KR102265435B1

KR102265435B1 - 피부 미백 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102265435B1
Application number: KR1020190101883A
Authority: KR
Inventors: 정용지; 김은미; 이응지
Original assignee: 주식회사 케어젠
Priority date: 2019-08-20
Filing date: 2019-08-20
Publication date: 2021-06-15
Also published as: ES2939257T3; JP2022500346A; JP7072636B2; CN112689640B; EP3800194A1; WO2021033833A1; US11453700B2; US20220169678A1; EP3800194B1; KR20210022410A; CN112689640A; EP3800194A4; BR112020024278A2

Abstract

피부 미백 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물, 상기 펩타이드를 포함하는 과색소침착성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 및 이를 이용한 피부 미백 방법 또는 과색소침착성 질환의 예방, 개선, 또는 치료 방법을 제공한다.

Description

피부 미백 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도{Peptide having activities of skin whitening and uses thereof}

피부 미백 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

피부색을 결정하는 인자에는 기본적으로 인종과 지역, 성별, 나이에 따른 차이를 제외하면, 기미, 주근깨, 및 자외선 노출로 인한 태닝이 있으며, 그 밖에도 전체적인 색소침착, 여드름, 흉터, 각질의 분포 상태와 혈액순환, 스트레스, 및 건강상태 등이 있다. 상기의 인자들 중에서 색소 침착은 피부색을 결정하는 주요한 인자로 알려져 있다.

피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 멜라노이드, 카로틴, 헤모글로빈, 및 카로티노이드 등이 있으며, 피부, 모발 및 눈의 다양한 색깔이 이들 색소에 의해 결정된다. 이들 중 피부의 색을 결정하는 가장 중요한 색소는 멜라닌으로서, 구체적으로, 멜라닌의 양과 분포에 의해 피부색이 결정된다. 멜라닌은 피부 표피 밑에 멜라닌 형성 세포(Melanocyte)라고 불리는 세포에서 생성되며, 피부의 신진대사에 의해 각질 표면으로 이동하여 떨어져 나간다. 피부색에 관계없이 멜라닌 형성 세포의 수는 거의 동일하지만, 단지 멜라닌이 생성되는 양과 종류, 분포가 다르기 때문에 피부색이 차이가 나는 것이다.

피부에서 티로신(Tyrosine)이 티로시나제(Tyrosinase)라는 인체 효소에 의해 도파(DOPA)로 전환되고, 계속되는 일련의 산화과정을 통해 최종적으로 흑갈색의 중합체인 멜라닌이 생성된다. 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미나 주근깨, 점 등과 같은 과색소침착증을 유발하여 미용상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 된다. 한편, 최근 레져 인구의 증가로 인해 외부에서 활동하는 것을 즐기는 사람들이 많아지면서, 자외선에 의한 멜라닌 색소 침착을 막고자 하는 요구가 늘어나고 있는 실정이다.

이러한 기술적 배경 하에서, 멜라닌 형성 세포의 활성 저해, 티로시나제의 활성 저해 등과 같은 기작을 통하여, 과도한 멜라닌 생성을 막는 미백제의 개발에 대한 다각적인 연구가 진행되고 있으나(한국 공개특허 제10-2019-0050058호), 아직은 미비한 실정이다.

미백 효능을 갖는 신규한 펩타이드를 제공한다.

상기 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

상기 펩타이드를 이용한 과색소침착성 질환의 예방, 개선, 또는 치료 방법을 제공한다.

일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 제공한다.

용어 "펩타이드(peptide)"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 상기 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술 (US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 생물학적으로 유효한 활성은 (a) 멜라닌 생성의 억제; (b) 티로시나제(tyrosinase) 활성의 억제; 및 (c) MRab27a, 멜라노필린(Melanophilin: Mlph), 미오신(myosin) VA, MITF(melanocyte inducing transcription factor), 티로시나제, 또는 TRP1(Tyrosinase-related protein 1) 발현의 억제와 같은 특성으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 나타내는 것일 수 있다. 따라서, 상기 펩타이드는 피부 미백 또는 과색소침착성 질환의 예방, 개선, 또는 치료를 위한 용도로 이용될 수 있다.

