパ球でもなく）、好中球によって主に媒介されている。
図５Ｂは、ＬＰＳ／エラスターゼ単独、及び抗ＴＬＲ３抗体又はロフルミラストと併用したＬＰＳ／エラスターゼの各々についての静脈血飽和酸素（％）を示す。動脈血中酸素の飽和率（％）は、健康な個体と比較してＣＯＰＤ患者において低下するが、酸素の静脈血飽和は、健康な個体と比較してＣＯＰＤ患者で増大する。従って、静脈血中Ｏ２の減少（％）は、疾患治療における好ましい応答の重要な指標である（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ２０１１；８１：１８−２５を参照）。抗ＴＬＲ３抗体が、ロフルミラストとほぼ同程度で静脈血中Ｏ２を減少したのを認めることができる。従って、抗ＴＬＲ３抗体は、ＣＯＰＤを治療する上で有効である。実際の医療では、急性期の場合と、臨床的安定期間中の患者のガス交換状態を評価する目的の両方で、動脈血ガス（ＡＢＧ）分析が用いられる。従って、ＡＢＧ分析などの血液ガス分析は、患者が抗ＴＬＲ３抗体による治療に適しているかどうかを評価し、また急性期又は臨床的安定期中に、抗ＴＬＲ３抗体による治療が有効であるかどうかを評価する特に有用な手段となり得る。
図５Ｃは、ＢＡＬ液（ＢＡＬＦ）中のＩＬ１７Ａを示す。抗ＴＬＲ３抗体は、ＩＬ１７Ａ（ｐｇ／ｍｌ）を実質的に減少し、しかもロフルミラストと同程度であった。図５Ｄは、ＢＡＬＦ中のＩＰ−１０を示す。抗ＴＬＲ３抗体は、ＩＰ−１０（ｐｇ／ｍｌ）を実質的に減少した。
Ｂ．薬剤併用試験
マウスの４つのグループを以下のように：
−１グループのマウスをビヒクルで（ＰＢＳ、ｉ．ｐ．、週２回）；
−１グループのマウスを抗マウスＴＬＲ３ ２８Ｇ７抗体投与で（ｉ．ｐ．、５００μｇ／マウス、週２回）；
−１グループのマウスを陽性対照ロフルミラスト（Ｄａｘａｓ（商標）として承認済み；ＰＤＥ−４のアンタゴニスト）で（３ｍｇ／ｋｇ、経口、週５回）；
−１グループのマウスをロフルミラストと２８Ｇ７抗体の両方で（各薬剤は、単剤として用いられたスケジュールに従う）
処置した。
試験Ａと同様に、全てのマウスをエラスチン及びＬＰＳ（ｉ．ｎ．）で処置して、ＣＯＰＤを誘導した。
試験Ａと同様に、細胞分画（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｓ）による気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液の分析によって、気道中への細胞浸潤物を測定した。
図５Ｅは、マクロファージ、好中球及びリンパ球についてのＢＡＬ細胞分画（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｓ）を示す。抗ＴＬＲ３抗体は、気道への好中球の浸潤を強力に低減し、また、マクロファージ及びリンパ球の低減も観察された。ＣＯＰＤは、マクロファージ又は好酸球ではなく（また、ここで対照として用いられたリンパ球でもなく）、好中球によって主に媒介されている。ロフルミラストも、マクロファージの低減と共に、気道への好中球の浸潤の低減をもたらした。興味深いことに、抗ＴＬＲ３抗体とロフルミラストとの併用は、実質的に野生型マウスにみられるレベルまでの気道への好中球の浸潤の低減、少なくともそれぞれ単独で用いて観察されたものをはるかに超える低減をもたらした。
実施例１２−敗血症−盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）−治癒セッティングの治療のためのｉｎ ｖｉｖｏ効力モデル
手短には、３０匹のマウスを手術した：手術は、盲腸結紮穿刺から成る。このようにして、盲腸管腔の内容物を腹腔から排出し、腹膜炎に到らせ、その結果、敗血症性ショックを引き起こす。ＣＬＰは、中程度、例えば、結紮を盲腸の中央で実施する。
手術から６時間及び２４時間後に、マウスを２８Ｇ７（１００μｇ／マウス、ｉｐ）、ＴＬＲ３特異性のない対照抗体（「対照」、１００μｇ／マウス、ｉｐ）又はＰＢＳ（３００μｌ／マウス、ｉｐ）で処置した。２４、２８、３２、４８、５２、５６、７２、７６、８０、９６、１００、１０４、１２０、１２４、１２８、１４４、１４８、１５２、１６８、１７２、１７６、１９２、１９６、２００、２１６、２２０、２２４、２４０、２４４、２４８、２６４、２７０、２７４、２８８、２９２、２９６、３１２、３１６、３２０及び３３６時間後に生存を評価した。３３６時間後に、生存しているマウスでは、急性期感染が除去された。実験を停止し、マウスを死なせた。
