FR2990352A1 - Composition immunogene comprenant un peptide derive du vegf et ses utilisations - Google Patents

Abstract

La présente invention est relative à une composition immunogénique comprenant un fragment peptidique de VEGF-A et son utilisation pour traiter des maladies inflammatoires ou prolifératives.

Description

Composition immunogène comprenant un peptide dérivé du VEGF et ses utilisations Domaine de l'invention La présente invention est relative au domaine médical. Contexte de l'invention La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune inflammatoire chronique entrainant une destruction articulaire progressive et des atteintes vasculaires. Cette maladie grave est le rhumatisme inflammatoire le plus fréquent chez l'homme (0,5 % de la population adulte). La PR est une source de handicap lourd et d'un fort coût social. La maladie se développe avec un excès de production de cytokines pro-inflammatoires (comme le TNF-a, «Tumor Necrosis Factor-alpha»). La PR se caractérise également par une forte néo-vascularisation de la membrane synoviale qui entoure les articulations, favorisant ainsi son hyperplasie et l'envahissement progressif des tissus environnants et la destruction des articulations. L'hyperplasie pseudo-tumorale de la membrane synoviale dépend de nombreux facteurs parmi lesquels on trouve des cytokines pro-inflammatoires (TNF-ci, interleukines (IL)-17, ...) et pro-angiogéniques (Angiopoiétines, VEGF «Vascular Endothelial Growth Factor»,...). Le VEGF-A favorise la formation de cette hyperplasie synoviale en permettant à la fois sa vascularisation et en stimulant l'afflux des cellules inflammatoires. Les patients atteints de PR ont une expression du VEGF sérique augmentée [Kurosaka et al. 2010]. Il a également été démontré que, très tôt dans la maladie, il existait une corrélation entre la concentration en VEGF-A, les paramètres de l'inflammation et la destruction osseuse [Clavel et al. 2007]. Le VEGF appartient à une famille de gènes localisés sur différents chromosomes (VEGF-A, -B, -C, -D), dont certains comme le VEGF-A existent sous différents isoformes qui ont des effets biologiques variés (angiogenèse, développement de vaisseaux lymphatiques, cicatrisation, ...) [Cross et al. 2003; Otrock et al. 2007]. La diversité des isoformes et la présence de différents récepteurs (VEGFR1-3) et co-récepteurs (Neuropiline 1-2) pour ces isoformes du VEGF rendent nécessaire le développement de thérapies ciblant spécifiquement une ou plusieurs formes de VEGF plutôt qu'un traitement globale. Dans la PR, le but est d'inhiber l'angiogenèse impliquée dans l'inflammation tout en conservant les autres effets biologiques. Pour ce faire, c'est l'interaction entre le VEGF-A165 et le récepteur 2 du VEGF (KDR) qu'il faudrait cibler. Une révolution dans la prise en charge de la PR est intervenue voici une dizaine d'années avec l'introduction de thérapies ciblant les acteurs de l'inflammation, comme le TNF-a, avec des anticorps monoclonaux et des récepteurs solubles, toujours aux côtés des traitements de fond classiques (methotrexate, ...). Cependant, ces thérapies ciblées (immunothérapies passives), sont responsables de nombreux effets secondaires et sont d'un coût très élevé (environ 15Keuros/an/patient), ce qui rend impossible leur utilisation extensive dans tous les pays. Des anticorps spécifiques du VEGF et capables d'inhiber la liaison du VEGF sur les récepteurs VEGF-R1 et VEGF-R2 ont été décrits dans W02009/055343. Les inventeurs ont précédemment développé dans leur laboratoire une approche alternative qui cible les cytokines par la vaccination. Cette fois, c'est l'organisme lui-même qui produit les anticorps qui permettent de neutraliser la cytokine. Les études précliniques effectuées au laboratoire dans un modèle d'arthrite spontanée (souris C57B1/6 transgéniques pour le TNF-a humain) ont montré qu'un vaccin composé de TNF humain entier couplé à une protéine porteuse, la KLH («Keyhole Limpet Hemocyanin»), était efficace à la fois sur les signes cliniques et histologiques de la maladie [LeBuanec et al. 2006; Delavallée et al. 2008; Delavallée et al. 2009]. Des résultats intéressants ont été obtenus lors de premiers essais cliniques menés dans la PR et la maladie de Crohn. Ces travaux ont été réalisés avec la cytokine entière couplée à la KLH. L'inconvénient de cette stratégie est le coût et la difficulté de manipulation puisque la cytokine entière est utilisée. Par ailleurs, cette stratégie pourrait également conduire à des effets secondaires à la suite de réactions immunitaires dirigées contre un épitope partagé par une autre molécule d'intérêt. Il est également possible de concevoir l'utilisation de peptides couplés à la KLH afin d'obtenir des anticorps réagissant de manière croisée avec la cytokine entière. En collaboration avec l'équipe de bioinformatique du CNAM dirigée par Jean-François Zagury, a été développée une approche avec des peptides ciblant l'IL-113, le TNF-a et la sous-unité p19 spécifique de l'IL-23 chez la souris [Bertin-Maghit et al. 2005; Capini et al. 2004; Ratsimandresy et al. 2011].

