KR20080082608A - Vegf 유사체 및 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 내피 세포의 VEGF-매개 활성화 또는 증식을 억제하는 변형된 VEGF 단백질을 개시한다. 이러한 유사체는 혈관형성-관련 질환, 예컨대 암, 염증성 질환, 안질환 및 피부 장애에 있어서 내피 세포의 VEGF-매개 활성화를 억제하는데 사용할 수 있다.
VEGF-매개 활성화, 변형된 혈관 내피 세포 성장 인자, 혈관형성-관련 질환, 생체활성, 길항제
Description
본 출원은 혈관형성과 관련된 상태 및 질환의 치료를 위하여 혈관형성을 억제하거나 또는 감소시키는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체 길항제로서의 VEGF 유사체의 디자인 및 용도에 관한 것이다. 본 출원은 또한 KDR과 같은 천연 수용체에 대하여 증가된 수용체 결합 친화성을 나타내는 VEGF 유사체를 개시한다.
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2005년 10월 6일에 출원된 미국 가출원 제60/723,917호 및 2006년 5월 25일에 출원된 미국 가출원 제60/808,106호의 이점을 청구하며, 상기 문헌들은 그 전체가 본원에 참고문헌으로 도입된다.
혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 혈관 및 림프관 발생을 조절한다. 이들은 주로 저산소증 및 형질전환 성장 인자, 인터루킨 및 혈소판 유도 성장 인자와 같은 성장 인자에 의한 자극에 반응하여, 내피, 조혈 및 간질 세포에 의하여 생성된다.
포유 동물에서, VEGF는 유전자들의 족(family)에 의해서 코딩되며, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 태반 유사 성장 인자 (PlGF)를 포함한다. 이와 매우 관련된 단백질로는 VEGF-E로 불리우는 orf 바이러스 코딩 VEGF-유사 단백질 및 VEGF-F로 불리우는 일련의 뱀독이 포함된다. VEGF 및 VEGF 관련 단백질은 시스틴 노트 성장 인자(cystine-knot growth factor)의 혈소판 유도 성장 인자 (PDGF) 초유전자족의 구성원이다. PDGF 초유전자족의 모든 구성원은 PDGF와 높은 수준의 구조적 상동성을 공유한다 (본원에 그 전체가 참고문헌으로 도입되는 미국 특허 출원 제09/813,398호 참조).
VEGF-A, VEGF-B 및 PlGF는 주로 혈관 형성에 필요하며, VEGF-C 및 VEGF-D는 림프관 형성에 필수적이다. 혈관형성은 기존에 존재하던 관으로부터 발생에 의하여 새로운 혈관 또는 림프관을 형성하는 과정이다. 이러한 과정은 내피 세포 상의 수용체에 VEGF가 결합하는 때에 시작되어, 내피 세포의 활성화 신호를 보낸다. 활성화된 내피 세포는 기존의 관들을 둘러싼 기저막 내의 작은 구멍들을 용해시키는 효소를 생성한다. 그 후, 내피 세포는 증식을 시작하고, 기존 관들의 용해된 구멍을 통해 이동하여 새로운 혈관을 형성한다 (Alberts et al, 1994, Molecular Biology of the Cell. Garland Publishing, Inc., New York, N. Y. 1294 pp.).
3개의 유형 III 수용체 티로신 키나제가 혈관형성 중 VEGF에 의하여 활성화된다: fms-유사 티로신 키나제 (Flt-1, VEGFR1로도 알려짐), 키나제 도메인 수용체 또는 키나제 삽입 도메인 함유 수용체 (KDR, 또한 VEGFR2 및 Flk-1로 알려짐) 및 Flt-4 (VEGFR3으로도 알려짐). KDR은 혈관형성 신호전달에서 주된 수용체이며, Flt-1은 혈관 형태형성의 조절과 관련되고, Flt-4는 림프혈관형성을 조절한다. 이러한 수용체들은 거의 전적으로 내피 세포 상에서 발현되지만, Flt-1는 화학주성을 매개하는 곳인 단핵구에서 발현되는 것과 같은 일부 예외도 있다 (Barleon et al, 1996, Blood. 87: 3336-3343).
VEGF 수용체는 Fms, Kit 및 PDGF 수용체와 밀접하게 연관된다. 이들은 7개의 세포외 면역글로불린 (Ig)-유사 도메인, 막횡단 (TM) 도메인, 조절 근접막 도메인, 짧은 펩티드에 의해 단절된 세포내 티로신 키나제 도메인, 키나제 삽입 도메인(하류 신호전달 분자를 동원(recruiting)하는데 관여하는 여러 티로신을 수반하는 서열을 따름)으로 구성된다. KDR 및 Flt-1의 세포외 도메인의 돌연변이 분석은, 2차 및 3차 Ig-유사 도메인이 VEGF에 대한 고친화성 리간드 결합 도메인을 구성하고, 1차 및 4차 Ig 도메인은 분명히 리간드 결합 및 수용체 이량체화를 각각 조절한다는 것을 보여준다 (Davis-Smyth et al, 1998, J. Biol. Chem. 273: 3216-3222; Fuh et al, 1998, J. Biol. Chem. 273: 11197-11204; 및 Shinkai et al, 1998, J. Biol. Chem. 273: 31283-31288). 수용체 티로신 키나제는 리간드 매개 수용체 이량체화시에 활성화된다 (Hubbard, 1991, Prog. Biophys. MoI. Biol. 71 : 343-358; Jiang 및 Hunter, 1999, Curr. Biol. 9: R568-R571; 및 Lemmon 및 Schlessinger, 1998, Methods Mol. Biol. 84: 49-71). VEGF 수용체의 신호 특이성은 뉴로필린, 헤파린 술페이트, 인테그린 또는 카드헤린과 같은 보조수용체의 동원에 의하여 추가로 조정된다.
VEGF 분자는 혈관형성 중 하나 이상의 티로신 키나제 수용체와 상호작용한다. 예를 들어, VEGF-A는 주로 KDR 및 Flt-1을 통하여 작용한다. VEGF-C 및 VEGF-D는 유사하게 KDR 및 VEGFR3에 대한 특정 리간드이다. PlGF 및 VEGF-B는 Flt-1에만 결합하는 것으로 생각된다. 바이러스성 VEGF-E 변이체는 KDR을 활성화시킨다. VEGF-F 변이체는 VEGFR3 또는 KDR과 상호작용한다.
2개의 전형적인 수용체에 더하여, VEGF 생체활성 및 혈관형성을 조정하는 여러가지 막 또는 가용성 수용체가 존재한다. 예를 들어, 뉴로필린-1 및 뉴로필린-2는 KDR 및 Flt-1 모두와 각각 상호작용하여 이러한 수용체의 신호전달을 자극한다. VEGF-A, VEGF-B, P1GF-2의 이소형은 뉴로필린-1과 결합하는 것으로 알려져 있다 (Soker et al., 1998, Cell. 92: 735-745; Makinen et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 21217- 21222; 및 Migdal et al, 1998, J. Biol. Chem. 273: 22272-22278). 뉴로필린과 상호작용할 수 있는 VEGF의 이소형, 즉, 엑손 7 또는 6 및 7을 갖는 이소형은 또한 헤파린 술페이트와 상호작용할 수 있다.
VEGF-A가 가장 특징적인 VEGF 단백질이지만, VEGF-A 및 KDR 및 Flt-1 사이의 상호작용에 대한 분자적 근거는 잘 알려져 있지 않다. VEGFR1은 KDR보다 50 배 높은 친화도로 VEGF-A와 결합하지만, KDR이 VEGF-A 혈관형성 효과, 즉, 유사분열 촉진성, 화학주성 및 관 형성의 유도 (Binetruy-Tourniere et al, 상기 문헌)에 대한 주요 탐촉자(transducer)로 여겨진다. 그러나, Flt-1이 조혈, 및 단핵구 및 종양 혈관계를 향하고 혈관형성을 촉진하는 다른 골수 유도 세포의 동원에 있어서 중요한 역할을 한다는 증거가 나타나고 있다 (Hattori et al, 2002, Nature Med. 8: 841-849; Gerber et al, 2002, Nature. 417: 954-958; 및 Luttun et al, 2002, Nature Med. 8: 831-840). 또한, 일부 경우에 Flt-1은 종양 세포에 의해 발현되고 화학주성 신호를 매개하여, 암 성장에서 이러한 수용체의 역할을 잠재적으로 확장할 수 있다 (Wey et al, 2005, Cancer. 104: 427-438).
단일 VEGF-A 동종이량체는 2개의 KDR 수용체의 이량체화 및 그들의 시토플라 스마 부위(cytoplasmatic portion)의 자동인산화를 유도한다. 종래의 연구는 당단백질 호르몬과 유사하게, VEGF-A의 말단 루프 중 대전된 아미노산 잔기가 또한 그의 각 수용체와의 고친화성 정전기 상호작용을 제공하는데에 핵심적이라는 것을 시사한다 (Szkudlinski et al, 1996, Nat. Biotechnol. 14(10): 1257-63; Fuh et al, 상기 문헌; Muller et al, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94(14): 7192-7; Keyt et al, 1996, J. Biol. Chem. 271(10): 5638-46). 그러나, VEGF-A 중 많은 돌연변이가 수용체 결합 친화성에 주요한 효과를 나타내지 않는다는 것을 주목해야 한다. VEGF의 말단 루프 중 돌연변이는 일차적으로 기능손실을 일으킨다. 또한, KDR에 대한 결합 친화성을 2 배 이상 증가시키는 이전의 아미노산 치환이 없는 것으로 보인다.
혈관형성은 창상 치유, 심근경색 치유 및 배란과 같은 유익한 생물학적 현상에 관여한다. 반면에, 혈관형성은 또한 다음과 같은 질환을 발생시키거나 그에 기여한다: 충실성 종양의 성장 및 전이 (Isayeva et al, 2004, Int. J. Oncol. 25(2):335-43; Takeda et al, 2002, Ann Surg. Oncol. 9(7):610-16); 아테롬성경화증; 미숙 망막증, 당뇨병 망막증, 망막정맥폐쇄, 및 노화성 홍반변성과 같은 질환에서 볼 수 있는 이상 신혈관생성 (Yoshida et al, 1999, Histol Histopathol. 14(4):1287-94; Aiello, 1997, Ophthalmic Res. 29(5):354-62); 류마티스성 관절염 골관절염, 및 패혈성 관절염과 같은 만성 염증 질환; 신경변성 질환 (Ferrara, N., 2004, Endocr. Rev. 25: 581-611); 태반 부전, 즉, 자간전증 (Ferrara, 상기 문헌); 및 피부염, 건선, 사마귀, 피부암, 욕창 궤양, 정체 궤양, 화농성 육아종, 혈관 종, 카포시(Kaposi) 육종, 비후성 반흔 및 흉터종과 같은 피부 질환 (Arbiser, 1996, J. Am. Acad. Dermatol. 34(3):486-97). 류마티스성 관절염 도중, 예를 들어 내피 세포가 활성화되고 접착 분자 및 케모카인을 발현하여, 혈액에서 조직 내로 백혈구가 이동된다. 내피 세포 투과성이 증가하여, 부종이 형성되며 관절이 부풀어 오른다 (Middleton et al, 2004, Arthritis Res. Ther. 6(2):60-72).
VEGF, 특히 VEGF-A는 혈관형성의 증가, 감소 및/또는 조절곤란과 관련된 많은 질병 및 상태와 관계가 있다(Binetruy-Tourniere et al., 2000, EMBO J. 19(7): 1525-33). 예를 들어, VEGF는 종양-관련된 혈관형성을 자극함으로써 고형 종양 성장 및 전이를 촉진시키는데 관계가 있다(Lu et al., 2003, J. Biol. Chem. 278(44): 43496-43507). VEGF는 또한 안내 혈관신생 및 투과성의 중요한 매개인자이다. 트랜스제닉 마우스에서 VEGF의 과발현으로 인해 임상학적으로 망막내 및 망막하 혈관신생이 발생하고, 혈관조영술에 의해 검출가능한 누출 안내 혈관의 형성이 발생하는데, 이들은 인간 안질환에서도 발견된다(Miller, 1997, Am. J. Pathol. 151(1): 13-23). 또한, VEGF는 원인불명 불임증 및 자궁내막증이 있는 여성의 복수에서 동정되며(Miedzybrodzki et al., 2001, Ginekol. Pol. 72(5): 427-430), 고환 및 부고환에서의 VEGF의 과발현은 트랜스제닉 마우스에서 불임증을 야기시키는 것으로 확인되었다(Korpelainen et al., 1998, J. Cell Biol. 143(6): 1705-1712). 최근, VEGF-A가 류마티스 관절염(RA)을 앓는 환자의 윤활액 및 혈청에서 동정되었는데, 이의 발현은 질병 중증도와 상호관련이 있다(Clavel et al., 2003, Joint Bone Spine. 70(5): 321-6). 병원성 혈관형성이 이러한 매우 다양한 장애 및 질병 에 관계되어 있다면, 혈관형성, 특히 VEGF 신호전달의 억제가 바람직한 치료 목적이 된다.
혈관형성의 억제 및 종양 억제는 VEGF-A 및 KDR 상호작용을 방해하고/하거나 KDR 신호 도입 경로를 차단하는, 하기를 포함하는 제제를 사용함으로써 달성되었다: VEGF의 KDR에의 결합을 차단하는 펩티드(Binetruy-Tourniere et al., 2000, EMBO J. 19(7): 1525-33); VEGF에 대한 항체(Kim et al., 1993, Nature 362, 841- 844; Kanai et al., 1998, J. Cancer 77, 933-936; Margolin et al., 2001, J. Clin. Oncol. 19, 851-856); KDR에 대한 항체(Lu et al., 2003, 상기 문헌; Zhu et al., 1998, Cancer Res. 58, 3209-3214; Zhu et al. 2003, Leukemia 17, 604-611; Prewett et al., 1999, Cancer Res. 59, 5209-5218); 가용성 수용체(Holash et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 11393-11398; Clavel et al., 상기 문헌); 티로신 키나제 억제제(Fong et al., 1999, Cancer Res. 59, 99-106; Wood et al., 2000, Cancer Res. 60, 2178-2189; Grosios et al., 2004, Inflamm Res. 53(4):133-42); 항-VEGF 면역독소(Olson et al., 1997, Int. J. Cancer 73, 865-870); 라이보자임(Pavco et al., 2000, Clin. Cancer Res. 6, 2094-2103); 안티센스 매개 VEGF 억제(Forster et al., 2004, Cancer Lett. 20;212(l):95-103); RNA 간섭(Takei et al., 2004, Cancer Res. 64(10):3365-70; Reich et al., 2003, Mol Vis. 9:210-6); 및 저황산화, 저분자량 글리콜-분리 헤파린(Pisano et al., 2005, Glycobiology. 15(2) 1-6). 하지만, 이들 치료제 중 몇몇은 바람직하지 않은 부작용을 야기시켰다. 예를 들어, VEGF를 표적화하는 모노클로날 항체인 제넨테크 사(Genentech)의 아바스틴(Avastin)은 몇몇 결정암 환자에서는 심각한 동맥 혈전색전성 사건을 증가시키고, 비소세포 폐암 환자에서는 심각한 (몇몇 경우에는 치명적인) 객혈을 증가시키는 것으로 보고되었다(Ratner, 2004, Nature Biotechnol. 22(10): 1198). 더욱 최근에는, 제넨테크사는 아바스틴으로 치료받은 난소암 환자의 11%(시험에서 44명의 여성 중 5명)에서 위장관 천공이 발견되었음을 보고하였다(Genentech Press Release dated September 23, 2005). 유사하게, 최초의 VEGF-표적화 약물인 화이자사(Pfizer)의 수용체 티로신 키나제 억제제 SU5416은 혈전색전성 사건을 포함하는 심각한 독성을 나타내었는데, 이로 인해 화이자사는 즉시 개발을 중단하였다(Ratner, 상기 문헌). 몇몇 공지된 항-혈관형성 치료제의 단점 및 효과적인 항-혈관형성 치료제의 개발로 인하여 이익을 얻게되는 매우 다양한 환자들을 고려하면, 신규한 항-혈관형성 치료제에 대한 요구가 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 야생형 VEGF에 비해 1 이상의 천연 VEGF 수용체에 대해 강한 결합 친화도를 나타내는, VEGF 유사체 및 VEGF 유사체 코딩 핵산을 포함한다. 본 발명은 또한 수용체 결합 친화도 및 생체활성의 해리를 나타내는, VEGF 유사체 및 VEGF 유사체 코딩 핵산을 포함한다. 특히, 개시된 유사체의 생체내 및 시험관내 생체활성은 야생형 VEGF에 비해 실질적으로 감소되지만, 1 이상의 천연 수용체에 대한 결합 친화도는 야생형 VEGF와 거의 동일하거나 야생형 VEGF에 비해 실질적으로 증가한다. VEGF 유사체의 KDR과 같은 천연 수용체에 대한 수용체 결합 친화도는 적어도 약 3 내지 4배로 나타날 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에서, VEGF 유사체는 VEGF 동종이량체 또는 이종이량체로 개질된다. 이러한 분자는 VEGF 분자의 일 또는 양쪽 서브유닛에 존재할 수 있는 1 이상의 돌연변이를 포함한다. 본 발명의 일 실시태양에서, 1 이상의 돌연변이를 포함하는 VEGF 유사체는 VEGF-A이다. VEGF-A 유사체는 임의의 VEGF-A 이소형, 예를 들어, 121, 145, 148, 165, 183, 189, 또는 206 아미노산의 이소형일 수 있다. 일 실시태양에서, 본 발명의 VEGF-A 유사체는 VEGF165b 이소형이다. 또다른 실시태양에서, 1 이상의 돌연변이를 포함하는 VEGF 분자는 VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 또는 PlGF이다.
본 발명은 1 이상의 서브유닛에 1 이상의 돌연변이를 포함하는 VEGF 융합 단백질을 포함한다. 본 발명의 VEGF 융합 단백질은 1 이상의 VEGF 서브유닛, 즉, 다른 시스틴 노트 성장 인자 또는 당단백질을 비제한적으로 포함하는 상이한 단백질의 1 이상의 서브유닛에 융합된 서브유닛을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 VEGF 분자가 VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, PDGF 또는 PlGF 서브유닛에 융합된 VEGF-A 서브유닛; VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, PDGF 또는 PlGF 서브유닛에 융합된 VEGF-B 서브유닛; VEGF-A, VEGF-B, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, PDGF 또는 PlGF 서브유닛에 융합된 VEGF-C 서브유닛; VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-E, VEGF-F, PDGF 또는 PlGF 서브유닛에 융합된 VEGF-D 서브유닛; 또는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, 또는 PDGF 서브유닛에 융합된 PlGF 서브유닛을 포함하는 키메라 VEGF 유사체를 포함한다. 서브유닛은 임의적으로 링커 펩티드 에 의해 분리될 수 있다. 본 발명은 또한 함께 융합된 동일한 VEGF의 상이한 이소형, 예를 들어 VEGF165b에 융합된 VEGF165 서브유닛을 포함한다.
일 실시태양에서, VEGF 유사체는 단일 사슬 분자이다. 예를 들어, 본 발명의 VEGF 유사체는 2개의 VEGF 서브유닛, 즉, 링커 펩티드를 통해 함께 결합된 단량체를 포함한다. 일 또는 두개의 연결된 서브유닛은 1 이상의 염기성 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 또한, 연결된 서브유닛은 상이한 VEGF 단백질 서브유닛일 수 있으며, VEGF 단백질 서브유닛의 상이한 이소형일 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 I83K 아미노산 치환기를 가진 VEGF165 서브유닛에 GS 링커를 통해 결합된 야생형 VEGF165 서브유닛을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 1 이상의 돌연변이를 포함하는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 또는 PlGF 서브유닛 또는 이량체는 독소에 융합된다. 이러한 실시태양의 펩티드는 종양 세포의 표적화 및 파괴에 유용할 수 있다.
본 발명의 VEGF 유사체는 44, 67, 72, 73, 83, 및 87번 위치의 군에 라이신 또는 아르기닌과 같은 1 이상의 염기성 아미노산 치환을 포함한다. 본 발명의 일 실시태양에서, VEGF 유사체는 83번 위치에 염기성 아미노산 치환을 포함하며, 임의적으로 44, 67, 72 및 73번 위치에 1 이상의 염기성 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 I83K 돌연변이를 갖는 VEGF 유사체를 포함한다. 본 발명은 또한 예를 들어, 72, 73 및 83번 위치에 염기성 아미노산을 갖는 VEGF 유사체를 포함한다.
본원에 기술된 염기성 아미노산 치환을 갖는 VEGF 유사체는 KDR에의 수용체 결합 친화도를 더욱 증가시키고/거나 뉴로필린-1에 대한 수용체 결합 친화도를 더욱 감소시키기 위해 추가의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 뉴로필린-1 결합 자리를 파괴시키는 작용을 하는 146 및 160번 위치의 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 유사체는 또한 안정성을 향상시키고 혈청 반감기를 증가시키는 추가의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 111 및 148번 위치에 존재하는 단백질 가수분해성 분열 자리를 제거하는 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명의 VEGF 수용체 길항제는 야생형 VEGF에 비해 혈장 반감기가 증가될 수 있다. 이는 반감기를 증가시키기 위한 당업계에 공지된 방법을 통해 VEGF 유사체를 추가로 개질시켜 달성될 수 있으며, 또는 별법으로, 혈장 반감기의 증가는 VEGF 유사체의 고유의 특성일 수 있다. 본 발명의 VEGF 수용체 길항제는 또한 야생형 VEGF에 비해 흡수 속도가 증가되고/거나 작용 지속시간이 감소될 수 있다.
본 발명의 개질된 유사체는 VEGF 수용체 길항제로서 작용하므로, 혈관형성과 관련된 광범위한 질병 및 상태를 앓고 있는 환자들이 오랜 시간 기다려온 해결책을 제공한다. VEGF 수용체 길항제는 단독으로, 또는 고형 종양 암, 혈관종, 류마티스 관절염, 골관절염, 패혈성 관절염, 천식, 아테롬성동맥경화증, 특발성 폐 섬유증, 혈관 재협착, 동정맥 기형, 수막종, 신생혈관 녹내장, 건선, 카포시 증후군(Kaposi's Syndrome), 혈관섬유종, 혈우병성 관절염, 비후성 반흔, 오슬러-웨버 증후군(Osler-Weber Syndrome), 화농성 육아종, 수정체후부섬유증식증, 공피증, 트 라코마, 폰 힙펠-린다우(von Hippel-Lindau) 질환, 혈관 유착 병리학, 윤활막염, 피부염, 신경계 퇴행 질환, 자간전증, 원인불명 여성 불임증, 자궁내막증, 원인불명 남성 불임증, 익상편, 상처, 앓이, 피부 궤양, 위궤양, 및 십이지장 궤양을 비제한적으로 포함하는 혈관형성과 관련된 질병의 치료를 위한 또다른 VEGF 수용체 길항제, 항암제, 또는 항-혈관형성 약물과 함께 환자에게 투여될 수 있다.
도 1A은 I83K 돌연변이체 및 야생형 VEGF-A의 KDR에 대한 결합을 비교한 그래프이다. 도 1B는 야생형 VEGF-A와 비교하여 183 K VEGF-A 돌연변이체의 존재하에 HUVEC-2 내피 세포의 증식의 감소를 나타낸 그래프이다.
도 2A는 E44R 유사체 및 야생형 VEGF-A의 KDR에 대한 결합을 비교한 그래프이다. 도 2B는 E44R VEGF-A 유사체 대 야생형 VEGF-A의 존재하에 HUVEC-2 세포 증식을 비교한 그래프이다.
