CN102066404B - 血管生成肽 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了这样的血管生成肽，即其引起靶细胞中细胞内钙释放，从而诱发原代培养的内皮细胞的增殖、迁移和毛细血管样管形成。所述血管生成肽可以用于预防和/或治疗血管生成相关病症，尤其是创伤愈合、治疗受试者的足腿溃疡，等。另外，所述血管生成肽可以用于化妆品，作为针对皮肤老化的化妆品组分，例如用于抗皱和皮肤美白。

Description

血管生成肽
技术领域
本发明涉及引起靶细胞中细胞内钙释放并从而诱发原代培养的内皮细胞的增殖、迁移和毛细血管样管形成的血管生成肽。另外，所述血管生成肽可以用于预防和/或治疗血管发生相关病症，尤其是创伤愈合、治疗受试者的足腿溃疡，等。另外，所述血管生成肽可以用于化妆品，作为针对皮肤老化的化妆品组分，例如用于抗皱和皮肤美白。
背景技术
血管发生——从已有血管系统长出新血管——是多种生理和病理状况下的基本过程，所述生理和病理状况包括创伤愈合、胚胎发育、慢性炎症和肿瘤进展和转移(J.Folkman，Nat.Med.1(1995)，pp.27-31；W.Risau，Nature 386(1997)，pp.671-674)。在血管发生过程中会发生复杂的细胞过程，包括内皮细胞的细胞外基质降解、增殖、迁移和形态分化以形成管。该整个过程受调节新血管形成的局部因子的协调(F.Bussolino，et al.，Trends Biochem.Sci.22(1997)，pp.251-256)，血管生成平衡的变化可以介导“血管生成开关”。对血管生成开关的干扰可以引起严重的血管问题。
钙在由多种细胞外刺激诱发的信号传递事件中以及对大量不同细胞功能的协调过程中起到关键作用(M.J.Berridge，Nature 361(1993)，pp.315-325；K.Kiselyov，et al.，Cell Signal 15(2003)，pp.243-253)。细胞内Ca2+增加是人内皮细胞的粘附、溶胶原活性、迁移和增殖以及体内毛细血管生长必不可少的(E.C.Kohn，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)，pp.1307-131)。实际上，血管内皮生长因子(VEGF)——一种受体酪氨酸激酶(RTK)配体——和1-磷酸鞘氨醇(S1P)——一种G蛋白偶联受体(GPCR)配体——通过调节细胞内Ca2+水平诱导新血管形成(M.Faehling，et al.，FASEB J.16(2002)，pp.1805-1807；M.Guidoboni，et al.，Cancer Res.65(2005)，pp.587-595)。因此，对内皮细胞中的Ca2+动员特性进行研究可能提供重要的信息，用于全面地理解血管发生涉及的生理过程。
合成肽组合文库位置扫描策略(PS-SPCL)已经被用于分离具有血管生成潜力的肽(R.A.Houghten，et al.，Nature 354(1991)，pp.84-86)。而且，所述PS-SPCL方法已被成功地应用于筛选参与多种生物过程的有用肽，由此鉴定出数种肽，如，白细胞介素-8特异性拮抗物(S.Hayashi，et al.，J Immunol.154(1995)，pp.814-824)、激活的T细胞的核因子的抑制物(J.Aramburu，et al，Science 285(1999)，pp.2129-2133)和免疫调节肽(Y.S.Bae，et al.，Blood 97(2001)，pp.2854-2862)。
发明内容
进行合成肽文库筛选以得到作用于内皮细胞的生物活性合成肽，本发明人已鉴定出在体外(in vitro)和离体(ex vivo)条件下强力诱导血管生成活性的新型肽。而且，本发明人提供了这样的证据，即SFKLRY-NH2的血管生成活性受到内皮细胞中VEGF-A诱导的介导。
本发明的一个实施方案提供了一种选定的长度为6-15个氨基酸的血管生成肽序列，所述血管生成肽序列具有如下活性：促进细胞迁移、血管发生或胶原合成，或者抑制黑色素形成。所述血管生成肽包括基本六肽以及由1-9个氨基酸组成的连接肽。任选地，所述血管生成肽通过以-NH2取代C末端羧基而被修饰。所述血管生成肽的血管生成活性受到血管内皮生长因子(VEGF)上调的介导。
本发明的另一个实施方案提供了一种用于治愈创伤、促进胶原合成或抑制黑色素合成的包含血管生成肽的组合物。所述组合物是一种用于创伤愈合的药物组合物，其包含作为活性成分的血管生成肽和可药用载体。所述组合物是一种用于改善老化皮肤状况的化妆品组合物，其包含作为活性成分的血管生成肽和化妆品可用载体。所述化妆品组合物是具有抗皱和皮肤美白活性的活性组合物。
又一实施方案提供了一种促进哺乳动物中血管发生的方法，所述方法包括对有需要的受试者给予有效量的血管生成肽。
再一实施方案提供了一种治愈受试者的创伤的方法，包括如下步骤：对有需要的所述受试者给予创伤愈合有效量的血管生成肽或其肽模拟物。
在另一方面中，本发明涉及一种改善皱纹的方法，包括对有需要的受试者给予有效量的血管生成肽或其肽模拟物。
在又一方面中，本发明涉及一种减少皮肤色素沉着的方法，包括对有需要的受试者给予有效量的血管生成肽或其肽模拟物。
在另一方面中，本发明涉及一种鉴定抗血管生成分子的方法，包括如下步骤：提供一种内皮细胞；将所述细胞与候选拮抗化合物相接触；以及如果所述候选拮抗化合物抑制上述多肽或其肽模拟物的血管生成活性，则将所述候选拮抗化合物鉴定为拮抗化合物。
附图说明
通过下文对本发明的描述、参照的其附图和其随附的权利要求书，将可以更全面地理解本发明的这些目标和其他目标。
通过本文下文给出的详细描述以及附图将可以更全面地理解本发明，所述附图仅仅是以示例的方式给出，因此不是对本发明的限制，其中：
图1A-1F示出针对使MS-1细胞的细胞内钙升高的肽进行的初始PS-SPCL筛查，其中每幅图示出了已知氨基酸在所述六肽的6个位置中的每一位置上的肽库(peptide pool)得到的结果。所述6个位置由19个L-氨基酸中的一个分别定义(例如O1、O2)。剩余的5个位置由所述19个L-氨基酸(不包括半胱氨酸(cystein))的混合物(X)组成。所述文库由114个肽库组成；PS-SPCL总共由47,045,881种不同肽构成。如“材料和方法”中所述，使用Fura-2/AM通过荧光分析测定[Ca2+]i升高。该结果表示3次独立实验中的一次。
图2A-2C示出SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导HUVEC增殖、迁移和管形成。将细胞以不同浓度的SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)(0.1-10μM)处理。在孵育48小时后，以液体闪烁计数器对DNA合成的活性计数。竖条代表3次独立实验的平均值±S.D.。*P＜0.05。(B)不同剂量SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)引起的HUVEC迁移率。在创伤后，将HUVEC以标明浓度的SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)(0.1-10μM)孵育16小时，然后对超出参考线的迁移HUVEC计数。值代表了进行2次重复的3次独立实验(平均值±S.D.)。*P＜0.05。(C)SFKLRY-NH2(SEQ IDNO：2)对HUVEC管形成的影响。将HUVEC接种于减少生长因子的基质胶(Matrigel)上并以SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)(1μM)、FYSRLK-NH2(10μM)和S1P(100nM)处理，以进行比较。在孵育24小时后，对所述管样结构照相并测量管形成的长度。值代表进行2次重复的3次独立实验(平均值±S.D.)。*P＜0.05。
