KR102468907B1 - 질환의 요인이 되는 생체내 단백질을 표적으로 하는 컨쥬게이트 백신 - Google Patents

질환의 요인이 되는 생체내 단백질을 표적으로 하는 컨쥬게이트 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, DPP4, IL-17A, IgE, S100A9, PCSK9 등의 질환의 요인이 되는 생체내 단백질의 에피토프와의 복합체를 포함하고, 캐리어 단백질의 항원성이 낮고 또한 백신으로서 유효한 항체 산생능을 갖는 백신을 제공한다.

Description

질환의 요인이 되는 생체내 단백질을 표적으로 하는 컨쥬게이트 백신
본 발명은 질환의 요인이 되는 생체내 단백질을 표적으로 하는 컨쥬게이트 백신에 관한 것이다.
천연두 등의 감염증의 예방에 예로부터 사용되어 온 백신의 기술을 암이나 생활습관병 등의 치료에 이용하는 시도가 행해지고 있다. 이러한 치료용 백신으로는, 표적 단백에 대한 항체 유도 등의 면역유도를 야기하는 부위(에피토프 부위)를 캐리어 단백질에 결합하여 사용하는 경우가 있다. 이러한 캐리어 단백으로는 KLH(Keyhole limpet hemocyanin: 스카시가이헤모시아닌), OVA(Ovalbumin: 오브알부민), BSA(Bovine serum albumin: 소혈청알부민) 등이 알려져 있다. 예를 들면, INF-α의 개변체를 항원부위로서 사용하여 KLH에 결합한 것을 투여하여 전신성 홍반루프스(SLE)를 치료하는 것이 시도되고 있다(비특허문헌 1).
그렇지만, KLH, OVA, BSA 등은 그것 자체가 항원성을 가지고 있어, 항원성이 높지 않은 에피토프를 컨쥬게이트하여 면역하는 경우에, 캐리어 단백 자체의 항원성이 문제가 되는 경우가 있다(비특허문헌 2).
본 발명자들은 DPP4의 에피토프 펩타이드와 KLH와의 컨쥬게이트를 당뇨병의 예방 또는 치료에 사용하는 것을 개시한 바 있다(특허문헌 1). 또한, 본 발명자들은 IL-17A의 에피토프 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 B형 간염의 바이러스 코어 항원 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 백신을, IL-17A가 증악인자(增惡因子)로서 관여하는 질환(전신성 홍반루프스(SLE), 류마티스 관절염 등)의 예방 또는 치료에 사용하는 것을 개시한 바 있다(특허문헌 2).
특허문헌 1: WO2015/033831 특허문헌 2: WO2015/099167
비특허문헌 1: ARTHRITIS & RHEUMATISM Vol. 65, No.2, February 2013, pp 447-456. 비특허문헌 2: N.E. van Houten, M.B. Zwick1, A. Menendez, and J.K. Scott Vaccine. 2006 May 8; 24(19): 4188-4200.
본 발명은 질환의 요인이 되는 생체내 단백질의 에피토프에 캐리어 단백질을 연결한 복합체를 함유하는 백신으로서, 캐리어 단백질의 항원성이 낮고 또한 백신으로서 유효한 항체 산생능을 갖는 백신을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여 이하의 각 발명을 포함한다.
[1] 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, 질환의 요인이 되는 생체내 단백질의 에피토프와의 복합체를 포함하는 백신.
[2] 생체내 단백질이 DPP4, IL-17A, IgE, S100A9 및 PCSK9로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인 상기 [1]에 기재된 백신.
[3] IL-17A의 에피토프가 서열번호 10, 11, 29∼36 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 10, 11, 29∼36 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 있어서 1 또는 2개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 상기 [2]에 기재된 백신.
[4] DPP4의 에피토프가 서열번호 2∼9 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 2∼9 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 있어서 1 또는 2개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 상기 [2]에 기재된 백신.
[5] IgE의 에피토프가 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 있어서 1 또는 2개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 상기 [2]에 기재된 백신.
[6] S100A9의 에피토프가 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 있어서 1 또는 2개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 상기 [2]에 기재된 백신.
[7] PCSK9의 에피토프가 서열번호 14∼16 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 14∼16 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 있어서 1 또는 2개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 상기 [2]에 기재된 백신.
[8] 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 생체내 단백질의 에피토프가 ε-아미노카프론산을 매개로 하여 연결되어 있는 상기 [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 백신.
[9] 상기 복합체의 N 말단의 아미노산이 아세틸화되어 있는 상기 [1]∼[8] 중 어느 하나에 기재된 백신.
[10] 상기 복합체의 C 말단의 아미노산이 아미드화되어 있는 상기 [1]∼[9] 중 어느 하나에 기재된 백신.
[11] 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, 질환의 요인이 되는 생체내 단백질의 에피토프와의 복합체를 포함하는 면역원성 조성물.
[12] 생체내 단백질이 DPP4, IL-17A, IgE, S100A9 및 PCSK9로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인 상기 [11]에 기재된 면역원성 조성물.
[13] 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, 질환의 요인이 되는 생체내 단백질의 에피토프와의 복합체의 유효량을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 생체내 단백질이 요인이 되는 질환의 예방 또는 치료 방법.
[14] 생체내 단백질이 요인이 되는 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, 상기 생체내 단백질의 에피토프와의 복합체.
[15] 생체내 단백질이 요인이 되는 질환의 예방 또는 치료용 의약을 제조하기 위한, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, 상기 생체내 단백질의 에피토프와의 복합체의 사용.
본 발명에 의해, 캐리어 단백질의 항원성이 낮고 또한 백신으로서 유효한 항체 산생능을 갖는, 질환의 요인이 되는 생체내 단백질의 에피토프에 캐리어 단백질을 연결한 복합체를 함유하는 백신을 제공할 수 있다.
[도 1] OSK-1 펩타이드(서열번호 1)와 마우스 DPP4의 에피토프 펩타이드(서열번호 17)를 ε-Acp를 링커로 하여 연결한 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트에 의한 항체 산생 작용을 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 2] OSK-1-DPP4 컨쥬게이트의 항체 산생 작용과, KLH와 마우스 DPP4의 에피토프 펩타이드(서열번호 17)와의 컨쥬게이트(KLH-DPP4)의 항체 산생 작용을 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 3] OSK-1-DPP4 컨쥬게이트에 의해 산생된 IgG의 서브클래스를 해석하고, KLH-DPP4 컨쥬게이트와 Alum 병용군 및 KLH-DPP4 컨쥬게이트와 OSK-1 병용군과 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 4] OSK-1 펩타이드(서열번호 1)와 WT1 펩타이드(서열번호 28)를 ε-Acp를 링커로 하여 컨쥬게이트한 OSK-1-WT1 컨쥬게이트를 미리 투여한 마우스에 암세포를 피하이식하고, 종양 증식 억제 효과를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 5] OSK-1-WT1 컨쥬게이트를 미리 투여한 마우스에 암세포를 피하이식하고, 연명 효과를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 6] 마우스에 암세포를 피하이식하고, 이식과 동일한 날로부터 OSK-1-WT1 컨쥬게이트의 투여를 개시한 경우의 종양 증식 억제 효과를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 7] 마우스에 암세포를 피하이식하고, 이식과 동일한 날로부터 OSK-1-WT1 컨쥬게이트의 투여를 개시한 경우의 연명 효과를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 8] OSK-1-DPP4 컨쥬게이트에 의한 표적 단백에 대한 IgE 산생을 KLH-DPP4 컨쥬게이트에 의한 표적 단백에 대한 IgE 산생과 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 9] OSK-1 펩타이드와 마우스 IL-17A의 에피토프 펩타이드(서열번호 21)를 ε-Acp를 링커로 하여 컨쥬게이트한 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트의 (A) 아미노산분석 결과 및 (B) HPLC 분석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 10] OSK-1 펩타이드와 마우스 IL-17A의 에피토프 펩타이드(서열번호 31)를 ε-Acp를 링커로 하여 컨쥬게이트한 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트의 (A) 아미노산분석 결과 및 (B) HPLC 분석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 11] OSK-1 펩타이드와 마우스 IL-17A의 에피토프 펩타이드(서열번호 32)를 ε-Acp를 링커로 하여 컨쥬게이트한 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트의 (A) 아미노산분석 결과 및 (B) HPLC 분석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 12] OSK-1 펩타이드와 마우스 IL-17A의 에피토프 펩타이드(서열번호 40)를 ε-Acp를 링커로 하여 컨쥬게이트한 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트의 (A) 아미노산분석 결과 및 (B) HPLC 분석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 13] OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트에 의한 항체 산생 작용을 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 14] 이미퀴모드(imiquimod) 유발성 건선성 피부염 모델 마우스의 피부상태에 의해, OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트의 약효를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 15] 이미퀴모드 유발성 건선성 피부염 모델 마우스의 귀 두께에 의해, OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트의 약효를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 16] OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트 또는 KLH-IL-17A 컨쥬게이트를 투여한 이미퀴모드 유발성 건선성 피부염 모델 마우스의 건선 유도 개시로부터 6일째의 피부상태를 나타내는 도면이다.