도 3A는 E72R+E73R VEGF 돌연변이체 및 야생형 VEGF-A의 KDR에 대한 결합을 비교한 그래프이다. 도 3B는 E72R+E73R VEGF 돌연변이체 대 야생형 VEGF-A의 존재하에 HUVEC-2 세포 증식을 비교한 그래프이다.
도 4는 E44R 및 EE72/73RR 돌연변이체의 야생형 VEGF-A에 대한 결합을 비교한 그래프이다.
도 5는 Q87K 돌연변이체의 야생형 VEGF-A에 대한 결합을 비교한 그래프이다.
도 6은 E67K 돌연변이체의 야생형 VEGF-A에 대한 결합을 비교한 그래프이다.
본 발명은 VEGF 수용체 길항제로서 놀라운 활성을 나타내는 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF) 족의 변형된 혈관형성 성장 인자를 제공한다. VEGF 수용체 길항제로서, 본 발명의 화합물은 "항-혈관형성" 성질을 갖는다. "변형된"이란, 단백질이 중요한 야생형 VEGF, 즉, 인간 VEGF 또는 동물 VEGF와 상이한 아미노산 서열을 함유할지라도, 다른 종들의 알려진 VEGF 서열과 동일하도록 상기 서열이 변화되지 않았다는 것을 의미한다. 용어 "돌연변이된" 및 "치환된"은 본 명세서에서 변형된 아미노산 잔기를 지칭할 때 상호교환 가능하게 사용된다. 용어 "변형된 VEGF 분자", "변형된 VEGF 단백질", "VEGF 유사체", "VEGF 수용체 길항제", "VEGF 키메라", "VEGF 융합 단백질" 및 "VEGF 단일쇄 분자"는 본 명세서에서 변형된 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 및 PlGF 유사체 분자를 지칭할 때 상호교환 가능하게 사용된다.
"길항제"는 본 명세서에서 혈관형성의 유도와 같은 VEGF의 천연, 생물학적 활성을 차단, 억제 또는 감소시키는 작용을 하는 분자를 지칭할 때 상호교환 가능하게 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 것으로서, 용어 "항-혈관형성"은 본 발명의 변형된 VEGF 분자가 혈관형성의 과정 또는 기존 혈관으로부터 새로운 혈관 또는 림프관이 형성되는 과정을 차단, 억제 또는 감소시키는 것을 의미한다. 본 발명의VEGF 유사체의 활성은 일반적으로 VEGF가 수용체에 결합할 때 발생하는 정상적인 VEGF/수용체 신호전달을 파괴한다. 따라서, 본 발명의 유사체는 VEGF 수용체 길항제이다. 이론에 구애됨 없이, 본 발명의 VEGF 유사체는 신호전달에 필요한 KDR의 이량체화를 파괴한다고 여겨진다.
혈관형성의 억제는 완전하거나 부분적일 수 있다. VEGF 수용체 길항제는 시험관내 및 생체내에서 혈관형성을 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 및 약 100% 이상 억제할 수 있다. 혈관형성의 억제는 당업계에 공지된 방법으로 당업자에 의해 측정될 수 있다. 혈관형성 억제의 측정은 음성 및/또는 양성 대조군의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 당업자는 본 발명의 VEGF 유사체로 치료받은 개체에서의 혈관형성을 VEGF 유사체로 치료받지 않은 유사한 개체와 비교함으로써 본 발명의 VEGF 유사체가 VEGF-유도 혈관형성을 억제한다고 결론내릴 수 있다.
본 발명의 변형된 VEGF 분자는 야생형 VEGF의 것과 비교하여 1종 이상의 천연 VEGF 수용체에 대해 증가된 수용체 결합 친화도 또는 유사한 수용체 결합 친화도를 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 것으로서, 천연 VEGF 수용체는 VEGF와 특이적으로 상호작용하는 비변형된 수용체이다. 예를 들어, 내인성 VEGF 수용체는 천연 VEGF 수용체이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 천연 수용체는 KDR이다. KDR은 VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E 및 VEGF-F의 수용체이다. 다른 실시태양에서, 천연 수용체는 Flt-1이다. Flt-1은 VEGF-A, VEGF-B 및 PlGF의 수용체이다.
"수용체 결합 친화도"란 생체내 또는 시험관내에서 수용체에 결합하는 리간드의 능력을 지칭하며, 이는 경쟁적 결합 분석법 및 직접 결합 분석법을 포함하나 이에 한정되지 않는, 당업계에서 쉽게 이용가능한 방법에 의해 평가될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 것으로서, 수용체 결합 친화도란, Flt-1 (VEGF-R1으로도 알려짐), KDR (VEGF-R2로도 알려짐) 및 Flt-4 (VEGF-R3로도 알려짐)를 포함하나 이에 한정되지 않는 천연 VEGF 수용체에 결합하는 VEGF 분자의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 변형된 VEGF-A 분자는 야생형 VEGF-A와 비교하여 KDR에 대해 증가된 결합 수용체 친화도 또는 유사한 결합 친화도를 나타낸다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 변형된 VEGF 분자의 수용체 결합 친화도에 있어서 증가는 야생형 VEGF의 것보다 약 1.25 배 이상, 약 1.5 배 이상, 약 1.75 배 이상, 약 2 배 이상, 약 3 배, 약 4 배 이상, 약 5 배 이상, 약 6 배 이상, 약 7 배 이상, 약 8 배 이상, 약 9 배 이상 또는 약 10 배 이상 크다.
또 다른 실시태양에서, 변형된 VEGF는 KDR 및/또는 혈관형성에 관계된 다른 수용체에 대해 야생형 VEGF의 것과 유사하거나 필적하는 수용체 결합 친화도를 나타낸다. 유사하거나 필적하는 수용체 결합 친화도는 야생형 VEGF 것의 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상 또는 약 97% 이상, 또는 그 이상이다. 예를 들어, 본 발명은 야생형 VEGF에 의해 나타나는 수용체 결합 친화도의 약 75% 내지 85%, 약 85% 내지 95% 및 약 95% 내지 100%를 나타내는 VEGF-A 유사체를 포함한다.
본 발명은 또한 1종 이상의 천연 수용체에 대해 증가된 또는 유사한 수용체 결합 친화도를 나타내지만, 다른 천연 수용체에 대해 감소된 수용체 결합 친화도를 나타내는 VEGF 유사체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 VEGF-A 유사체는 야생형 VEGF-A과 비교하여 KDR에 대해 증가된 또는 유사한 수용체 결합 친화도를 나타내나, Flt-1, 뉴로필린-1 또는 뉴로필린-2에 대해서는 야생형 VEGF-A에 비해 감소된 수용체 결합 친화도를 나타낼 수 있다.
본 발명의 VEGF 유사체는 또한 야생형 VEGF와 비교하여 생체활성의 감소를 나타낸다. "생체활성"이란, 내피 세포에서 세포 증식을 유도하는 VEGF의 능력을 포함하나 이에 한정되지 않는, 생체내 및 시험관내에서 VEGF의 천연, 생물학적 활성을 지칭한다. 생체활성의 감소는 혈관형성의 감소를 야기한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 VEGF 유사체는 동일한 이소형의 야생형 VEGF에 비해 생체활성에 있어서 감소를 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 VEGF165 유사체는 야생형 VEGF165에 비해 생체활성의 감소를 나타낼 수 있고, VEGF165b 유사체는 야생형 VEGF165b에 비해 생체활성의 감소를 나타낼 수 있다.
생체활성은 VEGF에 대한 노출에 따른 인간 배꼽정맥 내피 세포 (HUVEC)과 같은 내피 세포의 생존성을 분석하는 시험관내 세포 생존성 분석법을 포함하나 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 평가될 수 있다. 야생형 VEGF에 대한 노출에 의한 것에 비해 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상,약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상 또는 약 95% 이상 또는 그 이상의 내피 세포 생존성의 감소는 생체활성의 감소를 나타낸다.
또한, 생체활성을 생체내에서 평가할 수 있다. 예를 들어, 종양 주위 혈관형성의 증가가 없음을 검출함으로써 종양이 있는 대상체의 생체내에서 생체활성을 평가할 수 있다. 혈관형성의 증가가 없음을 검출하는 것은 생체내 매트리겔 이동 분석, 디스크 혈관형성 분석, 마우스의 등쪽 스킨폴드 챔버 (skinfold chamber)를 포함하는 분석, 혈관형성의 각막 이식 및 스펀지 이식 모델을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 달성될 수 있다. 한 실시양태에서, 혈관형성은 종양과 그 주위의 혈관형성을 치료받지 않은 대상체의 유사한 유형, 크기 및 위치의 종양의 혈관형성에 대해 비교함으로써 평가한다. 조직을 추출하고 혈관 형성을 분석하기 위해 당업계에 공지된 생검법을 사용할 수 있다.
수용체 결합 친화성 및 생체활성의 "분리"는 수용체 결합 친화성 및 생체활성이 서로 관련되지 않는다는 개념을 나타낸다. 비교적, 수용체 결합 친화성 및 생체활성은 야생형 VEGF 단백질 (예컨대, 야생형 VEGF-A)에 대해 서로 관련된다. 예를 들어, 수용체 결합력의 증가로 인해 야생형 VEGF-A에 대한 생체활성이 증가할 것임이 예상될 것이다. 한편, 본 발명의 변형된 VEGF 분자는 야생형 VEGF와 비교하여 유사한 수용체 결합 친화성 또는 증가된 수용체 결합 친화성을 나타내나, 야생형 VEGF에 비해 감소된 생체활성을 나타낸다.
포유동물의 VEGF는 관련된 유전자 패밀리의 별도의 스플라이싱으로 인해 다양한 이소형로 생산된다. 본 발명은 혈관형성에 관련된 VEGF 이소형에 상응하는 VEGF 유사체를 기재한다. 달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 VEGF 유사체는 임의의 VEGF 이소형을 사용하여 생성할 수 있다.
VEGF-A는 각각 121, 145, 148, 165, 183, 189 및 206개의 아미노산을 포함하는 이소형 (이에 제한되지는 않음)로 존재할 수 있다. 3개의 주요 mRNA 종은 VEGF121, VEGF165 및 VEGF189이다. 본원에 사용된 바와 같은, VEGF121 (서열 6), VEGF145 (서열 8), VEGF148 (서열 10), VEGF165 (서열 4), VEGF165b (서열 13), VEGF183 (서열 15), VEGF189 (서열 17) 및 VEGF206 (서열 19)은 항-혈관형성 특성을 갖도록 변형될 수 있는 VEGF-A의 이소형이다. 본원에 기재된 아미노산 위치는 리더 서열 (예컨대, 서열 3의 리더 서열)이 없는 VEGF 분자에 기초한다. 리더 서열을 갖는 VEGF-A 이소형의 아미노산 서열은 서열 2, 5, 7, 9, 12, 14, 16 및 18이다.
VEGF-A의 다양한 이소형은 110개의 아미노산으로 이루어진 공통적인 아미노-말단 도메인을 공유한다. VEGF-A 이소형은 엑손 2 내지 5에 의해 코딩되는 수용체 결합 도메인을 갖는다. 이소형 사이의 가장 두드러진 차이는, 엑손 6a, 6b, 7a 및 7b에 의해 코딩되는 뉴로필린과 헤파린 결합 도메인에서 발견된다.
가장 흔한 VEGF-A 이소형은 VEGF165이다. VEGF165를 코딩하는 핵산은 서열 1이다. 최근에, VEGF165b로 지칭되는 내재적 스플라이스 변이체가 카르복시 말단에서 엑손 8 대신 엑손 9에 의해 코딩되는 서열을 함유하는 것으로 기재되었다. 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 서열 11의 서열이다. VEGF165b (리더 서열을 갖는 서열 12; 리더 서열이 없는 서열 13)는 VEGF165에 의해 추가되는 경우, 내피 세포의 VEGF 신호전달을 억제하였다 (문헌 [Woolard et al., 2004, Cancer Research. 64: 7822-7835], U.S. 2005/0054036 (이들 전문이 본원에 포함됨) 참조).
본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 유사체는 VEGF-A 유사체이다. VEGF-A 유사체에는 "변형된 VEGF-A 단백질", "VEGF-A 수용체 길항제", "VEGF-A 키메라", "VEGF-A 융합 단백질" 및 "VEGF-A 단일 사슬 분자"가 포함된다. VEGF-A 유사체는 하나 이상의 변형된 VEGF-A 서브유닛을 함유하는 VEGF-A 분자이다.
VEGF-B는 두가지 이소형인 VEGF-B167 (서열 48) 및 VEGF-B186 (서열 50)으로 존재한다 (Makinen et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 21217-21222). 본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 유사체는 VEGF-B 유사체이다. VEGF-B 유사체에는 "변형된 VEGF-B 단백질", "VEGF-B 유사체", "VEGF-B 수용체 길항제", "VEGF-B 키메라", "VEGF-B 융합 단백질" 및 "VEGF-B 단일 사슬 분자"가 포함된다. VEGF-B 유사체는 하나 이상의 변형된 VEGF-B 서브유닛을 함유하는 VEGF-B 분자이다.
VEGF-C는, 단백질분해적으로 절단되어 21-kd 활성 단백질을 형성하는 프로펩티드 (서열 51)로서 생성된다 (Nicosia, 1998, Am. J. Path. 153: 11-16). 본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 유사체는 VEGF-C 유사체이다. VEGF-C 유사체에는 "변형된 VEGF-C 단백질", "VEGF-C 유사체", "VEGF-C 수용체 길항제", "VEGF-C 키메라", "VEGF-C 융합 단백질" 및 "VEGF-C 단일 사슬 분자"가 포함된다. VEGF-C 유사체는 하나 이상의 변형된 VEGF-C 서브유닛을 함유하는 VEGF-C 분자이다.
VEGF-D 또한, 단백질분해적으로 절단되어 활성 단백질을 형성하는 프로펩티드 (서열 52)로서 생성된다. VEGF-D는 VEGF-C와 48% 동일하다 (Nicosia, 상기 참조). 본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 유사체는 VEGF-D 유사체이다. VEGF-D 유사체에는 "변형된 VEGF-D 단백질", "VEGF-D 유사체", "VEGF-D 수용체 길항제", "VEGF-D 키메라", "VEGF-D 융합 단백질" 및 "VEGF-D 단일 사슬 분자"가 포함된다. VEGF-D 유사체는 하나 이상의 변형된 VEGF-D 서브유닛을 함유하는 VEGF-D 분자이다.
태반 성장 인자 (PlGF)는 3개의 이소형인 PlGF-1 (서열 54), PlGF-2 (서열 56) 및 PlGF-3 (서열 58)으로 존재한다. PlGF-2는 다른 두 이소형에는 없는 헤파린과 뉴트로필린-1 결합 특성을 부여하는 펩티드를 코딩하는 엑손 6을 함유한다. PlGF-1과 PlGF-2 둘 모두 내피 세포 이동을 유도할 수 있는 것으로 보고되어 있다 (Migdal et al, 1998, J. Biol. Chem. 273: 22272-22278). 본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 유사체는 PlGF 유사체이다. 또다른 실시양태에서, VEGF 유사체는 PlGF-1 또는 PlGF-2이다. PlGF 유사체에는 "변형된 PlGF 단백질", "PlGF 유사체", "PlGF 수용체 길항제", "PlGF 키메라", "PlGF 융합 단백질" 및 "PlGF 단일 사슬 분자"가 포함된다. PlGF 유사체는 하나 이상의 변형된 PlGF 서브유닛을 갖는 PlGF 분자이다.
본 발명의 VEGF 유사체는 변형된 동물 또는 인간 VEGF 분자이다. 본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 유사체는 포유동물 VEGF 분자이다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, VEGF 유사체는 조류 VEGF 분자이다. 본 발명의 VEGF 유사체는 변형된 영장류, 개과, 고양이과, 소과, 말과, 돼지과, 양과, 뮤린, 래트 및 토끼과 VEGF 분자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 동물 VEGF 유사체는 VEGF-A 유사체이다. 예를 들어, 본 발명의 동물 VEGF-A 유사체는 동물 VEGF165 또는 VEGF 165b 유사체일 수 있다.
인간 이외 종의 변형된 VEGF 분자는 본원에 개시된 변형된 인간 VEGF 분자 중의 것에 상응하는 위치에서 치환을 가지고, DNASIS, ALIONment, SIM 및 GCG 프로그램, 예컨대 Gap, BestFit, FrameAlign, 및 Compare를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 정렬 프로그램을 사용하여 확인될 수 있다. 당업자에게 인식될 수 있는 바와 같이, 염기성 아미노산과 치환될 상응하는 아미노산은 인간 VEGF-A의 것과 동일하지 않을 수 있다. 예를 들어, 당업자는 글루타메이트 (E)가 동물 중의 상이한 산성 아미노산, 예컨대 아스파르테이트 (D)에 상응할 수 있음을 인식할 것이다.
또다른 실시양태에서, 상응하는 아미노산은 정의된 구조, 예를 들어 외부 루프 구조 내에서 동일한 일반 위치에 위치하는 것에 의해 확인된다. 단백질의 구조는 단백질의 아미노산에 기초한 소프트웨어를 사용하여 예측될 수 있다. 따라서, 당업자는 단백질 폴딩 및 루프 구조를 예측하여 관련 단백질에서 상응하는 위치를 확인하는 소프트웨어를 사용할 수 있다.
VEGF
수용체 길항제
의
디자인
본 발명에 포함되는 VEGF 수용체 길항제는 목적 VEGF의 아미노산 서열을 다른 종의 것과 비교하여 다른 종의 VEGF의 단백질에서 염기성 잔기를 확인함으로써 디자인할 수 있다. 예를 들어, 실례로서 VEGF-A 분자는 인간 VEGF-A를 또다른 종의 것과 비교하여 디자인할 수 있다. 이러한 방법은 U.S. 6,361,992에 개시되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 비교 및 아미노산 치환을 위해 선택되는 종에 대해 각종 종으로부터의 VEGF의 관련 생물학적 활성이 고려될 수도 있다. 또한, 관련 당단백질의 구조에 기초한 상동성 모델링이 표면-노출 아미노산 잔기를 확인하는데 유용하다. 상동성 모델링은 단백질 모델링 컴퓨터 소프트웨어를 사용하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 당업계에 일반적으로 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 변형된 VEGF 단백질을 제공하며, 여기서 변형된 VEGF는 야생형 VEGF보다 증가된 결합 친화성 및/또는 감소된 생체활성을 갖는 또다른 종으로부터의 VEGF 단백질에서의 동일한 아미노산 위치에 상응하는 위치(들)에서 치환된 아미노산(들)을 포함한다. 예를 들어, 독사 독 VEGF-F는 고친화성으로 KDR에 결합하여 시험관내에서 혈관 내피 세포의 증식을 강하게 촉진한다. 인간 VEGF-A를 독사 독 VEGF와 비교하고, 독사 독과 인간 서열이 상이한 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 갖는 인간 VEGF-A 단백질을 디자인하고, 선택된 변화를 갖는 인간 VEGF-A 단백질을 작제하고, 변형된 인간 VEGF-A를 인간에게 투여할 수 있다. 독사 독 VEGF-F가 인간 VEGF에 비해 KDR 결합 친화성 및 생체활성의 증가를 나타내지만, 즉 결합 친화성과 생체활성은 상호관련되지만, 당업자는 아미노산 치환이 수용체 결합 친화성을 증가시키지만 생체활성을 감소시키거나 그에 대해 아무런 영향을 갖지 않는 아미노산 치환을 확인하기 위해 경험적으로 시험될 수 있음을 이해할 수 있다. 수용체 결합 친화성을 증가시키고/거나 생체활성을 감소시키거나 또는 그에 대해 아무런 영향을 갖지 않는 아미노산 치환은 이어서 수용체 결합 친화성을 증가시키고/거나 생체활성을 감소시키는 것으로 공지된 하나 이상의 다른 아미노산과 조합될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 변형된 VEGF 분자는 절지동물에 자연적으로 존재하는 VEGF 상동체 중의 동일한 아미노산 위치에 상응하는 위치(들)에서 치환되는 하나 이상의 아미노산을 함유할 수 있다. 절지동물에서, 단일 성장 인자는 고등 생물에서 PDGF 및 VEGF에 의해 수행되는 기능을 수행한다. 당업자는 아미노산 치환이 수용체 결합 친화성을 증가시키지만 생체활성을 감소시키거나 그에 대해 아무런 영향을 갖지 않거나, 또는 달리 수용체 결합 친화성에 대해 거의 영향을 갖지 않지만 생체활성을 감소시키는 아미노산 치환을 확인하기 위해 경험적으로 시험될 수 있음을 이해할 것이다.
또한, 본 발명은 변형된 VEGF를 제공하며, 여기서 변형된 VEGF는 상이한 VEGF 또는 VEGF 이소형 또는 매우 관련된 당단백질, 예컨대 동일한 종 또는 상이한 종으로부터의 PDGF 패밀리 중의 단백질의 동일한 아미노산에 상응하는 위치(들)에서 치환되는 염기성 아미노산(들)을 포함한다. 예를 들어, VEGF165는 동일한 종으로부터의 PDGF 및 임의의 서열 분화에 기초한 VEGF 단백질에 수행된 아미노산 치환과 비교될 수 있다. 당업자는 당업계에 공지된 방법, 예컨대 DNASIS, ALIONment, SIM 및 GCG 프로그램, 예컨대 Gap, BestFit, FrameAlign, 및 Compare를 포함하지만 이에 제한되지 않는 정렬 소프트웨어를 사용하여 VEGF 단백질 또는 VEGF-관련 단백질의 2 이상의 서열을 비교할 수 있다.
본 발명의 또다른 측면에서, 본원에 기재된 아미노산 치환은 매우 관련된 단백질, 예컨대 VEGF-E (서열 60), VEGF-F (서열 62) 및 PDGF (서열 63 및 서열 64)에 도입될 수 있다. 예를 들어, E67, E72, E73, I83 및 Q87로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기성 아미노산 치환은 동일한 종으로부터의 PDGF 이소형 및 PDGF 이소형에 수행된 아미노산 치환과 비교될 수 있다.
본 발명의 VEGF 유사체는 야생형 VEGF-A에 비해 Flt-1 수용체에 대한 감소된 수용체 결합 친화성을 나타내도록 디자인될 수 있다. 이들 유사체가 Flt-1에 대한 감소된 수용체 결합 친화성을 나타냄에도 불구하고, 이들은 야생형 VEGF-A에 비해 KDR에 대한 증가되거나 비슷한 수용체 결합 친화성을 가질 수 있다.
