CN105695495A - 一种高活性人趋化因子的制备方法及用途 - Google Patents

一种高活性人趋化因子的制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高活性人趋化因子的制备方法及用途，包括如下步骤：步骤1：根据NCBI数据库中Eotaxin-1的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；步骤2：通过设计引物在其N端引入一个或多个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoR I和Hind III；步骤3：利用PCR技术将目的片段进行扩增，再将基因片段双酶切后连接到用相同酶切割后的载体上面，而后导入大肠杆菌中进行异源表达，生产Eotaxin-1蛋白。本发明方法提供了一种简便、快速、低成本、高产量、高纯度的细胞趋化因子Eotaxin-1的制备方法，并对其活性进行了验证。

Description

一种高活性人趋化因子的制备方法及用途
技术领域
本发明涉及基因工程和食品医药技术领域，特别涉及一种高活性细胞因子Eotaxin-1的制备方法及用途。
背景技术
高活性细胞趋化因子Eotaxin-1属于β趋化因子或CC化学趋化因子家族的成员，是一种分子量多为8-10kDa的一种蛋白质。以近N-端处有2个相邻的半胱氨酸为特征。通过与具有7个跨膜区的G蛋白偶联受体即趋化因子受体结合，激活细胞内的信号转导通路，在细胞的迁移中发挥了重要作用。
目前越来越多的研究表明Eotaxin-1的趋化因子受体CCR3在炎症反应、过敏性哮喘等疾病中发挥着关键作用，是重要的药物靶点，通过阻断CCR3的信号传导途径将有望大大缓解或彻底治愈炎症及过敏性哮喘等相关疾病。因此，Eotaxin-1作为趋化因子的重要的组成部分，其研究受到了广泛的关注。
Eotaxin-1最早发现于致敏豚鼠抗原刺激后的支气管肺泡灌溉液(BALF)中，是一种嗜酸性粒细胞的特异性趋化因子，其基因位于第17号染色体的q21.1-21.2区(GriffithsjohnsonD.A.,CollinsP.D.,RossiA.G.,etal.Thechemokine,eotaxin,activatesguinea-pigeosinophilsinvitroandcausestheiraccumulationintothelunginvivo[J].Biochem.Biophys.Res.Commun.,1993,V197(3):1167-1172)。
1996年人Eotaxin-1基因被克隆，经研究发现，在生理pH条件下，存在单体和二聚体之间的动态平衡。在发挥趋化功能的浓度下，Eotaxin-1呈单体形式。单体的结构中含有三个反向平行的β片层和一个覆盖于其上的α螺旋，以及一个无序的N-端，可以与受体灵活、定向的结合。这样的结构及N-端对受体结合和信号传导都是很关键的，形成Eotaxin-1对大量存在于嗜酸粒细胞上的CCR3受体具高度选择性的结构基础(CrumpM.P.,RajarathnamK.,KimK.S.,etal.Solutionstructureofeotaxin,achemokinethatselectivelyrecruitseosinophilsinallergicinflammation[J].JournalofBiologicalChemistry,1998,V273(35):22471-22479)。
目前Eotaxin-1的获得由两种主要途径：从活体中天然提取和用基因工程的方法进行基因克隆到原核细胞中进行异源表达。第一种方法产量低，成本过高，不利于大规模生产，第二种方法经常会产生过量表达，然而过量表达会产生不溶和无活性的多肽，不溶的聚集物通常形成包涵体(ProudfootA.E.I.,BorlatF..ChemokineProtocols[M].HumanaPress,NewYork,2002,75
87)。
重组蛋白被包裹在包涵体中是不具有生物活性的，必须重新增溶、变性和复性以促进分子内正确二硫键和自然构象的形成，这个过程由于增加了许多色谱分离纯化步骤而比较费时且复性效果不好。因此，需要建立一个更加快速、高效的趋化因子表达系统，不仅可溶性蛋白表达量高，而且分离纯化步骤简单。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：提供了一种简便、快速、低成本、高产量、高纯度的细胞趋化因子Eotaxin-1的制备方法，并对其活性进行了验证。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种高活性细胞因子的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：根据NCBI数据库中Eotaxin-1的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；
步骤2：通过设计引物在其N端引入一个或多个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoRI和HindIII；
步骤3：利用PCR技术将目的片段进行扩增，再将基因片段双酶切后连接到用相同酶切割后的载体上面，而后导入大肠杆菌中进行异源表达，生产Eotaxin-1蛋白。