상기 펩타이드는 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 펩타이드의 N-말단, C-말단, 또는 양 말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 상기 안정성은 생체 내 단백질 절단효소의 공격으로부터 상기 펩타이드를 보호하는 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성 (예컨대, 상온 저장 안정성)도 포함한다. 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있다. 상기 펩타이드의 C-말단은 아미노기(amino group, -NH₂) 및 아자이드(azide, -NHNH₂)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 선택적으로, 표적화 서열, 태그 (tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 펩타이드는 전술한 바와 같다.

용어 "피부 미백(whitening)"은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 밝게 할뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 피부의 색소 과다 침착을 개선하는 것을 의미한다. 상기 피부의 색소 과다 침착은 기미, 주근깨, 검버섯, 잡티, 노인성 색소반, 또는 갈색 반점 등을 포함할 수 있다.

종래의 기능성 펩타이드는 유효한 생물학적 활성에도 불구하고 펩타이드 자체의 크기로 인해, 표적 조직 또는 세포에 효과적으로 유입되지 못하거나 반감기가 짧아 단기간에 체내에서 소멸되는 단점을 보여 주었다. 반면, 일 양상에 따른 피부 미백용 화장료 조성물은 10개 이하의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하며, 이에 따라, 유효 성분의 피부 침투율 등이 매우 우수하고, 예를 들어, 국소적으로 피부에 도포하는 경우, 유효한 피부 미백 효과를 얻을 수 있다.

용어 "개선"은 상태의 완화 또는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 상기 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및/또는 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 용어 "화장품학적 유효량"은 상기 화장료 조성물의 피부 미백 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 화장품학적 유효량은 목적하는 피부 미백 효과가 나타나는 정도로 당업자가 통상적인 상식에 기초하여 결정할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 예를 들어, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등 이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드와 담체 성분 이외에, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 과색소침착성 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

상기 펩타이드는 전술한 바와 같다.

용어 "예방"은 상기 조성물의 투여로 질병의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 용어 "치료"는 질병을 앓거나 또는 질병이 발병할 위험이 있는 개체에게, 상기 개체의 상태(예를 들면, 하나 이상의 증상)의 개선, 질병 진행의 지연, 증상 발생의 지연 또는 증상 진행의 둔화 등을 포함한 효과를 제공하는 임의의 형태의 치료를 의미한다. 따라서, 상기 "치료" 및 "예방"은 증상의 치유 또는 완전한 제거를 의미하도록 의도되지 않는다.

상기 "과색소침착성 질환"은 피부에 멜라닌 색소가 과다하게 생성되어 피부에 침착되는 질환 즉, 과색소침착(hyperpigmentation) 증상이 나타나는 질환을 말한다. 상기 과색소침착성 질환은 예를 들어, 기미, 주근깨, 검버섯, 잡티, 노인성 색소반, 또는 일광흑색종(solar lentigines)이다.

상기 약제학적 조성물은 상기 펩타이드의 약제학적 유효량(pharmaceutically effective amount); 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

용어 "약제학적 유효량"은 상기 약제학적 조성물의 과색소침착성 질환 예방 또는 치료 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미할 수 있다.

상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

상기 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥 내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약제학적 조성물의 투여량은 1일당 0.0001 내지 1000 ㎍(마이크로그램, 0.001 내지 1000 ㎍, 0.01 내지 1000 ㎍, 0.1 내지 1000 ㎍, 또는 1.0 내지 1000 ㎍일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 투여는 1일 1회 내지 4회, 2회 내지 3회 또는 2회 실시할 수 있다. 또한, 본원의 투여는 4주 이상, 8주 이상, 4주 내지 12주 또는 8주 내지 12주의 기간 동안 실시할 수 있다. 상기 투여는 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

상기 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 및/또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 개체의 피부에 도포하는 단계를 포함하는 피부 미백 방법을 제공한다.

상기 펩타이드, 피부 미백, 및 화장료 조성물은 전술한 바와 같다.

용어 "도포하는"은 "적용하는" 및 "투여하는"과 상호교환적으로 사용되고 일 실시예에 따른 조성물을 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 것, 또는 투여 경로에 의해 개체 내로 일 양상에 따른 조성물의 배치하는 것일 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 과색소침착성 질환의 예방, 개선, 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 펩타이드, 약제학적 조성물, 과색소침착성 질환, 예방, 개선, 및 치료는 전술한 바와 같다.