본 발명의 VEGF 유사체는 야생형 VEGF의 수용체 결합 친화성에 비해 공동-수용체 (뉴로필린-1 또는 뉴로필린-2를 포함하나 이에 제한되지 않음)에 대한 감소된 수용체 결합 친화성을 나타내도록 디자인될 수 있다. 뉴로필린-1 또는 뉴로필린-2에 대한 감소된 수용체 결합 친화성을 갖는 유사체는 야생형 VEGF의 수용체 결합 친화성에 비해 KDR, Flt-1 또는 VEGR3에 대한 증가되거나 유사한 수용체 결합 친화성을 가질 수 있다. 예를 들면, 뉴로필린-1에 대한 감소된 수용체 결합 친화성 및 KDR 및/또는 Flt-1에 대한 증가된 수용체 결합 친화성을 나타내는 VEGF-A 유사체를 디자인할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 뉴로필린-1에 대해 감소된 수용체 결합 친화성을 나타내는 VEGF-A는 VEGF165b 스플라이스 변이체에서 디자인된 유사체이다. 다른 실시양태에서, 뉴로필린-1에 대한 감소된 수용체 결합 친화성 및 Flt-1에 대한 증가된 결합 친화성을 나타내는 VEGF-B167 및 PlGF-2 유사체를 디자인할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 유사체는 VEGF 뉴로필린 결합 부위를 붕괴함으로써 야생형 VEGF에 비해 뉴로필린-1 또는 뉴로필린-2에 대한 감소된 수용체 결합 친화성을 타나내도록 디자인된다. 이는 뉴로필린-1 수용체 결합 도메인에서의 시스테인 아미노산 잔기의 수를 감소시킴으로써 달성할 수 있다. 예를 들면, VEGF165 유사체는 서열 4의 위치 146 및/또는 160에 있는 시스테인 잔기를 세린과 같은 아미노산으로 치환함으로써 디술피드 브릿지의 붕괴를 유발시켜 VEGF165에서의 뉴로필린 1 결합 부위를 붕괴하도록 디자인될 수 있다. 서열 4의 위치 146 및 160에 있는 시스테인 잔기의 치환은 뉴로필린-1 결합을 붕괴하지만, 헤파린 결합을 붕괴하지는 않는다. 위치 146 및/또는 160에서의 돌연변이는 본원에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 돌연변이와 커플링되어 KDR, Flt-1 및/또는 VEGFR3에 대한 수용체 결합 친화성을 증가, 유지 또는 회복시킬 수 있다.
유사하게, 본 발명은 야생형 VEGF에 비해 뉴로필린-2에 대한 감소된 수용체 결합 친화성을 나타내는 VEGF 유사체를 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 뉴로필린-2에 대한 감소된 결합 친화성을 나타내나 야생형 VEGF-C 또는 VEGF-D에 비해 각각 KDR 및/또는 VEGFR3에 대한 증가된 또는 유사한 결합 친화성을 나타내는 VEGF-C 및 VEGF-D 유사체를 포함한다.
또한, 본 발명은 프로테아제에 대한 향상된 안정성 및 내성을 나타내는 VEGF 유사체를 포함한다. 한 실시양태에서, 서열 4의 위치 A111 및 A148에서의 아미노산 치환이 VEGF-A 유사체에 포함되어 프로테아제에 대한 내성을 개선시킨다. 본 발명은 또한 각각 VEGF-C 프로펩티드 또는 VEGF-D 프로펩티드의 절단을 막는 돌연변이를 함유하는 VEGF-C 및 VEGF-D 유사체를 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 세린 프로테아제 플라스민 및/또는 플라스미노겐 족의 다른 구성원에 대한 내성을 유도하는 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 VEGF-C 및 VEGF-D 유사체를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서는, 길항 성질을 나타내는 자연 발생 VEGF 분자에서 하나 이상의 VEGF 수용체, 바람직하게는 KDR에 대한 증가된 수용체 결합 친화성을 나타내는 VEGF 유사체를 생성할 수 있다. 예를 들면, 신장 조직으로부터 단리된 이소형인 VEGF165b는 수용체 결합 능력 증가 및 단백질의 생체활성 감소와 연관된 아미노산 치환을 포함하도록 변형될 수 있다. 유사하게, 당업자는 VEGF165b의 성질을 함유하는 VEGF의 합성 또는 신규 이소형에 본 발명의 아미노산 치환을 포함시킬 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 돌연변이는 엑손 8로 코딩되는 아미노산 (CDKPRR; 서열 71) 이외에 또는 이를 대신하여 아미노산 SLTRKD (서열 70), 즉 엑손 9로 불려온 것으로 코딩되는 아미노산을 함유하는 다른 VEGF 단백질과 사용될 수 있다.
아미노산 치환
본 발명의 VEGF 유사체는 향상된 수용체 결합 친화성 및 감소된 생체활성을 부여하는 하나 이상의 염기성 아미노산 치환을 함유한다. 본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 유사체는 VEGF-A 길항제를 포함하나 이에 제한되지 않는 VEGF 수용체 길항제이다.
본 발명의 변형된 VEGF 분자는 VEGF의 하나 이상의 서브유닛, 즉 단량체 중에 염기성 아미노산 치환을 보유할 수 있다. 염기성 아미노산은 아미노산 리신 (K), 아르기닌 (R) 및 히스티딘 (H), 및 이들 세 아미노산 중 하나의 변형일 수 있는 임의의 다른 염기성 아미노산, 자연에서 보통 발견되지 않는 합성 염기성 아미노산 또는 중성 pH에서 양의 전하를 갖는 임의의 다른 아미노산을 포함한다. 이 중에서 바람직한 아미노산은 리신 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 변형된 VEGF 분자는 하나 이상의 변형된 서브유닛을 포함하며, 여기서 변형된 서브유닛은 야생형 인간 VEGF165 (서열 4), VEGF121 (서열 6), VEGF145 (서열 8), VEGF148 (서열 10), VEGF165b (서열 13), VEGF183 (서열 15), VEGF189 (서열 17) 또는 VEGF206 (서열 19)의 위치 I83에 염기성 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 VEGF-A 이소형의 아미노산 서열에 상응하는 서열 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17 또는 19에 I83K 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명은 또한 다른 VEGF 분자, 즉, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 PlGF에서 위치 83에 상응하는 위치, 예를 들어 VEGF-B167 (서열 48) 또는 VEGF-B186 (서열 50)의 위치 I83 및 PlGF-1 (서열 54), PlGF-2 (서열 56) 또는 PlGF-3 (서열 58)의 위치 I91에 염기성 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명은 인간이 아닌 동물에서의 변형된 VEGF 분자를 포함하며, 여기서 VEGF 분자는 하나 이상의 서브유닛에서 인간 VEGF-A에서 위치 83에 상응하는 위치에 염기성 아미노산 치환을 함유한다. 한 실시양태에서, 변형된 동물 VEGF는 변형된 VEGF-A 분자이다. 예를 들면, 본 발명은 영장류에서의 위치 I83 (서열 22), 소에서의 위치 I82 (서열 25), 개에서의 위치 I82 (서열 28), 닭에서의 위치 I83 (서열 31), 말에서의 위치 I82 (서열 182), 쥐에서의 위치 I82 (서열 37), 돼지에서의 위치 I82 (서열 40), 래트에서의 위치 I82 (서열 43) 및 양에서의 위치 I82 (서열 46)에 염기성 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명은 또한 서열 4의 위치 I83에 상응하는 아미노산 치환을 함유하는 변형된 VEGF-관련 단백질 (VEGF-E, VEGF-F 및 PDGF가 있으나, 이에 제한되지 않음)을 구상한다. 예를 들어, VEGF-F (서열 62)는 I83 아미노산 치환을 포함하기 위해 변형될 수 있다.
본 발명의 변형된 VEGF 분자는 야생형 VEGF, 예컨대 야생형 VEGF-A에 비해 VEGF의 결합 친화성을 더 증가시키거나 생체활성을 더 감소시키는 염기성 아미노산 치환을 함유할 수 있다. VEGF165 (서열 4), VEGF121 (서열 6), VEGF145 (서열 8), VEGF148 (서열 10), VEGF165b (서열 13), VEGF183 (서열 15), VEGF189 (서열 17) 및 VEGF206 (서열 19)의 하나 이상의 위치 44, 67, 72, 73 및/또는 87에서 염기성 아미노산 치환을 갖는 VEGF 분자는 야생형 VEGF에 비해 KDR에 대한 결합 친화성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 염기성 아미노산 변형 E44R, E44K, E72R, E72K, E73R, E73K, Q87R, Q87K 및 E67K를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 서열 4의 위치 44, 67, 72, 73 및/또는 87에 상응하는 염기성 아미노 치환은 서열 4의 위치 83에 상응하는 염기성 아미노산 치환과 커플링되어 VEGF 수용체 길항제를 생성한다. 예를 들어, 본 발명의 변형된 아미노산은 위치 72+73+83, 44+83, 72+83, 73+83, 44+72+83, 44+73+83, 44+72+73+83, 44+83+87, 83+87, 67+72+73+83; 44+67+83, 67+72+83, 67+73+83, 44+67+72+83, 44+67+73+83, 44+67+72+73+83, 44+67+83+87 및 67+83+87에서의 염기성 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 유사체는 위치 E44, E67, E72, E73 및 Q87에서의 하나 이상의 염기성 아미노산을 함유하는 VEGF165b 분자이고, 임의로 위치 I83에서의 염기성 아미노산 치환이다. VEGF-A 동형체가 VEGF165b인 경우, 달리 오직 다른 VEGF165에서의 수용체 결합 친화성의 증가를 유도하는 단일 아미노산 변형을 포함함으로써, 야생형 VEGF-A에 비해 증가된 결합 친화성 및 감소된 생체활성을 갖는 본 발명의 VEGF 유사체 (VEGF165 포함)를 생성하는 것이 가능하다.
당업자에 의해 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 VEGF-A (서열 4)의 위치 E44, E67, E72, E73 및/또는 Q87의 것들에 상응하는 염기성 아미노산 변형을 함유하는 VEGF-A를 제외한 VEGF-관련 단백질 및 VEGF 단백질을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 위치 A44, E67, G72, Q73 및 S87에서의 하나 이상의 염기성 아미노산 치환을 함유하는 변형된 VEGF-B 유사체 (서열 48 및 50)를 포함하고, 위치 E44, E67, E72, E73 및 Q87에서의 하나 이상의 염기성 아미노산 치환을 함유하는 변형된 VEGF-F 유사체 (서열 62)를 포함한다.
본 발명의 변형된 동물 (즉, 비-인간) VEGF-A 분자는 마찬가지로 야생형 동물 VEGF에 비해 변형된 동물 VEGF 분자의 결합 친화성을 증가시키거나 생체활성을 감소시키기 위해 추가의 아미노산 변형을 함유할 수 있다. 본 발명은 상기 기재된 서열 4의 I83에 상응하는 아미노산 치환과 관련한 이들 변형들의 용도를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 영장류 (긴꼬리 마카크원숭이) VEGF-A (서열 22)의 위치 E44, E67, E72, E73, I83 및 I87의 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기성 아미노산 치환; 소 VEGF-A (서열 25)의 위치 E43, E66, E71, E72, I82 및 Q86의 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기성 아미노산 치환; 개 VEGF-A (서열 28)의 위치 E43, E66, E71, E72, I82 및 Q86의 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기성 아미노산 치환; 새 (닭) VEGF-A (서열 31)의 위치 E44, E67, D72, V73, I83 및 Q87의 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기성 아미노산 치환; 말 VEGF-A (서열 34)의 위치 E43, E66, A71, E72, I82 및 Q86의 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기성 아미노산 치환; 뮤린(murine) VEGF-A (서열 37)의 위치 E43, E66, S71, E72, I82 및 Q86의 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기성 아미노산 치환; 돼지 VEGF-A (서열 40)의 위치 E43, E66, E71, E72, I82 및 Q86의 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기성 아미노산 치환; 래트 VEGF-A (서열 43)의 위치 E43, E66, S71, E72, I82 및 Q86의 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기성 아미노산 치환; 및 양 VEGF-A (서열 46)의 위치 E43, E66, E71, E72, I82 및 Q86의 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기성 아미노산 치환을 포함한다.
하나 이상의 염기성 아미노산 치환을 함유하는 VEGF 유사체는 또한 공동-수용체 결합 부위를 붕괴하도록 고안된 아미노산 치환과 합해질 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 VEGF 유사체는 붕괴된 뉴로필린-1 결합 부위를 함유한다. 뉴로필린-1 결합 부위는 VEGF165 (서열 04)의 아미노산 111 내지 165를 포함한다. 이 도메인은 엑손 6 및 7에 의해 코딩된 헤파린 결합 도메인과 중첩된다. 본 발명은 뉴로필린-1 결합 부위 도메인을 붕괴하지만 헤파린 결합 도메인의 헤파린 술페이트 결합 능력을 붕괴하지 않는 임의의 이내(또는 부근) 아미노산 변형 (즉, 약 5개의 아미노산 이내)을 포함한다. 상기 아미노산 변형은 당업자에 의해 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 뉴로필린-1 결합 도메인은 도메인의 시스테인 아미노산 잔기를 감소시킴으로써, 즉, VEGF-A의 아미노산 111 내지 165 사이의 시스테인 아미노산 잔기의 수를 감소시킴으로써 붕괴된다. 예를 들어, VEGF165 유사체는 아미노산 (예컨대, 세린)을 갖는 서열 4의 위치 146 및/또는 160에서 시스테인 잔기를 치환시킴으로써 뉴로필린 1 결합 부위를 붕괴하도록 고안될 수 있고, 이로써 디술파이드 브릿지가 붕괴된다. 서열 4의 위치 146 및 160에서의 시스테인 잔기의 치환은 뉴로필린-1 결합을 붕괴하지만 헤파린 결합은 붕괴하지 않는다. 뉴로필린-1 결합 부위는 또한 위치 146 또는 160에서의 아미노산 펩티드를 종결시킴으로써 붕괴될 수 있다.
본 발명은 또한 위치 146 및 160의 시스테인 잔기가 디술파이드 브릿지를 형성할 수 없도록, 서열 4의 위치 146 및 160에서 아미노산을 둘러싸고 있는 아미노산의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 디술파이드 브릿지의 형성을 붕괴시킬 수 있는 위치 136 내지 165에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
서열 4의 E44, E67, E72, E73, I83 및 Q87에 상응하는 염기성 아미노산 치환을 하나 이상 함유하는 본 발명의 변형된 VEGF 유사체를 본원에 기재하였다. 예를 들면, 본 발명은 이하
(여기서, B는 염기성 아미노산이고, X는 시스테인 이외의 아미노산이고, 일 실시양태에서, X는 세린임) 위치에 아미노산 치환을 가지는 VEGF 유사체를 포함한다.
또한, 본 발명의 변형된 단백질은 치환, 특히 단백질의 향상된 특성을 변화시키지 않는 보존적 치환을 더 함유할 수 있다. 그러나, 전형적으로 그러한 변형된 단백질은 상기에서 열거한 이외의 위치에 5개 미만의 치환을 함유할 것이고, 상기에서 열거한 위치 이외의 위치에서 상응하는 야생형 VEGF 서브유닛과 완벽한 아미노산 서열 동일성을 나타낼 수 있다.
당업자에 의해 인정될 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 개시된 모든 아미노산 치환과 펩티드 변형법은, VEGF 단백질과 관련 단백질 사이의 높은 상동성으로 인해 종을 불문하고 임의의 VEGF 단백질 또는 관련 단백질에 도입될 수 있다. 당업자들은 아미노산 서열 정렬 소프트웨어를 사용하는 것을 포함하지만 이것으로 제한되지 않는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 본원에 개시된 아미노산 치환을 서로 대비할 수 있다.
증가된
혈청 반감기를 가지는
VEGF
유사체
본 발명의 VEGF 유사체는 야생형 VEGF에 비해 증가된 혈장 반감기를 가질 수 있다. 일 실시양태에서, 야생형 VEGF에 비해 수용체 결합 친화성을 증가 또는 유지시키고, 생체활성을 감소시킨 변형(들)은 또한 야생형 VEGF에 비해 VEGF의 혈장 반감기를 증가시킨다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 변형된 VEGF 단백질은 더 변형되어, 그 혈장 반감기가 야생형 VEGF에 비해 증가된다.
단백질, 특히 당단백질의 반감기를 증가시키는데 사용될 수 있는 많은 변형체가 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 본 발명의 변형된 VEGF 단백질은 알파 또는 베타 쇄 상의 N-글리코실화 및/또는 O-글리코실화 부위를 포함하는 서열을 포함하여, 잠재적인 글리코실화 부위를 가지는 서열을 적어도 하나 더 포함할 수 있다. 잠재적인 글리코실화 인식 부위를 제공하는 서열은 각 서브유닛 상의 N-말단 또는 C-말단 연장부일 수 있다. 일례가 되는 변형된 단백질은 ANITV(서열 72) 및 ANITVNITV(서열 73)로 이루어진 군에서 선택된 서브유닛 상의 N-말단 연장부를 함유한다.
반감기의 증가는 hCG의 카르복실 말단 연장부 펩티드와 같은 펩티드 연장부의 사용에 의해 제공될 수도 있다. 본원에 참고문헌으로서 그의 전문이 포함되는 미국 09/519,728 참조. VEGF 유사체의 서브유닛은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 예컨대 펩티드 결합, 또는 펩티드 링커를 포함하지만 이것으로 제한되지 않는 단백질의 아미노 말단과 카르복실 말단 사이에 공유 결합을 형성시킬 수 있는 헤테로 이관능성 시약(heterobifunctional reagent)에 의해 CTEP에 공유 결합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 염기성 아미노산 치환은 하나 이상의 단백질 가수분해 절단 부위를 제거하는 것에 의해, 안정성을 향상시키고 혈청 반감기를 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환과 연결된다. 일 실시양태에서, 추가의 아미노산 치환은 단백질 가수분해 절단을 감소시킨다. 또 다른 실시양태에서, 추가의 아미노산 치환은 단백질 가수분해 절단을 방지한다. 본 발명은 플라스민, 및 플라스미노겐 과의 다른 일원에 대한 내성을 유도하는 돌연변이를 하나 이상 함유하는 VEGF 유사체를 포함한다. 본 발명의 일 실시양태에서, VEGF 분자의 적어도 하나의 서브유닛은, VEGF165(서열 4) 또는 VEGF 165b(서열 13)의 A111P 및/또는 A148P와 같은, 아미노산 위치 A111 및/또는 A148에 상응하는 아미노산 치환을 함유한다. 예를 들면, 본 발명은 위치 A111에 아미노산 치환을 함유하는 VEGF121, VEGF145, VEGF148, VEGF183, VEGF189 및 VEGF206을 포함한다. 본 발명은 프로테아제 절단을 억제하거나 감소시키는 VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 PlGF에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 생체활성에 필요한 VEGF-C 및 VEGF-D의 절단을 방지하는 아미노산 치환을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 반감기는 VEGF 단량체를 연결시키고, 융합 단백질을 구축하는 것에 의해 증가될 수 있다. 결합 부위를 방해하지 않고 VEGF 유사체의 크기를 증가시키는 것은 분자의 반감기를 증가시킬 수 있다.
반감기의 증가는 페길화(pegylation) 또는 컨쥬게이션을 포함하지만 이것으로 제한되지 않는 기타 적절한 화학기와의 교차 결합에 의해 제공될 수 있다. 그 방법들은 참고문헌으로서 그의 전문이 포함되는 미국 특허 5,612,034, 미국 특허 6,225,449 및 미국 특허 6,555,660의 각각에 개시된 바와 같이, 당업계에 알려져 있다. 반감기는 또한 분자 내의 음전하를 띤 잔기의 수, 예를 들면 글루타메이트 및/또는 아스파테이트 잔기의 수를 증가시키는 것에 의해 증가될 수도 있다. 그러한 변경은 부위 지정 돌연변이 유발(site directed mutagenesis)이나, 또는 음 전하를 띤 잔기를 하나 이상 함유하는 아미노산 서열, 그 중에서도 특히 GEFT 및 GEFTT로 이루어진 군에서 선택된 삽입물의 상기 변형된 VEGF로의 삽입에 의해 달성될 수 있다.
단백질의 반감기는 단백질 안정성의 측정치이며, 단백질 농도가 절반으로 감소하는데 필요한 시간을 나타낸다. 본원에 기재된 변형된 VEGF 분자의 혈청 반감기는, 일정 시간에 걸쳐 대상으로부터의 샘플 중 VEGF 수준을 측정하는데 적합한 임의의 방법, 예를 들어 변형된 VEGF의 투여 후 일정 기간에 걸쳐 취해진 혈청 샘플 중의 VEGF 수준을 항-VEGF 항체를 사용해서 측정하는 면역검정법이 있지만 이에 한정되지 않는 방법에 의해, 또는 표지된 VEGF의 투여 후 대상으로부터 취해진 샘플 중의 표지된 VEGF 분자, 즉 방사성표지된 분자를 검출함으로써 측정될 수 있다.
본 발명의 VEGF 유사체의 흡수 속도는 증가 또는 감소된 작용 기간을 나타낼 수 있다. 피하 투여에 의해 또는 투여 경로와 관련된 흡수 특성을 방해함으로써 작용 기간이 증가하고/하거나 흡수 속도가 느려지는 것과 일반적으로 관련된 다른 투여 경로에 의해 VEGF 유사체 제약 조성물을 수용하는 환자의 경우, 증가된 흡수 속도 및 감소된 작용 기간을 갖는 VEGF 유사체가 유리할 수 있다.
링커
본 발명의 VEGF 유사체는 링커 펩티드에 의해 분리된 2개 이상의 단량체를 함유할 수 있다. 링커 펩티드는 단일 쇄 형태의 VEGF 유사체를 형성하는 데 사용될 수 있다. 당업자는 본 발명에서 VEGF 수용체와 결합할 수 있으며 VEGF 수용체 길항제로서 작용하는 VEGF 단일 쇄 분자를 형성시키기 위해 다양한 유형의 링커를 사용할 수 있음을 인식할 수 있다. 링커 펩티드는 단일 쇄 분자가 VEGF 수용체와 결합하는 능력을 방해하지 않아야 한다.
링커 펩티드의 길이는 아미노산 약 2개 내지 약 50개 또는 그보다 더 긴 범위일 수 있다. 예를 들면, 링커는 약 2개의 아미노산, 약 3개의 아미노산, 약 4개의 아미노산, 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 약 10개의 아미노산, 약 10개 내지 약 15개의 아미노산 또는 약 15개 내지 약 20개의 아미노산으로 구성될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 링커는 Gly-Ser이거나 또는 Gly-Ser을 함유한다. 다른 실시양태에서, 링커는 글리신-풍부 폴리펩티드 쇄이다.
링커를 함유하는 VEGF 분자는 본원에 기재된 방법을 이용해서 구성할 수 있다. 당업자는 링커 펩티드를 함유하는 본 발명의 VEGF 유사체 분자가 하나 이상의 단량체에서 본원에 기재된 임의의 돌연변이를 포함할 수 있음을 인식할 수 있을 것이다. 추가로, 하나 이상의 링커 펩티드를 함유하는 VEGF 유사체는 하나 초과 유형의 VEGF 단백질 또는 이소형을 연결할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 I83B 치환을 함유하는 변형된 VEGF165 단량체에 연결된 야생형 VEGF165 단량체; I83B 치환을 함유하는 변형된 VEGF165b에 연결된 야생형 VEGF165 단량체; 및 변형된 VEGF-F 단량체에 융합된 변형된 VEGF165 단량체를 갖는 변형된 VEGF 단일 쇄 분자를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
VEGF
융합 단백질
본 발명은 또한 하나 이상의 변형된 VEGF 단백질 또는 단편을 함유하는 융합 단백질, 즉 키메라를 포함한다. "융합 단백질" 및 "키메라"는 본원에서 서로 바꾸어 쓸 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, VEGF 잔기는 본 발명의 염기성 아미노산 치환을 하나 이상 함유하는 VEGF 단백질 또는 단백질 단편이다. VEGF 융합 단백질은 하나 이상의 VEGF 잔기를 가질 수 있다.