所述步骤1中，所得人工合成目的基因的核苷酸序列优选为：GGTCCGGCATCTGTTCCGACCACGTGCTGTTTTAACCTGGCAAATCGTAAAATTCCGCTGCAGCGCCTGGAAAGCTATCGTCGCATCACCTCTGGCAAATGCCCGCAAAAAGCGGTGATTTTCAAAACGAAACTGGCGAAAGATATCTGTGCCGACCCGAAAAAAAAATGGGTGCAAGACTCAATGAAATACCTGGACCAAAAATCCCCGACGCCGAAACCGTAA。
所述步骤2中，所得修饰后的人工合成目的基因的核苷酸序列优选为：
EcoRIsite6×HisTEVcleavagesiteHindⅢsite
5-AGTGAATTC GAAAACCTGTATTTTCA GGGT-Eotaxin-1-TAAAAGCTTACT-3。
所述高活性细胞因子的制备方法，可以进一步包括：
步骤4：将诱导表达后的大肠杆菌收集、破碎、离心、过滤、镍柱亲和层析、凝胶过滤脱盐、酶切除去His标签后得到纯度很高的蛋白。
所述Eotaxin-1基因优选源自嗜酸性粒细胞(eosinophils)。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种人工合成目的基因，所述基因是根据NCBI数据库中Eotaxin-1的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；
所得人工合成目的基因的核苷酸序列为：GGTCCGGCATCTGTTCCGACCACGTGCTGTTTTAACCTGGCAAATCGTAAAATTCCGCTGCAGCGCCTGGAAAGCTATCGTCGCATCACCTCTGGCAAATGCCCGCAAAAAGCGGTGATTTTCAAAACGAAACTGGCGAAAGATATCTGTGCCGACCCGAAAAAAAAATGGGTGCAAGACTCAATGAAATACCTGGACCAAAAATCCCCGACGCCGAAACCGTAA。
为解决上述技术问题，本发明另提供了一种人工合成目的基因，所述基因是根据NCBI数据库中Eotaxin-1的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；并通过设计引物在其N端引入一个或多个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoRI和HindIII；
所得修饰后的人工合成目的基因的核苷酸序列为：
EcoRIsite6×HisTEVcleavagesiteHindⅢsite
5-AGTGAATTC GAAAACCTGTATTTTCA GGGT-Eotaxin-1-TAAAAGCTTACT-3。
为解决上述技术问题，本发明又提供了一种如前述任一项所述高活性细胞因子的制备方法在制备治疗肝炎、关节炎、特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、寄生虫感染、气道慢性炎症、艾滋病(HIV)、老年性黄斑变性、脉络膜新生血管性疾病、动脉粥样硬化、免疫性血小板减少症、和/或炎症及免疫相关疾病的药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明再提供了一种如前述任一项所述人工合成基因在制备治疗肝炎、关节炎、特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、寄生虫感染、气道慢性炎症、艾滋病(HIV)、老年性黄斑变性、脉络膜新生血管性疾病、动脉粥样硬化、免疫性血小板减少症、和/或炎症及免疫相关疾病的药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明另提供了一种如前述任一项所述高活性细胞因子的制备方法和/或所述人工合成基因，在治疗肝炎、关节炎、特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、寄生虫感染、气道慢性炎症、艾滋病(HIV)、老年性黄斑变性、脉络膜新生血管性疾病、动脉粥样硬化、免疫性血小板减少症、和/或炎症及免疫相关疾病的药物设计方面的应用。
所述的表达载体为普通大肠杆菌表达载体，优选质粒pET28a、pET32a、pMAL-p4X，分别对应于大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3)、Origami、TB1。
本发明还进一步对所用表达载体、诱导时机、诱导温度和时间进行了优化，最终优化的表达条件为：表达载体选用pET28a、OD600＝1.0～1.3、诱导时间为8h、诱导温度为25℃。
本发明方法还可以用SDS-PAGE、质谱方法对制备得到的蛋白的纯度和分子量进行了分析和验证，用表面等离子共振技术(SPR)对制备得到的Eotaxin-1的生物活性进行了表征。
本发明制备得到的Eotaxin-1有生物活性且纯度很高，在相关疾病的治疗和药物的设计方面显示了很大的应用前景。
本发明有益的技术效果在于：