Certaines stratégies ont mené à la production de vaccin comprenant des peptides dérivés des récepteurs VEGF-R1 et VEGF-R2 (W02010/143435). W000/53219 a décrit l'utilisation de peptides dérivés du VEGF encapsulés dans des liposomes dans des compositions immunologiques pour le traitement du cancer. Ils ont montré la capacité à induire des anticorps pour les peptides D et E, et une activité anti- tumorale pour le peptide F. Cependant, comme le montrera la partie expérimentale du présent document, la production d'anticorps anti-VEGF-A n'est pas suffisante pour obtenir un effet thérapeutique. En effet, il faut que les anticorps produits soient fonctionnels. Ainsi, il demeure un vif besoin de nouvelles stratégies pour identifier des traitements des maladies inflammatoires et notamment de la polyarthrite rhumatoïde. Résumé de l'invention Les inventeurs ont identifié dans la présente invention une région du VEGF commune à plusieurs isoformes, en particulier du VEGF-A, qui permet de préparer une composition immunogène comprenant des peptides issus de cette région, ladite composition étant capable d'induire la production d'anticorps fonctionnels permettant d'avoir un effet protecteur. Ainsi, la présente invention est relative à une composition immunogène comprenant un peptide comprenant la séquence (C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R (SEQ ID No 1), et ne comprenant pas la séquence C-D-K-P-R-R (SEQ ID No 2).

De préférence, ledit peptide a une longueur de 9 à 50 acides aminés, de préférence de 9 à 20 acides aminés. De préférence, le peptide comprend ou consiste en une séquence X-(R/K)-(C/S)-E(C/S)-R-P-K-K-D-R-X-(K/R)-X-E-(N/K), X étant un acide aminé quelconque (SEQ ID No 3) ou une séquence comprenant 10 résidus consécutifs de SEQ ID No 3.

