ES2934129T3 - Vacuna conjugada dirigida a una proteína biológica causante de enfermedad - Google Patents

Vacuna conjugada dirigida a una proteína biológica causante de enfermedad Download PDF

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Abstract

La presente invención proporciona una vacuna que incluye un conjugado de un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos indicada por SEQ ID NO: 1 y un epítopo de una proteína in vivo que es la causa de un trastorno, como DPP4, IL-17A, IgE , S100A9 y PCSK9. La vacuna tiene baja antigenicidad para las proteínas transportadoras y tiene una producibilidad de anticuerpos eficaz como vacuna. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vacuna conjugada dirigida a una proteína biológica causante de enfermedad
Campo técnico
La presente invención se refiere a una vacuna conjugada dirigida a una proteína biológica causante de una enfermedad.
Antecedentes de la técnica
Las técnicas de vacunación se han utilizado durante mucho tiempo para la prevención de infecciones tales como la viruela, y recientemente se ha intentado utilizarlas para el tratamiento del cáncer, enfermedades relacionadas con el estilo de vida, etc. Algunas vacunas terapéuticas utilizan una proteína transportadora conjugada con un epítopo de una proteína diana, que estimula respuestas inmunitarias, por ejemplo, la inducción de anticuerpos contra la proteína diana. Los ejemplos conocidos de dicha proteína transportadora incluyen KLH (hemocianina de la lapa californiana), OVA (ovoalbúmina) y BSA (albúmina de suero bovino). Por ejemplo, para el tratamiento del lupus eritematoso sistémico (SLE), se ha intentado la administración de una vacuna compuesta por una forma modificada de INF-a como un resto de antígeno conjugado con KLH (Bibliografía de no patentes 1).
Sin embargo, KLH, OVA, BSA y otras proteínas transportadoras son antigénicas en sí mismas, y esta antigenicidad a veces puede plantear un problema en el caso de que se use para la inmunización un epítopo moderadamente antigénico conjugado con dicha proteína transportadora (Bibliografía de no patentes 2).
Los presentes inventores describen el uso de un conjugado de un péptido epítopo de DPP4 y KLH para la prevención o el tratamiento de la diabetes mellitus (Bibliografía de patentes 1). Además, los presentes inventores describen el uso de una vacuna de DNA que contiene un polinucleótido que codifica un péptido epítopo de IL-17A y un polinucleótido que codifica un polipéptido de antígeno central del virus de la hepatitis B para la prevención o el tratamiento de enfermedades en las que la IL-17A está implicada como un factor desencadenante (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico (SLE), reumatismo articular, etc.) (Bibliografía de patentes 2).
Listado de citaciones
Bibliografía de patentes
Bibliografía de patentes 1: WO2015/033831
Bibliografía de patentes 2: WO2015/099167
Bibliografía de no patentes 1: ARTHRITIS & RHEUMATISM vol. 65, no. 2, February 2013, pp. 447-456.
Bibliografía de no patentes 2: N. E. van Houten, MB Zwick, A. Menéndez y J.K. Scott Vaccine. 2006 May 8; 24(19): 4188-4200.
Compendio de la invención
Problema técnico
Un objetivo de la presente invención es proporcionar una vacuna que contenga un complejo de una proteína transportadora menos antigénica conjugada con un epítopo de una proteína biológica causante de enfermedad y que sea capaz de inducir la producción de anticuerpos para servir como una vacuna eficaz.
Solución al problema
La presente invención incluye lo siguiente para lograr el objetivo mencionado anteriormente.
(1) Una vacuna que comprende un complejo de un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que es igual o sustancialmente igual a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y un epítopo de una proteína biológica causante de enfermedad, seleccionada del grupo que consiste en DPP4, IL-17A, IgE y PCSK9. (2) La vacuna según el punto (1) anterior, en la que el epítopo de IL-17A es un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 10, 11 y 29 a 36, o un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que es igual que la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 10, 11 y 29 a 36 excepto por deleciones, sustituciones o adiciones de 1 o 2 aminoácidos.
(3) La vacuna según el punto (1) anterior, en la que el epítopo de DPP4 es un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 2 a 9, o un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que es igual que la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 2 a 9 excepto por deleciones, sustituciones o adiciones de 1 o 2 aminoácidos.
(4) La vacuna según el punto (1) anterior, en la que el epítopo de IgE es un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que es igual que la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 excepto por deleciones, sustituciones o adiciones de 1 o 2 aminoácidos.
(5) La vacuna según el punto (1) anterior, en la que el epítopo de PCSK9 es un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 14 a 16, o un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que es igual que la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 14 a 16 excepto por deleciones, sustituciones o adiciones de 1 o 2 aminoácidos.
(6) La vacuna según uno cualquiera de los puntos (1) a (5) anteriores, en la que el epítopo de la proteína biológica se conjuga con el péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 a través del ácido £-aminocaproico.
(7) La vacuna según uno cualquiera de los puntos (1) a (6) anteriores, en la que el aminoácido en el extremo N-terminal del complejo está acetilado.
(8) La vacuna según uno cualquiera de los puntos (1) a (7) anteriores, en la que el aminoácido en el extremo C-terminal del complejo está amidado.
(9) Una composición inmunogénica que comprende un complejo de un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y un epítopo de una proteína biológica causante de enfermedad, en la que la proteína biológica es una clase seleccionada del grupo que consiste en DPP4, IL-17A, IgE y PCSK9.
(10) La vacuna del punto (1) o composición inmunogénica del punto (9) para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad.
Efectos ventajosos de la invención
La presente invención proporciona una vacuna que contiene un complejo de una proteína transportadora menos antigénica conjugada con un epítopo de una proteína biológica causante de enfermedad y es capaz de inducir la producción de anticuerpos para servir como vacuna eficaz.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra el efecto inductor de la producción de anticuerpos de un conjugado OSK-1-DPP4 compuesto por un péptido OSK-1 (SEQ ID NO: 1) conjugado con un péptido epítopo de d Pp4 de ratón (SEQ ID NO: 17) a través de un enlazador £-Acp.
La Figura 2 muestra la comparación de los efectos inductores de la producción de anticuerpos del conjugado OSK-1-DPP4 y un conjugado de KLH y un péptido epítopo de DPP4 de ratón (SEQ ID NO: 17) (KLH-DPP4). La Figura 3 muestra los resultados del análisis de la subclase IgG de anticuerpos producidos por vacunación con el conjugado OSK-1-DPP4 en comparación con un conjugado KLH-DPP4 más grupo Alumbre y un conjugado KLH-DPP4 más grupo OSK-1.
La Figura 4 muestra el efecto de crecimiento antitumoral de un conjugado OSK-1 -WT1 compuesto por el péptido OSK-1 (SEQ ID NO: 1) conjugado con un péptido WT1 (SEQ ID NO: 28) a través de un enlazador £-Acp en ratones que se han sometido a vacunación con el conjugado OSK-1-WT1 seguido de implantación subcutánea de células cancerosas.
La Figura 5 muestra el beneficio de supervivencia del conjugado OSK-1-WT1 en ratones que se han sometido a vacunación con el conjugado OSK-1-WT1 seguido de implantación subcutánea de células cancerosas.
La Figura 6 muestra el efecto de crecimiento antitumoral del conjugado OSK-1-WT1 en ratones que se han sometido a implantación subcutánea de células cancerosas y a la primera vacunación con el conjugado OSK-1-WT1 en el mismo día.
La Figura 7 muestra el beneficio de supervivencia del conjugado OSK-1-WT1 en ratones que se han sometido a implantación subcutánea de células cancerosas y a la primera vacunación con el conjugado OSK-1-WT1 en el mismo día.
La Figura 8 muestra la comparación de la producción de IgE inducida por el conjugado OSK-1-DPP4 frente a una proteína diana con la producción de IgE inducida por el conjugado KLH-DPP4 frente a la proteína diana. La Figura 9 muestra (A) los resultados del análisis de aminoácidos y (B) los resultados del análisis de HPLC de un conjugado OSK-1-DPP4 compuesto por el péptido OSK-1 conjugado con un péptido epítopo de IL-17A de ratón (SEQ ID NO: 21) a través de un enlazador £-Acp.
La Figura 10 muestra (A) los resultados del análisis de aminoácidos y (B) los resultados del análisis de HPLC de un conjugado OSK-1-DPP4 compuesto por el péptido OSK-1 conjugado con un péptido epítopo de IL-17A de ratón (SEQ ID NO: 31) a través de un enlazador s-Acp.
La Figura 11 muestra (A) los resultados del análisis de aminoácidos y (B) los resultados del análisis de HPLC de un conjugado OSK-1-DPP4 compuesto por el péptido OSK-1 conjugado con un péptido epítopo de IL-17A de ratón (SEQ ID NO: 32) a través de un enlazador s-Acp.
La Figura 12 muestra (A) los resultados del análisis de aminoácidos y (B) los resultados del análisis de HPLC de un conjugado OSK-1-DPP4 compuesto por el péptido OSK-1 conjugado con un péptido epítopo de IL-17A de ratón (SEQ ID NO: 40) a través de un enlazador s-Acp.
La Figura 13 muestra el efecto inductor de la producción de anticuerpos de los conjugados OSK-1 -IL-17A.
La Figura 14 muestra los resultados de la evaluación de la eficacia médica de los conjugados OSK-1-IL-17A basados en las afecciones de la piel de ratones modelo de dermatitis psoriasiforme inducida por imiquimod.