[도 17] 이미퀴모드 유발성 건선성 피부염 모델 마우스의 피부상태에 의해, OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트와 KLH-IL-17A 컨쥬게이트의 약효를 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 18] 이미퀴모드 유발성 건선성 피부염 모델 마우스의 귀 두께에 의해, OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트와 KLH-IL-17A 컨쥬게이트의 약효를 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 19] OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트 또는 KLH-IL-17A 컨쥬게이트를 투여한 이미퀴모드 유발성 건선성 피부염 모델 마우스의 건선 유도 개시로부터 12일째의 피부를 인볼루크린(involucrin) 염색한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 20] OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트 또는 KLH-IL-17A 컨쥬게이트를 투여한 이미퀴모드 유발성 건선성 피부염 모델 마우스의 건선 유도 개시로부터 12일째의 피부를 F4/80 염색한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 21] OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트 또는 KLH-IL-17A 컨쥬게이트를 투여한 이미퀴모드 유발성 건선성 피부염 모델 마우스의 건선 유도 개시로부터 12일째의 피부를 Gr-1 염색한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 22] OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트 또는 KLH-IL-17A 컨쥬게이트를 투여한 이미퀴모드 유발성 건선성 피부염 모델 마우스에 있어서의 혈중 IL-17 농도를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 23] 혈중 PCSK9 농도에 의해, OSK-1-PCSK9 컨쥬게이트의 약효를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명은 질환의 요인이 되는 생체내 단백질을 표적으로 하는 컨쥬게이트 백신을 제공한다. 본 발명의 백신은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열(ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK)과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, 질환의 요인이 되는 생체내 단백질의 에피토프와의 복합체를 포함하는 백신이 바람직하다. 본 명세서에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 OSK-1 펩타이드 또는 OSK-1이라고 기재하는 경우가 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 「컨쥬게이트」와 「복합체」는 동의어로 사용된다.
본 명세서에 있어서, 「백신」은 동물에게 투여함으로써 면역반응을 야기하는 면역원을 포함하는 조성물을 의미한다. 이 때문에, 본 발명의 백신은 면역원성 조성물로 환언할 수 있다. 본 발명의 백신은 예방적으로 투여되는 것에 한정되지 않고, 질환이 발증(發症)한 후에 치료적으로 투여되는 것일 수도 있다.
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로는, 예를 들면, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼4개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 들 수 있다. 바람직하게는 1∼3개, 더욱 바람직하게는 1∼2개, 더더욱 바람직하게는 1개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열이다. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 실질적으로 동질의 활성을 갖는 펩타이드가 바람직하다. 구체적으로는, 생체내 단백질의 에피토프와의 복합체에 의한 항체 산생능이, 동일한 생체내 단백질의 에피토프와 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와의 복합체에 의한 항체 산생능과 동등(예를 들면, 약 0.5∼2배)인 것을 들 수 있다.
질환의 요인이 되는 생체내 단백질은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, DPP4, IL-17A, IgE, S100A9, PCSK9 등을 들 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 「생체내 단백질」은 내재성 단백질(endogenous protein)을 의미한다.
DPP4(디펩티딜 펩티다아제-4: Dipeptidyl Peptidase-4)는 인슐린 분비에 관련되는 인크레틴(incretin)을 분해하는 효소이다. 인크레틴은 식사후 등의 고혈당 시에 있어서 인슐린 분비를 촉진하고, 혈당치를 저하시키는 소화관 호르몬이다. 여기에서, DPP4의 기능을 저해하여 인크레틴의 분해를 억제하면, 인크레틴 농도가 상승하고, 인슐린 분비가 촉진되어 당뇨병의 증상을 개선할 수 있다. 이 때문에, 다수의 DPP4 저해약이 당뇨병 치료약으로서 개발, 승인되고 있다. 따라서, 항DPP4 항체를 유도하는 백신에 의해 당뇨병을 치료하는 것을 기대할 수 있다.
OSK-1-DPP4 컨쥬게이트에 사용되는 인간 DPP4의 에피토프는 DPP4의 기능을 저해하는 항체(중화 항체)를 산생가능한 에피토프라면 특별히 한정되지 않지만, 이하의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 바람직하게 사용할 수 있다.
· ENSTFDEFG (서열번호 2)
· NKRQLITEE (서열번호 3)
· KNTYRLKLYS (서열번호 4)
· YSDESLQYPK (서열번호 5)
· PPHFDKSKKY (서열번호 6)
· GLPTPEDNLD (서열번호 7)
· FSKEAKYYQ (서열번호 8)
· NSSVFLENSTFDEFG (서열번호 9)
한편, 인간 DPP4의 아미노산 서열 및 인간 DPP4을 코딩하는 유전자의 염기 서열의 억세션(accession) 번호는 각각 NP_001926(NCBI) 및 NM_001935(NCBI)이다.
또한, 상기 서열번호 2∼9 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 있어서, 1 또는 2개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, DPP4의 기능을 저해하는 항체를 산생가능한 펩타이드도, OSK-1-DPP4 컨쥬게이트에 사용되는 인간 DPP4의 에피토프로서 바람직하다.
IL-17A (인터루킨17A: interleukin-17A)는 호모 2량체 당단백질이며, 단순히 IL-17이라고도 칭해진다. IL-17A는 주로 활성화 T세포에 의해 산생되어, 섬유아세포, 상피세포, 혈관내피세포, 마크로파지 등 광범위한 세포에 작용하고, 염증성 사이토카인, 케모카인, 세포접착인자 등의 다양한 인자를 유도하여 염증을 유도하는 것이 알려져 있다. 인간형 항인간 IL-17A 단일클론항체(세쿠키누맙(secukinumab))은 심상성 건선 및 관절증성 건선의 치료약으로서 사용되고 있다. 또한, IL-17A는 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장 질환 등의 자기면역질환, 비소세포성 폐암, 대장암, 췌장암을 비롯한 다양한 암, 동맥경화증 등에 관여하는 것이 보고되어 있다. 따라서, 항IL-17A 항체를 유도하는 백신에 의해, 이들의 IL-17A가 관여하는 질환을 치료하는 것을 기대할 수 있다.
OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트에 사용되는 인간 IL-17A의 에피토프는 IL-17A의 기능을 저해하는 항체(중화 항체)를 산생가능한 에피토프라면 특별히 한정되지 않지만, 이하의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 바람직하게 사용할 수 있다.
· RSSDYYNR (서열번호 10)
· PKRSSDYYNRSTSPW (서열번호 11)
· CPNSEDKNFPR (서열번호 29)
· RNEDPERYPS (서열번호 30)
· NRSTSPW (서열번호 31)
· LHRNEDP (서열번호 32)
· RYPSVIWEA (서열번호 33)
· PKRSSDYYNR (서열번호 34)
· TNPKRSSDYYNR (서열번호 35)
· TNTNPKRSSDYYNR (서열번호 36)
한편, 인간 IL-17A의 아미노산 서열 및 인간 IL-17A를 코딩하는 유전자의 염기 서열의 억세션 번호는 각각 NP_002181(NCBI) 및 NM_002190(NCBI)이다.
또한, 상기 서열번호 10, 11, 29∼36 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 있어서, 1 또는 2개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, IL-17A의 기능을 저해하는 항체를 산생가능한 펩타이드도, OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트에 사용되는 인간 IL-17A의 에피토프로서 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열의 제3-10 위치의 아미노산 서열을 포함하는 부분 서열로 이루어진 펩타이드도, OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트에 사용되는 인간 IL-17A의 에피토프로서 바람직하다.
알러지는 특정한 물질(알러겐)에 의해 야기되며, 알러겐이 체내에 들어오면 면역계가 작동하여 IgE가 산생된다. 산생된 IgE 항체는 비만세포나 호염기구에 결합한 상태로 보유되고, 다시 알러겐이 체내에 들어오면 IgE와 알러겐이 결합하여 히스타민이나 류코트리엔과 같은 케미컬 메디에이터가 방출되어 알러지 증상을 야기한다. 어떤 알러겐에 대하여 알러지를 발증하는 경우, 그 알러겐에 대한 특이적IgE가 과잉으로 산생되어, 이것에 의해 알러지 증상은 악화되어 간다. IgE의 활동을 저해하거나 또는 무효화함으로써 알러지 증상을 완화하는 것이 가능하며, 항인간 IgE 항체(오말리주맙(omalizumab))가 기관지천식의 치료에 사용되고 있다. 따라서, 항IgE 항체를 유도하는 백신에 의해 기관지천식, 화분증(花粉症), 알러지성 결막염, 아토피성 피부염 등의 알러지 질환을 치료하는 것을 기대할 수 있다.
OSK-1-IgE 컨쥬게이트에 사용되는 인간 IgE의 에피토프는, IgE의 기능을 저해하는 항체(중화 항체)를 산생가능한 에피토프라면 특별히 한정되지 않지만, 이하의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 바람직하게 사용할 수 있다.
