KR20120093932A - Ｉｌ－１７ 패밀리 사이토카인 조성물들 및 용도들 - Google Patents

Abstract

IL-17과 결합하는 비-자연적으로 생기고 재조합으로 변형된 단백질들을 포함하고 돌연변이된 IL-17 사이토카인 서열을 가지는 단백질들을 포함하는, 결합 단백질들, 이러한 분자들을 제조하는 방법들, 또한 이러한 분자들을 치료적, 예방적 및 진단적 제제들로서 사용하는 방법들이 제공된다.

Description

ＩＬ－１７ 패밀리 사이토카인 조성물들 및 용도들 {IL-17 family cytokine compositions and uses}

본 발명의 분야는 단백질 생화학 및 면역학이다. 보다 상세하게는, 본 분야는 변형된 면역조절성 (immunomodulatory) 폴리펩타이드들에 관한 것이다.

면역계는 감염성 제제들 (예로, 바이러스들, 박테리아, 및 다세포성 생물들)로부터, 뿐만 아니라 암 및 신생물들 (neoplasms)로부터 개인들을 보호한다. 면역계는 호중성구 (neutrophils), 단핵구 (monocytes), 대식세포 (macrophages), 가지세포 (dendritic cells, DCs), 호산구 (eosinophils), T 세포, 및 B 세포와 같은 많은 림프계 (lymphoid) 및 골수계 (myeloid) 세포 유형들을 포함하고 있다. 이들 세포들은 사이토카인들 (cytokines)이라고 알려져 있는 신호전달 (signalling) 단백질들을 생산할 수 있다. 사이토카인들은 면역세포 증식, 발생, 분화, 및/또는 이동의 유도, 뿐만 아니라 많은 세포 유형들의 성장 및 분화의 조절을 포함하는 다양한 생물학적 효과들을 매개하는 작은 수용성 단백질들이다 (예를 들어, Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 5P:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol 5:311 (1991); Paul and Seder, Cell 76:241 (1994)을 참조). 사이토카인-유도성 면역 기능들은 면역세포들의 전신적 또는 국소적 축적을 특징으로 하는 염증 반응도 역시 포함할 수 있다. 이들 면역 반응들이 숙주-보호 효과들을 가지더라도, 자가면역 장애들 (다발성 경화증) 및 암/신생물 질환들에서와 같이, 반응이 과다 및/또는 만성 염증에 관여할 때는, 병리학적 결과들을 생산할 수 있다 (Oppenheim and Feldmann (eds.) Cytokine Reference, Academic Press, CA 샌디에고 (2001); von Andrian and Mackay New Engl. J. Med. 343: 1020 (2000); Davidson and Diamond, New Engl. J. Med. 345:340 (2001); Lu et al, Mol. Cancer Res. 4:221(2006); Dagleish and O'Byrne, Cancer Treat Res. 130:1 (2006)).

사이토카인 그룹을 구성하는 단백질들로는 인터루킨 (interleukins), 인터페론 (interferons), 콜로니 자극인자 (colony stimulating factors), 종양괴사인자 (tumor necrosis factors), 및 기타 조절분자들을 포함한다. 예를 들어, 인간 인터루킨-17은 전염증성 (pro-inflammatory) 반응들을 유도하고 매개하는 데 관여한다. IL-17은 공통적으로 알레르기성 반응과 연관되어 있다. IL-17은 많은 세포 유형들 (섬유모세포들, 자궁내피세포들, 표피세포들, 각질형성세포들 및 대식세포들)로부터 서로 다른 많은 사이토카인들 (IL-6, G-CSF, GM-CSF, IL-1β TGF-β TNF-α와 같음), 케모카인들 (chemokines) (IL-8, GRO-α 및 MCP-1을 포함함) 및 프로스타글란딘들 (prostaglandins) (예로, PGE₂)의 생산을 유도한다. 최근 몇 년동안의 풍부한 증거는 수많은 자가면역 및 염증성 병폐에서 중심적 작용인자로서 Th17 세포들을 결부시키고 있다.

따라서, 사이토카인들 및 그들의 수용체들의 기술된 생체내 (in vivo) 활성들은 다른 사이토카인들, 사이토카인 수용체들, 사이토카인 작동제들 (cytokine agonists), 및 사이토카인 길항제들 (cytokine antagonists)의 임상적 잠재력, 및 이에 대한 필요성을 설명하고 있다. 예를 들어, 전염증성 사이토카인 패밀리의 기술된 생체내 활성들은 IL-17 및 IL-23과 같은 전-염증성 분자들의 길항제들로서의 광범위한 임상적 잠재력, 및 이에 대한 필요성을 설명하고 있다.

포유동물들에서는 질환들 및 장애들의 예방 및 치료에 유용한 새로운 조성물들에 대한 지속적인 필요성이 존재한다.

1. Mosmann TR, Coffman RL. Annu Rev Immunol. 1989;7:145-173. 2. Harrington LE, et al. Nat Immunol. 2005;6:1123-1132. 3. Park H, et al. Nat Immunol. 2005;6:1133-1141. 4. Korn T, et al.. IL-17 and Th17 Cells. Annu Rev Immunol. 2009;27:485-517. 5. Weaver CT, Hatton RD, Mangan PR, Harrington LE. Annu Rev Immunol. 2007;25:821-852. 6. Gaffen SL. Nat Rev Immunol. 2009 7. Hymowitz SG, et al. EMBO J. 2001;20:5332-5341. 8. Wright JF, et al. J Biol Chem. 2007;282:13447-13455. 9. Toy D, et al. J Immunol. 2006;177:36-39. 10. Zheng Y, et al. Nat Med. 2008;14:282-289. 11. Ishigame H, et al. Immunity. 2009;30:108-119. 12. O'Connor W, Jr, et al. Nat Immunol. 2009;10:603-609. 13. Novatchkova M, et al.. Trends Biochem Sci. 2003;28:226-229. 14. Kramer JM, et al. J Immunol. 2007;179:6379-6383. 15. Maitra A, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104:7506-7511. 16. Rochman Y, Spolski R, Leonard WJ. Nat Rev Immunol. 2009;9:480-490. 17. Claudio E, et al. J Immunol. 2009;182:1617-1630. 18. Chang SH, Park H, Dong C. J Biol Chem. 2006;281:35603-35607. 19. Qian Y, et al. Nat Immunol. 2007;8:247-256. 20. Kramer JM, et al. J Immunol. 2006;176:711-715. 21. Bazan JF. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990;87:6934-6938. 22. Wright JF, et al. J Immunol. 2008;181:2799-2805. 23. Rickel EA, et al. J Immunol. 2008;181:4299-4310. 24. Shi Y, et al. J Biol Chem. 2000;275:19167-19176. 25. Lee J, et al. J Biol Chem. 2001;276:1660-1664. 26. Rong Z, et al. Cell Res. 2009;19:208-215. 27. Wang X, Lupardus P, Laporte SL, Garcia KC. Annu Rev Immunol. 2009;27:29-60. 28. He XL, Garcia KC. Science. 2004;304:870-875. 29. Wehrman T, et al. Neuron. 2007;53:25-38. 30. Gong Y, Cao P, Yu HJ, Jiang T. Nature. 2008;454:789-793. 31. Wiesmann C, et al. Cell. 1997;91:695-704. 32. Wang X, Baloh RH, Milbrandt J, Garcia KC. Structure. 2006;14:1083-1092. 33. Wiesmann C, Ultsch MH, Bass SH, de Vos AM. Nature. 1999;401:184-188. 34. You Z, et al. Cancer Res. 2006;66:175-183. 35. Li TS, et al.. Cell Signal. 2006;18:1287-1298. 36. LaPorte SL, et al. Cell. 2008;132:259-272. 37. Dukkipati A, et al.. Protein Expr Purif. 2008;62:160-170. 38. Walter TS, et al. Structure. 2006;14:1617-1622. 39. Barton WA, et al.. Protein Sci. 2006;15:2008-2013. 40. Leslie AGW. Joint CCP4 + ESF-EAMCB Newsletter on Protein Crystallography. 1992;26 41. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 1994;50:760-763. 42. Strong M, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103:8060-8065. 43. McCoy AJ, et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 2007;40:658-674. 44. de La Fortelle E, Bricogne G. Methods Enzymol. 1997;276:472-494. 45. Emsley P, Cowtan K. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004;60:2126-2132. 46. Afonine PV, Grosse-Kunstleve RW, Adams PD. The Phenix refinement framework. CCP4 Newsletter. 2005;42 47. Brunger AT. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nat Protoc. 2007;2:2728-2733. 48. Laskowski RA, Moss DS, Thornton JM. Main-chain bond lengths and bond angles in protein structures. J Mol Biol. 1993;231:1049-1067. 49. Hooft RW, Vriend G, Sander C, Abola EE. Errors in protein structures. Nature. 1996;381:272. 50. DeLano WL. DeLano Scientific. San Carlos; CA, USA: 2002. 본 명세서에서 인용된 모든 참고문헌들은 본 명세서에 의해 참고문헌으로 전부 통합되어 있다.

우선권 주장

본 출원은 2009년 10월 10일자로 제출된 미국 가특허출원 일련번호 제 61/278,779호에 관한 우선권을 주장하고, 그의 내용들이 전부 통합되어 있다.

정부 기금

본 발명은 국립보건원 (National Institutes of Health)에 의해 수여되는 (AI51321) 하의 정부 지원으로 작성되었다. 정부는 본 발명에서 소정의 권리들을 가진다.

사이토카인 재조작 (cytokine reengineering)을 지향하는 조성물들 및 방법들이 제공된다.

한 가지 관점에서, 본 기재내용은 예로 도 4D에서의 번호매김에 따라 IL-17F의 약 21-41번, 42-78번, 82-103번, 또는 104-133번 아미노산들; IL-17A의 약 21-39번, 40-76번, 80-101번, 또는 102-131번 아미노산들; IL-17C의 약 44-65번, 78-117번, 121-143번, 또는 153-179번 아미노산들; IL-17D의 약 32-53번, 66-105번, 110-131번, 또는 134-163번 아미노산들; IL-17E의 약 27-49번, 50-87번, 93-114번, 및/또는 120-148번 아미노산들; IL-17B의 약 32-53번, 66-105번, 110-131번, 또는 135-158번 아미노산들:의 하나 이상에 결합하여, IL-17 사이토카인 폴리펩타이드와 특이적으로 결합하는 분리된 항체 (전장 (full length) 항체들, 항체 단편들 및 도메인들을 포함함)를 특징으로 한다.

한 가지 구현예에서, 항체는 IL-17 사이토카인의 영역 1 (Region 1)에서 에피토프와 결합하고, 여기에서 부위 1은 도 4D에서의 번호매김에 따라 IL-17F의 약 21-41번 아미노산들, IL-17A의 약 21-39번 아미노산들, IL-17C의 약 44-65번 아미노산들, IL-17D의 약 32-53번 아미노산들, IL-17E의 약 27-49번 아미노산들, 또는 IL-17B의 약 32-53번 아미노산들에 해당한다.

한 가지 구현예에서, 항체는 IL-17 사이토카인의 영역 2 (Region 2)에서 에피토프와 결합하고, 여기에서 부위 2는 도 4D에서의 번호매김에 따라 IL-17F의 약 42-78번 아미노산들, IL-17A의 약 40-76번 아미노산들, IL-17C의 약 78-117번 아미노산들, IL-17D의 약 66-105번 아미노산들, IL-17E의 약 50-87번 아미노산들, 또는 IL-17B의 약 66-105번 아미노산들에 해당한다.

한 가지 구현예에서, 본 항체는 IL-17 사이토카인의 영역 3 (Region 3)에서 에피토프와 결합하고, 여기에서 부위 3은 도 4D에서의 번호매김에 따라 IL-17F의 약 82-103번 아미노산들, IL-17A의 약 80-101번 아미노산들, IL-17C의 약 121-143번 아미노산들, IL-17D의 약 110-131번 아미노산들, IL-17E의 약 93-114번 아미노산들, 또는 IL-17B의 약 110-131번 아미노산들에 해당한다.

한 가지 구현예에서, 본 항체는 IL-17 사이토카인의 영역 4 (Region 4)에서 에피토프와 결합하고, 여기에서 부위 4는 도 4D에서의 번호매김에 따라 IL-17F의 약 104-133번 아미노산들, IL-17A의 약 102-131번 아미노산들, IL-17C의 약 153-179번 아미노산들, IL-17D의 약 134-163번 아미노산들, IL-17E의 약 120-148번 아미노산들, 또는 IL-17B의 약 135-158번 아미노산들에 해당한다.

한 가지 관점에서, 본 기재내용은 IL-17RA (서열번호 14)의 22-36번 아미노산들, 83-96번 아미노산들, 118-147번 아미노산들, 152-179번 아미노산들, 또는 256-271번 아미노산들과 특이적으로 결합하는 분리된 항체 (전장 항체들, 항체 단편들 및 도메인들을 포함함)를 특징으로 한다.

또 다른 관점에서, 본 기재내용은 IL-17RB (서열번호 15)의 25-39번 아미노산들, 86-100번 아미노산들, 126-155번 아미노산들, 160-187번 아미노산들, 또는 254-269번 아미노산들 및/또는 서열번호 15의 32-44번 (예로, 38-44번) 아미노산들, 82-98번 (예로, 88-98번) 아미노산들, 및 252-269번 (예로, 256-263번) 아미노산들과 특이적으로 결합하는 분리된 항체 (전장 항체들, 항체 단편들 및 도메인들을 포함함)를 특징으로 한다.

또 다른 관점에서, 본 기재내용은 IL-17RC (서열번호 16)의 15-30번 아미노산들, 70-84번 아미노산들, 96-124번 아미노산들, 129-156번 아미노산들, 또는 227-237번 아미노산들 및/또는 서열번호 16의 24-35번, 78-91번, 및 248-257번 아미노산들과 특이적으로 결합하는 분리된 항체 (전장 항체들, 항체 단편들 및 도메인들을 포함함)를 특징으로 한다.

또한 본 기재내용은

* 서열번호 12의 약 21-41번, 42-78번, 82-103번, 및 104-133번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산들이 다른 아미노산으로 돌연변이 또는 결실되고, 또한 예를 들어 폴리펩타이드가 서열번호 12와 100% 일치하지는 않지만 적어도 90, 92, 94, 95, 96, 97, 또는 98% 일치하는 서열을 포함하는 분리된 인터루킨-17F (IL-17F) 폴리펩타이드;

* 서열번호 2의 약 21-39번, 40-76번, 80-101번, 및 102-131번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산들이 다른 아미노산으로 돌연변이 또는 결실되고, 또한 예를 들어 폴리펩타이드가 서열번호 2와 100% 일치하지는 않지만 적어도 90, 92, 94, 95, 96, 97, 또는 98% 일치하는 서열을 포함하는 분리된 인터루킨-17A (IL-17A) 폴리펩타이드;

* 서열번호 4의 약 32-53번, 66-105번, 110-131번, 및 135-158번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산들이 다른 아미노산으로 돌연변이 또는 결실되고, 또한 예를 들어 폴리펩타이드가 서열번호 4와 100% 일치하지는 않지만 적어도 90, 92, 94, 95, 96, 97, 또는 98% 일치하는 서열을 포함하는 분리된 인터루킨-17B (IL-17B) 폴리펩타이드;

* 서열번호 6의 약 44-65번, 78-117번, 121-143번, 및 153-179번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산들이 다른 아미노산으로 돌연변이 또는 결실되고, 또한 예를 들어 폴리펩타이드가 서열번호 6과 100% 일치하지는 않지만 적어도 90, 92, 94, 95, 96, 97, 또는 98% 일치하는 서열을 포함하는 분리된 인터루킨-17C (IL-17C) 폴리펩타이드;

* 서열번호 8의 약 32-53번, 66-105번, 110-131번, 및 134-163번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산들이 다른 아미노산으로 돌연변이 또는 결실되고, 또한 예를 들어 폴리펩타이드가 서열번호 8과 100% 일치하지는 않지만 적어도 90, 92, 94, 95, 96, 97, 또는 98% 일치하는 서열을 포함하는 분리된 인터루킨-17D (IL-17D) 폴리펩타이드;

* 서열번호 10의 약 27-49번, 50-87번, 93-114번, 및 120-148번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산들이 다른 아미노산으로 돌연변이 또는 결실되고, 또한 예를 들어 폴리펩타이드가 서열번호 10과 100% 일치하지는 않지만 적어도 90, 92, 94, 95, 96, 97, 또는 98% 일치하는 서열을 포함하는 분리된 인터루킨-17E (IL-17E) 폴리펩타이드:를 특징으로 한다.

본 폴리펩타이드는 태그들 (tags) 및 면역글로불린 불변 도메인들과 같은 N-말단 및 C-말단 서열들을 포함하는, 추가적인 특징들을 포함할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 기재내용은 첫 번째 및 두 번째 IL-17 폴리펩타이드의 적어도 하나가 변형된 IL-17 폴리펩타이드 (예로, 돌연변이된 IL-17 폴리펩타이드)인, 첫 번째 및 두 번째 IL-17 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 특징으로 한다. 예를 들어, 본 조성물은 두 번째 IL-17 폴리펩타이드와 작동적으로 연결된 첫 번째 변형된 IL-17 폴리펩타이드 (예로, 돌연변이됨)를 포함한다. 한 가지 구현예에서, 두 번째 IL-17 폴리펩타이드도 역시 변형된 (예로, 돌연변이된) IL-17 폴리펩타이드이다. 또 다른 구현예에서, 두 번째 IL-17 폴리펩타이드는 자연적으로 생기는 IL-17 폴리펩타이드와 일치한다 (예로, 성숙한 인간 IL-17, 예로 IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, 및 IL-17F).

첫 번째 및 두 번째 폴리펩타이드들은 상호작용하여 IL-17 이중체 (예로, 단일 사슬 이중체)에 해당하는 구조를 형성할 수 있다. 첫 번째 폴리펩타이드는 두 번째 폴리펩타이드의 N-말단 또는 그 역으로 위치할 수 있다. 폴리펩타이드 사슬은 다른 요소들도 역시 포함할 수 있고; 예로, 이것은 융합 단백질일 수 있다. 폴리펩타이드들의 하나 또는 둘 다는 변형되고, 예로 기준 IL-17 폴리펩타이드와 대비하여 돌연변이 될 수 있다 (예로, 인간 IL-17, 예로 IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, 및 IL-17F). 한 가지 구현예에서, 첫 번째 및 두 번째 폴리펩타이드들은 동일한 폴리펩타이드 사슬의 성분들이다. 한 가지 구현예에서, 첫 번째 및 두 번째 폴리펩타이드들은 나선형-코일 (coiled-coil) 도메인 또는 루이신 지퍼 (leucine zipper)에 의해 작동적으로 연결된다.

한 가지 구현예에서, 첫 번째 폴리펩타이드는 변형된 IL-17A 폴리펩타이드 (예로, 서열번호 2 또는 20과 예로 적어도 85, 90, 95, 또는 98% 일치하는 돌연변이된 인간 IL-17A)를 포함하고, 또한 두 번째 폴리펩타이드는 IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, 및 IL-17F로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 변형된 IL-17 폴리펩타이드 (예로, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 이러한 사이토카인들의 자연적인 성숙한 형태들과 예로 적어도 85, 90, 95, 또는 98% 일치하는 돌연변이된 인간 IL-17 사이토카인) 또는 자연적인 성숙한 형태와 100% 일치하는 폴리펩타이드 (서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 또는 20)를 포함한다. 따라서, 대표적인 조성물들은 A/A 호모이중체 (homodimer), 또는 A/F 헤테로이중체 (heterodimer)에 해당하는 폴리펩타이드들을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 첫 번째 폴리펩타이드로는 변형된 IL-17F 폴리펩타이드 (예로, 서열번호 12와 예로 적어도 85, 90, 95, 또는 98% 일치하는 돌연변이된 인간 IL-17F)를 포함하고, 또한 두 번째 폴리펩타이드로는 IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, 및 IL-17F로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 변형된 IL-17 폴리펩타이드 (예로, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 이러한 사이토카인들의 자연적인 성숙한 형태들과 예로 적어도 85, 90, 95, 또는 98% 일치하는 돌연변이된 인간 IL-17 사이토카인) 또는 자연적인 성숙한 형태와 100% 일치하는 폴리펩타이드 (서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 또는 20)를 포함한다. 따라서, 대표적인 조성물들은 A/A 호모이중체, 또는 A/F 헤테로이중체에 해당하는 폴리펩타이드들을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 첫 번째 폴리펩타이드는 변형된 IL-17 사이토카인 폴리펩타이드 (예로, 서열번호 4, 6, 8, 또는 10과 예로 적어도 85, 90, 95% 일치하는 돌연변이된 인간 IL-17B, IL-17C, IL-17D, 또는 IL-17E)를 포함하고, 또한 두 번째 폴리펩타이드는 IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, 및 IL-17F로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 변형된 IL-17 폴리펩타이드 (예로, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 이러한 사이토카인들의 자연적인 성숙한 형태들과 예로 적어도 85, 90, 95% 일치하는 돌연변이된 인간 IL-17 사이토카인)를 포함한다. 따라서, 대표적인 조성물들은 B/B, C/C, D/D, E/E 호모이중체, 및 다양한 헤테로이중체들에 해당하는 폴리펩타이드들을 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 기재내용은 폴리펩타이드가 IL-17RA의 세포외 도메인과 일치하지 않는, IL-17RA의 IL-17 결합 결정기 (IL-17 binding determinant)를 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 특징으로 한다. 예를 들어, IL-17 결합 결정기는 IL-17RA (서열번호 14)의 약 22-36번, 83-96번, 118-147번, 152-179번, 및 256-271번 아미노산들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 결합 결정기는 예로 IL-17RA의 약 22-36번, 83-96번, 118-147번, 152-179번, 및 256-271번 아미노산들을 포함하는 펩타이드 또는 이로 구성되는 펩타이드일 수 있다. 한 가지 구현예에서, 폴리펩타이드는 IL-17F 및/또는 IL-17A와 결합할 수 있다. IL-17A와 폴리펩타이드의 결합은 IL-17A의 약 21-39번, 40-76번, 80-101번, 및 102-131번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산들과의 접촉을 포함할 수 있다. IL-17C와 폴리펩타이드의 결합은 IL-17C의 약 44-65번, 78-117번, 121-143번, 및 153-179번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산들과의 접촉을 포함할 수 있다.

일정 구현예들에서, 폴리펩타이드는 시스테인 매듭 모티브 (knot motif) 또는 4개-나선 다발 모티브 (helix bundle motif)를 형성할 수 있다. 일정 구현예들에서, 폴리펩타이드는 IL-17RA 폴리펩타이드, 예로 IL-17RA 폴리펩타이드의 세포외 부위 또한 IL-17RC 폴리펩타이드, 예로 IL-17RC 폴리펩타이드의 세포외 부위와 작동적으로 결합된다.

또 다른 관점에서, 본 기재내용은 폴리펩타이드가 IL-17RC의 세포외 도메인과 일치하지 않는, IL-17RC의 IL-17 결합 결정기를 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 특징으로 한다. 폴리펩타이드는 IL-17RA 폴리펩타이드, 예로 IL-17RA 폴리펩타이드의 세포외 부위 또한 IL-17RC 폴리펩타이드, 예로 IL-17RC 폴리펩타이드의 세포외 부위로부터 선택되는 결합 파트너와 작동적으로 결합될 수 있다. 폴리펩타이드는 IL-17 사이토카인 예로 IL-17A와 결합할 수 있고, IL-17A의 약 21-39번, 40-76번, 80-101번, 및 102-131번 또는 IL-17C로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산들과 접촉할 수 있고 또한 IL-17C의 약 44-65번, 78-117번, 121-143번, 및 153-179번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산들과 접촉할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 기재내용은 소단위들이 첫 번째 IL-17 수용체 소단위와 상호작용할 수 있는 첫 번째 단면 및 해당하는 자연적인 IL-17 단백질과 대비하여 두 번째 IL-17 수용체 소단위와 상호작용하는 감소된 능력을 가지거나 능력이 전혀 없는 두 번째 단면을 포함하는 이중체를 형성하는, 첫 번째 및 두 번째 IL-17 소단위를 포함하는 IL-17R 결합 단백질을 특징으로 한다. 예를 들어, 첫 번째 및 두 번째 소단위들은 서로 다르다. 각 소단위는 성숙한 IL-17 사이토카인, 예로 인간 IL-17 사이토카인 (서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 또는 12) 또는 성숙한 마우스 IL-17 사이토카인과 적어도 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 또는 98% 일치할 수 있고, 예로 소단위들 둘 다가 동일한 기준 사이토카인 또는 서로 다른 기준 사이토카인들 (IL-17A 및 IL-17F)일 수 있다.

소정의 구현예들에서, 각 소단위는 서열번호 127의 1-127번 및 서열번호 20의 1-126번에 해당하는 부위에서 성숙한 IL-17 사이토카인과 적어도 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 또는 98% 일치한다.

한 가지 구현예에서, 각 소단위는 성숙한 인간 IL-17 사이토카인 (서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 또는 12)과 대비하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개 이상의 치환들 또는 결실들을 가지고, 바람직하게는 12, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5개 이하를 가진다. 한 가지 구현예에서, 하나의 소단위는 성숙한 인간 IL-17 사이토카인 (서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 또는 12)과 대비하여 1 및 5, 7, 또는 8개 사이 범위의 돌연변이들을 가지고, 다른 하나의 소단위는 성숙한 인간 IL-17 사이토카인 (서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 또는 12)과 대비하여 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산들의 C-말단 결실 또한 임의적으로 1 및 5개 사이 범위의 치환들을 가진다.

한 가지 구현예에서, 이중체의 두 번째 단면은 적어도 1, 2, 또는 3개의 돌연변이들, 예로 적어도 1, 2, 또는 3개의 치환들을 포함한다. 예를 들어, 이중체의 두 번째 단면은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 돌연변이들 (예로, 치환들)을 가진다. 돌연변이들은 하나 이상의 부위들에서 위치할 수 있다. 첫 번째 단면은 성숙한 IL-17 사이토카인, 예로 성숙한 인간 IL-17 사이토카인 (서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 또는 12)과 대비하여 돌연변이라면 모두를 포함하지 않을 수 있다.

한 가지 구현예에서, 이중체의 두 번째 단면은 부위 1 (Site 1)에서 적어도 1, 2, 또는 3개의 돌연변이들, 예로 적어도 1, 2, 또는 3개의 치환들을 포함한다. 예를 들어, 이중체의 두 번째 단면은 부위 1에서 1 및 3, 4, 5, 또는 6개 사이 범위의 돌연변이들 (예로, 치환들)을 가진다.

한 가지 구현예에서, 이중체의 두 번째 단면은 부위 2 (Site 2)에서 적어도 1, 2, 또는 3개의 돌연변이들, 예로 적어도 1, 2, 또는 3개의 치환들을 포함한다. 예를 들어, 이중체의 두 번째 단면은 부위 2에서 1 및 3, 4, 5, 또는 6개 사이 범위의 돌연변이들 (예로, 치환들)을 가진다.

한 가지 구현예에서, 이중체의 두 번째 단면은 부위 3 (Site 3)에서 적어도 1, 2, 또는 3개의 돌연변이들, 예로 적어도 1, 2, 또는 3개의 치환들을 포함한다. 예를 들어, 이중체의 두 번째 단면은 부위 3에서 1 및 3, 4, 5, 또는 6개 사이 범위의 돌연변이들 (예로, 치환들)을 가진다.

첫 번째 및 두 번째 소단위들은 공유적으로 부착될 수 있고, 예로 그들은 동일한 폴리펩타이드 사슬의 성분들일 수 있다. 예를 들어, 그들은 유연성 링커 (flexible linker)에 의해 연결될 수 있다.

한 가지 구현예에서, 결합 단백질은 1% 이하의 IL-17A/A의 사이토카인 활성을 가진다. 예를 들어, 이것은 예로 본 명세서에서 기술된 검정법에 기초하여 IL-17 수용체들을 실질적으로 길항하지 못한다.

한 가지 구현예에서, 결합 단백질은 IL-17A/A, IL-17F/F, 또는 IL-17A/F 보다 100-, 50-, 20-, 10배 정도만 더 약한 IL-17RA 또는 IL-17RC에 대한 친화도를 가진다. 일반적으로, 결합 단백질은 IL-17RA 및 IL-17RC 둘 다에 결합하여 결합 단백질 또한 IL-17RA 및 IL-17RC 둘 다를 포함하는 복합체를 형성할 수 없다. 결합 단백질은 본 명세서에서 기술된 기타 다른 특징들 및 특성들을 가질 수 있다.

본 명세서에서 기술된 결합 단백질은 각 소단위가 성숙한 IL-17 사이토카인, 예로 인간 IL-17 사이토카인 (서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 또는 20)과 적어도 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 또는 98% 일치하고, 또한 포괄적으로 상기 소단위들은 이러한 성숙한 IL-17 폴리펩타이드와 대비하여 다음의 치환들 또는 결실들의 적어도 2, 3, 4, 또는 5개 이상을 포함하는, 두 가지의 IL-17 소단위들을 포함할 수 있다:

* 첫 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 47번 R에 해당하는 위치에서의 치환 (예로, R47E, R47A, 또는 R47D),

* 첫 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 65번 S에 해당하는 위치에서의 치환 (S65K, S65R, 또는 S65W),

* 첫 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 68번 W에 해당하는 위치에서의 치환 (예로, W68A, W68V, W68S, W68Q, 또는 W68N),

* 첫 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 102번 R에 해당하는 위치에서의 치환 (예로, R102A, R102V, R102S, 또는 R102T),

* 두 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 89번 N에 해당하는 위치에서의 치환 (예로, N89A 또는 N89V),

* 두 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 95번 Q에 해당하는 위치에서의 치환 (예로, Q95A 또는 Q95W),

* 두 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 127-132번에 해당하는 위치들에서 하나 이상의 치환들 또는 결실들 (예로, 적어도 128-132번에 해당하는 위치들의 결실).

예를 들어, 결합 단백질은 상기에 표시된 위치들에 관하여 다음의 돌연변이들의 조합들 (예로, 쌍들)의 적어도 하나 이상을 가질 수 있다: (R47, S65), (R47, W68), (R47, R102), (S65, W68), (S65, R102), (R47, N89), (R47, Q95), (N89, R102), (N89, 128-132번의 결실), (R47, N89, R102), (N89, Q95), (W68, R102), (N89, W68), (R47, S65, N89), (R47, W68, N89), (R47, N89, R102), (R47, W68, N89, 128-132번의 결실), (R47, S65, N89, 128-132번의 결실), (S65, N89, 128-132번의 결실), (R47, S65, 128-132번의 결실), 및 (N89, Q95, 128-132번의 결실). 결합 단백질은 본 명세서에서 기술된 기타 다른 특징들 및 특성들을 가질 수 있다.

본 명세서에서 기술된 바와 같이 하나 이상의 사이토카인 소단위들을 인코딩하는 서열들을 포함하는, 본 명세서에서 기술된 폴리펩타이드들을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산들도 역시 특징으로 한다. 본 핵산은 좀 더 나아가 벡터 서열들, 또한 전사 및 해독 조절 서열들을 포함할 수 있다. 이러한 핵산들을 포함하는 숙주 세포들 또한 예로 세포에서 이러한 핵산들을 발현하는 것을 포함하는 방법들도 역시 특징으로 한다. 본 방법들은 좀 더 나아가, 예로 세포들 또는 세포 배지로부터의 정제에 의해 단백질을 회수하는 것을 포함할 수 있다.

좀 더 나아간 특징들 및 장점들은 지금부터 다음의 상세한 설명 및 청구항들에서 보다 상세하게 기술될 것이다.

본 발명을 보다 잘 이해하기 위하여, 소정의 용어들 및 어구들이 하기에 뿐만 아니라 본 명세서를 통하여 정의되고 있다.

정의들

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "유효량 (effective amount)"은 원하는 생물학적 반응을 나타내는 데 필요한 양을 말한다. 약물의 유효량은 원하는 생물학적 종점, 전달될 약물, 추가적인 활성 또는 비활성 성분들이라면 모두의 조성 등과 같은 요인들에 의존하여 다양하게 변화될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "발현 (expression)"은 폴리펩타이드가 DNA로부터 생산되는 공정을 의미한다. 본 공정은 유전자의 mRNA로 전사 및 본 mRNA의 폴리펩타이드로의 해독이 관여한다. 이것이 사용되는 문맥에 의존하여, "발현"은 RNA, 단백질, 또는 둘 다의 생산을 말할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "유전자 산물 (gene product)"는 RNA (예를 들어, 메신저 RNA (mRNA) 또는 마이크로 RNA (miRNA)) 또는 유전자에 의해 인코드되는 단백질을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "분리된 (isolated)"는 실질적으로 순수한 분자를 말한다. 분리된 단백질은 실질적으로 순수하여, 예로 기타의 다른 단백질 분자들이 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 없을 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "조정하다 (modulate)" 및 "조정 (modulation)"은 일반적으로 특이적으로 표적된 유전자들 (그들의 RNA 및/또는 단백질 산물들을 포함함), 신호전달 경로들, 세포들 및/또는 표적된 표현형의 저하조절 (downregulation) (예로, 저해 (inhibition) 또는 억제 (suppression)), 또는 표적된 유전자들의 상승조절 (upregulation) (예로, 유도 또는 증가)를 말한다. 예를 들어, "조정하다" 및 "조정"은 IL-17 수용체 신호전달의 저하조절을 말한다.

"환자들 (patients)" 또는 "개체 (subject)"는 염증성 질환과 같은 질환 또는 병폐를 가지거나 이의 발생 위험이 있거나, 그렇지 않은 경우라면 본 명세서에서 기술된 조성물들 및 방법들로부터 유익을 얻을 수 있는 포유동물, 예로 인간을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "감소시키다 (reduce)"는 발현 또는 유전자 산물 활성에서 저해 (inhibition), 감소 (reduction), 감소 (decrease), 억제 (suppression), 저하조절 (downregulation), 또는 예방 (prevention)이라면 모두를 말한다. 예를 들어, 발현 또는 활성의 수준은 예를 들어 100% 또는 100% 이하, 예를 들어 미저해된 발현 또는 활성의 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하일 수 있다.

용어들 "치료하는 (teating)" 또는 "치료 (treatment)" 또는 "완화 (alleviation)" 또는 "개선 (amelioration)"은 치료적 처치 (therapeutic treatment) 및 예방적 (prophylactic) 또는 예방적 (preventative) 척도들 둘 다를 말하고, 이의 목적은 표적된 병리학적 병폐 또는 장애를 예방하거나 지연시키는 (경감시키는) 것이다.

용어 "IL-17 수용체 (IL-17 receptor)"는 IL-17RA, IL-17RB, IL-17RC, IL-17RD, 및 IL-17RE 수용체들과 같은 IL-17 수용체와 결합하는 단백질들, 상세하게는 이들 수용체들의 인간 이소형들 (isoforms) 및 이들 수용체들의 세포외 도메인들 (extracellular domains)을 말한다.

두 개 서열들 간 "상동성 (homology)" 또는 "서열 일치도 (sequence identity)" (본 용어들은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다)의 계산들은 다음과 같이 수행된다. 서열들은 최적의 비교 목적들을 위해 정렬된다 (예로, 최적을 정렬을 위해 간격들 (gaps)이 첫 번째 및 두 번째 아미노산 또는 핵산 서열의 하나 또는 둘 다에 도입될 수 있다). 최적의 정렬은 간격 페널티 10점 및 간격 연장 패널티 1점으로 블러섬 62 점수매기기 매트릭스 (Blossum 62 scoring matrix)를 사용하는 엠보스 패키지 (EMBOSS package)의 니들 알고리즘에서 시행된 바와 같이 니들만 및 운쉬 (Needleman and Wunsch) 알고리즘을 사용하는 최고의 점수로서 결정된다. Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453; Kruskal, J. B. (1983) 서열 비교의 개요 (An overview of sequence comparison) In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.); 시간 변형, 가닥 편집 및 거대분자들 (Time warps, string edits and macromolecules): 서열 비교의 이론 및 실제 (the theory and practice of sequence comparison), pp. 1-44 Addison Wesley, 및 유럽 생물정보학 연구소 (European Bioinformatics Institute, 케임브리지, 영국)로부터 입수가능한 도구들 EMBOSS: 유럽 분자생물학 공개 소프트웨어 모음 (European Molecular Biology Open Software Suite), (2000); Rice, P. et al., A., Trends in Genetics 16, (6) pp. 276-277 또한 hypertext transfer protocol ://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/ align/index.html 및 hypertext transfer protocol :// emboss . open - bio . org / wiki / Appdoc : Needle에서 입수가능한 온라인 정보를 참조. 다음으로 해당하는 아미노산 위치들 또는 뉴클레오타이드 위치들에서 아미노산 잔기들 또는 뉴클레오타이드들은 비교되고, 둘 서열들 간의 백분율 일치도 (percent identity)는 서열들에 의해 공유되는 일치하는 위치들의 수의 함수이다.

면역조절성 폴리펩타이드들

순진한 (naive) T 세포들은 자극되어 일차적으로 분비된 사이토카인들의 작용들을 통하여 분화된 효과기 세포들로 분화된다. T 헬퍼 (T_H) 세포들은 전형적으로 두 가지 효과기 세포 계열들; 그들의 사이토카인 발현 프로파일들 (1)에 근거하여 세포성 및 체액성 T 세포 면역을 각각 조정하는 T_H1 및 T_H2의 하나로 진행하는 것으로 고려되어 왔다. 더 최근의 연구는 Th1 세포들, Th1 및 Th2 계열들로부터 구별되고, 사실상 이들 산물들에 의해 길항되는 효과기 T_H 세포들의 세 번째 계열이 기술되었다 (2, 3). 본 Th 세포들의 소집합은 그들의 특징 사이토카인 인터루킨 17 (interleukin 17, IL-17)의 명칭으로부터 명명되고, 미생물들이 Th1 또는 Th2 반응들에 의해 효과적으로 조절될 수 있기 때문에 세포외 박테리아 및 일정 곰팡이들과 대항하는 증진된 숙주 보호작용을 위해 특화된 적응적 면역계의 중심 (arm)으로서 진화하였던 것으로 보인다 (4, 5). 조혈 및 비-조혈 세포들 둘 다에서 IL-17 수용체들의 존재와 함께, Th1 세포들, 즉 IL-23, IL-6, 및 형질전환 성장인자-β (TGF-β)의 분화를 유도하고 항상성 (homeostasis)을 조절하는 사이토카인들의 다양한 조직 출처들은 적응된 및 본래의 (innate) 면역 세포들 사이에 존재하는 복합화된 연관성들을 강조하여 왔다. Th17 세포 효과기 기능의 전 범위가 아직도 연구진행되고 있는 한편, Th17 세포들에 의해 촉진된 강한 염증성 반응은 류마티스성 관절염, 다발성 경화증 및 건선을 포함하는 이전에 Th1 또는 Th2 세포들로 인해 생겼던 많은 자가면역 및 염증성 장애들의 발병기전과 관련되는 것으로 알려져 왔다 (4).