Dans un mode particulièrement préféré, le peptide comprend ou consiste en une séquence (S/N)-(R/K)-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-(A/T)-(K/R)-(P/Q)-E-(N/K) (SEQ ID No 4) ou une séquence comprenant 10 résidus consécutifs de SEQ ID No 4. De préférence, le peptide comprend ou consiste en une séquence sélectionnée parmi C-E-C-R-P-K-K-D-R (SEQ ID No 5) C-E-S-R-P-K-K-D-R (SEQ ID No 6) S-E-C-R-P-K-K-D-R (SEQ ID No 7) S-E-S-R-P-K-K-D-R (SEQ ID No 8) Dans des modes très particuliers de l'invention, ledit peptide comprend ou consiste en une séquence sélectionnée parmi S-R-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 9) S-R-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 10) S-R-C-E-C-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 11) S-R-C-E-S-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 12) S-R-S-E-C-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 13) S-R-S-E-S-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 14) S-R-C-E-C-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 15) S-R-C-E-S-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 16) S-R-S-E-C-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 17) S-R-S-E-S-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 18) N-K-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 19) N-K-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 20) N-K-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-K (SEQ ID No 21) N-K-C-E-C-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 22) N-K-C-E-S-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 23) N-K-S-E-C-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 24) N-K-S-E-S-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 25) N-K-C-E-C-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 26) N-K-C-E-S-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 27) N-K-S-E-C-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 28) N-K-S-E-S-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 29) ou une séquence comprenant 10 résidus consécutifs d'une séquence choisie parmi les SEQ ID Nos 9-29. Dans un mode de réalisation préféré, ledit peptide est couplé à une protéine porteuse, 20 de préférence la KLH. La présente invention est également relative à une composition immunogène telle que décrite ci-dessus à titre de médicament. La présente invention est aussi relative à une composition immunogène telle que décrite ci-dessus pour une utilisation dans le traitement d'une maladie dépendante d'une 25 angiogenèse accrue. De préférence, la maladie est une maladie inflammatoire, en particulier une maladie inflammatoire chronique, ou une maladie proliférative. De manière plus spécifique, la maladie est une maladie inflammatoire chronique, de préférence sélectionnée parmi la polyarthrite rhumatoïde et les spondylarthropathies. 30 Description des figures Figure 1 : Protocole vaccinal. Les quantités indiquées lors de la vaccination par Vpep 1 -K et Vpep2-K (1001.1g), correspondent aux quantités de peptides contenus au sein des complexes avec la KLH. Figure 2 : ELISA anticorps anti-peptides du VEGF-A164 Figure 3: Scores cliniques d'arthrite Figure 4: Délais avant apparition des premiers signes cliniques d'arthrite Figure 5: Scores histologiques au sacrifice Description détaillée de l'invention Les travaux des inventeurs visaient à développer une stratégie vaccinale, notamment par immunothérapie active, anti-VEGF basée sur l'utilisation de peptides issus de la séquence de la cytokine. Cette stratégie permet de réduire les coûts, puisqu'un peptide peut être produit à faible coût, de faciliter la manipulation du produit et d'avoir un effet spécifique sur VEGF- 1 0 A, et par conséquent de diminuer les effets secondaires puisque les autres formes de VEGF restent fonctionnelles. Les inventeurs ont identifié dans la présente invention une région du VEGF commune à plusieurs isoformes de VEGF-A, qui permet de préparer une composition immunogène comprenant des peptides issus de cette région, ladite composition étant capable d'induire la 15 production d'anticorps fonctionnels permettant d'avoir un effet protecteur. Cette région se situe à la fin du feuillet bêta 7 du VEGF-A165 humain et dans la boucle en aval de celui-ci. Cette région est commune à cinq des six isoformes du VEGF-A, à savoir VEGF-A206, VEGFA189, VEGF-A165, VEGF-A145 et VEGF-A121. Les inventeurs ont également testé un peptide ciblant le domaine de liaison au co- 20 recepteur NRP-1. Il est à remarquer que ce peptide, nommé Vpep2 (RCDKPRR, SEQ ID No 30), n'a pas permis d'obtenir l'effet thérapeutique espéré bien qu'il induise la production d'anticorps. Il est à noter que les peptides C et D décrits dans WO 00/53219 ciblent également ce domaine. Ainsi, de manière tout à fait surprenante, les inventeurs ont réussi à concevoir une 25 composition immunogène dirigée contre le VEGF-A, en particulier les isoformes VEGF-A206, VEGF-A189, VEGF-A165, VEGF-A145 et VEGF-A121, comprenant un peptide dont la séquence est issue de la région incluant la fin du feuillet bêta 7 (lorsque l'on considère VEGF-A165) et la boucle en aval. Les inventeurs considèrent que la boucle en aval du feuillet bêta 7 présente un intérêt tout particulier. Outre la capacité de cette composition à induire la production des 30 anticorps, elle serait capable de bloquer l'effet du VEGF-A. Par « aval » est entendu un élément placé du coté C-terminal par rapport au révérenciel. Par « amont » est entendu un élément placé du coté N-terminal par rapport au révérenciel.

La présente invention est donc relative à une composition immunogène comprenant un peptide comprenant la séquence (C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R (SEQ ID No 1). En particulier, cette séquence peut être choisie parmi le groupe consistant en C-E-C-R-P-K-K-D-R (SEQ ID No 5), C-E-S-R-P-K-K-D-R (SEQ ID No 6), S-E-C-R-P-K-K-D-R (SEQ ID No 7) et S-E-S- R-P-K-K-D-R (SEQ ID No 8). De préférence, le peptide a une longueur de 9 à 50 acides aminés, de préférence de 9 à 20 acides aminés. Dans un mode de réalisation particulier, cette séquence peut être choisie parmi le groupe consistant en C-E-S-R-P-K-K-D-R (SEQ ID No 6), S-E-C-R-P-K-K-D-R (SEQ ID No 7) et S-E-S-R-P-K-K-D-R (SEQ ID No 8).