상기 "개체"는 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 식품 조성물을 제공한다.

상기 펩타이드 및 피부 미백은 전술한 바와 같다.

상기 식품 조성물에 함유된 유효성분으로서의 펩타이드의 함량은 식품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 비제한적으로 선택될 수 있으며, 예를 들어, 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 첨가할 수 있다. 또한 예를 들어, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 첨가할 수 있다.

일 양상에 따른 펩타이드에 의하면, 멜라닌의 생성과 티로시아나제 활성을 유의적으로 억제할 뿐만 아니라, 멜라닌 생성 관련 인자들의 발현을 억제함으로써, 우수한 피부 미백 효과를 나타내고, 과색소침착성 질환의 예방, 개선, 또는 치료하는데 적용할 수 있다. 따라서, 일 양상에 따른 펩타이드는 피부 미백용 조성물 또는 과색소침착성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다.

도 1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 B16F10 세포에 첨가한 후, 멜라닌의 생성 감소를 확인한 결과이다.
도 2는 상기 펩타이드를 B16F10 세포에 첨가한 후, 티로시나제의 활성 감소를 확인한 결과이다.
도 3은 상기 펩타이드를 B16F10 세포에 첨가한 후, 멜라닌 생성 관련 유전자인 Rab27a, Mlph, 미오신 VA, MITF, 티로시나제, 및 TRP1의 발현 억제를 확인한 결과이다.
도 4은 상기 펩타이드를 B16F10 세포에 첨가한 후, 멜라닌 생성 관련 단백질인 Mlph, Rab27a, 티로시나제(TYR), 및 MITF의 발현 억제를 확인한 결과이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 펩타이드의 합성

자동 펩타이드 합성기(Milligen 9050, Millipore, 미국)를 이용하여 하기의 표 1에 기재된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 합성하고, C18 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC)(Waters Associates, 미국)를 이용하여 이들 합성된 펩타이드를 순수 분리하였다. 컬럼은 ACQUITY UPLC BEH300 C18 (2.1 ㎜ Х 100 ㎜, 1.7 ㎛, Waters Co, 미국)을 이용하였다.

서열번호	펩타이드 서열
1	PNRYP

실시예 2. 합성된 펩타이드의 미백 효능

(1) 멜라닌 생성 억제 효과 확인

마우스 흑색종 세포인 B16F10 세포를 6-웰 플레이트에 5×10⁴ cells/well의 밀도로 접종한 후, 이를 16 시간 동안 배양하였다. 이후, 배양 배지를 2%(v/v) 혈청이 포함된 배지로 교체한 뒤, 여기에 멜라닌의 생성을 촉진하기 위하여, 200 ng/ml의 α-MSH(a-melanocyte-stimulating hormones)를 첨가하였으며, 이와 함께, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 각각을 10 μM, 50 μM, 100 μM, 또는 200 μM로 첨가한 뒤, 이를 72 시간 동안 배양하였다. 이후, 배양된 세포를 1N의 NaOH로 용해시킨 뒤, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 한편, 대조군으로 미처리군(Con)을 사용하였고, 음성 대조군으로 α-MSH 만을 첨가한 군, 양성 대조군으로 피부 미백제로 알려진 200 μM 또는 500 μM의 알부틴(Arbutin) 및 α-MSH를 첨가한 군을 사용하였다.

450 nm에서의 흡광도로부터 B16F10 세포가 생성한 멜라닌의 함량(%)을 산출하였다. 산출된 멜라닌 함량(%)을 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 첨가에 의해, 농도 의존적으로 멜라닌의 생성이 감소됨을 확인하였다.

(2) 티로시나제 활성 억제 효과 확인

서열번호 1의 펩타이드의 멜라닌생성의 핵심 효소의 티로시나제(tyrosinase)에 대한 활성 억제 효과를 확인하였다.