IL-17A에 추가하여, IL-17 패밀리의 구성원들은 IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (IL-25라고도 명명됨), 및 IL-17F을 포함한다. IL-17 패밀리의 모든 구성원들은 4개의 매우 보존된 시스테인 잔기들을 포함하는 유사한 단백질 구조를 가진다. IL-17A 및 F는 가장 밀접하게 연관되어 있고 다음으로 IL-17B (29%), IL-17D (25%), IL-17C (23%), 및 IL-17E가 이어지고 IL-17A (17%)가 가장 멀리 연관되어 있다. 이들 사이토카인들은 포유동물들에서 모두 잘 보존되어 있고 인간 및 마우스 상동체들 간에 보존된 아미노산들은 62 내지 88% 정도이다. 다른 사이토카인들과는 서열 유사도가 전혀 없다. IL-17F의 결정 구조를 근거로 하여, 6가지의 구조적으로 관련된 IL-17 사이토카인들 (IL-17A-IL-17F)은 신경성장인자 (NGF)와 같은 시스테인-매듭 성장인자들 (cysteine-knot growth factors)의 것들과 동종유래의 호모이중체 접힘 (또는 IL-17A-F의 경우 헤테로이중체 접힘)을 형성할 것으로 예측된다 (7, 8). Th17 세포-유래성 IL-17A 및 IL-17F은 패밀리 내에서 가장 큰 상동성을 공유하고 신호전달을 위해 IL-17RA 및 IL-17RC를 둘 다 요구한다 (9, 10). 이것은 섬유모세포들, 표피세포들 및 내피세포들이 IL-17RA 및 IL-17RC를 둘 다 공동발현하는 것을 보여주는 한편, T 세포들은 외관상으로 IL-17RC을 발현하지 않고, 단지 IL-17RA만을 발현한다 (11). 림프구들은 IL-17에 반응하지 않을 것이라고 생각되었지만; 플라벨 등 (Flavell and coworkers)은 T 세포들이 IL-17에 직접적으로 반응할 수 있는 점을 보고하였다 (12).

사이토카인들이 IL-17 패밀리는 부분적으로는 Th17 계열의 효과기 사이토카인들로서 그들의 작용들을 통하여, 면역 및 염증성 반응들의 조작 (manipulation)에 혁신적인 접근법들을 제공한다. 이와 같이, 본 명세서에서 기술된 길항제들과 같은 IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F의 길항제들, 및 그들의 수용체들은 단독으로 또는 다함께, 다발성 경화증, 염증성 장질환 (IBD), 류마티스성 관절염, 건선, 및 암과 같은 염증성 질환들의 치료적 처치에 유용하다.

인간 IL-17 사이토카인들을 위한 일정의 대표적인 서열들은 다음과 같다.

IL -17A. 대표적인 인간 IL-17A 사이토카인 서열은 다음과 같고 유니프로트 인증번호 (UniProt identifier) Q16552에 의해 기술된다 (uniprot.org에서의 웹 자료 및 유니프로트 컨소시움 (The UniProt Consortium), Nucleic Acids Res. D142-D148 (2010)을 참조): MTPGKTSLVS LLLLLSLEAI VKAGITIPRN PGCPNSEDKN FPRTVMVNLNIHNRNTNTNP KRSSDYYNRS TSPWNLHRNE DPERYPSVIW EAKCRHLGCINADGNVDYHM NSVPIQQEIL VLRREPPHCP NSFRLEKILV SVGCTCVTPIVHHVA (서열번호 1).

또 다른 대표적인 서열은 상기 서열의 24-155번 아미노산들을 포함하고, IL-17A 신호 서열 (signal sequence)이 결여되거나 도 4D에서 나타낸 서열을 형성한다: ITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAK CRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA (서열번호 2).

본 서열은 서열번호 2의 첫 번째 잔기를 선행하는 글리신도 역시 포함할 수 있다. 서열번호 2를 기준으로 하여 본 명세서에서 기술된 각 IL-17A 서열은 또한 서열번호 2에서 첫 번째 나열된 아미노산인 이소루이신을 선행하는 이러한 글리신도 포함할 수 있다. 기타 다른 잔기들도 역시 사용될 수 있다. 다른 대표적인 IL-17A 서열들은 마우스 (Q62386), 래트 (Q61453) 및 소의 서열들 (Q687Y7)을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 돌연변이들 및 변형들은, 예로 본 명세서에서 기술된 바와 같이 모든 종으로부터 나온 IL-17A 서열들로 만들어질 수 있다.

IL -17B. 대표적인 인간 IL-17B 사이토카인 서열은 다음과 같고 유니프로트 인증번호 Q9UHF5에 의해 기술된다: MDWPHNLLFLLTISIFLGLGQPRSPKSKRKGQGRPGPLAPGPHQVPLDLVSRMKPYARMEEYERNIEEMVAQLRNSSELAQRKCEVNLQLWMSNKRSLSPWGYSINHDPSRIPVDLPEARCLCLGCVNPFTMQEDRSMVSVPVFSQVPVRRRLCPPPPRTGPCRQRAVMETIAVGCTCIF (서열번호 3). 또 다른 대표적인 서열은 상기 서열의 21-180번 아미노산들을 포함하고, IL-17B 신호 서열이 결여되거나 도 4D에서 나타낸 서열을 형성한다: RSPKSKRKGQGRPGPLAPGPHQVPLDLVSRMKPYARMEEYERNIEEMVAQLRNSSELAQRKCEVNLQLWMSNKRSLSPWGYSINHDPSRIPVDLPEARCLCLGCVNPFTMQEDRSMVSVPVFSQVPVRRRLCPPPPRTGPCRQRAVMETIAVGCTCIF (서열번호 4).

IL -17C. 대표적인 IL-17C 사이토카인 서열은 다음과 같고 유니프로트 인증번호 Q9P0M4에 의해 기술된다:

MTLLPGLLFLTWLHTCLAHHDPSLRGHPHSHGTPHCYSAEELPLGQAPPHLLARGAKWGQALPVALVSSLEAASHRGRHERPSATTQCPVLRPEEVLEADTHQRSISPWRYRVDTDEDRYPQKLAFAECLCRGCIDARTGRETAALNSVRLLQSLLVLRRRPCSRDGSGLPTPGAFAFHTEFIHVPVGCTCVLPRSV (서열번호 5). 또 다른 대표적인 서열은 상기 서열의 19-197번 아미노산들을 포함하고 IL-17C 신호 서열이 결여되거나 도 4D에서 나타낸 서열을 형성한다:

HHDPSLRGHPHSHGTPHCYSAEELPLGQAPPHLLARGAKWGQALPVALVSSLEAASHRGRHERPSATTQCPVLRPEEVLEADTHQRSISPWRYRVDTDEDRYPQKLAFAECLCRGCIDARTGRETAALNSVRLLQSLLVLRRRPCSRDGSGLPTPGAFAFHTEFIHVPVGCTCVLPRSV (서열번호 6).

IL -17D. 대표적인 IL-17D 사이토카인 서열은 다음과 같고 유니프로트 인증번호 Q8TAD2에 의해 기술된다:

MLVAGFLLALPPSWAAGAPRAGRRPARPRGCADRPEELLEQLYGRLAAGVLSAFHHTLQLGPREQARNASCPAGGRPADRRFRPPTNLRSVSPWAYRISYDPARYPRYLPEAYCLCRGCLTGLFGEEDVRFRSAPVYMPTVVLRRTPACAGGRSVYTEAYVTIPVGCTCVPEPEKDADSINSSIDKQGAKLLLGPNDAPAGP (서열번호 7). 또 다른 대표적인 서열은 상기 서열의 16-202번 아미노산들을 포함하고 IL-17D 신호 서열이 결여되거나 도 4D에서 나타낸 서열을 형성한다:

AGAPRAGRRPARPRGCADRPEELLEQLYGRLAAGVLSAFHHTLQLGPREQARNASCPAGGRPADRRFRPPTNLRSVSPWAYRISYDPARYPRYLPEAYCLCRGCLTGLFGEEDVRFRSAPVYMPTVVLRRTPACAGGRSVYTEAYVTIPVGCTCVPEPEKDADSINSSIDKQGAKLLLGPNDAPAGP (서열번호 8).

IL -17E. 대표적인 IL-17E 사이토카인 서열 (IL-25라고도 명명됨)은 다음과 같고 유니프로트 인증번호 Q9H293에 의해 기술된다:

MRERPRLGEDSSLISLFLQVVAFLAMVMGTHTYSHWPSCCPSKGQDTSEELLRWSTVPVPPLEPARPNRHPESCRASEDGPLNSRAISPWRYELDRDLNRLPQDLYHARCLCPHCVSLQTGSHMDPRGNSELLYHNQTVFYRRPCHGEKGTHKGYCLERRLYRVSLACVCVRPRVMG (서열번호 9).

또 다른 대표적인 서열은 상기 서열의 33-177번 아미노산들을 포함하고 IL-17E 신호 서열이 결여되거나 도 4D에서 나타낸 서열을 형성한다:

THTYSHWPSCCPSKGQDTSEELLRWSTVPVPPLEPARPNRHPESCRASEDGPLNSRAISPWRYELDRDLNRLPQDLYHARCLCPHCVSLQTGSHMDPRGNSELLYHNQTVFYRRPCHGEKGTHKGYCLERRLYRVSLACVCVRPRVMG (서열번호 10).

IL -17F. 대표적인 IL-17F 사이토카인 서열은 다음과 같고 유니프로트 인증번호 Q96PD4에 의해 기술된다: MTVKTLHGPAMVKYLLLSILGLAFLSEAAARKIPKVGHTFFQKPESCPPVPGGSMKLDIGIINENQRVSMSRNIESRSTSPWNYTVTWDPNRYPSEVVQAQCRNLGCINAQGKEDISMNSVPIQQETLVVRRKHQGCSVSFQLEKVLVTVGCTCVTPVIHHVQ (서열번호 11). 사이토카인의 해독은 상기 서열의 1번 MET 또는 11번 MET에서 개시될 수 있다.

또 다른 대표적인 서열은 상기 서열의 31-163번 아미노산들을 포함하고 IL-17F 신호 서열이 결여되거나 도 4D에서 나타낸 서열을 형성한다:

RKIPKVGHTFFQKPESCPPVPGGSMKLDIGIINENQRVSMSRNIESRSTSPWNYTVTWDPNRYPSEVVQAQCRNLGCINAQGKEDISMNSVPIQQETLVVRRKHQGCSVSFQLEKVLVTVGCTCVTPVIHHVQ (서열번호 12). 본 서열은 도 4D와 연결하여 IL-17 패밀리 구성원들에서 잔기들의 위치를 확인하는 유용한 디폴트 기준을 제공한다. 다른 대표적인 IL-17F 서열들은 마우스 (Q7TNI7), 래트 (Q5BJ95) 및 돼지의 서열들 (Q5BJ95)을 포함한다.

여러 가지의 다른 포유동물 IL-17 사이토카인들의 서열들도 역시 알려져 있다. 예로, 유니프로트 등록: Q62386 (마우스 IL-17A), Q61453 (래트 IL-17A), Q687Y7 (소의 IL-17A), Q7TNI7 (마우스 IL-17F), Q5BJ95 (래트 IL-17F), Q9QXT6 (마우스 IL-17B), Q9EQI6 (햄스터 IL-17B), Q8K4C5 (마우스 IL-17C), Q8K4C4 (마우스 IL-17D), 및 Q9VHH8 (마우스 IL-17E)를 참조.

IL -17 RA. 대표적인 인간 IL-17RA 수용체 서열은 다음과 같고 유니프로트 인증번호 Q96F46에 의해 기술된다:

MGAARSPPSAVPGPLLGLLLLLLGVLAPGGASLRLLDHRALVCSQPGLNCTVKNSTCLDDSWIHPRNLTPSSPKDLQIQLHFAHTQQGDLFPVAHIEWTLQTDASILYLEGAELSVLQLNTNERLCVRFEFLSKLRHHHRRWRFTFSHFVVDPDQEYEVTVHHLPKPIPDGDPNHQSKNFLVPDCEHARMKVTTPCMSSGSLWDPNITVETLEAHQLRVSFTLWNESTHYQILLTSFPHMENHSCFEHMHHIPAPRPEEFHQRSNVTLTLRNLKGCCRHQVQIQPFFSSCLNDCLRHSATVSCPEMPDTPEPIPDYMPLWVYWFITGISILLVGSVILLIVCMTWRLAGPGSEKYSDDTKYTDGLPAADLIPPPLKPRKVWIIYSADHPLYVDVVLKFAQFLLTACGTEVALDLLEEQAISEAGVMTWVGRQKQEMVESNSKIIVLCSRGTRAKWQALLGRGAPVRLRCDHGKPVGDLFTAAMNMILPDFKRPACFGTYVVCYFSEVSCDGDVPDLFGAAPRYPLMDRFEEVYFRIQDLEMFQPGRMHRVGELSGDNYLRSPGGRQLRAALDRFRDWQVRCPDWFECENLYSADDQDAPSLDEEVFEEPLLPPGTGIVKRAPLVREPGSQACLAIDPLVGEEGGAAVAKLEPHLQPRGQPAPQPLHTLVLAAEEGALVAAVEPGPLADGAAVRLALAGEGEACPLLGSPGAGRNSVLFLPVDPEDSPLGSSTPMASPDLLPEDVREHLEGLMLSLFEQSLSCQAQGGCSRPAMVLTDPHTPYEEEQRQSVQSDQGYISRSSPQPPEGLTEMEEEEEEEQDPGKPALPLSPEDLESLRSLQRQLLFRQLQKNSGWDTMGSESEGPSA (서열번호 13)

또한 신호 서열이 제거 (예로, 프로세싱)되거나 1-31번 또는 1-32번 아미노산들이 결실되고, 임의적으로 다른 결실들, 삽입들 및 치환들을 가지는 IL-17RA 폴리펩타이드도 제공된다. 대표적인 IL-17RA 폴리펩타이드는 다음과 같다:

SLRLLDHRALVCSQPGLNCTVKNSTCLDDSWIHPRNLTPSSPKDLQIQLHFAHTQQGDLFPVAHIEWTLQTDASILYLEGAELSVLQLNTNERLCVRFEFLSKLRHHHRRWRFTFSHFVVDPDQEYEVTVHHLPKPIPDGDPNHQSKNFLVPDCEHARMKVTTPCMSSGSLWDPNITVETLEAHQLRVSFTLWNESTHYQILLTSFPHMENHSCFEHMHHIPAPRPEEFHQRSNVTLTLRNLKGCCRHQVQIQPFFSSCLNDCLRHSATVSCPEMPDTPEPIPDYMPLWVYWFITGISILLVGSVILLIVCMTWRLAGPGSEKYSDDTKYTDGLPAADLIPPPLKPRKVWIIYSADHPLYVDVVLKFAQFLLTACGTEVALDLLEEQAISEAGVMTWVGRQKQEMVESNSKIIVLCSRGTRAKWQALLGRGAPVRLRCDHGKPVGDLFTAAMNMILPDFKRPACFGTYVVCYFSEVSCDGDVPDLFGAAPRYPLMDRFEEVYFRIQDLEMFQPGRMHRVGELSGDNYLRSPGGRQLRAALDRFRDWQVRCPDWFECENLYSADDQDAPSLDEEVFEEPLLPPGTGIVKRAPLVREPGSQACLAIDPLVGEEGGAAVAKLEPHLQPRGQPAPQPLHTLVLAAEEGALVAAVEPGPLADGAAVRLALAGEGEACPLLGSPGAGRNSVLFLPVDPEDSPLGSSTPMASPDLLPEDVREHLEGLMLSLFEQSLSCQAQGGCSRPAMVLTDPHTPYEEEQRQSVQSDQGYISRSSPQPPEGLTEMEEEEEEEQDPGKPALPLSPEDLESLRSLQRQLLFRQLQKNSGWDTMGSESEGPSA (서열번호 14) 또한 하기 실시예들 1 내지 3에서 사용되는 번호매김을 나타낸다.

또 다른 대표적인 IL-17RA 폴리펩타이드는 IL-17RA의 세포외 도메인, 예로 서열번호 13의 약 33-320번 아미노산들을 포함한다. 다른 대표적인 IL-17RA 서열들은 마우스 (Q60943), 래트 (진뱅크 (GenBank) 번호 NP_001101353.2) 및 소의 서열들 (진뱅크 번호 XP_603383.5)을 포함한다.

IL -17 RB . 대표적인 인간 IL-17RB 수용체 서열은 다음과 같고 유니프로트 인증번호 Q9NRM6를 가진다: MSLVLLSLAALCRSAVPREPTVQCGSETGPSPEWMLQHDLIPGDLRDLRVEPVTTSVATGDYSILMNVSWVLRADASIRLLKATKICVTGKSNFQSYSCVRCNYTEAFQTQTRPSGGKWTFSYIGFPVELNTVYFIGAHNIPNANMNEDGPSMSVNFTSPGCLDHIMKYKKKCVKAGSLWDPNITACKKNEETVEVNFTTTPLGNRYMALIQHSTIIGFSQVFEPHQKKQTRASVVIPVTGDSEGATVQLTPYFPTCGSDCIRHKGTVVLCPQTGVPFPLDNNKSKPGGWLPLLLLSLLVATWVLVAGIYLMWRHERIKKTSFSTTTLLPPIKVLVVYPSEICFHHTICYFTEFLQNHCRSEVILEKWQKKKIAEMGPVQWLATQKKAADKVVFLLSNDVNSVCDGTCGKSEGSPSENSQDLFPLAFNLFCSDLRSQIHLHKYVVVYFREIDTKDDYNALSVCPKYHLMKDATAFCAELLHVKQQVSAGKRSQACHDGCCSL (서열번호 15)

또한 Tian et al., Oncogene 19:2098-2109 (2000) and Shi et al., J. Biol. Chem. 275:19167-19176 (2000)을 참조. 또한 신호 서열이 제거 (예로, 프로세싱)되거나 1-17번 아미노산들이 결실되고, 임의적으로 다른 결실들, 삽입들 및 치환들을 가지는 IL-17RB 폴리펩타이드도 제공된다. 또 다른 대표적인 IL-17RB 폴리펩타이드는 IL-17RB의 세포외 도메인, 예로 Q9NRM6의 약 18-292번 아미노산들을 포함한다.

IL -17 RC . 대표적인 인간 IL-17RC 수용체 서열은 다음과 같고 유니프로트 인증번호 Q8NAC3를 가진다: MPVPWFLLSLALGRSPVVLSLERLVGPQDATHCSPVSLEPWGDEERLRVQFLAQQSLSLAPVTAATARTALSGLSGADGRREERGRGKSWVCLSLGGSGNTEPQKKGLSCRLWDSDILCLPGDIVPAPGPVLAPTHLQTELVLRCQKETDCDLCLRVAVHLAVHGHWEEPEDEEKFGGAADSGVEEPRNASLQAQVVLSFQAYPTARCVLLEVQVPAALVQFGQSVGSVVYDCFEAALGSEVRIWSYTQPRYEKELNHTQQLPDCRGLEVWNSIPSCWALPWLNVSADGDNVHLVLNVSEEQHFGLSLYWNQVQGPPKPRWHKNLTGPQIITLNHTDLVPCLCIQVWPLEPDSVRTNICPFREDPRAHQNLWQAARLQLLTLQSWLLDAPCSLPAEAALCWRAPGGDPCQPLVPPLSWENVTVDKVLEFPLLKGHPNLCVQVNSSEKLQLQECLWADSLGPLKDDVLLLETRGPQDNRSLCALEPSGCTSLPSKASTRAARLGEYLLQDLQSGQCLQLWDDDLGALWACPMDKYIHKRWALVWLACLLFAAALSLILLLKKDHAKGWLRLLKQDVRSGAAARGRAALLLYSADDSGFERLVGALASALCQLPLRVAVDLWSRRELSAQGPVAWFHAQRRQTLQEGGVVVLLFSPGAVALCSEWLQDGVSGPGAHGPHDAFRASLSCVLPDFLQGRAPGSYVGACFDRLLHPDAVPALFRTVPVFTLPSQLPDFLGALQQPRAPRSGRLQERAEQVSRALQPALDSYFHPPGTPAPGRGVGPGAGPGAGDGT (서열번호 16).

또한 신호 서열이 제거 (예로, 프로세싱)되거나 1-20번 아미노산들이 결실되고, 임의적으로 다른 결실들, 삽입들 및 치환들을 가지는 IL-17RC 폴리펩타이드도 제공된다. 또 다른 대표적인 IL-17RC 폴리펩타이드는 IL-17RC의 세포외 도메인, 예로 서열번호 14의 약 21-538번 아미노산들을 포함한다. 다른 대표적인 IL-17RC 서열들은 마우스 (Q8K4C2), 래트 (진뱅크 번호 XP_216240.5) 및 소의 서열들 (진뱅크 번호 NP_001068646.1)를 포함한다.

IL -17 RD. 대표적인 인간 IL-17RD 수용체 서열은 유니프로트 인증번호 Q8NFM7에 의해 기술된다. 또한 Xiong et al., J. Biol. Chem. 278:50273-50282 (2003)도 참조. 또한 신호 서열이 제거 (예로, 프로세싱)되거나 1-16번 아미노산들이 결실되고, 임의적으로 다른 결실들, 삽입들 및 치환들을 가지는 IL-17RD 폴리펩타이드도 제공된다. 또 다른 대표적인 IL-17RD 폴리펩타이드는 IL-17RD의 세포외 도메인, 예로 Q8NFM7의 약 17-299번 아미노산들을 포함한다.

IL -17 RE. 대표적인 인간 IL-17RE 수용체 서열은 유니프로트 인증번호 Q8NFR9에 의해 기술된다. 또한 신호 서열이 제거 (예로, 프로세싱)되거나 1-23번 아미노산들이 결실되고, 임의적으로 다른 결실들, 삽입들 및 치환들을 가지는 IL-17RE 폴리펩타이드도 제공된다. 또 다른 IL-17RE 폴리펩타이드는 IL-17RE의 세포외 도메인, 예로 Q8NFR9의 약 24-454번 아미노산들을 포함한다.

본 발명은 IL-17 수용체 신호전달의 새로운 길항제들, 예로 IL-17RA, IL-17RB, IL-17RC, IL-17RD, 및 IL-17RE 신호전달의 하나 이상의 길항제들, 또한 염증성 질환들 및 자가면역 질환들의 치료에서 이러한 길항제들의 용도를 제공한다. 본 발명은 좀 더 나아가 IL-17 사이토카인 신호전달, 예로 IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, 및 IL-17F 신호전달의 새로운 길항제들 또한 염증성 질환들 및 자가면역 질환들의 치료에서 그들의 용도들을 제공한다.

대표적인 구성원이 IL-17RA에 대한 길항제이고 본 발명의 중화하는 항-IL-17RA 설계자 사이토카인 길항제들을 포함하는, 본 발명의 길항제들은 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 암 (상세하게는 IL-17 및/또는 IL-23의 발현을 특징으로 함), 건선 (psoriasis), 건선성 관절염 (psoriatic arthritis), 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis), 자가면역 안구 질환들 (autoimmune ocular diseases), 내독소혈증 (endotoxemia), IBS 및 염증성 장질환 (IBD), 장염 (colitis), 천식 (asthma), COPD, 낭성 섬유증 (cystic fibrosis), 동종이식 거부 (allograft rejection), 면역 매개성 신장 질환들, 간담도 질환들 (hepatobiliary diseases), 죽상동맥경화증 (atherosclerosis), 종양 성장의 촉진 또는 퇴화성 관절 질환, 죽상동맥경화증, 또한 본 명세서에서 기술된 기타 염증성 병폐들과 같은 염증 및 염증성 질환들의 치료에서 IL-17A, IL-17F, 또는 IL-17A/F 또는 여기에서의 조합이라면 모두의 활성을 차단하거나, 저해하거나, 감소시키거나, 길항하거나 중화하는 데 사용될 수 있다.

본 발명은 IL-17 리간드들 및/또는 수용체들의 접촉 표면들과 결합하여 그들의 생산적 상호작용을 방지하는, 분리된 폴리펩타이드들을 제공한다. 보다 상세하게, 본 발명은 IL-17 리간드들 및/또는 수용체들과 결합하고 IL-17 수용체들을 발현하는 세포에서 염증성 매개인자의 생산을 저해하는 폴리펩타이드들을 제공한다.

5가지의 IL-17 수용체들 (IL-17RA-IL-17RE)는 기지의 수용체들이라면 모두와 동종유래가 아니고, 상당한 서열 분지 (divergence)를 나타낸다. 모두는 제 Ⅲ형 피브로넥틴 (FnⅢ) 도메인들, 또한 Toll/IL-1R (TLR) 도메인들과는 먼 상동성을 보여주는 세포질 SEF/IL-17R (SEFIR) 도메인들로 구성되는 세포외 도메인들을 포함하는 것으로 여겨진다 (13, 4). IL-17 수용체들은 제 I형 4개 나선 사이토카인들에 대한 더 널리 알려진 수용체들에 의해 촉발된 것들과는 구별되는 신호전달 과정들을 매개한다 (15, 16). TLR 자극과 같이, IL-17 수용체 자극은 NF-κB의 활성화 및 미토젠-활성화된 단백질 키나제 (MAPK)를 유도한다. 그러나, IL-17 수용체 신호전달은 TLR 신호전달과 동일한 한 벌의 막 인접 어댑터 (membrane proximal adaptor) 분자들을 사용하지 않고; IL-17R은 SEFIR 도메인도 포함하는 어댑터 Act1을 요구한다 (17-19). 이들 IL-17 수용체들의 독특한 신호전달 특성들은 T_H-17 세포들이 본래의 적응적 면역세포들 간의 연결다리로서 작용하는 것을 가능하게 한다.

기계적으로, 형광 공명 에너지 전이 (FRET) 연구들은 IL-17RA가 IL-17RC와 헤테로이중의 (heterodimeric) 신호전달 복합체를 형성하도록 IL-17 결합 시 입체형태적 변화를 겪는 세포 표면에서 미리 형성된 (preformed) 이중체로서 존재할 수 있는 점을 제시하여 왔다. 그러나, 호모이중의 (homodimeric) IL-17 사이토카인이 두 가지의 서로 다른 수용체들과 쌍을 이루는 방법에 관한 분자적인 기초는 여전히 미지로 남아있다 (14, 20). 본 명세서에서 제공된 구조적 및 생화학적 분석은 처음으로 IL-17 시스템의 특이적 길항제들의 합리적인 설계를 가능하게 한다. 본 분석을 근거로 하여, 우리는 IL-17 신호전달을 차단하고 다양한 질환들을 가진 포유동물들을 치료하는 데 유용한 한 벌의 길항제들을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예들은 "IL-17R 길항제들 (IL-17R antagonists)", "IL-17 길항제들 (IL-17 antagonists)", "IL-17R 중화 실체들 (IL-17R neutralizing entities)", "IL-17R 설계자 사이토카인 길항제들 (IL-17R designer cytokine antagonists)" 및 "IL-17 설계자 사이토카인 길항제들 (IL-17 designer cytokine antagonists)"라고 상호교환적으로 명명되는 IL-17R 또는 IL-17 사이토카인과 결합하는 결합 펩타이드들, 단백질들 및 그의 단편들 또는 순열들이라면 모두를 포함한다. 상세하게 일정 구현예들에서, 이러한 결합 펩타이드들 또는 단백질들은 인간 IL-17R과 특이적으로 결합할 수 있고 "IL-17R 결합 단백질들"이라고 말한다. 좀 더 나아가, 이들 결합 펩타이들 또는 단백질들은 IL-17과 연관된 생물학적 활성들을 조절하고, 예로 IL-17 수용체의 Il-17 활성화를 길항할 수 있고, 따라서 다양한 질환들 및 염증 및 면역-관련 질환들과 같은 병리학적 병폐의 치료에 유용하다. 대표적인 길항제들은 200, 50, 20, 또는 10 nM 이하의 IC50을 가진다.

보다 또 다른 구현예에서, 본 발명은 IL-17R, 예로 IL-17RA, IL-17RB, IL-17RC, IL-17RD, 또는 IL-17RE과 결합하고 그의 신호전달 능력을 감소시킬 수 있는, 본 발명의 폴리펩타이드를 인코드하는 분리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 길항제 및 면역글로불린 소부분 (moiety), 예로 면역글로불린 도메인 또는 영역을 포함하는, 융합 단백질들을 제공한다. 이러한 융합 단백질들에서, 면역글로불린 소부분은 인간 F_C 단편과 같은 면역글로불린 중쇄 불변 부위 (immunoglobulin heavy chain constant region)일 수 있다. 본 발명은 좀 더 나아가 이러한 융합 단백질들을 인코드하는 분리된 핵산 분자들을 포함한다.

또한 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜의 중합체와 결합된 본 발명의 길항제를 포함하는 단백질 결합체들 (conjugates)을 제공한다.

본 발명은 좀 더 나아가 약제학적으로 허용가능한 담체 및 본 명세서에서 기술된 IL-17R 길항제를 포함하는 약제학적 조성물들을 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 개체에게 IL-17 신호전달의 길항제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 개체에서 IL-17 및/또는 IL-23 및/또는 IFN-γ의 증가된 (elevated) 발현을 특징으로 하는 염증성 질환의 치료 방법에 관한 것이다.

보다 또 다른 구현예에서, 본 발명은 IL-17R의 길항제로 세포 또는 그의 배지를 처리하여 포유동물 세포에서 염증성 매개인자의 생산을 저해하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 개체에게 IL-17 신호전달의 길항제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 개체에서 IL-17 및/또는 IL-23 및/또는 IFN-γ의 증가된 발현을 특징으로 하는 염증성 질환의 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명의 전형적인 방법들은 증가된 또는 증진된 IL-17 및/또는 IL-23 및/또는 IFN-γ발현 및/또는 활성과 연관되거나 이로부터 유도되는 포유동물에서의 병리학적 병폐 또는 질환들을 치료하는 방법들을 포함한다. 치료의 방법에서, 바람직하게는 개별적인 수용체 활성화를 감소시키는 본 발명의 길항제들이 투여될 수 있다. 본 발명은 IL-17R 복합체 형성을 차단하여 신호전달을 감소시키는 IL-17R의 길항제의 용도를 참작하고 있다.

또한 본 발명의 길항제들 (예로, IL-17R의 길항제들)은, 예를 들어 전신성 홍반 루프스 (systemic lupus erythematosis), 관절염, 류마티스성 관절염, 골관절염 (osteoarthritis), 건선, 다발성 경화증, 특발성 탈수초 다발신경증 (idiopathic demyelinating polyneuropathy), 또는 길레인-바르 증후군 (Guillain-Barre syndrome)과 같은 중앙 및 말초 신경계의 탈수초 질환들 (demyelinating diseases), 염증성 장질환, 장염, 궤양성 장염, 크론씨 질환 (Crohn's disease), 글루텐-민감성 소장병 (gluten-sensitive enteropathy), 자가면역 안구 질환들, 암, 신생물 질환들, 죽상동맥경화증, 및 혈관형성 (angiogenesis)을 포함하는 면역-관련 및 염증성 질환들의 치료를 위한 의약들 (medicines) 및 약제들을 제조하는 데 유용하다.

상세한 관점에서, 이러한 의약들 및 약제들은 약제학적으로 허용가능한 담체를 가진 IL-17R 길항제의 치료적 유효량을 포함한다. 바람직하게, 본 혼합물 (admixture)은 무균 (sterile)이다.

보다 또 다른 구현예에서, 본 발명은 T 세포들을 IL-17R 길항제로 치료하여 IL-17 생산 및/또는 유지 (maintenance)를 저해하는 방법에 관한 것이다.

보다 더 나아간 구현예에서, 본 발명은 포유동물에서 T-림프구들의 활성이 감소되는, IL-17 사이토카인 서열과 동종유래 서열을 포함하는 IL-17R 결합 단백질과 같은 IL-17R 길항제를 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 T-림프구들의 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.

보다 더 나아간 구현예에서, 본 발명은 포유동물에서 T-림프구들의 증식이 감소되는, IL-17 사이토카인 서열과 동종유래 서열을 포함하는 IL-17R 결합 단백질과 같은 IL-17R 길항제를 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 T-림프구들의 증식을 감소시키는 방법을 제공한다.

본 명세서에서는 상기 항체의 발현에 적합한 조건들 하에서 적절한 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하고 세포 배양액으로부터 상기 항체를 회수하는 것을 포함하는, 이를 생산하는 방법들도 기술되고 있다.

IL -17R 결합 단백질들

IL-17 사이토카인은 그의 수용체 결합 단면들의 하나 위에 IL-17R을 접촉시키는 적어도 3개의 부위들을 포함할 수 있다. 일반적으로, IL-17은 2가지의 소단위들 (본 명세서에서는 사슬 A 및 사슬 B라고 명명됨)를 포함하고, 각각은 특정한 수용체 결합 단면에 아미노산들을 부여한다. 용어들 "사슬 A (Chain A)" 및 "사슬 B (Chain B)"의 사용은 단순히 기준이 된다. 예를 들어, 단일 사슬 형식을 사용하는 구현예들에서, "사슬 A"는 "사슬 B"의 C-말단에 놓여질 수 있고, 대안으로 "사슬 B"의 N-말단에 놓여질 수 있다.

IL-17RA를 결합시키는 IL-17 경계면은 표 1에 나타난 바와 같이 다음의 접촉 잔기들을 포함하는 세 가지의 부위들 (부위 1, 부위 2, 및 부위 3)를 포함한다 (IL-17F 및 서열번호 12의 번호매김에 따름).

소정의 잔기들이 두 가지 인접한 부위들의 연결부에 존재하고 따라서 둘 다의 부위들을 위해 나열되고 있다. 여러 가지의 경계면 잔기들이 하기 실시예 20에서의 표에 나타난 바와 같이 IL-17RA와의 결합 시 묻히게 된다.

한 가지 관점에서, 본 기재내용은 두 가지 소단위들에 의해 형성된 이중체의 하나의 수용체 결합 단면이 하나 이상의 치환들, 예로 적어도 2 또는 3개의 치환들, 예로 비-보존적 치환들 또는 본 명세서에서 기술된 치환들을 포함하는, 두 가지의 소단위들을 포함하는 IL-17 사이토카인을 포함하는 IL-17R 결합 단백질을 특징으로 한다. 예를 들어, 사이토카인은 상기 표 1에서 확인된 위치들에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 치환들 (또는 결실들), 예로 2 내지 10개, 2 내지 7개, 3 내지 10개, 또는 3 내지 6개 사이의 범위로 가진다. 일정 경우들에서, 하나의 사이토카인 소단위는 다른 하나의 소단위와 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 치환들 (또는 결실들)에서 서로 다르다. 예를 들어, IL-17R 결합 단백질에서 두 가지의 수용체 결합 단면들은 서로 다른 아미노산들, 예로 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 차이들을, 예로 표 1에서의 것들에 해당하는 위치들에서 포함할 수 있다.

하나 또는 둘 다의 소단위들은 하나 이상의 보존적 및/또는 하나 이상의 비-보존적 치환들을 가질 수 있다. 전형적으로 적어도 하나의 소단위 또는 둘 다의 소단위들은 성숙한 인간 IL-17, 예로 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 또는 20과 100% 일치하지는 않는다. 한 가지 구현예에서, 소단위 모두는 성숙한 인간 IL-17과 100% 일치하지는 않고, 예로 그들은 적어도 1, 2, 또는 3개의 아미노산들이 그들이 유래한 인간 IL-17과 서로 다르다. 한 가지 구현예에서, 하나의 소단위는 성숙한 인간 IL-17과 서로 다른 한편, 다른 하나는 성숙한 인간 IL-17과 일치한다. 소정의 구현예들에서, 소단위에서 치환들이 해당하는 마우스 단백질에서 잔기들에는 해당되지 않는다.

