CN107922493A - 包含志贺毒素a亚基效应物和cd8+ t‑细胞表位的细胞靶向分子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能够将CD8+T‑细胞表位货物递送至细胞的MHC I类呈递途径的细胞靶向分子。本发明的可以用于实际上将任意的CD8+T‑细胞表位从细胞外空间递送至靶细胞的MHC I类途径，所述靶细胞可以是恶性细胞和/或非免疫细胞。然后，所述靶细胞可以在细胞表面上展示与MHC I分子复合的递送的CD8+T‑细胞表位。本发明的细胞靶向分子具有下述应用，包括在多种细胞类型的混合物中(包括在脊索动物内)对特定细胞类型的靶向标记和/或杀伤，以及刺激有益的免疫应答。例如，本发明的细胞靶向分子具有治疗多种疾病、病症和病患的用途，所述疾病、病症和病患包括癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症和微生物感染。

Description

包含志贺毒素A亚基效应物和CD8+ T-细胞表位的细胞靶向 分子
技术领域
本发明涉及多种细胞靶向分子，其分别包含：(1)用于细胞靶向的结合区，(2)用于亚细胞递送的志贺毒素A亚基效应物多肽区，和(3)一个或多个异源的CD8+ T-细胞表位；其中所述细胞靶向分子能够将异源的CD8+ T-细胞表位递送至靶细胞的MHC I类呈递途径，所述靶细胞诸如，例如，恶性细胞。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子可以将在志贺毒素A1片段来源区域的羧基端的羧基末端位置直接或间接与志贺毒素A亚基效应物多肽连接的异源CD8+ T-细胞表位递送至MHC I类呈递途径。本发明的细胞靶向分子具有下述应用：例如，用于从CD8+ T-细胞表位的细胞外区域递送至靶细胞；用展示的CD8+ T-细胞表位对靶细胞进行细胞表面标记；选择性杀伤特定的细胞类型；在体内刺激有益的免疫应答；引发针对靶细胞的细胞毒性T淋巴细胞的细胞应答；抑制体内有害免疫应答；产生记忆免疫细胞，以及诊断和治疗多种疾病、病症和病患，诸如例如，癌症，肿瘤，其他生长异常，免疫病症，和微生物感染。
背景
免疫系统通过区分自身与非自身而保护身体免受潜在的有害侵入。脊索动物(包括两栖类、鸟类、鱼、哺乳动物、爬行动物和鲨鱼)的免疫监视系统在体内扫描外源分子，从而识别侵入的病原体、外源细胞和恶性细胞，从而启动保护性免疫应答。有颚脊椎动物(颚口类(Gnathostomata))的免疫系统持续扫描细胞外和细胞内环境的外源表位，试图检测有威胁的分子、病原体和/或细胞。在此类脊椎动物中，主要组织相容性(MHC)系统起作用在细胞表面上展示肽已被免疫系统的T淋巴细胞(T-细胞)识别(参见Elliot T编，Nature 348：195-7(1990))。脊椎动物中的MHC系统作为适应性免疫系统的一部分起作用区分自身与非自身，这有助于免疫系统清除病原体、中和外源分子、杀死感染的或损伤的细胞并且排斥转化的细胞的能力(Janeway’s Immunobiology(Murphy K，编，Garland Science，第8版，2011))。
MHC I类系统通过提供细胞内抗原的表位呈递而在免疫系统中起重要作用(Cellular and Molecular Immunology(Abbas A，编，Saunders，第8版，2014))。认为这一过程是适应性免疫系统中的重要部分，所述适应性免疫系统是在脊索动物中主要进化为针对细胞内病原体以及表达细胞内抗原的恶性细胞(诸如例如癌细胞)进行保护的系统。例如，涉及细胞内病原体的人感染仅可以通过MHC I类和II类两个系统的联合作用而克服(参见，例如，Chiu C，Openshaw P，Nat Immunol 16：18-26(2015))。MHC I类系统的贡献是识别并基于对细胞内抗原的识别而杀死恶性细胞。
MHC I类系统在脊椎动物的任意有核细胞中起作用呈递细胞内(或内源)抗原，而MHC II类系统途径在专门的抗原呈递细胞(APC)中起作用呈递细胞外(或外源)抗原(Neefjes J等人，Nat Rev Immunol 11：823-36(2011))。由MHC I类系统识别的细胞内或“内源”表位典型地是在细胞的细胞溶胶或内质网(ER)腔内存在的分子的片段，并且这些分子典型地被细胞溶胶中的蛋白酶体和/或另一种或多种蛋白酶进行蛋白水解加工。当存在于ER中时，这些内源表位位于MHC I类分子上，并且作为pMHC I呈递在细胞表面上。相反，MHC II类系统仅在专门的细胞中起作用识别来源于细胞外存在的分子的外源表位，所述细胞外存在的分子仅在特定的内体区室中被加工，诸如，例如，次级内体，溶酶体，吞噬体和吞噬溶酶体，并且包括存在于内吞细胞器中的细胞内病原体。
MHC I类系统的肽呈递涉及五个主要的步骤：1)产生细胞溶质肽，2)将这些肽转运到ER的腔中，3)稳定形成与某些肽结合的MHC I类分子的复合物，4)将这些稳定的pMHC I展示在细胞表面上，并且5)由特定的CD8+免疫细胞识别某些呈递的pMHC I。CD8+ T-细胞对呈递的pMHC I的识别可以导致CD8+ T-细胞激活、克隆扩增和分化成CD8+效应物T-细胞，包括靶向特定的pMHC I呈递细胞进行破坏的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。这导致产生一群特异性的CD8+效应物T-细胞，它们中的一些可以遍布身体系统性移动，从而寻找并破坏展示特异性表位-MHC I类复合物的细胞，以及产生一群记忆T细胞。如果已经存在识别被呈递的特异性pMHC I的CTL(例如，回忆抗原)，那么该CTL可以立即杀死pMHC I呈递细胞并且释放细胞因子。
通常，所述MHC I类途径以细胞溶质肽起始。肽在细胞溶胶中存在可以以多种方式发生。通常，由MHC I类分子呈递的肽来源于细胞内蛋白的蛋白酶体降解。MHC I类途径可以以与抗原加工相关的转运蛋白(TAP)起始，所述抗原加工相关的转运蛋白与ER膜连接。TAP将肽从细胞溶胶转运到ER腔内，在此处它们然后可以与空的MHC I类分子连接。TAP通常转运长度为8-12个氨基酸残基的肽，但是TAP也可以转运长度短至6个和长至40个氨基酸残基的肽(Koopmann J等人，Eur J Immunol 26：1720-8(1996))。
通过涉及将蛋白或肽转运到细胞溶胶中进行加工然后经由TAP-介导的转运将某些降解的片段转运回到ER中的途径，也可以在ER的腔中起始MHC I类途径。
然后，经由TAP从细胞溶胶转运到ER腔内的肽可被MHC I类分子结合。在ER中，复杂的负载肽的分子机器帮助组装稳定的肽-MHC I类分子复合物(pMHC I)，并且，在一些情形中，通过以称为修剪的过程将所述肽切割成最优的尺寸而进一步加工所述肽(参见Mayerhofer P，Tampé R，JMol Biol pii S0022-2835(2014))。在ER中，MHC I类分子利用高特异性免疫球蛋白型抗原结合结构域紧密结合特定的肽-表位，所述高特异性免疫球蛋白型抗原结合结构域中的每一个都具有仅针对特定肽-表位的强结合亲和力。然后，所述肽-MHC I类复合物通过分泌途径被转运到质膜，从而被呈递到细胞外环境并且被CD8+免疫细胞审查。然后，特定的CD8+ CTL靶向杀死呈递特异性pMHC I的细胞，从而保护生物体。
脊索动物中有核细胞对与MHC I类分子复合的特异性表位-肽的呈递在刺激和维持针对细胞内病原体、肿瘤和癌症的免疫应答方面起主要作用。CD8+ T-细胞对呈递特异性表位-MHC I类复合物的细胞的细胞问CD8+ T-细胞结合起始保护性免疫应答，其可以导致对所述呈递细胞的排斥，即，由于一个或多个CTL的细胞毒性活性而导致所述呈递细胞死亡。该细胞问结合的特异性由多种因子决定。CD8+ T-细胞通过其TCR识别在另一种细胞的细胞表面上的pMHC I。CD8+ T-细胞表达不同的T细胞表位(TCR)，它们具有针对不同的同源pMHC I的差异性结合特异性。CD8+ T-细胞特异性取决于每种个体T细胞的特异性TCR，和所述TCR针对被呈递的表位-MHC复合物的结合亲和力以及针对呈递细胞的总体TCR结合占有。另外，存在多样性的MHC I类分子变体，其以至少两种方式影响细胞问CD8+ T-细胞识别：通过影响负载和展示的肽的特异性(即，pMHC I全体成员)和通过影响TCR与参与表位识别的pMHC I之问的接触区域。
与MHC I类分子复合的某些表位的呈递可以使呈递细胞对溶胞、诱导的凋亡和/或坏死引起靶向杀伤敏感。pMHC I-呈递细胞的CTL杀伤主要通过由经由细胞毒性颗粒将穿孔蛋白和/或粒酶递送到呈递细胞内介导的细胞溶胞活性而发生(参见，例如，Russell J，LeyT，Annu Rev Immunol 20：323-70(2002)；Cullen S，Martin S，Cell Death Diff 15：251-62(2008))。其他CTL-介导的靶细胞杀伤机制涉及经由TNF信号传导，诸如例如，经由FasL/Fas和TRAIL/TRAIL-DR信号传导在呈递细胞中诱导凋亡(参见，例如I，Topham D等人，Jlmmunol 159：5197-200(1997)；Ishikawa E等人，J Virol 79：7658-63(2005)；Brincks E等人，J Immunol 181：4918-25(2008)；Cullen S，Martin S，Cell Death Diff 15：251-62(2008))。此外，激活的CTL可以无区分地杀死邻近被识别的pMHC I-呈递细胞的其他细胞，而不管由其他邻近的细胞呈递的肽-MHC I类复合物全体成员(Wiedemann A等人，ProcNatl Acad Sci USA 103：10985-90(2006))。另外，激活的CTL可以释放免疫刺激性细胞因子、白介素和其他分子，从而影响微环境的免疫激活。
可以想到，某些疗法利用该MHC I类和CTL免疫监视系统来指导受试者的适应性免疫系统排斥并特异性杀死特定的细胞类型。具体地，该MHC I类呈递途径可以被多种治疗分子利用，从而迫使某些被靶向的细胞在细胞表面上展示特定的表位，从而诱导需要的免疫应答，包括杀死被特异性靶向的细胞。此类治疗分子可以将CD8+ T-细胞表位特异性地递送至MHC I类途径，用于被恶性细胞(例如，肿瘤或被感染的细胞)呈递，从而信号传导它们自身的毁灭。然而，在开发此类治疗分子中存在一些障碍，包括，例如，治疗分子的细胞型靶向；递送治疗分子穿过靶细胞的质膜；提供能够避开内吞途径并且避免在溶酶体中的破坏的治疗分子；和提供通常能够保护其CD8+ T-细胞表位货物免受靶细胞对外源的外来分子的扣留、修饰和/或破坏同时将其货物递送至需要的亚细胞位置的治疗分子(Sahay G等人，J Control Release 145：182-195(2010)；Fuchs H等人，Antibodies 2：209-35(2013))。
通常，向细胞外源性施用外来分子导致该分子的降解，有时在被扣留和/或修饰之后被降解。首先，向细胞施用外源肽(例如，免疫原性表位)或蛋白(例如，抗原蛋白)，由于质膜的物理屏障，导致这些分子不能进入所述细胞。另外，这些分子通常被在细胞表面上和/或在细胞外环境中的细胞外酶活性降解成更小的分子(例如，蛋白降解成肽)。通过胞吞作用由细胞外环境内在化的蛋白通常通过溶酶体蛋白水解降解，所述溶酶体蛋白水解是涉及早期内体、晚期内体和溶酶体的胞吞途径的一部分。通过吞噬作用由细胞外环境内在化的蛋白通常通过在吞噬溶酶体中结束的类似途径降解。由此，外源施用的肽和蛋白或其片段通常不能到达能够进入MHC I类途径的细胞内区室，诸如，例如，细胞溶胶或ER。
具有在外源施用时能够将CD8+ T-细胞表位递送到所选的靶细胞的MHC I类呈递途径的细胞靶向分子将是合乎需要的，其中所述靶细胞可以选白宽泛种类的细胞，诸如，例如，恶性细胞和/或被感染的细胞，特别是除专门的APC(如树突细胞)之外的细胞。可以向脊索动物施用所述相较于健康细胞优先靶向恶性细胞的细胞靶向分子，用于体内递送CD8+T-细胞表位，用以被靶向的细胞的MHC I类呈递，所述被靶向的细胞诸如，例如，被感染的细胞、赘生性细胞或其他的恶性细胞。
发明概述
本发明提供志贺毒素A亚基来源的细胞靶向分子，其包含相对于志贺毒素A亚基是异源的CD8+ T-细胞表位-肽；其中每个细胞靶向分子具有将其CD8+ T-细胞表位-肽货物递送至靶细胞的MHC I类呈递途径的能力。本发明的细胞靶向分子可以用于将多种CD8+ T-细胞表位靶向递送至脊索动物中任意有核的靶细胞，从而使得所递送的CD8+ T-细胞表位被呈递在与MHC I类分子复合的所述靶细胞表面上。所述靶细胞可以是多种类型，诸如，例如，赘生性细胞、被感染的细胞、携带细胞内病原体的细胞和其他不需要的细胞，并且所述靶细胞可以在体外或体内被本发明的细胞靶向分子靶向。另外，本发明提供多种细胞靶向的分子，其包含蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽，能够将异源性CD8+ T-细胞表位细胞内递送至靶细胞的MHC I类呈递途径，同时改善这些细胞靶向分子的细胞外、体内耐受性。由于在给予的剂量减少的产生非特异性毒性的可能性，本发明的某些细胞靶向分子具有用于脊索动物施用作为治疗剂和/或诊断剂的改善的用途。
本发明的细胞靶向分子包含三个不同的组分：(i)志贺毒素效应物多肽，(ii)能够特异性结合至少一个细胞外靶标生物分子的结合区，和(iii)CD8+ T-细胞表位；由此向细胞施用所述细胞靶向分子在所述细胞内导致将与MHC I类分子复合的CD8+ T-细胞表位-肽呈递在细胞表面上。在某些其他实施方案中，所述CD8+ T-细胞表位直接或间接融合在所述志贺毒素效应物多肽和/或所述结合区上。在某些其他实施方案中，所述细胞靶向分子包含单链多肽，所述单链多肽包含所述结合区、志贺毒素效应物多肽和CD8+ T-细胞表位-肽。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含：(i)具有志贺毒素A1片段区的志贺毒素效应物多肽，(ii)异源结合区，其包含能够特异性结合至少一个细胞外靶标生物分子的细胞靶向部分或试剂，和(iii)异源的CD8+ T-细胞表位-肽；由此向细胞施用所述细胞靶向分子在所述细胞内导致将与MHC I类分子复合的CD8+ T-细胞表位-肽呈递在细胞表面上。在某些其他实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位没有包埋或插入在所述志贺毒素A1片段区中。在某些其他实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽直接或间接融合在所述志贺毒素效应物多肽和/或所述结合区上。在某些其他实施方案中，所述细胞靶向分子包含单链多肽，所述单链多肽包含所述结合区、志贺毒素效应物多肽和异源的CD8+ T-细胞表位-肽。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含：(i)具有志贺毒素A1片段区的志贺毒素效应物多肽，(ii)异源结合区，其包含能够特异性结合至少一个细胞外靶标生物分子的细胞靶向部分或试剂，和(iii)异源的CD8+ T-细胞表位-肽；由此向细胞施用所述细胞靶向分子在所述细胞内导致将与MHC I类分子复合的CD8+ T-细胞表位-肽呈递在细胞表面上；并且条件是所述细胞靶向分子不包含SEQ ID NOs：71-72或不是由其组成。在某些其他实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位没有包埋或插入在所述志贺毒素A1片段区中。在某些其他实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽直接或间接融合在所述志贺毒素效应物多肽和/或所述结合区上。在某些其他实施方案中，所述细胞靶向分子包含单链多肽，所述单链多肽包含所述结合区、志贺毒素效应物多肽和异源的CD8+ T-细胞表位-肽。
对于某些实施方案，向细胞施用所述细胞靶向分子导致所述CD8+ T-细胞表位-肽在细胞内区域与MHC I类分子复合，然后所述细胞将与MHC I类分子复合的CD8+ T-细胞表位-肽呈递在细胞表面上。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区包含两条以上的多肽链，并且所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽直接或间接融合在包含志贺毒素效应物多肽和所述结合区的两条以上的多肽链中的一条的多肽上。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区包含选自由下述组成的组的多肽：自体VH结构域，单结构域抗体片段(sdAb)，纳米抗体(nanobody)，来源于骆驼科动物的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，来源于软骨鱼的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，VNAR片段，单链可变片段(scFv)，抗体可变片段(Fv)，互补决定区3片段(CDR3)，限制的FR3-CDR3-FR4多肽(FR3-CDR3-FR4)，Fd片段，小模块免疫药物(SMIP)结构域，抗体结合片段(Fab)，南美犰狳(Armadillo)重复多肽(ArmRP)，纤连蛋白-来源的第10个纤连蛋白III型结构域(10Fn3)，生腱蛋白III型结构域(TN(n3)，锚蛋白重复基序结构域，低密度脂蛋白受体来源的A-结构域(LDLR-A)，脂质运载蛋白(anticalin)，Kunitz结构域，蛋白-A-来源的Z结构域，γ-B结晶来源的结构域，泛蛋白-来源的结构域，Sac7d-来源的多肽(affitin)，Fyn-来源的SH2结构域，小蛋白(miniprotein)，C-型凝集素-样结构域支架，工程改造的抗体模拟物，以及任何前述物质的保留结合功能性的任何遗传操作的对应物。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含选自由下述组成的组的多肽序列或基本上由选自由下述组成的组的多肽序列组成：(i)SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的氨基酸75-251；(ii)SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的氨基酸1-241；(iii)SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的氨基酸1-251；和(iv)SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的氨基酸1-261。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区能够结合选自由下述组成的组的细胞外靶标生物分子：CD20，CD22，CD40，CD74，CD79，CD25，CD30，HER2/neu/ErbB2，EGFR，EpCAM，EphB2，前列腺-特异性膜抗原(PSMA)，Cripto，CDCP1，内皮糖蛋白，成纤维细胞激活蛋白(FAP)，Lewis-Y，CD19，CD21，CS1/SLAMF7，CD33，CD52，CD133，CEA，gpA33，粘蛋白，TAG-72，酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体(ROR1或NTRKR1)，碳酸酐酶IX(CA9)，叶酸盐结合蛋白(FBP)，神经节苷脂GD2，神经节苷脂GD3，神经节苷脂GM2，神经节苷脂Lewis-Y2，VEGFR，αVβ3，α5β1，ErbB1/EGFR，Erb3，c-MET，IGF1R，EphA3，TRAIL-R1，TRAIL-R2，RANK，FAP，生腱蛋白，CD64，问皮素(mesothelin)，BRCA1，MART-1/MelanA，gp100，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，GAGE-1/2，BAGE，RAGE，NY-ESO-1，CDK-4，β-联蛋白，MUM-1，胱天蛋白酶-8，KIAA0205，HPVE6，SART-1，PRAME，癌胚抗原(CEA)，前列腺特异性抗原(PSA)，前列腺干细胞抗原(PSCA)，人天冬氨酰基(天冬酰胺酰基)β-羟化酶，EphA2，HER3/ErbB-3，MUC1，MART-1/MelanA，g1p100，酪氨酸酶相关的抗原，HPV-E7，EB病毒(Epstein-Barr virus)抗原，Bcr-Ab1，甲胎蛋白抗原，17-A1，膀胱肿瘤抗原(BTA)，CD38，CD15，CD23，CD45(蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型)，CD53，CD88，CD129，CD183，CD191，CD193，CD244，CD294，CD305，C3AR，FceRIa，半乳凝集素-9，IL-1R(白介素-1受体)，mrp-14，NKG2D配体，程序性死亡-配体1(PD-L1)，Siglec-8，Siglec-10，CD49d，CD13，CD44，CD54，CD63，CD69，CD123，TLR4，FceRIa，IgE，CD107a，CD203c，CD14，CD68，CD80，CD86，CD105，CD115，F4/80，ILT-3，半乳凝集素-3，CD11a-c，GITRL，MHC I类分子(任选地与多肽复合)，MHC II类分子(任选地与肽复合)，CD284(TLR4)，CD107-Mac3，CD195(CCR5)，HLA-DR，CD16/32，CD282(TLR2)，CD11c，以及前述任一项的任何免疫原性片段。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含KDEL家族成员的羧基端内质网保留/回收信号基序。在某些其他实施方案中，所述羧基端内质网保留/回收信号基序选自由下述组成的组：KDEL，HDEF，HDEL，RDEF，RDEL，WDEL，YDEL，HEEF，HEEL，KEEL，REEL，KAEL，KCEL，KFEL，KGEL，KHEL，KLEL，KNEL，KQEL，KREL，KSEL，KVEL，KWEL，KYEL，KEDL，KIEL，DKEL，FDEL，KDEF，KKEL，HADL，HAEL，HIEL，HNEL，HTEL，KTEL，HVEL，NDEL，QDEL，REDL，RNEL，RTDL，RTEL，SDEL，TDEL，和SKEL。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含异源的CD8+ T-细胞表位-肽，其位于所述细胞靶向分子内所述志贺毒素效应物多肽和/或结合区的羧基端。在某些其他实施方案中，所述细胞靶向分子包含在所述细胞靶向分子位于所述志贺毒素效应物多肽和/或结合区羧基端的两个、三个、四个、五个或更多个异源的CD8+ T-细胞表位-肽。
在某些实施方案中，所述细胞靶向分子包含羧基端、异源的CD8+ T-细胞表位-肽。
对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，当向与结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的靶细胞施用所述细胞靶向分子时，所述细胞靶向分子能够引起CD8+免疫细胞对所述靶细胞的细胞问结合。
对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，当向与结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的靶细胞施用所述细胞靶向分子时，所述细胞靶向分子能够引起所述靶细胞死亡。对于某些其他实施方案，当向其成员与结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的第一细胞群体和其成员不与结合区的任意细胞外靶标生物分子物理连接的第二细胞群体施用本发明的细胞靶向分子时，相对于所述第二细胞群体的成员，所述细胞靶向分子对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用是至少3倍高。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，相对于志贺毒素家族成员的天然存在的A亚基，所述志贺毒素效应物多肽包含突变，所述突变改变所述志贺毒素效应物多肽的酶活性，所述突变选自至少一个氨基酸残基缺失、插入或置换。在某些其他实施方案中，所述突变选自减少或消除毒素效应物多肽的细胞毒性的至少一个氨基酸残基缺失、插入或置换。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不是由SEQ ID NOs：71-115中的任一项组成，也不包含SEQ ID NOs：71-115中的任一项。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含或基本上由SEQ ID NOs：13-61和72-115中的任一项组成。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含：(i)结合区，所述结合区包含能够特异性结合至少一种细胞外靶标生物分子的细胞靶向部分或试剂，(ii)志贺毒素效应物多肽，其包含具有羧基端的志贺毒素A1片段来源的区域，和(iii)异源的CD8+ T-细胞表位-肽，其与所述细胞靶向分子的蛋白样组分连接；由此所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽在所述志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端的羧基末端；并且由此向细胞施用细胞靶向分子导致在所述细胞中将与MHC I类分子复合的CD8+ T-细胞表位-肽呈递在细胞表面上(参见，例如，图1-B)。在某些其他实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽直接或间接融合到所述志贺毒素效应物多肽和/或所述结合区上。在某些其他实施方案中，所述细胞靶向分子包含单链多肽，所述单链多肽包含所述结合区、志贺毒素效应物多肽和异源的CD8+ T-细胞表位-肽。在某些实施方案中，所述结合区包含两条以上多肽链，并且所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽直接或间接融合在包含所述志贺毒素效应物多肽和所述结合区的两条以上多肽链中的一条的多肽上。在某些其他实施方案中，所述结合区包含选自由下述组成的组的多肽：自体VH结构域，单结构域抗体片段(sdAb)，纳米抗体，来源于骆驼科动物的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，来源于软骨鱼的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)，免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，VNAR片段，单链可变片段(scFv)，抗体可变片段(Fv)，互补决定区3片段(CDR3)，限制的FR3-CDR3-FR4多肽(FR3-CDR3-FR4)，Fd片段，小模块免疫药物(SMIP)结构域，抗原-结合片段(Fab)，南美犰狳重复多肽(ArmRP)，纤连蛋白-来源的第10个纤连蛋白III型结构域(10Fn3)，生腱蛋白III型结构域(TNfn3)，锚蛋白重复基序结构域，低密度脂蛋白受体来源的A-结构域(LDLR-A)，脂质运载蛋白(anticalin)，Kunitz结构域，蛋白-A-来源的Z结构域，γ-B结晶来源的结构域，泛蛋白-来源的结构域，Sac7d-来源的多肽(affitin)，Fyn-来源的SH2结构域，小蛋白，C-型凝集素-样结构域支架，工程改造的抗体模拟物，以及任何前述物质的保留结合功能性的任何遗传操作的对应物。在某些其他实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含或基本上由选自由下述组成的组的多肽序列组成：(i)SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的氨基酸75-251；(ii)SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的氨基酸1-241；(iii)SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的氨基酸1-251；和(iv)SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3的氨基酸1-261。在某些其他实施方案中，所述细胞靶向分子包含或基本上由SEQ ID NOs：21-39，52-53，57-61和101-115中任一项的多肽组成。在本发明的细胞靶向分子的某些其他实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含具有羧基端的志贺毒素A1片段来源的区域，并且所述志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端包含破坏的弗林蛋白酶切割基序。在某些其他实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序在所述弗林蛋白酶切割基序的最小弗林蛋白酶切割位点中包含一个或多个突变。在某些其他实施方案中，所述最小弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列R/Y-x-x-R和/或R-x-x-R所示。在某些其他实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个突变，所述突变改变天然位于志贺样毒素1的A亚基(SEQ ID NO：1)或志贺毒素的A亚基(SEQ ID NO：2)的248-251或志贺样毒素2的A亚基(SEQ ID NO：3)的247-250或在志贺毒素A亚基或其衍生物的等价区域中的至少一个氨基酸残基。在某些其他实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序在所述弗林蛋白酶切割基序中包含氨基酸残基置换。在某些其他实施方案中，在所述弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基置换是精氨酸残基与选自由下述组成的组的不带正电荷的氨基酸残基的置换：精氨酸，甘氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，和酪氨酸。在某些其他实施方案中，所述结合区能够结合选自由下述组成的组的细胞外靶标生物分子：CD20，CD22，CD40，CD74，CD79，CD25，CD30，HER2/neu/ErbB2，EGFR，EpCAIM，EphB2，前列腺-特异性膜抗原(PSMA)，Cripto，CDCP1，内皮糖蛋白，成纤维细胞激活蛋白(FAP)，Lewis-Y，CD19，CD21，CS1/SLAMF7，CD33，CD52，CD133，CEA，gpA33，粘蛋白，TAG-72，酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体(ROR1 or NTRKR1)，碳酸酐酶IX(CA9)，叶酸盐结合蛋白(FBP)，神经节苷脂GD2，神经节苷脂GD3，神经节苷脂GM2，神经节苷脂Lewis-Y2，VEGFR，αVβ3，α5β1，ErbB1/EGFR，Erb3，c-MET，IGF1R，EphA3，TRAIL-R1，TRAIL-R2，RANK，FAP，生腱蛋白，CD64，问皮素，BRCA1，MART-1/Me1anA，gp100，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，GAGE-1/2，BAGE，RAGE，NY-ESO-1，CDK-4，β-联蛋白，MUM-1，胱天蛋白酶-8，KIAA0205，HPVE6，SART-1，PRAME，癌胚抗原(CEA)，前列腺特异性抗原(PSA)，前列腺干细胞抗原(PSCA)，人天冬氨酰基(天冬酰胺酰基)β-羟化酶，EphA2，HER3/ErbB-3，MUC1，MART-1/MelanA，gp100，酪氨酸酶相关的抗原，HPV-E7，EB病毒抗原，Bcr-Ab1，甲胎蛋白抗原，17-A1，膀胱肿瘤抗原(BTA)，CD38，CD15，CD23，CD45(蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型)，CD53，CD88，CD129，CD183，CD191，CD193，CD244，CD294，CD305，C3AR，FceRIa，半乳凝集素-9，IL-1R(白介素-1受体)，mrp-14，NKG2D配体，程序性死亡-配体1(PD-L1)，Siglec-8，Siglec-10，CD49d，CD13，CD44，CD54，CD63，CD69，CD123，TLR4，FceRIa，IgE，CD107a，CD203c，CD14，CD68，CD80，CD86，CD105，CD115，F4/80，ILT-3，半乳凝集素-3，CD11a-c，GITRL，MHC I类分子(任选地与多肽复合)，MHC II类分子(任选地与肽复合)，CD284(TLR4)，CD107-Mac3，CD195(CCR5)，HLA-DR，CD16/32，CD282(TLR2)，CD11c，和前述任一项的任意免疫原性片段。在某些其他实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含KDEL家族成员的羧基端内质网保留/回收信号基序。在某些其他实施方案中，所述羧基端内质网保留/回收信号基序选自由下述组成的组：KDEL，HDEF，HDEL，RDEF，RDEL，WDEL，YDEL，HEEF，HEEL，KEEL，REEL，KAEL，KCEL，KFEL，KGEL，KHEL，KLEL，KNEL，KQEL，KREL，KSEL，KVEL，KWEL，KYEL，KEDL，KIEL，DKEL，FDEL，KDEF，KKEL，HADL，HAEL，HIEL，HNEL，HTEL，KTEL，HVEL，NDEL，QDEL，REDL，RNEL，RTDL，RTEL，SDEL，TDEL，和和SKEL。对于某些实施方案，当向与结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的靶细胞施用本发明的细胞靶向分子时，所述细胞靶向分子能够引起CD8+免疫细胞对所述靶细胞的细胞问结合。对于某些其他实施方案，当向与结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的靶细胞施用本发明的细胞靶向分子时，所述细胞靶向分子能够引起所述靶细胞死亡。对于某些其他实施方案，当向其成员与结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的第一细胞群体和其成员不与结合区的任意细胞外靶标生物分子物理连接的第二细胞群体施用本发明的细胞靶向分子时，相对于所述第二细胞群体的成员，所述细胞靶向分子对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用是至少3倍高。在某些其他实施方案中，所述细胞靶向分子包含或基本上由SEQ ID NOs：21-39，52，57-61和101-115中任一项的多肽组成。在某些实施方案中，相对于志贺毒素家族成员的天然存在的A亚基，所述志贺毒素效应物多肽包含突变，所述突变改变所述志贺毒素效应物多肽的酶活性，所述突变选自至少一个氨基酸残基缺失、插入或置换。在某些其他实施方案中，所述突变选自减少或消除毒素效应物多肽的细胞毒性的至少一个氨基酸残基缺失、插入或置换。在某些其他实施方案中，所述细胞靶向分子包含或基本上由SEQ ID NO：53所示的多肽组成。在某些实施方案中，所述结合区包含异源的CD8+ T-细胞表位，而不管所述CD8+表位-肽相对于所述结合区是自体的还是异源的。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽直接或间接融合在所述志贺毒素效应物多肽和/或所述结合区上。在某些其他实施方案中，所述细胞靶向分子包含单链多肽，所述单链多肽包含所述结合区、志贺毒素效应物多肽和异源的CD8+ T-细胞表位-肽。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端包含破坏的弗林蛋白酶切割基序。在某些其他实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序在所述弗林蛋白酶切割基序的最小弗林蛋白酶切割位点中包含一个或多个突变。在某些其他实施方案中，所述最小弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列R/Y-x-x-R和/或R-x-x-R所示。在某些其他实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个突变，所述突变改变天然位于志贺样毒素1的A亚基(SEQ ID NO：1)或志贺毒素的A亚基(SEQ ID NO：2)的248-251或志贺样毒素2的A亚基(SEQ ID NO：3)的247-250或在志贺毒素A亚基或其衍生物的等价区域中的至少一个氨基酸残基。在某些其他实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序在所述弗林蛋白酶切割基序中包含氨基酸残基置换。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽包埋或插入在所述结合区中。
对于某些实施方案，向细胞施用所述细胞靶向分子导致所述CD8+ T-细胞表位-肽在细胞内区域与MHC I类分子复合，然后所述细胞将与MHC I类分子复合的CD8+ T-细胞表位-肽呈递在细胞表面上。对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子和/或其志贺毒素效应物多肽能够表现出与包含野生型志贺毒素A1片段或野生型志贺毒素效应物多肽的参比细胞靶向分子相当的亚细胞按路线发送效率(subcellular routing efficiency)，和/或能够表现出从细胞的内体起始位置到内质网和/或细胞溶胶的显著水平的细胞内按路线发送活性。
对于某些实施方案，与第二细胞靶向分子相比，本发明的细胞靶向分子在被引入到脊索动物中时能够表现出改善的体内耐受性，所述第二细胞靶向分子由所述第一细胞靶向分子除其所有志贺毒素效应物多肽成分分别包含野生型志贺毒素A1片段和/或在其A1片段区羧基端的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点而组成。这意味着所述第二细胞靶向分子包含以与本发明的细胞靶向分子中相同的方式与同本发明的细胞靶向分子相同的结合区和相同的异源CD8+表位-肽结合的志贺毒素A亚基效应物多肽，但是第二细胞靶向分子的志贺毒素效应物多肽不同于第一细胞靶向分子的志贺毒素效应物多肽，不同之处在于，其包含含有具有羧基端的志贺毒素A1片段区的野生型志贺毒素效应物多肽和/或在所述野生型志贺毒素效应物多肽的A1片段区羧基端的野生型弗林蛋白酶切割位点。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够表现出：(i)与野生型志贺毒素A1片段或野生型志贺毒素效应物多肽相当的催化活性水平，(ii)半最大抑制浓度(IC50)值为10,000皮摩尔以下的核糖体抑制活性，和/或(iii)显著水平的志贺毒素催化活性。
对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，其中向与所述细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞施用所述细胞靶向分子，所述细胞靶向分子能够引起所述细胞死亡。在某些其他实施方案中，相关于细胞外靶标生物分子的存在或水平而不同的两种不同的细胞类型群体施用本发明的细胞靶向分子，所述细胞靶向分子能够引起与所述细胞毒性细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞类型的死亡，其CD50比针对不与所述细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞类型的CD50小至少三倍。对于某些实施方案，其中向其成员与所述细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的第一细胞群体和其成员不与所述结合区的任意细胞外靶标生物分子物理连接的第二细胞群体施用本发明的细胞靶向分子，相对于所述第二细胞群体的成员，所述细胞靶向分子对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用是至少3倍高。对于某些实施方案，其中向其成员与所述细胞靶向分子的结合区显著量的细胞外靶标生物分子物理连接的第一细胞群体和其成员不与所述结合区显著量的任意细胞外靶标生物分子物理连接的第二细胞群体施用本发明的细胞靶向分子，相对于所述第二细胞群体的成员，所述细胞靶向分子对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用是至少3倍高。对于某些实施方案，其中向第一靶标生物分子阳性细胞群体和其成员不在细胞表面表达显著量的所述细胞靶向分子的结合区的靶标生物分子的第二细胞群体施用本发明的细胞靶向分子，相对于所述第二细胞群体的成员，所述细胞靶向分子对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用是至少3倍高。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子在被引入到细胞中时能够表现出半最大抑制浓度(CD50)值为300nM以下的细胞毒性，和/或能够表现出显著水平的志贺毒素细胞毒性。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子表现出第细胞毒性效力(即，当引入到特定的阳性靶细胞型中时，在1000nM，500nM，100nM，75nM，或50nM的细胞靶向分子浓度，不能表现出大于1％的细胞群体细胞死亡的细胞毒性)。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含天然存在的志贺毒素B亚基。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含含有或基本上由天然志贺毒素B亚基的功能性结合结构域组成的任意多肽。相反，在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素A亚基多肽与异源的结合区功能上相接，用以实现细胞靶向。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽没有包埋在志贺毒素A1片段区中。在某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽没有包埋在志贺毒素效应物多肽中。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽没有插入在志贺毒素A1片段区中。在某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽没有插入在志贺毒素效应物多肽中。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽不包含或由SEQ ID NO：10所示的多肽组成。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含含有包埋在SLT-1A(SEQ ID NO：1)的天然位置53的CD8+ T-细胞表位-肽GILGFVFTL(SEQID NO：10)。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含SEQ ID NO：10所示的多肽。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含含有任意包埋的或插入的CD8+ T-细胞表位的任意志贺毒素效应物多肽。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含SEQ ID NO：71所示的接头，其中所述接头直接或间接地融合在结合区与志贺毒素效应物多肽之间，并且其中所述结合区位于所述志贺毒素效应物多肽的氨基端。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含SEQ ID NO：71所示的接头，其中所述接头融合在结合区与志贺毒素效应物多肽之间。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含融合在结合区与志贺毒素效应物多肽之间的任意异源的CD8+ T-细胞表位-肽，其中所述结合区位于所述志贺毒素效应物的氨基端。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含融合在结合区与志贺毒素效应物多肽之间的任意异源的CD8+ T-细胞表位-肽。
对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，所述靶细胞不是专门的抗原呈递细胞，诸如树突细胞型。对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，所述结合区的细胞外靶标生物分子不由专门的抗原呈递细胞表达。对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，所述结合区的细胞外靶标生物分子不以显著的量与专门的抗原呈递细胞物理连接。对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，所述结合区的细胞外靶标生物分子不与专门的抗原呈递细胞物理连接。对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，所述结合区的靶标生物分子不以显著的量表达在被治疗的脊索动物受试者内的任意专门的抗原呈递细胞的细胞表面上。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽不直接与志贺毒素效应物多肽的志贺毒素A1片段来源的区域的任意氨基酸残基连接。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽不直接与志贺毒素效应物多肽的任意内部氨基酸残基连接，这意指所述志贺毒素效应物多肽的氨基端或羧基端氨基酸残基可以直接与异源的CD8+ T-细胞表位-肽连接。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽没有包埋在志贺毒素效应物多肽中。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽没有插入在志贺毒素效应物多肽中。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区不包含与氨基酸残基19-183对应的人CD4的片段。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区不包含人CD4的片段，其为I型跨膜糖蛋白。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区不包含人免疫细胞表面共受体的片段。