· YQCRVTHPHLP (서열번호 12)
한편, 인간 면역 글로불린 ε쇄 정상영역의 아미노산 서열 및 인간 면역 글로불린 ε쇄 정상영역을 코딩하는 유전자의 염기 서열의 억세션 번호는 각각 P01854(UniProtKB) 및 NG_001019(NCBI)이다.
또한, 상기 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 있어서, 1 또는 2개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, IgE의 기능을 저해하는 항체를 산생가능한 펩타이드도, OSK-1-IgE 컨쥬게이트에 사용되는 인간 IgE의 에피토프로서 바람직하다.
S100 단백질은 세포종 특이적으로 발현되는 2개의 EF-hand를 갖는 칼슘 결합성 단백질이며, 현재까지 20종류의 서브패밀리가 확인되고 있다. S100A9(MRP14라고도 칭해진다.)는 저분자량 칼슘 결합성 S100 단백질에 속하며, 다양한 염증성 질환에 관련되는 것이 알려져 있다. 또한, 세포성 동맥염, 낭포성 섬유증, 만성 류마티스 관절염, 피부병, 만성 염증성 장 질환, 만성 기관지염, 몇 가지의 악성 종양, 및 자기면역질환을 포함하는 수많은 염증성 질환의 환자에 있어서, S100A9 혈청 수준이 항진되는 것이 밝혀져 있다. 또한, S100A9을 차단하면, 출혈의 리스크를 높이지 않고 혈전이 예방될 가능성이 있는 것이 보고되어 있다. 따라서, 항S100A9 항체를 유도하는 백신에 의해, 아테롬 혈전증, 심근경색이나 뇌경색에 있어서의 혈전 형성을 예방하는 것을 기대할 수 있다.
OSK-1-S100A9 컨쥬게이트에 사용되는 인간 S100A9의 에피토프는, S100A9의 기능을 저해하는 항체(중화 항체)를 산생가능한 에피토프라면 특별히 한정되지 않지만, 이하의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 바람직하게 사용할 수 있다.
· GHHHKPGLGE (서열번호 13)
한편, 인간 S100A9의 아미노산 서열 및 인간 S100A9을 코딩하는 유전자의 염기 서열의 억세션 번호는 각각 NP_002956(NCBI) 및 NM_002965(NCBI)이다.
또한, 상기 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 있어서, 1 또는 2개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, S100A9의 기능을 저해하는 항체를 산생가능한 펩타이드도, OSK-1-S100A9 컨쥬게이트에 사용되는 인간 S100A9의 에피토프로서 바람직하다.
PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)은 가족성 고콜레스테롤혈증의 원인 유전자인 것이 동정되었으며, 그 후의 연구로부터 PCSK9은 간세포 표면에 발현되는 LDL 수용체를 분해하고, 간장이 혈중의 LDL-C를 유입하는 능력을 저하시키는 것이 알려져 있다. PCSK9의 기능을 저해하는 것에 의해, LDL 수용체의 분해를 억제하고, 혈중 콜레스테롤의 간장으로의 유입을 촉진함으로써 혈중 콜레스테롤 수치를 저하시키는 것이 가능하다. 항인간 PCSK9 단일클론항체(에볼로쿠맙(evolocumab))이 가족성 고콜레스테롤혈증 및 고콜레스테롤혈증의 치료에 사용되고 있으며, PCSK9의 기능을 저해하는 RNAi 의약이 개발되고 있다. 따라서, 항PCSK9 항체를 유도하는 백신에 의해, 고콜레스테롤혈증을 치료하는 것을 기대할 수 있다.
OSK-1-PCSK9 컨쥬게이트에 사용되는 인간 PCSK9의 에피토프는, PCSK9의 기능을 저해하는 항체(중화 항체)를 산생가능한 에피토프라면 특별히 한정되지 않지만, 이하의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 바람직하게 사용할 수 있다.
· LRPRGQPNQC (서열번호 14)
· SRHLAQASQ (서열번호 15)
· SRSGKRRGER (서열번호 16)
한편, 인간 PCSK9의 아미노산 서열 및 인간 PCSK9을 코딩하는 유전자의 염기 서열의 억세션 번호는 각각 NP_777596(NCBI) 및 NM_174936(NCBI)이다.
또한, 상기 서열번호 14∼16 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 있어서, 1 또는 2개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, PCSK9의 기능을 저해하는 항체를 산생가능한 펩타이드도, OSK-1-PCSK9 컨쥬게이트에 사용되는 인간 PCSK9의 에피토프로서 바람직하다.
한편, 본 발명의 백신 효과를 확인하기 위하여, 실험동물(마우스 등)을 사용하여 실험을 행하는 경우, 상기의 인간 에피토프 서열에 대응하는 실험동물의 에피토프 서열을 사용하여 실험을 행하는 것이 바람직하다. 사용하는 실험동물의 대응하는 에피토프 서열은, 공지의 데이터베이스(NCBI 등)를 사용하여 표적 단백질의 아미노산 서열을 취득하고, 대응하는 인간의 아미노산 서열과 얼라인먼트(alignment)함으로써 설계할 수 있다. 표 1에, 상기 서열번호 2∼16의 인간 에피토프 서열에 대응하는 마우스 에피토프 서열을 나타낸다.
Figure 112018096507550-pct00001
표 1에 있어서, 인간 DPP4의 전장 아미노산 서열은 NP_001926, 마우스 DPP4의 전장 아미노산 서열은 AAH22183, 인간 IL-17A의 전장 아미노산 서열은 NP_002181, 마우스 IL-17A의 전장 아미노산 서열은 NP_034682, 인간 IgE의 전장 아미노산 서열은 P01854, 마우스 IgE의 전장 아미노산 서열은 P06336, 인간 S100A9의 전장 아미노산 서열은 NP_002956, 마우스 S100A9의 전장 아미노산 서열은 CAC14292, 인간 PCSK9의 전장 아미노산 서열은 NP_777596, 마우스 PCSK9의 전장 아미노산 서열은 NP_705793의 각 억세션 번호로 등록되어 있는 아미노산 서열에 근거한다.
본 발명의 백신에 사용되는 생체내 단백질의 에피토프 크기는 특별히 한정되지 않지만, 20 아미노산 이하가 바람직하고, 15 아미노산 이하가 더욱 바람직하고, 13 아미노산 이하가 더욱 바람직하고, 12 아미노산 이하가 더욱 바람직하고, 11 아미노산 이하가 더욱 바람직하고, 10 아미노산 이하가 더욱 바람직하다. 하한은 특별히 한정되지 않지만, 3 아미노산 이상이 바람직하고, 4 아미노산 이상이 더욱 바람직하고, 5 아미노산 이상이 더욱 바람직하고, 6 아미노산 이상이 더욱 바람직하다.
OSK-1 펩타이드와 생체내 단백질의 에피토프와의 복합체는 양자가 직접 연결되어도 좋고, 링커(스페이서와 동의어)를 매개로 하여 연결되어도 좋다. 링커는 OSK-1 펩타이드와 생체내 단백질의 에피토프를 연결할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, β-아미노알라닌, γ-아미노젖산, ε-아미노카프론산, 7-아미노헵탄산, 12-아미노라우린산, 글루타민산, p-아미노안식향산 등의 아미노카르복실산을 사용할 수 있다. 또한, 천연의 단백질에 존재하는 L-아미노산이나 이들의 D-아미노산도 사용할 수 있다. 본원 명세서의 실시예에서는 ε-아미노카프론산을 링커로서 사용하고 있으나, 이것에 한정되지 않는다.
OSK-1 펩타이드와 생체내 단백질의 에피토프와의 복합체에 있어서의 연결 순서는 특별히 한정되지 않고, N 말단측이 OSK-1 펩타이드이고 C 말단측이 생체내 단백질의 에피토프여도 좋고, 반대로 N 말단측이 생체내 단백질의 에피토프이고 C 말단측이 OSK-1 펩타이드라도 좋다. 바람직하게는, N 말단측이 OSK-1 펩타이드이고 C 말단측이 생체내 단백질의 에피토프 순서이다.
해당 복합체는 이의 N 말단의 아미노산이 아세틸화되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 해당 복합체는 이의 C 말단의 아미노산이 아미드화되어 있는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 복합체의 N 말단의 아미노산이 아세틸화되어 있고, 또한 C 말단의 아미노산이 아미드화되어 있는 것이다.
OSK-1 펩타이드와 생체내 단백질의 에피토프와의 복합체는 융합 단백질로서 제조할 수 있다. 구체적으로는, 공지의 유전자공학적 수법에 의해, OSK-1 펩타이드와 생체내 단백질의 에피토프의 융합 단백질을 코딩하는 융합 유전자를 제작하고, 해당 유전자를 발현가능하게 삽입한 재조합 발현 벡터를 구축하고, 이것을 적당한 숙주세포에 도입하여 재조합 단백질로서 발현시키고, 정제함으로써 제조할 수 있다. OSK-1 펩타이드와 생체내 단백질의 에피토프와의 복합체는 상기 융합 유전자와 공지의 in vitro 전사·번역계(예를 들면, 토끼 망상적혈구, 밀배아 또는 대장균 유래의 무세포 단백질 합성계 등)을 사용하여 제조할 수 있다. 또한, 박테리오파지를 사용하여, 그 표면에 OSK-1 펩타이드와 생체내 단백질의 에피토프와의 복합체를 재조합 단백질로서 발현시키는 경우는, 해당 복합체를 단리, 정제하지 않고, 파지 표면에 발현되는 채로 대상 동물에게 투여하는 것도 가능하다.