1.本发明为运用基因工程技术，将Eotaxin-1基因进行了优化，并在其N端加入了能与Ni柱特异性结合的His标签以及后续可以去除标签的TEV酶切位点，在N端和C端分别加入限制性酶切位点EcoRI和HindIII，连接到表达载体上然后转入相应的大肠杆菌表达体系中，在菌体OD600＝1.0～1.3时加入IPTG诱导蛋白表达。这一生产过程生产周期为12个小时，同时大肠杆菌易于实现高密度大规模培养，从而大大缩短了培养时间，降低生产成本。
2.大肠杆菌细胞容易破碎，且含杂蛋白比较少，因为是诱导型表达，有利于目的蛋白的富集和反应过程的调控，使得下游纯化过程变得更加简单，容易获得低成本、高产量、高纯度的Eotaxin-1蛋白。
3、本发明通过优化最终选择表达菌株pET28a/BL21(DE3)，使Eotaxin-1水溶性表达量高，包涵体形成较少，所得蛋白结构折叠正确、性质稳定。培养1L大肠杆菌可以获得8.7mg左右的蛋白，和传统提取方法相比产量提高100倍以上。
4、本发明Eotaxin-1的分离纯化过程简单，只经过镍柱亲和层析和凝胶层析两步，减少了过多的分离纯化步骤对蛋白活性和产量的影响。
5、在蛋白的纯化过程中杂蛋白组氨基酸的含量比较少，在与目的蛋白进行竞争性结合Ni柱时，由于结合力较弱非常容易就被少量的咪唑洗脱下来，而目的蛋白用500mM的咪唑洗脱，从而得到纯度很高的蛋白。
6、本发明中通过Eotaxin-1表达体系的选择、表达条件的优化和表达过程的调控，最终获得的蛋白单体比较多，二聚体和寡聚体比较少。
7、本发明用表面等离子共振技术(SPR)对制备得到的Eotaxin-1的生物活性进行了验证，通过活性实验可以看出本实验室制备的Eotaxin-1比商业化的Eotaxin-1与CCR3的结合亲和力高10倍，因此在相关疾病的治疗和药物的设计方面显示了更大的应用前景。
附图说明
图1为本发明细胞因子Eotaxin-1表达载体PET28a-Eotaxin-1基因的构建图。
图2为本发明表达藻蓝胆素重组载体pET32a-Eotaxin-1基因的构建图。
图3为本发明表达藻蓝胆素重组载体pMAL-p4X-Eotaxin-1基因的构建图。
图4为不同表达载体表达Eotaxin-1蛋白的优化图。
图5为不同诱导时机Eotaxin-1蛋白表达量优化图。
图6为不同诱导温度Eotaxin-1蛋白表达量优化图。
图7为His-Tag-Eotaxin-1融合蛋白的纯化图。
图8为Eotaxin-1蛋白的纯化图。
图9为Eotaxin-1的质谱检测图。
图10为本发明表面等离子共振技术(SPR)验证Eotaxin-1活性效果图。
具体实施方式
以下将结合实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。
需要说明的是，为节省说明书撰写篇幅，避免不必要的重复和浪费，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明公开了细胞因子Eotaxin-1的制备方法，包括如下步骤：根据NCBI数据库嗜酸性粒细胞中Eotaxin-1成熟蛋白的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因，所得核苷酸序列为：GGTCCGGCATCTGTTCCGACCACGTGCTGTTTTAACCTGGCAAATCGTAAAATTCCGCTGCAGCGCCTGGAAAGCTATCGTCGCATCACCTCTGGCAAATGCCCGCAAAAAGCGGTGATTTTCAAAACGAAACTGGCGAAAGATATCTGTGCCGACCCGAAAAAAAAATGGGTGCAAGACTCAATGAAATACCTGGACCAAAAATCCCCGACGCCGAAACCGTAA。通过设计引物在其N端引入6个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoRI和HindIII。最终得到含有Eotaxin-1成熟蛋白的核苷酸序列如下：
EcoRIsite6×HisTEVcleavagesiteHindⅢsite
5-AGTGAATTC GAAAACCTGTATTTTCA GGGT-Eotaxin-1-TAAAAGCTTACT-3
所得基因序列碱基总数为282。利用PCR技术，将目的片段进行扩增，再将基因片段双酶切后连接到用相同酶切割后的表达载体上，而后导入大肠杆菌宿主细胞中进行异源表达，生产Eotaxin-1蛋白。将重组大肠杆菌扩大培养，诱导表达后收集菌体细胞，并进行高压破碎、高速离心、0.45μm微孔滤膜过滤、镍柱亲和层析、凝胶过滤脱盐、酶切除去His标签一系列分离纯化过程，最终得到可溶性表达量(8.7mg/l)和纯度都很高的Eotaxin-1蛋白。
本发明还对所用表达载体、诱导时机、诱导温度和时间进行了优化，最终优化的表达条件为：表达载体选用pET28a、OD600＝1.0～1.3、诱导时间为8h、诱导温度为25℃。同时用SDS-PAGE、质谱方法对制备得到的蛋白的纯度和分子量进行了分析和验证，用表面等离子共振技术(SPR)对制备得到的细胞因子Eotaxin-1的生物活性进行了表征。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种高活性细胞因子的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：根据NCBI数据库中Eotaxin-1的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；