图3A-3B示出BAPTA、U73122和PTX抑制MS-1细胞中SFKLRY-NH2诱导的[Ca2+]i升高。在存在和不存在细胞内钙螯合剂BAPTA-AM(A)、PLC抑制剂U73122及其无活性类似物U73433以及PTX(B)的情况下，测量SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导的细胞内Ca2+动员活性。(A)在37℃下，将所述细胞在包含10μM BAPTA-AM的DMEM中以Fluo-4/AM预孵育30分钟。将细胞悬浮于包含0.2mMEGTA的无Ca2+的Locke溶液中，并以标明浓度的SFKLRY-NH2(SEQ IDNO：2)处理。通过在488nm下激发并在520nm下发射来确定荧光强度的变化。(B)将细胞以Fura-2分别在有或无U73122(10μM)、U73433(10μM)下预孵育30分钟，以及在有或无PTX(100ng/mL)下预孵育2小时。然后，将载有Fura-2的细胞悬浮于无Ca2+的Locke溶液中，然后以1μM SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)处理。数据代表进行3次重复的3次独立实验的平均值±S.D.。*P＜0.05。
图4示出SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导离体血管萌芽。在基质胶中将大鼠主动脉外植体以含有SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)(1μM)、FYSRLK-NH2(1μM)，S1P(10nM)、VEGF(10ng/mL)、含U73122(10μM)或PTX(50ng/mL)的SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)(1μM)或者10％FBS的M-199孵育，并在孵育7天后照相。然后进行3次独立实验，每次实验重复两次。
图5A-5B示出SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)引起的VEGF和VEGFR-1 mRNA的上调。对从以SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)处理的原代培养的HUVEC中分离的mRNA进行RT-PCR分析。所示数据代表3次独立实验。在HUVEC中以SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)(10μM)处理0、1、2、3、4、8或12小时(A)，以及以0、0.01、0.1或10μM处理2小时(B)，使用VEGF-A的特异性引物扩增它。将GAPDH用作参照基因。
图6A-6B示出抗VEGF抗体在HUVEC中抑制SFKLRY-NH2(SEQID NO：2)诱导的管形成。在存在抗VEGF-A中和抗体(0.1、1或10μg/mL)的情况下，将细胞在包含SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)(10μM)或VEGF-A(10ng/mL)的培养基中孵育24小时。在孵育24小时后，对所述管样结构照相并测量管形成的长度。数据表示为2次独立实验的一次实验，值是2次独立实验的平均值。与载体处理相比*P＜0.05。
图7A-7B示出愈合创伤组织在第14天时的组织学。(A)假处理的创伤表现出重度水肿和杂乱的微结构。(B)通过以SFKLRY-NH2(SEQ IDNO：2)(10μM)处理观察到了微结构几乎完全恢复正常。
图8示出SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)对I型胶原合成的影响。将人成纤维细胞以SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)(0.1、1、10μM)处理。
图9A-9B示出SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)对B16黑色素瘤细胞中黑色素含量的影响。
具体实施方式
通过提供合成肽组合文库的位置扫描方法(PS-SPCL)公开了一系列在内皮细胞中诱导[Ca2+]i升高的新型肽。在这些肽中，原型肽SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)被证明在内皮细胞中通过PTX敏感性G蛋白/PLC介导的[Ca2+]i升高来诱导DNA合成、迁移和管形成，这些是血管发生的关键步骤。作为小肽的SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)的鉴定在血管发生研究中是值得注意的。SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)不但在体外和离体条件下显示出血管生成活性，而且在大鼠模型中具有显著的创伤愈合活性。而且，所述肽的处理在皮肤成纤维细胞中刺激了胶原合成并抑制了黑色素合成。
本发明涉及具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的原型肽和其保守变体或功能性片段。所述血管生成肽的长度可以是约6-15个氨基酸、6-10个氨基酸、6-7个氨基酸或6个氨基酸，包含氨基酸序列X1FX2LRX3作为基本部分，以及连接于X1FX2LRX3的C末端的由1-9个氨基酸组成的肽。所述血管生成肽可以通过以-NH2取代末端羧基进行修饰。血管生成肽的实例包括由SEQ ID NO：1、2、8、12、14或15-24组成的肽。
本文使用的血管生成肽是指长度可以是约6-约15个氨基酸且包含具有化学式I的氨基酸序列的六肽的寡肽。此外，所述肽是刺激内皮细胞中[Ca2+]i升高并从而诱导毛细血管样管形成的化合物。
X1FX2LRX3
其中X1是丝氨酸或苏氨酸；
X2是赖氨酸、精氨酸或异亮氨酸；并且
X3是苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、精氨酸或组氨酸。
在每个位置活性最大的氨基酸是：第一位置Ser(S)和Thr(T)；第二位置Phe(F)；第三位置Ile(I)、Lys(K)和Arg(R)；第四位置Leu(L)；第五位置Arg(R)；第六位置Arg(R)、Phe(F)、Trp(W)、Tyr(Y)和His(H)。
本文使用的术语“血管发生”是指新血管的生长或“新血管形成”，包括由内皮细胞构成的管径相对较小的新血管的生长。血管发生是许多重要生物过程的一个不可缺少的部分，所述生物过程包括癌细胞增殖实体瘤形成、炎症、创伤愈合、受损缺血组织的修复、心肌血管重建和重塑、卵泡成熟、月经周期和胎儿发育。新血管形成对于任何新组织的发育都是需要的，不管是正常的还是病理的新组织发育，因此它不仅代表促进正常组织生长和“正常”血管发生的治疗良机，也代表许多疾病状态调控中的潜在控制点。
血管发生的完整过程还不是完全清楚，但已知它以如下方式影响毛细血管的内皮细胞：
(1)内皮细胞和周围细胞外基质(ECM)之间的附着被改变，据推测受到蛋白酶和糖苷酶的介导，这使得微血管内皮细胞周围的基底膜被破坏，从而使得内皮细胞朝趋化因子的方向伸出细胞质芽；
(2)存在所述内皮细胞向待血管形成的组织迁移的“趋化过程”；以及
(3)存在“有丝分裂过程”(例如，所述内皮细胞增殖以提供另外的细胞用于新血管)。这些血管生成活性的每一种均可以利用体外内皮细胞培养物独立地测量。
创伤是由物理途径例如机械途径、化学途径、细菌途径或热途径引起的内部或外部身体损伤或损害，它们可破坏结构的正常连续性。这类身体损伤包括挫伤——皮肤未破的创伤；割伤——皮肤被切割器械割破的创伤；以及裂伤——皮肤因不锋利的或钝的器械破损的创伤。创伤可以由意外引起或者由手术操作引起。
创伤愈合由一系列过程组成，经由这些过程，损伤组织得到修复，特化的组织得以再生，并且新组织得以重组。创伤愈合通常可分成3个阶段：炎症阶段、增殖阶段和重塑阶段。纤连蛋白已被报道参与创伤愈合过程的每个阶段，特别是通过生成侵入细胞可附着的支架。最初，许多调节因子，例如纤连蛋白和血纤蛋白原，被释放至创伤位点。此后，发生血管发生和上皮再形成(美国专利5,641,483)。由缺血造成的损伤组织的修复是一种需要广泛重塑和血管再形成的创伤愈合形式。梗死以及组织区域缺血性坏死实际上是由局部血液循环阻塞引起的。所形成的坏死损害使得受损组织缺乏氧和营养物。在心脏中，特别是冠状循环的阻塞可形成心肌梗死。随着缺血性心肌膜出现快速缺氧，受影响心肌的低氧微环境导致血管生成因子的合成，以试图进行血管再形成。例如，已知在出现梗死形成(Ref)的心肌膜区域会产生血管内皮生长因子(VEGF)。
