ES2882274T3 - Proteínas que comprenden regiones efectoras de la subunidad A de la toxina Shiga próximas al extremo amino terminal y regiones de unión de tipo inmunoglobulina de reconocimiento celular capaces de unirse específicamente a CD38 - Google Patents

Abstract

Proteína citotóxica que comprende: a) una región de unión de tipo inmunoglobulina que comprende uno o más polipéptidos y es capaz de unirse específicamente a al menos una biomolécula diana extracelular, en la que dicha región de unión de tipo inmunoglobulina deriva de un anticuerpo, en la que dicha biomolécula diana extracelular es CD38; y b) una región efectora de la toxina Shiga que comprende un polipéptido que es capaz de efectuar la citotoxicidad de la Subunidad A de la toxina Shiga, y comprende: una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3; o una secuencia de aminoácidos seleccionada de: (i) aminoácidos 75 a 251 de la SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2 o SEQ ID No: 3; (ii) aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; (iii) aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; y (iv) aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, en la que la proteína es capaz de causar la muerte de una célula físicamente acoplada con CD38; y en la que la región de unión y la región efectora de la toxina Shiga están orientadas dentro de la proteína de manera que la región de unión se encuentra en una posición que está más próxima al extremo carboxi terminal de la región efectora de la toxina Shiga que al extremo amino terminal de la región efectora de la toxina Shiga.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas que comprenden regiones efectoras de la subunidad A de la toxina Shiga próximas al extremo amino terminal y regiones de unión de tipo inmunoglobulina de reconocimiento celular capaces de unirse específicamente a CD38

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a proteínas citotóxicas que comprenden regiones de unión de tipo inmunoglobulina para mediar en el reconocimiento celular y regiones efectoras de la toxina Shiga que se combinan de tal manera que las regiones efectoras de la toxina Shiga efectoras son próximas a los extremos amino terminales de las proteínas citotóxicas, tal como se define en las reivindicaciones. Las proteínas de la presente invención tienen usos, por ejemplo, para la eliminación selectiva de tipos celulares específicos, el suministro de materiales exógenos dentro de las células diana, el marcaje de los compartimentos subcelulares de las células diama y como moléculas terapéuticas para el tratamiento de una variedad de enfermedades, trastornos y afecciones, incluidos cánceres, tumores, trastornos inmunes e infecciones microbianas.

ANTECEDENTES

El desarrollo de proteínas de fusión sintéticas a partir de las toxinas que son eficaces como agentes terapéuticos ha desafiado a los científicos durante décadas (Pastan I et al, Annu Rev Med. 58: 221-37 (2007)). Un obstáculo es que los restos de toxina enzimáticos de proteínas citotóxicas sintéticas derivados de las toxinas bacterianas y de plantas deben llegar a sus sustratos diana citosólicos con el fin de eliminar las células. Para muchas proteínas citotóxicas recombinantes, la potencia de la citotoxicidad depende de la eficacia de la molécula en el direccionamiento intracelular (Pirie C et al, J Biol Chem 286: 4165-72 (2011)); sin embargo, la comprensión de cómo las toxinas dirigen su propio transporte intracelular desde los endosomas al citosol sigue siendo un reto para la investigación científica (Antignani A, D Fitzgerald, Toxinas 5: 1486-502 (2013)).

Muchas proteínas contienen secuencias de polipéptidos conservadas llamadas dominios que forman unidades plegadas autocontenidas de estructura de proteína que pueden funcionar independientemente de la proteína completa o cuando se recombinan en una proteína ortóloga (Kirshner M, Gerhart J, Proc Natl Acad Sci USA 95: 8420-7 (1988)). El uso de dominios de proteínas modulares en la creación de nuevas proteínas ofrece posibilidades casi ilimitadas (Nixon A et al., Proc Natl Acad Sci USA 94: 1069-73 (1997)). Una posibilidad es la ingeniería molecular de moléculas quiméricas compuestas de dominios de reconocimiento y dominios de toxina proteica. Las toxinas de origen natural o los fragmentos de toxinas truncadas se han unido o fusionado a dominios de inmunoglobulina o ligandos receptores mediante conjugación química o técnicas de ingeniería de proteínas recombinantes con la esperanza de crear moléculas terapéuticas dirigidas a células (Moolten F, Cooperband S, Science 169: 68-70 ( 1970); Thorpe P et al., Nature 271: 752-5 (1978); Krolick K et al., Proc Natl Acad Sci USA 77: 5419-23 (1980); Krolick K et al., Cancer Immunol Immunother 12: 39-41 (1981); Blythman H et al., Nature 290: 145­ 46 (1981); Chaudhary V et al., Nature 339: 394-7 (1989); Strom T et al., Semin Immunol 2: 467 -79 (1990); Pastan I y col., Annu Rev Biochem 61: 331-54 (1992); Foss F y col., Curr Top Microbiol Immunol 234: 63-81 (1998)). Un objetivo de dicha ingeniería molecular es diseñar moléculas quiméricas con la doble funcionalidad de: 1) administrar toxinas a tipos o lugares celulares específicos dentro de un organismo después de la administración sistémica; y 2) efectuar una citotoxicidad dirigida a células específicas usando mecanismos potentes de citotoxicidad efectivos en células eucariotas.

La familia de toxinas Shiga de toxinas proteicas relacionadas, en particular toxinas aisladas de S. dysenteriae y E. coli se compone de varias toxinas de origen natural que están estructural y funcionalmente relacionadas (Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). Por ejemplo, la familia de toxinas Shiga abarca la toxina Shiga verdadera (Stx) aislada de S. dysenteriae serotipo 1, variantes de la toxina semejante a Shiga 1 (SLT1 o Stx1 o SLT1 o Slt-I) aisladas de serotipos de E. coli enterohemorrágica y y variantes de la toxina semejante a Shiga 2 (SLT2 o Stx2 o SLT2) aisladas de serotipos de E. coli enterohemorrágica. SLT1 difiere por sólo un residuo de Stx, y ambas han sido referidas como Verocitotoxinas o Verotoxinas (VTS) (O'Brien A et al, Curr Top Microbiol Immunol.

180: 65-94 (1992)). Los miembros de la familia de toxinas Shiga comparten la misma estructura general y mecanismo de acción (Engedal N et al, Microbial Biotech. 4: 32-46 (2011)). Por ejemplo, Stx, SLT-1 y SLT-2 muestran actividad enzimática indistinguible en sistemas libres de células (Head S et al, J Biol Chem. 266:. 3617-21 (1991); Tesh V et al, Infect Immun 61: 3392-402 (1993); Brigotti M et al, Toxicon 35: 1431-1437 (1997)). Los miembros de la familia de toxinas Shiga contienen dominios de reconocimiento que se unen preferentemente a un glicoesfingolípido específico presente en la superficie de algunas células huésped y un dominio enzimático capaz de inactivar permanentemente ribosomas una vez dentro de una célula (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). Los miembros de la familia de toxinas Shiga son empleados por las bacterias como factores de virulencia durante la infección de un huésped (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). En un huésped infectado, las toxinas Shiga son citotóxicas debido a la potente capacidad de las toxinas para inhibir la síntesis de proteínas y para desencadenar la muerte celular apoptótica (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). Los potentes efectos citotóxicos de las toxinas Shiga en las células huésped pueden dar como resultado colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)).

Los miembros de la familia de toxinas Shiga comparte una estructura proteica común multimérica caracterizada por una disposición A(B)5 de subunidades de proteína de Shiga (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). Cada toxina Shiga se compone de dos subunidades de la proteína, A y B, que se asocian en una disposición A(B)5 para formar un complejo de proteínas holotoxina. La subunidad A de la toxina Shiga es un monómero de 32 kilodaltons que contiene un dominio enzimático, y la subunidad B de la toxina Shiga es una subunidad de 7,7 kilodaltons que se asocia con otras cuatro subunidades B de la toxina Shiga para formar un pentámero de subunidades B de la toxina Shiga. El pentámero de subunidades B se asocia con una subunidad A para formar la holotoxina Shiga que tiene aproximadamente 70 kilodaltons (O'Brien A, Holmes, R, Microbiol Rev 51: 206-20 (1987)).

Los miembros de la familia de toxinas Shiga comparten un proceso común para la intoxicación de una célula huésped que puede dividirse en cinco fases principales: la unión a la superficie celular, la endocitosis, el movimiento subcelular retrógrado al retículo endoplasmático, la translocación del retículo endoplasmático al citosol y la inactivación enzimática de los ribosomas en el citosol. En primer lugar, las holotoxinas Shiga se dirigen a las superficies celulares de células huésped específicas por la capacidad de la subunidad B para unirse específicamente al glicoesfingolípido globotriaosilceramida Gb3, también conocido como CD77, presente en la parte de la membrana exoplásmica (Ling, H et al, Biochemistry 37: 1777-88 (1998); Thorpe C et al, Infect Immun. 67: 5985-93 (1999); Soltyk A et al, J Biol Chem 277: 5351-59 (2002)). En segundo lugar, las holotoxinas Shiga explotan la maquinaria endocítica de la célula huésped para entrar en la célula huésped, donde las holotoxinas están contenidas inicialmente dentro de los endosomas (Sandvig K et al, J Cell Biol. 108: 1331-1343 (1989); Sandvig K et al., Histochem Cell Biol 117: 131-141 (2002)). En tercer lugar, las holotoxinas Shiga explotan la maquinaria del transporte intracelular de la célula huésped para alcanzar el retículo endoplásmico y obtener acceso al citosol (Nichols B et al, J Cell Biol 153: 529-41 (2001); Lauvrak S et al, J Cell Sci. 117: 2321-31 (2004); Saint-Pol A et al, Dev Cell 6: 525-38 (2004)). En cuarto lugar, los fragmentos enzimáticamente activos de las holotoxinas Shiga se retrotranslocan desde el lumen del retículo endoplásmico al citosol (Yu M, Haslam D, Infect Immun 73: 2524-32 (2005); LaPointe P et al, J Biol Chem 280: 23310 -18 (2005); Falguieres T, Johannes L, Biol Cell 98: 125-34 (2006); Tam P, Lingwood C, Microbiology 153: 2700-10 (2007)). En quinto lugar, la fracción citosólica de los fragmentos enzimáticamente activos de la toxina Shiga provoca citotoxicidad mediante la inactivación de los ribosomas de la célula huésped (Tam, Microbiology 153: 2700-10 (2007)).

Durante el proceso de intoxicación por la toxina Shiga, la subunidad A de la toxina Shiga es escindida proteolíticamente entre un residuo de arginina conservado y un residuo de metionina (por ejemplo, Arg251-Met252 en StxA y SLT-1A) por furina, una endoproteasa de la célula huésped (Garred 0 et al., J Biol Chem 270: 10817-21 (1995)). El fragmento amino-terminal de la subunidad A de la toxina Shiga escindida por furina se llama "fragmento A1" de la toxina Shiga (o Stxn-A1, SLTn-A1, SLT-nA1). El fragmento A1 de la toxina Shiga es una proteína de 28 kilodaltons que contiene el dominio catalítico de la toxina Shiga (Fraser M et al, Nat Struct Biol. 1: 59-64 (1994)). El mecanismo de citotoxicdad de las toxinas Shiga a las células huésped es predominantemente a través de la potente inactivación catalítica del fragmento A1 de los ribosomas eucariotas y la inhibición en toda la célula de la síntesis de proteínas (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)).

El fragmento A1 de la toxina Shiga inhibe la traducción de proteínas mediante su potente actividad de despurinación hacia una nucleobase de adenina universalmente conservada en la posición 4324 en el bucle de alfa-sarcina-ricina del ARN ribosomal 28S de los ribosomas eucariotas (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). Después de inactivar un número umbral de ribosomas, se predice que la célula huésped experimenta una reducción suficiente en la síntesis de proteínas para inducir la muerte celular a través de apoptosis (lordanov M et al, Mol Cell Biol. 17: 3373­ 81 (1997); Smith W et al., Infect Immun. 71: 1497-504 (2003); Lee S et al, Microbiol Cell 10: 770-80 (2008); Tesh V, Future Microbiol 5: 431-53 (2010)).

Se ha descrito que la potencia de las toxinas A-B es extremadamente alta, de manera que tan poco como una molécula de toxina puede eliminar una célula (Yamaizumi M et al, Cell 15: 245-50 (1978); Antignani A, Fitzgerald D, toxins 5: 1486-502 (2013)). Una toxina A-B inactivadora de ribosomas puede paralizar de forma permanente un ribosoma tras otro dentro de la misma célula a una velocidad de aproximadamente 1.500 ribosomas por minuto (Endo Y, Tsurugi K, Eur J Biochem 171: 45-50 (1988); Endo Y et al., J Biol Chem 263: 8735-9 (1988)). La eficiencia catalítica de esta reacción enzimática (Kcat/Km) está cerca del límite de difusión (Jasheway K et al, Toxins. 3: 1233­ 1248 (2011)). Se cree que una sola molécula de la toxina A-B puede inactivar irreversiblemente 300 ribosomas en 35 minutos y es suficiente para eliminar una célula de cáncer (ver Weldon J, Pastan I, FEBS Journal 278: 4683-700 (2011)). Este nivel de potencia citotóxica se predice adicionalmente para la subunidad A de la toxina Shiga para la que se ha sugerido que una molécula translocada en el citosol sería suficiente para eliminar una célula (Tam, Microbiology 153: 2700-10 (2007)).

Las holotoxinas de la familia de toxinas Shiga se prevé que sean demasiado tóxica para un uso no dirigido como agente terapéutico (Jain, R, Tumor physiology and antibody delivery, Front Radiat Ther Oncol 24: 32-46 (1990)). Sin embargo, los miembros de la familia de toxinas Shiga tienen el potencial de diseñarse de forma sintética para aplicaciones terapéuticas racionales mediante alteraciones de la estructura, características y actividades biológicas de la toxina (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010); Engedal Microbiana Biotech 4: 32-46 (2011)). Las holotoxinas Shiga tienen una estructura bipartida compuesta de dos partes modulares unidas de forma no covalente: un resto A que contiene el fragmento A1 enzimáticamente activo y un resto B que contiene sitios de unión a la diana de la superficie celular Gb3. Debido a que las subunidades de la toxina Shiga son modulares, se ha planteado la hipótesis de que las composiciones terapéuticas pueden crearse en base a las estructuras y funciones separadas de los restos A y B (Solicitud de Estados Unidos 20090156417 A1; Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010); Engedal, Microbial Biotech 4: 32-46 (2011); solicitud EP 2402367 A1; solicitud de Estados Unidos 20130196928 A1.

El resto A de los miembros de la familia de toxinas Shiga es estable, enzimáticamente activo y citotóxico independiente de cualquier resto B (Engedal, Microbial Biotech 4: 32-46 (2011)). La subunidad A de la toxina Shiga 1 es catalíticamente activa, capaz de inactivar enzimáticamente ribosomas in vitro y citotóxica incluso si está truncada 0 fusionada con otros dominios de la proteína (Haddad J et al, J Bacteriol. 175: 4970-8 (1993); Al-Jaufy A et al, Infect Immun 62: 956-60 (1994); al-Jaufy A et al, Infect Immun. 63: 3073-8 (1995); LaPointe, J Biol Chem 280:. 23310-18 (2005); Di . R et al, Toxicon 57: 525-39 (2011)). Los truncamientos de la subunidad A de la toxina semejante a Shiga 1 son catalíticamente activos, capaces de inactivar los ribosomas enzimáticamente in vitro y citotóxicos cuando se expresan dentro de una célula (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)).

La idea de la unión de una toxina a un dominio de reconocimiento para producir una molécula quimérica que mata selectivamente las células de cáncer no es nueva (Strebhardt K, Ullrich A, Nat Rev Cancer 8: 473-80 (2008)). Por ejemplo, desde los años 70 se han desarrollado inmunotoxinas utilizando tres candidatos de toxinas principales: la toxina de la difteria bacteriana, la exotoxina bacteriana de Pseudomonas y toxinas de plantas ejemplificadas por la ricina (Antignani, Toxins 5: 1486-502 (2013)). En 2013, sin embargo, estas tres toxinas permanecieron "entre las mejores opciones para el desarrollo de inmunotoxinas" (Antignani, Toxins 5: 1486-502 (2013)). Hasta la fecha, nadie ha descrito una proteína citotóxica que comprenda una secuencia de aminoácidos derivada de una toxina Shiga combinada con una región de unión de tipo inmunoglobulina dirigida a células que sea capaz de eliminar específica y selectivamente un tipo de célula diana.

La potencia citotóxica de una construcción de toxina Shiga depende de su eficacia en alcanzar el citosol (Tam, Microbiología 153: 2700-10 (2007)); sin embargo, la comprensión actual de los mecanismos moleculares de enrutamiento de toxinas al citosol sigue siendo un desafío para la investigación científica (Antignani, Toxins 5: 1486­ 502 (2013)). Al-Jaufy, et al., Infection and Immunity, 62 (3): 956-960 (1994), describe la citotoxicidad de una proteína de fusión subunidad A de toxina Shiga-CD4 a las células infectadas por el virus de inmunodeficiencia humana; Roudkenar, et al., Cell Biology and Toxicology, 22 (3): 213-219 (2006) describe la citotoxicidad selectiva de la proteína STXA1-GM -CSF recombinante en células de cáncer hematopoyético; Pastan, et al., Annual Review of Medicine 58: 221-237 (2007), describe el tratamiento con inmunotoxinas del cáncer; WO2014/164693 describe proteínas citotóxicas que comprenden regiones de unión de tipo inmunoglobulina para mediar en el reconocimiento específico del tipo de célula y regiones efectoras de toxina Shiga derivadas de subunidades A de miembros de la familia de toxinas Shiga para efectuar la citotoxicidad; WO00/06194 describe el agotamiento de células responsables para el rechazo de injerto mediado por anticuerpo; Goldmacher et al., Blood, American Society of Hematology, 84(9), 3017-3025 (1994), describe ricina bloqueada con anti-CD38. An immunotoxin for the treatment of multiple mieloma; Peng et al. American Society of Hematology, 101(7): 2557-2562 (2003), describe virus del sarampión oncolíticos que muestran un anticuerpo de cadena única contra CD38, un marcador de células de mieloma; Stevenson G T, Molecular Medicine, 12, 11-12 (2006), describe CD38 como una diana terapéutica. Sería deseable tener proteínas citotóxicas dirigidas a las células que comprendan regiones derivadas de la subunidad A de la toxina Shiga que autodirijan su propio enrutamiento intracelular y muestren una citotoxicidad potente para usos que implican la eliminación dirigida de tipos celulares específicos y para su uso como agente terapéutico en el tratamiento de una variedad de enfermedades, tales como, por ejemplo, cánceres, tumores, trastornos inmunes e infecciones microbianas. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad en la técnica de formas de diseñar proteínas citotóxicas que comprendan regiones derivadas de la subunidad A de la toxina Shiga que retengan las funciones efectoras de la toxina, tales como el enrutamiento intracelular autodirigido y la citotoxicidad, después de unirse a regiones de unión de polipéptidos heterólogos para reconocimiento celular.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona varias proteínas que comprenden 1) regiones de unión de tipo inmunoglobulina, tal como de inmunoglobulinas, tal como se define en las reivindicaciones y 2) regiones efectoras de toxina Shiga, tal como de SLT1A, tal como se define en las reivindicaciones. La unión de las regiones de unión de tipo inmunoglobulina con regiones de polipéptidos derivados de la subunidad A de la toxina Shiga permitió el diseño del reconocimiento específico de tipo celular de la citotoxicidad de la toxina Shiga, y la citotoxicidad fue mayor cuando estas dos regiones se combinaron de manera que las regiones de unión de tipo inmunoglobulina no estaban próximas en relación con las regiones de toxina Shiga a los extremos amino terminales de las proteínas. Las proteínas de la invención tienen usos tales como, por ejemplo, la eliminación de células específicas, el suministro de materiales exógenos, como agentes de diagnóstico y como moléculas terapéuticas para el tratamiento de una variedad de enfermedades, trastornos y afecciones, que incluyen cánceres, tumores, anormalidades de crecimiento, trastornos inmunes e infecciones microbianas.

Una proteína de la presente invención comprende (a) una región de unión de tipo inmunoglobulina que comprende uno o más polipéptidos y es capaz de unirse específicamente a al menos una biomolécula diana extracelular, tal como se define en las reivindicaciones, y (b) una región efectora de la toxina Shiga que comprende un polipéptido derivado de la secuencia de aminoácidos de la Subunidad A de al menos un miembro de la familia de toxinas Shiga, tal como se define en las reivindicaciones; en la que dicha región de unión de tipo inmunoglobulina y dicha región efectora de toxina Shiga están dispuestas u orientadas físicamente dentro de la proteína citotóxica de modo que la región de unión tipo inmunoglobulina no se encuentra próxima al extremo amino terminal de la región efectora de toxina Shiga.

Una proteína de la presente invención comprende (a) una región de unión de tipo inmunoglobulina que comprende uno o más polipéptidos y es capaz de unirse específicamente a al menos una biomolécula diana extracelular, tal como se define en las reivindicaciones, y (b) una región efectora de la toxina Shiga que comprende un polipéptido derivado de la secuencia de aminoácidos de la Subunidad A de al menos un miembro de la familia de toxinas Shiga, tal como se define en las reivindicaciones; en la que dicha región de unión de tipo inmunoglobulina y dicha región efectora de toxina Shiga están dispuestas u orientadas físicamente dentro de la proteína citotóxica de tal manera que la región de unión tipo inmunoglobulina no se encuentra próxima al extremo amino terminal de la proteína con respecto a la región efectora de toxina Shiga.

En ciertas realizaciones adicionales, la proteína de la presente invención comprende (a) una región de unión de tipo inmunoglobulina que comprende uno o más polipéptidos y es capaz de unirse específicamente a al menos una biomolécula diana extracelular, tal como se define en las reivindicaciones y (b) una región efectora de toxina Shiga que comprende un polipéptido derivado de la secuencia de aminoácidos de la Subunidad A de al menos un miembro de la familia de toxinas Shiga, tal como se define en las reivindicaciones; en la que dicha región de unión de tipo inmunoglobulina y dicha región efectora de toxina Shiga están dispuestas u orientadas físicamente dentro de la proteína citotóxica de tal manera que la región efectora de toxina Shiga se encuentra próxima al extremo amino terminal de la proteína.

Para ciertas realizaciones de las proteínas de la presente invención, la región de unión de tipo inmunoglobulina comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: fragmento de anticuerpo de un solo dominio (sdAb), Nanobody®, dominio de anticuerpo de cadena pesada derivado de un camélido (fragmento V^hH), dominio de anticuerpo de cadena pesada derivado de un pez cartilaginoso, nuevo receptor de antígeno de inmunoglobulina (IgNAR), fragmento V^nar, fragmento variable de cadena única (scFv), fragmento variable de anticuerpo (Fv), un fragmento de región determinante complementaria 3 (CDR3), polipéptido FR3-CDR3-FR4 (FR3-CDR3-FR4) restringido, fragmento Fd, dominio inmunofarmacéutico modular pequeño (SMIP™), fragmento de unión a antígeno (Fab), domonio tipo III de la 10a fibronectina derivada de fibronectina (10Fn3) (por ejemplo, monocuerpo), dominio de tenascina tipo III (por ejemplo, TNfn3), dominio de motivo de repetición de anquirina (ARD), dominio A derivado de receptor de lipoproteína de baja densidad (dominio A de LDLR o LDLR-A), lipocalina (anticalina), dominio Kunitz, dominio Z derivado de proteína A, dominio derivado de cristalina gamma B, dominio derivado de ubiquitina, polipéptido derivado de Sac7d (affitin), dominio SH2 derivado de Fyn, miniproteína, andamiaje de dominio tipo lectina tipo C, mimético de anticuerpos modificados genéticamente y cualquier homólogo manipulado genéticamente de cualquiera de los anteriores que conserven la funcionalidad de unión.