La Figura 15 muestra los resultados de la evaluación de la eficacia médica de los conjugados OSK-1-IL-17A basados en el grosor de la oreja de ratones modelo de dermatitis psoriasiforme inducida por imiquimod.
La Figura 16 muestra las afecciones de la piel de ratones modelo de dermatitis psoriasiforme inducida por imiquimod el día 6 después del comienzo de la inducción de psoriasis precedida por la vacunación con un conjugado OSK-1 -IL-17A o un conjugado KLH-IL-17A.
La Figura 17 muestra la comparación de las eficacias médicas del conjugado OSK-1 -IL-17A y el conjugado KLH-IL-17A basado en las afecciones de la piel de ratones modelo de dermatitis psoriasiforme inducida por imiquimod.
La Figura 18 muestra la comparación de las eficacias médicas del conjugado OSK-1 -IL-17A y el conjugado KLH-IL-17A basado en el grosor de la oreja de ratones modelo de dermatitis psoriasiforme inducida por imiquimod.
La Figura 19 muestra los resultados de la tinción con involucrina de la piel de ratones modelo de dermatitis psoriasiforme inducida por imiquimod el día 12 después del comienzo de la inducción de la psoriasis precedida por la vacunación con el conjugado OSK-1 -IL-17A o el conjugado KLH-IL-17A.
La Figura 20 muestra los resultados de la tinción con F4/80 de la piel de ratones modelo de dermatitis psoriasiforme inducida por imiquimod el día 12 después del comienzo de la inducción de la psoriasis precedida por la vacunación con el conjugado OSK-1 -IL-17A o el conjugado KLH-IL-17A.
La Figura 21 muestra los resultados de la tinción con Gr-1 de la piel de ratones modelo de dermatitis psoriasiforme inducida por imiquimod el día 12 después del comienzo de la inducción de la psoriasis precedida por la vacunación con el conjugado OSK-1 -IL-17A o el conjugado KLH-IL-17A.
La Figura 22 muestra la concentración de IL-17 en sangre medida en ratones modelo de dermatitis psoriasiforme inducida por imiquimod que se habían sometido a vacunación con el conjugado OSK-1-IL-17A o el conjugado KLH-IL-17A antes de la inducción de la psoriasis.
La Figura 23 muestra los resultados de la valoración de la eficacia médica de un conjugado OSK-1-PCSK9 basado en la concentración de PCSK9 en sangre.
Descripción de realizaciones
La presente invención proporciona una vacuna conjugada dirigida a una proteína biológica causante de enfermedad. La vacuna de la presente invención contiene un complejo de un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que es igual o sustancialmente igual que la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK) y un epítopo de la proteína biológica causante de enfermedad. Como se usa en la presente memoria, el péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 puede denominarse como péptido OSK-1 u OSK-1. Además, como se usa en la presente memoria, los términos "conjugado" y "complejo" se usan indistintamente.
Como se usa en la presente memoria, el término "vacuna" significa una composición que contiene un inmunógeno que provoca una reacción inmunológica después de administrarse a un animal. Por tanto, dicho de otro modo, la vacuna de la presente invención es una composición inmunogénica. La vacuna de la presente invención no se limita a una vacuna para administrarla con fines preventivos y puede ser una vacuna para administrarla con fines terapéuticos después del inicio de la enfermedad.
La secuencia de aminoácidos que es sustancialmente igual a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 es, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 excepto por las deleciones, sustituciones o adiciones de 1 a 4 aminoácidos. Se prefiere una secuencia de aminoácidos que sea igual a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 excepto por las deleciones, sustituciones o adiciones de 1 a 3 aminoácidos, más preferiblemente de 1 o 2 aminoácidos, aún más preferiblemente de un aminoácido. El péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente igual que la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 es preferiblemente un péptido que tiene una actividad que es sustancialmente igual que la del péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Específicamente, un complejo de este péptido y un epítopo de una proteína biológica tiene una capacidad de inducción de la producción de anticuerpos comparable (por ejemplo, aproximadamente de 0,5 a 2 veces) a la de un complejo del péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y el mismo epítopo de la proteína biológica.
La proteína biológica causante de enfermedad no está particularmente limitada, y los ejemplos incluyen DPP4, IL-17A, IgE y PCSK9. Como se usa en la presente memoria, el término "proteína biológica" significa una proteína endógena. DPP4 (dipeptidil peptidasa-4) es una enzima que degrada la incretina, que está implicada en la secreción de insulina. La incretina es una hormona gastrointestinal que promueve la secreción de insulina durante la hiperglucemia, tal como la hiperglucemia posprandial, para reducir el nivel de glucosa en sangre. Por lo tanto, la inhibición de la función de DPP4 para prevenir la degradación de incretina aumenta la concentración de incretina, promoviendo así la secreción de insulina y mejorando así los síntomas de la diabetes mellitus. Basado en este mecanismo, se han desarrollado y aprobado muchos inhibidores de la DPP4 como fármacos antidiabéticos. Por lo tanto, se esperan vacunas capaces de inducir un anticuerpo anti-DPP4 para tratar la diabetes mellitus.
El epítopo de DPP4 humano usado para un conjugado OSK-1-DPP4 no está particularmente limitado siempre que sea un epítopo capaz de inducir la producción de un anticuerpo que inhiba las funciones de DPP4 (anticuerpo neutralizante). Los ejemplos preferibles del epítopo incluyen péptidos que consisten en una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos.
• ENSTFDEFG (SEQ ID NO: 2)
• NKRQLITEE (SEQ ID NO: 3)
• KNTYRLKLYS (SEQ ID NO: 4)
• YSDESLQYPK (SEQ ID NO: 5)
• PPHFDKSKKY (SEQ ID NO: 6)
• GLPTPEDNLD (SEQ ID NO: 7)
• FSKEAKYYQ (SEQ ID NO: 8)
• NSSVFLENSTFDEFG (SEQ ID NO: 9)
Los números de acceso de la secuencia de aminoácidos de la DPP4 humana y la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la DPP4 humana son NP_001926 (NCBI) y NM_001935 (NCBI), respectivamente.
Los péptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos que es igual que la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 2 a 9 excepto por deleciones, sustituciones o adiciones de 1 o 2 aminoácidos y que son capaces de inducir la producción de un anticuerpo que inhibe las funciones de DPP4 también son preferibles como epítopo de DPP4 humano usado para el conjugado OSK-1-DPP4.
IL-17A (interleucina-17A) es una glicoproteína homodimérica y también se denomina simplemente IL-17. La IL-17A, que es producida principalmente por las células T activadas, actúa sobre una amplia gama de células tales como fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales vasculares y macrófagos para reclutar varios factores tales como citocinas inflamatorias, quimiocinas y factores de adhesión celular, induciendo así la inflamación. Secukinumab, un anticuerpo monoclonal humano de IL-17A anti-humano, se utiliza como un fármaco terapéutico para la psoriasis vulgar y la psoriasis artropática. Además, se informa que la IL-17A está implicada en enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple y el trastorno inflamatorio intestinal, varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el cáncer colorrectal y el cáncer de páncreas, la arteriosclerosis, etc. Por lo tanto, se espera que las vacunas capaces de inducir un anticuerpo anti-IL-17A traten estas enfermedades asociadas a IL-17A. El epítopo de IL-17A humana utilizado para un conjugado OSK-1 -IL-17A no está particularmente limitado siempre que sea un epítopo capaz de inducir la producción de un anticuerpo que inhiba las funciones de IL-17A (anticuerpo neutralizante). Los ejemplos preferibles del epítopo incluyen péptidos que consisten en una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos.
• RSSDYYNR (SEQ ID NO: 10)
• PKRSSDYYNRSTSPW (SEQ ID NO: 11)
• CPNSEDKNFPR (SEQ ID NO: 29)
• RNEDPERYPS (SEQ ID NO: 30)
• NRSTSPW (SEQ ID NO: 31)
• LHRNEDP (SEQ ID NO: 32)
• RYPSVIWEA (SEQ ID NO: 33)
• PKRSSDYYNR (SEQ ID NO: 34)
• TNPKRSSDYYNR (SEQ ID NO: 35)
• TNTNPKRSSDYYNR (SEQ ID NO: 36)
Los números de acceso de la secuencia de aminoácidos de la IL-17A humana y la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la IL-17A humana son NP_002181 (NCBI) y NM_002190 (NCBI), respectivamente.
Los péptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos que es igual que la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 10, 11 y 29 a 36 excepto por las deleciones, sustituciones o adiciones de 1 o 2 aminoácidos y que son capaces de inducir la producción de un anticuerpo que inhibe las funciones de IL-17A también son preferibles como el epítopo de IL-17A humana usado para el conjugado OSK-1-IL-17A. Además, un péptido que consiste en una secuencia parcial que contiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 3 a 10 de SEQ ID NO: 11 también es preferible como el epítopo de la IL-17A humana usado para el conjugado OSK-1 -IL-17A.
La alergia es provocada por sustancias específicas (alérgenos), y después de que un alérgeno ingresa al cuerpo, el sistema inmunitario responde al alérgeno e induce la producción de IgE. Los anticuerpos IgE producidos se unen a los mastocitos y basófilos y se mantienen en la superficie de estas células. Cuando el mismo alérgeno ingresa nuevamente al cuerpo, la IgE y el alérgeno se unen, lo que induce la liberación de mediadores químicos tales como la histamina y el leucotrieno, que desencadenan los síntomas alérgicos. En el caso de que se haya desarrollado una alergia a un alérgeno específico, la sobreproducción de IgE específica contra el alérgeno empeora los síntomas alérgicos. Los síntomas alérgicos se pueden aliviar inhibiendo o eliminando las acciones de la IgE y, por ejemplo, el anticuerpo anti-IgE humano omalizumab se usa para el tratamiento del asma bronquial. Por lo tanto, se espera que las vacunas capaces de inducir un anticuerpo anti-IgE traten enfermedades alérgicas tales como el asma bronquial, la alergia al polen, la conjuntivitis alérgica y la dermatitis atópica.