이러한 융합 단백질은 목적하는 아미노산 서열을 코딩하는 적절한 핵산 서열을 당업계에 공지된 방법에 의해 적절한 코딩 프레임으로 라이게이션하고, 융합 단백질을 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 발현시킴으로써 제조할 수 있다. 또는, 이러한 융합 단백질은 단백질 합성 기술, 예를 들어 펩티드 합성기에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 본원에 기재된 하나 이상의 염기성 아미노산 치환을 함유하는 하나 이상의 VEGF 단백질 또는 단백질 단편을 함유한다. 한 실시양태에서, 융합 단백질은 VEGF165 (서열 4), VEGF165b (서열 13), VEGF121 (서열 6), VEGF145 (서열 8), VEGF148 (서열 10), VEGF183 (서열 15), VEGF189 (서열 17) 또는 VEGF206 (서열 19)의 위치 I83에서 염기성 아미노산 치환을 함유한다. 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 다른 VEGF 단백질, 예를 들어 VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 또는 PlGF의 이소형에서 서열 4의 I83K에 상응하는 위치에서 하나 이상의 염기성 아미노산 치환을 함유한다. 당업자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 인간 또는 동물의 VEGF 단백질 또는 그의 단편은 본 발명의 융합 단백질에 사용될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 2개의 상이한 VEGF 단백질 서브유닛 또는 그의 단편을 융합한다. 예를 들어, 본 발명은 VEGF-B 서브유닛 또는 그의 단편, VEGF-C 서브유닛 또는 그의 단편, VEGF-D 서브유닛 또는 그의 단편, 또는 PlGF 서브유닛 또는 그의 단편에 융합된 VEGF-A 서브유닛 또는 그의 단편; VEGF-A 서브유닛 또는 그의 단편, VEGF-C 서브유닛 또는 그의 단편, VEGF-D 서브유닛 또는 그의 단편, 또는 PlGF 서브유닛 또는 그의 단편에 융합된 VEGF-B 서브유닛 또는 그의 단편; VEGF-A 서브유닛 또는 그의 단편, VEGF-B 서브유닛 또는 그의 단편, VEGF-D 서브유닛 또는 그의 단편, 또는 PlGF 서브유닛 또는 그의 단편에 융합된 VEGF-C 서브유닛 또는 그의 단편; VEGF-A 서브유닛 또는 그의 단편, VEGF-B 서브유닛 또는 그의 단편, VEGF-C 서브유닛 또는 그의 단편, 또는 PlGF 서브유닛 또는 그의 단편에 융합된 VEGF-D 서브유닛 또는 그의 단편; 및 VEGF-A 서브유닛 또는 그의 단편, VEGF-B 서브유닛 또는 그의 단편, VEGF-C 서브유닛 또는 그의 단편, 또는 VEGF-D 서브유닛 또는 그의 단편에 융합된 PlGF 서브유닛 또는 그의 단편을 포함한다.
본 발명은 동일한 VEGF 단백질의 두 가지 이상의 상이한 이소형 또는 그의 단편으로 이루어진 융합 단백질을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 VEGF121 서브유닛 또는 그의 단편, VEGF145 서브유닛 또는 그의 단편, VEGF148 서브유닛 또는 그의 단편 또는 서브유닛, VEGF165b 서브유닛 또는 그의 단편, VEGF153 서브유닛 또는 그의 단편, VEGF139 서브유닛 또는 그의 단편, 또는 VEGF206 서브유닛 또는 그의 단편에 융합된 VEGF165 서브유닛 또는 그의 단편으로 이루어진 융합 단백질을 포함한다. 본 발명은 또한 VEGF121 서브유닛 또는 그의 단편, VEGF145 서브유닛 또는 그의 단편, VEGF145 서브유닛 또는 그의 단편 또는 서브유닛, VEGF165 서브유닛 또는 그의 단편, VEGF153 서브유닛 또는 그의 단편, VEGF189 서브유닛 또는 그의 단편, 또는 VEGF206 서브유닛 또는 그의 단편에 융합된 VEGF165b 서브유닛 또는 그의 단편을 포함한다.
본 발명의 염기성 아미노산 치환은 단백질의 1개 이상의 서브유닛 중에 존재할 수 있다. 예를 들어, VEGF165 서브유닛 및 VEGF165b 서브유닛을 함유하는 융합 단백질은 오직 VEGF165 서브유닛 중에 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 본 발명은, I83K 아미노산 치환을 함유하는 VEGF165에 GS 링커를 통해 융합된 야생형 VEGF165 서브유닛을 포함한다. 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 1개의 돌연변이된 서브유닛을 함유하는 본 발명의 융합 단백질은 두 방향으로 생성될 수 있다 (즉, 돌연변이를 함유하는 서브유닛은 융합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 존재할 수 있음).
본 발명의 또다른 실시양태에서, VEGF 서브유닛 또는 그의 단편은 관련 단백질 서브유닛 또는 그의 단편에 융합된다. 예를 들어, VEGF 서브유닛 또는 그의 단편은 PDGF 서브유닛 또는 다른 당단백질 서브유닛 또는 그의 단편에 융합될 수 있다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 본원에 기재된 융합 단백질은 인간 또는 동물 VEGF 서열을 이용하여 구축할 수 있다. 또한, 융합 단백질은 동물 VEGF 서브유닛에 융합된 인간 VEGF 서브유닛을 이용하여 구축할 수 있다.
VEGF 융합 단백질은 VEGF 유사체인 것으로 이해되어야 한다. 본원에 개시된 모든 변형, 예를 들어 수용체 결합 친화성을 더 증가시키기 위한 변형, 반감기 및 안정성을 증가시키기 위한 변형, 프로테아제 절단을 감소시키거나 억제하기 위한 변형, 및 보조 수용체 (co-receptor) 결합 부위, 예를 들어 뉴로필린-1 결합 부위를 붕괴시키기 위한 변형은 VEGF 융합 단백질의 1개 이상의 서브유닛 중에 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질은 2개 이상의 VEGF 서브유닛 또는 VEGF-관련 단백질 서브유닛을 분리하는 링커를 함유할 수 있다. 상기 링커는 융합 단백질의 펩티드들 사이로 공유결합될 수 있다.
VEGF
및 독소 융합 단백질
본 발명은 독소, 및 본원에 기재된 염기성 아미노산 치환 중 하나 이상을 함유하는 1개 이상의 변형된 VEGF 서브유닛 (즉, 단량체)을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 예를 들어, VEGF-독소 융합 단백질의 VEGF 단량체 (즉, 서브유닛)는 44, 67, 72, 73, 83 및 87 (서열 4 또는 서열 13)로 구성된 군으로부터의 아미노산 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 염기성 아미노산을 함유할 수 있다. 본 발명의 VEGF 및 독소 융합 단백질은 독소 및 1개 이상의 VEGF 서브유닛을 분리하는 링커 서열을 임의로 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 "독소"란 용어는 생물학적 기원의 독성 물질을 의미한다. 본 발명의 독소는 당업계에 공지된 바와 같은 가용성 독소일 수 있다. 가용성 독소를 포함하는 융합 단백질은 종양을 표적으로 하도록 사용될 수 있다. 이러한 융합 단백질은 진단 목적으로도 사용될 수 있다.
독소의 예로는 슈도모나스 (Pseudomonas) 외독소 (PE), 디프테리아 (Diphtheria) 독소 (DT), 리신 독소, 아브린 독소, 탄저균 독소, 시가 독소, 보툴리누스 중독 독소, 파상풍 독소, 콜레라 독소, 마이토톡신, 팔리톡신, 시구아톡신, 텍스틸로톡신, 바트라코톡신, 알파 코노톡신, 타이폭신, 테트로도톡신, 알파 티티우스톡신, 삭시톡신, 아나톡신, 마이크로시스틴, 아코니틴, 엑스폴리아틴 독소 A 및 B, 장독소, 독성 쇼크 증후군 독소 (TSST-1), 예르시니아 페스티스 (Y. pestis) 독소 및 가스 괴저 독소 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 변형된 VEGF에 융합된 가용성 독소 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 혈관형성과 관련된 질환 또는 증상의 치료 또는 예방용 의약의 제조를 위한, 가용성 독소를 포함하는 변형된 VEGF 융합 단백질의 용도를 제공한다.
특정 이론에 속박되기를 원하는 것은 아니지만, 본 발명의 VEGF-독소 융합 단백질은 VEGF 수용체를 표적으로 하여 이를 붕괴하고 내피 세포 및 종양 세포를 포위함으로써 혈관형성, 종양의 성장 및/또는 암의 확산을 예방하거나 감소시키는 것으로 판단된다.
VEGF
수용체 길항제의 발현 및/또는 합성
본 발명은 본 발명의 변형된 VEGF 단백질을 코딩하는 핵산, 및 핵산을 발현하는 벡터 및 숙주 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"란 용어는, 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 의미한다. 본 발명은 본 발명의 변형된 VEGF 분자를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 변형된 VEGF165 분자를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 야생형 VEGF165를 코딩하는 서열 1의 핵산 분자는, 돌연변이된 VEGF165 핵산 분자가 변형 단백질을 코딩할 수 있도록 당업자에게 공지된 방법에 의해 돌연변이될 수 있다. 이와 유사하게, 야생형 VEGF165b를 코딩하는 서열 11의 핵산 분자는, 핵산 분자가 변형 단백질을 코딩할 수 있도록 당업자에게 공지된 방법에 의해 돌연변이될 수 있다.
관심있는 특정 변형된 VEGF를 코딩하는 핵산, 또는 염기성 아미노산 치환을 함유하는 단백질의 일부를 코딩하는 상기 핵산의 소정 영역이 구축되거나, 변형되거나 또는 단리되면, 상기 핵산은 적절한 벡터 내로 클로닝될 수 있으며, 이는 변형된 VEGF 단백질의 생체내 또는 시험관내 합성을 제어할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 VEGF 유사체를 코딩하는 핵산은 관심있는 발현 벡터 내에서 직접 변형되거나 클로닝될 수 있다. 벡터는 삽입된 유전자 또는 하이브리드 유전자의 전사를 제어 및 조절하는 필수적인 기능적 요소를 갖는 것으로 판단된다. 이러한 기능적 요소로는 프로모터, 이 프로모터의 상류 또는 하류 영역, 예를 들어 프로모터의 전사 활성을 조절할 수 있는 인핸서, 복제 개시점 (origin of replication), 프로모터에 인접한 삽입물의 클로닝을 용이하게 하는 적절한 제한 부위, 벡터 또는 삽입물-함유 벡터를 함유하는 세포에 대해 선택적으로 기능할 수 있는 항생제 내성 유전자 또는 다른 마커, RNA 스플라이스 접합, 전사 종결 영역, 또는 삽입된 유전자 또는 하이브리드 유전자의 발현을 용이하게 하는 기능을 할 수 있는 임의의 여타 영역이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다 (일반적으로, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989)] 참조). 각종 숙주 세포에서 핵산의 발현을 위한 적절한 프로모터는 당업계에 잘 알려져 있으며, 발현을 위해 이용되는 벡터-숙주 시스템에 따라 용이하게 상호 교환된다. 예시적인 벡터 및 숙주 세포는 US 6,361,992 (상기 전문이 본원에 포함됨)에 기재되어 있다.
핵산 삽입물의 발현에 유용한, 당업자에게 공지된 수많은 이. 콜라이 (에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli)) 발현 벡터가 있다. 사용하기 적합한 다른 벡터로는 바실리, 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 그 밖의 엔테로박테리아세아에, 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종으로부터의 발현 벡터가 있다. 이러한 발현 벡터는 통상적으로, 숙주 세포 (예를 들어, 복제 기점)와 상용할 수 있는 발현 조절 서열을 함유할 것이다. 또한, 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (Trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 람다 파지로부터의 프로모터 시스템과 같은 상당수의 익히 공지된 다양한 프로모터가 존재할 것이다. 프로모터는 통상적으로, 임의로는 작동 서열로 발현을 조절할 것이며, 예를 들어, 전사 및 번역의 개시 및 완료에 대한 리보솜 결합 부위 서열을 가질 것이다. 필요한 경우, 아미노 말단 메티오닌은 Met 코돈 5'의 삽입 및 하류 핵산 삽입물을 갖는 구조(in-frame)에 의해 제공될 수 있다. 또한, 핵산 삽입물의 카르복시-말단 연장은 표준 올리고뉴클레오티드 돌연변이유발 절차를 사용하여 제거될 수 있다.
추가로, 효모 발현 시스템이 사용될 수 있다. 효모 발현 시스템에 대한 다수의 이점이 있다. 첫째로, 효모 분비 시스템에서 생성되는 단백질은 올바른 디술파이드 쌍형성(pairing)을 나타낸다는 근거가 있다. 둘째, 번역후 글리코실화는 효모 분비 시스템에 의해 효율적으로 수행된다. 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 프리-프로(pre-pro)-알파-인자 선도 영역 (MF"-1 유전자에 의해 코딩됨)이 통상적으로 사용되어 효모로부터 단백질의 분비를 유도한다 (문헌 [Brake, et al., "varies-Factor-Directed Synthesis and Secretion of Mature Foreign Proteins in Saccharomyces cerevisiae." Proc. Nat. Acad. Sci., 81:4642-4646 (1984)] 참조). 프리-프로-알파-인자의 선도 영역은 KEX2 유전자에 의해 코딩되는 효모 프로테아제에 대한 인지 서열을 포함하는 신호 펩티드 및 전-절편을 함유한다. 상기 효소는 Lys-Arg 디펩티드 절단 신호 서열의 카르복실 측면 상의 전구체 단백질을 제거한다. VEGF 코딩 서열은 프리-프로-알파-인자 선도 영역에의 융합된 구조일 수 있다. 이어서, 이들 구조체는 강한 전사 프로모터, 예컨대 알코올 탈수소효소 I 프로모터 또는 당분해 프로모터의 제어 하에서 번역된다. 핵산 코딩 서열은 전사 종료 신호에 의해 수행되는 번역 종료 코돈에 의해 수행된다. 별법으로, 핵산 코딩 서열은 Sj26 또는 베타-갈락토시다제와 같은 제2 단백질 코딩 서열에 융합될 수 있으며, 이는 친화성 크로마토그래피에 의해 융합 단백질의 정제를 촉진시키는데 사용될 수 있다. 융합 단백질의 성분을 분리하기 위한 프로테아제 절단 부위의 삽입은 효모에서의 발현에 사용되는 구조체에 적절하다. 효과적인 번역후 글리코실화 및 재조합 단백질의 발현은 또한 배큘로바이러스(Baculovirus) 시스템에서 달성될 수 있다.
포유동물 세포는 중요한 번역후 변형, 예컨대 폴딩 및 시스테인 쌍형성, 복합 탄수화물 구조물의 부가 및 활성 단백질의 분비에 유리한 환경에서 단백질을 발현할 수 있게 한다. 포유동물 세포에서의 활성 단백질의 발현에 유용한 벡터는 강한 바이러스 또는 기타 프로모터와 폴리아데닐화 신호 사이에 단백질 코딩 서열의 삽입을 특징으로 한다. 상기 벡터는 하이그로마이신 내성, 젠타마이신 내성을 제공하는 유전자, 또는 선별가능한 마커로서 사용하기 적합한 다른 유전자 또는 표현형, 또는 유전자 증폭에 대한 메토트렉세이트 내성을 제공하는 유전자를 함유할 수 있다. 키메라 단백질 코딩 서열은 메토트렉세이트 내성-코딩 벡터를 사용하여 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주에 도입되거나, 또는 적합한 선별 마커를 사용하여 다른 세포주에 도입될 수 있다. 형질전환된 세포에서 벡터 DNA의 존재는 서던(Southern) 블롯 분석으로 확인될 수 있다. 삽입물 코딩 서열에 상응하는 RNA의 생성은 노던(Northern) 블롯 분석으로 확인될 수 있다. 완전한 인간 단백질을 분비할 수 있는 그 밖의 다수의 적합한 숙주 세포주가 당업계에서 개발되었으며, CHO 세포주, 헬라(HeLa) 세포, 골수종 세포주, 주르카트(Jurkat) 세포 등이 있다. 이들 세포들에 대한 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터, 인핸서 및 필수적인 정보 처리 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종료자 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 발현 조절 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소유두종 바이러스 등으로부터 유도된 프로모터이다. 세포 숙주의 유형에 따라 달라지는 관심 핵산 절편을 함유하는 벡터는 익히 공지된 방법에 의해 숙주 세포로 이동될 수 있다. 예를 들어, 염화칼슘 형질전환은 통상적으로 원핵 세포에 대해 이용되는 반면, 인산칼슘, DEAE 덱스트란 또는 리포펙틴 매개된 형질감염 또는 전기천공은 다른 세포 숙주에 사용될 수 있다.
유전자 또는 하이브리드 유전자의 발현은 생체내 또는 시험관내에서 일어날 수 있다. 생체내 합성은 벡터에 대한 숙주 세포로서 작용할 수 있는 원핵 또는 진핵 세포의 형질전환을 포함한다. 예를 들어, 진균을 형질전환시키는 기법은 문헌에 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, 베그스(Beggs) (상기문헌), 힌넨(Hinnen) 등 (문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933, 1978]), 옐톤(Yelton) 등 (문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1740-1747, 1984]) 및 러셀(Russell) (문헌 [Nature 301: 167-169, 1983])에 의해 기재되었다. 복제된 DNA 서열의 진균 세포로의 도입에 대해 다른 기법, 예컨대 전기천공 (문헌 [Becker and Guarente, Methods in Enzymol. 194: 182-187, 1991])이 사용될 수 있다. 숙주 세포의 유전형은 일반적으로, 발현 벡터 상에 제공된 선별가능한 마커에 의해 상보화되는 유전적 결함을 함유할 것이다. 특정 숙주 및 선별가능한 마커의 선택은 당업자의 수준 내에 있다.
본 발명의 변형된 VEGF 및 VEGF 융합 단백질을 포함하는 복제된 DNA 서열은 예를 들어, 인산칼슘-매개된 형질감염에 의해 배양된 포유동물 세포 안에 도입될 수 있다 (문헌 [Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52: 456, 1973]). 복제된 DNA 서열의 포유동물 세포로의 도입에 대해 다른 기법, 예컨대 전기천공 (문헌 [Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982]) 또는 리포펙션이 또한 사용될 수 있다. 복제된 DNA를 통합하는 세포를 확인하기 위해서, 선별가능한 마커가 일반적으로 관심 유전자 또는 cDNA와 함께 세포 안에 도입된다. 배양된 포유동물 세포에서 사용하기에 바람직한 선별가능한 마커로는 약물, 예컨대 네오마이신, 히그로마이신 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 제공하는 유전자가 있다. 선별가능한 마커는 증폭가능한 선별가능한 마커일 수 있다. 바람직한 증폭가능한 선별가능한 마커는 DHFR 유전자이다. 특히 바람직한 증폭가능한 마커는 DHFRr (미국 특허 제6,291,212호), cDNA (문헌 [Simonsen and Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2495-2499, 1983])이다. 선별가능한 마커는 틸리(Thilly)에 의해 검토되었고 (문헌 [Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass]), 선별가능한 마커의 선택은 당업자의 수준 내에 있다.
별법으로, 유전자의 발현은 시험관내 발현 시스템에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 대량의 mRNA를 합성하기 위해 일상적으로 사용되는 시험관내 전사 시스템이 시판된다. 이러한 시험관내 전사 시스템에서, 변형된 VEGF를 코딩하는 핵산이 전사 프로모터에 인접하는 발현 벡터 내로 클로닝될 것이다. 예를 들어, 블루스크립트 (Bluescript) II 클로닝 및 발현 벡터는 강한 원핵세포 전사 프로모터에 의해 플랭킹된 다중 클로닝 부위를 함유한다 (스트라테이진 클로닝 시스템즈 (Stratagene Cloning Systems; 캘리포니아주 라 호야 (La Jolla, Cailf.) 소재)). DNA 주형, 예컨대 블루스크립트 벡터로부터의 RNA의 시험관내 합성에 필요한 모든 시약을 함유하는 키트가 이용가능하다 (스트라테이진 클로닝 시스템즈, 캘리포니아주 라 호야 소재). 이후, 상기와 같은 시스템에 의해 시험관내 생성된 RNA를 시험관내 번역하여 목적 VEGF 유사체를 생성할 수 있다 (스트라테이진 클로닝 시스템즈, 캘리포니아주 라 호야 소재).
VEGF 수용체 길항제의 또 다른 제조 방법은 단백질 화학 기법에 의해 2개 펩티드 또는 폴리펩티드를 함께 연결시키는 것이다. 펩티드 또는 폴리펩티드는 Fmoc (9-플루오레닐메틸옥시카르보닐) 또는 Boc (tert-부틸옥시카르보닐) 화학 중 하나를 사용하는 현재 이용가능한 실험실 장치를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다 (어플라이드 바이오시스템즈, 인크. (Applied Biosystems, Inc.; 캘리포니아주 포스터 시티 (Foster City, Cailf.) 소재)). 하이브리드 VEGF 단백질에 상응하는 펩티드 또는 폴리펩티드가 표준 화학적 반응에 의해 합성될 수 있다는 것을 당업자들은 쉽게 알 수 있다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드는 합성되고, 그의 합성 수지로부터 분해되지 않을 수 있으나, 반면 하이브리드 펩티드의 다른 단편은 합성되고, 후속적으로 수지로부터 분해되며, 이에 의해 다른 단편에서 관능적으로 차단된 말단 기를 노출할 수 있다. 펩티드 축합 반응에 의해, 2개 단편은 그의 카르복실 및 아미노 잔기 각각에서의 펩티드 결합을 통해 공유 연결되어, 하이브리드 펩티드를 형성할 수 있다 (문헌 [Grant, G.A., "Synthetic Peptides: A User Guide," W.H. Freeman and Co., N.Y. (1992)] 및 [Bodansky, M and Trost, B., Ed., "Principles of Peptide Synthesis," Springer-Verlag Inc., N.Y. (1993)] 참조). 별법으로, 펩티드 또는 폴리펩티드는 상기 기재된 것과 같이 독립적으로 생체내 합성될 수 있다. 일단 단리되면, 이러한 독립적인 펩티드 또는 폴리펩티드는 연결되어 유사한 펩티드 축합 반응을 통해 VEGF를 형성할 수 있다. 예를 들어, 클로닝 또는 합성 펩티드 세그먼트 (segment)의 효소적 또는 화학적 라이게이션 (ligation)은 상대적으로 짧은 펩티드 단편을 연결하여 보다 거대한 펩티드 단편, 폴리펩티드 또는 전체 단백질 도메인을 생성하도록 할 수 있다 (문헌 [Abrahmsen, L., et al., Biochemistry, 30:4151 (1991)], [Dawson, et al., "Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation," Science, 266:776-779 (1994)] 참조).
또한, 본 발명은 길항제 활성을 갖는 변형된 VEGF의 단편을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드 단편은 펩티드를 제조할 수 있는 발현 시스템에서 펩티드를 코딩하는 핵산을 클로닝하여 얻어진 재조합 단백질일 수 있다. 예를 들어, 아미노 또는 카르복시-말단 아미노산은 천연 또는 VEGF 단백질 중 하나로부터 순서대로 제거될 수 있으며, 각각의 활성은 상기 기재된 여러 이용가능한 분석 중 하나로 시험된다. 또 다른 예에서, 본 발명의 변형된 단백질은 아미노 말단 또는 카르복시 말단 아미노 산 중 하나의 일부, 또는 심지어 폴리펩티드 단편 또는 기타 잔기, 예컨대 비오틴으로 대체된 단백질의 내부 영역을 가질 수 있으며, 이는 변형된 VEGF의 정제를 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 변형된 VEGF는 코딩 영역의 발현이 하이브리드 폴리펩티드를 유발하도록 2개의 폴리펩티드 단편을 발현 벡터로 코딩하는 각각의 핵산을 클로닝하는 펩티드 화학 중 하나를 통해 말토스 결합 단백질에 융합할 수 있다. 아밀로스 친화 컬럼을 통과시켜 하이브리드 폴리펩티드를 친화도 정제시킬 수 있으며, 이후 하이브리드 폴리펩티드를 특정 프로테아제 인자 Xa로 절단하여 변형된 VEGF를 말토스 결합 영역으로부터 분리시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [New England Biolabs Product Catalog, 1996, pg. 164] 참조).