Para ciertas realizaciones, tras la administración de la proteína de la presente invención a una célula acoplada físicamente con la biomolécula diana extracelular de la región de unión de la proteína, la proteína es capaz de causar la muerte de la célula. En ciertas realizaciones adicionales, tras la administración de la proteína de la invención a dos poblaciones diferentes de tipos de células que difieren con respecto a la presencia o nivel de una biomolécula diana extracelular, la proteína es capaz de causar la muerte celular de los tipos de células acoplados físicamente con una biomolécula diana extracelular de la región de unión de la proteína citotóxica en una CD50 que es al menos tres veces menor que la CD50 observada para tipos de células que no están físicamente acopladas con una biomolécula diana extracelular de la región de unión de la proteína. Para ciertas realizaciones, tras la administración de la proteína de la invención a una primera población de células cuyos miembros están físicamente acoplados a biomoléculas diana extracelulares de la región de unión de la proteína, y una segunda población de células cuyos miembros no están físicamente acoplados a ninguna biomolécula diana extracelular de la región de unión, el efecto citotóxico de la molécula dirigida a la célula con respecto a los miembros de dicha primera población de células en relación con los miembros de dicha segunda población de células es al menos 3 veces mayor. Para ciertas realizaciones, mediante las cuales la administración de la proteína de la invención a una primera población de células cuyos miembros están acoplados físicamente a una cantidad significativa de la biomolécula diana extracelular de la región de unión de la proteína, y una segunda población de células cuyos miembros no están acoplados físicamente a una cantidad significativa de ninguna biomolécula diana extracelular de la región de unión, el efecto citotóxico de la molécula dirigida a la célula con respecto a los miembros de dicha primera población de células en relación con los miembros de dicha segunda población de células es al menos 3 veces mayor. Para ciertas realizaciones, tras la administración de la proteína de la invención a una primera población de células positivas de biomoléculas diana, y a una segunda población de células cuyos miembros no expresan una cantidad significativa de una biomolécula diana de la región de unión de la proteína en una superficie celular, el efecto citotóxico de la proteína para los miembros de la primera población de células en relación con los miembros de la segunda población de células es al menos 3 veces mayor.

En ciertas realizaciones, la región de unión de tipo inmunoglobulina está diseñada o seleccionada por su capacidad para unirse a una biomolécula diana extracelular seleccionada del grupo que consiste en: CD20, CD22, CD40, CD74, CD79, CD25, CD30, HER2/neu/ErbB2, EGFR, EpCAM, EphB2, antígeno de membrana específico de próstata, Cripto, CDCP1, endoglina, proteína de activación de fibroblastos, Lewis-Y, CD19, CD21, CS1/SLAMF7, CD33, CD52, CD133, gpA33, mucina, TAG-72, receptor transmembrana de tirosina-proteína quinasa (ROR1 o NTRKR1), anhidrasa carbónica IX, proteína de unión a folato, gangliósido GD2, gangliósido GD3, gangliósido GM2, gangliósido Lewis-Y2, VEGFR, Alpha Vbeta3, Alpha5betal, ErbB1/EGFR, Erb3, ErbB1/EGFR, Erb3, Erb3 MET, IGF1R, EphA3, TRAIL-R1, TRAIL-R2, RANK, FAP, tenascina, CD64, mesotelina, BRCA1, tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, beta-catenina, MUM-1, caspasa-8, KIAA0205, HPVE6, SART-1, PRAME, antígeno carcinoembrionario, antígeno específico de próstata, antígeno de células madre de próstata, aspartil (asparaginil) beta-hidroxilasa humana, EphA2, HER3/ErbB-3, MUC1, MART-1/MelanA, gp100, antígeno asociado a tirosinasa, HPV-E7, antígeno de virus Epstein-Barr, Bcr-Abl, antígeno de alfafetoproteína, 17-A1, antígeno tumoral de vejiga, CD38, CD15, CD23, CD53, CD88, CD129, CD183, CD191, CD193, CD244, CD294, CD305; C3AR, FceRIa, galectina-9, mrp-14, ligando de muerte programada 1 (PD-L1), Siglec-8, Siglec-10, CD49d, CD13, CD44, CD54, CD63, CD69, CD123, CD193, TLR4, IgE , CD107a, CD203c, CD14, CD15, CD33, CD64, CD68, CD80, CD86, CD105, CD115, F4/80, ILT-3, galectina-3, CD11a-c, GITRL, MHC Clase I (opcionalmente complejado con un péptido), molécula MHC de clase II (opcionalmente complejada con un péptido), CD284-TLR4, CD107-Mac3, CD195-CCR5, HLA-DR, CD16/32, CD282-TLR2, CD11c, CD123 y cualquier fragmento inmunogénico de cualquiera de los anteriores.

En ciertas realizaciones, las proteínas de la presente invención comprenden la región fectora de la toxina Shiga derivada de aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3. En ciertas realizaciones adicionales, la proteína de la presente invención comprende la región efectora de toxina Shiga derivada de los aminoácidos 1 a 241 de la SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2 o SEQ ID N°: 3. En ciertas realizaciones adicionales, la región efectora de la toxina Shiga se deriva de los aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. En ciertas realizaciones adicionales, la región efectora de la toxina Shiga se deriva de los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

En ciertas realizaciones, las proteínas de la presente invención comprenden un motivo señal de recuperación/retención del retículo endoplasmático carboxi terminal. En ciertas realizaciones adicionales, las proteínas de la presente invención comprenden un motivo señal de retención/recuperación del retículo endoplásmico carboxi terminal seleccionado del grupo que consiste en: KDEL (SEQ ID NO: 32), HDEF (SEQ ID NO: 33), HDEL ( SEQ ID NO: 34), RDEF (SEQ ID NO: 35), RDEL (SEQ ID NO: 36), WDEL (SEQ ID NO: 37), YDEL (SEQ ID NO: 38), HEEF (SEQ ID NO: 39 ), HEEL (SEQ ID NO: 40), KEEL (SEQ ID NO: 41), REEL (SEQ ID NO: 42), KAEL (SEQ ID NO: 43), KCEL (SEQ ID NO: 44), KFEL (SEQ ID NO: 45), KGEL (SEQ ID NO: 46), KHEL (SEQ ID NO: 47), KLEL (SEQ ID NO: 48), KNEL (SEQ ID NO: 49), KQEL (SEQ ID NO: 50) , KREL (SEQ ID NO: 51), KSEL (SEQ ID NO: 52), KVEL (SEQ ID NO: 53), KWEL (SEQ ID NO: 54), KYEL (SEQ ID NO: 55), KEDL (SEQ ID NO: 56), KIEL (SEQ ID NO: 57), DKEL (SEQ ID NO: 58), FDEL (SEQ ID NO: 59), KDEF (SEQ ID NO: 60), KKEL (SEQ ID NO: 61), HADL (SEQ ID NO: 62), HAEL (SEQ ID NO: 63), HIEL (SEQ ID NO: 64), HNEL (SEQ ID NO: 65), HTEL (SEQ ID NO: 66), KTEL (SEQ ID NO : 67), HVEL (SEQ ID NO: 68), NDEL (SEQ ID NO: 69), QDEL (SEQ ID NO: 70), REDL (SEQ ID NO: 71), RNEL (SEQ ID NO: 72), RTDL (SEQ ID NO: 73), RTEL (SEQ ID NO: 74), SDEL (SEQ ID NO: 75) , TDEL (SEQ ID NO: 76), SKEL (SEQ ID NO: 77), STEL (SEQ ID NO: 78) y EDEL (SEQ ID NO: 79).

En ciertas realizaciones adicionales, la proteína de la presente descripción comprende la región de unión que comprende o que consiste esencialmente de los aminoácidos 269-508 de cualquiera de las SEQ ID NOs: 4-19.

En ciertas realizaciones, la proteína de la presente descripción comprende o consiste esencialmente en el polipéptido mostrado en una cualquiera de SEQ ID NOs: 4-31.

En ciertas realizaciones, las proteínas de la presente invención comprenden una región efectora de la toxina Shiga que comprende una mutación con relación a una subunidad A de origen natural de un miembro de la familia de toxinas Shiga que cambia la actividad enzimática de la región efectora de la toxina Shiga, en donde la mutación se selecciona de al menos una eliminación, inserción o sustitución de residuos de aminoácidos que reduce o elimina la citotoxicidad de la región de la toxina Shiga, tal como se define en las reivindicaciones. En ciertas realizaciones adicionales, la proteína comprende una mutación que reduce o elimina la actividad catalítica pero retiene otras funciones efectoras de la toxina Shiga, tales como, por ejemplo, promover la internalización celular y/o dirigir el enrutamiento intracelular. En ciertas realizaciones, la mutación se selecciona de al menos una sustitución de residuo de aminoácido, tal como, por ejemplo, A231E, R75A, Y77S, Y114S, E167D, R170A, R176K y/o W203A en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3.

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de la presente invención y al menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como se define en las reivindicaciones; y el uso de dicha proteína o una composición que la comprende, tal como se describe adicionalmente en este documento. Ciertas realizaciones de la presente invención son composiciones farmacéuticas que comprenden cualquier proteína de la presente invención y al menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como se define en las reivindicaciones.

Entre ciertas realizaciones de la presente descripción está una composición de diagnóstico que comprende una proteína de la invención comprende además un agente promotor de la detección para la recogida de información, tal como información útil para el diagnóstico de un tipo de célula, tejido, órgano, enfermedad, trastorno, condición y/o paciente.

Más allá de las proteínas de la presente invención y composiciones de las mismas, los polinucleótidos capaces de codificar una proteína de la invención, tal como se define en las reivindicaciones, están dentro del alcance de la presente invención, así como vectores de expresión que comprenden un polinucleótido de la invención y células huésped que comprenden un vector de expresión de la invención. Las células huésped que comprenden un vector de expresión pueden usarse, por ejemplo, en procedimientos para producir una proteína de la invención, tal como se define en las reivindicaciones, o un componente de polipéptido o fragmento del mismo mediante expresión recombinante.

La descripción también incluye un sistema para conferir una mejor citotoxicidad a una proteína que comprende (a) una región de unión de tipo inmunoglobulina que comprende uno o más polipéptidos y es capaz de unirse específicamente a al menos una biomolécula diana extracelular y (b) una región efectora de toxina Shiga que comprende un polipéptido derivado de la secuencia de aminoácidos de la Subunidad A de al menos un miembro de la familia de toxinas Shiga; comprendiendo el sistema la etapa de disponer dicha región de unión de tipo inmunoglobulina de forma próxima al extremo carboxi terminal de dicha región efectora de toxina Shiga dentro de la proteína. La descripción también incluye un sistema para conferir citotoxicidad mejorada a una proteína que comprende (a) una región de unión de tipo inmunoglobulina que comprende uno o más polipéptidos y es capaz de unirse específicamente al menos a una biomolécula diana extracelular y (b) una región efectora de toxina Shiga que comprende un polipéptido derivado de la secuencia de aminoácidos de la Subunidad A de al menos un miembro de la familia de toxinas Shiga; comprendiendo el sistema la etapa de disponer dicha región de unión de tipo inmunoglobulina de forma próxima al extremo carboxi terminal de la proteína con respecto a dicha región efectora de toxina Shiga. La descripción también incluye un sistema para conferir citotoxicidad mejorada a una proteína que comprende (a) una región de unión de tipo inmunoglobulina que comprende uno o más polipéptidos y es capaz de unirse específicamente al menos a una biomolécula diana extracelular y (b) una región efectora de toxina Shiga que comprende un polipéptido derivado de la secuencia de aminoácidos de la Subunidad A de al menos un miembro de la familia de toxinas Shiga; comprendiendo el sistema la etapa de disponer dicha región efectora de toxina Shiga de forma próxima al extremo amino terminal de la proteína.

Adicionalmente, la presente invención proporciona procedimientos in vitro de eliminar una célula o células, tal como se define en las reivindicaciones, que comprende la etapa de poner en contacto una célula o células con una proteína de la invención o una composición farmacéutica que comprende una proteína de la invención. En realizaciones adicionales de los procedimientos de eliminación o destrucción de células, el procedimiento es capaz de eliminar selectivamente una célula o células y/o tipos de células preferentemente sobre otra célula o células y/o tipos de células cuando se pone en contacto con una mezcla de células que difieren con respecto al nivel de presencia y/o expresión extracelular de una biomolécula diana extracelular de la región de unión de la proteína.

La presente invención proporciona además para el tratamiento de enfermedades, trastornos y/o afecciones en pacientes utilizando una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína o composición farmacéutica de la invención, tal como se define en las reivindicaciones. En ciertas realizaciones, la enfermedad, trastorno o afección a tratar utilizando la invención se selecciona entre: cáncer, un tumor, un trastorno inmunitario o una infección microbiana, tal como se define en las reivindicaciones. En ciertas realizaciones, el cáncer a tratar se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de hueso, cáncer de mama, cáncer del sistema nervioso central/periférico, cáncer gastrointestinal, cáncer de células germinales, cáncer glandular, cáncer de cabeza-cuello, cáncer hematológico, cáncer de riñón-tracto urinario, cáncer de hígado, cáncer de pulmón/pleura, cáncer de próstata, sarcoma, cáncer de piel y cáncer de útero. En ciertas realizaciones, el trastorno inmunitario a tratar es un trastorno inmunitario asociado con una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: amiloidosis, espondilitis anquilosante, asma, enfermedad de Crohn, diabetes, rechazo de injerto, enfermedad de injerto contra huésped, tiroiditis de Hashimoto, síndrome urémico hemolítico, enfermedad relacionada con el VIH, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, poliarteritis nodosa, poliartritis, psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, esclerodermia, choque séptico, síndrome de Sjogren, colitis ulcerosa, y vasculitis.

El uso de cualquier composición de la presente invención para el tratamiento o prevención de un cáncer, tumor, anormalidad de crecimiento y/o trastorno inmunitario está dentro del alcance de la presente descripción. Entre ciertas realizaciones de la presente invención está una proteína de la presente invención y/o una composición farmacéutica de la misma para usar en el tratamiento o la prevención de un cáncer, un tumor, un trastorno inmunitario o una infección microbiana, tal como se define en las reivindicaciones. Entre ciertas realizaciones de la presente descripción está el uso de una proteína de la presente invención y/o composición farmacéutica de la misma en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un cáncer, tumor, anormalidad de crecimiento, trastorno inmunitario o infección microbiana.

Ciertas realizaciones de las proteínas de la invención pueden utilizarse para el suministro de material exógeno adicional en una célula acoplada físicamente con una biomolécula diana extracelular de la proteína de la invención. Adicionalmente, la presente descripción proporciona un procedimiento para el suministro de material exógeno al interior de una célula o células que comprende poner en contacto la célula o células, ya sea in vitro o in vivo, con una proteína, composición farmacéutica y/o composición de diagnóstico de la presente invención. La presente descripción proporciona además un procedimiento para la liberación de material exógeno al interior de una célula o células en un paciente, comprendiendo el procedimiento la etapa de administrar al paciente una proteína de la presente invención (con o sin actividad citotóxica), en el que la célula o células diana están acopladas físicamente con una biomolécula diana extracelular de la proteína.

El uso de cualquier composición de la presente invención para el diagnóstico, pronóstico y/o caracterización de una enfermedad, trastorno y/o afección está dentro del alcance de la presente descripción. Entre ciertas realizaciones de la presente descripción se encuentra un procedimiento para usar una proteína de la invención que comprende un agente promotor de detección y/o composición de la descripción (por ejemplo, una composición de diagnóstico) para la recopilación de información útil en el diagnóstico, pronóstico o caracterización de una enfermedad, trastorno o afección. Entre ciertas realizaciones de la presente descripción está el procedimiento para detectar una célula usando una proteína y/o composición de diagnóstico de la descripción que comprende las etapas de poner en contacto una célula con la proteína y/o composición de diagnóstico y detectar la presencia de dicha molécula y/o composición diagnóstica dirigida a la célula. En ciertas realizaciones de la descripción, la etapa de poner en contacto la célula o células tiene lugar in vitro. En ciertas realizaciones de la descripción, la etapa de poner en contacto la célula o células tiene lugar in vivo. En ciertas realizaciones de la descripción, la etapa de detectar la célula o células tiene lugar in vitro. En ciertas realizaciones de la descripción, la etapa de detectar la célula o células tiene lugar in vivo. En ciertas realizaciones adicionales de la descripción, el procedimiento implica la detección de la ubicación de la proteína en un organismo usando uno o más procedimientos de formación de imágenes después de la administración de la proteína a dicho organismo. Por ejemplo, las proteínas de la descripción que incorporan agentes promotores de detección, tal como se describe en el presente documento, pueden usarse para caracterizar enfermedades como potencialmente tratables por una composición farmacéutica relacionada de la invención. Por ejemplo, ciertos compuestos (por ejemplo, proteínas) de la invención, composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas y composiciones de diagnóstico) de la invención, y procedimientos de descripción pueden usarse para determinar si un paciente pertenece a un grupo que responde a una composición farmacéutica de la invención. Entre ciertas realizaciones de la presente descripción están kits que comprenden una composición de materia de la invención, y opcionalmente, instrucciones de uso, reactivo o reactivos adicionales, y/o dispositivo o dispositivos de administración farmacéutica.

Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor con respecto a la siguiente descripción, reivindicaciones adjuntas, y las figuras adjuntas. Los elementos antes mencionados de la invención pueden combinarse individualmente o eliminarse libremente para realizar otras realizaciones de la invención, dentro del alcance de las reivindicaciones, sin ninguna declaración de objetar dicha combinación o eliminación en lo sucesivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra la disposición general de las proteínas de la invención con "N" y "C" que indican un extremo amino terminal y carboxi terminal, respectivamente, de la proteína o un componente polipeptídico de la proteína que comprende la región efectora de la toxina Shiga.

La Figura 2 muestra gráficamente que SLT-1A::aCD38scFv exhibió una citotoxicidad mejorada en comparación con la orientación inversa aCD38scFv::SLT-1A. El porcentaje de viabilidad de las células se trazó sobre el logaritmo en base 10 de la concentración de proteína citotóxica.

La Figura 3 muestra gráficamente una citotoxicidad específica de tipo de célula diana mejorada de la proteína SLT-1A::aHER2scFv en comparación con la proteína de orientación inversa aHER2scFv::SLT-1A. El porcentaje de viabilidad de las células se trazó sobre el logaritmo en base 10 de la concentración de proteína citotóxica.

La Figura 4 muestra imágenes de microscopía de la localización subcelular de aHER2scFv::SLT-1A y SLT-1A::aHER2scFv. Las imágenes muestran que ambas proteínas citotóxicas entraron en las células diana dentro de una hora de la administración.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención se describe más completamente en lo sucesivo usando realizaciones ilustrativas, no limitantes, y las referencias a las figuras adjuntas. La presente invención puede, sin embargo, realizarse de muchas formas diferentes y no debe interpretarse como limitada a las realizaciones expuestas a continuación. Más bien, estas realizaciones se proporcionan para que esta descripción sea exhaustiva y transmita el alcance de la invención a los expertos en la técnica.

A fin de que la presente invención pueda entenderse más fácilmente, ciertos términos se definen a continuación. Se pueden encontrar definiciones adicionales dentro de la descripción detallada de la presente invención.

Tal como se utiliza en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, los términos "un", "una" y "el/la" incluyen tanto los referentes singular y plural, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

Tal como se utiliza en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, el término "y/o" cuando se refiere a dos especies, A y B, significa al menos uno de A y B. Tal como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, el término "y/o" cuando hace referencia a más de dos especies, tales como A, B, y C, significa al menos uno de A, B, o C, o al menos uno de cualquier combinación de A, B, o C (con cada especie en posibilidad singular o múltiple).

A lo largo de esta memoria descriptiva, la palabra "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" se entenderán que implican la inclusión de un número entero (o componentes) o grupo de números enteros (o componentes) indicados, pero no la exclusión de cualquier otro número entero (o componentes) o grupo de números enteros (o componentes).

En toda esta memoria descriptiva, el término "que incluye" se usa para significar "que incluye, pero no limitado a". "Que incluye" y "que incluye, pero no limitado a" se utilizan indistintamente.

El término "residuo de aminoácido" o "aminoácido" incluye la referencia a un aminoácido que se incorpora en una proteína, polipéptido o péptido. El término "polipéptido" incluye cualquier polímero de aminoácidos o residuos de aminoácidos. El término "secuencia de polipéptido" se refiere a una serie de aminoácidos o residuos de aminoácidos que componen físicamente un polipéptido. Una "proteína" es una macromolécula que comprende uno o más polipéptidos o “cadenas” de polipéptido. Un "péptido" es un pequeño polipéptido de tamaño de menos de un total de 15-20 residuos de aminoácidos. El término "secuencia de aminoácidos" se refiere a una serie de aminoácidos o residuos de aminoácidos que comprenden físicamente un péptido o polipéptido dependiendo de la longitud. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de polipéptidos y proteínas descritas en este documento se escriben de izquierda a derecha representando su orden de un extremo amino terminal a un extremo carboxi terminal.

Los términos "aminoácido", "residuo de aminoácido", "secuencia de aminoácidos", o secuencias de polipéptidos incluyen aminoácidos de origen natural (incluyendo isosteriómeros L y D) y, a menos que se limite de otro modo, también incluyen análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden funcionar de una manera similar a los aminoácidos de origen natural, tales como selenocisteína, pirrolisina, N-formilmetionina, gamma-carboxiglutamato, hidroxiprolinahipusina, ácido piroglutámico y selenometionina. Los aminoácidos referidos en este documento por designaciones taquigráficas se indican en la Tabla A:

Tabla A: Nomenclatura de aminoácidos

La frase "sustitución conservativa" con respecto a un polipéptido, se refiere a un cambio en la composición de aminoácidos del polipéptido que no altera sustancialmente la función y la estructura del polipéptido general (véase Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (WH Freeman and Company, Nueva York (2a ed., 1992)). Tal como se usa en el presente documento, los términos "expresado", "que expresa", o "expresa", y las variantes gramaticales de los mismos, se refieren a la traducción de un polinucleótido o ácido nucleico en un polipéptido o proteína. Los polipéptidos o proteínas expresadas pueden permanecer intracelulares, convertirse en un componente de la membrana de la superficie celular o secretarse en un espacio extracelular.

Tal como se usa en el presente documento, las células que expresan una cantidad significativa de una biomolécula diana extracelular al menos una superficie celular son "células positivas diana" o "células diana+" y son células acopladas físicamente a la biomolécula diana extracelular especificada.

Tal como se usa en el presente documento, el símbolo "a" es la abreviatura de una región de unión de tipo inmunoglobulina capaz de unirse a la biomolécula después del símbolo. El símbolo "a" se utiliza para referirse a la característica funcional de una región de unión de tipo inmunoglobulina en base a su capacidad de unirse a la biomolécula después del símbolo.

El símbolo "::" significa las regiones de polipéptidos antes y después de que se unan físicamente entre sí para formar un polipéptido continuo.

El término "citotoxicidad selectiva" con respecto a la actividad citotóxica de una proteína citotóxica se refiere a los niveles relativos de citotoxicidad entre una población de células diana y una población de células no diana observadoras, que puede ser expresada como una relación de la concentración citotóxica semimáxima (CD50) para un tipo de célula diana sobre la CD50 para un tipo de célula no diana para mostrar preferencialidad de eliminación celular del tipo de célula diana.

Para los propósitos de la presente invención, el término "efector" significa proporcionar una actividad biológica, tal como citotoxicidad, señalización biológica, catálisis enzimática, direccionamiento subcelular y/o unión intermolecular, que da lugar al reclutamiento de un factor o factores y/o efecto o efectos alostéricos.

Para los propósitos de la presente invención, la frase "derivado de" significa que la región de polipéptido comprende secuencias de aminoácidos halladas originalmente en una proteína y que ahora pueden comprender adiciones, deleciones, truncamientos u otras alteraciones de la secuencia original, de manera que la función global y estructura se conservan sustancialmente.

Para los propósitos de la presente invención, una función efectora de la toxina Shiga es una actividad biológica conferida por una región de polipéptido derivada de una subunidad A de la toxina Shiga. Los ejemplos no limitativos de funciones efectoras de la toxina Shiga incluyen la internalización celular, direccionamiento subcelular, actividad catalítica y la citotoxicidad. Las actividades catalíticas de la toxina Shiga incluyen, por ejemplo, la inactivación de ribosomas, inhibición de la síntesis de proteínas, la actividad de N-glicosidasa, actividad de polinucleótido:adenosina glicosidasa, la actividad de la ARNasa y la actividad ADNasa. Las RIPs pueden despurinar ácidos nucleicos, polinucleósidos, polinucleótidos, ARNr, ADNss, ADNds, ARNm (y poliA), y ácidos nucleicos virales (Barbieri L et al, Biochem J 286: 1-4 (1992); Barbieri L et al, Nature 372: 624 (1994); Ling J et al, FEBS Lett 345: 143-6 (1994); Barbieri L et al, Biochem J 319: 507-13 (1996); Roncuzzi L, Gasperi-Campani A, FEBS Lett 392: 16-20 (1996); Stirpe F et al, FEBS Lett 382: 309-12 (1996); Barbieri L et al, Nucleic Acids Res. 25: 518-22 (1997); Wang P, Turner N, Nucleic Acids Res 27: 1900-5 (1999); Barbieri L et al, Biochim Biophys Acta 1480: 258-66 (2000); Barbieri L et al, J Biochem 128: 883-9 (2000); Brigotti. M et al, Toxicon 39: 341-8 (2001); Brigotti M et al, FASEB J 16: 365-72 (2002); Bagga S et al, J Biol Chem 278: 4813-20 (2003); Picard D et al, J Biol Chem 280: 20069-75 (2005)). Algunas RIPs muestran actividad antiviral y actividad superóxido dismutasa (Erice A et al, Antimicrob Agents Chemother 37: 835-8 (1993); Au T et al, FEBS Lett 471: 169-72 (2000); Parikh B, Tumer N, Mini Rev Med Chem. 4: 523-43 (2004); Sharma N et al, Plant Physiol 134: 171-81 (2004)). Las actividades catalíticas de toxinas Shiga se han observado tanto in vitro como in vivo. Los ensayos para la actividad efectora de la toxina Shiga pueden medir diferentes actividades, tales como, por ejemplo, actividad inhibidora de la síntesis de proteínas, la actividad de despurinación, la inhibición del crecimiento celular, la citotoxicidad, la actividad de relajación de ADN superenrollado y/o actividad de nucleasa.