在一个实施方案中，本发明涉及对刺激内皮细胞中[Ca2+]i升高并从而诱导毛细血管样管形成的化合物例如多肽、肽模拟物或化学上的化合物进行筛选。所述化合物预计将治疗患有由血液供应受损诱发的疾病的患者，所述疾病包括与糖尿病或创伤相关的足和腿溃疡以及视网膜病变。
可以使用包括噬菌体展示文库或化学文库的多种文库来筛选刺激内皮细胞中[Ca2+]i升高的化合物。另一方法利用了双杂交系统(例如酵母或哺乳动物双杂交系统)来鉴定诱导在所述受试者中形成血管的化合物，包括治疗由血液供应受损诱发的疾病，包括与糖尿病或创伤相关的足和腿溃疡以及视网膜病变。这些方法中有许多可用于高通量分析。另外，提供了这样的方法，即这些方法使得可鉴定另外的血管生成化合物，并且这些方法还可治疗和/或预防足和腿溃疡、视网膜病变和创伤。一种方法涉及应用合理药物设计技术。因此，使用基于计算机的同源搜索、蛋白质建模和组合化学来设计并形成与鉴定出的化合物以及这些分子的片段或衍生物相似的分子。例如，通过一个搜索程序访问包含与X1FX2LRX3肽或者这些分子的片段或衍生物对应的核酸或蛋白序列的数据库，所述搜索程序将所述序列与公共或商业数据库中的其他序列对比，以鉴定同源配体。通过另一种合理性方法，将蛋白建模技术(例如X射线晶体学、NMR和计算机建模)用于构建所述化合物的模型。从这些模型可实现合理药物设计。一旦设计并生成所述候选化合物，优选评估它们刺激内皮细胞中[Ca2+]i升高的能力。评估候选物的能力以及产生的对血管形成的诱导作用的方法可以使用多种测定例如基质胶测定完成。
变体和突变体多肽
为了改善或改变所述多肽的特征，可以采用氨基酸工程。本领域技术人员已知的重组DNA技术可以用于产生包含单个或多个氨基酸置换、缺失、插入的新型突变体多肽或融合蛋白。类似的突变体多肽还可以通过化学合成产生，尤其是短肽。这类修饰的多肽可以表现出例如活性增加/降低或者稳定性增加/降低。另外，至少在某些纯化和保存条件下，它们与相应的天然多肽相比可以以更高的产率纯化并且表现出更好的溶解性。
与X1FX2LRX3肽以及这些分子的片段或衍生物(例如X1FX2LRX3肽模拟物)相似的化合物，不仅包括那些包含整个或部分的血管生成肽氨基酸序列作为一级氨基酸序列的分子以及这些分子的天然片段或衍生物，而且还包括如下改变的序列：其中以功能等价的氨基酸残基置换所述序列中的残基，从而产生沉默的改变。因此，血管生成肽以及这些分子的片段或衍生物的序列中的一个或多个氨基酸残基可以被作为功能等价物发挥作用的极性相似的另一氨基酸置换，从而产生沉默的改变。所述序列中的氨基酸置换物可以选自所述氨基酸所属类别的其他成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。不带电的极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在本发明的另一方面中，考虑到了X1FX2LRX3肽以及这些分子的片段或衍生物，它们在翻译过程中或翻译之后被差异修饰，例如通过磷酸化、糖基化、交联、酰化、蛋白水解切割、连接于抗体分子、膜分子或其他配体。因此，对应于X1FX2LRX3肽或者这些分子的片段或衍生物的蛋白质序列可以与已知序列进行比较。大于或等于X1FX2LRX3肽的候选化合物被鉴定并随后使用钙动员测定进行检查。
模拟物
用于本发明的一些方面中的肽还可以被修饰，例如所述肽可以具有正常不存在于肽上的取代基，或者所述肽可以具有正常存在于所述肽上、但被引入至非正常肽区域的取代基。例如，用于本发明的一些方面中的肽可以被乙酰化、酰化或胺化。为了修饰，所述肽上可以包括的取代基包括但不限于H、烷基、芳基、烯基、炔基、芳香族基团、醚、酯、未被取代或取代的胺、酰胺、卤素、未被取代或取代的磺酰基或者5元或6元脂肪环或芳环。“SFKLRY肽模拟物”是一种类似于所述SFKLRY肽的化合物。SFKLRY肽模拟物可以是拟肽、肽、修饰肽和衍生肽。
另外的衍生化合物包括类似于目的多肽的拟肽。参与肽生物学生成的天然氨基酸都具有L构型。利用L氨基酸、D氨基酸或者两种不同构型的氨基酸的各种结合，应用常规合成方法可以制备合成肽。如下这样的合成化合物被称为“拟肽”：即一种具体肽(例如寡肽)一经发现，该化合物模拟这种肽的构象和所需特征，但回避不需要的特征，例如柔性(失去构象)和键断裂。
一般而言，拟肽的设计和合成包括以所述肽的序列和所需肽(例如最可能的模拟的肽)的构象数据(例如几何数据，如键长和键角)开始，并使用这类数据来确定应设计到所述拟肽中的几何参数。本领域中已知有多种用于实施该步骤的方法和技术，可以使用它们中的任一种。
虽然根据肽模拟物的定义，模拟物被表征为非肽配体，但是存在许多处于天然氨基酸组成的真正的肽和肽模拟物之间的结构。对于肽模拟物是由什么构成的争论仍在持续，然而本领域技术人员能够区分模拟物和肽。肽模拟物通常可以被认为是改良的肽形式。对肽的化学修饰，例如肽键的减少，可以提高其酶稳定性。掺入非天然氨基酸还可以提高肽的活性和选择性。肽在结构和/或化学上变化越多，它就越符合真正的肽模拟物。肽模拟物包括肽、蛋白及其衍生物，例如：包含非肽有机部分的肽、可以包含或不包含氨基酸和/或肽键但保持肽配体结构和功能特征的合成肽、以及包含N取代的甘氨酸的分子即类肽和寡类肽，例如Simonet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：9367(1992)描述的那些；以及抗体，包括抗独特型抗体。
在本发明的另一方面中，本发明的化合物可以通过合成引入多种可选化合物例如支架、翻转模拟物和结合肽的替代物来制备。可以使用这样的氨基酸合成，即使用多种线性和杂环支架代替肽骨架。化学过程和方法包括将带电荷的肽短暂保护形成中性前药用于改善血脑屏障的穿透，以及以诸如杂环、烯烃、氟烯烃和酮亚甲基(ketomethylene)的基团代替肽键。
在本发明的一个实施方案中，所述模拟物对其靶是高度特异的，毒性低，并且是指穿透皮肤屏障以促进创伤愈合的肽模拟物。因此，本发明涵盖这样的化合物，即该化合物被修饰，使得其能够穿透皮肤屏障。
药物组合物
本文使用的“载体”包括在使用剂量和浓度下对暴露于其下的细胞或哺乳动物无毒的可药用载体、赋形剂或稳定剂。所述可药用载体一般是pH缓冲水溶液。可药用载体的实例非限制地包括诸如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸的缓冲剂；包括抗坏血酸的抗氧化剂；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酰、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；形成盐的反荷离子例如钠；以及/或者非离子型表面活性剂例如TWEEN、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS。
本文使用的“有效量”是指足以获得有益或所需临床或生物化学结果的量。可以将有效量给药1次或多次。对于本发明，抑制剂化合物的有效量是足以缓和、改善、稳定、反转、放慢或延缓疾病状态进展的量。在本发明的一个优选实施方案中，“有效量”被定义为能够在给定的一组实验中诱发反应的化合物量。
本文使用的“受试者”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。
本文使用的术语“治疗”是一种用于得到有益或所需临床结果的方法。对于本发明，有益或所需临床结果包括但不限于，减轻症状、降低疾病程度、稳定疾病状态(即不恶化)、延缓或放慢疾病发展、改善或缓和疾病状态以及(部分或完全)缓解，无论这些结果是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以是指与不接受治疗的预计存活时间相比延长存活时间。“治疗”是指治疗性治疗以及预防性或防御性措施。需要治疗的受试者包括已具有病症的受试者，以及要预防所述病症的受试者。“缓和”疾病是指与未治疗的情形相比，疾病状态的程度和/或不利临床表现减轻以及/或者其发展的时间过程变缓或延长。
在本公开内容中提供了多个新血管生成肽的发现。这些药物可通过任何常规途径送递，所述途径包括但不限于经皮途径、局部方式、肠胃外途径、肠胃途径、经支气管途径和经肺泡途径。本发明的实施方案还包括生物技术工具、预防法、治疗法，以及使用前述各项的方法，以研究、治疗和/或预防与糖尿病、创伤和皮肤老化相关的足和腿溃疡及视网膜病变。