Dans un mode de réalisation préféré, le peptide ne comprend pas la séquence C-D-K- P-R-R (SEQ ID No 2), en particulier ne comprend pas cette séquence en aval de la séquence (C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R (SEQ ID No 1). Dans un mode particulier, il ne comprend pas la séquence R-C-D-K-P-R-R (SEQ ID No 30). Dans un premier mode de réalisation particulier, le peptide comprend ou consiste en une séquence X-(R/K)-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-X-(K/R)-X-E-(N/K), X étant un acide aminé quelconque (SEQ ID No 3), ou une séquence comprenant 10 résidus consécutifs de SEQ ID No 3. De préférence, le peptide comprend ou consiste en une séquence (S/N)-(R/K)- (C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-(A/T)-(K/R)-(P/Q)-E-(N/K) (SEQ ID No 4), ou une séquence comprenant 10 résidus consécutifs de SEQ ID No 4. Dans un mode de réalisation particulier, le peptide comprend ou consiste en une séquence sélectionnée parmi S-R-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 9) S-R-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 10) S-R-C-E-C-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 11) S-R-C-E-S-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 12) S-R-S-E-C-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 13) S-R-S-E-S-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 14) S-R-C-E-C-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 15) S-R-C-E-S-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 16) S-R-S-E-C-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 17) S-R-S-E-S-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 18) N-K-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 19) N-K-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 20) N-K-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-K (SEQ ID No 21) N-K-C-E-C-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 22) N-K-C-E-S-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 23) N-K-S-E-C-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 24) N-K-S-E-S-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 25) N-K-C-E-C-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 26) N-K-C-E-S-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 27) N-K-S-E-C-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 28) N-K-S-E-S-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 29) ou une séquence comprenant 10 résidus consécutifs d'une séquence choisie parmi les SEQ ID Nos 9-29.

De préférence, le peptide pourra comprendre ou consister en une séquence sélectionnée parmi S-R-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 9) S-R-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 10) S-R-C-E-C-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 11) S-R-C-E-S-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 12) S-R-S-E-C-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 13) S-R-S-E-S-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 14) S-R-C-E-C-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 15) S-R-C-E-S-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 16) S-R-S-E-C-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 17) S-R-S-E-S-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 18) ou une séquence comprenant 10 résidus consécutifs d'une séquence choisie parmi les SEQ ID Nos 9-18. En particulier, le peptide pourra comprendre ou consister en une séquence sélectionnée 25 parmi S-R-C-E-C-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 15), S-R-C-E-S-R-P-K-K-D-R-TK-P-E-N (SEQ ID No 16) et une séquence comprenant 10 résidus consécutifs d'une séquence choisie parmi les SEQ ID Nos 15-16. De manière alternative, le peptide pourra comprendre ou consister en une séquence sélectionnée parmi 30 N-K-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 19) N-K-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 20) N-K-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-K (SEQ ID No 21) N-K-C-E-C-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 22) N-K-C-E-S-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 23) N-K-S-E-C-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 24) N-K-S-E-S-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 25) N-K-C-E-C-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 26) N-K-C-E-S-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 27) N-K-S-E-C-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 28) N-K-S-E-S-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 29) ou une séquence comprenant 10 résidus consécutifs d'une séquence choisie parmi les SEQ ID Nos 19-29. Facultativement, la composition immunogénique peut comprendre un peptide tel que défini ci-dessus. Alternativement, elle peut comprendre plusieurs peptides différents tels que définis ci-dessus. Le peptide selon la présente invention peut comprendre des acides aminés non-naturels. Par « acide aminé non-naturel » est entendu un analogue ou dérivé d'un acide aminé naturel. Ainsi, les isomères L et D des acides aminés sont envisagés. En effet, les isomères D ne sont pas sensibles aux protéases et la présente invention comprend également des peptides comprenant uniquement ou essentiellement des D acides aminés. Dans un mode particulier, les acides aminés L sont préférés. Les séquences peptidiques définies dans le présent document sont représentées avec le symbole en une lettre tel qu'indiqué ci-dessous: A Ala (alanine) ; R Arg (arginine) ; N Asn (asparagine) ; D Asp (acide aspartique) ; C Cys (cystéine) ; Q Gln (glutamine) ; E Glu (acide glutamique) ; G Gly (glycine) ; H His (histidine) ; I Ile (isoleucine) ; L Leu (leucine) ; K Lys (lysine) ; M Met (méthionine) ; F Phe (phénylalanine) ; P Pro (proline) ; S Ser (sérine) ; T Thr (thréonine) ; W Trp (tryptophane) ; Y Tyr (tyrosine) ; V Val (valine).

Par ailleurs, les ou des liaisons peptidiques du peptide selon la présente invention peuvent être modifiées pour les rendre résistantes à la protéolyse. Par exemple, au moins une liaison peptidique (-CO-NH-) peut être remplacée par une liaison telle que (-CH2-NH-), (-NET-CO-), (-CH2-0-), (-CH2-S-), (-CH2-CH2-), (-CO-CH2-), (-CHOH-CH2-), (-N=N-), et (- CH=CH-), par exemple. Facultativement, toutes les liaisons peptidiques peuvent être remplacées. Le peptide peut comprendre soit une extrémité C terminale carboxylique (-000-) ou amidée (-CONH2). Le peptide peut également être facultativement modifié à son extrémité N-terminale, par exemple par un radical acétyle.