구체적으로, 마우스 흑색종 세포인 B16F10 세포를 6-웰 플레이트에 5×10⁴ cells/well의 밀도로 접종한 후, 이를 16 시간 동안 배양하였다. 이후, 배양 배지를 2%(v/v) 혈청이 포함된 배지로 교체한 뒤, 여기에 200 ng/ml의 α-MSH를 첨가하였다. 이와 함께, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 각각을 1 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 60 μM, 80 μM, 또는 160 μM로 첨가한 뒤, 이를 72 시간 동안 배양하였다. 얼음 위에 상기 6-웰 플레이트를 위치시키고, 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 그 후, 1%(v/v) Triton X-100이 함유된 0.1 M 인산 나트륨 완충액(pH 6.8, 용해 완충액)을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 이후, 상기 웰 플레이트에 존재하는 세포를 스크래퍼로 긁어 1.5 ㎖ 튜브에 모았다. 회수한 세포는 볼텍싱하고 15,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 이후, 상층액 내 단백질을 정량하여, 일정량의 단백질이 포함되도록 조정한 뒤, 여기에 완충액을 첨가하여 총 90 ㎕의 시료를 96-웰 플레이트 상에 분주하였다. 또한, 상기 플레이트에서, 실험 시료, Blank 시료, 양성 대조군 시료은 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 준비하였다.

	실험 시료	Blank 시료	양성 대조군 시료
시료	90 ㎕	-	-
완충액	-	90 ㎕	90 ㎕
버섯 티로시나제 (0.1 mg/ml)	-	-	10 ㎕

이후, 각각의 시료에 20 ㎕의 10 mM L-DOPA를 첨가한 뒤, 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 475 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 한편, 대조군으로 미처리군(Con)을 사용하였고, 음성 대조군으로 α-MSH 만을 첨가한 군, 양성 대조군으로 피부 미백제로 알려진 200 μM 또는 500 μM의 알부틴(Arbutin) 및 α-MSH를 첨가한 군을 사용하였다.

450 nm에서의 흡광도로부터 티로시나제 활성(배수)을 산출하였다. 산출된 티로시나제 활성(배수)를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 첨가에 의해, 티로시나제 활성이 억제됨을 확인하였다.

(3) 멜라닌 생성 관련 유전자의 발현 억제 효과 확인

서열번호 1의 펩타이드의 멜라닌생성 관련 유전자의 발현을 억제하는지를 확인하였다.

구체적으로, 마우스 흑색종 세포인 B16F10 세포를 6-웰 플레이트에 5×10⁴ cells/well의 밀도로 접종한 후, 이를 16 시간 동안 배양하였다. 이후, 배양 배지를 2%(v/v) 혈청이 포함된 배지로 교체한 뒤, 여기에 200 ng/ml의 α-MSH를 첨가하였다. 이와 함께, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 각각을 1 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 60 μM, 80 μM, 또는 160 μM로 첨가한 뒤, 이를 72시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포로부터 mRNA를 추출한 뒤, cDNA synthesis kit & PCR pre-mix (Intron, Korea)를 사용하여, 상기 추출된 mRNA를 역전사시킴으로써 각각의 cDNA를 합성하였다. 이후, 상기 cDNA와 Rab27a, Mlph(멜라노필린, Melanophilin), 미오신 VA, MITF, 티로시나제, 또는 TRP1 증폭용 프라이머쌍을 사용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)을 수행하였다. 한편, 대조군, 음성 대조군 및 양성 대조군은 실시예 2.(1)과 동일한 군을 사용하였으며, 본 실시예에서 사용한 프라이머의 핵산 서열은 하기 표 3에 기재된 바와 같다.

프라이머		핵산 서열 (5'->3')	서열번호
Rab27a	정방향	GAAAATAGCGCCAAGCACCC	2
Rab27a	역방향	CCTCTTTCACTGCCCTCTGG	3
Mlph	정방향	ACGATGTCAGGGGCAAACAT	4
Mlph	역방향	CTCCTCTGTGTCAGCACTGG	5
myosin VA	정방향	TTCTACATTGTGGGCGCCAT	6
myosin VA	역방향	TCCTCCAGGTTGGTCAATC	7
MITF	정방향	CCAGCCTGGCGATCATGTCAT	8
MITF	역방향	GGTCTGGACAGGAGTTGCTG	9
티로시나제	정방향	GGCCAGCTTTCAGGCAGAGG	10
티로시나제	역방향	TGGTGCTTCATGGGCAAAAT	11
TRP1	정방향	TCTGTGAAGGTGTGCAGGAG	12
TRP1	역방향	CCGAAACAGAGTGGAAGGTT	13
GAPDH	정방향	GGTGTGAACGGATTTGGCCGTATTG	14
GAPDH	역방향	CCGTTGAATTTGCCGTGAGTGGAGT	15

PCR 증폭 결과로부터 산출된 발현 변화를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 첨가에 의해, 멜라닌 생성 관련 유전자인 Rab27a, Mlph, 미오신 VA, MITF, 티로시나제, 및 TRP1의 발현이 억제됨을 확인하였다.