또한, OSK-1 펩타이드와 생체내 단백질의 에피토프와의 복합체는 공지의 일반적인 펩타이드 합성의 프로토콜을 따라, 고상 합성법(Fmoc법, Boc법) 또는 액상 합성법에 의해 제조할 수 있다. 복합체가 OSK-1 펩타이드와 생체내 단백질의 에피토프를 직접 연결한 것인 경우, 또는 복합체가 OSK-1 펩타이드와 생체내 단백질의 에피토프를 적당한 아미노산을 매개로 하여 연결한 것인 경우는, 복합체의 전체를 한번에 합성할 수 있다. 또한, OSK-1 펩타이드와 생체내 단백질의 에피토프를 별도로 합성하고, 그 후에 2개의 펩타이드를 적당한 링커를 사용하여 연결해도 좋다.
링커의 도입은 펩타이드 합성화학에서 잘 알려진 방법으로 행할 수 있다. 먼저 표준적인 수법에 의해 링커 위치까지의 펩타이드 단편을 작성하고, 링커로서 사용하는 아미노카르복실산의 아미노기를 적절하게 보호한 것을 사용하여 표준적인 조건하 펩타이드 합성화학에서 사용되는 축합제로 해당 링커기를 축합하고, 이어서 링커기의 보호기를 탈보호하고 나서, 다음 위치의 목적으로 하는 아미노산을 도입하면 좋다. 예를 들면, 펩타이드 자동합성기에서 잘 사용되는 고상법 펩타이드 합성법은 그 일예이다. 이러한 조작에서 사용할 수 있는 아미노카르복실산의 보호기로는, tBOC(tert-Butyl Oxy Carbonyl) 기, FMOC(Fluorenyl-MethOxy-Carbonyl) 기 등을 들 수 있다. 축합제로는, 예를 들면 DCC(N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide), EDC((N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide) 등의 카르보디이미드계 화합물, CDI(1,1'-카르보닐디이미다졸) 등의 이미다졸계 화합물, BOP(benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate) 등의 포스포늄염계 화합물, HBTU(O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate), HCTU(O-(6-Chlorobenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate) 등의 우로니움염계 화합물 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기의 조건을 적절하게 조합시키면, OSK-1의 소정의 펩타이드 단편과 표적의 생체내 단백 에피토프 부위 서열의 펩타이드 단편을 각각 제작하여 적절하게 보호한 후, 적절한 보호를 시행한 링커기를 이용하여, 축합 또는 탈보호의 스텝을 적절히 조합하여 조작함으로써 소망의 컨쥬게이트를 얻을 수도 있다.
본 발명의 백신은 아주반트를 포함하지 않아도 질환의 요인이 되는 생체내 단백질의 기능을 저해하는 항체를 유도할 수 있다는 점에서, 유용성이 높은 점에서 유용하다. 다만, 본 발명의 백신은 1종 이상의 아주반트를 포함하고 있어도 좋다. 본 발명의 백신이 아주반트를 포함하는 경우, 공지의 아주반트 중에서 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 알루미늄 아주반트(예를 들면, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄 등의 알루미늄염 또는 이의 조합), 프로인트 아주반트(완전 또는 불완전), TLR 리간드(예를 들면, CpG, Poly(I:C), Pam3CSK4 등), BAY, DC-chol, pcpp, 모노포스포릴지질 A, QS-21, 콜레라 독소, 포르밀메티오닐 펩타이드 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 알루미늄 아주반트, TLR 리간드 또는 이들의 조합이다. 본 발명의 백신이 아주반트를 포함하는 경우, 아주반트의 배합량은 특별히 한정되지 않고, 아주반트의 종류 등에 의해 적절히 선택하면 좋다. 예를 들면, 알루미늄 아주반트(수산화알루미늄) 및 CpG를 병용하는 경우, 본 발명의 융합 단백질에 대하여 질량비로 알루미늄 아주반트가 약 1∼100배량, CpG가 약 1∼50배량을 배합하는 것이 바람직하다.
본 발명의 백신은 경구투여 또는 비경구투여에 의해 투여할 수 있다. 비경구투여로는, 예를 들면 복강내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 정맥내 투여, 비강내 투여, 경피 투여, 경점막 투여, 설하 투여, 흡입 투여 등을 들 수 있다. 바람직하게는 비경구투여이며, 더욱 바람직하게는 피내 투여, 피하 투여 또는 근육내 투여이다. 또한, 비경구투여의 수단에는, 마이크로 니들 주사, 무침 주사, 스탬프 등이 포함된다.
본 발명의 백신은 OSK-1 펩타이드와 생체내 단백질의 에피토프와의 복합체와 약학적으로 허용되는 담체, 추가로 첨가제를 적절히 배합하여 제제화할 수 있다. 구체적으로는 정제, 피복 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 액제, 현탁제, 유제 등의 경구 투여용 제제; 주사제, 수액, 좌제, 연고, 패치제 등의 비경구 투여용 제제로 할 수 있다. 담체 또는 첨가제의 배합 비율에 대해서는, 의약품 분야에 있어서 통상 채용되고 있는 범위에 근거하여 적절히 설정하면 좋다. 배합할 수 있는 담체 또는 첨가제는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 물, 생리식염수, 기타의 수성 용매, 수성 또는 유성 기제 등의 각종 담체; 부형제, 결합제, pH 조정제, 붕해제, 흡수촉진제, 활택제, 착색제, 교미제, 향료 등의 각종 첨가제를 들 수 있다.
경구 투여용의 고형 제제에 사용되는 첨가제로는, 예를 들면, 락토오스, 만니톨, 글루코오스, 미결정 셀룰로오스, 옥수수 전분 등의 부형제; 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 메타규산알루민산 마그네슘 등의 결합제; 옥수수 전분 등의 분산제; 섬유소 글리콜산 칼슘 등의 붕해제; 스테아린산 마그네슘 등의 활택제; 글루타민산, 아스파라긴산 등의 용해보조제; 안정제; 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올 등의 합성 고분자류 등의 수용성 고분자; 백당, 분당(粉糖), 수크로오스, 과당, 포도당, 유당, 환원맥아당시럽, 분말 환원맥아당시럽, 포도당과당액당, 과당포도당액당, 벌꿀, 솔비톨, 말티톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 아스파탐, 사카린, 사카린 나트륨 등의 감미제, 백당, 젤라틴, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀루로오스 프탈레이트 등의 코팅제 등을 들 수 있다.
경구 투여용의 액체 제제는 일반적으로 사용되는 희석제에 용해, 현탁 또는 유화시켜 제제화할 수 있다. 희석제로는 예를 들면, 정제수, 에탄올, 이들의 혼합액 등을 들 수 있다. 또한 이 액제는 습윤제, 현탁화제, 유화제, 감미제, 풍미제, 방향제, 보존제, 완충제 등을 함유하고 있어도 좋다.
비경구 투여용의 주사제에 사용되는 첨가제로는 예를 들면, 염화나트륨, 염화칼륨, 글리세린, 만니톨, 솔비톨, 붕산, 붕사, 포도당, 프로필렌글리콜 등의 등장화제; 인산 완충액, 초산 완충액, 붕산 완충액, 탄산 완충액, 구연산 완충액, 트리스 완충액, 글루타민산 완충액, 입실론 아미노카프론산 완충액 등의 완충제; 파라옥시안식향산 메틸, 파라옥시안식향산 에틸, 파라옥시안식향산 프로필, 파라옥시안식향산 부틸, 클로로부탄올, 벤질알코올, 염화벤잘코늄, 데히드로초산 나트륨, 에데트산 나트륨, 붕산, 붕사 등의 보존제; 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜 등의 증점제; 아황산수소나트륨, 티오황산나트륨, 에데트산 나트륨, 구연산 나트륨, 아스코르빈산, 디부틸히드록시톨루엔 등의 안정화제; 염산, 수산화나트륨, 인산, 초산 등의 pH 조정제 등을 들 수 있다. 또한 주사제에는 적당한 용해 보조제 예를 들면, 에탄올 등의 알코올; 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등의 폴리알코올; 폴리소르베이트 80, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 50, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올 등의 비이온 계면활성제 등을 추가로 배합해도 좋다. 주사제 등의 액상 제제는 동결보존 또는 동결건조 등에 의해 수분을 제거하여 보존할 수도 있다. 동결건조제제는 사용시에 주사용 증류수 등을 가하여, 재용해하여 사용된다.