En outre, le peptide selon la présente invention peut être modifié pour le rendre plus stable, et notamment plus résistant aux protéases. Ainsi, la molécule peut porter des groupements PEG (polyéthylèneglycol). Les procédés de PEGylation sont bien connus de l'homme du métier (Olson et al, 2009, Integrative Biology, 1(5-6): p. 382-393).

Dans la composition immunogène et de façon à augmenter la réponse immunitaire, le peptide peut être couplé à une protéine porteuse. De préférence, le couplage est covalent. Par exemple, la protéine porteuse pourra être choisie parmi la protéine Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), l'albumine sérique bovine (BSA), la protéine de liaison au maltose (MBP), l'ovalbumine, la flagelline, la thyroglobuline et la toxine tétanique (Tetanus Toxoid, TT). Dans un mode de réalisation, la protéine porteuse est la KLH. Les méthodes de conjugaison sont bien connues de l'homme du métier. On peut citer à titre d'exemples le couplage par le carbodiimide, celui par le glutaraldéhyde, par la benzidine bis-diazotée, ou par un maléimide. La réalisation de ces couplages pourra être facilitée par l'addition ou l'incorporation d'acides aminés à la séquence comme par exemple des résidus lysine, histidine, tyrosine ou cystéine. Un résidu facilitant le couplage pourra être facultativement ajouté à l'extrémité ou parmi les trois résidus formant l'extrémité du peptide. Il peut être ajouté à l'extrémité C-terminale du peptide ou à l'extrémité N-terminale. De préférence, il sera plutôt ajouté à l'extrémité N-terminale de celui-ci. Dans un mode de réalisation préféré, le résidu sera une cystéine. De façon alternative, le couplage peut également être envisagé sous forme de protéine de fusion qui peut être produite par génie génétique. Des couplages en réseau de type en candélabre ou à des molécules telles que la transferrine ou la ferritine peuvent être également mis en oeuvre pour stimuler efficacement la réponse immunitaire.

Les peptides selon l'invention peuvent être notamment produits par synthèse chimique ou par génie génétique ou par toute autre méthode adaptée. Facultativement, les peptides peuvent être cyclisés, au besoin en greffant un ou plusieurs acides aminés en bout de chaîne comme des cystéines pour créer un pont disulfure. Alternativement et de manière préférée, les peptides sont utilisés sous forme linéaire, c'est-à-dire non cyclisée.

Les peptides peuvent également être formulés avec des particules d'or ou dans des liposomes. La composition immunogène selon la présente invention peut comprendre facultativement un adjuvant. Des exemples non limitatifs d'adjuvants incluent l'adjuvant incomplet de Freund, l'adjuvant complet de Freund, des mannanes acétyles tels que l'acemannane, des copolymères polyoxyéthylène-polyoxypropylène comme le TITERMAXe, des adjuvants lipidiques modifiés, des adjuvants dérivés de saponine, Bordella pertusis tuée, un lipopolysaccharide (LPS) de bactérie gram (-), des anions polymériques de grande taille comme le sulfate de dextran, des gels inorganiques comme l'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate d'aluminium, et les oligodésoxynucléotides CpG. La composition peut également comprendre des supports pharmaceutiquement acceptables, des agents de préservation, des diluants, des émulsifiants, des excipients et/ou des agents stabilisants. La présente invention concerne un vaccin comprenant la composition immunogénique selon la présente invention. Elle concerne en outre la composition immunogénique selon la présente invention en tant que médicament, le peptide étant le principe actif Elle concerne enfin une composition pharmaceutique comprenant un peptide telle que défini ci-dessus. Cette composition peut comprendre en outre un autre principe actif La composition immunogène peut être administrée par toute voie appropriée, de 15 préférence par injection intramusculaire, intraveineuse, orale ou sous-cutanée. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain intervalle de temps. Par « quantité efficace » est entendue la quantité nécessaire pour provoquer une réponse immune lorsqu'elle est administrée au patient. De préférence, c'est la quantité 20 nécessaire pour provoquer une réponse immune lorsqu'elle est administrée au patient et pour prévenir ou diminuer la maladie traitée. Cette quantité peut être facilement déterminée par des expériences de routine. A titre d'exemple, la dose administrée peut aller par exemple de 1 à 1000 pg, notamment 10 à 500 lag par voie sous-cutanée. De préférence, la composition sera administrée 25 plusieurs fois. Par exemple, elle pourrait être administrée une fois par mois pendant trois mois, puis périodiquement en fonction du taux des anticorps sériques induits, par exemple tous les 2-6 mois. La composition selon la présente invention peut être utilisée pour le traitement des maladies dépendantes d'une angiogenèse accrue. Tout particulièrement, elle peut être utilisée 30 pour le traitement des maladies inflammatoires, de préférence les maladies inflammatoires chroniques. Ces maladies peuvent toucher tout particulièrement les articulations. Par exemple, les maladies inflammatoires peuvent être choisies parmi lesquelles les arthrites, les formes de lupus, les vascularites, les entérocolopathies inflammatoires, notamment la maladie de Crohn, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, et le psoriasis. De manière plus spécifique, elles peuvent être choisies parmi les spondylarthropathies et la polyarthrite rhumatoïde. Ces maladies inflammatoires peuvent être des maladies auto-immunes. La composition peut également être utilisée pour le traitement des maladies prolifératives. En particulier, les maladies prolifératives peuvent être des cancers ou des tumeurs bénignes. De préférence, les cancers sont des tumeurs solides. Dans le cadre du traitement des maladies inflammatoires, la composition pourra comprendre en outre un autre principe actif, par exemple un actif anti-inflammatoire. Dans le cadre du traitement d'un cancer, la composition pourra comprendre en outre un autre principe actif, par exemple un agent antitumoral.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un peptide tel que défini ci- dessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies dépendantes d'une angiogenèse accrue. En particulier, les maladies sont telles que définies ci-dessus. La présente invention est enfin relative à une méthode de traitement d'un patient souffrant d'une maladie dépendante d'une angiogenèse accrue, comprenant l'administration d'une dose thérapeutiquement efficace du peptide tel que défini dans ci-dessus. En particulier, les maladies sont telles que définies ci-dessus. Dans le contexte de la présente invention, le terme « traitement » ou « traiter » inclut le traitement préventif, curatif, palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression de la maladie, réduction de la croissance tumorale, diminution de la taille des tumeurs, la prévention ou la diminution des métastases et des rechutes etc.). D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