Tal como se usa en el presente documento, la retención de la función efectora de la toxina Shiga se refiere a un nivel de actividad funcional de la toxina Shiga, tal como se mide por un ensayo cuantitativo apropiado con reproducibilidad comparable a un control de la región efectora de la toxina Shiga de tipo salvaje. Para la inhibición de ribosomas, la función efectora de la toxina toxina Shiga función efectora es mostrar una CI⁵⁰ de 10.000 picomolar (pM) o menos. Para la citotoxicidad en un ensayo de eliminación de células positivas de diana, la función efectora de la toxina Shiga es mostrar una CD50 de 1.000 nanomolar (nM) o menos, dependiendo del tipo de célula y su expresión de la biomolécula diana extracelular apropiada.

La eficacia y la potencia de las inmunotoxinas y fusiones de ligando-toxina como moléculas citotóxicas están influenciadas por la densidad de su antígeno o antígenos diana sobre una superficie de células diana (véase, por ejemplo Decket T et al, Blood 103: 2718-26 (2004); Du X et al, Blood 111: 338-43 (2008); Baskar S et al, mAbs 4: 349-61 (2012)), ubicación del epítopo (Pulse O et al, J Immunol 141: 4410-7 (1988); Godal A et al, en J Cancer 52: 631-5 (1992); Yazdi P et al, Cancer Res. 55:. 3763-71 (1995)), velocidad de internalización de la molécula citotóxica unida a la superficie (ver por ejemplo, Du X et al, Cancer Res 68: 6300-5 (2008)), y el itinerario intracelular (Tortorella L et al, PLoS One. 7: e47320 (2012)).

La representación de la superficie celular y/o la densidad de una biomolécula diana extracelular determinada puede influir en las aplicaciones para las que pueden utilizarse más adecuadamente ciertas proteínas de la presente invención. Las diferencias en la representación de la superficie celular y/o la densidad de una biomolécula diana determinada entre las células pueden alterar la internalización y/o la citotoxicidad de una proteína determinada de la invención, tanto cuantitativa como cualitativamente. La representación de la superficie celular y/o la densidad de una biomolécula diana determinada pueden variar mucho entre las células positivas de la biomolécula diana o incluso en la misma célula en diferentes puntos en el ciclo celular o la diferenciación celular. La representación de la superficie celular total de una biomolécula diana determinada en una célula particular o población de células se puede determinar usando procedimientos conocidos para el experto, tales como procedimientos de citometría de flujo de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).

Introducción

La presente invención resuelve los problemas para el diseño de proteínas potencialmente citotóxicos, que comprenden regiones derivadas de la subunidad A de la toxina Shiga unidas a regiones de unión heterólogas para el reconocimiento celular, tal como se define en las reivindicaciones, por ejemplo proteínas de fusión que retienen funcionalidades efectoras robustas de toxina Shiga, como el enrutamiento intracelular autodirigido hacia el citosol y la citotoxicidad. La presente invención se basa en la observación de que una relación estructural particular entre la región de toxina derivada de la subunidad A de la toxina Shiga y una región de unión heteróloga puede afectar la efectividad de la eliminación celular para proteínas citotóxicas basadas en la toxina Shiga diseñadas. El enrutamiento intracelular de estos polipéptidos debe ser suficiente para permitir que los polipéptidos derivados de la subunidad A de la toxina Shiga, enzimáticamente activos, lleguen de manera eficiente al compartimento citosólico e inactiven los ribosomas para causar la muerte celular. Tal como se describe con más detalle en los Ejemplos, tener la región de toxina derivada de la Subunidad A de la toxina Shiga orientada proximal al extremo terminal amino en relación con una región de unión de reconocimiento celular heteróloga dio como resultado resultados una eliminación celular significativamente más robusta que los restos idénticos dispuestos en la orientación opuesta. La presente invención proporciona una forma específica de diseñar tales proteínas citotóxicas para lograr esto mediante la disposición de la región de unión de reconocimiento celular de forma próxima al extremo carboxi terminal de la región efectora de la toxina Shiga dentro de la proteína citotóxica. La unión de las regiones de unión de reconocimiento celular heterólogas con las regiones de la subunidad A de la toxina Shiga en esta orientación específica permitió el diseño de un reconocimiento específico del tipo de células más potente de la citotoxicidad de la toxina Shiga, así como proteínas con enrutamiento intracelular deseable al retículo endoplásmico y/o el citosol. Anteriormente, se observó que las construcciones de fusión de subunidad A de la toxina Shiga eran citotóxicas y presumiblemente capaces de autodirigir su propio direccionamiento intracelular para la liberación de un fragmento de toxina enzimáticamente activo al citosol (Al-Jaufy, Infect Immun 62: 956-60 (1994); Al-Jaufy, Infect Immun 63: 3073-8 (1995); Su, Protein Expr Purif 66: 149-57 (2009)). Cuando se crearon múltiples proteínas citotóxicas y se ensayaron con las regiones derivadas de toxina Shiga unidas a regiones de reconocimiento derivadas de inmunoglobulina en sus extremos amino terminales, estas proteínas diseñadas no mostraron los niveles esperados de citotoxicidad (ver, Ejemplos, a continuación). Sin embargo, estas proteínas de citotoxicidad reducida exhibieron unión y entrada celular así como actividades enzimáticas similares in vitro y afinidades de unión en comparación con variantes más citotóxicos con las mismas regiones de polipéptido unidas en una configuración diferente (véase, Ejemplos, a continuación).

Tal como se describe adicionalmente en los Ejemplos, la citotoxicidad de proteínas citotóxicas basadas en la subunidad A de la toxina Shiga se mejoró cambiando la orientación de tal manera que la región de unión de tipo inmunoglobulina se unió a regiones carboxi-proximales de la región de toxinas Shiga. Sin embargo, la orientación del diseño no alteró ni la actividad catalítica de la región derivada de toxina Shiga ni la cinética de unión de la región de unión de tipo inmunoglobulina. La sensibilidad de la citotoxicidad (y el enrutamiento intracelular) de las proteínas basadas en la toxina Shiga a la orientación que diseña sus componentes polipeptídicos es inesperada y permanece sin explicación. Estos resultados no pudieron explicarse por las diferencias en las características de unión a la diana de las proteínas, las características de unión celular o las actividades catalíticas.

I. La estructura general de las proteínas de la invención.

La presente invención proporciona varias proteínas citotóxicas, comprendiendo cada proteína 1) una región de unión de tipo inmunoglobulina para el reconocimiento celular, tal como se define en las reivindicaciones y 2) una región efectora de la toxina Shiga para la internalización celular, enrutamiento intracelular y/o eliminación celular, tal como se define en las reivindicaciones. La unión de las regiones de unión del tipo de inmunoglobulina de reconocimiento celular con las regiones derivadas de la subunidad A de la toxina Shiga permite el diseño de un reconocimiento específico del tipo celular de la potente citotoxicidad de la toxina Shiga. Una proteína de la invención comprende una región efectora de toxina Shiga derivada de una o más subunidades A de miembros de la familia de toxinas Shiga, tal como se define en las reivindicaciones, unida a una región de unión de tipo inmunoglobulina que puede unirse específicamente a al menos una biomolécula diana extracelular en asociación física con una célula, tal como una biomolécula diana expresada en la superficie de una célula, en la que dicha biomolécula diana extracelular es CD38. Esta estructura general es modular en el sentido de que cualquier cantidad de regiones de unión de tipo inmunoglobulina diversas puede unirse a regiones efectoras derivadas de la subunidad A de la toxina Shiga para producir variaciones de la misma estructura general.

A. Regiones de unión de tipo inmunoglobulina

La región de unión de una proteína de la presente invención comprende una región de unión de tipo inmunoglobulina que comprende uno o más polipéptidos capaces de unirse de manera selectiva y específica a una biomolécula diana extracelular, tal como se define en las reivindicaciones. El término "región de unión de tipo inmunoglobulina", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una región de polipéptido capaz de unirse a una o más biomoléculas diana, tales como un antígeno o epítopo. Las regiones de unión de tipo inmunoglobulina se definen funcionalmente por su capacidad para unirse a moléculas diana. Las regiones de unión de tipo inmunoglobulina se derivan comúnmente de anticuerpos o estructuras similares a anticuerpos; sin embargo, se contemplan andamios alternativos de otras fuentes dentro del alcance del término.

Las proteínas de inmunoglobulina (Ig) tienen un dominio estructural conocido como un dominio de Ig. Los dominios de Ig varían en longitud desde aproximadamente 70-110 residuos de aminoácidos y poseen un característico pliegue de Ig, en el que típicamente de 7 a 9 hebras beta antiparalelas se disponen en dos láminas beta, que forman una estructura tipo sándwich. El pliegue de Ig se estabiliza mediante interacciones de aminoácidos hidrófobos en las superficies interiores del sándwich y enlaces disulfuro altamente conservados entre residuos de cisteína en las hebras. Los dominios de Ig pueden ser variables (IGV o grupo V), constante (IgC o grupo C) o intermedio (IgI o grupo I). Algunos dominios de Ig pueden estar asociados con una región determinante de la complementariedad (CDR), también llamada "región determinante de la complementariedad", que es importante para la especificidad de la unión de anticuerpos a sus epítopos. Los dominios de tipo Ig también se encuentran en proteínas no inmunoglobulinas y se clasifican sobre esa base como miembros de la superfamilia de Ig de las proteínas. El comité de nomenclatura de genes HUGO (HGNC) proporciona una lista de los miembros de la familia que contiene el dominio de tipo Ig.

Una región de unión de tipo inmunoglobulina puede ser una secuencia de polipéptido de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en el que la secuencia de aminoácidos se ha variado de la de un anticuerpo nativo o un dominio de tipo Ig de una proteína no inmunoglobulina, por ejemplo, mediante ingeniería molecular o la selección mediante cribado de la biblioteca. Debido a la relevancia de las técnicas de ADN recombinante y del cribado de biblioteca in vitro en la generación de regiones de unión de tipo inmunoglobulina, los anticuerpos pueden rediseñarse para obtener las características deseadas, tales como el tamaño más pequeño, entrada en la célula u otras mejoras terapéuticas. Las variaciones posibles son muchas y pueden variar desde el cambio de un solo aminoácido al rediseño completo de, por ejemplo, una región variable. Típicamente, los cambios en la región variable se realizarán con el fin de mejorar las características de unión a antígeno, mejorar la estabilidad de la región variable, o reducir la posibilidad de respuestas inmunógenas.

Hay numerosas regiones de unión de tipo inmunoglobulina contempladas como componentes de las proteínas de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones. En ciertas realizaciones, la región de unión de tipo inmunoglobulina deriva de una región de unión de inmunoglobulina, tal como un paratopo de anticuerpo capaz de unirse a una biomolécula diana extracelular. En ciertas otras realizaciones, la región de unión de tipo inmunoglobulina comprende un polipéptido diseñado no derivado de cualquier dominio de inmunoglobulina, pero que funciona como una región de unión a inmunoglobulina al proporcionar una unión de alta afinidad a una biomolécula diana extracelular. Este polipéptido diseñado puede incluir opcionalmente andamios estructurales de polipéptido que comprenden o que consisten esencialmente en las regiones determinantes de la complementariedad de las inmunoglobulinas, tal como se describe en el presente documento.

También hay numerosas regiones de unión derivadas de inmunoglobulina y polipéptidos diseñados no de inmunoglobulina de la técnica anterior que son útiles para el direccionamiento de polipéptidos a tipos de células específicas a través de sus características de unión de alta afinidad. En ciertas realizaciones, la región de unión de tipo inmunoglobulina de las presentes proteínas se selecciona entre el grupo que incluye los dominios de anticuerpo de un solo dominio (sdAbs), nanocuerpos, dominios de anticuerpo de cadena pesada derivados de camélidos (fragmentos V^hH), nanoanticuerpos bivalentes, dominios de anticuerpos de cadena pesada derivados de peces cartilaginosos, nuevos receptores de antígenos de inmunoglobulina (IgNAR), fragmentos V^nar, fragmentos variables de cadena única (scFv), fragmentos scFv multimerizantes (diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos), fragmentos scFv biespecíficos en tándem, fragmentos variables (Fv) de anticuerpos estabilizados por puente disulfuro, fragmentos de unión a antígeno (Fab) estabilizados con puentes disulfuro que consisten en los dominios V^l, V^h, C^l Y C^h1, fragmentos divalentes F(ab')2, fragmentos Fd que consisten en la cadena pesada y dominios C^h1, minicuerpos de cadena única Fv-C^h3, minicuerpos biespecíficos, fragmentos de dominios diméricos C^h2 (C^h2D), dominios de unión a antígeno Fc (Fcabs), fragmentos aislados de región determinante de complementariedad 3 (CDR3), región estructural 3 restringida, CDR3, polipéptidos de región estructural 4 (FR3-CDR3-FR4), dominios inmunofarmacéuticos modulares (SMIP), fusiones scFv-Fc, fragmentos scFv multimerizantes (diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos), fragmentos variables (Fv) de anticuerpos estabilizados por puente disulfuro, fragmentos de unión a antígeno (fab) estabilizados con puentes disulfuro que consisten en los dominios V^l, V^h, CL y C^h1, nanoanticuerpos bivalentes, minicuerpos bivalentes, fragmentos bivalentes F(ab')2 (dímeros Fab), fragmentos V^hH en tándem biespecíficos, fragmentos scFv en tándem biespecíficos, nanoanticuerpos biespecíficos, minicuerpos biespecíficos, y cualesquiera homólogos genéticamente manipulados de los anteriores que retienen su paratopo y función de unión (ver Saerens D et al, Curr Opin Pharmacol. 8: 600-8 (2008); Dimitrov D, MAbs 1: 26-8 (2009); Weiner L, Cell 148: 1081-4 (2012); .Ahmad Z et al, Clin Dev Immunol 2012: 980250 (2012)). Hay una gran variedad de regiones que comprenden los polipéptidos derivados de las regiones constantes de inmunoglobulinas, tales como, por ejemplo, los dominios Fc diméricos diseñados, Fcs monoméricos (mFc), scFv-Fcs, V^hH-F^cs, dominios C^h2, dominios C^h3s monoméricos (^{it i}C^h3s), dominios de inmunoglobulina sintéticamente reprogramados, y/o fusiones híbridas de dominios de inmunoglobulina con ligandos (Hofer T et al, Proc Natl Acad Sci USA. 105: 12451-6 (2008); Xiao J et al. , J Am Chem Soc 131: 13.616-13.618 (2009); Xiao X et al, Biochem Biophys Res Commun 387:.387-92 (2009); Wozniak-Knopp G et al, Protein Eng Des Sel 23289-97 ( 2010); Gong R et al, PLoS ONE. 7: e42288 (2012); Wozniak-Knopp G et al, PLoS ONE 7:.. e30083 (2012); Ying T et al, J Biol Chem 287: 19399-408 ( 2012); Ying T et al, J Biol Chem 288: 25154-64 (2013); Chiang M et al, J Am Chem Soc 136:. 3370-3 (2014); Rader C, Trends Biotechnol. 32: 186-97 (2014); Ying T et al, Biochimica Biophys Acta 1844:. 1977-1982 (2014)).

De acuerdo con ciertas otras realizaciones, la región de unión de tipo inmunoglobulina comprende un andamio estructural alternativo diseñado a dominios de inmunoglobulina. Los andamios estructurales alternativos diseñados son conocidos en la técnica que presentan características funcionales similares a las estructuras derivadas de inmunoglobulina, tales como de unión de alta afinidad y específica de biomoléculas diana, y pueden proporcionar características mejoradas a dominios de inmunoglobulina, tales como, por ejemplo, mayor estabilidad o inmunogenicidad reducida. Generalmente, los andamios estructurales alternativos a inmunoglobulinas tienen menos de 20 kilodaltons, consisten en una única cadena polipeptídica, carecen de residuos de cisteína, y exhiben estabilidad termodinámica relativamente alta.

Para ciertas realizaciones de las proteínas de la presente invención, la región de unión comprende un andamio estructural alternativo seleccionado de entre el grupo que incluye el 10° dominio diseñado de fibronectina tipo III (10Fn3) derivado de fibronectina (monocuerpos, AdNectins™ o AdNexins™); dominio diseñado de tenascina tipo III derivado de tenascina (Centryns™); polipéptido diseñado qie contiene el motivo de repetición de anquirina (DARPins™); dominio A diseñado derivado de receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR-A) (Avimers™), lipocalina (anticalinas), dominio Kunitz diseñado derivado de inhibidor de proteasa; dominio Z diseñado derivado de Proteína A (Affibodies™); andamio estructural diseñado derivado de gamma B cristalina o andamio estructural diseñado derivado de ubiquitina (Affilins); polipéptidos derivados de Sac7d (Nanoffitins® o afitinas); dominio SH2 diseñado derivado de Fyn (Fynomers®); miniproteínas; andamios estructurales de dominio del tipo lectina de tipo C, mimético de anticuerpo manipulado y cualquier homólogo genéticamente manipulado de cualquiera de los anteriores que retienen su funcionalidad de unión (Worn A, Plückthun A, J Mol Biol 305: 989-1010 (2001); Xu L et al., Chem Biol 9: 933-42 (2002); Wikman M et al, Protein Eng Des Sel 17: 455-62 (2004); Binz H et al, Nat Biotechnol 23: 1257­ 1268 (2005); Hey T et al, Trends Biotechnol 23: 514-522 (2005); Holliger P, Hudson P, Nat Biotechnol. 23: 1126­ 1136 (2005); Gill D, Damle N, Curr Opin Biotech 17: 653-8 (2006); Koide A, Koide S, Methods Mol Biol 352: 95-109 (2007); Byla P et al, J Biol Chem 285: 12096 (2010); Zoller F et al, Molecules 16: 2467-85 (2011)).

Por ejemplo, han sido identificados numerosos andamios estructurales alternativos que se unen al receptor extracelular de HER2 (véase, por ejemplo Wikman M et al, Protein Eng Des Sel. 17: 455-62 (2004); Orlova A et al Cancer Res 66: 4339-8 (2006); Ahlgren S et al, Bioconjug Chem 19: 235-43 (2008); Feldwisch J et al, J Mol Biol 398: 232-47 (2010); patentes de Estados Unidos 5.578.482; 5.856.110; 5.869.445; 5.985.553; 6.333.169 ; 6.987.088; 7.019.017; 7.282.365; 7.306.801; 7.435.797; 7.446.185; 7.449.480; 7.560.111; 7.674.460; 7.815.906; 7.879.325; 7.884.194; 7.993.650; 8.241.630; 8.349.585; 8.389.227; 8.501.909; 8.512.967; 8.652.474; y la solicitud de patente 2011/0059090).

Cualquiera de las regiones de unión de tipo inmunoglobulina anteriores se puede utilizar como un componente de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, siempre que el componente de región de unión tenga una constante de disociación de 10'5a 10'12 moles/litro, preferiblemente menos de 200 nM, hacia una biomolécula diana extracelular, tal como se describe en el presente documento.

Biomoléculas diana extracelulares

La región de unión de la proteína de la invención comprende una región de polipéptido que es capaz de unirse específicamente a una biomolécula diana extracelular, tal como se define en las reivindicaciones, preferiblemente que está físicamente acoplada a la superficie de un tipo de célula de interés, tal como una célula de cáncer, célula tumoral, célula plasmática, célula infectada, o célula huésped que alberga un patógeno intracelular.

El término "biomolécula diana" se refiere a una molécula biológica, comúnmente una proteína o una proteína modificada por modificaciones post-traduccionales, tales como glicosilación, que es capaz de unirse mediante una región de unión para dirgir una proteína a un tipo de célula o localización específica dentro de un organismo. Las biomoléculas diana extracelulares pueden incluir varios epítopos, incluyendo polipéptidos no modificados, polipéptidos modificados por la adición de grupos funcionales bioquímicos y glicolípidos (véase por ejemplo la patente de Estados Unidos 5.091.178; EP 2431743). Es deseable que una biomolécula diana extracelular se internalice endógenamente o se fuerce fácilmente para internalizar tras la interacción con una molécula de la invención.

Para los propósitos de la presente invención, el término "extracelular" con respecto a la modificación de una biomolécula diana se refiere a una biomolécula que tiene al menos una parte de su estructura expuesta al medio extracelular. Las biomoléculas diana extracelulares incluyen componentes de la membrana celular, proteínas de la zona transmembrana, biomoléculas ancladas a la membrana de las células, biomoléculas unidas a la superficie celular y biomoléculas secretadas.

Con respecto a la presente invención, la frase "acoplada físicamente" cuando se usa para describir una biomolécula diana significa interacciones intermoleculares covalentes y/o no covalentes que acoplan la biomolécula diana, o una parte de la misma, al exterior de una célula, tal como una pluralidad de interacciones no covalentes entre la biomolécula diana y la célula, donde la energía de cada interacción individual es del orden de aproximadamente 1-5 kilocalorías (por ejemplo, enlaces electrostáticos, enlaces de hidrógeno, interacciones de Van der Walls, fuerzas hidrófobas, etc. ). Todas las proteínas integrales de membrana se pueden encontrar acopladas físicamente a una membrana celular, así como proteínas de membrana periféricas. Por ejemplo, una biomolécula diana extracelular podría comprender una región de la zona transmembrana, un anclaje lipídico, un anclaje de glicolípido, y/o puede asociarse no covalentementemente (por ejemplo, a través de interacciones hidrofóbicas no específicas y/o interacciones de unión de lípidos) con un factor que comprende cualquiera de los anteriores.

Las biomoléculas diana extracelular de la región de unión de las proteínas de la descripción pueden incluir biomarcadores sobreproporcionalmente o exclusivamente presentes en células cancerosas, células inmunitarias y células infectadas con patógenos intracelulares, tales como virus, bacterias, hongos, priones o protozoos.

Las regiones de unión de las proteínas de la descripción pueden diseñarse o seleccionarse en base a numerosos criterios, tales como la expresión específica del tipo de célula de sus biomoléculas diana y/o la localización física de sus biomoléculas diana con respecto a tipos de células específicos. Por ejemplo, ciertas proteínas de la presente invención comprenden dominios de unión capaces de unir dianas de la superficie celular que se expresan exclusivamente por un solo tipo de células a la superficie celular.

La estructura general de las proteínas de la descripción es modular en que varias regiones de unión diversas se pueden utilizar con la misma región efectora de la toxina Shiga para proporcionar un direccionamiento diverso de varias biomoléculas diana extracelulares y por lo tanto el direccionamiento de la citotoxicidad, la citostasis, agentes de diagnóstico y/o liberación de material exógeno a varios tipos de células diversas.

B. Regiones efectoras de la toxina Shiga derivadas de subunidades A de los miembros de la familia de toxina Shiga Para los propósitos de la presente invención, la frase "región efectora de la toxina Shiga" se refiere a una región polipeptídica derivada de una subunidad A de la toxina Shiga de un miembro de la familia de toxinas Shiga que es capaz de exhibir al menos una función de la toxina Shiga, tal como se define en las reivindicaciones. Las funciones de toxina Shiga incluyen, por ejemplo, entrada en la célula, deformación de la membrana lipídica, dirección del direccionamiento subcelular, evitar la degradación, inactivar catalíticamente los ribosomas, efectuar la citotoxicidad y efectuar efectos citostáticos.