步骤2：通过设计引物在其N端引入一个或多个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoRI和HindIII；
步骤3：利用PCR技术将目的片段进行扩增，再将基因片段双酶切后连接到用相同酶切割后的载体上面，而后导入大肠杆菌中进行异源表达，生产Eotaxin-1蛋白。
所述步骤1中，所得人工合成目的基因的核苷酸序列优选为：GGTCCGGCATCTGTTCCGACCACGTGCTGTTTTAACCTGGCAAATCGTAAAATTCCGCTGCAGCGCCTGGAAAGCTATCGTCGCATCACCTCTGGCAAATGCCCGCAAAAAGCGGTGATTTTCAAAACGAAACTGGCGAAAGATATCTGTGCCGACCCGAAAAAAAAATGGGTGCAAGACTCAATGAAATACCTGGACCAAAAATCCCCGACGCCGAAACCGTAA。
所述步骤2中，所得修饰后的人工合成目的基因的核苷酸序列优选为：
EcoRIsite6×HisTEVcleavagesiteHindⅢsite
5-AGTGAATTC GAAAACCTGTATTTTCA GGGT-Eotaxin-1-TAAAAGCTTACT-3。
所述高活性细胞因子的制备方法，可以进一步包括：
步骤4：将诱导表达后的大肠杆菌收集、破碎、离心、过滤、镍柱亲和层析、凝胶过滤脱盐、酶切除去His标签后得到纯度很高的蛋白。
所述Eotaxin-1基因优选源自嗜酸性粒细胞(eosinophils)。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种人工合成目的基因，所述基因是根据NCBI数据库中Eotaxin-1的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；
所得人工合成目的基因的核苷酸序列为：GGTCCGGCATCTGTTCCGACCACGTGCTGTTTTAACCTGGCAAATCGTAAAATTCCGCTGCAGCGCCTGGAAAGCTATCGTCGCATCACCTCTGGCAAATGCCCGCAAAAAGCGGTGATTTTCAAAACGAAACTGGCGAAAGATATCTGTGCCGACCCGAAAAAAAAATGGGTGCAAGACTCAATGAAATACCTGGACCAAAAATCCCCGACGCCGAAACCGTAA。
为解决上述技术问题，本发明另提供了一种人工合成目的基因，所述基因是根据NCBI数据库中Eotaxin-1的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；并通过设计引物在其N端引入一个或多个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoRI和HindIII；
所得修饰后的人工合成目的基因的核苷酸序列为：
EcoRIsite6×HisTEVcleavagesiteHindⅢsite
5-AGTGAATTC GAAAACCTGTATTTTCA GGGT-Eotaxin-1-TAAAAGCTTACT-3。
为解决上述技术问题，本发明又提供了一种如前述任一项所述高活性细胞因子的制备方法在制备治疗肝炎、关节炎、特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、寄生虫感染、气道慢性炎症、艾滋病(HIV)、老年性黄斑变性、脉络膜新生血管性疾病、动脉粥样硬化、免疫性血小板减少症、和/或炎症及免疫相关疾病的药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明再提供了一种如前述任一项所述人工合成基因在制备治疗肝炎、关节炎、特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、寄生虫感染、气道慢性炎症、艾滋病(HIV)、老年性黄斑变性、脉络膜新生血管性疾病、动脉粥样硬化、免疫性血小板减少症、和/或炎症及免疫相关疾病的药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明另提供了一种如前述任一项所述高活性细胞因子的制备方法和/或所述人工合成基因，在治疗肝炎、关节炎、特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、寄生虫感染、气道慢性炎症、艾滋病(HIV)、老年性黄斑变性、脉络膜新生血管性疾病、动脉粥样硬化、免疫性血小板减少症、和/或炎症及免疫相关疾病的药物设计方面的应用。
所述的表达载体为普通大肠杆菌表达载体，优选质粒pET28a、pET32a、pMAL-p4X，分别对应于大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3)、Origami、TB1。
本发明还进一步对所用表达载体、诱导时机、诱导温度和时间进行了优化，最终优化的表达条件为：表达载体选用pET28a、OD600＝1.0～1.3、诱导时间为8h、诱导温度为25℃。