(4) 멜라닌 생성 관련 단백질의 발현 억제 효과 확인

서열번호 1의 펩타이드의 멜라닌생성 관련 단백질의 발현을 억제하는지를 확인하였다.

구체적으로, 마우스 흑색종 세포인 B16F10 세포를 6-웰 플레이트에 5Х10⁴ cells/well의 밀도로 접종한 후, 이를 16 시간 동안 배양하였다. 이후, 배양 배지를 2%(v/v) 혈청이 포함된 배지로 교체한 뒤, 여기에 200 ng/ml의 α-MSH를 첨가하였다. 이와 함께, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 각각을 1 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 60 μM, 80 μM, 또는 160 μM로 첨가한 뒤, 이를 72시간 동안 배양하였다. 이후, 배양된 세포를 용해한 뒤, Mlph, Rab27a, 티로시나제(TYR), 또는 MITF에 대한 항체들(모두 santacruz biotechnology, USA)을 사용하여 면역블로팅을 수행하였다. 한편, 대조군, 음성 대조군 및 양성 대조군은 실시예 2.(1)과 동일한 군을 사용하였다.

면역블로팅 결과로부터 산출된 발현 변화를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 첨가에 의해, 멜라닌 생성 관련 단백질인 Mlph, Rab27a, 티로시나제(TYR), 및 MITF의 발현이 억제됨을 확인하였다.

상기 실험 결과를 종합하면, 일 실시예에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 피부의 미백 효능을 지니고 있음을 알 수 있었다.

<110> CAREGEN CO., LTD. <120> Peptide having activities of skin whitening and uses thereof <130> GN-127900-KR <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having activities of skin whitening <400> 1 Pro Asn Arg Tyr Pro 1 5 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying Rab27a <400> 2 gaaaatagcg ccaagcaccc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying Rab27a <400> 3 cctctttcac tgccctctgg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying Mlph <400> 4 acgatgtcag gggcaaacat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying Mlph <400> 5 ctcctctgtg tcagcactgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying myosin VA <400> 6 ttctacattg tgggcgccat 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying myosin VA <400> 7 tcctccaggt tggtcaatc 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying MITF <400> 8 ccagcctggc gatcatgtca t 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying MITF <400> 9 ggtctggaca ggagttgctg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying tyrosinase <400> 10 ggccagcttt caggcagagg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying tyrosinase <400> 11 tggtgcttca tgggcaaaat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying TRP1 <400> 12 tctgtgaagg tgtgcaggag 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying TRP1 <400> 13 ccgaaacaga gtggaaggtt 20 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying GAPDH <400> 14 ggtgtgaacg gatttggccg tattg 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying GAPDH <400> 15 ccgttgaatt tgccgtgagt ggagt 25

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol: PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합된 것인 펩타이드.
청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드의 C-말단은 아미노기(amino group, -NH₂) 및 아자이드(azide, -NHNH₂)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합된 것인 펩타이드.
청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 하기와 같은 특성으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 나타내는 것인 펩타이드:
(a) 멜라닌 생성의 억제;
(b) 티로시나제(tyrosinase) 활성의 억제; 및
(c) Rab27a, 멜라노필린(Melanophilin: Mlph), 미오신(myosin) VA, MITF(melanocyte inducing transcription factor), 티로시나제, 또는 TRP1(Tyrosinase-related protein 1) 발현의 억제.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 과색소침착성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서,
상기 과색소침착성 질환은 기미, 주근깨, 검버섯, 잡티, 노인성 색소반, 또는 일광흑색종(solar lentigines)인 것인 약제학적 조성물.
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