본 발명의 VEGF 유사체는 이종이량체 또는 동종이량체일 수 있다. 한 실시양태에서, VEGF 유사체는 하나 이상의 VEGF 서브유닛을 함유하는 융합 단백질이다. 본 발명의 VEGF 융합 단백질은 링커 펩티드에 의해 분리된 2개 이상의 VEGF 서브유닛을 함유하는 단일쇄 단백질일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 VEGF 유사체는 독소에 융합된 하나 이상의 VEGF 서브유닛을 함유하는 융합 단백질이다. 본 발명의 VEGF 유사체 및 VEGF 유사체 융합 단백질은 당업계에 알려진 방법에 의해 단리 및 정제할 수 있다.
본 발명의 모든 VEGF 유사체는 1개 이상의 VEGF 서브유닛에서의 하나 이상의 염기성 아미노산 치환을 함유한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 VEGF 유사체는 1개 이상 또는 2개 이상의 VEGF 서브유닛에서의 2개 이상의 염기성 아미노산 치환, 3개 이상의 염기성 아미노산 치환, 4개 이상의 염기성 아미노산 치환, 또는 5개 이상의 염기성 아미노산 치환을 함유한다.
본 발명에는 VEGF 활성 단편, 즉 전장 단백질이 아닌 펩티드를 함유하는 VEGF 유사체가 포함된다. 또한, 본 발명의 변형된 VEGF의 활성 단편은 직접 합성되거나, 또는 거대 변형된 VEGF 단백질의 화학적 또는 기계적 붕괴에 의해 얻을 수 있다. 활성 단편은 천연 아미노산 서열로부터 유래된 약 5개 이상의 연속적인 아미노산, 10개 이상의 연속적인 아미노산, 20개 이상의 연속적인 아미노산, 30개 이상의 연속적인 아미노산, 40개 이상의 연속적인 아미노산, 50개 이상의 연속적인 아미노산, 60개 이상의 연속적인 아미노산, 70개 이상의 연속적인 아미노산, 80개 이상의 연속적인 아미노산, 90개 이상의 연속적인 아미노산, 100개 이상의 연속적인 아미노산, 110개 이상의 연속적인 아미노산, 120개 이상의 연속적인 아미노산, 130개 이상의 연속적인 아미노산, 140개 이상의 연속적인 아미노산, 150개 이상의 연속적인 아미노산, 또는 160개 이상의 연속적인 아미노산의 아미노산 서열로서 정의되며, 이는 관련된 활성, 예를 들어 결합 또는 조절 활성을 갖는다. 또한, 단편은 다른 서열에 부착되는 것에 관계없이 특정 영역 또는 특정 아미노산 잔기의 삽입, 삭제, 치환 또는 기타 선택된 변형을 포함할 수 있되, 단 펩티드의 활성은 변형된 VEGF에 비해 유의하게 변경되거나 또는 손상되지 않는다. 이러한 변형은 몇몇 추가 특성, 예컨대 디술파이드 결합 가능한 아미노산의 제거/첨가, 그의 생물 수명 (biolongevity) 및/또는 생활성 등의 증가를 제공할 수 있다. 임의의 경우에서, 펩티드는 생물활성 특성, 예컨대 결합 활성, 결합 도메인에서의 결합의 조절 등을 가져야 한다. VEGF의 기능적 또는 활성 영역은 호르몬의 특정 영역의 돌연변이 유발, 이어서 발현 및 발현된 폴리펩티드의 시험에 의해 확인될 수 있다. 이러한 방법은 당업계의 실무자들에게 용이하게 명백하며, 수용체를 코딩하는 핵산의 부위-특이적 돌연변이 유발을 포함할 수 있다 (문한 [Zoller, M.J. et al.] 참조).
사용 방법
본 발명은 세포 발현 키나제 도메인 수용체 (KDR)를 본원에 기재된 VEGF-A165 및 VEGF-A165b 유사체를 비롯한 VEGF 유사체와 접촉시켜 VEGF-매개 혈관형성을 감소시키는 것을 포함하는, VEGF-매개 혈관형성을 감소시키는 방법을 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 표적화되는 KDR-발현 세포는 원핵 및 진핵 세포 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 그러한 세포는 시험관내에서 유지되거나, 또는 생체내, 예를 들어 암 또는 기타 혈관형성-관련 질환으로 진단된 환자 또는 대상체 내에 존재할 수 있다.
본 발명은 치료 유효량의 본원에 기재된 임의의 VEGF 수용체 길항제의 유사체 또는 융합 단백질을 혈관형성-매개 질환 또는 상태로 진단된 환자에게 투여하여 상기 혈관형성-관련 질환 또는 상태를 감소시키거나 억제시키는 것을 포함하는, 상기 환자를 상기 길항제로 치료하는 방법을 포함한다. 혈관형성의 감소를 측정하기 위해, 환자의 결과를 위약 투여한 환자의 혈관형성과 비교할 수 있다. 예시적 혈관형성-관련 질환은 본원 전반에 기재되어 있으며, 여기에는 비제한적으로, 종양 및 신생물, 혈관종, 류마티스 관절염, 골관절염, 패혈성 관절염, 천식, 아테롬성동맥경화증, 특발성 폐 섬유증, 혈관 재협착, 동정맥 기형, 수막종, 신생혈관 녹내장, 건선, 카포시 증후군, 혈관섬유종, 혈우병성 관절, 비후성 반흔, 오슬러-웨버 증후군, 화농성 육아종, 후수정체 섬유증식증, 경피증, 트라코마, 폰 히펠-린다우 질환, 혈관 유착 병리상태, 윤활막염, 피부염, 자궁내막증, 익상편, 당뇨병성 망막증, 각막 손상 또는 이식편과 관련된 혈관신생, 상처, 앓이, 및 궤양 (피부 궤양, 위궤양 및 십이지장 궤양)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환이 포함된다.
혈관형성 증가, 혈관형성 감소, 또는 달리 조절 곤란한 혈관형성에 의해 야기되거나 악화되는 질환을 앓고 있는 환자는 VEGF 유사체 단독으로, 또는 공지된 VEGF 수용체 길항제, 항혈관형성 요법제, 항암 요법제, 또는 상기 질환 또는 상태를 치료하는 것으로 공지된 기타 요법제와 조합하여 처리될 수 있다. 본원에 사용된 "요법제"에는 비제한적으로, 공지된 약물이 포함된다. 공지된 VEGF 수용체 길항제 또는 항혈관형성 요법제에는 비제한적으로, VEGF/KDR 상호작용을 방해하고/하거나 KDR 신호 전달 경로를 차단하는 작용제, 예컨대 VEGF와 KDR의 결합을 차단하는 펩티드, VEGF에 대한 항체, KDR에 대한 항체, 가용성 수용체, 티로신 키나제 억제제, 항VEGF 항체독소, 리보자임, 안티센스 매개 VEGF 억제제, 및 저황산화 저분자량 글리콜-스플릿 헤파린이 포함된다.
본 발명의 VEGF 유사체가 기타 요법제와 조합하여 사용되는 경우, 요법제의 커플링은 상승 효과를 초래한다. 또한, 본 발명의 VEGF 유사체는 원하지 않은 부작용과 관련된 약물과 조합될 수 있다. VEGF 유사체와 그러한 약물의 커플링에 의해, 부작용이 있는 약물의 유효 투여량을, 부작용의 발생 확률을 감소시키기 위해 줄일 수 있다.
본 발명은 치료 유효량의 본원에 기재된 임의의 VEGF 수용체 길항제를 암으로 진단된 환자에게 투여하여 상기 암이 퍼지는 것을 감소시키거나 억제시키는 것, 즉, 전이를 감소시키거나 억제시키는 것을 포함하는, 상기 환자를 상기 길항제로 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명은 치료 유효량의 본원에 기재된 임의의 VEGF 수용체 길항제를 암으로 진단된 환자에게 투여하여 종양의 성장을 감소시키거나 억제하는 것을 포함하는, 상기 환자를 상기 길항제로 치료하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, VEGF 유사체는 VEGF-유도 혈관형성을 감소시키거나 방지함으로써 혈관형성을 억제함으로써 작용한다. 다른 실시양태에서, VEGF 유사체는 종양 세포, 혈관 세포, 예컨대 내피 세포 및/또는 VEGF 수용체를 표적화하거나 사멸시킴으로써 혈관형성을 방지하거나 감소시키는 VEGF-독소 융합 단백질이다.
본 발명의 방법에 의해 치료가능한 암에는 비제한적으로, 방광암, 유방암, 간암, 골암, 신장암, 결장암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 폐암, 뇌암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 비롯한 모든 고형 종양 및 전이성 암이 포함된다. 본 발명은 비제한적으로, 본 발명의 VEGF 유사체 단독으로, 당업계에 공지된 방법에 의해 화학요법과 조합하여, 또는 방사선요법과 조합하여 암을 치료하는 것을 포함한다 (미국 특허 제6,596,712호 참조). 예를 들어, VEGF 유사체는 세슘, 이리듐, 요오드, 또는 코발트 방사선과 함께 사용할 수 있다.
본 발명은 치료 유효량의 본원에 기재된 임의의 VEGF 수용체 길항제를 불임으로 진단된 환자에게 투여하여 당업자에 의해 불임이 치료된 것으로 판정되는 것을 포함하는, 상기 환자를 상기 길항제로 치료하는 방법을 포함한다. 불임은 당업계에 공지된 양적 및 질적 파라미터, 예컨대 난모세포의 양, 수정률, 배반포 형성률, 및 태아 형성률에 의해 측정될 수 있다. 그러한 불임 질환에는 비제한적으로, 원인불명 여성 불임증, 자궁내막증, 및 원인불명 남성 불임증을 비롯한 환자의 불임을 포함하는 VEGF의 발현과 관련된 임의의 질환이 포함된다. 본 발명은 비제한적으로, VEGF 유사체 단독으로, 또는 기타 항VEGF 치료제, 항혈관형성 치료제, 및/또는 불임 치료제와 조합하여 투여함으로써 불임을 치료하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 치료 유효량의 본원에 기재된 임의의 VEGF 수용체 길항제를 혈관형성-관련 안질환으로 진단된 환자에게 투여하여 상기 안질환을 감소시키거나 억제시키는 것을 포함하는, 상기 환자를 상기 길항제로 치료하는 방법을 포함한다. 그러한 안질환에는 비제한적으로, 미숙아 망막증, 당뇨병성 망막증, 망막 정맥 폐쇄, 및 황반 변성을 비롯한 안내 비정상 혈관신생과 관련된 임의의 안질환이 포함된다. 본 발명은 비제한적으로, VEGF 유사체 단독으로, 또는 기타 항VEGF 치료제, 항혈관형성 치료제, 및/또는 기타 안질환 치료제와 조합하여 투여함으로써 혈관형성-관련 안질환을 치료하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 VEGF 유사체는 환자에게 당뇨병성 황반 부종, 망막 정맥 폐쇄, 및 황반 변성의 치료를 위한, VEGF와 결합하여 VEGF의 활성을 억제함으로써 작용하는 페길화된 항VEGF 앱타머 (aptamer)인 파이자의 마쿠겐 (Pfizer's Macugen) (페갑타니브 (pegaptanib))과 함께 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 치료 유효량의 임의의 VEGF 수용체 길항제를 혈관형성-관련 염증성 증상 또는 자가면역 질환을 가진 것으로 진단된 환자에게 투여하여 상기 염증성 증상을 감소시키거나 억제하는 것을 포함하는, 상기 길항제를 이용하여 상기 환자를 치료하는 방법을 포함한다. 이러한 염증성 증상 또는 질환으로는 VEGF의 발현 및 VEGF에 의한 세포 활성화와 관련된 임의의 염증성 질환, 예컨대 모든 유형의 관절염 및 특정 류마티스성 관절염 및 골관절염, 천식, 폐 섬유증 및 피부염이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 VEGF 유사체의 단독 투여에 의해, 또는 다른 항-VEGF 치료, 항-혈관형성 치료, 염증 치료법 및/또는 자가면역 질환 치료법과의 병용에 의해 혈관형성-관련 염증성 증상 또는 자가면역 질환을 치료하는 것을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 변형된 VEGF 단백질은 진단제로서 사용된다. 본 발명의 VEGF 유사체 또는 VEGF 수용체는 합성 표면상에, 예컨대 단백질 또는 펩티드 어레이에 제시될 수 있다. 이러한 어레이는 당업계에 널리 공지되어 있고, KDR 및 혈관형성에 관여하는 것으로 공지된 다른 수용체에 결합하는 VEGF 유사체를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 VEGF 유사체는 KDR 및 혈관형성에 관여하는 것으로 공지된 다른 수용체에 결합하는 추정 VEGF 유사체의 능력을 평가하기 위해 양성 대조군으로서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 혈관형성에 관여할 수 있는 추정 VEGF 수용체를 스크리닝하기 위해 본 발명의 VEGF 유사체를 포함하는 어레이를 포함한다.
본원에 기재된 유사체의 특성 분석에 적합한 검정법은 PCT/US/99/05908에 기재되어 있고, 상기 문헌은 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 예를 들어, 다양한 면역검정법, 예컨대 비제한적인 예로서 방사선면역검정, ELISA, 샌드위치 면역검정, 면역방사계수 검정, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 검정, 동일계내 면역검정, 웨스턴 블롯, 침전 반응, 점착 검정, 보체 결합 검정, 면역형광 검정, 단백질 A 검정, 및 면역전기이동 검정과 같은 기술을 이용하는 경쟁 결합 검정 및 비-경쟁 검정 시스템이 이용될 수 있다.
제약 제제
본 발명은 유효량의 본 발명의 치료제를 대상체에게 투여하여 진단 및 치료하는 방법을 제공한다. 대상체는 동물, 예컨대 비제한적인 예로서 소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개 등일 수 있으며, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간이다. 특정 실시양태에서, 비-인간 포유동물이 대상체이다.
본 발명의 제약 조성물은 유효량의 1종 이상의 본 발명의 변형된 VEGF 단백질을 제약상 허용되는 담체와 함께 포함한다. 상기 조성물은 추가로 표적으로 하는 특정 질환의 치료에 적합한 다른 공지된 약물을 포함할 수 있다. 본 발명의 VEGF 수용체 길항제의 유효량은 상기 화합물의 부재시에 일어나는 것과 비교하여 내피 세포의 VEGF 자극을 차단, 억제 또는 감소시키는 양, 달리 말하면, 상기 화합물의 부재시에 일어나는 것과 비교하여 내피의 혈관형성 활성을 감소시키는 양이다. 유효량 (및 투여 방식)은 개개인의 기준에 따라 결정될 것이고, 사용되는 특정 치료적 VEGF 수용체 길항제 및 대상체의 고려사항 (크기, 연령, 전반적인 건강), 치료할 증상 (암, 관절염, 안질환 등), 치료할 증후의 중증도, 목적하는 결과, 사용되는 특정 담체 또는 제약 제제, 투여 경로, 및 당업자에게 명백한 다른 인자들을 기준으로 할 것이다. 본원에 기재된 화합물의 치료 유효량은 당업계에 공지된 시험관내 시험, 동물 모델 또는 다른 투여량-반응 연구를 이용하여 결정될 수 있다. 본 발명의 VEGF 단백질은 단독으로 사용되거나 다른 치료법과 병용될 수 있다. VEGF 유사체가 또다른 치료법과 병용되는 경우 치료 유효량은 감소될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 경피, 정맥내, 피하, 경구, 직장, 질, 비경구, 복강내, 국소, 폐, 비측, 협측, 안구, 수막강내, 경막외 또는 다른 투여 경로에 적합한 제제로서 제조되거나 포장되거나 판매될 수 있다. 화합물은 임의의 편리한 경로, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막 라이닝 (예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통합 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제약 조성물은 미세주입을 통해 종양으로 국소 투여될 수 있다. 또한, 단일 투여량 또는 일련의 투여량으로 투여될 수 있다.
제약학적 용도의 경우, 본 발명의 VEGF 유사체는 제약상 허용되는 담체와 함께 사용될 수 있고, 임의로 제약상 허용되는 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 VEGF 유사체는 다른 공지된 치료법, 예컨대 비제한적인 예로서 항-VEGF 치료법, 항-혈관형성 치료법, 항암 치료법, 불임 치료법, 자가면역 질환 치료법, 염증 치료법, 안구 질환 치료법, 및 피부 질환 치료법과 병용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 대상체에게 투여하기에 적합한 제약 조성물을 제공한다. 담체는 조성물의 비경구 투여에 적합하도록 액체일 수 있고, 고체, 즉 경구 투여를 위해 제형화된 정제 또는 환제일 수 있다. 또한, 담체는 조성물의 흡입에 적합하도록 분무가능한 액체 또는 고체 형태일 수 있다. 비경구로 투여되는 경우, 조성물은 발열원을 함유하지 않아야 하고, 비경구용으로 허용되는 담체중에 있어야 한다. 활성 화합물은 공지된 방법을 이용하여 달리 제형화되거나 리포좀 중에 캡슐화될 수 있다. 다른 가능한 제제로는 추진가능한 나노입자 및 면역학 기재의 제제가 있다.
리포좀은 포획된 수성 용적을 함유하는 완전히 밀폐된 지질 이중층 막이다. 리포좀은 단층 (단일 막) 또는 다층 (수성 층에 의해 각각 분리되어 있는 다중 막 이중층을 특징으로 하는 양파와 같은 구조)일 수 있는 소낭이다. 이중층은 소수성 "꼬리" 영역 및 친수성 "머리" 영역을 갖는 2개의 지질 단일층으로 이루어진다. 이중층 막에서, 지질 단일층의 소수성 (비극성) "꼬리"는 이중층의 중심을 향해 배향되는 반면, 친수성 (극성) "머리"는 수성 상을 향해 배향된다.
본 발명의 리포좀은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 형성할 수 있다. 여러 방법을 이용하여 본 발명의 리포좀을 형성할 수 있다. 예를 들어, 다층라멜라 소포체 (MLV), 안정한 다수라멜라(plurilamellar) 소포체 (SPLV), 소형 단일라멜라 (SUV) 또는 역상 증발 소포체 (REV)를 사용할 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 사용되는 여과기 크기에 따른 크기의 대형 단일라멜라 소포체 (LUV)를 형성하는 여과기를 통해 MLV를 압출한다. 일반적으로, 30, 50, 60, 100, 200 또는 800 nm 기공의 폴리카르보네이트 여과기를 사용할 수 있다. 관련 부분이 인용을 통해 본원에 포함된 쿨리스(Cullis) 등의 미국 특허 제5,008,050호에 개시된 상기 방법에서, 리포좀 현탁액을 압출 장치에 반복적으로 통과시켜 균일한 크기 분포의 리포좀 집단을 얻는다.
예를 들어, 여과는 직통(straight-through) 막 여과기 (뉴클레포어(Nuclepore) 폴리카르보네이트 여과기) 또는 굴곡형 통로 여과기 (예를 들어, 0.1 ㎛ 크기의 뉴클레오포어 멤브라필(Nuclepore Membrafil) 여과기 (셀룰로오스 에스테르와 혼합))를 통해서, 또는 균질화와 같은 또다른 크기 감소 기술에 의해 수행될 수 있다. 리포좀의 크기는 직경 약 0.03 내지 약 2 ㎛ 초과, 바람직하게는 약 0.05 내지 0.3 ㎛, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 약 0.2 ㎛로 다양할 수 있다. 크기 범위는 MLV, SPLV 또는 LUV인 리포좀을 포함한다.
본 발명의 리포좀 제제에 사용될 수 있는 지질로는 합성 또는 천연 인지질을 들 수 있고, 포스파티딜콜린 (PC), 포스파티딜에탄올아민 (PE), 포스파티딜세린 (PS), 포스파티딜글리세롤 (PG), 포스파티드산 (PA), 포스파티딜이노시톨 (PI), 스핀고미엘린 (SPM) 및 카르디올리핀을 특히 단독으로 또는 조합하여, 및 또한 콜레스테롤과 조합하여 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 인지질은 또한 디미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC) 및 디미리스토일포스파티딜글리세롤 (DMPG)을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC) 또는 수소화 소이 포스파티딜콜린 (HSPC)이 또한 사용될 수 있다. 디미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC) 및 디아라키도노일포스파티딜콜린 (DAPC)이 유사하게 사용될 수 있다.
리포좀의 제조 중에 또한 유기 용매를 사용하여 지질을 현탁할 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 유기 용매로는 지질을 가용화하는 다양한 극성 및 유전체 특성을 갖는 용매, 예를 들어 클로로포름, 메탄올, 에탄올, 디메틸술폭시드 (DMSO), 염화메틸렌, 및 특히 용매 혼합물, 예컨대 벤젠:메탄올 (70:30)을 들 수 있다. 그 결과, 지질을 함유하는 용액 (지질 및 기타 성분이 전반에 걸쳐 균일하게 분포된 혼합물)이 형성된다. 용매는 일반적으로 그의 생체친화성, 낮은 독성 및 가용화 능력에 기초하여 선택된다.
본 발명의 VEGF 수용체 길항제를 리포좀으로 캡슐화하기 위해서, 관련 부분이 인용을 통해 본원에 포함된 미국 특허 제5,380,531호에 기재된 방법이 본 발명의 유사체와 함께 이용될 수 있다.
본 발명의 VEGF 유사체 함유 리포좀은, 포유동물, 특히 인간에서 지속 방출 제제 뿐만 아니라 반복 투여가 필요한 다수의 질환 상태 또는 약리학적 상태의 치료에 치료상 사용될 수 있다. 본 발명의 작용제를 함유하는 리포좀의 투여 방식은 VEGF 유사체를 전달할 수 있는 유기체 내 부위 및 세포를 결정할 수 있다.
본 발명의 리포좀은 단독으로 투여될 수 있지만, 일반적으로 의도하는 투여 경로 및 표준 제약 방법을 고려하여 선택된 제약 담체와의 혼합물로 투여될 것이다. 제제는 비경구, 예를 들어 정맥내 주사될 수 있다. 비경구 투여를 위해, 이를, 예를 들어 등장성이 필요하거나 요구되는 경우, 다른 용질, 예컨대 등장성 용액을 형성하기에 충분한 염 또는 글루코오스를 함유할 수 있는 멸균 수용액의 형태로 사용할 수 있다. 본 발명의 리포좀을 또한 피하 또는 근육내 사용할 수 있다. 당업자는 특정한 제제 특성에 따른 기타 이용을 계획할 수 있다.
경구 투여 방식을 위해, 본 발명의 리포좀 제제를 정제, 캡슐, 로젠지, 트로키, 산제, 시럽, 엘릭시르, 수용액제 및 현탁액제 등의 형태로 이용할 수 있다. 정제의 경우, 사용될 수 있는 담체로는 락토오스, 시트르산나트륨, 및 인산염을 들 수 있다. 다양한 붕해제, 예컨대 전분, 윤활제 및 탈크가 일반적으로 정제에 사용된다. 캡슐형 경구 투여를 위해, 유용한 희석제는 락토오스 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜이다. 수현탁액이 경구 용도를 위해 필요한 경우, 활성 성분을 유화제 및 현탁제와 합한다. 필요한 경우, 특정 감미제 및/또는 향미제를 첨가할 수 있다.