本发明方法还可以用SDS-PAGE、质谱方法对制备得到的蛋白的纯度和分子量进行了分析和验证，用表面等离子共振技术(SPR)对制备得到的Eotaxin-1的生物活性进行了表征。
本发明制备得到的Eotaxin-1有生物活性且纯度很高，在相关疾病的治疗和药物的设计方面显示了很大的应用前景。
如图1所示，为本发明细胞因子Eotaxin-1表达载体PET28a-Eotaxin-1基因的构建图。
如图2所示，为本发明表达藻蓝胆素重组载体pET32a-Eotaxin-1基因的构建图。
如图3所示，为本发明表达藻蓝胆素重组载体pMAL-p4X-Eotaxin-1基因的构建图。
如图4所示，为不同表达载体表达Eotaxin-1蛋白的优化图。(a)为DOT-Blot图；(b)为对应的柱状图，1、2、3分别为pMAL-p4X-Eotaxin-1/TB1、pET28a-Eotaxin-1/BL21、pET32a-Eotaxin-1/Origami。
如图5所示，为不同诱导时机Eotaxin-1蛋白表达量优化图。(a)为DOT-Blot图，(b)为对应的柱状图。
如图6所示，为不同诱导温度Eotaxin-1蛋白表达量优化图。(a)为DOT-Blot图，(b)为对应的柱状图。
如图7所示，为His-Tagged-Eotaxin-1融合蛋白的纯化图。(a)为His-Tagged-Eotaxin-1用Ni2+亲和色谱柱纯化色谱图；(b)为SDS-PAGE和考马斯亮兰染色检测，M为蛋白电泳标准条带，1、2、3、4、5条带分别为His-Tagged-Eotaxin-1融合蛋白的破碎液、流穿液、20％、50％、100％的BufferB的洗脱液。
如图8所示，为Eotaxin-1蛋白的纯化图。(a)为His-Tagged-Eotaxin-1酶切后用Ni2+亲和色谱柱纯化色谱图；(b)为SDS-PAGE和考马斯亮兰染色检测，M为蛋白电泳标准条带，1、2、3、4、5条带分别为His-Tagged-Eotaxin-1融合蛋白的原样、酶切原样、流穿1、流穿2；(c)为SDS-PAGE和考马斯亮兰染色检测，M为蛋白电泳标准条带，1条带分别为100％的BufferB的洗脱液。
如图9所示，为Eotaxin-1的质谱检测图。
如图10所示，为本发明表面等离子共振技术(SPR)验证Eotaxin-1活性效果图。
Eotaxin-1的制备方法：根据NCBI数据库中Eotaxin-1成熟蛋白的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，通过设计引物在其N端引入6个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoRI和HindIII。利用PCR技术，将目的片段序列进行扩增，再将基因片段双酶切后连接到用相同酶切割后的表达载体上面，而后导入相应的大肠杆菌宿主细胞中进行异源表达。首先对表达载体、诱导时机、诱导温度和时间进行优化，选出最优表达条件。再根据最佳配比大规模培养重组大肠杆菌，诱导表达后收集菌体细胞，并进行高压破碎、高速离心、0.45μm微孔滤膜过滤、镍柱亲和层析、凝胶过滤脱盐、酶切除去His标签一系列分离纯化过程，最后得到纯度很高的蛋白，所得Eotaxin-1蛋白分子量为8.4kDa。
所述Eotaxin-1基因源自嗜酸性粒细胞(eosinophils)。
所述的表达载体为普通大肠杆菌表达载体，优选质粒pET28a、pET32a、pMAL-p4X，分别对应于大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3)、Origami、TB1。
特别应指出的是在下列实施例中，使用的DNA提取、PCR扩增反应、表达载体构建和转化、大肠杆菌的培养、亲和色谱纯化以及活性分析等技术除特别说明外均是本领域普通技术人员所熟知的，并可在诸如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年第三版)、《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿等著，马学军等译，科学出版社，2005年版)、《亲和色谱方法及应用》(于世林著化学工业出版社2008-08-01第一版)中整体引用。
实施例1
从NCBI数据库中获得嗜酸性粒细胞的Eotaxin-1氨基酸序列，对其密码子进行优化后用人工合成的方法合成目的基因，所得核苷酸序列：GGTCCGGCATCTGTTCCGACCACGTGCTGTTTTAACCTGGCAAATCGTAAAATTCCGCTGCAGCGCCTGGAAAGCTATCGTCGCATCACCTCTGGCAAATGCCCGCAAAAAGCGGTGATTTTCAAAACGAAACTGGCGAAAGATATCTGTGCCGACCCGAAAAAAAAATGGGTGCAAGACTCAATGAAATACCTGGACCAAAAATCCCCGACGCCGAAACCGTAA。并在其N端加入6个His标签、TEV酶切位点，在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoRI和HindIII，最终目的基因构成为：
EcoRIsite6×HisTEVcleavagesiteHindⅢsite
5-AGTGAATTC GAAAACCTGTATTTTCA GGGT-Eotaxin-1-TAAAAGCTTACT-3