在本发明的某些实施方案中是向细胞内递送能够被所述细胞的MHC I类分子呈递的CD8+ T-细胞表位的方法，所述方法包括下述步骤：使所述细胞与本发明的细胞靶向分子和/或其组合物(例如，本发明的药物组合物或诊断组合物)接触。
在本发明的某些实施方案中是诱导细胞呈递外源施用的与MHC I类分子复合的CD8+ T-细胞表位的方法，所述方法包括下述步骤：在体外或体内使所述细胞与本发明的包含CD8+ T-细胞表位的细胞靶向分子和/或其组合物(例如，本发明的包含本发明所述的细胞靶向分子的药物组合物或诊断组合物)接触。
在本发明的某些实施方案中是通过CD8+ T-细胞表位MHC I类分子复合物诱导针对靶细胞的免疫细胞介导的反应的方法，所述方法包括下述步骤：在体外或体内使所述靶细胞与本发明的包含CD8+ T-细胞表位的细胞靶向分子或其组合物(例如，本发明的包含本发明所述的细胞靶向分子的药物组合物或诊断组合物)接触。对于某些其他的实施方案，所述免疫应答选自由下述组成的组：CD8+免疫细胞分泌细胞因子，靶细胞中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导的生长停滞，CTL-诱导的靶细胞坏死，CTL-诱导的靶细胞凋亡，免疫细胞介导的对除靶细胞外的细胞的细胞杀伤。
在本发明的某些实施方案中是引起CD8+免疫细胞与靶细胞的细胞间结合的方法，所述方法包括下述步骤：使所述靶细胞与本发明的细胞靶向分子在存在CD8+免疫细胞的条件下接触，或具有后续使所述靶细胞与一个或多个CD8+免疫细胞接触的步骤。对于某些实施方案，所述接触步骤在体外发生。对于某些实施方案，所述接触步骤在体内发生，诸如例如，通过将所述细胞靶向分子施用给脊索动物、脊椎动物和/或哺乳动物。对于某些实施方案，所述细胞间结合在体外发生。对于某些实施方案，所述细胞间结合在体内发生。
在本发明的某些实施方案中是包含本发明的细胞靶向分子的组合物，其用于在脊索动物内“播种”组织部位(tissue locus)。
对于某些实施方案，本发明的方法是用于在脊索动物内“播种”组织部位，所述方法包括下述步骤：向所述脊索动物施用本发明的细胞靶向分子、本发明的药物组合物和/或本发明的诊断组合物。对于某些其他实施方案，所述方法用于在包含恶性、患病和/或发炎的组织的脊索动物内“播种”组织部位。对于某些其他实施方案，所述方法用于在包含选自由下述组成的组的组织的脊索动物内“播种”组织部位：患病的组织，肿瘤块，癌症生长，肿瘤，感染的组织，或异常的细胞块。对于某些实施方案，用于在脊索动物内“播种”组织部位的方法包括下述步骤：向所述脊索动物施用本发明的细胞靶向分子，所述本发明的细胞靶向分子包含选自由下述组成的组的异源的CD8+ T-细胞表位-肽：不被MHC I类复合物中所述细胞靶向分子的靶细胞天然呈递的肽，不在靶细胞表达的任意蛋白中天然存在的肽，不在靶细胞的转录组和/或蛋白组中天然存在的肽，不在要播种的部位的细胞外微环境中天然存在的肽，和不在要被靶向的肿瘤块或感染的组织部位天然存在的肽。
本发明还提供包含本发明的细胞靶向分子和至少一种药用赋形剂或载体的药物组合物；和所述细胞靶向分子、包含其的组合物在本文进一步描述的本发明方法中的应用。本发明的某些实施方案是包含本发明任意细胞靶向分子和至少一种药用赋形剂或载体的药物组合物。
在本发明的某些实施方案中是诊断组合物，其包含本发明的细胞靶向分子，或其组合物，和检测促进剂，所述检测促进剂用于收集信息，诸如诊断上有用的关于细胞类型、组织、器官、疾病、病症、状况和/或患者的信息。
除本发明的细胞靶向分子和组合物之外，能够编码本发明的细胞靶向分子或其蛋白组分的多核苷酸也在本发明的范围内，以及包含本发明的多核苷酸的表达载体和包含本发明的表达载体的宿主细胞。包含表达载体的宿主细胞可以用于，例如，通过重组表达制备本发明的细胞靶向分子或其蛋白组分或片段的方法中。
本发明还包括固定在固体基底上的本发明的物质的任意组合物。例如，本发明的物质的组合物的此种排列可以用在筛选本文所述的分子的方法中。
另外，本发明提供杀死细胞的方法，所述方法包括下述步骤：使细胞与本发明的细胞靶向分子或包含本发明的细胞靶向分子的药物组合物接触。对于某些实施方案，接触细胞的步骤在体外发生。对于某些其他实施方案，接触细胞的步骤在体内发生。对于所述杀死细胞的方法的其他实施方案，当与关于所述细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子的细胞外存在和/或表达水平而不同的细胞混合物接触时，所述方法能够较其他细胞和/或细胞型优先地选择性杀死某些细胞和/或细胞型。
本发明还提供治疗有此需要的患者中的疾病、病症和/或病患的方法，所述方法包括下述步骤：向有此需要的患者施用治疗有效量的包含细胞靶向分子的组合物或本发明的药物组合物。对于某些实施方案，要使用本发明的方法治疗的疾病、病症或病患选自：癌症，肿瘤，生长异常，免疫病症，或微生物感染。对于该方法的某些实施方案，要治疗的癌症选自由下述组成的组：骨癌，乳腺癌，中枢/周围神经系统癌症，胃肠癌，生殖细胞癌，腺癌，头颈癌，血液学癌症，肾-尿道癌，肝癌，肺/胸膜癌，前列腺癌，肉瘤，皮肤癌，和子宫癌。对于该方法的某些实施方案，要治疗的免疫病症是与选自由下述组成的组的疾病相关的免疫病症：淀粉样变性，强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)，哮喘，克罗恩病(Crohn’sdisease)，糖尿病，移植排斥，移植物抗宿主病，桥本甲状腺炎(Hashimoto’sthyroiditis)，溶血性尿毒性综合征(hemolytic uremic syndrome)，HIV相关的疾病，红斑狼疮(lupus erythematosus)，多发性硬化(multiple sclerosis)，结节性多动脉炎(polyarteritis nodosa)，多动脉炎(polyarthritis)，银屑病(psoriasis)，银屑病关节炎(psoriatic arthritis)，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)，硬皮病(scleroderma)，脓毒性休克(septic shock)，舍格伦综合征(Sjorgren’s syndrome)，溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)和血管炎(vasculitis)。
在本发明的某些实施方案中是包含本发明的细胞靶向分子的组合物，其用于癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症或微生物感染的治疗或预防。在本发明的某些实施方案中是本发明的物质的组合物在制备用于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症或微生物感染的药物中的应用。
在本发明的某些实施方案中是包含本发明的细胞靶向分子的组合物，其用于将一种或多种另外的外源物质递送到与本发明的细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞中。本发明的细胞靶向分子的某些实施方案可以用于将一种或多种另外的外源物质递送到与本发明的细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞中。另外，本发明提供用于将外源物质递送到细胞内部的方法，所述方法包括在体外或体内使所述细胞与本发明的细胞靶向分子、药物组合物和/或诊断组合物接触。本发明还提供用于将外源物质递送到有此需要的患者的细胞内部的方法，所述方法包括向所述患者施用本发明的细胞靶向分子的步骤，其中靶细胞与本发明的细胞靶向分子的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接。
本发明的任意组合物(例如，细胞靶向分子，药物组合物，或诊断组合物)用于诊断、预后和/或表征疾病、病症和/或病患的应用也在本发明的范围内。
在本发明的某些实施方案中是使用本发明的细胞靶向分子和/或诊断组合物检测细胞的方法，所述方法包括下述步骤：使细胞与所述细胞靶向分子和/或诊断组合物接触，并且检测所述细胞靶向分子和/或诊断组合物的存在。对于某些实施方案，接触细胞的步骤在体外发生。对于某些实施方案，接触细胞的步骤在体内发生。对于某些实施方案，检测细胞的步骤在体外发生。对于某些实施方案，检测细胞的步骤在体内发生。
例如，本发明的诊断组合物可以用于在体内检测细胞，其通过向脊索动物受试者施用包含本发明的细胞靶向分子的组合物(其包含检测促进剂)，然后在体外或体内检测本发明的细胞靶向分子和/或所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽的存在而进行。
本发明的任意组合物用于治疗与预防癌症、肿瘤、生长异常和/或免疫病症的应用也在本发明的范围内。
本发明的某些实施方案包括利用免疫疗法治疗患者中的癌症的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用本发明的细胞靶向分子和/或药物组合物的步骤。
在本发明的某些实施方案中是试剂盒，所述试剂盒包括本发明的物质的组合物，和任选地，使用说明，另外的试剂和/或药物递送装置。
参考下述描述、后附的权利要求书和附图，将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点。本发明的前述元件可以各自组合或自由去除，从而产生本发明的其他实施方案，在下文中无需任何反对所述组合或去除的声明。
附图简述
图1(A-B)显示本发明的示例性细胞靶向分子的总布置，所述细胞靶向分子分别包含细胞靶向结合区(结合区)、志贺毒素A亚基效应物多肽(志贺毒素效应物结构域)和异源的CD8+ T-细胞表位-肽(表位)。“N”和“C”标记分别表示志贺毒素效应物多肽的氨基端和羧基端。图1中示例性分子的显示是用于本发明有限组的实施方案的结构特征的某些总布置的说明性目的。应该理解，这些示例性的分子不是旨在，也不应该解释为，关于本发明的分子的任意结构特征和/或组分的布置是完全限定性的。在图1的原理图中所示的相对尺寸、位置或特征的数目已经被简化。例如，每个细胞靶向分子的异源的CD8+ T-细胞表位-肽货物的总数可以大于2，3，4，5，10，20，或30，并且异源的CD8+ T-细胞表位肽可以包含在更大的抗原性分子中。图1的原理图不旨在准确描述关于本发明中任意实施方案的分子结构的相对尺寸的任何信息。
图1B显示本发明的示例性细胞靶向分子的总布置，所述细胞靶向分子包含蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽(参见，例如，WO 2015/191764)，并且其中异源的CD8+ T-细胞表位-肽在志贺毒素效应物多肽组分的羧基端与所述细胞靶向分子连接。
图2图示异源的CD8+ T-细胞表位-肽融合到志贺毒素A亚基来源的细胞靶向分子上没有显著削弱所述细胞靶向分子针对靶标阳性细胞的细胞毒性活性。细胞的百分比存活力针对蛋白浓度以10为底的对数绘图。图2图示细胞杀伤测定的结果，其中SLT-1A：：scFv1：：C2(SEQ ID NO：61)表现出与母本细胞靶向分子SLT-1A：：scFv1(SEQ ID NO：63)(其缺少任意的异源的CD8+ T-细胞表位-肽)的细胞毒性相似的细胞毒性。
图3图示细胞杀伤测定的结果，其中示例性的细胞靶向分子SLT-1A：：scFv1：：C2(SEQ ID NO：61)的细胞毒性活性在特定浓度范围内特异性针对靶标阳性细胞。细胞的百分比存活力针对蛋白浓度以10为底的对数绘图。在用于准确测量SLT-1A：：scFv1：：C2(SEQ IDNO：61)针对靶标阳性细胞的CD50值的分子浓度范围内，SLT-1A：：scFv1：：C2(SEQ ID NO：61)不杀死对结合区scFv2的靶标生物分子的细胞表面表达是阴性的细胞(大约100％的细胞存活力)，并且显示在图2中。
图4图示与阴性对照相比，靶标阳性癌细胞对细胞靶向分子递送的与MHC I类分子复合的异源CD8+ T-细胞表位-肽的细胞表面呈递。图4显示用阴性对照、细胞靶向分子SLT-1A：：scFv1：：C2(SEQ ID NO：61)或细胞靶向分子SLT-1A：：scFv2(SEQ ID NO：64)处理的细胞组的TCR-STARTM测定、流式细胞计数分析的结果的报告。靶标阳性细胞的荧光激活细胞分选(FACS)流式细胞术细胞计数针对相对光单位(RLU)的来自PE-STARTM多聚体试剂的光信号绘图，所述光信号表示细胞表面MHC I类分子(人HLA-A2)展示的C2表位-肽(SEQ ID NO：6)复合物的存在。用本发明的示例性细胞靶向分子SLT-1A：：scFv1：：C2(SEQ ID NO：61)处理的靶标阳性细胞在其细胞表面上展示与MHC I类分子复合的C2表位-肽(SEQ ID NO：6)(上图)，而用相关的细胞靶向分子SLT-1A：：scFv2(SEQ ID NO：64)处理的靶标阳性细胞没有在细胞表面上展示C2表位-肽(SEQ ID NO：6)(下图)。
图5图示与阴性对照相比，靶标阳性癌细胞对细胞靶向分子递送的与MHC I类分子复合的异源的CD8+ T-细胞表位-肽的细胞表面呈递。在图5中，绘制了对应于接收不同处理的细胞组的PE-STARTM多聚体试剂的索引的平均荧光强度(“iMFI”，阳性群体的荧光乘阳性百分数)(以RLU为单位)。图5显示了用外源的C2肽(SEQ ID NO：6)对照、“无活性SLT-1A：：scFv”(SEQ ID NO：65)或细胞靶向分子“无活性SLT-1A：：scFv2：：C2”(SEQ ID NO：53)处理的细胞的TCR-STAR assayTM、流式细胞计数分析的结果。外源施用的C2肽((SEQ ID NO：6)，如上)与肽负载增强剂(“PLE，”Altor Biosicence Corp.，Miramar，FL，U.S.)组合。与肽负载增强剂(PLE)处理组合的C2肽(SEQ ID NO：6)提供阳性对照，其中外源施用的C2肽(SEQID NO：6)可以负载在细胞表面MHC I类分子上而从不进入细胞。用本发明的示例性细胞靶向分子“无活性SLT-1A：：scFv2：：C2”(SEQ ID NO：53)处理的靶标阳性细胞在其细胞表面上展示与MHC I类分子复合的C2表位-肽(SEQ ID NO：6)，而仅用外源C2表位-肽(SEQ ID NO：6)或母本细胞靶向分子“无活性SLT-1A：：scFv2”(SEQ ID NO：65)处理的相同细胞没有在细胞表面上展示C2表位-肽(SEQ ID NO：6)。
图6图示与阴性对照相比，在不同培育时间(4小时或16小时)，靶标阳性癌细胞对细胞靶向分子递送的与MHC I类分子复合的异源CD8+ T-细胞表位-肽的细胞表面展示。图6显示用细胞靶向分子SLT-1A：：scFv1：：C2(SEQ ID NO：61)或阴性对照处理的细胞组的TCR-STARTM测定、流式细胞计数分析的结果报告。将靶标阳性细胞的FACS细胞计数针对相对光单位(RLU)的来自PE-STARTM多聚体试剂的光信号绘图，所述光信号表示细胞表面MHC I类分子(人HLA-A2)展示的C2表位-肽(SEQ ID NO：6)复合物的存在。用本发明的示例性细胞靶向分子SLT-1A：：scFv1：：C2(SEQ ID NO：61)处理的靶标阳性细胞在4小时(4hrs)(上图)或16小时(16hrs)(下图)培育持续时间后在其细胞表面上展示与MHC I类分子复合的C2表位-肽(SEQ ID NO：6)。
图7图示与阴性对照相比，靶标阳性癌细胞对细胞靶向分子递送的与MHC I类分子复合的异源CD8+ T-细胞表位-肽的细胞表面展示。图7显示用阴性对照、细胞靶向分子SLT-1A：：scFv5：：C2(SEQ ID NO：57)或细胞靶向分子SLT-1A：：scFv5(SEQ ID NO：66)处理的细胞组的TCR-STARTM测定、流式细胞计数分析的结果报告。靶标阳性细胞的FACS细胞计数针对相对光单位(RLU)的来自PE-STARTM多聚体试剂的光信号绘图，所述光信号表示细胞表面MHCI类分子(人HLA-A2)展示的C2表位-肽(SEQ ID NO：6)复合物的存在。用本发明的示例性细胞靶向分子SLT-1A：：scFv5：：C2(SEQ ID NO：57)处理的靶标阳性细胞在其细胞表面上展示与MHC I类分子复合的C2表位-肽(SEQ ID NO：6)(上图)，而用母本细胞靶向分子SLT-1A：：scFv5(SEQ ID NO：66)处理的靶标阳性细胞不在细胞表面上展示C2表位-肽(SEQ ID NO：6)(下图)。
图8图示与阴性对照相比，靶标阳性癌细胞对细胞靶向分子递送的与MHC I类分子复合的异源CD8+ T-细胞表位-肽的细胞表面展示。图7显示用阴性对照、细胞靶向分子SLT-1A：：scFv7：：C2(SEQ ID NO：60)或细胞靶向分子SLT-1A：：scFv7(SEQ ID NO：69)处理的细胞组的TCR-STARTM测定、流式细胞计数分析的结果报告。靶标阳性细胞的FACS细胞计数针对相对光单位(RLU)的来自PE-STARTM多聚体试剂的光信号绘图，所述光信号表示细胞表面MHC I类分子(人HLA-A2)展示的C2表位-肽(SEQ ID NO：6)复合物的存在。用本发明的示例性细胞靶向分子SLT-1A：：scFv7：：C2(SEQ ID NO：60)处理的靶标阳性细胞在其细胞表面上展示与MHC I类分子复合的C2表位-肽(SEQ ID NO：6)(上图)，而用母本细胞靶向分子SLT-1A：：scFv7(SEQ ID NO：69)处理的靶标阳性细胞不在细胞表面上展示C2表位-肽(SEQ IDNO：6)(下图)。
图9图示使用多个点或分泌细胞的干扰素γELIspot测定的结果，其针对每种测试的条件绘图。对于每份样品，将靶标阳性癌细胞用细胞靶向分子或阴性对照处理，然后与人PBMC一起温育，之后进行ELISPOT测定。用本发明的示例性细胞靶向分子“无活性SLT-1A：：scFv2：：C2”(SEQ ID NO：53)处理的靶标阳性细胞刺激以免疫细胞分泌细胞因子的形式的细胞间反应，而来自用母本细胞靶向分子“无活性SLT-1A：：scFv2”(SEQ ID NO：65)处理的靶标阳性细胞可能显示背景水平的导致干扰素γ分泌PBMC的细胞间结合，这与“仅用缓冲液”的阴性对照处理大致相同。
图10图示细胞间T淋巴细胞(T-细胞)激活测定的结果，其对每种测试条件以RLU绘制荧光素酶活性。对于每份样品，将靶标阳性癌细胞用细胞靶向分子或阴性对照处理，然后与人T-细胞一起温育，所述人T-细胞表达特异性识别细胞表面呈递的人MHC I类分子(HLA-A2)F2表位(SEQ ID NO：10)复合物的人T-细胞受体(TCR)，并且包含驱动荧光素酶表达的NFAT转录反应元件。用本发明的示例性细胞靶向分子“无活性SLT-1A：：scFv6：：F2”(SEQ IDNO：59)处理的靶标阳性细胞经由TCR识别和NFAT信号传导刺激T-细胞激活形式的分子间反应；而来自用母本细胞靶向分子“无活性SLT-1A：：scFv6”(SEQ ID NO：68)处理的靶标阳性细胞的结果可能显示NFAT背景水平的分子间T-细胞信号传导激活，这与“仅用缓冲液”的阴性对照处理大致相同。
详述
在下文中使用示例性的、非限制性的实施方案和参照附图更充分地描述本发明。但是，本发明可以以许多不同的形式实施，并且不应被理解为限于下面阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案使得本公开内容更透彻并且将本发明的范围传递给本领域技术人员。为了可以更容易地理解本发明，在下面定义某些术语。在发明详述中可以发现另外的定义。
如在说明书和所附权利要求书中使用的，除非上下文另外清楚地指明，术语“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指示物。
如在说明书和所附权利要求书中使用的，当提及两种物质A和B时，术语“和/或”是指A和B中的至少一种。如在说明书和所附权利要求书中使用的，当提及超过两种物质诸如A、B和C时，术语“和/或”是指A、B、或C中的至少一种，或A、B、或C的任何组合中的至少一种(每种物质以单个或多个可能性存在)。
贯穿本说明书，词语“包含”或变体诸如“包括”或“含有”应理解为暗示包括所述的整数(或组分)或整数(或组分)的组，但是不排除任何其他整数(或组分)或整数(或组分)的组。
贯穿本说明书，术语“包括”用于指“包括、但不限于”。“包括”和“包括、但不限于”互换使用。
术语“氨基酸残基”或“氨基酸”包括对结合到蛋白、多肽或肽中的氨基酸的提及。术语“多肽”包括氨基酸或氨基酸残基的任何聚合物。术语“多肽序列”表示在物理上构成多肽的一系列氨基酸或氨基酸残基。“蛋白”是包含一个或多个多肽或多肽“链”的大分子。“肽”是尺寸小于总计15-20个氨基酸残基的小多肽。术语“氨基酸序列”表示在物理上构成肽或多肽的一系列氨基酸或氨基酸残基，取决于长度。除非另有说明，本文中公开的多肽和蛋白序列从左至右书写，代表它们从氨基端至羧基端的次序。
术语“氨基酸”、“氨基酸残基”、“氨基酸序列”或“多肽序列”包括天然存在的氨基酸(包括L和D异构体)，且除非另有限制，也包括可以以与天然存在的氨基酸类似方式起作用的天然氨基酸的已知类似物，诸如硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、羟脯氨酸羟丁赖氨酸(hydroxyprolinehypusine)、焦谷氨酸和硒代甲硫氨酸(参见，例如，Nagata K等人，Bioinformatics 30：1681-9(2014))。用如下表A中的简写名称描述在本文中提及的氨基酸：
表A.氨基酸命名法
关于多肽、肽区域、多肽区域、蛋白或分子的氨基酸残基的短语“保守置换”表示所述肽、肽区域、多肽区域、蛋白或分子的氨基酸组成的变化，所述变化不会实质上改变整体肽、肽区域、多肽区域、蛋白或分子的功能和结构(参见Creighton，Proteins：StructuresandMolecular Properties (W.H.Freeman and Company，New York(第2版，1992)))。
就本发明的目的而言，短语“来源于”在提及多肽或多肽区域时是指，所述多肽或多肽区域包含最初在“母本”蛋白中发现的氨基酸序列，且其现在相对于原始多肽或多肽区域可能包含某些氨基酸残基添加、缺失、截短、重排或其他改变，只要基本上保留所述“母本”分子的某些功能和结构即可。熟练的技术人员能够使用本领域已知的技术鉴定衍生多肽或多肽区域的母本分子，例如，使用蛋白序列比对软件进行鉴定。
就所要求的发明的目的而言，并且关于志贺毒素多肽序列或志贺毒素来源的多肽，术语“野生型”通常是指在活的物种(诸如例如，致病细菌)中发现的天然存在的志贺毒素蛋白序列，其中所述志贺毒素蛋白序列是最常见的变体中的一种。这与通常存在的志贺毒素蛋白序列相反，尽管其仍然是天然存在的，但在对包含至少一种志贺毒素蛋白变体的物种的统计学力度的数量的天然存在的个体生物体取样时，其在给定的物种的不到百分之一的个体生物体中发现。天然分离物在其自然环境之外的克隆扩增(不管所述分离物是生物体还是包含生物学序列信息的分子)不改变天然存在的需要，只要所述克隆扩增不引入所述物种的天然存在群体中不存在的新的序列变化和/或不改变彼此间的序列变体的相对比例。
关于所要求的本发明，术语“相连”、“相连的”、“连接的”或“连接”是指分子的两个以上的组分被接合、附着、连接或另外连接形成单个分子的状态，或通过在两个分子之间产生缔合、连接、附着和/或任意其他联系而使所述两个分子彼此相连形成单个分子的作用。例如，术语“连接的”可以指通过一种或多种原子相互作用相连的两个以上的组分，从而形成单个分子，并且其中所述原子相互作用可以是共价的和/或非共价的。两个组分之间的共价连接的非限制性实例包括肽键和半胱氨酸-半胱氨酸二硫键。两个分子组分之间的非共价连接的非限制性实例包括离子键。
就本发明的目的而言，术语“连接的”是指通过一种或多种原子相互作用连接的两个以上的分子组分，从而形成单个分子，并且其中所述原子相互作用包括至少一个共价键。就本发明的目的而言，术语“连接”是指产生上述连接的分子的作用。
就本发明的目的而言，术语“融合的”是指通过至少一个共价键连接的两个以上的蛋白样组分，所述共价键是肽键，而不管所述肽键涉及羧酸基团的碳原子的参与还是涉及另一个碳原子，诸如例如，α-碳、β-碳、γ-碳、σ-碳等。融合在一起的两个蛋白样组分的非限制性实例包括，例如，通过肽键与多肽融合的氨基酸、肽或多肽，使得得到的分子是单一的连续的多肽。就本发明的目的而言，术语“融合”是指产生上述融合的分子的作用，诸如，例如，由重组融合在翻译时产生单个蛋白样分子的遗传区域产生的融合蛋白。
符号“：：”是指在它前面和后面的多肽区域物理地连接在一起以形成连续多肽。
本文中使用的术语“表达”(“expressed，”“expressing，”或“expresses，”)及其语法变体表示多核苷酸或核酸翻译成蛋白。表达的蛋白可以保留在细胞内，变成细胞表面膜的组分，或者被分泌进细胞外空间中。
用于本文时，在至少一个细胞表面上表达显著量的细胞外靶标生物分子的细胞是“靶标阳性细胞”或“靶标+细胞”，并且是与指定的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞。
用于本文时，符号“α”是能够与该符号后的生物分子结合的免疫球蛋白型结合区的简写。符号“α”用于表示免疫球蛋白型结合区的功能特性，这基于它以10-5以下的解离常数(KD)所述的结合亲和力结合该符号后的生物分子的能力。
用于本文时，术语“重链可变(VH)结构域”或“轻链可变(VL)结构域”分别是指任意的抗体VH或VL结构域(例如，人VH或VL结构域)及其保留相对应的天然抗体的至少定性的抗原结合能力的任意衍生物(例如，来源于天然鼠VH或VL结构域的人源化的VH或VL结构域)。VH或VL结构域由三个CDR或ABR中断的“构架”区组成。所述构架区起作用排列CDR或ABR，用以特异性结合抗原的表位。从氨基端到羧基端，VH和VL结构域都包含下述构架(FR)和CDR区或ABR区：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，和FR4；或者，类似地，FR1，ABR1，FR2，ABR2，FR3，ABR3，和FR4。用于本文时，术语“HCDR1”、“HCDR2”或“HCDR3”分别用于表示VH结构域中的CDR1、2或3，术语“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”分别用于表示VL结构域中的CDR 1、2或3。用于本文时，术语“HABR1”、“HABR2”或“HABR3”分别用于表示VH结构域中的ABR 1、2或3，术语“LABR1”、“LABR2”或“LABR3”分别用于表示VL结构域中的CDR 1、2或3。对于骆驼科动物VHH片段，软骨鱼的IgNAR，VNAR片段，某些单结构域抗体，及其衍生物，存在包含相同的基本布置的单一重链可变结构域：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，和FR4。用于本文时，术语“HCDR1”、“HCDR2”或“HCDR3”可以分别用于表示单一重链可变结构域中的CDR 1、2或3。
就本发明的目的而言，术语“效应物”是指提供生物活性，诸如细胞毒性、生物信号传导、酶促催化、亚细胞按路线发送(subcellular routing)、和/或导致一种或多种因子的变构效应和/或募集的分子间结合。
就本发明的目的而言，短语“志贺毒素效应物多肽”、“志贺毒素效应物多肽区”和“志贺毒素效应物区”是指来源于志贺毒素家族成员的至少一个志贺毒素A亚基的多肽或多肽区域，其中所述多肽或多肽区域能够表现出至少一种志贺毒素功能。
就本发明的目的而言，术语“异源的”在描述结合区时，意指所述结合区是来自与天然存在的志贺毒素不同的来源，例如，作为多肽的异源结合区不是作为任意天然志贺毒素的一部分天然存在的多肽。
就本发明的目的而言，术语“异源的”在描述CD8+ T-细胞表位时，意指所述CD8+T-细胞表位是来自不同于下述的来源：(1)天然存在的志贺毒素的A亚基，例如，异源多肽不是作为天然志贺毒素的任意A亚基的一部分天然存在的，和(2)现有技术的志贺毒素效应物多肽。例如，在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，关于CD8+ T-细胞表位-肽的术语“异源的”表示不是在要被修饰的细胞靶向分子(母本分子)中初始存在的而是添加到该分子中的肽序列，不管是通过本文所述的包埋、融合、插入和/或氨基酸置换过程添加，还是通过任意其他改造方式添加，从而产生修饰的细胞靶向分子。结果是产生修饰的细胞靶向分子，其包含针对初始的未修饰的细胞靶向分子是外源的CD8+ T-细胞表位-肽，即所述CD8+T-细胞表位不存在于未修饰的细胞靶向分子(母本分子)中。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位针对所述细胞靶向分子的结合区组分也是异源的，例如，异源表位是结合区的结合活性不需要的一种表位，并且不是提供结合区的结合活性的最小结合区结构的一部分结构。例如，不天然存在于免疫球蛋白中的CD8+ T-细胞表位针对来源于所述免疫球蛋白的免疫球蛋白型结合区是异源的，条件是，其不是所述免疫球蛋白型结合区的结合活性所需要的，并且不是提供所述免疫球蛋白型结合区的结合活性的最小结合区结构的一部分结构。
就所要求的发明的目的而言，短语CD8+免疫细胞的“细胞间接合”是指CD8+免疫细胞以指示由所述CD8+免疫细胞引起的免疫应答激活的方式响应不同的细胞(例如，通过致敏其他的，展示一种或多种pMHC I)，所述由所述CD8+免疫细胞引起的免疫应答激活诸如，例如，参与杀死其他细胞的反应，招募和激活其他免疫细胞(例如，细胞因子分泌)，CD8+免疫细胞的成熟，CD8+免疫细胞的激活等等。
用于本文时，在描述分子的功能活性时，术语“CD8+ T-细胞表位递送”意指分子提供在细胞内定位在亚细胞区室的生物活性，所述亚细胞区室能够导致包含CD8+ T-细胞表位-肽的分子的蛋白样部分被蛋白酶体切割。分子的“CD8+ T-细胞表位递送”功能可以通过观察所述分子的CD8+T-细胞表位-肽货物在外源施用所述分子的细胞或其中用在其一个或多个内体区室中包含所述分子的细胞开始测定的细胞的细胞表面上的MHC呈递进行测定。通常，可以确定分子将CD8+ T-细胞表位递送到蛋白酶体的能力，其中“CD8+ T-细胞表位递送”分子的初始位置是细胞的早期内体区室，然后，凭经验显示所述分子将所述表位-肽递送到细胞的蛋白酶体。然而，也可以确定“CD8+ T-细胞表位递送”能力，其中所述分子在细胞外位置起始，并且凭经验显示其直接或间接地将表位递送到细胞内和所述细胞的蛋白酶体内。例如，某些“CD8+ T-细胞表位递送”分子通过细胞的内体区室，诸如，例如，在内吞进入到所述细胞内之后。备选地，可以对在细胞外位置起始的分子观察到“CD8+ T-细胞表位递送”活性，其中所述分子不进入细胞的任何内体区室——相反，所述“CD8+ T-细胞表位递送”分子进入细胞并且将T-细胞表位-肽递送至所述细胞的蛋白酶体，这可能是由于所述“CD8+ T-细胞表位递送”分子指导其自身的向亚细胞区室组分的按路线发送，从而导致对其CD8+ T-细胞表位-肽组分的蛋白酶体切割。
就本发明的目的而言，志贺毒素效应物功能是由来源于志贺毒素A亚基的多肽区域赋予的生物活性。志贺毒素效应物功能的非限制性实例包括促进细胞进入；脂质膜变形；促进细胞内在化；刺激网格蛋白介导的胞吞作用；指导向个细胞内区室(诸如，例如，高尔基体、内质网和细胞溶胶)的细胞内按路线发送；指导货物的细胞内按路线发送；抑制核糖体功能；催化活性，诸如例如，N-糖苷酶活性和催化抑制核糖体；减少蛋白合成，包括胱天蛋白酶激活，激活效应物胱天蛋白酶，实施抑制细胞效应，和细胞毒性。志贺毒素催化活性包括，例如，核糖体灭活，蛋白合成抑制，N糖苷酶活性，多核苷酸：腺苷糖苷酶活性，RNA酶活性和DNA酶活性。志贺毒素是核糖体灭活蛋白(RIP)。RIP可以将核酸、多核苷、多核苷酸、rRNA、ssDNA、dsDNA、mRNA(和聚腺苷酸)和病毒核酸脱嘌呤化(参见例如，Barbieri L等人，Biochem J 286：1-4(1992)；Barbieri L等人，Nature372：624(1994)；Ling J等人，FEBSLett 345：143-6(1994)；Barbieri L等人，Biochem J 319：507-13(1996)；Roncuzzi L，Gasperi-Campani A，FEBS Lett392：16-20(1996)；Stirpe F等人，FEBS Lett 382：309-12(1996)；Barbieri L等人，Nucleic Acids Res 25：518-22(1997)；Wang P，Tumer N，Nucleic Acids Res 27：1900-5(1999)；Barbieri L等人，Biochim Biophys Acta 1480：258-66(2000)；Barbieri L等人，J Biochem 128：883-9(2000)；Brigotti M等人，Toxicon39：341-8(2001)；Brigotti M等人，FASEB J 16：365-72(2002)；Bagga S等人，J Biol Chem278：4813-20(2003)；Picard D等人，J Biol Chem280：20069-75(2005))。有些RIP表现出抗病毒活性和超氧化物歧化酶活性(Erice A等人，Antimicrob Agents Chemother 37：835-8(1993)；Au T等人，FEBS Lett 471：169-72(2000)；Parikh B，Tumer N，Mini Rev Med Chem4：523-43(2004)；Sharma N等人，Plant Physiol 134：171-81(2004))。已经在体外和在体内观察到志贺毒素催化活性。针对志贺毒素效应物活性的测定的非限制性例子测量多种活性，诸如例如，蛋白合成抑制活性、脱嘌呤化活性、细胞生长的抑制、细胞毒性、超螺旋化的DNA松弛活性和核酸酶活性。
用于本文时，志贺毒素效应物功能的保留表示，如通过具有再现性的适当定量测定所测量的，在相同条件下，与野生型志贺毒素效应物多肽对照(例如，志贺毒素A1片段)或包含野生型志贺毒素效应物多肽(例如，志贺毒素A1片段)的细胞靶向分子相当的志贺毒素功能活性水平。对于志贺毒素效应物的核糖体灭活或核糖体抑制的功能，保留的志贺毒素效应物功能是在体外设置中表现出10,000皮摩尔(pM)或更低的IC50，所述体外设置诸如例如，通过使用技术人员已知的和/或本文描述的测定。对于志贺毒素效应物在靶标阳性细胞杀死测定中的细胞毒性功能，取决于细胞类型和其对适当的细胞外靶标生物分子的表达，保留的志贺毒素效应物功能是表现出1,000纳摩尔(nM)或更低的CD50，例如，如使用技术人员已知的和/或本文描述的测定所示的。
就所要求的发明的目的而言，关于核糖体抑制的术语“等价的”意指凭经验测量的核糖体抑制活性水平，如通过具有重现性的适当的定量测定测量的，其在相同条件下可重现地在参比分子(例如，第二细胞靶向分子或第三细胞靶向分子)活性的10％以下。
就所要求的发明的目的而言，关于细胞毒性的术语“等价的”意指凭检验测量的细胞毒性水平，如通过具有重现性的适当的定量测定测量的，其在相同条件下可重现地在参比分子(例如，第二细胞靶向分子或第三细胞靶向分子)活性的10％以下。
用于本文时，关于细胞毒性的术语“减毒的”意指分子在相同条件下表现出或已表现出的CD50为参比分子所表现的CD50的10倍至100倍。
在确定志贺毒素效应物功能活性水平时，不应该考虑不准确的IC50和CD50值。对于一些样品，由于不能收集用于准确的曲线拟合的需要的数据点，IC50或CD50的准确的值可能是不可获得的。例如，理论上，通过在给定样品的浓度系列中分别没有发生大于50％的核糖体抑制或细胞死亡，则IC50和CD50都不能确定。如在来自示例性志贺毒素效应物功能测定(诸如，例如，在下文实施例中所述的测定)的数据的分析中描述的不足以准确地拟合曲线的数据不应该被认为代表实际的志贺毒素效应物功能。
不能检测志贺毒素效应物功能的活性可能是由于不适当的表达、多肽折叠、和/或多肽稳定性，而不是缺少细胞进入、亚细胞按路线发送和/或酶活性。志贺毒素效应物功能的测定可能不需要很多本发明的多价来测量显著量的志贺毒素效应物功能活性。在凭经验确定低或没有效应物功能的潜在的原因与蛋白表达或稳定性相关的程度上，本领域技术人员可以能够使用本领域已知的蛋白化学和分子工程改造技术抵消这些因素，使得志贺毒素功能性效应物活性可以被恢复并测量。例如，基于不适当的细胞的表达可以通过使用不同的表达控制序列进行抵消；不适当的多肽折叠和/或稳定性可以受益于稳定末端序列、或稳定分子的三维结构的非效应物区域中的补偿性突变。
某些志贺毒素效应物功能是不容易测量的，例如，亚细胞按路线发送功能。例如，没有常规的定量测定来区分志贺毒素效应物多肽不具有细胞毒性和/或不能递送异源的CD8+ T-细胞表位是否是由于不适当的亚细胞按路线发送，但是，在试验可用的时候，可以与适当的野生型志贺毒素效应物多肽相比针对任何显著水平的亚细胞按路线发送来分析志贺毒素效应物多肽。然而，如果本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应物多肽组分表现出与野生型志贺毒素A亚基构建体相当或等价的细胞毒性，则推测至少在测试的条件下，亚细胞按路线发送活性分别与野生型志贺毒素A亚基构建体的亚细胞按路线发送活性水平是相当或等价的。
当用于个体志贺毒素功能的新测定可用时，可以针对任意水平的这些志贺毒素效应物功能，诸如在野生型志贺毒素效应物多肽的活性的1000倍至100倍以下之内，或与功能性敲除的志贺毒素效应物多肽相比，表现出3倍至30倍或更大的活性，分析志贺毒素效应物多肽和/或包含志贺毒素效应物多肽的细胞靶向分子。
充分的亚细胞按路线发送可以仅通过在细胞毒性测定中观察细胞靶向分子的志贺毒素细胞毒性活性水平而推导，所述细胞毒性测定诸如例如，基于T-细胞表位呈递或基于参与细胞溶质和/或内质网定位的靶标底物的志贺毒素效应物功能的细胞毒性测定。
用于本文时，“显著的”志贺毒素效应物功能的保留表示，如通过具有再现性的适当定量测定所测量的，与野生型志贺毒素效应物多肽对照(例如，志贺毒素A1片段)相当的志贺毒素功能活性水平。对于体外核糖体抑制，显著的志贺毒素效应物功能是表现出300pM或更低的IC50，取决于测定中所用的核糖体的来源(例如，细菌、古细菌(archaeal)或真核生物(藻类，真菌，植物或动物)来源)。与催化破坏的SLT-1A 1-251双重突变体(Y77S/E167D)的100,000pM的IC50相比，这是显著更大的抑制。对于在实验室细胞培养物中的靶标阳性细胞杀死测定中的细胞毒性，显著的志贺毒素效应物功能是表现出100、50、30nM或更低的CD50，取决于结合区的靶标生物分子和细胞类型，特别是适当的细胞外靶标生物分子和/或由被评价的分子所靶向的细胞外表位的细胞型表达和/或细胞表面呈递。与单独的没有细胞靶向结合区域的志贺毒素A亚基(或野生型志贺毒素A1片段，它们具有100-10,000nM的CD50，取决于细胞系)相比，这是对适当的靶标细胞群体显著更大的细胞毒性。
就本发明的目的而言，并且关于本发明的分子的志贺毒素效应物功能，术语“合理的活性”是指相对于包含天然存在的志贺毒素的分子，至少表现出中等水平的(例如，在11倍至1,000倍之内)本文定义的志贺毒素效应物活性，其中所述志贺毒素效应物活性选自由下述组成的组：内在化效率，向细胞溶胶的亚细胞按路线发送效率，靶细胞对递送的表位的呈递，核糖体抑制和细胞毒性。对于细胞毒性，合理水平的志贺毒素效应物活性包括在野生型志贺毒素构建体的1,000倍以内，诸如，例如，当野生型志贺毒素构建体表现出0.5nM的CD50(例如，包含野生型志贺毒素A1片段的细胞靶向分子)时，表现出500nM以下的CD50。
就本发明的目的而言，并且关于本发明的分子的细胞毒性，术语“最优的”是指在包含野生型志贺毒素A1片段(例如，志贺毒素A亚基或其某些截短的变体)和/或天然存在的志贺毒素的分子的细胞毒性的2，3，4，5，6，7，8，9，或10倍之内的志贺毒素催化结构域介导的细胞毒性水平。
应该注意到，即使在实践中相对于野生型志贺毒素A亚基或其片段，志贺毒素效应物多肽的细胞毒性减小，使用生物活性减弱的志贺毒素效应物多肽的应用也可能与使用野生型志贺毒素效应物多肽同等有效或比其更有效，原因在于最高效力的变体可能表现出不需要的作用，这些作用在减小的细胞毒性效力的变体中是最小的或减小的。野生型志贺毒素是非常有效力的，能够在仅一个毒素分子已经到达中毒细胞的细胞溶胶后或可能在仅四十个毒素分子已经内在化到中毒的细胞中后杀死所述中毒的细胞。与野生型志贺毒素效应物多肽相比，具有甚至相当大地减弱的志贺毒素效应物功能(诸如，例如，亚细胞按路线发送或细胞毒性)的志贺毒素效应物多肽的效力可能仍然是足够的，足以用于实践应用，诸如例如，涉及靶向的细胞杀死、异源表位递送和/或检测特定的细胞及其亚细胞区室的应用。另外，某些活性减弱的志贺毒素效应物多肽可以特别用于将货物(例如，另外的外源物质或T-细胞表位)递送至细胞内位置或靶细胞的亚细胞区室中。
关于分子的细胞毒性活性的术语“选择性细胞毒性”表示生物靶标阳性细胞群体(例如，被靶向的细胞类型)和非靶向的旁观细胞群体(例如，生物分子靶标阴性细胞类型)之间的相对细胞毒性水平，其可以被表示为靶向细胞类型的半数最大细胞毒性浓度(CD50)与非靶向的细胞类型的CD50之比，以提供相对于未靶向细胞杀死靶向细胞的优先性的选择性细胞毒性的度量或指示。
给定的细胞外靶标生物分子(或给定靶标生物分子的细胞外表位)的细胞表面再呈递(representation)和/或密度可以影响其中最适当使用本发明的某些细胞靶向分子的应用。细胞之间给定的靶标生物分子的细胞表面再呈递和/或密度的差异可以定量和定性地改变给定的本发明的细胞靶向分子的细胞内在化效率和/或细胞毒性效力。给定的靶标生物分子的细胞表面再呈递和/或密度可以在靶标生物分子阳性细胞之间或者甚至在相同细胞不同的细胞周期或细胞发育时间点极大地不同。给定靶标生物分子和/或给定靶标生物分子的某些细胞外表位在特定的细胞或细胞群体上的总细胞表面再呈递可以使用技术人员已知的方法进行确定，诸如涉及荧光激活细胞分选(FACS)流式细胞术的方法。
用于本文时，关于多肽区域或多肽内的特征，术语“破坏的”、“破坏作用”或“破坏”以及其语法变体是指在所述区域内或构成所述破坏的特征的至少一个氨基酸的改变。氨基酸改变包括多种突变，诸如，例如，改变多肽的氨基酸序列的缺失、倒置、插入或置换。氨基酸改变还包括化学变化，诸如，例如，改变氨基酸官能团中的一个或多个原子或向氨基酸官能团中添加一个或多个原子。
用于本文时，“去免疫化的”意指，与参比分子(诸如例如，野生型多肽区，多肽区或多肽)相比，在施用给脊索动物后减少的抗原性和/或免疫原性潜力。这包括降低的整体抗原性和/或免疫原性潜力，而不管相较于参比分子一个或多个从头的抗原性和/或免疫原性表位的引入。对于某些实施方案，“去免疫化的”意指与自其衍生的“母本”分子(诸如，例如，野生型志贺毒素A1片段)相比，在施用给哺乳动物后表现出减小的抗原性和/或免疫原性的分子。在某些实施方案中，与参比分子相比，本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽能够表现出的相对抗原性比在相同条件下通过相同测定测量的参比分析的抗原性减小10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或更多，所述测定诸如例如技术人员已知的和/或本文中所述的测定，如定量ELISA或蛋白质印迹分析。在某些实施方案中，与参比分子相比，本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽能够表现出的相对免疫原性比在相同条件下通过相同测定测量的参比分子的免疫原性减小10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，99％或更多，所述测定诸如，例如，技术人员已知的和/或本文中所述的测定，如在给定时间点接受所述分子的肠胃外施用后在哺乳动物中产生的抗-分子抗体的定量测量。
在许多时间段内重复肠胃外施用后，使用用于针对细胞靶向分子的体内抗体反应的测定来确定示例性的细胞靶向分子的相对免疫原性。
就本发明的目的而言，短语“CD8+ T-细胞超免疫”是指，当存在于活脊索动物内的有核脊索动物细胞中时，与缺少任何异源的CD8+ T-细胞表位-肽的相同分子相比，所述细胞靶向分子具有关于CD8+ T-细胞抗原性或免疫原性而言增加的抗原性和/或免疫原性潜力。
关于多肽的T-细胞表位或T-细胞表位-肽组分的术语“嵌入”及其语法变体表示用不同的氨基酸对多肽区域内的一个或多个氨基酸的内部替换，以便产生与起始多肽区域共享相同的氨基酸残基总数的新多肽序列。因而，术语“嵌入”不包括任何另外氨基酸、肽或多肽组分向起始多肽的任何外部末端融合，也不包括任何另外氨基酸残基的任何另外内部插入，而是仅包括现有氨基酸的置换。内部替换可以仅仅通过氨基酸残基置换或通过一系列置换、缺失、插入和/或倒位完成。如果使用一个或多个氨基酸的插入，那么必须在所述插入以后删除相等数目的近侧氨基酸，以产生嵌入的T-细胞表位。这不同于关于本发明的多肽内所含的T-细胞表位使用的术语“插入”，其表示在多肽内部插入一个或多个氨基酸，从而产生与起始多肽相比具有增加的氨基酸残基数目的新多肽。
关于多肽内所含的T-细胞表位的术语“插入”及其语法变体表示在多肽内插入一个或多个氨基酸，从而产生与起始多肽相比具有增加的氨基酸残基数目的新多肽序列。
就本发明的目的而言，关于本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应物多肽区域的位置的短语“在氨基端的近侧”表示这样的距离：其中志贺毒素效应物多肽区域的至少一个氨基酸残基是在细胞靶向分子的氨基端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个(例如，多至18-20个)氨基酸残基内，只要所述细胞靶向分子能够表现出适当水平的在本文中指出的志贺毒素效应物功能活性(例如，某种水平的细胞毒性效能)。因而，对于本发明的某些实施方案，在氨基端与志贺毒素效应物多肽融合的任何氨基酸残基应当不会降低任何志贺毒素效应物功能(例如，通过在空间上阻碍志贺毒素效应物多肽区域的氨基端附近的结构)，使得志贺毒素效应物多肽的功能活性降低到本文所需的适当活性水平以下。