본 발명의 백신은 면역계를 갖는 모든 동물(인간, 비인간)을 투여 대상으로 할 수 있다. 예를 들면, 인간, 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 모르모트, 래트, 마우스 등의 포유동물; 닭, 오리, 거위 등의 조류를 들 수 있다. 본 발명의 백신은 동물약으로서 유용하지만, 인간의 소아 및 성인을 대상으로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 백신의 투여횟수 및 투여간격은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 단회 투여라도 좋고, 약 2일 ∼ 약 8주간의 간격으로 복수회 투여해도 좋다. 백신 투여량은 투여 대상, 투여 방법 등에 의해 상이하지만, 1회 투여량을 약 0.01 μg ∼ 약 10 mg로 하는 것이 바람직하고, 약 0.1 μg ∼ 약 1 mg으로 하는 것이 더욱 바람직하고, 약 1 μg ∼ 약 0.1 mg로 하는 것이 더더욱 바람직하다.
본 발명에는 본 발명의 백신 유효량을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 표적 생체 단백질이 요인이 되는 질환의 예방 또는 치료 방법이 포함된다.
또한, 본 발명에는 생체내 단백질이 요인이 되는 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 백신이 포함된다.
또한, 본 발명에는 생체내 단백질이 요인이 되는 질환의 예방 또는 치료용 의약을 제조하기 위한, 본 발명의 백신의 사용이 포함된다.
본 발명의 백신에 있어서, 질환의 요인이 되는 생체내 단백질의 에피토프의 캐리어 단백질로서 사용되는 OSK-1은 20개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이며, OSK-1 자신의 항원성은 매우 낮으므로, 캐리어 단백질의 항원성에 유래하는 바람직하지 못한 효과나 부작용을 저감할 수 있다. 한편, OSK-1은 짧은 펩타이드임에도 불구하고 강한 아주반트 효과를 가지므로, 백신으로서 유효한 항체 산생능을 부여할 수 있다. 또한, OSK-1과 생체내 단백질의 에피토프와의 복합체에 의해 산생되는 항체에는, Th2 타입의 IgG1 뿐만 아니라 Th1 타입의 IgG2a, IgG2b 및 IgG3이 많이 포함되므로, 알러지 반응 등의 부작용을 저감할 수 있다는 점에서 매우 유용하다. 또한, KLH 등의 천연물 유래의 캐리어 단백질을 사용하는 경우에는 불순물의 문제가 발생하지만, OSK-1은 합성에 의해 제조할 수 있으므로 이러한 문제를 회피할 수 있다. 또한, OSK-1은 짧은 펩타이드이므로, 제조 비용을 억제할 수 있다는 점에서도 유리하다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
[펩타이드의 제조예]
문헌 「Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce(1984), Fmoc solid synthesis: a practical approach, Oxford University Press (2000)」 및 「제5판 실험화학강좌 16 유기 화합물의 합성 IV」 등에 기재된 방법에 따라, 전자동 고상 합성기를 사용하여, 보호 펩타이드 수지를 Fmoc법으로 합성하였다. 얻어진 보호 펩타이드 수지에 트리플루오로초산(TFA)과 스캐빈저(티오아니올, 에탄디티올, 페놀, 트리이소프로필실란, 물 등의 혼합물)을 가하여, 수지로부터 잘라냄과 동시에 탈보호하여, 조(粗) 펩타이드를 얻었다. 이 조 펩타이드를 역상 HPLC 컬럼(ODS)을 사용하여, 0.1% TFA-H20/CH3CN의 계에서 글라디언트 용출하여 정제를 수행하였다. 목적물을 포함하는 분획을 모아 동결건조하여, 목적으로 하는 펩타이드를 얻었다. 합성한 펩타이드의 아미노산 서열은 아미노산 시퀀서 G1000A(Hewlett Packard), PPSQ-23A(시마즈제작소) 또는 ProciscLC(ABI사)를 이용하여 확인하고, 얻어진 펩타이드의 N 말단을 아세틸화하였다.
[실시예 1: OSK-1-DPP4 컨쥬게이트에 의한 항체 산생의 검토 1]
OSK-1 펩타이드(서열번호 1)와 마우스 DPP4의 에피토프 펩타이드(서열번호 17)을 ε-Acp를 링커로 하여 연결(컨쥬게이트)한 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트(Ac-ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK-X-ENSTFESFG (X=ε-Acp))에 의한 항체 산생 작용을 평가하였다. 군 구성은 생리식염수군 및 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트군(100 μg/mouse)의 2군으로 하였다(6마리/군). Balb/c 마우스에 2주 간격으로 3회 피내 투여하였다. 투여 전, 투여로부터 2주 마다 8주후까지 채혈하고, DPP4 에피토프 펩타이드에 대한 항체가(antibody titer)를 ELISA에 의해 측정하였다.
결과를 도 1에 나타내었다. OSK-1-DPP4 컨쥬게이트의 투여에 의해, DPP4 에피토프 펩타이드에 대한 항체 산생이 인정되었다.
[실시예 2: OSK-1-DPP4 컨쥬게이트에 의한 항체 산생의 검토 2]
실시예 1과 동일한 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트에 의한 항체 산생 작용을 KLH(Keyhole limpet hemocyanin: 스카시가이헤모시아닌)과 마우스 DPP4의 에피토프 펩타이드(서열번호 17)와의 컨쥬게이트(KLH-DPP4)의 항체 산생 작용과 비교하였다. 군 구성은 KLH-DPP4 컨쥬게이트군(20μg/mouse), OSK-1-DPP4 컨쥬게이트군(100μg/mouse), OSK-1-DPP4 컨쥬게이트(100μg/mouse) + Alum(Alhydrogel 2% (InvivoGen) 1 mg/mouse) 병용군의 3군으로 하였다(2마리/군). Balb/c 마우스에 2주 간격으로 3회 피내 투여하였다. 투여 전, 투여로부터 2주 마다 6주후까지와, 12주후에 채혈하고, DPP4 에피토프 펩타이드에 대한 항체가를 ELISA에 의해 측정하였다.
결과를 도 2에 나타내었다. OSK-1-DPP4 컨쥬게이트는 KLH-DPP4 컨쥬게이트와 동등한 항체 산생능이 인정되었다. 또한, OSK-1-DPP4 컨쥬게이트와 Alum의 병용군에서는 상승효과가 인정되었다.
[실시예 3: 산생된 항체의 IgG 서브클래스의 해석]
실시예 1 및 2와 동일한 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트에 의해 산생된 IgG 항체의 IgG 서브클래스를 실시예 2와 동일한 KLH-DPP4 컨쥬게이트에 의해 산생된 IgG 항체의 IgG 서브클래스와 비교하였다. 군 구성은 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트군(100 μg/mouse), KLH-DPP4 컨쥬게이트(20μg/mouse) + Alum(Alhydrogel 2% (InvivoGen) 1 mg/mouse) 병용군, KLH-DPP4 컨쥬게이트(20μg/mouse) + OSK-1(100μg/mouse) 병용군의 3군으로 하였다. Balb/c 마우스에 2주 간격으로 3회 및 투여 개시로부터 9주후에 1회, 합계 4회 피내 투여한 후, 투여후 11주에 채혈하고, DPP4 에피토프 펩타이드에 대한 IgG 항체의 항체가를 IgG 서브클래스마다 ELISA에 의해 측정하였다.
결과를 도 3에 나타내었다. KLH-DPP4 컨쥬게이트와 Alum의 병용군에서는 Th2 타입의 IgG인 IgG1이 특히 높은 경향이었다. 한편, OSK-1-DPP4 컨쥬게이트군에서는 Th1 타입의 IgG인 IgG2a, IgG2b에서도 높은 산생이 인정되었다. 또한, KLH-DPP4 컨쥬게이트와 OSK-1의 병용군에서는 마찬가지로 Th1 타입인 IgG2b, IgG3의 항체가가 높았다.
[참고예 1: OSK-1-WT1 컨쥬게이트에 의한 항종양 효과의 검토 1]
OSK-1 펩타이드(서열번호 1)와 WT1 펩타이드(서열번호 28)를 ε-Acp를 링커로 하여 컨쥬게이트한 OSK-1-WT1 컨쥬게이트(Ac-ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK-X-RMFPNAPYL (X=ε-Acp))에 의한 항종양 효과를 평가하였다. 또한, WT1 펩타이드 백신의 항종양효과에 대한 OSK-1 펩타이드의 아주반트 효과에 대하여 검토하였다. 군 구성은 생리식염수군, WT1 펩타이드(100μg/mouse) + 폴리(I:C)(InvivoGen; Poly(I:C) HMW VacciGrade, 50μg/mouse)군, WT1 펩타이드(100μg/mouse) + OSK-1 펩타이드(100μg/mouse)군, OSK-1-WT1 컨쥬게이트(350μg/mouse)군의 4군으로 하였다(6마리/군). C57BL/6J 마우스에 백신을 주에 1회, 4회 투여하고, 4회째의 투여로부터 1주간후에 B16F10 멜라노마 세포(1Х105 cells/mouse)를 배부(背部) 피내에 이식하였다. 세포 이식으로부터 1주간후에 다시 백신을 투여하였다. 세포 이식후, 주에 2회 체중 및 종양직경을 측정하였다. 종양직경은 디지털 캘리퍼스를 사용하여 측정하고, 장경× 단경2을 종양 체적으로 하였다.