El epítopo de la IgE humana utilizado para un conjugado OSK-1 -IgE no está particularmente limitado siempre que sea un epítopo capaz de inducir la producción de un anticuerpo que inhiba las funciones de la IgE (anticuerpo neutralizante). Un ejemplo preferible del epítopo es un péptido que consiste en la siguiente secuencia de aminoácidos.
• YQCRVTHPHLP (SEQ ID NO: 12)
Los números de acceso de la secuencia de aminoácidos de la región constante de una cadena £ de inmunoglobulina humana y la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la región constante de una cadena £ de inmunoglobulina humana son P01854 (UniProtKB) y NG_001019 (NCBI), respectivamente.
Los péptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos que es igual que la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 excepto por las deleciones, sustituciones o adiciones de 1 o 2 aminoácidos y que son capaces de inducir la producción de un anticuerpo que inhibe las funciones de la IgE también son preferibles como epítopo de la IgE humana usado para el conjugado OSK-1-IgE.
Las proteínas S100 son una familia de proteínas de unión a calcio con dos dominios mano EF y se expresan de forma específica en el tipo de célula. Hasta el momento, se han identificado 20 subfamilias. S100A9 (también denominada como MRP14) es una proteína S100 de unión a calcio de bajo peso molecular y se sabe que está implicada en varias enfermedades inflamatorias. Además, se observan niveles elevados de S100A9 en suero en pacientes de muchas enfermedades inflamatorias que incluyen arteritis de células gigantes, fibrosis quística, artritis reumatoide, dermatosis, enfermedad intestinal inflamatoria crónica, bronquitis crónica, algunos tumores malignos y enfermedades autoinmunes. Además, según se informa, el bloqueo de S100A9 podría prevenir la formación de trombos sin aumentar el riesgo de hemorragia. Por lo tanto, se espera que las vacunas capaces de inducir un anticuerpo anti-S100A9 prevengan la formación de trombos en la aterotrombosis, el infarto de miocardio y el infarto cerebral. La realización que implica S100A9 no está cubierta por la presente invención.
El epítopo de S100A9 humana usado para un conjugado OSK-1 -S100A9 no está particularmente limitado siempre que sea un epítopo capaz de inducir la producción de un anticuerpo que inhiba las funciones de S100A9 (anticuerpo neutralizante). Un ejemplo preferible del epítopo es un péptido que consiste en la siguiente secuencia de aminoácidos.
• GHHHKPGLGE (SEQ ID NO: 13)
Los números de acceso de la secuencia de aminoácidos de la S100A9 humana y la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la S100A9 humana son NP_002956 (NCBI) y NM_002965 (NCBI), respectivamente.
Los péptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos que es igual que la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 excepto por las deleciones, sustituciones o adiciones de 1 o 2 aminoácidos y que son capaces de inducir la producción de un anticuerpo que inhibe las funciones de S100A9 también son preferibles como epítopo de S100A9 humana usada para el conjugado OSK-1 -S100A9.
La PCSK9 (proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9) se identificó como un gen causante de la hipercolesterolemia familiar. Estudios posteriores confirmaron que PCSK9 degrada los receptores de LDL expresados en la superficie de los hepatocitos y reduce la capacidad del hígado para absorber LDL-C de la sangre. Al inhibir las funciones de PCSK9, se puede prevenir la degradación de los receptores de LDL y se puede facilitar la absorción de colesterol en sangre en el hígado, permitiendo así la reducción del nivel de colesterol en sangre. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-PCSK9 humano evolocumab se utiliza para el tratamiento de la hipercolesterolemia familiar y la hipercolesterolemia, y se han desarrollado fármacos de RNAi que inhiben las funciones de PCSK9. Por lo tanto, se espera que las vacunas capaces de inducir un anticuerpo anti-PCSK9 traten la hipercolesterolemia.
El epítopo de PCSK9 humana usada para un conjugado OSK-1-PCSK9 no está particularmente limitado siempre que sea un epítopo capaz de inducir la producción de un anticuerpo que inhiba las funciones de PCSK9 (anticuerpo neutralizante). Los ejemplos preferibles del epítopo incluyen péptidos que consisten en una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos.
• LRPRGQPNQC (SEQ ID NO: 14)
• SRHLAQASQ (SEQ ID NO: 15)
• SRSGKRRGER (SEQ ID NO: 16)
Los números de acceso de la secuencia de aminoácidos de la PCSK9 humana y la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la PCSK9 humana son NP_777596 (NCBI) y NM_174936 (NCBI), respectivamente.
Los péptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos que es igual que la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 14 a 16 excepto por deleciones, sustituciones o adiciones de 1 o 2 aminoácidos y que son capaces de inducir la producción de un anticuerpo que inhibe las funciones de PCSK9 también son preferibles como el epítopo de PCSK9 humana usada para el conjugado OSK-1 -PCSK9.
En el caso de que se realicen experimentos usando animales de laboratorio (ratones, etc.) para examinar el efecto de la vacuna de la presente invención, es preferible usar una secuencia de epítopo del animal de laboratorio que corresponde a la secuencia de epítopo humana mencionada anteriormente. La secuencia de epítopo del animal de laboratorio que se va a utilizar puede diseñarse mediante el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de una proteína diana obtenida de bases de datos conocidas (NCBI, etc.) con la secuencia de aminoácidos humana correspondiente. La Tabla 1 enumera las secuencias de epítopos de ratón correspondientes a las secuencias de epítopos humanos mencionadas anteriormente de SEQ ID NOs: 2 a 16.
[Tabla 1]
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En la Tabla 1, la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la DPP4 humana se basa en la secuencia de aminoácidos registrada con el número de acceso NP_001926, la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la DPP4 de ratón se basa en la secuencia de aminoácidos registrada con el número de acceso AAH22183, la secuencia de aminoácidos de longitud completa de IL-17A humana se basa en la secuencia de aminoácidos registrada con el número de acceso NP_002181, la secuencia de aminoácidos de longitud completa de IL-17A de ratón se basa en la secuencia de aminoácidos registrada con el número de acceso NP_034682, la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la IgE humana se basa en la secuencia de aminoácidos registrada con el número de acceso P01854, la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la IgE de ratón se basa en la secuencia de aminoácidos registrada con el número de acceso P06336, la secuencia de aminoácidos completa de S100A9 humana se basa en la secuencia de aminoácidos registrada con el número de acceso NP_002956, la secuencia de aminoácidos de longitud completa de S100A9 de ratón se basa en la secuencia de aminoácidos registrada con el número de acceso CAC14292, la secuencia de aminoácidos de longitud completa de PCSK9 humana se basa en la secuencia de aminoácidos registrada con el número de acceso NP_777596, y la secuencia de aminoácidos de longitud completa de PCSK9 de ratón se basa en la secuencia de aminoácidos registrada con el número de acceso NP_705793. Las realizaciones que implican S100A9 no están cubiertas por la invención reivindicada.
La longitud del epítopo de la proteína biológica utilizada para la vacuna de la presente invención no está particularmente limitada, pero la longitud es preferiblemente de 20 aminoácidos o menos, más preferiblemente de 15 aminoácidos o menos, aún más preferiblemente de 13 aminoácidos o menos, aún más preferiblemente 12 aminoácidos o menos, aún más preferiblemente 11 aminoácidos o menos, y aún más preferiblemente 10 aminoácidos o menos. El mínimo de la longitud no está particularmente limitado; pero la longitud es preferiblemente de 3 aminoácidos o más, más preferiblemente de 4 aminoácidos o más, aún más preferiblemente de 5 aminoácidos o más, y aún más preferiblemente de 6 aminoácidos o más.
En el complejo del péptido OSK-1 y el epítopo de la proteína biológica, el péptido OSK-1 y el epítopo pueden conjugarse directamente o a través de un enlazador (usado como sinónimo de espaciador). El enlazador no está particularmente limitado siempre que sea capaz de conectar el péptido OSK-1 con el epítopo de la proteína biológica. Los ejemplos del enlazadores incluyen ácidos aminocarboxílicos tales como p -aminoalanina, ácido Y-aminobutírico, ácido £-aminocaproico, ácido 7-aminoheptanoico, ácido 12-aminoláurico, ácido glutámico y ácido p-aminobenzoico. Otros ejemplos incluyen L-aminoácidos, que están presentes en proteínas naturales, y D-isómeros de las mismas. En los ejemplos de la presente especificación, se usa ácido £-aminocaproico, pero es un ejemplo no limitante.
El orden secuencial del péptido OSK-1 y el epítopo de la proteína biológica en el complejo no está particularmente limitado. El complejo puede tener el péptido OSK-1 en el extremo N-terminal y el epítopo de la proteína biológica en el extremo C-terminal. Además, el complejo puede tener el epítopo de la proteína biológica en el extremo N-terminal y el péptido OSK-1 en el extremo C-terminal. Preferiblemente, el complejo tiene el péptido OSK-1 en el extremo N-terminal y el epítopo de la proteína biológica en el extremo C-terminal.