就本发明的目的而言，关于志贺毒素效应物多肽区域相对于另一种组分(例如，细胞靶向、结合区、分子部分和/或另外的外源物质)在本发明的细胞靶向分子内的位置的短语“在氨基端的更近侧”表示这样的位置：其中志贺毒素效应物多肽的氨基端的至少一个氨基酸残基与其他提及的组分相比更靠近本发明的细胞靶向分子的直链多肽组分的氨基端。
就本发明的目的而言，短语“从志贺毒素家族的成员的一个A亚基来源的活性酶结构域”表示，具有通过催化性核糖体灭活机制抑制蛋白合成的能力。使用技术人员已知的测定，诸如，例如，涉及在没有活细胞存在下的RNA翻译的体外测定，或涉及在活细胞中的RNA翻译的体内测定，可以通过抑制蛋白翻译的能力来定义天然存在的志贺毒素的酶活性。使用技术人员已知的和/或本文描述的测定，可以如下评估志贺毒素酶活性的效能：通过观察对核糖体RNA(rRNA)的N-糖苷酶活性(诸如，例如，核糖体切割测定)直接地评估，和/或通过观察核糖体功能和/或蛋白合成的抑制间接地评估。
就本发明的目的而言，术语“志贺毒素A1片段区域”表示基本上由志贺毒素A1片段组成和/或从志贺毒素的志贺毒素A1片段来源的多肽区域。
就本发明的目的而言，关于细胞靶向分子的术语“末端”、“氨基端”或“羧基端”通常表示细胞靶向分子的多肽链(例如，单个连续多肽链)的最后一个氨基酸残基。细胞靶向分子可以包含超过一种多肽或蛋白，且因而，本发明的细胞靶向分子可以包含多个氨基端和羧基端。例如，细胞靶向分子的“氨基端”可以由代表多肽的氨基端端部的多肽链的第一个氨基酸残基限定，所述氨基端端部通常特征在于不具有与任何氨基酸残基的肽键的起始氨基酸残基，所述肽键涉及起始氨基酸残基的伯氨基或涉及是N-烷基化的α氨基酸残基类别的成员的起始氨基酸残基的等同氮。类似地，细胞靶向分子的“羧基端”可以由代表多肽的羧基端端部的多肽链的最后一个氨基酸残基限定，所述羧基端端部通常特征在于这样的最后氨基酸残基：其不具有通过肽键与它的伯羧基的α-碳连接的任何氨基酸残基。
就本发明的目的而言，关于多肽区域的术语“末端”、“氨基端”或“羧基端”表示该区域的区域边界，不论在该区域的外面是否通过肽键连接另外的氨基酸残基。换而言之，多肽区域的末端，不论该区域是否与其他肽或多肽融合。例如，包含两个蛋白性区域的融合蛋白，例如，包含肽或多肽和志贺毒素效应物多肽的结合区域，可能具有这样的志贺毒素效应物多肽区域：其在羧基端以志贺毒素效应物多肽区域的氨基酸残基251封端，尽管涉及残基251至在位置252处的氨基酸残基的肽键代表另一个蛋白性区域(例如，结合区域)的开始。在该实施例中，所述志贺毒素效应物多肽区域的羧基端表示残基251，其不是融合蛋白的末端，但是代表内部区域边界。因而，对于多肽区域，术语“末端”、“氨基端”和“羧基端”用于表示多肽区域的边界，不论所述边界是物理末端还是嵌入较大多肽链内的内部位置。
就本发明的目的而言，短语“志贺毒素A1片段来源的区域”是指志贺毒素效应物多肽的全部或一部分，其中所述区域由与天然存在的志贺毒素A1片段或其截短物同源的多肽组成，诸如，例如，由下述组成或包含下述的多肽：SLT-1A(SEQ ID NO：1)的氨基酸75-239，StxA(SEQ ID NO：2)的氨基酸75-239，或(SEQ ID NO：3)的氨基酸77-238，或在志贺毒素家族成员的另一个A亚基中的等价区域。相对于天然存在的志贺毒素A1片段，“志贺毒素A1片段来源的区域”的羧基端定义为：(1)以与天然存在的志贺毒素A1片段具有同源性的羧基端氨基酸残基结束；(2)在A1片段与A2片段的连接部处结束；(3)以弗林蛋白酶切割位点或破坏的弗林蛋白酶切割位点结尾；和/或(4)以志贺毒素A1片段的羧基端剪截结尾，即，羧基端氨基酸残基与天然存在的志贺毒素A1片段具有同源性。
就本发明的目的而言，短语“志贺毒素A1片段的羧基端区域”表示从天然存在的志贺毒素A1片段来源的多肽区域，所述区域以疏水残基(例如，StxA-A1和SLT-1A1的V236，和SLT-2A1的V235)开始，其后面是疏水残基，且所述区域以在志贺毒素A1片段多肽中保守的弗林蛋白酶切割位点结束，并且在天然志贺毒素A亚基中在A1片段和A2片段之间的连接部处结束。就本发明的目的而言，志贺毒素A1片段的羧基端区域包括从志贺毒素A1片段多肽的羧基端来源的肽区域，诸如，例如，包含志贺毒素A1片段的羧基端或基本上由其组成的肽区域。从志贺毒素A1片段的羧基端来源的肽区域的非限制性例子包括天然地定位在以下位置的氨基酸残基序列：Stx1A(SEQ ID NO：2)或SLT-1A(SEQ ID NO：1)中的位置236至位置239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250或251；和SLT-2A(SEQ ID NO：3)中的位置235至位置239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250。
就本发明的目的而言，关于连接的分子部分和/或结合区域的短语“在A1片段多肽的羧基端的近侧”表示从限定志贺毒素A1片段多肽的最后一个残基的氨基酸残基开始在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基内。
就本发明的目的而言，短语“在空间上覆盖A1片段-来源的区域的羧基端”包括与A1片段-来源的区域的羧基端中的氨基酸残基(诸如，例如，从天然地定位在Stx1A(SEQ IDNO：2)或SLT-1A(SEQ ID NO：1)中的位置236-251或SLT-2A(SEQ ID NO：3)中的位置235-250中的任一个处的氨基酸残基来源的氨基酸残基)连接和/或融合的4.5kDa或更大的尺寸的任何分子部分(例如，免疫球蛋白型结合区域)。就本发明的目的而言，短语“在空间上覆盖A1片段-来源的区域的羧基端”也包括与A1片段-来源的区域的羧基端中的氨基酸残基(诸如，例如，在最后的氨基酸A1片段-来源的区域和/或志贺毒素效应物多肽的羧基端的氨基酸残基)连接和/或融合的4.5kDa或更大的尺寸的任何分子部分(例如，免疫球蛋白型结合区域)。就本发明的目的而言，短语“在空间上覆盖A1片段-来源的区域的羧基端”也包括在物理上阻止A1片段-来源的区域的羧基端的细胞识别(诸如，例如通过真核细胞的ERAD机制做出的识别)的4.5kDa或更大的尺寸的任何分子部分(例如，免疫球蛋白型结合区域)。
就本发明的目的而言，包含含有至少40个氨基酸的多肽且与包含A1片段-来源的区域的志贺毒素效应物多肽区域的羧基端连接(例如，融合)的结合区域(例如，免疫球蛋白型结合区域)是“在空间上覆盖A1片段-来源的区域的羧基端”的分子部分。
就本发明的目的而言，包含含有至少40个氨基酸的多肽且与包含A1片段-来源的区域的志贺毒素效应物多肽区域的羧基端连接(例如，融合)的结合区域(例如，免疫球蛋白型结合区域)是“妨碍A1片段-来源的区域的羧基端”的分子部分。
就本发明的目的而言，术语“志贺毒素家族的成员的A1片段”表示，在弗林蛋白酶切割位点(其在志贺毒素A亚基中是保守的且位于野生型志贺毒素A亚基中的A1片段和A2片段之间)处被弗林蛋白酶蛋白酶解以后，志贺毒素A亚基的剩余氨基端片段。
就所要求的发明的目的而言，短语“在A1片段区域的羧基端处的弗林蛋白酶切割基序”表示在志贺毒素A亚基中保守的且桥连天然存在的志贺毒素A亚基中的A1片段和A2片段之间的连接部的特定弗林蛋白酶切割基序。
就本发明的目的而言，短语“在A1片段区域的羧基端近侧的弗林蛋白酶切割位点”表示这样的任何可辨别的弗林蛋白酶切割位点：其具有在限定A1片段区域或A1片段来源的区域中的最后氨基酸残基的氨基酸残基的小于1、2、3、4、5、6、7个或更多个氨基酸残基的距离内的氨基酸残基，包括位于A1片段区域或A1片段来源的区域的羧基端的弗林蛋白酶切割基序，诸如，例如，在A1片段-来源的区域与分子的另一种组分(诸如，例如，本发明的细胞靶向分子的分子部分)的连接处近侧的位置。
就本发明的目的而言，短语“被破坏的弗林蛋白酶切割基序”表示：(i)如本文中描述的特定弗林蛋白酶切割基序，和(ii)其包含相对于参比分子可以给分子赋予弗林蛋白酶切割的减少的突变和/或截短，诸如，例如，可再现地观察到比在相同条件下在相同测定中观察到的参比分子的弗林蛋白酶切割少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或更少(包括100％，对于无切割)的弗林蛋白酶切割的减少。相对于参比分子的弗林蛋白酶切割的百分比可以表达为切割的：未切割的目标分子物质除以切割的：未切割的参比分子物质的比率(参见实施例，出处同上)。合适的参比分子的非限制性例子包括包含野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割基序和/或弗林蛋白酶切割位点的某些分子(如本文中在部分I-B、部分IV-B和/或实施例中所述的)和/或在下面实施例中用作参比分子的分子。
就本发明的目的而言，短语“弗林蛋白酶切割抗性的”是指，分子或其特定多肽区域表现出与以下对象相比可再现地更少的弗林蛋白酶切割：(i)野生型志贺毒素A亚基中的志贺毒素A1片段的羧基端，或(ii)构建体的志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端，其中天然地定位在A1和A2片段之间的连接部处的天然存在的弗林蛋白酶切割位点没有被破坏；如通过技术人员可利用的任何方式(包括通过使用本文描述的方法)所测定的。
就本发明的目的而言，短语“从志贺毒素家族的成员的A亚基来源的活性酶结构域”表示，基于志贺毒素酶活性通过核糖体的催化灭活而具有抑制蛋白合成的能力的多肽结构。使用技术人员已知的各种测定，诸如，例如，涉及在没有活细胞存在下的RNA翻译测定的体外测定，或涉及活细胞的核糖体的体内测定，可以观察分子结构的表现出蛋白合成的抑制活性和/或核糖体的催化灭活的能力。例如，使用技术人员已知的测定，可以如下评估基于志贺毒素酶活性的分子的酶活性：通过观察对核糖体RNA(rRNA)的N-糖苷酶活性(例如，核糖体切割测定)直接地评估，和/或通过观察核糖体功能、RNA翻译和/或蛋白合成的抑制间接地评估。
如本文中关于志贺毒素效应物多肽使用的，“组合”描述了包含两个或更多个亚区域的志贺毒素效应物多肽，其中每个亚区域包含以下至少一个：(1)在内源性表位或表位区域中的破坏，和(2)在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序。
以下使用示例性的非限制性的实施方案并且参考附图更充分地描述本发明。然而，本发明可以以多种不同的形式实施，并且不应该解释为限于下文所述的实施方案。相反，提供这些实施方案，从而本公开是透彻的，并且将本发明的范围传达给本领域技术人员。
引论
本发明提供了多种示例性的志贺毒素A亚基来源的构建体，它们能够将异源的CD8+ T-细胞表位递送到靶细胞的MHC I类系统，导致所递送的表位的细胞表面呈递。志贺毒素A亚基来源的多肽可以通过将其与特异性的细胞靶向结合区连接而被改造，以具有细胞靶向特异性。本发明研究了志贺毒素A亚基来源的多肽驱动其自身的亚细胞按路线发送从而将高免疫原性的CD8+ T-细胞抗原(诸如，例如，肽-表位)递送到脊索动物细胞的MHC I类呈递系统的能力。志贺毒素A亚基效应物多肽可以诱导细胞内在化，指导亚细胞按路线发送至细胞溶胶并且将异源的CD8+ T-细胞表位货物递送至MHC I类途径用于呈递在细胞表面上。以与MHC I类分子复合呈递在细胞表面上的某些肽-表位可以向CD8+效应物T-细胞传导信号，从而杀死呈递细胞，以及刺激局部区域内的其他免疫应答。由此，本发明提供杀死特定靶细胞的志贺毒素A亚基来源的细胞靶向分子，诸如，例如，通过经由MHC I类途径呈递特定的CD8+ T-细胞表位-肽而杀死特定靶细胞。例如，本发明的细胞靶向分子可以用作细胞杀伤分子。细胞毒性治疗剂、治疗性递送剂和诊断分子。
I.本发明的细胞靶向分子的一般结构
本发明的细胞靶向分子分别包含：1)细胞靶向结合区，2)志贺毒素A亚基效应物多肽，和3)CD8+ T-细胞表位-肽，其与志贺毒素A亚基和所述分子的结合区是异源的。该系统是模块式的，由于任意数量的多样性CD8+ T-细胞表位-肽可以用作本发明的细胞靶向分子的货物而递送到靶细胞的MHC I类呈递途径。
A.志贺毒素A亚基效应物多肽
本发明的志贺毒素效应物多肽是来源于志贺毒素家族的至少一个成员的志贺毒素A亚基的多肽，其中所述志贺毒素效应物多肽能够表现出至少一种志贺毒素功能。志贺毒素功能包括，例如，促进细胞进入，使脂质膜变形，刺激网格蛋白介导的胞吞，指导逆向转运，指导亚细胞按路线发送，避免细胞内降解，催化性使核糖体失活，实现细胞毒性，和实现细胞抑制作用。
存在多种技术人员已知的志贺毒素效应物多肽(例如，参见Cheung M等人，MolCancer 9：28(2010)；WO 2014/164693；WO 2015/113005；WO 2015/113007；WO 2015/138452；WO 2015/191764)，其适合用于本发明或用作母本多肽使用本领域已知的技术修饰成本发明的志贺毒素效应物多肽。
本发明的志贺毒素效应物多肽包含来源于志贺毒素A亚基的多肽或基本上由其组成，所述志贺毒素A亚基是与其任何形式的天然志贺毒素B亚基解离的。本发明的志贺毒素效应物多肽不包含志贺毒素B亚基的细胞靶向结构域。原型志贺毒素通过志贺毒素B亚基天然靶向人细胞表面受体球形三脂酰基鞘鞍醇(Gb3，Gb3Cer，或CD77)和球形四脂酰基鞘鞍醇(globotetraosylceramide)(Gb4或Gb4Cer)，其通过限制靶向细胞类型和潜在的不需要的血管内皮细胞、某些肾上皮细胞和/或呼吸上皮细胞的靶向而严重限制潜在的应用(Tesh V等人，Infet Immun 61：3392-402(1993)；Ling H等人，Biochemistry 37：1777-88(1998)；Bast D等人，Mol Microbiol 32：953-60(1999)；Rutjes N等人，Kidney Int 62：832-45(2002)；Shimizu T等人，Microb Pathog 43：88-95(2007)；Pina D等人，Biochim BiophysActa 1768：628-36(2007)；Shin I等人，BMB Rep 42：310-4(2009)；Zumbrun S等人，InfectImmun 4488-99(2010)；Engedal N等人，Microb Biotechnol 4：32-46(2011)；Gallegos K等人，PLoS ONE 7：e30368(2012)；A等人，PLoS Pathog 11：e1004619(2015))。Gb3和Gb4是在多种健康细胞型(诸如多形核白细胞和来自多种血管床的人内皮细胞)的细胞膜的细胞外小叶上存在的常见的中性鞘脂。本发明的细胞靶向分子不包含任何含有天然志贺毒素B亚基的功能性结合结构域或基本上由其组成的多肽。相反，本发明的志贺毒素效应物多肽可以与异源结合区功能性上关联，从而实现细胞靶向。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽可以包含下述或基本上由下述组成：全长志贺毒素A亚基(例如，SLT-1A(SEQ ID NO：1)，StxA(SEQ ID NO：2)，或SLT-2A(SEQ ID NO：3))，注意天然存在的志贺毒素A亚基可以包含含有在其氨基端的约22个氨基酸的信号序列的前体，该信号序列被去除从而产生成熟的志贺毒素A亚基并且可被技术人员认识到。在其他实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成，所述阶段的志贺毒素A亚基比全长志贺毒素A亚基短，诸如，例如，本领域已知的截短物(参见，例如，WO 2014/164693；WO 2015/113005；WO 2015/113007；WO 2015/138452；WO 2015/191764)。
尽管技术人员已知的任意志贺毒素效应物多肽均可以适合用作本发明的细胞靶向分子的组分，但是，下述是未知的：WO 2015/113005中所述的任何志贺毒素效应物多肽是否能够对异源的CD8+ T-细胞表位-肽(其没有插入或嵌入志贺毒素效应物多肽中)提供充分的向靶细胞的MHC I类呈递途径的亚细胞递送，从而诱导所递送的与MHC I类分子复合的异源CD8+ T-细胞表位-肽的可检测的细胞表面呈递。此外，下述是未知的和不可预测的：WO2015/113005中所述的任何志贺毒素效应物多肽是否可与WO 2015/191764中作为本发明描述的志贺毒素效应物多肽的任何结构特征组合，从而所产生的组合分子是稳定的，并且能够对异源的CD8+ T-细胞表位-肽向靶细胞提供充分的向MHC I类呈递途径的亚细胞递送，从而诱导所递送的与MHC I类分子复合的异源CD8+ T-细胞表位-肽的可检测的细胞表面呈递。
B.用于递送的异源的CD8+ T-细胞表位-肽货物
本发明的细胞靶向分子分别包含一个或多个CD8+ T-细胞表位-肽(其与它们各自的志贺毒素效应物多肽和结合区是异源的)。CD8+ T-细胞表位是可被至少一个个体的免疫系统识别的分子结构，即抗原肽。本发明的细胞靶向分子的异源的CD8+ T-细胞表位-肽可以选自基本上任意的CD8+ T-细胞表位。
就所要求的发明的目的而言，CD8+ T-细胞表位(也称为MHC I类表位或MHC I类肽)是抗原肽所包含的并且可以由直链氨基酸序列表示的分子结构。通常，CD8+ T-细胞表位是尺寸为八个至十一个氨基酸残基的肽(Townsend A，Bodmer H，Annu Rev Immunol 7：601-24(1989))；然而，某些CD8+ T-细胞表位具有小于八个或大于十一个氨基酸长的长度(参见，例如，Livingstone A，Fathman C，Annu Rev Immunol 5：477-501(1987)；Green K等人，Eur J Immunol 34：2510-9(2004))。
就所要求的发明的目的而言，术语“异源的”意指与下述不同的来源：(1)天然存在的志贺毒素的A亚基，和(2)包含该异源组分的细胞靶向分子的结合区。本发明的细胞靶向分子的异源的CD8+ T-细胞表位-肽是没有已经存在于下述中的CD8+ T-细胞表位-肽：野生型志贺毒素A1片段；天然存在的志贺毒素A1片段；和/或用作所述细胞靶向分子的组分的现有技术的志贺毒素效应物多肽。
在本发明的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽长度为至少七个氨基酸残基。在本发明的某些实施方案中，所述CD8+ T-细胞表位-肽被TCR以小于10毫摩尔(mM)(例如，1-100μM)的KD为特征的结合亲和力结合，如使用Stone J等人，Immunology126：165-76(2009)的式子计算的。然而，应该注意到，MHC-表位与TCR之间在给定范围内的结合亲和力可能不与抗原性和/或免疫原性相关(参见，例如，A1-Ramadi B等人，J Immunol155：662-73(1995))，诸如，是由于如MHC I-肽-TCR复合物稳定性、MHC I-肽密度和TCR辅因子(如CD8)的不依赖于MHC的功能的因素(Baker B等人，Immunity 13：475-84(2000)；Hornell T等人，J Immunol 170：4506-14(2003)；Woolridge L等人，J Immunol 171：6650-60(2003))。
T-细胞表位可以选自或来源于多种用于本发明的源分子(source molecules)。T-细胞表位可以由多种天然存在的蛋白产生或来源于多种天然存在的蛋白。T-细胞表位可以由对哺乳动物是外源的多种天然存在的蛋白产生或来源于对哺乳动物是外源的多种天然存在的蛋白，诸如，例如，微生物的蛋白。T-细胞表位可以由突变的人蛋白和/或由恶性人细胞异常表达的人蛋白产生或来源于突变的人蛋白和/或由恶性人细胞异常表达的人蛋白。T-细胞表位可以是合成产生的或者来源于合成分子(参见，例如，Carbone F等人，J ExpMed 167：1767-9(1988)；Del Val M等人，J Virol 65：3641-6(1991)；Appella E等人，Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1：177-84(1995)；Perez S等人，Cancer 116：2071-80(2010))。
本发明的细胞靶向分子的CD8+ T-细胞表位-肽可以选自多种已知的抗原，诸如，例如，充分表征的来自人病原体(通常是最常见的致病性病毒和细菌)的免疫原性表位。
CD8+ T-细胞表位可以通过技术人员已知的逆向免疫学方法鉴定，诸如，例如，遗传方法，文库筛选，和从展示MHC I类分子的细胞上洗脱肽并且通过质谱对其进行测序，(参见，例如，Van Der Bruggen P等人，Immunol Rev 188：51-64(2002))。
另外，已经开发了其他的MHC I-肽结合测定(例如，来自ProImmune，Inc.，Sarasota，FL，U.S.的MHC I-肽结合测定)，所述测定基于对肽针对给定的MHC I类等位基因稳定三元MHC-肽复合物的能力的测量，作为与已知的对照的比较。此类方法可以帮助预测推定的CD8+ T-细胞表位-肽的有效性或确证关于已知的CD8+ T-细胞表位的经验证据。
尽管考虑任意的CD8+ T-细胞表位用作本发明的异源的CD8+ T-细胞表位，但是某些CD8+ T-细胞表位可以基于需要的特性进行选择。一个目标是产生CD8+ T-细胞超免疫的细胞靶向分子，这意味着，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽是高度免疫原性的，原因在于，当与细胞表面上的MHC I类分子复合被展示时，其可以在体内引发稳健的免疫应答。
CD8+ T-细胞表位可以来源于已经知晓能够引发脊椎动物免疫应答的多种源分子。CD8+ T-细胞表位可以来源于对脊椎动物是异源的多种天然存在的蛋白，诸如，例如，致病微生物的蛋白和非自身的癌症抗原。具体地，传染性的微生物可以包含多种具有已知的抗原性和/或免疫原性特性的蛋白。此外，传染性微生物可以包含多种具有已知的抗原性和/或免疫原性亚区域或表位的蛋白。CD8+ T-细胞表位可以来源于突变的人蛋白和/或由恶性人细胞异常表达的人蛋白，诸如，例如，由癌细胞表达的突变的蛋白(参见，例如，Sjoblom T等人，Science 314：268-74(2006)；Wood L等人，Science 318：1108-13(2007)；Jones S等人，Science 321：1801-6(2008)；Parsons D等人，Science 321：1807-12(2008)；Wei X等人，Nat Genet 43：442-6(2011)；Govindan R等人，Cell 150：1121-34(2012)；Vogelstein B等人，Science 339：1546-58(2013))。
CD8+ T-细胞表位可以选自多种已经知晓能够引起哺乳动物免疫应答的源分子或来源于多种已经知晓能够引起哺乳动物免疫应答的源分子，包括肽，蛋白的肽组分，以及来源于蛋白的肽。例如，具有哺乳动物宿主的细胞内病原体的蛋白是CD8+ T-细胞表位的来源。存在多种细胞内病原体，诸如病毒、细菌、真菌和单细胞真核生物，具有充分研究的抗原蛋白或肽。可以从人病毒或其他细胞内病原体(诸如，例如，细菌如分枝杆菌(mycobacterium)，真菌如弓形虫属(toxoplasmae)和原生生物如锥虫(trypanosomes.))选择或鉴定CD8+ T-细胞表位。
例如，存在许多已知的来自感染人类的病毒的病毒蛋白的免疫原性病毒肽组分。已经将众多人CD8+ T-细胞表位绘制至来自甲型流感病毒(influenza A viruses)的蛋白内的肽上，诸如在蛋白HA糖蛋白FE17、S139/1、CH65、C05、血凝素1(HA1)、血凝素2(HA2)、非结构蛋白1和2(NS1和NS 2)、基质蛋白1和2(M1和M2)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA))中的肽，且这些肽中的许多已经被证实会引起人免疫应答，诸如通过使用离体测定(参见，例如，Assarsson E等人，J Virol 82：12241-51(2008)；Alexander J等人，Hum Immunol 71：468-74(2010)；Wang M等人，PLoS One 5：e10533(2010)；Wu J等人，Clin Infect Dis 51：1184-91(2010)；Tan P等人，Human Vaccin 7：402-9(2011)；Grant E等人，Immunol Cell Biol91：184-94(2013)；Terajima M等人，Virol J 10：244(2013))。类似地，已经将众多人CD8+T-细胞表位绘制至来自人巨细胞病毒(HCMV)的蛋白的肽组分上，诸如在蛋白pp65(UL83)、UL128-131、立即早期1(IE-1；UL123)、糖蛋白B、壳皮蛋白中的肽，且这些肽中的许多已经被证实会引起人免疫应答，诸如通过使用离体测定(Schoppel K等人，J Infect Dis 175：533-44(1997)；Elkington R et al，J Virol 77：5226-40(2003)；Gibson L等人，JImmunol 172：2256-64(2004)；Ryckman B等人，J Virol 82：60-70(2008)；Sacre K等人，JVirol 82：10143-52(2008))。
另一个实施例是，在人类中存在许多免疫原性的癌抗原。技术人员使用本领域已知的技术，例如，差别基因组学、差别蛋白组学、免疫蛋白组学、预测然后验证和基因方案如反向基因转染(参见例如，Admon A等人，Mol Cell Proteomics 2：388-98(2003)；PurcellA，Gorman J，Mol Cell Proteomics 3：193-208(2004)；Comber J，Philip R，Ther AdvVaccines 2：77-89(2014))，可以鉴别癌抗原和/或肿瘤细胞抗原的CD8+ T-细胞表位。存在许多已经被鉴别或预测存在于人癌症和/或肿瘤细胞中的抗原性的和/或免疫原性的T-细胞表位。例如，已经在赘生性细胞中通常突变或过表达的人蛋白中预测T-细胞表位，诸如，例如，ALK、CEA、N-乙酰基葡糖胺基-转移酶V(GnT-V)、HCA587、HER-2/neu、MAGE、Melan-A/MART-1、MUC-1、p53和TRAG-3(参见例如，van der Bruggen P等人，Science 254：1643-7(1991)；Kawakami Y等人，J Exp Med 180：347-52(1994)；Fisk B等人，JExp Med 181：2109-17(1995)；Guilloux Y等人，J Exp Med 183：1173(1996)；Skipper J等人，J Exp Med183：527(1996)；Brossart P等人，93：4309-17(1999)；Kawashima I等人，Cancer Res 59：431-5(1999)；Papadopoulos K等人，Clin Cancer Res 5：2089-93(1999)；Zhu B等人，ClinCancer Res 9：1850-7(2003)；Li B等人，Clin Exp Immunol 140：310-9(2005)；Ait-TaharK等人，Int J Cancer 118：688-95(2006)；Akiyama Y等人，Cancer Immunol Immunother61：2311-9(2012))。另外，已经制备了来自人癌细胞的T-细胞表位的合成变体(参见例如，Lazoura E，Apostolopoulos V，Curr Med Chem 12：629-39(2005)；Douat-Casassus C等人，J Med Chem 50：1598-609(2007))。
尽管任何异源的CD8+ T-细胞表位可以用在本发明的组合物和方法中，但是，某些CD8+ T-细胞表位基于它们的已知的和/或经验地确定的特征可以是优选的。已经描述了引发人CD8+ T-细胞反应的免疫原性肽-表位和/或可以使用技术人员已知的技术进行鉴定(参见，例如，Kalish R，J Invest Dermatol 94：108S-111S(1990)；Altman J等人，Science274：94-6(1996)；Callan M等人，J Exp Med 187：1395-402(1998)；Dunbar P等人，CurrBiol 8：413-6(1998)；Sourdive D等人，J Exp Med 188：71-82(1998)；Collins E等人，JImmunol 162：331-7(1999)；Yee C等人，J Immunol 162：2227-34(1999)；Burrows S等人，JImmunol 165：6229-34(2000)；Cheuk E等人，J Immunol 169：5571-80(2002)；Elkington Ret al，J Virol 77：5226-40(2003)；Oh S等人，Cancer Res 64：2610-8(2004)；Hopkins L等人，Hum Immunol 66：874-83(2005)；Assarsson E等人，J Virol 12241-51(2008)；Semeniuk C等人，AIDS 23：771-7(2009)；Wang X等人，J Vis Exp 61：3657(2012)；Song H等人，Virology 447：181-6(2013)；Chen L等人，J Virol 88：11760-73(2014))。
在许多物种中，MHC基因编码多种MHC-I分子变体。因为MHC I类蛋白多态性可以影响CD8+ T-细胞对抗原-MHC I类复合物识别，因此，基于关于某些MHC I类多态性的知识和/或某些抗原-MHC I类复合物被具有不同基因型的T-细胞识别的能力，可以选择异源的T-细胞表位。
存在确定地定义的肽-表位，已知其是免疫原性的、MHC I类限制的和/或与特定人白细胞抗原(HLA)变体匹配的。就在人类中或涉及人靶细胞的应用而言，技术人员使用本领域已知的标准技术可以选择或鉴别HLA-I类-限制的表位。肽的结合人MHC I类分子的能力可以用于预测推定的CD8+ T-细胞表位的免疫原性潜力。使用软件工具可以对肽结合人MHCI类分子的能力评分。基于在某些人群体中更流行的等位基因编码的HLA变体的肽选择性，可以选择CD8+ T-细胞表位用于用作本发明的CD8+异源T-细胞表位组分。例如，人群体就MHC I类分子的α链而言是多态的，并且HLA基因编码可变的等位基因。某些T-细胞表位可能被特定HLA分子更有效地呈递，诸如，例如，由HLA-A等位基因组HLA-A2和HLA-A3编码的常见的HLA变体。
当选择CD8+ T-细胞表位用于用作本发明的细胞靶向分子的异源CD8+ T-细胞表位-肽组分时，可以选择这样的CD8+表位，其最佳匹配在被靶向的细胞型或细胞群体中存在的MHC I类分子。不同的MHC I类分子表现出与特定肽序列的优先结合，并且特定的肽-MHCI类变体复合物由效应物T-细胞的TCR特异性识别。技术人员可以利用关于MHC I类分子特异性和TCR特异性的知识来优化用于本发明的异源T-细胞表位的选择。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽包含在异源多肽内，诸如，例如，抗原或抗原蛋白内。在某些其他实施方案中，所述异源多肽不大于27kDa、28kDa、29kDa或30kDa。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含两个以上异源的CD8+ T-细胞表位-肽。在某些其他实施方案中，全部所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽的组合尺寸不大于27kDa、28kDa、29kDa或30kDa。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，与标准的蛋白酶体相比，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽在细胞内用更多的免疫蛋白酶体、中间体蛋白酶体和/或胸腺蛋白酶体(thymoproteasomes)被更好地加工；然而，在其他实施方案中，情况是相反的。
当选择CD8+ T-细胞表位-肽用作本发明的细胞靶向分子的异源的CD8+ T-细胞表位-肽组分时，可以考虑MHC I类呈递系统中的多种因子，其可以影响CD8+ T-细胞表位产生和运输至接受的MHC I类分子，诸如，例如，下述因子在靶细胞中的表位特异性：蛋白酶体、ERAAP/ERAP1、tapasin和TAP(参见，例如，Akram A，Inman R，Clin Immunol 143：99-115(2012))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽仅以完整形式被中间体蛋白酶进行蛋白水解加工(参见，例如，Guillaume B等人，Proc NatlAcad Sci USA 107：18599-604(2010)；Guillaume B等人，J Immunol 189：3538-47(2012))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽不被标准的蛋白酶体、免疫蛋白酶体、中间体蛋白酶体和/或胸腺蛋白酶体破坏，这也可能取决于细胞类型、细胞因子环境、组织位置等(参见例如，Morel S等人，Immunity 12：107-17(2000)；Chapiro J等人，J Immunol 176：1053-61(2006)；Guillaume B等人，Proc NatlAcad Sci U.S.A.107：18599-604(2010)；Dalet A等人，Eur J Immunol 41：39-46(2011)；Basler M等人，J Immunol 189：1868-77(2012)；Guillaume B等人，J Immunol 189：3538-47(2012))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽被认为是“弱”表位，诸如，例如，在体内在给定的受试者或基因型组或来源于上述的细胞中引发CD8+ CTL方面是“弱的”(参见，例如，Cao W等人，J Immunol 157：505-11(1996))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽是肿瘤细胞表位，诸如，例如，NY-ESO-1 157-165A(参见，例如，Jager E等人J Exp Med 187：265-70(1998))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽已被修饰在其氨基端具有大体积或带电荷的残基，从而增加泛素化作用(参见例如，Grant E等人，J Immunol 155：3750-8(1995)；Townsend A等人，J Exp Med 168：1211-24(1998)；Kwon Y等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A.95：7898-903(1998))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽已被修饰在其羧基端具有疏水氨基酸残基，从而增加蛋白水解切割的可能性(参见例如，Driscoll J等人，Nature 365：262-4(1993)；Gaczynska M等人，Nature 365：264-7(1993))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽是Tregitope。Tregitope功能上定义能够诱导免疫抑制结果的表位-肽。天然存在的Tregitope的实例包括人免疫球蛋白G重链恒定区(Fcs)和Fabs的亚区(参见例如，Sumida T等人，Arthritis Rheum 40：2271-3(1997)；Bluestone J，Abbas A，Nat Rev Immunol 3：253-7(2003)；Hahn B等人，J Immunol 175：7728-37(2005)；Durinovic-Belló I等人，ProcNatl Acad Sci USA 103：11683-8(2006)；Sharabi A等人，Proc Natl Acad Sci USA 103：8810-5(2006)；De GrootA等人，Blood 112：3303-11(2008)；Sharabi A等人，J ClinImmunol 30：34-4(2010)；Mozes E，Sharabi A，Autoimmun Rev 10：22-6(2010))。
尽管通常不限制本发明的细胞靶向分子的所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽的位置，但是，在本发明的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端位置连接到所述细胞靶向分子上。
C.细胞靶向结合区域
本发明的细胞靶向分子包含能够特异性结合细胞外靶标生物分子的细胞靶向结合区。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的结合区域是能够以高亲和力特异性地结合靶标生物分子的细胞外部分(例如，细胞外靶标生物分子)的细胞靶向组分，诸如，例如，结构域、分子部分或试剂。存在众多类型的技术人员已知的结合区域，或其可以由技术人员使用本领域已知的技术发现。例如，表现出本文描述的必要结合特征的任何细胞靶向组分可以在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中用作结合区域。
靶标生物分子的细胞外部分表示，当所述分子与细胞物理上连接时，诸如，例如，当靶标生物分子由细胞在细胞表面处表达时，它的结构暴露于细胞外环境的部分。在该背景下，暴露于细胞外环境是指，靶标生物分子的部分是可接近的，例如，被以下对象接近：抗体或至少比抗体更小的结合部分诸如单结构域抗体结构域、纳米抗体(nanobody)、从骆驼科或软骨鱼来源的重链抗体结构域、单链可变片段或任何数目的经工程改造的免疫球蛋白替代支架(参见下文)。技术人员使用本领域众所周知的方法可以经验地确定向细胞外环境的暴露或与细胞物理上连接的靶标生物分子的部分的可达性。
本发明的细胞靶向分子的结合区域可以是，例如，配体、肽、免疫球蛋白型结合区域、单克隆抗体、经工程改造的抗体衍生物或经工程改造的抗体替代物。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的结合区域是能够以高亲和力特异性地结合靶标生物分子的细胞外部分的蛋白性部分。本发明的细胞靶向分子的结合区域可以包含一个或多个不同的肽或多肽部分，诸如随机产生的肽序列、天然存在的配体或其衍生物、免疫球蛋白来源的结构域、作为免疫球蛋白结构域的替代物的合成地工程改造的支架等(参见例如，WO 2005/092917；WO 2007/033497；Cheung M等人，Mol Cancer 9：28(2010)；US 2013/0196928；WO 2014/164693；WO 2015/113005；WO 2015/113007；WO 2015/138452；WO 2015/191764)。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含结合区域，所述结合区域包含一个或多个能够选择性地和特异性地结合细胞外靶标生物分子的多肽。
存在众多本领域已知的可用于通过它们的结合特征将分子靶向特定细胞类型的结合区域，诸如某些配体、单克隆抗体、经工程改造的抗体衍生物和经工程改造的抗体替代物。
根据一个具体的、但是非限制性的方面，本发明的细胞靶向分子的结合区域包含保留对细胞外靶标生物分子(通常是细胞表面受体)的结合功能性的天然存在的配体或其衍生物。例如，本领域已知的多种细胞因子、生长因子和激素可以用于将本发明的细胞靶向分子靶向至表达相应细胞因子受体、生长因子受体或激素受体的特定细胞类型的细胞表面。配体的某些非限制性例子包括(在括号中指示替代名称)血管生成素、B-细胞活化因子(BAFF、APRIL)、集落刺激因子(CSF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素-样生长因子(IGF)、干扰素、白介素(诸如IL-2、IL-6和IL-23)、神经生长因子(NGF)、血小板来源的生长因子、转化生长因子(TGF)和肿瘤坏死因子(TNF)。
根据本发明的细胞靶向分子的某些其他实施方案，所述结合区域包含能够结合细胞外靶标生物分子的合成配体(参见例如，Liang S等人，J Mol Med 84：764-73(2006)；Ahmed S等人，Anal Chem 82：7533-41(2010)；Kaur K等人，Methods Mol Biol 1248：239-47(2015))。
在某些实施方案中，所述结合区域包含肽拟似物，诸如，例如，AA肽、γ-AA肽和/或磺基-γ-AA肽(参见例如，Pilsl L，Reiser O，Amino Acids 41：709-18(2011)；Akram O等人，Mol Cancer Res 12：967-78(2014)；Wu H等人，Chemistry 21：2501-7(2015)；Teng P等人，Chemistry 2016年3月4日))。
根据一个具体的、但是非限制性的方面，所述结合区域可以包含免疫球蛋白型结合区域。本文中使用的术语“免疫球蛋白型结合区域”表示能够结合一个或多个靶标生物分子(诸如抗原或表位)的多肽区域。结合区域可以在功能上通过它们的结合靶分子的能力来定义。免疫球蛋白型结合区域通常源自抗体或抗体-样结构；但是，在该术语的范围内考虑来自其他来源的替代支架。
免疫球蛋白(Ig)蛋白具有被称作Ig结构域的结构域。Ig结构域在约70-110个氨基酸残基的长度范围内，且具有特征性的Ig折叠，其中通常7-9个反向平行的β链排列进2个β片中，它们形成夹心-样结构。Ig折叠通过所述夹心的内表面上的疏水氨基酸相互作用和在所述链中的半胱氨酸残基之间的高度保守的二硫键稳定化。Ig结构域可以是可变的(IgV或V-组)、恒定的(IgC或C-组)或中间的(IgI或I-组)。一些Ig结构域可以与互补性决定区(CDR)结合，所述互补性决定区(CDR)也称为“互补决定区”，对于抗体与它们的表位的结合特异性而言是重要的。Ig-样结构域也存在于非-免疫球蛋白蛋白中，且在此基础上分类为蛋白的Ig超家族的成员。HUGO基因命名委员会(HUGO Gene Nomenclature Committee，HGNC)提供了含有Ig-样结构域的家族的成员的列表。
免疫球蛋白型结合区域可以是抗体或其抗原结合片段的多肽序列，其中所述氨基酸序列已经从天然抗体或非-免疫球蛋白蛋白的Ig-样结构域的氨基酸序列改变，例如通过分子工程或文库筛选选择。因为重组DNA技术和体外文库筛选在免疫球蛋白型结合区域的制备中的关联性，可以将抗体重新设计以得到期望的特征，诸如更小的大小、细胞进入或对于体内和/或治疗用途而言的其他改善。可能的变异有许多，且可以在从仅一个氨基酸的改变至例如可变区的完全重新设计的范围内。通常，将做出可变区的变化，以便改善抗原结合特征、改善可变区稳定性或减少免疫原性应答的潜力。
存在众多考虑作为本发明的组分的免疫球蛋白型结合区域。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白型结合区域源自免疫球蛋白结合区域，诸如能够结合细胞外靶标生物分子的抗体互补位。在某些其他实施方案中，所述免疫球蛋白型结合区域包含经工程改造的多肽，其并非源自任何免疫球蛋白结构域，但是其象免疫球蛋白结合区域一样通过提供与细胞外靶标生物分子的高亲和力结合来起作用。该经工程改造的多肽可以任选地包括多肽支架，所述多肽支架包含如本文中所述的来自免疫球蛋白的互补决定区或基本上由其组成。
在现有技术中也存在众多可用于通过它们的高亲和力结合特征将多肽靶向至特定细胞类型的结合区域。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区域包含免疫球蛋白结构域，所述免疫球蛋白结构域选自包括以下成员的组：自主VH结构域、单结构域抗体结构域(sdAb)、从骆驼科来源的重链抗体结构域(VHH片段或VH结构域片段)、从骆驼科VHH片段或VH结构域片段来源的重链抗体结构域、从软骨鱼来源的重链抗体结构域、免疫球蛋白新抗原受体(IgNARs)、VNAR片段、单链可变(scFv)片段、纳米抗体(nanobodies)、由重链和CH1结构域组成的Fd片段、完全变化的Fv(pFv)、单链Fv-CH3微体、二聚体CH2结构域片段(CH2D)、Fc抗原结合结构域(Fcab)、分离的互补决定区3(CDR3)片段、限制的构架区3、CDR3、构架区4(FR3-CDR3-FR4)多肽、小模块免疫药物(SMIP)结构域、scFv-Fc融合体、多聚化scFv片段(双体、三体、四体)、二硫键稳定化的抗体可变(Fv)片段、二硫键稳定化的由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗原结合(Fab)片段、二价纳米抗体、二价微体、二价F(ab’)2片段(Fab二聚体)、双特异性的串联VHH片段、双特异性的串联scFv片段、双特异性的纳米抗体、双特异性的微体、和前述物质的保留其结合功能的任何遗传上操作的相应物(A，Plückthun A，J Mol Biol 305：989-1010(2001)；Xu L等人，Chem Biol 9：933-42(2002)；Wikman M等人，Protein Eng Des Sel 17：455-62(2004)；Binz H等人，Nat Biotechnol 23：1257-68(2005)；Hey T等人，Trends Biotechnol 23：514-522(2005)；Holliger P，Hudson P，NatBiotechnol 23：1126-36(2005)；Gill D，Damle N，Curr Opin Biotech 17：653-8(2006)；Koide A，Koide S，Methods Mol Biol 352：95-109(2007)；Byla P等人，J Biol Chem 285：12096(2010)；Zoller F等人，Molecules 16：2467-85(2011)；Alfarano P等人，ProteinSci 21：1298-314(2012)；Madhurantakam C等人，Protein Sci 21：1015-28(2012)；Varadamsetty G等人，J Mol Biol 424：68-87(2012)；Reichen C等人，J Struct Biol185：147-62(2014))。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的结合区域选自包括下述的组：自主VH结构域，单结构域抗体结构域(sdAbs)，从骆驼科来源的重链抗体结构域(VHH片段或VH结构域片段)，从骆驼科VHH片段或VH结构域片段来源的重链抗体结构域，从软骨鱼来源的重链抗体结构域，免疫球蛋白新抗原受体(IgNARs)，VNAR片段，单链可变(scFv)片段，纳米抗体，由重链和CH1结构域组成的Fd片段，单链Fv-CH3微体，二聚体CH2结构域片段(CH2D)，Fc抗原结合结构域(Fcab)，分离的互补决定区3(CDR3)片段，限制的构架区3，CDR3，构架区4(FR3-CDR3-FR4)多肽，小模块免疫药物(SMIP)结构域，scFv-Fc融合体，多聚化scFv片段(双体、三体、四体)，二硫键稳定化的抗体可变(Fv)片段，二硫键稳定化的由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗原-结合(Fab)片段，二价纳米抗体，二价微体，二价F(ab’)2片段(Fab二聚体)，双特异性的串联VHH片段，双特异性的串联scFv片段，双特异性的纳米抗体，双特异性的微体，和前述物质的保留其互补位和结合功能的任何遗传上操作的相应物(参见Ward E等人，Nature 341：544-6(1989)；Davies J，Riechmann L，Biotechnology(NY)13：475-9(1995)；Reiter Y等人，Mol Biol 290：685-98(1999)；Riechmann L，Muyldermans S，J ImmunolMethods 231：25-38(1999)；Tanha J等人，J Immunol Methods 263：97-109(2002)；Vranken W等人，Biochemistry 41：8570-9(2002)；Jespers L等人，J Mol Biol 337：893-903(2004)；Jespers L等人，Nat Biotechnol 22：1161-5(2004)；To R等人，J Biol Chem280：41395-403(2005)；Saerens D等人，Curr Opin Pharmacol 8：600-8(2008)；DimitrovD，MAbs 1：26-8(2009)；Weiner L，Cell 148：1081-4(2012)；Ahmad Z等人，Clin DevImmunol 2012：980250(2012))。