図６は、実験の結果を示す。２８Ｇ７で治療したグループは、８０％生存を有するのに対し、非治療グループは、４０％生存を呈示する。これらの結果は、ＴＬＲ３抗体が、ＣＬＰマウスモデルにおいてマウスの治療に有効であることを証明している。この急性モデルでは、マウスは、敗血症性ショックによく似た急性感染を呈する。生存するマウスでは、急性感染が効率的に除去された。従って、抗ＴＬＲ３抗体は、ＳＩＲＳ、敗血症、重症敗血症又は敗血症性ショックなどの重症の急性感染を患う患者を治療するのに好適な薬剤である。
実施例１３−ＤＳＲＮＡ及び薬剤併用に応答するドナーＰＢＭＣＳによるＩＮ ＶＩＴＲＯのＩＰ−１０産生
ｐＩＣに応答するヒトドナーにおいて、ＩＰ−１０産生を評価した。新鮮なＰＢＭＣをドナーの全血から単離して、０、１０又は５０μｇ／ｍｌの抗ヒトＴＬＲ３ｍＡｂ及び特定の用量範囲のデキサメタゾン（０．２、２及び２０μｇ／ｍｌ）又はＨｕｍｉｒａ（登録商標）（１、０．１、０．０１μｇ／ｍｌ）の存在下でインキュベートした。細胞を３７℃で３０分インキュベートした後、３０μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を添加した。細胞を３７℃でさらに２４時間インキュベートした。次に、上澄みを回収して、ＥＬＩＳＡによりＩＰ１０産生を定量した。
デキサメタゾン又はＨｕｍｉｒａ（登録商標）と組み合わせた抗ヒトＴＬＲ３ｍＡｂとの薬剤併用の結果をそれぞれ図７Ａ及び７Ｂに示す。抗体は、各々、ｐｏｌｙＩＣに応答してＩＰ−１０産生を実質的に低減し、デキサメタゾン又はＨｕｍｉｒａ（登録商標）と併用した場合、ＩＰ−１０をさらに低減する。従って、抗ＴＬＲ３抗体は、デキサメタゾン又はＨｕｍｉｒａと組み合わせて用いれば、付加的効果をもたらし得る。特に、ｐｏｌｙＩＣに応答して、抗体は、リウマチ様関節炎における標準治療薬であるデキサメタゾンの効果を増強する。さらに、抗ＴＬＲ３抗体は、０．１及び１μｇ／ｍｌのＨｕｍｉｒａの効果を増強することもわかった。抗ＴＬＲ３抗体は、アンタゴニスト作用なしに、デキサメタゾン又はＨｕｍｉｒａ（登録商標）によって調節されるものと相補的なシグナル経路を調節することにより作用することができるため、このような薬剤と組み合わせて有利に用いることができる。
全ての見出し及び小見出しは本明細書においてあくまで便宜のために用いているに過ぎず、本発明を限定するものとして一切解釈すべきではない。前述した要素の考えられるあらゆる変形におけるあらゆる組合せは、本明細書に特に記載がないか、又は本文の内容と明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。数値の範囲の詳説は、本明細書に特に記載のない限り、当該範囲内に含まれる個々の値を個別に示す簡単な方法としての役割を果たすことを意図しているに過ぎず、個別の値は各々、あたかもそれが本明細書に個別に記載されているのと同様に本明細書に組み込まれる。特に記載のない限り、本明細書に記載される厳密な値は全て、相応する近似値を代表するものである（例えば、特定の要因又は測定に関して記載されるあらゆる厳密な値は、必要に応じて「約」によって変更される、相応の近似測定値も提供すると考えることができる）。
本明細書に記載する方法はすべて、本明細書に特に記載がないか、又は本文の内容と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。
本明細書に記載するあらゆる例、又は例示的語法（例えば、「などの」）は、本発明をより明瞭に説明することを意図するに過ぎず、特に記載のない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。そのように明示されていない限り、本明細書におけるいかなる言葉も、いずれかの要素が本発明の実施に必須であると示していると解釈すべきではない。
本明細書における特許文献の引用及び組込みは、便宜性のために行うに過ぎず、こうした特許文献の有効性、特許可能性及び／又は実施可能性の見解を一切表すものではない。要素又は複数の要素と関連するような用語を用いた本発明のあらゆる態様又は実施形態の説明は、本明細書に特に記載がないか、又は本文の内容と明らかに矛盾しない限り、特定の要素又は複数の要素「から構成される」、「からほぼ構成される」、「を実質的に含む」本発明の同様の態様又は実施形態に関する支持を提供することを意図する（例えば、特定の要素を含むものとして本明細書に記載される組成物は、本明細書に特に記載がないか、又は本文の内容と明らかに矛盾しない限り、その要素から構成される組成物を表すものとしても理解すべきである）。