En el complejo, el aminoácido del extremo N-terminal está preferiblemente acetilado. En el complejo, el aminoácido en el extremo C-terminal está preferiblemente amidado. Más preferiblemente, el aminoácido en el extremo N-terminal del complejo está acetilado y el aminoácido en el extremo C-terminal del complejo está amidado.
El complejo del péptido OSK-1 y el epítopo de la proteína biológica se puede preparar como una proteína de fusión. Por ejemplo, el complejo se puede preparar usando técnicas de ingeniería genética conocidas, específicamente preparando un gen de fusión que codifica una proteína de fusión del péptido OSK-1 y el epítopo de la proteína biológica, construyendo un vector de expresión recombinante que tiene el gen de fusión insertado de forma expresa, transfectando el vector de expresión recombinante en células huésped apropiadas para la expresión de una proteína recombinante y purificando la proteína recombinante. Alternativamente, la preparación del complejo del péptido OSK-1 y el epítopo de la proteína biológica se puede realizar utilizando el gen de fusión descrito anteriormente en combinación con un sistema de transcripción-traducción acoplado in vitro conocido (por ejemplo, un sistema de síntesis de proteínas libre de células derivado de reticulocitos de conejo, germen de trigo o Escherichia coli). Además, en el caso de que se utilice un bacteriófago para proporcionar la expresión del complejo del péptido OSK-1 y el epítopo de la proteína biológica como una proteína recombinante en la superficie del bacteriófago, el complejo expresado en la superficie del fago se puede administrar directamente a un animal objetivo sin aislamiento ni purificación.
El complejo del péptido OSK-1 y el epítopo de la proteína biológica se puede producir mediante un método de síntesis en fase sólida (por ejemplo, el método Fmoc y el método Boc) o un método de síntesis en fase líquida según un protocolo de síntesis de péptido ordinario conocido. En el caso de que el complejo tenga el péptido OSK-1 conjugado directamente con el epítopo de la proteína biológica, o en el caso de que el complejo tenga el péptido OSK-1 conjugado con el epítopo de la proteína biológica a través de un aminoácido apropiado (s ), se puede sintetizar todo el complejo. Alternativamente, el péptido OSK-1 y el epítopo de la proteína biológica pueden sintetizarse por separado antes del acoplamiento de los dos péptidos a través de un enlazador apropiado.
El enlazador puede introducirse mediante un método bien conocido utilizado en la química de síntesis de péptidos. En primer lugar, mediante un método estándar se produce un fragmento de péptido cuyo extremo N-terminal se supone que está acoplado a un enlazador. Después, un ácido aminocarboxílico como enlazador, en el que el grupo amino está apropiadamente protegido, y el fragmento peptídico se condensan en condiciones estándar usando un agente de condensación usado en la química de síntesis de péptidos. Después de eliminar el grupo protector del grupo enlazador, se introduce el aminoácido deseado en la siguiente posición. Un ejemplo de dicho método es el método de síntesis de péptidos en fase sólida empleado a menudo en un sintetizador automático de péptidos. Los ejemplos del grupo protector para el ácido aminocarboxílico usado en dicho procedimiento incluyen un grupo tBOC (tert-butiloxicarbonilo) y un grupo FMOC (fluorenil-metoxicarbonilo). Los ejemplos del agente de condensación incluyen compuestos de carbodiimida tales como DCC (N,N'-diciclohexilcarbodiimida) y EDC (N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida); compuestos de imidazol tales como CDI (1,1'-carbonildiimidazol); compuestos de sal de fosfonio tales como BOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfonio); y compuestos de sal de uronio tales como HBTU hexafluorofosfato de (O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio) y HCTU hexafluorofosfato de (O-(6-clorobenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio). Además, se puede obtener un conjugado deseado mediante otro procedimiento usando una combinación apropiada de las condiciones anteriores. Específicamente, primero, un fragmento peptídico específico de OSK-1 y un fragmento peptídico de la secuencia del epítopo de la proteína biológica diana se producen por separado y se protegen apropiadamente. A continuación, estos fragmentos se condensan con un grupo enlazador adecuadamente protegido y después se desprotegen en las condiciones apropiadas.
Sin un adyuvante, la vacuna de la presente invención puede inducir un anticuerpo que inhibe las funciones de la proteína biológica causante de la enfermedad y, por lo tanto, es muy útil. Sin embargo, la vacuna de la presente invención puede contener uno o más adyuvantes. En el caso de que la vacuna de la presente invención contenga un adyuvante, el adyuvante se puede seleccionar según corresponda entre los adyuvantes conocidos. Los ejemplos específicos de adyuvantes conocidos incluyen adyuvantes de aluminio (por ejemplo, sales de aluminio tal como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio, o cualquier combinación de las mismos), adyuvante de Freund completo o incompleto, ligandos TLR (por ejemplo, CpG, poli(I:C), Pam3CSK4, etc.), BAY, DC-chol, pcpp, monofosforil lípido A, QS-21, toxina del cólera y péptidos de formilmetionilo. Los adyuvantes preferibles son adyuvantes de aluminio, ligandos TLR y una combinación de estos. En el caso de que la vacuna de la presente invención contenga un adyuvante, la cantidad del adyuvante no está particularmente limitada y puede seleccionarse según corresponda según el tipo de adyuvante, etc. Por ejemplo, en el caso de que un adyuvante de aluminio (hidróxido de aluminio) y CpG se usen en combinación, es preferible que la vacuna contenga una cantidad de aproximadamente 1 a 100 veces del adyuvante de aluminio y una cantidad de aproximadamente 1 a 50 veces de CpG en relación a la cantidad de la proteína de fusión de la presente invención en masa.
La vacuna de la presente invención se puede administrar por vía oral o parenteral. Los ejemplos de la administración parenteral incluyen la administración intraperitoneal, la administración subcutánea, la administración intracutánea, la administración intramuscular, la administración intravenosa, la administración intranasal, la administración transdérmica, la administración transmucosa, la administración sublingual y la administración por inhalación. Se prefiere la administración parenteral y son más preferidas la administración intracutánea, la administración subcutánea y la administración intramuscular. Para la administración parenteral, puede emplearse la inyección con microagujas, la inyección sin agujas, un método de estampación, etc.
Para la formulación de la vacuna de la presente invención, el complejo del péptido OSK-1 y el epítopo de la proteína biológica, un vehículo farmacéuticamente aceptable y, si es necesario, un aditivo, se mezclan y forman una forma de dosificación. Los ejemplos específicos de la forma de dosificación incluyen preparaciones orales tales como comprimidos, comprimidos recubiertos, píldoras, polvos, gránulos, cápsulas, soluciones, suspensiones y emulsiones; y preparaciones parenterales tales como inyecciones, infusiones, supositorios, ungüentos y parches. La cantidad del vehículo o del aditivo que se va a utilizar se determina según corresponda basándose en el intervalo de cantidades convencionalmente utilizado en el campo farmacéutico. El vehículo o el aditivo que se puede usar no está particularmente limitado, y los ejemplos incluyen varios vehículos tales como agua, solución salina fisiológica, otros disolventes acuosos y bases acuosas u oleosas; y diversos aditivos tales como excipientes, aglutinantes, ajustadores de pH, disgregantes, potenciadores de la absorción, lubricantes, colorantes, correctores y fragancias.
Los ejemplos del aditivo usado para preparaciones orales sólidas incluyen excipientes tales como lactosa, manitol, glucosa, celulosa microcristalina y almidón de maíz; aglutinantes tales como hidroxipropilcelulosa, polivinilpirrolidona y aluminometasilicato de magnesio; dispersantes tales como almidón de maíz; disgregantes tales como carboximetilcelulosa de calcio; lubricantes tales como estearato de magnesio; agentes solubilizantes tales como ácido glutámico y ácido aspártico; estabilizadores; polímeros solubles en agua que incluyen celulosas tales como hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y metilcelulosa, y polímeros sintéticos tales como polietilenglicol, polivinilpirrolidona y alcohol polivinílico; edulcorantes tales como azúcar blanco, azúcar en polvo, sacarosa, fructosa, glucosa, lactosa, jarabe de azúcar de malta reducido (jarabe de maltitol), jarabe de azúcar de malta reducido en polvo (jarabe de maltitol en polvo), jarabe de maíz con alto contenido de glucosa, jarabe de maíz con alto contenido de fructosa, miel, sorbitol, maltitol, manitol, xilitol, eritritol, aspartamo, sacarina y sacarina de sodio; y agentes de recubrimiento tales como azúcar blanco, gelatina, hidroxipropilcelulosa y ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa.
La formulación de preparaciones orales líquidas implica disolución, suspensión o emulsificación en un diluyente de uso general. Los ejemplos del diluyente incluyen agua purificada, etanol y una mezcla de los mismos. Las preparaciones líquidas orales pueden contener además un agente humectante, un agente de suspensión, un emulsionante, un edulcorante, un agente aromatizante, una fragancia, un conservante, un agente de tamponamiento y/o similares.