存在多种包含来源于免疫球蛋白的恒定区的多肽的结合区域，诸如，例如，经改造的二聚体Fc结构域，单体Fcs(mFcs)，scFv-Fcs，VHH-Fcs，CH2结构域，单体CH3s结构域(mCH3s)，合成的重编的免疫球蛋白结构域，和/免疫球蛋白结构域与配体的杂化融合体(Hofer T等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A.105：12451-6(2008)；Xiao J等人，J Am ChemSoc 131：13616-13618(2009)；Xiao X等人，Biochem Biophys Res Commun 387：387-92(2009)；Wozniak-Knopp G等人，Protein Eng Des Sel 23 289-97(2010)；Gong R等人，PLoS ONE 7：e42288(2012)；Wozniak-Knopp G等人，PLoS ONE 7：e30083(2012)；Ying T等人，J Biol Chem 287：19399-408(2012)；Ying T等人，J Biol Chem 288：25154-64(2013)；Chiang M等人，J Am Chem Soc 136：3370-3(2014)；Rader C，Trends Biotechnol 32：186-97(2014)；Ying T等人，Biochimica Biophys Acta 1844：1977-82(2014))。
按照某些其他实施方案，所述结合区域包含经工程改造的免疫球蛋白结构域替代支架。经工程改造的替代支架是本领域已知的，其表现出与免疫球蛋白来源的结构类似的功能特征，诸如靶标生物分子的高亲和力和特异性结合，且可以给某些免疫球蛋白结构域提供改善的特征，诸如，例如，更大的稳定性或降低的免疫原性。通常，免疫球蛋白替代支架小于20千道尔顿(kDa)，由单个多肽链组成，缺乏半胱氨酸残基，且表现出相对较高的热力学稳定性。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，免疫球蛋白型结合区域选自包括下述的组：经改造的南美犰狳(Armadillo)重复多肽(ArmRPs)；经改造的纤连蛋白来源的第10个纤连蛋白III型(10Fn3)结构域(单抗体(monobody)，AdNectinsTM，或AdNexinsTM)；经改造的生腱蛋白-来源的生腱蛋白III型结构域(CentrynsTM)；经改造的包含锚蛋白重复基序的多肽(DARPinsTM)；经改造的低密度脂蛋白受体来源的A结构域(LDLR-A)(AvimersTM)；脂质运载蛋白(anticalins)；经改造的蛋白酶抑制剂来源的Kunitz结构域；经改造的蛋白质-A-来源的Z结构域(AffibodiesTM)；经改造的γ-B结晶来源的支架或经改造的泛蛋白-来源的支架(Affilins)；Sac7d-来源的多肽(或affitins)；经改造的Fyn-来源的SH2结构域和经工程改造的抗体模拟物以及前述保留其结合功能性的任何遗传上操作的相应物(A，Plückthun A，J Mol Biol 305：989-1010(2001)；Xu L等人，Chem Biol 9：933-42(2002)；Wikman M等人，Protein Eng Des Sel 17：455-62(2004)；Binz H等人，Nat Biotechnol 23：1257-68(2005)；Hey T等人，Trends Biotechnol 23：514-522(2005)；Holliger P，Hudson P，Nat Biotechnol 23：1126-36(2005)；Gill D，Damle N，Curr Opin Biotech 17：653-8(2006)；Koide A，Koide S，Methods Mol Biol352：95-109(2007)；Byla P等人，J Biol Chem 285：12096(2010)；Zoller F等人，Molecules 16：2467-85(2011)；Alfarano P等人，Protein Sci 21：1298-314(2012)；Madhurantakam C等人，Protein Sci 21；1015-28(2012)；Varadamsetty G等人，J MolBiol 424：68-87(2012))。
例如，存在经改造的Fn3(CD20)结合区域支架，其表现出针对CD20表达细胞的高亲和力结合(Natarajan A等人，Clin Cancer Res 19：6820-9(2013))。
例如，已经鉴定了多种结合细胞外受体HER2的替代支架(参见，例如，Wikman M等人，Protein Eng Des Sel 17：455-62(2004)；Orlova A等人Cancer Res 66：4339-8(2006)；Ahlgren S等人，Bioconjug Chem 19：235-43(2008)；Feldwisch J等人，J MolBiol 398：232-47(2010)；美国专利5,578,482；5,856,110；5,869,445；5,985,553；6,333,169；6,987,088；7,019,017；7,282,365；7,306,801；7,435,797；7,446,185；7,449,480；7,560,111；7,674,460；7,815,906；7,879,325；7,884,194；7,993,650；8,241,630；8,349,585；8,389,227；8,501,909；8,512,967；8,652,474；和美国专利申请2011/0059090)。除了替代抗体形式，通过非蛋白样化合物，诸如，例如，寡聚体，RNA分子，DNA分子，碳水化合物，和多糖包被杯芳烃(glycocalyxcalixarenes)(参见，例如，Sansone F，Casnati A，ChemSoc Rev 42：4623-39(2013))，或通过部分蛋白样的化合物，诸如，例如，与肽连接的苯酚-甲醛环式寡聚物和杯芳烃(calixarene)-肽组合物(参见，例如，U.S.5,770,380)，可以赋予抗体样结合能力。
任何上述结合区域结构可以用作本发明的细胞靶向分子的组分，只要所述结合区域组分具有10-5至10-12摩尔/升、优选小于200纳摩尔(nM)的针对细胞外靶标生物分子的解离常数即可。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含与结合区域连接和/或融合的本发明的志贺毒素效应物多肽，所述结合区域能够特异性地结合靶标生物分子的细胞外部分或细胞外靶标生物分子。基于众多标准，诸如本文描述的判据，可以选择细胞外靶标生物分子。
被结合区域结合的细胞外靶标生物分子
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的结合区域包含蛋白性区域，所述蛋白性区域能够特异性地结合靶标生物分子的细胞外部分或细胞外靶标生物分子，优选地其物理上连接至目标细胞类型(诸如，例如，癌细胞、肿瘤细胞、浆细胞、被感染的细胞或携带细胞内病原体的宿主细胞)的表面。优选地，被靶向的细胞类型将正在表达一种或多种MHCI类分子。被本发明的细胞靶向分子的结合区域结合的靶标生物分子可以包括超比例地(over-proportionately)或排它地存在于癌细胞、免疫细胞和/或被细胞内病原体(诸如，例如，病毒、细菌、真菌、朊病毒或原生动物)感染的细胞上的生物标志物。
术语“靶标生物分子”表示这样的生物分子，通常是蛋白性分子或通过翻译后修饰(诸如糖基化)修饰的蛋白：其被本发明的细胞靶向分子的结合区域结合，从而导致细胞靶向分子向特定细胞、细胞类型和/或多细胞生物内的位置的靶向。
就本发明的目的而言，关于靶标生物分子的术语“细胞外”表示这样的生物分子：其具有暴露于细胞外环境的它的结构的至少一部分。技术人员使用本领域众所周知的方法可以经验地确定向细胞外环境的暴露或向与细胞连接的靶标生物分子的部分的可达性。细胞外靶标生物分子的非限制性例子包括细胞膜组分、跨膜蛋白、锚定细胞膜的生物分子、细胞表面-结合的生物分子和分泌的生物分子。
关于本发明，短语“物理上连接”当用于描述靶标生物分子时是指，共价和/或非共价分子间相互作用将靶标生物分子或其部分连接至细胞外，诸如靶标生物分子和细胞之间的多个非共价相互作用，其中每个单独相互作用的能量是在至少约1-5千卡的量级(例如，静电键、氢键、离子键、范德华相互作用、疏水力等)。可以发现所有嵌膜蛋白物理上连接至细胞膜、以及周围膜蛋白。例如，细胞外靶标生物分子可能包含跨膜区域、脂质锚、糖脂锚和/或与包含前述任一个的因子非共价地结合(例如通过非特异性的疏水相互作用和/或结合脂质的相互作用)。
靶标生物分子的细胞外部分可以包括多种表位，包括未修饰的多肽、通过添加生化官能团而修饰的多肽，和糖脂(参见例如US 5,091,178；EP2431743)。
基于众多标准，诸如它们的靶标生物分子的细胞类型特异性的表达、它们的靶标生物分子关于特定细胞类型的物理定位和/或它们的靶标生物分子的性能，可以设计或选择本发明的细胞靶向分子的结合区域。例如，本发明的某些细胞靶向分子包含能够结合细胞表面靶标生物分子的结合区域，所述细胞表面靶标生物分子由物种的仅一个细胞类型或多细胞生物内的仅一个细胞类型排它地在细胞表面处表达。合乎需要的、但是非必要的是，细胞外靶标生物分子固有地内化或在与本发明的细胞靶向分子相互作用后容易地被迫内化。
技术人员应该理解，可以使用任何需要的靶标生物分子来设计或选择与志贺毒素效应物多肽缔合和/或连接的适当的结合区域，从而产生本发明的细胞靶向分子。
本发明的细胞靶向分子的一般结构是模块，因为多种不同的靶向细胞的结合区域可以与多种志贺毒素效应物多肽和CD8+ T-细胞表位-肽一起使用，从而提供多种表位向多样性靶细胞类型的MHC I类系统的多样性的靶向和递送。任选地，本发明的细胞靶向分子(例如，蛋白)可以进一步包含羧基端内质网保留/回收信号基序，诸如，例如，在所述细胞靶向分子的蛋白样组分的羧基端的氨基酸KDEL(参见，例如，PCT/US2015/19684)。
D.连接本发明的细胞靶向分子的组分的连接键
本发明的细胞靶向分子的各个靶向细胞的结合区域、志贺毒素效应物多肽、CD8+T-细胞表位和/或其他组分可以通过本领域众所周知的和/或本文描述的一个或多个接头适当地彼此连接(参见例如，WO 2014/164693；WO 2015/113005；WO 2015/113007；WO 2015/138452；WO 2015/191764)。结合区的各个多肽亚组分，例如重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、CDR和/或ABR区，可以通过本领域众所周知的和/或本文描述的一个或多个接头适当地彼此连接。本发明的蛋白组分，例如，多链结合区域，可以通过本领域众所周知的一个或多个接头适当地彼此连接或连接至本发明的其他多肽组分。本发明的肽组分，例如，异源的CD8+ T-细胞表位-肽，可以通过本领域众所周知的一个或多个接头(诸如蛋白性接头)适当地连接至本发明的另一个组分。
合适的接头通常是允许本发明的每个多肽组分以这样的三维结构折叠的那些接头，所述三维结构非常类似于在没有任何接头或其他组分与其连接的情况下单独产生的多肽组分。合适的接头包括单个氨基酸、肽、多肽和缺乏前述任一种的接头，诸如各种非蛋白性的碳链，无论是分支的还是环状的。
合适的接头可以是蛋白性的，且包含一个或多个氨基酸、肽和/或多肽。蛋白性的接头适合用于重组融合蛋白和化学连接的缀合物。蛋白性的接头典型地具有约2至约50个氨基酸残基，诸如，例如，约5至约30个或约6至约25个氨基酸残基。选择的接头的长度取决于多种因素，诸如，例如，选择所述接头所期望的一种或多种性质。在某些实施方案中，所述接头是蛋白样的，并且连接在本发明的蛋白组分的末端附近，典型地在末端约20个氨基酸之内。
合适的接头可以是非蛋白性的，诸如，例如，化学接头。
用于连接本发明的细胞靶向分子的组分的合适方法可以是通过目前本领域已知的用于实现该目的的任意方法，只要所述连接不会实质上阻碍靶向细胞的结合区的结合能力和/或在适当时，不会实质上阻碍通过适当测定(包括本文描述的测定)测量的期望的毒素效应物功能即可。例如，可以使用二硫键和硫醚键连接本发明的细胞靶向分子的两个以上的蛋白样组分。
就本发明的细胞靶向分子的目的而言，除非规定，特定的顺序或方向对于所述组分不是固定的。除非特别注明，志贺毒素效应物多肽、异源的CD8+ T-细胞表位、结合区域、和任意可选的接头相对于彼此或整个细胞靶向分子的布置是不固定的(参见，例如，图1)。通常，本发明的细胞靶向分子的各个组分可以以任意顺序布置，条件是不消除所述结合区域、志贺毒素效应物多肽和异源的CD8+ T-细胞表位的一种或多种需要的活性。
II.本发明的细胞靶向分子的特异性结构变化的实例
本发明的细胞靶向分子包含志贺毒素A亚基效应物多肽、靶向细胞的结合区和异源的CD8+ T-细胞表位-肽。原则上，可以通过连接任意异源的CD8+ T-细胞表位-肽与靶向细胞的结合区和志贺毒素A亚基效应物多肽的任意组合而产生具有将CD8+ T-细胞表位递送至靶细胞的MHC I类呈递途径的细胞靶向分子，只要所产生的细胞靶向分子具有由至少志贺毒素效应物、细胞靶向部分或它们一起的结构组合提供的细胞内在化能力(诸如，例如，通过胞吞作用)，并且只要所述志贺毒素效应物多肽组分或所述细胞靶向分子结构整体上在进入靶细胞内部时提供充分的向亚细胞区室组分的亚细胞按路线发送，用于将所述T-细胞表位-肽递送至靶细胞的MHC I类呈递途径，诸如，例如，递送至细胞溶胶或内质网(ER)。
本发明的细胞靶向分子分别包含至少一个来源于志贺毒素家族成员的至少一种A亚基的志贺毒素A亚基效应物多肽。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应物多肽包含截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成。志贺毒素A亚基的截短可能导致整个表位和/或表位区域、B-细胞表位、CD4+ T-细胞表位和/或弗林蛋白酶切割位点的缺失，而不影响志贺毒素效应物功能，诸如，例如，催化活性和细胞毒性。经证实会表现出完全酶活性的最小志贺毒素A亚基片段是由Slt1A的残基1-239组成的多肽(LaPointe P等人，JBiol Chem 280：23310-18(2005))。经证实会表现出显著酶活性的最小志贺毒素A亚基片段是由StxA的残基75-247组成的多肽(Al-Jaufy A等人，Infect Immun 62：956-60(1994))。
尽管本发明的志贺毒素效应物多肽通常可能小于全长志贺毒素A亚基，但是，本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应物多肽可能需要维持氨基酸位置77-239的多肽区域(SLT-1A(SEQ ID NO：1)或StxA(SEQ ID NO：2))或志贺毒素家族的成员的其他A亚基中的等同区域(例如，(SEQ ID NO：3)的77-238)。例如，在本发明的分子的某些实施方案中，从SLT-1A来源的本发明的志贺毒素效应物多肽可以包含SEQ ID NO：1的氨基酸75-251、SEQ IDNO：1的氨基酸1-241、SEQ ID NO：1的氨基酸1-251、或SEQ ID NO：1的氨基酸1-261或基本上由其组成。类似地，从StxA来源的志贺毒素效应物多肽可以包含SEQ ID NO：2的氨基酸75-251、SEQ ID NO：2的氨基酸1-241、SEQ ID NO：2的氨基酸1-251或SEQ ID NO：2的氨基酸1-261或基本上由其组成。另外，从SLT-2来源的志贺毒素效应物多肽可以包含SEQ ID NO：3的氨基酸75-251、SEQ ID NO：3的氨基酸1-241、SEQ ID NO：3的氨基酸1-251或SEQ ID NO：3的氨基酸1-261或基本上由其组成。
尽管来源于野生型志贺毒素A亚基多肽，但是，对于本发明的分子的某些实施方案，所述志贺毒素效应物多肽与天然存在的志贺毒素A亚基有多至1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40或更多个氨基酸残基的不同(但是不超过其保留至少85％，90％，95％，99％或更高的氨基酸序列同一性的程度)。
本发明还提供了本发明的细胞靶向分子的变体，其中所述志贺毒素效应物多肽与天然存在的志贺毒素A亚基的差别在于仅或多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40个或更多个氨基酸残基(但是不超过保留至少85％、90％、95％、99％或更高氨基酸序列同一性的程度)。因而，从志贺毒素家族的成员的A亚基来源的本发明的分子可以包含从原始序列的添加、缺失、截短或其他改变，只要维持与天然存在的志贺毒素A亚基的至少85％、90％、95％、99％或更多氨基酸序列同一性，诸如，例如，其中在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处存在被破坏的弗林蛋白酶切割基序。
因此，在某些实施方案中，本发明的分子的志贺毒素效应物多肽包含与天然存在的志贺毒素A亚基具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％总序列同一性的氨基酸序列或基本上由其组成，诸如SLT-1A(SEQ ID NO：1)、StxA(SEQ ID NO：2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO：3)，诸如，例如，其中在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处存在被破坏的弗林蛋白酶切割基序。
任选地，本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应物多肽的全长或截短的版本，其中，与天然存在的志贺毒素A亚基相比，所述志贺毒素来源的多肽包含一个或多个突变(例如置换、缺失、插入或倒位)。在本发明的某些实施方案中优选的是，所述志贺毒素效应物多肽具有与野生型志贺毒素A亚基的足够序列同一性以保留在进入细胞以后的细胞毒性，无论是通过众所周知的宿主细胞转化、转染、感染或诱导的方法，还是通过由与志贺毒素效应物多肽连接的靶向细胞的结合区域介导的内化进入细胞。已经将对于志贺毒素A亚基的酶活性和/或细胞毒性而言最关键的残基特别绘制至下述残基-位置：天冬酰胺-75、酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170和精氨酸-176(Di R等人，Toxicon 57：525-39(2011))。在本发明的任一个实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽可以优选地但不一定在某些位置维持一个或多个保守氨基酸，诸如在StxA、SLT-1A中的位置77、167、170和176处发现的那些，或在志贺毒素家族的其他成员中的有力的细胞毒性活性通常所需的等同保守位置。使用本领域众所周知的许多测定中的任意一个或多个，可以测量本发明的细胞毒性细胞靶向分子的造成细胞死亡的能力，例如它的细胞毒性。
应该注意，本发明的细胞靶向分子包含与野生型志贺毒素效应物多肽相比在亚细胞按路线发送的志贺毒素效应物功能方面甚至具有相当多的减少的志贺毒素效应物多肽，其仍然能够将它们的异源的CD8+ T-细胞表位-肽组分递送到靶细胞的MHC I类呈递途径，诸如，例如，以充分的量递送，以诱导涉及CD8+免疫细胞的细胞间结合的免疫应答，和/或，甚至当单pMHC I复合物的呈递对于用于细胞溶解的呈递细胞与CTL的细胞间结合是充分的时候，检测特定的细胞类型的某些亚细胞区室(Sykulev Y等人，Immunity 4：565-71(1996))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含：(1)具有羧基端的志贺毒素A1片段来源的多肽，和(2)在所述志贺毒素A1片段来源的多肽的羧基端的被破坏的弗林蛋白酶切割基序。志贺毒素A1片段来源的多肽的羧基端可以由技术人员使用本领域已知的技术鉴定，诸如，例如，使用蛋白序列比对软件来鉴别以下内容：(i)天然存在的志贺毒素保守的弗林蛋白酶切割基序，(ii)天然存在的志贺毒素保守的表面暴露的延长环，和/或(iii)可以被ERAD系统识别的一段氨基酸残基，其主要是疏水的(即疏水“片”)。
本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应物多肽(1)可以在它的志贺毒素A1片段区域的羧基端处完全缺乏任何弗林蛋白酶切割基序，和/或(2)在它的志贺毒素A1片段区域的羧基端和/或从志贺毒素A1片段的羧基端来源的区域处包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序。弗林蛋白酶切割基序的破坏包括对弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基的各种改变，诸如，例如，翻译后修饰，氨基酸官能团中的一个或多个原子的改变，一个或多个原子向氨基酸官能团的添加，非蛋白性部分的结合，和/或与氨基酸残基、肽、多肽的连接，诸如产生支链蛋白性结构。例如，与缺少连接的表位-肽的参比分子相比，异源的CD8+ T-细胞表位-肽与野生型志贺毒素效应物多肽的志贺毒素A1片段区的羧基端的连接可以导致所述志贺毒素效应物多肽减少的弗林蛋白酶切割。
使用本文所述的方法，在WO 2015/191764中所述的方法，和/或技术人员已知的方法，可以由志贺毒素效应物多肽和/或志贺毒素A亚基多肽(不管是天然存在的还是不是)产生蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽，其中所产生的分子仍然保留一种或多种志贺毒素A亚基功能。
就本发明的目的而言，关于弗林蛋白酶切割位点或弗林蛋白酶切割基序，术语“破坏”或“被破坏的”表示从天然存在的弗林蛋白酶切割位点和/或弗林蛋白酶切割基序改变(诸如，例如，突变)，与野生型志贺毒素A亚基或从仅包含野生型多肽序列的野生型志贺毒素A亚基来源的多肽的弗林蛋白酶切割相比，所述改变导致在志贺毒素A1片段区域的羧基端或来源于其的可辨别区域近侧的弗林蛋白酶切割的减少。对弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基的改变包括在弗林蛋白酶切割基序中的突变，诸如，例如，弗林蛋白酶切割基序的缺失、插入、倒位、置换和/或羧基端截短，以及翻译后修饰(诸如，例如，由于糖基化、白蛋白化等)，其涉及将分子与氨基酸残基的官能团缀合或连接。因为弗林蛋白酶切割基序包含约二十个氨基酸残基，在理论上，涉及这二十个位置中的任一个的一个或多个氨基酸残基的改变、修饰、突变、缺失、插入和/或截短可能导致弗林蛋白酶切割敏感性的下降(Tian S等人，Sci Rep 2：261(2012))。
就本发明的目的而言，“被破坏的弗林蛋白酶切割基序”是包含对从20氨基酸残基区域来源的一个或多个氨基酸残基的改变的弗林蛋白酶切割基序，所述区域代表在志贺毒素A1片段和A2片段区域之间的连接部处在天然志贺毒素A亚基中发现的保守弗林蛋白酶切割基序，且定位成使得志贺毒素A亚基的弗林蛋白酶切割导致A1和A2片段的产生；其中所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序以实验上可再现的方式表现出与参比分子相比减少的弗林蛋白酶切割，所述参比分子包含与羧基端多肽融合的野生型志贺毒素A1片段区域，所述羧基端多肽具有足够大的大小以使用技术人员已知的和/或本文描述的适当测定监测弗林蛋白酶切割。
可以破坏弗林蛋白酶切割位点和弗林蛋白酶切割基序的突变类型的例子是氨基酸残基缺失、插入、截短、倒位和/或置换，包括使用非标准的氨基酸和/或非天然的氨基酸的置换。另外，弗林蛋白酶切割位点和弗林蛋白酶切割基序可以被突变破坏，所述突变包含通过添加共价连接的结构对氨基酸的修饰，所述结构掩蔽所述位点或基序中的至少一个氨基酸，例如，由于聚乙二醇化、小分子辅助物的连接和/或位点特异性的白蛋白化。
如果弗林蛋白酶切割基序已经被突变和/或非天然的氨基酸残基的存在破坏，某些被破坏的弗林蛋白酶切割基序不可容易地识别为与任何弗林蛋白酶切割基序有关；但是，志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端将是可识别的，且将定义弗林蛋白酶切割基序将定位的地方，在此处它不会被破坏。例如，由于相对于志贺毒素A亚基和/或志贺毒素A1片段的羧基端截短，被破坏的弗林蛋白酶切割基序可以包含弗林蛋白酶切割基序的小于二十个氨基酸残基。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含：(1)具有羧基端的志贺毒素A1片段来源的多肽，和(2)在志贺毒素A1片段多肽区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序；其中所述细胞靶向分子与参比分子相比具有更大的弗林蛋白酶切割抗性，诸如，例如，所述参比分子是仅包含野生型志贺毒素多肽组分或仅包含在A1与A2片段之间具有保守的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应物多肽的相关分子。例如，使用在WO 2015/191764中描述的体外弗林蛋白酶切割测定，可以确定一种分子相对于参比分子的弗林蛋白酶切割的减少，所述测定使用相同条件进行，然后执行从切割产生的任何片段的带密度的定量以定量地测量弗林蛋白酶切割的变化。
一般而言，如下检测本发明的细胞靶向分子的蛋白酶切割敏感性：将它与相同分子对比，所述相同分子的弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽组分被包含志贺毒素A1片段的野生型志贺毒素效应物多肽组分替换。在某些实施方案中，与参比分子相比，本发明的包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序的分子表现出30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％或更大的体外弗林蛋白酶切割减少，所述参比分子包含在它的羧基端处与肽或多肽融合的野生型志贺毒素A1片段。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含在来源于志贺毒素A亚基的保守的、高度可及的、蛋白酶切割敏感性的环的一个或多个氨基酸中的破坏。在某些其他实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在志贺毒素A亚基中保守的表面暴露的、蛋白酶敏感环中的突变。在某些其他实施方案中，所述突变减少在所述环内的某些氨基酸残基的表面可及性，从而减少弗林蛋白酶切割敏感性。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应物多肽的被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含关于共有氨基酸残基P1和P4中的一个或两个的存在、位置或官能团方面的破坏，诸如，例如，最小弗林蛋白酶切割基序R/Y-x-x-R的位置1和4处的氨基酸残基。例如，将在最小弗林蛋白酶共有位点R-x-x-R中的两个精氨酸残基中的一个或两个突变为丙氨酸将通过减少或消除在该位点的弗林蛋白酶切割而破坏弗林蛋白酶切割基序。例如，将一个或两个精氨酸残基突变为组氨酸将引起弗林蛋白酶切割减少。类似地，将在最小的弗林蛋白酶切割基序R-x-x-R中的精氨酸残基中的一个或两个向技术人员已知的任意非保守的氨基酸残基的氨基酸残基置换将减少该基序的弗林蛋白酶切割敏感性。具体地，精氨酸向缺乏正电荷的任何非碱性氨基酸残基(例如，A、G、P、S、T、D、E、Q、N、C、I、L、M、V、F、W和Y)的氨基酸残基置换将产生被破坏的弗林蛋白酶切割基序。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽的被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在共有氨基酸残基P4和P1之间的间距的破坏，其中插入氨基酸残基的数目不是2，且因而，将P4和/或P1改变至不同的位置和消除P4和/或P1命名。例如，在最小弗林蛋白酶切割位点的弗林蛋白酶切割基序或核心弗林蛋白酶切割基序内的缺失将降低弗林蛋白酶切割基序的弗林蛋白酶切割敏感性。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个氨基酸残基置换。在某些其他实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小的弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或多个氨基酸残基置换，诸如，例如，对于StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应物多肽，用任何不带正电荷的氨基酸残基置换天然地定位的氨基酸残基R248，和/或用任何不带正电荷的氨基酸残基置换R251；和对于SLT-2A来源的志贺毒素效应物多肽，用任何不带正电荷的氨基酸残基置换天然地定位的氨基酸残基Y247，和/或用任何不带正电荷的氨基酸残基置换R250。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含未破坏的最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R，而是相反包含被破坏的侧接区域，诸如，例如，在天然地定位在例如241-247和/或252-259处的弗林蛋白酶切割基序侧接区域中的一个或多个氨基酸残基的氨基酸残基置换。在某些其他实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含位于弗林蛋白酶切割基序的P1-P6区域中的一个或多个氨基酸残基的置换；将P1’突变为庞大的氨基酸，诸如，例如，R、W、Y、F和H；和将P2’突变为极性的和亲水的氨基酸残基；和用一个或多个庞大的且疏水的氨基酸残基置换位于弗林蛋白酶切割基序的P1’-P6’区域中的一个或多个氨基酸残基。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，相对于野生型志贺毒素A亚基，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在弗林蛋白酶切割基序内的至少一个氨基酸残基的缺失、插入、倒位和/或突变。在某些其他实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含天然地定位在以下位置的氨基酸序列的破坏：志贺样毒素1的A亚基(SEQ ID NO：1)或志贺毒素的A亚基(SEQ ID NO：2)的249-251，或志贺样毒素2的A亚基(SEQ ID NO：3)的247-250，或保守的志贺毒素效应物多肽和/或非天然的志贺毒素效应物多肽序列中的等同位置。在某些其他实施方案中，所述破坏的弗林蛋白酶切割基序包含含有突变的破坏，诸如，例如，置换成非标准氨基酸或具有化学修饰的侧链的氨基酸的氨基酸置换。在某些其他实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含这样的破坏，所述破坏包含在弗林蛋白酶切割基序内的至少一个氨基酸的缺失。在某些其他实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在所述弗林蛋白酶切割基序内羧基端氨基酸残基中九个、十个或更多个的缺失。在这些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序不包含弗林蛋白酶切割位点或最小的弗林蛋白酶切割基序。换言之，某些实施方案缺少在A1片段区羧基端的弗林蛋白酶切割位点。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失和氨基酸残基置换以及羧基端截短。在某些其他实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或多个氨基酸残基缺失或置换。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的氨基酸置换与羧基端截短二者，诸如，例如，对于StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应物多肽，截短终止于天然氨基酸位置249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291或更大处，并且包含在适当的情况下用任意不带正电荷的氨基酸残基置换的天然位置的氨基酸残基R248和/或R251；和对于SLT-2A来源的志贺毒素效应物多肽，截短终止于天然氨基酸位置248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291或更大处，并且包含在适当的情况下用任意不带正电荷的氨基酸残基置换的天然位置的氨基酸残基Y247和/或R250。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失和氨基酸残基置换。在某些其他实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或多个氨基酸残基缺失和置换。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含氨基酸残基缺失、氨基酸残基插入、氨基酸残基置换和/或羧基端截短。
本发明的细胞靶向分子分别包含一个或多个异源的CD8+ T-细胞表位-肽。在某些实施方案中，所述CD8+ T-细胞表位-肽是人中的抗原性和/或免疫原性的表位。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的CD8+ T-细胞表位-肽组分包含来源于感染人的微生物病原体分子的8-11个氨基酸长的肽或基本上由其组成，诸如，例如，来自感染人的病毒的抗原。在某些其他实施方案中，本发明的细胞靶向分子的CD8+ T-细胞表位-肽组分包含SEQID NOs：4-12所示的任一种肽或基本上由其组成。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽通过二硫键连接在所述细胞靶向分子上。在某些其他实施方案中，所述二硫键是半胱氨酸-半胱氨酸二硫键。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述异源的CD8+ T-细胞表位-肽通过涉及细胞靶向分子的志贺毒素效应物多肽组分的半胱氨酸残基(诸如，例如，SLT-2A(SEQID NO：3)的C241或者StxA(SEQ ID NO：2)或SLT-1A(SEQ ID NO：1)的242)的官能团的二硫键连接在所述细胞靶向分子上。在某些其他实施方案中，所述半胱氨酸残基位于志贺毒素效应物多肽的志贺毒素A1片段区羧基端的羧基末端(例如，SLT-2A(SEQ ID NO：3)的半胱氨酸残基C260或者StxA(SEQ ID NO：2)或SLT-1A(SEQ ID NO：1)的C261)。
本发明的细胞靶向分子包含至少一个靶向细胞的结合区域。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区域来源于针对与癌症或肿瘤细胞的细胞表面上的表面抗原的特异性和高亲和力结合选择的免疫球蛋白型多肽，其中所述抗原在表达上限于癌症或肿瘤细胞(参见Glokler J等人，Molecules 15：2478-90(2010)；Liu Y等人，Lab Chip 9：1033-6(2009))。根据其他实施方案，针对与癌细胞的细胞表面上的表面抗原的特异性和高亲和力结合选择结合区域，其中所述抗原由癌细胞相对于非癌细胞过表达或优先表达。一些代表性的靶标生物分子包括、但不限于与癌症和/或特定免疫细胞类型有关的以下列举的靶标。
许多以高亲和力结合与癌细胞有关的细胞外表位的免疫球蛋白型结合区域是技术人员已知的，诸如结合下述靶标生物分子中的任一种的结合区域：膜联蛋白AI，B3黑素瘤抗原，B4黑素瘤抗原，CD2，CD3，CD4，CD19，CD20(B-淋巴细胞抗原蛋白CD20)，CD22，CD25(白介素-2受体IL2R)，CD30(TNFRSF8)，CD37，CD38(环状ADP核糖水解酶)，CD40，CD44(透明质烷受体)，ITGAV(CD51)，CD56，CD66，CD70，CD71(转铁蛋白受体)，CD73，CD74(HLA-DR抗原相关的不变链)，CD79，CD98，内皮糖蛋白(END，CD105)，CD106(VCAM-1)，CD138，4型趋化因子受体(CDCR-4，融合素，CD184)，CD200，胰岛素-样生长因子1受体(CD221)，粘蛋白1(MUC1，CD227，CA6，CanAg)，基底细胞粘附分子(B-CAM，CD239)，CD248(内皮唾酸蛋白，TEM1)，肿瘤坏死因子受体10b(TNFRSF1OB，CD262)，肿瘤坏死因子受体13B(TNFRSF13B，TACI，CD276)，血管内皮生长因子受体2(KDR，CD309)，上皮细胞粘附分子(EpCAM，CD326)，人表皮生长因子受体2(HER2，Neu，ErbB2，CD340)，癌抗原15-3(CA15-3)，癌抗原19-9(CA 19-9)，癌抗原125(CA125，MUC16)，CA242，癌胚抗原相关的细胞粘附分子(例如，CEACAM3(CD66d)和CEACAM5)，癌胚抗原蛋白(CEA)，胆碱转运蛋白-样蛋白4(SLC44A4)，硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSP4，MCSP，NG2)，CTLA4，δ-样蛋白(例如，DLL3，DLL4)，外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶蛋白(例如，ENPP3)，内皮缩血管肽受体(ETBRs)，表皮生长因子受体(EGFR，ErbB1)，叶酸受体(FOLRs，例如，FRα)，G-28，神经节苷脂GD2，神经节苷脂GD3，HLA-Dr10，HLA-DRB，人表皮生长因子受体1(HER1)，HER3/ErbB-3，Ephrin B型受体2(EphB2)，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，成纤维细胞活化蛋白(FAP/seprase)，鸟苷酸环化酶c(GCC)，胰岛素-样生长因子1受体(IGF1R)，白介素2受体(IL-2R)，白介素6受体(IL-6R)，整联蛋白α-Vβ-3(αvβ3)，整联蛋白α-Vβ-5(αvβ5)，整联蛋白α-5β-1(α5β1)，L6，锌转运蛋白(LIV-1)，MPG，黑素瘤-相关的抗原1蛋白(MAGE-1)，黑素瘤-相关的抗原3(MAGE-3)，间皮素(MSLN)，金属还原酶STEAP1，MPG，MS4A，NaPi2b，连接素(例如，连接素-4)，p21，p97，脊髓灰质炎病毒受体-样4(PVRL4)，蛋白酶激活受体(诸如PAR1)，前列腺特异性的膜抗原蛋白(PSMAs)，SLIT和NTRK-样蛋白(例如，SLITRK6)，Thomas-Friedenreich抗原，跨膜糖蛋白(GPNMB)，滋养层糖蛋白(TPGB，5T4，WAIF1)，和肿瘤相关的钙信号转换器(TACSTDs，例如，Trop-2，EGP-1，等)(参见，例如，Lui B等人，Cancer Res 64：704-10(2004)；Novellino L等人，Cancer Immunol Immunother 54：187-207(2005)；Bagley R等人，Int J Oncol 34：619-27(2009)；Gerber H等人，mAbs 1：247-53(2009)；Beck A等人，Nat Rev Immunol10：345-52(2010)；Andersen J等人，J BiolChem 287：22927-37(2012)；Nolan-Stevaux O等人，PLoS One 7：e50920(2012)；Rust S等人，Mol Cancer 12：11(2013))。该靶标生物分子列表意图是非限制性的。技术人员会明白，与癌细胞或其他期望的细胞类型有关的任何期望的靶标生物分子可以用于设计或选择可能适合用作本发明的细胞靶向分子的组分的结合区域。
与癌细胞强相关且被已知的免疫球蛋白型结合区域以高亲和力结合的其他靶标生物分子的例子包括BAGE蛋白(B黑素瘤抗原)、基底细胞粘附分子(BCAM或Lutheran血型糖蛋白)、膀胱肿瘤抗原(BTA)、癌症-睾丸抗原NY-ESO-1、癌症-睾丸抗原LAGE蛋白、CD19(B-淋巴细胞抗原蛋白CD19)、CD21(补体受体-2或补体3d受体)、CD26(二肽基肽酶-4、DPP4或腺苷脱氨酶络合蛋白2)、CD33(结合唾液酸的免疫球蛋白型凝集素-3)、CD52(CAMPATH-1抗原)、CD56、CS1(SLAM家族编号7或SLAMF7)、细胞表面A33抗原蛋白(gpA33)、EB病毒抗原蛋白、GAGE/PAGE蛋白(黑素瘤有关的癌症/睾丸抗原)、肝细胞生长因子受体(HGFR或c-Met)、MAGE蛋白、被T-细胞1蛋白识别的黑素瘤抗原(MART-1/MelanA，MARTI)、粘蛋白、黑素瘤(PRAME)蛋白的优先表达抗原、前列腺特异性抗原蛋白(PSA)、前列腺干细胞抗原蛋白(PSCA)、高级糖化终产物的受体(RAGE)、肿瘤相关的糖蛋白72(TAG-72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)和肾母细胞瘤(Wilms’tumor)抗原。
与癌细胞强相关的其他靶标生物分子的例子是碳酸酐酶IX(CA9/CAIX)、封闭蛋白蛋白(CLDN3、CLDN4)、ephrin A型受体3(EphA3)、叶酸结合蛋白(FBP)、神经节苷脂GM2、胰岛素-样生长因子受体、整联蛋白(诸如CDlla-c)、核因子κB的受体活化剂(RANK)、受体酪氨酸-蛋白激酶erB-3、肿瘤坏死因子受体10A(TRAIL-R1/DR4)、肿瘤坏死因子受体10B(TRAIL-R2)、生腱蛋白C和CD64(FcγRI)(参见Hough C等人，Cancer Res 60：6281-7(2000)；ThepenT等人，Nat Biotechnol 18：48-51(2000)；Pastan I等人，Nat Rev Cancer 6：559-65(2006)；Pastan，Annu Rev Med 58：221-37(2007)；Fitzgerald D等人，Cancer Res 71：6300-9(2011)；Scott A等人，Cancer Immun 12：14-22(2012))。该靶标生物分子列表意图是非限制性的。
另外，存在预见到的靶标生物分子的众多其他例子，例如，ADAM金属蛋白酶(例如ADAM-9、ADAM-10、ADAM-12、ADAM-15、ADAM-17)、ADP-核糖基转移酶(ART1、ART4)、抗原F4/80、骨髓基质抗原(BST1、BST2)、断裂点簇区域-c-ab1癌基因(BCR-ABL)蛋白、C3aR(补体组分3a受体)、CD7、CD13、CD44、CD15(Lewis X或阶段特异性的胚胎抗原1)、CD23(FCεRII)、CD45(蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型)、CD49d、CD53、CD54(细胞间粘附分子1)、CD63(四次穿膜蛋白)、CD69、CD80、CD86、CD88(补体组分5a受体1)、CD115(集落刺激因子1受体)、IL-1R(白介素-1受体)、CD123(白介素-3受体)、CD129(白介素9受体)、CD183(趋化因子受体CXCR3)、CD191(CCR1)、CD193(CCR3)、CD195(趋化因子受体CCR5)、CD203c、CD225(干扰素诱导的跨膜蛋白1)、CD244(天然杀伤细胞受体2B4)、CD282(Toll-样受体2)、CD284(Toll-样受体4)、CD294(GPR44)、CD305(白细胞-相关的免疫球蛋白-样受体1)、ephrin A型受体2(EphA2)、FceRIa、半乳糖凝集素-9、甲胎蛋白抗原17-A1蛋白、人天冬氨酰基(天冬酰胺酰基)β-羟化酶(HAAH)、免疫球蛋白样转录物ILT-3、溶血磷脂甘油酰基转移酶1(LPGAT1/IAA0205)、溶酶体-相关的膜蛋白(LAMP，诸如CD107)、黑素细胞蛋白PMEL(gp100)、骨髓相关蛋白-14(mrp-14)、NKG2D配体(例如，MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、UL-16-结合蛋白、H-60s、Rae-1s和其同系物)、受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-3、SART蛋白、清道夫受体(诸如CD64和CD68)、Siglecs(结合唾液酸的免疫球蛋白型凝集素)、多配体聚糖(诸如SDC1或CD138)、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP-1)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)、酪氨酸酶相关抗原(TAA)、APO-3、BCMA、CD2、CD3、CD4、CD8、CD18、CD27、CD28、CD29、CD41、CD49、CD90、CD95(Fas)、CD103、CD104、CD134(0X40)、CD137(4-1BB)、CD152(CTLA-4)、趋化因子受体、补体蛋白、细胞因子受体、组织相容性蛋白、ICOS、干扰素-α、干扰素-β、c-myc、骨保护素、PD-1、RANK、TACI、TNF受体超家族成员(TNF-R1、TNFR-2)、Apo2/TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3和TRAIL-R4(参见Scott A等人，Cancer Immunity 12：14(2012)；Cheever M等人，Clin CancerRes 15：5323-37(2009))，对于靶标生物分子，并且指出本文所述的靶标生物分子是非限制性例子)。