Un miembro de la familia de toxinas Shiga se refiere a cualquier miembro de una familia toxinas proteicas de origen natural que están relacionadas estructural y funcionalmente, en particular toxinas aisladas de S. dysenteriae y E. coli (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010 )). Por ejemplo, la familia de toxinas abarca la toxina Shiga verdadera (Stx) aislada de S. dysenteriae serotipo 1, variantes de toxina semejante a Shiga 1 (SLT1 o Stx1 o SLT1 o Slt-I) aislados de serotipos de E. coli enterohemorrágica, y variantes de toxina semejante a Shiga 2s (SLT2 o Stx2 o SLT-2) aislados de serotipos de E. coli enterohemorrágica. SLT1 difiere por sólo un residuo de Stx, y ambos han sido referidos como Verocitotoxinas o Verotoxinas (VT) (O'Brien, Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992)). Aunque las variantes SLT1 y SLT2 son sólo aproximadamente un 53-60% similares entre sí a nivel de secuencia de aminoácidos, comparten mecanismos de la actividad enzimática y la citotoxicidad comunes a los miembros de la familia de toxinas Shiga (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105- 16 (2010)). Más de 39 toxinas Shiga diferentes se han descrito, tal como los subtipos definidos Stx1a, Stx1c, Stx1d y Stx2a-g (Scheutz F et al, J Clin Microbiol. 50: 2951-63 (2012)). Los miembros de la familia de toxinas Shiga no se limitan, naturalmente, a ninguna especie bacteriana porque los genes que codifican la toxina Shiga pueden propagarse entre especies bacterianas a través de transferencia horizontal de genes (Strauch E et al, Infect Immun 69: 7588-95 (2001); Zhaxybayeva O., Doolittle W, Curr Biol 21: R242-6 (2011)). Como ejemplo de transferencia entre especies, se descubrió una toxina Shiga en una cepa de A. haemolyticus aislada de un paciente (Grotiuz G et al, J Clin Microbiol. 44: 3838-41 (2006)). Una vez que un polinucleótido que codifica la toxina Shiga entra en una nueva subespecie o especie, la secuencia de aminoácidos de la toxina presumiblemente es capaz de desarrollar ligeras variaciones en la secuencia debido a la deriva genética y/o presión selectiva manteniendo al mismo tiempo un mecanismo de citotoxicidad común a los miembros de la familia de toxinas Shiga (ver Scheutz, J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)).

Las regiones efectoras de la toxina Shiga de la proteína de la invención pueden comprender o consistir esencialmente en un polipéptido derivado de una subunidad A de la toxina Shiga disociada de cualquier forma de su subunidad B de toxina Shiga nativa. Además, las proteínas de la presente invención no comprenden cualquier polipéptido que comprende o que consiste esencialmente en un dominio de unión funcional de una subunidad B de toxina Shiga nativa. Más bien, las regiones derivadas de la subunidad A de la toxina Shiga están asociadas funcionalmente con regiones de unión heterólogas para efectuar el direccionamiento celular.

En ciertas realizaciones, una región efectora de la toxina Shiga de la invención puede comprender o consistir esencialmente en una subunidad A de la toxina Shiga de longitud completa (por ejemplo, SLT-1A (SEQ ID NO: 1), StxA (SEQ ID NO: 2), o SLT-2A (SEQ ID NO: 3)), indicando que las subunidades A de la toxina Shiga natural pueden comprender formas precursoras que contienen secuencias señal de aproximadamente 22 aminoácidos en sus extremos amino terminales que se eliminan para producir subunidades A de la toxina Shiga madura y son reconocibles para el experto. En otras realizaciones, la región efectora de la toxina Shiga de la invención puede comprender o consistir esencialmente en una subunidad A de toxina Shiga truncada que es más corta que una subunidad A de toxina Shiga de longitud completa, tal como se define en las reivindicaciones.

Los truncamientos de la subunidad A de la toxina semejante a Shiga 1 son catalíticamente activos, capaces de inactivar los ribosomas enzimáticamente in vitro, y citotóxicos cuando se expresan dentro de una célula (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). El fragmento de subunidad A de la toxina Shiga más pequeño que presenta actividad enzimática completa es un polipéptido compuesto de residuos 1-239 de Slt1A (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Aunque el fragmento más pequeño de la subunidad A de la toxina Shiga que se indicó que retenía la actividad catalítica sustancial fueron los residuos 75-247 de StxA (Al-Jaufy, Infect Immun 62: 956-60 (1994)), un truncamiento de StxA expresado de novo dentro de una célula eucariota requiere sólo hasta el residuo 240 para alcanzar el citosol y ejercer la inactivación catalítica de ribosomas (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)).

Las regiones efectoras de la toxina Shiga pueden comúnmente ser menor que la subunidad A de longitud completa. Se prefiere que la región efectora de la toxina Shiga mantenga la región de polipéptido desde la posición de aminoácido 77 a 239 (SLT-1A (SEQ ID NO: 1) o StxA (SEQ ID NO: 2)) o el equivalente en otras subunidades A de los miembros de la familia de toxinas Shiga (por ejemplo, 77 a 238 del (SEQ ID NO: 3)). Por ejemplo, en ciertas realizaciones de la invención, una región efectora de la toxina Shiga derivada de SLT-1A puede comprender o consistir esencialmente en los aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 1, 1 a 241 de la SEQ ID NO: 1, 1 a 251 de la SEQ ID NO: 1, o los aminoácidos 1 a 261 de la SEQ ID NO: 1. Entre otras ciertas realizaciones, una región efectora de la toxina Shiga derivada de StxA puede comprender o consistir esencialmente en los aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 2, 1 a 241 de SEQ ID NO: 2, 1 a 251 de SEQ ID NO: 2 , o los aminoácidos 1 a 261 de la SEQ ID NO: 2. Entre otras ciertas realizaciones, una región efectora de la toxina Shiga derivada de SLT-2 puede comprender o consistir esencialmente en los aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 3, 1 a 241 de SEQ ID NO: 3, 1 a 251 del SEQ ID NO : 3, o los aminoácidos 1 a 261 de la SEQ ID NO: 3.

La invención proporciona además variantes de las proteínas de la invención, en la que la región efectora de la toxina Shiga difiere de una subunidad A de la toxina Shiga de origen natural hasta en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o más residuos de aminoácidos (pero en no más de lo que retiene al menos 85%, 90%, 95%, 99% o más de identidad de secuencia de aminoácidos, tal como se define en las reivindicaciones). Por lo tanto, una región polipeptídica derivada de una subunidad A de un miembro de la familia de toxinas Shiga puede comprender adiciones, deleciones, truncamientos, u otras alteraciones de la secuencia original, siempre y cuando al menos 85%, 90%, 95%, 99% o más de identidad de secuencia de aminoácidos se mantenga con respecto a una subunidad A de la toxina Shiga de origen natural, tal como se define en las reivindicaciones.

Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la región efectora de la toxina Shiga comprende o consiste esencialmente en secuencias de aminoácidos que tiene al menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98 %, 99%, 99,5% o 99,7% de identidad de secuencia global a una subunidad A de la toxina Shiga de origen natural, tal como SLT-1A (SEQ ID NO: 1), stxA (SEQ ID NO: 2) y/o SLT-2A (SEQ ID NO: 3).

Opcionalmente, una versión de longitud total o truncada de la subunidad A de la toxina Shiga puede comprender una o más mutaciones (por ejemplo, sustituciones, deleciones, inserciones o inversiones). En ciertas realizaciones, se prefiere, en ciertas realizaciones de la invención, que la región efectora de la toxina Shiga tenga suficiente identidad de secuencia con una subunidad A de la toxina Shiga de origen natural para retener la citotoxicidad después de la entrada en una célula, ya sea por procedimientos bien conocidos de transformación, la transfección, la infección o inducción de la célula huésped, o mediante la internalización mediada por la región de unión dirigida a célula unida con la región efectora de la toxina Shiga. Los residuos más críticos para la actividad enzimática y/o la citotoxicidad en las subunidades A de la toxina Shiga han sido asignadas a los siguientes posiciones de residuos: asparagina-75, tirosina-77, glutamato-167, arginina-170 y la arginina-176 entre otras (Di, Toxicon 57: 525-39 (2011)). En cualquiera de las realizaciones de la invención, la región efectora de la toxina Shiga puede preferiblemente, pero no necesariamente, mantener uno o más aminoácidos conservados en las posiciones, tales como los que se encuentran en las posiciones 77, 167, 170, y 176 en StxA, SLT-1A o la posición conservada equivalente en otros miembros de la familia de toxinas Shiga que normalmente se requieren para la actividad citotóxica. La capacidad de una proteína citotóxica de la invención para causar la muerte celular, por ejemplo, su citotoxicidad, se puede medir utilizando uno cualquiera o más de una serie de ensayos bien conocidos en la técnica.

En ciertas realizaciones de la invención, uno o más residuos de aminoácidos pueden ser mutados, insertados o suprimidos con el fin de aumentar la actividad enzimática de la región efectora de la toxina Shiga. Por ejemplo, la mutación de la posición del residuo de alanina-231 en Stx1A a glutamato aumentó su actividad enzimática in vitro (Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)).

En ciertas realizaciones de la invención, uno o más residuos de aminoácidos pueden ser mutados o eliminados con el fin de reducir o eliminar la actividad catalítica y/o citotóxica de la región efectora de la toxina Shiga. La actividad catalítica y/o citotóxica de las subunidades A de los miembros de la familia de toxinas Shiga puede reducirse o eliminarse por mutación o truncamiento. Las posiciones marcadas tirosina-77, glutamato-167, arginina-170, tirosina-114, y triptófano-203 ehan demostrado ser importantes para la actividad catalítica de Stx, Stx1, y Stx2 (Hovde C et al., Proc Natl Acad Sci USA. 85:. 2568-72 (1988); Deresiewicz R et al, Biochemistry 31: 3272-80 (1992); Deresiewicz R et al, Mol Gen Genet 241: 467-73 (1993); Ohmura M et al. , Microb Pathog 15: 169-76 (1993); Cao C et al, Microbiol Immunol. 38: 441-7 (1994); Suhan, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)). La mutación de ambos glutamato-167 y arginina-170 eliminó la actividad enzimática de Slt-I A1 en un ensayo de inactivación de ribosomas libre de células (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). En otro enfoque utilizando la expresión de novo de Slt-I A1 en el retículo endoplásmico, mutando tanto glutamato-167 como arginina-170 o truncándolos a los residuos 1-239 eliminó la citotoxicidad del fragmento Slt-I A1 en ese nivel de expresión (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Un análisis de truncamiento demostró que un fragmento de StxA de los residuos 75 a 268 aún conserva una actividad enzimática significativa in vitro (Haddad, J Bacteriol 175: 4970-8 (1993)). Un fragmento truncado de Slt-I A1 que contiene los residuos 1-239 mostró actividad enzimática significativa in vitro y citotoxicidad por expresión de novo en el citosol (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). La expresión de un fragmento Slt-I A1 truncado en los residuos 1-239 en el retículo endoplásmico no fue citotóxica porque no pudo retrotranslocarse en el citosol (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)).

Tal como se usa en el presente documento, la retención de una función efectora de la toxina Shiga "significativa" se refiere a un nivel de actividad funcional de la toxina Shiga, tal como se mide por un ensayo cuantitativo apropiado con reproducibilidad comparable a un control de polipéptido efector de la toxina Shiga de tipo salvaje. Para la inhibición in vitro de ribosoma, una función efectora de la toxina Shiga significativa es mostrar una IC50 de 300 pM o menos dependiendo de la fuente de los ribosomas (por ejemplo, bacterias, arqueas o eucariotas (algas, hongos, plantas o animales)). Esta es una inhibición significativamente mayor en comparación con la IC50 aproximada de 100000 pM para el doble mutante SLT-1A 1-251 catalíticamente inactivo (Y77S/E167D). Para la citotoxicidad en un ensayo de eliminación de células positivas de diana en un cultivo de células de laboratorio, una función efectora de la toxina Shiga significativa es mostrar una CD50 de 100, 50, o 30 nM o menos, dependiendo de la línea celular y su expresión de la biomolécula diana extracelular apropiada. Esta es una citotoxicidad significativamente mayor para la línea celular diana apropiada en comparación con el componente SLT-1A sola, sin una región de unión de reconocimiento celular, que tiene una CD50 de 100-10.000 nM, dependiendo de la línea celular.

Para algunas muestras, los valores exactos, ya sea para IC50 o CD50, podrían ser imposibles de obtener debido a la incapacidad para recoger los puntos de datos requeridos para una curva de ajuste preciso. Valores de IC50 y/o CD50 inexactos no deben considerarse cuando se determina la actividad de la función efectora de la toxina Shiga significativa. Datos insuficientes para adaptar con precisión una curva, tal como se describe en el análisis de los datos de ensayos de la función efectora de la toxina Shiga de ejemplo, tales como, por ejemplo, ensayos descritos en los ejemplos, no deben considerarse como representativos de la función efectora real de la toxina Shiga. Por ejemplo, en teoría, ni IC50 ni CD50 se pueden determinar si no se produce más del 50% de inhibición de ribosomas o muerte celular, respectivamente, en una serie de concentraciones para una muestra determinada.

El fracaso para detectar la actividad en la función efectora de la toxina Shiga puede ser debido a la expresión inadecuada, el plegamiento del polipéptido y/o la estabilidad del polipéptido en lugar de la falta de entrada celular, enrutamiento subcelular y/o actividad enzimática. Los ensayos para las funciones efectoras de la toxina Shiga pueden no requerir mucho polipéptido de la invención para medir cantidades significativas de actividad de la función efectora de la toxina Shiga. En la medida en que una causa subyacente de función efectora baja o nula se determine empíricamente para relacionarse con la expresión o la estabilidad de la proteína, un experto en la técnica puede ser capaz de compensar tales factores utilizando química de proteínas y técnicas de ingeniería molecular conocidas en la técnica, de tal manera que se puede restaurar y medir una actividad efectora funcional de la toxina Shiga. Como ejemplos, la expresión basada en células inadecuada puede ser compensada mediante el uso de diferentes secuencias de control de expresión; el plegamiento y/o estabilidad del polipéptido inadecuados se pueden beneficiar de la estabilización de secuencias terminales, o mutaciones compensatorias en regiones no efectoras que estabilizan la estructura tridimensional de la proteína, etc. Cuando están disponibles nuevos ensayos para funciones individuales de la toxina Shiga, las regiones o polipéptidos efectores de la toxina Shiga pueden analizarse para cualquier nivel de estas funciones efectoras de la toxina Shiga, tales como por estar dentro de un número determinada de veces de la actividad un polipéptido efector de la toxina Shiga de tipo salvaje. Ejemplos de diferencias de actividad significativas son, por ejemplo, polipéptidos efectores de la toxina Shiga que tienen 1.000 veces o 100 veces o menos la actividad de un polipéptido efector de la toxina Shiga de tipo salvaje; o que tienen de 3 veces a 30 veces o más actividad en comparación con un knock-down funcional o polipéptido efector de la toxina Shiga knock-out.

Ciertas funciones efectoras de la toxina Shiga no son fácilmente medibles, por ejemplo, la actividad de direccionamiento subcelular. Actualmente no hay ninguna rutina, ensayo cuantitativo para distinguir si el fallo de un polipéptido efector de la toxina Shiga para ser citotóxico es debido a un direccionamiento subcelular inadecuado, pero en el momento que estas pruebas estén disponibles, los polipéptidos efectores de la toxina Shiga se pueden analizar para cualquier nivel significativo de direccionamiento subcelular en comparación con el polipéptido efector de la toxina Shiga de tipo salvaje apropiado.

Cabe señalar que incluso si la citotoxicidad de un polipéptido efector de toxina Shiga se reduce en relación con el de tipo salvaje, en la práctica, las aplicaciones que utilizan polipéptidos efectores de la toxina Shiga pueden ser igual o más eficaces que las que utilizan polipéptidos efectores de la toxina Shiga de tipo salvaje porque las variantes de potencia más elevada pueden exhibir efectos indeseables que se minimizan en variantes de potencia reducida. Los polipéptidos efectores de la toxina Shiga de tipo salvaje son muy potentes, siendo capaces de eliminar con sólo una molécula que alcanza el citosol o tal vez se internalizan 40 moléculas. Los polipéptidos efectores de la toxina Shiga con incluso funciones efectoras de la toxina Shiga considerablemente reducidas, tales como, por ejemplo, el direccionamiento subcelular o la citotoxicidad, en comparación con los polipéptidos efectores de la toxina Shiga de tipo salvaje todavía puede ser lo suficientemente potente para aplicaciones prácticas que implican la eliminación de células diana y/o la detección de células específicas.

Para los propósitos de la presente invención, el orden específico o la orientación del efector de la toxina Shiga y regiones de unión de tipo inmunoglobulina se fija tal como se define en las reivindicaciones, de manera que la región de unión de tipo inmunoglobulina de unión está situada dentro de la proteína más proxima al extremo carboxi terminal de la región efectora de la toxina Shiga que el extremo amino terminal de la región efectora de la toxina Shiga (véase, por ejemplo, la Figura 1). En las realizaciones anteriores de proteínas de la invención, las regiones de unión, las regiones efectoras de la toxina Shiga (que pueden ser citotóxicas y/o albergar una o más mutaciones que reducen o eliminan la actividad catalítica y/o la citotoxicidad) pueden estar directamente unidas entre sí y/o adecuadamente unidas entre sí a través de una o más secuencias de polipéptidos intermedias, tal como con uno o más enlazadores bien conocidos en la técnica y/o descritos aquí.

C. Enlaces que conectan componentes polipeptídicos de la invención y/o sus subcomponentes

Los componentes de polipéptidos y/o proteínas individuales de la proteína de la invención, por ejemplo, las regiones de unión y regiones efectoras de la toxina Shiga (que pueden ser citotóxicas y/o albergar una o más mutaciones que alteran, reducen o eliminan la actividad catalítica y/o citotoxicidad), puede estar adecuadamente unidas entre sí mediante uno o más enlazadores bien conocidos en la técnica y/o descritas en el presente documento. Los subcomponentes de polipéptidos individuales de las regiones de unión, por ejemplo, regiones CDR y/o ABR, pueden unirse adecuadamente entre sí mediante uno o más enlazadores bien conocidos en la técnica y/o descritos en el presente documento (véase, por ejemplo Weisser N, Hall J, Biotechnol Adv 27: 502-20 (2009); Chen X et al, Adv Drug Deliv Rev. 65: 1357-1369 (2013)). Los componentes de polipéptidos de la proteína de la invención, por ejemplo, regiones de unión multicadenas, pueden estar adecuadamente unidos entre sí u otros componentes del polipéptido a través de uno o más enlazadores conocidos en la técnica. Los componentes peptídicos de la invención, por ejemplo, los motivos señal de retención/recuperación del retículo endoplasmático de la familia KDEL, pueden estar adecuadamente ligados a otro componente de la invención a través de uno o más enlazadores, tales como un enlazador proteico, que son bien conocidos en la técnica.

Los enlazadores adecuados son generalmente aquellos que permiten que cada componente polipeptídico de la invención se pliegue con una estructura tridimensional muy similar a los componentes polipeptídicos producidos individualmente sin ningún enlazador u otro componente. Los enlazadores adecuados incluyen aminoácidos individuales, péptidos, polipéptidos, y enlazadores que carecen de cualquiera de los anteriores, tales como, por ejemplo, varias cadenas de carbono no proteináceas, ya sean ramificadas o cíclicas (véase, por ejemplo Chen X et al, Adv Drug Deliv Rev. 65: 1357 -69 (2013)).

Los enlazadores adecuados pueden ser proteico y comprender uno o más aminoácidos, péptidos y/o polipéptidos. Los enlazadores proteicos son adecuados para proteínas de fusión recombinantes y conjugados unidos químicamente. Un enlazador proteico tiene típicamente de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos, tales como, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 o de aproximadamente 6 a aproximadamente 25 residuos de aminoácidos. La longitud del enlazador seleccionado dependerá de una variedad de factores, tales como, por ejemplo, la propiedad o propiedades deseadas para las que se selecciona el enlazador (véase, por ejemplo Chen X et al, Adv Drug Deliv Rev. 65: 1357-1369 (2013)).

Los enlazadores adecuados pueden ser no proteínico, tales como, por ejemplo, enlazadores químicos (véase, por ejemplo Dosio F et al, Toxins 3: 848-83 (2011); Feld J et al, Oncotarget 4: 397-412 (2013)). Se pueden usar varios enlazadores no proteínicos conocidos en la técnica para enlazar regiones de unión a las regiones efectoras de la toxina Shiga, tales como enlazadores comúnmente usados para conjugar polipéptidos derivados de inmunoglobulina a polipéptidos heterólogos. Por ejemplo, las regiones de polipéptidos de las proteínas de la presente invención pueden unirse usando las cadenas laterales funcionales de sus residuos de aminoácidos y restos de carbohidrato, tales como, por ejemplo, un grupo carboxi, amina, sulfhidrilo, ácido carboxílico, carbonilo, hidroxilo y/o anillo cíclico. Por ejemplo, se pueden usar enlaces disulfuro y enlaces tioéter para unir dos o más polipéptidos (véase, por ejemplo Fitzgerald D et al, Bioconjugate Chem. 1: 264-8 (1990); Pasqualucci L et al, Haematologica 80: 546-56 (1995)). Además, se pueden utilizar residuos de aminoácidos no naturales con otras cadenas laterales funcionales, tales como grupos cetona (véase, por ejemplo Sun S et al, Chembiochem 18 jul (2014); Tian F et al, Proc Natl Acad Sci USA 111: 1766-1771 (2014)). Los ejemplos de enlazadores químicos no proteicos incluyen, pero no se limitan a, N-succinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato, S-(N-succinimidil) tioacetato (SATA), N-succinimidil-oxicarbonil-cu-metila-(2-piridilditio) tolueno (SMPT), N-succinimidil 4-(2-piridilditio) pentanoato (SPP), succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano carboxilato (SMCC o MCC), sulfosuccinimidil (4-yodoacetil) aminobenzoato, 4-succinimidil-oxicarbonil-a-(2-piridilditio) tolueno, sulfosuccinimidil-6-(a-metil-a-(piridilditiol)-toluamido) hexanoato, N-succinimidil-3-(-2-piridilditio) -proprionato (SPDP), succinimidil 6(3(-(-2-piridilditio)-proprionamido) hexanoato, sulfosuccinimidil 6(3(-(-2-piridilditio) -propionamido) hexanoato, maleimidocaproil (MC), maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonilo (MC-vc-PAB), éster N-hidroxisuccinimida de ácido 3-maleimidobenzoico (MBS), derivados de alfa alquilo, sulfoNHS-ATMBA (sulfosuccinimidil N-[3-(acetiltio)-3-metilbutiril-beta-alanina]), sulfodiclorofenol, 2-iminotiolano, 3-(2-piridilditio) -propionilhidrazida, reactivo de Ellman, ácido diclorotriazínico y S-(2-tiopiridil)-L-cisteína (véase, por ejemplo Thorpe P et al, Eur J Biochem. 147: 197-206 (1985); Thorpe P et al, Cancer Res. 47: 5924-31 (1987); Thorpe P et al, Cancer Res. 48: 6396-403 (1988); Grossbard M et al, Blood 79: 576-85 (1992); Lui C et al, Proc Natl Acad Sci USA 93: 8618-23 (1996); Doronina S et al, Nat Biotechnol 21: 778-84 (2003); Feld J et al, Oncotarget 4:. 397-412 (2013)).

Los enlazadores adecuados, sean proteínicos o no proteínico, pueden incluir, por ejemplo, enlazadores sensibles a la proteasa, sensibles a potencial redox ambiente, sensible al pH, escindibles al ácido, fotoescindible y/o sensibles al calor (véase por ejemplo Dosio F et al, Toxins 3: 848-83 (2011); Chen X et al, Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-1369 (2013); Feld J et al, Oncotarget 4: 397-412 (2013)).