부위 1

한 가지 구현예에서, IL-17R 결합 단백질은 하나의 수용체 결합 단면의 부위 1이 하나 이상의 돌연변이들, 예로 적어도 2 또는 3개의 돌연변이들, 예로 비-보존적 돌연변이들 또는 본 명세서에서 기술된 돌연변이를 포함하는 두 가지의 소단위들을 포함하는 IL-17 사이토카인을 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 다음의 부위 1 잔기들 (IL-17F 및 서열번호 12의 번호매김에 근거하여 확인됨)이 돌연변이된다: 사슬 A: 25번 MET 및 115번 LYS; 또한 사슬 B: 29번 ILE, 31번 ILE, 58번 TRP, 61번 ASN, 63번 TYR, 64번 PRO, 65번 SER, 66번 GLU, 100번 VAL, 102번 ARG, 104번 HIS, 109번 VAL, 및 111번 PHE, 또한 도 4D에서 나타난 바와 같이 IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, 및 IL-17E에서 해당하는 잔기들. 한 가지 구현예에서, 결합 단백질은 상기 부위 1의 사슬 A 잔기들의 하나에서 적어도 하나의 돌연변이 및 상기 부위 1의 사슬 B 잔기들의 하나에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 부위 1에서 만들어질 수 있는 일정 대표적인 돌연변이들은 다음을 포함한다:

사슬 A에서 25번 MET은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 25번 MET은 중성의 친수성 잔기, 작은 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 예를 들어, 25번 MET은 Trp 또는 Tyr로 돌연변이된다. 25번 MET은 표면 근처의 소수성 포장을 분해하도록, 예로 하전되거나 큰 방향족 잔기로의 돌연변이에 의해 돌연변이 될 수 있다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 23번 VAL, 서열번호 4의 36번 ARG, 서열번호 6의 48번 LEU, 서열번호 8의 36번 LEU, 및 서열번호 10의 33번 LEU으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 29번 ILE은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 29번 ILE은 중성의 친수성 잔기, 작은 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 27번 ILE으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 31번 ILE은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 31번 ILE은 작은 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 29번 ASN으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 58번 TRP는 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 58번 TRP는 작은 지방족 잔기로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 56번 GLU, 서열번호 4의 85번 HIS, 서열번호 6의 97번 THR, 서열번호 8의 85번 TYR, 및 서열번호 10의 67번 ARG으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 61번 ASN은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 61번 ASN은 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 59번 GLU, 서열번호 4의 88번 SER, 서열번호 6의 100번 ASP, 서열번호 8의 88번 ALA, 및 서열번호 10의 70번 ASN으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 63번 TYR은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 63번 TYR은 지방족 잔기, 중성의 친수성 잔기, 또는 하전된 잔기로 돌연변이된다. 예를 들어, 63번 TYR은 Ala 또는 Lys으로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 61번 TYR, 서열번호 4의 90번 ILE, 서열번호 6의 102번 TYR, 서열번호 8의 90번 TYR, 및 서열번호 10의 72번 LEU으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 64번 PRO는 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 64번 PRO는 글리신, 지방족 잔기, 중성의 친수성 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 62번 PRO, 서열번호 4의 91번 PRO, 서열번호 6의 103번 PRO, 서열번호 8의 91번 PRO, 및 서열번호 10의 73번 PRO으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 65번 SER은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 65번 SER은 지방족 잔기 상세하게는 큰 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 예를 들어, 65번 SER은 Lys 또는 Trp로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 63번 SER, 서열번호 4의 92번 VAL, 서열번호 6의 104번 GLN, 서열번호 8의 92번 ARG, 및 서열번호 10의 74번 GLN으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 100번 VAL은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 100번 VAL은 중성의 친수성 잔기, 작은 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 98번 LEU, 서열번호 4의 128번 ARG, 서열번호 6의 140번 LEU, 서열번호 8의 128번 LEU, 및 서열번호 10의 111번 PHE으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 102번 ARG는 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 102번 ARG는 지방족 잔기, 중성의 친수성 잔기, 산성 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 예를 들어, 102번 ARG는 Ala, Ser, Gln, 또는 Asn으로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 100번 ARG, 서열번호 4의 130번 ARG, 서열번호 6의 142번 ARG, 서열번호 8의 130번 ARG, 및 서열번호 10의 113번 ARG으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 104번 HIS는 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 104번 HIS는 지방족 잔기, 또는 산성 잔기로 돌연변이된다. 예를 들어, 104번 HIS는 Glu 또는 Asp로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 102번 PRO, 서열번호 4의 136번 PRO, 서열번호 6의 153번 PRO, 서열번호 8의 134번 CYS, 및 서열번호 10의 121번 GLY으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 109번 VAL은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 109번 VAL은 중성의 친수성 잔기, 큰 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다.

사슬 B에서 111번 PHE는 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 111번 PHE는 작은 지방족 잔기, 중성의 친수성 잔기, 또는 하전된 잔기로 돌연변이된다. 예를 들어, 111번 PHE는 Ala로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 109번 PHE, 서열번호 4의 143번 GLN, 서열번호 6의 160번 PHE, 서열번호 8의 141번 TYR, 및 서열번호 10의 128번 LEU으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 66번 GLU은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 66번 GLU은 지방족 잔기, 중성의 친수성 잔기, 염기성 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 예를 들어, 돌연변이는 66번 GLU에 의한 수소 결합을 분해하도록 만들어진다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 64번 VAL, 서열번호 4의 93번 ASP, 서열번호 6의 105번 LYS, 서열번호 8의 93번 TYR, 및 서열번호 10의 75번 ASP로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 115번 LYS은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 115번 LYS은 지방족 잔기, 중성의 친수성 잔기, 산성 잔기 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 예를 들어, 115번 LYS은 Ala로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 113번 LYS, 서열번호 4의 147번 MET, 서열번호 6의 164번 PHE, 서열번호 8의 145번 TYR, 및 서열번호 10의 132번 LEU으로 만들어질 수 있다.

부위 2

한 가지 구현예에서, IL-17R 결합 단백질은 하나의 수용체 결합 단면의 부위 2가 하나 이상의 돌연변이들, 예로 적어도 2 또는 3개의 돌연변이들, 예로 비-보존적 돌연변이들 또는 본 명세서에서 기술된 돌연변이를 포함하는, 두 가지의 소단위들을 포함하는 IL-17 사이토카인을 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 다음의 부위 2 잔기들 (IL-17F 및 서열번호 12의 번호매김에 근거하여 확인됨)이 돌연변이된다: 사슬 A: 94번 GLN, 95번 GLN, 96번 GLU, 115번 LYS, 및 117번 LEU; 또한 사슬 B: 36번 GLN, 37번 ARG, 40번 MET, 41번 SER, 43번 ASN, 45번 GLU, 54번 TYR, 56번 VAL, 66번 GLU, 68번 VAL, 및 118번 VAL 또한 도 4D에서 나타난 바와 같이 IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, 및 IL-17E에서 해당하는 잔기들. 한 가지 구현예에서, 결합 단백질은 상기 부위 2의 사슬 A 잔기들의 하나에서 적어도 하나의 돌연변이 및 상기 부위 2의 사슬 B 잔기들의 하나에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 부위 2에서 만들어질 수 있는 일정 대표적인 돌연변이들은 다음을 포함한다:

사슬 B에서 36번 GLU은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 36번 GLU은 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 예를 들어, 36번 GLU은 본 잔기에 의한 수소 결합을 분해하도록 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 34번 THR, 서열번호 4의 47번 MET, 서열번호 6의 59번 GLY, 서열번호 8의 47번 PRO, 및 서열번호 10의 44번 SER으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 37번 ARG은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 37번 ARG은 지방족 잔기, 중성의 친수성 잔기, 산성 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 예를 들어, 37번 ARG은 Ala 또는 Glu으로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 35번 ASN, 서열번호 4의 48번 VAL, 서열번호 6의 60번 ARG, 서열번호 8의 48번 ARG, 및 서열번호 10의 45번 CYS으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 40번 MET은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 40번 MET은 중성의 친수성 잔기, 작은 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 38번 ARG, 서열번호 4의 51번 LEU, 서열번호 6의 63번 ARG, 서열번호 8의 51번 ALA, 및 서열번호 10의 48번 SER으로 만들어질 수 있다. 예를 들어, 서열번호 2의 38번 ARG 및 서열번호 6의 63번 ARG는 Glu, Asp, Gln, Asn, Thr, 또는 Ser으로 또는 그의 수소 결합에 대한 능력을 파괴하는 또 다른 잔기로 돌연변이 되거나 염 연결다리를 형성할 수 있다.

사슬 B에서 41번 SER은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 41번 SER은 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 예를 들어, 41번 SER은 Ala, Trp, Tyr, Arg 또는 Lys으로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 39번 SER으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 43번 ASN은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 43번 ASN은 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 예를 들어, 43번 ASN은 Glu 또는 Asp으로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 41번 ASN, 서열번호 4의 70번 MET, 서열번호 6의 82번 ASP, 서열번호 8의 70번 PRO, 및 서열번호 10의 52번 PRO으로 만들어질 수 있다. 예를 들어, 서열번호 2의 41번 ASP는 Ile, Leu, Tyr, Arg 또는 Lys으로 돌연변이 될 수 있다.

사슬 B에서 45번 GLU은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 45번 GLU은 지방족 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 43번 TYR, 서열번호 4의 72번 ASN, 서열번호 6의 84번 HIS, 서열번호 8의 72번 ASN, 및 서열번호 10의 54번 ASN으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 54번 TYR은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 54번 TYR은 지방족 잔기, 중성의 친수성 잔기, 또는 하전된 잔기로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 52번 LEU, 서열번호 4의 81번 TYR, 서열번호 6의 93번 TYR, 서열번호 8의 81번 TYR, 및 서열번호 10의 63번 TYR으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 56번 VAL은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 56번 VAL은 중성의 친수성 잔기, 큰 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 54번 ARG, 서열번호 4의 83번 ILE, 서열번호 6의 95번 VAL, 서열번호 8의 83번 ILE, 및 서열번호 10의 65번 LEU으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 68번 VAL은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 68번 VAL은 중성의 친수성 잔기, 큰 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 예를 들어, 68번 VAL은 Gln, Asn, Ser, 또는 Thr으로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 66번 TRP, 서열번호 4의 95번 PRO, 서열번호 6의 107번 ALA, 서열번호 8의 95번 PRO, 및 서열번호 10의 77번 TYR으로 만들어질 수 있다.

사슬 A에서 94번 GLN은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 94번 GLN은 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 92번 GLN, 서열번호 4의 122번 PHE, 서열번호 6의 134번 LEU, 서열번호 8의 122번 TYR, 및 서열번호 10의 105번 TYR으로 만들어질 수 있다.

사슬 A에서 95번 GLN은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 95번 GLN은 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 예를 들어, 95번 GLN은 Asp, Glu, Ala 또는 Trp으로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 93번 GLN, 서열번호 4의 123번 SER, 서열번호 6의 135번 GLN, 서열번호 8의 123번 MET, 및 서열번호 10의 106번 HIS으로 만들어질 수 있다.

사슬 A에서 96번 GLU은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 96번 GLU은 지방족 잔기, 염기성 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 94번 GLU, 서열번호 4의 124번 GLN, 서열번호 6의 136번 SER, 서열번호 8의 124번 PRO, 및 서열번호 10의 107번 ASN으로 만들어질 수 있다.

사슬 A에서 117번 LEU은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 117번 LEU은 중성의 친수성 잔기, 작은 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 115번 LEU, 서열번호 4의 149번 THR, 서열번호 6의 166번 HIS, 서열번호 8의 147번 THR, 및 서열번호 10의 134번 ARG으로 만들어질 수 있다.

사슬 A에서 118번 VAL은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 118번 VAL은 중성의 친수성 잔기, 큰 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 116번 VAL, 서열번호 4의 150번 ILE, 서열번호 6의 167번 VAL, 서열번호 8의 148번 ILE, 및 서열번호 10의 135번 VAL으로 만들어질 수 있다.

또한, 예를 들어 서열번호 2의 37번 LYS은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 이것은 Glu, Glu, Asp, Gln, Asn, Thr, 또는 Ser으로, 또는 그의 수소 결합에 대한 능력을 파괴하는 또 다른 잔기로 돌연변이 되거나 염 연결다리들을 형성할 수 있다.

서열번호 2의 30번 ARG 및 서열번호 10의 40번 ARG는 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 이것은 Glu, Glu, Asp, Gln, Asn, Thr, 또는 Ser으로, 또는 그의 수소 결합에 대한 능력을 파괴하는 또 다른 잔기로 돌연변이 되거나 염 연결다리들을 형성할 수 있다.

부위 3

한 가지 구현예에서, IL-17R 결합 단백질은 하나의 수용체 결합 단면의 부위 3이 하나 이상의 돌연변이들, 예로 적어도 2 또는 3개의 돌연변이들, 예로 비-보존적 돌연변이들 또는 본 명세서에서 기술된 돌연변이를 포함하는, 두 가지의 소단위들을 포함하는 IL-17 사이토카인을 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 다음의 부위 3 잔기들 (IL-17F 및 서열번호 12의 번호매김에 근거하여 확인됨)이 돌연변이 된다: 사슬 A: 75번 LEU, 86번 ILE, 87번 SER, 89번 ASN, 91번 VAL, 125번 VAL, 127번 PRO, 128번 VAL, 129번 ILE, 130번 HIS, 131번 HIS, 및 132번 VAL, 및/또는 사슬 A는 125번 VAL, 126번 THR, 127번 PRO, 128번 VAL, 129번 ILE, 130번 HIS, 131번 HIS, 또는 132번 VAL을 선행하는 잔기에서 절단될 수 있음; 또한 사슬 B: 40번 MET, 42번 ARG, 44번 ILE, 및 47번 ARG, 또한 도 4D에서 나타난 바와 같이 IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, 및 IL-17E에서 해당하는 잔기들. 한 가지 구현예에서, 결합 단백질은 상기 부위 3의 사슬 A 잔기들의 하나에서 적어도 하나의 돌연변이 및 상기 부위 3의 사슬 B 잔기들의 하나에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

부위 3에서 만들어질 수 있는 일정 대표적인 돌연변이들은 다음을 포함한다:

사슬 B에서 42번 ARG은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 42번 ARG은 지방족 잔기, 중성의 친수성 잔기, 산성 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 예를 들어, 42번 ARG은 Glu, Asp, Trp, 또는 Ala로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 40번 SER, 서열번호 4의 69번 TRP, 서열번호 6의 81번 ALA, 서열번호 8의 69번 PRO, 및 서열번호 10의 51번 GLY으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 44번 ILE은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 44번 ILE은 중성의 친수성 잔기, 작은 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 42번 TYR, 서열번호 4의 71번 SER, 서열번호 6의 83번 THR, 서열번호 8의 71번 THR, 및 서열번호 10의 53번 LEU으로 만들어질 수 있다.

사슬 B에서 47번 ARG은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 47번 ARG은 지방족 잔기, 중성의 친수성 잔기, 산성 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 예를 들어, 47번 ARG은 Glu, Asp, Gln, 또는 Asn으로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 45번 ARG, 서열번호 4의 74번 ARG, 서열번호 6의 86번 ARG, 서열번호 8의 74번 ARG, 및 서열번호 10의 56번 ARG으로 만들어질 수 있다.

사슬 A에서 75번 LEU은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 75번 LEU은 중성의 친수성 잔기, 작은 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 73번 LEU, 서열번호 4의 102번 LEU, 서열번호 6의 114번 ARG, 서열번호 8의 102번 ARG, 및 서열번호 10의 84번 PRO으로 만들어질 수 있다.

사슬 A에서 86번 ILE은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 86번 ILE은 중성의 친수성 잔기, 작은 지방족 잔기, 또는 하전된 잔기로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 84번 TYR, 서열번호 4의 114번 ARG, 서열번호 6의 126번 ALA, 서열번호 8의 114번 VAL, 및 서열번호 10의 97번 PRO으로 만들어질 수 있다.

사슬 A에서 87번 SER은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 87번 SER은 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 85번 HIS, 서열번호 4의 115번 SER, 서열번호 6의 127번 ALA, 서열번호 8의 115번 ARG, 및 서열번호 10의 98번 ARG으로 만들어질 수 있다.

사슬 A에서 89번 ARG은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 89번 ARG은 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 예를 들어, 89번 ARG은 Ala로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 87번 ASN, 서열번호 4의 117번 VAL, 서열번호 6의 129번 ASN, 서열번호 8의 117번 ARG, 및 서열번호 10의 100번 ASN으로 만들어질 수 있다.

사슬 A에서 91번 VAL은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 91번 VAL은 중성의 친수성 잔기, 큰 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 예를 들어, 91번 VAL은 Asp 또는 Glu로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 89번 VAL, 서열번호 4의 119번 VAL, 서열번호 6의 131번 VAL, 서열번호 8의 119번 ALA, 및 서열번호 10의 102번 GLU으로 만들어질 수 있다.

사슬 A에서 125번 VAL은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 125번 VAL은 중성의 친수성 잔기, 큰 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 123번 VAL, 서열번호 4의 157번 ILE, 서열번호 6의 174번 VAL, 서열번호 8의 155번 VAL, 및 서열번호 10의 142번 VAL으로 만들어질 수 있다.

사슬 A에서 127번 PRO은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 127번 PRO은 지방족 잔기, 중성의 친수성 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 한 가지 구현예에서, 127번 PRO은 결실된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 125번 PRO, 서열번호 6의 176번 PRO, 서열번호 8의 157번 GLU, 및 서열번호 10의 144번 PRO으로 만들어질 수 있다.

사슬 A에서 128번 VAL은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 128번 VAL은 중성의 친수성 잔기, 큰 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 한 가지 구현예에서, 128번 VAL은 결실된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 126번 ILE, 서열번호 6의 177번 ARG, 서열번호 8의 158번 PRO, 및 서열번호 10의 145번 ARG으로 만들어질 수 있다.

사슬 A에서 129번 ILE은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 129번 ILE은 중성의 친수성 잔기, 작은 지방족 잔기, 하전된 잔기, 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 한 가지 구현예에서, 129번 ILE은 결실된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 127번 VAL, 서열번호 6의 178번 SER, 서열번호 8의 159번 GLU, 및 서열번호 10의 146번 VAL으로 만들어질 수 있다.

사슬 A에서 130번 HIS은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 130번 HIS은 지방족 잔기 또는 상성 잔기로 돌연변이된다. 한 가지 구현예에서, 130번 HIS은 결실된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 128번 HIS, 서열번호 6의 179번 VAL, 서열번호 8의 160번 LYS, 및 서열번호 10의 147번 MET으로 만들어질 수 있다.

사슬 A에서 131번 HIS은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 131번 HIS은 지방족 잔기 또는 산성 잔기로 돌연변이된다. 한 가지 구현예에서, 131번 HIS은 결실된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 129번 HIS, 서열번호 8의 161번 ASP, 및 서열번호 10의 148번 GLY으로 만들어질 수 있다.

사슬 A에서 132번 VAL은 또 다른 아미노산, 예로 알라닌 또는 알라닌이 아닌 아미노산으로 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 132번 VAL은 중성의 친수성 잔기, 큰 지방족 잔기, 하전된 잔기 또는 방향족 잔기로 돌연변이된다. 한 가지 구현예에서, 132번 VAL은 결실된다. 해당하거나 비-보존적인 돌연변이들은 서열번호 2의 130번 VAL, 및 서열번호 8의 162번 ALA으로 만들어질 수 있다.

사이토카인 소단위는 다음의 잔기들 및 소단위의 자연적인 C-말단 사이에 하나 이상, 예로 적어도, 2, 3, 4, 또는 5개의 결실들을 포함할 수 있다: 서열번호 12의 130번 VAL, 서열번호 2의 125번 PRO, 서열번호 6의 176번 PRO, 서열번호 8의 157번 GLU, 및 서열번호 10의 144번 PRO. 일정 구현예들에서, 사이토카인 소단위는 상기 위치들의 하나 또는 이러한 위치들로부터 1, 2, 또는 3개 잔기들 떨어진 바로 다음에서 절단된다. 사이토카인 소단위를 포함하는 폴리펩타이드는 이러한 절단에서 종결되거나, 대안으로 절단된 사이토카인 소단위의 말단에 융합된 기타 다른 외인성 서열들 (폴리펩타이드 태그와 같음)을 포함할 수 있다.

대표적인 IL-17R 결합 단백질들은 다수의 돌연변이들, 예를 들어

* 부위 1에서 적어도 하나, 둘, 또는 세 개의 치환들 및 부위 2에서 적어도 하나, 둘 또는 세 개의 치환들;

* 부위 1에서 적어도 하나, 둘, 또는 세 개의 치환들 및 부위 3에서 적어도 하나, 둘 또는 세 개의 치환들 또는 결실들;

* 부위 2에서 적어도 하나, 둘, 또는 세 개의 치환들 및 부위 3에서 적어도 하나, 둘 또는 세 개의 치환들 또는 결실들;

* 부위 1에서 적어도 하나, 둘, 또는 세 개의 치환들, 부위 2에서 적어도 하나, 둘, 또는 세 개의 치환들 및 부위 3에서 적어도 하나, 둘 또는 세 개의 치환들 또는 결실들:을 포함한다.

대표적인 IL-17R 결합 단백질들은 IL-17 사이토카인에서 다수의 치환들 및/또는 결실들을 포함한다. 예를 들어, IL-17 결합 단백질은 (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 적어도 둘, 셋 또는 네 가지의 다음의 특징들을 포함할 수 있다: (i) 사슬 A의 47번 R에서 치환들, (ii) 사슬 A의 65번 S에서 치환들, (iii) 사슬 A의 65번 W에서 치환들, (iv) 사슬 A의 102번 R에서 치환들, (v) 사슬 B의 89번 N에서 치환들, 및 (vi) 서열번호 12의 적어도 두 개의 C-말단 잔기들 또는 서열번호 12의 128-133번에 해당하는 적어도 둘, 셋, 넷, 또는 다섯 개의 잔기들의 결실들. 단백질은 본 명세서에서 기술된 다른 특징들을 여전히 가질 수 있다.

일정의 대표적인 돌연변이된 IL-17 사이토카인 서열들이 실시예들 24 내지 27에서 나열되고 있다. 이러한 서열들과 적어도 85,90, 92, 94, 96, 98, 또는 99% 일치하고 이러한 서열들과 동일한 위치들에서 치환들을 포함하는 서열들도 역시 사용될 수 있다.

해당하는 돌연변이들이 도 4D에서 나타낸 해당 위치들에 의해 표시되는 바와 같이 다른 IL-17 사이토카인들에서 만들어질 수 있다. 또한, 다음의 잔기들은 IL-17 사이토카인의 중심 (core)에 묻히기 쉽고, 소정의 구현예들에서 이들 잔기들의 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%는 돌연변이 되지 않는다.

한 가지 구현예에서, IL-17R 결합 단백질은 IL-17R을, 예로 세포의 표면에서, 시료에서, 또는 환자에서 검출하는 데 사용된다. 예를 들어, IL-17R 결합 단백질은 IL-17R에 부착하고 수용체를 길항하지 않고도 세포 상에서 IL-17R를 검출할 수 있다.

한 가지 구현예에서, IL-17R 결합 단백질은 수용체 길항제로서, 예로 IL-17 수용체 소단위에 결합하고 수용체 이중합 (dimerization)을 예방한다.

아미노산 변형들

본 명세서에서 기술된 폴리펩타이드들은 치환, 결실, 또는 첨가를 포함하는 다양한 방식들로 변형될 수 있다. 치환은 하나의 아미노산의 또 다른 아미노산으로의 치환을 수반한다. 이러한 치환은 유전 암호에 의해 직접적으로 인코드되는 20가지의 아미노산들이라면 모두를 사용하여 만들어질 수 있다: 알라닌 (alanine), 아르기닌 (arginine), 아스파라진 (asparagine), 아스파트산 (aspartic acid), 시스테인 (cysteine), 글루탐산 (glutamic acid), 글루타민 (glutamine), 글리신 (glycine), 히스티딘 (histidine), 이소루이신 (isoleucine), 루이신 (leucine), 라이신 (lysine), 메티오닌 (methionine), 페닐알라닌 (phenylalanine), 프롤린 (proline), 세린 (serine), 트레오닌 (threonine), 트립토판 (tryptophan), 타이로신 (tyrosine), 및 발린 (valine). 또한, 폴리펩타이드의 아미노산들은 유전 암호에 의해 직접적으로 인코드되지 않는 아미노산들, 예를 들어 셀레노시스테인 (selenocysteine), 피롤라이신 (pyrrolysine), p-니트로페닐알라닌 (p-nitrophenylalanine), p-설포타이로신 (p-sulfotyrosine), p-카복시페일알라닌 (p-carboxyphenylalanine), o-니트로페닐알라닌 (o-nitrophenylalanine), 5-니트로 His, 3-니트로 Tyr, 2-니트로 Tyr, 니트로 치환된 Leu, 니트로 치환된 His, 니트로 치환된 Ile, 니트로 치환된 Trp, 2-니트로 Trp, 4-니트로 Trp, 5-니트로 Trp, 6-니트로 Trp, 7-니트로 Trp, 아미노타이로신들 (aminotyrosines), 및 카복시페닐알라닌들 (carboxyphenyalanines):을 사용하여 치환될 수 있다.

보존적 아미노산 치환들은 흔히 단백질의 입체형태 또는 기능을 변경하지 않고도 단백질로 만들어질 수 있다. 치환들은 (a) 치환의 인접 영역에서 골격 구조, 예를 들어 판상 (sheet) 또는 나선형 입체형태, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측 사슬의 부피 또는 분지화 (branching)에 미치는 그들의 잠재적인 효과를 근거로 하여 선택될 수 있다.

아미노산 잔기들은 측 사슬의 특성들을 근거로 하여 분류될 수 있다: (1) 지방족 (aliphatic): ala, met, val, leu, ile; (2) 작은 지방족 (small aliphatic): ala, val; (3) 큰 지방족 (large aliphatic): met, leu, ile; (4) 중성의 친수성 (eutral hydrophilic): ser, thr; asn; gln; (5) 산성 (acidic): asp, glu; (6) basic: his, lys, arg; (7) 하전됨 (charged): arg, asp, glu, his, lys; (8) 골격의 입체형태에 영향을 주는 잔기들: gly, pro; 또한 (9) 방향족 (aromatic): trp, tyr, phe. 비-보존적인 치환들은 이들 부류들의 하나의 구성원을 다른 부류의 구성원으로 치환하거나 하기 표에서 확인되지 않은 치환을 만드는 것을 포함할 수 있다. 보존적인 치환들은 이들 부류들의 하나의 구성원을 동일한 부류의 또 다른 구성원으로 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로 돌연변이들은 Cys로 만들어지지 않는다.

대표적 보존적인 치환들은 (보존적인 치환들로서 확인되지 않는 잔기들로 치환들이 되는 대표적인 비-보존적인 치환들과 함께) 다음의 표에서 기술되고 있다.

헤테로이중체 형성

적절한 접근법이 본 명세서에서 기술된 두 가지의 사이토카인 소단위들의 헤테로이중체들을 형성하는 데 사용될 수 있다. 대표적인 헤테로이중체들로는 IL-17A, IL-17F, IL-17B, IL-17C, IL-17D, 및 IL-17E의 서로 다른 두 가지의 서열 변이체들의 헤테로이중체들 뿐만 아니라 두 가지의 서로 다른 사이토카인 패밀리 구성원들을 조합하는 헤테로이중체들, 예로 IL-17A의 서열 변이체 및 IL-17F의 야생형 또는 변이체; IL-17F의 서열 변이체 및 IL-17A의 야생형 또는 변이체; 등을 포함한다.

헤테로이중체들을 형성하는 한 가지 접근법은 둘 중 하나의 소단위를 헤테로이중체 쌍의 한쪽 서열로 연결하고, 다른 하나의 소단위를 쌍의 다른 한쪽 서열로 연결하는 것이다. 헤테로이중체 쌍으로부터 나온 외인성 헤테로이중합 (heterodimerization) 서열은 사이토카인 소단위의 N- 또는 C-말단에 위치한다. 예를 들어, 헤테로이중체 짝은 비-사이토카인 단백질, 예로 전사인자 (예로, fos/jun)의 헤테로이중합 도메인, 수용체, 또는 인위적 서열이다. 대표적인 인위적 서열은 조작된 산성-염기성 지퍼 (acidic-basic zipper)이다. 또 다른 대표적인 헤테로이중합 접근법은 헤테로이중체를 형성하도록 조작된 Fc 도메인, 예로 구멍들-내-융기 변형된 CH3 도메인을, 예로 Fc 도메인 내에서 또는 독립적으로 사용하는 것이다. 예로, Ridgway Protein Eng. 1996 Jul;9(7):617-2를 참조. 보다 또 다른 접근법은 하나의 사이토카인 소단위를 면역글로불린 경쇄의 불변 부위에, 다른 하나의 사이토카인 소단위를 면역글로불린 중쇄의 CH1 불변 부위에 부착하는 것을 포함한다.

헤테로이중체들을 형성하는 또 다른 접근법은 단일 사슬 단백질을 형성하도록 두 가지의 소단위들을 링커를 사용하여 연결하는 것이다. 링커는 적절한 길이라면 모두, 예로 적어도 24, 25, 27, 29, 30 또는 32개의 잔기들, 예로 25 내지 34개 또는 27 내지 37개 잔기들 사이의 범위일 수 있다. 링커는 반복 서열, 예로 (Gly-Gly-Ser)_n 또는 (Gly-Gly-Gly Ser)_n 또는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n을 포함할 수 있고, 여기에서 "n"은 예로 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 이상이다. 더 길거나 더 짧은 링커들도 역시 사용될 수 있다. 최대의 안정성 및 최대의 헤테로이중체 형성을 나타내는 링커 길이들이 선택되어 사용될 수 있다.

IL-17R 결합 단백질들 및 본 명세서에서 기술된 다른 단백질들은 재조합 숙주에서 발현에 의해, 뿐만 아니라 시험관내 전사 및 해독 또한 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 세포 발현의 경우, 결합 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 핵산들 (예로, cDNA 또는 게놈 DNA)이 클로닝 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터 내로 삽입될 수 있다. 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스성 게놈, 파지미드, 파지 게놈, 또는 기타 다른 자가 복제하는 서열일 수 있다. 적절한 코딩 핵산 서열은 다양한 절차들에 의해 벡터 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 적절한 제한효소 부위들이 조작될 수 있다 (예로, PCR을 사용함). 다음으로 제한효소 소화 및 라이게이션이 코딩 핵산 서열을 적절한 위치에 삽입하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로 벡터 구성성분들은 하나 이상의 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자들, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열을 포함한다.

박테리아 발현의 경우, 결합 단백질은 신호 서열 존재 시 또는 부재 시 생산될 수 있다. 예를 들어, 이것은 세포들 내에서 생산될 수 있고 봉입체들 (inclusion bodies)에 축적된다. 또한 이것은, 예로 원핵성 신호 서열, 예로 알칼라인 포스파타제, 페니실리나제 (penicillinase), 또는 열-안정성 제 Ⅱ형 장내독소 (enterotoxin Ⅱ)로부터 나온 것과 같은 적절한 리더 서열의 첨가에 의해 분비될 수 있다. 발현을 위한 대표적인 박테리아 숙주세포들은 형질전환 가능한 균주라면 모두 E. coli K-12 strain (E. coli C600, ATCC 23724; E. coli HB101 NRRLB-11371, ATCC-33694; E. coli MM294 ATCC-33625; E. coli W3110 ATCC-27325), B. 섭틸리스 (B. subtilis), 슈도모나스 (Pseudomonas), 및 기타 다른 바실러스들을 포함한다. 박테리아 시스템에서 생산된 단백질들은 전형적으로 당화 (glycosylation)가 결여되어 있을 것이다.

결합 단백질은 효모 숙주세포, 예로 사카로마이세스 세레비시아애 (Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼브 (Schizosaccharomyces pombe), 한세울라 (Hanseula), 또는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 발현될 수 있다. 효모 발현의 경우, 결합 단백질은 또한 내세포적으로 또는 분비에 의해, 예로 효모 인버타제 리더 (invertase leader) 또는 알파인자 리더 (alpha factor leader)를 사용하여 생산될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서는, 동일 또는 관련 종의 분비된 폴리펩타이드들로부터 나온 신호 서열들, 뿐만 아니라 바이러스성 분비 리더들과 같은 포유동물 신호 서열들이 단백질의 분비를 유도하는 데 사용될 수 있다. 진핵성 숙주세포들 (효모, 곰팡이, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물들로부터 나온 핵을 가진 세포들)에서 사용되는 발현 벡터들은 또한 전사의 종결 및 mRNA를 안정화하는 데 필요한 서열들을 포함할 수 있다. 이러한 서열들은 공통적으로 진핵성 또는 바이러스성 DNAs 또는 cDNAs의 5', 때로 3' 미해독된 부위들로부터 사용가능하다. 이들 부위들은 결합 단백질을 인코딩하는 mRNA의 미해독된 부분 (untranslated portion)에서 폴리아데닐화된 단편들로서 전사되는 뉴클레오타이드 분절들을 포함한다. 발현 벡터은 또한 하나 이상의 인트론 서열들을 포함할 수도 있다.

또한 결합 단백질은 곤충세포들, 예로 Sf9 또는 SF21 세포들에서, 예로 pFAST-BAC^TM 시스템을 사용하여 발현될 수 있다. 결합 단백질은 포유동물 세포들에서도 역시 발현될 수 있다. 예를 들어, 포유동물 기원의 세포주들도 역시 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포주들의 예로는 원숭이 신장 세포들의 COS-7 계열 (ATCC 번호 CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), L 세포들, C127 세포들, 3T3 세포들 (ATCC 번호 CCL 163), 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포들, HeLa 세포들, 및 BHK (ATCC 번호 CRL 10) 세포주들, 또한 맥마한 등에 의해 기술된 바와 같이 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 (ATCC 번호 CCL 70)로부터 유래한 CV1/EBNA 세포주 (McMahan et al., EMBO J. 10: 2821, 1991)를 포함한다. 포유동물 세포들 내로 DNA를 도입하는 확립된 방법들은 기술되어 왔다 (Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 1569).

재조합 세포들에서 결합 단백질의 합성의 적용에 보다 적합한 다른 방법들, 벡터들, 및 숙주 세포들이 분자적 클로닝: 실험실 매뉴얼에서 기술되어 있다. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 3판., Sambrook et al. (eds.), Cold Spring Harbor Press, (2001) (ISBN: 0879695773). IL-17 사이토카인 단백질들은 예로 포유동물, 곰팡이, 또는 벡테리아 세포들에서 적절한 방법이라면 모두에 의해 발현되고 정제될 수 있다. 단백질들은 당화되거나 당화되지 않을 수 있다.

일단 세포들에서 발현되고 나면, IL-17R 결합 단백질들 및 본 명세서에서 기술된 단백질들은 배양 배지, 봉입체들, 또는 세포 용출물들로부터 회수될 수 있다. 세포들은 냉동-해동, 순환 파쇄 (cycling sonication), 기계적 분해, 또는 세포 용해제들 (예로, 계면활성제들)과 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단들에 의해 분해될 수 있다. IL-17R 결합 단백질들 및 본 명세서에서 기술된 단백질들은 세포 용출물들 또는 세포 배지에서 발견될 수 있는 다른 세포 단백질들 또는 폴리펩타이드들로부터 정제될 수 있다. 한 가지 대표적인 정제 절차로는 양이온 교환 크로마토그래피 및 젤 여과를 포함한다. 예로, Murphy et al. Protein Expr Purif. 1998 Mar;12(2):208-14를 참조. 다양한 단백질 정제의 방법들이 사용될 수 있고 이러한 방법들은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어 효소학의 방법 (Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); and Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (2010) (ISBN: 1441928332))에 기술되어 있다. 정제 소부분들 (에피토프 태그들 및 친화도 핸들들 (affinity handles))은 임의적으로 단백질분해 절단에 의해 제거될 수 있다.

사용 방법들

본 명세서에서 기술된 조성물들은 척추동물 개체에서 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법들에 유용하다. 이러한 한 가지 방법에서, 하나 이상의 폴리펩타이드들을 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계가 제공된다. 본 명세서에서 기술되는 바, 본 조성물은 소포내로, 국소적으로, 경구적으로, 직장으로, 안구로, 광학적으로, 비강으로, 또는 흡입을 통하여 투여된다.

본 명세서에서 기술된 결합 단백질들 (IL-17R 결합 단백질들, IL-17 사이토카인 구성원에 대한 항체들, 및 IL-17R에 대한 항체들과 같음)을 척추동물의 면역계를 조정하도록 사용하는 방법들도 역시 제공된다. 염증성 사이토카인의 수준은 변형된 IL-17을 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 것과 같은 포유동물 개체에게 변형된 폴리펩타이드의 투여 시 감소될 수 있다. 대표적인 염증성 사이토카인들은 IL-1, IL-6, TNF-α, IL-17, IL-21, 및 IL-23이다. 혈액 및/또는 포유동물의 또 다른 조직에 존재하는 염증성 사이토카인의 수준은 일반적으로 감소된다. 면역계의 조정은 포유동물 개체에서 항-염증성 사이토카인의 수준을 증가시키는 방법들도 역시 포함한다. 예를 들어, 항-염증성 사이토카인은 IL-10, IL-4, IL-11, IL-13, 또는 TGF-β이다. 임의적으로, 포유동물의 혈액에 존재하는 항-염증성 사이토카인의 수준은 증가된다.

일정 관점들에서, IL-17R 결합 단백질 또는 본 명세서에서 기술된 다른 조작된 단백질은 Th17 매개된 장애 또는 IL-17 사이토카인 패밀리 구성원에 의해 매개되는 장애를 치료하도록 개체에게 투여된다. 예를 들어, 본 단백질은 아토피 및 접촉성 피부염, 장염, 내독소혈증, 관절염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 자가면역 안구 질환들 (포도막염 (uveitis), 공막염 (scleritis)), 성인 호흡기 질환 (ARD), 탈수초 질환들, 패혈 쇼크, 다발성 기관부전, 천식과 같은 염증성 폐 손상, 만성 폐쇄 폐질환 (COPD), 기도 과다-반응, 만성 기관지염, 알레르기성 천식, 건선, 습진 (eczema), 궤양성 장염 및 크론씨 질환과 같은 IBS 및 염증성 장 질환 (IBD), 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 감염, 복강 염증의 결과들로서 (예로, 감염, 손상 등) 복부내 유착들 및 농양들, 전신성 홍반 루프스 (SLE), 다발성 경화증, 전신성 경화증, 콩팥 증후군 (nephrotic syndrome), 기관 동종이식 거부 (organ allograft rejection), 이식 대비 숙주 질환 (GVHD), 신장, 폐, 심장 등 이식 거부, 스트렙토코커스 세포벽 (SCW)-유도성 관절염, 골관절염, 치은염/치주염 (gingivitis/periodontitis), 헤르페스 간질 각막염 (herpetic stromal keratitis), 협착증 (restenosis), 가와사키 질환 (Kawasaki disease), 또한 IL- 17 및/또는 IL-23 발현을 특징으로 하는 이에 제한되는 것은 아니지만 전립선, 신장, 결장, 난소 및 자궁경부 암, 및 백혈병을 포함하는 암들/신생물 질환들을 치료하도록 개체에게 투여될 수 있다 (Tartour et al, Cancer Res. 5P:3698 (1999); Kato et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 282:735 (2001); Steiner et al, Prostate. 56:171 (2003); Langowksi et al, Nature 442: 461, 2006). 예를 들어, 결합 단백질은 IL-17 패밀리 구성원들을 (단독으로 또는 다함께) 결합하거나, 차단하거나, 저해하거나, 감소시키거나, 길항하거나 중화할 수 있다.

본 명세서에서 기술된 조성물들은 치료적으로 또는 예방적으로 사용될 수 있다. 다양한 서로 다른 폴리펩타이드들의 혼합물들 (cocktails)은 하나 또는 복수의 표적들, 예로 복수의 세포 유형들에 한 번에 결합하고 이들의 작용에 다함께 사용될 수 있다. 성공적인 치료가 의사에게 친숙한 일상적인 절차들에 의해 시도될 수 있다.