종양 체적의 결과를 도 4에, 생존율의 결과를 도 5에 나타내었다. OSK-1 펩타이드를 아주반트로 하여 WT1 펩타이드 백신과 함께 투여한 경우, 종양 증식 억제 효과 및 연명 효과는 인정되지 않았다. OSK-1-WT1 컨쥬게이트군에서는 종양 증식 억제 효과 및 연명 효과가 인정되었다.
[참고예 2: OSK-1-WT1 컨쥬게이트에 의한 항종양 효과의 검토 2]
참고예 1과 동일한 OSK-1-WT1 컨쥬게이트에 의한 항종양 효과를 평가하였다. 군 구성은 생리식염수군, WT1 펩타이드(100μg/mouse) + 폴리(I:C) (InvivoGen; Poly(I:C) HMW VacciGrade, 50μg/mouse)군, OSK-1-WT1 컨쥬게이트(350μg/mouse)군, 시스플라틴(5mg/kg)군의 4군으로 하였다(10마리/군). C57BL/6J 마우스에 B16F10 멜라노마 세포(3Х105 cells/mouse)을 배부 피내에 이식하고, 동일한 날에 백신을 피내 투여하였다. 세포 이식일을 Day 0으로 하여 Day 7, 14, 21, 28, 35에 백신을 투여하였다. 세포 이식후, 주에 2회, 디지털 캘리퍼스를 사용하여 종양직경을 측정하고, 장경× 단경2을 종양 체적으로 하였다.
종양 체적의 결과를 도 6에, 생존율의 결과를 도 7에 나타내었다. 세포 이식일과 동시에 백신 투여를 시작한 경우, OSK-1-WT1 컨쥬게이트의 종양 증식 억제 효과는 약하지만, Day 32까지는 생리식염수 투여군(음성대조)과 비교하여 종양 체적은 낮은 값을 추이(推移)하였다. 또한, OSK-1-WT1 컨쥬게이트는 WT1 펩타이드 + 폴리(I:C)군 및 시스플라틴 군과 동등한 연명 효과가 인정되었다.
[실시예 4: OSK-1-DPP4 컨쥬게이트에 의한 항체 산생의 검토 3]
OSK-1 펩타이드(서열번호 1)와 7종류의 마우스 DPP4의 에피토프 펩타이드(서열번호 3, 5, 6, 8, 18, 19, 20) 및 1종류의 인간 DPP4의 에피토프 펩타이드(서열번호 9)를, 각각 ε-Acp를 링커로 하여 컨쥬게이트한 8종류의 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트를 제조하였다. 이하, 각 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트를 「OSK1-DDP4-서열번호」로 표기한다.
6종류의 마우스 DPP4의 에피토프 펩타이드(서열번호 3, 5, 6, 8, 18, 19)를 포함하는 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트를 1마리당 100 μg의 용량으로 Balb/c 마우스에 2주 간격으로 3회 피내 투여하였다. 투여 전, 투여로부터 2주 간격으로 채혈하고, 각 에피토프 펩타이드에 대한 항체가를 ELISA에 의해 측정하였다.
초회 투여로부터 4주후의 항체가를 표 2에 나타내었다. 항체가는 half maximum 값으로 나타내었다. Half maximum 값은 측정기에 있어서의 최대 흡광도의 반의 흡광도를 나타내는 혈청의 희석 배율이며, 혈청 희석 배율과 흡광도의 시그모이드 곡선을 작성하여 산출하였다.
Figure 112018096507550-pct00002
OSK1-DDP4-6, OSK1-DDP4-9 및 OSK1-DDP4-12의 3종류의 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트를 1마리당 250 μg의 용량으로 Balb/c 마우스에 2주 간격으로 3회 피내 투여하였다. 초회 투여로부터 4주후, 9주후 및 13주후에 채혈하고, 각 에피토프 펩타이드에 대한 항체가를 ELISA에 의해 측정하였다.
결과를 표 3에 나타내었다. 항체가는 half maximum 값으로 나타내었다.
Figure 112018096507550-pct00003
[실시예 5: HbA1c 값에 의한 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트의 평가]
OSK-1 펩타이드(서열번호 1)와 DPP4의 에피토프 펩타이드(서열번호 6)를 ε-Acp를 링커로 하여 컨쥬게이트한 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트를, 1마리당 100 μg의 용량으로, 고지방식(DIO SERIES DIET D12492, 일본 쿠레아 주식회사)을 자유 섭취시킨 Balb/c 마우스에 2주 마다 3회 피내 투여하였다. 초회 투여후 57일에 채취한 혈액의 일부를 신속하게 EDTA 처리하여 튜브에 분주하고, 전도혼화시켜, EDTA 처리 혈액을 조제하였다. HbA1c 측정용에 약 20μL을 마이크로 튜브에 분주하고, HbA1c 측정기기 쿠오라브(Quo-Lab)(니프로)를 사용하여 측정하였다. 그 결과, OSK-1-DPP4 컨쥬게이트군의 HbA1c 값(%, NGSP)은 컨트롤군(KLH 투여군)의 HbA1c 값과 비교하여, -0.4%의 개선을 나타내었다.
[실시예 6: 경구 포도당 부하 시험(OGTT)에 의한 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트의 평가]
OSK-1 펩타이드(서열번호 1)와 2종류의 DPP4의 에피토프 펩타이드(서열번호 6 및 서열번호 9)를 각각 ε-Acp를 링커로 하여 컨쥬게이트한 2종류의 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트를 1마리당 250 μg의 용량으로 고지방식(DIO SERIES DIET D12492, 일본 쿠레아 주식회사)을 자유 섭취시킨 Balb/c 마우스에 2주 마다 3회 피내 투여하였다. 또한, 초회 투여후 63일째에 1마리당 250 μg의 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트를 피내 투여하였다. 초회 투여후 77일째에 경구 포도당 부하 시험(OGTT)을 실시하였다. OGTT 실시 전날부터 약 16시간의 절식을 행하고, OGTT 실시중은 절식 상태를 유지하였다. 20% 글루코오스액을 5 mL/kg의 용량으로 단회 경구투여하였다. 채혈 및 혈당치 측정은 무마취하에서 행하였다. 동물의 꼬리를 가볍게 면도칼로 상처를 입히고, 누출하는 혈액 중의 당 농도를 혈당자기측정기(니프로후리스타일후리덤)로 측정하였다. 혈당치는 당 부하전, 당 부하후 30, 60, 90 및 120분의 계 5시점에서 측정하고, 경시적인 농도 추이에 의해 각 투여군의 혈당상승곡선하 면적 AUC(time*mg/dl)를 산출하였다. 그 결과, 2종류의 OSK-1-DPP4 컨쥬게이트 투여군의 AUC는 모두 컨트롤군(KLH 투여군)의 AUC와 비교하여 저하되었다.
[실시예 7: OSK-1-DPP4 컨쥬게이트에 의한 IgE 산생의 검토]
OSK1-DPP4-17에 의한 표적 단백에 대한 IgE 산생을 캐리어 단백질을 KLH로 변경한 KLH-DPP4-17과 비교하였다. KLH-DPP4-17군은 KLH-DPP4-17이 20 μg/mouse 및 Alum(Alhydrogel 2% (InvivoGen))이 1 mg/mouse가 되도록 혼합하여 피내 투여하였다. OSK-1-DPP4-17군은 100 μg/mouse로 피내 투여하였다. Balb/c 마우스에 2주 간격으로 3회 피내 투여하고, 또한 11주째에 4회째의 투여를 행하였다. 21주째에 채혈하고, 혈청 중의 DPP4에 대한 IgE 항체량을 ELISA에 의해 측정하였다.
결과를 도 8에 나타내었다. KLH-DPP4-17군에서는 표적 단백에 대한 IgE 산생이 관찰되었지만, OSK1-DPP4-17군에서는 표적 단백에 대한 IgE 산생은 관찰되지 않았다.
[실시예 8: OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트에 의한 항체 산생의 검토]
(1) OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트의 제조
OSK-1 펩타이드(서열번호 1)와 10 종류의 마우스 IL-17A의 에피토프 펩타이드(서열번호 21, 22, 31∼33, 37∼41)를 각각 ε-Acp를 링커로 하여 컨쥬게이트한 10 종류의 OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트를 제조하였다. 이하, 각 OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트를 「OSK1-IL-서열번호」로 표기한다. 이들의 대표예로서 4종류의 에피토프 펩타이드(서열번호 21, 31, 32, 40)를 포함하는 컨쥬게이트에 대하여, 도 9∼12에 각각 (A) 아미노산 분석 결과 및 (B) HPLC 분석 결과를 나타내었다. 다른 컨쥬게이트도 실질적으로 동일한 형태의 분석 결과를 얻었다.