Los enlazadores proteicos pueden ser elegidos para la incorporación en proteínas de fusión recombinantes de la presente invención. Por ejemplo, los polipéptidos componentes de las proteínas de la presente invención o sus subcomponentes pueden estar unidos por uno o más enlazadores que comprenden uno o más aminoácidos, péptidos y/o polipéptidos. Para las proteínas de fusión recombinantes de la invención, los enlazadores comprenden típicamente de aproximadamente 2 a 50 residuos de aminoácidos, preferiblemente de aproximadamente 5 a 30 residuos de aminoácidos (Argos P, J Mol Biol 211: 943-58 (1990); Williamson M, Biochem J 297: 240-60 (1994); George R, Heringa J, Protein Eng 15: 871-9 (2002); Kreitman R, AAPS J 8: E532-51 (2006)). Comúnmente, los enlazadores proteicos comprenden una mayoría de residuos de aminoácidos con residuos polares, no cargados, y/o cargados, tales como, por ejemplo, treoninas, prolinas, glutaminas, glicinas y alaninas (véase, por ejemplo Huston J et al. Proc Natl Acad Sci USA. 85: 5879-83 (1988); Pastan I et al, Annu Rev Med. 58: 221-37 (2007); Li J et al, Cell Immunol. 118: 85-99 (1989); Cumber A et al Bioconj Chem 3: 397-401 (1992); Friedman P et al, Cancer Res 53: 334-9 (1993); Whitlow M et al, Protein Engineering 6: 989-95 (1993); Siegall C et al, J Immunol 152: 2377-84 (1994); Newton et al Biochemistry 35: 545-53 (1996); Ladurner et al J Mol Biol 273: 330-7 (1997); Kreitman R et al, Leuk Lymphoma 52 : 82-6 (2011), US 4.894.443). Los ejemplos no limitantes de enlazadores proteicos incluyen alaninaserina-glicina-glicina-prolina-glutamato (ASGGPE) (SEQ ID NO: 89), valina-metionina (VM), alanina-metionina (AM), AM (G 2 a 4S)xAM (SEQ ID NO: 90) donde G es glicina, S es serina, y x es un número entero de 1 a 10.

Los enlazadores proteicos pueden ser seleccionados en base a las propiedades deseadas. Los enlazadores proteicos pueden ser elegidos por el experto en la materia con características específicas en mente, tales como para optimizar uno o más de las propiedades de plegamiento de la molécula de fusión, estabilidad, expresión, solubilidad, propiedades farmacocinéticas, propiedades farmacodinámicas, y/o la actividad de los dominios fusionados en el contexto de un constructo de fusión en comparación con la actividad del mismo dominio por sí mismo. Por ejemplo, los enlazadores proteináceos pueden seleccionarse basándose en la flexibilidad, la rigidez, y/o capacidad de escisión (véase, por ejemplo Chen X et al, Adv Drug Deliv Rev. 65: 1357-1369 (2013)). El experto en la materia puede utilizar bases de datos y herramientas de software de diseño de enlazadores para elegir enlazadores. Ciertos enlazadores se pueden elegir para optimizar la expresión (véase, por ejemplo Turner D et al, J Immunl Methods 205: 43-54 (1997)). Ciertos enlazadores pueden elegirse para promover las interacciones intermoleculares entre polipéptidos o proteínas idénticas para formar homomultímeros o diferentes polipéptidos o proteínas para formar heteromultímeros. Por ejemplo, los enlazadores proteináceos pueden ser seleccionados que permitan interacciones no covalentes deseadas entre los componentes de polipéptidos de proteínas de la invención, tales como, por ejemplo, interacciones relacionadas con la formación de dímeros y otros multímeros de orden superior (ver por ejemplo, US 4.946.778).

Los enlazadores proteicos flexibles son a menudo mayores que 12 residuos de aminoácidos de largo y ricos en residuos de aminoácidos no polares pequeños, residuos de aminoácidos polares, y/o residuos de aminoácidos hidrófilos, tales como, por ejemplo, glicinas, serinas y treoninas (ver por ejemplo Bird R et al, Science 242: 423-6 (1988) ; Friedman P et al, Cancer Res. 53: 334-9 (1993); Siegall C et al, J Immunol 152: 2377-84 (1994). Los enlazadores proteicos flexibles pueden ser elegidos para aumentar la separación espacial entre los componentes y/o para permitir interacciones intramoleculares entre los componentes. Por ejemplo, diversos enlazadores "GS" son conocidos por el experto y se componen de múltiples glicinas y/o una o más serinas, a veces en unidades de repetición, tales como, por ejemplo, (GxS)n(SEQ ID NO: 82), (SxG)n (SEQ ID NO: 83), (GGGGS)n (SEQ ID NO: 84), y (G)n (SEQ ID NO: 85), en la que x es de 1 a 6 y n es de 1 a 30 (véase por ejemplo WO 96/06641). Los ejemplos no limitantes de enlazadores proteicos flexibles incluyen GKSS^g S^g SESKS (S^eQ ID NO: 86), G^sT^s GSGK^s S^eGKG (SEQ ID NO: 87), GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEQ ID NO: 88), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 90), EGKSSGSGSESKEF (SEQ ID NO: 91), SRSSG (SEQ ID NO: 92), y SGSSC (SEQ ID NO: 93).

Los enlazadores proteicos rígidos son a menudo estructuras rígidas alfa-helicoidales y ricas en residuos de prolina y/o uno o más prolinas colocadas estratégicamente (ver Chen X et al, Adv Drug Deliv Rev. 65: 1357-1369 (2013)). Los enlazadores rígidos pueden ser elegidos para evitar interacciones intramoleculares entre los componentes.

Los enlazadores adecuados pueden ser elegidos para permitir la separación in vivo de los componentes, tales como, por ejemplo, debido a la escisión y/o inestabilidad específica del entorno (ver Dosio F et al, Toxins. 3: 848-83 (2011); Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-1369 (2013)). Los enlazadores escindibles proteicos in vivo son capaces de desunirse mediante procesamiento proteolítico y/o de reducir entornos a menudo en un sitio específico dentro de un organismo o dentro de un cierto tipo de célula (véase, por ejemplo Doronina S et al, Bioconjug Chem. 17: 144-24 (2006) ; Erickson H et al, Cancer Res 66: 4426-33 (2006)). Los enlazadores escindibles proteicos in vivo a menudo comprenden motivos sensible a la proteasa y/o enlaces disulfuro formados por un o más pares de cisteína (véase, por ejemplo Pietersz G et al, Cancer Res 48: 4469-76 (1998); El J et al, J Immunol. Procedimientos 110: 101-9 (1998); ver Chen X et al, Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-1369 (2013)). Los enlazadores escindibles proteicos in vivo pueden ser diseñados para ser sensibles a las proteasas que sólo existen en ciertos lugares en un organismo, compartimentos dentro de una célula y/o se vuelven activos sólo en ciertas condiciones fisiológicas o patológicas (tales como, por ejemplo, proteasas con niveles anormalmente altos, proteasas sobreexpresadas en ciertos sitios de la enfermedad, y proteasas expresadas específicamente por un microorganismo patógeno). Por ejemplo, hay enlazadores proteicos conocidos en la técnica que son escindidos por proteasas presentes solamente intracelularmente, las proteasas presentes sólo dentro de determinados tipos de células, y las proteasas presentes sólo en condiciones patológicas, como el cáncer o la inflamación, tales como, por ejemplo, motivo R-x-x-R y AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM ( SEQ ID NO: 94).

En ciertas realizaciones de las proteínas de la presente invención, puede utilizarse un enlazador que comprende uno o más sitios sensible a proteasas para proporcionar la escisión por una proteasa presente dentro de una célula diana. En ciertas realizaciones de las proteínas de la invención, puede utilizarse un enlazador que no sea escindible para reducir la toxicidad no deseada después de la administración a un organismo vertebrado (véase, por ejemplo Polson A et al, Cancer Res. 69: 2358-64 (2009)).

Los enlazadores adecuados pueden incluir, por ejemplo, enlazadores sensibles a la proteasa, sensibles a potencial redox ambiental, sensible al pH, escindiblepor ácido, fotoescindible, y/o sensibles al calor, ya sea proteínico o no proteínico (ver Chen X et al, Adv Drug Deliv Rev 65.: 1357-1369 (2013)).

Los enlazadores escindibles adecuados pueden incluir enlazadores que comprenden grupos escindibles que son conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, enlazadores señalados por Zarling D et al, J Immunol 124:. 913-20 (1980); Jung S, Moroi M, Biochem Biophys Acta 761: 152-62 (1983); Bouizar Z et al, Eur J Biochem 155:. 141-7 (1986); Parque L et al, J Biol Chem. 261: 205-10 (1986); Browning J, Ribolini A, J Immunol 143: 1859-1867 (1989) ; Joshi S, Burrows R, J Biol Chem 265: 14518-25 (1990).

Los enlazadores adecuados pueden incluir enlazadores sensibles al pH. Por ejemplo, ciertos enlazadores adecuados pueden ser elegidos por su inestabilidad en entornos de pH más bajos para proporcionar la disociación dentro de un compartimiento subcelular de una célula diana. Por ejemplo, enlazadores que comprenden uno o más grupos tritilo, grupos tritilo derivatizados, grupos bismaleimideotoxi propano, grupos de dihidrazida de ácido adípico, y/o grupos de transferrina lábiles a ácido, pueden proporcionar la liberación de componentes de la invención, por ejemplo un componente polipéptido, en entornos con intervalos de pH específicos (véase, por ejemplo Welhoner H et al, J Biol Chem. 266:. 4309-14 (1991); Fattom A et al, Infect Immun 6o: 584-9 (1992)). Ciertos enlazadores se pueden elegir que escinden en intervalos de pH que corresponden a diferencias de pH fisiológico entre los tejidos, tales como, por ejemplo, el pH del tejido tumoral es menor que en los tejidos sanos (ver por ejemplo, US 5.612.474).

Los enlazadores fotoescindibles son enlazadores que se esciden después de la exposición a la radiación electromagnética de ciertos intervalos de longitud de onda, tales como luz en el rango visible (véase, por ejemplo Goldmacher V et al, Bioconj Chem. 3: 104-7 (1992)). Los enlazadores fotoescindibles se pueden usar para liberar un componente de una molécula de la invención, por ejemplo un componente de polipéptido, tras la exposición a la luz de determinadas longitudes de onda. Los ejemplos no limitantes de enlazadores fotoescindibles incluyen un grupo nitrobencilo como grupo protector fotoescindible para cisteína, retculadores de cloruro de nitrobenciloxicarbonilo, copolímero de hidroxipropilmetacrilamida, copolímero de glicina, copolímero de fluoresceína y copolímero de metilrodamina (Hazum E et al., Pept Proc Eur Pept Symp. 16a, Brunfeldt K, ed, 105-110 (1981); Senter et al, Photochem Photobiol 42: 231-7 (1985); Yen et al, Makromol Chem. 190:. 69-82 (1989); Goldmacher V et al, Bioconj Chem. 3: 104-7 (1992)). Los enlazadores fotoescindibles pueden tener usos particulares en la unión de componentes para formar moléculas de la invención diseñada para el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones que pueden ser expuestas a la luz utilizando fibra óptica.

En ciertas realizaciones de las proteínas de la invención, una región de unión dirigida a una célula se une a una región efectora de la toxina Shiga usando cualquier número de medios conocidos para el experto, incluyendo tanto enlaces covalentes como no covalentes (véase, por ejemplo Chen X et al., Drugs adv Deliv Rev 65: 1357-1369 (2013); Behrens C, Liu B, MAbs 6: 46-53 (2014)).

En ciertas realizaciones de las proteínas de la presente invención, la proteína comprende una región de unión que es un scFv con un enlazador que conecta un dominio variable de cadena pesada ^{( V h)} y un dominio variable de cadena ligera ^{( V l) .} Hay numerosos enlazadores conocidos en la técnica adecuados para este propósito, tales como, por ejemplo, el péptido de 15 residuos (Gly4Ser)³ (SEQ ID NO: 95). Enlazadores de scFv adecuados que pueden ser utilizados en la formación de estructuras multivalentes no covalentes incluyen GGS, GGGS (Gly3Ser o G3S) (SEQ ID NO: 96), GGGGS (Gly4Ser o G4S) (SEQ ID NO: 97), GGGGSGGG (SEQ ID NO : 98), GGSGGGG (SEQ ID NO: 99), GSTSGGGSGGGSGGGGSS (SEQ ID NO: 100), y GSTSGSGKPGSSEGSTKG (SEQ ID NO: 101) (Plückthun A, Pack P, Immunotechnology 3: 83-105 (1997); Atwell J et al, Protein Eng. 12: 597-604 (1999); Wu A et al, Protein Eng 14: 1025-1033 (2001); Yazaki P et al, J Immunol Methods 253: 195-208 (2001); Carmichael J et al, J Mol Biol 326:.

341-51 (2003); Arndt M et al, FEBS Lett 578:. 257-61 (2004); Bie C et al, World J Hepatol 2: 185-91 (2010)).

Los procedimientos adecuados para la unión de los componentes de las proteínas de la presente invención pueden ser mediante cualquier procedimiento actualmente conocido en la técnica para llevarlas a cabo, siempre que la fijación no impida sustancialmente la capacidad de unión de la región de unión, la internalización celular de la proteína y/o función o funciones efectoras de la toxina deseada de la región efectora de la toxina Shiga tal como se mide mediante un ensayo apropiado, incluyendo los ensayos como se describe en el presente documento.

II Ejemplos de variaciones estructurales específicas de las proteínas de la invención.

Entre ciertas realizaciones de la presente invención, las proteínas de la invención comprenden una región de unión derivada de un polipéptido de tipo inmunoglobulina seleccionado por la unión específica y de alta afinidad a un antígeno de superficie, tal como se define en las reivindicaciones, en la superficie celular de una célula cancerosa, donde se restringe el antígeno en la expresión a las células cancerosas (véase Glokler J et al, las moléculas 15: 2478-90 (2010); Liu Y et al, Lab chip de 9: 1033-6 (2009)). De acuerdo con otras realizaciones, se selecciona la región de unión para una unión específica y de alta afinidad a un antígeno de superficie en la superficie celular de una célula cancerosa, donde el antígeno es sobreexpresado o preferencialmente expresado por las células cancerosas en comparación con células no canceerosas. Algunas biomoléculas diana representativas incluyen, pero no se limitan a, las siguientes dianas enumerados asociadas con cánceres y/o tipos de células inmunes específicos.

Existen muchas regiones de unión de tipo inmunoglobulina que reconocen epítopos asociados con células cancerosas en la técnica anterior, tales como las regiones de unión que reconocen (los nombres alternativos se indican entre paréntesis) anexina AI, antígeno de melanoma B3, antígeno de melanoma B4, CD2, CD3, CD4, CD20 (proteína de antígeno de linfocitos B CD20), CD22, CD25 (receptor de interleuquina-2 IL2R), CD30 (TNFRSF8), ^{C d 3 8} (ADP ribosa cíclica hidrolasa), CD40, CD44 (receptor de hialuronano), ITGAV (CD51), CD66, CD71 (receptor de transferrina), CD73, CD74 (cadena invariante asociada a antígenos de HLA-DR), CD79, CD98, endoglina (FIN o CD105), CD106 (VCAM-1), receptor de quimioquinas tipo 4 (CDCR-4, fusina, CD184), CD200, receptor de factor de crecimiento 1 semejante a insulina (CD221), mucina 1 (MUC1, CD227), molécula de adhesión de células basales (B-CAM o CD239), CD248 (endosialina o TEM1), receptor del factor necrosis tumoral 10b (TNFRSF10B, CD262), receptor del factor de necrosis tumoral 13B (TNFRSF13B, TACI, CD276), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2 (KDR, CD309), molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM, CD326), receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2/Neu/ErbB2/CD340), antígeno de cáncer 15-3 (CA15-3), antígeno de cáncer 19-9 (CA 19-9), antígeno de cáncer 125 (CA125, MUC16), CA242, moléculas de adhesión celular relacionadas con antígeno carcinoembrionario (por ejemplo CEACAM3 (CD66d) y CEACAM5), proteína de antígeno carcinoembrionario (CEA), proteoglicanos de sulfato de condroitina 4 (CSP4, ^m C^s P, NG2), CTLA4, DLL4, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR/ErbB1), receptor de folato (FOLR), G-28, gangliósido GD2, gangliósido GD3, HLA-DR10, HLA-DRB, receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 1 (HER1), receptor 2 de Efrina tipo-B (EphB2), molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM), proteína de activación de fibroblastos (FAP/seprasa), receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina (IGF1R), receptor de interleuquina 2 (IL-2R), receptor de interleuquina 6 (IL-6R), integrinas alfa-V beta-3 (ayp3), integrinas alfa-V beta-5, integrinas alfa-5 beta-1 (a5p-i), L6, MPG, proteína de antígeno asociado a melanoma 1 (MAGE 1), antígeno asociado a melanoma 3 (MAGE-3), mesotelina (MSLN), MPG, MS4A, p21, p97, receptor de virus de la polio similar 4 (PVRL4), receptores activados por proteasa (tales como PAR1), proteína de antígeno de membrana específica de la próstata (PSMA), glicoproteína de trofoblasto (TPGB) y transductores señal de calcio asociados a tumores (TACSTDs) (véase, por ejemplo Lui B et al, Cancer Res. 64: 704-10 (2004); Novellino L et al, Cancer Immunol Immunother 54: 187-207 (2005); Bagley R et al, Int J Oncol 34: 619-27 (2009); Gerber H et al, mAbs 1: 247-53 (2009); Beck A et al, Nat Rev Immunol. 10: 345-52 (2010); Andersen J et al, J Biol Chem 287: 22927-37 (2012); Nolan-Stevaux O et al, PLoS One 7: e50920 (2012); Rust S et al, Cancer Mol 12: 11 (2013)). Esta lista de biomoléculas diana no pretende ser limitativa. Se apreciará por el experto en la materia que cualquier biomolécula diana deseada, tal como se define en las reivindicaciones, asociada con una célula de cáncer u otro tipo de célula deseada se puede usar para diseñar o seleccionar una región de unión para acoplarse con la región efectora de la toxina Shiga para producir una proteína de la invención.

Ejemplos de otras biomoléculas diana que están fuertemente asociadas con las células cancerosas y regiones de unión de tipo inmunoglobulina conocidas por unirse a las mismas incluyen proteínas BAGE (antígenos de melanoma B), moléculas de adhesión celular basal (BCAMs o glicoproteínas de grupos sanguíneos luteranos), antígeno de tumor de vejiga (BTA), antígeno de cáncer de testículo-NY-ESO-1, proteínas LAGE de antígeno de cáncer de testículo, CD19 (proteína de antígeno de linfocitos B CD19), CD21 (receptor del complemento-2 o receptor del complemento 3d), CD26 (dipeptidil peptidasa-4, DPP4, o proteína complejante de adenosina desaminasa 2), CD33 (lectina de tipo inmunoglobulina 3 de unión a ácido siálico), CD52 (antígeno de CAMPATH-1), CD56 (molécula de adhesión celular neural o NCAM), CD133 (prominina-1), CS1 (familia SLAM número 7 o SLAMF7), proteína de antígeno de la superficie celular A33 (gpA33), proteínas de antígeno de virus Epstein-Barr, proteínas GAGE/PAGE (antígenos de cáncer/testículo asociado a melanoma), receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFR o c-Met), proteínas MAGE, antígeno de melanoma reconocido por proteína 1 de células T (MART-1/MelanA, MARTI), mucinas, expresados proteínas de antígeno preferencialmente expresadas de melanoma (PRAME), proteína de antígeno específica de próstata (PSA), proteína de antígeno de células madre de próstata (PSCA), receptor para productos finales de glucosilación avanzada (RAGE), glicoproteína asociada a tumor 72 (TAG -72), receptor transmembrana de proteína tirosina quinasa (ROR1 o NTRKR1), receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFRs) y el antígeno de tumor de Wilms.

Ejemplos de otras biomoléculas diana que están fuertemente asociadas con las células cancerosas son anhidrasa carbónica IX (CA9/CAIX), proteínas claudin (CLDN3, CLDN4), receptor 3 de efrina tipo-A (EphA3), proteínas de unión a folato (FBP), gangliósido GM2, receptores de factores de crecimiento similares a la insulina, integrinas (como CD11a-c), receptor activador del factor nuclear kappa B (RANK), receptor de proteína tirosina quinasa erb-3, receptor del factor necrosis tumoral 10A (TRAIL-R1/DR4), receptor del factor de necrosis tumoral 10B (TRAIL-R2), tenascina C, y CD64 (FcyRI) (véase Hough C et al, Cancer Res 60: 6281-7 (2000); Thepen T et al, Nat Biotechnol 18: 48-51 (2000); Pastan I et al, Cancer Nat Rev 6: 559-65 (2006); Pastan, Annu Rev Med 58: 221-37 (2007); Fitzgerald D et al, Cancer Res 71: 6300-9 (2011); Scott A et al, Cancer Immun 12: 14-22 (2012)). Esta lista de biomoléculas diana no pretende ser limitativa.

Además, existen numerosos otros ejemplos de biomoléculas diana contempladas, tales como las metaloproteinasas de ADAM (por ejemplo, ADAM-9, ADAM-10, ADAM-12, ADAM-15, ADAM-17), ADP-ribosiltransferasas (ART1, ART4), antígeno F4/80, antígenos de estroma de médula ósea (BST1, BST2), proteínas del oncogén c-abI de la región clúster de punto de ruptura (BCR-aBL), C3aR (receptores del componente de complemento 3a), CD7, CD13, CD14, CD15 (antígeno embrionario Lewis X o específico de etapa 1), c D23 (FC epsilon RII), CD49d, CD53, CD54 (molécula de adhesión intercelular 1), CD63 (tetraspanina), CD69, CD80, CD86, CD88 (receptor 1 de componente de complemento componente 5a), CD115 (receptor del factor estimulante de colonias 1), CD123 (receptor de interleuquina-3), CD129 (receptor de interleuquina 9), CD183 (receptor de quimioquinas CXCR3), CD191 (CCR1), CD193 (CCR3), CD195 (receptor de quimioquina ^c C^r5), C^d203^c, CD225 (proteína transmembrana inducida por interferón 1), CD244 (receptor de células asesinas naturales 2B4), CD282 (receptor de tipo Toll 2), CD284 (receptor de tipo Toll 4), CD294 (GPR44), CD305 (receptor de tipo inmunoglobulina asociado a leucocitos 1), receptor 2 de efrina tipo-A (EphA2), FceRIa, galectina-9, proteína de antígeno alfa-fetoproteína 17-A1, aspartil (asparaginil) betahidroxilasa humana (HAAH), transcripción similar a inmunoglobulina ILT-3, lisofosfatidilglicerol aciltransferasa 1 (LPGAT1/IAA0205), proteínas de membrana asociada a lisosoma (LAMP, tales como CD107), proteínas de m e la n o cito s P M E L (g p 100 ), p ro te ín a -14 re la c io n a d a con m ielo id e ( M R P -14 ) , ligando 1 de m uerte p ro g ra m ad a ( P D -L 1) , recepto r de p roteína tiro sin a q u in a s a e rb B -3 , p ro te ín a s S A R T , re cep to res s c a v e n g e r (tales com o C D 64 y C D 68 ), S ig le c s (le ctin a s de tipo in m un o g lo b ulin a de unión a á cid o s iá lico ), s in d e c a n o s (tales com o S D C 1 o C D 138 ) , t iro s in a sa , p roteína re la c io n a d a con la t iro s in a sa 1 ( T R P -1 ) , prote ína re la c io n a d a con t iro s in a s a 2 ( T R P -2 ) , an tíg en o a so c ia d o a t iro s in a sa (T A A ), A P O -3 , B C M A , C D 2 , C D 3 , C D 4 , C D 8 , C D 18 , C D 27 , C D 28 , C D 29 , C D 41, C D 49 , C D 90 , C D 95 (F a s), C D 103 , C D 104 , C D 134 (O X 40 ), C D 137 (41B B ) , C D 152 ( C T L A -4 ) , recep to res de q u im io q u in a s, p ro te ín a s del com p lem ento, recep to res de c ito cin as, p ro te ín a s de h istoco m patib ilid ad , IC O S , interferón-alfa, interferón-beta, c -m y c , o steop rotegerina, P D -1, R A N K , T A C I, m iem bro de la su p e rfa m ilia de recep to res de T N F ( T N F -R 1, T N F R -2 ) , A p o 2 /T R A IL -R 1, T R A IL -R 2 , T R A IL -R 3 , y T R A IL -R 4 (ver, C h e e v e r M et al, C lin C a n c e r R e s . 15 : 5 323 -37 (2009); Scott A et al, C a n c e r Im m un 12 : 14 (2012 )) , para b io m o lé cu la s d ia n a y cab e in d ica r que la s m o lé c u la s d ia n a d e sc rita s en la m ism a son e je m p lo s no lim itantes). S e a p re c ia rá por el experto en la m ateria que c u a lq u ie r b io m o lé cu la d ia n a d e se a d a , tal com o se d efine en la s re iv in d ica c io n e s, se p u ede u s a r para d is e ñ a r o s e le c c io n a r un a región de unión p a ra s e r a c o p la d a con la región efectora de toxina S h ig a para p rod u cir un a proteína de la invención .