Los ejemplos del aditivo usado para inyecciones para administración parenteral incluyen agentes isotonizantes tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, glicerina, manitol, sorbitol, ácido bórico, bórax, glucosa y propilenglicol; agentes de tamponamiento tales como una solución tampón de fosfato, una solución tampón de acetato, una solución tampón de borato, una solución tampón de carbonato, una solución tampón de citrato, una solución tampón Tris, una solución tampón de glutamato y una solución tampón de £-aminocaproato; conservantes tales como parahidroxibenzoato de metilo, parahidroxibenzoato de etilo, parahidroxibenzoato de propilo, parahidroxibenzoato de butilo, clorobutanol, alcohol bencílico, cloruro de benzalconio, deshidroacetato de sodio, edetato de disodio, ácido bórico y bórax; espesantes tales como hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, alcohol polivinílico y polietilenglicol; estabilizadores tales como hidrogenosulfito de sodio, tiosulfato de sodio, edetato de disodio, citrato de sodio, ácido ascórbico y dibutilhidroxitolueno; y ajustadores de pH tales como ácido clorhídrico, hidróxido de sodio, ácido fosfórico y ácido acético. La inyección puede contener además un solubilizante apropiado. Los ejemplos del solubilizante incluyen alcoholes tales como etanol; polialcoholes tales como propilenglicol y polietilenglicol; y tensioactivos no iónicos tales como polisorbato 80, aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno 50, lisolecitina y poliol Plurónico. Las preparaciones líquidas tales como las inyecciones se pueden conservar en estado de congelación o en estado seco después de la eliminación del agua por liofilización, etc. Las preparaciones liofilizadas se pueden reconstituir en agua destilada para inyección o similar justo antes de su uso.
La vacuna de la presente invención se puede administrar a cualquier animal (un animal humano o no humano) con un sistema inmunitario. Los ejemplos del animal incluyen mamíferos tales como humanos, monos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos, cobayas, ratas y ratones; y aves tales como pollos, patos y gansos. La vacuna de la presente invención es útil como fármaco veterinario, pero se usa preferiblemente para niños humanos y adultos humanos.
En la administración de la vacuna de la presente invención, la frecuencia y el intervalo de dosificación no están particularmente limitados. Por ejemplo, la vacuna se puede administrar una vez o múltiples veces a intervalos de aproximadamente dos días a aproximadamente ocho semanas. La dosis de la vacuna varía con el sujeto de administración, el método de administración, etc., pero la dosis por administración es preferiblemente de aproximadamente 0,01 gg a aproximadamente 10 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 gg a aproximadamente 1 mg, y aún más preferiblemente de aproximadamente 1 gg a aproximadamente 0,1 mg.
La presente invención incluye un método para prevenir o tratar una enfermedad provocada por una proteína biológica diana, comprendiendo el método administrar una cantidad eficaz de la vacuna de la presente invención a un animal.
Además, la presente invención incluye la vacuna de la presente invención para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad provocada por la proteína biológica.
Además, la presente invención incluye el uso de la vacuna de la presente invención para la producción de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una enfermedad provocada por la proteína biológica.
OSK-1, que se utiliza como proteína transportadora para el epítopo de la proteína biológica causante de la enfermedad en la vacuna de la presente invención, es un péptido de 20 aminoácidos con una antigenicidad muy baja. Por lo tanto, es menos probable que OSK-1 cause efectos desfavorables y efectos secundarios atribuibles a la proteína transportadora per se. A pesar de su corta longitud, OSK-1 tiene un fuerte efecto adyuvante y, por lo tanto, es capaz de impartir a la vacuna una capacidad eficaz para inducir la producción de anticuerpos. Además, el complejo de OSK-1 y el epítopo de la proteína biológica es capaz de inducir la producción no solo de anticuerpos de tipo Th2 tal como IgG1, sino también de una gran cantidad de anticuerpos de tipo Th1 tales como IgG2a, IgG2b e IgG3. Por lo tanto, es menos probable que el complejo cause efectos secundarios tales como reacciones alérgicas y es muy útil. Además, en el caso de que se utilicen proteínas transportadoras de origen natural, tales como KLH, sus impurezas pueden presentar un problema, pero OSK-1 está libre de dicho problema porque OSK-1 puede producirse mediante síntesis química. Además, el péptido corto OSK-1 es ventajoso en términos de costes de producción reducidos.
Ejemplos
A continuación, la presente invención se ilustrará en detalle mediante ejemplos, pero la presente invención no se limita a ellos.
Ejemplo de producción de péptido
Se sintetizó una resina unida a un péptido protegido mediante el método Fmoc utilizando un sintetizador de fase sólida completamente automático según el protocolo descrito en: Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce (1984)); Fmoc Solid Synthesis: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); The Fifth Series of Experimental Chemistry (Jikken Kagaku Kouza), vol. 16, Synthesis of Organic Compounds IV; o similares. A la resina unida al péptido protegido, se añadieron ácido trifluoroacético (TFA) y un depurador (una mezcla de tioanisol, etanoditiol, fenol, triisopropilsilano, agua y similares) para la escisión del péptido protegido de la resina y la desprotección del mismo. Por lo tanto, el péptido de interés se obtuvo como producto bruto. Para la purificación del péptido, el producto bruto se aplicó a una columna de HPLC de fase reversa (ODS) y la elución se realizó con un gradiente de TFA-H2O al 0,1 %/CH3CN. Las fracciones que contenían el péptido de interés se combinaron y liofilizaron y se obtuvo el péptido de interés. La secuencia de aminoácidos del péptido sintetizado se confirmó con el secuenciador de aminoácidos G1000A (Hewlett Packard), PPSQ-23A (Shimadzu Corporation) o Procise cLC (ABI). El péptido obtenido se sometió a acetilación del extremo N-terminal.
Ejemplo 1: Examen de la producción de anticuerpos inducida por el conjugado OSK-1-DPP4 - Parte 1
Un conjugado OSK-1-DPP4 compuesto por un péptido OSK-1 (SEQ ID NO: 1) conjugado con un péptido epítopo DPP4 de ratón (SEQ ID NO: 17) a través de un enlazador s-Acp (Ac-ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK-X-ENSTFESFG (X = s-Acp)) se evaluó para determinar el efecto inductor de la producción de anticuerpos. Para esta prueba, se prepararon los siguientes dos grupos: un grupo de solución salina fisiológica y un grupo del conjugado OSK-1 -DPP4 (100 gg/ratón) (6 animales por grupo). Las muestras de prueba se administraron por vía intracutánea a ratones Balb/c 3 veces a intervalos de 2 semanas. Antes de la primera administración y cada 2 semanas hasta 8 semanas después de la primera administración, se recogieron muestras de sangre y se midió el título de anticuerpos contra el péptido epítopo DPP4 mediante ELiSa .
Los resultados se muestran en la Figura 1. Después de la administración del conjugado OSK-1-DPP4, se observó la producción de anticuerpos contra el péptido epítopo DPP4.
Ejemplo 2: Examen de la producción de anticuerpos inducida por el conjugado OSK-1-DPP4 - Parte 2
El efecto inductor de la producción de anticuerpos del mismo conjugado OSK-1-DPP4 que se usó en el Ejemplo 1 se comparó con el de un conjugado de KLH (hemocianina de lapa californiana) y el péptido epítopo DPP4 de ratón (SEQ ID NO: 17) (KLH- DPP4). Para esta prueba, se prepararon los siguientes tres grupos: un grupo del conjugado KLH-DPP4 (20 gg/ratón), un grupo del conjugado OSK-1-DPP4 (100 gg/ratón) y un conjugado del OSK-1-DPP4 (100 gg /ratón) más un grupo de Alumbre (Alhydrogel al 2% (InvivoGen) 1 mg/ratón) (2 animales por grupo). Las muestras de prueba se administraron por vía intracutánea a ratones Balb/c 3 veces a intervalos de 2 semanas. Antes de la primera administración, cada 2 semanas hasta 6 semanas después de la primera administración y 12 semanas después de la primera administración, se recogieron muestras de sangre y se midió el título de anticuerpos contra el péptido epítopo DPP4 mediante ELISA.
Los resultados se muestran en la Figura 2. La capacidad de inducir la producción de anticuerpos del conjugado OSK-1-DPP4 fue comparable a la del conjugado KLH-DPP4. Además, se observó un efecto sinérgico en el conjugado OSK-1-DPP4 más el grupo de Alumbre.
Ejemplo 3: Análisis de la subclase IgG de los anticuerpos producidos
La subclase de anticuerpos IgG producidos por vacunación con el mismo conjugado OSK-1-DPP4 que se usó en los Ejemplos 1 y 2 se comparó con la de anticuerpos producidos por vacunación con el mismo conjugado KLH-DPP4 que se usó en el Ejemplo 2. Para esta prueba, se prepararon los siguientes tres grupos: un grupo de conjugado OSK-1-DPP4 (100 gg/ratón), un grupo del conjugado Kl H-DPP4 (20 gg/ratón) más Alumbre (Alhydrogel al 2% (InvivoGen) 1 mg/ratón) y un grupo del conjugado KLH-DPP4 (20 gg/ratón) más OSK-1 (100 gg/ratón). Las muestras de prueba se administraron por vía intracutánea a ratones Balb/c 3 veces a intervalos de 2 semanas y 9 semanas después del comienzo de la administración, 4 veces en total. A las 11 semanas después del comienzo de la administración, se recogieron muestras de sangre y se midió mediante ELISA el título de cada subclase IgG de anticuerpos contra el péptido epítopo DPP4.
Los resultados se muestran en la Figura 3. En el grupo del conjugado KLH-DPP4 más Alumbre, el título de IgG1, que es una subclase de IgG de tipo Th2, tenía tendencia a ser particularmente más alto que el de otras subclases de IgG. En el grupo del conjugado OSK-1 -DPP4, IgG2a e IgG2b, que son subclases de IgG de tipo Th1, también se produjeron en niveles elevados además de IgG1. De manera similar, en el grupo del conjugado KLH-DPP4 más OSK-1, los títulos de IgG2b e IgG3, que son subclases de IgG de tipo Th1, fueron altos.