再将基因片段双酶切后和用相同酶切割后的pET28a载体连接。具体操作方法如下：
(1)优化所得的Eotaxin-1的基因序列设计引物：
Eotaxin-1-fwd-EcoRI:AGTGAATTCCACCATCATCACCACCATGAAAACCTGTATTTTCAGGGTGGTCCGGCATCTGTTCCGAC。
Eotaxin-1-rev-HindIII：AGTAAGCTTTTACGGTTTCGGCGTCGGGGATT。
以合成的基因组DNA作为PCR反应扩增模板，经PCR扩增得到所需基因片段。PCR产物经Cyclepure试剂盒(Omega公司)纯化。将所得基因片段与pET28a载体用EcoRI和HindIII核酸内切酶37℃分别酶切12～16h、2～3h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(普通离心柱型)(TIANGEN)回收胶产物，分别测定目的基因片段和载体的浓度，然后将基因片段与载体浓度10：1混合，在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α。利用含50ug/ml卡那青霉素的LB平板筛选，挑取阳性克隆，利用菌落PCR和DNA测序进行验证，得到重组表达载体pET28a-Eotaxin-1。用碱变性法提取出构建好的表达质粒PET28a-Eotaxin-1，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)(索莱宝科技有限公司，下同)，得到能在T7启动子驱动下高效表达活性Eotaxin-1蛋白的大肠杆菌菌株P1。上述质粒提取、连接、转化以及阳性重组子的筛选和鉴定均参考《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年第三版)介绍的方法。
(2)从LB固体(含1.5％琼脂的LB培养基)平板上挑取基因工程菌菌株P1单菌落于5mL含50μg/mL卡那青霉素的液体LB培养基中，在恒温振荡培养箱中培养(温度：37℃，转速：170r/min)。将过夜培养物以1：100的比例接种于100mLTB培养基(含卡那青霉素50μg/mL)中。再此过程中对诱导时机、诱导温度和时间进行优化，得到以下条件：在恒温振荡培养箱中在温度37℃、转速170r/min的培养条件下培养至OD600＝1.0～1.3时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)至终浓度为0.5mmol/L进行诱导。加入诱导剂后，在温度25℃、转速170r/min的培养条件下继续培养8h后停止。
(3)将收获的菌液在6000g条件下离心10min，弃上清液。收集的菌体用1×PBS缓冲液(常用生物试验试剂)洗涤2次后，将菌体重悬于相当于原培养物1/20体积预冷的1×PBS缓冲液中，并加入溶菌酶0.3mg/mL、DNaseI100u/mL用高压破碎仪破碎，压强为1000～15000bar，破碎前加入终浓度为1mmol/LPMSF，反复破碎3～4次。破碎过程中保持破碎液低温(4℃)。破碎后10000g、4℃离心30min，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤后，在滤液中加入约体积比为5％的BufferB(咪唑终浓度为25mmol/L)，在4℃下用微量泵将上清液以2mL/min流速通过HiTrapTMChelatingHP柱，带有His-Tag的融合蛋白被吸附，收集流穿液，4℃保存。
(4)首先向AKTAprimeplus蛋白液相仪中通入BufferA，调节、平衡体系的pH值、离子强度等。待体系平衡后调节仪器使100％BufferA流过HiTrapTMChelatingHP柱，洗脱未挂上的蛋白。利用蛋白对280nm紫外光的吸收，测出蛋白的吸收峰。当吸收峰趋于平稳时，改用20％的BufferB(10％的BufferB+90％BufferA)洗脱杂蛋白，收集样品；吸收峰趋于平稳时，再用50％的BufferB洗脱杂蛋白，收集样品；吸收峰平稳后，最后用100％的BufferB洗脱蛋白，收集洗脱蛋白，4℃保存待用。
(5)SDS-PAGE蛋白电泳
取4℃保存的用20％、50％的BufferB洗脱的蛋白和100％的BufferB洗脱的蛋白样品，做SDS-PAGE蛋白电泳。先用恒压100V运行10min，然后改用恒压150V至电泳结束。电泳结束后取下胶，用染色液快速染色0.5h，用脱色液脱色2次，每次1h。用凝胶成像系统记录结果。
(6)脱盐
a.平衡：将脱盐柱HiTrapTMDeasating(柱床体积为15mL)连接在AKTAprimeplus蛋白液相仪中，先用超纯水冲洗脱盐柱，然后用1×PBS缓冲液平衡脱盐柱，流速4mL/min，平衡4个柱体积，至UV280nm曲线呈水平，归零。
b.上样：上样体积为柱床体积的20％，用注射器将100％的BufferB洗脱的目的蛋白样品注入15mL上样柱，上样时流速0mL/min，每次上样3mL。
c.洗脱：1×PBS缓冲液洗脱，流速4mL/min。
d.收集：洗脱下的第一个峰为蛋白峰，后出的为盐峰，待峰过后，再次平衡脱盐柱至UV280nm曲线呈水平，再次上样，至所有洗脱样品脱完盐。脱盐样品用液氮骤速冷冻后-80℃保存。
(7)酶切条件的优化