E n c ie rta s re a liz a c io n e s , la región de unión co m p re n d e o co n siste e se n c ia lm e n te en un polipéptido de tipo in m u n o g lo b u lin a s e le c c io n a d o pa la un ión e s p e c íf ic a y de alta afin id ad a la su p e rfic ie c e lu la r de un tipo de c é lu la del s iste m a inm unitario. P o r ejem p lo , los d om in io s de unión de tipo in m un o g lo b ulin a son co n o cid o s por un irse a C D 1, C D 2 , C D 3 , C D 4 , C D 5 , C D 6 , C D 7 , C D 8 , C D 9 , C D 10 , C D 11, C D 12 , C D 13 , C D 14 , C D 15 , C D 16 , C D 17 , C D 18 , C D 19 , C D 20 , C D 21, C D 22 , C D 23 , C D 24 , C D 25 , C D 26 , C D 27 , C D 28 , C D 29 , C D 30 , C D 31, C D 33 , C D 34 , C D 35 , C D 36 , C D 37 , C D 38 , C D 40 , C D 41, C D 56 , C D 61, C D 62 , C D 66 , C D 95 , C D 117 , C D 123 , C D 235 , C D 146 , C D 326 , recepto r de interleu q uin a 2 ( IL -2 R ) , receptor a ctiv a d o r del ligando ka p p a B de factor n u cle a r (R A N K L ), p roteína a s o c ia d a a S L A M (S A P ), y T N F S F ^{1 8} (lig an d o 18 del factor de n e c ro s is tum oral o G IT R L ) .

E n c ie rta s re a liz a c io n e s , la región de unión s e une con alta afin id ad a la b io m o lé cu la d ia n a qu e e s un recepto r de q u im io q u in a s se le c c io n a d o de los s ig u ie n te s C X C R - 1, C X C R -2 , C X C R - 3 A, C X C R 3 B , C X C R -4 , C X C R -5 , C C R -I , C C R -2 A , C C R -2 B , C C R -3 , C C R -4 , C C R -5 , C C R -6 , C C R -7 , C C R -8 , C C R -9 , C C R -10 , C X 3 C R - 1, X C R 1, C X C R -6 , C X C R -7 , la p ro te ín a -2 de unión a q u im io q u in a s ( C C B P 2 , recepto r D6), y el recepto r de a n tíg e n o /q u im io q u in a s Duffy ( D A R C glicop ro teín a, F y , F Y , C D 234 ) . P a ra m á s b io m o lé cu la s d ia n a no lim itantes, v é a s e la T a b la 11 en los E je m p lo s s ig u ie n te s.

En tre c iertas re a liz a c io n e s , la s p ro te ín a s de la p resen te inven ción co m p ren d en la región efectora de la toxina S h ig a qu e co m p ren d e o qu e co n siste e se n c ia lm e n te en los a m in o á c id o s 75 a 251 de S L T - 1 A ( S E Q ID N O : 1), stxA ( S E Q ID N O : 2), y/o S L T -2 A ( S E Q ID N O : 3). O tra s re a liz a c io n e s so n p ro te ín a s en la s qu e la región efecto ra de la toxina S h ig a co m p ren d e o co n siste e se n c ia lm e n te en los a m in o á c id o s 1 a 241 de S L T - 1 A ( S E Q ID N O : 1), stxA ( S E Q ID N O : 2), y/o S L T -2 A ( S E Q ID N O : 3). O tra s re a liz a c io n e s son p ro te ín a s en la s que la región efectora de la toxina S h ig a co m p ren d e o co n siste e se n c ia lm e n te en los a m in o á c id o s 1 a 251 de S L T - 1 A ( S E Q ID N O : 1), stxA ( S E Q ID N O : 2), y/o S L T -2 A ( S E Q ID N O : 3). O tra s re a liz a c io n e s son p ro te ín a s en la s que la región efectora de la toxina S h ig a co m p ren d e o co n siste e se n c ia lm e n te en los a m in o á c id o s 1 a 261 de S L T - 1 A ( S E Q ID N O : 1), stxA ( S E Q ID N O : 2), y /o S L T -2 A ( S E Q ID N O : 3).

E n c ie rta s re a liz a c io n e s de la invención , tal com o se d efine en la s re iv in d ica c io n e s, la s p ro te ín a s co m p re n d e n la región de unión de tipo inm u n o g lo b u lin a que co m p ren d e o que co n siste e se n c ia lm e n te en los a m in o á cid o s 269 -508 de la S E Q ID N O : 4, que m uestra una unión de alta afin idad e sp e c ífic a m e n te a C D 38 hum ano. O tra s re a liz a c io n e s so n la s p ro te ín a s co m p re n d e n o qu e co n siste n e s e n c ia lm e n te en uno cu a lq u ie ra de los polip ép tidos m o strad os en S E Q ID N O s: 4 -7.

E n c ie rta s re a liz a c io n e s de la d e scrip c ió n , la s prote ín as de la p resen te in ven ció n co m p re n d e n la región de unión de tipo in m u n o g lo b u lin a qu e co m p re n d e o qu e co n siste e se n c ia lm e n te en los a m in o á c id o s 269 -512 de la S E Q ID No: 8, qu e m u estra una unión de alta afin idad e sp e c ífic a m e n te a H E R 2 hum ano. O tra s re a liz a c io n e s de la d e scrip c ió n son la s p ro te ín a s que co m p ren d en o co n siste n e se n c ia lm e n te en uno cu a lq u ie ra de los polip ép tidos m o strad os en las S E Q ID No: 8 -11.

E n c ie rta s re a liz a c io n e s de la d e scrip c ió n , la s p ro te ín a s co m p re n d e n la región de unión de tipo in m u n o g lo b u lin a que co m p re n d e o qu e co n siste e se n c ia lm e n te en los a m in o á c id o s 269 -516 de S E Q ID No: 12 , qu e m u estra un a unión de alta afin id ad e sp e c ífic a m e n te a C D 19 hu m ano . O tra s re a liz a c io n e s de la d e scrip c ió n son la s p ro te ín a s que co m p re n d e n o co n siste n e s e n c ia lm e n te en uno cu a lq u ie ra de los polip ép tidos m o stra d o s en la s S E Q ID No: 12 - 15. E n c ie rta s re a liz a c io n e s de la d e scrip c ió n , la s p ro te ín a s co m p re n d e n la región de unión de tipo in m u n o g lo b u lin a que co m p re n d e o qu e c o n s iste e se n c ia lm e n te en los a m in o á c id o s 269 -518 de la S E Q ID N O : 16 , qu e m u e stra un a unión de alta afin idad e s p e c ífic a m e n te a C D 74 hu m ano. O tra s re a liz a c io n e s de la d e scrip c ió n son la s p ro te ín a s que co m p re n d e n o co n siste n e s e n c ia lm e n te en uno cu a lq u ie ra de los polip ép tidos m o strad os en la s S E Q ID No: 16 -19. En tre c ie rta s re a liz a c io n e s de la s p ro te ín a s de la p resen te d e scrip c ió n , la región de unión e s un a región d e riv a d a de in m u n o g lo b u lin a de dom inio ún ico V hH que m u estra un a unión de alta afin id ad e s p e c ífic a m e n te a H E R 2 , tal com o derivada de una región variable de dominio único de la proteína 5F7 de anticuerpo de camélido (V^hH), tal como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. 2011/0059090. En ciertas realizaciones adicionales de la descripción, las proteínas comprenden la región de unión de tipo inmunoglobulina que comprende o que consiste esencialmente en los aminoácidos 268-385 de la SEQ ID No: 20, que muestra una unión de alta afinidad específicamente a HER2 humano. Otras realizaciones de la descripción son las proteínas que comprenden o consisten esencialmente en uno cualquiera de los polipéptidos mostrados en las SEQ ID No: 20-29.

En ciertas realizaciones de la descripción, las proteínas comprenden la región de unión de tipo inmunoglobulina que comprende o consiste esencialmente en los aminoácidos 269-365 de SEQ ID NO: 16, que muestra una unión de alta afinidad específicamente a CD20 humano. Otras realizaciones de la descripción son las proteínas que comprenden o que consisten esencialmente en uno cualquiera de los polipéptidos mostrados en las SEQ ID No: 30-31.

Tal como se utiliza aquí, el término "dominio variable de cadena pesada (V^h)" o "dominio variable de cadena ligera (V^l)" se refieren respectivamente a cualquier dominio de anticuerpo V^h o V^l (por ejemplo, un dominio V^h o V^l humano), así como cualquier derivado de los mismos que retiene por lo menos la capacidad de unión a antígeno cualitativa del anticuerpo nativo correspondiente (por ejemplo un dominio V^h o V^l humanizado derivado de un dominio V^h o V^l murino nativo). Un dominio V^h o V^l consiste en una región "marco" interrumpida por las tres CDRs o ABRs. Las regiones marco sirven para alinear las CDR para la unión a un epítopo de un antígeno específico. Desde el extremo amino-terminal al extremo carboxilo terminal, ambos dominios V^h y V^l comprenden las siguientes regiones marco (FR) y regiones CDR: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Para fragmentos V^hH de camélido, IgNARs de peces cartilaginosos, fragmentos V^nar y derivados de los mismos, existe un solo dominio variable de cadena pesada que comprende la misma disposición básica: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4.

Está dentro del alcance de la presente invención usar fragmentos, variantes y/o derivados de los polipéptidos de las proteínas de la invención que contienen un sitio de unión a biomolécula diana extracelular funcional, tal como se define en las reivindicaciones, e incluso más preferiblemente capaces de unirse a la biomolécula diana con alta afinidad (por ejemplo, tal como se muestra por K^d). Por ejemplo, mientras que la invención proporciona secuencias de polipéptidos que pueden unirse a CD38, cualquier región de unión de tipo inmunoglobulina que comprende un polipéptido, tal como se define en las reivindicaciones, que se une a CD38 extracelular, expresado en una superficie celular, con una constante de disociación de 10'5a 10'12 moles por litro, preferiblemente menos de 200 nM, puede ser sustituida para uso en la fabricación de proteínas de la invención y los procedimientos de la invención.

Entre ciertas realizaciones de la presente invención, la región de unión de tipo inmunoglobulina se deriva de una región derivada de inmunoglobulina de dominio único V^hH, tal como se define en las reivindicaciones. En general, los nanocuerpos® se construyen a partir de fragmentos de anticuerpos monoméricos de dominio variable únicos naturales (sdAbs) del tipo encontrado en camélidos y peces cartilaginosos (Chondrichthyes). Los nanobodies® están diseñados a partir de estos anticuerpos naturales truncando el dominio variable monomérico único para crear una molécula más pequeña y más estable. Debido a su pequeño tamaño, los nanocuerpos® pueden unirse a antígenos que no son accesibles a anticuerpos completos. Entre ciertas realizaciones de la presente descripción, la región de unión de tipo inmunoglobulina se deriva de un nanocuerpo o una región derivada de inmunoglobulina de dominio único V^hH que exhibe una unión de alta afinidad específicamente a las proteínas HER2 humanas.

III. Funciones generales de las proteínas de la invención.

La presente invención proporciona varias proteínas citotóxicas, que comprenden cada una 1) una región de unión de tipo inmunoglobulina para el reconocimiento celular, tal como se define en las reivindicaciones y 2) una región efectora tde oxina Shiga citotóxica, tal como se define en las reivindicaciones. La unión de las regiones de unión del tipo de inmunoglobulina de reconocimiento celular con las regiones derivadas de la subunidad A de la toxina Shiga permite la ingeniería del reconocimiento específico del tipo celular de la potente citotoxicidad de la toxina Shiga. Las proteínas de la invención son capaces de unir biomoléculas diana extracelulares asociadas con la superficie celular de tipos celulares particulares y entrar en esas células, tal como se define en las reivindicaciones. Una vez internalizadas dentro de un tipo de célula diana, ciertas realizaciones de las proteínas de la invención son capaces de dirigir un fragmento de polipéptido efector de la toxina Shiga citotóxica hacia el citosol de la célula diana. Una vez en el citosol de un tipo de célula diana, ciertas realizaciones de las proteínas citotóxicas de la invención son capaces de inactivar enzimáticamente los ribosomas, interferir con la homeostasis celular y finalmente matar la célula. Este sistema es modular, ya que se puede usar cualquier cantidad de regiones de unión de tipo inmunoglobulina diversas para dirigir esta potente citotoxicidad o citostasis a diversos tipos de células diversas. Alternativamente, las variantes no tóxicas de las proteínas de la descripción pueden usarse para suministrar materiales exógenos adicionales a las células diana, tales como agentes promotores de detección para etiquetar los interiores de las células diana para funciones de recopilación de información de diagnóstico.

A. Eliminación de células a través de la citotoxicidad dirigida de la toxina Shiga

Debido a que los miembros de la familia de toxinas Shiga están adaptados para eliminar células eucariotas, las proteínas diseñadas usando regiones efectoras de toxinas Shiga pueden mostrar una potente actividad de eliminación celular. Las subunidades A de los miembros de la familia de toxinas Shiga comprenden dominios enzimáticos capaces de matar una célula eucariota una vez en el citosol de la célula. Ciertas realizaciones de las proteínas citotóxicas de la invención aprovechan este mecanismo citotóxico pero deben ser capaces de llevar la región efectora de la toxina Shiga al citosol de un tipo de célula diana. La orientación de la ingeniería afecta la citotoxicidad probablemente al mejorar el suministro al citosol a través de funcionalidades nativas a las regiones efectoras de la toxina Shiga.

En ciertas realizaciones de las proteínas citotóxicas de la presente invención, al contactar una célula físicamente acoplada con una biomolécula diana extracelular de la región de unión de tipo inmunoglobulina de una proteína citotóxica de la invención, la proteína citotóxica es capaz de causar la muerte de la célula. La eliminación celular puede lograrse usando una proteína citotóxica de la invención en condiciones variadas de células diana, tales como una célula diana manipulada ex vivo, una célula diana cultivada in vitro, una célula diana dentro de una muestra de tejido cultivada in vitro o una célula diana in vivo.

La expresión de la biomolécula diana no tiene que ser nativa con el fin de eliminar célulass diana por una proteína citotóxica de la invención. La expresión en la superficie celular de la biomolécula diana podría ser el resultado de una infección, la presencia de un patógeno, y/o la presencia de un patógeno microbiano intracelular. La expresión de una biomolécula diana podría ser artificial tal como, por ejemplo, por expresión forzada o inducida después de la infección con un vector de expresión viral, véase, por ejemplo, sistemas adenovirales, adeno-asociados y los sistemas retrovirales. Un ejemplo de la inducción de la expresión de una biomolécula diana es la regulación positiva de la expresión de CD38 de las células expuestas a los retinoides, como el ácido todo-trans retinoico y diversos retinoides sintéticos, o cualquier agonista del receptor de ácido retinoico (RAR) (Drach J et al., Cancer Res 54: 1746­ 1752 (1994); Uruno A et al, J Leukoc Biol. 90: 235-47 (2011)). En otro ejemplo, la expresión de CD20, HER2 y EGFR pueden ser inducida mediante la exposición de una célula a la radiación ionizante (Wattenberg M et al, Br J Cancer.

110: 1472-1480 (2014)).

B. Citotoxicidad selectiva entre tipos de células.

Al dirigirse el suministro a regiones de toxina Shiga enzimáticamente activas utilizando regiones de unión de tipo de inmunoglobulina de alta afinidad a tipos de células específicas, esta potente actividad de eliminación de células puede restringirse a destruir preferentemente los tipos de células seleccionados. La presente invención proporciona diversas proteínas citotóxicas con esta capacidad funcional, tal como se define en las reivindicaciones.

En ciertas realizaciones, la administración de la proteína citotóxica de la presente invención a una mezcla de tipos de células, la proteína citotóxica es capaz de matar selectivamente aquellas células que están físicamente acopladas con una determinada biomolécula diana extracelular en comparación con los tipos de células que no están acopladas físicamente con cualquier biomolécula diana extracelular unida específicamente por la región de unión de esa proteína citotóxica. Debido a que los miembros de la familia de toxinas Shiga están adaptados para matar células eucariotas, las proteínas citotóxicas diseñadas usando regiones efectoras de toxinas Shiga pueden mostrar una potente actividad citotóxica. Al dirigirse el suministro de regiones de toxina Shiga enzimáticamente activas a tipos de células específicas usando regiones de unión de alta afinidad, esta potente actividad de eliminación celular puede restringirse a matar preferentemente solo aquellos tipos de células que desean ser reconocidos por su asociación física con una biomolécula unida específicamente unida por regiones de unión elegidas.

En ciertas realizaciones, la proteína citotóxica de la presente invención es capaz de causar selectiva o preferentemente la muerte de un tipo celular específico dentro de una mezcla de dos o más tipos celulares diferentes. Esto permite dirigir la actividad citotóxica a tipos de células específicos con una alta preferencia, tal como un efecto citotóxico de 3 veces, sobre los tipos de células "espectadoras" que no expresan la biomolécula diana. Alternativamente, la expresión de la biomolécula diana de la región de unión puede no ser exclusiva de un tipo de célula si la biomolécula diana se expresa en cantidades suficientemente bajas y/o está físicamente acoplada en cantidades bajas con tipos de células que no son diana. Esto permite la eliminación selectiva de células de tipos de células específicos con una alta preferencia, tal como un efecto citotóxico triple, sobre los tipos de células "espectadoras" que no expresan cantidades significativas de la biomolécula diana o que no están físicamente acopladas a cantidades significativas de la biomolécula diana.

Los niveles de biomoléculas diana extracelulares en la superficie de las células pueden determinarse usando varios procedimientos conocidos por el experto en la materia, tales como, por ejemplo, procedimientos FACS. Tal como se usa en el presente documento, una cantidad significativa de una biomolécula diana extracelular expresada en una superficie celular es mayor que 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000 o 70.000 de intensidad de fluorescencia media (MFI) mediante análisis FACS dependiendo del tipo de célula.

En ciertas realizaciones adicionales, la administración de la proteína citotóxica de la invención a dos poblaciones de tipos celulares que difieren con respecto a la presencia y/o secuencia de polipéptidos de una biomolécula diana extracelular, la proteína citotóxica es capaz de causar la muerte celular, tal como se define por la concentración citotóxica semimáxima (CD⁵⁰) en una población de células diana, cuyos miembros expresan una biomolécula diana extracelular de la región de unión de la proteína citotóxica, por ejemplo, a una dosis al menos tres veces menor que la dosis de CD⁵⁰ de la misma proteína citotóxica a una población de células cuyos miembros no expresan una biomolécula diana extracelular de la región de unión de la proteína citotóxica.

En ciertas realizaciones, la actividad citotóxica de una proteína de la presente invención hacia poblaciones de tipos celulares físicamente acoplados con una biomolécula diana extracelular es al menos 3 veces mayor que la actividad citotóxica hacia poblaciones de tipos celulares no físicamente acoplados a ninguna biomolécula diana extracelular unida específicamente por la proteína de la invención. De acuerdo con la presente invención, la citotoxicidad selectiva puede cuantificarse en términos de la relación (a/b) de (a) citotoxicidad hacia una población de células de un tipo de célula específico físicamente acoplado con una biomolécula diana de la región de unión con respecto a (b) citotoxicidad hacia una población de células de un tipo celular no físicamente acoplado con una biomolécula diana de la región de unión. En ciertas realizaciones, la relación de citotoxicidad es indicativa de citotoxicidad selectiva que es al menos 3 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces , 50 veces, 75 veces, 100 veces, 250 veces, 500 veces, 750 veces, 1000 veces o más para poblaciones de células o tipos de células físicamente acopladas con una biomolécula diana de la región de unión en comparación con poblaciones de células o tipos de células que no están físicamente acopladas con una biomolécula diana de la región de unión.

Esta función de eliminación celular preferencial permite eliminar una célula diana por ciertas proteínas citotóxicas de la invención bajo condiciones variadas y en presencia de células espectadoras no reconocidas, tales como mezclas manipuladas ex vivo de tipos de células, tejidos cultivados in vitro con mezclas de tipos de células, o in vivo en presencia de múltiples tipos de células (por ejemplo, in situ o en una ubicación nativa dentro de un organismo multicelular).

En ciertas realizaciones, las proteínas de la presente invención son capaces de causar selectivamente o preferencialmente la muerte de un tipo celular específico dentro de una mezcla de dos o más tipos de células diferentes. Esto permite la actividad citotóxica dirigida a determinados tipos de células con una alta preferencialidad, tal como un efecto citotóxico de 3 veces sobre tipos de células "espectadoras" que no expresan la diana extracelular unida específicamente por la región de unión de esa proteína citotóxica de la invención. Alternativamente, la expresión de una biomolécula diana extracelular puede ser no exclusiva para un tipo de célula si la biomolécula diana extracelular se expresa en suficientes cantidades bajas por tipos de células que no son reconocidas. Esto permite la eliminación celular preferencial de sólo aquel o aquellos tipos celulares que expresan las cantidades más altas de biomoléculas diana extracelulares, tales como un efecto citotóxico de 3 veces sobre los tipos de células "espectadoras" que no expresan cantidades significativas de la biomolécula diana unida específicamente por la proteína citotóxica y/o no están acopladas físicamente a cantidades significativas de biomolécula diana expuesta extracelularmente específicamente unida por la proteína citotóxica.

Las proteínas citotóxicas de la presente invención son útiles para la eliminación de poblaciones de tipos de células específicos. Por ejemplo, las proteínas citotóxicas de la invención son útiles para el tratamiento de ciertos tumores, cánceres, y/u otras anormalidades de crecimiento mediante la eliminación de células de "biomolécula diana+" que expresan niveles elevados de biomolécula diana en una o más superficies celulares.

En ciertas realizaciones, la actividad citotóxica de una proteína de la presente invención hacia poblaciones de tipos celulares físicamente acoplados con una determinada biomolécula diana extracelular es al menos 3 veces mayor que la actividad citotóxica hacia poblaciones de tipos celulares no físicamente acoplados con cantidades significativas de una biomolécula diana extracelular unida específicamente por la región de unión de esa proteína particular de la invención. De acuerdo con la presente invención, la citotoxicidad selectiva puede cuantificarse en términos de la relación (a/b) de (a) citotoxicidad hacia una población de células físicamente acopladas con una cantidad significativa de una biomolécula diana extracelular unida por la región de unión de la proteína citotóxica de la invención con respecto a (b) citotoxicidad hacia una población de células de un tipo celular que no está físicamente acoplado con una cantidad significativa de ninguna biomolécula diana extracelular unida específicamente por la región de unión de esa proteína citotóxica particular de la invención. En ciertas realizaciones, la relación de citotoxicidad es indicativa de citotoxicidad selectiva que es al menos 3 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 250 veces, 500 veces, 750 veces, 1000 veces o más para poblaciones de células o tipos de células que expresan una biomolécula diana extracelular o físicamente acoplada con una biomolécula diana extracelular unida por el región de unión de la proteína citotóxica de la invención en comparación con poblaciones de células o tipos de células que no expresan una biomolécula diana extracelular o que no están físicamente acopladas con cantidades significativas de una biomolécula diana extracelular unida específicamente a la región de unión de esa proteína citotóxica particular de la invención. Por ejemplo, tras la administración de ciertas proteínas citotóxicas de la presente invención a dos poblaciones diferentes de células que difieren con respecto a la presencia y/o secuencia de polipéptidos de una biomolécula diana extracelular, la proteína citotóxica de la invención es capaz de causar la muerte celular de los tipos de células acoplados físicamente con una biomolécula diana extracelular unida por la región de unión de la proteína citotóxica, por ejemplo, en una CD⁵⁰ que es al menos tres veces menor que la CD⁵⁰ observada para la unión a tipos de células que no están físicamente acopladas con una biomolécula diana extracelular unida por la región de unión de la proteína citotóxica o a tipos de células que están físicamente acoplados solo con formas de esa biomolécula diana extracelular que comprenden variaciones o mutaciones de secuencia que alteran la especificidad de unión por la región de unión de esa proteína citotóxica.

En ciertas realizaciones de las proteínas citotóxicas de la presente invención, la administración de la proteína citotóxica a dos poblaciones diferentes de tipos de células, la proteína citotóxica es capaz de causar la muerte celular, tal como se define por la concentración citotóxica semimáxima (CD⁵⁰) en una primera población celular, cuyos miembros expresan una determinada biomolécula diana en una superficie celular, a una dosis al menos tres veces menor que la dosis CD⁵⁰ de la misma proteína citotóxica a una segunda población de células cuyos miembros no expresan esa biomolécula diana, no expresan una cantidad significativa de esa biomolécula diana, o no están exponiendo una cantidad significativa de esa biomolécula diana unida por la región de unión de la proteína citotóxica.