한 가지 구현예에서, IL-17R 결합 단백질 또는 본 발명에서 기술된 다른 조작된 단백질 (예로, 항체)은 눈의 표면에 영향을 주는 안구 질환들, 자가면역 반응에 의해 적어도 부분적으로는 매개되는 안구 장애들, 전신성 자가면역 장애 (스조렌 증후군 및 류마티스성 관절염과 같음)과 연관된 안구 장애들을 포함하는 안구 장애들 또는 IL-17 사이토카인 패밀리 구성원과 연관된 장애들을 치료하도록 투여된다. 본 환자는 더 심한 전신성 자가면역 장애의 다른 소견들을 가져도 가능하다.

안구 장애는 눈의 표면에 영향을 주는 눈 건조 장애일 수 있다. 본 장애는 건성 각막결막염 (keratoconjunctivitis sicca), 건성 각막염 (keratitis sicca), 건성 증후군 (sicca syndrome), 눈마름병 (xerophthalmia), 눈물 필름 장애 (tear film disorder), 감소된 눈물 생산, 수성 눈물 결핍 (aqueous tear deficiency), 및 메이보미안 샘 부전 (Meibomian gland dysfunction)이라고도 명명되는 병폐들을 포함한다. 또한, 본 명세서에서 기술된 결합 단백질은 봄철 결막염 및 녹내장과 연관된 염증을 치료하는 데 사용될 수 있다.

눈 건조는 스조렌 증후군 (SS), 예로 건성 각막결막염과 연관된 스조렌 증후군과 연관되는 형태들, 뿐만 아니라 이와 연관되지 않는 형태들, 예로 건성 각막결막염과 연관된 비-스조렌 증후군을 포함한다. 환자는 전신성 자가면역 장애의 다른 소견들을 가져도 가능하다.

눈 건조 증후군을 가지는 개체들은 눈 건조의 염증을 나타낼 수 있고, 스크래치, 빈약, 가려움, 타거나 누르는 감각들, 자극, 통증 및 발진을 경험할 수 있다. 눈 건조는 과다한 눈의 유루 (watering) 및 역으로 부족한 눈물 생산 둘 다와 연관될 수 있다.

IL-17R 결합 단백질 또는 본 발명에서 기술된 다른 공학조작된 단백질 (예로, 항체)은 각막과 같은 눈의 표면에 영향을 주는 기타 다른 장애들을 치료하는 데도 역시 사용될 수 있다. 이러한 장애들로는 각막 안구 표면 염증성 병폐, 각막 신생혈관형성, 말초 궤양성 각막염 및 미생물성 각막염을 포함하는 각막염을 포함한다. 또한 IL-17R 결합 단백질 또는 본 발명에서 기술된 다른 공학조작된 단백질 (예로, 항체)은 결막 손상 장애들 및 결막염을 포함하는 결막에 영향을 주는 기타 다른 장애들을 치료하는 데도 사용될 수 있다. IL-17R 결합 단백질 또는 본 발명에서 기술된 다른 조작된 단백질 (예로, 항체)은 유사물집 증후군 (pemphigoid syndrome) 및 스티븐슨-존슨 증후군과 같은 보다 다른 장애들을 치료하는 데도 역시 사용될 수 있다.

IL-17R 결합 단백질 또는 본 발명에서 기술된 다른 조작된 단백질 (예로, 항체)은 눈이 관여된 시술절차, 예로 각막 이식/각막 성형술 (keratoplasty), 인공각막 이식 수술 (keratoprosthesis surgery), 층판 이식 (lamellar transplantation), 선택적 내피 이식을 받거나, 경험하거나, 이로부터 회복하려는 개체에게 투여될 수 있다. IL-17R 결합 단백질 또는 본 발명에서 기술된 다른 조작된 단백질 (예로, 항체)은 눈 또는 눈 주변에서 신생혈관형성을 조정하도록 개체에게 투여될 수 있다.

IL-17R 결합 단백질 또는 본 발명에서 기술된 다른 조작된 단백질 (예로, 항체)은 눈에 영향을 주는 알레르기성 반응을 가지는 개체, 예로 심각한 알레르기성(아토피성) 눈 질환을 경험한 개체에게 투여될 수 있다.

IL-17R 결합 단백질 또는 본 발명에서 기술된 다른 조작된 단백질 (예로, 항체)은 눈에 영향을 주는 자가면역 장애를 가지는 개체에게 투여될 수 있다. 대표적인 자가면역 안구 장애들로는 교감성 안염 (sympathetic ophthalmia), 보그트-고야나기 하라다 (Vogt-Koyanagi Harada, VKH) 증후군, 자극성 망막영양증 (birdshot retinochoriodopathy), 안구 흉터성 유사물집증 (ocular cicatricial pemphigoid), 퓨크 이시성 홍채섬모체염 (Fuchs’heterochronic iridocyclitis), 및 포도막염의 다양한 형태들을 포함한다. IL-17R 결합 단백질 또는 본 발명에서 기술된 다른 조작된 단백질 (예로, 항체)은 상기 장애들이라면 모두를 치료하도록 개체에게 투여될 수 있다.

포도막염은 급성 및 만성 형태들을 포함하고, 하나 이상의 홍채, 섬모체, 및 맥락막의 염증을 포함하며 또한 전방, 중간 및 후방 형태들을 포함한다. 맥락막 형태들은 전신성 자가면역 질환, 예로, 베체트 증후군 (Behchet's syndrome), 강직성 척추염 (ankylosing spondylitis), 아동 류마티스 관절염 (juvenile rheumatoid arthritis), 레이터 증후군 (Reiter's syndrome), 및 염증성 장 질환과 연관될 수 있다. IL-17R 결합 단백질 또는 본 발명에서 기술된 다른 조작된 단백질 (예로, 항체)은 포도막염의 상기 형태들이라면 모두를 치료하도록 개체에게 투여될 수 있다.

IL-17R 결합 단백질 또는 본 발명에서 기술된 다른 조작된 단백질 (예로, 항체)은 안구 질환을 치료하도록 양식 (mode)이라면 모두에 의해서라도 투여될 수 있다. 제제는 비경구 양식에 의해 전달될 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 제제는 눈에 또는 눈에 인접하여 직접적으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 국소적으로 또는 안구내로, 예로 하기에 기술된 바와 같이 투여될 수 있다.

안과적 제형물들은 국소적 투여, 예로 점안액 또는 연고로서 투여로, 또는 이식, 예로 눈의 전방 체임버 또는 결막 낭 내로의 이식으로 전달될 수 있다. 점안액들은 점적기 (eye dropper)를 사용하여 전달될 수 있다. 안구 전달을 위해 제형화될 때, IL-17R 결합 단백질은 0.001 내지 5%, 예로 0.01 내지 5%, 0.1 내지 2% 또는 1 내지 5% 농도로 존재할 수 있다.

제형물들

하나 이상의 치료적 제제는 단독으로 또는 하나 이상의 화학치료적 제제들과 조합으로 개체에게 투여를 위한 약제학적으로 허용가능한 담체로 제형화될 수 있다. 일정 구현예들에서, 치료적 제제는 가동 인자 (mobilization factor), 임의적으로 화학치료적 제제와 조합으로 제형화된다. 활성 성분들은 연속적인 투여를 위해 단독으로 (개별적으로) 제형화될 수 있거나 동시적인 투여를 위해 다함께 제형화될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체 (pharmaceutically acceptable carrier)"는 개체에게 투여에 적합한 하나 이상의 양립가능한 고체 또는 액체 필러, 희석제들 또는 피막화 물질들을 의미한다. 또한 약제학적 조성물들의 성분들은, 실질적으로 원하는 약제학적 효율을 손상시킬 수도 있는 상호작용이 전혀 없는 방식으로 서로 같이 혼합될 수 있다. 이러한 조제물들은 일상적으로 약제학적으로 허용가능한 농도들의 염, 완충제들, 보존제들, 양립가능한 담체들, 아쥬반트들, 임의적으로 기타 다른 치료적 성분들을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 기술된 조성물들은 자유 염기로서 또는 약제학적으로 허용가능한 염으로서 투여될 수 있다. 이러한 약학적으로 및 약제학적으로 허용가능한 염들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 다음의 산들로부터 제조된 것들을 포함한다: 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, p-톨루엔 설폰산, 타르타르산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 말론산, 숙신산, 나프탈렌 설폰산, 및 벤젠 설폰산. 또한, 약제학적으로 허용가능한 염들은 카르복실산 그룹의 소듐, 포타슘 또는 칼슘 염들과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염들로서 제조될 수 있다.

또한 약제학적 조성물들은 적합한 고체 또는 젤 상의 담체들 또는 부형제들을 포함할 수 있다. 이러한 담체들 또는 부형제들의 예들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 다양한 슈가들, 전분들, 셀룰로우스 유도체들, 젤라틴, 및 폴리에틸렌 글리콜류와 같은 중합체들을 포함한다.

적합한 완충제들로는: 아세트산 및 염 (1 내지 2% w/v); 시트르산 및 염 (1 내지 3% w/v); 붕산 및 염 (0.5 내지 2.5% w/v); 또한 인산 및 염 (0.8 내지 2% w/v)를 포함한다. 적합한 보존제들로는 염화 벤즈알코늄 (benzalkonium chloride) (0.003 내지 0.03% w/v); 클로로부탄올 (0.3 내지 0.9% w/v); 파라벤들 (0.01 내지0.25% w/v) 및 티머로잘 (0.004 내지 0.02% w/v)를 포함한다.

적합한 액체 또는 고체 약제학적 조제물 형식들은, 예를 들어 흡입을 위한 수성 또는 식염수 용액들이고, 미세피막화되고 (microencapsulated), 껍질에 싸이고 (encochleated), 현미경적 금 입자들 위에 코팅되고, 리포좀들 내에 포함되고 (pH-의존성 방출 제형물들을 포함함), 지질성 물질들 (lipidoids)이 되고, 분무되고 (nebulized), 에어로졸들이 되고, 피부 내 이식용 펠렛들이 되거나, 피부 내에 스크래치되는 날카로운 물체 위에서 건조된다. 또한 약제학적 조성물들은 입자들, 파우더들, 정제들, 코팅된 정제들, (미세)캡슐들, 좌약들, 시럽들, 에멀전들, 현탁액들, 크림들, 점안액들 또는 조성물들의 지연된 방출 (protracted release) 조제물들을 포함하고, 이러한 조제물에는 부형제들 및 첨가물들 및/또는 붕해제들, 결합제들, 코팅제들, 팽창제들, 윤택제들, 향미제들, 감미제들 또는 수용화제들이 상기에서 기술된 바와 같이 통상적으로 사용된다. 약제학적 조성물들은 다양한 약물 전달 시스템들에서의 용도에 적합하다. 약물 전달을 위한 방법들의 간략한 리뷰를 위해, Langer, Science 249:1527-1533, 1990 또한 Langer and Tirrell, Nature, 2004 Apr 1; 428(6982): 487-92를 참조.

조성물들은 편의상 단위 용량 형태로 제공될 수 있고 약국의 기술분야에 잘 알려져 있는 방법들이라면 모두에 의해 제조될 수 있다. 소정의 구현예들에서, 투여되는 조성물은 용액으로서 보다는 파우더 또는 입자 형태로 있다. 본 발명의 일부분으로서 참작되는 입자 형태들의 예들은 미국 특허 제 US 2002/0128225호에서 제공된다. 일정 구현예들에서, 조성물들은 에어로졸 형태로 투여된다. 다른 구현예들에서, 조성물들은 적합한 운반체, 예로 무균의 무-발열원 물로 사용 전 조제되는 파우더 형태로 있을 수 있다.

또한, 본 명세서에서 기술된 조성물들은 저장 조제물 (depot preparation)로서 시간-방출 (time-release), 지연된 방출 (delayed release) 또는 지속된 방출 (sustained release) 전달 시스템으로 제형화된다. 이러한 시스템들은 본 명세서에서 기술된 조성물들의 반복된 투여들을 피하고, 개체 및 의사에게 편의성을 증가시킬 수 있다. 이러한 장기 작용하는 제형물들은 적합한 중합체 또는 소수성 물질들 (예를 들어, 허용가능한 오일에 넣은 에멀전으로서) 또는 이온 교환 레진들을 사용하여, 또는 약간 (sparingly) 수용성 유도체들로서, 예를 들어 약간 수용성 염으로서 제형화될 수 있다. 많은 유형들의 방출 전달 시스템들이 사용가능하고 당업자라면 알고 있다. 그들은 폴리락트산 및 폴리글리콜산, 베타-글루칸 입자들, 폴리안하이드라이드들 및 폴리카프로락톤과 같은 중합체 기초한 시스템들; 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르들 및 지방산들과 같은 스테롤, 모노-, 디- 및 트리글리세라이드들과 같은 중성 지방들 또는 지질성 물질들을 포함하는 지질들인 비중합체 시스템들; 하이드로젤 방출 시스템들; 실라스틱 시스템들 (silastic systems); 펩타이드 기초한 시스템들; 왁스 코팅들, 통상적인 결합제들 및 부형제들을 사용하는 압축된 정제들, 부분적으로 융합된 이식체들 등을 포함한다. 또한, 펌프-기초한 하드웨어 전달 시스템이 사용될 수 있고, 이들의 일부는 이식에 적용된다.

조절된 방출도 역시 생물적합성 (biocompatible) 및 생분해성 적절한 부형제 물질들을 사용하여 달성될 수 있다. 서방성에 효과를 미치는 이들 중합체 물질들은, 이에 제한되는 아니지만 비-생침식성 (nonbioerodable)/비-생분해성 (non-biodegradable) 및 생침식성/생분해성 중합체들을 포함하는 입자들을 생성하는 데 적합한 중합체 물질이라면 모두일 수 있다. 이러한 중합체들은 선행 기술에서 매우 자세하게 기술되어 왔으며, 이에 제한되는 것은 아니지만 베타-글루칸 입자들, 폴리아마이드들, 폴리카보네이트들, 폴리알킬렌들, 폴리알킬렌 글리콜들, 폴리알킬렌 옥사이드들, 폴리알킬렌 테레프탈레이트들, 폴리비닐 알코올들, 폴리비닐 에테르들, 폴리비닐 에스테르들 폴리비닐 할라이드들, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글리콜라이드들, 폴리실록산들, 폴리우레탄들 및 그의 공중합체들, 알킬 셀룰로우스, 하이드록시알킬 셀룰로우스들, 셀룰로우스 에테르들, 셀룰로우스 에스테르들, 니트로 셀루로스들, 아크릴 및 메타아크릴 에스테르들의 중합체들, 메틸 셀룰로우스, 에틸 셀룰로우스, 하이드록시프로필 셀룰로우스, 하이드록시-프로필 메틸 셀룰로우스, 하이드록시부틸 메틸 셀룰로우스, 셀룰로우스 아세테이트, 셀룰로우스 프로피오네이트, 셀루로스 아세테이트 부틸레이트, 셀룰로우스 아세테이트 프탈레이트, 카복시에틸 셀룰로우스, 셀룰로우스 트리아세테이트, 셀룰로우스 설페이트 소듐 염, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸메타크릴레이트), 폴리(부틸메타크릴레이트), 폴리(이소부틸메타크릴레이트), 폴리(헥실메타크릴레이트), 폴리(이소데실메타크릴레이트), 폴리(로릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐 메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(비닐 알코올), 폴리 (비닐 아세테이트), 폴리 비닐 클로라이드 폴리스티렌, 폴리비닐피롤리돈, 하이알루론산, 및 콘드로이틴 설페이트:를 포함한다. 한 가지 구현예에서, 서방성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)/폴리(락트-공-글리콜산) (poly(lactic-co-glycolic acid)) (PLGA) 블록 공중합체와 같은 블록 공중합체이다.

비-생분해성 중합체들의 예들로는 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리(메트)아크릴산, 폴리아마이드들, 공중합체들 및 그들의 혼합물들을 포함한다.

생분해성 중합체들의 예들로는 합성 중합체들, 예를 들어 베타-글루칸 입자들, 락트산 및 글리콜산의 중합체들, 폴리안하이드라이드들, 폴리(오소)에스테르들, 폴리우레탄들, 폴리(부트산), 폴리(발레르산), 폴리(카프로락톤), 폴리(하이드록시부틸레이트), 폴리(락타이드-공-글리콜라이드) 및 폴리(락타이드-공-카프로락톤), 또한 알지네이트 및 덱스트란과 셀룰로우스를 포함하는 기타 다른 폴리사카라이드들, 콜라겐, 그들의 화학적 유도체들 (치환들, 화학적 그룹들, 예를 들어 알킬, 알킬렌의 첨가들, 수산화들, 산화들, 및 당업자에 의해 일상적으로 만들어지는 다른 변형들), 알부민 및 기타 다른 친수성 단백질들, 제인 (zein) 및 다른 프롤라민들 및 소수성 단백질들, 공중합체들 및 그들의 혼합물과 같은 자연적인 중합체들을 포함한다. 일반적으로, 이들 물질들은 효소적 가수분해 또는 시험관내에서 물에 노출에 의해, 표면 또는 대량 마모 (bulk erosion)에 의해 분해된다. 상기 물질들은 물리적 혼합물들 (mixtures) (배합물들 (blends))로서 또는 공중합체들로서 단독으로 사용될 수 있다. 바람직한 중합체들은 폴리에스테르들, 폴리안하이드라이드들, 폴리스티렌들 및 그들의 배합물들이다.

본 명세서에서 기술된 조성물들의 유효량들은 이러한 치료의 필요가 있는 개체에게 투여된다. 유효량들은 병폐, 질환 또는 장애, 또는 병폐, 질환 또는 장애의 증상들에서 원하는 개선을 유도할 이들의 양들이다.

유효 용량들은 투여의 방식에 의존하여 1 ng/kg로부터 100 mg/kg 체중까지, 또는 100 ng/kg으로부터 50 mg/kg 체중까지, 또는 1 μg/kg으로부터 10 mg/kg 체중까지의 범위이다. 대안으로, 유효 용량들은 세포들의 4 제곱 센티미터 당 3 마이크로그램으로부터 14 밀리그램까지의 범위일 수 있다. 절대량은 다양한 요인들 (투여가 다른 치료 방법들과 조합되는지 여부, 용량들의 숫자 또한 연령, 신체적 조건, 키 및 체중을 포함하는 개인 환자의 변수들을 포함함)에 의존할 것이고 통상적인 실험법으로 결정될 수 있다. 가능한 유용한 용량의 하나는 건전한 의학적 판정에 따른 가장 높은 안전한 용량이다.

다양한 활성을 가진 제제들의 전달 간의 시간은 동력학, 전달, 방출, 제제의 약물역학, 제제의 약물동력학, 또는 그들의 조합이라면 모두에 의해 합리적으로 정의될 수 있다. 대안으로, 다양한 제제들의 전달 간의 시간은 최대의 효과가 달성될 수 있을 때 정의되는 실험들에 의해 경험적으로 정의될 수 있다.

투여의 방식

투여의 방식은 경구적 투여, 설하적 투여, 비강내 투여, 기관내 투여, 흡입, 안구적 투여, 국소적 투여, 경피적 투여, 피내 투여, 직장 투여, 질내 투여, 피하적 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 흉골내 투여, 또는 경점막 투여를 포함하는 의학적으로 허용가능한 방식이라면 모두일 수 있다. 또한, 투여의 방식들은 체외 기기 및/또는 조직-침투 전자기 기기에 의할 수 있다.

선택된 특정한 방식은 선택된 활성을 가진 제제들, 원하는 결과들, 치료되는 특정한 병폐 및 치료적 효능에 필요한 용량에 의존할 것이다. 본 명세서에서 기술된 방법들은, 일반적으로 말하면 의학적으로 허용가능한 투여의 방식이라면 모두, 예를 들어 임상적으로 허용가능하지 않는 부작용들 없이도 염증성 반응 변경의 유효한 수준들을 생산하는 방식이라면 모두를 사용하여 실행될 수 있다.

조성물들은 장애 및 투여의 방식에 의존하여 서로 다른 용기들, 운반체들 또는 제형물들로 제공될 수 있다. 예를 들어, 경구적 적용을 위해 조성물들은 설하적 정제들, 검들, 구강 세척제들, 치약들, 캔디, 젤들, 필름들 등으로서; 안구적 적용을 위해 눈 점적기들에 넣은 점안액들, 눈 연고들, 눈 젤들, 눈 팩들로서, 콘택트 렌즈 또는 안구내 렌즈 상의 코팅으로서, 콘택트 렌즈 저장 또는 세척 용액들 등에서; 국소적 적용을 위해, 로션들, 연고들, 크림들, 스프레이들, 조직들, 면봉들, 와이퍼들 등으로서; 질내 또는 직장 적용을 위해, 연고, 탐폰, 좌약, 점막부착 제형물 등으로서 투여될 수 있다.

조성물들은 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 흉골내 경로들을 통하여, 주사에 의해, 예로 일시 주사 또는 연속적 주입에 의해 투여될 수 있다. 주사를 위한 제형물들은 단위 용량 형태로, 예로 앰풀 또는 복수-용량 용기들로 첨가된 보존제와 함께 제공될 수 있다. 조성물들은 유성 또는 수성의 운반체들에 넣은 현탁액들, 용액들 또는 에멀전들과 같은 이러한 형태들을 취할 수 있고, 현탁, 안정화 및/또는 분산 제제들과 같은 제형화 제제들를 포함할 수 있다. 경구적 투여를 위해, 조성물들은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있는 약제학적으로 허용가능한 담체들과 조성물들을 바로 조합하여, 예로 설하적 정제, 액체 제형물, 또는 경구적 젤로서 제형화될 수 있다.

흡입에 의한 투여를 위해, 조성물들은 적합한 추진제, 예로 디클로로디플루오로메탄, 디클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 기체의 사용으로 압축된 포장들 또는 분무기로부터 나오는 에어로졸 스프레이 제공의 형태로 편리하게 운반될 수 있다. 압축된 에어로졸의 경우 용량 단위는 계량된 양을 운반하는 밸브를 제공하여 결정될 수 있다. 흡입기 (inhaler) 또는 취분기 (insufflator)에서의 사용을 위한 예로 젤라틴의 캡슐들 및 카트리지들은 조성물들의 파우더 믹스 및 락토스 또는 전분과 같은 적합한 파우더 베이스를 포함하도록 제형화될 수 있다. 치료제들의 흡입을 위한 의학적 기기들은 당해 기술분야에 알려져 있다. 일정 구현예들에서, 의학적 기기들은 흡입기이다. 다른 구현예들에서, 의학적 기기는 계량된 용량 흡입기 (metered dose inhaler), 디스크할러 (diskhaler), 터르부할러 (Turbuhaler), 디스쿠스 (diskus) 또는 스페이서 (spacer)이다. 소정의 이들 구현예들에서, 흡입기는 스핀할러 (Spinhaler) (Rhone-Poulenc Rorer, West Malling, Kent)이다. 기타 다른 의학적 기기들이 당해 기술분야에 알려져 있고 인할/파이저 (Inhale/Pfizer), 만카인드/글락소 (Mannkind/Glaxo) 및 어드밴스 인할레이션 리서치/알컴 (Advanced Inhalation Research/Alkermes)를 포함한다.

또한 조성물들은 좌약들 또는 보유 에네마들 (retention enemas)와 같은, 예로 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드들과 같은 통상적인 베이스들을 포함하는 직장 또는 질내 조성물들로 제형화될 수 있다.

항체들의 생산

대표적인 IL-17 사이토카인 길항제들은 항체들, 예로 IL-17RA, IL-17RB, IL-17RC, IL-17RD, 또는 IL-17RE와 같은 IL-17 사이토카인 수용체와 결합하는 항체들 또는 IL-17 사이토카인, 예로 IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, 또는 IL-17F와 결합하는 항체들이다. 본 명세서에서 사용되는 바, "항체 (antibody)"는 적어도 하나의 면역글로불린 가변 부위를 포함하는 단백질을 말한다. 예를 들어, 항체는 중쇄 가변 부위 (VH), 및 경쇄 가변 부위 (VL)를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 항체는 두 개의 VH 부위들 및 두 개의 VL 부위들을 포함한다. 용어 "항체"는 항체들의 항원-결합 단편들 (예로, 단일 사슬 항체들, Fab 단편들, F(ab')₂ 단편들, Fd 단편들, Fv 단편들, 및 dAb 단편들)뿐만 아니라 완전한 항체들, 예로 IgA, IgG, IgE, IgD, IgM 유형들 (뿐만 아니라 아형들 및 그들의 변형된 버전들)의 본래의 면역글로불린들을 포괄한다. 보다 다른 항체들은 단일 면역글로불린 가변 도메인만을 포함한다. 예로, Janssens et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103(41):15130-5 (2006)를 참조.

각 VH 및 VL은 전형적으로 다음의 순서로 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 배열된, 3가지의 "상보성 결정 부위들 (complementarity determining regions)" ("CDR") 및 4가지의 "구조틀 부위들 (framework regions)" (FR)로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. FRs 및 CDRs의 범위 (extent)는 명확하게 정의되어 왔다 (Kabat, E.A., et al . (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 5판, 미국보건부 (U.S. Department of Health and Human Services), NIH 출판물 번호 제 91-3242호; and Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917를 참조). 카밧 정의들이 본 명세서에서 사용된다. 면역글로불린 가변 부위의 과다가변 루프들의 규정적인 (canonical) 구조들은 Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798); and Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14(18):4628-38에 기술된 바와 같이 그의 서열로부터 추론될 수 있다.

대표적인 항체는 예로 10⁶ M 이상, 바람직하게는 10⁷ M 이상, 더욱 바람직하게는 10⁸ M 이상, 가장 바람직하게는 10⁹ M 이상의 결합 친화도로 IL-17 사이토카인 또는 IL-17 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합한다. 항체의 결합 친화도는 당해 기술분야의 보통의 방법 하나에 의해, 예를 들어 스캐차드 분석 (Scatchard analysis)에 의해 바로 결정될 수 있다. 또한 대표적인 항체는 100 nM, 20 nM, 또는 5 nM 이하의 EC50을 가질 수 있다. 좀 더 나아가, 대표적인 항체는 IL-17 사이토카인 또는 IL-17 사이토카인 수용체의 결합, 예로 IL-17A의 IL-17RA 또는 IL-17RC에 결합, 또는 IL-17F의 IL-17RA 또는 IL-17RC과의 결합을 방해할 수 있다.

특이적 항체는 예를 들어 다른 세포성 폴리펩타이드들이 아닌 원하는 폴리펩타이드(들)을 검출하는 경우라면 표준 웨스턴 블럿 분석법을 사용하여 미관련된 폴리펩타이드 분자들과는 유의하게 교차-반응하지 않는다. 일정 구현예들에서, 항체는 다른 것들과 대비하여 하나의 IL-17 사이토카인 또는 하나의 IL-17 수용체에 특이적이고, 예로 항체는 선호하기로는 적어도 10, 100, 또는 1000의 팩터로 하나의 특정한 IL-17 사이토카인 또는 수용체와 결합한다.

한 가지 구현예에서, 항체는 IL-17RA, 예로 IL-17RA의 D1 또는 D2 도메인과 결합한다. 예를 들어, 항체는 IL-17RA (서열번호 14)의 22-36번 아미노산들, 83-96번 아미노산들, 118-147번 아미노산들, 152-179번 아미노산들, 또는 256-271번 아미노산들 내의 하나 이상의 아미노산들, 예로 서열번호 14의 25번 Thr - 31번 Trp, 86번 Leu - 93번 Arg, 또는 259번 Cys - 265번 Arg 내의 하나 이상의 아미노산들, 예로 적어도 2 또는 3개의 아미노산들을 포함하는 에피토프와 결합한다. 예를 들어, 항체는 IL-17RA 및 IL-17 사이토카인, 예로 IL-17A 또는 IL-17F 사이의 결합을, 예로 적어도 100, 200, 500, 1000, 또는 5000배로 감소시킨다.

또 다른 구현예에서, 항체는 IL-17RB, IL-17RB (서열번호 15)의 25-39번 아미노산들, 86-100번 아미노산들, 126-155번 아미노산들, 160-187번 아미노산들, 또는 254-269번 아미노산들 및/또는 서열번호 15의 32-44번 (예로, 38-44번), 82-98번 (예로, 88-98번), 및 252-269번 (예로, 256-263번) 아미노산들 내의 하나 이상의 아미노산들을 포함하는 에피토프에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 IL-17RC, 예로 IL-17RC (서열번호 15)의 15-30번 아미노산들, 70-84번 아미노산들, 96-124번 아미노산들, 129-156번 아미노산들, 또는 227-237번 아미노산들 및/또는 서열번호 16의 24-35번, 78-91번, 및 248-257번 아미노산들 내의 하나 이상의 아미노산들을 포함하는 에피토프와 결합한다.

폴리펩타이드에 대한 폴리클론 항체들은 기지의 방법들을 사용하여 제조될 수 있다. Green et al ., "Production of Polyclonal Antisera," in Immunochemical Protocols (Manson, ed.) (Humana Press 1992)을 참조. 모노클론 항체들은 생성될 수 있다. 특이적 항원들에 대한 설치동물의 모노클론 항체들이 당업자가 숙지하고 있는 방법들에 의해 획득될 수 있다 (예를 들어, Kohler et al ., Nature 256:495 (1975); Coligan et al . (eds.), Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons 1991); Picksley et al ., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 제 2판, Glover et al. (eds.) (Oxford University Press 1995))를 참조.

예를 들어, 모노클론 항체들은 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 마우스에 주사하고, 혈청 시료를 얻어 항체 생산의 존재를 확인하고, 비장을 제거하고 B-림프구들을 획득하고, B-림프구들을 골수세포들과 융합하여 하이브리도마들을 생산하고, 하이브리도마들을 클로닝하고, 항원에 대한 항체들을 생산하는 양성 클론들을 선별하고, 항원에 대한 항체들을 생산하는 클론들을 배양하고, 또한 항체들을 하이브리도마 배양액으로부터 분리하여 획득될 수 있다.

폴리펩타이드에 대한 인간 항체들도 역시 유래될 수 있다. 인간 모노클론 항체들은 항원 접종에 반응하여 특이적 인간 항체들을 생산하도록 조작되었던 트랜스유전자 (transgenic) 마우스로부터 획득된다. 본 기법에서, 인간 중쇄 및 경쇄 좌위의 요소들이 내인성 중쇄 및 경쇄 좌위들의 표적된 파괴들을 포함하는 배아 줄기 세포주들로부터 유래한 마우스 균주들 내에 도입된다. 트랜스유전자 마우스는 인간 항원들에 특이적인 인간 항체들을 합성할 수 있고, 마우스는 인간 항체-분비하는 하이브리도마들을 생산하는 데 사용될 수 있다. 트랜스유전자 마우스로부터 나온 인간 항체들을 획득하는 방법들은, 예를 들어 Green et al., Nature Genet . 7:13 (1994), Lonberg et al ., Nature 368:856 (1994), 및 Taylor et al ., Int . Immun. 6:579 (1994)에 의해 기술되어 있다.

모노클론 항체들은 다양한 잘-확립된 기법들에 의해 하이브리도마 배양액들로부터 분리되고 정제될 수 있다. 이러한 분리 기법들은 프로테인-A 세파로스 (Protein-A Sepharose)를 사용하는 친화 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 및 이온-교환 크로마토그래피를 포함한다 (예를 들어, Coligan; Baines et al ., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Molecular Biology, (The Humana Press, Inc. 1992)를 참조).

항체는 "인간화 (humanized)" 모노클론 항체일 수 있다. 인간화 모노클론 항체들은 마우스 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 사슬들로부터 나온 마우스 상보성 결정 부위들을 인간 가변 도메인에 전달하여 생산된다. 다음으로 인간 항체들의 전형적인 잔기들이 마우스 상대방들의 구조틀 부위들에 치환된다. 인간화 모노클론 항체들로부터 유래한 항체 성분들의 사용은 마우스 불변 부위들의 면역원성과 연관된 잠재적인 문제점들을 방지한다. 마우스 면역글로불린 가변 도메인들을 클로닝하는 일반적인 기법들은, 예를 들어 Orlandi et al ., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 86:3833 (1989)에 의해 기술되고 있다. 인간화 모노클론 항체들을 생산하는 기법들은, 예를 들어 Jones et al ., Nature 321:522 (1986); Carter et al ., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 89:4285 (1992); Sandhu, Crit . Rev . Biotech. 12:437 (1992); Singer et al ., J. Immun. 150:2844 (1993); Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995); Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies," in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al . (eds.) (John Wiley & Sons, Inc. 1996); 또한 Queen et al ., 미국 특허 제 US 5,693,762호에 의해 기술되어 있다.

당업자가 숙지하고 있는 다양한 검정법들은 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체들을 검출하는 데 사용될 수 있다. 대표적인 검정법들은 항체들: 실험실 매뉴얼 (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)에서 자세하게 기술되고 있다. 이러한 검정법들의 대표적인 예들로는 방사성면역검정법들 (radioimmunoassays), 방사성면역침전법들 (radioimmunoprecipitations), 효소-결합 면역흡착 검정법들 (enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA), 점 블럿 (dot blot) 또는 웨스턴 블럿 검정법들, 저해 또는 경쟁 검정법들, 샌드위치 검정법들 및 표면 플라스몬 공명법 (surface plasmon resonance):을 포함한다.

Fc 및 다른 융합 단백질들

본 명세서에서 기재된 단백질, 예로 IL-17R 결합 단백질은 면역글로불린의 불변 도메인 또는 면역글로불린의 Fc 부위와 같은 이종유래 도메인, 혈청 알부민, 또는 혈청 알부민 결합 도메인과 연관될 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 IL-17 폴리펩타이드 서열 및 Fc 부위의 하나 이상의 불변 도메인들은 동일한 폴리펩타이드 사슬의 성분들일 수 있고 또한 예를 들어 링커에 의해 결합될 수 있다. 대표적인 Fc 부위는 인간 IgG, 예로 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 나온다. 이종유래 폴리펩타이드는 면역글로불린의 CH2 도메인, CH3 도메인, 및/또는 힌지 부위 (hinge region)의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 이종유래 폴리펩타이드는 링커, 예로 유연성 링커에 의해 연결될 수 있다.

또한 Fc 부위의 단편들은 Fc 뮤테인들 (muteins)이 사용되는 것과 같이 사용될 수 있다. 예를 들어, Fc 부위의 힌지 부위 내의 소정의 잔기들은 FcγRI에 고친화도 결합을 위해 결정적이다. Canfield and Morrison (1991) J. Exp . Med. 173:1483)은 234번 Leu 및 235번 Leu이 U937 세포들에 존재하는 FcγRI에 대한 IgG₃의 고친화도 결합에 결정적이라는 점을 보고하였다. 유사한 결과들이 Lund et al . (1991) J. Immunol . 147:2657에 의해서도 획득되었다. 이러한 돌연변이들은 단독으로 또는 조합으로 FcR에 대한 IgG1의 친화도를 감소하도록 IgG1 Fc 부위에서 만들어질 수 있다. Fc 결합, 항체-의존성 세포 매개성 세포독성 (antibody-dependent cell mediated cytotoxicity, ADCC) 및 보체 의존성 세포독성 (complement dependent cytotoxicity, CDC)에 영향을 주는 기타 다른 Fc 뮤테인들이 Shields et al . (2001) J. Biol. Chem. 276(9):6591 또한 미국 특허 제 US 2004/0132101호에 기술되어 있다.

추가적인 용도들

본 명세서에서 기술된 결합 단백질 (예로, IL-17R 결합 단백질 또는 본 명세서에서 기술된 항체)는 표지가 되거나 신호를 생산하는 소부분, 예로 효소, 방사성표지, 에피토프, 형광 단백질 (녹색 형광 단백질과 같음)으로 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 결합 단백질은 수용체가 시료에 또는 세포 위에 존재하는지 결정하도록, 예로 표준 면역블럿팅, 면역형광, 효소 면역검정법 (EIA), 형광 에너지 전달, 웨스턴 블럿, 또한 기타 다른 진단적 및 검출 기법들을 사용하여 시료에 또는 세포들에 접촉될 수 있다.

또한 결합 단백질은 생체내 검출을 위해 표지되고 개체에게 투여될 수 있다. 개체는 NMR 또는 기타 다른 단층촬영 수단들에 의해 영상화될 수 있다. 예를 들어, 결합제는 131I, 111In, 123I, 99mTc, 32P, 125I, 3H, 14C, 및 188Rh와 같은 방사성 표지, 플루오레신 및 로다민과 같은 형광성 표지들, 핵자기 공명 활성을 가진 표지들, 양전자 방출 단층촬영술 ("PET") 스캐너에 의해 검출가능한 양전자 방출 방사성 동위원소들, 루시페린과 같은 화학발광제들 (chemiluminescers), 또한 퍼옥시다제 또는 포스파타제와 같은 효소적 마커들로 표지될 수 있다. 결합 단백질은 상자성 제제들 및 철자성 또는 초자성 제제들과 같은 조영제로 (일차적으로 T2 반응을 변경시킴) 표지될 수 있다.

또한 결합 단백질은 이것이 결합하는 수용체를 발현하는 세포들을 정제하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 결합 단백질은 고정된 지지체 (예로, 자성 비드들 또는 컬럼 매트릭스)에 결합되고 수용체를 발현할 수 있는 세포들에 접촉될 수 있다. 지지체는 예로 생리학적 완충용액으로 세척될 수 있고 세포들은 지지체로부터 회수될 수 있다.

또한 결합 단백질은 이것이 결합하는 수용체의 수용성 형태들을 정제하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 수용성 수용체를 포함하는 시료들은 고정된 결합 단백질에 접촉될 수 있고 다음으로, 예로 세척한 이후에 고정된 결합 단백질로부터 회수될 수 있다.