Exemples Dans la présente invention, les inventeurs ont commencé par créer des vaccins antiVEGF-A, basés sur l'utilisation de peptides synthétiques issus de la séquence de la cytokine murine, qui ont été rendus immunogènes par couplage à la KLH. Ils ont cherché à limiter l'interaction du VEGF-A avec l'un de ses co-récepteurs, la neuropiline-1 (NP-1), qui semble être particulièrement impliquée dans l'angiogenèse pathologique [Kong et al. 2010; Jubb et al. 2012]. Ils ont postulé que cette approche présentait potentiellement moins d'effets secondaires, notamment sur la cicatrisation. Pour la mettre en place, ils ont défini des séquences dans la zone d'interaction du VEGF-A avec NP-1, ont synthétisé des peptides correspondant à ces séquences, les ont purifiés, analysés, couplés à la KLH. Ils ont ensuite testé leur efficacité dans un modèle expérimental d'arthrite. Ces résultats sur la souris semblent transposables à l'homme puisque seuls 19 résidus d'acide aminé diffèrent entre le VEGF-A164 de souris et son équivalent chez l'homme, le 5 VEGF-A165. Matériel et méthodes Choix de la séquence peptidique: Des séquences peptidiques ont été sélectionnées dans la séquence du VEGF-Al 10 (VEGF-A164) de souris. Le choix de la séquence du peptide Vpepl a été motivé par des données de la littérature concernant des peptides antagonistes de la liaison du VEGF-A au corécepteur NRP-1. De plus, le peptide Vpepl (SRCECRPKKDRTKPEN (SEQ ID NO 15), 16aa (acides aminés), position 98-113 dans la séquence du VEGF-A164), présentait l'avantage d'être localisé dans une région commune avec deux autres isoformes du VEGF-A de souris: 15 VEGF-A2 (VEGF-A120) et VEGF-A3 (VEGF-A188). La structure tridimensionnelle du VEGF- A164 de souris n'est pas décrite, contrairement à celle du VEGF-A165 humain [Muller et al. 1997; Iyer et al. 2001]. Les séquences protéiques des deux espèces présentent 90% d'identité et 93% d'homologie. Seuls 19 résidus d'acide aminé diffèrent entre les VEGF-A164 et VEGF- A165 des deux espèces. Par homologie de séquence, Vpepl se trouverait «à cheval » entre 20 l'exon 4 et l'exon 5 dans la zone de clivage par la plasmine. Le peptide Vpep2 (RCDKPRR (SEQ ID NO 30), 7aa) correspond aux 7 derniers résidus d'acide aminé du VEGF-A164 (position 158-164 dans la séquence du VEGF-A164). Le choix de ce court peptide tenait compte des travaux d'une équipe ayant travaillé sur un peptide homologue, antagoniste de la liaison du VEGF-A165 humain à NP-1 [Starzec et al. 2006]. La séquence de Vpep2 est 25 commune avec le VEGF-A165 humain. Préparation du vaccin: Lors de la synthèse du peptide Vpepl, le résidu cystéine en position 5 a été muté en sérine (SRCESRPKKDRTKPEN (SEQ ID NO 16)) afin de ne réaliser le couplage à la KLH qu'avec le résidu cystéine en position 3. L'hétéro-complexe ainsi formé a été nommé Vpepl- 30 K. De façon similaire, Vpep2-K était issu du couplage de Vpep2 à la KLH via son résidu cystéine en position 2. Vaccination dans un modèle d'arthrite expérimentale au collagène: Des souris DBA/1 mâles, sensibles à l'induction des arthrites par du collagène II bovin (CIIb), ont été vaccinées par Vpepl-K, Vpep2-K ou les contrôles KLH et PBS (13 souris par groupe). Trois injections intramusculaires de vaccins émulsionnés en adjuvant incomplet de Freund (IFA) ont été pratiquées avant l'induction de l'arthrite expérimentale au collagène (ABC), puis deux autres après cette induction (Figure 1). Dans ce modèle, les arthrites ont été induites par deux injections sous-cutanées de CM à la base de la queue. Le collagène a été émulsionné en CFA (adjuvant complet de Freund) lors de la première injection (JO) et en IFA lors du rappel à J21. Résultats ELISA anticorps anti-peptides La production d'anticorps anti-peptides a été analysée par ELISA dans les sera collectés au sacrifice pour les différents groupes de souris. L'injection des peptides couplés à la KLH (Vpepl-K et Vpep2-K) a entrainé une forte production d'anticorps reconnaissant spécifiquement le peptide cible. Il n'y avait pas de reconnaissance croisée entre les deux vaccins, ni de production d'anticorps anti-peptides détectable dans les groupes PBS ou KLH contrôles (Figure 2). L'observation clinique régulière des articulations des pattes de souris a conduit à l'établissement d'un score cumulé pour chaque souris. Le score moyen des quatre groupes de souris est représenté dans la Figure 3. Comme le montre la Figure 3, Vpepl-K a limité significativement le développement 20 des arthrites chez la DBA/1. Dans le même temps, Vpep2-K n'a eu aucune incidence sur le développement des arthrites en comparaison avec les deux groupes contrôles KLH et PB S. Le VEGF pouvant jouer un rôle important dans la phase précoce de développement des arthrites, les inventeurs ont recherché s'il existait des différences entre les groupes dans l'apparition des premiers signes cliniques d'arthrite. 25 Comme le montre la figure 4, l'analyse de la cinétique d'apparition des arthrites a montré que, contrairement à Vpep2-K, la vaccination par Vpepl-K a permis de retarder significativement l'initiation des arthrites de 4,7 jours par rapport aux souris contrôle KLH. (Moyennes des groupes: Vpepl-K 33,8 ± 1,6 jours; Vpep2-K 29,1 ± 0,5 jours; PB S 29,5 ± 1,2 jours; KLH 29,1 ± 0,9 jours). 30 Enfin, l'analyse histologique de coupes de patte a été réalisée sur les souris au sacrifice (Figure 5). Comme on peut le voir sur cette figure, contrairement à Vpep2-K, la vaccination par Vpepl-K a réduit de façon spectaculaire l'inflammation articulaire (Vpepl-K 2,0 ± 0,2 versus KLH 1,0 ± 0,2; p<0,0001 Mann Whitney) et la destruction articulaire (Vpepl-K 1,4 ± 0,2 versus KLH 0,7 ± 0,2; p<0,0001 Mann Whitney).