C. Suministro de material exógeno adicional al interior de una célula diana

Además de la eliminación celular directa, las proteínas de la presente invención pueden usarse opcionalmente para el suministro de materiales exógenos adicionales al interior de las células diana. El suministro de materiales exógenos adicionales puede usarse, por ejemplo, para funciones citotóxicas, citostáticas, de recopilación de información y/o diagnósticas. Pueden usarse variantes no tóxicas de las proteínas citotóxicas de la descripción, u opcionalmente variantes tóxicas, para suministrar materiales exógenos adicionales y/o marcar el interior de las células físicamente acopladas con una biomolécula diana extracelular de la región de unión de la proteína de la invención. Las proteínas de la invención pueden dirigir varios tipos de células y/o poblaciones de células que expresan biomoléculas diana a al menos una superficie celular para recibir materiales exógenos. Los componentes funcionales de la presente invención son modulares, en el sentido de que varias regiones efectoras de toxina Shiga y materiales exógenos adicionales pueden unirse a diversas regiones de unión para proporcionar diversas aplicaciones, tales como obtención de imágenes in vivo no invasivas de células tumorales.

Debido a que las proteínas de la presente invención, y las formas catalíticamente inactivas de las mismas, son capaces de entrar en las células acopladas físicamente con una biomolécula diana extracelular reconocida por su región de unión, ciertas realizaciones de las proteínas de la descripción pueden usarse para administrar exógenos adicionales materiales al interior de tipos de células diana. En un sentido, la proteína completa es un material exógeno que entrará la célula; por lo tanto, los materiales exógenos "adicionales" son materiales heterólogos unidos a, pero que no son la proteína central propia.

"Material exógeno adicional" como se usa en el presente documento se refiere a una o más moléculas, a menudo generalmente no presentes dentro de una célula diana nativa, donde las proteínas de la presente invención pueden usarse para transportar específicamente dicho material al interior de una célula. Ejemplos no limitantes de materiales exógenos adicionales son agentes citotóxicos, péptidos, polipéptidos, proteínas, polinucleótidos, agentes promotores de detección y agentes quimioterapéuticos de molécula pequeña.

En ciertas realizaciones de las proteínas de la presente descripción para el suministro de material exógeno adicional, el material exógeno adicional es un agente citotóxico, tal como, por ejemplo, un agente quimioterapéutico de molécula pequeña, antibiótico citotóxico, agente alquilante, antimetabolito, inhibidor de topoisomerasa y/o inhibidor de tubulina. Ejemplos de agentes citotóxicos no limitantes incluyen aziridinas, cisplatino, tetrazinas, procarbazina, hexametilmelamina, vinca alcaloides, taxanos, camptotecinas, etopósido, doxorrubicina, mitoxantrona, tenipósido, novobiocina, aclarrubicina, antraciclinas, actinomicina, bleomicina, plicamicina, mitomicina, daunorubicina, epirubicina, idarubicina, dolastatina, maitansinas, docetaxel, adriamicina, caliqueamicina, auristatinas, pirrolobenzodiazepina, carboplatino, 5-fluorouracilo (5-FU), capecitabina, mitomicina C, paclitaxel, 1,3-Bis (2-cloroetil)-1-nitrosourea (BCNU), rifampicina, cisplatino, metotrexato y gemcitabina.

En ciertas realizaciones de la descripción, el material exógeno adicional comprende una proteína o polipéptido que comprende una enzima. En ciertas otras realizaciones, el material exógeno adicional es un ácido nucleico, tal como, por ejemplo, un ácido ribonucleico que funciona como un pequeño ARN inhibidor (ARNsi) o microARN (ARNmi). En ciertas realizaciones, el material exógeno adicional es un antígeno, tal como antígenos derivados de proteínas bacterianas, proteínas virales, proteínas mutadas en cáncer, proteínas expresadas aberrantemente en cáncer o regiones determinantes complementarias de células T. Por ejemplo, los materiales exógenos incluyen antígenos, tales como los característicos de las células presentadoras de antígeno infectadas por bacterias, y las regiones determinantes complementarias de células T capaces de funcionar como antígenos exógenos.

D. Recopilación de información para funciones de diagnóstico

Ciertas proteinas de la invención tienen usos en la detección in vitro y/o in vivo de células especificas, tipos de células y/o poblaciones celulares. En ciertas realizaciones de la descripción, las proteínas citotóxicas descritas en el presente documento se usan tanto para diagnóstico como para tratamiento, o solo para diagnóstico. Cuando se usa la misma proteína citotóxica tanto para el diagnóstico como para el tratamiento, la variante de proteína citotóxica que incorpora un agente promotor de detección para el diagnóstico puede volverse no tóxica mediante la inactivación catalítica de una región efectora de la toxina Shiga a través de una o más sustituciones de aminoácidos, incluyendo sustituciones de ejemplo descritas en este documento. Las formas catalíticamente inactivas de las proteínas citotóxicas de la descripción que se conjugan con agentes promotores de detección pueden usarse opcionalmente para funciones de diagnóstico, tales como diagnósticos complementarios utilizados junto con un régimen terapéutico que comprende la misma región de unión o una relacionada.

La capacidad de los agentes de promoción de detección de conjugados conocidos en la técnica para diversas proteínas de la invención proporciona composiciones útiles para la detección de cáncer, tumor, células inmunes y células infectadas. Estas realizaciones de diagnóstico de las proteínas de la invención pueden usarse para recopilar información a través de diversas técnicas de imagen y ensayos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las realizaciones de diagnóstico de las proteínas de la invención se pueden usar para recopilar información a través de imágenes de orgánulos intracelulares (por ejemplo, endocitóticos, Golgi, retículo endoplásmico y compartimentos citosólicos) de células cancerosas individuales, células inmunes o células infectadas en un paciente o muestra de biopsia.

Pueden recogerse varios tipos de información utilizando las realizaciones de diagnóstico de las proteínas de la invención ya sea para usos de diagnóstico u otros usos. Esta información puede ser útil, por ejemplo, para diagnosticar tipos de células neoplásicas, determinar la susceptibilidad terapéutica de la enfermedad de un paciente, evaluar la progresión de las terapias antineoplásicas a lo largo del tiempo, ensayar la progresión de las terapias inmunomoduladoras a lo largo del tiempo, ensayar la progresión de las terapias antimicrobianas a lo largo del tiempo, evaluar la presencia de células infectadas en materiales de trasplante, evaluar la presencia de tipos de células no deseadas en materiales de trasplante y/o evaluar la presencia de células tumorales residuales después de la escisión quirúrgica de una masa tumoral.

Por ejemplo, las subpoblaciones de pacientes podrían determinarse utilizando la información recopilada utilizando las variantes de diagnóstico de las proteínas de la invención, y a continuación los pacientes individuales podrían clasificarse en subpoblaciones en función de sus características únicas reveladas utilizando esas realizaciones de diagnóstico. Por ejemplo, la efectividad de productos farmacéuticos o terapias específicas podría ser un tipo de criterio utilizado para definir una subpoblación de pacientes. Por ejemplo, una variante de diagnóstico no tóxica de una proteína citotóxica particular de la descripción puede usarse para diferenciar qué pacientes están en una clase o subpoblación de pacientes que se predice que responden positivamente a una variante citotóxica de la misma proteína de la invención. Por consiguiente, los procedimientos asociados para la identificación del paciente, la estratificación y el diagnóstico del paciente usando proteínas de la invención y/o sus variantes no tóxicas se consideran dentro del alcance de la presente descripción.

IV. Variaciones en las secuencias de polipéptidos de las proteínas de la invención que mantienen la estructura general y función

El experto en la materia reconocerá que se pueden hacer variaciones a las proteínas de la presente invención (y a los polinucleótidos que las codifican) dentro del alcance de las reivindicaciones, sin disminuir sus actividades biológicas, por ejemplo manteniendo la estructura general y la función de la proteína de la invención. Por ejemplo, algunas modificaciones pueden facilitar la expresión, purificación, propiedades farmacocinéticas y/o inmunogenicidad. Dichas modificaciones son bien conocidas por el experto e incluyen, por ejemplo, una metionina añadida en el extremo amino para proporcionar un sitio de inicio, aminoácidos adicionales colocados en cualquiera de los extremos para crear sitios de restricción o codones de terminación convenientemente ubicados, y etiquetas de afinidad bioquímica fusionadas a cualquiera de los extremos terminales para proporcionar una detección y/o purificación conveniente.

También se contempla en el presente documento la inclusión de residuos de aminoácidos adicionales en los extremos amino y/o carboxi, tales como secuencias para etiquetas de epítopo u otros restos. Los residuos de aminoácidos adicionales se pueden usar para diversos fines que incluyen, por ejemplo, para facilitar la clonación, expresión, modificación postraduccional, síntesis, purificación, detección y/o administración. Ejemplos no limitantes de etiquetas de epítopos y restos son: dominios de proteínas de unión a quitina, sitios de escisión por enteropeptidasa, sitios de escisión de Factor Xa, etiquetas FIAsH, etiquetas FLAG, proteínas fluorescentes verdes (GFP), restos de glutatión-S-transferasa, etiquetas HA, dominios de proteínas de unión a maltosa, etiquetas myc, etiquetas de polihistidina, etiquetas ReAsH, etiquetas strep, etiqueta strep II, sitios de proteasa TEV, dominios de tiorredoxina, sitio de escisión de trombina y etiquetas de epítopo V5.

En algunas de las realizaciones anteriores, la proteína de la presente invención es una variante en la que hay una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos introducidas en la región o regiones de polipéptido, tal como se define en las reivindicaciones. Como se usa en el presente documento, el término "sustitución conservadora" indica que uno o más aminoácidos se reemplazan por otro residuo de aminoácido biológicamente similar. Los ejemplos incluyen la sustitución de residuos de aminoácidos con características similares, por ejemplo, aminoácidos pequeños, aminoácidos ácidos, aminoácidos polares, aminoácidos básicos, aminoácidos hidrófobos y aminoácidos aromáticos (véase, por ejemplo, la Tabla B a continuación). Un ejemplo de una sustitución conservadora por un residuo que normalmente no se encuentra en péptidos y proteínas endógenos de mamíferos es la sustitución conservadora de un residuo de arginina o lisina por, por ejemplo, ornitina, canavanina, aminoetilcisteína u otro aminoácido básico. Para obtener más información sobre las sustituciones fenotípicamente silenciosas en péptidos y proteínas (véase, por ejemplo, Bowie J et al., Science 247: 1306-10 (1990)).

En el esquema de sustitución conservadora de la Tabla B a continuación, las sustituciones conservadoras de ejemplo de aminoácidos se agrupan por propiedades fisicoquímicas: I: neutro, hidrófilo; II: ácidos y amidas; III: básico; IV: hidrofóbico; V: aminoácidos aromáticos y voluminosos, VI sin carga hidrofílica, VII sin carga alifática, VIII sin carga polar, IX asociado a cicloalquenilo, X hidrofóbico, XI polar, XII pequeño, XIII que permite el giro y XIV flexible. Por ejemplo, las sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen lo siguiente: 1) S puede estar sustituido por C; 2) M o L pueden estar sustituidos por F; 3) Y puede estar sustituido por M; 4) Q o E pueden estar sustituidos por K; 5) N o Q pueden estar sustituidos por H; y 6) H puede estar sustituido por N.

TABLA B. Ejemplos de sustituciones conservativas de aminoácidos

En ciertas realizaciones, tal como se define en las reivindicaciones, una proteína de la presente invención puede comprender fragmentos funcionales o variantes de una región de polipéptidos de la invención que tienen, como máximo, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6 ,5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones de aminoácidos en comparación con una secuencia de polipéptidos mencionada en el presente documento, siempre que la región de polipéptido sustituida conserve actividad biológica medible sola o como un componente de una proteína de la invención. Las variantes de proteínas de la invención están dentro del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones como resultado de cambiar un polipéptido de la proteína de la invención alterando uno o más aminoácidos o eliminando o insertando uno o más aminoácidos, tales como dentro de la región de unión de tipo inmunoglobulina o la región efectora de la toxina Shiga, para lograr las propiedades deseadas, tales como citotoxicidad cambiada, efectos citostáticos cambiados, inmunogenicidad cambiada y/o semivida sérica cambiada. Un polipéptido de una proteína de la invención puede estar además con o sin una secuencia señal.

En ciertas realizaciones, una proteína de la presente invención comparte al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de una proteína mencionada en el presente documento, tal como se define en las reivindicaciones, siempre que conserve actividad biológica medible, tal como citotoxicidad, unión a biomolécula diana extracelular, catálisis enzimática o enrutamiento subcelular. La región de unión del tipo de inmunoglobulina puede diferir de las secuencias de aminoácidos de una proteína mencionada en el presente documento, siempre que conserve la funcionalidad de unión a su biomolécula diana extracelular, tal como se define en las reivindicaciones. La funcionalidad de unión probablemente se retendrá si las secuencias de aminoácidos de las CDR o ABR son idénticas. Por ejemplo, una proteína está dentro del alcance de la reivindicación que comprende o consiste esencialmente en un 85% de identidad de aminoácidos con una proteína mencionada en el presente documento que a los efectos de determinar el grado de identidad de aminoácidos, los residuos de aminoácidos que forman las CDR o ABR son ignorados. La funcionalidad de unión puede ser determinada por el experto utilizando técnicas estándar.

En ciertas realizaciones, la región efectora de la toxina Shiga puede alterarse para cambiar su actividad enzimática y/o citotoxicidad siempre que la región efectora de la toxina Shiga conserve una o más funciones efectoras de la toxina Shiga. Este cambio puede o no resultar en un cambio en la citotoxicidad de una proteína de la cual la región efectora de la toxina Shiga alterada es un componente. Las posibles alteraciones incluyen mutaciones en la región efectora de la toxina Shiga seleccionadas del grupo que consiste en: truncamiento, deleción, inversión, inserción, reordenamiento y sustitución.

La citotoxicidad de las subunidades A de los miembros de la familia de toxinas Shiga puede alterarse, reducirse o eliminarse por mutación o truncamiento. Se ha demostrado que las posiciones etiquetadas como tirosina-77, glutamato-167, arginina-170, tirosina-114 y triptófano-203 son importantes para la actividad catalítica de Stx, Stx1 y Stx2 (Hovde C et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988); Deresiewicz R et al., Biochemistry 31: 3272-80 (1992); Deresiewicz R et al., Mol Gen Genet 241: 467-73 (1993); Ohmura M et al. , Microb Pathog 15: 169-76 (1993); Cao C et al., Microbiol Immunol 38: 441-7 (1994); Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)). La mutación tanto del glutamato-167 como de la arginina-170 eliminó la actividad enzimática de Slt-I A1 en un ensayo de inactivación de ribosomas sin células (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). En otro enfoque que utiliza la expresión de novo de Slt-I A1 en el retículo endoplásmico, la mutación de glutamato-167 y arginina-170 eliminó la citotoxicidad del fragmento Slt-I A1 a ese nivel de expresión (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Un análisis de truncamiento demostró que un fragmento de StxA de los residuos 75 a 268 aún conserva una actividad enzimática significativa in vitro (Haddad, J Bacteriol 175: 4970-8 (1993)). Un fragmento truncado de Slt-I A1 que contiene los residuos 1-239 mostró actividad enzimática significativa in vitro y citotoxicidad por expresión de novo en el citosol (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). La expresión de un fragmento Slt-I A1 truncado en los residuos 1-239 en el retículo endoplásmico no fue citotóxica porque no pudo retrotranslocarse al citosol (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)).

Los residuos más críticos para la actividad enzimática y/o la citotoxicidad en las subunidades A de toxina Shiga se han mapeado en las siguientes posiciones de residuos: asparagina-75, tirosina-77, glutamato-167, arginina-170, y la arginina-176, entre otras (Di, Toxicon 57: 525-39 (2011)). En particular, una construcción de doble mutante de Stx2A que contiene mutaciones de glutamato-E167 a lisina y arginina-176 a lisina fue completamente inactivada; mientras que muchas mutaciones individuales en Stx1 y Stx2 mostraron una reducción de 10 veces en la citotoxicidad. Además, el truncamiento de Stx1A a 1-239 o 1-240 redujo su citotoxicidad, y de manera similar, el truncamiento de Stx2A a un residuo hidrofóbico conservado redujo su citotoxicidad.

Los residuos más críticos para la unión a ribosomas eucariotas y/o inhibición a ribosomas eucariotas en la subunidad A de la toxina Shiga se han mapeado a las siguientes posiciones de residuos arginina-172, arginina-176, arginina-179, arginina-188, tirosina 189, valina-191 y leucina-233, entre otras (McCluskey A et al., PLoS One 7: e31191 (2012).

Los trucamientos de la subunidad A de toxina semejante a Shiga 1 son catalíticamente activos, capaces de inactivar enzimáticamente los ribosomas in vitro, y citotóxicos cuando se expresan dentro de una célula (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). El fragmento de subunidad A de toxina Shiga más pequeño que exhibe actividad enzimática completa es un polipéptido compuesto por los residuos 1-239 de Slt1A (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Aunque el fragmento más pequeño de la subunidad A de la toxina Shiga que se describió que retenía una actividad catalítica sustancial fueron los residuos 75-247 de StxA (Al-Jaufy, Infect Immun 62: 956-60 (1994)), un truncamiento de StxA expresado de novo dentro de una célula eucariota requiere solo hasta el residuo 240 para alcanzar el citosol y ejercer la inactivación catalítica de los ribosomas (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310­ 18 (2005)).

En ciertas realizaciones derivadas de SLT-1A (SEQ ID NO: 1) o StxA (SEQ ID NO: 2), estos cambios incluyen la sustitución de la asparagina en la posición 75, tirosina en la posición 77, tirosina en la posición 114, glutamato en la posición 167, arginina en la posición 170, arginina en la posición 176, y/o sustitución del triptófano en la posición 203. Los expertos en la materia conocerán ejemplos de tales sustituciones basadas en la técnica anterior, tales como asparagina en la posición 75 a alanina, tirosina en la posición 77 a serina, sustitución de la tirosina en la posición 114 a serina, sustitución del glutamato en la posición 167 a aspartato, sustitución de la arginina en la posición 170 a alanina, sustitución de la arginina en la posición 176 a lisina, y/o sustitución del triptófano en la posición 203 a alanina.

Las proteínas de la presente invención pueden conjugarse opcionalmente con uno o más agentes adicionales, tales como agentes terapéuticos y/o de diagnóstico conocidos en la técnica, incluyendo agentes, tales como se describen en el presente documento.

V. Producción, fabricación y purificación de una proteína de la invención.

Las proteínas de la presente invención pueden ser producidas utilizando técnicas de ingeniería bioquímica bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las proteínas citotóxicas de la invención pueden fabricarse mediante procedimientos sintéticos estándar, mediante el uso de sistemas de expresión recombinantes o mediante cualquier otro procedimiento adecuado. Las proteínas de la invención pueden producirse como proteínas de fusión, conjugados químicamente acoplados y/o combinaciones de los mismos, tales como, por ejemplo, un componente de proteína de fusión acoplado covalentemente a uno o más componentes. Por lo tanto, las proteínas de la invención pueden sintetizarse de varias maneras, que incluyen, por ejemplo, procedimientos que comprenden: (1) sintetizar un polipéptido o componente de polipéptido de una proteína de la invención usando metodología estándar de fase sólida o fase líquida, ya sea paso a paso o por ensamblaje de fragmentos, y aislar y purificar el producto compuesto peptídico final; (2) expresar un polinucleótido que codifica un polipéptido o componente de polipéptido de una proteína de la invención en una célula huésped y recuperar el producto de expresión de la célula huésped o cultivo de células huésped; o (3) expresión in vitro sin células de un polinucleótido que codifica un polipéptido o componente de polipéptido de una proteína de la invención, y recuperar el producto de expresión; o mediante cualquier combinación de los procedimientos de (1), (2) o (3) para obtener fragmentos del componente peptídico, uniendo posteriormente (por ejemplo, ligando) los fragmentos para obtener el componente peptídico y recuperando el componente peptídico.

Puede ser preferible sintetizar un polipéptido o componente de polipéptido de una proteína de la presente invención por medio de síntesis de péptidos en fase sólida o en fase líquida. Las proteínas de la invención pueden fabricarse adecuadamente por procedimientos sintéticos estándar. Por lo tanto, los péptidos pueden sintetizarse mediante, por ejemplo, procedimientos que comprenden sintetizar el péptido mediante metodología estándar en fase sólida o en fase líquida, ya sea por etapas o por ensamblaje de fragmentos, y aislar y purificar el producto peptídico final. En este contexto, se puede hacer referencia al documento WO 1998/11125 o, entre otros, Fields G et al., Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthesis (Polipéptido sintético” Peptides, Grant G, ed., Oxford University Press, Reino Unido, 2da. ed., 2002) y los ejemplos de síntesis en los mismos.

Las proteínas de la presente invención pueden prepararse (producirse y purificarse) usando técnicas recombinantes bien conocidas en la técnica. En general, los procedimientos para preparar polipéptidos mediante el cultivo de células huésped transformadas o transfectadas con un vector que comprende el polinucleótido codificador y la recuperación del polipéptido del cultivo celular se describen, por ejemplo, en Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, e E. UU., 1989); Dieffenbach C et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, EE. UU., 1995). Se puede usar cualquier célula huésped adecuada para producir una proteína de la invención. Las células huésped pueden ser células transfectadas, transformadas, transducidas o infectadas de manera estable o transitoria con uno o más vectores de expresión que conducen la expresión de un polipéptido de la invención. Además, se puede producir una proteína de la invención modificando el polinucleótido que codifica la proteína de la invención que da como resultado la alteración de uno o más aminoácidos o la eliminación o inserción de uno o más aminoácidos para lograr las propiedades deseadas, tales como la citotoxicidad cambiada, efectos citostáticos modificados, inmunogenicidad modificada y/o semivida sérica modificada.

Hay una amplia variedad de sistemas de expresión que pueden elegirse para producir una proteína de la presente invención. Por ejemplo, los organismos huéspedes para la expresión de proteínas de la invención incluyen procariotas, como E. coli y B. subtilis, células eucariotas, tales como levaduras y hongos filamentosos (como S. cerevisiae, P. pastoris, A. awamori y K. lactis), algas (como C. reinhardtii), líneas celulares de insectos, células de mamíferos (como células CHO), líneas celulares de plantas y organismos eucariotas, tales como plantas transgénicas (como A. thaliana y N. benthamiana).

Por consiguiente, la presente descripción también proporciona procedimientos para producir una proteína de la presente invención de acuerdo con los procedimientos mencionados anteriormente y usar (i) un polinucleótido que codifica una parte o toda una proteína de la invención o un componente de polipéptido de la misma, (ii) un vector de expresión que comprende al menos un polinucleótido de la invención capaz de codificar parte o la totalidad de una proteína de la invención o un componente de polipéptido de la misma cuando se introduce en una célula huésped adecuada o un sistema de expresión libre de células, y/o (iii) una célula huésped que comprende un polinucleótido o vector de expresión de la invención.

Cuando un polipéptido o proteína se expresa usando técnicas recombinantes en una célula huésped o sistema libre de células, es ventajoso separar (o purificar) el polipéptido o proteína deseado de otros componentes, tales como los factores de la célula huésped, a efectos de obtener preparaciones que sean de alta pureza o que sean sustancialmente homogéneas. La purificación se puede lograr mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como técnicas de centrifugación, técnicas de extracción, técnicas cromatográficas y de fraccionamiento (por ejemplo, separación por tamaño mediante filtración en gel, separación de carga mediante columna de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de fase inversa, cromatografía en sílice o resinas de intercambio catiónico tales como DEAE y similares, cromatofocalización y cromatografía de proteína A Sepharosa para eliminar contaminantes) y técnicas de precipitación (por ejemplo, precipitación en etanol o precipitación con sulfato de amonio). Se puede usar cualquier cantidad de técnicas de purificación bioquímica para aumentar la pureza de una proteína de la invención. En ciertas realizaciones, las proteínas de la invención pueden purificarse opcionalmente en formas homo-multiméricas (es decir, un complejo de proteínas de dos o más proteínas idénticas) o en formas hetero-multiméricas (es decir, un complejo de proteínas de dos o más proteínas no idénticas).

En los siguientes ejemplos hay descripciones de ejemplos no limitantes de procedimientos para producir una proteína de la presente invención, así como aspectos específicos, pero no limitantes, de la producción de proteínas para las proteínas citotóxicas, de ejemplo, descritas.