治疗化合物的制剂是本领域中公知的，可方便地参考Remington′s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，USA。例如，每千克体重每天可以给予约0.05μg至约20mg。可以调节剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，可以每天给予多个分开的剂量，或者根据治疗情况的紧急程度的指示可以按比例减少剂量。可以以简便的方式给予所述活性化合物，例如通过口服、静脉内(可溶于水的情况下)、肌肉、皮下、鼻内、真皮内或栓塞途径或植入(例如使用通过腹膜内途径的缓释分子，或者通过使用细胞如单核细胞或树突细胞，所述细胞在体外致敏并过继性转移至受体中)。根据给药途径，可能需要将所述肽包被于一种物质中，以保护它免受酶、酸和其他可能使所述成分失活的其他天然条件的作用。
例如，所述肽的低亲脂性会使得它们在胃肠道内可被能够切割肽键的酶破坏以及在胃中被酸水解破坏。为了通过除肠胃外给药之外的途径给予肽，肽将被一种物质包被或者与一种物质一块给药，以防止其失活。例如，肽可以在辅料中给药、与酶抑制剂共给药或者在脂质体中给药。本文考虑的辅料包括间苯二酚、非离子型表面活性剂如聚氧乙烯油基醚和正十六基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸酯(DEP)和特斯乐(trasylol)。脂质体包括常规的脂质体和水包油包水CGF乳剂。
所述活性化合物还可以通过肠胃外或腹膜内给药。还可在丙三醇、液体聚乙二醇及其混合物中，以及在油中制备分散系。在通常的保存和使用条件下，这些制品包含防腐剂以防止微生物的生长。
适用于注射使用的药物形式包括无菌水性溶液(可溶于水的情况下)或分散系，以及用于临用时制备无菌注射溶液或分散系的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，并且流动性必须达到注射器容易排出的程度。它必须在制造和保存条件下稳定，并且必须是经防腐处理的以抵抗微生物例如细菌和真菌的污染。所述载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其合适混合物，以及植物油。例如，通过使用包衣如卵磷脂，对于分散系而言通过保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以保持合适的流动性。对微生物作用的预防可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂实现，例如氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(theomersal)等。在许多情况下，它优选包含等张剂，例如糖或氯化钠。注射组合物的吸收延长可以通过在所述组合物中使用延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶实现。
如果所述肽被合适地保护，那么所述活性化合物可以与例如惰性稀释剂或与可吸收的可食用载体口服；或者可以将它包在硬壳或软壳明胶胶囊中；或者可以将它压成片剂；或者可以将它直接掺入膳食中。对于口服治疗给药，所述活性化合物可以与赋形剂一起掺合，并以可摄取的片剂、含片、糖锭、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、薄片等的形式使用。这类组合物和制品应包含至少1份重量的活性化合物。所述组合物和制品的百分比当然可以变化。活性化合物在这类治疗上可用的组合物中的量使得可以获得合适的剂量。制备本发明的优选组合物或制品，使得口服剂量单位形式包含约0.1μg至2000mg的活性化合物。
所述片剂、丸剂、胶囊剂等还可以包含如下：粘合剂，例如西黄蓍胶、阿卡胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；以及甜味剂，例如可加入蔗糖、乳糖或糖精，或者调味剂，例如薄荷油、冬青油或樱桃味调味剂。如果剂量单位形式是胶囊剂，那么除以上类型的物质外，它还可以包含液体载体。多种其他物质可作为包衣存在，或者改变所述剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可以被虫胶和/或糖包被。糖浆或酏剂可包含所述活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的尼泊金甲酯和尼泊金丙酯、染料和调味剂如樱桃味调味剂或橙味调味剂。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何物质应该是药学纯的，并且所应用的量是基本无毒的。另外，所述活性化合物可以掺入至缓释制品和制剂中。
本文使用的“可药用载体和/或稀释剂”包括任意和所有溶剂、分散介质、包衣抗细菌剂和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂等。将这类介质和试剂用于药物活性物质是本领域中公知的。除了任何常规介质或试剂与所述活性成分不相容的情况，考虑了常规介质或试剂在所述治疗组合物中的使用。补充活性成分也可以掺入至所述组合物中。
多种送递体系是已知的，并且可以用于给予本发明的化合物，例如脂质体、微颗粒、微胶囊的包封，受体介导的胞吞作用。引入方法包括但不限于真皮内途径、肌内途径、腹膜内途径、静脉内途径、皮下途径、鼻内途径、硬膜外途径和口服。所述化合物或组合物可以通过任何常规途径给药，例如通过输注或推注，通过经上皮或粘膜被覆层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收，并且可以与其他生物活性剂一块给药。可以全身给药或局部给药。另外，可能需要将本发明的药物化合物或组合物通过任何合适途径导入中枢神经系统中，所述途径包括脑室内注射和鞘内注射；脑室内注射可以通过脑室内导管帮助进行，所述脑室内导管例如连接至一容器如奥马耶贮器(Ommaya reservoir)。还可以使用肺部给药，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及含雾化剂的制剂。
化妆品组合物
本文使用的“化妆品可用”是指所述成分适合用于与组织(例如皮肤或毛发)接触而无过分毒性、不相容性、不稳定性、刺激、变态反应等。
本文使用的“有效量”是指足以改善人老化皮肤如皱纹和变暗、但低至足以避免严重副作用的量。所述组合物的安全且有效的量可以随以下因素而不同：治疗的区域、最终使用者的年龄和皮肤类型、治疗的持续时间和性质、应用的具体成分或组合物、使用的具体的化妆品可用载体等。
在一个实施方案中，除了所述聚合物之外，所述局部组合物还包含另一化妆品活性剂。“化妆品活性剂”指的是一种对皮肤或毛发具有美容或治疗作用的化合物(例如合成化合物或从天然源或天然提取物分离的化合物)，包括但不限于抗痤疮剂、控油剂、抗微生物剂、抗炎剂、遮光剂、光防护剂、抗氧剂、角质层分离剂、去污剂/表面活性剂、增湿剂、营养物、维生素、能量增强剂、防汗剂、收敛剂、除臭剂、固化剂、抗角质剂以及用于调整毛发和/或皮肤状况的试剂。
参考如下的实施例进一步更详细地描述本发明。然而，这些实施例不应以任何方式被解释为对本发明范围进行限制。
实施例1
用于表征FPRL1拮抗肽的材料和方法
1.1.材料
Fura-2戊乙酰氧甲基酯(pentaacetoxymethylester)(Fura-2-AM)和1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酰氧甲酯(BAPTA-AM)购自Molecular Probes(Eugene，OR)。百日咳毒素(PTX)、U73122和U73433来自Calbiochem(San Diego，CA)。基质胶(Matrigel)来自Becton Dickinson(Bedford，MA)。重组人VEGF和抗-VEGF中和抗体来自R&D systems(Minneapolis，MN)。肽由Peptron Inc.(韩国)合成。PS-SPCL在浦项科技大学的Peptide Library Support Facility(韩国)按前人所述(S.H.Baek，et al，J Biol Chem 271(1996)，pp.8170-8175；R.A.Houghten，et al.，Nature 354(1991)，pp.84-86)准备。
1.2.细胞培养