Résumé / conclusion Les travaux réalisés dans cette étude ont montré pour la première fois qu'une approche vaccinale basée sur des peptides du VEGF pouvait limiter le développement des arthrites.

L'utilisation de peptides synthétiques présente l'avantage d'être plus aisée que la manipulation de la cytokine entière, d'être moins coûteuse, et surtout de permettre de cibler spécifiquement l'interaction de certains isoformes du VEGF avec l'un de ses récepteurs ou co-récepteurs. Dans cette étude, les inventeurs ont cherché à limiter l'interaction du VEGF avec l'un de ses co-récepteurs: la neuropiline-1 (NRP-1). La séquence du peptide Vpepl (16aa) a été choisie en amont d'une séquence impliquée dans l'interaction du VEGF avec NP-1 [Zachary et al. 2006], et correspond aux derniers résidus d'acide aminé communs entre les isoformes du VEGF-A 164, 120 et 188 de souris. De plus, cette séquence est comprise dans le fragment polypeptidique humain VEGF111-165 obtenu après clivage du VEGF165 humain par la plasmine. Ce fragment est un antagoniste de la liaison du VEGF à NRP-1 exprimé par des synoviocytes de patients atteints de PR [Kong et al. 2010]. Dans ce contexte, la vaccination précoce des souris par l'hétérocomplexe Vpepl-K s'est révélée efficace dans le modèle d'arthrite expérimentale au collagène, sans pour autant induire d'effet secondaire détectable. Vpep2 correspond à une séquence peptidique plus petite (7 aa), décrite comme ayant des propriétés antagoniste de la liaison du VEGF165 humain à son co-recepteur NRP-1 [Starzec et al. 2006]. L'hétérocomplexe Vpep2-K formé avec la KLH a bien induit la formation d'anticorps après vaccination, mais ceux-ci n'a exercé aucune influence sur le développement des arthrites. La taille du peptide cible limite le nombre d'épitopes. La réponse anticorps, très spécifique, qui a été générée, n'est pas protectrice. Reférences * Bertin-Maghit SM, et al. Vaccine.

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2006 May 12;281(19):13493-502.

Claims (11)

1. REVENDICATIONS1- Composition immunogénique comprenant un peptide comprenant la séquence (C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R (SEQ ID No 1), et ne comprenant pas la séquence C- D-K-P-R-R (SEQ ID No
2. 2). 2- Composition immunogénique selon la revendication 1, dans laquelle le peptide a une longueur de 9 à 50 acides aminés, de préférence de 9 à 20 acides aminés.
3. 3- Composition immunogénique selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le peptide comprend ou consiste en une séquence X-(R/K)-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-KD-R-X-(K/R)-X-E-(N/K), X étant un acide aminé quelconque (SEQ ID No 3), ou une séquence comprenant 10 résidus consécutifs de SEQ ID No 3.
4. 4- Composition immunogénique selon l'une quelconque des revendications 1-3, dans laquelle le peptide comprend ou consiste en une séquence (S/N)-(R/K)-(C/S)-E(C/S)-R-P-K-K-D-R-(A/T)-(K/R)-(P/Q)-E-(N/K) (SEQ ID No 4), ou une séquence comprenant 10 résidus consécutifs de SEQ ID No 4.
5. 5- Composition immunogénique selon l'une quelconque des revendications 1-4, dans laquelle le peptide comprend ou consiste en une séquence sélectionnée parmi C-E-C-R-P-K-K-D-R (SEQ ID No 5) C-E-S-R-P-K-K-D-R (SEQ ID No
6. 6) S-E-C-R-P-K-K-D-R (SEQ ID No7) S-E-S-R-P-K-K-D-R (SEQ ID No 8) 6- Composition immunogénique selon l'une quelconque des revendications 1-4, dans laquelle le peptide comprend ou consiste en une séquence sélectionnée parmi S-R-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 9) S-R-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 10) S-R-C-E-C-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 11) S-R-C-E-S-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 12) S-R-S-E-C-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 13) S-R-S-E-S-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-(N/K) (SEQ ID No 14)S-R-C-E-C-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 15) S-R-C-E-S-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 16) S-R-S-E-C-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 17) S-R-S-E-S-R-P-K-K-D-R-T-K-P-E-N (SEQ ID No 18) N-K-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 19) N-K-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 20) N-K-(C/S)-E-(C/S)-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-K (SEQ ID No 21) N-K-C-E-C-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 22) N-K-C-E-S-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 23) N-K-S-E-C-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 24) N-K-S-E-S-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-(N/K) (SEQ ID No 25) N-K-C-E-C-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 26) N-K-C-E-S-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 27) N-K-S-E-C-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 28) N-K-S-E-S-R-P-K-K-D-R-A-R-Q-E-N (SEQ ID No 29) ou une séquence comprenant 10 résidus consécutifs d'une séquence choisie parmi les SEQ ID Nos 9-29.
7. 7- Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le peptide est couplé à une protéine porteuse, de préférence la KLH.
8. 8- Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes à titre de médicament.
9. 9- Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes pour une utilisation pour le traitement d'une maladie dépendante d'une angiogenèse accrue.
10. 10- Composition selon la revendication 9 pour une utilisation dans le traitement d'une maladie inflammatoire, en particulier une maladie inflammatoire chronique, ou une maladie proliférative.
11. 11- Composition selon la revendication 9 ou 10 pour une utilisation dans le traitement d'une maladie inflammatoire chronique, de préférence sélectionnée parmi la polyarthrite rhumatoïde et les spondylarthropathies.35