또한 IL-17 수용체와 결합하는 결합 단백질은 IL-17 수용체를 발현하는 세포에 독소 또는 세포독성 효과를 전달하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 결합 단백질은 독소와 (예로, 공유적으로) 연관될 수 있거나 세포독소, 치료제 또는 방사성 금속 이온과 같은 치료적 소부분에 결합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성 제제로는 또 다른 단백질, 예로 아브린 (abrin), 리신 A, 슈도모나스 내독소, 또는 디프테리아 독소와 같은 독소, 또는 ADCC 또는 보체 매개성 세포독성 반응을 채용할 능력을 가진 Fc 도메인을 포함하는, 세포들에게 해로운 제제라면 모두를 포함한다. 결합 단백질과 연관될 수 있는 기타 다른 독소들로는 택솔 (taxol), 사이토찰라신 B (cytochalasin B), 그라미시딘 D (gramicidin D), 에티디움 브로마이드 (ethidium bromide), 에메틴 (emetine), 미토마이신 (mitomycin), 엑토포사이드 (etoposide), 테노포사이드 (tenoposide), 빈크리스딘 (vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine), 콜히친 (colchicin), 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 디하이드록시 안트라신 디온 (dihydroxy anthracin dione), 미토크산트론 (mitoxantrone), 미스라마이신 (mithramycin), 악티노마이신 D (actinomycin D), 1-디하이드로테스토스테론 (1-dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드들 (glucocorticoids), 프로케인 (procaine), 테트라케인 (tetracaine), 리도케인 (lidocaine), 프로프라놀올 (propranolol), 및 퓨로마이신 (puromycin) 또한 그들의 유사체들 또는 상동체들을 포함한다. 치료적 제제들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 항대사물들 (예로, 메토트렉세이트 (methotrexate), 6-머캅토퓨린 (6-mercaptopurine), 6-티오구아닌 (6-thioguanine), 사이타라빈 (cytarabine), 5-플루오로우라실 데카바진 (5-fluorouracil decarbazine), 알킬화 제제들 (예로, 메클로르에타민 (mechlorethamine), 티오에파 (thioepa) 클로르암부실 (chlorambucil), 멜팔란 (melphalan), 카무스틴 및 로무스틴 (carmustine and lomustine), 사이클로토스파마이드 (cyclothosphamide), 부설판 (busulfan), 디브로모만니톨 (dibromomannitol), 스트렙토조토신 (streptozotocin), 미토마이신 C (mitomycin C), 및 백금 (Ⅱ) 시스-디클로로디아민 (DDP) 시스플라틴 (cis-dichlorodiamine platinum (II) (DDP) cisplatin), 안트라사이클린들 (anthracyclines) (예로, 다우노루비신 (이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제들 (예로, 닥티노마이신, 블레오마이신, 미스라마이신, 및 안트라마이신), 또한 항-분열 제제들 (anti-mitotic agents) 예로, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함한다.

예를 들어, 결합 단백질은 α, β, 또는 γ-방출자와 같은 방사성 동위원소와 결합될 수 있다. 방사성 동위원소들의 예들로는 요오드 (¹³¹I 또는 ¹²⁵I), 이트륨 (⁹⁰Y), 루테튬 (¹⁷⁷Lu), 악티늄 (²²⁵Ac), 프라세오디뮴, 또는 비스무스 (²¹²Bi 또는 ²¹³Bi)를 포함한다. 결합 단백질은 생물학적 단백질, 식물 또는 박테리아 기원의 분자 (또는 그의 유도체), 예로 메이탄시노이드 (maytansinoid) (예로, 메이탄시놀 (maytansinol), 그의 유사체 또는 DM1), 뿐만 아니라 택산 (taxane) (예로, 택솔 또는 택소테르 (taxotere)), 또는 칼리캐미신 (calicheamicin)과 결합될 수 있다. 메이탄시놀 유사체들의 예들로는 변형된 방향족 고리를 가지는 것들 (예로, C-19-데클로로, C-20-데메톡시, C-20-아실옥시) 및 다른 위치들에서 변형들을 가지는 것들 (예로, C-9-CH, C-14-알콕시메틸, C-14-하이드록시메틸 또는 아셀옥시메틸, C-15-하이드록시/아실옥시, C-15-메톡시, C-18-N-데메틸, 4,5-데옥시)를 포함한다. 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체들은, 예를 들어 미국 특허 제 US 6,333,410호에 기술되고 있다. 메이탄시놀은, 예로 N-숙시니미딜 3-(2-피리미딜디티오)프로피오네이트 (N-숙시니미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트 또는 SPP라고도 알려져 있음), 4-숙시니미딜-옥시카보닐-α-(2-피리미딜디티오)-톨루엔 (SMPT), N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티오)부틸레이트 (SDPB), 2-이미노티올란, 또는 S-아세틸숙신 안하이드라이드를 사용하여 결합될 수 있다.

본 명세서에서 언급되는 특허 문서들 및 과학 논문들 각각의 기재내용 전부, 및 이들에 의해 인용되는 이들 특허 문서들 및 과학적 논문들은 모든 목적으로 본 명세서에서 참고문헌에 의해 명백하게 통합되어 있다.

도 1은 IL-17RA 내지 IL-17F 복합체 구조의 모식적 도시를 나타낸 것이다. IL-17F (사슬 A 및 사슬 B), N-연결된 글리칸들에 결합된 IL-17RA의 리본 도면을 볼-및-막대 (ball-and-stick) 표현으로 나타낸다. IL-17RA는 짧은 나선형 링커 (helical linker)에 의해 연결된 두 개의 제 Ⅲ형 피브로넥틴 도메인들 (D1 및 D2)로 구성된다. 오른쪽 패널은 y-축 주변으로 60°회전된 복합체를 나타낸다.
도 2는 IL-17RA와의 IL-17F 결합이 세 가지의 구별된 경계면들 (interfaces)에 의해 매개되는 것을 보여주는 모식적 도시를 나타낸 것이다. (A) 부위 2, N-말단 코일 부위 및 IL-17F 사슬 B의 가닥들 1과 2 사이에 IL- 17RA D1 C-C' 루프 삽입자들 (inserts). N-말단 코일은 미결합 및 결합 입체형태들 (conformations) 간의 입체형태적 변화를 겪는다. (B) 부위 2, 구멍들-내-융기 (knob-in-holes) IL-17F 결합 포켓 상보성 (binding pocket complementarity)의 표면 표현. (C) 부위 3, IL-17RA D1 N-말단 결합 부위. (D) 부위 3, IL-17RA D2 결합 부위. 접촉 잔기들은 막대 모델들로서 나타낸다. 점선은 수소 결합 및 염-연결다리를 표현한다.
도 3은 헤테로이중체 IL-17 신호전달 복합체의 조립 및 모델을 나타낸 것이다. (A) IL-17 수용체-사이토카인 친화도가 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance, SPR)에 의해 측정되었다. IL-17RA, IL-17RB 및 IL-17RC은 SPR 칩 표면상에 고정되었고 IL-17A, IL-17F 또는 IL-17E의 결합 친화도가 측정되었다. 다음으로 표시된 곳에서, 미리-조립된 수용체-사이토카인 복합체와 칩 상에서 결합하는 두 번째 수용체의 친화도가 측정되었다. 동력학적 실험들의 경우 (첨단의 3개 열들), 대표적인 SPR 센서도들 (sensorgrams)은 채색된 선들로서 또한 맞춤 곡선 (curve-fit)은 검은색 선으로 나타낸다. 초(들) 단위 시간은 반응에 대해 좌표로 표시된다 (RU, 공명 단위). 주입된 농도들은 감지도들의 오른쪽에 표시된다. 평형 실험들의 경우 (네 번째 열), 주입된 농도 (M)는 대표적인 실험의 최대의 반응 (RU)에 대해 좌표로 표시된다; 맞춤 곡선은 검은색 선으로 나타내고 해리 상수 (Kd)는 수직선으로서 표시된다. Kd는 적어도 두 번의 독립적 실험들의 평균 ± 평균의 표준 오차로서 보고된다. (B) 헤테로이중의 신호전달 복합체 형성의 모델. 두 번째 수용체 (마젠타)는 둘 다의 수용체들이 동일한 방향으로 IL-17F와 결합하는 것을 가정하여 모델화되었다. 수용체들의 C-말단 도메인들 (D2)은 박스 모양으로 강조된 바와 같이 매우 인접하게 된다.
도 4는 결합 경계면 및 보존된 IL-17 잔기들을 보여주는 모식적 도시를 나타낸 것이다. 노란색으로 채색된 리본 형식의 IL-17A를 가진 흰색의 IL-17F의 표면 표현. (A) 녹색으로 강조된 IL-17RA-IL-17F 접촉 잔기들. (B) IL-17A 및 IL-17F 중에서 보존된 잔기들은 IL-17F 구조 위에 지도작성되어 있고; 일치하는 잔기들은 점묘되고 보존된 치환들은 밝은 분홍색이다. (C) 4, 5 또는 6가지의 IL-17 사이토카인 패밀리 구성원들 중에서 일치하는 잔기들은 표시되고 모두 6가지의 사이토카인들을 통하여 보존된 치환들도 역시 확인되어 있다. (D) 인간 IL-17 사이토카인들의 정렬. IL-17RA-IL-17F 구조에서 접촉들을 형성하는 잔기들은 IL-17F 서열 위에 또한 정렬 아래에 검은색 박스로 강조된다. 4, 5 또는 6가지의 사이토카인들에서 일치하는 잔기들은 점묘되어 있고; 모두 6가지의 사이토카인들에서 일치하는 것들도 역시 "*"로 표시되고; 보존된 그룹들은 ';"로 표시된다. 서열들은 각각 서열번호 12, 2, 6, 8, 10, 및 4에 해당한다.
도 5는 호모이중의 시스테인-매듭 성장인자 수용체 복합체들과 대비하여 IL-17RA-IL-17F 수용체 복합체의 비교를 나타낸 것이다. (A) IL-17RA-IL-17F, (B) P75NTR-NGF 및 (C) TrkA-NGF가 리본 모델들로서 나타나 있다.

실시예 1: IL -17 RA - IL -17F 복합체 발현 및 결정화

우리는 IL-17F와 결합된 IL-17RA의 결정 구조를 3.3 Å 해상도에서 변칙 분산 (anomalous scattering, SIRAS) 상결정 (phasing)으로 단일 동형의 치환 (single isomorphous replacement)을 사용하여 결정하였다 (표 1). 우리는 배큘로바이러스로부터 IL-17F를, 또한 293 GnTI-세포들을 사용하여 IL-17RA 세포외 도메인 (ECD)을 발현하였다. 결정화를 용이하게 하기 위하여, 복합체는 메틸화되었고, 중쇄 당화된 수용체 ECD는 균질도를 개선하도록 결정화 이전에 엔도글리코시다제 H (endoglycosidase H)로 "처리 (shaved)"되었고, Asn-연결 당화 부위들 각각에 하나의 GlcNAc 잔기를 남기었다. 생화학적으로 처리되거나 미처리된 복합체들은 일치하게 행동하였다. 젤 여과에 의하여, IL-17RA ECD 를 가진 IL-17F 또는 IL-17A의 혼합물들은 2 : 2 (2개 수용체들 + 1개 IL-17 이중체) 및 1 : 2 (1개 수용체 + 1개 IL-17 이중체) 화학량론으로 주요한 종은 1 : 2가 되도록 복합체의 공동-용출을 유도하였다. 2 : 2는 높은 단백질 농도들에서만 검출되었던 한편, 더 낮은 농도들에서는 1 : 2가 과다한 IL-17RA의 존재 시에도 우세하였다. 결정들은 하나의 IL-17F 호모이중체와 결합된 하나의 IL-17RA를 포함하였다 (도 1). 하기에 논의된 바와 같이, "부분적" 신호전달 복합체는 사실상 IL-17RA-IL-17F 및 IL-17RA-IL-17A 복합체들의 생물학적으로 적절한 형태일 수 있다.

실시예 2: IL -17 RA - IL -17F 복합체의 전반적인 구조

IL-17RA 엑토도메인 (ectodomain)은 18개-아미노산 링커에 의해 연결된 2개의 특별한 FnⅢ 도메인 모듈들로 구성된다 (도 1). 서열로부터 드러나지 않더라도, IL-17A 구조는 일렬의 β-샌드위치 도메인들을 포함하는 조혈 사이토카인 수용체들를 회상한다; 그러나, 도메인들 자체는 규정적인 FnⅢ 접힘들로부터 일정의 실질적인 편차들 (deviation)을 포함하고, 리간드 상호작용의 방식은 다른 사이토카인 수용체들과는 전적으로 다르다. 예측된 286개 엑토도메인 잔기들의 2-272번 잔기들 (여기에서 1번 잔기는 서열번호 14에서 나타난 바와 같이 성숙한 펩타이드의 첫 번째 아미노산임)은 수용체 사슬을 위한 연속적인 전자 밀도 내로 모델화되었고 감재적인 7개의 N-연결 글리칸들의 5개는 분명하게 영상화되었다. 첫 번째 FnⅢ (D1)은 독특한 접힘을 형성하는 추가적인 40개 아미노산 N-말단 연장을 가진다. 사슬은 디설파이드 결합 (12번 Cys - 19번 Cys)에 의해 연결된 헤어핀-유사 회전 (turn)을 만들고, 회전의 두 번째 가닥은 FnⅢ β-판상을 연장시키는 β-가닥 (A')을 형성하고 다음으로 FnⅢ 도메인의 A-가닥을 시작하도록 도메인을 통과하기 이전에 C' 가닥 95번 Cys로의 디설파이드 결합인, D1 도메인의 표면 주변을 둘러싼다. 도메인간 링커 부위는 짧은 나선을 포함하고 내부 디설파이드 결합 (154번 Cys - 165번 Cys)에 의해 안정화된다. 두 번째 FnⅢ 도메인 (D2)는 두 가의 비전형적인 디설파이드 결합들을 가지는데, 하나는 C-C'루프 (214번 Cys)를 D-F 루프 (245번 Cys)에 연결하고 두 번째는 F-G 루프 (259번 Cys - 263번 Cys) 내에 있다. 우리는 세 번째 디설파이드 결합이 F-G 루프 (246번 Cys) 및 G-가닥의 C-말단 (272번 Cys)사이 클래스-Ⅱ 사이토카인 수용체들에서 관찰된 것과 유사하게 존재하는 것을 예측하고는 있지만 (21), 본 결합은 현재의 전자 밀도 지도에서는 잘 정의되어 있지 않다.

IL17-F 분자들에 결합된 IL-17RA의 중심 구조는 IL-17F의 리간드 없는 형태의 것과 대비하여 본질적으로는 변화되지 않는 한편, 말초 가닥들 및 루프들은 IL-17RA과의 결합을 용이하게 하도록 구조적 적응을 겪고 있었다. 리간드가 없는 IL-17F 구조에서 관찰되는 입체형태는 수용체의 N-말단 코일 부위와 입체구조적 충돌을 생성할 수 있기 때문에, IL-17RA-결합된 상태에서 유지될 수 없었다. 각 IL-17F 단일체 (monomer)는 시스테인-융기 패밀리 단백질들과 동종유래의 방식으로 두 개의 디설파이드 결합들에 의해 연결된 두 번째 및 네 번째 가닥들을 가진 두 쌍의 항-평행 β-판상들 (1-4번 가닥들)로 구성되었다. 29-42번 잔기들이 두 번째 IL-17F 프로모터의 3 및 4번 가닥들에 평행하게 진행하는 50개 아미노산 N-말단 연장이 존재한다. 본 코일 부위는 인접한 가닥들과의 여러 가지 수소 결합들을 포함하는 수많은 상호작용들에 의해 안정화된다. IL-17RA-결합된 IL-17F 입체형태에서 본 부위 (33-42번 잔기들)은 이동하여 결합 포켓을 열고 수용체와 상호작용한다 (도 2A). 각 IL-17F 사슬의 첫 번째 24개 아미노산들, 및 IL-17F 프로모터 상의 3-4번 루프로부터 나온 105-109번 잔기들은 모델화될 수 없었다. 리간드가 없는 IL-17F 구조에서 17번 Cys는 인접한 IL-17F 사슬 상의 3-4번 루프의 첨단에서 107번 Cys와 디설파이드 결합을 형성하고 있다. 이들 사슬간 디설파이드 결합들은 모델화되지 않았지만, 단백질이 SDS-PAGE 상에서 디설파이드-연결된 이중체와 같이 행동하였기 때문에 존재하고 있었다.

실시예 3: IL -17 RA - IL -17F 결합 경계면

IL-17F의 IL-17RA에 대한 전반적인 결합 방식은 수용체 FnⅢ 도메인들 둘 다가 "측면-상 (side-on)" 방향으로 결합하고 리간드의 이중체 경계면에서 형성되는 틈 내로 삽입하도록 모서리 가닥들을 사용하여, 다른 사이토카인 또는 성장인자 수용체 복합체들과는 다르다. IL-17RA은 IL-17F와 연장된 결합 경계면을 형성하여 표면적의 ~ 2200Å이 묻히고; 본 묻힌 표면적의 ~70%는 IL-17RA D1 도메인에 의해 매개된다. 결합 경계면에는 세 개의 주요한 상호작용 부위들이 존재한다 (도 2). 부위 1은 IL-17RA의 N-말단 연장 (서열번호 14의 25번 Thr - 31번 Trp) 및 IL-17F 사슬 B의 3번 가닥 (100번 Val, 102번 Arg)의 C-말단 부위를 더한 1-2번 가닥 사이에 형성되고; 본 상호작용은 ~ 330Ų을 묻히게 한다 (도 2C). 수용체의 31번 Trp는 본 결합 부위의 중심에 묻히고; 중심-사슬 O는 102번 Arg와 수소 결합들을 형성하고 측 사슬은 60번 Pro와 수소 결합들을 형성한다. 두 개의 추가적인 수소 결합들이 IL-17RA 25번 Thr 및 26번 Cys26 또한 IL-17F 63번 Tyr 사이에 형성된다. 부위 2는 가장 현저한 복합체의 경계면이 특징이고, N-말단 연장이 사이에낀 깊은 결합-포켓 내에 들어있는 IL-17RA D1 C'-C 루프 (서열번호 14의 86번 Leu - 93번 Arg) 또한 IL-17F 사슬 B의 2번 가닥 및 IL-17F 사슬 A의 3번 가닥으로 구성되고; 본 상호작용은 거의 550Å (도 2A, 2B)를 묻히게 한다. 본 8개-아미노산 IL-17RA 루프는 IL-17RA 92번 Glu 및 IL-17F 사슬 B 37번 Arg 사이의 잠재적인 염 연결다리를 포함하는 IL-17F의 사슬들 둘 다와 강한 소수성 및 극성 상호작용들 또한 IL-17RA 89번 Asn의 중심-사슬 O 및 IL-17F 사슬 A 95번 Asn 사이에 수소 결합을 형성한다. 부위 3은 묻힌 표면적 (BSA)의 ~410 Ų을 포괄하고 IL-17RA D2 F-G 루프 (259번 Cys - 265번 Arg), IL-17F 사슬 A의 3번 및 4번 가닥들의 C-말단 부위들 및 IL-17F 사슬 B의 N-말단 연장 상에에 형성된다 (도 2D). 부위 3은 9개의 잠재적인 수소 결합들 및 IL-17RA 262번 Asp 및 IL-17F 사슬 B 47번 Arg 사이에 염 연결다리와 하전된 상호작용들이 풍부하다. 전반적인 경계면은 연장되고 수많은 특이적 접촉들로 구성된다. 유사한 결합 방식이 접촉 잔기들의 서열 보존을 제공하면서 다른 IL-17 수용체-사이토카인 쌍들에 의해 사용될 것이라고 보여진다 (하기에 논의됨). 그러나, 더 많은 결합-네트워크 및/또는 형태 상보성 (shape complementarity)이 더 고친화도 복합체들에서 적용될 수 있다.

실시예 4: 헤테로이중의 수용체 복합체 형성

수용체 복합체들의 화학량론들은 전적으로 밝혀져 있지만 (6), IL-17RA-IL-17F 복합체는 두 번째의 서로 다른 수용체와의 헤테로이중합 (heterodimerization)에 대한 선호도를 보여준다. 따라서 우리는 호모이중의 사이토카인이 두 가지의 서로 다른 수용체들을 가능하게 배위시킬 수 있는 기작을 조사하였다. IL-17RA 및 IL-17RC 둘 다는 IL-17A 및 IL-17F에 독립적으로 결합할 수 있지만 수용체들 둘 다가 신호전달에 필요하다 (9, 10, 22). 신호전달 복합체가 형성되는 과정을 좀 더 이해하기 위하여, 우리는 사이토카인에 대한 호모이중 및 헤테로이중의 수용체 복합체들 둘 다의 친화도들을 시험관내에서 측정하도록 수용성 단백질들을 사용하는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 전략을 고안하였다. 다른 연구자들이 IL-17A 및 IL- 17F 에 대한 IL-17RA 및 IL-17RC의 결합 친화도들을 보고하였던 반면 (7, 22), 우리는 이것이 두 번째 수용체-결합 부위의 결합 친화도를 평가하는 데 적절한 것이라고 고려하였다. 전략은 칩 상에 수용체들의 가능한 호모-이중합 (예로, 교차-연결)을 최소화하도록 낮은 결합 밀도에서 SRP 상에 하나의 수용체를 고정하는 것이다. 이중체의 IL-17 사이토카인은 다음으로 본 수용체에 의해 포획되고 각 수용체는 노출된 접근가능한 두 번째의 수용체-결합 부위를 남기면서 하나의 이중체의 IL-17 리간드에 결합될 것이다. 두 번째 수용체-결합 과정의 친화도를 측정하도록 두 번째 수용체는 연속적으로 미리 형성된 수용체-사이토카인 복합체들을 넘어 통과되었다. 본 방식에서, 복합체는 단계적 방식으로 조립되었고 각각의 결합 친화도들이 측정되었다 (도 3). IL-17A은 IL-17RA (2.8 ± 0.9 nM) 및 IL-17RC (1.2 ± 0.1 nM) 둘 다와 높은 친화도로 결합하였다. 일단 IL-17A가 하나의 IL-17RA 분자와 결합되면, 두 번째 IL-17RA에 대한 결합 친화도는 3.1 ± 0.5 μM로 감소되었던 한편 본 두 번째 결합 부위에 대한 IL-17RC 친화도는 174 ± 3 nM이 되었다. IL-17A가 원래 IL-17RC에 의해 포획된 경우라면, 두 번째 IL-17RA는 기존의 IL-17RC-IL-17A 복합체와 162 ± 29 nM의 친화도로 결합하였다. 두 번째 IL-17RC의 기존의 IL-17RC-IL-17A 복합체와의 결합 친화도는 단지 8.0 ± 0.5 μM이었다.

유사한 경향성이 IL-17F의 경우 관찰되었고, 이는 IL-17RA (292 ± 19 nM)과 대비하여 IL-17RC (4.4 ± 0.2 nM)에 대한 더 높은 친화도를 가진다. 다양한 (diverent) 친화도들이 주어지면 이것은 IL-17F가 처음으로 IL-17RC에 의해 포획될 것으로 여겨지고; 일단 결합되면 IL-17RC-IL-17F 복합체에 대한 IL-17A의 친화도는 23.8 ± 3 μM이 되었다. 대조적으로, 미리 형성된 IL-17RA-IL-17F 및 IL-17RC-IL-17F 복합체들에 대한 IL-17RA 및 IL-17RC의 결합 친화도는 각각 매우 약하여 이들 실험들에 사용되는 농도 범위에서는 정확하게 계산될 수 없었다. 따라서, 이들 연구들은 IL-17A 또는 IL-17F에 의한 IL-17RA 또는 IL-17RC의 결합이 다른 수용체와 결합하여 헤테로이중의 수용체 복합체를 형성하도록 두 번째 수용체-결합 부위에 선호도를 자극하는 것을 분명하게 보여준다.

IL-17RA는 IL-17RB와 함께 IL-17E (IL-25라고도 알려져 있음) 신호전달에 관여하여 왔다 (23). IL-25은 Th2 염증성 반응들을 촉진하고 IL-17A 및 IL-17F와 대략 ~ 20% 일치도를 공유한다. 결합 실험들은 IL-25가 높은 친화도로 IL-17RB와 결합하는 한편, IL-17RA에 대한 외관상의 친화도는 없다 (23-25). 우리는 IL-17RA가 일단 IL-25가 IL-17RB에 의해 포획되면 IL-25에 결합할 수 있는 것으로 가정하였다. 본 가정을 테스트하기 위하여, 우리는 IL-17RB를 SPR 칩 상에 고정하였고, IL-25를 포획하였고, IL-17RB-IL-25 복합체에 대한 IL-17RA의 친화도를 측정하였다. 우리의 가정을 후원하도록, IL-17RA는 IL-17RB-IL-25 복합체와 14.1 ± 2.4 μM 친화도로 결합하였다 (도 3). 50 μM까지의 농도에서, IL-17RA 및 IL-25 사이 또는 IL-17RB-IL-25 복합체 및 두 번째 IL-17RB 분자 사이에서는 상호작용이 전혀 관찰될 수 없었다. IL-17A 및 IL-17F 결합 데이타와 함께, 이들 결과들은 헤테로이중의 복합체가 알로스터리 (allostery) 및/또는 수용체들 간 상호작용에 의해 매개될 수 있는 것을 가르키고 있다.

본 개념을 좀 더 설명하기 위하여, 우리는 가설적인 2 : 2 수용체-사이토카인 복합체를 형성하도록 두 번째 IL-17RA 분자를 모델화하였다 (도 3B). 두 번째 수용체가 첫 번째와 일치하는 방식으로 결합하는 것을 가정하면, IL-17RA D2의 기초는 두 번째 IL-17RA의 D2와 매우 근접하게 될 것이다 (도 3B, 빗금친 박스). IL-17F와 결합된 두 개의 IL-17RA 분자들의 경우, 하나의 IL-17RA의 C-C' 루프 상의 212번 HIS는 두 번째 IL-17F, 212번 His와 충돌할 것이다. 본 잠재적인 상호작용 부위는 수용체들이 그들의 쌍 형성 (pairing)을 조절하도록 허용할 수 있다. 입체구조적 충돌들은 두 번째 일치하는 수용체에 대한 감소된 친화도를 유도할 수 있거나, 바람직한 수용체-수용체 상호작용들은 헤테로이중의 수용체 복합체들을 안정화시킬 수 있다. 우리는 호모이중의 수용체 복합체들이 소정의 조건들 하에서 세포들 상에서 형성될 수 있는 가능성을 배제하지 않지만, 우리의 데이타는 수용체 헤테로이중체들이 우세한 신호전달 종류가 될 것이라고 주장한다.

실시예 5: IL -17 RA 는 공통적인 수용체로서 기능한다

IL-17RA는 IL-17F보다 ~100배 더 높은 친화도로 IL-17A와 결합한다. IL-17A 및 IL-17F은 ~ 50% 일치도를 공유하고, 보존된 잔기들의 IL-17F 구조 상에 지도작성은 수용체-결합 포켓 주변에 가변 잔기들의 말발굽-모양의 고리를 드러낸다 (도 4). 대부분의 IL-17RA C'-C 루프 상호작용은 IL-17A 및 IL-17F 분자들 사이에 서로 다른 잔기들을 사용하여 형성되는 한편, N-말단 부위 및 IL-17RA D2 F-G 루프 상호작용들은 보존된 잔기들이 우세하게 관여한다. 우리는 본 명세서에서 IL-17RA의 세포외 부위도 역시 IL-17RB-IL-25 복합체와 결합할 수 있는 것을 보고하였고, 최근에는 IL-17RD가 IL-17A 신호전달을 매개하도록 IL-17RA와 상호작용할 수 있는 것을 보여주었다 (26). 다양한 IL-17 패밀리와 본 IL-17RA의 연관성이 주어지면서, 우리는 IL-17RA가 클래스 I 사이토카인 복합체들에서 사용되는 것들과 유사한 공유된 수용체로서 작용할 수 있는 점을 전망하고 있다 (27). 본 가능성을 조사하기 위하여, 우리는 IL-17F 표면 위의 모든 IL-17 패밀리 구성원들 중에서 보존된 잔기들을 지도작성하였다. IL-17RA-IL-17F 복합체에서 이들 잔기들의 위치를 분석하여, IL-17RA가 이들 보존된 잔기들을 D1 도메인의 N-말단 부위 및 D2 도메인의 F-G 루프와 접촉시키는 것이 가능성 있게 여겨진다 (도 4C). 대조적으로, IL-17RA는 비-보존된 사이토카인 잔기들을 C-C' 루프와 접촉시켜서 각 사이토카인에 대한 특이도를 조정할 수 있다 (도 4C). 포괄적으로, 다음 IL-17RA은 구별되는 접촉의 배경 중에서 보존된 접촉들의 소집합을 기초로 하는 여러 가지 서로 다른 IL-17 사이토카인들과 교차-반응성의 전략을 사용하는 것으로 여겨진다. 이것은 서로 다른 뉴로트로핀 (neurotrophin) 리간드들²⁸의 인식을 위한 공유된 p75 수용체에 의해 사용되는 전략과 유사하고, 예를 들어 gp130 및 g_c 사슬에 의한 교차-반응성에 사용되는 기작과는 대조적이고, 이것은 서로 다른 4개-나선형 사이토카인들과 매우 구별되는 분자적 상호작용을 형성하는 것이다 (27).

실시예 6: 시스테인-융기 성장인자들의 수용체 결합 방식들

신경성장인자 (NGF) (28-30), 혈관 내피성장인자 (VEGF) (31), 두 가지의 신경아교세포-유래성 뉴로트로핀 인자 (GDNF) 패밀리 구성원들 (32), 및 기타 인자들과 같은 시스테인-융기 성장인자 리간드 복합체들의 여러 가지 결정 구조들: 이들 구조들은 IL-17RA에 의해 매개되는 리간드 작용의 방식과의 교육적인 비교들로서 작용할 수 있다 (도 5). p75 뉴로트로핀 수용체와 결합된 NGF의 복합체 (p75NTR, 사망 수용체 패밀리 구성원)에서 (28, 30), 수용체는 IL-17RA과 구조적 유사성을 전혀 보유하지 않지만; IL-17RA와 같이, p75NTR은 리간드 이중체 경계면에서 오목한 굴곡 내에서 NGF와 결합한다 (도 5B). NGF와의 TrkA 복합체 (29, 33)에서, Trk에서 면역글로불린 (Ig)-도메인은 IL-17RA의 FnⅢ 도메인들과 구조적으로 관련되어 있고 리간드 결합에 사용된다. 그러나, TrkA의 Ig-도메인은 NGF β-판상들에 의해 형성되는 NGF의 "안장 (saddle)"에서 편평한 면 위의 말단을 결합시키고; 따라서 결합의 방식이 구별된다 (도 5C). 흥미롭게도, NGF-p75NTR 복합체는 호모이중의 p75 신호전달 복합체의 부분적 및 완전한 형태들을 각각 표현할 수 있는 1 : 2 및 2 : 2 복합체들 둘 다로서 보고되어 왔다 (28, 30). 그러나 이 경우에서, 호모이중의 NGF 리간드는 두 개의 일치하는 p75 분자들을 결합시키고, 따라서 대칭적인 이중체 리간드가 두 개의 서로 다른 수용체들을 헤테로이중합하는 구조적인 기작을 필요로 하지 않는다.

실시예 7: 인간 IL -17 RC 또는 인간 IL -17 RA 결합

형질전환된 세포들에 바이오틴화된 사이토카인들의 결합. 인간 IL-17RA, 인간 IL-17RC, 또는 이들 수용체 둘 다를 인코딩하는 발현 벡터들로 형질전환된 어린 햄스터 신장 (BHK) 세포들이 바이오틴화된 인간 IL-17A, 인간 IL-17F, 및 본 명세서에서 기술된 길항제들을 포함하는 그들의 변이체들을 결합시키는 그들의 능력에 대해 평가된다. 세포들은 베르센 (versene)으로 수확되었고, 계수되었으며, 1 mg/ml 소혈청 알부민 (BSA), 10 mM HEPES, 및 0.1% 소듐 아자이드 (w/v)가 첨가된 HBSS인 염색 배지 (SM)에서 mL 당 10⁷개 세포들로 희석되었다. 바이오틴화된 인간 IL-17A, 인간 IL-17F, 및 기타 관심있는 단백질들은 세포들과 얼음 위에서 30분 동안 다양한 농도들에서 배양된다. 30분 이후에, 과다한 단백질은 SM으로 세척해내고 세포들은 1 : 100 희석의 스트렙트아비딘 결합된 파이코에리트린 (SA-PE)과 얼음 위에서 30분 동안 배양된다. 과다한 SA-PE는 세척해내고 세포들은 유동세포측정법에 의해 분석된다. 결합의 양은 염색의 평균 형광 강도로부터 정량된다.

인간 말초혈액 단핵세포 ( PBMC )와 바이오틴화된 사이토카인들의 결합. PBMCs는 전혈로부터 피콜 밀도 구배 원심분리에 의해 준비된다. mL 당 10⁷개의 세포들 농도에서 PBMC가 바이오틴화된 IL-17A 또는 IL-17F 또는 관심 있는 단백질들과 1 μg/mL 농도로 또한 다양한 혈액세포 계열들을 구별하도록 설계된 특이적 세포 표면 단백질들에 대한 형광크롬 결합된 항체들과 배양된다. 이들 마커들로는 CD4, CD8, CD19, CD11b, CD56 및 CD16을 포함한다. 과다한 항체 및 사이토카인은 세척해내고 특이적 사이토카인 결합은 상기에 기술된 바와 같이 SA-PE로 배양하여 검출된다. 시료들은 유동 세포측정법에 의해 분석된다.

특이적 결합의 저해. 결합 연구들은 상기에 논의된 바와 같이 수행되지만, 과다한 미표지된 인간 L-17A 및 IL-17F 또는 본 명세서에서 기술된 단백질들과 같은 과다한 미표지된 관심있는 단백질들이 결합 반응에 포함된다. BHK 세포들을 사용한 연구들에서, 미표지된 단백질의 양은 농도들의 범위에서 다양하고 미표지된 IL-17A 및 관심 있는 단백질들은 IL-17A 및 IL-17F 둘 다 내지 IL-17RC 및 IL-17RA 둘 다의 결합을 위해 경쟁하는 능력에 대해 평가된다.

실시예 8: 마우스 NIH3T3 세포들은 인간 IL -17A 및 IL -17F에 반응한다.

마우스 NIH3T3 세포들은 공통적인 NF-κB 결합 부위, 인간 면역결핍 바이러스-1 긴 말단 반복서열, 콜라게나제 AP-1 요소의 두 개 사본들, 및 Blumberg et al. (2001) Cell 104:9-19에 기술된 바와 같이 루시퍼라제 리포터 카세트 내에 라이게이션되고 pACCMV.pLpA 아데노바이러스 셔틀 벡터 내에 놓여진 c-Jun TRE의 단일 사본을 포함하는 Kz142 아데노바이러스 입자들로 형질전환된다.

아데노바이러스 입자 리포터와 밤샘 배양 이후에, 처리들 (예로, IL-17A, IL-17F, 또는 기타 관심있는 단백질들을 사용함)이 0.28% BSA를 포함하는 무혈청 배지에서 준비된다. 아데노바이러스 입자들 및 배지가 제거되고 적절한 용량들이 주어진다. 37℃ 및 5% CO₂에서 배양은 4시간 동안 지속되고 이후에 배지는 제거되고 세포는 15분 동안 용출되고 평균 형광 강도 (MFI)가 루시퍼라제 검정법 시스템 및 반응액들 (카탈로그 번호 #e1531 프로메가사, Madison, WI)을 사용하여 마이크로플레이트 루미노미터 (microplate luminometer)로 측정된다. 안정한 세포주들이 또한 만들어질 수 있다. 안정한 및/또는 일시적 세포주들이 본 명세서에서 기술된 단백질의 활성을 평가하는 데 사용될 수 있다.

실시예 9: IL -17A는 인간 말초혈액 단핵 세포들에서 IFN ν 및 TNF α의 증가된 수준들을 유도한다.

인간 말초혈액 단핵 세포들 (PBMC)은 피콜 밀도 구배 원심분리에 의해 정제되고 다음으로 37℃에서 배지 단독, 50 ng/mL 항-인간 CD3 항체, 또는 1 μg/mL 항-인간 CD28 항체를 첨가한 50 ng/mL 항-인간 CD3 항체의 조합으로 배양된다. 이들 조건들의 각각을 위한 복수의 (replicate) 배양액들이 설정되고 사이토카인 없음, 25 ng/mL 인간 IL-17A, 25 ng/mL 인간 IL-17F, 또는 관심있는 단백질의 다양한 농도들이 주어진다. 24시간 배양 이후에, 각 배양액으로부터 나온 상청액들이 수확되고 B-D 바이오사이언스사의 인간 Th1/Th2 세포측정 비드 어레이 (CBA)를 사용하여 사이토카인 함량이 검정된다. 우리는 항-CD3 또는 항-CD28을 더한 항-CD3 둘 중 하나로 자극되고 IL-17A가 보충된 배양액들이 사이토카인이 첨가되지 않은 배양액 또는 IL-17F을 수여받은 것들에서 유의하게 증가된 수준들의 IFNγ 및 TNFα을 포함할 것으로 예상한다. 관심 있는 단백질들은 IFNγ및 TNFα의 IL-17A 유도를 저해하는 그들의 능력에 대해 평가될 수 있다.

실시예 10: 마우스 콜라겐 유도성 관절염 ( CIA ) 모델

마우스 콜라겐 유도성 관절염 (CIA) 모델은 인간 관절염을 치료하는 약물 (본 명세서에서 기술된 단백질들과 같음)의 치료적 가능성을 평가하는 데 사용될 수 있다. 8주 내지 10주 된 수컷 DBA/IJ 마우스 (잭슨 랩사 (Jackson Labs); 각각 25-30 g)가 이들 연구들에 사용된다. 21일차에, 동물들에게 완전한 프런드 아쥬반트로 제형화된 100 mL의 1 mg/mL 닭의 제 Ⅱ형 콜라겐의 꼬리 피부내 주사가 주어졌고 3주 이후에 0일차에 불완전한 프런드 아쥬반트로 준비된 것을 제외하고는 동일한 주사가 주어졌다. 두 번째 콜라겐 주사 이후에 동물들은 관절염의 증상들을 보여주기 시작하였고 대부분의 동물들이 1-2주 이내에 염증을 발생시켰다. 질환의 정도가 발의 두께를 측정하도록 캘리퍼를 사용하고 또한 임상적 점수를 각 발에 부과하여 (0 - 3점) 각 발에서 평가된다: 하기에 자세하게 기술된 바와 같이, 0 = 정상, 0.5 = 염증이 생긴 발가락(들), 1 = 약한 발 염증, 2 = 적당한 발 염증, 및 3 = 심각한발 염증.

본 모델에서의 발병율은 전형적으로 95 내지 100%이고, 0-2% 미반응자들 (관찰 6주 이후에 결정됨)이 전형적으로 40마리의 동물들을 사용한 연구에서 관찰된다. 염증이 시작되면서 다양한 저급 발 또는 발가락 염증의 공통적인 일시적 발생이 일어날 수 있는 점을 주목하라. 이러한 이유로, 동물은 현저하고 지속적인 발 종창이 발생될 때까지는 확립된 것으로 고려되지 않는다.