국소 투여 방식을 위해, 본 발명의 제약 제제를 투여 형태, 예컨대 액제, 현탁액제, 겔, 오일, 연고 또는 고약 등에 혼입할 수 있다. 이러한 국소 제제의 제조는, 예를 들어 문헌 [Gennaro et al. (1995) Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing]과 같은 제약 제제 기술에 기재되어 있다. 국소 도포를 위해, 조성물은 또한 산제 또는 스프레이, 특히 에어로졸 형태로 투여될 수 있다. 질환 상태 또는 약리학적 상태의 치료에서 인간에게 투여하기 위해, 처방 의사는 주어진 인간 대상체에 적합한 작용제 투여량을 최종 결정할 것이며, 이는 개개인의 연령, 체중 및 반응 뿐만 아니라 사용된 작용제의 약동학에 따라 달라질 것으로 예상될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 생체 고분자 데포 제제, 예컨대 생분해성 미소구를 포함한다. 생분해성 미소구를 사용하여 약물 방출 속도를 제어하고 체내 특정 부위에 약물을 표적화함으로써, 그의 치료 반응을 최적화하고, 독성 부작용을 감소시키며, 반복 주사의 불편함을 없앨 수 있다. 생분해성 미소구는 이식 및 제거를 위해 외과적 처치가 필요하지 않다는 점에서 대형 고분자 이식물에 비해 이점이 있다.
본 발명에 사용되는 생분해성 미소구는 단백질의 방출을 지연시키고 작용 부위에서 연장된 기간 동안 치료 유효 농도를 유지하는 중합체로 형성된다. 상기 중합체는 에틸셀룰로스, 폴리스티렌, 폴리(ε-카프롤락톤), 폴리(락트산) 및 폴리(락트산-co-글리콜산) (PLGA)으로부터 선택될 수 있다. PLGA 공중합체는 재생가능한 서방형 특징을 갖는 합성 생분해성 및 생체적합성 중합체의 일종이다. PLGA 공중합체의 이점은, 이들의 분해 속도가 수개월 내지 수년의 범위이고 이것이 중합체 분자량 및 폴리락트산:폴리글리콜산 잔기의 비율의 함수라는 점이다. 미국의 루프론 데팟(Lupron Depot) 및 졸라덱스(Zoladex) 및 유럽의 에난톤 데팟(Enantone Depot), 데카페프틸(Decapeptil) 및 파리오델 엘에이(Pariodel LA)를 비롯하여 PLGA를 사용한 여러가지 비경구용 생성물이 현재 판매되고 있다 (검토하기 위해서는 문헌 [Yonsei, Med J. 2000 Dec;41(6):720-34] 참조).
추가로, 본 발명의 제약 조성물은 비측 상피의 융합막(tight junction)을 통한 투과성 증가가 입증된 바 있기 때문에 [Pietro and Woolley, The Science behind Nastech's intranasal drug delivery technology. Manufacturing Chemist, August, 2003]), 비측 투여에 적합한 제제로 제조되거나 포장되거나 또는 판매될 수 있다. 이러한 제제는 활성 성분을 포함하고 약 0.5 내지 약 7 나노미터, 바람직하게는 약 1 내지 약 6 나노미터 범위의 직경을 갖는 건조 입자를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 편리하게는 추진제 기류가 산제를 분산시킬 수 있는 건조 산제 저장고를 포함하는 장치를 사용하거나, 또는 자가 추진 용매/산제-분산 용기, 예를 들어 밀폐 용기에서 저비점 추진제 중에 용해되거나 현탁된 활성 성분을 포함하는 장치를 사용하여 투여하기 위한 건조 산제의 형태이다. 바람직하게는, 이러한 산제는 98 중량% 이상의 입자가 직경이 0.5 나노미터 초과이고, 95 수% 이상의 입자가 직경이 7 나노미터 미만인 입자를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 95 중량% 이상의 입자가 직경이 1 나노미터 초과이고, 90 수% 이상의 입자가 직경이 6 나노미터 미만이다. 건조 산제 조성물은 바람직하게는 당과 같은 고체 미분 희석제를 포함하고, 편리하게는 단위 투여량 형태로 제공된다.
비측 전달용으로 제형화된 본 발명의 제약 조성물은 또한 활성 성분을 용액 또는 현탁액의 액적 형태로 제공할 수도 있다. 이러한 제제는 활성 성분을 포함하고 임의로는 멸균된 수성 또는 묽은 알콜계 용액제 또는 현탁액제로 제조되거나 포장되거나 또는 판매될 수 있으며, 편리하게는 임의의 연무화 또는 미립화 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 이러한 제제는 향미제, 예컨대 사카린 나트륨, 휘발성 오일, 완충제, 표면 활성제, 또는 보존제, 예컨대 메틸히드록시벤조에이트 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 1종 이상의 추가의 성분을 포함할 수도 있다. 이러한 투여 경로로 제공되는 액적은 바람직하게는 평균 직경이 약 0.1 내지 약 200 나노미터의 범위이다.
비내 투여에 적합한 또다른 제제는 활성 성분을 포함하고 평균 입자가 약 0.2 내지 500 마이크로미터인 조립 산제이다. 이러한 제제는 코 가까이 가져간 산제 용기로부터 코로 들이키는 방식, 즉 비측 통로에 의한 신속한 흡입에 의해 투여된다.
비측 투여에 적합한 제제는 예를 들어 활성 성분을 겨우 약 0.1% (w/w) 및 무려 100% (w/w)로 포함할 수 있고, 본원에 기재한 1종 이상의 추가의 성분을 포함할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 흡입으로 투여될 수 있다. 흡입 ㅊ요법의 경우, 활성 성분은 계량식 흡입기에 의한 투여에 유용한 용액일 수도 있고 건조 산제 흡입기에 적합한 형태일 수도 있다. 또다른 실시양태에서, 상기 조성물은 기관지 세정에 의한 투여에 적합하다.
경구 투여에 적합한 제제는 경질 또는 연질의 젤라틴 캡슐제, 환제, 정제, 예를 들어 코팅 정제, 엘릭시르제, 현탁액제, 시럽제 또는 흡입제 및 이들의 제어 방출 형태를 포함한다.
본 발명의 VEGF 수용체 길항제는 달리 발생하게 될 증상의 진행을 감소시키거나 완화시키기 위해서 급성 투여 (즉, 염증을 야기하는 사건의 발병 동안 투여하거나 상기 사건 이후 바로 투여)될 수도 있고, 또는 퇴행성 질환의 진행 동안에 투여될 수도 있다. 투여 시점 및 간격은 대상체의 증상에 따라 달라지고, 당업자에 의해 결정되는 바와 같이 시간, 일, 주 또는 그 이상의 시간 경과에 걸쳐서 수시간 내지 수일의 간격으로 투여될 수 있다. 전형적인 1일 투약법은 체중 1 kg 당 1일 약 0.01 ㎍, 체중 1 kg 당 1일 약 1 mg, 체중 1 kg 당 1일 약 10 mg, 체중 1 kg 당 1일 약 100 mg, 및 체중 1 kg 당 1일 약 1 g일 수 있다.
본 발명의 VEGF 수용체 길항제는 정맥내, 경구, 비내, 안내, 근육내 또는 경막내로 투여될 수도 있고, 또는 VEGF 단백질, 단백질 제제 및 치료될 질환에 적합한 임의의 경로로 투여될 수도 있다. 염증성 관절염 치료용의 변형된 VEGF는 활액에 직접 주사될 수 있다. 고형 종양 치료용의 변형된 VEGF는 종양에 직접 직접 주사될 수 있다. 피부 질환 치료용의 변형된 VEGF는 예를 들어 로션제 또는 분무제의 형태로 국소 적용될 수 있다. 경막내 투여, 즉 뇌종양 치료를 위한 경막내 투여는 뇌에 직접 주사하는 것을 포함할 수 있다. 별법으로, 변형된 VEGF는 혈액-뇌 장벽을 침투하고 활성 성분을 혈액-뇌 장벽을 지나 수송하는 능력에 대하여 선택된 펩티드 또는 비-단백질성 부분인 제2 분자 ("담체")와 커플링되거나 접합될 수 있다. 적합한 담체의 예는 미국 특허 제4,902,505호, 동 제5,604,198호 및 동 제5,017,566호에 개시되어 있고, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 VEGF 수용체 길항제를 투여하는 별법의 방법은 대상체에게 변형된 VEGF 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 운반하고 상기 단백질의 발현 및 분비를 지시할 수 있는 벡터를 투여하여 수행된다. 전형적으로, 적합한 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 DNA 바이러스, RNA 바이러스, 및 레트로바이러스이다. 벡터 전달 시스템을 사용하고 유전자 요법을 수행하는 기술은 당업계에 공지되어 있다 (검토하기 위해서는 문헌 [Lundstrom, 2003, Trends Biotechnol. 21(3):117-22] 참조).
트랜스제닉
동물
증가된 수용체 결합 친화성 및 임의로는 길항성을 갖는 변형된 VEGF 구축물을 함유하는 트랜스제닉 비-인간 동물의 생산이 본 발명의 한 실시양태에서 고려된다.
트랜스제닉 비-인간 동물의 성공적인 생산은 수많은 특허 및 간행물, 예를 들면 그 내용 전문이 본원에 참고로 포함되는, 미국 특허 제6,291,740호 (2001년 9월 18일자로 허여됨); 미국 특허 제6,281,408호 (2001년 8월 28일자로 허여됨); 및 미국 특허 제6,271,436호 (2001년 8월 7일자로 허여됨)에 개시되어 있다.
암소, 돼지, 염소, 말, 소 및 양을 비롯한 가축화된 포유동물과 같은 동물의 유전적 구성을 변경시키는 능력은 수많은 상업적 적용을 가능하게 한다. 이러한 적용은 용이하게 수집되는 형태로 다량의 외인성 단백질을 발현 (예를 들면, 우유 또는 혈액으로의 발현)하는 동물의 생산, 체중 증가분, 사료 효율, 도체 구성(carcass composition), 우유 생산 또는 생산량, 내병성 및 특정한 미생물에 의한 감염에 대한 저항성이 증가한 동물의 생산, 및 향상된 성장률 또는 생식능을 갖는 동물의 생산을 포함한다. 그의 게놈에 외인성 DNA 서열을 함유하는 동물을 트랜스제닉 동물이라 한다.
트랜스제닉 동물 생산에 가장 널리 사용되는 방법은 수정된 배(embryo)의 전핵으로의 DNA의 미량주사법이다 (문헌 [Wall et al., J. Cell. Biochem. 49:113 [1992]]). 트랜스제닉 동물의 생산을 위한 다른 방법은 배를 레트로바이러스로 또는 레트로바이러스 벡터로 감염시키는 것을 포함한다. 착상-전 및 착상-후 마우스 배를 야생형 또는 재조합 레트로바이러스로 감염시키는 것이 보고되었다 (문헌 [Janenich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:1260 [1976]]; 문헌 [Janenich et al., Cell 24:519 [1981]]; 문헌 [Stuhlmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7151 [1984]]; 문헌 [Jahner et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:6927 [1985]]; 문헌 [Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:6148-6152 [1985]]; 문헌 [Stewart et al., EMBO J. 6:383-388 [1987]]).
배를 레트로바이러스로 감염시키는 별법의 수단은 바이러스 또는 바이러스-생산 세포를 마우스 배의 포배강으로 주입하는 것이다 (문헌 [Jahner, D. et al., Nature 298:623 [1982]]). 임신 중기 마우스 배의 자궁내 레트로바이러스 감염을 사용하여 마우스의 생식세포로 트랜스진을 도입하는 것이 보고되었다 (자네르(Jahner) 등의 상기 문헌 [1982]). 소 및 양 배를 레트로바이러스 또는 레트로바이러스 벡터로 감염시켜 트랜스제닉 동물을 생산하는 것이 보고되었다. 이들 프로토콜은 레트로바이러스 입자 또는 레트로바이러스 입자를 탈락시키는 증식이 중지된 (즉, 미토마이신 C-처리된) 세포를 수정란 또는 초기 배의 난황 주위공간에 미량주입하는 것을 포함한다 (PCT 국제 출원 WO 90/08832 [1990]; 및 문헌 [Haskell and Bowen, Mol. Reprod. Dev., 40:386 [1995]]). PCT 국제 출원 WO 90/08832에 야생형 고양이 백혈병 바이러스 B를 2 내지 8 세포기에서 양 배의 난황 주위공간에 주입하는 것이 개시되어 있다. 주입된 배로부터 유래된 태아는 복수의 통합 부위를 함유하는 것으로 나타났다.
미국 특허 제6,291,740호 (2001년 9월 18일자로 허여됨)에 분열 세포를 도입한 레트로바이러스 벡터 (예를 들면, 뮤린 백혈병 바이러스 [MLV]로부터 유래된 벡터)를 사용하여 외인성 DNA를 성숙-전 난모세포 및 성숙한 수정되지 않은 난모세포 (즉, 수정-전 난모세포)에 도입함으로써 트랜스제닉 동물을 생산하는 것이 개시되어 있다. 상기 특허에는 또한 다양한 재조합 단백질의 마우스 유방 종양 및 사이토메갈로바이러스 프로모터-유도된 LTR 발현을 위한 조성물 및 그러한 방법이 개시되어 있다.
미국 특허 제6,281,408호 (2001년 8월 28일자로 허여됨)에 배아줄기세포를 사용하는 트랜스제닉 동물의 생산 방법이 개시되어 있다. 간략하게 말하면, 배아줄기세포를 상실배를 함유하는 혼합된 세포 공-배양액에 사용하여 트랜스제닉 동물을 생산한다. 공-배양 전에, 예를 들어 전기천공법, 미량주사법 또는 레트로바이러스 전달에 의해 외래 유전 물질을 배아줄기세포에 도입한다. 이러한 방식으로 형질감염된 ES 세포를 유전자 통합을 위해 네오마이신과 같은 선별 마커를 통해 선별한다.
미국 특허 제6,271,436호 (2001년 8월 7일자로 허여됨)에 원시 생식 세포의 단리, 이들 세포를 배양함으로써 원시 생식 세포-유래된 세포주의 생산, 원시 생식 세포 및 배양된 세포주의 형질전환, 및 이들 형질전환된 세포 및 세포주를 사용하는 트랜스제닉 동물의 생산을 포함하는 방법을 사용하여 트랜스제닉 동물을 생산하는 것이 개시되어 있다. 트랜스제닉 동물이 생산되는 효율이 현저히 증가하여, 트랜스제닉 비-설치류 동물 종의 생산에 상동성 재조합의 사용을 가능하게 한다.
변형된
VEGF
단백질을 함유하는
키트
추가의 실시양태에서, 본 발명은 예를 들면 치료학적 또는 비-치료학적 적용에 사용가능한, VEGF 유사체 및/또는 VEGF 유사체 융합 단백질을 함유하는 키트를 제공한다. 키트는 표지가 있는 용기를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면, 보틀, 바이알 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 상기 기재한 바와 같이, 치료학적 또는 비-치료학적 적용에 있어서 효과적인 VEGF 유사체 또는 VEGF 융합 단백질을 포함하는 조성물을 보유한다. 용기 상의 표지는 조성물이 특정한 치료법에 또는 비-치료학적 적용에 사용됨을 표시하며, 또한 상기 기재한 것들과 같이, 생체내 또는 시험관내 사용에 대한 지시사항을 표시하기도 한다.
본 발명의 키트는 전형적으로 상기 기재한 용기, 및 상업적으로, 또한 사용자의 관점에서 바람직한 물질 (예를 들면, 완충제, 희석제, 충전제, 니들, 시린지 및 사용 지침서와 함께 팩키지 삽입물)을 포함하는 하나 이상의 기타 용기를 포함할 것이다. 본 발명의 키트는 또한 야생형 VEGF, 예컨대 야생형 VEGF165 또는 VEGF165b로 이루어진 대조군을 포함할 수 있다.
본 발명을 설명하고 예시하기 위해 하기 실시예가 제공된다. 따라서, 이들은 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 당업자라면 수많은 다른 실시양태 또한, 본원에서 상기 및 청구범위에서 기재된 본 발명의 범주 내에 포함됨을 알 것이다.
실시예
1:
VEGF
수용체 길항제의 디자인
본 발명의 VEGF-A 길항제는 야생형 VEGF-A에 비해 수용체 결합 친화성이 증가하고 생체활성이 감소하도록 디자인하였다. 이를 수행하는 하나의 방법은 VEGF-A의 루프에 양성 전하를 추가하는 것이다. 수퍼-길항제를 디자인하는 이러한 접근법은 상동성 모델링, 서열 비교, 전하 스캐닝 돌연변이유발, 및 단량체 연결 및 연결된 단량체로의 돌연변이의 도입 등을 비롯한 당업계에 공지된 여러 방법을 조합하는 것을 포함한다.
밤민(vammin), 또는 뱀독 VEGF는 높은 친화성으로 KDR-IgG에 결합하여 시험관내에서 혈관 내피 세포의 증식을 강하게 자극하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Yamazaki et al., 2003, J. Biol. Chem. 278, 51985-51988] 참조, 그 전문이 본원에 참고로 포함됨). VEGF-A 수용체 길항제는 밤민에 대한 VEGF165 상동성에 기초하여 디자인하였다. VEGF165는 72 및 73 위치에 글루타메이트 잔기를 갖는 반면, 밤민은 이들 위치에 각각 글리신 및 리신 잔기를 함유한다. VEGF-A가 72 및 73 위치에서 2개의 염기성 아미노산 잔기를 함유하도록 변형시킴으로써, 변형된 VEGF-A가 야생형 VEGF-A에 비해 수용체 결합 친화성을 상당히 증가시킴을 입증하였다 (도 3A).
실시예
2:
VEGF
수용체 길항제의 특성화
VEGF 유사체인 I83K, E44R, E72RE73R, E67K 및 Q87K를 생성시켜 이들이 KDR에 결합하는 능력 및 야생형 VEGF에 비해 세포 증식을 감소시키는 능력을 분석하였다.
방법
효모 세포에 의해 발현된 VEGF 유사체를 고정된 KDR-Fc와 인큐베이션하고, 상기 유사체가 KDR-Fc에 결합하는 능력을 분석하였다. 결합 분석은 다음과 같이 수행하였다:
1. 넌크 맥시소프(Nunc MaxiSorp; 상표명) 96 마이크로웰 플레이트를 150 ng/웰 KDR-Fc (알 앤드 디 시스템, 인크.; R & D System, Inc.) 및 pH 9.6의 50 mM 중탄산나트륨 완충액 (15 mM Na2CO3 + 35 mM NaHCO3) 100 ㎕로 코팅하였다. 시험되는 VEGF 유사체 및 야생형 VEGF 각각에 대해 별도의 플레이트를 사용하였다.
2. 플레이트를 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
3. 다음날, 웰을 세척 완충액 (PBS 중 0.05% tween)으로 3회 세척하였다.
4. 웰을 PBS (3% BSA, 0.03% tween 포함)로 실온에서 1 시간 동안 차단시켰다.
5. 차단시킨 후에, 웰을 세척 완충액 (PBS 중 0.05% tween)으로 3회 세척하였다.
6. VEGF-A (야생형 또는 돌연변이)를 결합 완충액 (PBS 중 1% BSA 및 0.03% tween) 50 ㎕가 포함된 웰에 상이한 농도로 첨가하였다.
7. 125I-표지된 VEGF-A (야생형 또는 돌연변이)를 결합 완충액 (PBS 중 1% BSA 및 0.03% tween) 50 ㎕가 포함된 각각의 웰에 70,000 cpm/웰 (퍼킨엘머; PerkinElmer)로 첨가하였다.
8. 웰의 내용물을 혼합하고, 서서히 진탕시키면서 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다.
9. 웰을 세척 완충액 (PBS 중 0.05% tween)으로 3회 세척하였다.
10. 각각의 웰에, 용해 완충액 (0.2M NaOH + 0.5% SDS) 120 ㎕를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 20 분 동안 격렬하게 진탕시켰다.
11. 용해 완충액을 각각의 웰로부터 개별 튜브로 옮겼다. 웰을 용해 완충액으로 2회 더 세척하고, 상응하는 튜브에서 용해 용액 완충액과 합하였다.
12. 야생형 VEGF-A 및 다양한 VEGF-A 돌연변이에 대한 결합의 척도는 감마 계수기를 이용하여 계수함으로써 결정하였다.
HUVEC 내피 세포가 VEGF 유사체의 존재하에 증식하는 능력은 다음과 같이 분석하였다:
1. HUVEC 내피 세포 (6세대)를 메디아(Media)-200을 사용하여 성장 인자와 함께 96 웰 플레이트에 3,000개 세포/웰로 시딩하고, 밤새 인큐베이션하였다.
2. 밤새 인큐베이션한 후에, 배지를 제거하고, 메디아 199 (인비트로젠; Invitrogen)를 2% 투석 FBS (인비트로젠)와 함께 첨가하였다.
3. 세포를 20 시간 동안 인큐베이션하였다.
4. 야생형 VEGF-A 및 VEGF-A 유사체를 96-웰 플레이트에서 200 ng/웰로 출발하여 메디아 199 (2% 투석 FBS 포함)로 연속 희석하였다.
5. 각각의 웰로부터 배지를 제거하고, 200 ㎕/웰 희석된 VEGF 배지로 대체하였다.
6. 세포를 37 ℃에서 72 시간 동안 인큐베이션하였다.
7. 세포 증식을 프로메가(Promega)의 셀타이터-글로(CellTiter-Glo; 등록상표) 발광 세포 생존성 분석을 이용하여 분석하였다. 요컨대, 셀타이터 완충액을 녹이고, 셀타이터-글로 기질로 옮기고, 잘 혼합하여 기질 혼합물을 만들었다. 각각의 웰로부터 성장 배지 100 ㎕를 새로운 96 웰 플레이트에 분리시키고, 기질 혼합물 100 ㎕와 잘 혼합하였다. 플레이트를 2 분 동안 진탕시키고, 실온에서 10 분 더 인큐베이션하였다.
8. 플레이트를 25O mS로 설정된 통합 시간을 갖는 플레이트 판독기 (테칸; Tecan)를 사용하여 발광 신호에 대해 판독하였다.
분석
KDR-Fc에 대한 I83K 유사체의 수용체 결합 친화성은 야생형 VEGF-A보다 약간 낮았다 (도 1A). 그러나, I83K 유사체는 야생형 VEGF-A에 비해 내피 세포 증식이 상당히 감소하는 것으로 입증되었다 (도 1B). VEGF-A 유사체인 E44R, EE72/73RR, E67K 및 Q87K는 모두 야생형 VEGF-A에 비해 수용체 세포 결합 친화성이 증가하는 것으로 입증되었다 (도 2A, 3A, 4, 5 및 6). 그러나, 유사체 E44R 및 EE72/73RR은 내피 세포 증식에 거의 변화가 없는 것으로 입증되었다 (도 2B 및 3B). 이러한 결과는 I83K를 포함하는 VEGF165 유사체가 VEGF-A 수용체 길항제로서 효과적으로 기능할 수 있음을 보여준다. 또한, VEGF-A 유사체인 E44R 및 EE72/73RR은 단독으로 내피 세포 증식을 감소시킬 수 없었으나, I83K에 첨가한 경우, 이러한 변형은 수용체 결합 친화성을 추가로 증가시킬 수 있는 가능성을 나타내었다.
본 출원에 논의된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본원에 참고로 포함된다. 상기 명세서에서 본 발명은 이들의 특정 바람직한 실시양태와 관련하여 기재되었고, 설명 목적을 위해 상세하게 열거될 수 있었으나, 당업자에게는 본 발명이 추가의 실시양태를 가질 수 있으며, 본원에 기재된 상세한 내용 중 일부는 본 발명의 기본 원리로부터 벗어나지 않고 상당히 변화될 수 있음이 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Trophogen, Inc.