本発明は、適用可能な法律により許容される最大範囲まで、本明細書に記載の態様又は請求項で述べる主題のあらゆる変更及び同等物を含む。
本明細書に引用した刊行物及び特許出願は全て、あたかも個々の刊行物及び特許出願の各々が、参照として組み込まれることが具体的かつ個別に記載されているのと同様に、その全体を参照として本明細書に組み込むものとする。
以上、理解を明瞭にする目的で、例示及び例として、本発明をある程度詳細に説明してきたが、当業者であれば、本発明の教示に照らして、添付する請求項の精神又は範囲を逸脱することなく、本発明に特定の変更及び改変を加え得ることは容易に明らかであろう。

Claims (7)

  1. ヒトＴＬＲ３ポリペプチドに特異的に結合し、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドによるシグナル伝達を阻害するモノクローナル抗体であって、前記抗体が、以下：
    （ｉ）配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列を含む重鎖；及び（ｂ）配列番号４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列を含む軽鎖；
    （ｉｉ）配列番号１４の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列を含む重鎖；及び（ｂ）配列番号１５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列を含む軽鎖；
    （ｉｉｉ）配列番号２５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列を含む重鎖；及び（ｂ）配列番号２６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列を含む軽鎖；
    （ｉｖ）配列番号３６の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列を含む重鎖；及び（ｂ）配列番号３７の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列を含む軽鎖；又は
    （ｖ）配列番号４７の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列を含む重鎖；及び（ｂ）配列番号４８の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列を含む軽鎖
    を含む、モノクローナル抗体。
  2. ＴＬＲ３発現細胞におけるＴＬＲ３媒介シグナル伝達を阻害するモノクローナル抗体であって、前記抗体が、前記ＴＬＲ３ポリペプチドのＮ末端部分のグリカンフリー外側面に結合し、前記抗体が、前記抗体と配列番号１の野生型ＴＬＲ３ポリペプチド同士の結合に比して、配列番号１のＴＬＲ３ポリペプチドの残基１３７及び／又は１３９に突然変異を含む突然変異体ＴＬＲ３ポリペプチドとの低減した結合を有し、
    ここで、さらに前記抗体が配列番号１のＴＬＲ３ポリペプチドの残基Ｄ１１６及び／又はＫ１４５に突然変異を有するＴＬＲ３ポリペプチドとの結合に有意な低減がなく、
    ここで、前記抗体が、配列番号３の重鎖可変領域及び配列番号４の軽鎖可変領域を含む抗体１１Ｅ１、配列番号１４の重鎖可変領域及び配列番号１５の軽鎖可変領域を含む抗体３１Ｆ６、配列番号２５の重鎖可変領域及び配列番号２６の軽鎖可変領域を含む抗体３２Ｃ４、配列番号３６の重鎖可変領域及び配列番号３７の軽鎖可変領域を含む抗体３７Ｂ７又は配列番号４７の重鎖可変領域及び配列番号４８の軽鎖可変領域を含む抗体７Ｇ１１と、ヒトＴＬＲ３ポリペプチドとの結合について競合する、モノクローナル抗体。
  3. 前記抗体が、ＴＬＲ３発現細胞によってインターナライズすることができる、請求項１または２に記載の抗体。
  4. 前記抗体が、有毒部分と結合又は共有結合している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
  5. 炎症性又は自己免疫障害の治療に用いるための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
  6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  7. 前記抗体が、２５ｍｇ〜５００ｍｇの量で存在する、請求項６に記載の組成物。
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