在某些实施方案中，所述结合区域包含能够以高亲和力特异性地结合至免疫系统的细胞类型的细胞表面上的免疫球蛋白型结合区域或基本上由其组成。例如，已知结合免疫细胞表面因子的免疫球蛋白型结合结构域，诸如，例如，CD1，CD2，CD3，CD4，CD5，CD6，CD7，CD8，CD9，CD10，CD11，CD12，CD13，CD14，CD15，CD16，CD17，CD18，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD26，CD27，CD28，CD29，CD30，CD31，CD33，CD34，CD35，CD36，CD37，CD38，CD40，CD41，CD56，CD61，CD62，CD66，CD95，CD117，CD123，CD235，CD146，CD326，白介素-1受体(IL-1R)，白介素-2受体(IL-2R)，核因子κB的受体活化剂(RANKL)，SLAM-相关的蛋白(SAP)和TNFSF18(肿瘤坏死因子配体18或GITRL)。
关于预见到用于用在本发明的分子中的靶标生物分子和结合区域的其他例子，参见WO 2005/092917，WO 2007/033497，US2009/0156417，JP4339511，EP1727827，DE602004027168，EP1945660，JP4934761，EP2228383，US2013/0196928，WO 2014/164680，WO2014/164693，WO 2015/138435，WO 2015/138452，WO 2015/113005，WO 2015/113007，WO2015/191764，US20150259428，62/168,758，62/168,759，62/168,760，62/168,761，62/168,762，62/168,763，和PCT/US2016/016580。
本发明的细胞靶向分子的某些实施方案是细胞毒性的靶向细胞的融合蛋白。某些其他实施方案是包含SEQ ID NOs：13-40、42、44-50、52、54-58、60-61和72-115中所示的任一种多肽或基本上由其组成的细胞靶向分子。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子是融合蛋白，诸如，例如，免疫毒素和配体-毒素融合体。本发明的细胞靶向分子的某些实施方案是细胞毒性减小的或无细胞毒性的靶向细胞的融合蛋白。某些其他实施方案是包含SEQ ID NOs：41、43、51、53和59中所示的任一种多肽或基本上由其组成的细胞靶向分子。其他实施方案是这样的细胞靶向分子：所述细胞靶向分子包含SEQ ID NOs：13-40、42，44-50、52、54-58、60-61和72-115中所示的任一种多肽或基本上由其组成，并且所述细胞靶向分子还包含在志贺毒素效应物多肽组分中改变选自由下述组成的组的天然位置的残基的一个或多个氨基酸置换：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中的A231E，R75A，Y77S，Y114S，E167D，R170A，R176K和/或W203A，或志贺毒素A亚基中的等价氨基酸残基。
本发明的细胞靶向分子分别包含靶向细胞的结合区域，所述结合区域能够特异性结合与细胞物理连接的至少一种细胞外靶标生物分子，诸如在细胞表面上表达的靶标生物分子。该一般结构是模块式的，原因在于任意数量的多样性细胞靶向部分可以用作本发明的细胞靶向分子的结合区域。使用本发明的细胞靶向分子的片段、变体和/或衍生物也在本发明的范围内，它们包含针对靶标生物分子的任意细胞外部分的功能性结合位点，并且甚至更优选地能够以高亲和力(例如，如小于10-9摩尔/升的KD所示)结合靶标生物分子。例如，尽管本发明提供能够结合人蛋白的多肽序列，但是可以替代使用以10-5至10-12摩尔/升、优选小于200nM的解离常数(KD)结合靶标生物分子的细胞外部分的结合区域来用于制备本发明的细胞靶向分子和用于本发明的方法中。
III.本发明的细胞靶向分子的一般功能
本发明提供包含下述的细胞靶向分子：(1)能够展现出至少一种志贺毒素功能的志贺毒素A亚基来源的毒素效应物多肽，和(2)与志贺毒素A亚基不相关的CD8+ T-细胞表位-肽货物；由此向细胞施用所述细胞靶向分子能够导致所述细胞靶向分子进入所述细胞并且将其异源的CD8+ T-细胞表位-肽货物递送到靶细胞的MHC I类路径。该系统是模块式的，原因在于任意数量的多样性结合区域可以用于靶向多样化的细胞类型，并且可以将任意数量的多样性CD8+ T-细胞表位-肽递送到靶细胞中。本发明的细胞靶向分子可以用作治疗分子、细胞毒性分子、细胞标记分子和诊断分子。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子在施用给脊索动物后提供以下的一种或多种：1)对靶向的细胞(例如，被感染的或赘生性细胞)的高效和选择性杀死，2)当细胞靶向分子存在于细胞外空间中时，靶向细胞的结合区域和志贺毒素效应物多肽区域之间的连接稳定性(参见，例如，WO 2015/191764)，3)低水平的脱靶细胞死亡和/或不希望的组织损伤(参见，例如，WO 2015/191764)，和4)用于被靶细胞呈递的异源CD8+ T-细胞表位的细胞靶向递送，以便刺激需要的免疫应答，诸如，例如，CD8+CTL的募集和免疫刺激性细胞因子在组织部位处(例如，肿瘤块)的定位释放。此外，靶细胞对所递送的异源CD8+ T-细胞表位-肽的呈递将这些呈递细胞用pMHC I标记，可以检测其用于收集信息的目的，诸如，例如，用于诊断信息。
本发明的细胞靶向分子可用于多种应用，例如，所述应用涉及CD8+T-细胞表位-货物的靶向递送，免疫应答刺激，被靶向的细胞杀死，被靶向的细胞生长抑制，生物学信息收集，和/或修复健康状况。本发明的细胞靶向分子可用作治疗和/或诊断分子，诸如，例如，用作靶向细胞的无毒递送赋形剂；靶向细胞的细胞毒性治疗分子；和/或靶向细胞的诊断分子；例如在涉及特定细胞类型的体内靶向的应用中用于诊断或治疗多种疾病，包括癌症、免疫病症和微生物感染。本发明的某些细胞靶向分子可以通过提高脊索动物的抗肿瘤免疫性、特别是涉及CD8+ T-细胞介导的机制的有效性而用于治疗患有肿瘤或癌症的所述脊索动物(参见，例如，Ostrand-Rosenberg S，Curr Opin Immuno16：722-7(1994)；Pietersz G等人，Cell Mol Life Sci 57：290-310(2000)；Lazoura E等人，Immunology 119：306-16(2006))。
取决于实施方案，本发明的细胞靶向分子可以具有或提供下述特征或功能性中的一种或多种：(1)体内刺激CD8+ T-细胞免疫应答，(2)去免疫化(参见，例如，WO 2015/113007)，(3)蛋白酶切割抗性(参见，例如，WO 2015/191764)，(4)在某些浓度的有效细胞毒性，(5)选择性细胞毒性，(6)在某些用量或剂量在多细胞生物中的低脱靶毒性(参见，例如，WO 2015/191764)，(7)由另外的物质(例如，核酸或检测促进剂)组成的货物的细胞内递送。本发明的细胞靶向分子的某些实施方案是多功能的，因为所述分子具有本文描述的特征或功能性中的两种或更多种。本发明的细胞靶向分子的某些其他实施方案会在单个分子中提供所有前述特征和功能性。
本发明的治疗性细胞靶向分子的作用机制包括通过志贺毒素效应物功能的直接的靶细胞杀死，通过细胞间免疫细胞介导的过程的间接细胞杀死；和/或由于“CD8+ T-细胞表位接种”而训练接受者的免疫系统以排斥某些细胞和组织部位，例如，肿瘤块。
A.异源的CD8+ T-细朐表位向靶细朐的MHC I类呈递途径的递送
本发明的细胞靶向分子的一种主要功能是细胞靶向递送一种或多种异源的CD8+T-细胞表位-肽用于脊索动物细胞的MHC I类呈递。本发明的细胞靶向分子是模块式构架，用作向几乎任意的脊索动物靶细胞递送几乎任意CD8+ T-细胞表位的递送赋形剂(delivery vehicles)。靶向递送需要所述细胞靶向分子特异性结合特定的靶细胞，进入所述靶细胞，并且将完整的异源CD8+ T-细胞表位-肽递送至亚细胞区室组分，用于进入MHC I类呈递路径。使用本发明的细胞靶向分子将CD8+ T-细胞表位-肽递送至靶细胞的MHC I类递送路径可以用于诱导所述靶细胞将与MHC I类分子缔合的表位-肽呈递在细胞表面上。
通过使用免疫原性的MHC I类表位(诸如，例如，来自己知的病毒抗原)作为本发明的细胞靶向分子的异源CD8+ T-细胞表位-肽货物，可以实现免疫刺激性抗原的靶向递送和呈递，从而刺激脊索动物免疫细胞的有益功能，例如，体外的，和/或体内的脊索动物免疫系统。
在脊索动物中，MHC I类复合物对免疫原性CD8+ T-细胞表位的呈递可以靶向所述呈递细胞，以通过CTL-介导的细胞溶解杀死，促进免疫细胞进入微环境，并且信号传导，以募集更多的免疫细胞到达所述脊索动物内的所述靶细胞部位。本发明的某些细胞靶向分子能够在生理条件下将其异源CD8+ T-细胞表位-条货物递送至靶标脊索动物细胞的MHC I类路径，用于所递送的与MHC I类分子复合的T-细胞表位的呈递。这可以这样而实现：通过向细胞外空间(诸如例如，血管腔)内外源施用所述细胞靶向分子，然后允许所述细胞靶向分子找到靶细胞，进入所述细胞，并且细胞内递送其CD8+ T-细胞表位货物。脊索动物内靶细胞对CD8+ T-细胞表位的递送可以导致免疫应答，包括直接针对所述靶细胞的应答和/或在所述脊索动物内的靶细胞组织部位的一般应答。
本发明的细胞靶向分子的这些CD8+ T-细胞表位递送和MHC I类呈递功能的应用是巨大的。例如，将CD8+表位递送至细胞以及脊索动物中的细胞对所递送的表位的MHC I类呈递可以引起CD8+效应物T-细胞的细胞间结合，并且可以导致杀死所述靶细胞和/或分泌免疫刺激性细胞因子的CTL。
本发明的细胞靶向分子在外源性施用时能够递送一种或多种CD8+T-细胞表位，用于有核的脊索动物细胞的MHC I类呈递。对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够结合与特定细胞类型的细胞表面结合的细胞外靶标生物分子并且进入这些细胞。一旦在被靶向的细胞类型中内在化，本发明的细胞靶向分子的某些实施方案就能够将志贺毒素效应物多肽组分(不论是催化活性的、细胞毒性减小的还是无毒的)按路线发送到靶细胞的细胞溶胶中。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够从细胞外空间将一种或多种异源CD8+ T-细胞表位-肽递送至靶细胞的蛋白酶体。然后，所递送的CD8+ T-细胞表位-肽可以被蛋白水解加工，并且通过MHC I类路径被呈递在所述靶细胞的表面上。对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够将与所述细胞靶向分子连接的异源CD8+ T-细胞表位-肽递送至细胞的MHC I类分子，用于由所述MHC I类分子将所述表位-肽呈递在所述细胞的表面上。对于某些实施方案，当细胞与本发明的细胞靶向分子接触时，所述细胞靶向分子能够将与所述细胞靶向分子连接的异源CD8+ T-细胞表位-肽递送至所述细胞的MHC I类分子，用于由所述MHC I类分子将所述表位-肽呈递在所述细胞的表面上。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子在施用给脊索动物受试者后能够靶向递送一种或多种异源的CD8+ T-细胞表位，用于通过所述受试者内特定的靶细胞的MHC I类呈递。
原则上，可以选择任意的CD8+ T-细胞表位-肽用在本发明的细胞靶向分子中。由此，本发明的细胞靶向分子可用于用与你所选的表位-肽复合的MHC I类分子标记靶细胞的表面。
哺乳动物生物中的每个有核细胞可以能够将免疫原性的CD8+ T-细胞表位肽MHCI类路径呈递在其与MHC I类分子复合的细胞外表面上。另外，T-细胞表位识别的敏感性是如此精密，以致仅需要少量的MHC-I肽复合物被呈递以引起免疫应答，例如，甚至呈递单个复合物就可能对CD8+效应物T-细胞的细胞间结合是充分的(Sykulev Y等人，Immunity 4：565-71(1996))。本发明的细胞靶向分子的靶细胞可以几乎是任意的有核脊索动物细胞类型，并且不需要是免疫细胞和/或专门的抗原呈递细胞。专门的抗原呈递细胞的实例包括树突细胞、巨噬细胞和具有功能性MHC II类系统的专门的上皮细胞。事实上，本发明的细胞靶向分子的优选实施方案不靶向专门的抗原呈递细胞。一个原因是由于施用本发明的细胞靶向分子引起的不需要的免疫应答将是针对所述细胞靶向分子(诸如，例如，识别所述细胞靶向分子内的表位的抗-细胞靶向分子抗体)本身的体液应答。因此，本发明的细胞靶向分子的某些实施方案不靶向专门的抗原呈递细胞和特定的免疫细胞类型，原因在于这些细胞对本发明的细胞靶向分子的摄入可能导致对下述的识别：CD4+ T-细胞，和在所述细胞靶向分子、特别是在志贺毒素效应物多肽组分和/或抗原货物、而且包括所述结合区域中存在的B-细胞表位。
可以在不同条件下并且在不被靶向的旁观细胞(诸如，例如，离体操作的靶细胞、体外培养的靶细胞、在体外培养的组织样品内的靶细胞或在体内场合中如在多细胞生物内的靶细胞)存在下实现本发明的细胞靶向分子的某些实施方案递送CD8+ T-细胞表位的能力。
为了使本发明的细胞靶向分子如设计那样起作用，所述细胞靶向分子必须：1)进入靶细胞，和2)将其CD8+ T-细胞表位-肽货物定位在亚细胞位置组分，用于进入MHC I类路径。通常，本发明的细胞靶向分子通过内吞实现靶细胞内在化。一旦本发明的细胞靶向分子被内在化，其将典型地位于早期内体区室中，诸如，例如，内吞囊泡中，并且注定在溶酶体或晚期内体中消亡。细胞靶向分子必须避免完全隔离和降解，以使所述细胞靶向分子至少包含T-细胞表位-肽货物的部分逃逸到另一个亚细胞区室中。此外，靶细胞应该表达MHC I类分子或者能够被诱导表达MHC I类分子。
为了与MHC I类分子复合的异源CD8+ T-细胞表位-肽(由本发明的细胞靶向分子递送)的细胞表面呈递，MHC I类分子的表达不需要是天然的。对于本发明的某些实施方案，使用技术人员已知的方法，诸如，例如，用IFN-γ处理，可以诱导靶细胞表达MHC I类分子。
通常，本发明的细胞靶向分子通过将其CD8+ T-细胞表位-肽货物定位在靶细胞细胞溶胶区室中的蛋白酶体中而实现MHC I类路径递送。然而，对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子可以将异源CD8+表位-肽递送到MHC I类呈递路径，而无需所述表位-肽曾经进入细胞溶胶区室和/或无需所述表位-肽曾经被所述蛋白酶体蛋白水解加工。
对于本发明的某些实施方案，使用技术人员已知的方法，诸如，例如，通过用IFN-γ和/或TNF-α处理，可以诱导靶细胞表达不同的蛋白酶体亚基和/或蛋白酶体亚型。这可以改变被递送到所述细胞的CD8+表位肽的位置定位和/或蛋白水解加工的相对效率，诸如，例如，通过改变蛋白酶体和蛋白酶体亚型的相对肽酶活性水平。
可以通过多种本领域中技术人员已知的和/或本文所述的标准方法检测并监测本发明的细胞靶向分子的CD8+ T-细胞表位递送功能。例如，使用多种体外和体内测定，包括，例如，MHC I类/肽复合物(pMHC I)的直接检测/显现，测量T-细胞肽针对MHC I类分子的结合亲和力，和/或测量pMHC I呈递在靶细胞上的功能性后果(例如，通过监测细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)应答)(参见，例如，实施例，出处同上)，可以研究本发明的细胞靶向分子递送CD8+ T-细胞表位-肽并且驱动靶细胞的MHC I类系统呈递所述肽的能力。
用于监测并量化本发明的细胞靶向分子的CD8+ T-细胞表位递送功能的某些测定涉及在体外或离体直接检测特定的pMHC I。用于pMHC I的直接显现和定量的常见方法涉及技术人员已知的多种免疫检测试剂。例如，可以开发特异性的单克隆抗体来识别特定的pMHC I。类似地，可溶性的多聚体T细胞受体(诸如TCR-STAR试剂(Altor BioscienceCorp.，Mirmar，FL，U.S.))可以用于直接显示或量化特定的pMHC I(Zhu X等人，JImmunol176：3223-32(2006)；参见，例如，实施例，出处同上)。这些特异性的mAb或可溶性的多聚体T-细胞受体可以与多种检测方法(包括，例如免疫组织化学、流式细胞计量术和酶联免疫测定(ELISA))一起使用。
用于直接鉴别和定量pMHC的一种替代方法涉及质谱法分析，诸如，例如，ProPresent抗原呈递测定(ProPresent Antigen Presentation Assay，ProImmune，Inc.，Sarasota，FL，U.S.)，其中从细胞表面提取肽-MHC I类复合物，然后通过测序质谱法纯化和鉴别所述肽(Falk K等人，Nature 351：290-6(1991))。
用于监测本发明的细胞靶向分子的CD8+ T-细胞表位递送和MHC I类呈递功能的某些测定涉及计算和/或实验方法以监测MHC I类和肽的结合和稳定性。几种软件程序可供技术人员使用，用于预测肽对MHC I类等位基因的结合应答，诸如，例如，免疫表位数据库和分子源(IEDB)分析源MHC-I结合预测共用工具(The Immune Epitope Database andAnalysis Resource(IEDB)Analysis Resource MHC-I binding prediction Consensustool)(Kim Y等人，Nucleic Acid Res 40：W525-30(2012))。已经常规地应用几种实验性测定，诸如，例如，细胞表面结合测定和/或表面等离子体共振测定，以定量和/或对比结合动力学(Miles K等人，Mol Immunol 48：728-32(2011))。
备选地，通过监测对特定复合物的细胞毒性T细胞(CTL)应答，可以执行细胞表面上的pMHC I呈递的后果的测量。这些测量包括用MHC I类四聚体或五聚体试剂直接标记CTL。四聚体或五聚体直接结合有特定特异性的T细胞受体，其由主要组织相容性复合物(MHC)等位基因和肽复合物决定。另外，通常测定ELISA或酶联免疫斑点(ELIspot)对释放的细胞因子(诸如干扰素γ或白介素)的定量以鉴别特定CTL应答。使用许多测定，包括经典的51铬(Cr)释放测定或替代性的非放射性的细胞毒性测定(例如，非放射性的试剂盒和CellToxTM 试剂盒，可得自Promega Corp.，Madison，WI，U.S.)、Granzyme B ELISpot、胱天蛋白酶活性测定(Caspase Activity Assays)或LAMP-1易位流式细胞计数测定，可以测量CTL的细胞毒性能力。为了特异性地监测靶细胞的杀死，二乙酸羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)可以用于容易地和快速地标记目标细胞群体用于体外或体内研究以监测表位特异性的CSFE标记的靶细胞的杀死(Durward M等人，J Vis Exp45pii 2250(2010))。
可以如下跟踪对MHC I类呈递的体内应答：施用MHC I类/抗原促进剂(例如，肽、蛋白或灭活的/减弱的病毒疫苗)，然后用活性剂(例如，病毒)攻击，并监测对该试剂的应答，典型地与未接种疫苗的对照进行对比。用与前述的那些(例如，CTL细胞毒性测定和细胞因子释放的定量)类似的方法，可以针对CTL活性监测离体样品。
可以通过反向免疫学跟踪生物内的MHC I类呈递。例如，使用免疫亲和力(例如，抗-MHC抗体“下拉”纯化)从裂解以后的用包含抗原X的本发明的细胞靶向分子中毒的细胞分离HLA-A、HLA-B和/或HLA-C分子，并从纯化的复合物回收有关的肽(即，分离的pMHC I结合的肽)。通过测序质谱法分析回收的肽。将质谱法数据与蛋白数据库文库进行对比，所述蛋白数据库文库由外源(非自身)肽(抗原X)的序列和国际人类蛋白索引(代表“自身的”或非免疫原性的肽)组成。根据概率数据库，将所述肽按照重要性排序。将所有检测的抗原(非自身)肽序列列出。通过检索乱序诱饵数据库来验证数据以减少伪命中(参见，例如，Ma B，Johnson R，Mol Cell Proteomics 11：O111.014902(2012))。结果可以证实，来自CD8+ T-细胞抗原X的肽在MHC I复合物中被呈递到细胞靶向分子中毒的靶细胞的表面上。
B.细胞杀死：直接靶向的志贺毒素细胞毒性和/或通过募集CTL的间接靶向的细胞 介导的细胞毒性
本发明的细胞靶向分子可以提供下述细胞类型特异性的递送：1)递送CD8+ T-细胞表位至MHC I类呈递路径，用以呈递和CTL的细胞间结合，以及2)向细胞溶胶递送有效的志贺毒素细胞毒性。这些多重细胞毒性机制可以彼此补充，诸如通过提供直接的(志贺毒素催化介导的)靶细胞杀死和间接的(例如，CTL-介导的)靶细胞杀死二者。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子在特定的浓度是有细胞毒性的。本发明的细胞靶向分子可以用于涉及间接的(例如，通过细胞间CD8+免疫细胞结合)和/或直接的细胞杀死机制(例如，通过细胞内毒素效应物活性)的应用。由于志贺毒素能够杀死真核细胞，因此，使用志贺毒素A亚基来源的多肽设计的细胞毒性的细胞靶向分子可以表现出有效的细胞杀死活性。志贺毒素A亚基及其包含活性酶结构域的衍生物可以在进入细胞的细胞溶胶中时杀死真核细胞。可以实现靶向细胞的结合区域和异源CD8+ T-细胞表位-肽与志贺毒素A亚基效应物多肽的融合，而不显著减少所述志贺毒素效应物多肽的催化和细胞毒性活性(参见实施例，出处同上)。因此，本发明的某些细胞靶向分子可以提供至少两种丰富的靶细胞杀死机制-(1)由于本发明的细胞靶向分子的异源CD8+表位货物递送引起的间接的免疫细胞介导的杀死，和(2)通过本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应物多肽组分的功能活性的直接杀死。
对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，当与所述分子的结合区域的细胞外靶标生物分子物理连接的靶细胞接触时，所述细胞靶向分子能够引起所述靶细胞死亡。细胞杀死的机制可以是直接的，例如，通过志贺毒素效应物多肽的酶活性杀死，或是间接的，通过免疫细胞-介导的机制杀死，例如，CTL-介导的靶细胞细胞溶解，并且可以在靶细胞的不同条件下进行，诸如离体操作的靶细胞，体外培养的靶细胞，体外培养的组织样品中的靶细胞或体内靶细胞。
为了用于本发明的细胞靶向分子的靶向的细胞杀死，靶标生物分子的表达不需要是天然的。靶标生物分子的细胞表面表达可以是感染、病原体存在和/或细胞内微生物病原体存在的结果。靶标生物分子的表达可以是人为的，诸如，例如，通过在用病毒表达载体感染后迫使或诱导表达，参见，例如，腺病毒、腺相关病毒和反转录病毒系统。诱导靶标生物分子表达的实例是暴露于维A酸类(retinoids)(如全反式视黄酸和各种合成的维A酸类)或任何视黄酸受体(RAR)激动剂的细胞的CD38表达的上调(Drach J等人，Cancer Res 54：1746-52(1994)；Uruno A等人，J Leukoc Biol 90：235-47(2011))。在另一个实施例中，通过将细胞暴露于电离辐射可以诱导CD20、HER2和EGFR表达(Wattenberg M等人，Br J Cancer 110：1472-80(2014))。
对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，所述细胞靶向分子是有细胞毒性的，原因在于递送该分子的异源CD8+ T-细胞表位货物导致靶细胞对所递送的表位的MHC I类呈递和所述靶细胞的免疫细胞介导的杀死。
本发明的某些细胞靶向分子可以用于涉及间接细胞杀死机制的应用中，诸如，例如，刺激CD8+免疫细胞介导的靶细胞杀死。被靶向的细胞的免疫刺激性非自身抗原(诸如，例如，已知的具有高免疫原性的病毒表位-肽)的呈递可以向其他免疫细胞传递信号，从而破坏所述靶细胞并且募集更多的免疫细胞到达生物体内的靶细胞部位。在某些条件下，MHCI类复合物靶标对免疫原性CD8+表位-肽的细胞表面呈递刺激免疫系统杀死所述呈递细胞，用于通过CD8+CTL-介导的细胞溶解杀死。
对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，当接触与所述分子结合区域的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞时，所述细胞靶向分子能够间接地引起所述细胞的死亡，诸如，例如，通过由靶细胞呈递一个或多个T-细胞表位和随后的CTL募集。
另外，在脊索动物内，靶细胞对由本发明的细胞靶向分子递送的CD8+ T-细胞表位的呈递可以对局部区域提供另外的免疫刺激功能性和/或破坏局部区域中对某些恶性细胞的免疫耐受性和/或系统性遍布整个脊索动物中。
对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，当接触与所述结合区域的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞时，本发明的细胞靶向分子能够直接引起所述细胞的死亡，诸如，例如，通过本文所述的志贺毒素效应物多肽或细胞毒性试剂的酶活性。对于本发明的细胞靶向分子的某些其他实施方案，所述细胞靶向分子是有细胞毒性的，原因在于它们包含催化活性的志贺毒素效应物多肽组分，而与所述细胞靶向分子将任意异源的CD8+ T-细胞表位-肽递送至MHC I类呈递路径的任意功能性结果无关。
另外，使用常规方法，技术人员可以将本发明表现出基于志贺毒素效应物多肽催化活性的细胞毒性的有细胞毒性的细胞靶向分子改造成酶失活的变体，以减少或消除基于志贺毒素效应物的细胞毒性。由于其将异源的CD8+ T-细胞表位递送至靶细胞的MHC I类系统随后由MHC I类分子将所递送的CD8+ T-细胞表位-肽呈递在所述靶细胞的表面上，得到的“失活的”细胞靶向分子可以或可以不仍旧是细胞毒性的。
C.细胞类型间的选择性细胞毒性
本发明的某些细胞靶向分子具有在有未靶向的旁观细胞存在下选择性地杀死特定靶细胞的用途。通过将免疫原性CD8+ T-细胞表位的递送靶向至靶细胞的MHC I类路径，可以将所递送的CD8+ T-细胞表位的随后呈递和CTL-介导的表位-呈递靶细胞的细胞溶解的TCR特异性调节限制为在未被靶向的细胞的存在下优先杀死所选的细胞类型。另外，多种志贺毒素效应物多肽的有效细胞毒性活性对靶细胞的杀死可以限制为优先杀死具有同时的免疫原性T-细胞表位和细胞毒性毒素效应物多肽递送的靶细胞。
对于某些实施方案，当将本发明的细胞靶向分子施用给多种细胞类型的混合物时，与没有与细胞外靶标生物分子物理连接的细胞类型相比，所述细胞靶向分子能够选择性杀死与细胞外靶标生物分子物理连接的那些细胞。
对于某些实施方案，当将本发明的细胞靶向分子施用给多种细胞类型的混合物时，与没有与细胞外靶标生物分子物理连接的细胞类型相比，细胞毒性的细胞靶向分子能够选择性杀死与细胞外靶标生物分子物理连接的那些细胞。对于某些实施方案，本发明的细胞毒性的细胞靶向分子能够选择性或优先引起两种以上不同的细胞类型的混合物中的特定细胞类型的死亡。这能够实现与不表达靶标生物分子的“旁观”细胞类型相比高优先的对特定细胞类型的靶向细胞毒性活性，诸如3倍的细胞毒性效应。备选地，如果靶标生物分子以足够低的量表达和/或以小量与未被靶向的细胞类型物理上连接，结合区域的靶标生物分子的表达可以非专属于一种细胞类型。这能够实现与不表达显著量的靶标生物分子或没有与显著量的靶标生物分子物理上连接的“旁观”细胞类型相比高优先的对特定细胞类型的靶向细胞杀死，诸如3倍的细胞毒性效应。
对于某些其他实施方案，在将细胞毒性的细胞靶向分子施用给两个不同的细胞类型群体后，细胞毒性的细胞靶向分子能够造成细胞死亡，如通过靶细胞群体(其成员表达细胞毒性的细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶标生物分子)上的半数最大细胞毒性浓度(CD50)所确定的，其剂量比相同细胞毒性的细胞靶向分子对于其成员不表达细胞毒性的细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶标生物分子的细胞群体的CD50剂量低至少三倍。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子对与细胞外靶标生物分子物理上连接的细胞类型的群体的细胞毒性活性是没有与结合区域的任何细胞外靶标生物分子物理上连接的细胞类型群体的细胞毒性活性的至少3倍高。根据本发明，可以以下述比率(a/b)的方式定量选择性的细胞毒性：(a)对与结合区域的靶标生物分子物理上连接的特定细胞类型的细胞群体的细胞毒性，除以(b)对没有与结合区域的靶标生物分子物理上连接的细胞类型的细胞群体的细胞毒性。在某些实施方案中，所述细胞毒性比率指示，相对于没有与结合区域的靶标生物分子物理上连接的细胞群体或细胞类型，对与结合区域的靶标生物分子物理上连接的细胞群体或细胞类型的选择性的细胞毒性高至少3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍、750倍或1000倍。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子的优先细胞杀死功能或选择性细胞毒性是由于另外的外源物质(例如细胞毒性的物质)和/或存在于本发明的细胞靶向分子中的异源CD8+ T-细胞表位，且不一定是所述细胞靶向分子的志贺毒素效应物多肽组分的催化活性的结果。
重要的是注意到，对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，当向脊索动物施用细胞靶向分子时，所述细胞靶向分子可以引起未被靶向的细胞的死亡，所述未被靶向的细胞纯在靶细胞的附近处和/或通过享有共同的恶性病患而与靶细胞相关。脊索动物内靶细胞对某些T-细胞表位的呈递可以导致对所述靶细胞的CTL-介导的杀死以及对没有呈递所递送的表位但是处在表位呈递细胞附近处的其他细胞的杀死。因此，在脊索动物内被靶向的肿瘤细胞对某些T-细胞表位的呈递可以导致分子间表位扩展，肿瘤微环境针对刺激条件重编程，从无效应性释放已有的免疫细胞或去除对靶细胞或包含其的损伤组织的脱敏作用，并且克服受试者免疫系统对非自身肿瘤抗原的耐受生理状态(参见，SectionX.Methods of Using a Cell-Targeting Molecule，出处同上)。
D.另外的外源物质向靶向细胞的内部的递送
除了直接的细胞杀死，本发明的细胞靶向分子任选地可以用于将另外的外源物质递送到靶细胞内部。例如，另外的外源物质的递送可以用于细胞毒性的、细胞抑制的免疫系统刺激、免疫细胞靶向、信息收集和/或诊断功能。本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的无细胞毒性的变体或任选的毒性变体可以用于将另外的外源物质递送到与所述细胞靶向分子的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞内部和/或标记所述细胞内部。将靶标生物分子表达至至少一个细胞表面的多种类型的细胞和/或细胞群体可以被本发明的细胞靶向分子靶向，以接收外源物质。
因为本发明的细胞靶向分子(包括其无毒形式)能够进入与细胞外靶标生物分子(其被细胞靶向分子的结合区域识别)物理上连接的细胞中，本发明的细胞靶向分子的某些实施方案可以用于将另外的外源物质递送进被靶向的细胞类型的内部。在一种意义上，本发明的整个细胞靶向分子是将进入细胞的外源物质；由此，所述“另外的”外源物质是与核心细胞靶向分子本身连接但是与其不同的异源物质。本发明的无毒细胞靶向分子包含在某些情形中不刺激CTL-介导的细胞杀死的异源CD8+ T-细胞表位-肽，该无毒细胞靶向分子仍然可以用于递送“良性的”CD8+ T-细胞-表位-肽，其在MHC I类呈递时不导致细胞杀死但是允许信息收集，诸如，例如，关于个体中免疫系统功能、MHC I类变体表达和某种细胞中MHCI类系统的操作性的信息。
“另外的外源物质”用在本文中是指这样的一种或多种分子，其通常不存在于天然靶细胞内，在天然靶细胞中，本发明的蛋白可以用于将所述物质特异性地转运到细胞内部。另外的外源物质的非限制性实例是细胞毒性剂、肽、多肽、蛋白、多核苷酸、检测促进剂和小分子化疗剂。
在本发明用于递送另外的外源物质的蛋白的某些实施方案中，所述另外的外源物质是细胞毒性剂，诸如，例如，小分子化疗剂，细胞毒性抗生素，烷化剂，抗代谢剂，拓扑异构酶抑制剂和/或微管蛋白抑制剂。细胞毒性剂的非限制性例子包括氮丙啶(aziridines)，顺铂，四嗪，丙卡巴肼(procarbazine)，六甲蜜胺(hexamethylmelamine)，长春花生物碱(vinca alkaloids)，紫杉烷(taxanes)，喜树碱(camptothecins)，依托泊苷(etoposide)，多柔比星(doxorubicin)，米托蒽醌(mitoxantrone)，替尼泊苷(teniposide)，新生霉素(novobiocin)，阿柔比星(aclarubicin)，蒽环类抗生素(anthracyclines)，放线菌素(actinomycin)，博来霉素(bleomycin)，普卡霉素(plicamycin)，丝裂霉素(mitomycin)，柔红霉素(daunorubicin)，表柔比星(epirubicin)，伊达比星(idarubicin)，多拉司他汀(dolastatins)，美坦辛(maytansines)，多西他赛(docetaxel)，阿霉素(adriamycin)，卡奇霉素(calicheamicin)，耳他汀(auristatins)，吡咯苯并二(pyrrolobenzodiazepine)，卡铂，5-氟尿嘧啶(5-FU)，卡培他滨(capecitabine)，丝裂霉素C，紫杉醇(paclitaxel)，1，3-双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲(BCNU)，利福平(rifampicin)，顺铂，甲氨蝶呤(methotrexate)，和吉西他滨(gemcitabine)。
在某些实施方案中，所述另外的外源物质包含含有酶的蛋白或多肽。在某些其他实施方案中，所述另外的外源物质是核酸，诸如，例如，作为小抑制RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)起作用的核糖核酸。在某些实施方案中，所述另外的外源物质是抗原，诸如从细菌蛋白、病毒蛋白、在癌症中突变的蛋白、在癌症中异常表达的蛋白、或T-细胞互补决定区来源的抗原。例如，外源物质包括抗原，诸如被细菌感染的抗原呈递细胞特有的那些抗原，和能够作为外源抗原起作用的T-细胞互补决定区。外源物质的其他例子包括比抗原肽更大的多肽和蛋白，诸如酶。
在某些实施方案中，所述另外的外源物质包含促凋亡肽(proapoptoticpeptide)、多肽、或蛋白，诸如，例如，BCL-2，胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶-3或胱天蛋白酶-6的片段)，细胞色素，粒酶B，凋亡诱导因子(AIF)，BAX，tBid(截短的Bid)，及其促凋亡片段或衍生物(参见，例如，Ellerby H等人，Nat Med 5：1032-8(1999)；Mai J等人，CancerRes 61：7709-12(2001)；Jia L等人，Cancer Res 63：3257-62(2003)；Liu Y等人，MolCancer Ther 2：1341-50(2003)；Perea S等人，Cancer Res64：7127-9(2004)；Xu Y等人，JImmunol 173：61-7(2004)；B等人，Cell Death Differ 13：576-85(2006)；Wang T等人，Cancer Res 67：11830-9(2007)；Kwon M等人，Mol Cancer Ther 7：1514-22(2008)；Shan L等人，Cancer Biol Ther 11：1717-22(2008)；Qiu X等人，Mol Cancer Ther7：1890-9(2008)；Wang F等人，Clin Cancer Res 16：2284-94(2010)；Kim J等人，J Virol 85：1507-16(2011))。
E.用于诊断功能的信息收集
本发明的细胞靶向分子可以用于信息收集功能。本发明的细胞靶向分子的某些实施方案可以用于对特定的pMHC I呈递细胞成像，其使用特异性针对pMHC I的抗体进行，所述抗体识别细胞表面上与MHC I类分子复合的异源的CD8+ T-细胞表位-肽(由本发明的细胞靶向分子递送)。另外，本发明的某些细胞靶向分子在特定细胞、细胞类型和/或细胞群体的体外和/或体内检测中具有用途。在某些实施方案中，本文所述的细胞靶向分子用于诊断和治疗二者，或仅用于诊断。
将本领域已知的检测促进剂与本发明的各种细胞靶向分子缀合的能力提供用于检测癌症、肿瘤、生长异常、免疫和被感染的细胞的有用组合物。通过本领域已知的各种成像技术和测定，本发明的细胞靶向分子的这些诊断实施方案可以用于信息收集。例如，通过患者或活组织检查样品中各个癌细胞、免疫细胞或受感染的细胞的细胞内细胞器(例如，内吞隔室、高尔基隔室、内质网隔室和细胞溶质隔室)的成像，本发明的细胞靶向分子的诊断实施方案可以用于信息收集。
使用本发明的细胞靶向分子的诊断实施方案可以收集不同类型的信息，无论用于诊断用途还是其他用途。该信息可用于，例如，诊断赘生性细胞亚型，确定特定细胞类型中的MHC I类路径和/或TAP系统功能性，确定特定细胞类型中MHC I类路径和/或TAP系统功能性随时间的变化，确定患者的疾病的治疗敏感性，测定抗肿瘤治疗随时间的进展，测定免疫调节治疗随时间的进展，测定抗微生物治疗随时间的进展，评价受感染的细胞在移植物质中的存在，评价不希望的细胞类型在移植物质中的存在，和/或评价肿瘤块的外科手术切除以后残余肿瘤细胞的存在。
例如，使用用本发明的细胞靶向分子的诊断变体收集的信息，可能确定患者亚群，然后可以基于使用那些诊断实施方案揭示的他们的独特特征将各个患者分类成亚群。例如，特定药物或治疗的有效性可能是用于定义患者亚群的一类判据。例如，可以使用本发明的特定细胞毒性细胞靶向分子的无毒诊断变体区分哪些患者属于预期对本发明的相同细胞靶向分子的细胞毒性变体做出阳性应答的患者的类别或亚群。因此，使用本发明的细胞靶向分子(包括本发明的细胞毒性细胞靶向分子的无毒变体)进行患者鉴别、患者分级和诊断的有关方法被认为是在本发明范围内。
IV.本发明的细胞靶向分子的蛋白组分的多肽序列内的变异
技术人员应该认识到，可以在不消除它们的生物活性的前提下，对上述本发明的细胞靶向分子和编码任意前者的多核苷酸进行变异，例如，通过维持所述细胞靶向分子在外源施用给所述靶细胞后将它们的异源CD8+ T-细胞表位-肽货物递送至靶细胞的MHC I类呈递路径的整体结构和功能。例如，一些修饰可以促进表达、促进纯化、提高药物代谢动力学特性和/或提高免疫原性。此类修饰是技术人员公知的，并且包括，例如，在氨基端添加的甲硫氨酸，以提供起始位点，放置在任一末端的另外的氨基酸，以产生便利放置的限制性位点或终止密码子，和融合在任一末端的生化亲和性标签，以提供便利的检测和/或纯化。提高多肽免疫原性的常用的修饰是在纯化多肽后去除起始的甲硫氨酸残基，在细菌宿主系统的生产过程中，该起始的甲硫氨酸残基可以被甲酰化，原因在于，例如，N-甲酰基甲硫氨酸(fMet)的存在可能在脊索动物中诱导不需要的免疫应答。
在本发明的细胞靶向分子的实施方案的某些变化中，必须保持所述结合区域的特定的细胞靶向功能，以便明显地保留靶标生物分子结合的特异性和选择性。在本发明的细胞靶向分子的实施方案的某些变化中，志贺毒素效应物多肽的某些生物活性可能需要保留，例如，诱导细胞内在化，向特定亚细胞区室(如能够进入MHC I类路径的区室)的细胞内按路线发送，和/或将外源物质递送到靶细胞的某些亚细胞区室中的能力。
在本文中还预见到在氨基端和/或羧基端包括另外的氨基酸残基，诸如表位标签或其他部分的序列。所述另外的氨基酸残基可以用于多种目的，包括，例如，促进克隆、表达、翻译后修饰、合成、纯化、检测和/或施用。生化标签和部分的非限制性例子是：壳多糖结合蛋白结构域、肠肽酶切割位点、因子Xa切割位点、FIAsH标签、FLAG标签、绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽-S-转移酶部分、HA标签、麦芽糖结合蛋白结构域、myc标签、聚组氨酸标签、ReAsH标签、strep-标签、strep-标签II、TEV蛋白酶位点、硫氧还蛋白结构域、凝血酶切割位点和V5表位标签。
在某些上述实施方案中，本发明的细胞靶向分子或其多肽组分的蛋白序列通过引入到所述蛋白或多肽组分中的一个或多个保守氨基酸置换而变化，只要所述细胞靶向分子在外源施用到靶细胞后保留将其异源的CD8+ T-细胞表位-肽货物递送至所述靶细胞的MHCI类呈递系统的能力，使得使用技术人员已知的和/或本文所述的测定可以检测所述递送和/或所递送的CD8+ T-细胞表位的细胞表面MHC I类呈递。
用于本文时，术语“保守置换”表示，一个或多个氨基酸被另一个生物学上相似的氨基酸残基替换。例子包括具有相似特征(例如小氨基酸、酸性氨基酸、极性氨基酸、碱性氨基酸、疏水氨基酸和芳族氨基酸)的氨基酸残基的置换(参见，例如，下表B)。使用通常不存在于内源哺乳动物肽和蛋白中的残基的保守置换的一个例子是利用例如鸟氨酸、刀豆氨酸、氨基乙基半胱氨酸或另一种碱性氨基酸对精氨酸或赖氨酸残基的保守置换。关于与肽和蛋白中表型上沉默的置换相关的其他信息，参见，例如，Bowie J等人，Science 247：1306-10(1990)。
表B.保守氨基酸置换的例子
在上述表B的保守置换方案中，示例性的保守氨基酸置换根据物理化学性质进行分组——I：中性的、亲水的；II：酸和酰胺；III：碱性的；IV：疏水的；V：芳族的、庞大氨基酸，VI亲水的、不带电荷的，VII脂族不带电荷的，VIII非极性的不带电荷的，IX环烯基相关的、X疏水的，XI极性的，XII小的，XIII允许旋转的，和XIV柔性的。例如，保守氨基酸置换包括下述：1)S可以置换C；2)M或L可以置换F；3)Y可以置换M；4)Q或E可以置换K；5)N或Q可以置换H；和6)H可以置换N。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子(例如，靶向细胞的融合蛋白)可以包含本发明的多肽区域的功能性片段或变体，与本文引用的多肽序列相比，所述功能片段或变体最多具有20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基置换，条件是，包含其的所述细胞靶向分子能够将其异源的CD8+ T-细胞表位-肽货物递送到靶细胞的MHC I类呈递路径。作为通过下述改变本发明的细胞靶向蛋白的多肽组分的结果，本发明的细胞靶向分子的变体在本发明的范围内：改变一个或多个氨基酸或删除或插入一个或多个氨基酸(诸如在结合区或志贺毒素效应物多肽区域内)，以便实现期望的性能，诸如改变的细胞毒性、改变的细胞生长抑制作用、改变的免疫原性和/或改变的血清半衰期。本发明的细胞靶向分子或其多肽组分可以进一步具有或不具有信号序列。
因此，在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的结合区域包含与本文引用的或在比较比对序列时(其中比对通过本领域已知的计算机同源性程序进行)已经知晓的结合区域具有至少80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％，99.5％或99.7％的整体序列同一性的氨基酸序列或基本上由所述氨基酸序列组成，只要作为所述细胞靶向分子的组分的结合区域表现出合理数量的细胞外靶标生物分子结合特异性和亲和性，诸如，例如，表现出10-5至10-12摩尔/升的针对所述靶标生物分子的KD。
在某些实施方案中，当与比对的序列进行比较时(其中比对通过本领域已知的计算机同源性程序进行)，本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应物多肽区域包含与天然存在的毒素具有至少55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％，99.5％或99.7％整体序列同一性的氨基酸序列或基本上由所述氨基酸序列组成，只要所述志贺毒素效应物多肽(作为所述细胞靶向分子的组分)表现出需要水平的与所述细胞靶向分子的异源CD8+ T-细胞表位-肽货物向至少一种靶细胞类型的MHC I类呈递路径的细胞内递送相关的志贺毒素效应物功能，所述天然存在的毒素，诸如，例如，志贺毒素A亚基，如SLT-1A(SEQ ID NO：1)，StxA(SEQ ID NO：2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO：3)。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应物多肽组分可以该改变，以改变所述志贺毒素效应物多肽的酶活性和/或细胞毒性，只要所述志贺毒素效应物多肽(作为所述细胞靶向分子的组分)表现出需要水平的与所述细胞靶向分子的CD8+ T-细胞表位-肽货物向至少一种靶细胞类型的MHC I类呈递路径的细胞内递送相关的志贺毒素效应物功能。这种改变可以或可以不导致志贺毒素效应物多肽或改变的志贺毒素效应物多肽是其中的组分的细胞靶向分子的细胞毒性。通过诱变或截短可以改变、减少或消除志贺毒素酶活性和细胞毒性二者。可能的改变包括选自由下述组成的组的对志贺毒素效应物多肽的突变：截短，缺失，倒位，插入，重排，和置换，只要所述志贺毒素效应物多肽(作为所述细胞靶向分子的组分)保留需要水平的与所述细胞靶向分子的异源CD8+ T-细胞表位-肽货物向至少一种靶细胞类型的MHC I类呈递路径的细胞内递送相关的志贺毒素效应物功能。