모든 동물들은 그들의 발들에서 질환의 상태를 평가하도록 매일 관찰되고, 이것은 각 발들에 정량적인 임상적 점수를 부과하여 시행된다. 매일 각 동물은 임상적 질환의 상태에 따라 점수 매긴 4개의 발들을 가지게 된다. 임상적 점수를 결정하기 위하여, 발은 세 가지 영역들, 발가락, 발 자체 (앞 발 또는 뒷 발), 및 손목 또는 발목 관절을 가지는 것으로 생각된다. 이들 영역들에 대한 염증의 정도 및 중증도가: 종창에 대한 각 발의 관찰; 발톱 손상 또는 발가락들의 발적; 발이라면 모두에서 부종 또는 발적의 증거라면 모두의 표기; 힘줄들 또는 뼈들의 분명한 해부학적 구획의 상실이라면 모두의 표기; 손목 또는 발목의 부종 또는 발적이라면 모두의 평가; 또한 염증이 다리까지 근접하게 확산되었는 지 여부의 표기를 포함하여 주목된다. 1, 2, 또는 3점의 발 점수는 먼저 중증도의 전반적인 인지 또한 둘째는 많은 영역들이 관여되는 과정을 근거로 한다.

치료들: 확립된 질환은 1 이상으로 순위가 매겨진 발 염증의 정량적인 점수로서 정의된다. 일단 확립된 질환이 존재하는 경우라면, "확립된 질환"을 가지는 동물의 첫 날로서 표시되는 날짜가 기록되고 치료가 시작된다. 마우스는 PBS 또는 전체 5가지 용량들 150 μg; 75 μg; 25 μg; 및 10 μg이 이틀 마다 복강내로 주어진 관심 있는 단백질의 다양한 용량들로 치료된다.

혈액은 항-콜라겐 항체들의 혈청 수준들, 뿐만 아니라 혈청 면역들로불린 및 사이토카인 수준들을 감시하도록 실험 기간을 통하여 수집된다. 동물들은 질환 발생 이후 약 10일이 지난, 마지막 처리 (5번째)하고 48시간 이후에 안락사된다. 혈액은 혈청을 위해 수집되고 모든 발들은 조직학을 위해 10% NBF 내에서 수집된다. 혈청은 수집되어 면역글로불린 및 사이토카인 검정을 위해 -80℃에 냉동된다. 치료된 마우스에서 임상적 점수 중증도에서 용량-의존적, 유의한 감소는 본 테스트 시스템에서 단백질의 생물학적 효과를 가르키고 있다.

실시예 11: 추가적인 질환 모델

염증성 장 질환 (IBD) 모델은 IBD를 가진 환자들로부터 나온 배양된 장 조직이 건강한 대조군들로부터 나온 조직과 대비하여 더 높은 수준들의 염증 매개인자들을 생산하는 것을 보여주도록 설계된다. 염증성 매개인자들 (이에 제한되는 것은 아니지만 IL-1b, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A 및 F, IL-18, IL-23, TNF-α, IFN-ν, MIP 패밀리 구성원들, MCP-1, G- 및 GM-CSF 등을 포함함)의 본 증진된 생산은 크론씨 질환 (CD) 및 궤양성 장염 (UC)과 같은 IBDs와 연관된 증상들 및 병리학에 염증성 경로들 및 하류 (downstream) 효과기 세포들을 활성화하는 데 미치는 그들의 효과(들)에 의하여 기여한다. 다음으로, 이들 경로들 및 성분들은 생체내에서 관찰되는 조직 및 세포 손상/파괴를 유도한다. 따라서, 본 모델은 IBD의 본 증진된 염증성 매개인자 관점을 자극할 수 있다. 또한, 건강한 대조군들로부터 또는 인간 장 표피세포 (IEC) 계열으로부터 나온 장 조직이 이들 염증성 성분들의 존재 시 배양될 때, 염증성 경로 신호전달뿐만 아니라 조직 및 세포 손상의 증거가 관찰될 수 있다.

인간 IBD에서 생체내 효능을 가질 치료제들은 상기 생체외 또는 IEC 모델들에서 염증성 매개인자들의 생산 및/또는 이의 존재를 저해하고 및/또는 중화하여 작용할 것이다.

본 모델에서, 인간 장 조직은 IBD를 가진 환자들로부터 또는 장 생검, 재-섹션 과정을 거친 건강한 대조군들로부터 또는 사후 검시 조직 수집으로부터 수집되고, 또한 알렉사키스 등 (Alexakis et al., Gut 53:85-90; 2004)의 변형을 사용하여 프로세싱된다. 방부적 조건들 하에서, 시료는 많은 양의 PBS로 가만히 세척되고 이어서 조직의 얇은 (minced) 섹션들이 완전한 조직 배양 배지 (박테리아의 과다 증식을 막는 항생제를 첨가함)의 존재 시 배양된다. 동일한 얇은 조직의 풀로부터 나온 시료들은 다음의 하나로 처리된다: 운반체 (PBS); 재조합 인간 (rh) IL-17A; rhIL-17F; 또는 rhIL-17A+rhIL-17F. 또한, 이들 시료들은 IL-17A, IL-17F, IL-17B, IL-17C, IL-17D, 및 IL-17E의 길항제 존재 시 또는 부재 시 단독으로 또는 조합으로 처리될 수 있다. 본 실험적 프로토콜은 세포들이 기존의 스톡들로부터 계대되는 것을 제외하고는 인간 IEC 계열을 사용하는 연구들로 이어졌다. 배양에서 시간대를 다양하게 변화시킨 이후에 (1시간으로부터 수 일까지), 상청액들이 수집되고 상기에 나열된 것들을 포함하는 염증성 매개인자들의 수준들에 대해 분석된다. IBD를 가진 환자들로부터 나온 시료들에서 또는 rhIL-17A 및/또는 F로 처리된 시료들에서, 염증성 사이토카인들 및 케모카인들의 수준들이 미처리된 건강한 대조군 조직 시료들과 대비하여 증가된다. 관심 있는 단백질들은 염증성 매개인자들의 생산을 감소시켜서 인간 IBD에서 효능을 가지는 능력에 대해 평가될 수 있다.

관심 있는 단백질들은 눈 건조 질환에 대한 마우스 모델에서 평가될 수 있다. 건조한 눈은 스코폴라민 (scopolamine)의 피하 주사, 다음으로 조절된-환경 체임버들에서 마우스 사육에 의해 마우스에서 유도될 수 있다. 조절된-환경 체임버는 상대 습도, 온도 및 공기 유동이 조절될 수 있다. 예로, Barabino et al., Invest. Ophth. Vis. Sci., 46:2766-71, 2005를 참조. 다양한 마우스 품종들이 사용될 수 있다. 이들로는 예로 C57BL/6, BALB/c, NZB/W, 및 MLR/lpr, MLR/+을 포함한다. 다른 동물들, 예로 토끼들, 래트들, 원숭이들, 개들, 및 고양이들도 역시 눈 건조 질환 모델들로서 사용될 수 있다. 예로, Nguyen and Peck, Ocul. Surf., 7(1):11-27, 2009 (표 1을 포함함), 또한 Barabino and Dana, Invest. Ophth. Vis. Sci., 45(6): 1641-46, 2004를 참조.

예로서, 건조 눈은 정상의 건강한 6 내지 10주 된 암컷 C57BL/6 마우스로 30% 이하의 습도 (일반적으로 약 19%), 높은 공기유동 (일반적으로 약 15 리터/분 이상) 및 일정한 온도 (약 22℃)를 가진 조절된 환경 체임버에서 건조한 환경에 계속적인 노출에 의해서 유도될 수 있다. 체임버에 넣은 마우스는 또한 눈물 분비를 저해하도록 스코폴라민으로 처리된다. 지속적 방출 경피적 스코폴라민 패치 (노바티스사 (Novartis), Summit NJ)의 1/4이 마우스의 탈모된 꼬리 중간에 48시간 마다 적용되거나 스코폴라민이 예로 750 μg씩 하루 두 번 피하적으로 주사될 수 있다. 조절된 환경 체임버 및 스코폴라민의 조합은 상대적으로 짧은 시간대 (약 2 - 4일)에 심각한 눈 건조를 생성한다. 마우스들은 질환 발생 이후에 관심 있는 단백질로 이들 조건들 하에서 7 내지 16일 동안 처리되고 위약 또는 운반체가 처리된 대조군들과 비교될 수 있다. 마우스들은 감시되고 건조한 눈에 대해, 예로 다음 과정들을 수행하여 평가될 수 있다: (a) 수성의 눈물 생산의 평가; (b) 각막 표면 손상의 마커가 되는 각막 플로오레신 염색; (c) 우성 및 열성 결막에서 배상세포 밀도의 평가; (d) 예로, 결막 표피 모양에 대한 일반적인 안과적 검사; (e) 각막 표면의 주사전자현미경 검사; 또한 (9) 면역조직화학.

실시예 12: 류마티스성 관절염 ( RA ) 및 골관절염 ( OA ) 모델

본 모델은 인간 윤활 배양액들 (윤활 대식세포들, 윤활 섬유모세포들, 및 관절 연골세포들을 포함함) 또한 RA 및 OA 환자들로부터 나온 이식물들이 건강한 대조군들로부터 나온 배양액들/이식물들과 대비하여 더 높은 수준들의 염증성 매개인자들을 생산하는 것을 보여주도록 설계된다. 염증성 매개인자들 (이에 제한되는 것은 아니지만 온코스타틴 M, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17 A 및 F, IL-18, IL-23, TNF-α, IFN-ν, IP-10, RANTES, RANKL, MIP 패밀리 구성원들, MCP-1, G- and GM-CSF, 산화 질소 등을 포함함)의 본 증진된 생산은 염증성 경로들 및 하류 효과기 세포들을 활성화에 미치는 그들의 효과(들)에 의하여 RA 및 OA와 연관된 증상들 및 병리학에 기여한다. 다음으로 이들 경로들 및 성분들은 염증성 침윤물들, 연골 및 기질 소실/파괴, 뼈 소실, 또한 프로스타글란딘들 및 사이클로옥시게나제들의 상승조절을 유도한다. 따라서, 본 모델은 시험관내 및 생체외 실험들에서 RA 및 OA의 파괴적인 염증성 관점들을 자극할 수 있다. 또한, 건강한 대조군들로부터 나온 이식물들 및 윤활 배양액들이 여러 가지의 이들 염증성 성분들 (예로, 온코스타틴 M, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17A 및 F, IL-15)의 존재 시 배양될 때, 염증성 경로 신호전달이 관찰될 수 있다. 인간 RA에서 생체내 효능을 가질 치료제들은 상기 시험관내 및 생체외 모델들에서 염증성 매개인자들의 생산 및/또는 이의 존재를 저해하고 및/또는 중화하여 작용할 것이다.

본 모델에서, 인간 윤활 이식물들은 RA를 가진 환자들로부터 또는 관절 이식을 거친 건강한 대조군들로부터 또는 사후 검시 조직 수집으로부터 수집되고, 또한 울리 및 테트로우 (Wooley and Tetlow, Arthritis Res 2: 65-70, 2000) 및 반트 H 등 (van't H et al., Rheumatology 39:1004-1008, 2000)의 변형을 사용하여 프로세싱된다. 윤활 대식세포들, 윤활 섬유모세포들, 및 관절 연골세포들의 배양액들도 역시 연구된다. 복수의 시료들은 다음의 하나로 처리되고: 운반체 (PBS); 재조합 인간 (rh) IL-17A; rhIL-17F; 또는 rhIL-17A+rhIL-17F, 또한 일정 시료들이 온코스타틴 M, TNF-α, IL-1, IL-6, IL-17A, IL-17F, 및 IL-15의 다양한 조합들을 포함한다. 또한, 이들은 관심있는 단백질의 존재 시 또는 부재 시 평가될 수 있다. 배양의 시간을 다양하게 변화시킨 이후에 (1시간으로부터 수 일까지), 상청액들이 수집되고 상기에 나열된 것들을 포함하는 염증성 매개인자들의 수준들에 대해 분석된다. RA 또는 OA를 가진 환자들로부터 나온 시료들에서 또는 rhIL-17A 및/또는 F로 처리된 시료들에서 (단독으로 또는 다른 염증성 사이토카인들과 조합으로), 염증성 사이토카인들 및 케모카인들의 수준들이 미처리된 건강한 대조군 이식물들과 대비하여 또는 미처리된 세포 배양액들에서 올라간다. 관심 있는 단백질들은 염증성 매개인자들의 생산을 감소시켜서 인간 RA 및 OA에서 효능을 가지는 능력에 대해 평가될 수 있다.

실시예 13: G- CSF , IL -6 및 IL -8의 유도

인간 IL-17A 또는 인간 IL-17F으로 처리된 인간 소기도 표피세포들 (SAEC)은, 예로 처리 48시간 이후에 세포 상청액들의 평가에 의해 G-CSF, IL-6, 및 IL-8의 용량-의존적 유도를 보여줄 수 있다. 관심 있는 단백질들은 본 유도를 저해하는 그들의 능력에 대해 평가될 수 있다.

실시예 14: 인간 류마티스성 관절염 (" RA ") 및 골관절염 (" OA ") 시료들

이들 모델들은 인간 윤활 배양액들 (윤활 대식세포들, 윤활 섬유모세포들, 및 관절 연골세포들을 포함함) 또한 RA 및 OA 환자들로부터 나온 이식물들이 건강한 대조군들로부터 나온 배양액들/이식물들과 대비하여 더 높은 수준들의 염증성 매개인자들을 생산하는 것을 보여주도록 설계되고, 이는 다시 이들 질환들의 표시가 되는 세포외 기질 성분들 (예로, 뼈, 연골 등)의 분해에 기여할 수 있다. 또한 하기에 기술된 공동-배양 모델들은 RA/OA 윤활액 및/또는 활성화된 T 세포들에 존재하는 염증성 매개인자들도 역시 더 큰 염증 및 기질 분해를 유도할 수 있는 점을 보여주도록 설계된다.

염증성 매개인자들 (이에 제한되는 것은 아니지만 온코스타틴 M, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17 A 및 F, IL-18, IL-23, TNF-α, IFN-ν, IP-10, RANTES, RANKL, MIP 패밀리 구성원들, MCP-1, G- and GM-CSF, 산화 질소 등을 포함함)의 증진된 생산은 염증성 경로들 및 하류 효과기 세포들을 활성화에 미치는 그들의 효과(들)에 의하여 RA 및 OA와 연관된 증상들 및 병리학에 기여한다. 다음으로 이들 경로들 및 성분들은 염증성 침윤물들, 연골 및 기질 소실/파괴, 뼈 소실, 또한 기질 금속단백분해효소들, 프로스타글란딘들, 및 사이클로옥시게나제들의 상승조절을 유도한다. 따라서, 이들 모델들은 시험관내 및 생체외 실험들에서 RA 및 OA의 파괴적인 염증성 관점들을 자극할 수 있다. 또한, 건강한 대조군들로부터 나온 이식물들 및 윤활 배양액들이 외인성으로 첨가된 염증성 성분들 (예로, 온코스타틴 M, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17A 및 F, IL-15)의 존재 시, 또는 대안으로 RA 환자들 (염증성 성분들을 외인성으로 포함함)로부터 나온 윤활액의 존재 시 배양될 때, 염증성 및 분해성 경로 신호전달이 관찰될 수 있다. 인간 RA에서 생체내 효능을 가질 치료제들은 상기 시험관내 및 생체외 모델들에서 염증성 매개인자들의 생산 및/또는 이의 존재를 저해하고 및/또는 중화하여 작용할 것이다.

이들 모델들에서, 인간 윤활 이식물들은 RA를 가진 환자들로부터 또는 관절 이식을 거친 건강한 대조군들로부터 또는 사후 검시 조직 수집으로부터 수집되고, 또한 울리 및 테트로우 (Wooley and Tetlow, Arthritis Res 2: 65-70, 2000) 및 반트 H 등 (van't H et al., Rheumatology 39:1004-1008, 2000)의 변형을 사용하여 프로세싱된다. 윤활 대식세포들, 윤활 섬유모세포들, 및 관절 연골세포들의 배양액들도 역시 연구된다. 복수의 시료들은 다음의 하나로 처리되고: 운반체 (PBS); 재조합 인간 (rh) IL-17A; rhIL-17F; 또는 rhIL-17A+rhIL-17F, 또한 일정 시료들이 온코스타틴 M, TNF-α, IL-1, IL-6, IL-17A, IL-17F, 및 IL-15의 다양한 조합들을 포함한다. 별도의 한 벌의 시료들이 활성화된 인간 T 세포들, 또는 건강한 대조군들 또는 RA 또는 OA를 가진 환자들로부터 나온 윤활액으로 처리된다. 배양의 시간을 다양하게 변화시킨 이후에 (1시간으로부터 수 일까지), 상청액들이 수집되고 상기에 나열된 것들을 포함하는 염증성 매개인자들 및 연골/뼈/기질 바이오마커들의 수준들에 대해 분석된다. 시료들은 관심 있는 단백질들로 처리되어 염증성 및 연골/뼈/기질 분해 매개인자들의 생산을 감소시켜서 인간 RA 및 OA에서 효능을 가지는 능력에 대해 평가될 수 있다.

실시예 15: 단일 사슬 인간 IL17A : IL17F 헤테로이중체들

재조합 인간 IL17A:IL17F 헤테로이중체 단백질 또는 재조합 IL17A:IL17F 변이체는 CHO DXB11 세포들 및 WAVE 장치에서 세포 배양으로 적절한 단일 사슬 제작물 (construct)의 발현으로부터 생산된다. 한 가지 제작물은 N-말단에서 IL-17F와 C-말단에서 (G₄S)₃ 링커와 연결된 인간 IL-17A의 서열들로 구성되고; 또 다른 대표적인 제작물은 N-말단에 IL-17F-변이체와 C-말단에서 (G₄S)₃ 링커와 연결된 인간 IL-17A의 서열들로 구성된다. His 태그가 산물의 포획을 위해 C-말단에 포함될 수 있다. 대표적인 정제 방법은 미국 특허 제 US 20080241138호에 기술되어 있다. 간략하게, 이것은 산 침전 단계, 여과, 이어지는 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 예를 들어, 대략 10 L의 조절된 배지가 수확되고 0.2 μm 필터를 사용하여 무균 여과된다. 배지는 교반하면서 아세트산을 첨가하여 pH 5.0로 조절된다. 침전 이후에, pH-조절된 배지는 다시 0.8 내지 0.2 마이크론 필터를 통하여 여과된다. 다음으로 배지는 SP 패스트 플로우 레진 (SP Fast Flow resin) 상에서 양이온 교환 크로마토그래피가 시행될 수 있고, 염 구배로 용출된다. 다음으로 피크 분획들은 예로 5 mL 히스트랩®IMAC 컬럼 (HISTRAP® IMAC column) (GE 헬스케어사 (GE Healthcare))을 사용하여 IMAC 크로마토그래피가 시행될 수 있다. 이미다졸로 용출 이후에, 피크 분획들은 예로 슈퍼덱스®200 (SUPERDEX®200) 상에서 크기 배제 크로마토그래피가 시행될 수 있다. 다음으로 피크 분획들은 모아서 사용될 수 있다. 분획들은 웨스턴 분석법 (예로, 항-HIS 항체로)에 의해 및/또는 쿠마시 젤 염색을 사용하는 SDS-PAGE에 의해 평가될 수 있다.

실시예 16: IL -17 RA 및 IL -17F의 발현 및 정제

인간 IL-17RA의 본래의 신호 펩타이드 및 세포외 부위 (1-286번 잔기들)가 BACMAM®발현 벡터 pVLAD637 내에 클론되었다, 재조합 단백질은 1% 우태아 혈청 (FBS) 및 10 mM Na 부틸레이트가 보충된 PRO293^TM 배지 (론자사 (Lonza))에서 성장된 293 GnTI- 세포들에서 37℃에서 일시적으로 발현되었다. C-말단 헥사-His 태그를 가진 전장의 IL-17F가 pAcGP67-A 발현 벡터 (BD 바이오사이언스사 (BD Biosciences)) 내로 클론되었고 단백질이 INSECT XPRESS^TM 배지에서 성장한 하이 파이브 곤충세포들에 의해 27℃에서 분비되었다. IL-17RA 및 IL-17F 단백질들을 포함하는 상청액들이 혼합되었고 Ni-친화 정제 이전에 농축되었다. IL-17RA 단백질은 엔도글리코시다제-H (endoglycosidase-H) 처리에 의하여 탈당화되었고 또한 IL-17RA 및 IL-17F 정제 태그들은 3C-단백분해효소 및 카복시펩티다제 A (시그마-알드리치사 (Sigma-Aldrich))를 사용하여 절단되었다. 단백질 복합체는 Walter et al.에 기술된 바와 같이 디메틸아미민-보란 복합체 및 포름알데하이드를 사용하여 환원성 라이신 메틸화가 시행되었다 (38). IL-17RA-IL-17F 복합체는 10 mM 헤페스 pH 7.4 및 150 mM NaCl로 평형화된 SUPERDEX®200 크기 배제 컬럼 (GE 헬스케어사)을 사용하여 좀 더 정제되었다. IL-17RA-IL-17F 복합체를 포함하는 분획들은 결정화 과정들을 위해 ~15 mg/mL로 농축되었다.

셀레노-메티오닌 (SeMet) 표지된 IL-17RA 단백질은 다음의 변형들을 사용하여 기술된 바와 같이 제조되었다 (39). 미형질전환된 부착성 293 GnTI- 세포들은 FBS-보충된 DMEM 배지 (인비트로겐사 (Invitrogen))에서 배양되었다. 배지는 한 번의 인산-완충 식염수 세척 이후에 40 mg/l L-Cys, 45 mg/l 셀레논-L-Met, 2% FBS, L-글루타메이트, Na 피루베이트, IL-17RA BacMam 바이러스 및 10 mM Na 부틸레이트가 보충된 무-Cys DMEM (인비트로겐사)로 교환되었다. 발현은 72시간 동안 진행되도록 허용되었다. IL-17RA-SeMet 단백질 상청액들이 IL-17F와 혼합되었고 상기에 기술된 바와 같이 정제되었다.

결합 실험들을 위해, 단백질들이 필수적으로 상기에 기술된 바와 같이 발현되었고 정제되었다. IL-17RA, IL-17RB 및 IL-17RC 세포외 도메인들은 C말단 BirA 라이게아제 태그의 존재 또는 부재 시 293s GnTI- 세포들에 의해 발현되었다. IL-17RC는 크기 배제 크로마토그래피 이전에 3C-단백분해효소에 의해 절단되는 추가적인 C-말단 Fc 태그를 가지고 발현되었다. IL-17A, IL-17F 및 IL-25 사이토카인들은 C-말단 헥사-HIS 태그들을 가지는 하이 파이브 세포들에 의해 발현되었다. 단백질들은 BirA 라이게아제를 사용하여 효소적으로 바이오틴화되었고 크기 배제 클로마토그래피를 통하여 정제되었다.

실시예 17: 결정화 및 X-선 데이타 수집

IL-17RA-IL-17F 복합체들은 처음에 10% PEG6000 및 0.1 M 바이신 (bicine) pH 9.0에서 증기 확산 (hanging-drop vapor diffusion)에 의해 성장되었다. 최적화된 본래의 단백질 및 SeMet 단백질 복합체 결정들은 PEG6000 (4-14%) 및 0.1 M CAPSO 완충용액 (pH 9.1-9.3)에 넣어 20 mM CaCl₂ 또는 10 mM CaCl₂ 및 1.5% w/v 트리메틸아민 N-옥사이드 디하이드레이트를 단백질-침전 점적에 직접적으로 첨가하면서 성장되었다. 중금속 유도체들이 0.5 mM K₂PtCl₄ 및 2% 에틸렌글리콜이 보충된 웰 용액에 결정들을 6시간 동안 담구어 제조되었다. 결정들은 데이타 수집 이전에 20-25% 에틸렌 글리콜이 첨가된 웰 용액에서 냉동-보호되었고 100 K로 냉각시켰다. 결정들은 공간 그룹 P41212에 속하고 ~171, 171, 83 Å의 단위 세포들 차원을 가진다. 초기 본래의 데이타 세트는 스탠포드 신크로트론 방사선원 (Stanford Synchrotron Radiation Lightsource, SSRL) 조사선 번호 (beamline) 9-2 (Stanford, CA)에서 수집되었다. Pt-유도체들 및 SeMet 데이타 세트들은 SSRL 조사선 번호 11-1에서 수집되었다. 더 높은 해상도의 본래의 데이타 세트는 어드밴스 광자원 (Advanced Photon Source, APS) 조사선 번호 ID-23D (Argonne, IL)에서 수집되었다. 모든 데이타들은 인덱스가 표시되었고 프로그램 Mosflm40을 사용하여 통합되었으며 CCP4 수트로부터 나온 SCALA로 비교 (scale)되었다 (41). 회절은 비등방성 (anisotropic)이고 또한 초기의 본래 데이타세트는 타원형 절단 및 회절 비등방성 서버 (42)를 사용하여 데이타 세트를 3.4, 3.4 및 3.9Å로 만드는 비등방성 비교가 시행되었다.

실시예 18: 구조 결정 및 정련

IL-17A 호모이중체로의 분자적 치환 해법은 모델로서 이미 결정된 2.85Å IL-17F 구조를 가진 프로그램 페이저 43 (Phaser43)를 사용하여 결정되었다 (PDB ID 1JPY) (7). 초기의 지도들은 IL-17RA의 결합 부위를 비추는 IL-17F 이중체의 한 측면 상에 추가적인 밀도를 보여주었다. 상들은 프로그림 샤프 (Sharp)에서 변칙 분산을 가진 단일한 동형 치환 (SIRAS)에 의하여 K₂PtCl₄ 유도체들을 사용하여 계산되었다 (44). 밀도 변형된 지도들은 71% 용매를 가정하고 IL-17F 분자적 치환으로부터 나온 부분적 모델을 포함하여 20회 중의 10회 동안 계산되었다. IL-17RA주요 사슬의 부분적 모델은 프로그램 쿠트 (Coot)를 사용하여 본 지도 내에 수작업으로 작성되었다 (45).

IL-17RA Met 잔기들의 위치는 패스트 포리어 트랜스폼 (fast Fourier transform, FFT)에 의해 CCP4 슈트에서 프로그램 FFT를 사용하여 변칙 차이 지도를 생성하도록 계산되었다. SeMet 데이타 세트는 본래의 데이타 세트와는 동형이 아니고 신호도 역시 너무 약하여 단일 변칙 차이 (SAD) 상분석 방법들에 의해 부위들을 위치시키지 못하기 때문에, 부분적으로 작성된 모델이 SeMet 데이타 세트의 분자적 치환 모델로서 사용되었고 계산된 상들은 셀레노늄 (selenonium) 피크들을 찾는 데 사용되었다. 잠재적인 여섯 개의 SeMet 잔기들이 IL- 17RA 159번 Met, 166번 Met 및 218번 Met에 해당하는 것으로 위치되었다. 이들 Met 위치들은 예측된 Asn-연결된 당화 부위들 및 디설파이드 결합들에 추가하여 폴리펩타이드를 밀도로 등록하고 초기의 IL-17RA 모델을 완벽하게 작성하는 데 사용되었다. 배위 (coordinate) 및 B-인자 정련의 반복적 시도들은 쿠트에서 작성된 수작업 모델과 교차되는 (intersected) 프로그램 피닉스46 (Phenix46)을 사용하여 수행되었다. 모델 작성의 초기의 시도들은 프로그램 CNS에 의해 계산되는 B-인자 정리된 σ_A-가중된 상분석된-결합된 지도들을 사용하였다 (47). 최종의 모델은 각각 22.7% 및 25.3%의 R_인자 및 R_자유를 사용하여 3.3Å으로 정련되었다. 비대칭 단위에서 하나의 IL-17RA-IL-17F 복합체가 존재한다. 모델은 IL-17RA 사슬의 43번 위치에서 디메틸-라이신, IL-17RA 사슬에서 다섯 개의 단일한 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 부위들, IL-17F 사슬 B 위에 두 개의 GlcNAc 잔기들을 가지는 하나의 부위 및 칼슘 이온을 포함한다. 프로그램들 PROCHECK48 및 WHAT_CHECK (49)가 최종 모델의 기하학을 평가하는 데 사용되었다. CCP4 슈트 프로그램들 컨택트 및 애리몰 (Contact and Areaimol)이 경계면 접촉들 및 묻힌 표면적을 각각 결정하는 데 사용되었다. 모든 구조적 도면들이 프로그램 파이몰 (Pymol) (50)을 사용하여 생성되었다.

실시예 19: 친화도 측정

결합 친화도들은 BIACORE® T100 (GE 헬스케어사) 상에서 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 통하여 계산되었다. C-말단 바이오틴화된 IL-17 수용체들이 SA 또는 CM4-센서 칩 (GE 헬스케어사) 상에서 고정된 스트렙트아비딘에 결합되었다. 부적절한 바이오틴화된 단백질은 유동 세포들을 조절하도록 동등한 고정 밀도들에서 포획되었다. 두 번째 수용체 결합 상호작용을 측정하기 위하여, 사이토카인이 먼저 고정된 수용체에 포획되었고 다음으로 두 번째 수용체 주입이 이어졌다. 낮은 결합 밀도들 (200 - 400 RU) 및 과다 사이토카인 농도들이 단일 수용체와 결합한 사이토카인 호모이중체들의 수를 최적화하는 데 사용되었다. 표면은 각 주기 사이에서 3 M MgCl₂를 사용하여 재생되었다. 동력학 실험들의 경우, 50 μL/분의 유속이 사용되었다. 데이타는 Biacore® T100 평가 소프트웨어 버전 2.0 (GE 헬스케어사)를 사용하여 분석되었다. 친화도들은 적어도 두 개의 독립적인 실험들의 평균 ± 평균의 표준 오차 (s.e.m.)로서 보고되었다.

실시예 20

IL-17RA와 결합된 IL-17F의 구조가 분석되었다.

89번 Asn은 IL-17A 및 IL-17F 사이에서 보존되고 사슬 A는 부위 3 포켓에서 IL- 17RA 골격과 수소 결합을 형성한다. 예로 알라닌과의 치환이 상호작용을 제거할 것이다.

사슬 A에서 95번 Gln은 부위 2 포켓에서 일정의 소수성 상호작용들을 만든다. 알라닌과 같은 작은 잔기로의 치환은 상호작용을 분해하는 데 사용될 수 있고, 큰 그룹 예로 트립토판으로의 치환은 IL-17RA 루프 삽입을 차단하는 데 사용될 수 있다.

IL-17F (서열번호 12)의 사슬 B에서 37번 Arg: 37번 Arg은 IL-17RA과 잠재적인 수소 결합들 및 염 연결다리들을 형성하고 41번 위치는 측 사슬이 정확하게 모델화될 수 없더라도 세린이다. 37번 Arg에서 알라닌은 수소 결합들 및 염 연결다리들을 분해할 것이다. IL-17A는 37번 Arg에 해당하는 위치에서 하전된 잔기를 가지지 않지만 서열번호 2의 37번 위치에서 라이신을 가진다 (서열번호 12의 39번 위치에 해당함). IL-17F (서열번호 12)의 37번 위치에서 하전된 잔기 또는 IL- 17A (서열번호 2)의 37번 Lys 또는 38번 Arg을 알라닌 잔기로 치환하는 것은 수용체에 대한 친화도를 감소시키는 데 사용될 수 있다. 이들 위치들의 반대 전하를 가진 잔기, 예로 글루탐산 또는 아스파트산으로 치환도 역시 사용될 수 있다.

사슬 B에서 42번 Arg, 47번 Arg 및 102번 Arg은 보존된 아르기닌 잔기들이다. IL-17RA-IL-17F 복합체에서 이들 아르기닌들은 부위 3 (42번 Arg 및 47번 Arg) 및 부위 1 (102번 Arg)에서 수소 결합들 및 염 연결다리들을 형성할 수 있다. 42번 Arg 및 47번 Arg은 유사한 환경에 있기 때문에, 그들은 둘 다 함께 표적될 수 있다. 하나, 둘 또는 셋 모두가, 예로 동일한 분자에서, 예로 미하전된 잔기 또는 산성 잔기로 치환될 수 있다. 또한, IL-17A의 문맥에서 서열번호 2의 38번 Arg은 예로 47번 Arg 및 102번 Arg에 해당하는 위치들과 조합으로 치환될 수 있다.

사슬 B에서 63번 Tyr은 여섯 가지의 IL-17 사이토카인들의 네 가지에서 보존되고 다른 둘에서는 소수성이다. 63번 Tyr는 부위 1의 중심에 묻힌 31번 Trp와의 상호작용을 포함하는 강한 소수성 상호작용들을 만든다. 63번 Tyr는 또한 다른 부위 1 잔기들과 잠재적인 수소 결합들을 형성한다. 알라닌 치환은 상호작용들을 분해하는 데 사용될 수 있고 하전된 잔기 (예로, 라이신)으로 치환은 포켓을 차단하는 데 사용될 수 있다.

사슬 B에서 68번 Val (IL-17A에서 Trp)는 부위 2에서 수용체와 소수성 상호작용들을 형성한다. 68번 Val을 예를 들어 길고 극성의 측 삿ㄹ (예로, 글루타민)으로 치환하는 것은 루프 삽입을 파괴하는 데 사용될 수 있다.

사슬 B에서 111번 Phe는 부위 1 포켓의 첨단에서 소수성 상호작용들을 형성한다. 알라닌으로 및/또는 102번 Arg 치환과 조합으로의 치환은 결합 경계면에서 이들 상호작용들을 분해하는 데 사용될 수 있다.

또한 표 3에서 관찰들이 작성되었다 (IL-17F 및 서열 12를 기준으로 확인된 잔기들).

컬럼 3은 IL-17RA에 의해 묻힌 측 사슬 용매 접근가능한 표면적 (SASA)의 분획을 제공하고 접히지 않은 상태로 SASA에 의해 정상화된다. 컬럼 4는 잔기에서 측 사슬 원자라면 모두로부터 IL-17RA에서 원자라면 모두까지 최소의 거리를 제공한다 (옹스트롬 단위).

실시예 21: 산-염기 지퍼들에 의해 형성된 IL -17 헤테로이중체들

여러 가지 돌연변이된 IL-17 사이토카인 이중체 단백질들이 두 가지의 서로 다른 소단위 서열들의 헤테로이중체들로서 설계되었다. 이러한 헤테로이중체들을 제조하는 한 가지의 접근법은 각각의 소단위의 두 가지 헤테로이중의 지퍼 서열들의 하나와 융합에 의한다. 예로, O'Shea et al., Curr Biol. (1993), 3(10):658-67를 참조. 본 실시예에서, IL-17A의 하나의 소단위는 산성 서열 및 헥사히스티딘 태그를 포함하는 C-말단 태그와 함께 발현되었다. IL-17A의 또 다른 소단위는 염기성 서열 및 헥사히스티딘 태그를 포함하는 C-말단 태그와 함께 발현되었다. 이들 소단위들의 서열은 다음과 같다:

IL-17A-산 지퍼:

GITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVASGGGGSRGGLEVLFQGPEFGGSTTAPSAQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQHHHHHH (서열번호 17)

IL-17A-염 지퍼:

GITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVASGGGGSRGGLEVLFQGPEFGGSTTAPSAQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQHHHHHH (서열번호 18)

제작물들은 293 세포들 내에 공동-형질전환되었고 단백질이 회수되었다.

실시예 22: 단일 사슬 융합에 의해 형성된 IL -17 헤테로이중체들

헤테로이중체들을 제조하는 또 다른 접근법은 유연성 펩타이드 링커를 사용하여 두 개의 소단위들을 공유적으로 연결하고 또한 그들을 단일 폴리펩타이드 사슬로서 발현시키는 것에 의한다. 단일 사슬 IL-17A 분자의 예로는 다음과 같다:

GITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVASGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVASHHHHHH (서열번호 19)

본 단백질은 293 세포들에서 발현되었다. 세포들로부터 나온 상청액들은 비-환원성 젤들 상에서 전개되었으며, 항-헥사히스티딘 항체를 사용하는 웨스턴 블럿 분석이 수행되었다. His-태그 단백질의 실질적인 부분은 단일-사슬 단백질의 단일체 형태에 해당하는 분자량 (~ 35 kDa)으로 이동하였다.

실시예 23: IL -17 활성의 검정

대조군 IL-17A 및 IL-17F 단백질 또한 돌연변이 IL-17A 및 IL-17F 단백질들이 포시에즈 등의 방법에 따라 세포-기초 기능적 검정법으로 평가되었다 (Fossiez et al., J. Exp. Med. 183(6):2593-603 (1996). 간략하게, MRC-5 인간 배아 섬유모세포들이 96-웰 플레이트들에서 1 x 10⁵개 세포/웰의 농도로 10% FBS가 보충된 DMEM 배지를 넣어 계대배양되었다. PBS pH 7.4에 넣은 대조군 단백질 및 관심 있는 단백질들이 0.1-10,000 ng/mL의 최종 농도에서 각 웰들에 첨가되었다. 세포들은 추가 48시간 동안 배양되었다. 다음으로 상청액들에서 IL-6 농도가 써모 사이언스 인간 IL-6 검색 세트 (Thermo Scientific Human IL-6 Screening Set) (카탈로그 번호 ENESS0005)를 사용하는 엘라이자 (ELISA)에 의해 측정되었다. 본 검정법을 사용하여, IL-17A 및 IL-17F 대조군 단백질들이 공개된 범위들 이내, IL-17A의 경우 1-10 ng/mL 또한 IL-17F의 경우 50-100 ng/mL에서 EC50을 가지는 것이 관찰되었다.

실시예 24: IL -17A 및 IL -17F에서 단일 돌연변이들

단일 돌연변이들이 IL-17A/IL-17A 이중체 및 IL-17F/IL-17F 이중체의 소단위들 둘 다에서 만들어졌다. 즉 단백질들이 각각 단일 돌연변이를 포함하는 두 개의 일치하는 소단위들을 가지도록 생산되었다. 표 4 및 표 5는 상기 실시예 23에서 기술된 검정법을 사용하여 본 형식에서의 각 돌연변이에 대해 관찰된 활성의 감소를 나열하고 있다:

돌연변이들 F111Q 및 Y63A는 약한 분비를 유도하였다.