a.在EP管中加入15μL脱盐产物，再分别加入0.0、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0、7.0、15.0μLTEV酶，总体积为30μL，不足部分用PBS代替，同时加入只含TEV酶的对照，于4℃缓慢垂直混悬14h，以便TEV酶充分发挥酶切作用。反应完成后加入上样缓冲液，95℃加热5～10min，进行SDS-PAGE蛋白电泳检测。
(8)脱盐产物的TEV酶切反应
a.根据优化的最佳酶切反应条件，在脱盐产物中加入TEV酶，4℃反应14h。反应结束后，0.45μm微孔滤膜过滤，取样20μL于4℃保存。
b.把再生过的HiTrapTMChelatingHP柱连接到AKTAprimeplus蛋白液相色谱仪上，用BufferA冲洗平衡HiTrapTMChelatingHP柱。将过滤的样品在4℃条件下用蠕动泵上样，调节泵的流速和AKTAprimeplus蛋白液相色谱仪的流速基本一致，利用UV280nm曲线监测蛋白的流出情况。当上完样后，依次用100％BufferA、5％BufferB、100％BufferB冲洗镍柱，根据出峰情况，收集样品，4℃暂存。将收集的样品进行SDS-PAGE蛋白电泳。
(9)蛋白的质谱检测
a.用脱盐柱将酶切后的流穿液交换到超纯水中，将收集的样品在液氮下迅速冷冻，放入-80℃下冷冻2h，放入真空干燥箱进行冷冻干燥。冻干后的样品于-80℃保存。
b.取部分样品进行MALDI-TOF型质谱检测，确定所获得的蛋白为所需目的蛋白。
实施例2
将Eotaxin-1与其G蛋白偶联受体CCR3相互作用来检验其活性和生物学功能。为进一步确认提取的Eotaxin-1是否具有生物学活性，我们通过使用表面等离子共振技术(SPR)测定Eotaxin-1是否与受体CCR3有相互作用来分析Eotaxin-1的是否有活性。实验中所使用的受体蛋白CCR3的C末端融合有His标签，该His标签可以与NTA芯片的镍离子相结合使CCR3固定在芯片表面，然后不同浓度的Eotaxin-1可以流过芯片。
先用购买的有活性的Eotaxin-1和CXCL12(不是CCR3的配体)进行验证。结果表明我们所使用的受体CCR3能和Eotaxin-1发生特异性结合，不能与CXCL12发生特异性结合，这表明纯化的CCR3是有生物学活性的。该实验是在DDM作为表面活性剂增溶的条件下进行的，CCR3和Eotaxin-1的KD值为7.3×10-7M。
我们用验证有生物活性的CCR3和我们纯化的Eotaxin-1进行了SPR分析，表明我们提取的Eotaxin-1也是有生物活性的。为分析在不同表面活性剂增溶CCR3的情况下对Eotaxin-1与CCR3相互作用的影响，我们对表面活性剂FC-14、DDM和Trx-100增溶下的CCR3与Eotaxin-1结合能力进行了对比研究。通过拟合SPR曲线，可以得出平衡解离常数(KD)、结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)。在FC-14增溶的条件下，CCR3与Eotaxin-1的KD值是1.3×10-6M；在DDM增溶的条件下，CCR3与Eotaxin-1的KD值是7.0×10-8M；在Trx-100增溶的条件下，CCR3与Eotaxin-1的KD值是6.04×10-7M；在FC-14增溶条件下KD的值数量级在10-6M，DDM在10-8M，Trx-100在10-7M，这表明DDM增溶条件下的CCR3与其配体Eotaxin-1的结合能力最强，FC-14增溶条件下结合能力最弱，相比之下Trx-100增溶条件下的结合能力处于两者之间。在FC-14增溶下CCR3与Eotaxin-1的ka值是4.9×104M-1s-1，在DDM增溶下ka值是2.5×105M-1s-1，在Trx-100增溶下ka值是2.47×105M-1s-1；在FC-14增溶下CCR3与Eotaxin-1的kd值分别是0.063s-1，在DDM增溶下kd值是0.017s-1，在Trx-100增溶下kd值是0.149s-1。总体看来，Trx-100增溶下ka和kd值比其它条件下增溶的都要大，尤其是kd值明显比其它条件下增溶的要大很多，表明Trx-100增溶下CCR3和配体的结合快解离也快。从以上数据的分析表明表面活性剂会极大影响CCR3的生物学活性，从而影响CCR3与其配体的相互作用。
此外，由以上结果：在DDM作为表面活性剂增溶的条件下，商业化的Eotaxin-1与其受体CCR3作用的KD值为7.3×10-7M。而本实验室提取的Eotaxin-1与CCR3的KD值是7.0×10-8M，比商业化的Eotaxin-1与CCR3的结合亲和力高10倍，因此在相关疾病的治疗和药物的设计方面显示了更大的应用前景。
鉴于以上的实验结果，为了更进一步分析表面活性剂对CCR3和配体结合的影响，我们把用表面活性剂FC-14提取的CCR3在DDM中溶解半小时，当CCR3固定在NTA芯片上后，用含有DDM的HEPES作为流动相冲洗420秒，尽可能的将FC-14置换成DDM，然后将适宜浓度的Eotaxin-1流过芯片表面。得到的数据经过拟合，得出CCR3与其配体Eotaxin-1的KD值为2.35×10-7M，是FC-14增溶下KD值的0.18倍，表明将表面活性剂FC-14置换成DDM后，CCR3和配体的亲和力明显增加，进一步证明了表面活性剂对CCR3和其配体的相互作用有很大的影响。