通过突变或截短可以改变、减少或消除志贺毒素家族成员的A亚基的细胞毒性。本发明的细胞靶向分子分别包含志贺毒素A亚基效应物多肽区域，其为每个细胞靶向分子提供将所述细胞靶向分子的异源CD8+ T-细胞表位-肽货物递送至至少一种靶细胞类型的MHCI类呈递路径的能力，而与志贺毒素效应物多肽的催化活性无关。如在下述实施例中所示，志贺毒素效应物多肽的催化活性和细胞毒性可以不与提供本发明的细胞靶向分子所需要的其他志贺毒素效应物功能相关，所述细胞靶向分子具有将融合的异源CD8+ T-细胞表位递送到靶细胞类型的MHC I类呈递路径的能力。因此，在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，改造所述志贺毒素效应物多肽组分，以表现出减少的或消除的志贺毒素细胞毒性，诸如，例如，由于相对于野生型志贺毒素A亚基在一个或多个参与酶活性的关键残基中存在按设计残基突变导致。这提供了不通过志贺毒素细胞毒性功能直接杀死靶细胞的本发明的细胞靶向分子。本发明的此类细胞靶向分子缺少细胞毒性的志贺毒素效应物多肽区域，可用于实现下述：1)通过递送异源的CD8+ T-细胞表位-肽用于由靶细胞进行MHC I类呈递而进行细胞杀死，2)由于向靶细胞的MHC I类系统中递送异源的CD8+ T-细胞表位-肽，刺激针对靶细胞的需要的细胞间免疫细胞应答，和/或3)当在靶细胞没有以需要这样做的机制损坏时，用特异性的CD8+ T-细胞表位-肽/MHC I类分子复合物标记靶细胞。
通过突变或截短可以减小或消除志贺毒素家族成员的A亚基的催化和/或细胞毒性活性。在志贺毒素A亚基中对酶活性和/或细胞毒性而言最关键的残基被绘制在以下残基位置：尤其是天冬酰胺-75、酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、精氨酸-176和色氨酸-203等(Di R等人，Toxicon57：525-39(2011))。具体地，含有谷氨酸-E167-至-赖氨酸和精氨酸-176-至-赖氨酸突变的Stx2A的双重突变构建体被完全灭活；而Stx1和Stx2中的许多单一突变显示出细胞毒性的10倍降低。已经表明，酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、酪氨酸-114和色氨酸-203标记的位置对于Stx、Stx1和Stx2的催化活性是重要的(Hovde C等人，Proc Natl Acad Sci USA85：2568-72(1988)；Deresiewicz R等人，Biochemistry 31：3272-80(1992)；Deresiewicz R等人，Mol Gen Genet 241：467-73(1993)；Ohmura M等人，Microb Pathog 15：169-76(1993)；Cao C等人，Microbiol Immunol 38：441-7(1994)；Suhan M，Hovde C，Infect Immun 66：5252-9(1998))。突变谷氨酸-167和精氨酸-170二者消除了Slt-I A1在无细胞核糖体灭活测定中的酶活性(LaPointe P等人，J Biol Chem280：23310-18(2005))。在内质网中使用Slt-I A1的从头表达的另一种方法中，突变谷氨酸-167和精氨酸-170二者消除了在其表达水平上的Slt-I A1片段细胞毒性(LaPointe P等人，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。
此外，将Stx1A截短为1-239或1-240减小其细胞毒性，并且类似地，将Stx2A截短至保守疏水残基减小其细胞毒性。志贺毒素A亚基中对于结合真核核糖体和/或真核核糖体抑制最关键的残基已经绘制在下述残基位置上：尤其是精氨酸-172，精氨酸-176，精氨酸-179，精氨酸-188，酪氨酸-189，缬氨酸-191，和亮氨酸-233(McCluskey A等人，PLoS One 7：e31191(2012))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，与野生型志贺毒素多肽序列相比，从SLT-1A(SEQ ID NO：1)或StxA(SEQ ID NO：2)来源的或包含从其来源的组分的志贺毒素A亚基效应物多肽包含改变，诸如，例如，下述氨基酸残基置换中的一个或多个：位置75处的天冬酰胺，位置77处的酪氨酸，位置114处的酪氨酸，位置167处的谷氨酸，位置170处的精氨酸，位置176处的精氨酸和/或位置203处的色氨酸的置换。对于技术人员而言，基于现有技术，这种置换的例子将是已知的，诸如位置75处的天冬酰胺置换为丙氨酸、位置77处的酪氨酸置换为丝氨酸、位置114处的酪氨酸置换为丙氨酸、位置167处的谷氨酸置换为天冬氨酸、位置170处的精氨酸置换为丙氨酸、位置176处的精氨酸置换为赖氨酸、和/或位置203处的色氨酸置换为丙氨酸。增强或减小志贺毒素A亚基效应物多肽酶活性和/或细胞毒性的其他突变是在本发明范围内，且可以使用本文中公开的众所周知的技术和测定来确定。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或其蛋白性组分包含一种或多种翻译后修饰，诸如，例如，磷酸化，乙酰化，糖基化，酰胺化，羟基化，和/或甲基化(参见，例如，Nagata K等人，Bioinformatics 30：1681-9(2014))。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，可以突变、插入或缺失一个或多个氨基酸残基，以增加所述志贺毒素效应物多肽区域的酶活性，只要所述细胞靶向分子能够将其异源的CD8+ T-细胞表位-肽货物递送至靶细胞的MHC I类呈递路径。例如，将Stx1A中的残基位置丙氨酸-231突变成谷氨酸增加其体外酶活性(Suhan M，Hovde C，Infect Immun66：5252-9(1998))。
本发明的细胞靶向分子可以任选地缀合到一种或多种另外的试剂上，所述试剂可以包括本领域已知的治疗试剂和/或诊断试剂，包括本文所述的此类试剂。
V.本发明的细胞靶向分子的生产、制备和纯化
使用本领域技术人员众所周知的技术可以生产本发明的细胞靶向分子。例如，通过标准合成方法、通过使用重组表达系统或通过任意其他合适的方法，可以制备本发明的细胞靶向分子和/或其蛋白组分。因而，可以以许多方式合成本发明的某些细胞靶向分子及其蛋白组分，所述方式包括，例如，包括以下步骤的方法：(1)使用标准固相或液相方法(分步地或通过片段组装)来合成多肽或蛋白的多肽组分，并且分离和纯化最终的多肽或蛋白化合物产物；(2)在宿主细胞中表达编码本发明的细胞靶向分子的多肽或多肽组分的多核苷酸，并且从宿主细胞或宿主细胞培养物中回收表达产物；或(3)进行编码本发明的细胞靶向分子的多肽或多肽组分的多核苷酸的无细胞体外表达，并且回收表达产物；或者通过(1)、(2)或(3)的方法的任意组合以获得肽组分的片段，随后将所述片段结合(例如连接)以获得肽组分，并且回收所述肽组分。例如，使用偶联剂，诸如，例如，N，N’-二环己基碳二亚胺和N-乙基-5-苯基-异噁唑鎓-3′-磺酸盐(Woodward的试剂K)，可以将多肽和/或肽组分连接在一起。
可能优选的是，借助于固相或液相肽合成来合成细胞靶向分子或本发明的细胞靶向分子的蛋白性组分。可以适当地通过标准合成方法生产本发明的细胞靶向分子及其组分。因而，可以通过例如这样的方法来合成肽：所述方法包括通过标准固相或液相方法、分步地或通过片段组装来合成肽，并且将最终的肽产物分离并纯化。在该背景下，可以参考WO1998/11125，或尤其是Fields G等人，Principles andPractice of Solid-Phase PeptideSynthesis(Synthetic Peptides，Grant G，编，Oxford University Press，U.K.，第2版，2002)以及其中的合成实施例。
使用本领域众所周知的重组技术，可以制备(生产和纯化)本发明的细胞靶向分子。一般而言，通过培养用包含编码多核苷酸的载体转化或转染的宿主细胞并且从细胞培养物中回收蛋白来制备所述蛋白的方法记载于，例如Sambrook J等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，U.S.，1989)；Dieffenbach C等人，PCR Primer：ALaboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press，N.Y.，U.S.，1995)中。任意合适的宿主细胞可以用于生产本发明的靶向细胞的蛋白或本发明的细胞靶向分子的蛋白性组分。宿主细胞可以是被一种或多种表达载体稳定地或瞬时地转染、转化、转导或感染的细胞，所述表达载体驱动本发明的细胞靶向分子和/或其蛋白组分的表达。另外，可以如下生产本发明的细胞靶向分子：修饰编码本发明的靶向细胞的蛋白或本发明的细胞靶向分子的蛋白性组分的多核苷酸，这会导致改变一个或多个氨基酸或删除或插入一个或多个氨基酸，以便实现期望的性能，诸如改变的细胞毒性、改变的细胞生长抑制作用和/或改变的血清半衰期。
存在多种表达系统可供选择来生产本发明的细胞靶向分子。例如，用于表达本发明的靶向细胞的蛋白的宿主生物包括：原核生物，诸如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，真核细胞，诸如酵母和丝状真菌(如酿酒酵母(S.cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、泡盛曲霉(A.awamori)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis))，藻类(如莱茵衣藻(C.reinhardtii))，昆虫细胞系，哺乳动物细胞(如CHO细胞)，植物细胞系，和真核生物诸如转基因植物(如拟南芥(A.thaliana)和本赛姆氏烟草(N.benthamiana))。
因此，本发明也提供了根据以上所述方法并且使用以下物质生产本发明的细胞靶向分子的方法：(i)编码本发明的分子的全部或部分或本发明的细胞靶向分子的多肽组分的多核苷酸，(ii)包含至少一种本发明的多核苷酸的表达载体，所述多核苷酸当引入合适的宿主细胞或无细胞表达系统中时能够编码本发明的分子或其多肽组分的部分或全部，和/或(iii)包含本发明的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。
当使用重组技术在宿主细胞或无细胞系统中表达蛋白时，有利的是，从其他组分诸如宿主细胞因子中分离(或纯化)出期望的蛋白，从而获得高纯度的或基本均质的制品。纯化可以通过本领域众所周知的方法完成，诸如离心技术、萃取技术、层析和分级分离技术(例如，通过凝胶过滤的尺寸分离、通过离子交换柱的电荷分离、疏水相互作用层析法、反相层析法、在硅胶或阳离子交换树脂诸如DEAE等上的层析法、层析聚焦、和蛋白A琼脂糖层析法，以除去污染物)，以及沉淀技术(例如乙醇沉淀或硫酸铵沉淀)。任何数量的生物化学纯化技术可以用于增加本发明的细胞靶向分子的纯度。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子可以任选地以同型多聚体形式(例如两个或更多个相同的本发明的细胞靶向分子的稳定复合物)或以异多聚体形式(例如两个或更多个不同的本发明的细胞靶向分子的稳定复合物)纯化。
在下面的实施例中描述了用于生产本发明的细胞靶向分子或其多肽组分的方法的非限制性实施例，以及本发明的示例性的本发明的细胞靶向分子的生产的具体的、但是非限制性的方面。
VI.包含本发明的细胞靶向分子的药物组合物和诊断组合物
本发明提供了细胞靶向分子，其单独地或与一种或多种另外的治疗剂组合地在药物组合物中用于治疗或预防以下更详细地描述的病患、疾病、病症或症状(例如癌症、恶性肿瘤、非恶性肿瘤、生长异常、免疫病症和微生物感染)。本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的细胞靶向分子或根据本发明的其药学上可接受的盐或溶剂合物，以及至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。在某些实施方案中，本发明的药物组合物可以包含为同型多聚体和/或异多聚体的本发明的细胞靶向分子。本发明的药物组合物可用在治疗、改善、或预防以下更详细地描述的疾病、病患、病症或症状的方法中。预期每种这样的疾病、病患、病症或症状是就根据本发明的药物组合物的应用而言的单独实施方案。本发明还提供了用在至少一种如以下更详细地描述的根据本发明的治疗方法中的药物组合物。
本文中使用的术语“患者”和“受试者”可互换使用以表示表现出至少一种疾病、病症或病患的症状、征象和/或指征的任何生物体，通常是脊椎动物，诸如人类和动物。这些术语包括哺乳动物，诸如灵长类动物、家畜动物(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)、伴侣动物(例如猫、狗等)和实验动物(例如小鼠、兔、大鼠等)的非限制性例子。
本文中使用的“治疗”或“处理”及其语法变体表示用于获得有益的或期望的临床结果的方案。该术语可以表示延缓病患、病症或疾病的发作或发展速度，减轻或缓解与其有关的症状，产生病患的全部或部分消退，或者以上任何的一些组合。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括、但不限于：症状的减轻或缓解、疾病程度的降低、疾病状态的稳定(例如不恶化)、疾病进展的推迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及康复(无论是部分的还是完全的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”或“处理”还可以是指相对于在不接受治疗的情况下预期的存活时间延长存活。需要治疗的受试者(例如人)因此可以是已经罹患所讨论的疾病或病症的受试者。术语“治疗”或“处理”包括相对于不存在治疗的情况抑制或减轻病理学状态或症状的严重程度的增加，并且不一定意味着暗示相关疾病、病症或病患的完全停止。关于肿瘤和/或癌症，治疗包括总肿瘤负荷和/或单个肿瘤大小的减小。
本文中使用的术语“防止”、“预防”及其语法变体表示用于预防病患、疾病或病症的发展或者改变病患、疾病或病症的病理学的方案。因此，“预防”可以表示预防或防止的措施。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括、但不限于：预防或减慢疾病的症状、进展或发展，无论是否是可检测的还是不可检测的。需要预防的受试者(例如人)因此可以是尚未罹患所讨论的疾病或病症的受试者。术语“预防”包括相对于不存在治疗的情况减慢疾病的发作，并且不一定意图暗示相关疾病、病症或病患的永久性预防。因此病患的“预防”或“防止”在某些上下文中可以表示降低发展病患的风险，或者预防或延迟与该病患有关的症状的发展。
本文中使用的“有效量”或“治疗有效量”是在受试者中产生至少一种期望的治疗效果的组合物(例如治疗组合物或试剂)的量或剂量，诸如预防或治疗靶病患或有益地缓解与该病患有关的症状。最合乎需要的治疗有效量是将会产生由本领域技术人员为有此需要的给定受试者选择的具体治疗的期望效力的量。该量将随技术人员理解的多种因素变化，包括、但不限于，治疗组合物的特征(包括活性、药代动力学、药效动力学和生物利用度)，受试者的生理条件(包括年龄、性别、疾病类型、疾病阶段、一般身体状况、对给定剂量的响应性、和药物的类型)，制剂中一种或多种药学上可接受的载体的性质，和施用途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过例行实验确定治疗有效量，即通过监测受试者对组合物的施用的响应并且相应地调节剂量(参见例如Remington：The Science and Practice ofPharmacy(Gennaro A，编，Mack Publishing Co.，Easton，PA，U.S.，第19版，1995))。
本发明的诊断组合物包含本发明的细胞靶向分子和一种或多种检测促进剂。各种检测促进剂是本领域已知的，诸如同位素、染料、比色测量剂、反差增强剂、荧光剂、生物发光剂和磁性剂。这些试剂可以在任意合适的位置掺入在本发明的细胞靶向分子中。检测促进剂的掺入可以是通过本发明的蛋白的氨基酸残基，或通过本领域已知的某些连接类型，包括通过接头和/或螯合剂。检测促进剂的掺入是以这样的方式：在筛选、测定、诊断操作和/或成像技术中，能够检测诊断组合物的存在。
当生产或制备本发明的诊断组合物时，本发明的细胞靶向分子可以直接地或间接地连接至一种或多种检测促进剂。存在众多技术人员已知的检测促进剂，其可以可操作地与本发明的多肽或细胞靶向分子链接，用于信息收集方法，诸如用于生物体的疾病、病症或病患的诊断和/或预后应用(参见，例如，Cai W等人，JNuclMed48：304-10(2007)；Nayak T，Brechbiel M，Bioconjug Chem 20：825-41(2009)；Paudyal P等人，Oncol Rep 22：115-9(2009)；Qiao J等人，PLoS ONE 6：e18103(2011)；Sano K等人，Breast Cancer Res 14：R61(2012))。例如，检测促进剂包括增强图像的造影剂，诸如荧光染料(例如Alexa680、吲哚菁绿和Cy5.5)、同位素和放射性核素，诸如11C、13N、15O、18F、32P、51Mn、52mMn、52Fe、55Co、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、72As、73Se、75Br、76Br、82mRb、83Sr、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、110In、111In、120I、123I、124I、125I、131I、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、177Lu、186Re、188Re和223R；顺磁离子，诸如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)；金属，诸如镧(III)、金(III)、铅(II)和铋(III)；超声-反差增强剂，诸如脂质体；不透射线的试剂，诸如钡、镓和铊化合物。通过使用中间官能团，诸如螯合剂如2-苄基DTPA、PAMAM、NOTA、DOTA、TETA、其类似物和前述任一种的功能等同物，可以直接地或间接地掺入检测促进剂(参见Leyton J等人，Clin Cancer Res 14：7488-96(2008))。
存在众多技术人员已知的用于将各种检测促进剂掺入、附加和/或缀合至蛋白或分子的蛋白性组分(特别是免疫球蛋白和免疫球蛋白来源的结构域)的标准技术(Wu A，Methods 65：139-47(2014))。类似地，本领域中存在技术人员已知的众多成像方案，诸如在医学领域中常用的非侵袭性体内成像技术，例如：计算机体层摄影术成像(CT扫描)、光学成像(包括直接的、荧光的和生物发光的成像)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机体层摄影术(SPECT)、超声和x-射线计算机体层摄影术成像(关于综述，参见Kaur S等人，CancerLett 315：97-111(2012))。
VII.包含本发明的细胞靶向分子的药物组合物和/或诊断组合物的生产或制备
本发明的细胞靶向分子中的任一种的药学上可接受的盐或溶剂合物同样地是在本发明范围内。
术语“溶剂合物”在本发明的上下文中表示在溶质(例如在本发明中，根据本发明的细胞靶向分子或其药学上可接受的盐)和溶剂之间形成的确定化学计量的复合物。在这方面的溶剂可以是，例如，水、乙醇或另一种药学上可接受的、通常为小分子的有机物质，例如，但不限于，乙酸或乳酸。当所讨论的溶剂是水时，这样的溶剂合物通常被称为水合物。
可以将本发明的细胞靶向分子或其盐配制成为了贮存或施用而制备的药物组合物，所述药物组合物通常包含在药学上可接受的载体中的治疗有效量的本发明的化合物或其盐。术语“药学上可接受的载体”包括任何标准的药物载体。用于治疗用途的药学上可接受的载体是制药领域中众所周知的，并且描述于例如Remington’s PharmaceuticalSciences(Mack Publishing Co.(A.Gennaro，编，1985))中。本文中使用的“药学上可接受的载体”包括任意的和所有的生理上可接受的(即相容的)溶剂、分散介质、包衣剂、抗微生物剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体或稀释剂包括在适合用于口服、直肠、鼻或胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内、真皮内和透皮)施用的制剂中使用的那些。示例性的药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。可以在本发明的药物组合物中采用的合适的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、和它们的合适混合物，植物油诸如橄榄油，以及可注射的有机酯诸如油酸乙酯。可以维持适当的流动性，例如，通过使用包衣材料如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂。在某些实施方案中，所述载体适合用于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于所选择的施用途径，可以将本发明的蛋白或其他药物组分包被在物质中，所述物质意图保护化合物免于当通过特定施用途径施用给患者时所述活性蛋白可能遇到的低pH和其他天然灭活条件的作用。
本发明的药物组合物的制剂可以方便地以单位剂型呈现，并且可以通过药学领域众所周知的任何方法制备。以这种形式，将组合物分入含有适当量的活性组分的单位剂量中。单位剂型可以是包装的制剂，含有离散量的制剂的包装，例如，小包片剂、胶囊剂、和在小瓶或安瓿瓶中的粉剂。单位剂型还可以是胶囊剂、扁囊剂、或片剂本身，或者它可以是适当数量的这些包装形式中的任一种。它可以以单次剂量可注射形式例如以笔的形式提供。可以为任意合适的施用途径和方式配制组合物。皮下或透皮施用模式可以特别适用于本文描述的药物组合物和治疗分子。
本发明的药物组合物还可以含有辅料，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌操作，和通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等，可以确保防止微生物的存在。组合物中的等渗剂，诸如糖、氯化钠等，也可能是合乎需要的。此外，通过包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射药物形式的延长吸收。
本发明的药物组合物还任选地包括药学上可接受的抗氧化剂。示例性的药学上可接受的抗氧化剂是水溶性的抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；油溶性的抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴香醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDrA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的不同的细胞靶向分子或前述任一种的酯、盐或酰胺中的一种或组合，以及至少一种药学上可接受的载体。
治疗组合物通常在制造和储存条件下是无菌和稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳液、脂质体、或适合高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，包括，例如，水、醇诸如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇)、或任何合适的混合物。可以维持适当的流动性，例如，通过使用包衣诸如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒尺寸，以及通过本领域众所周知的制剂化学使用表面活性剂。在某些实施方案中，等渗剂(例如糖类，多元醇诸如甘露醇、山梨醇，或氯化钠)可以是在组合物中合乎需要的。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。
用于真皮内或皮下应用的溶液或混悬液通常包括以下一种或多种：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和张度调节剂，诸如，例如，氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱(诸如盐酸或氢氧化钠)或者含有柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐等的缓冲液调节pH。这样的制品可以封装在安瓿瓶、一次用弃注射器或由玻璃或塑料制成的多次剂量小瓶中。
可以如下制备无菌注射溶液：将所需量的本发明的细胞靶向分子掺入含有上述成分中的一种或组合(当需要时)的适当溶剂中，随后灭菌微滤。通过将活性化合物掺入含有分散介质和其他成分(诸如上述的那些)的无菌媒介物中，可以制备分散体。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干法)，其产生活性成分以及来自其无菌过滤溶液的任何另外期望成分的粉末。
当将治疗有效量的本发明的细胞靶向分子设计为通过例如静脉内、皮肤或皮下注射来施用时，结合剂将呈无热原的、胃肠外可接受的水溶液的形式。考虑到适当的pH、等渗性、稳定性等，用于制备胃肠外可接受的蛋白溶液的方法是在本领域技术内。除了结合剂之外，用于静脉内、皮肤、或皮下注射的优选药物组合物将含有等渗媒介物诸如氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、含有乳酸盐的林格氏注射液、或本领域已知的其他媒介物。本发明的药物组合物还可以含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂、或本领域技术人员众所周知的其他添加剂。
如本文别处所述，本发明的细胞靶向分子或其组合物(例如药物或诊断组合物)可以用保护所述细胞靶向分子免于快速释放的载体来制备，诸如受控释放制剂，包括植入物、透皮贴剂、和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多用于制备这样的制剂的方法被授予专利或是本领域技术人员通常已知的(参见例如Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems(Robinson J，编，Marcel Dekker，Inc.，NY，U.S.，1978)。
在某些实施方案中，可以将本发明的组合物(例如药物或诊断组合物)配制成确保在体内的期望分布。例如，血脑屏障排除许多大的和/或亲水的化合物。为了将本发明的治疗性细胞靶向分子或组合物靶向至特定体内位置，可以将它配制在例如脂质体中，所述脂质体可以包含被选择性地运输进特定细胞或器官中的一个或多个部分，从而增强靶向的药物递送。示例性的靶向部分包括叶酸盐或生物素；甘露糖苷；抗体；表面活性蛋白A受体；p120联蛋白等。
药物组合物包括被设计成用作植入物或微粒系统的胃肠外制剂。植入物的例子是由聚合的或疏水的组分(诸如乳剂、离子交换树脂和可溶性的盐溶液)组成的贮库制剂。微粒系统的例子是微球、微粒、纳米囊、纳米球和纳米颗粒(参见，例如，Honda M等人，IntJNanomedicine 8：495-503(2013)；Sharma A等人，BiomedRes Int 2013：960821(2013)；Ramishetti S，Huang L，Ther Deliv 3：1429-45(2012))。使用对离子敏感的聚合物，诸如，例如，脂质体、polaxamer 407和羟磷灰石，可以制备控释制剂。
VIII.本发明的多核苷酸、表达载体和宿主细胞
除了本发明的细胞靶向分子及其多肽组分以外，编码本发明的多肽和细胞靶向分子或它们的功能部分的多核苷酸也被包括在本发明范围内。术语“多核苷酸”等同于术语“核酸”，其中的每一个包括以下的一个或多个：脱氧核糖核酸(DNA)的聚合物、核糖核酸(RNA)的聚合物、使用核苷酸类似物产生的这些DNA或RNA的类似物、以及它们的衍生物、片段和同源物。本发明的多核苷酸可以是单链的、双链的或三链的。这样的多核苷酸被具体公开为包括所有能够编码示例性蛋白的多核苷酸，例如，考虑已知在RNA密码子的第三位中可容忍的但是与不同RNA密码子编码相同的氨基酸的摆动(wobble)(参见Stothard P，Biotechniques 28：1102-4(2000))。
在一个方面，本发明提供了多核苷酸，其编码本发明的细胞靶向分子(例如，融合蛋白)或其多肽片段或衍生物。所述多核苷酸可以包括例如这样的核酸序列：其编码的多肽与包含所述蛋白的氨基酸序列之一的多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多的同一性。本发明还包括这样的多核苷酸：其包含在严谨条件下与编码本发明的细胞靶向分子或其多肽片段或衍生物的多核苷酸杂交的核苷酸序列，或者任何这样的序列的反义物或互补物。
本发明的细胞靶向分子的衍生物或类似物尤其包括这样的多核苷酸(或多肽)分子：其具有与本发明的多核苷酸、细胞靶向分子或细胞靶向分子的多肽组分基本上同源的区域，例如，与相同大小的多核苷酸或多肽序列具有至少约45％、50％、70％、80％、95％、98％或甚至99％同一性(具有80-99％的优选同一性)，或当与比对序列进行对比时，其中所述比对通过本领域已知的计算机同源性程序进行。一种示例性的程序是使用默认设置的GAP程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8for UNIX，GeneticsComputer Group，University Research Park，Madison，WI，U.S.)，其使用Smith T，Waterman M，Adv Appl Math 2：482-9(1981)的算法。还包括能够在严谨条件下与编码本发明的细胞靶向分子的序列的互补物杂交的多核苷酸(参见，例如，Ausubel F等人，CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons，New York，NY，U.S.，1993))，以及以下。严谨条件是本领域技术人员已知的，并且可以在例如Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley&Sons，NY，U.S.，Ch.Sec.6.3.1-6.3.6(1989))中找到。
本发明还提供了包含本发明范围内的多核苷酸的表达载体。使用本领域众所周知的材料和方法，可以将能够编码本发明的细胞靶向分子或其多肽组分的多核苷酸插入已知载体(包括细菌质粒、病毒载体和噬菌体载体)中以产生表达载体。这样的表达载体将包括支持在任何选择的宿主细胞或无细胞表达系统(例如，pTxb1和pIVEX2.3)内生产本发明的预见到的细胞靶向分子所必需的多核苷酸。用于与特定类型的宿主细胞或无细胞表达系统一起使用的、包含特定多核苷酸的表达载体是本领域普通技术人员众所周知的，可以使用例行实验确定，或者可以购买。
本文中使用的术语“表达载体”表示包含一个或多个表达单元的直线或环形的多核苷酸。术语“表达单元”表示编码目标多肽并且能够提供核酸区段在宿主细胞中的表达的多核苷酸区段。表达单元通常包含均处于可操作构型的转录启动子、编码目标多肽的开放读码框和转录终止子。表达载体含有一个或多个表达单元。因而，在本发明的上下文中，编码本发明的细胞靶向分子(例如，在遗传上与融合在T-细胞表位-肽上的志贺毒素效应物多肽重组的scFv)的表达载体至少包括单个多肽链的表达单元，而包含例如两个或更多个多肽链(例如，一条链包含VL结构域，且第二条链包含与毒素效应物区域连接的VH结构域)的蛋白至少包括两个表达单元，所述蛋白的两条多肽链中的每一个具有一个表达单元。对于本发明的多链的靶向细胞的蛋白的表达，每个多肽链的表达单元还可以单独地包含在不同的表达载体上(例如，可以用已经在其中引入每条多肽链的表达载体的单个宿主细胞实现表达)。
能够指导多肽和蛋白的瞬时或稳定表达的表达载体是本领域众所周知的。表达载体通常包括，但不限于以下一个或多个：异源信号序列或肽、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列，其中的每一个均为本领域众所周知的。任选的调节控制序列、整合序列、和可以采用的可用标记物是本领域已知的。
术语“宿主细胞”表示可以支持表达载体的复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞诸如大肠杆菌(E.coli)，或者真核细胞(例如，酵母、昆虫、两栖动物、鸟或哺乳动物细胞)。使用本领域已知的标准技术，可以实现包含本发明的多核苷酸或能够生产本发明的细胞靶向分子的宿主细胞系的创建和分离。
在本发明范围内的细胞靶向分子可以是如下产生的本文描述的多肽和蛋白的变体或衍生物：通过改变一个或多个氨基酸或者删除或插入一个或多个氨基酸(这可以使它更适合实现期望的性能，诸如被宿主细胞更佳地表达)，修饰编码多肽和/或蛋白的多核苷酸。
IX.递送装置和试剂盒
在某些实施方案中，本发明涉及一种装置，其包含用于递送给有此需要的受试者的本发明的一种或多种组合物，诸如药物组合物。因而，包含本发明的一种或多种化合物的递送装置可以用于通过多种递送方法给患者施用本发明的组合物，所述递送方法包括：静脉内、皮下、肌肉内或腹膜内注射；口服施用；透皮施用；肺或透粘膜施用；通过植入物、渗透泵、筒或微量泵施用；或通过本领域技术人员已知的其他方式。
试剂盒也在本发明范围内，所述试剂盒包含根据本发明的至少一种组合物和任选的包装和使用说明书。试剂盒可用于药物施用和/或诊断信息收集。本发明的试剂盒可以任选地包含至少一种另外的试剂(例如，标准品、标志物等)。试剂盒通常包括标签，所述标签指示试剂盒的内容物的预期用途。所述试剂盒还可以包含用于检测在样品中或在受试者中的细胞类型(例如，肿瘤细胞)或用于诊断患者是否属于对利用本发明的细胞靶向分子或其组合物或如本文中所述的本发明的有关方法的治疗策略做出应答的群体的试剂和其他工具。
X.使用本发明的细胞靶向分子和其药物组合物和/或诊断组合物的方法
通常，本发明的一个目的是提供药理学上有活性的试剂、以及包含它们的组合物，它们可以用于预防和/或治疗疾病、病症和病患，诸如某些癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症、或在本文中提及的其他病理学状况。因此，本发明提供了使用本发明的细胞靶向分子、药物组合物和诊断组合物的方法，其用于将CD8+ T-细胞表位-肽递送到靶细胞的MHC I类呈递路径，靶向杀死特定的细胞，用特异性的pMHC I标记靶细胞的细胞表面和/或靶细胞特定的内部区室，用于收集诊断信息，和用于治疗本文所述的疾病、病症和病患。例如，本发明的方法可以用作免疫疗法以预防或治疗癌症、癌症起始、肿瘤起始、转移和/或癌症疾病复发。
具体地，本发明的一个目的是提供这样的药理学上有活性的试剂、组合物和/或方法，其与本领域目前已知的试剂、组合物和/或方法相比具有某些优点。因此，本发明提供了使用特征在于特定蛋白序列的细胞靶向分子及其组合物的方法。例如，SEQ ID NOs：1-62和71-115所示的多肽序列中的任一个可以具体地用作在下述方法中或在技术人员已知的使用使用细胞靶向分子的任一种方法中的细胞靶向分子的组分，诸如，例如，记载于下述的各种方法：WO 2014/164680，WO 2014/164693，WO 2015/138435，WO 2015/138452，WO 2015/113005，WO 2015/113007，WO 2015/191764，US2015/0259428，和US2014/965882。
本发明提供了将CD8+ T-细胞表位-肽递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞在体外或体内与本发明的细胞靶向分子或药物组合物接触的步骤。在某些其他实施方案中，本发明的细胞靶向分子在接触步骤后在体外细胞培养物中或在活脊索动物的体内引起免疫细胞(诸如，例如，CD8+ T-细胞和/或CTL)对所述细胞的细胞间接合。生物体内靶细胞对CD8+ T-细胞表位的呈递可以导致针对靶细胞和/或其在生物体内的一般位置的稳健的免疫应答的激活。因此，用于呈递的CD8+ T-细胞表位的靶向递送可以用作在治疗方案和/或接种策略过程中激活CD8+ T-细胞应答的机制。
本发明提供将CD8+ T-细胞表位-肽递送至脊索动物细胞的MHC I类呈递路径的方法，所述方法包括使所述细胞在体外或体内与本发明的细胞靶向分子、药物组合物和/或诊断组合物接触的步骤。在某些其他实施方案中，本发明的细胞靶向分子在接触步骤后在体外细胞培养物中或在脊索动物的体内引起免疫细胞(诸如，例如，CD8+ T-细胞和/或CTL)对所述细胞的细胞间接合。
使用本发明的细胞靶向分子将CD8+ T-细胞表位-肽递送至靶细胞的MHC I类呈递路径可以用于诱导所述靶细胞将与MHC I类分子结合的表位-肽呈递在细胞表面上。在脊索动物中，MHC I类复合物对免疫原性的CD8+ T-细胞表位的呈递可以使呈递细胞对CTL-介导的细胞溶解的杀死敏感，诱导免疫细胞改变微环境，并且信号传导以募集更多的免疫细胞到所述脊索动物内的靶细胞部位。因此，本发明的细胞靶向分子及其组合物可以用于在一种或多种细胞与本发明的细胞靶向分子接触时杀死特定的细胞类型，和/或用于刺激在脊索动物中的免疫应答。
通过将MHC I类表位(诸如，例如，从已知的病毒抗原)改造成细胞靶向分子，免疫刺激性抗原的靶向递送和呈递可以用于利用并指导脊索动物免疫细胞(例如，在体外)和/或在体内脊索动物免疫系统的有益功能。这可以通过将所述细胞靶向分子外源施用至细胞外空间(诸如，例如，血管腔)然后允许所述细胞靶向分子找到靶细胞、进入所述细胞并细胞内递送其CD8+ T-细胞表位货物而实现。本发明的细胞靶向分子的这些CD8+ T-细胞表位递送和MHC I类呈递功能的应用是巨大的。例如，将CD8+表位递送至细胞和所述细胞对所递送的表位的MHC I类呈递可以引起CD8+效应物T-细胞的细胞间接合，并且可以导致对靶细胞的CTL杀死和/或分泌免疫刺激性细胞因子。
本发明的某些实施方案是免疫治疗方法，所述方法包括下述步骤：向有此需要的患者施用本发明的细胞靶向分子和/或药物组合物。在某些其他实施方案中，所述免疫治疗方法是通过刺激患者中的有益免疫应答而治疗疾病、病症和/或病患(诸如，例如，癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症和/或微生物感染)的方法。
本发明的某些实施方案是治疗癌症的免疫治疗方法，所述方法包括向有此需要的患者施用本发明的本发明的细胞靶向分子和/或药物组合物的步骤。
本发明提供涉及将CD8+ T-细胞表位-肽递送至脊索动物中的靶细胞中并且引起免疫应答的免疫治疗方法，所述方法包括包括向所述脊索动物施用本发明的细胞靶向分子或药物组合物的步骤。对于某些其他实施方案，免疫应答是选自由下述组成的组的细胞间免疫细胞应答：CD8+免疫细胞分泌细胞因子，靶细胞中CTL诱导的生长停滞，CTL诱导的靶细胞坏死，CTL诱导的靶细胞凋亡，组织部位的非特异性细胞死亡，分子间表位扩展，破坏针对恶性细胞类型的免疫学耐受性，和脊索动物获得针对恶性细胞类型的持久的免疫性(参见，例如，Matsushita H等人，Cancer Immunol Res 3：26-36(2015))。这些免疫应答可以使用技术人员已知的技术进行检测和/或定量。例如，CD8+免疫细胞可以释放免疫刺激性细胞因子，诸如，例如，IFN-γ，肿瘤坏死因子α(TNFα)，巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)，和白介素，如IL-17，IL-4，IL-22，和IL-2(参见，例如，下述实施例；Seder R等人，Nat Rev Immunol 8：247-58(2008))。IFN-γ可以增加MHC I类分子表达并且使赘生性细胞对CTL-介导的细胞杀死敏感(VlkováV等人，Oncotarget 5：6923-35(2014))。炎性细胞因子可以刺激携带针对细胞因子释放细胞的不相关的TCR特异性的旁观T-细胞(参见，例如，Tough D等人，Science272：1947-50(1996))。激活的CTL可以不加选择地杀死邻近表位-MHC I类复合物呈递细胞的细胞，而与邻近的细胞呈递的肽-MHC I类复合物全体成员无关(Wiedemann A等人，ProcNatl AcadSci USA 103：10985-90(2006))。因此，对于某些其他实施方案，所述免疫应答是选自由下述组成的组的细胞间免疫细胞应答：由免疫细胞介导的邻近的细胞杀死，其中所述邻近的细胞不展示任意由本发明的细胞靶向分子递送的CD8+ T-细胞表位-肽，并且与同被杀死的邻近细胞物理连接的细胞靶向分子结合区的任意细胞外靶标生物分子的存在无关。
在CTL-溶解的细胞(不管是靶细胞还是仅在靶细胞邻近处的细胞)中非自身表位的存在可以被免疫系统作为外来物识别并靶向，包括通过分子间表位扩展的机制识别靶细胞中的非自身表位(参见McCluskey J等人，Immunol Rev 164：209-29(1998)；VanderlugtC等人，Immunol Rev 164：63-72(1998)；Vanderlugt C，Miller S，Nat Rev Immunol 2：85-95(2002))。邻近的细胞可以包括非赘生性细胞，诸如，例如，癌症相关的成纤维细胞，间质干细胞，肿瘤相关的内皮细胞，和不成熟的骨髓来源的抑制细胞。例如，癌细胞可以在编码区携带平均25-500个非同义的突变(参见，例如，Fritsch E等人，Cancer Immunol Res 2：522-9(2014))。癌症驱动突变和非驱动突变是癌症细胞的突变布局的一部分，其可以每个细胞提供多个非自身表位，并且平均地肿瘤可以具有十个以上非自身表位(参见，例如，Segal N等人，Cancer Res 68：889-92(2008))。例如，肿瘤蛋白p53的突变形式可以包含非自身表位(参见，例如，Vigneron N等人，Cancer Immun 13：15(2013))。另外，非自身表位(诸如突变的自身蛋白)的存在可能导致产生对这些新表位特异性的记忆细胞。由于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案可能增加在被靶向的组织部位的树突细胞取样，可能增加具有细胞内抗原的免疫系统的交叉致敏的可能性(参见，例如，Chiang C等人，Expert OpinBiol Ther 15：569-82(2015))。因此，作为异源的CD8+ T-细胞表位的细胞靶向分子递送和所述表位的MHC I类呈递的结果，包含非自身表位的靶细胞和其他邻近的细胞可能被免疫系统排斥，包括通过与本发明的细胞靶向分子递送的表位不同的非自身表位。例如，此类机制可能诱导针对不表达所述细胞靶向分子结合区的细胞外靶标生物分子的肿瘤细胞的抗肿瘤免疫性。
涉及细胞因子分泌和/或T-细胞激活的免疫应答可以导致脊索动物内部位的免疫微环境的调节。本发明的方法可以用于改变脊索动物内组织部位的微环境，从而改变免疫细胞上的调节性稳态，所述免疫细胞诸如，例如，肿瘤相关的巨噬细胞，T细胞，T辅助细胞，抗原呈递细胞，和天然杀伤细胞。
对于某些实施方案，本发明的方法可以用于增强脊索动物受试者中的抗肿瘤细胞免疫性和/或在脊索动物中产生持久的抗肿瘤免疫性，诸如，例如，由于发展基因T细胞和/或肿瘤微环境的改变。
本发明的细胞靶向分子或其药物组合物的某些实施方案可以用于用非自身CD8+T-细胞表位-肽呈递细胞“播种”脊索动物内的部位，从而刺激免疫系统以更大的强度保卫所述部位和/或减轻免疫抑制信号，例如，诱导无反应性的信号。在本发明的这一“播种”方法的某些其他的实施方案中，所述部位是肿瘤块或感染的肿瘤部位。在本发明的这一“播种”方法的某些其他的实施方案中，所述非自身的CD8+ T-细胞表位-肽选自由下述组成的组：没有已经被所述细胞靶向分子的靶细胞呈递的肽，不在靶细胞表达的任意蛋白中存在的肽，不在靶细胞的蛋白质组或转录体组中存在的肽，不在要被播种的部位的细胞外微环境中存在的肽，和不在肿瘤块或要被靶向的感染组织部位中存在的肽。
“播种”方法起作用用一种或多种MHC I类呈递的CD8+ T-细胞表位(pMHC I)标记脊索动物内的一种或多种靶细胞，用于通过免疫细胞进行细胞间识别和激活下游免疫应答。通过利用本发明的细胞靶向分子的细胞内在化的细胞内按路线发送和MHC I类表位递送功能，展现所递送的CD8+ T-细胞表位的靶细胞能够被脊索动物免疫细胞的免疫监视机制识别，并且导致CD8+ T-细胞(诸如，例如，CTL)对呈递靶细胞的细胞间接合。使用本发明的细胞靶向分子的这种“播种”方法可以刺激免疫细胞介导的靶细胞杀死，而与它们是否呈递细胞靶向分子-递送的T-细胞表位无关，诸如，例如，由于分子间表位扩展和/或对基于内源抗原(与人工递送的表位相反)的呈递的针对靶细胞的免疫耐受性的破坏。基于被首次用于免疫的T细胞识别为外来物和/或已经被记忆T细胞识别为非自身的(即，回忆抗原)的表位的检测，通过诱导针对所播种的微环境内(诸如，例如，肿瘤块或感染的组织部位)的细胞的适应性免疫应答，使用本发明的细胞靶向分子的这种“播种”方法可以提供疫苗接种效应(新表位暴露)和/或疫苗接种加强剂量效应(表位再暴露)。这种“播种”方法还可以诱导脊索动物内针对靶细胞群、肿瘤块、患病的组织部位和/或被感染的组织部位的免疫耐受性的破坏(周围的或系统的)。
本发明涉及用一种或多种抗原性和/或免疫原性CD8+ T-细胞表位接种脊索动物内的部位的某些方法可以与施用免疫佐剂组合，不管是局部施用还是系统施用，以刺激针对某些抗原的免疫应答，诸如，例如，共同施用本发明的组合物与一种或多种免疫佐剂，如细胞因子、细菌产物或植物皂苷。可以适于用在本发明的方法中的免疫佐剂的其他实例包括铝盐和油，诸如，例如，明矾，氢氧化铝，矿物油，鲨烯，石蜡油，花生油和硫柳汞(thimerosal)。
本发明的某些方法涉及促进脊索动物中的免疫原交叉呈递和/或首次用于免疫的CD8+ T-细胞的交叉致敏。对于本发明的某些方法，由于本发明的细胞靶向分子引起的靶细胞的死亡和/或死亡方式，发生交叉致敏，从而促进在濒死或死亡的靶细胞内的细胞内抗原对免疫监视机制的暴露。
由于通过本发明的单一细胞靶向分子可以递送多个异源的CD8+ T-细胞表位，本发明的细胞靶向分子的单个实施方案在具有不同MHC I类分子变体的相同物种的不同个体脊索动物中(诸如，例如，在具有不同HLA等位基因的人中)可能是治疗有效的，本发明的某些实施方案的这一能力可以允许在单一细胞靶向分子内组合不同的CD8+ T-细胞表位-肽，基于MHC I类分子多样性和多态性，所述不同的CD8+ T-细胞表位-肽在不同的受试者亚群中具有不同的治疗效力。例如，人MHC I类分子，HLA蛋白，基于遗传祖先在人中是不同的，所述人例如，非洲人种(sub-Saharan)，美国印第安人种，高加索人种，蒙古人种，新几内亚人种和澳大利亚人种，或太平洋岛民。