在37℃下，在供应95％空气和5％CO2的潮湿培养箱中，将MS-1细胞和B16F1鼠黑色素瘤细胞在包含10％FBS的DMEM中培养。如以前的描述(E.A.Jaffe，et al.，J Clin Invest 52(1973)，pp.2745-2756)，通过胶原酶消化从新鲜人脐带制备HUVEC，并且维持在含20％FBS的M-199培养基中。该研究中使用的所有HUVEC不超过第5次传代。人正常成纤维细胞购自美国典型培养物中心(ATCC)。在37℃下，在5％CO2的潮湿气氛中，将所述细胞培养在包含10％FBS和1％抗生素的DMEM中。然后，在每2天或3天更换新鲜培养基后，将所述细胞以0.05％胰蛋白酶-0.53mM EDTA进行次代培养。
1.3.使用[Ca2+]i动员测定在MS-1细胞中反复进行PS-SPCL筛选
在37℃下，在无血清DMEM培养基中将细胞以4μM Fura-2 AM和250μM磺吡酮(sulfinpyrazone)在连续搅拌下孵育30min。然后，将所述细胞以Locke溶液(M.Faehling，et al.，FASEB J 16(2002)，pp.1805-1807)洗涤，并稀释至2×106细胞/mL。将50μL等分的细胞悬液加入96孔板的每个孔中，并在加入肽后测定340和380nm双激发波长下以及在500nm发射波长下的荧光比率变化。在加入肽库后立即对板进行读数，在加入肽和FLEXstation(Molecular Devices)检测之间有大约5秒的时间延迟。阴性对照和阳性对照与测试样品同时进行，以确保所有样品的条件相同。依照Grynkiewicz et al.J BiolChem 260(1985)，pp.3440-3450以[Ca2+]i校正荧光比率。
1.4.[3H]-胸苷掺入测定
将HUVEC以2×104个细胞/孔的密度铺于24孔培养皿，并使之贴附过夜。在血清饥饿12小时后，将所述细胞用或不用标明浓度的SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)下处理48小时。在进行所述测定之前，将细胞以[3H]-胸苷(25mCi/mmol；Amersham，Aylesbury，UnitedKingdom)标记4小时(M.Guidoboni，et al.，Cancer Res 65(2005)，pp.587-595)。通过以10％三氯乙酸洗涤除去未掺入的[3H]-胸苷，然后在37℃下在0.2M NaOH和0.1％SDS中提取掺入的[3H]-胸苷1小时。以液体闪烁计数器(Beckman Instruments，Fullerton，CA)对细胞的放射性进行计数。
1.5.管形成测定
如先前的M.S.Lee，et al.，J Immunol 177(2006)，pp.5585-5594中所述，在存在或不存在VEGF中和抗体的条件下，将HUVEC以及SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)、其打乱的序列FYSRLK-NH2、S1P或VEGF一起接种于已经聚合的基质胶层上。在孵育24小时后，通过相差显微镜观察细胞形态的变化并照相。为了测量毛细血管网络的形成，在40×放大倍数下以标尺测量每个视野中的管总长度。每孔分析3个不同的视野。
1.6.创伤迁移测定
为了确定SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)对HUVEC迁移的影响，如先前的M.S.Lee，et al.，J Immunol 177(2006)，pp.5585-5594中所述进行了体外创伤愈合修复测定。简而言之，将铺板于35-mm培养皿上90％汇合的HUVEC以2-mm宽的剃刀刀片进行创伤，并标记损伤线。在进行创伤后，将所述细胞以无血清培养基洗涤，并在包含1％血清和/或标明量的SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)的M199中进一步孵育。使HUVEC迁移16小时，以无血清培养基冲洗，以无水甲醇固定并以姬姆萨染料(Giemsa)染色。通过对移动到所述损伤线以外的细胞数目进行计数来对迁移进行定量。
1.7.主动脉环测定
使用Nicosia和Ottinetti在In Vitro Cell Dev Biol 26(1990)，pp.119-128中开发的方法，稍有改动。从6周龄Sprague-Dawley大鼠采集主动脉。在除去周围纤维脂肪组织后，将主动脉环浸于培养皿的孔中的基质胶中。在存在或不存在PTX或U73122的情况下，将所述主动脉环培养于包含SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)、S1P、FYSRLK-NH2或VEGF的无血清M199中(5％CO2，37℃)。在第7天，测量主动脉外植体的萌芽情况。
1.8.RT-PCR分析
使用easy-BLUETM总RNA提取试剂盒(Intron Biotechnology，Inc.)依照生产商的说明书从HUVEC分离总RNA。由莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(MMLV-RT)以3μg不含DNA的总RNA和寡聚(dT)15引物(Promega)合成单链cDNA。使用的引物的序列是：人VEGF(150-bp产物)：正向，5′-GAGGAGGGCAGAATCATCACG-3′(SEQ ID NO：25)；反向，5′-ATCGCATGAGGGGCACACAGG-3′(SEQ ID NO：26)。将PCR产物在2％琼脂糖凝胶上进行电泳，并通过溴化乙锭染色显示。
1.9.条件培养基和ELISA
按如下产生条件培养基：向6孔皿中的80％汇合的HUVEC中加入每皿2mL的无血清M199，并孵育标明的时间。将收集的培养基离心以除去任何残留细胞并在-80℃下冷冻。依照制造商说明书对VEGF(R&D系统)进行酶联免疫吸附测定(ELISA)分析。
1.10.统计分析
数据表示为平均值±S.D。先使用Sigma Plot，再使用Student′st-检验在组间进行统计学比较。
实施例2
2.1.鉴定诱导MS-1细胞中[Ca2+]i升高的肽
为了鉴定刺激鼠内皮细胞(MS-1细胞)中细胞内的钙动员的肽，发明人筛查了114个C末端酰胺化的合成六肽库。肽文库在MS-1细胞中的初始筛查结果显示于图1A-1F。
图1A-1F示出针对使MS-1细胞的细胞内钙升高的肽进行的初始PS-SPCL筛查。每幅图示出了已知氨基酸在所述六肽的6个位置中的每一位置上的肽库得到的结果。所述6个位置由19个L-氨基酸中的一个分别定义(例如O1、O2)。剩余的5个位置由所述19个L-氨基酸(不包括半胱氨酸(cystein))的混合物(X)组成。所述文库由114个肽库组成；PS-SPCL总共由47,045,881种不同肽构成。如实施例1中所述，使用Fura-2/AM通过荧光分析测定[Ca2+]i升高。该结果表示3次独立实验中的一次。
在每个位置活性最大的氨基酸是：第一位置Ser(S)和Thr(T)；第二位置Phe(F)；第三位置是Ile(I)、Lys(K)和Arg(R)；第四位置Leu(L)；第五位置Arg(R)；第六位置Arg(R)、Phe(F)、Trp(W)、Tyr(Y)和His(H)。
基于从所述肽文库的初始筛查得到的结果，选出SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)并合成作为原型肽用于进一步分析。C末端酰胺化形式的SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)显示出比羧化的肽(SFKLRY-COOH)更强的活性，并且对首个氨基末端残基的修饰(缺失或被D型氨基酸置换)导致了细胞内钙动员活性完全失去，这表明细胞内钙动员活性是序列特异性的，并且对于活性而言，氨基末端残基比C末端残基更重要。而且，其他六肽的结果也与初始筛查结果(表1)相互关联。许多肽配体以C末端酰胺化的形式存在，该修饰对于一些情况下活性的表达是至关重要的(Y.In，M.Fujii，etal.，Acta Crystallogr B 57(2001)，pp.72-81)；因此，本发明的肽具有作为细胞中的某个(些)受体的配体的特征。
表1
在MS-1细胞上测试的肽的EC50，这从细胞内Ca2+的剂量依赖性变化测定。肽序列与来自3次实验的EC50和S.E.M一起示出。
 SEQ ID NO   序列   平均EC50(μM)   S.E.M.