<120> VEGF Analogs and Methods of Use
<130> TROP-005/01WO
<150> US 60/808,106
<151> 2006-05-25
<150> US 60/723,917
<151> 2005-10-06
<160> 73
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 576
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 60
gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 120
gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180
atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240
atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300
aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360
agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420
aatccctgtg ggccttgctc agagcggaga aagcatttgt ttgtacaaga tccgcagacg 480
tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct tgagttaaac 540
gaacgtactt gcagatgtga caagccgagg cggtga 576
<210> 2
<211> 191
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
100 105 110
Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly
130 135 140
Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr
145 150 155 160
Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln
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<210> 3
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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20 25
<210> 4
<211> 165
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys
1 5 10 15
Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu
20 25 30
Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys
35 40 45
Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu
50 55 60
Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile
65 70 75 80
Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe
85 90 95
Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg
100 105 110
Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe
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Asp Lys Pro Arg Arg
165
<210> 5
<211> 147
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
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<213> Homo sapiens
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65 70 75 80
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85 90 95
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<213> Homo sapiens
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<210> 11
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<213> Homo sapiens
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gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 120
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atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300
aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360
agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420
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85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
100 105 110
Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly
130 135 140
Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr
145 150 155 160
Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln
165 170 175
Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Ser Leu Thr Arg Lys Asp
180 185 190
<210> 13
<211> 165
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys
1 5 10 15
Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu
20 25 30
Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys
35 40 45
Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu
50 55 60
Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile
65 70 75 80
Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe
85 90 95
Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg
100 105 110
Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe
115 120 125
Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser
130 135 140
Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Ser
145 150 155 160
Leu Thr Arg Lys Asp
165
<210> 14
<211> 209
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
100 105 110
Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val
130 135 140
Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Pro
145 150 155 160
Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro
165 170 175
Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala
180 185 190
Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg
195 200 205
Arg
<210> 15
<211> 183
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys
1 5 10 15
Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu
20 25 30
Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys
35 40 45
Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu
50 55 60
Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile
65 70 75 80
Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe
85 90 95
Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg
100 105 110
Gln Glu Lys Lys Ser Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys
115 120 125
Arg Lys Lys Ser Arg Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
180
<210> 16
<211> 215
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35 40 45
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50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
100 105 110
Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val
130 135 140
Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His
165 170 175
Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr
180 185 190
Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys
195 200 205
Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
210 215
<210> 17
<211> 189
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys
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50 55 60
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Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe
85 90 95
Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg
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Gln Glu Lys Lys Ser Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys
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Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
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<210> 18
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
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Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
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Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
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195 200 205
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225 230
<210> 19
<211> 206
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys
1 5 10 15
Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu
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Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys
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195 200 205
<210> 20
<211> 576
<212> DNA
<213> Macaca fascicularis
<400> 20
atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctgta cctccaccat 60
gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 120
gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180
atcttccagg agtaccctga tgagattgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240
atgcgatgtg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300
aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360
agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420
aatccctgtg ggccttgctc agagcggaga aagcatttgt ttgtacaaga tccgcagacg 480
tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct tgagttaaac 540
gaacgtactt gcagatgtga caagccgagg cggtga 576
<210> 21
<211> 191
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 21
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
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65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
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130 135 140
Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr
145 150 155 160
Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln
165 170 175
Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
180 185 190
<210> 22
<211> 165
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 22
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys
1 5 10 15
Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu
20 25 30
Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys
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50 55 60
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65 70 75 80
Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe
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130 135 140
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Asp Lys Pro Arg Arg
165
<210> 23
<211> 573
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 23
atgaactttc tgctctcttg ggtacattgg agccttgcct tgctgctcta ccttcaccat 60
gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggagggc agaaacccca cgaagtggtg 120
aagttcatgg atgtctacca gcgcagcttc tgccgtccca tcgagaccct ggtggacatc 180
ttccaggagt acccagatga gattgagttc attttcaagc cgtcctgtgt gcccctgatg 240
cggtgcgggg gctgctgtaa tgacgaaagt ctggagtgtg tgcccactga ggagttcaac 300
atcaccatgc agattatgcg gatcaaacct caccaaagcc agcacatagg agagatgagc 360
ttcctacagc ataacaaatg tgaatgcaga ccaaagaaag ataaagcaag gcaagaaaat 420
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aaatgttcct gcaaaaacac agactcgcgt tgcaaggcga ggcagcttga gttaaacgaa 540
cgtacttgca gatgtgacaa gccgaggcgg tga 573
<210> 24
<211> 190
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 24
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gln Lys Pro His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg
35 40 45
Ser Phe Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr
50 55 60
Pro Asp Glu Ile Glu Phe Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met
65 70 75 80
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85 90 95
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115 120 125
Cys Arg Pro Lys Lys Asp Lys Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro
130 135 140
Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys
145 150 155 160
Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu
165 170 175
Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
180 185 190
<210> 25
<211> 164
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 25
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gln Lys Pro His Glu Val Val Lys Phe
1 5 10 15
Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Phe Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val
20 25 30
Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Phe Ile Phe Lys Pro
35 40 45
Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp
145 150 155 160
Lys Pro Arg Arg
<210> 26
<211> 645
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 26
atgaactttc tgctctcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 60
gccaagtggt cccaggctgc gcctatggca ggaggagagc acaaacccca cgaagtggtg 120
aagttcatgg acgtctacca gcgcagctac tgccgtccca ttgagaccct ggtggacatc 180
ttccaggagt accctgacga gatcgagtac atcttcaagc catcctgcgt gcccctgatg 240
cggtgtgggg gctgctgtaa tgatgagggc ctagagtgcg tgcccactga ggagttcaac 300
atcaccatgc agattatgcg gatcaaacct catcaaggcc agcacatagg ggagatgagt 360
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ccctggagcg ttccctgtgg gccttgctca gagcggagaa agcatttgtt tgtacaagat 540
ccgcagacgt gtaaatgttc ctgcaaaaac acagactcgc gttgcaaggc gaggcagctt 600
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<210> 27
<211> 214
<212> PRT
<213> Canis familiaris
<400> 27
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Gly Gly
20 25 30
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100 105 110
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115 120 125
Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Ile Arg
130 135 140
Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr Lys
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180 185 190
Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg
195 200 205
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210
<210> 28
<211> 188
<212> PRT
<213> Canis familiaris
<400> 28
Ala Pro Met Ala Gly Gly Glu His Lys Pro His Glu Val Val Lys Phe
1 5 10 15
Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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165 170 175
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180 185
<210> 29
<211> 651
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 29
atgaactttc tgctcacttg gatccactgg gggctggcgg cgctgctcta tctgcagagc 60
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atcaaattcc tggaagtcta cgaacgcagc ttctgcagga caattgagac cctggtggac 180
attttccagg agtaccctga tgaggtggag tacatattca ggccatcctg tgtgcctctg 240
atgagatgtg cgggttgctg cggcgatgag ggcctagaat gtgtccctgt ggatgtgtac 300
aacgtcacga tggagatcgc aagaattaaa ccccatcaga gtcagcacat agcgcacatg 360
agcttcttac agcacagtaa atgtgactgc agaccaaaga aagatgtcaa aaataaacaa 420
gaaaaaaaat caaagcgagg aaaggggaag ggtcaaaaga gaaagcgcaa gaaaggccgg 480
tacaaaccac ccagctttca ctgtgagcct tgctcagaga ggagaaagca cttgtttgta 540
caagatcccc agacctgtaa atgttcctgc aaattcacag actcacgttg caagtcgagg 600
cagcttgagt taaacgagcg cacttgcaga tgtgaaaaac cgagacggtg a 651
<210> 30
<211> 216
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<400> 30
Met Asn Phe Leu Leu Thr Trp Ile His Trp Gly Leu Ala Ala Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu Gln Ser Ala Glu Leu Ser Lys Ala Ala Pro Ala Leu Gly Asp
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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195 200 205
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210 215
<210> 31
<211> 190
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<400> 31
Ala Pro Ala Leu Gly Asp Gly Glu Arg Lys Pro Asn Glu Val Ile Lys
1 5 10 15
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20 25 30
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Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys
145 150 155 160
Lys Cys Ser Cys Lys Phe Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ser Arg Gln Leu
165 170 175
Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Glu Lys Pro Arg Arg
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<211> 573
<212> DNA
<213> Equus caballus
<400> 32
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gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggagagc ataaaaccca tgaagtggtg 120
aagttcatgg acgtctacca gcgcagctac tgccgtccaa tcgagaccct ggtggacatc 180
ttccaggagt accccgatga gatcgagtac atcttcaagc catcctgtgt gcccctgatg 240
cggtgtgggg gctgctgcaa cgacgagggc ctagagtgcg tgcccactgc ggagttcaac 300
atcaccatgc agattatgcg gatcaaacct caccaaagcc aacacatagg agagatgagt 360
ttcctacagc atagcaaatg tgaatgcaga ccaaagaaag ataaagcaag gcaagaaaat 420
ccctgtgggc cttgctcaga gcggagaaag catttgtttg tacaagatcc gcagacgtgt 480
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<211> 190
<212> PRT
<213> Equus caballus
<400> 33
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Glu His Lys Thr His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg
35 40 45
Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr
50 55 60
Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys
145 150 155 160
Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu
165 170 175
Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
180 185 190
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<211> 164
<212> PRT
<213> Equus caballus
<400> 34
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1 5 10 15
Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val
20 25 30
Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro
35 40 45
Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp
145 150 155 160
Lys Pro Arg Arg
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<212> DNA
<213> Mus musculus
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aagttcatgg acgtctacca gcgaagctac tgccgtccaa ttgagaccct ggtggacatc 180
ttccaggagt accccgacga gatagagtac atcttcaagc cgtcctgtgt gccgctgatg 240
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 36
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Thr Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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145 150 155 160
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210
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<212> PRT
<213> Mus musculus
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Ala Pro Thr Thr Glu Gly Glu Gln Lys Ser His Glu Val Ile Lys Phe
1 5 10 15
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<212> DNA
<213> Sus scrofa
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<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 39
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
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Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr
50 55 60
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Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys
145 150 155 160
Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu
165 170 175
Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
180 185 190
<210> 40
<211> 164
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 40
Ala Pro Met Ala Glu Gly Asp Gln Lys Pro His Glu Val Val Lys Phe
1 5 10 15
Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val
20 25 30
Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro
35 40 45
Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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145 150 155 160
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<211> 573
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 41
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<211> 214
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 42
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Thr Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Thr Thr Glu Gly
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Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr
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65 70 75 80
Arg Cys Ala Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ala Leu Glu Cys Val Pro Thr
85 90 95
Ser Glu Ser Asn Val Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln
100 105 110
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115 120 125
Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Thr Lys Pro Glu Lys Lys Ser Val Arg
130 135 140
Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Phe Lys
145 150 155 160
Ser Trp Ser Val His Cys Glu Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu
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Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp
180 185 190
Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg
195 200 205
Cys Asp Lys Pro Arg Arg
210
<210> 43
<211> 188
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 43
Ala Pro Thr Thr Glu Gly Glu Gln Lys Ala His Glu Val Val Lys Phe
1 5 10 15
Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val
20 25 30
Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<210> 44
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<212> DNA
<213> Ovis aries
<400> 44
atgaactttc tgctctcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta ccttcaccat 60
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ttcctacagc ataacaaatg tgaatgcaga ccaaagaaag ataaagcaag gcaagaaaaa 420
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<211> 146
<212> PRT
<213> Ovis aries
<400> 45
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
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Arg Arg
145
<210> 46
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<212> PRT
<213> Ovis aries
<400> 46
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gln Lys Pro His Glu Val Met Lys Phe
1 5 10 15
Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Phe Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val
20 25 30
Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Phe Ile Phe Lys Pro
35 40 45
Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ser
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65 70 75 80
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<210> 47
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
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<210> 48
<211> 167
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
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Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg
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<210> 49
<211> 207
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu
1 5 10 15
Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln
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195 200 205
<210> 50
<211> 186
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln Arg Lys Val Val Ser
1 5 10 15
Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val
20 25 30
Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val Ala Lys Gln Leu Val
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100 105 110
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Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Asp Ala
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala
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<210> 51
<211> 419
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Met His Leu Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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290 295 300
Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys
305 310 315 320
Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu
325 330 335
Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro
340 345 350
Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys
355 360 365
Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr
370 375 380
Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser
385 390 395 400
Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro
405 410 415
Gln Met Ser
<210> 52
<211> 354
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Met Tyr Arg Glu Trp Val Val Val Asn Val Phe Met Met Leu Tyr Val
1 5 10 15
Gln Leu Val Gln Gly Ser Ser Asn Glu His Gly Pro Val Lys Arg Ser
20 25 30
Ser Gln Ser Thr Leu Glu Arg Ser Glu Gln Gln Ile Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Ser Leu Glu Glu Leu Leu Arg Ile Thr His Ser Glu Asp Trp Lys Leu
50 55 60
Trp Arg Cys Arg Leu Arg Leu Lys Ser Phe Thr Ser Met Asp Ser Arg
65 70 75 80
Ser Ala Ser His Arg Ser Thr Arg Phe Ala Ala Thr Phe Tyr Asp Ile
85 90 95
Glu Thr Leu Lys Val Ile Asp Glu Glu Trp Gln Arg Thr Gln Cys Ser
100 105 110
Pro Arg Glu Thr Cys Val Glu Val Ala Ser Glu Leu Gly Lys Ser Thr
115 120 125
Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Asn Val Phe Arg Cys Gly Gly
130 135 140
Cys Cys Asn Glu Glu Ser Leu Ile Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr
145 150 155 160
Ile Ser Lys Gln Leu Phe Glu Ile Ser Val Pro Leu Thr Ser Val Pro
165 170 175
Glu Leu Val Pro Val Lys Val Ala Asn His Thr Gly Cys Lys Cys Leu
180 185 190
Pro Thr Ala Pro Arg His Pro Tyr Ser Ile Ile Arg Arg Ser Ile Gln
195 200 205
Ile Pro Glu Glu Asp Arg Cys Ser His Ser Lys Lys Leu Cys Pro Ile
210 215 220
Asp Met Leu Trp Asp Ser Asn Lys Cys Lys Cys Val Leu Gln Glu Glu
225 230 235 240
Asn Pro Leu Ala Gly Thr Glu Asp His Ser His Leu Gln Glu Pro Ala
245 250 255
Leu Cys Gly Pro His Met Met Phe Asp Glu Asp Arg Cys Glu Cys Val
260 265 270
Cys Lys Thr Pro Cys Pro Lys Asp Leu Ile Gln His Pro Lys Asn Cys
275 280 285
Ser Cys Phe Glu Cys Lys Glu Ser Leu Glu Thr Cys Cys Gln Lys His
290 295 300
Lys Leu Phe His Pro Asp Thr Cys Ser Cys Glu Asp Arg Cys Pro Phe
305 310 315 320
His Thr Arg Pro Cys Ala Ser Gly Lys Thr Ala Cys Ala Lys His Cys
325 330 335
Arg Phe Pro Lys Glu Lys Arg Ala Ala Gln Gly Pro His Ser Arg Lys
340 345 350
Asn Pro
<210> 53
<211> 149
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Met Pro Val Met Arg Leu Phe Pro Cys Phe Leu Gln Leu Leu Ala Gly
1 5 10 15
Leu Ala Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala Gly
20 25 30
Asn Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp Gly
35 40 45
Arg Ser Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser Glu
50 55 60
Tyr Pro Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser Leu
65 70 75 80
Leu Arg Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asn Leu His Cys Val Pro
85 90 95
Val Glu Thr Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly
100 105 110
Asp Arg Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gln His Val Arg Cys
115 120 125
Glu Cys Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Cys Gly Asp
130 135 140
Ala Val Pro Arg Arg
145
<210> 54
<211> 131
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala Gly Asn Gly