本发明的包含来自CMV抗原的异源的CD8+ T-细胞表位的细胞靶向分子可以是特别有效的，原因在于，大部分人群具有被致敏与CMV抗原反应的特定的CD8+ T-细胞组合，并且不断地抑制慢性CMV感染，从而在他们的一生内保持是没有症状的。另外，由于在关于CMV的适应性免疫系统中年龄相关的变化，诸如，例如，潜在的更集中的针对CMV的免疫监视，并且如在年纪更大的人中由T-细胞抗原受体全体成员的组成和相对CTL水平所示的，老年人可能甚至更快且更强地与CMV CD8+ T-细胞表位反应(参见，例如，Koch S等人，Ann N YAcad Sci 1114：23-35(2007)；Vescovini R等人，J Immunol 184：3242-9(2010)；Cicin-Sain L等人，J Immunol 187：1722-32(2011)； T等人，Front Immunol 4：271(2013)；Pawelec G，Exp Gerontol 54：1-5(2014))。
本发明提供杀死细胞的方法，所述方法包括在体外或体内使所述细胞与本发明的细胞靶向分子或药物组合物接触的步骤。本发明的细胞靶向分子和药物组合物可以在使一种或多种细胞与一种所要求的物质的组合物接触时用于杀死特定的细胞类型。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可以用于杀死不同细胞类型的混合物中的特定的细胞类型，所述不同细胞类型的混合物诸如包含癌细胞、被感染的细胞和/或血液细胞的混合物。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可以用于杀死不同细胞类型的混合物中的癌细胞。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可以用于杀死不同细胞类型的混合物(如移植前组织)中的特定细胞类型。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可以用于杀死多种细胞类型的混合物(诸如施用前的组织材料)中特定的细胞类型，以用于治疗目的。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可以用于选择性杀死被病毒或微生物感染的细胞，或另外选择性杀死表达特定细胞外靶标生物分子(如细胞表面生物分子)的细胞。本发明的细胞靶向分子和药物组合物具有多种应用，包括，例如，在体外或体内从组织中消耗不需要的细胞类型的应用，作为抗病毒试剂的用途，作为抗寄生虫试剂的用途，和在清除不需要的细胞类型的移植组织中的用途。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子和/或药物组合物可以用于杀死不同细胞类型的混合物中特定的细胞类型，诸如施用前的组织材料以用于治疗目的，例如，移植前的组织。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可以用于选择性杀死被病毒或微生物感染的细胞，或另外选择性杀死表达特定细胞外靶标生物分子(如细胞表面生物分子)的细胞。
本发明提供杀死有此需要的患者中的细胞的方法，所述方法包括向所述患者施用至少一种本发明的细胞靶向分子或其药物组合物的步骤。在某些实施方案中，通过靶向被发现与被感染的细胞物理连接的细胞外生物分子，本发明的志贺毒素效应物多肽或细胞靶向分子或其药物组合物可以用于杀死患者中被感染的细胞。
在某些实施方案中，通过靶向被发现与癌细胞或肿瘤细胞物理连接的细胞外生物分子，本发明的细胞靶向分子或其药物组合物可以用于杀死患者中的癌细胞。术语“癌细胞”或“癌性细胞”是指以异常加快的和/或失调的方式生长和分裂的各种赘生性细胞，且是技术人员所清楚的。术语“肿瘤细胞”包括恶性细胞和非恶性细胞。通常，癌症和/或肿瘤可以定义为适合治疗和/或预防的疾病、病症或病患。可能受益于本发明的方法和组合物的、由癌细胞和/或肿瘤细胞构成的癌症和肿瘤(恶性的或非恶性的)是技术人员显而易见的。赘生性细胞经常与以下一种或多种相关：失调的生长、分化的缺失、局部组织侵入、血管生成和转移。技术人员将显而易见可能受益于本发明的靶向某些癌细胞和/或肿瘤细胞的方法和组合物的、由癌症和/或肿瘤(恶性的或非恶性的)引起的疾病、病症和病患。
本发明的细胞靶向分子和组合物的某些实施方案可以用于杀死癌症干细胞、肿瘤干细胞、恶化前的癌症起始细胞和肿瘤起始细胞，它们通常缓慢地分裂且耐受癌症治疗如化学疗法和辐射。例如，通过杀死AML干细胞和/或静止的AML祖细胞(参见例如Shlush L等人，Blood 120：603-12(2012))，可以用本发明治疗急性髓性白血病(acute myeloidleukemias，AML)。癌症干细胞经常过表达细胞表面靶标，诸如，例如，CD44、CD200和本文中列出的其他靶标，它们可以是本发明的细胞靶向分子的某些实施方案的某些结合区域的靶标(参见例如Kawasaki B等人，Biochem BiophysRes Commun 364：778-82(2007)；Reim F等人，CancerRes 69：8058-66(2009))。
因为基于志贺毒素A亚基的作用机理，本发明的物质组合物可以更有效地用在涉及它们与其他疗法(诸如，例如，化学疗法、免疫疗法、辐射、干细胞移植和免疫检验点抑制剂)的组合或互补方式的方法中，和/或对化学抗性的/辐射抗性的和/或静止的肿瘤细胞/肿瘤起始细胞/干细胞是有效的。类似地，本发明的物质组合物可以更有效地用在涉及与其他细胞靶向疗法的组合的方法中，所述其他细胞靶向疗法靶向相同疾病、病症或病患的不重叠或不同靶标上的相同表位以外。
本发明的细胞靶向分子或其药物组合物的某些实施方案可以用于通过靶向被发现与免疫细胞物理上连接的细胞外生物分子而杀死患者中的免疫细胞(无论是健康的还是恶性的)。
为了以下目的利用本发明的细胞靶向分子或其药物组合物是在本发明范围内：净化恶性的和/或赘生性细胞的细胞群体(例如骨髓)，然后将除去了靶细胞的物质重新输入有此需要的患者中。
另外，本发明提供了治疗患者中疾病、病症或病患的方法，所述方法包括下述步骤：给有此需要的患者施用治疗有效量的至少一种本发明的细胞靶向分子或其药物组合物。可以使用该方法治疗的预见到的疾病、病症和病患包括癌症、恶性肿瘤、非恶性肿瘤、生长异常、免疫病症和微生物感染。“治疗有效的剂量”的本发明的组合物的施用可以导致疾病症状的严重程度降低，无疾病症状阶段的频率和持续时间的增加，或由疾病折磨而导致的损害或残疾的预防。
本发明的组合物的治疗有效量将取决于施用途径、所治疗的受试者的类型、和在考虑中的特定患者的体格特征。这些因素以及它们与确定这种量的关系是医学领域的技术从业人员众所周知的。这种量和施用方法可以进行调节以实现最佳效力，并且可以取决于医学领域的技术人员众所周知的因素，如重量、饮食、并存的药物和其他因素。最适用于人类用途的剂量大小和定量施用方案可以由通过本发明得到的结果指导，并且可以在适当地设计的临床试验中确认。通过常规方式，在实验动物中以低剂量开始并且然后在监测效果的同时增加剂量、以及系统性地改变给药方案，可以确定有效剂量和治疗方案。当为给定受试者确定最佳剂量时，临床医师可以考虑许多因素。这样的考虑因素是技术人员已知的。
可接受的施用途径可以表示在本领域中已知的任何施用途径，包括但不限于气雾剂、肠内、鼻、眼、口服、胃肠外、直肠、阴道或透皮(例如，乳膏、凝胶或软膏的局部施用，或借助于透皮贴剂)。“胃肠外施用”典型地与在预期作用部位处的注射有关或与预期作用部位连通，包括眶下、输注、动脉内、囊内、心内、真皮内、肌肉内、腹膜内、肺内、椎管内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、透粘膜或经气管施用。
关于本发明的药物组合物的施用，剂量范围通常将为约0.001-10毫克/千克(mg/kg)受试者体重，并且更通常为0.001-0.5mg/kg受试者体重。示例性剂量可以是0.01mg/kg体重、0.03mg/kg体重、0.07mg/kg体重、0.09mg/kg体重或0.1mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。一个示例性的治疗方案是每天一次或两次施用，或每周一次或两次施用，每两周一次，每三周一次，每四周一次，每月一次，每两个月或三个月一次或者每三至6个月一次。剂量可以由熟练的健康护理专业人员根据需要选择并重新调节以使对于特定患者而言的治疗益处最大化。
本发明的药物组合物典型地将会在多种情形下施用给相同患者。单次剂量之间的间隔可以是，例如，2-5天、每周、每月、每两个月或三个月、每六个月、或每年。基于调节受试者或患者中的血液水平或其他标志物，施用之间的间隔也可以是不规律的。本发明的组合物的剂量方案包括1mg/kg体重或3mg/kg体重的静脉内施用，其中将组合物每两至四周施用一次达六个剂量，然后以3mg/kg体重或1mg/kg体重每三个月施用一次。
使用本领域已知的多种方法中的一种或多种，可以经由一种或多种施用途径施用本发明的药物组合物。如技术人员将会理解的，施用的途径和/或模式将会根据期望的结果而变化。本发明的细胞靶向分子、药物组合物和诊断组合物的施用途径包括，例如静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他胃肠外施用途径，例如通过注射或输注。对于其他实施方案，本发明的细胞靶向分子、药物组合物和诊断组合物可以通过非胃肠外途径施用，诸如局部、表皮或粘膜施用途径，例如，鼻内地、口服地、阴道地、直肠地、舌下地或局部地。
利用本领域已知的多种医疗装置中的一种或多种，可以施用本发明的治疗性细胞靶向分子或其药物组合物。例如，在一个实施方案中，可以利用无针皮下注射装置施用本发明的药物组合物。在本领域中具有可用于本发明的众所周知的植入物和模块的例子，包括例如，用于受控速率递送的可植入微量输液泵；用于穿过皮肤施用的装置；用于以精确的输注速率递送的输液泵；用于连续药物递送的可变流可植入输注装置；以及渗透药物递送系统。这些和其他这样的植入物、递送系统、和模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物单独的或与其他化合物或药物组合物组合可以在体外或体内施用给受试者(诸如需要治疗的患者)中的细胞群时表现出有效的细胞杀死活性。通过使用高亲和性结合区域将与异源CD8+ T-细胞表位货物连接的志贺毒素效应物多肽的递送靶向特定的细胞类型，可以限制志贺毒素效应物和/或CD8+ T-细胞表位呈递介导的细胞杀死活性，以特异性且选择性地杀死生物体内的某些细胞类型，诸如某些癌细胞，赘生性细胞，恶性细胞，非恶性肿瘤细胞，或被感染的细胞。
本发明的细胞靶向分子或其药物组合物可以单独施用或与一种或多种其他治疗剂或诊断剂联合施用。联合治疗可以包括与至少一种其他治疗剂组合的本发明的细胞靶向分子或其药物组合物，所述其他治疗剂基于待治疗的特定患者、疾病或病患而选择。其他这样的药剂的例子包括，尤其是，细胞毒性的抗癌剂或化学治疗剂、抗炎或抗增殖剂、抗微生物或抗病毒剂、生长因子、细胞因子、镇痛药、治疗活性的小分子或多肽、单链抗体、经典抗体或其片段、或调节一个或多个信号传递途径的核酸分子、以及在治疗性或预防性处理方案中互补的或在其他方面有益的类似调节治疗分子。
用本发明的细胞靶向分子或药物组合物对患者的治疗优选地导致被靶向的细胞的细胞死亡和/或被靶向的细胞的生长的抑制。这样，本发明的细胞靶向分子和包含它们的药物组合物将可用在治疗多种病理学病症(其中杀死或除去靶细胞可能是有益的，例如尤其是癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症和受感染的细胞)的方法中。本发明提供了用于抑制细胞增殖和治疗细胞病症(包括瘤形成和/或某些细胞类型的不需要的增殖)的方法。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子和药物组合物可以用于治疗或预防癌症、肿瘤(恶性的和非恶性的)、生长异常、免疫病症和微生物感染。在另一个方面，以上离体方法可以与以上体内方法组合以提供治疗或预防骨髓移植接受者中的排斥的方法和用于实现免疫耐受的方法。
本发明的细胞靶向分子和药物组合物通常是抗肿瘤剂——意味着它们能够通过抑制癌症或肿瘤细胞的生长和/或造成癌症或肿瘤细胞的死亡而治疗和/或预防肿瘤或恶性细胞的发育、成熟或传播。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗哺乳动物受试者(如人)中的恶性病或肿瘤和其他血细胞相关的癌症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的细胞靶向分子或药物组合物的步骤。
在另一方面，本发明的细胞靶向分子和药物组合物的某些实施方案是抗微生物剂——意味着它们能够治疗和/或预防微生物致病感染(诸如由病毒、细菌、真菌、朊病毒或原生动物造成)的获得、发展或后果。
本发明的细胞靶向分子和/或药物组合物可以用在治疗癌症的方法中，所述方法包括：给有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的细胞靶向分子或药物组合物。在本发明的方法的某些实施方案中，正在治疗的癌症选自由下述组成的组：骨癌(诸如多发性骨髓瘤(multiple myeloma)或尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma))、乳腺癌、中枢/周围神经系统癌症(诸如脑癌、神经纤维瘤病(neurofibromatosis)或胶质母细胞瘤(glioblastoma))、胃肠癌(诸如胃癌或结直肠癌)、生殖细胞癌(诸如卵巢癌和睾丸癌、腺癌(诸如胰腺癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma)、唾液腺癌或甲状腺癌)、头颈癌(诸如鼻咽癌、口癌或咽癌)、血液学癌症(诸如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)、肾-尿道癌(诸如肾癌和膀胱癌)、肝癌、肺/胸膜癌(诸如间皮瘤(mesothelioma)、小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、前列腺癌、肉瘤(诸如血管肉瘤(angiosarcoma)、纤维肉瘤(fibrosarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi’ssarcoma)或滑膜肉瘤(synovial sarcoma))、皮肤癌(诸如基底细胞癌、鳞状细胞癌或黑素瘤)和子宫癌。
本发明的细胞靶向分子和药物组合物可以用在治疗免疫病症的方法中，所述方法包括：给有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的细胞靶向分子或药物组合物。在本发明的方法的某些实施方案中，所述免疫病症与炎症有关，所述炎症与选自由下述组成的组的疾病有关：淀粉样变性(amyloidosis)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、哮喘、孤独症(autism)、心脏发生(cardiogenesis)、克罗恩病(Crohn’s disease)、糖尿病、红斑(erythematosus)、胃炎、移植排斥、移植物抗宿主病、格雷夫斯病(Grave’s disease)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、溶血性尿毒性综合征(hemolytic uremicsyndrome)、HIV相关的疾病、红斑狼疮(lupus erythematosus)、淋巴组织增生病症(lymphoproliferative disorders)、多发性硬化、重症肌无力(myasthenia gravis)、神经炎症(neuroinflammation)、结节性多动脉炎(polyarteritis nodosa)、多关节炎(polyarthritis)、银屑病(psoriasis)、银屑病关节炎(psoriatic arthritis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、硬皮病(scleroderma)、脓毒性休克(septic shock)、舍格伦综合征(Sjorgren’s syndrome)、全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)/血管炎(vasculitis)。
在本发明的某些实施方案中是使用本发明的细胞靶向分子作为药物组合物或药物的组分，所述药物组合物或药物用于治疗或预防癌症、肿瘤、其他生长异常、免疫病症和/或微生物感染。例如，在减少炎症的努力中，可以用这样的药物治疗在患者的皮肤上呈现的免疫病症。在另一个实施例中，在减小肿瘤大小或完全消除肿瘤的努力中，可以用这样的药物治疗皮肤肿瘤。
在本发明的某些实施方案中是使用本发明的细胞靶向分子、药物组合物和/或诊断组合物标记进行关于疾病、病患和/或病症的信息收集的方法。例如，本发明的细胞靶向分子可以施用特异性针对某些pMHC I的抗体用于成像肿瘤细胞的pMHC I呈递。在用本发明的细胞靶向分子治疗后检测此类标记的靶细胞可以提供关于被靶向的细胞类型的抗原加工和MHC I类呈递的能力的读数，以及在与本发明的细胞靶向分子的诊断变体的读数组合时提供在靶细胞群中此类能力的靶细胞的百分数。
在本发明的某些实施方案中是使用本发明的细胞靶向分子、药物组合物和/或诊断组合物来检测细胞类型的存在的方法，所述方法目的在于收集关于疾病、病患和/或病症的信息。所述方法包括使细胞与诊断足够量的本发明的细胞靶向分子接触以通过测定或诊断技术检测所述分子。短语“诊断足够量”表示为了信息收集目的通过利用的特定测定或诊断技术提供适当检测和准确测量的量。通常，对于完整生物体内诊断应用而言，诊断足够量是每位受试者在0.01mg-10mg本发明的检测促进剂连接的细胞靶向分子/千克受试者之间的非累积剂量。典型地，在这些信息收集方法中使用的本发明的细胞靶向分子的量将尽可能地低，前提条件是，它仍然是诊断足够量。例如，对于在生物体中的体内检测，施用给受试者的本发明的细胞靶向分子或诊断组合物的量将可行地尽可能地低。
与检测促进剂组合的本发明的细胞靶向分子的细胞类型特异性的靶向会提供检测细胞并获取其图像的方式，所述细胞与本发明的分子的结合区域的细胞外靶标生物分子物理上连接。备选地，展示细胞靶向分子递送的异源的CD8+ T-细胞表位可以提供检测本发明的细胞靶向分子在其中内在化的细胞并获取其图像的方式。使用本发明的细胞靶向分子和诊断组合物对细胞的成像可以通过本领域已知的任意合适的技术在体外或在体内执行。使用本领域已知的各种方法，包括生物体的全身成像或使用取自生物体的离体样品，可以收集诊断信息。本文中使用的术语“样品”表示任意数目的物品，但不限于，流体，诸如血液、尿、血清、淋巴液、唾液、肛门分泌物、阴道分泌物和精液，以及通过活组织检查操作得到的组织。例如，通过技术诸如磁共振成像(MRI)、光学方法(诸如直接的、荧光的和生物发光的成像)、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机体层摄影术(SPECT)、超声、x-射线计算机体层摄影术和前述技术的组合，多种检测促进剂可以用于非侵袭性体内肿瘤成像(关于综述，参见，Kaur S等人，Cancer Lett 315：97-111(2012))。
在本发明的某些实施方案中是在诊断组合物中使用本发明的细胞靶向分子、药物组合物和/或诊断组合物来标记或检测赘生性细胞和/或免疫细胞类型的内部的方法(参见例如，Koyama Y等人，Clin Cancer Res 13：2936-45(2007)；Ogawa M等人，Cancer Res 69：1268-72(2009)；Yang L等人，Small 5：235-43(2009))。这可以基于本发明的某些细胞靶向分子进入特定细胞类型并通过逆向细胞内运输在细胞内按路线发送至特定亚细胞区室的能力，以使特定细胞类型的内部区室被标记用于检测。这可以在患者内在原位细胞上执行，或在体外在从生物体取出的细胞和组织(例如活组织检查材料)上执行。
本发明的诊断组合物可以用于将疾病、病症或病患表征为本发明的有关药物组合物潜在地可治疗的。本发明的主题的某些组合物可以用于确定患者是否属于对利用如本文中所述的本发明的细胞靶向分子、或其组合物或本发明的有关方法的治疗策略做出应答的组或非常适合使用本发明的递送装置。
可以在检测出疾病(例如癌症)以后使用本发明的诊断组合物以便更好地表征它，诸如以监测远距离转移、异质性和癌症进展阶段。疾病、病症或感染的表型评估可以帮助在做出治疗决策的过程中的预后和预测。在疾病复发中，本发明的某些方法可以用于确定是局部问题还是全身问题。
本发明的诊断组合物可以用于评估对治疗剂的应答，无论治疗剂的类型，例如小分子药物、生物药物或基于细胞的疗法。例如，本发明的诊断组合物的某些实施方案可以用于测量肿瘤大小的变化、抗原阳性细胞群体(包括数目和分布)的变化、或监测已经施用给患者的疗法所靶向的抗原以外的标志物(参见Smith-Jones P等人，Nat.Biotechnol 22：701-6(2004)；Evans M等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108：9578-82(2011))。
本发明的诊断组合物可以用于评估靶细胞类型中MHC I类系统的功能性。例如，某些恶性细胞，诸如被感染的、肿瘤或癌症细胞，可以表现出它们的MHC I类呈递途径的改变，缺陷和干扰。这可以在体外或体内进行研究。本发明的诊断组合物可以用于监测生物体内靶细胞群体中个体细胞间MHC I类呈递的变化或计数或确定生物体、肿瘤活组织检查样品等中MHC I类呈递缺陷靶细胞的百分数。
用于检测细胞类型的存在的方法的某些实施方案可以用于收集关于疾病、病症和病患的信息，所述疾病、病症和病患诸如，例如，骨癌(诸如多发性骨髓瘤或尤因肉瘤)、乳腺癌、中枢/周围神经系统癌症(诸如脑癌、神经纤维瘤病或胶质母细胞瘤)、胃肠癌(诸如胃癌或结直肠癌)、生殖细胞癌(诸如卵巢癌和睾丸癌、腺癌(诸如胰腺癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、唾液腺癌或甲状腺癌)、头颈癌(诸如鼻咽癌、口癌或咽癌)、血液学癌症(诸如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)、肾-尿道癌(诸如肾癌和膀胱癌)、肝癌、肺/胸膜癌(诸如间皮瘤、小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、前列腺癌、肉瘤(诸如血管肉瘤、纤维肉瘤、卡波西氏肉瘤或滑膜肉瘤)、皮肤癌(诸如基底细胞癌、鳞状细胞癌或黑素瘤)、子宫癌、AIDS、淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、孤独症、心脏发生、克罗恩病、糖尿病、红斑(erythematosus)、胃炎、移植排斥、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒性综合征、HIV相关的疾病、红斑狼疮、淋巴组织增生的病症、多发性硬化、重症肌无力、神经炎症、结节性多动脉炎、多关节炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、血管炎、细胞增殖、炎症、白细胞活化、白细胞粘附、白细胞趋化性、白细胞成熟、白细胞迁移、神经元分化、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤(ALL)、急性髓性白血病、急性髓性白血病(AML)、B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、B-细胞前淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma，BL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML-BP)、慢性髓性白血病(CML)、弥漫性大B细胞性淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma)、滤泡淋巴瘤、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s Lymphoma，HL)、血管内大B-细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病(lymphomatoidgranulomatosis)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)、多发性骨髓瘤(MM)、天然杀伤细胞白血病、结节边缘B-细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、浆细胞白血病、浆细胞瘤(plasmacytoma)、原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma)、幼淋巴细胞白血病、早幼粒细胞性白血病、小淋巴细胞性淋巴瘤、脾边缘带淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤(TCL)、重链病、单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathy)、单克隆免疫球蛋白沉积病、骨髓增生异常综合征(MDS)、郁积型多发性骨髓瘤和Waldenstrom巨球蛋白血症。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或其药物组合物用于诊断和治疗，或仅用于诊断。在某些情形下，合乎需要的是，在选择本发明的细胞靶向分子用于治疗之前，确定或验证在受试者和/或来自受试者(诸如，例如，需要治疗的患者)的患病组织中表达的HLA变体和/或HLA等位基因。在一些情形中，合乎需要的是，在选择哪种细胞靶向分子或其组合物用于本发明的方法之前，为个体受试者确定某些CD8+ T-细胞表位的免疫原性。
通过以下包含前述结构和功能(特别是将CD8+ T-细胞表位的递送靶向特定细胞的细胞外靶向任何将所述CD8+ T-细胞表位递送至MHC I类路径用于呈递在细胞表面上的细胞内递送的功能)的细胞靶向分子的非限制性实施例进一步例证了本发明。
实施例
以下实施例证实了本发明的某些实施方案。但是，应当理解，这些实施例仅仅用于解释目的，且不意图、也不应当解释为对本发明的条件和范围的一概限制。除了另外详细描述以外，使用本领域技术人员众所周知的且常规的标准技术进行以下实施例中的实验。
靶向细胞的志贺毒素效应物多肽可以经过改造，以递送免疫原性的表位-肽，用于被靶细胞呈递。这些靶向细胞的多肽提供表位的靶向递送，并且可以用在涉及免疫刺激性表位在脊索动物内的细胞类型特异性呈递的应用中。在脊索动物内由MHC I类系统呈递T细胞免疫原表位靶向呈递所述表位的细胞，用于被CD8+ CTL-介导的溶解杀死，并且还可以刺激邻近处的其他免疫应答。
在实施例中，T-细胞抗原融合在包含志贺毒素A亚基效应物多肽的细胞靶向分子上。所有这些融合多肽涉及在起始多肽支架上添加至少一个肽，并且不需要在志贺毒素效应物多肽区域内部嵌入或插入任意异源的CD8+ T-细胞表位。因此，在本发明某些示例性的细胞靶向分子中，所述志贺毒素效应物多肽区域由完全野生型的志贺毒素多肽组成。
下述实施例描述本发明的示例性的靶向细胞的蛋白，其分别包含免疫球蛋白型结合区、志贺毒素效应物多肽和融合的异源CD8+ T-细胞表位-肽。本发明的示例性的细胞靶向分子结合有被靶向的细胞类型表达的靶标生物分子，并且进入所述被靶向的细胞。本发明的内在化的示例性的靶向细胞的蛋白有效的将它们的志贺毒素效应物多肽区域按路线发送到细胞溶胶中并杀死被靶向的细胞。示例性的靶向细胞的蛋白在被靶向的细胞内将其融合的T-细胞表位-肽递送至MHC I类路径，导致所述T-细胞表位-肽呈递在靶细胞的表面上。靶标对所递送的T-细胞表位的呈递可以向CD8+效应物T-细胞传递信号，从而杀死展示表位的靶细胞，以及刺激在表位展示的靶细胞邻近处的其他免疫应答。
实施例1.包含志贺毒素A亚基来源的多肽区域和融合的T-细胞表位-肽的细胞靶向分子
产生并检测细胞靶向分子——所述细胞靶向分子分别包含：1)靶向细胞的结合区域，2)志贺毒素效应物多肽区域，和3)T-细胞表位-肽区域。之前，已经构建了志贺毒素A亚基来源的细胞靶向分子，并且显示促进细胞内在化和指导它们自身细胞内按路线发送到细胞溶胶中(参见，例如，WO 2014/164680，WO 2014/164693，WO 2015/138435，WO 2015/138452，WO 2015/113005，WO 2015/113007，和WO 2015/191764)。T-细胞表位-肽融合在这些志贺毒素A亚基来源的细胞靶向分子的模块多肽组分上，从而产生新型细胞靶向分子。
如在本实施例中下文所证明的，本发明的一些靶向细胞的蛋白在外源施用时能够将异源T-细胞表位-肽递送至MHC I类路径，用于被靶向的人癌细胞呈递。也在本实施例中下文所证明的，本发明的某些靶向细胞的蛋白能够通过它们的志贺毒素效应物多肽区域特异性杀死被靶向的人癌细胞。本发明的示例性的靶向细胞的蛋白的靶向细胞的结合区域分别能够表现出与特定细胞类型表面物理连接的细胞外靶标生物分子的高亲和力结合。该实施例中本发明的示例性的靶向细胞的蛋白能够选择性靶向表达它们的靶向细胞的结合区域的靶标生物分子的细胞并且在这些靶细胞中内在化。
I.用于细胞靶向分子的人CD8+ T-细胞表位组分
在该实施例中，选择已知对人CD8+ T-细胞是免疫原性的表位-肽，用于融合到志贺毒素来源的靶向细胞的蛋白上。具体地，从感染人的病毒的病毒蛋白选择免疫原性表位-肽，并且将这些T-细胞表位-肽融合到包含志贺毒素效应物多肽的靶向细胞的蛋白上，其具有固有的通过内质网细胞内按路线发送到细胞溶胶的能力。
本实施例的病毒、免疫原性的T-细胞表位-肽基于它们结合人MHC I类分子的能力进行选择，并且由此激发人CTL-介导的免疫应答。存在多种已知的来自人病毒的免疫原性病毒蛋白和病毒蛋白的肽组分，所述人病毒诸如人甲型流感病毒(influenza A viruses)和人CMV病毒。使用免疫表位数据库(Immune Epitope Database，IEDB)分析资源MHC-I结合预测共用工具和推荐的参数(Kim Y等人，Nucleic Acids Res 40：W252-30(2012))，对七种病毒表位-肽(SEQ ID NOs：4-12)针对结合有人群体中更普遍的等位基因编码的常见的人MHC I类人白细胞抗原(HLA)变体的能力进行评分。IEDB MHC-I结合预测分析共用工具预测“ANN亲和性”——在输入的肽与所选的人HLA变体之间的估测的结合亲和力，其中，认为小于50纳摩尔(nM)的IC50值是高亲和力，认为介于50与500nM之间的IC50值是中等亲和力，并且认为介于500与5000nM之间的IC50值是低亲和力。IEDB MHC-I结合预测分析表明较高亲和力的结合剂具有较低的百分数排序。表1显示了七种在计算机芯片上检测的与某些人HLA变体结合的T细胞表位-肽(SEQ ID NOs：4-12)的IEDB MHC-I结合预测分析百分数排序和预测的结合亲和力。
表1.表位-肽针对人MHC I类分子的预测的结合亲和力
IEDB MHC-I结合预测分析的结果表明，预测一些肽以高亲和力与至少一种人MHCI类分子结合，而预测其他肽以较中等的亲和力与所分析的人MHC I类分子结合。
II.产生靶向细胞的包含志贺毒素A亚基效应物多肽区域和融合的T-细胞表位-肽 区域的融合蛋白
本实施例的示例性的靶向细胞的融合蛋白分别包含靶向细胞的结合区多肽、志贺毒素A亚基效应物多肽、蛋白样接头和来自表1的人CD8+ T-细胞表位。
使用本领域已知的技术，通过将人CD8+ T-细胞表位-肽遗传融合到母本靶向细胞的蛋白的多肽组分的氨基端(N端)或羧基端(C端)而产生示例性的靶向细胞的融合蛋白，所述母本靶向细胞的蛋白包含：1)志贺毒素A亚基效应物多肽，和2)通过蛋白样接头隔开的靶向细胞的结合区多肽。从一些起源于通常感染人的病毒的T-细胞表位-肽(见表1)选择融合的CD8+ T-细胞表位。构建所得到的本实施例的靶向细胞的融合蛋白，使得分别包含单一的含有靶向细胞的结合区多肽、志贺毒素A亚基效应物多肽和融合的异源CD8+ T-细胞表位的连续多肽。
在本实施例中生产并检测的本发明的细胞靶向分子包括：C2：：SLT-1A：：scFv2(SEQ ID NO：50)，“失活的C2：：SLT-1A：：scFv2”(SEQ ID NO：51)，SLT-1A：：scFv1：：C2(SEQID NO：61)，SLT-1A：：scFv2：：C2(SEQ ID NO：52)，“失活的SLT-1A：：scFv2：：C2”(SEQ IDNO：53)，F2：：SLT-1A：：scFv2(SEQ ID NO：54)，scFv3：：F2：：SLT-1A(SEQ ID NO：55)，scFv4：：F2：：SLT-1A(SEQ ID NO：56)，SLT-1A：：scFv5：：C2(SEQ ID NO：57)，SLT-1A：：scFv6：：F2(SEQ ID NO：58)，“失活的SLT-1A：：scFv6：：F2”(SEQ ID NO：59)，和SLT-1A：：scFv7：：C2(SEQ ID NO：60)。在本实施例中检测的本发明其他的细胞靶向分子包括：C1：：SLT-1A：：scFv1(类似于SEQ ID NO：13)，C1-2：：SLT-1A：：scFv1(类似于SEQ ID NO：14)，C3：：SLT-1A：：scFv1(类似于SEQ ID NO：15)，C24：：SLT-1A：：scFv1(类似于SEQ ID NO：16)，SLT-1A：：scFv1：：C1(类似于SEQ ID NO：21)，SLT-1A：：scFv1：：C24-2(类似于SEQ ID NO：23)，SLT-1A：：scFv1：：E2(类似于SEQ ID NO：24)，和SLT-1A：：scFv1：：F3(类似于SEQ IDNO：25)。本发明的这些示例性的靶向细胞的融合蛋白分别包含含有单链可变片段(scFv)的靶向细胞的结合区、来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)的志贺毒素A亚基效应物多肽和融合在所述结合区或所述志贺毒素效应物多肽上的人CD8+ T-细胞表位-肽。
本实施例的细胞靶向分子的所有的志贺毒素效应物多肽区域由下述组成或来源于下述：SLT-1A(SEQ ID NO：1)的氨基酸1-251，并且它们中的一些相对于野生型志贺毒素A亚基包含两个以上的氨基酸残基置换，诸如，例如，使催化结构域失活的置换E167D、C242S和/或导致弗林蛋白酶切割抗性的置换R248A/R251A(参见，例如，WO 2015/191764)。用于本实施例时，细胞靶向分子命名“失活的”是指仅包含具有E167D置换的志贺毒素效应物多肽组分的分子。
免疫球蛋白型结合区域scFv1，scFv2，scFv3，scFv4，scFv5，scFv6和scFv7分别是单链可变片段，其以高亲和力结合与某些人癌细胞表面物理连接的某些细胞表面靶标生物分子。scFv 1和scFv2都以高亲和力和特异性结合相同的细胞外靶标生物分子。
使用技术人员已知的技术，在细菌系统中产生在本实施例的实验中检测的所有细胞靶向分子，包括参比细胞靶向分子(例如，SEQ ID NOs：63-70)，并且通过柱层析纯化。
III.检测细胞靶向分子的志贺毒素A亚基效应物多肽组分在融合结合区和T-细胞 表位-肽后保留志贺毒素功能
检测示例性的靶向细胞的蛋白在异源CD8+ T-细胞表位-肽融合后保留志贺毒素A亚基效应物的功能。分析的志贺毒素A亚基效应物功能为：催化激活真核核糖体，细胞毒性，和干扰自身引导的向细胞溶胶的亚细胞按路线发送。至少七种本发明的示例性的靶向细胞的蛋白表现出与没有融合任何异源T-细胞表位-肽或另外的多肽部分的野生型志贺毒素效应物多肽相当的催化活性。
A.检测本发明的示例性细胞靶向分子的核糖体抑制活性
使用核糖体抑制测定检测本发明的细胞靶向分子的志贺毒素A亚基来源的志贺毒素效应物多肽区域的催化活性。
使用快速偶联的转录/翻译试剂盒(Quick Coupled Transcription/Translation Kit)(L1170Promega Madison，WI，U.S.)，利用不含细胞的体外蛋白翻译测定，确定本实施例的示例性的靶向细胞的蛋白的核糖体失活能力。该试剂盒包括荧光素酶T7对照DNA(L4821 Promega Madison，WI，U.S.)和Quick主要混合物。按照供应商的使用说明制备核糖体活性反应物。在适当的缓冲液中制备一系列待测的志贺毒素来源的靶向细胞的蛋白的10倍稀释液，并为每种稀释液产生一系列相同的TNT反应混合物组分。将在每种稀释系列中的每份样品与每种TNT反应混合物以及荧光素酶T7对照DNA组合。将测试样品在30摄氏度(℃)温育1.5小时。在温育之后，将荧光素酶测定试剂(E1483 Promega，Madison，WI，U.S.)加入到所有试验样品中，并且根据生产商的说明书通过发光测量荧光素酶蛋白翻译的量。
通过总蛋白的对数转化浓度相对于相对发光单位的非线性回归分析，确定翻译抑制的水平。使用统计软件(GraphPad Prism，San Diego，CA，U.S.)，使用Prism软件在标题剂量-响应-抑制下的1og(抑制剂)相对于响应(三参数)的函数[Y＝底部+((顶部-底部)/(1+10^(X-LogIC50)))]计算每个样品的半最大抑制浓度(IC50)值。为来自一次或多次实验的每种志贺毒素来源的靶向细胞的蛋白计算IC50值，并且显示在表2中，单位为皮摩尔(pM)。在本文中认为本发明的表现出在包含野生型志贺毒素效应物多肽(例如，SLT-1A-WT(SEQ IDNO：62))的阳性对照分子的10倍以内的IC50的示例性细胞靶向分子表现出与野生型相当的核糖体抑制活性。
表2.与异源的表位-肽融合的志贺毒素来源的靶向细胞的蛋白的核糖体抑制作用
如表2所示，示例性的靶向细胞的蛋白表现出与下述阳性对照相当的有效核糖体抑制作用：1)“仅有SLT-1A-WT”的多肽(SEQ ID NO：62)，其仅包含野生型志贺毒素A亚基多肽序列，和2)包含融合在scFv结合区的SLT-1A来源的志贺毒素效应物多肽但是缺少任何融合的异源CD8+ T-细胞表位-肽的靶向细胞的蛋白，例如，SLT-1A：：scFv1(SEQ ID NO：63)，SLT-1A：：scFv2(SEQ ID NO：64)，SLT-1A：：scFv5(SEQ ID NO：66)，或SLT-1A：：scFv6(SEQID NO：67)。
B.检测本发明示例性的细胞靶向分子的细胞毒性活性
使用基于组织培养细胞的毒性测定，测量本发明示例性的细胞靶向分子的细胞毒性活性。为本发明特定的细胞靶向分子确定杀死均相细胞群体中一半的细胞所外源施用的细胞靶向分子的浓度(半最大细胞毒性浓度)。使用细胞杀死测定检测示例性的细胞靶向分子的细胞毒性，所述细胞杀死测定设计相对于每种细胞靶向分子的结合区的靶标生物分子为靶标生物分子阳性的或靶标生物分子阴性的细胞。
所述细胞杀死测定按下述进行。将人肿瘤细胞系细胞铺板(通常，对于贴壁细胞，以2x 103个细胞/孔，在蛋白添加前一天铺板；或对于悬浮细胞，以7.5x 103个细胞/孔，在蛋白添加同一天铺板)在384-孔平板内的20μL细胞培养基中。在适当的缓冲液中制备每种待试蛋白的一系列10倍稀释液，然后将5μL稀释液或仅缓冲液(作为阴性对照)添加到细胞中。将仅含有培养基的对照孔用于基线校正。将细胞样品与蛋白或仅缓冲液一起在37℃和在5％二氧化碳(CO2)气氛下温育3天或5天。根据生产商的说明书，使用发光细胞存活力测定(Luminescent Cell Viability Assay，G7573PromegaMadison，WI，U.S.)使用发光读出以相对光单位(RLU)进行测量而确定总细胞存活或生存力百分比。
使用下述方程式计算实验孔的生存力百分比：(试验RLU-平均培养基RLU)/(平均细胞RLU-平均培养基RLU)*100。在Prism(GraphPad Prism，San Diego，CA，U.S.)中绘制Log蛋白浓度相对于生存力百分比，并使用log(抑制剂)相对于响应(3参数)分析来确定试验的蛋白的半最大细胞毒性浓度(CD50)值。在可能时，计算所测试的每种示例性的靶向细胞的蛋白的CDs0值。
通过将针对表达显著量的所述细胞靶向分子的结合区的靶标生物分子的细胞(靶标阳性细胞)的细胞杀死活性与针对没有表现出任何显著量的与任意细胞表面物理连接的细胞靶向分子结合区的任意靶标生物分子的细胞(靶标阴性细胞)的细胞杀死活性进行比较，而确定给定的细胞靶向分子的细胞毒性活性的特异性。这通过下述实现：确定本发明给定的细胞靶向分子针对对于分析的细胞靶向分子的靶标生物分子的细胞表面表达是阳性的细胞群体的半最大细胞毒性浓度，然后使用该细胞靶向分子浓度范围尝试确定针对对所述细胞靶向分子的靶标生物分子的细胞表面表达是阴性的细胞群体的半最大细胞毒性浓度。在一些实验中，与“仅用缓冲液”的阴性对照相比，使用最大量的包含志贺毒素的分子处理的靶标阴性细胞没有显示出任何存活力变化。
使用上述细胞杀死测定检测的多种分子的细胞毒性活性水平报道在表3中。如表3中报告的，在该测定中检测的本发明的示例性的靶向细胞的蛋白表现出有效的细胞毒性。尽管异源CD8+ T-细胞表位-肽与志贺毒素来源的靶向细胞的蛋白的融合体可能没有导致细胞毒性变化，但是与它们所来源的母本蛋白(其不包含任何融合的异源表位-肽)相比，一些示例性的靶向细胞的蛋白表现出降低的细胞毒性(表3)。如在本实施例中报道的，认为表现出在参比分子测量的CD50值的10倍以内的CD50值的分子表现出与所述参比分子相当的细胞毒性活性。具体而言，本发明表现出的针对靶标阳性细胞群体的CD50值在参比细胞靶向分子针对相同细胞类型的CD50值的10倍以内的任意示例性的细胞靶向分子在本文中称为“与野生型相当”，所述参比细胞靶向分子包含相同的结合区和野生型志贺毒素效应物多肽(例如，SLT-1A-WT(SEQ ID NO：62))，但是不包含任何融合的异源T-细胞表位-天。表现出的针对靶标阳性细胞的CD50值在参比分子的100倍至10倍以内的细胞靶向分子在本文中被称为是活性的但是“减毒的”，所述参比分子包含相同的结合区和相同的志贺毒素效应物多肽但是不包含任意融合的异源T-细胞表位-肽。
表3.包含融合的异源表位-肽的志贺毒素来源的靶向细胞的蛋白的细胞毒性活性
所有检测的示例性的靶向细胞的蛋白有效地杀死靶标阳性细胞(表3)，但是在相同的剂量没有杀死相当百分数的靶标阴性细胞(参见，例如，图2和3)。图2和3图示显示，示例性的靶向细胞的蛋白SLT-1A：：scFv1：：C2(SEQ ID NO：61)的特异性的细胞毒性在所测试的浓度范围仅特异性针对表达靶标的细胞(图2)，但是不特异性针对靶标阴性细胞(图3)。靶向细胞的蛋白针对靶标阴性细胞的CD50值不能由所检测的靶向细胞的蛋白的浓度范围计算出，原因在于，当在最高检测浓度没有相当大的细胞存活力下降时，不能产生准确的曲线(参见，例如，图3)。
IV.检测表位-肽的递送和所递送的表位-肽的靶细胞表面呈递
可以通过检测特异性的细胞表面MHC I类分子/表位复合物(pMHC I)确定T-细胞表位的成功递送。为了检测靶向细胞的蛋白能否将融合的T-细胞表位递送到靶细胞的MHCI类呈递路径，使用检测与特定表位复合的人MHC I类分子的测定。使用流式细胞术方法来证明T-细胞表位(融合在志贺毒素A亚基来源的靶向细胞的蛋白上)的递送和所递送的T-细胞表位-肽与MHC I类分子复合被细胞展示在靶细胞的表面上。该流式细胞术方法使用可溶的人T-细胞受体(TCR)多聚体试剂(可溶的T-细胞抗原受体STARTM多聚体，AltorBioscience Corp.，Miramar，FL，U.S.)，其分别具有针对不同的表位-人HLA复合物的高亲和力结合。
每种STARTM TCR多聚体试剂来源于特异性的T-细胞受体，并且允许基于所选择的TCR识别在特定MHC I类分子情形中呈递的特定的肽的能力检测特定的肽-MHC复合物。这些TCR多聚体由重组人TCR组成，所述重组人TCR已经生物素酰化并且用链霉抗生物素蛋白多聚体化。将TCR多聚体用藻红蛋白(PE)标记。这些TCR多聚体试剂允许检测呈递在人细胞表面上的特定的肽-MHC I类复合物，原因在于，在不同的条件下，每种可溶的TCR多聚体类型识别并且稳定结合特定的肽-MHC复合物(Zhu X等人，J Immunol 176：3223-32(2006))。这些TCR多聚体试剂允许通过流式细胞术鉴定并定量细胞表面上存在的肽-MHC I类复合物。
在本实施例中使用TCR CMV-pp65-PE STARTM多聚体试剂(Altor BioscienceCorp.，Miramar，FL，U.S.)。使用TCR CMV-pp65-PE STARTM多聚体试剂可以检测由表达HLA-A2的人细胞对人CMV C2肽(NLVPMVATV(SEQ ID NO：6))的MHC I类路径呈递，所述TCR CMV-pp65-PE STARTM多聚体试剂表现出对与人HLA-A2复合的CMV-pp65表位-肽(残基495-503，NLVPMVATV)的高亲和力识别并且用PE标记。
在本实施例中使用的靶细胞(靶标阳性细胞系B，E，F，G，和H)是可从ATCC(Manassas VA，U.S.)或DSMZ(The Leibniz Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulture)(Braunschweig，DE))获得的无限增殖的人癌细胞。使用本领域已知的标准流式细胞术方法，证实靶细胞在其细胞表面上表达HLA-A2 MHC-I类分子和用于本实施例的靶向细胞的蛋白的细胞外靶标生物分子二者。在一些实验中，将所述人癌细胞用人干扰素γ(IFN-γ)预先处理，以增加人HLA-A2的表达。
将各组靶细胞用下述外源施用的包含羧基端融合的病毒CD8+ T-细胞表位的细胞靶向分子处理：SLT-1A：：scFv1：：C2(SEQ ID NO：61)，“无活性的SLT-1A：：scFv2：：C2”(SEQID NO：53)，SLT-1A：：scFv5：：C2(SEQ ID NO：57)，和SLT-1A：：scFv7：：C2(SEQ ID NO：60)；或通过外源施用不包含任何融合的异源病毒表位-肽的靶向阴性对照细胞的融合蛋白处理(SLT-1A：：scFv1(SEQ ID NO：63)，SLT-1A：：scFv2(SEQ ID NO：65)，“无活性的SLT-1A：：scFv2”(SEQ ID NO：64)，SLT-1A：：scFv5(SEQ ID NO：66)，或SLT-1A：：scFv7(SEQ ID NO：69))。用于这些实验的细胞靶向分子和参比分子包括催化活性的细胞毒性的细胞靶向分子和“失活的”细胞靶向分子二者——意指所有它们的志贺毒素效应物多肽组分包含严重减小志贺毒素A亚基和志贺毒素的催化活性的突变E167D。这些处理是以与其他人考虑针对志贺毒素的细胞类型特异的敏感性应用的那些(参见，例如，WO 2015/113005)相似的细胞靶向分子浓度进行的。然后，将处理的细胞在标准条件(包括在37C和5％二氧化碳的气氛)下温育4-16小时，以允许志贺毒素效应物多肽介导的中毒。然后，将细胞清洗，并用TCR CMV-pp65-PE STARTM多聚体试剂温育，以“染色”呈递C2肽-HLA-A2复合物的细胞。