 1   SFKLRY-COOH   ＞10   N/A
 2   SFKLRY-NH2   1.21   0.01
 3   sFKLRY-NH2(d型)   N/D   N/A
 4   SfKLRY-NH2(d型)   N/D   N/A
 5   SFkLRY-NH2(d型)   N/D   N/A
 6   SFKlRY-NH2(d型)   ＞100   N/A
 7   SFKLrY-NH2(d型)   ＞100   N/A
 8   SFKLRy-NH2(d型)   1.14   0.09
 9   FKLRY-NH2   N/D   N/A
 10   KLRY-NH2   N/D   N/A
 11   LRY-NH2   N/D   N/A
 12   SFKLR-NH2   6.19   0.84
 13   SFKL-NH2   ＞50   N/A
 14   SFK-NH2   N/D   N/A
 15   SFRLRY-NH2   0.97   0.14
 16   SFKLRR-NH2   2.66   0.36
 17   SFILRY-NH2   0.99   0.2
 18   SFILRR-NH2   0.97   0.09
 19   SFKLRW-NH2   2.37   0.4
 20   SFILRW-NH2   1.98   0.03
 21   SFKLRF-NH2   3.16   0.91
 22   SFILRF-NH2   2.01   0.18
 23   SFKLRH-NH2   3.6   0.11
 24   TFKLRY-NH2   3.87   1.15
注：在SEQ ID NO：3至8中，小写字母表示D型氨基酸。
2.2.SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导HUVEC的[Ca2+]i升高、增殖、迁移和管状结构形成
为了证实SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)可诱导人内皮细胞中的[Ca2+]i升高，测量了原代培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞内Ca2+动员。以SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)进行的处理诱导了HUVEC中的[Ca2+]i升高，在1.4±0.15μM产生半最大效应(数据未显示)，但打乱序列FYSRLK-NH2(10μM)未触发HUVEC中的Ca2+动员。由所述肽触发的Ca2+释放的剂量-反应曲线与在小鼠内皮细胞系中观察到的非常相似(图2A-2C)。
图2A-2C示出SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导HUVEC增殖、迁移和管形成。(A)SFKLRY-NH2对HUVEC增殖的影响。将细胞以不同浓度的SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)(0.1-10μM)处理。在孵育48小时后，以液体闪烁计数器对DNA合成的活性计数。竖条代表3次独立实验的平均值±S.D.。*P＜0.05。(B)不同剂量SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)引起的HUVEC迁移率。在创伤后，将HUVEC以标明浓度的SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)(0.1-10μM)孵育16小时，然后对超出参考线的迁移HUVEC计数。值代表进行2次重复的3次独立实验(平均值±S.D.)。*P＜0.05。(C)SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)对HUVEC管形成的影响。将HUVEC接种于减少生长因子的基质胶上并以SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)(1μM)、FYSRLK-NH2(10μM)和S1P(100nM)处理，以进行比较。在孵育24小时后，对所述管样结构照相并测量管形成的长度。值代表进行2次重复的3次独立实验(平均值±S.D.)。*P＜0.05。
血管发生的过程是复杂的并涉及多个不同步骤，包括内皮细胞的细胞外基质降解、增殖、迁移和形态分化以形成管(F.Bussolino，et al.，Trends Biochem Sci 22(1997)，pp.251-256)。为了确定SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)是否会诱导血管发生，在体外血管发生模型中评估了SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)作为血管发生刺激物的能力。本发明人首次检验了SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)对血管发生级联：HUVEC增殖这一方面的影响。
在使用[3H]-胸苷掺入测定评估SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)对HUVEC的DNA合成的影响时，SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)以剂量依赖的方式促进HUVEC的增殖活性，在1μM时使HUVEC的DNA合成增加至约2.5倍。10μM所述肽的增殖活性与10％FBS的增殖活性相当(图2A)。
由于血管发生高度依赖于内皮细胞的运动性，本发明人接下来在体外创伤迁移测定中检查了SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)对HUVEC迁移的影响。如图2B中所示，HUVEC的迁移活性以剂量依赖的方式被加入的SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)增强，在10μM接近最大活性。10μM的SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)的迁移活性是对照(载体或未处理)的1.6倍，SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)的作用与已知为HUVEC迁移的刺激物的10％FBS相当。
为了提供SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)在内皮细胞中功能作用的进一步证据，在体外管形成测定中检查了SFKLRY-NH2(SEQ IDNO：2)对HUVEC形态分化的影响(图2C)。虽然对照细胞聚集并形成簇，但是以SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)(10μM)处理的HUVEC显示了形态变化如伸长和形成线状，这导致了网络形成。SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)的管形成活性(20.25±1.31)是对照细胞(9.4±0.67)的2倍多，10μM SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)的活性类似于100nM S1P(19.69±0.32)的活性，但10μM的打乱序列FYSRLK-NH2(8.96±1.14)对HUVEC的形态分化没有影响(图2C)。这些结果可支持SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)在体外人内皮细胞培养体系中对于新血管形成的序列特异性属性。
2.3.SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导的[Ca2+]i升高由PTX敏感性G蛋白-PLC信号通路介导
为了阐明内皮细胞中SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)介导的信号传递通路，本发明人研究了与使细胞内Ca2+升高相关的上游信号传递机制。已知PLC可产生IP3和二酰基甘油，其可活化细胞内Ca2+动员(M.J.Berridge et al.，Nature 312(1984)，pp.315-321；P.W.Majerus，et al.，Biochem Biophys Res Commun 268(2000)，pp.47-53；和Y.Nishizuka，Science 258(1992)，pp.607-614)。为了对PLC介导的信号传递通路在SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导的Ca2+信号传递中的可能作用进行研究，研究了PLC抑制剂U73122及其无活性类似物U73433对所述肽诱导的细胞内钙动员的影响。
图3A-3B示出BAPTA、U73122和PTX抑制MS-1细胞中SFKLRY-NH2诱导的[Ca2+]i升高。在存在和不存在细胞内钙螯合剂BAPTA-AM(A)、PLC抑制剂U73122及其无活性类似物U73433以及PTX(B)的情况下，测量SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导的细胞内Ca2+动员活性。(A)在37℃下，将所述细胞在包含10μMBAPTA-AM的DMEM中以Fluo-4/AM预孵育30分钟。将细胞悬浮于包含0.2mM EGTA的无Ca2+的Locke溶液中，并以标明浓度的SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)处理。通过在488nm下激发并在520nm下发射来确定荧光强度的变化。(B)将细胞以Fura-2分别在有或无U73122(10μM)、U73433(10μM)下预孵育30分钟，以及在有或无PTX(100ng/mL)下预孵育2小时。然后，将载有Fura-2的细胞悬浮于无Ca2+的Locke溶液中，然后以1μM SFKLRY-NH2(SEQ IDNO：2)处理。数据代表进行2次重复的3次独立实验的平均值±S.D.。*P＜0.05。
U73122(10μM)完全消除了所述肽诱导的细胞内钙动员，但U73433(10μM)几乎没有抑制作用(图3B)。由于通过Gi偶联受体-PLC-细胞内Ca2+信号通路的HUVEC的血管生成活性的诱导已经有详细的描述(D.English，et al.，Biochim Biophys Acta 1582(2002)，pp.228-239；O.H.Lee，et al.，Biochem Biophys Res Commun 268(2000)，pp.47-53；F.Wang，et al.，J Biol Chem 274(1999)，pp.35343-35350)，因此检查了G蛋白参与SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导的细胞内Ca2+动员的情况。在以百日咳毒素(PTX)(100ng/mL)将MS-1细胞处理2小时，之后以SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)处理时，如图3B中所示，所述肽依赖的细胞内Ca2+动员被PTX预处理显著地减弱，这表明该反应很大程度上由PTX敏感的G蛋白驱动。一般而言，[Ca2+]i升高的实现是通过从内库释放Ca2+，或者通过从细胞外环境流入。