所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。

Claims (10)

1.一种高活性人趋化因子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：根据NCBI数据库中Eotaxin-1的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；
步骤2：通过设计引物在其N端引入一个或多个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoRI和HindIII；
步骤3：利用PCR技术将目的片段进行扩增，再将基因片段双酶切后连接到用相同酶切割后的载体上面，而后导入大肠杆菌中进行异源表达，生产Eotaxin-1蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所得人工合成目的基因的核苷酸序列为：GGTCCGGCATCTGTTCCGACCACGTGCTGTTTTAACCTGGCAAATCGTAAAATTCCGCTGCAGCGCCTGGAAAGCTATCGTCGCATCACCTCTGGCAAATGCCCGCAAAAAGCGGTGATTTTCAAAACGAAACTGGCGAAAGATATCTGTGCCGACCCGAAAAAAAAATGGGTGCAAGACTCAATGAAATACCTGGACCAAAAATCCCCGACGCCGAAACCGTAA。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所得修饰后的人工合成目的基因的核苷酸序列为：
EcoRIsite6×HisTEVcleavagesiteHindⅢsite
5-AGTGAATTC GAAAACCTGTATTTTCA GGGT-Eotaxin-1-TAAAAGCTTACT-3。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，进一步包括：
步骤4：将诱导表达后的大肠杆菌收集、破碎、离心、过滤、镍柱亲和层析、凝胶过滤脱盐、酶切除去His标签后得到纯度很高的蛋白。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Eotaxin-1基因源自嗜酸性粒细胞(eosinophils)。
6.一种人工合成目的基因，其特征在于，所述基因是根据NCBI数据库中Eotaxin-1的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；
所得人工合成目的基因的核苷酸序列为：GGTCCGGCATCTGTTCCGACCACGTGCTGTTTTAACCTGGCAAATCGTAAAATTCCGCTGCAGCGCCTGGAAAGCTATCGTCGCATCACCTCTGGCAAATGCCCGCAAAAAGCGGTGATTTTCAAAACGAAACTGGCGAAAGATATCTGTGCCGACCCGAAAAAAAAATGGGTGCAAGACTCAATGAAATACCTGGACCAAAAATCCCCGACGCCGAAACCGTAA。
7.一种人工合成目的基因，其特征在于，所述基因是根据NCBI数据库中Eotaxin-1的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；并通过设计引物在其N端引入一个或多个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoRI和HindIII；
所得修饰后的人工合成目的基因的核苷酸序列为：
EcoRIsite6×HisTEVcleavagesiteHindⅢsite
5-AGTGAATTC GAAAACCTGTATTTTCA GGGT-Eotaxin-1-TAAAAGCTTACT-3。
8.一种如权利要求1～5中任一项所述的制备方法在制备治疗肝炎、关节炎、特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、寄生虫感染、气道慢性炎症、艾滋病、老年性黄斑变性、脉络膜新生血管性疾病、动脉粥样硬化、免疫性血小板减少症、和/或炎症及免疫相关疾病的药物中的应用。
9.一种如权利要求6或7所述人工合成基因在制备治疗肝炎、关节炎、特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、寄生虫感染、气道慢性炎症、艾滋病(HIV)、老年性黄斑变性、脉络膜新生血管性疾病、动脉粥样硬化、免疫性血小板减少症、和/或炎症及免疫相关疾病的药物中的应用。
10.一种如权利要求1～5中任一项所述的制备方法和/或如权利要求6或7所述人工合成基因，在治疗肝炎、关节炎、特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、寄生虫感染、气道慢性炎症、艾滋病(HIV)、老年性黄斑变性、脉络膜新生血管性疾病、动脉粥样硬化、免疫性血小板减少症、和/或炎症及免疫相关疾病的药物设计方面的应用。
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