作为对照，将各组靶细胞在下述三个条件下处理：1)没有任何处理(“未处理的”)，意指仅向细胞中加入缓冲液，没有加入任何外源分子，2)外源施用CMV C2肽(CMV-pp65，aa495-503：序列NLVPMVATV，由BioSynthesis，Lewisville，TX，U.S.合成)(SEQ ID NO：6)，和/或3)外源施用与肽负载增强剂(Peptide Loading Enhancer，“PLE，”Altor BiosicenceCorp.，Miramar，FL，U.S.)组合的CMV C2肽((SEQ ID NO：6)，如上文)。与PLE处理组合的C2肽(SEQ ID NO：6)允许外源肽负载并且作为阳性对照。展示适当的MHC I类单元型的细胞可能被迫使从细胞外空间(即，不存在所施加的肽的细胞内在化)或在PLE的存在下负载适当的外源施加的肽，所述PLE是B2-微球蛋白和其他组分的混合物。
处理后，将所有组的细胞清洗，并用TCR CMV-pp65-PE STARTM多聚体试剂在冰上温育一小时。将细胞清洗，并使用AccuriTM C6流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA，U.S.)通过流式细胞术检测样品的荧光，从而以相对光单位(RLU)检测与群体中细胞结合的(在本文中有时称为“染色”)任意TCR CMV-pp65-PE STARTM多聚体的存在并定量。
表4和图4-8显示了来自使用TCR STARTM测定的实验的结果，所述测定检测C2表位/HLA-A2 MHC I类分子的细胞表面复合物。对于每次实验，使用未处理的对照样品鉴别阳性和阴性细胞群体，其使用导致小于1％的来自未处理的对照的细胞为“阳性”门控(表示背景信号)的门控进行鉴别。然后对其他样品应用相同的门控，以表征每种样品的阳性群体。该测定中的阳性细胞为被TCR-CMV-pp65-PE STARTM试剂结合并在上述阳性门控中计数的细胞。在图4和图6-8中，给出流式细胞术直方图，Y-周为计数(细胞数目)，X-轴为表示TCRCMV-pp65 STARTM多聚体、PE染色信号的相对荧光单位(RFU)(对数级别)。黑线显示仅有未处理的细胞的样品的结果，灰线显示阴性对照(仅用缺少任意病毒表位-肽的母本靶向细胞的蛋白处理)或用本发明的特定的示例性的靶向细胞的蛋白处理的结果。在图4、7和8中，上图用黑线显示未处理的细胞样品的结果并且用灰线显示细胞靶向分子处理的样品的结果。在图4、7和8中，下图用黑线显示未处理的细胞样品的结果并用灰线显示不包含任意融合的表位-肽的对照蛋白的结果。在图6中，上图显示4小时温育的结果，下图显示16小时温育的结果。在表4中，给出处理组中针对C2-表位-肽-HLA-A2MHC I类分子复合物染色为阳性的细胞的百分数。表4还以RFU显示每个处理组的相对应的索引的平均荧光强度(“iMFI”，阳性群体荧光乘阳性百分数)。
表4.在由本发明的示例性的靶向细胞的蛋白递送C2表位-肽后检测细胞表面MHCI类/C2表位复合物：在中毒的靶细胞表面上检测到肽-表位C2/MHC I类复合物
如在表4和图4-8中可见，用本发明的示例性的靶向细胞的蛋白处理的细胞样品取决于温育持续时间在大部分处理的细胞的表面上展示了C2-表位/HLA-A2 MHC I类分子复合物的表达。用外源靶向细胞的蛋白SLT-1A：：scFv1：：C2(SEQ ID NO：61)或“无活性的SLT-1A：：scFv2：：C2”(SEQ ID NO：53)，SLT-1A：：scFv5：：C2(SEQ ID NO：57)，和SLT-1A：：scFv7：：C2(SEQ ID NO：60)处理的细胞在分析的样品中33-95％的细胞上显示针对细胞表面的C2-表位/HLA-A2复合物的阳性信号(表4)。相反，用不包含任何融合的T-细胞表位-肽的母本靶向细胞的蛋白(作为阴性对照)处理的细胞在所处理的细胞群体中显示出百分之五以下的细胞的阳性细胞染色(表4；图4-8)。
尽管大部分用本发明的示例性的靶向细胞的蛋白处理的细胞在细胞表面上展示C2-表位/HLA-A2复合物，但是在“未处理的”细胞群体中百分之五以下的细胞展示针对C2-表位/HLA-A2复合物的TCR STARTM染色(表4；图4；图6)。完全是由于在存在肽负载增强剂时仅负载外源C2表位-肽(SEQ ID NO：6)，因此，阳性对照处理显示群体中99％的细胞的稳健的染色(图5)。由于加工效率和动力学(未检测的)，可能的是，在“靶向细胞的蛋白”处理样品中在单个时间点检测到的呈递的C2-表位/HLA-A2复合物的百分数可能不能准确反映在被本发明的给定的示例性靶向细胞的蛋白递送后可能的C2-表位/HLA-A2呈递的最大量。
在细胞靶向分子处理的靶细胞的细胞表面上检测到与人MHC I类分子(C2表位-肽/HLA-A2)复合的T-细胞表位C2(SEQ ID NO：6)证明了包含该融合的表位-肽(C2(SEQ IDNO：6))的示例性的靶向细胞的蛋白(SLT-1A：：scFv1：：C2(SEQ ID NO：61)，“无活性的SLT-1A：：scFv2：：C2”(SEQ ID NO：53)，SLT-1A：：scFv5：：C2(SEQ ID NO：57)，和SLT-1A：：scFv7：：C2(SEQ ID NO：60))能够进入靶细胞，进行充分的亚细胞按路线发送，并且将充分的C2(SEQ ID NO：6)表位递送至MHC I类路径，用于由靶细胞表面的表面呈递。
V.检测中毒的靶细胞的细胞毒性T细胞介导的细胞溶解和由本发明的细胞靶向分 子递送T-细胞表位的MHC I类呈递引发的其他免疫应答
在本实施例中，使用本领域已知的标准测定来研究靶细胞对由本发明的示例性细胞靶向分子递送的T-细胞表位的MHC I类呈递的功能性后果。所研究的功能性后果包括CTL激活(例如，信号级联诱导)，CTL介导的靶细胞杀死，和CTL的CTL细胞因子释放。
使用基于CTL的细胞毒性测定来评估表位呈递的后果。所述测定涉及组织培养的靶细胞和T细胞。上文部分IV.检测表位-肽递送和靶细胞表面呈递等中所述的本发明的示例性的细胞靶向分子使靶细胞中毒。简言之，将靶标阳性细胞在标准条件下用不同的外源施用的分子(包括本发明的细胞靶向分子)温育二十小时。接着，向处理的靶细胞中加入CTL，并且温育，以允许CTL识别并结合任意展示表位-肽/MHC I类复合物(pMHC I)的靶细胞。然后，使用技术人员已知的标准方法研究pMHC I识别的某些功能性后果，包括通过ELISA或ELISPOT研究与靶细胞的CTL结合，CTL-介导的细胞溶解对呈递表位的靶细胞的杀死，和细胞因子(如IFN-γ或白介素)的释放。
进行测定来评估响应由被靶向的展示由本发明的示例性的细胞靶向分子递送的表位的癌细胞的细胞表面表位呈递的T细胞的细胞间接合的功能性后果。
图9和表5显示按照供应商的说明书使用的干扰素γELIspot测定(Mabtech，Inc.，Cincinnati，OH，U.S.)的结果。该ELISPOT测定可以用于定量IFN-γ分泌，每个点表示分泌IFN-γ的细胞。简言之，将靶标阳性细胞系G的细胞样品用下述温育20小时：仅用磷酸缓冲盐水(PBS)缓冲液(“仅有缓冲液”)，“无活性的SLT-1A：：scFv2：：C2”(SEQ ID NO：53)，或参比分子“无活性的SLT-1A：：scFv2”(SEQ ID NO：65)。将样品用PBS清洗，并且添加到已经负载了来自Cellular Technology Limited(Shaker Heights，OH，U.S.)的人PBMC(HLA-A2血清型)的ELISPOT平板中。将平板再温育24小时，然后按照干扰素γELIspot测定MabTech试剂盒使用说明检测各个点，并且使用ELISPOT平板读取仪(Zellnet Consulting，Inc.，FortLee，NJ，U.S.)定量。
表5.在识别与“无活性的SLTA-1A：：scFv2：：C2”温育的靶细胞的表位呈递后，PBMC的干扰素γ分泌
表5和图9的结果表明，用本发明示例性的细胞靶向分子“无活性的SLT-1A：：scFv2：：C2”(SEQ ID NO：53)温育细胞系G细胞导致的PBMC荧光素酶活性信号大于用仅用缓冲液处理的细胞样品确定的背景信号或用参比分子“无活性的SLT-1A：：scFv2”(SEQ IDNO：65)处理的样品细胞的荧光素酶信号。来自该体外细胞间免疫细胞接合测定的结果表明，志贺毒素效应物多肽-介导的融合的表位-肽向靶标阳性癌细胞的递送以及随后被靶向的癌细胞对所述表位的细胞表面呈递可以导致免疫细胞的细胞间接合，这具有功能性后果，特别是PBMC的IFN-γ分泌。
当效应物T细胞识别特定的表位-MHC-I复合物时，所述T细胞可以起始细胞内信号传导级联，其驱动激活的T细胞核因子(nuclear factor of activated T-cells，NFAT)转录因子从细胞溶胶向细胞核的转运，并且可以导致包含NFAT响应元件(RE)的基因表达的刺激(参见，例如，Macian F，Nat Rev Immunol 5：472-84(2005))。将改造表达特异性识别F2肽/人HLA A2 MHC I类分子复合物的人T细胞受体的J76 T细胞系(Berdien B等人，HumVaccin Immunother 9：1205-16(2013))转染由NFAT-RE调节的荧光素酶表达载体(pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Hygro]，CAT#E8481，Promega Corp.，Madison，WI，U.S.)。当所述荧光素酶-报道子-转染的J76TCR特异性细胞识别展示HLA-A2/F2表位-肽(SEQ ID NO：10)复合物的细胞时，然后可以由NFAT转录因子与表达载体的NFAT-RE的结合刺激荧光素酶的表达。通过添加标准荧光素酶底物，然后使用光感测器读取发光水平，可以定量转染的J76细胞中的荧光素酶活性水平。
进行测定来评估在识别被靶向的展示由本发明示例性的细胞靶向分子递送的表位的癌细胞的细胞表面表位呈递后的细胞间T细胞激活。简言之，将细胞系F的细胞样品用“无活性的SLT-1A：：scFv6：：F2”(SEQ ID NO：59)、参比分子“无活性的SLT-1A：：scFv6”(SEQID NO：68)或禁用单独的缓冲液温育6小时，然后清洗。然后，将荧光素酶-报道子-转染的J76T细胞与每种样品混合，并且将细胞混合物温育18小时。接着，使用One-GloTM荧光素酶测定系统试剂(Promega Corp.，Madison，WI，U.S.)测量荧光素酶活性。图10和表6显示该细胞间T细胞接合测定的结果。
表6.在识别由与“无活性的SLTA-1A：：scFv6：：F2”温育的靶细胞的表位呈递后，由报道子细胞中的NFAT响应元件驱动的荧光素酶信号
表6和图10的结果显示，用本发明示例性的细胞靶向分子“无活性的SLT-1A：：scFv6：：F2”(SEQ ID NO：59)温育导致的荧光素酶活性水平大于用“仅有缓冲液”处理的细胞确定的背景荧光素酶活性信号或用阴性对照分子“无活性的SLT-1A：：scFv6”(SEQ IDNO：68)处理的细胞样品的荧光素酶活性。该体外T细胞接合测定表明，志贺毒素效应物多肽-介导的将融合的表位-肽递送至靶标阳性的癌细胞和随后由被靶向的癌细胞表面呈递所述表位可以导致T细胞激活特有的T细胞的细胞间接合和细胞内细胞信号传导。
另外，使用商购CTL响应测定，例如，非放射性测定(Promega，Madison，WI，U.S.)，粒酶B ELISpot测定(Mabtech，Inc.，Cincinnati，OH，U.S.)，胱天蛋白酶活性测定，和LAMP-1转运流式细胞术测定，定量展示表位-肽/MHC I类复合物(pMHC I)的靶细胞对CTL的激活。为了特异性监测CTL-介导的靶细胞杀死，对靶细胞使用羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)，用于体外和体内研究，如本领域所述(参见，例如，Durward M等人，JVis Exp 45pii 2250(2010))。
总之，多种细胞靶向分子，它们分别包含：1)靶向细胞的结合区，2)志贺毒素效应物多肽，和3)融合的异源人CD8+ T-细胞表位货物，表现出一定水平的细胞毒性，这证明它们分别表现出充分水平的将志贺毒素效应物多肽组分发送到细胞溶胶的细胞内按路线发送(表7)。综合来看，这些结果表明，尽管存在融合的表位-肽，并且与分子内的表位货物的位置无关，可以以高水平保留志贺毒素效应物功能，特别是亚细胞按路线发送(表7)。此外，一些细胞靶向分子表现出充分水平的表位货物递送，足以产生刺激与呈递表位-货物的细胞的细胞内T细胞接合的表位-MHC I类呈递水平。
表7.关于上述检测的本发明示例性的细胞靶向分子的实验结果的总结
实施例2.包含志贺毒素A亚基效应物多肽和CD8+ T-细胞表位-肽的靶向IL-2R的细胞靶向分子
在本实施例中，志贺毒素效应物多肽来源于上文所述的志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)，任选地具有赋予弗林蛋白酶切割抗性的氨基酸残基置换，诸如，例如，R248A/R251A(WO 2015/191764)。基于MHC I分子结合预测，HLA类型，已经表征的免疫原性，和上述所述的容易得到的试剂，如C1-2表位-肽GLDRNSGNY(SEQ ID NO：5)，选择CD8+ T-细胞表位-肽。蛋白样结合区来源于针对人白介素2受体(IL-2R)的配体(细胞因子白介素2或IL-2)，其能够特异性结合人IL-2R的细胞外部分。IL-2R是由多种免疫细胞类型表达的细胞表面受体，所述免疫细胞类型如T细胞和天然杀伤细胞。
构建并产生靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白
将配体型结合区αIL-2R、志贺毒素效应物多肽和CD8+ T-细胞表位融合在一起，形成单一的连续的多条，诸如“C1-2：：SLT-1A：：IL-2”或“IL-2：：C1-2：：SLT-1A”，以及任选地，在得到的多肽的羧基端添加KDEL。
确定靶向IL-2R的细胞靶向分子的体外特征
通过基于荧光的流式细胞术确定本实施例的细胞靶向分子针对IL-2R阳性细胞和IL-2R阴性细胞的结合特征。本实施例的某些靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白针对阳性细胞的Bmax测量为约50,000-200,000MFI，KD在0.01-100nM范围内，而在该测定中没有针对IL-2R阴性细胞的显著结合。
在如前述实施例中所述的不含细胞的体外蛋白翻译中确定本实施例的靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白的核糖体失活能力。本实施例的细胞靶向分子对不含细胞的蛋白合成的抑制作用是显著的。对于某些靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白，在该不含细胞的测定中对蛋白合成的IC50为约0.1-100pM。
使用细胞杀死测定确定靶向IL-2R的细胞靶向分子的细胞毒性
使用IL-2R阳性细胞，通过在上文前述实施例中所述的通用细胞杀死测定，确定本实施例的靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白的细胞毒性特征。另外，使用IL-2R阴性细胞作为与IL-2R阳性细胞的对比，通过相同的通用细胞杀死测定确定该实施例相同的靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白的选择性细胞毒性特征。取决于细胞系，本实施例的细胞靶向分子针对IL-2R阳性细胞的CD50值为约0.01-100nM。与确实在细胞表面上表达IL-2R的细胞相比，对于不在细胞表面上表达IL-2R的细胞，本实施例的靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白的CD50值为大约10-10,000倍更高(细胞毒性较低)。另外，使用技术人员已知的和/或本文所述的测定，针对通过导致CTL-介导的细胞毒性的异源CD8+ T-细胞表位递送和呈递引起的间接细胞毒性，研究本实施例的靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白对呈递C1-2的靶细胞的分子间CD8+ T细胞接合的诱导和细胞毒性。
使用动物模型确定靶向IL-2R的细胞靶向分子的体内作用
使用动物模型来确定本实施例的某些靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白对赘生性细胞的体内作用。使用多种小鼠品系来检测静脉内施用的本实施例的靶向IL-2R的细胞靶向融合蛋白对小鼠中IL-2R阳性细胞的作用。使用技术人员已知的和/或本文所述的测定，针对直接细胞毒性和间接细胞毒性(通过导致CTL-介导的细胞毒性的CD8+ T-细胞表位递送和呈递引起)二者研究细胞杀死作用。任选地，使用本实施例的细胞靶向分子的“无活性的”变体(例如，E167D)，来研究在不存在所述细胞靶向分子的任意志贺毒素效应物多肽组分的催化活性的条件下由CD8+ T-细胞表位递送引起的间接细胞毒性。
实施例3.包含志贺毒素效应物多肽和异源CD8+ T-细胞表位的靶向CEA的细胞靶向分子
成年人中的癌胚抗原(CEA)表达与癌细胞相关，诸如例如，乳腺、结肠、非、胰腺和胃的腺癌。在本实施例中，志贺毒素效应物多肽来源于志贺毒素的A亚基(StxA)，任选地具有赋予弗林蛋白酶切割抗性的氨基酸残基置换R248A/R251A(WO 2015/191764)。基于MHC I分子结合预测，HLA类型，已经表征的免疫原性，和上文所述的容易得到的试剂，诸如实施例1和表1中所述的F3-表位ILRGSVAHK(SEQ ID NO：11)，选择人CD8+ T-细胞表位-肽。免疫球蛋白型结合区αCEA，其特异性且以高亲和力结合人癌胚抗原(CEA)上的细胞外抗原，诸如第十个人纤连蛋白III型结构域来源的结合区C743，如在Pirie C等人，J Biol Chem 286：4165-72(2011)中所述。
靶向CEA的细胞靶向分子的构建、产生和纯化
使用技术人员已知的标准方法，将志贺毒素效应物多肽、αCEA结合区多肽和异源CD8+ T-细胞表位-肽可操作地连接在一起，形成本发明的细胞靶向分子。例如，通过编码下述的一种或多种的多核苷酸产生融合蛋白：StxA：：αCEA：：F3，StxA：：F3：：αCEA，αCEA：：StxA：：F3，F3：：αCEA：：StxA，αCEA：：F3：：StxA，和F3：：StxA：：αCEA，它们分别任选地在融合的蛋白样组分之间具有本文所述的一个或多个蛋白样接头。使用细菌和/或在前述实施例中所述的不含细胞的蛋白翻译系统实现这些示例性的靶向CEA的融合蛋白的表达。
确定示例性的靶向CEA的细朐靶向融合蛋白的体外特征
通过基于荧光的流式细胞术确定本实施例的细胞靶向分子针对CEA阳性细胞和CEA阴性细胞的结合特征。StxA：：αCEA：：F3，StxA：：F3：：αCEA，αCEA：：StxA：：F3，F3：：αCEA：：StxA，αCEA：：F3：：StxA和F3：：StxA：：αCEA针对CEA阳性细胞的Bmax分别测量为约50,000-200,000MFI，KD在0.01-100nM范围内，而在该测定中没有显著的针对CEA阴性细胞的结合。
在如上文前述实施例中所述的不含细胞的体外蛋白翻译中，确定本实施例的融合蛋白的核糖体灭活能力。本实施例的细胞毒性融合蛋白对不含细胞的蛋白合成的抑制作用是显著的。在该不含细胞的测定中针对StxA：：αCEA：：F3，StxA：：F3：：αCEA，αCEA：：StxA：：F3，F3：：αCEA：：StxA，αCEA：：F3：：StxA，和F3：：StxA：：αCEA测量的对蛋白合成的IC50值分别为约0.1-100pM。
使用细朐杀死测定确定示例性的靶向CEA的细朐靶向融合蛋白的细朐毒性
使用CEA阳性细胞，通过在上文前述实施例中所述的通用细胞杀死测定，确定本实施例的细胞靶向分子的细胞毒性特征。另外，使用CEA阴性细胞作为与CEA抗原阳性细胞的对比，通过相同的通用细胞杀死测定确定所述示例性的靶向CEA的细胞靶向融合蛋白的选择性细胞毒性特征。取决于细胞系，针对StxA：：αCEA：：F3，StxA：：F3：：αCEA，αCEA：：StxA：：F3，F3：：αCEA：：StxA，αCEA：：F3：：StxA和F3：：StxA：：αCEA测量的对CEA阳性细胞的CD50值为约0.01-100nM。与确实在细胞表面上表达CEA的细胞相比，对于不在细胞表面上表达CEA的细胞，本实施例的靶向CEA的细胞靶向融合蛋白的CD50值为大约10-10,000倍更高(细胞毒性较低)。另外，使用技术人员已知的和/或本文所述的测定，针对通过导致CTL-介导的细胞毒性的异源CD8+ T-细胞表位递送和呈递引起的间接细胞毒性，研究StxA：：αCEA：：F3，StxA：：F3：：αCEA，αCEA：：StxA：：F3，F3：：αCEA：：StxA，αCEA：：F3：：StxA，和F3：：StxA：：αCEA对呈递F3的靶细胞的分子间CD8+ T细胞接合的诱导和细胞毒性。
使用动物模型确定示例性的靶向CEA的细胞靶向融合蛋白的体内作用
使用动物模型来确定示例性的靶向CEA的融合蛋白对赘生性细胞的体内作用。使用多种小鼠品系，在向注射了在其细胞表面上表达CEA的人赘生性细胞的小鼠静脉内施用后，检测靶向细胞的融合蛋白StxA：：αCEA：：F3，StxA：：F3：：αCEA，αCEA：：StxA：：F3，F3：：αCEA：：StxA，αCEA：：F3：：StxA，和F3：：StxA：：αCEA对异种移植肿瘤的作用。使用技术人员已知的和/或本文所述的测定，针对直接细胞毒性和间接细胞毒性(通过导致CTL-介导的细胞毒性的CD8+ T-细胞表位货物递送和呈递引起)二者研究细胞杀死。任选地，使用本实施例的细胞靶向分子的“无活性的”变体(例如，E167D)，来研究在不存在所述细胞靶向分子的任意志贺毒素效应物多肽组分的催化活性的条件下由CD8+ T-细胞表位递送引起的间接细胞毒性。
实施例4.包含志贺毒素效应物多肽和异源CD8+ T-细胞表位的靶向HER2的细胞靶向分子
已经在乳腺、结直肠、子宫内膜、食管、胃、头颈、肺、卵巢、前列腺、胰腺和睾丸生长细胞的肿瘤细胞中观察到HER2过表达。在本实施例中，志贺毒素效应物多肽来源于志贺毒素的A亚基(StxA)，任选地具有赋予弗林蛋白酶切割抗性的氨基酸残基置换R248A/R251A(WO 2015/191764)。基于MHC I分子结合预测，HLA类型，已经表征的免疫原性，和上文所述的容易得到的试剂，诸如实施例1和表1中所述的C3-表位GVMTRGRLK(SEQ ID NO：7)，选择人CD8+ T-细胞表位-肽。结合区αHER2，其结合人HER2的细胞外部分，通过筛选产生或选自技术人员已知的可获得的免疫球蛋白型多肽(参见，例如，anyrin重复DARPinTMG3，其以高亲和力结合HER2的细胞外表位(Goldstein R等人，Eur J Nucl Med Mol Imaging 42：288-301(2015)))。
靶向HER2的细胞靶向分子的构建、产生和纯化
使用技术人员已知的标准方法，将志贺毒素效应物多肽、αHER2结合区多肽和异源CD8+ T-细胞表位-肽可操作地连接在一起，形成本发明的细胞靶向分子。例如，通过编码下述的一种或多种的多核苷酸产生融合蛋白：StxA：：αHER2：：C3，StxA：：C3：：αHER2，αHER2：：StxA：：C3，C3：：αHER2：：StxA，αHER2：：C3：：StxA，和C3：：StxA：：αHER2，它们分别任选地在融合的蛋白样组分之间具有本文所述的一个或多个蛋白样接头。使用细菌和/或在前述实施例中所述的不含细胞的蛋白翻译系统实现这些示例性的靶向HER2的融合蛋白的表达。
确定示例性的靶向HER2的细胞靶向融合蛋白的体外特征
通过基于荧光的流式细胞术确定本实施例的细胞靶向分子针对HER2阳性细胞和HER2阴性细胞的结合特征。StxA：：αHER2：：C3，StxA：：C3：：αHER2，αHER2：：StxA：：C3，C3：：αHER2：：StxA，αHER2：：C3：：StxA，和C3：：StxA：：αHER2针对HER2阳性细胞的Bmax分别测量为约50,000-200,000MFI，KD在0.01-100nM范围内，而在该测定中没有针对显著的HER2阴性细胞的结合。
在如上文前述实施例中所述的不含细胞的体外蛋白翻译中，确定本实施例的融合蛋白的核糖体灭活能力。本实施例的细胞毒性融合蛋白对不含细胞的蛋白合成的抑制作用是显著的。在该不含细胞的测定中针对StxA：：αHER2：：C3，StxA：：C3：：αHER2，αHER2：：StxA：：C3，C3：：αHER2：：StxA，αHER2：：C3：：StxA，和C3：：StxA：：αHER2测量的对蛋白合成的IC50值分别为约0.1-100pM。
使用细胞杀死测定确定示例性的靶向HER2的细胞靶向融合蛋白的细胞毒性
使用HER2阳性细胞，通过在上文前述实施例中所述的通用细胞杀死测定，确定本实施例的细胞靶向分子的细胞毒性特征。另外，使用HER2阴性细胞作为与HER2抗原阳性细胞的对比，通过相同的通用细胞杀死测定确定所述示例性的靶向HER2的细胞靶向融合蛋白的选择性细胞毒性特征。取决于细胞系，针对StxA：：αHER2：：C3，StxA：：C3：：αHER2，αHER2：：StxA：：C3，C3：：αHER2：：StxA，αHER2：：C3：：StxA，和C3：：StxA：：αHER2测量的对HER2阳性细胞的CD50值为约0.01-100nM。与确实在细胞表面上表达HER2的细胞相比，对于不在细胞表面上表达HER2的细胞，本实施例的靶向HER2的细胞靶向融合蛋白的CD50值为大约10-10,000倍更高(细胞毒性较低)。另外，使用技术人员已知的和/或本文所述的测定，针对通过导致CTL-介导的细胞毒性的异源CD8+ T-细胞表位递送和呈递引起的间接细胞毒性，研究StxA：：αHER2：：C3，StxA：：C3：：αHER2，αHER2：：StxA：：C3，C3：：αHER2：：StxA，αHER2：：C3：：StxA，和C3：：StxA：：αHER2对呈递C3的靶细胞的分子间CD8+ T细胞接合的诱导和细胞毒性。
使用动物模型确定示例性的靶向HER2的细胞靶向融合蛋白的体内作用
使用动物模型来确定示例性的靶向HER2的融合蛋白对赘生性细胞的体内作用。使用多种小鼠品系，在向注射了在其细胞表面上表达HER2的人赘生性细胞的小鼠静脉内施用后，检测靶向细胞的融合蛋白StxA：：αHER2：：C3，StxA：：C3：：αHER2，αHER2：：StxA：：C3，C3：：αHER2：：StxA，αHER2：：C3：：StxA，和C3：：StxA：：αHER2对异种移植肿瘤的作用。使用技术人员已知的和/或本文所述的测定，针对直接细胞毒性和间接细胞毒性(通过导致CTL-介导的细胞毒性的CD8+ T-细胞表位货物递送和呈递引起)二者研究细胞杀死。任选地，使用本实施例的细胞靶向分子的“无活性的”变体(例如，E167D)，来研究在不存在所述细胞靶向分子的任意志贺毒素效应物多肽组分的催化活性的条件下由CD8+ T-细胞表位递送引起的间接细胞毒性。
实施例5.包含志贺毒素效应物多肽和异源CD8+ T-细胞表位的靶向EGFR的细胞靶向分子
表皮生长因子受体的表达与人癌细胞相关，诸如，例如，肺癌细胞，乳腺癌细胞和结肠癌细胞。在本实施例中，志贺毒素效应物多肽来源于志贺毒素的A亚基(StxA)，任选地具有赋予弗林蛋白酶切割抗性的氨基酸残基置换R248A/R251A(WO 2015/191764)。基于MHCI分子结合预测，HLA类型，已经表征的免疫原性，和上文所述的容易得到的试剂，诸如实施例1和表1中所述的C1-表位VTEHDTLLY(SEQ ID NO：4)，选择人CD8+ T-细胞表位-肽。结合区αEGFR来源于AdNectinTM(GenBank Accession：3QWQ_B)，AffibodyTM(GenBank Accession：2KZI_A；美国专利8,598,113)，或抗体，它们全部结合一种或多种人表皮生长因子受体的细胞外部分。
靶向EGFR的细胞靶向分子的构建、产生和纯化
使用技术人员已知的标准方法，将志贺毒素效应物多肽、αEGFR结合区多肽和异源CD8+ T-细胞表位-肽可操作地连接在一起，形成本发明的细胞靶向分子。例如，通过编码下述的一种或多种的多核苷酸产生融合蛋白：StxA：：αEGFR：：C1，StxA：：C1：：αEGFR，αEGFR：：StxA：：C1，C1：：αEGFR：：StxA，αEGFR：：C1：：StxA，和C1：：StxA：：αEGFR，它们分别任选地在融合的蛋白样组分之间具有本文所述的一个或多个蛋白样接头。使用细菌和/或在前述实施例中所述的不含细胞的蛋白翻译系统实现这些示例性的靶向EGFR的融合蛋白的表达。
确定示例性的靶向EGFR的细胞靶向融合蛋白的体外特征
通过基于荧光的流式细胞术确定本实施例的细胞靶向分子针对EGFR+细胞和EGFR-细胞的结合特征。StxA：：αEGFR：：C1，StxA：：C1：：αEGFR，αEGFR：：StxA：：C1，C1：：αEGFR：：StxA，αEGFR：：C1：：StxA，和C1：：StxA：：αEGFR针对EGFR阳性细胞的Bmax分别测量为约50,000-200,000MFI，KD在0.01-100nM范围内，而在该测定中没有显著的针对EGFR阴性细胞的结合。
在如上文前述实施例中所述的不含细胞的体外蛋白翻译中，确定本实施例的融合蛋白的核糖体灭活能力。本实施例的细胞毒性融合蛋白对不含细胞的蛋白合成的抑制作用是显著的。在该不含细胞的测定中针对StxA：：αEGFR：：C1，StxA：：C1：：αEGFR，αEGFR：：StxA：：C1，C1：：αEGFR：：StxA，αEGFR：：C1：：StxA，和C1：：StxA：：αEGFR测量的对蛋白合成的IC50值分别为约0.1-100pM。
使用细朐杀死测定确定示例性的靶向EGFR的细朐靶向融合蛋白的细朐毒性
使用EGFR+细胞，通过在上文前述实施例中所述的通用细胞杀死测定，确定本实施例的细胞靶向分子的细胞毒性特征。另外，使用EGFR-细胞作为与EGFR抗原阳性细胞的对比，通过相同的通用细胞杀死测定确定所述示例性的靶向EGFR的细胞靶向融合蛋白的选择性细胞毒性特征。取决于细胞系，针对StxA：：αEGFR：：C1，StxA：：C1：：αEGFR，αEGFR：：StxA：：C1，C1：：αEGFR：：StxA，αEGFR：：C1：：StxA，和C1：：StxA：：αEGFR测量的对EGFR阳性细胞的CD50值为约0.01-100nM。与确实在细胞表面上表达EGFR的细胞相比，对于不在细胞表面上表达EGFR的细胞，本实施例的靶向EGFR的细胞靶向融合蛋白的CD50值为大约10-10,000倍更高(细胞毒性较低)。另外，使用技术人员已知的和/或本文所述的测定，针对通过导致CTL-介导的细胞毒性的异源CD8+ T-细胞表位递送和呈递引起的间接细胞毒性，研究StxA：：αEGFR：：C1，StxA：：C1：：αEGFR，αEGFR：：StxA：：C1，C1：：αEGFR：：StxA，αEGFR：：C1：：StxA，和C1：：StxA：：αEGFR对呈递C1的靶细胞的分子间CD8+ T细胞接合的诱导和细胞毒性。
使用动物模型确定示例性的靶向EGFR的细朐靶向融合蛋白的体内作用
使用动物模型来确定示例性的靶向EGFR的融合蛋白对赘生性细胞的体内作用。使用多种小鼠品系，在向注射了在其细胞表面上表达EGFR的人赘生性细胞的小鼠静脉内施用后，检测靶向细胞的融合蛋白StxA：：αEGFR：：C1，StxA：：C1：：αEGFR，αEGFR：：StxA：：C1，C1：：αEGFR：：StxA，αEGFR：：C1：：StxA，和C1：：StxA：：αEGFR对异种移植肿瘤的作用。使用技术人员已知的和/或本文所述的测定，针对直接细胞毒性和间接细胞毒性(通过导致CTL-介导的CD8+ T-细胞表位货物递送和呈递引起)二者研究细胞杀死。任选地，使用本实施例的细胞靶向分子的“无活性的”变体(例如，E167D)，来研究在不存在所述细胞靶向分子的任意志贺毒素效应物多肽组分的催化活性的条件下由CD8+ T-细胞表位递送引起的间接细胞毒性。
实施例6.靶向多种细胞类型的细胞靶向分子，其分别包含志贺毒素A亚基效应物多肽和一种或多种位于所述志贺毒素A亚基效应物多肽组分羧基端的异源CD8+ T-细胞表位-肽
在本实施例中，将三种蛋白样结构彼此连接，形成本发明示例性的细胞靶向分子。具有志贺毒素A1片段区域的志贺毒素A亚基效应物多肽组分来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)、志贺毒素的A亚基(StxA)和/或志贺样毒素2的A亚基(SLT-2A)，任选地具有赋予弗林蛋白酶切割抗性的氨基酸残基置换(WO 2015/191764)。诸如，例如，基于MHC I分子结合预测，HLA类型，已经表征的免疫原性，和本文所述的容易得到的试剂，选择一种或多种CD8+ T-细胞表位-肽。结合区组分来源于选自表8第1列的分子的免疫球蛋白结构域，并且其结合表8第2列所示的细胞外靶标生物分子。
使用本领域已知的试剂和技术，将下述三种组分彼此连接：1)免疫球蛋白来源的结合区，2)志贺毒素效应物多肽，和3)CD8+ T-细胞表位-肽或更大的包含至少一个异源CD8+ T-细胞表位-肽的多肽，形成本发明的细胞靶向分子，其中CD8+ T-细胞表位-肽位于所述志贺毒素效应物多肽的志贺毒素A1片段区域的羧基端的羧基末端。如在前述实施例中搜书，使用表达适当的细胞外靶标生物分子的细胞，检测本实施例的示例性的细胞靶向分子。例如，本实施例的示例性的细胞靶向分子可以用于诊断和治疗表8第3列所示的疾病、病患和/或病症。
表8.用于细胞靶向的多种结合区
尽管已经通过举例说明的方式描述了本发明的一些实施方案，但是，显而易见，可以利用许多修改、变化和改编以及利用在本领域技术人员范围内的众多等同或替代方案实施本发明，而不背离本发明的精神或超出权利要求书的范围。
所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文，达到如同明确地且单独地指出每篇单独的出版物、专利或专利申请通过引用整体并入的程度。美国临时专利申请系列号61/777,130，61/932,000，61/951,110，61/951,121，62/010,918和62/049,325的公开内容各自通过引用整体并入本文。国际专利申请公布WO 2014/164680，WO 2014/164693，WO2015/138435，WO 2015/138452，WO 2015/113005，WO 2015/113007和WO 2015/191764各自通过引用整体并入本文。美国专利申请公布US 2007/0298434 A1，US 2009/0156417 A1，US2013/0196928 A1和US 2016/0177284 A1的功能内容各自通过引用整体并入本文。国际PCT专利申请系列号PCT/US2016/016580的公开内容通过引用整体并入本文。关于在本文中引用的氨基酸和核苷酸序列的来自GenBank(国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)，美国)的所有可电子获得的生物序列信息的完整公开内容各自通过引用整体并入本文。

Claims (36)

1.包含下述的细胞靶向分子：
i)具有志贺毒素A1片段区的志贺毒素效应物多肽，
ii)异源结合区，其能够特异性结合至少一个细胞外靶标生物分子，和
iii)异源的CD8+T-细胞表位，其没有嵌入在所述志贺毒素A1片段区内；
由此向细胞施用所述细胞靶向分子导致所述细胞对所述细胞靶向分子的内在化和所述细胞将与MHC I类分子复合的所述CD8+T-细胞表位呈递在细胞表面上。
2.权利要求1的细胞靶向分子，其中所述CD8+T-细胞表位融合在所述志贺毒素效应物多肽或所述结合区上。
3.权利要求2的细胞靶向分子，其中所述细胞靶向分子包含含有所述结合区、所述志贺毒素效应物多肽和所述CD8+T-细胞表位的单链多肽。
4.权利要求2的细胞靶向分子，其中所述结合区包含两条以上的多肽链，并且所述T-细胞表位-肽融合在包含所述志贺毒素效应物多肽和所述两条以上多肽链之一的多肽上。
5.权利要求1-4中任一项的细胞靶向分子，其中所述志贺毒素效应物多肽包含具有羧基端的来源于志贺毒素A1片段的区域，并且所述异源的CD8+T-细胞表位位于所述来源于志贺毒素A1片段的区域的羧基端的羧基末端。
6.权利要求1-5中任一项的细胞靶向分子，其中所述结合区包含选自由下述组成的组的多肽：
单结构域抗体片段，单链可变片段，抗体可变片段，互补决定区3片段，限制的FR3-CDR3-FR4多肽，Fd片段，抗原-结合片段，南美犰狳重复多肽，纤连蛋白-来源的第10个纤连蛋白III型结构域，生腱蛋白III型结构域，锚蛋白重复基序结构域，低密度脂蛋白受体来源的A-结构域，脂质运载蛋白，Kunitz结构域，蛋白-A-来源的Z结构域，γ-B结晶来源的结构域，泛蛋白-来源的结构域，Sac7d-来源的多肽，Fyn-来源的SH2结构域，小蛋白，C-型凝集素-样结构域支架，工程改造的抗体模拟物，以及任何前述物质的保留结合功能性的任何遗传操作的对应物。
7.权利要求1-6中任一项的细胞靶向分子，其中所述志贺毒素效应物多肽包含选自由下述组成的组的多肽序列或基本上由选自由下述组成的组的多肽序列组成：
(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸75-251；
(ii)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸1-241；
(iii)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸1-251；和
(iv)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸1-261。
8.权利要求1-6中任一项的细胞靶向分子，其中所述来源于志贺毒素A1片段的区域的羧基端包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序。
9.权利要求8的细胞靶向分子，其中，相对于野生型志贺毒素A亚基，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个突变，所述突变改变天然位于志贺样毒素1的A亚基(SEQID NO：1)或志贺毒素的A亚基(SEQ ID NO：2)的248-251处或志贺样毒素2的A亚基(SEQ IDNO：3)的247-250处的区域中的至少一个氨基酸残基。
10.权利要求8或权利要求9的细胞靶向分子，其中，相对于野生型志贺毒素A亚基，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基置换。
11.权利要求10的细胞靶向分子，其中所述在弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基置换是用选自由下述组成的组的不带正电荷氨基酸残基置换精氨酸残基：
丙氨酸，甘氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸。
12.权利要求1-11中任一项的细胞靶向分子，其中所述结合区能够结合选自由下述组成的组的细胞外靶标生物分子：
CD20，CD22，CD40，CD74，CD79，CD25，CD30，HER2/neu/ErbB2，EGFR，EpCAM，EphB2，前列腺-特异性膜抗原，Cripto，CDCP1，内皮糖蛋白，成纤维细胞活化的蛋白，Lewis-Y，CD19，CD21，CS1/SLAMF7，CD33，CD52，CD133，CEA，gpA33，粘蛋白，TAG-72，酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体，碳酸酐酶IX，叶酸结合蛋白，神经节苷脂GD2，神经节苷脂GD3，神经节苷脂GM2，神经节苷脂Lewis-Y2，VEGFR，αVβ3，α5β1，ErbB1/EGFR，Erb3，c-MET，IGF1R，EphA3，TRAIL-R1，TRAIL-R2，RANK，FAP，生腱蛋白，CD64，间皮素，BRCA1，MART-1/MelanA，gp100，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，GAGE-1/2，BAGE，RAGE，NY-ESO-1，CDK-4，β-联蛋白，MUM-1，胱天蛋白酶-8，KIAA0205，HPVE6，SART-1，PRAME，癌胚抗原，前列腺特异性抗原，前列腺干细胞抗原，人天冬氨酰基(天冬酰胺酰基)β-羟化酶，EphA2，HER3/ErbB-3，MUC1，MART-1/MelanA，gp100，酪氨酸酶相关的抗原，HPV-E7，EB病毒抗原，Bcr-Ab1，甲胎蛋白抗原，17-A1，膀胱肿瘤抗原，CD38，CD15，CD23，CD45，CD53，CD88，CD129，CD183，CD191，CD193，CD244，CD294，CD305，C3AR，FceRIa，IL-1R，半乳凝集素-9，mrp-14，NKG2D，PD-L1，Siglec-8，Siglec-10，CD49d，CD13，CD44，CD54，CD63，CD69，CD123，TLR4，FceRIa，IgE，CD107a，CD203c，CD14，CD68，CD80，CD86，CD105，CD115，F4/80，ILT-3，半乳凝集素-3，CD11a-c，GITRL，MHC I类分子，MHCII类分子，CD284，CD107-Mac3，CD195，HLA-DR，CD16/32，CD282，CD11c，以及前述任一种的任意免疫原性片段。
13.权利要求1-12中任一项的细胞靶向分子，其中将所述细胞靶向分子施用给与所述结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞，所述细胞靶向分子能够引起所述细胞死亡。
14.权利要求13的细胞靶向分子，其中将所述细胞靶向分子施用给其成员与所述结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的第一细胞群体和其成员不与所述结合区的任意细胞外靶标生物分子物理连接的第二细胞群体，相对于所述第二细胞群体的成员，所述细胞靶向分子针对所述第一细胞群体成员的细胞毒性作用是至少3倍高。
15.权利要求1-14中任一项的细胞靶向分子，其中，相对于志贺毒素家族成员的天然存在的A亚基，所述志贺毒素效应物多肽包含突变，所述突变改变所述志贺毒素效应物区域的酶活性，所述突变选自至少一个氨基酸残基缺失、插入或置换。
16.权利要求15的细胞靶向分子，其中所述突变选自减少或消除毒素效应物多肽的细胞毒性的至少一个氨基酸残基缺失、插入或置换。
17.权利要求1-16中任一项的细胞靶向分子，其包含SEQ ID NOs：13-61和73-115中任一项的多肽或基本上由SEQ ID NOs：13-61和73-115中任一项的多肽组成。
18.药物组合物，其包含权利要求1-17中任一项的细胞靶向分子和至少一种药用赋形剂或载体。
19.能够编码权利要求1-17中任一项的细胞靶向分子的多核苷酸或其互补物，或任意前述物质的片段。
20.包含权利要求19的多核苷酸的表达载体。
21.包含权利要求19-20的多核苷酸或表达载体中的任一种的宿主细胞。
22.杀死细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求1-17中任一项的细胞靶向分子或权利要求18的药物组合物接触的步骤。
23.权利要求22的方法，其中所述接触发生在体外。
24.权利要求22的方法，其中所述接触发生在体内。
25.治疗患者中的疾病、病症或病患的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用治疗有效量的权利要求1-17中任一项的细胞靶向分子或权利要求18的药物组合物的步骤。
26.权利要求25的方法，其中所述疾病、病症或病患选自由下述组成的组：癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症和微生物感染。
27.权利要求26的方法，其中所述癌症选自由下述组成的组：
骨癌、乳腺癌、中枢/周围神经系统癌症、胃肠癌、生殖细胞癌、腺癌、头颈癌、血液学癌症、肾-尿道癌、肝癌、肺/胸膜癌、前列腺癌、肉瘤、皮肤癌和子宫癌。
28.权利要求26的方法，其中所述免疫病症与选自由下述组成的组的疾病相关：
淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、孤独症、心脏发生、克罗恩病、糖尿病、红斑、胃炎、移植排斥、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒性综合征、HIV相关的疾病、红斑狼疮、淋巴组织增生病症、多发性硬化、重症肌无力、神经炎症、结节性多动脉炎、多关节炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、血管炎。
29.用于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症或微生物感染的组合物，所述组合物包含权利要求1-17中任一项的细胞靶向分子。
30.权利要求1-21任一项的物质的组合物在制备用于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症或微生物感染的药物中的用途。
31.一种“播种”于脊索动物内组织部位的方法，所述方法包括向所述脊索动物施用权利要求1-17中任一项的细胞靶向分子，权利要求18的药物组合物的步骤。
32.权利要求31的方法，其中所述细胞靶向分子的T-细胞表位-肽选自由下述组成的组：
不被所述细胞靶向分子的靶细胞在MHC I类复合物中天然呈递的肽，不天然存在于靶细胞表达的任意蛋白内的肽，不天然存在于靶细胞的转录体组或蛋白质组内的肽，不天然存在于待播种的位点的细胞外微环境中的肽，和不天然存在于要被靶向的肿瘤块或感染组织部位中的肽。
33.权利要求31的方法，其中所述组织部位包括恶性的、患病的或发炎的组织。
34.权利要求33的方法，其中所述组织部位包括选自由下述组成的组的组织：肿瘤块，癌性生长，肿瘤，被感染的组织，或异常的细胞块。
35.使用免疫疗法治疗癌症的方法，所述方法包括下述步骤：向有此需要的患者施用权利要求1-17中任一项的细胞靶向分子或权利要求18的药物组合物。
36.试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-21中任一项的物质的组合物；和另外的试剂和/或药物递送装置。
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