(2) 항체가의 측정
10종류의 OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트를 표 4에 기재된 용량으로 Balb/c 마우스에 2주 간격으로 3회 피내 투여하였다. 투여 전, 투여로부터 2주 마다 6주후까지 채혈하고, 각 에피토프 펩타이드에 대한 항체가를 ELISA에 의해 측정하였다.
초회 투여로부터 6주후의 결과를 표 4에 나타내었다. 또한, 2, 4, 6주후의 항체가의 변화를 도 13에 나타내었다. 항체가는 half maximum 값으로 나타내었다.
Figure 112018096507550-pct00004
[실시예 9: 이미퀴모드 유발성 건선성 피부염 모델 마우스에 의한 OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트의 평가(1)]
건선 모델로서 이미퀴모드 유발 건선성 피부염 모델을 사용하였다. 6주령의 BALB/c 마우스에 3종류의 OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트(OSK1-IL-31, OSK1-IL-32, OSK1-IL-40)을 1마리당 500 μg의 용량으로 2주 마다 3회 피내 투여하였다. 3회째의 백신 투여로부터 2주간후에 배중(背中)을 제모하고, 추가로 탈모 크림을 사용하여 탈모한 피부에, 1일당 이미퀴모드 62.5 mg분의 베셀나 크림 5%(상품명, 모치다 제약)을 8일간 매일 도포함으로써 건선을 유도하였다. 귀에 도포하는 경우는, 한쪽 귀마다 1일당 이미퀴모드 0.35 mg분의 베셀나 크림 5%을 8일간 매일 도포함으로써 건선 증상을 유도하였다.
건선 유도 개시로부터 8일간(0∼7일째), 피부상태(홍반, 비후도, 백색비늘(白色鱗屑)의 증상범위)를 매일 관찰하고, 각 0∼4의 5 단계(0: 없음, 1: 경도, 2: 중등증, 3: 중증, 4: 지극히 중증)로 점수화하여 평가하였다. 귀의 두께는 건선 유도 개시로부터 8일간(0∼7일째), 디지털 캘리퍼스를 사용하여 매일 측정하였다. 피부상태의 결과를 도 14에, 귀의 두께의 결과를 도 15에 나타내었다. 사용한 4 종류의 OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트는 이미퀴모드 유발 건선성 피부염을 억제하는 것이 나타났다.
[실시예 10: 이미퀴모드 유발성 건선성 피부염 모델 마우스에 의한 OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트의 평가(2)]
(1) 피부상태 및 귀의 두께
OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트로서 OSK1-IL-21을 사용하여, 1마리당 100 μg, 300 μg 또는 1000 μg의 용량으로 Balb/c 마우스에 2주 마다 3회 피내 투여하였다. 또한, 캐리어 단백질을 KLH로 변경한 KLH-IL-21을 1마리당 20μg의 용량으로 Balb/c 마우스에 2주 마다 3회 피내 투여하였다. KLH-IL-21에 대해서는, 1회째의 투여에서는 프로인트 완전 아주반트(SIGMA) 50 μL/mouse를, 2회째 및 3회째의 투여에서는 프로인트 불완전 아주반트(SIGMA) 50 μL/mouse를 아주반트로 하여 혼합투여하였다. 사용한 백신 및 베셀나 크림 5%을 13일간 매일 도포한 것 이외는 상기 실시예 9와 동일한 순서로 행하였다.
건선 유도 개시로부터 6일째의 피부상태를 사진 촬영하여, 도 16에 나타내었다. 건선성 피부염 유발 기간 동안(0∼12일째)의 피부의 상태의 변화를 도 17에 나타내었고, 건선성 피부염 유발 기간 동안(0∼7일째)의 귀의 두께의 변화를 도 18에 나타내었다. 이들 결과에 의해, KLH-IL-17A 컨쥬게이트보다 OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트가 이미퀴모드 유발 건선성 피부염을 강하게 억제할 수 있다는 것이 나타났다.
(2) 면역조직화학 염색
이미퀴모드 도포에 의해 건선성 피부염을 유도한 때에 피부에 존재하고 있는 면역세포 및 인볼루크린의 발현을 면역조직화학 염색에 의해 검출하였다.
건선 유도 개시로부터 12일째의 배부 피부 및 귓바퀴를 채취하고, 4% PFA로 고정후, 파라핀 포매를 행하였다. 절편 작성후, 탈파라핀, 항원부활화 처리를 행하고, 비특이반응 블로킹, 일차 항체 반응, 표지 2차 항체 반응을 행하였다. 각화(角化)의 최종 마커인 인볼루크린 염색에 의해 각화 경향을, 마크로파지의 마커인 F4/80 및 과립구의 마커인 Gr-1로 각각 염색하고, 면역세포를 검출하였다.
인볼루크린 염색의 결과를 도 19에, F4/80 염색의 결과를 도 20에, Gr-1 염색의 결과를 도 21에 각각 나타내었다. 이들의 결과로부터, 정상피부에서는 유극층(stratum spinosum) 상부에 인정되는 인볼루크린의 발현이, 이미퀴모드 도포에 의해 표피의 넓은 범위에 펼쳐져 각화의 항진이 일어나고 있는 것이 확인되었다. OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트 투여군에서는 KLH-IL-17A 컨쥬게이트 투여군보다 이 현상이 현저하게 억제되어 있는 소견이 인정되었다. 또한, 이미퀴모드를 도포한 피부, 귓바퀴에 있어서 F4/80에 양성을 나타내는 마크로파지나, Gr-1에 양성을 나타내는 과립구의 증가가 보다 현저하게 인정되었다. 한편, OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트 투여군에서는 KLH-IL-17A 컨쥬게이트 투여군보다 이들 면역세포의 침윤이 현저하게 억제되어 있었다.
(3) IL-17의 혈중 농도
건선 유도 개시전(0 일째) 및 건선 유도 개시로부터 12일째에 채혈하여, 혈청 중의 IL-17 농도를 Mouse IL-17A/F Heterodimer Quantikine ELISA Kit(R&D systems사)를 사용하여 측정하였다.
결과를 도 22에 나타내었다. (A)는 이미퀴모드를 도포하지 않는 마우스(0 일째)의 결과이며, (B)는 이미퀴모드를 도포한 마우스(12 일째)의 결과이다. (B)에 나타낸 바와 같이, OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트 투여군은 KLH-IL-17A 컨쥬게이트 투여군에 비해 IL-17A/F의 혈중 농도가 낮았다. 또한, (A)에 나타낸 바와 같이, 컨쥬게이트 투여후 이미퀴모드 도포 개시전의 혈중 IL-17A/F는 KLH-IL-17A 컨쥬게이트 투여군만 상승이 인정되었다.
(4) 건선 부위에 있어서의 염증 관련 인자의 발현
건선 유도 개시로부터 12일째에 건선 부위의 피부를 채취하고, RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit를 사용하여 피부조직 중의 RNA를 추출하였다. Taqman Gene Expression Assays의 프라이머 및 프로브를 사용하여, 실시간 PCR법에 의해 IL-17A, IL-17F, IL-22 및 IL-23의 염증 관련 인자의 메신저 RNA를 측정하였다.
그 결과, OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트 비투여의 마우스에서는 각종 인자의 메신저 RNA가 상승했지만, OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트 투여군에서는 각 인자의 메신저 RNA 발현은 억제되어 있었다.
상기 실시예 9, 10에서는 이미퀴모드 유발성 건선성 피부염 모델 마우스를 사용하였지만, OSK-1-IL-17A 컨쥬게이트의 약효의 평가에는 IL-23 유발성 건선성 피부염 모델 마우스를 사용할 수도 있다. 구체적으로는, 예를 들면, W. Jiang 등(" A Toll-Like Receptor 7, 8, and 9 Antagonist Inhibits Th1 and Th17 Responses and Inflammasome Activation in a Model of IL-23-Induced Psoriasis" W. Jiang, et al, 1784 Journal of Investigative Dermatology (2013), Volume 133)의 기재에 따라 실시할 수 있다. 즉, 6∼8주령의 C57BL/6 마우스를 사용하여, 0.5 mg의 마우스 IL-23을 20 mL의 PBS에 용해하고, 예를 들면 0, 2, 4, 6, 10, 12 및 14일째에, 피험 동물의 왼쪽 귀에 피내 주사함으로써 피부염을 유도한다. 피부염을 유도한 마우스를 무작위로 군분류하여, 피험 물질 또는 대조 물질(예를 들면 PBS)을 투여한다. 예를 들면, 3, 6, 9, 12 및 15일째에, 피험 물질 또는 대조 물질을 피하 투여한다. 예를 들면 18일째에 귓바퀴의 두께를 디지털 캘리퍼스로 측정한다. 또한, 귓바퀴를 채취하여, 병리조직학적 검사에 제공한다.
[실시예 11: OSK-1-IgE 컨쥬게이트에 의한 항체 산생의 검토]
OSK-1 펩타이드(서열번호 1)와 마우스 IgE의 에피토프 펩타이드(서열번호 23)를 ε-Acp를 링커로 하여 컨쥬게이트한 OSK-1-IgE 컨쥬게이트를 제조하고, 1마리당 100 μg 또는 250 μg의 용량으로, Balb/c 마우스에 2주 간격으로 3회 피내 투여하였다. 투여로부터 2주 간격으로 채혈하고, 각 에피토프 펩타이드에 대한 항체가를 ELISA에 의해 측정하였다.