Ejemplo de referencia 1: Examen del efecto antitumoral del conjugado OSK-1-WT1 - Parte 1
Un conjugado OSK-1-WT1 compuesto por el péptido OSK-1 (SEQ ID NO: 1) conjugado con un péptido WT1 (SEQ ID NO: 28) a través de un enlazador s-Acp (Ac-ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK-X-RMFPNAPYL (X = e-Acp)) se evaluó para el efecto antitumoral. Además, también se examinó el efecto adyuvante del péptido OSK-1 sobre el efecto antitumoral de una vacuna del péptido WT1. Para esta prueba, se prepararon los siguientes cuatro grupos: un grupo de solución salina fisiológica, un grupo del péptido WT1 (100 gg/ratón) más poli(I:C) (InvivoGen; Poly(I:C) HMW VacciGrade, 50 gg/ratón), un grupo del péptido WT1 (100 gg/ratón) más péptido OSK-1 (100 gg/ratón) y un grupo del conjugado OSK-1 -WT1 (350 gg/ratón) (6 animales por grupo). Las vacunas se administraron a ratones C57BL/6J una vez a la semana, 4 veces en total. Una semana después de la 4a administración, las células de melanoma B16F10 (1 x 105 células/ratón) se implantaron en la piel dorsal. Las vacunas se administraron nuevamente una semana después de la implantación celular. El peso corporal y el diámetro del tumor se midieron dos veces por semana después de la implantación celular. El diámetro del tumor se midió utilizando un calibrador digital y el volumen del tumor se calculó mediante la fórmula: (eje mayor) x (eje menor)2.
Los resultados del volumen del tumor se muestran en la Figura 4, y los resultados de la tasa de supervivencia se muestran en la Figura 5. En el grupo en el que se administró la vacuna del péptido WT 1 en combinación con el péptido OSK-1 como adyuvante, no se observó el efecto inhibitorio sobre el crecimiento del tumor, ni el beneficio de supervivencia. Por el contrario, en el grupo del conjugado OSK-1-WT1, se observaron el efecto inhibitorio sobre el crecimiento del tumor y el beneficio de supervivencia.
Ejemplo de referencia 2: Examen del efecto antitumoral del conjugado OSK-1-WT1 - Parte 2
Se evaluó el efecto antitumoral del mismo conjugado OSK-1-WT1 que se usó en el Ejemplo de Referencia 1. Para esta prueba, se prepararon los siguientes cuatro grupos: un grupo de solución salina fisiológica, un grupo del péptido WT1 (100 gg/ratón) más poli (I:C) (InvivoGen; Poly (I:C) HMW VacciGrade, 50 gg/ratón), un grupo del conjugado OSK-1-WT1 (350 gg/ratón) y un grupo de cisplatino (5 mg/kg) (10 animales por grupo). Las células de melanoma B16F10 (3 x 105 células/ratón) se implantaron en ratones C57BL/6J, y el mismo día, las vacunas se administraron por vía intracutánea en la piel dorsal. El día de la implantación celular se designó como Día 0. Las vacunas se administraron en el Día 7, Día 14, Día 21, Día 28 y Día 35. Dos veces por semana después de la implantación celular, se midió el diámetro del tumor con un calibrador digital, y el volumen del tumor se calculó mediante la fórmula: (eje mayor) x (eje menor)2.
Los resultados del volumen del tumor se muestran en la Figura 6, y los resultados de la tasa de supervivencia se muestran en la Figura 7. En el caso en el que la vacunación comenzó el día de la implantación celular, el efecto inhibidor del conjugado OSK-1-WT1 sobre el crecimiento del tumor fue modesto, pero el volumen del tumor se mantuvo en niveles más bajos que los del grupo de administración de solución salina fisiológica (control negativo) hasta el Día 32. Además, el beneficio de supervivencia en el grupo del conjugado OSK-1-WT1 fue comparable a los del grupo del péptido WT1 más poli(I:C) y el grupo de cisplatino.
Ejemplo 4: Examen de la producción de anticuerpos inducida por conjugados OSK-1-DPP4 - Parte 3
Siete tipos de péptidos epítopo DPP4 de ratón (SEQ ID NOs: 3, 5, 6, 8, 18, 19 y 20) y un tipo de péptido epítopo DPP4 humano (SEQ ID NO: 9) se conjugaron por separado con el péptido OSK-1 (SEQ ID NO: 1) a través de un enlazador s-Acp para producir 8 tipos de conjugados OSK-1 -DPP4. En lo sucesivo, cada conjugado OSK-1 -DPP4 se denomina como "número de ID de secuencia de OSK1-DDP4".
Seis tipos de conjugados OSK-1-DPP4 que contenían diferentes péptidos epítopos DPP4 de ratón (SEQ ID NOs: 3, 5, 6, 8, 18 y 19) se administraron por vía intracutánea a ratones Balb/c a una dosis de 100 gg por animal 3 veces a intervalos de 2 semanas. Antes de la primera administración y cada 2 semanas después de la primera administración, se recogieron muestras de sangre y se midió el título de anticuerpos contra cada péptido epítopo mediante ELISA.
Los títulos de anticuerpos medidos 4 semanas después de la primera administración se muestran en la Tabla 2. El título de anticuerpos se expresa como la mitad del valor máximo. La mitad del valor máximo es un valor de un factor de dilución en el que la absorbancia de la muestra de suero es la mitad de la absorbancia máxima medida en un dispositivo de medición. La mitad del valor máximo se puede obtener a partir de una curva sigmoidea creada al trazar los factores de dilución del suero frente a las absorbancias medidas.
[Tabla 2]
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Tres tipos de conjugados OSK-1-DPP4, OSK1-DDP4-6, OSK1-DDP4-9 y OSK1-DDP4-12, se administraron por vía intracutánea a ratones Balb/c a una dosis de 250 gg por animal 3 veces a intervalos de 2 semanas. A las 4, 9 y 13 semanas después de la primera administración, se recogieron muestras de sangre y se midió el título de anticuerpos contra cada péptido epítopo mediante ELISA.
Los resultados se muestran en la Tabla 3. El título de anticuerpos se expresa como la mitad del valor máximo.
[Tabla 3]
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Ejemplo 5: Evaluación del conjugado OSK-1-DPP4 mediante la medición del nivel de HbAlc
Se administró por vía intracutánea un conjugado OSK-1-DPP4 compuesto por el péptido OSK-1 (SEQ ID NO: 1) conjugado con el péptido epítopo DPP4 (SEQ ID NO: 6) a través de un enlazador s-Acp a una dosis de 100 gg por animal 3 veces a intervalos de 2 semanas a ratones Balb/c a los que se les había dado libre acceso a una dieta rica en grasas (DIO SERIES DIET D12492, CLEA Japón). A los 57 días después de la primera administración, se recogieron muestras de sangre y, tan pronto como fue posible, cada una de las muestras de sangre se transfirió parcialmente a un tubo separado que contenía EDTA. Cada tubo se invirtió para mezclar y se prepararon muestras de sangre tratada con EDTA. Aproximadamente 20 gl de cada muestra de sangre tratada con EDTA se transfirieron a un microtubo para la medición de HbAlc, y el nivel de HbAlc se midió utilizando el analizador Quo-Lab HbAlc (Nipro). Los resultados muestran que el nivel de HbAlc (%, NGSP) del grupo del conjugado OSK-1-DPP4 mejoró (se redujo en un 0,4 %) en comparación con el del grupo de control (grupo de administración de KLH).
Ejemplo 6: Evaluación de conjugados OSK-1-DPP4 mediante la prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT)
Dos tipos de conjugados OSK-1-DPP4 compuestos por el péptido OSK-1 (SEQ ID NO: 1) conjugado con el péptido epítopo de DPP4 (SEQ ID NO: 6 o 9) a través de un enlazador s-Acp se administraron por vía intracutánea a una dosis de 250 gg por animal 3 veces a intervalos de 2 semanas a ratones Balb/c a los que se les había dado libre acceso a una dieta rica en grasas (DIO SERIES DIET D12492, CLEA Japón). Los conjugados OSK-1-DPP4 se administraron intracutáneamente además a una dosis de 250 gg por animal 63 días después de la primera administración. Se realizó una prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT) a los 77 días después de la primera administración. Los ratones estuvieron en condiciones de ayuno durante aproximadamente 16 horas antes de la prueba de OGTT, y durante la prueba de OGTT, los ratones todavía estaban en condiciones de ayuno. Se administró por vía oral una solución de glucosa al 20% en una dosis única de 5 mL/kg a los ratones. La recolección de sangre y la medición del nivel de glucosa en sangre se realizaron en condiciones sin anestesia. La cola del ratón se cortó suavemente con una hoja de afeitar y se midió la concentración de glucosa en la sangre que se escapaba del corte con un sistema de control de glucosa en sangre (Nipro, FreeStyle Freedom). Los niveles de glucosa en sangre se midieron antes de la carga de glucosa y a los 30, 60, 90 y 120 minutos después de la carga de glucosa, en 5 puntos de tiempo en total. Los niveles de glucosa en sangre de cada grupo se representaron frente al tiempo y se calculó el área bajo la curva de glucosa en sangre (AUC de glucosa) (tiempo*mg/dl). Los resultados muestran que las AUCs de ambos grupos de administración del conjugado OSK-1-DPP4 fueron más bajas que las del grupo de control (grupo de administración de KLH).