为了确定所述Ca2+库的来源，在包含0.2mM EGTA的无Ca2+的Locke溶液中测量了MS-1细胞中的所述肽诱导的[Ca2+]i升高。虽然在不存在BAPTA-AM的情况下细胞内Ca2+浓度被证明以剂量依赖的方式升高(图3A)，但通过将细胞内Ca2+螯合剂BAPTA-AM(10μM)预载入MS-1细胞来消耗细胞内Ca2+完全消除了[Ca2+]i升高，甚至在以最大有效肽浓度处理的细胞中也是如此(图3A)。这些结果表明，SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)可以触发来自细胞内Ca2+库的[Ca2+]i升高，并且PTX敏感的G蛋白在MS-1细胞内可能参与PLC介导的细胞内钙动员。
如果假设SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)结合一种或多种膜受体并诱导细胞内Ca2+产生，则有必要了解所涉及的信号转导机制。通过α亚基的ADP核糖基化抑制G蛋白的PTX很大程度上减弱了细胞内Ca2+升高(图3B)，并显著消除SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)在大鼠主动脉环中导致内皮细胞从血管外植体向外生长的活性(图4)。因此，本发明人的数据表明，PTX敏感性G蛋白的介导作用是SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导的血管发生作用中的重要信号。G蛋白之后的信号传递可导致多种细胞反应，包括磷脂酶C的活化，所述活化磷脂酶C水解PIP2并随后形成介导细胞内钙从细胞内Ca2+存储库中释放的IP3和DAG。多种激素、生长因子和多种神经递质参与该信号传递通路(M.J.Berridge.，Nature 312(1984)，pp.315-321；P.W.Majerus，et al.，Cell 63(1990)，pp.459-465；Y.Nishizuka，Science 258(1992)，pp.607-614)。磷脂酶C抑制剂U73122消除了SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)启动的细胞内钙动员(图3B)，因此表明[Ca2+]i升高依赖于PLC的活化。基于这些结果，SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)可能通过如下方式触发其反应：活化PTX敏感的G蛋白偶联细胞表面受体，然后进行PLC介导的来自内部存储库的细胞内钙动员(图3A)。
因此，本发明人的数据表明，百日咳毒素敏感的G蛋白的介导作用是SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导的血管发生作用中的重要信号，该介导作用涉及的是归属于GPCR类别的受体，而非直接的G蛋白受体激活物如黄蜂毒素(R.Weingarten，J Biol Chem 265(1990)，pp.11044-11049)。黄蜂毒素是两亲性肽，并且在包括免疫和神经细胞系的多种细胞中具有细胞内Ca2+动员活性(J.F.Klinker，et al.，Biochem J 304(1994)，pp.377-383；T.Murayama，et al.，J CellPhysiol 169(1996)，pp.448-454)。然而，SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)是亲水性肽，它难以穿透细胞膜，所述细胞内钙动员活性出现于诸如MC3T3-E1、C6bu1、NIH/3T3和C2C12细胞的细胞中，但不出现在神经元或免疫细胞例如PC12和U937(数据未显示)。然而，为了在其他细胞中达到相同水平的钙反应，需要10倍剂量或更高剂量的SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)。本发明人的结果表明，SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)的推定受体广泛表达于间质细胞系细胞中，SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)在内皮细胞中的作用更加特异。
最近，几项研究描述了在血管发生过程的调节过程中活化G蛋白偶联受体(GPCR)后开启PLC-Ca2+信号传递通路的结果(D.English，et al.，Biochim Biophys Acta 1582(2002)，pp.228-239；D.S.Gelinas，et al.，Br J Pharmacol 137(2002)，pp.1021-1030；Y.M.Kim，et al.，J Biol Chem 277(2002)，pp.6799-6805；F.Wang，et al.，J BiolChem 274(1999)，pp.35343-35350)。已经知道Gi偶联受体介导的PLC-Ca2+信号传递通路在S1P刺激的黏着斑形成和内皮细胞迁移中是重要的(O.H.Lee，et al.，Biochem Biophys Res Commun 268(2000)，pp.47-53；F.Wang，et al.，J Biol Chem 274(1999)，pp.35343-35350)。在新血管形成的初始阶段，内皮细胞的萌芽是关键步骤，需要细胞增殖、细胞迁移和管形成(W.Risau，et al.，Nature 386(1997)，pp.671-674)。本发明人的结果表明，HUVEC的细胞增殖、细胞迁移和管形成经SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)处理后以剂量依赖的方式增强(图2)。另外，在SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)刺激下内皮细胞从离体大鼠主动脉环向外生长的结果类似于通过VEGF处理得到的结果(图4)。SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)导致的内皮细胞从血管外植体的萌芽在PTX或U73122的处理下显著减少，这与这些抑制剂对所述肽诱导的[Ca2+]i动员的作用是一致的。这些结果暗示，PTX敏感的GPCR-PLC-Ca2+信号通路对于SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导的内皮细胞萌芽是必不可少的。
2.4.SFKLRY-NH2对离体血管萌芽的诱导
为了阐明SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)是否在离体血管内皮细胞萌芽中起作用，在存在包括1μM SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)、10ng/mL VEGF、10nM S1P和10％FBS的多种刺激物下分析了主动脉环。SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)(1μM)引起了内皮细胞从血管外植体显著向外生长，其血管萌芽活性高于10nM S1P和10ng/mLVEGF处理的活性。图4示出SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导离体血管萌芽。在基质胶中将大鼠主动脉外植体以含有SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)(1μM)、FYSRLK-NH2(1μM)，S1P(10nM)、VEGF(10ng/mL)、含U73122(10μM)或PTX(50ng/mL)的SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)(1μM)或者10％FBS的M-199孵育，并在孵育7天后照相。然后进行3次独立实验，每次实验重复两次。
另外，打乱的序列FYSRLK-NH2(1μM)的活性可忽略不计。与PTX和U73122对[Ca2+]i动员的作用相符，SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)促进的血管萌芽活性被其与PTX(50ng/mL)或U73122(10μM)的共处理显著减弱(图4)。因此，这些结果表明，PLC-[Ca2+]i信号传递通路——PTX敏感的G蛋白参与所述肽对血管萌芽的增强作用。
2.5.SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)对VEGF mRNA的上调
为了弄清楚VEGF信号传递通路参与SFKLRY-NH2(SEQ IDNO：2)诱导的血管发生过程中的可能性，在以SFKLRY-NH2(SEQ IDNO：2)处理的HUVEC中通过RT-PCR测量了血管发生因子的表达。图5A-5B示出SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)引起VEGF和VEGFR-1mRNA的上调。对从以SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)处理的原代培养HUVEC中分离的mRNA进行RT-PCR分析。所示数据代表3次独立实验。在HUVEC中以SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)(10μM)处理0、1、2、3、4、8或12小时(A)，并以0、0.01、0.1或10μM处理2小时，使用VEGF-A的特异性引物扩增VEGF-A。将GAPDH用作参照基因。
如图5A中所示，强血管生成因子VEGF-A的表达水平增加至3.77倍，并呈现时间依赖方式的诱导作用，在2小时内达到最大表达。
对VEGF-A的诱导持续8小时和4小时以上。另一方面，SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)刺激不影响bFGF和FGFR-2的表达水平(数据未显示)。所述肽以剂量依赖的方式引发对VEGF-A的诱导(图5B)。这些数据表明，增强的VEGF表达在HUVEC中可能参与SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)引起的血管形成作用。
2.6.SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)经VEGF上调来诱导血管生成作用
通过用RT-PCR分析评估VEGF的信使的增加，本发明人表明了这些蛋白的上调可能参与SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导的血管发生(图5A & 5B)。为了进一步支持对VEGF-A的诱导在SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导的血管发生中的可能作用，在管形成测定中检验了VEGF中和抗体对所述肽诱导的血管发生的影响。