실시예 25: IL -17A에서 조합 돌연변이들

돌연변이들은 소단위 1이 IL-17A 배경으로 표 1의 첫 번째 컬럼에서 확인된 돌연변이들을 포함하고 소단위 2는 IL-17A 배경으로 두 번째 컬럼에서 확인된 돌연변이들을 포함하는 이중체 단백질에서 만들어졌다. 실시예 21에서 기술된 산/염기 지퍼 접근법은 소단위 1 및 소단위 2를 포함하는 이중체들을 생산하는 데 사용되었다. 단백질들은 293 세포들에서 발현되었고, 상청액들이 수집되었고 검정되었다. 실시예 23에서 기술된 검정법에서 길항하는 단백질들의 능력이 평가되었고 야생형IL-17A/IL-17A 이중체와 비교되었다.

IL-17A의 또 다른 유용한 기준 서열은 다음과 같고 N-말단 글리신을 가지는 서열번호 2에 해당한다:

GITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA (서열번호 20)

단백질들은 하기 나열된 서열들을 가지는 소단위들을 사용하여 제조되었고 IL-17A에서 돌연변이들이 상기 기준 서열 (컬럼 2)의 번호매김에 따라 또한 IL-17F 번호매김 (컬럼 3)에 따라 확인되었다.

C-말단 절단은 서열번호 12의 128번 위치 (서열번호 2의 126번 위치 또는 서열번호 20의 127번 위치) 바로 앞에서 있었고, 서열번호 12의 127번 위치 (서열번호 2의 125번 위치 또는 서열번호 20의 126번 위치)에서 프롤린을 남겼다.

또한, 다음의 돌연변이들의 조합 (wt/N89A), (R47E/N89A), (R47E, S65K/N89A), (R47E, W68Q/N89A), (R47E,R102A/N89A)을 가지는 단백질들은 플레이트 결합 검정법에서 IL-17RA와 결합하는 것으로 관찰되었다.

실시예 26

다른 인간 IL-17 사이토카인들에 대한 보다 다른 대표적인 돌연변이 서열들은 다음을 포함한다:

돌연변이 단일-사슬 IL-17A 단백질이 세포-기초 길항기작 검정법으로 평가되었다. 상세하게, 돌연변이 단백질은 하나의 소단위가 R47E 및 S65K 돌연변이들 (서열번호 22에 상기 나타난 바와 같음)을 포함하고 두 번째 소단위가 N89A 돌연변이 및 C-말단 절단 (서열번호 27에 나타난 바와 같음)을 포함하는 단일-사슬 IL-17A이었다. 두 가지의 소단위들은 (G₄S)₆ 설계의 링커에 의해 연결되었다. 단백질은 C-말단 히스티딘 태그도 역시 포함하였다. 단백질의 서열은 다음과 같았다:

GITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNESTSPWNLHRNEDPERYPKVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVASGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMASVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPASHHHHHH (서열번호 46)

IL-17RA의 수용성 세포외 도메인의 플레이트 결합 검정법에서, 돌연변이 단백질은 야생형 IL-17A과 비교가능한 친화도로 결합하는 것이 관찰되었다 (대략 팩터 4 이내).

활성 검정법의 경우, MRC-5 인간 배아 섬유모세포들은 DMEM + 10% FBS에 넣어 1 x 10⁵개 세포/웰의 농도로 96-웰 플레이트들의 웰들에서 배양되었다. 돌연변이 단일-사슬 IL-17A 단백질들은 4 - 2400 nM의 최종 농도로 웰들에 첨가되었다. 야생형 IL-17A 및 TNF-α가 각각 5　ng/mL 및 2 ng/mL의 최종 농도로 웰들에 첨가되었다. 세포들은 37℃, 5% CO₂에서 48시간 동안 배양되었다. 다음으로 상청액들에서 IL-6 농도는 써모 사이언스 인간 IL-6 검색 세트 (카탈로그 번호 ENESS0005)를 사용하여 엘라이자에 의해 측정되었다. 결과들은 하기 표 9에 나타나 있고, 본 단단백질이 약 10-15 nM의 IC50으로 IL-17A를 길항할 수 있는 것을 보여주고 있다.

SEQUENCE LISTING <110> The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University GARCIA, K. Christopher REDDY, Sashank K. SIECZKIEWICZ, Gregory J. BARNES, Thomas M. SCHMIDT, Michael M. KING, Bracken M. ELY, Lauren K. <120> IL-17 FAMILY CYTOKINE COMPOSITIONS AND USES <130> 01661-5003WO <140> PCT/US10/52194 <141> 2010-10-11 <150> US 61/278,779 <151> 2009-10-10 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Glu Ala Ile Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly 20 25 30 Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn 35 40 45 Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser 50 55 60 Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu 65 70 75 80 Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His 85 90 95 Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser 100 105 110 Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His 115 120 125 Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys 130 135 140 Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala 145 150 155 <210> 2 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn 1 5 10 15 Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr 20 25 30 Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser 35 40 45 Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val 50 55 60 Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly 65 70 75 80 Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu 85 90 95 Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu 100 105 110 Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His 115 120 125 His Val Ala 130 <210> 3 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asp Trp Pro His Asn Leu Leu Phe Leu Leu Thr Ile Ser Ile Phe 1 5 10 15 Leu Gly Leu Gly Gln Pro Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys Gly Gln 20 25 30 Gly Arg Pro Gly Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp 35 40 45 Leu Val Ser Arg Met Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg 50 55 60 Asn Ile Glu Glu Met Val Ala Gln Leu Arg Asn Ser Ser Glu Leu Ala 65 70 75 80 Gln Arg Lys Cys Glu Val Asn Leu Gln Leu Trp Met Ser Asn Lys Arg 85 90 95 Ser Leu Ser Pro Trp Gly Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile 100 105 110 Pro Val Asp Leu Pro Glu Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn 115 120 125 Pro Phe Thr Met Gln Glu Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe 130 135 140 Ser Gln Val Pro Val Arg Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr 145 150 155 160 Gly Pro Cys Arg Gln Arg Ala Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys 165 170 175 Thr Cys Ile Phe 180 <210> 4 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys Gly Gln Gly Arg Pro Gly Pro Leu 1 5 10 15 Ala Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp Leu Val Ser Arg Met Lys 20 25 30 Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Glu Met Val 35 40 45 Ala Gln Leu Arg Asn Ser Ser Glu Leu Ala Gln Arg Lys Cys Glu Val 50 55 60 Asn Leu Gln Leu Trp Met Ser Asn Lys Arg Ser Leu Ser Pro Trp Gly 65 70 75 80 Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile Pro Val Asp Leu Pro Glu 85 90 95 Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn Pro Phe Thr Met Gln Glu 100 105 110 Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe Ser Gln Val Pro Val Arg 115 120 125 Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr Gly Pro Cys Arg Gln Arg 130 135 140 Ala Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys Thr Cys Ile Phe 145 150 155 <210> 5 <211> 197 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Thr Leu Leu Pro Gly Leu Leu Phe Leu Thr Trp Leu His Thr Cys 1 5 10 15 Leu Ala His His Asp Pro Ser Leu Arg Gly His Pro His Ser His Gly 20 25 30 Thr Pro His Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Leu Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Pro His Leu Leu Ala Arg Gly Ala Lys Trp Gly Gln Ala Leu Pro Val 50 55 60 Ala Leu Val Ser Ser Leu Glu Ala Ala Ser His Arg Gly Arg His Glu 65 70 75 80 Arg Pro Ser Ala Thr Thr Gln Cys Pro Val Leu Arg Pro Glu Glu Val 85 90 95 Leu Glu Ala Asp Thr His Gln Arg Ser Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Arg 100 105 110 Val Asp Thr Asp Glu Asp Arg Tyr Pro Gln Lys Leu Ala Phe Ala Glu 115 120 125 Cys Leu Cys Arg Gly Cys Ile Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Asn Ser Val Arg Leu Leu Gln Ser Leu Leu Val Leu Arg Arg 145 150 155 160 Arg Pro Cys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe 165 170 175 Ala Phe His Thr Glu Phe Ile His Val Pro Val Gly Cys Thr Cys Val 180 185 190 Leu Pro Arg Ser Val 195 <210> 6 <211> 179 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 His His Asp Pro Ser Leu Arg Gly His Pro His Ser His Gly Thr Pro 1 5 10 15 His Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Leu Gly Gln Ala Pro Pro His 20 25 30 Leu Leu Ala Arg Gly Ala Lys Trp Gly Gln Ala Leu Pro Val Ala Leu 35 40 45 Val Ser Ser Leu Glu Ala Ala Ser His Arg Gly Arg His Glu Arg Pro 50 55 60 Ser Ala Thr Thr Gln Cys Pro Val Leu Arg Pro Glu Glu Val Leu Glu 65 70 75 80 Ala Asp Thr His Gln Arg Ser Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Arg Val Asp 85 90 95 Thr Asp Glu Asp Arg Tyr Pro Gln Lys Leu Ala Phe Ala Glu Cys Leu 100 105 110 Cys Arg Gly Cys Ile Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala Ala Leu 115 120 125 Asn Ser Val Arg Leu Leu Gln Ser Leu Leu Val Leu Arg Arg Arg Pro 130 135 140 Cys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe Ala Phe 145 150 155 160 His Thr Glu Phe Ile His Val Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Leu Pro 165 170 175 Arg Ser Val <210> 7 <211> 202 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Leu Val Ala Gly Phe Leu Leu Ala Leu Pro Pro Ser Trp Ala Ala 1 5 10 15 Gly Ala Pro Arg Ala Gly Arg Arg Pro Ala Arg Pro Arg Gly Cys Ala 20 25 30 Asp Arg Pro Glu Glu Leu Leu Glu Gln Leu Tyr Gly Arg Leu Ala Ala 35 40 45 Gly Val Leu Ser Ala Phe His His Thr Leu Gln Leu Gly Pro Arg Glu 50 55 60 Gln Ala Arg Asn Ala Ser Cys Pro Ala Gly Gly Arg Pro Ala Asp Arg 65 70 75 80 Arg Phe Arg Pro Pro Thr Asn Leu Arg Ser Val Ser Pro Trp Ala Tyr 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Asp Pro Ala Arg Tyr Pro Arg Tyr Leu Pro Glu Ala 100 105 110 Tyr Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu Thr Gly Leu Phe Gly Glu Glu Asp 115 120 125 Val Arg Phe Arg Ser Ala Pro Val Tyr Met Pro Thr Val Val Leu Arg 130 135 140 Arg Thr Pro Ala Cys Ala Gly Gly Arg Ser Val Tyr Thr Glu Ala Tyr 145 150 155 160 Val Thr Ile Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Pro Glu Pro Glu Lys Asp 165 170 175 Ala Asp Ser Ile Asn Ser Ser Ile Asp Lys Gln Gly Ala Lys Leu Leu 180 185 190 Leu Gly Pro Asn Asp Ala Pro Ala Gly Pro 195 200 <210> 8 <211> 187 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Gly Ala Pro Arg Ala Gly Arg Arg Pro Ala Arg Pro Arg Gly Cys 1 5 10 15 Ala Asp Arg Pro Glu Glu Leu Leu Glu Gln Leu Tyr Gly Arg Leu Ala 20 25 30 Ala Gly Val Leu Ser Ala Phe His His Thr Leu Gln Leu Gly Pro Arg 35 40 45 Glu Gln Ala Arg Asn Ala Ser Cys Pro Ala Gly Gly Arg Pro Ala Asp 50 55 60 Arg Arg Phe Arg Pro Pro Thr Asn Leu Arg Ser Val Ser Pro Trp Ala 65 70 75 80 Tyr Arg Ile Ser Tyr Asp Pro Ala Arg Tyr Pro Arg Tyr Leu Pro Glu 85 90 95 Ala Tyr Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu Thr Gly Leu Phe Gly Glu Glu 100 105 110 Asp Val Arg Phe Arg Ser Ala Pro Val Tyr Met Pro Thr Val Val Leu 115 120 125 Arg Arg Thr Pro Ala Cys Ala Gly Gly Arg Ser Val Tyr Thr Glu Ala 130 135 140 Tyr Val Thr Ile Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Pro Glu Pro Glu Lys 145 150 155 160 Asp Ala Asp Ser Ile Asn Ser Ser Ile Asp Lys Gln Gly Ala Lys Leu 165 170 175 Leu Leu Gly Pro Asn Asp Ala Pro Ala Gly Pro 180 185 <210> 9 <211> 177 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Arg Glu Arg Pro Arg Leu Gly Glu Asp Ser Ser Leu Ile Ser Leu 1 5 10 15 Phe Leu Gln Val Val Ala Phe Leu Ala Met Val Met Gly Thr His Thr 20 25 30 Tyr Ser His Trp Pro Ser Cys Cys Pro Ser Lys Gly Gln Asp Thr Ser 35 40 45 Glu Glu Leu Leu Arg Trp Ser Thr Val Pro Val Pro Pro Leu Glu Pro 50 55 60 Ala Arg Pro Asn Arg His Pro Glu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asp Gly 65 70 75 80 Pro Leu Asn Ser Arg Ala Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Glu Leu Asp Arg 85 90 95 Asp Leu Asn Arg Leu Pro Gln Asp Leu Tyr His Ala Arg Cys Leu Cys 100 105 110 Pro His Cys Val Ser Leu Gln Thr Gly Ser His Met Asp Pro Arg Gly 115 120 125 Asn Ser Glu Leu Leu Tyr His Asn Gln Thr Val Phe Tyr Arg Arg Pro 130 135 140 Cys His Gly Glu Lys Gly Thr His Lys Gly Tyr Cys Leu Glu Arg Arg 145 150 155 160 Leu Tyr Arg Val Ser Leu Ala Cys Val Cys Val Arg Pro Arg Val Met 165 170 175 Gly <210> 10 <211> 148 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Thr His Thr Tyr Ser His Trp Pro Ser Cys Cys Pro Ser Lys Gly Gln 1 5 10 15 Asp Thr Ser Glu Glu Leu Leu Arg Trp Ser Thr Val Pro Val Pro Pro 20 25 30 Leu Glu Pro Ala Arg Pro Asn Arg His Pro Glu Ser Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Glu Asp Gly Pro Leu Asn Ser Arg Ala Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Glu 50 55 60 Leu Asp Arg Asp Leu Asn Arg Leu Pro Gln Asp Leu Tyr His Ala Arg 65 70 75 80 Cys Leu Cys Pro His Cys Val Ser Leu Gln Thr Gly Ser His Met Asp 85 90 95 Pro Arg Gly Asn Ser Glu Leu Leu Tyr His Asn Gln Thr Val Phe Tyr 100 105 110 Arg Arg Pro Cys His Gly Glu Lys Gly Thr His Lys Gly Tyr Cys Leu 115 120 125 Glu Arg Arg Leu Tyr Arg Val Ser Leu Ala Cys Val Cys Val Arg Pro 130 135 140 Arg Val Met Gly 145 <210> 11 <211> 163 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Thr Val Lys Thr Leu His Gly Pro Ala Met Val Lys Tyr Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ser Ile Leu Gly Leu Ala Phe Leu Ser Glu Ala Ala Ala Arg Lys 20 25 30 Ile Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln Lys Pro Glu Ser Cys Pro 35 40 45 Pro Val Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Asp Ile Gly Ile Ile Asn Glu 50 55 60 Asn Gln Arg Val Ser Met Ser Arg Asn Ile Glu Ser Arg Ser Thr Ser 65 70 75 80 Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr Trp Asp Pro Asn Arg Tyr Pro Ser Glu 85 90 95 Val Val Gln Ala Gln Cys Arg Asn Leu Gly Cys Ile Asn Ala Gln Gly 100 105 110 Lys Glu Asp Ile Ser Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Thr Leu 115 120 125 Val Val Arg Arg Lys His Gln Gly Cys Ser Val Ser Phe Gln Leu Glu 130 135 140 Lys Val Leu Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Val Ile His 145 150 155 160 His Val Gln <210> 12 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Arg Lys Ile Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln Lys Pro Glu Ser 1 5 10 15 Cys Pro Pro Val Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Asp Ile Gly Ile Ile 20 25 30 Asn Glu Asn Gln Arg Val Ser Met Ser Arg Asn Ile Glu Ser Arg Ser 35 40 45 Thr Ser Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr Trp Asp Pro Asn Arg Tyr Pro 50 55 60 Ser Glu Val Val Gln Ala Gln Cys Arg Asn Leu Gly Cys Ile Asn Ala 65 70 75 80 Gln Gly Lys Glu Asp Ile Ser Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu 85 90 95 Thr Leu Val Val Arg Arg Lys His Gln Gly Cys Ser Val Ser Phe Gln 100 105 110 Leu Glu Lys Val Leu Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Val 115 120 125 Ile His His Val Gln 130 <210> 13 <211> 866 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Gly Ala Ala Arg Ser Pro Pro Ser Ala Val Pro Gly Pro Leu Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ala Pro Gly Gly Ala Ser 20 25 30 Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Leu Val Cys Ser Gln Pro Gly Leu 35 40 45 Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His 50 55 60 Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu Gln Ile Gln Leu 65 70 75 80 His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro Val Ala His Ile 85 90 95 Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala 100 105 110 Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Arg 115 120 125 Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Arg Arg Trp Arg Phe 130 135 140 Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Asp Gln Glu Tyr Glu Val Thr 145 150 155 160 Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gln 165 170 175 Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu His Ala Arg Met Lys Val 180 185 190 Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr 195 200 205 Val Glu Thr Leu Glu Ala His Gln Leu Arg Val Ser Phe Thr Leu Trp 210 215 220 Asn Glu Ser Thr His Tyr Gln Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met 225 230 235 240 Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro Arg 245 250 255 Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr Leu Thr Leu Arg Asn 260 265 270 Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile Gln Pro Phe Phe Ser 275 280 285 Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr Val Ser Cys Pro 290 295 300 Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp Tyr Met Pro Leu Trp 305 310 315 320 Val Tyr Trp Phe Ile Thr Gly Ile Ser Ile Leu Leu Val Gly Ser Val 325 330 335 Ile Leu Leu Ile Val Cys Met Thr Trp Arg Leu Ala Gly Pro Gly Ser 340 345 350 Glu Lys Tyr Ser Asp Asp Thr Lys Tyr Thr Asp Gly Leu Pro Ala Ala 355 360 365 Asp Leu Ile Pro Pro Pro Leu Lys Pro Arg Lys Val Trp Ile Ile Tyr 370 375 380 Ser Ala Asp His Pro Leu Tyr Val Asp Val Val Leu Lys Phe Ala Gln 385 390 395 400 Phe Leu Leu Thr Ala Cys Gly Thr Glu Val Ala Leu Asp Leu Leu Glu 405 410 415 Glu Gln Ala Ile Ser Glu Ala Gly Val Met Thr Trp Val Gly Arg Gln 420 425 430 Lys Gln Glu Met Val Glu Ser Asn Ser Lys Ile Ile Val Leu Cys Ser 435 440 445 Arg Gly Thr Arg Ala Lys Trp Gln Ala Leu Leu Gly Arg Gly Ala Pro 450 455 460 Val Arg Leu Arg Cys Asp His Gly Lys Pro Val Gly Asp Leu Phe Thr 465 470 475 480 Ala Ala Met Asn Met Ile Leu Pro Asp Phe Lys Arg Pro Ala Cys Phe 485 490 495 Gly Thr Tyr Val Val Cys Tyr Phe Ser Glu Val Ser Cys Asp Gly Asp 500 505 510 Val Pro Asp Leu Phe Gly Ala Ala Pro Arg Tyr Pro Leu Met Asp Arg 515 520 525 Phe Glu Glu Val Tyr Phe Arg Ile Gln Asp Leu Glu Met Phe Gln Pro 530 535 540 Gly Arg Met His Arg Val Gly Glu Leu Ser Gly Asp Asn Tyr Leu Arg 545 550 555 560 Ser Pro Gly Gly Arg Gln Leu Arg Ala Ala Leu Asp Arg Phe Arg Asp 565 570 575 Trp Gln Val Arg Cys Pro Asp Trp Phe Glu Cys Glu Asn Leu Tyr Ser 580 585 590 Ala Asp Asp Gln Asp Ala Pro Ser Leu Asp Glu Glu Val Phe Glu Glu 595 600 605 Pro Leu Leu Pro Pro Gly Thr Gly Ile Val Lys Arg Ala Pro Leu Val 610 615 620 Arg Glu Pro Gly Ser Gln Ala Cys Leu Ala Ile Asp Pro Leu Val Gly 625 630 635 640 Glu Glu Gly Gly Ala Ala Val Ala Lys Leu Glu Pro His Leu Gln Pro 645 650 655 Arg Gly Gln Pro Ala Pro Gln Pro Leu His Thr Leu Val Leu Ala Ala 660 665 670 Glu Glu Gly Ala Leu Val Ala Ala Val Glu Pro Gly Pro Leu Ala Asp 675 680 685 Gly Ala Ala Val Arg Leu Ala Leu Ala Gly Glu Gly Glu Ala Cys Pro 690 695 700 Leu Leu Gly Ser Pro Gly Ala Gly Arg Asn Ser Val Leu Phe Leu Pro 705 710 715 720 Val Asp Pro Glu Asp Ser Pro Leu Gly Ser Ser Thr Pro Met Ala Ser 725 730 735 Pro Asp Leu Leu Pro Glu Asp Val Arg Glu His Leu Glu Gly Leu Met 740 745 750 Leu Ser Leu Phe Glu Gln Ser Leu Ser Cys Gln Ala Gln Gly Gly Cys 755 760 765 Ser Arg Pro Ala Met Val Leu Thr Asp Pro His Thr Pro Tyr Glu Glu 770 775 780 Glu Gln Arg Gln Ser Val Gln Ser Asp Gln Gly Tyr Ile Ser Arg Ser 785 790 795 800 Ser Pro Gln Pro Pro Glu Gly Leu Thr Glu Met Glu Glu Glu Glu Glu 805 810 815 Glu Glu Gln Asp Pro Gly Lys Pro Ala Leu Pro Leu Ser Pro Glu Asp 820 825 830 Leu Glu Ser Leu Arg Ser Leu Gln Arg Gln Leu Leu Phe Arg Gln Leu 835 840 845 Gln Lys Asn Ser Gly Trp Asp Thr Met Gly Ser Glu Ser Glu Gly Pro 850 855 860 Ser Ala 865 <210> 14 <211> 835 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ser Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Leu Val Cys Ser Gln Pro Gly 1 5 10 15 Leu Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile 20 25 30 His Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu Gln Ile Gln 35 40 45 Leu His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro Val Ala His 50 55 60 Ile Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly 65 70 75 80 Ala Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val 85 90 95 Arg Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Arg Arg Trp Arg 100 105 110 Phe Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Asp Gln Glu Tyr Glu Val 115 120 125 Thr Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His 130 135 140 Gln Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu His Ala Arg Met Lys 145 150 155 160 Val Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile 165 170 175 Thr Val Glu Thr Leu Glu Ala His Gln Leu Arg Val Ser Phe Thr Leu 180 185 190 Trp Asn Glu Ser Thr His Tyr Gln Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His 195 200 205 Met Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro 210 215 220 Arg Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr Leu Thr Leu Arg 225 230 235 240 Asn Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile Gln Pro Phe Phe 245 250 255 Ser Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr Val Ser Cys 260 265 270 Pro Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp Tyr Met Pro Leu 275 280 285 Trp Val Tyr Trp Phe Ile Thr Gly Ile Ser Ile Leu Leu Val Gly Ser 290 295 300 Val Ile Leu Leu Ile Val Cys Met Thr Trp Arg Leu Ala Gly Pro Gly 305 310 315 320 Ser Glu Lys Tyr Ser Asp Asp Thr Lys Tyr Thr Asp Gly Leu Pro Ala 325 330 335 Ala Asp Leu Ile Pro Pro Pro Leu Lys Pro Arg Lys Val Trp Ile Ile 340 345 350 Tyr Ser Ala Asp His Pro Leu Tyr Val Asp Val Val Leu Lys Phe Ala 355 360 365 Gln Phe Leu Leu Thr Ala Cys Gly Thr Glu Val Ala Leu Asp Leu Leu 370 375 380 Glu Glu Gln Ala Ile Ser Glu Ala Gly Val Met Thr Trp Val Gly Arg 385 390 395 400 Gln Lys Gln Glu Met Val Glu Ser Asn Ser Lys Ile Ile Val Leu Cys 405 410 415 Ser Arg Gly Thr Arg Ala Lys Trp Gln Ala Leu Leu Gly Arg Gly Ala 420 425 430 Pro Val Arg Leu Arg Cys Asp His Gly Lys Pro Val Gly Asp Leu Phe 435 440 445 Thr Ala Ala Met Asn Met Ile Leu Pro Asp Phe Lys Arg Pro Ala Cys 450 455 460 Phe Gly Thr Tyr Val Val Cys Tyr Phe Ser Glu Val Ser Cys Asp Gly 465 470 475 480 Asp Val Pro Asp Leu Phe Gly Ala Ala Pro Arg Tyr Pro Leu Met Asp 485 490 495 Arg Phe Glu Glu Val Tyr Phe Arg Ile Gln Asp Leu Glu Met Phe Gln 500 505 510 Pro Gly Arg Met His Arg Val Gly Glu Leu Ser Gly Asp Asn Tyr Leu 515 520 525 Arg Ser Pro Gly Gly Arg Gln Leu Arg Ala Ala Leu Asp Arg Phe Arg 530 535 540 Asp Trp Gln Val Arg Cys Pro Asp Trp Phe Glu Cys Glu Asn Leu Tyr 545 550 555 560 Ser Ala Asp Asp Gln Asp Ala Pro Ser Leu Asp Glu Glu Val Phe Glu 565 570 575 Glu Pro Leu Leu Pro Pro Gly Thr Gly Ile Val Lys Arg Ala Pro Leu 580 585 590 Val Arg Glu Pro Gly Ser Gln Ala Cys Leu Ala Ile Asp Pro Leu Val 595 600 605 Gly Glu Glu Gly Gly Ala Ala Val Ala Lys Leu Glu Pro His Leu Gln 610 615 620 Pro Arg Gly Gln Pro Ala Pro Gln Pro Leu His Thr Leu Val Leu Ala 625 630 635 640 Ala Glu Glu Gly Ala Leu Val Ala Ala Val Glu Pro Gly Pro Leu Ala 645 650 655 Asp Gly Ala Ala Val Arg Leu Ala Leu Ala Gly Glu Gly Glu Ala Cys 660 665 670 Pro Leu Leu Gly Ser Pro Gly Ala Gly Arg Asn Ser Val Leu Phe Leu 675 680 685 Pro Val Asp Pro Glu Asp Ser Pro Leu Gly Ser Ser Thr Pro Met Ala 690 695 700 Ser Pro Asp Leu Leu Pro Glu Asp Val Arg Glu His Leu Glu Gly Leu 705 710 715 720 Met Leu Ser Leu Phe Glu Gln Ser Leu Ser Cys Gln Ala Gln Gly Gly 725 730 735 Cys Ser Arg Pro Ala Met Val Leu Thr Asp Pro His Thr Pro Tyr Glu 740 745 750 Glu Glu Gln Arg Gln Ser Val Gln Ser Asp Gln Gly Tyr Ile Ser Arg 755 760 765 Ser Ser Pro Gln Pro Pro Glu Gly Leu Thr Glu Met Glu Glu Glu Glu 770 775 780 Glu Glu Glu Gln Asp Pro Gly Lys Pro Ala Leu Pro Leu Ser Pro Glu 785 790 795 800 Asp Leu Glu Ser Leu Arg Ser Leu Gln Arg Gln Leu Leu Phe Arg Gln 805 810 815 Leu Gln Lys Asn Ser Gly Trp Asp Thr Met Gly Ser Glu Ser Glu Gly 820 825 830 Pro Ser Ala 835 <210> 15 <211> 502 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Ser Leu Val Leu Leu Ser Leu Ala Ala Leu Cys Arg Ser Ala Val 1 5 10 15 Pro Arg Glu Pro Thr Val Gln Cys Gly Ser Glu Thr Gly Pro Ser Pro 20 25 30 Glu Trp Met Leu Gln His Asp Leu Ile Pro Gly Asp Leu Arg Asp Leu 35 40 45 Arg Val Glu Pro Val Thr Thr Ser Val Ala Thr Gly Asp Tyr Ser Ile 50 55 60 Leu Met Asn Val Ser Trp Val Leu Arg Ala Asp Ala Ser Ile Arg Leu 65 70 75 80 Leu Lys Ala Thr Lys Ile Cys Val Thr Gly Lys Ser Asn Phe Gln Ser 85 90 95 Tyr Ser Cys Val Arg Cys Asn Tyr Thr Glu Ala Phe Gln Thr Gln Thr 100 105 110 Arg Pro Ser Gly Gly Lys Trp Thr Phe Ser Tyr Ile Gly Phe Pro Val 115 120 125 Glu Leu Asn Thr Val Tyr Phe Ile Gly Ala His Asn Ile Pro Asn Ala 130 135 140 Asn Met Asn Glu Asp Gly Pro Ser Met Ser Val Asn Phe Thr Ser Pro 145 150 155 160 Gly Cys Leu Asp His Ile Met Lys Tyr Lys Lys Lys Cys Val Lys Ala 165 170 175 Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr Ala Cys Lys Lys Asn Glu Glu 180 185 190 Thr Val Glu Val Asn Phe Thr Thr Thr Pro Leu Gly Asn Arg Tyr Met 195 200 205 Ala Leu Ile Gln His Ser Thr Ile Ile Gly Phe Ser Gln Val Phe Glu 210 215 220 Pro His Gln Lys Lys Gln Thr Arg Ala Ser Val Val Ile Pro Val Thr 225 230 235 240 Gly Asp Ser Glu Gly Ala Thr Val Gln Leu Thr Pro Tyr Phe Pro Thr 245 250 255 Cys Gly Ser Asp Cys Ile Arg His Lys Gly Thr Val Val Leu Cys Pro 260 265 270 Gln Thr Gly Val Pro Phe Pro Leu Asp Asn Asn Lys Ser Lys Pro Gly 275 280 285 Gly Trp Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Val Ala Thr Trp Val 290 295 300 Leu Val Ala Gly Ile Tyr Leu Met Trp Arg His Glu Arg Ile Lys Lys 305 310 315 320 Thr Ser Phe Ser Thr Thr Thr Leu Leu Pro Pro Ile Lys Val Leu Val 325 330 335 Val Tyr Pro Ser Glu Ile Cys Phe His His Thr Ile Cys Tyr Phe Thr 340 345 350 Glu Phe Leu Gln Asn His Cys Arg Ser Glu Val Ile Leu Glu Lys Trp 355 360 365 Gln Lys Lys Lys Ile Ala Glu Met Gly Pro Val Gln Trp Leu Ala Thr 370 375 380 Gln Lys Lys Ala Ala Asp Lys Val Val Phe Leu Leu Ser Asn Asp Val 385 390 395 400 Asn Ser Val Cys Asp Gly Thr Cys Gly Lys Ser Glu Gly Ser Pro Ser 405 410 415 Glu Asn Ser Gln Asp Leu Phe Pro Leu Ala Phe Asn Leu Phe Cys Ser 420 425 430 Asp Leu Arg Ser Gln Ile His Leu His Lys Tyr Val Val Val Tyr Phe 435 440 445 Arg Glu Ile Asp Thr Lys Asp Asp Tyr Asn Ala Leu Ser Val Cys Pro 450 455 460 Lys Tyr His Leu Met Lys Asp Ala Thr Ala Phe Cys Ala Glu Leu Leu 465 470 475 480 His Val Lys Gln Gln Val Ser Ala Gly Lys Arg Ser Gln Ala Cys His 485 490 495 Asp Gly Cys Cys Ser Leu 500 <210> 16 <211> 791 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Pro Val Pro Trp Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Arg Ser Pro 1 5 10 15 Val Val Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His 20 25 30 Cys Ser Pro Val Ser Leu Glu Pro Trp Gly Asp Glu Glu Arg Leu Arg 35 40 45 Val Gln Phe Leu Ala Gln Gln Ser Leu Ser Leu Ala Pro Val Thr Ala 50 55 60 Ala Thr Ala Arg Thr Ala Leu Ser Gly Leu Ser Gly Ala Asp Gly Arg 65 70 75 80 Arg Glu Glu Arg Gly Arg Gly Lys Ser Trp Val Cys Leu Ser Leu Gly 85 90 95 Gly Ser Gly Asn Thr Glu Pro Gln Lys Lys Gly Leu Ser Cys Arg Leu 100 105 110 Trp Asp Ser Asp Ile Leu Cys Leu Pro Gly Asp Ile Val Pro Ala Pro 115 120 125 Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr His Leu Gln Thr Glu Leu Val Leu Arg 130 135 140 Cys Gln Lys Glu Thr Asp Cys Asp Leu Cys Leu Arg Val Ala Val His 145 150 155 160 Leu Ala Val His Gly His Trp Glu Glu Pro Glu Asp Glu Glu Lys Phe 165 170 175 Gly Gly Ala Ala Asp Ser Gly Val Glu Glu Pro Arg Asn Ala Ser Leu 180 185 190 Gln Ala Gln Val Val Leu Ser Phe Gln Ala Tyr Pro Thr Ala Arg Cys 195 200 205 Val Leu Leu Glu Val Gln Val Pro Ala Ala Leu Val Gln Phe Gly Gln 210 215 220 Ser Val Gly Ser Val Val Tyr Asp Cys Phe Glu Ala Ala Leu Gly Ser 225 230 235 240 Glu Val Arg Ile Trp Ser Tyr Thr Gln Pro Arg Tyr Glu Lys Glu Leu 245 250 255 Asn His Thr Gln Gln Leu Pro Asp Cys Arg Gly Leu Glu Val Trp Asn 260 265 270 Ser Ile Pro Ser Cys Trp Ala Leu Pro Trp Leu Asn Val Ser Ala Asp 275 280 285 Gly Asp Asn Val His Leu Val Leu Asn Val Ser Glu Glu Gln His Phe 290 295 300 Gly Leu Ser Leu Tyr Trp Asn Gln Val Gln Gly Pro Pro Lys Pro Arg 305 310 315 320 Trp His Lys Asn Leu Thr Gly Pro Gln Ile Ile Thr Leu Asn His Thr 325 330 335 Asp Leu Val Pro Cys Leu Cys Ile Gln Val Trp Pro Leu Glu Pro Asp 340 345 350 Ser Val Arg Thr Asn Ile Cys Pro Phe Arg Glu Asp Pro Arg Ala His 355 360 365 Gln Asn Leu Trp Gln Ala Ala Arg Leu Gln Leu Leu Thr Leu Gln Ser 370 375 380 Trp Leu Leu Asp Ala Pro Cys Ser Leu Pro Ala Glu Ala Ala Leu Cys 385 390 395 400 Trp Arg Ala Pro Gly Gly Asp Pro Cys Gln Pro Leu Val Pro Pro Leu 405 410 415 Ser Trp Glu Asn Val Thr Val Asp Lys Val Leu Glu Phe Pro Leu Leu 420 425 430 Lys Gly His Pro Asn Leu Cys Val Gln Val Asn Ser Ser Glu Lys Leu 435 440 445 Gln Leu Gln Glu Cys Leu Trp Ala Asp Ser Leu Gly Pro Leu Lys Asp 450 455 460 Asp Val Leu Leu Leu Glu Thr Arg Gly Pro Gln Asp Asn Arg Ser Leu 465 470 475 480 Cys Ala Leu Glu Pro Ser Gly Cys Thr Ser Leu Pro Ser Lys Ala Ser 485 490 495 Thr Arg Ala Ala Arg Leu Gly Glu Tyr Leu Leu Gln Asp Leu Gln Ser 500 505 510 Gly Gln Cys Leu Gln Leu Trp Asp Asp Asp Leu Gly Ala Leu Trp Ala 515 520 525 Cys Pro Met Asp Lys Tyr Ile His Lys Arg Trp Ala Leu Val Trp Leu 530 535 540 Ala Cys Leu Leu Phe Ala Ala Ala Leu Ser Leu Ile Leu Leu Leu Lys 545 550 555 560 Lys Asp His Ala Lys Gly Trp Leu Arg Leu Leu Lys Gln Asp Val Arg 565 570 575 Ser Gly Ala Ala Ala Arg Gly Arg Ala Ala Leu Leu Leu Tyr Ser Ala 580 585 590 Asp Asp Ser Gly Phe Glu Arg Leu Val Gly Ala Leu Ala Ser Ala Leu 595 600 605 Cys Gln Leu Pro Leu Arg Val Ala Val Asp Leu Trp Ser Arg Arg Glu 610 615 620 Leu Ser Ala Gln Gly Pro Val Ala Trp Phe His Ala Gln Arg Arg Gln 625 630 635 640 Thr Leu Gln Glu Gly Gly Val Val Val Leu Leu Phe Ser Pro Gly Ala 645 650 655 Val Ala Leu Cys Ser Glu Trp Leu Gln Asp Gly Val Ser Gly Pro Gly 660 665 670 Ala His Gly Pro His Asp Ala Phe Arg Ala Ser Leu Ser Cys Val Leu 675 680 685 Pro Asp Phe Leu Gln Gly Arg Ala Pro Gly Ser Tyr Val Gly Ala Cys 690 695 700 Phe Asp Arg Leu Leu His Pro Asp Ala Val Pro Ala Leu Phe Arg Thr 705 710 715 720 Val Pro Val Phe Thr Leu Pro Ser Gln Leu Pro Asp Phe Leu Gly Ala 725 730 735 Leu Gln Gln Pro Arg Ala Pro Arg Ser Gly Arg Leu Gln Glu Arg Ala 740 745 750 Glu Gln Val Ser Arg Ala Leu Gln Pro Ala Leu Asp Ser Tyr Phe His 755 760 765 Pro Pro Gly Thr Pro Ala Pro Gly Arg Gly Val Gly Pro Gly Ala Gly 770 775 780 Pro Gly Ala Gly Asp Gly Thr 785 790 <210> 17 <211> 195 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys 1 5 10 15 Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn 20 25 30 Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr 35 40 45 Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser 50 55 60 Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp 65 70 75 80 Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile 85 90 95 Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 100 105 110 Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val 115 120 125 His His Val Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Gly Gly Leu Glu Val 130 135 140 Leu Phe Gln Gly Pro Glu Phe Gly Gly Ser Thr Thr Ala Pro Ser Ala 145 150 155 160 Gln Leu Glu Lys Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Asn Ala Gln Leu 165 170 175 Glu Trp Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala Gln His His His 180 185 190 His His His 195 <210> 18 <211> 195 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys 1 5 10 15 Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn 20 25 30 Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr 35 40 45 Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser 50 55 60 Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp 65 70 75 80 Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile 85 90 95 Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 100 105 110 Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val 115 120 125 His His Val Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Gly Gly Leu Glu Val 130 135 140 Leu Phe Gln Gly Pro Glu Phe Gly Gly Ser Thr Thr Ala Pro Ser Ala 145 150 155 160 Gln Leu Lys Lys Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Asn Ala Gln Leu 165 170 175 Lys Trp Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Leu Ala Gln His His His 180 185 190 His His His 195 <210> 19 <211> 302 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys 1 5 10 15 Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn 20 25 30 Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr 35 40 45 Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser 50 55 60 Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp 65 70 75 80 Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile 85 90 95 Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 100 105 110 Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val 115 120 125 His His Val Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Ser Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser 165 170 175 Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His 180 185 190 Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn 195 200 205 Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg 210 215 220 Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile 225 230 235 240 Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln 245 250 255 Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser 260 265 270 Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr 275 280 285 Pro Ile Val His His Val Ala Ser His His His His His His 290 295 300 <210> 20 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys 1 5 10 15 Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn 20 25 30 Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr 35 40 45 Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser 50 55 60 Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp 65 70 75 80 Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile 85 90 95 Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 100 105 110 Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val 115 120 125 His His Val Ala 130 <210> 21 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys 1 5 10 15 Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn 20 25 30 Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Glu Ser Thr 35 40 45 Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser 50 55 60 Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp 65 70 75 80 Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile 85 90 95 Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 100 105 110 Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val 115 120 125 His His Val Ala 130 <210> 22 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys 1 5 10 15 Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn 20 25 30 Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Glu Ser Thr 35 40 45 Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Lys 50 55 60 Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp 65 70 75 80 Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile 85 90 95 Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 100 105 110 Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val 115 120 125 His His Val Ala 130 <210> 23 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys 1 5 10 15 Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn 20 25 30 Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Glu Ser Thr 35 40 45 Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Trp 50 55 60 Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp 65 70 75 80 Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile 85 90 95 Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 100 105 110 Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val 115 120 125 His His Val Ala 130 <210> 24 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys 1 5 10 15 Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn 20 25 30 Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Glu Ser Thr 35 40 45 Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser 50 55 60 Val Ile Gln Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp 65 70 75 80 Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile 85 90 95 Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 100 105 110 Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val 115 120 125 His His Val Ala 130 <210> 25 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys 1 5 10 15 Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn 20 25 30 Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Glu Ser Thr 35 40 45 Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser 50 55 60 Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp 65 70 75 80 Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile 85 90 95 Leu Val Leu Arg Ala Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 100 105 110 Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val 115 120 125 His His Val Ala 130 <210> 26 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys 1 5 10 15 Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn 20 25 30 Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr 35 40 45 Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser 50 55 60 Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp 65 70 75 80 Gly Asn Val Asp Tyr His Met Ala Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile 85 90 95 Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 100 105 110 Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val 115 120 125 His His Val Ala 130 <210> 27 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys 1 5 10 15 Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn 20 25 30 Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr 35 40 45 Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser 50 55 60 Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp 65 70 75 80 Gly Asn Val Asp Tyr His Met Ala Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile 85 90 95 Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 100 105 110 Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro 115 120 125 <210> 28 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Arg Lys Ile Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln Lys Pro Glu Ser 1 5 10 15 Cys Pro Pro Val Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Asp Ile Gly Ile Ile 20 25 30 Asn Glu Asn Gln Arg Val Ser Met Ser Arg Asn Ile Glu Ser Glu Ser 35 40 45 Thr Ser Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr Trp Asp Pro Asn Arg Tyr Pro 50 55 60 Ser Glu Val Val Gln Ala Gln Cys Arg Asn Leu Gly Cys Ile Asn Ala 65 70 75 80 Gln Gly Lys Glu Asp Ile Ser Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu 85 90 95 Thr Leu Val Val Arg Arg Lys His Gln Gly Cys Ser Val Ser Phe Gln 100 105 110 Leu Glu Lys Val Leu Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Val 115 120 125 Ile His His Val Gln 130 <210> 29 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Arg Lys Ile Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln Lys Pro Glu Ser 1 5 10 15 Cys Pro Pro Val Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Asp Ile Gly Ile Ile 20 25 30 Asn Glu Asn Gln Arg Val Ser Met Ser Arg Asn Ile Glu Ser Glu Ser 35 40 45 Thr Ser Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr Trp Asp Pro Asn Arg Tyr Pro 50 55 60 Lys Glu Val Val Gln Ala Gln Cys Arg Asn Leu Gly Cys Ile Asn Ala 65 70 75 80 Gln Gly Lys Glu Asp Ile Ser Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu 85 90 95 Thr Leu Val Val Arg Arg Lys His Gln Gly Cys Ser Val Ser Phe Gln 100 105 110 Leu Glu Lys Val Leu Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Val 115 120 125 Ile His His Val 130 <210> 30 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Arg Lys Ile Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln Lys Pro Glu Ser 1 5 10 15 Cys Pro Pro Val Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Asp Ile Gly Ile Ile 20 25 30 Asn Glu Asn Gln Arg Val Ser Met Ser Arg Asn Ile Glu Ser Glu Ser 35 40 45 Thr Ser Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr Trp Asp Pro Asn Arg Tyr Pro 50 55 60 Trp Glu Val Val Gln Ala Gln Cys Arg Asn Leu Gly Cys Ile Asn Ala 65 70 75 80 Gln Gly Lys Glu Asp Ile Ser Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu 85 90 95 Thr Leu Val Val Arg Arg Lys His Gln Gly Cys Ser Val Ser Phe Gln 100 105 110 Leu Glu Lys Val Leu Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Val 115 120 125 Ile His His Val Gln 130 <210> 31 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Arg Lys Ile Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln Lys Pro Glu Ser 1 5 10 15 Cys Pro Pro Val Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Asp Ile Gly Ile Ile 20 25 30 Asn Glu Asn Gln Arg Val Ser Met Ser Arg Asn Ile Glu Ser Glu Ser 35 40 45 Thr Ser Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr Trp Asp Pro Asn Arg Tyr Pro 50 55 60 Ser Glu Val Gln Gln Ala Gln Cys Arg Asn Leu Gly Cys Ile Asn Ala 65 70 75 80 Gln Gly Lys Glu Asp Ile Ser Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu 85 90 95 Thr Leu Val Val Arg Arg Lys His Gln Gly Cys Ser Val Ser Phe Gln 100 105 110 Leu Glu Lys Val Leu Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Val 115 120 125 Ile His His Val Gln 130 <210> 32 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Arg Lys Ile Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln Lys Pro Glu Ser 1 5 10 15 Cys Pro Pro Val Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Asp Ile Gly Ile Ile 20 25 30 Asn Glu Asn Gln Arg Val Ser Met Ser Arg Asn Ile Glu Ser Glu Ser 35 40 45 Thr Ser Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr Trp Asp Pro Asn Arg Tyr Pro 50 55 60 Ser Glu Val Val Gln Ala Gln Cys Arg Asn Leu Gly Cys Ile Asn Ala 65 70 75 80 Gln Gly Lys Glu Asp Ile Ser Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu 85 90 95 Thr Leu Val Val Arg Ala Lys His Gln Gly Cys Ser Val Ser Phe Gln 100 105 110 Leu Glu Lys Val Leu Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Val 115 120 125 Ile His His Val Gln 130 <210> 33 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Arg Lys Ile Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln Lys Pro Glu Ser 1 5 10 15 Cys Pro Pro Val Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Asp Ile Gly Ile Ile 20 25 30 Asn Glu Asn Gln Arg Val Ser Met Ser Arg Asn Ile Glu Ser Glu Ser 35 40 45 Thr Ser Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr Trp Asp Pro Asn Arg Tyr Pro 50 55 60 Ser Glu Val Val Gln Ala Gln Cys Arg Asn Leu Gly Cys Ile Asn Ala 65 70 75 80 Gln Gly Lys Glu Asp Ile Ser Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu 85 90 95 Thr Leu Val Val Arg Ala Lys His Gln Gly Cys Ser Val Ser Phe Gln 100 105 110 Leu Glu Lys Val Leu Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Val 115 120 125 Ile His His Val Gln 130 <210> 34 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys Gly Gln Gly Arg Pro Gly Pro Leu 1 5 10 15 Ala Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp Leu Val Ser Arg Met Lys 20 25 30 Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Glu Met Val 35 40 45 Ala Gln Leu Arg Asn Ser Ser Glu Leu Ala Gln Arg Lys Cys Glu Val 50 55 60 Asn Leu Gln Leu Trp Met Ser Asn Lys Glu Ser Leu Ser Pro Trp Gly 65 70 75 80 Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile Pro Val Asp Leu Pro Glu 85 90 95 Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn Pro Phe Thr Met Gln Glu 100 105 110 Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe Ser Gln Val Pro Val Arg 115 120 125 Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr Gly Pro Cys Arg Gln Arg 130 135 140 Ala Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys Thr Cys Ile Phe 145 150 155 <210> 35 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys Gly Gln Gly Arg Pro Gly Pro Leu 1 5 10 15 Ala Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp Leu Val Ser Arg Met Lys 20 25 30 Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Glu Met Val 35 40 45 Ala Gln Leu Arg Asn Ser Ser Glu Leu Ala Gln Arg Lys Cys Glu Val 50 55 60 Asn Leu Gln Leu Trp Met Ser Asn Lys Glu Ser Leu Ser Pro Trp Gly 65 70 75 80 Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile Pro Val Asp Leu Pro Glu 85 90 95 Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn Pro Phe Thr Met Gln Glu 100 105 110 Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe Ser Gln Val Pro Val Arg 115 120 125 Arg Ala Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr Gly Pro Cys Arg Gln Arg 130 135 140 Ala Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys Thr Cys Ile Phe 145 150 155 <210> 36 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys Gly Gln Gly Arg Pro Gly Pro Leu 1 5 10 15 Ala Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp Leu Val Ser Arg Met Lys 20 25 30 Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Glu Met Val 35 40 45 Ala Gln Leu Arg Asn Ser Ser Glu Leu Ala Gln Arg Lys Cys Glu Val 50 55 60 Asn Leu Gln Leu Trp Met Ser Asn Lys Arg Ser Leu Ser Pro Trp Gly 65 70 75 80 Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile Pro Val Asp Leu Pro Glu 85 90 95 Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn Pro Phe Thr Met Gln Glu 100 105 110 Asp Arg Ser Met Ala Ser Val Pro Val Phe Ser Gln Val Pro Val Arg 115 120 125 Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr Gly Pro Cys Arg Gln Arg 130 135 140 Ala Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys Thr Cys Ile Phe 145 150 155 <210> 37 <211> 179 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 His His Asp Pro Ser Leu Arg Gly His Pro His Ser His Gly Thr Pro 1 5 10 15 His Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Leu Gly Gln Ala Pro Pro His 20 25 30 Leu Leu Ala Arg Gly Ala Lys Trp Gly Gln Ala Leu Pro Val Ala Leu 35 40 45 Val Ser Ser Leu Glu Ala Ala Ser His Arg Gly Arg His Glu Arg Pro 50 55 60 Ser Ala Thr Thr Gln Cys Pro Val Leu Arg Pro Glu Glu Val Leu Glu 65 70 75 80 Ala Asp Thr His Gln Glu Ser Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Arg Val Asp 85 90 95 Thr Asp Glu Asp Arg Tyr Pro Gln Lys Leu Ala Phe Ala Glu Cys Leu 100 105 110 Cys Arg Gly Cys Ile Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala Ala Leu 115 120 125 Asn Ser Val Arg Leu Leu Gln Ser Leu Leu Val Leu Arg Arg Arg Pro 130 135 140 Cys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe Ala Phe 145 150 155 160 His Thr Glu Phe Ile His Val Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Leu Pro 165 170 175 Arg Ser Val <210> 38 <211> 179 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 His His Asp Pro Ser Leu Arg Gly His Pro His Ser His Gly Thr Pro 1 5 10 15 His Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Leu Gly Gln Ala Pro Pro His 20 25 30 Leu Leu Ala Arg Gly Ala Lys Trp Gly Gln Ala Leu Pro Val Ala Leu 35 40 45 Val Ser Ser Leu Glu Ala Ala Ser His Arg Gly Arg His Glu Arg Pro 50 55 60 Ser Ala Thr Thr Gln Cys Pro Val Leu Arg Pro Glu Glu Val Leu Glu 65 70 75 80 Ala Asp Thr His Gln Glu Ser Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Arg Val Asp 85 90 95 Thr Asp Glu Asp Arg Tyr Pro Gln Lys Leu Ala Phe Ala Glu Cys Leu 100 105 110 Cys Arg Gly Cys Ile Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala Ala Leu 115 120 125 Asn Ser Val Arg Leu Leu Gln Ser Leu Leu Val Leu Arg Ala Arg Pro 130 135 140 Cys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe Ala Phe 145 150 155 160 His Thr Glu Phe Ile His Val Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Leu Pro 165 170 175 Arg Ser Val <210> 39 <211> 179 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 His His Asp Pro Ser Leu Arg Gly His Pro His Ser His Gly Thr Pro 1 5 10 15 His Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Leu Gly Gln Ala Pro Pro His 20 25 30 Leu Leu Ala Arg Gly Ala Lys Trp Gly Gln Ala Leu Pro Val Ala Leu 35 40 45 Val Ser Ser Leu Glu Ala Ala Ser His Arg Gly Arg His Glu Arg Pro 50 55 60 Ser Ala Thr Thr Gln Cys Pro Val Leu Arg Pro Glu Glu Val Leu Glu 65 70 75 80 Ala Asp Thr His Gln Arg Ser Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Arg Val Asp 85 90 95 Thr Asp Glu Asp Arg Tyr Pro Gln Lys Leu Ala Phe Ala Glu Cys Leu 100 105 110 Cys Arg Gly Cys Ile Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala Ala Leu 115 120 125 Ala Ser Val Arg Leu Leu Gln Ser Leu Leu Val Leu Arg Arg Arg Pro 130 135 140 Cys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe Ala Phe 145 150 155 160 His Thr Glu Phe Ile His Val Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Leu Pro 165 170 175 Arg Ser Val <210> 40 <211> 187 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Ala Gly Ala Pro Arg Ala Gly Arg Arg Pro Ala Arg Pro Arg Gly Cys 1 5 10 15 Ala Asp Arg Pro Glu Glu Leu Leu Glu Gln Leu Tyr Gly Arg Leu Ala 20 25 30 Ala Gly Val Leu Ser Ala Phe His His Thr Leu Gln Leu Gly Pro Arg 35 40 45 Glu Gln Ala Arg Asn Ala Ser Cys Pro Ala Gly Gly Arg Pro Ala Asp 50 55 60 Arg Arg Phe Arg Pro Pro Thr Asn Leu Glu Ser Val Ser Pro Trp Ala 65 70 75 80 Tyr Arg Ile Ser Tyr Asp Pro Ala Arg Tyr Pro Arg Tyr Leu Pro Glu 85 90 95 Ala Tyr Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu Thr Gly Leu Phe Gly Glu Glu 100 105 110 Asp Val Arg Phe Arg Ser Ala Pro Val Tyr Met Pro Thr Val Val Leu 115 120 125 Arg Arg Thr Pro Ala Cys Ala Gly Gly Arg Ser Val Tyr Thr Glu Ala 130 135 140 Tyr Val Thr Ile Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Pro Glu Pro Glu Lys 145 150 155 160 Asp Ala Asp Ser Ile Asn Ser Ser Ile Asp Lys Gln Gly Ala Lys Leu 165 170 175 Leu Leu Gly Pro Asn Asp Ala Pro Ala Gly Pro 180 185 <210> 41 <211> 187 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Ala Gly Ala Pro Arg Ala Gly Arg Arg Pro Ala Arg Pro Arg Gly Cys 1 5 10 15 Ala Asp Arg Pro Glu Glu Leu Leu Glu Gln Leu Tyr Gly Arg Leu Ala 20 25 30 Ala Gly Val Leu Ser Ala Phe His His Thr Leu Gln Leu Gly Pro Arg 35 40 45 Glu Gln Ala Arg Asn Ala Ser Cys Pro Ala Gly Gly Arg Pro Ala Asp 50 55 60 Arg Arg Phe Arg Pro Pro Thr Asn Leu Glu Ser Val Ser Pro Trp Ala 65 70 75 80 Tyr Arg Ile Ser Tyr Asp Pro Ala Arg Tyr Pro Arg Tyr Leu Pro Glu 85 90 95 Ala Tyr Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu Thr Gly Leu Phe Gly Glu Glu 100 105 110 Asp Val Arg Phe Arg Ser Ala Pro Val Tyr Met Pro Thr Val Val Leu 115 120 125 Arg Ala Thr Pro Ala Cys Ala Gly Gly Arg Ser Val Tyr Thr Glu Ala 130 135 140 Tyr Val Thr Ile Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Pro Glu Pro Glu Lys 145 150 155 160 Asp Ala Asp Ser Ile Asn Ser Ser Ile Asp Lys Gln Gly Ala Lys Leu 165 170 175 Leu Leu Gly Pro Asn Asp Ala Pro Ala Gly Pro 180 185 <210> 42 <211> 187 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Ala Gly Ala Pro Arg Ala Gly Arg Arg Pro Ala Arg Pro Arg Gly Cys 1 5 10 15 Ala Asp Arg Pro Glu Glu Leu Leu Glu Gln Leu Tyr Gly Arg Leu Ala 20 25 30 Ala Gly Val Leu Ser Ala Phe His His Thr Leu Gln Leu Gly Pro Arg 35 40 45 Glu Gln Ala Arg Asn Ala Ser Cys Pro Ala Gly Gly Arg Pro Ala Asp 50 55 60 Arg Arg Phe Arg Pro Pro Thr Asn Leu Arg Ser Val Ser Pro Trp Ala 65 70 75 80 Tyr Arg Ile Ser Tyr Asp Pro Ala Arg Tyr Pro Arg Tyr Leu Pro Glu 85 90 95 Ala Tyr Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu Thr Gly Leu Phe Gly Glu Glu 100 105 110 Asp Val Arg Phe Ala Ser Ala Pro Val Tyr Met Pro Thr Val Val Leu 115 120 125 Arg Arg Thr Pro Ala Cys Ala Gly Gly Arg Ser Val Tyr Thr Glu Ala 130 135 140 Tyr Val Thr Ile Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Pro Glu Pro Glu Lys 145 150 155 160 Asp Ala Asp Ser Ile Asn Ser Ser Ile Asp Lys Gln Gly Ala Lys Leu 165 170 175 Leu Leu Gly Pro Asn Asp Ala Pro Ala Gly Pro 180 185 <210> 43 <211> 148 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Thr His Thr Tyr Ser His Trp Pro Ser Cys Cys Pro Ser Lys Gly Gln 1 5 10 15 Asp Thr Ser Glu Glu Leu Leu Arg Trp Ser Thr Val Pro Val Pro Pro 20 25 30 Leu Glu Pro Ala Arg Pro Asn Arg His Pro Glu Ser Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Glu Asp Gly Pro Leu Asn Ser Glu Ala Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Glu 50 55 60 Leu Asp Arg Asp Leu Asn Arg Leu Pro Gln Asp Leu Tyr His Ala Arg 65 70 75 80 Cys Leu Cys Pro His Cys Val Ser Leu Gln Thr Gly Ser His Met Asp 85 90 95 Pro Arg Gly Asn Ser Glu Leu Leu Tyr His Asn Gln Thr Val Phe Tyr 100 105 110 Arg Arg Pro Cys His Gly Glu Lys Gly Thr His Lys Gly Tyr Cys Leu 115 120 125 Glu Arg Arg Leu Tyr Arg Val Ser Leu Ala Cys Val Cys Val Arg Pro 130 135 140 Arg Val Met Gly 145 <210> 44 <211> 148 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Thr His Thr Tyr Ser His Trp Pro Ser Cys Cys Pro Ser Lys Gly Gln 1 5 10 15 Asp Thr Ser Glu Glu Leu Leu Arg Trp Ser Thr Val Pro Val Pro Pro 20 25 30 Leu Glu Pro Ala Arg Pro Asn Arg His Pro Glu Ser Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Glu Asp Gly Pro Leu Asn Ser Glu Ala Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Glu 50 55 60 Leu Asp Arg Asp Leu Asn Arg Leu Pro Gln Asp Leu Tyr His Ala Arg 65 70 75 80 Cys Leu Cys Pro His Cys Val Ser Leu Gln Thr Gly Ser His Met Asp 85 90 95 Pro Arg Gly Asn Ser Glu Leu Leu Tyr His Asn Gln Thr Val Phe Tyr 100 105 110 Ala Arg Pro Cys His Gly Glu Lys Gly Thr His Lys Gly Tyr Cys Leu 115 120 125 Glu Arg Arg Leu Tyr Arg Val Ser Leu Ala Cys Val Cys Val Arg Pro 130 135 140 Arg Val Met Gly 145 <210> 45 <211> 148 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Thr His Thr Tyr Ser His Trp Pro Ser Cys Cys Pro Ser Lys Gly Gln 1 5 10 15 Asp Thr Ser Glu Glu Leu Leu Arg Trp Ser Thr Val Pro Val Pro Pro 20 25 30 Leu Glu Pro Ala Arg Pro Asn Arg His Pro Glu Ser Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Glu Asp Gly Pro Leu Asn Ser Arg Ala Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Glu 50 55 60 Leu Asp Arg Asp Leu Asn Arg Leu Pro Gln Asp Leu Tyr His Ala Arg 65 70 75 80 Cys Leu Cys Pro His Cys Val Ser Leu Gln Thr Gly Ser His Met Asp 85 90 95 Pro Arg Gly Ala Ser Glu Leu Leu Tyr His Asn Gln Thr Val Phe Tyr 100 105 110 Arg Arg Pro Cys His Gly Glu Lys Gly Thr His Lys Gly Tyr Cys Leu 115 120 125 Glu Arg Arg Leu Tyr Arg Val Ser Leu Ala Cys Val Cys Val Arg Pro 130 135 140 Arg Val Met Gly 145 <210> 46 <211> 297 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys 1 5 10 15 Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn 20 25 30 Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Glu Ser Thr 35 40 45 Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Lys 50 55 60 Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp 65 70 75 80 Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile 85 90 95 Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 100 105 110 Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val 115 120 125 His His Val Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Ser Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser 165 170 175 Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His 180 185 190 Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn 195 200 205 Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg 210 215 220 Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile 225 230 235 240 Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Ala Ser Val Pro Ile Gln 245 250 255 Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser 260 265 270 Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr 275 280 285 Pro Ala Ser His His His His His His 290 295