8주후의 항체가를 표 5에 나타내었다. 항체가는 half maximum 값으로 나타내었다.
Figure 112018096507550-pct00005
[실시예 12: OSK-1-PCSK9 컨쥬게이트에 의한 항체 산생의 검토]
OSK-1 펩타이드(서열번호 1)와 3종류의 마우스 PCSK9의 에피토프 펩타이드(서열번호 25, 26, 27)를 각각 ε-Acp를 링커로 하여 컨쥬게이트한 3종류의 OSK-1-PCSK9 컨쥬게이트를 제조하고, 1마리당 100 μg 또는 250 μg의 용량으로, Balb/c 마우스에 2주 간격으로 3회 피내 투여하였다. 투여로부터 2주 간격으로 채혈하고, 각 에피토프 펩타이드에 대한 항체가를 ELISA에 의해 측정하였다.
8주후의 항체가를 표 6에 나타내었다. 항체가는 half maximum 값으로 나타내었다.
Figure 112018096507550-pct00006
[실시예 13: 혈중의 PCSK9 농도에 의한 OSK-1-PCSK9 컨쥬게이트의 평가]
실시예 12에 있어서, OSK1-PCSK9-27을 250μg의 용량으로 투여한 마우스(OSK-1-PCSK9 컨쥬게이트 투여군)로부터, 투여 전 및 투여 2, 4, 6주후에 채취한 혈청 중의 PCSK9 농도를 측정하였다. 컨트롤로서 OSK-1 투여군을 마련하고, 동일한 스케쥴로 투여 및 채혈을 행하고, 혈청 중의 PCSK9 농도를 측정하였다. 측정에는 Mouse Proprotein Convertase 9/PCSK9 Quantikine ELISA Kit(R&D systems)를 사용하였다. 여기에서, PCSK9 항체를 투여하면 혈중 PCSK9 농도의 상승이 인정된다는 것이 보고되어 있다. 이 현상은 항체에 의해 PCSK9 단백이 안정화되어 체내로부터의 소실이 늦어지기 때문인 것으로 여겨지고 있다. 이로부터, 백신 투여에 의한 혈중 PCSK9 값의 상승은 백신 투여에 의해 산생된 항체가 표적 단백과 작용하고 있는 것을 나타내는 현상의 하나인 것으로 생각된다(Peptide-Based Anti-PCSK9 Vaccines - An Approach for Long-Term LDLc Management, PLoS One. 2014;9 (12), An Anti-PCSK9 Antibody Reduces LDL-Cholesterol On Top Of A Statin And Suppresses Hepatocyte SREBP-Regulated Genes; Int.J.Biol.Sci.2012, 8(3):310-327).
결과를 도 23에 나타내었다. OSK-1-PCSK9 컨쥬게이트 투여군에서는 투여 전과 비교하여, 투여후 2∼6주간후의 혈중의 PCSK9 값이 상승하였다.
[참고예 3: KLH-PCSK9 컨쥬게이트의 혈중 지질량에 대한 효과]
KLH와 마우스 PCSK9의 에피토프 펩타이드(서열번호 26)를 컨쥬게이트한 KLH-PCSK9 컨쥬게이트를 사용하였다. 7주령의 ApoE 결손 마우스를 일본 찰스 리버로부터 구입하였다. KLH-PCSK9 컨쥬게이트 저용량군(5μg (PCSK9 펩타이드)/mouse), KLH-PCSK9 컨쥬게이트 고용량군(50μg (PCSK9 펩타이드)/mouse), KLH 투여군 및 컨트롤로서 생리식염수 투여군을 마련하였다. KLH 투여군의 마우스에는 컨쥬게이트 투여군에 투여한 컨쥬게이트에 포함되는 KLH와 등량의 KLH를 투여하였다. 투여 전에 KLH-PCSK9 컨쥬게이트 또는 KLH 단독을 등용적(等容積)의 프로인트 아주반트(와코 준야쿠)과 혼합하여 피하투여하였다. 초회는 프로인트 완전 아주반트를 사용하고, 2회째 이후는 프로인트 불완전 아주반트를 사용하였다. 합계 3회(0, 14 및 28일째) 컨쥬게이트를 투여하고, 최종투여의 24주후에 채혈하여 지질량을 측정하였다. 그 결과, KLH-PCSK9 컨쥬게이트 투여군에서는 CM(카이로미크론), VLDL의 값이 약 반으로 저하되고, TG(중성지방)의 값이 약 3분의 2로 저하되었다.
여전히, 본 발명은 상술한 각 실시형태 및 실시예에 한정되는 것이 아니고, 청구항에 나타낸 범위에서 다양한 변경이 가능하며, 다른 실시형태에 각각 개시된 기술적 수단을 적절히 조합하여 얻어지는 실시형태에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다. 또한, 본 명세서 중에 기재된 학술문헌 및 특허문헌의 모두가, 본 명세서 중에 있어서 참고로서 원용된다.
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Claims (23)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, DPP4, IL-17A, IgE, 및 PCSK9로 이루어진 군으로부터 선택된 생체내 단백질의 에피토프와의 복합체를 포함하는, 당뇨병, 건선, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 비소세포성 폐암, 대장암, 췌장암, 동맥경화증, 기관지천식, 화분증, 알러지성 결막염, 아토피성 피부염, 또는 고콜레스테롤혈증의 치료를 위한 백신으로서,
    DPP4의 에피토프가 서열번호 2∼9 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드이고,
    IL-17A의 에피토프가 서열번호 10, 11, 29∼36 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드이고,
    IgE의 에피토프가 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드이고,
    PCSK9의 에피토프가 서열번호 14∼16 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 백신.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 생체내 단백질의 에피토프가 ε-아미노카프론산을 매개로 하여 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 백신.
  9. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 복합체의 N 말단의 아미노산이 아세틸화되어 있는 것을 특징으로 하는 백신.
  10. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 복합체의 C 말단의 아미노산이 아미드화되어 있는 것을 특징으로 하는 백신.
  11. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, DPP4, IL-17A, IgE, 및 PCSK9로 이루어진 군으로부터 선택된 생체내 단백질의 에피토프와의 복합체를 포함하는 면역원성 조성물로서,
    DPP4의 에피토프가 서열번호 2∼9 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드이고,
    IL-17A의 에피토프가 서열번호 10, 11, 29∼36 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드이고,
    IgE의 에피토프가 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드이고,
    PCSK9의 에피토프가 서열번호 14∼16 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 면역원성 조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, (b) 서열번호 10, 11, 29∼36 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 ε-아미노카프론산을 매개로 하여 연결되어 있는 복합체로서, 상기 복합체의 N 말단의 아미노산이 아세틸화되어 있고, 상기 복합체의 C 말단의 아미노산이 아미드화되어 있는 복합체.
  17. (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, (b) 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 ε-아미노카프론산을 매개로 하여 연결되어 있는 복합체로서, 상기 복합체의 N 말단의 아미노산이 아세틸화되어 있고, 상기 복합체의 C 말단의 아미노산이 아미드화되어 있는 복합체.
  18. (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, (b) 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 ε-아미노카프론산을 매개로 하여 연결되어 있는 복합체로서, 상기 복합체의 N 말단의 아미노산이 아세틸화되어 있고, 상기 복합체의 C 말단의 아미노산이 아미드화되어 있는 복합체.
  19. (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, (b) 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 ε-아미노카프론산을 매개로 하여 연결되어 있는 복합체로서, 상기 복합체의 N 말단의 아미노산이 아세틸화되어 있고, 상기 복합체의 C 말단의 아미노산이 아미드화되어 있는 복합체.
  20. (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, (b) 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 ε-아미노카프론산을 매개로 하여 연결되어 있는 복합체로서, 상기 복합체의 N 말단의 아미노산이 아세틸화되어 있고, 상기 복합체의 C 말단의 아미노산이 아미드화되어 있는 복합체.
  21. (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, (b) 서열번호 2∼9 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 ε-아미노카프론산을 매개로 하여 연결되어 있는 복합체로서, 상기 복합체의 N 말단의 아미노산이 아세틸화되어 있고, 상기 복합체의 C 말단의 아미노산이 아미드화되어 있는 복합체.
  22. (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, (b) 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 ε-아미노카프론산을 매개로 하여 연결되어 있는 복합체로서, 상기 복합체의 N 말단의 아미노산이 아세틸화되어 있고, 상기 복합체의 C 말단의 아미노산이 아미드화되어 있는 복합체.
  23. (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와, (b) 서열번호 14∼16 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 ε-아미노카프론산을 매개로 하여 연결되어 있는 복합체로서, 상기 복합체의 N 말단의 아미노산이 아세틸화되어 있고, 상기 복합체의 C 말단의 아미노산이 아미드화되어 있는 복합체.
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