图6A-6B示出抗VEGF抗体在HUVEC中抑制SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导的管形成。在包含SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)(10μM)或VEGF-A(10ng/mL)的培养基中，将细胞与抗VEGF-A中和抗体(0.1、1或10μg/mL)一起孵育24小时。在孵育24小时后，对所述管样结构照相并测量管形成的长度。数据表示为2次独立实验中的一次，值是2次独立实验的平均值。与载体处理相比*P＜0.05。
SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导的HUVEC管形成(18.2±0.77)显示出通过与VEGF中和抗体的共处理而统计学显著地减弱，抑制大约一半，该水平与对照类似(VEGF+VEGF中和抗体，12.1±0.63)(图6A)。另外，在SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)刺激后，VEGF-A mRNA表达提高至最大3.77倍伴随有HUVEC的VEGF-A产量显著增加，这通过ELISA确定(图6B)。这些结果表明，对VEGF的诱导参与SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导的血管发生。
为了研究SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)是否可能通过诱导其他血管发生因子影响血管发生，对参与血管发生的公知信号传递分子进行RT-PCR分析。本发明人观察到在HUVEC中VEGF-A表达早在SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)处理2小时时就有增加(图5)，而bFGF和FGFR-2的表达水平没有变化(数据未显示)。另外，VEGF中和抗体高度抑制了SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导的HUVEC管形成(图6A)。监测分泌至培养基中的VEGF-A蛋白的ELISA分析也表明，在HUVEC中SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)的刺激作用导致VEGF积累增加至3倍(图6B)。这些结果使本发明人相信，SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)诱导的血管生成活性的机制可能通过诱导VEGF而被介导，并且VEGF中和抗体的半抑制结果(图6A)还表明，在SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)刺激诱导的血管生成活性中存在未被表征的介导物。
最近的研究表明VEGF诱导在如下临床环境下的重要性：在动物模型中，转移编码VEGF的质粒或腺病毒DNA在心肌梗死和十二指肠溃疡愈合中具有有利效应(X.Deng，et al.，J Pharmacol Exp THer311(2004)，pp.982-988；J.Rutanen，et al.，Circulation 109(2004)，pp.1029-1035；Y.S.Yoon，et al.，Mol Cell Biochem 264(2004)，pp.63-74)。虽然应测试SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)是否可诱导体内VEGF表达，但是与基因送递相比肽处理将更有利，原因是治疗性质粒基因送递至靶器官是困难的且经常是短暂的。再者，在已知的VEGF诱导物如TNF-α、转化生长因子β、白细胞介素1β和内皮缩血管肽(F.Bussolino，et al.，J Pharmacol Exp Ther 311(2004)，pp.982-988)中，SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)是最小的肽，它们与其他蛋白相比在如下方面有几项优点：合成更容易、比蛋白表达成本低并且不一定要表达体系；本发明人简单地得到了高纯度的肽。SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)对血管重构的这类潜在益之处可表明SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)在由血供受损诱发的人疾病方面的潜在应用，所述人疾病包括与糖尿病或创伤相关的足和腿溃疡。
实施例3：对动物模型中创伤愈合的促进
以Sprague-Dawley(6周龄、雄性、体重140～160克)进行创伤愈合实验，将所述动物随机分成3组。在gerolan麻醉下，将背部脱毛并将皮肤以70％乙醇消毒。使用8-mm皮肤活检穿孔器在背部皮肤上形成全厚度创伤。将创伤部位以Tegaderm覆盖。本发明人对每组局部给予对照(HBSS)、SFKLRY 10uM和fysrlk 10uM，每天一次，持续14天。在14天后，将大鼠处死，然后取出创伤组织。然后，将这些样品分别固定于4％甲醛中，通过梯度乙醇系列脱水，在二甲苯中透明并包埋于石蜡中。切4μm的连续切片，并以苏木精和伊红(H&E)染色。
基于在体外创伤迁移测定中SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)对HUVEC迁移的阳性作用，在大鼠模型中检查了SFKLRY-NH2(SEQID NO：2)对创伤的影响。在第14天时的活组织检查的创伤组织的组织学显示于图7A & 7B中。图7A-7B示出愈合创伤组织在第14天时的组织学。在图7A中，假处理的创伤表现出重度水肿和杂乱的微结构。在图7B中，通过以SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)(10μM)处理观察到了微结构几乎完全恢复正常。
与对照(PBS处理)相比，以SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)处理的创伤几乎完全恢复。
实施例4：胶原合成的诱导
考虑到血管形成和皮肤老化之间可能的联系，研究了SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)作为抗皱化妆品组分的可能用途。通过蛋白质印迹确定了I型胶原的表达。将来自每组的成纤维细胞沉淀并用冰冷的细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Technologies)提取。在4℃下，将细胞裂解物以15000g离心15分钟，并将来自每组的上清液通过8％SDS-PAGE分离，之后转移至硝酸纤维素膜。在封闭溶液(5％脱脂乳)中孵育后，在4℃下将膜以一抗(Sigma-Aldrich)孵育过夜。将膜以1×TBST溶液洗涤，之后以二抗(1∶5000稀释，Amersham Life Sciences)孵育2小时。将所述膜以ECL系统(Amersham Life Sciences)检测，通过Scan-gel-it软件分析蛋白带的相对强度。
如图8中所示，SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)显著增强了I型胶原表达，在10μM的浓度时出现最大反应。图8示出SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)对I型胶原合成的影响。将人成纤维细胞以SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)(0.1，1，10μM)处理。在24小时后，以蛋白质印迹确定I型胶原的表达。实验重复3次，结果可重复。
实施例5：对黑色素瘤细胞中黑色素形成的抑制
为了研究SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)对黑色素生成的可能作用，在存在1、10或50μM浓度的SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)的条件下将以α-MSH刺激的B16黑色素瘤细胞培养5天。将B16黑色素瘤细胞以给定浓度的SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)处理，之后以α-MSH(10nM)处理5天。在处理后，通过与胰蛋白酶/EDTA短暂孵育使之不再贴壁。在沉淀后，对细胞片状沉淀物照相并在煮沸的2M NaOH中溶解20分钟。在405nm下进行黑色素含量的分光光度分析。
图9A-9B示出SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)对B16黑色素瘤细胞中黑色素含量的影响。在图9A中，将B16黑色素瘤细胞以给定浓度的SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)处理，之后以α-MSH(10nM)处理5天。在处理后，通过与胰蛋白酶/EDTA短暂孵育使之不再贴壁。在沉淀后，对细胞片状沉淀物照相(图9A)并在煮沸的2M NaOH中溶解20分钟。在405nm下进行黑色素含量的分光光度分析(图9B)。实验结果表示为对照(α-MSH处理)的百分数。
如图9A和9B中所示，细胞片状沉淀物的颜色退色，以SFKLRY-NH2(SEQ ID NO：2)处理对黑色素形成产生显著抑制作用(抑制大约60％)，在1μM下呈现饱和反应。
本文引用的所有参考文献通过援引的方式全文纳入本文。仅利用常规实验，本领域技术人员就应认识到或者能够确定本文具体描述的本发明的具体实施方案的许多等价方案。这类等价方案意欲包括在权利要求书的范围内。
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Claims (9)

1.一种血管生成肽，选自氨基酸序列SEQ ID NO：2、8、12、14或15-24的血管生成肽，并且
其中所述血管生成肽通过以-NH2取代C末端羧基而被修饰。
2.一种用于治愈创伤、促进胶原合成或抑制黑色素合成的组合物，包含权利要求1的血管生成肽。
3.权利要求2的组合物，其中所述组合物是一种用于创伤愈合的药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求1的血管生成肽和可药用载体。
4.权利要求2的组合物，其中所述组合物是一种用于改善老化皮肤状况的化妆品组合物，其包含作为活性成分的权利要求1的血管生成肽和化妆品可用载体。
5.包含作为活性成分的权利要求1的血管生成肽和化妆品可用载体的化妆品组合物用于抗皱和皮肤美白的用途。
6.权利要求1的血管生成肽在制备用于促进哺乳动物受试者血管发生的药物中的用途。
7.权利要求6的用途，其中所述受试者需要血管发生用于上皮创伤愈合。
8.权利要求6的用途，其中所述受试者需要血管发生用于诱导胶原合成。
9.权利要求6的用途，其中通过局部、全身、口服或肠胃外途径给予所述药物。
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