Claims (50)

1. a. IL-17F (서열번호 12)의 약 21-41번 아미노산들;
   b. IL-17A (서열번호 2)의 약 21-39번 아미노산들;
   c. IL-17C (서열번호 6)의 약 44-65번 아미노산들;
   d. IL-17D (서열번호 8)의 약 32-53번 아미노산들;
   e. IL-17E (서열번호 10)의 약 27-49번 아미노산들; 또는
   f. IL-17B (서열번호 4)의 약 32-53번 아미노산들: 내의 부위에 있는 에피토프에서 IL-17 사이토카인과 결합하는 항체를 포함하는 분리된 단백질.
2. * IL-17RA (서열번호 14)의 약 22-36번, 83-96번, 118-147번, 152-179번, 및/또는 256-271번 아미노산들;
   * IL-17RB (서열번호 15)의 약 25-39번, 86-100번, 126-155번, 160-187번, 및/또는 254-269번 아미노산들; 또는
   * IL-17RC (서열번호 16)의 약 15-30번, 70-84번, 96-124번, 129-156번, 및/또는 227-237번 아미노산들: 내의 부위에 있는 에피토프에서 IL-17R과 결합하는 항체를 포함하는 분리된 단백질.
3. * IL-17A (서열번호 2)와 적어도 90% 일치하지만 100% 이하로 일치하고, 약 21-39번, 40-76번, 80-101번, 및 102-131번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산들이 다른 아미노산으로 돌연변이 또는 결실되고;
   * IL-17B (서열번호 4)와 적어도 90% 일치하지만 100% 이하로 일치하고, 약 32-53번, 66-105번, 110-131번, 및 135-158번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산들이 다른 아미노산으로 돌연변이 또는 결실되고;
   * IL-17C (서열번호 6)와 적어도 90% 일치하지만 100% 이하로 일치하고, 약 44-65번, 78-117번, 121-143번, 및 153-179번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산들이 다른 아미노산으로 돌연변이 또는 결실되고;
   * IL-17D (서열번호 8)와 적어도 90% 일치하지만 100% 이하로 일치하고, 약 32-53번, 66-105번, 110-131번, 및 134-163번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산들이 다른 아미노산으로 돌연변이 또는 결실되고;
   * IL-17E (서열번호 10)와 적어도 90% 일치하지만 100% 이하로 일치하고, 약 27-49번, 50-87번, 93-114번, 및 120-148번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산들이 다른 아미노산으로 돌연변이 또는 결실되고; 또한
   * IL-17F (서열번호 12)와 적어도 90% 일치하지만 100% 이하로 일치하고, 약 21-41번, 42-78번, 82-103번, 및 104-133번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산들이 다른 아미노산으로 돌연변이 또는 결실되는: 서열을 포함하는 분리된 인터루킨 17 (IL-17)을 포함하는 분리된 단백질.
4. 소단위들이 아미노산 서열에서 또 다른 것과 각각 서로 다르고, 또한 첫 번째 IL-17 수용체 소단위와 상호작용할 수 있는 첫 번째 단면 및 해당하는 자연적인 IL-17 단백질과 대비하여 두 번째 IL-17 수용체 소단위와 상호작용하는 감소된 능력을 가지는 두 번째 단면을 포함하는 이중체를 형성하는, 첫 번째 및 두 번째 IL-17 소단위를 포함하는 분리된 단백질.
5. 제 4항에 있어서,
   각 소단위는 서열번호 12의 1-127번 및 서열번호 2의 1-125번에 해당하는 부위에서 성숙한 인간 IL-17 사이토카인 (서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 또는 12)과 적어도 90% 일치하는, 단백질.
6. 제 5항에 있어서,
   적어도 하나의 소단위는 서열번호 12의 1-127번 및 서열번호 2의 1-125번에 해당하는 부위에서 성숙한 인간 IL-17 사이토카인 (서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 또는 12)과 대비하여 1개 및 7개 사이 범위의 치환들 또는 결실들을 가지는, 단백질.
7. 제 5항에 있어서,
   적어도 하나의 소단위는 서열번호 12의 1-127번 및 서열번호 2의 1-125번에 해당하는 부위에서 성숙한 인간 IL-17 사이토카인 (서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 또는 12)에 대비하여 1개 및 7개 사이 범위의 돌연변이들, 또한 서열번호 12의 128-133번 또는 서열번호 2의 126-131번에 해당하는 잔기들의 C-말단 절단을 가지는, 단백질.
8. 제 5항에 있어서,
   적어도 하나의 소단위는 인간 IL-17 사이토카인 (서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 또는 12)와 일치하는, 단백질.
9. 제 5항에 있어서,
   하나의 소단위는 성숙한 인간 IL-17 사이토카인 (서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 또는 12)에 대비하여 1개 및 5개 사이 범위의 돌연변이들을 가지고, 다른 하나의 소단위는 성숙한 인간 IL-17 사이토카인 (서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 또는 12)에 대비하여 적어도 4개 아미노산들의 C-말단 결실, 임의적으로 1개 및 5개 사이 범위의 돌연변이들을 가지는, 단백질.
10. 제 5항에 있어서,
    각 소단위는 다른 하나의 소단위와 동일한 인간 IL-17 사이토카인과 적어도 90% 일치하는, 단백질.
11. 제 4항에 있어서,
    하나의 소단위는 성숙한 인간 IL-17A와 적어도 90% 일치하고, 다른 하나의 소단위는 성숙한 IL-17F와 적어도 90% 일치하는, 단백질.
12. 제 4항에 있어서,
    상기 이중체의 두 번째 단면은 부위 1에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 단백질.
13. 제 4항에 있어서,
    상기 이중체의 두 번째 단면은 부위 1에서 1개 및 4개 사이 범위의 돌연변이들을 가지는, 단백질.
14. 제 4항에 있어서,
    상기 이중체의 두 번째 단면은 부위 2에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 단백질.
15. 제 4항에 있어서,
    상기 이중체의 두 번째 단면은 부위 2에서 1개 및 4개 사이 범위의 돌연변이들을 가지는, 단백질.
16. 제 4항에 있어서,
    상기 이중체의 두 번째 단면은 부위 3에서 적어도 하나의 치환 또는 돌연변이를 포함하는, 단백질.
17. 제 4항에 있어서,
    상기 이중체의 두 번째 단면은 부위 3에서 1개 및 4개 사이 범위의 치환들 및/또는 적어도 하나의 아미노산의 C-말단 결실을 가지는, 단백질.
18. 제 4항에 있어서,
    상기 이중체의 두 번째 단면은 다음의 부위들: 부위 1, 부위 2, 및 부위 3의 적어도 2개에서 적어도 하나의 치환 또는 결실을 가지는, 단백질.
19. 제 4항에 있어서,
    상기 이중체의 두 번째 단면은 다음의 부위들: 각각의 부위 1, 부위 2, 및 부위 3에서 적어도 하나의 치환 또는 결실을 가지는, 단백질.
20. 제 4항에 있어서,
    상기 첫 번째 소단위는 (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 47번 R에 해당하는 위치에서 치환을 포함하는, 단백질.
21. 제 20항에 있어서,
    상기 47번 R에 해당하는 위치에서 치환은 비-염기성 잔기로 되는, 단백질.
22. 제 21항에 있어서,
    상기 47번 R에 해당하는 위치에서 치환은 산성 또는 소수성 잔기로 되는, 단백질.
23. 제 20항에 있어서,
    상기 첫 번째 소단위는 상기에 더하여 (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 65번 S, 68번 V, 또는 102번 R, 또는 (서열번호 20에서의 번호매김에 따라) 64번 S, 67번 W, 또는 101번 R에 해당하는 하나 이상의 위치들에서 적어도 두 번째 치환을 포함하는, 단백질.
24. 제 4항 또는 제 20항에 있어서,
    상기 두 번째 소단위는 (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 89번 N에 해당하는 위치에서 치환을 포함하는, 단백질.
25. 제 4항 또는 제 20항에 있어서,
    상기 두 번째 소단위는 (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 128-133번에 해당하는 하나 이상의 C-말단 잔기들의 결실 또는 돌연변이를 포함하는, 단백질.
26. 제 4항 또는 제 20항에 있어서,
    상기 두 번째 소단위는 (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 128-133번에 해당하는 C-말단 잔기들이 결실된, 단백질.
27. 제 4항에 있어서,
    상기 첫 번째 및 두 번째 소단위들은 공유적으로 부착되는, 단백질.
28. 제 27항에 있어서,
    상기 첫 번째 및 두 번째 소단위들은 동일한 폴리펩타이드 사슬의 성분들인, 단백질.
29. 제 4항에 있어서,
    IL-17A/A, IL-17F/F, 또는 IL-17A/F 보다 100배 정도만 더 약한 IL-17RA에 대한 친화도를 가지는, 단백질.
30. 제 4항에 있어서,
    IL-17A/A, IL-17F/F, 또는 IL-17A/F 보다 100배 정도만 더 약한 IL-17RC에 대한 친화도를 가지는, 단백질.
31. 제 4항에 있어서,
    상기 첫 번째 단면은 성숙한 인간 IL-17 사이토카인 (서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 또는 12)과 대비하여 돌연변이들이라면 모두를 포함하지 않는, 단백질.
32. 제 4항에 있어서,
    상기 첫 번째 소단위는 (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 25번 MET 및 115번 LYS에 해당하는 위치들에서 하나 이상의 돌연변이들을 포함하고, 및/또는 상기 두 번째 소단위는 (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 29번 ILE, 131번 ILE, 58번 TRP, 61번 ASN, 63번 TYR, 64번 PRO, 65번 SER, 66번 GLU, 100번 VAL, 102번 ARG, 104번 HIS, 109번 VAL, 및 111번 PHE에 해당하는 위치들에서 하나 이상의 돌연변이들을 포함하는, 단백질.
33. 제 4항에 있어서,
    상기 첫 번째 소단위는 (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 94번 GLN, 95번 GLN, 96번 GLU, 115번 LYS, 및 117번 LEU에 해당하는 위치들에서 하나 이상의 돌연변이들을 포함하고, 및/또는 상기 두 번째 소단위는 (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 36번 GLN, 37번 ARG, 40번 MET, 41번 SER, 43번 ASN, 45번 GLU, 54번 TYR, 56번 VAL, 66번 GLU, 68번 VAL, 및 118번 VAL에 해당하는 위치들에서 하나 이상의 돌연변이들을 포함하는, 단백질.
34. 제 4항에 있어서,
    상기 첫 번째 소단위는 (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 75번 LEU, 86번 ILE, 87번 SER, 89번 ASN, 91번 VAL, 125번 VAL, 127번 PRO, 128번 VAL, 129번 ILE, 130번 HIS, 131번 HIS, 및 132번 VAL에 해당하는 위치들에서 하나 이상의 돌연변이들을 포함하고, 및/또는 상기 두 번째 소단위는 (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 40번 MET, 42번 ARG, 44번 ILE, 및 47번 ARG에 해당하는 위치들에서 하나 이상의 돌연변이들을 포함하는, 단백질.
35. 각 소단위는 인간 IL-17 폴리펩타이드와 적어도 90% 일치하고, 또한 포괄적으로 상기 소단위들은 이러한 인간 IL-17 폴리펩타이드와 대비하여 다음의 치환들 또는 결실들의 적어도 둘을 포함하는, 첫 번째 및 두 번째 IL-17 소단위를 포함하는 분리된 단백질:
    * 첫 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 47번 R에 해당하는 위치에서의 치환,
    * 첫 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 65번 S에 해당하는 위치에서의 치환,
    * 첫 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 68번 W에 해당하는 위치에서의 치환,
    * 첫 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 102번 R에 해당하는 위치에서의 치환,
    * 두 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 89번 N에 해당하는 위치에서의 치환,
    * 두 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 95번 Q에 해당하는 위치에서의 치환,
    * 두 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 127-132번에 해당하는 위치들에서 하나 이상의 치환들 또는 결실들.
36. 제 35항에 있어서,
    상기 소단위들은 포괄적으로 이러한 인간 IL-17 폴리펩타이드와 대비하여 다음의 치환들 또는 결실들의 적어도 둘을 포함하는, 단백질:
    * 첫 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 47번 R에 해당하는 위치에서의 R47E, R47A, 또는 R47D 치환,
    * 첫 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 65번 S에 해당하는 위치에서의 S65K, S65R, 또는 S65W 치환,
    * 첫 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 68번 W에 해당하는 위치에서의 W68A, W68V, W68S, W68Q, 또는 W68N 치환,
    * 첫 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 102번 R에 해당하는 위치에서의 R102A, R102V, R102S, 또는 R102T 치환,
    * 두 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 89번 N에 해당하는 위치에서의 N89A 또는 N89V 치환,
    * 두 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 95번 Q에 해당하는 위치에서의 Q95A 또는 Q95W 치환, 또한
    * 두 번째 소단위에서, (서열번호 12에서의 번호매김에 따라) 적어도 128-132번에 해당하는 위치들의 결실.
37. IL-17 폴리펩타이드들의 하나 또는 둘 다는 인간 IL-17 사이토카인의 돌연변이된 형태들이고, 또한 첫 번째 및 두 번째 IL-17 폴리펩타이드들은 결합하여 이중체를 형성하는, (1) 첫 번째 인터루킨-17 폴리펩타이드 및 (2) 두 번째 인터루킨-17 폴리펩타이드를 포함하는 단백질을 포함하는 분리된 단백질.
38. 제 37항에 있어서,
    상기 첫 번째 및 두 번째 IL-17 폴리펩타이드들은 각각 인간 IL-17 사이토카인과 적어도 95% 일치하는, 분리된 단백질.
39. 제 37항에 있어서,
    상기 첫 번째 및 두 번째 IL-17 폴리펩타이드들은 단일 폴리펩타이드 사슬의 성분들인, 분리된 단백질.
40. 제 37항에 있어서,
    상기 단백질은 상기에 더하여 Fc 도메인 또는 알부민 결합 도메인을 포함하는, 분리된 단백질.
41. 제 37항에 있어서,
    상기 첫 번째 및 두 번째 폴리펩타이드들은 나선형-코일 도메인 (coiled-coil domain) 또는 루이신 지퍼 (leucine zipper)에 의해 작동적으로 연결되는, 분리된 단백질.
42. 제 37항에 있어서,
    상기 첫 번째 또는 두 번째 폴리펩타이드는 인간 IL-17 사이토카인과 일치하는 서열을 포함하는, 분리된 단백질.
43. 서열번호 21 내지 46 또는 서열번호 21 내지 46과 적어도 95% 일치하지만 자연적인 성숙한 IL-17 사이토카인과는 서로 다른 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드 서열들을 포함하는, 분리된 단백질.
44. 제 1항 내지 제 43항의 어느 한 항에 따른 단백질을 포함하는 약제학적 조성물.
45. 제 44항에 따른 조성물을 개체에서 면역성 또는 염증성 반응을 조절하는 유효량으로 상기 개체에게 투여하는 것:을 포함하는, 개체에서 면역성 또는 염증성 반응을 조정하는 방법.
46. 제 44항에 따른 조성물을 개체에서 면역성 또는 염증성 반응을 조절하는 유효량으로 상기 개체에게 투여하는 것:을 포함하는, 개체에서 IL-17 매개성 장애를 치료하는 방법.
47. 제 1항 내지 제 44항의 어느 한 항의 단백질 또는 그의 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 하나 이상의 서열들을 포함하는, 분리된 핵산.
48. 제 1항 내지 제 44항의 어느 한 항의 단백질 또는 그의 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 하나 이상의 서열들을 포함하는 재조합 핵산을 포함하는, 재조합 숙주세포.
49. 제 48항의 숙주세포를 재조합 단백질의 발현을 허용하는 조건들 하에서 배양하고, 또한 상기 재조합 단백질을 회수하는 것을 포함하는, 재조합 단백질을 제조하는 방법.
50. 제 49항에 있어서,
    상기 재조합 단백질은 세포 용출물 또는 세포 배지로부터 정제되고 및/또는 상기 재조합 단백질을 하나 이상의 부형제, 안정화제, 및 완충용액으로 제형화하는 과정을 포함하는, 방법.

Images