Ejemplo 7: Examen de la producción de IgE inducida por el conjugado OSK-1-DPP4
En cuanto a la producción de IgE frente a una proteína diana, se comparó OSK1-DPP4-17 con KLH-DPP4-17, que utilizaba KLH como proteína transportadora en lugar de OSK1. A un grupo de KLH-DPP4-17 de ratones, se les administró por vía intracutánea KLH-DPP4-17 y Alumbre (Alhydrogel al 2% (InvivoGen)) como una mezcla en dosis de 20 gg/ratón y 1 mg/ratón, respectivamente. A un grupo de OSK-1 -DPP4-17 de ratones, se administró OSK-1 -DPP4-17 por vía intracutánea a una dosis de 100 gg/ratón. En cualquier grupo, el conjugado se administró por vía intracutánea a ratones Balb/c 3 veces a intervalos de 2 semanas, y la cuarta administración se realizó 11 semanas después de la primera administración. A las 21 semanas después de la primera administración, se recogieron muestras de sangre y se midió mediante ELISA la cantidad de anticuerpos IgE en suero frente a DPP4.
Los resultados se muestran en la Figura 8. Se observó producción de IgE frente a la proteína diana en el grupo de KLH-DPP4-17, pero no se observó producción de IgE frente a la proteína diana en el grupo de OSK1-DPP4-17. Ejemplo 8: Examen de la producción de anticuerpos inducida por conjugados OSK-1-IL-17A
(1) Producción de conjugados OSK-1-IL-17A
Diez tipos de péptidos epítopo de IL-17A de ratón (SEQ ID NOs: 21,22, 31 a 33 y 37 a 41) se conjugaron por separado con el péptido OSK-1 (SEQ ID NO: 1) a través de un enlazador s-Acp para producir 10 tipos de conjugados OSK-1 -IL-17A. En lo sucesivo, cada conjugado OSK-1 -IL-17A se denomina como "número de ID de secuencia de OSK1 -IL". Las Figuras 9 a 12 muestran (A) los resultados del análisis de aminoácidos y (B) los resultados del análisis de HPLC de 4 tipos representativos de conjugados que contienen diferentes péptidos epítopos (SEQ ID NOs: 21, 31, 32 y 40). Los resultados de los análisis de los otros conjugados fueron sustancialmente los mismos que estos resultados.
(2) Medición del título de anticuerpos
Diez tipos de conjugados OSK-1 -IL-17A se administraron por vía intracutánea a ratones Balb/c en las dosis indicadas en la Tabla 4 tres veces a intervalos de 2 semanas. Antes de la primera administración y cada 2 semanas hasta 6 semanas después de la primera administración, se recogieron muestras de sangre y se midió el título de anticuerpos frente a cada péptido epítopo mediante ELISA.
Los resultados obtenidos 6 semanas después de la primera administración se muestran en la Tabla 4. Los títulos de anticuerpos medidos 2, 4 y 6 semanas después de la primera administración se muestran en la Figura 13. El título de anticuerpos se expresa como la mitad del valor máximo.
[Tabla 4]
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Ejemplo 9: Evaluación de conjugados OSK-1-IL-17A en ratones modelo de dermatitis psoriasiforme inducida por imiquimod - Parte 1
Como modelo de psoriasis se utilizó un modelo de dermatitis psoriasiforme inducida por imiquimod. Se administraron por vía intracutánea tres tipos de conjugados OSK-1-IL-17A (OSK1-IL-31, OSK1-IL-32 y OSK1-IL-40) a ratones BALB/c de 6 semanas de edad a una dosis de 500 pg por animal 3 veces a intervalos de 2 semanas. A las 2 semanas después de la 3a vacunación, se afeitó la piel dorsal y se depiló con una crema depilatoria. A la piel denudada, se aplicó Beselna Cream al 5% (nombre comercial, Mochida Pharmaceutical Co., LTD.) a una dosis diaria de 62,5 mg de imiquimod durante 8 días para la inducción de psoriasis. En las orejas se aplicó Beselna Crema al 5% a una dosis diaria de 0,35 mg de imiquimod por oreja durante 8 días para la inducción de psoriasis.
Las afecciones de la piel (eritema, el grado de endurecimiento, el área de la piel cubierta con escamas de color blanco plateado) se observaron diariamente durante 8 días desde el inicio de la inducción de la psoriasis (Día 0 a Día 7) y se puntuaron en una escala de 5 puntos de 0 a 4 (0: ninguno, 1: leve, 2: moderado, 3: severo y 4: muy severo) para su evaluación. El grosor de la oreja se midió diariamente durante 8 días desde el inicio de la inducción de la psoriasis (Día 0 a Día 7) utilizando un calibrador digital. Los resultados de las afecciones de la piel se muestran en la Figura 14, y los resultados del grosor de la oreja se muestran en la Figura 15. Los resultados muestran que los cuatro tipos de conjugados OSK-1 -IL-17A alivian la dermatitis psoriasiforme inducida por imiquimod.
Ejemplo 10: Evaluación del conjugado de OSK-1-IL-17A en ratones modelo de dermatitis psoriasiforme inducida por imiquimod - Parte 2
(1) Afección de la piel y grosor de las orejas
OSK1 -IL-21, que es un conjugado OSK-1 -IL-17A, se administró por vía intracutánea a ratones Balb/c a una dosis de 100 gg, 300 gg o 1000 gg por animal 3 veces a intervalos de 2 semanas. Por separado, se administró por vía intracutánea KLH-IL-21, que usaba KLH como proteína transportadora en lugar de OSK-1, a ratones Balb/c a una dosis de 20 gg por animal 3 veces a intervalos de 2 semanas. Para la administración de KLH-IL-21 se utilizó en la primera administración una mezcla de KLH-IL-21 con adyuvante completo de Freund (SIGMA) a 50 gL/ratón, y una mezcla de KLH-IL-21 con adyuvante incompleto de Freund (SIGMA) a 50 gL/ratón en la segunda y tercera administraciones. Los procedimientos fueron los mismos que se usaron en el Ejemplo 9 mostrado anteriormente excepto que se usó una vacuna diferente y que se aplicó Beselna Cream al 5% diariamente durante 13 días.
En la Figura 16 se muestran fotografías de las afecciones de la piel el Día 6 después del inicio de la inducción de la psoriasis. En la Figura 17 se muestran los cambios en las afecciones de la piel durante el período de inducción de la dermatitis psoriasiforme (Día 0 al Día 12), y los cambios en el grosor de la oreja durante el período de inducción de la dermatitis psoriasiforme (Día 0 al Día 7) se muestran en la Figura 18. Los resultados muestran que el conjugado OSK-1-IL-17A es capaz de aliviar de forma más potente la dermatitis psoriasiforme inducida por imiquimod que el conjugado KLH -IL-17A.
(2) Tinción inmunohistoquímica
Después de la inducción de la dermatitis psoriasiforme mediante la aplicación de imiquimod, las células inmunitarias presentes en la piel y la expresión de involucrina en la piel se detectaron mediante tinción inmunohistoquímica.
El día 12 después del inicio de la inducción de la psoriasis, se disecaron la piel dorsal y las aurículas, se fijaron con PFA al 4% y se embebieron en parafina. Después de la preparación de la sección, se realizó el tratamiento de desparafinización y recuperación de antígenos. Después, las secciones se bloquearon para evitar una reacción no específica, se hicieron reaccionar con un anticuerpo primario y se hicieron reaccionar con un anticuerpo secundario marcado. Las secciones se tiñeron para involucrina, que es el marcador final de queratinización, para examinar el grado de queratinización. Las secciones también se tiñeron para el marcador de macrófagos F4/80 y el marcador de granulocitos Gr-1 para detectar células inmunitarias.
Los resultados de la tinción con involucrina se muestran en la Figura 19, los resultados de la tinción con F4/80 se muestran en la Figura 20 y los resultados de la tinción con Gr-1 se muestran en la Figura 21. Como se muestra en estos resultados, la expresión de involucrina, que se observaba localmente en la parte superior del estrato espinoso en la piel normal, estaba ampliamente extendida sobre la epidermis en la piel sometida a la aplicación de imiquimod, lo que representaba un signo de mayor queratinización. En el grupo de administración del conjugado OSK-1-IL-17A, este fenómeno se suprimió notablemente en comparación con el grupo de administración del conjugado KLH-IL-17A. En la piel y las aurículas sometidas a la aplicación de imiquimod, se incrementó más notablemente el número de macrófagos, que son células F4/80 positivas, y el número de granulocitos, que son células Gr-1 positivas. En el grupo de administración del conjugado OSK-1 -IL-17A, la infiltración de estas células inmunitarias se inhibió notablemente en comparación con el grupo de administración del conjugado KLH-IL-17A.
(3) Concentración de IL-17 en sangre
Se recogieron muestras de sangre antes del inicio de la inducción de la psoriasis (Día 0) y en el Día 12 después del inicio de la inducción de la psoriasis, y se midió la concentración de IL-17 en suero utilizando el kit Mouse IL-17 A/F Heterodimer Quantikine ELISA (R&D systems).
Los resultados se muestran en la Figura 22. La Figura 22A muestra los resultados de los ratones antes de la aplicación de imiquimod (Día 0) y la Figura 22B muestra los resultados de los ratones sometidos a la aplicación diaria de imiquimod (Día 12). Como se muestra en la Figura 22B, en los grupos de administración del conjugado OSK-1 -IL-17A, las concentraciones de IL-17A/F en sangre fueron más bajas que las del grupo de administración del conjugado KLH-IL-17A. Además, como se muestra en la Figura 22A, solo en el grupo de administración del conjugado KLH-IL-17A, la concentración de IL-17A/F en sangre se elevó antes de la aplicación de imiquimod.