1 5 10 15
Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp Gly Arg Ser
20 25 30
Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser Glu Tyr Pro
35 40 45
Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser Leu Leu Arg
50 55 60
Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asn Leu His Cys Val Pro Val Glu
65 70 75 80
Thr Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly Asp Arg
85 90 95
Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gln His Val Arg Cys Glu Cys
100 105 110
Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Cys Gly Asp Ala Val
115 120 125
Pro Arg Arg
130
<210> 55
<211> 170
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Met Pro Val Met Arg Leu Phe Pro Cys Phe Leu Gln Leu Leu Ala Gly
1 5 10 15
Leu Ala Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala Gly
20 25 30
Asn Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp Gly
35 40 45
Arg Ser Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser Glu
50 55 60
Tyr Pro Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser Leu
65 70 75 80
Leu Arg Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asn Leu His Cys Val Pro
85 90 95
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100 105 110
Asp Arg Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gln His Val Arg Cys
115 120 125
Glu Cys Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Arg Arg Pro
130 135 140
Lys Gly Arg Gly Lys Arg Arg Arg Glu Lys Gln Arg Pro Thr Asp Cys
145 150 155 160
His Leu Cys Gly Asp Ala Val Pro Arg Arg
165 170
<210> 56
<211> 152
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala Gly Asn Gly
1 5 10 15
Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp Gly Arg Ser
20 25 30
Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser Glu Tyr Pro
35 40 45
Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser Leu Leu Arg
50 55 60
Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asn Leu His Cys Val Pro Val Glu
65 70 75 80
Thr Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly Asp Arg
85 90 95
Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gln His Val Arg Cys Glu Cys
100 105 110
Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Arg Arg Pro Lys Gly
115 120 125
Arg Gly Lys Arg Arg Arg Glu Lys Gln Arg Pro Thr Asp Cys His Leu
130 135 140
Cys Gly Asp Ala Val Pro Arg Arg
145 150
<210> 57
<211> 221
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57
Met Pro Val Met Arg Leu Phe Pro Cys Phe Leu Gln Leu Leu Ala Gly
1 5 10 15
Leu Ala Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala Gly
20 25 30
Asn Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp Gly
35 40 45
Arg Ser Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser Glu
50 55 60
Tyr Pro Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser Leu
65 70 75 80
Leu Arg Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asn Leu His Cys Val Pro
85 90 95
Val Glu Thr Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly
100 105 110
Asp Arg Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gln His Val Arg Cys
115 120 125
Glu Cys Arg His Ser Pro Gly Arg Gln Ser Pro Asp Met Pro Gly Asp
130 135 140
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Met Leu Phe Arg Met Glu Trp Gly Cys Ala Leu Thr Gly Ser Gln Ser
165 170 175
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180 185 190
Pro Gly Arg Asn Gly Lys Lys Gln Gln Arg Lys Pro Leu Arg Glu Lys
195 200 205
Met Lys Pro Glu Arg Cys Gly Asp Ala Val Pro Arg Arg
210 215 220
<210> 58
<211> 203
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala Gly Asn Gly
1 5 10 15
Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp Gly Arg Ser
20 25 30
Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser Glu Tyr Pro
35 40 45
Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser Leu Leu Arg
50 55 60
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65 70 75 80
Thr Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly Asp Arg
85 90 95
Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gln His Val Arg Cys Glu Cys
100 105 110
Arg His Ser Pro Gly Arg Gln Ser Pro Asp Met Pro Gly Asp Phe Arg
115 120 125
Ala Asp Ala Pro Ser Phe Leu Pro Pro Arg Arg Ser Leu Pro Met Leu
130 135 140
Phe Arg Met Glu Trp Gly Cys Ala Leu Thr Gly Ser Gln Ser Ala Val
145 150 155 160
Trp Pro Ser Ser Pro Val Pro Glu Glu Ile Pro Arg Met His Pro Gly
165 170 175
Arg Asn Gly Lys Lys Gln Gln Arg Lys Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys
180 185 190
Pro Glu Arg Cys Gly Asp Ala Val Pro Arg Arg
195 200
<210> 59
<211> 345
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
Met Ser Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Thr Ser Ala Leu Ala Gly Gln
1 5 10 15
Arg Gln Gly Thr Gln Ala Glu Ser Asn Leu Ser Ser Lys Phe Gln Phe
20 25 30
Ser Ser Asn Lys Glu Gln Asn Gly Val Gln Asp Pro Gln His Glu Arg
35 40 45
Ile Ile Thr Val Ser Thr Asn Gly Ser Ile His Ser Pro Arg Phe Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Glu Asn Val Trp Ile Gln Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu
85 90 95
Glu Asp Pro Glu Asp Asp Ile Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu
100 105 110
Glu Pro Ser Asp Gly Thr Ile Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr
115 120 125
Val Pro Gly Lys Gln Ile Ser Lys Gly Asn Gln Ile Arg Ile Arg Phe
130 135 140
Val Ser Asp Glu Tyr Phe Pro Ser Glu Pro Gly Phe Cys Ile His Tyr
145 150 155 160
Asn Ile Val Met Pro Gln Phe Thr Glu Ala Val Ser Pro Ser Val Leu
165 170 175
Pro Pro Ser Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Asn Asn Ala Ile Thr Ala
180 185 190
Phe Ser Thr Leu Glu Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Glu Pro Glu Arg Trp
195 200 205
Gln Leu Asp Leu Glu Asp Leu Tyr Arg Pro Thr Trp Gln Leu Leu Gly
210 215 220
Lys Ala Phe Val Phe Gly Arg Lys Ser Arg Val Val Asp Leu Asn Leu
225 230 235 240
Leu Thr Glu Glu Val Arg Leu Tyr Ser Cys Thr Pro Arg Asn Phe Ser
245 250 255
Val Ser Ile Arg Glu Glu Leu Lys Arg Thr Asp Thr Ile Phe Trp Pro
260 265 270
Gly Cys Leu Leu Val Lys Arg Cys Gly Gly Asn Cys Ala Cys Cys Leu
275 280 285
His Asn Cys Asn Glu Cys Gln Cys Val Pro Ser Lys Val Thr Lys Lys
290 295 300
Tyr His Glu Val Leu Gln Leu Arg Pro Lys Thr Gly Val Arg Gly Leu
305 310 315 320
His Lys Ser Leu Thr Asp Val Ala Leu Glu His His Glu Glu Cys Asp
325 330 335
Cys Val Cys Arg Gly Ser Thr Gly Gly
340 345
<210> 60
<211> 326
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Thr Gln Ala Glu Ser Asn Leu Ser Ser Lys Phe Gln Phe Ser Ser Asn
1 5 10 15
Lys Glu Gln Asn Gly Val Gln Asp Pro Gln His Glu Arg Ile Ile Thr
20 25 30
Val Ser Thr Asn Gly Ser Ile His Ser Pro Arg Phe Pro His Thr Tyr
35 40 45
Pro Arg Asn Thr Val Leu Val Trp Arg Leu Val Ala Val Glu Glu Asn
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Asp Ile Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Gly Thr Ile Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr Val Pro Gly
100 105 110
Lys Gln Ile Ser Lys Gly Asn Gln Ile Arg Ile Arg Phe Val Ser Asp
115 120 125
Glu Tyr Phe Pro Ser Glu Pro Gly Phe Cys Ile His Tyr Asn Ile Val
130 135 140
Met Pro Gln Phe Thr Glu Ala Val Ser Pro Ser Val Leu Pro Pro Ser
145 150 155 160
Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Asn Asn Ala Ile Thr Ala Phe Ser Thr
165 170 175
Leu Glu Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Glu Pro Glu Arg Trp Gln Leu Asp
180 185 190
Leu Glu Asp Leu Tyr Arg Pro Thr Trp Gln Leu Leu Gly Lys Ala Phe
195 200 205
Val Phe Gly Arg Lys Ser Arg Val Val Asp Leu Asn Leu Leu Thr Glu
210 215 220
Glu Val Arg Leu Tyr Ser Cys Thr Pro Arg Asn Phe Ser Val Ser Ile
225 230 235 240
Arg Glu Glu Leu Lys Arg Thr Asp Thr Ile Phe Trp Pro Gly Cys Leu
245 250 255
Leu Val Lys Arg Cys Gly Gly Asn Cys Ala Cys Cys Leu His Asn Cys
260 265 270
Asn Glu Cys Gln Cys Val Pro Ser Lys Val Thr Lys Lys Tyr His Glu
275 280 285
Val Leu Gln Leu Arg Pro Lys Thr Gly Val Arg Gly Leu His Lys Ser
290 295 300
Leu Thr Asp Val Ala Leu Glu His His Glu Glu Cys Asp Cys Val Cys
305 310 315 320
Arg Gly Ser Thr Gly Gly
325
<210> 61
<211> 147
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 61
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
85 90 95
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100 105 110
Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys
130 135 140
Pro Arg Arg
145
<210> 62
<211> 121
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys
1 5 10 15
Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu
20 25 30
Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys
35 40 45
Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu
50 55 60
Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile
65 70 75 80
Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe
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Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg
100 105 110
Gln Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg Arg
115 120
<210> 63
<211> 211
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
Met Arg Thr Leu Ala Cys Leu Leu Leu Leu Gly Cys Gly Tyr Leu Ala
1 5 10 15
His Val Leu Ala Glu Glu Ala Glu Ile Pro Arg Glu Val Ile Glu Arg
20 25 30
Leu Ala Arg Ser Gln Ile His Ser Ile Arg Asp Leu Gln Arg Leu Leu
35 40 45
Glu Ile Asp Ser Val Gly Ser Glu Asp Ser Leu Asp Thr Ser Leu Arg
50 55 60
Ala His Gly Val His Ala Thr Lys His Val Pro Glu Lys Arg Pro Leu
65 70 75 80
Pro Ile Arg Arg Lys Arg Ser Ile Glu Glu Ala Val Pro Ala Val Cys
85 90 95
Lys Thr Arg Thr Val Ile Tyr Glu Ile Pro Arg Ser Gln Val Asp Pro
100 105 110
Thr Ser Ala Asn Phe Leu Ile Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Lys Arg
115 120 125
Cys Thr Gly Cys Cys Asn Thr Ser Ser Val Lys Cys Gln Pro Ser Arg
130 135 140
Val His His Arg Ser Val Lys Val Ala Lys Val Glu Tyr Val Arg Lys
145 150 155 160
Lys Pro Lys Leu Lys Glu Val Gln Val Arg Leu Glu Glu His Leu Glu
165 170 175
Cys Ala Cys Ala Thr Thr Ser Leu Asn Pro Asp Tyr Arg Glu Glu Asp
180 185 190
Thr Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu
195 200 205
Lys Pro Thr
210
<210> 64
<211> 196
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Met Arg Thr Leu Ala Cys Leu Leu Leu Leu Gly Cys Gly Tyr Leu Ala
1 5 10 15
His Val Leu Ala Glu Glu Ala Glu Ile Pro Arg Glu Val Ile Glu Arg
20 25 30
Leu Ala Arg Ser Gln Ile His Ser Ile Arg Asp Leu Gln Arg Leu Leu
35 40 45
Glu Ile Asp Ser Val Gly Ser Glu Asp Ser Leu Asp Thr Ser Leu Arg
50 55 60
Ala His Gly Val His Ala Thr Lys His Val Pro Glu Lys Arg Pro Leu
65 70 75 80
Pro Ile Arg Arg Lys Arg Ser Ile Glu Glu Ala Val Pro Ala Val Cys
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Lys Thr Arg Thr Val Ile Tyr Glu Ile Pro Arg Ser Gln Val Asp Pro
100 105 110
Thr Ser Ala Asn Phe Leu Ile Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Lys Arg
115 120 125
Cys Thr Gly Cys Cys Asn Thr Ser Ser Val Lys Cys Gln Pro Ser Arg
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Val His His Arg Ser Val Lys Val Ala Lys Val Glu Tyr Val Arg Lys
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Lys Pro Lys Leu Lys Glu Val Gln Val Arg Leu Glu Glu His Leu Glu
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180 185 190
Thr Asp Val Arg
195
<210> 65
<211> 1338
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro
20 25 30
Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr
35 40 45
Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro
50 55 60
Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
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165 170 175
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
180 185 190
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
195 200 205
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
210 215 220
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val
225 230 235 240
Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr
245 250 255
Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys
260 265 270
Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His
275 280 285
Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys
290 295 300
Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys
305 310 315 320
Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val
325 330 335
Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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405 410 415
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485 490 495
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Asn Val Ser Leu Gln Asp Ser Gly Thr Tyr Ala Cys Arg Ala Arg Asn
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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755 760 765
Leu Leu His Lys Ser Leu Lys Leu Tyr Gln Val Ile Phe Glu Gly Glu
770 775 780
Ile Gly Lys Gly Asn Leu Gly Gly Ile Ala Val Asp Asp Ile Ser Ile
785 790 795 800
Asn Asn His Ile Ser Gln Glu Asp Cys Ala Lys Pro Ala Asp Leu Asp
805 810 815
Lys Lys Asn Pro Glu Ile Lys Ile Asp Glu Thr Gly Ser Thr Pro Gly
820 825 830
Tyr Glu Gly Glu Gly Glu Gly Asp Lys Asn Ile Ser Arg Lys Pro Gly
835 840 845
Asn Val Leu Lys Thr Leu Glu Pro Ile Leu Ile Thr Ile Ile Ala Met
850 855 860
Ser Ala Leu Gly Val Leu Leu Gly Ala Val Cys Gly Val Val Leu Tyr
865 870 875 880
Cys Ala Cys Trp His Asn Gly Met Ser Glu Arg Asn Leu Ser Ala Leu
885 890 895
Glu Asn Tyr Asn Phe Glu Leu Val Asp Gly Val Lys Leu Lys Lys Asp
900 905 910
Lys Leu Asn Thr Gln Ser Thr Tyr Ser Glu Ala
915 920
<210> 69
<211> 931
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
Met Asp Met Phe Pro Leu Thr Trp Val Phe Leu Ala Leu Tyr Phe Ser
1 5 10 15
Arg His Gln Val Arg Gly Gln Pro Asp Pro Pro Cys Gly Gly Arg Leu
20 25 30
Asn Ser Lys Asp Ala Gly Tyr Ile Thr Ser Pro Gly Tyr Pro Gln Asp
35 40 45
Tyr Pro Ser His Gln Asn Cys Glu Trp Ile Val Tyr Ala Pro Glu Pro
50 55 60
Asn Gln Lys Ile Val Leu Asn Phe Asn Pro His Phe Glu Ile Glu Lys
65 70 75 80
His Asp Cys Lys Tyr Asp Phe Ile Glu Ile Arg Asp Gly Asp Ser Glu
85 90 95
Ser Ala Asp Leu Leu Gly Lys His Cys Gly Asn Ile Ala Pro Pro Thr
100 105 110
Ile Ile Ser Ser Gly Ser Met Leu Tyr Ile Lys Phe Thr Ser Asp Tyr
115 120 125
Ala Arg Gln Gly Ala Gly Phe Ser Leu Arg Tyr Glu Ile Phe Lys Thr
130 135 140
Gly Ser Glu Asp Cys Ser Lys Asn Phe Thr Ser Pro Asn Gly Thr Ile
145 150 155 160
Glu Ser Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr Pro His Asn Leu Asp Cys Thr
165 170 175
Phe Thr Ile Leu Ala Lys Pro Lys Met Glu Ile Ile Leu Gln Phe Leu
180 185 190
Ile Phe Asp Leu Glu His Asp Pro Leu Gln Val Gly Glu Gly Asp Cys
195 200 205
Lys Tyr Asp Trp Leu Asp Ile Trp Asp Gly Ile Pro His Val Gly Pro
210 215 220
Leu Ile Gly Lys Tyr Cys Gly Thr Lys Thr Pro Ser Glu Leu Arg Ser
225 230 235 240
Ser Thr Gly Ile Leu Ser Leu Thr Phe His Thr Asp Met Ala Val Ala
245 250 255
Lys Asp Gly Phe Ser Ala Arg Tyr Tyr Leu Val His Gln Glu Pro Leu
260 265 270
Glu Asn Phe Gln Cys Asn Val Pro Leu Gly Met Glu Ser Gly Arg Ile
275 280 285
Ala Asn Glu Gln Ile Ser Ala Ser Ser Thr Tyr Ser Asp Gly Arg Trp
290 295 300
Thr Pro Gln Gln Ser Arg Leu His Gly Asp Asp Asn Gly Trp Thr Pro
305 310 315 320
Asn Leu Asp Ser Asn Lys Glu Tyr Leu Gln Val Asp Leu Arg Phe Leu
325 330 335
Thr Met Leu Thr Ala Ile Ala Thr Gln Gly Ala Ile Ser Arg Glu Thr
340 345 350
Gln Asn Gly Tyr Tyr Val Lys Ser Tyr Lys Leu Glu Val Ser Thr Asn
355 360 365
Gly Glu Asp Trp Met Val Tyr Arg His Gly Lys Asn His Lys Val Phe
370 375 380
Gln Ala Asn Asn Asp Ala Thr Glu Val Val Leu Asn Lys Leu His Ala
385 390 395 400
Pro Leu Leu Thr Arg Phe Val Arg Ile Arg Pro Gln Thr Trp His Ser
405 410 415
Gly Ile Ala Leu Arg Leu Glu Leu Phe Gly Cys Arg Val Thr Asp Ala
420 425 430
Pro Cys Ser Asn Met Leu Gly Met Leu Ser Gly Leu Ile Ala Asp Ser
435 440 445
Gln Ile Ser Ala Ser Ser Thr Gln Glu Tyr Leu Trp Ser Pro Ser Ala
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
Thr Ala Val Glu Ala Arg Ala Phe Val Arg Lys Phe Lys Val Ser Tyr
515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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610 615 620
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Pro Pro Val His Leu Pro Arg Ser Pro Val Cys Met Glu Phe Gln Tyr
705 710 715 720
Gln Ala Thr Gly Gly Arg Gly Val Ala Leu Gln Val Val Arg Glu Ala
725 730 735
Ser Gln Glu Ser Lys Leu Leu Trp Val Ile Arg Glu Asp Gln Gly Gly
740 745 750
Glu Trp Lys His Gly Arg Ile Ile Leu Pro Ser Tyr Asp Met Glu Tyr
755 760 765
Gln Ile Val Phe Glu Gly Val Ile Gly Lys Gly Arg Ser Gly Glu Ile
770 775 780
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785 790 795 800
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Leu Ser Ser Arg Ser Cys Thr Thr Leu Glu Asn Tyr Asn Phe Glu Leu
900 905 910
Tyr Asp Gly Leu Lys His Lys Val Lys Met Asn His Gln Lys Cys Cys
915 920 925
Ser Glu Ala
930
<210> 70
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
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1 5
<210> 71
<211> 6
<212> PRT
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<400> 71
Cys Asp Lys Pro Arg Arg
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 72
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73
Ala Asn Ile Thr Val Asn Ile Thr Val
1 5
Claims (81)
- 변형된 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF)가 수용체 길항제로서 작용하도록 하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 여기서 돌연변이는 수용체 결합 친화성 및 생체활성의 분리를 유발하는 것인 변형된 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF).
- 제1항에 있어서, 천연 VEGF 수용체에 대한 길항제의 수용체 결합 친화성이 천연 VEGF 수용체에 대한 야생형 VEGF의 수용체 결합 친화성에 비해 큰 것인 VEGF 수용체 길항제.
- 제2항에 있어서, 천연 VEGF 수용체가 Flt-1 또는 KDR인 VEGF 수용체 길항제.
- 제2항에 있어서, 수용체 결합 친화성이 약 3 내지 4배 이상 증가한 VEGF 수용체 길항제.
- 제2항에 있어서, 수용체 결합 친화성이 약 2배 이상 증가한 VEGF 수용체 길항제.
- 제1항에 있어서, 길항제에 대한 생체활성이 야생형 VEGF에 대한 생체활성에 비해 감소된 것인 VEGF 수용체 길항제.
- 제1항에 있어서, 길항제가 동종이량체 또는 이종이량체로서 발현되는 VEGF 수용체 길항제.
- 제7항에 있어서, 동종이량체 또는 이종이량체의 각 서브유닛이 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 VEGF 수용체 길항제.
- 제8항에 있어서, 동종이량체 또는 이종이량체 중 하나의 서브유닛이 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 VEGF 수용체 길항제.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 VEGF 서브유닛을 포함하는 융합 단백질로서 발현되는 VEGF 수용체 길항제.
- 제10항에 있어서, 하나 이상의 VEGF 서브유닛 각각이 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 VEGF 수용체 길항제.
- 제10항에 있어서, 하나 이상의 VEGF 서브유닛이 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 VEGF 수용체 길항제.
- 제10항에 있어서, 링커 펩티드를 더 포함하는 VEGF 수용체 길항제.
- 제10항에 있어서, 독소를 더 포함하는 VEGF 수용체 길항제.
- 제1항에 있어서, 돌연변이가 서열 번호 4의 위치 83에 상응하는 위치에서의 염기성 아미노산 치환인 VEGF 수용체 길항제.
- 제15항에 있어서, 상기 염기성 아미노산이 I83K인 VEGF 수용체 길항제.
- 제15항에 있어서, 상기 염기성 아미노산이 I83R인 VEGF 수용체 길항제.
- 제15항에 있어서, 길항제가 서열 번호 4의 위치 44, 67, 72, 73 및 87로 이루어진 군에 상응하는 하나 이상의 추가의 염기성 아미노산 치환을 함유하는 VEGF.
- 제18항에 있어서, 추가의 치환이 E72R 및 E73R로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 VEGF 수용체 길항제.
- 제18항에 있어서, 추가의 치환이 E72K 및 E73K로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 VEGF 수용체 길항제.
- 제18항에 있어서, 추가의 치환이 E44R 또는 E44K인 VEGF 수용체 길항제.
- 제18항에 있어서, 추가의 치환이 Q87K 또는 Q87L인 VEGF 수용체 길항제.
- 제18항에 있어서, 추가의 치환이 E67K인 VEGF 수용체 길항제.
- 제1항에 있어서, VEGF-A 수용체 길항제 및 천연 VEGF 수용체의 상호작용이 혈관형성의 억제를 유발하는 것인 VEGF 수용체 길항제.
- 제24항에 있어서, 천연 VEGF 수용체가 KDR인 VEGF 수용체 길항제.
- 제18항에 있어서, 아미노산 E72R + E73R + I83K를 함유하는 VEGF 수용체 길항제.
- 제18항에 있어서, 아미노산 E44R + E72R + E73R + I83K를 함유하는 VEGF 수용체 길항제.
- 제15항 또는 제18항에 있어서, 뉴로필린-1 결합을 붕괴하는 서열 번호 4의 위치 111-165에 상응하는 아미노산에서의 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 함유하는 VEGF 길항제.
- 제28항에 있어서, 추가의 아미노산 치환이 헤파린 술페이트 결합을 붕괴하지 않는 VEGF 길항제.
- 제28항에 있어서, 서열 번호 4의 C146 또는 C160에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 함유하는 VEGF 길항제.
- 제30항에 있어서, 아미노산 치환이 C146S 또는 C160S인 VEGF 길항제.
- 제28항에 있어서, 서열 번호 4의 C146 및 C160에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 함유하는 VEGF 길항제.
- 제32항에 있어서, 아미노산 치환이 C146S 또는 C160S인 VEGF 길항제.
- 제15항 또는 제18항에 있어서, 길항제의 프로테아제 절단을 감소시키거나 방지하는 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 함유하는 VEGF 길항제.
- 제34항에 있어서, 프로테아제가 플라스민인 VEGF 길항제.
- 제34항에 있어서, 하나 이상의 추가의 아미노산 치환이 서열 번호 4의 위치 A111 및 A148에 상응하는 위치의 군으로부터 선택되는 것인 VEGF 길항제.
- 제36항에 있어서, 아미노산 치환이 A111P 또는 A148P인 VEGF 길항제.
- 제36항에 있어서, 아미노산 치환이 A111P 및 A148P인 VEGF 길항제.
- 제14항에 있어서, 독소가 슈도모나스 (Pseudomonas) 외독소 (PE), 디프테리아 (Diphtheria) 독소 (DT), 리신 독소, 아브린 독소, 탄저균 독소, 시가 독소, 보툴리누스 중독 독소, 파상풍 독소, 콜레라 독소, 마이토톡신, 팔레톡신, 시구아톡신, 텍스틸로톡신, 바트라코톡신, 알파 코노톡신, 타이폭신, 테트로도톡신, 알파 티티우스톡신, 삭시톡신, 아나톡신, 마이크로시스틴, 아코니틴, 엑스폴리아틴 독소 A 및 B, 장독소, 독성 쇼크 증후군 독소 (TSST-1), 예르시니아 페스티스 (Y. pestis) 독소, 및 가스 괴저 독소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 VEGF 길항제.
- 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서브유닛 중 하나 이상이 VEGF-A 서브유닛인 VEGF 길항제.
- 제40항에 있어서, 상기 VEGF-A 서브유닛이 VEGF165 서브유닛인 VEGF 길항제.
- 제40항에 있어서, 상기 VEGF-A 서브유닛이 VEGF165b인 VEGF 길항제.
- 제40항에 있어서, 상기 VEGF-A 서브유닛이 VEGF121 서브유닛인 VEGF 길항제.
- 제40항에 있어서, 상기 VEGF-A 서브유닛이 VEGF145인 VEGF 길항제.
- 제40항에 있어서, 상기 VEGF-A 서브유닛이 VEGF148 서브유닛인 VEGF 길항제.
- 제40항에 있어서, 상기 VEGF-A 서브유닛이 VEGF183인 VEGF 길항제.
- 제40항에 있어서, 상기 VEGF-A 서브유닛이 VEGF189 서브유닛인 VEGF 길항제.
- 제40항에 있어서, 상기 VEGF-A 서브유닛이 VEGF206인 VEGF 길항제.
- 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서브유닛 중 하나 이상이 VEGF-B 서브유닛인 VEGF 길항제.
- 제49항에 있어서, 상기 VEGF-B 서브유닛이 VEGF-B167 서브유닛인 VEGF 길항 제.
- 제49항에 있어서, 상기 VEGF-B 서브유닛이 VEGF-B186인 VEGF 길항제.
- 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서브유닛 중 하나 이상이 VEGF-C 서브유닛인 VEGF 길항제.
- 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서브유닛 중 하나 이상이 VEGF-D 서브유닛인 VEGF 길항제.
- 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서브유닛 중 하나 이상이 PlGF 서브유닛인 VEGF 길항제.
- 제54항에 있어서, 상기 PlGF 서브유닛이 PlGF-1인 VEGF 길항제.
- 제54항에 있어서, 상기 PlGF 서브유닛이 PlGF-2인 VEGF 길항제.
- 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관형성을 부분적으로 억제하는 VEGF 길항제.
- 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관형성을 대략 거의 완전히 억제하는 VEGF 길항제.
- 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 VEGF 수용체 길항제를 포함하는 제약 조성물.
- 제59항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 더 포함하는 조성물.
- 제60항에 있어서, 에어로졸 전달용으로 제형화된 조성물.
- 제61항에 있어서, 비내 스프레이로 제형화된 조성물.
- 제60항에 있어서, 경구 투여용으로 제형화된 조성물.
- 제63항에 있어서, 정제, 환제, 또는 캡슐제로 제형화된 조성물.
- 제60항에 있어서, 데포 (depot) 또는 좌제로 제형화된 조성물.
- 제60항에 있어서, 항-VEGF 약물, 항혈관형성제, 항암제, 불임제, 자가면역 제, 소염제, 안질환약, 및 피부 질환약으로 이루어진 군으로부터의 1종 이상의 부가 약물을 포함하는 조성물.
- 치료 유효량의 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 따른 VEGF 수용체 길항제를 암으로 진단된 환자에게 투여하여 상기 암을 감소시키거나 억제하는 것을 포함하는, 상기 환자를 상기 길항제로 치료하는 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 암이 방광암, 유방암, 간암, 골암, 신장암, 결장암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 폐암, 뇌암, 유방암, 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 고형 종양 암인 방법.
- 치료 유효량의 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 따른 VEGF 수용체 길항제를 혈관형성-관련 안질환으로 진단된 환자에게 투여하여 상기 안질환을 감소시키거나 억제하는 것을 포함하는, 상기 환자를 상기 길항제로 치료하는 방법.
- 제69항에 있어서, 상기 안질환이 미숙아 망막증, 당뇨병성 망막증, 망막 정맥 폐쇄, 황반 변성, 및 각막 손상 또는 이식편과 관련된 혈관신생으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 치료 유효량의 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 따른 VEGF 수용체 길항제 를 혈관형성-관련 질환 또는 상태로 진단된 환자에게 투여하여 상기 혈관형성-관련 질환을 감소시키거나 억제하는 것을 포함하는, 상기 환자를 상기 길항제로 치료하는 방법.
- 제71항에 있어서, 상기 질환 또는 상태가 혈관종, 류마티스 관절염, 골관절염, 패혈성 관절염, 천식, 아테롬성동맥경화증, 특발성 폐 섬유증, 혈관 재협착, 동정맥 기형, 수막종, 신생혈관 녹내장, 건선, 카포시 증후군, 혈관섬유종, 혈우병성 관절, 비후성 반흔, 오슬러-웨버 (Osler-Weber) 증후군, 화농성 육아종, 후수정체 섬유증식증, 경피증, 트라코마, 폰 히펠-린다우 (von Hippel-Lindau) 질환, 혈관 유착 병리상태, 윤활막염, 피부염, 원인불명 여성 불임증, 자궁내막증, 원인불명 남성 불임증, 익상편, 상처, 앓이, 피부 궤양, 위궤양, 및 십이지장 궤양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, VEGF의 서브유닛 중 하나 또는 둘 다가 반감기 연장을 위한 변형을 포함하는 것인 VEGF 수용체 길항제.
- 제73항에 있어서, 반감기 연장을 위한 변형이 N 말단 또는 C 말단 연장부인 VEGF 수용체 길항제.
- 제73항에 있어서, 반감기 연장을 위한 변형이 페길화인 VEGF 수용체 길항제.
- 제10항에 있어서, 융합 단백질이 서로 융합된 2개의 VEGF 또는 VEGF-관련 단백질 서브유닛을 함유하는 것인 VEGF 수용체 길항제.
- 제76항에 있어서, 2개의 VEGF 또는 VEGF-관련 단백질 서브유닛이 VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, PDGF 또는 PlGF 서브유닛과 융합된 VEGF-A 서브유닛; VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, PDGF 또는 PlGF 서브유닛과 융합된 VEGF-B 서브유닛; VEGF-A, VEGF-B, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, PDGF 또는 PlGF 서브유닛과 융합된 VEGF-C 서브유닛; VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-E, VEGF-F, PDGF 또는 PlGF 서브유닛과 융합된 VEGF-D 서브유닛; 및 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, 또는 PDGF 서브유닛과 융합된 PlGF 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 VEGF 수용체 길항제.
- 서열 13의 E44B, E67B, E72B, E73B, I83B 및 Q87B로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 여기서 B가 염기성 아미노산인 VEGF165b 수용체 길항제.
- 제78항에 있어서, 야생형 VEGF165 또는 야생형 VEGF165b와 비교하여 증가된 수용체 결합 친화성을 나타내는 VEGF165b 수용체 길항제.
- 뉴로필린-1 결합을 붕괴시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 서열 4의 E44, E67, E72, E73, 183 및 Q87로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 염기성 아미노산 치환을 포함하는 VEGF 수용체 길항제.
- 제80항에 있어서, 상기 뉴로필린-1 결합을 붕괴시키는 하나 이상의 돌연변이가 C146S 및 C160S로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 VEGF 수용체 길항제.
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