(4) Expresión de factores relacionados con la inflamación en lesiones de psoriasis
El día 12 después del inicio de la inducción de la psoriasis, se disecaron las lesiones de la piel de la psoriasis y se extrajo el RNA del tejido de la piel utilizando RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit. Los niveles de RNA mensajero de los factores relacionados con la inflamación IL-17A, IL-17F, IL-22 e IL-23 se midieron mediante PCR en tiempo real utilizando los cebadores y la sonda de TaqMan Gene Expression Assays.
Como resultado, los niveles de RNA mensajero de los factores indicados fueron mayores en los ratones no sometidos a la administración del conjugado OSK-1-IL-17A, pero en los grupos de administración del conjugado OSK-1-IL-17A, se suprimió la expresión de los RNA mensajeros de los factores indicados.
En los Ejemplos 9 y 10 mostrados anteriormente, se usaron ratones modelo de dermatitis psoriasiforme inducida por imiquimod para evaluar la eficacia médica del conjugado OSK-1-IL-17A, pero también se usaron ratones modelo de dermatitis psoriasiforme inducida por IL-23 para el mismo propósito. El procedimiento específico se describe, por ejemplo, en W. Jiang et al. ("A Toll-Like Receptor 7, 8, and 9 Antagonist Inhibits Th1 and Th17 Responses and Inflammasome Activation in a Model of IL-23-Induced Psoriasis" W. Jiang, et al., 1784 Journal of Investigative Dermatology (2013), Volume 133) y es el siguiente. Se preparan ratones C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad y se disuelven 0,5 mg de IL-23 de ratón en 20 ml de PBS. Se inyecta por vía intracutánea una alícuota de la solución de IL-23 de ratón en la oreja izquierda de cada ratón, por ejemplo, el Día 0, el Día 2, el Día 4, el Día 6, el Día 10, el Día 12 y el Día 14 para inducir dermatitis. Los ratones con dermatitis inducida se asignan aleatoriamente a grupos y la muestra de prueba o una muestra de control (por ejemplo, PBS) se administra al grupo de ratones correspondiente. La muestra de prueba o la muestra de control se administra por vía subcutánea, por ejemplo, el Día 3, el Día 6, el Día 9, el Día 12 y el Día 15. El grosor de la aurícula se mide con un calibrador digital, por ejemplo, el Día 18. Además, se diseca el pabellón auricular y se analiza histopatológicamente.
Ejemplo 11: Examen de la producción de anticuerpos inducida por el conjugado OSK-1-IgE
Se produjo un conjugado OSK-1-IgE compuesto por el péptido OSK-1 (SEQ ID NO: 1) y un péptido epítopo de IgE de ratón (SEQ ID NO: 23) a través de un enlazador s-Acp y se administró por vía intracutánea a ratones Balb/c a una dosis de 100 o 250 pg por animal 3 veces a intervalos de 2 semanas. Cada 2 semanas después de la primera administración, se recogieron muestras de sangre y se midió el título de anticuerpos frente al péptido epítopo mediante ELISA.
Los títulos de anticuerpos medidos 8 semanas después de la primera administración se muestran en la Tabla 5. El título de anticuerpos se expresa como la mitad del valor máximo.
[Tabla 5]
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Ejemplo 12: Examen de la producción de anticuerpos inducida por conjugados OSK-1-PCSK9
Se produjeron tres tipos de conjugados OSK-1-PCSK9 compuestos por el péptido OSK-1 (SEQ ID NO: 1) conjugado con un péptido epítopo de PCSK9 de ratón (SEQ ID NO: 25, 26 o 27) a través de un enlazador s-Acp y se administraron por vía intracutánea a ratones Balb/c a una dosis de 100 o 250 pg por animal 3 veces a intervalos de 2 semanas. Cada 2 semanas después de la primera administración, se recogieron muestras de sangre y se midió el título de anticuerpos frente a cada péptido epítopo mediante ELISA.
Los títulos de anticuerpos medidos 8 semanas después de la primera administración se muestran en la Tabla 6. El título de anticuerpos se expresa como la mitad del valor máximo.
[Tabla 6]
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Ejemplo 13: Evaluación del conjugado OSK-1-PCSK9 mediante la medición de la concentración de PCSK9 en sangre
La concentración de PCSK9 en suero se midió utilizando las muestras de sangre recogidas de los ratones a los que se les había administrado OSK1-PCSK9-273 veces a una dosis de 250 pg (el grupo de administración del conjugado OSK-1-PCSK9) en el Ejemplo 12. Las muestras de sangre se recogieron antes de la primera administración y a las 2, 4 y 6 semanas después de la primera administración. Por separado, se preparó un grupo de administración de OSK-1 como control, la administración de OSK-1 y la recolección de muestras de sangre se realizaron con el mismo programa que se empleó en el grupo de administración del conjugado OSK-1-PCSK9, y se midió la concentración de PCSK9 en suero. Para la medición de la concentración de PCSK9 en suero, se utilizó el kit Mouse Proprotein Convertase 9/PCSK9 Quantikine ELISA (R&D Systems). Se ha informado previamente que la administración de un anticuerpo PCSK9 induce la elevación de la concentración de PCSK9 en sangre. Se considera que este fenómeno es el resultado de la estabilización de la proteína PCSK9 por el anticuerpo, lo que ralentiza la eliminación de la proteína PCSK9 del cuerpo. En base a esta consideración, la elevación del nivel de PCSK9 en sangre por la vacunación puede considerarse como una evidencia del hecho de que el anticuerpo producido por la vacunación actúa sobre su proteína diana (Peptide-Based Anti-PCSK9 Vaccines - An Approach for Long - Term LDLc Management, PLoS One. 2014; 9(12), An Anti-PCSK9 Antibody Reduces LDL-Cholesterol On Top Of A Statin And Suppresses Hepatocyte SREBP -Regulated Genes; Int. J. Biol. Sci. 2012, 8 (3): 310-327).
Los resultados se muestran en la Figura 23. En el grupo de administración del conjugado OSK-1-PCSK9, los niveles de PCSK9 en sangre de 2 a 6 semanas después de la primera administración se elevaron desde el nivel anterior a la primera administración.
Ejemplo de referencia 3: efecto del conjugado KLH-PCSK9 en los niveles de lípidos en sangre
Para esta prueba, se usó un conjugado KLH-PCSK9 compuesto por un péptido epítopo de PCSK9 de ratón (SEQ ID NO: 26) conjugado con KLH. Se compraron ratones deficientes en ApoE de siete semanas de edad de Charles River Japón. Los ratones se asignaron a un grupo de conjugado KLH-PCSK9 de dosis baja (5 pg (péptido PCSK9)/ratón), un grupo de conjugado KLH-PCSK9 de dosis alta (50 pg (péptido PCSK9)/ratón), un grupo de administración de KLH y un grupo de administración de solución salina fisiológica como control. La cantidad de KLH administrada a los ratones del grupo de administración de KLH fue igual a la cantidad de KLH contenida en el conjugado administrado a los ratones de los grupos de administración del conjugado. El conjugado KLH-PCSK9 o KLH solo se mezcló con un volumen igual de adyuvante de Freund (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) antes de la administración y la mezcla se administró por vía subcutánea. Se utilizó adyuvante de Freund completo en la primera administración, y adyuvante de Freund incompleto en la segunda administración y posteriormente. Los conjugados se administraron 3 veces en total (Día 0, Día 14 y Día 28). A las 24 semanas después de la administración final, se recogieron muestras de sangre y se midieron los niveles de lípidos. Como resultado, en los grupos de administración del conjugado KLH-PCSK9, los niveles de CM (quilomicrones) y VLDL se redujeron a casi la mitad, y el nivel de TG (triglicéridos) se redujo a casi 2/3.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Una vacuna que comprende un complejo de un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que es igual que la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 1 o igual que la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 excepto por las deleciones, sustituciones o adiciones de 1 o 2 aminoácidos y un epítopo de una proteína biológica causante de enfermedad, seleccionada del grupo que consiste en DPP4, IL-17a , IgE y PCSK9.
2. La vacuna según la reivindicación 1, en la que el epítopo de IL-17A es un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 10, 11 y 29 a 36, o un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que es igual que la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 10, 11 y 29 a 36 excepto por las deleciones, sustituciones o adiciones de 1 o 2 aminoácidos.
3. La vacuna según la reivindicación 1, en la que el epítopo de DPP4 es un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 2 a 9, o un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que es igual que la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 2 a 9 excepto por deleciones, sustituciones o adiciones de 1 o 2 aminoácidos.
4. La vacuna según la reivindicación 1, en la que el epítopo de IgE es un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que es igual que la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 excepto por deleciones, sustituciones o adiciones de 1 o 2 aminoácidos.
5. La vacuna según la reivindicación 1, en la que el epítopo de PCSK9 es un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 14 a 16, o un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que es igual que la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 14 a 16 excepto por deleciones, sustituciones o adiciones de 1 o 2 aminoácidos.
6. La vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el epítopo de la proteína biológica se conjuga con el péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 a través del ácido £-aminocaproico.
7. La vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el aminoácido en el extremo N-terminal del complejo está acetilado.
8. La vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el aminoácido en el extremo C-terminal del complejo está amidado.
9. Una composición inmunogénica que comprende un complejo de un péptido como se define en la reivindicación 1.
10. La vacuna de la reivindicación 1 o la composición inmunogénica de la reivindicación 9, para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad.
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