VI. Composiciones farmacéuticas y de diagnóstico que comprenden una proteína de la invención

La presente invención proporciona proteínas para usar, solas o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, en una composición farmacéutica, para el tratamiento o la profilaxis de afecciones, enfermedades, trastornos o síntomas, tal como se definen en las reivindicaciones y se describen en más detalle a continuación (por ejemplo, cánceres, tumores malignos, tumores no malignos, trastornos inmunitarios e infecciones microbianas). La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de la invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de la mismas, junto con un al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como se define en las reivindicaciones. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica de la invención puede comprender formas homomultiméricas y/o heteromultiméricas de las proteínas de la invención. Las composiciones farmacéuticas serán útiles en procedimientos de tratamiento, mejora o prevención de una enfermedad, afección, trastorno o síntoma que se describe en más detalle a continuación. Cada una de dicha enfermedad, afección, trastorno o síntoma se prevé que sea una realización separada con respecto a los usos de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención. La invención proporciona además composiciones farmacéuticas para usar en al menos un procedimiento de tratamiento según la invención, tal como se describe en más detalle a continuación.

Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "paciente" y "sujeto" se utilizan indistintamente para referirse a cualquier organismo, habitualmente vertebrados, tales como seres humanos y animales, que presenta síntomas, signos y/o indicaciones de al menos una enfermedad, trastorno o afección. Estos términos incluyen mamíferos, tales como los ejemplos, no limitantes, de primates, animales de ganado (por ejemplo, ganado bovino, caballos, cerdos, ovejas, cabras, etc.), animales de compañía (por ejemplo, gatos, perros, etc.) y animales de laboratorio (por ejemplo ratones, conejos, ratas, etc.).

Tal como se usa en el presente documento, "tratar", "que trata" o "tratamiento" y las variantes gramaticales de los mismos se refieren a una estrategia para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Los términos pueden referirse a retardar la aparición o la velocidad de desarrollo de una afección, trastorno o enfermedad, reducir o aliviar los síntomas asociados con los mismos, generar una regresión completa o parcial de la afección, o alguna combinación de cualquiera de los anteriores. Para los fines de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, la reducción o alivio de los síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, la estabilización (por ejemplo, no empeoramiento) del estado de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad y la remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratar", "que trata" o "tratamiento" también pueden significar prolongar la supervivencia en relación con el tiempo de supervivencia esperado si no se recibe tratamiento. Un sujeto (por ejemplo un ser humano) en necesidad de tratamiento puede ser por tanto un sujeto ya aquejado de la enfermedad o trastorno en cuestión. Los términos "tratar", "que trata" o "tratamiento" incluyen la inhibición o la reducción de un aumento en la gravedad de un estado o síntomas patológicos con respecto a la ausencia de tratamiento, y no está necesariamente destinado a implicar el cese completo de la enfermedad, trastorno o estado pertinentes. Con respecto a los tumores y/o cánceres, el tratamiento incluye reducciones en la carga tumoral global y/o el tamaño del tumor individual.

Tal como se usa en este documento, los términos "prevenir", "que previene", "prevención" y variantes gramaticales de los mismos se refieren a un procedimiento para prevenir el desarrollo de, o alterar la patología de, una afección, enfermedad o trastorno. En consecuencia, la "prevención" puede referirse a las medidas profilácticas o preventivas. Para los fines de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, la prevención o ralentización de los síntomas, progresión o desarrollo de una enfermedad, ya sea detectable o indetectable. Un sujeto (por ejemplo un ser humano) en necesidad de la prevención puede ser por tanto un sujeto aún no afectado por la enfermedad o trastorno en cuestión. El término "prevención" incluye retardar la aparición de la enfermedad en relación con la ausencia de tratamiento, y no está necesariamente destinado a implicar la prevención permanente de la enfermedad, trastorno o afección pertinentes. Por lo tanto "prevenir" o "prevención" de una enfermedad puede, en ciertos contextos, referirse a la reducción del riesgo de desarrollar la afección, o prevenir o retrasar la aparición de los síntomas asociados con la enfermedad.

Tal como se usa en el presente documento, una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad o dosis de una composición (por ejemplo, una composición o agente terapéutico) que produce al menos un efecto terapéutico deseado en un sujeto, tal como la prevención o el tratamiento de una afección objetivo o alivio beneficioso de un síntoma asociado con la enfermedad. La cantidad terapéuticamente eficaz más deseable es una cantidad que producirá una eficacia deseada de un tratamiento particular seleccionado por un experto en la técnica para un sujeto dado en necesidad del mismo. Esta cantidad variará dependiendo de una variedad de factores entendidos por el experto en la materia, incluyendo, pero no limitado a, las características del compuesto terapéutico (incluyendo actividad, farmacocinética, farmacodinámica y biodisponibilidad), la condición fisiológica del sujeto (incluyendo edad, sexo, tipo de enfermedad, estadio de la enfermedad, condición física general, respuesta a una dosis dada y tipo de medicación), la naturaleza del vehículo o vehículos farmacéuticamente aceptables en la formulación y la vía de administración. Un experto en el sector clínico y farmacológico será capaz de determinar una cantidad terapéuticamente efectiva a través de la experimentación de rutina, es decir, mediante el control de la respuesta de un sujeto a la administración de un compuesto y el ajuste de la dosificación en consecuencia (véase, por ejemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro A, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, Estados Unidos, 19a ed., 1995)).

Las composiciones de diagnóstico de la presente descripción comprenden una proteína de la invención y uno o más agentes promotores de detección. Varios agentes promotores de la detección son conocidos en la técnica, tales como isótopos, colorantes, agentes colorimétricos, agentes potenciadores de contraste, agentes fluorescentes, agentes bioluminiscentes y agentes magnéticos. Estos agentes pueden ser incorporados en la proteína de la invención en cualquier posición. La incorporación del agente puede ser a través de un residuo o residuos de aminoácidos de la proteína de la invención o a través de algún tipo de unión conocido en la técnica, incluyendo a través de enlazadores y/o quelantes. La incorporación del agente es de tal manera que permite la detección de la presencia de la composición de diagnóstico en una pantalla, ensayo, procedimiento de diagnóstico y/o técnica de imagen.

Cuando se produce o fabrica una composición de diagnóstico de la presente descripción, una proteína de la invención puede unirse directa o indirectamente a uno o más agentes promotores de la detección. Hay numerosos agentes promotores de la detección conocidos para el experto que pueden unirse operativamente a las proteínas de la presente invención para los procedimientos de recopilación de información, tales como para aplicaciones de diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades, trastornos o afecciones de un organismo (véase, por ejemplo Cai W et al, J Nucl Med 48: 304-10 (2007); Nayak T, Brechbiel M, Bioconjug Chem. 20: 825-41 (2009); Paudyal P et al, Oncol Rep. 22: 115-9 (2009 ); Qiao J et al, PLoS ONE 6: e18103 (2011); Sano K et al, Breast Cancer Res. 14:. R61 (2012)). Por ejemplo, los agentes promotores de la detección incluyen agentes de contraste que mejoran la imagen, tales como colorantes fluorescentes (por ejemplo Alexa680, verde de indocianina y Cy5.5), isótopos y radionúclidos, tales como 11C, 13N, 15O, 18F, 32P, 51Mn, 52mMn, 52Fe, 55Co, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 72As, 73Se, 75Br, 76Br, 82mRb, 83Sr, 86Y, 90Y, 89Zr, 94mTc, 94Tc, 99mTc, 110In, 111In, 120I, 123I, 124I, 125I, 131I, 154Gd, 155Gd, 156Gd, 157Gd, 158Gd, 177Lu, 186Re, 188Re, y 223R, iones paramagnéticos, tales como cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III) o erbio (III), metales, tales como lantano (III), oro (III), plomo (II) y bismuto (III), agentes que mejoran el contraste por ultrasonidos, tales como liposomas, agentes radiopacos, tales como compuestos de bario, galio y talio. Los agentes promotores de la detección pueden incorporarse directa o indirectamente usando un grupo funcional intermediario, tales como quelantes como 2-bencil DTPA, PAMAM, NOTA, DOTA, TETA, análogos de los mismos, y equivalentes funcionales de cualquiera de los anteriores (ver Leyton J et al., Clin Cancer Res 14: 7488-96 (2008)).

Existen numerosas técnicas estándar conocidas para el experto para la incorporación, adhesión y/o conjugación de diversos agentes promotores de la detección a proteínas, especialmente a inmunoglobulinas y dominios derivados de inmunoglobulina (Wu A, Methods 65: 139-47 (2014)). De manera similar, hay numerosas estratategias de imágenes conocidas para el experto, tales como las técnicas de obtención de imágenes in vivo no invasivas comúnmente usadas en el campo médico, por ejemplo: formación de imágenes por tomografía computarizada (TC), formación de imágenes ópticas (incluyendo obtención de imágenes de forma directa, fluorescente y bioluminiscente), obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI), tomografía por emisión de positrones (PET), ultrasonidos con tomografía computarizada por emisión de un solo fotón (SPECT) de ultrasonidos, y obtención de imágenes por tomografía computarizada con rayos X (ver Kaur S et al, Cancer Lett. 315: 97-111 (2012), para una revisión).

Producción o fabricación de una composición farmacéutica y/o de diagnóstico que comprende una proteína de la invención

Las sales o solvatos farmacéuticamente aceptables de cualquiera de las proteínas de la presente invención están igualmente dentro del alcance de la presente invención.

El término "solvato" en el contexto de la presente invención se refiere a un complejo de estequiometría definida formado entre un soluto (en este caso, una molécula de la invención o sal farmacéuticamente aceptable de la misma de acuerdo con la invención) y un disolvente. El disolvente en esta conexión puede, por ejemplo, ser agua, etanol u otra especie orgánica farmacéuticamente aceptable, típicamente de peso molecular pequeño, tal como, pero no limitado a, ácido acético o ácido láctico. Cuando el disolvente en cuestión es agua, un solvato de este tipo se conoce normalmente como un hidrato.

Las proteínas de la presente invención, o sales de las mismas, se pueden formular como composiciones farmacéuticas preparadas para almacenamiento o administración, que típicamente comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de la invención, o una sal de la misma, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar. Los vehículos farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. (A. Gennaro, ed., 1985)). Tal como se usa en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos y agentes que retrasan la absorción, y similares, fisiológicamente aceptables, es decir, compatibles. Los vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen los usados en formulaciones adecuadas para administración oral, rectal, nasal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, y transdérmica). Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. En ciertas realizaciones, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo mediante inyección o infusión). Dependiendo de la ruta de administración seleccionada, la proteína de la invención u otro componente farmacéutico pueden recubrirse en un material destinado a proteger el compuesto de la acción del pH bajo y otras condiciones de inactivación natural en las que la proteína activa se puede encontrar cuando se administra a un paciente por una vía de administración particular.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de la farmacia. En dicha forma, la composición se divide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación envasada, conteniendo el envase cantidades discretas de las preparaciones, por ejemplo, comprimidos envasados, cápsulas y polvos en viales o ampollas. La forma de dosificación unitaria puede ser también una cápsula, píldora o el propio comprimido, o puede ser el número apropiado de cualquiera de estas formas envasadas. Puede proporcionarse en forma inyectable de dosis única, por ejemplo en forma de una pluma. Las composiciones se pueden formular mediante cualquier vía y medios de administración adecuados. Los modos de administración subcutáneos o transdérmicos pueden ser particularmente adecuados para las proteínas terapéuticas descritas en este documento.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede asegurar tanto mediante procedimientos de esterilización como mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También pueden ser deseables agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede ser provocada por la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Una composición farmacéutica de la presente invención también incluye opcionalmente un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Los antioxidantes farmacéuticamente aceptables de ejemplo son antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y similares; y agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.

En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o una combinación de diferentes proteínas de la invención, o un éster, sal o amida de cualquiera de los anteriores, y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones terapéuticas son típicamente estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, alcohol, tal como etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), o cualquier mezcla adecuada. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de agentes tensioactivos de acuerdo con la química de la formulación bien conocida en la técnica. En ciertas realizaciones, pueden ser deseables en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede provocarse mediante la inclusión en la composición de un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación intradérmica o subcutánea incluyen típicamente uno o más de: un diluyente estéril, tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes de ajuste de la tonicidad, tales como, por ejemplo, cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio, o tampones con citrato, fosfato, acetato y similares. Dichas preparaciones se pueden encerrar en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis fabricados de vidrio o plástico.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante la incorporación de una proteína de la invención en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes descritos anteriormente, según se requiera, seguido de microfiltración con esterilización. Las dispersiones se pueden preparar mediante la incorporación de un compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión y los otros ingredientes, tales como los descritos anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación son secado al vacío y secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del principio activo además de cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada estéril de los mismos.

Cuando se diseña una cantidad terapéuticamente eficaz de una protéina de la invención para ser administrada mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, el agente de unión estará en forma de una solución acuosa libre de pirógenos parenteralmente aceptable. Los procedimientos para preparar soluciones de proteína parenteralmente aceptables, teniendo en consideración un pH, isotonicidad, estabilidad, y similares apropiados están dentro de la experiencia en la técnica. Una composición farmacéutica preferida para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea contiene, además de agentes de unión, un vehículo isotónico, tal como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro sódico, inyección de Ringer con lactato, u otro vehículo conocido en la técnica. Una composición farmacéutica de la presente invención también puede contener estabilizantes, conservantes, tampones, antioxidantes, u otros aditivos bien conocidos por los expertos en la técnica.

Tal como se describe en otra parte en el presente documento, una proteína de la presente invención o composición de la misma (por ejemplo, composición farmacéutica o de diagnóstico) se pueden preparar con vehículos que protegerán la composición contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de liberación microencapsulada. Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetaro de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos procedimientos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son generalmente conocidos para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (Robinson J, ed., Marcel Dekker, Inc., NY, US, 1978)).

En ciertas realizaciones, la composición de la presente invención (por ejemplo, composición farmacéutica o de diagnóstico) puede formularse para asegurar una distribución deseada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica excluye muchos compuestos grandes y/o hidrófilos. Para direccionar una proteína terapéutica o composición de la invención a una localización particular in vivo, se puede formular, por ejemplo, en liposomas que pueden comprender uno o más restos que se transportan selectivamente en células u órganos específicos, mejorando así la administración dirigida de fármacos. Los restos de direccionamiento de ejemplo incluyen folato o biotina; manósidos; anticuerpos; receptor de la proteína A surfactante; p120 catenina y similares.

Las composiciones farmacéuticas incluyen formulaciones parenterales diseñadas para ser utilizadas como implantes o sistemas de partículas. Los ejemplos de implantes son formulaciones de depósito compuestas de componentes poliméricos o hidrófobos, tales como emulsiones, resinas de intercambio iónico y soluciones de sales solubles. Ejemplos de sistemas de partículas son dendrímeros, liposomas, microesferas, micropartículas, nanocápsulas, nanopartículas, nanovaras, nanoesferas, micelas poliméricas y nanotubos (véase, por ejemplo Honda M et al, Int J Nanomedicine. 8: 495-503 (2013); Sharma A et al, Biomed Res Int 2013:. 960821 (2013); Ramishetti S, Huang L, Ther Deliv 3: 1429-1445 (2012)). Las formulaciones de liberación controlada se pueden preparar utilizando polímeros sensibles a iones, tales como, por ejemplo, liposomas, polaxámero 407 e hidroxiapatita. Las formulaciones de partículas y de polímero pueden comprender un agente o agentes de alteración de la permeabilidad de la membrana plasmática, tal como, por ejemplo, diversos péptidos y proteínas como citolisinas, agentes derivados de toxina, agentes derivados de virus, péptidos biomiméticos sintéticos y agentes químicos (véase, por ejemplo Varkouhi et al., J control Release 151: 220-8 (2011); J Pirie C et al, Mol cáncer Ther 12: 1774­ 1782 (2013)).

VII. Polinucleótidos, vectores de expresión y células huésped

Más allá de las proteínas de la presente invención, los polinucleótidos que codifican tales proteínas están dentro del alcance de la presente invención. El término "polinucleótido" es equivalente al término "ácidos nucleicos", los cuales incluyen polímeros de ácidos desoxirribonucleicos (ADN), polímeros de ácidos ribonucleicos (ARN), análogos de estos ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos y derivados, fragmentos y homólogos de los mismos. El polinucleótido de la invención puede ser monocatenario, bicatenario o tricatenario. Los polinucleótidos divulgados se describen específicamente para incluir todos los polinucleótidos capaces de codificar una proteína de ejem p lo de la in ven ción , por e jem p lo, ten ien d o en cuen ta la v a ria c ió n qu e se sa b e que s e to lera en la tercera p o sició n de los c o d o n e s de A R N , pero que co d ifica el m ism o a m in o á cid o com o un codón de A R N diferente (v é a se Stothard P , B io te ch n iq u e s 28 : 1102 -4 (2000)).

E n un asp ecto , la invención prop orciona po linu cleó tid os que co difican una proteína de la invención . Lo s p o lin u cleó tid os p ueden incluir, por ejem p lo , la s e c u e n c ia de á cid o n u cle ico que co d ifica un polipéptido al m en o s 5 0 % , 55 % , 60 % , 65 % , 70 % , 75 % , 80 % , 85 % , 90 % , 95 % , 99 % o m ás, idéntico a un polipéptido que co m p ren d e una de la s s e c u e n c ia s de a m in o á c id o s de la proteína de la invención . La inven ción tam b ién in c lu ye po linu cleó tid os que co m p re n d e n s e c u e n c ia s de nu cleótido s que se hibridan en co n d ic io n e s rig u ro sa s con un polinucleótido qu e co d ifica un a p roteína de la invención , o el antisentid o o co m p lem en to de cu a lq u ie ra de ta le s s e c u e n c ia s .

L o s d e riv a d o s o a n á lo g o s de los po linu cleó tid os (o p ro te ín a s) de la inven ción in cluyen , entre otros, m o lé c u la s de p o lin u cleó tid os (o polipéptidos) qu e tien en re g io n e s que son su sta n cia lm e n te h o m ó lo g as a los polinu cleó tid os o p ro te ín a s de la invención , por e jem p lo al m e n o s a p ro x im a d a m e n te 45 % , 50 % , 70 % , 80 % , 95 % , 98 % o in c lu so 99 % de identidad (con una identidad preferida de 80 -99 % ) so b re un a s e c u e n c ia de po linu cleó tid os o polipéptidos del m ism o tam a ñ o o en co m p ara ció n con una s e c u e n c ia a lin e a d a en la que la a lin e a c ió n se re a liza m ediante un p rog ram a inform ático de h o m o lo g ía co no cid o en la té cn ica . Un p rogram a de e jem p lo e s el program a G A P (W isc o n s in S e q u e n c e A n a ly s is P a c k a g e , V e rs ió n 8 para U N IX , G e n e t ic s C o m p u te r G ro u p , U n ive rsity R e s e a rc h P ark, M ad ison , W I, E E . U U .) utilizando la co nfigu ració n p red eterm in ad a, que utiliza el a lgoritm o de Sm ith T, W a te rm a n M, A d v. A p pl. Math. 2: 482 -9 ( 1981 ) . T a m b ié n s e in c lu ye n p o lin u cleó tid os c a p a c e s de h ib rid arse con el co m p lem en to de un a s e c u e n c ia que co d ifica la s p ro te ín a s de la inven ción en co n d ic io n e s r ig u rsa s (v é a se , por e jem p lo , A u su b e l F et al., C u rre n t P rotocols in M o le cu lar B io log y (Jo hn W ile y & S o n s, N u e va Y ork, N Y , Ee . U U ., 1993)), y por d ebajo . Lo s expertos en la m ateria co n o ce n co n d ic io n e s rig u ro sa s y se p ueden e n co n tra r en C u rre n t P ro toco ls in M o le cu lar B io lo g y (Jo hn W ile y & S o n s, N Y , E E . U U ., C a p . 6.3.1 -6.3.6 (1989 )).

L a presen te in ven ción p rop orciona a d e m á s v e cto re s de ex p resió n qu e co m p re n d e n los polinu cleó tid os dentro del a lc a n c e de la in ve n ció n . L o s p o lin u cleó tid o s c a p a c e s de co d ifica r la s p ro te ín a s de la in ve n ció n p u e d e n in se rta rse en ve cto re s co n o cid o s, que in clu yen p lá sm id o s b a cte ria n o s, v e cto re s v ira le s y v e cto re s de fago, u sa n d o m ateria l y p ro ced im ien to s bien co n o cid o s en la té cn ica para prod ucir ve cto re s de ex p resión . D ich o s v e cto re s de e x p resió n in clu irán los polinu cleó tid os n e c e s a r io s para so p o rtar la prod ucció n de p ro te ín a s co n te m p la d a s de la invención dentro de c u a lq u ie r c é lu la h u é sp e d de e le cc ió n o s iste m a s de ex p resió n libres de c é lu la s (por e jem p lo, p T xb 1 y p IV E X 2.3 d e scrito s en los E je m p lo s a co ntinu ació n). Lo s po linu cleó tid os e s p e c ífic o s que co m p ren d en v e cto re s de ex p re sió n para u sa r con tipos e s p e c ífic o s de c é lu la s h u é sp e d o s is te m a s de e x p resió n libres de c é lu la s son bien co n o cid o s por un experto en la m ateria, p u eden d e te rm in a rse u sa n d o e x p erim en tació n de rutina o pueden a d q u irirse .

E l térm ino "vector de expresión", tal com o se u sa en el p resen te d ocum ento, se refiere a un polinucleótido, lineal o c ircu la r, que co m p ren d e una o m á s u n id a d e s de expresión . E l térm ino "unidad de expresión" in d ica un seg m en to p o lin u cleo tíd ico que co d ifica un polipéptido de interés y e s c a p a z de prop orcio n ar la e x p resió n del se g m e n to de á cid o n u cle ico en una c é lu la h u é sp e d . U n a unid ad de e x p resió n t íp ica m e n te co m p ren d e un prom otor de tra n scrip ció n , un m arco de lectura abierto que co d ifica el polipéptido de interés y un te rm in ad o r de tra n scrip ció n , todos en co n fig u rac ió n o p erab le . Un v e cto r de e x p re sió n co n tien e un a o m á s u n id a d e s de e x p resió n . P o r lo tanto, en el contexto de la p resen te invención , un ve cto r de ex p resió n que co difica una proteína de la inven ción que co m p re n d e un a c a d e n a po lip ep tíd ica ú n ica (por e jem p lo , un s c F v g e n é tica m e n te re co m b in ad o con un a región efectora de toxina S h ig a ) in c lu ye al m e n o s una u n id ad de ex p re sió n para la c a d e n a p o lip ep tíd ica ún ica, m ien tras que un a proteína de la inven ción que com p rend e, por e jem p lo, d o s o m á s c a d e n a s de polipéptidos (por e jem p lo, una c a d e n a que co m p ren d e un dom inio V^l y una se g u n d a ca d e n a que co m p ren d e un d om inio V^h unido a una región efectora de toxina) in c lu ye al m e n o s d os u n id a d e s de e x p resió n , un a para c a d a una de la s d os c a d e n a s p o lip ep tíd ica s de la proteína. P a ra la e x p resió n de p ro te ín a s de m últip les c a d e n a s de la in ven ción , una unid ad de e x p re sió n para c a d a ca d e n a de polip ép tid os tam b ién p u ed e e sta r co ntenid a por se p a ra d o en d iferentes v e cto re s de ex p re sió n (por e jem p lo, la ex p resió n p uede lo g ra rse con una ún ica cé lu la h u é sp e d en la que se han introducido ve cto re s de ex p re sió n para c a d a c a d e n a de polipéptidos).

L o s v e cto re s de ex p resió n c a p a c e s de d irig ir la ex p resió n transito ria o estab le de polip ép tidos y p ro te ín a s son bien co n o cid o s en la té cn ica . Lo s ve cto re s de e x p resió n g e n e ra lm e n te in cluyen , pero no s e lim itan a, uno o m á s de los s ig u ie n te s : una s e c u e n c ia se ñ a l o péptido heterólogo, un origen de re p lica c ió n , uno o m á s g e n e s m a rca d o re s, un e lem ento potenciador, un prom otor y un a s e c u e n c ia de te rm in ació n de la tra n scrip ció n , c a d a uno de los c u a le s e s bien co n o cid o en la té cn ica . L a s s e c u e n c ia s de control regulatorio o p c io n a le s, la s s e c u e n c ia s de integració n y los m a rca d o re s útiles qu e pu ed en e m p le a rse se co n o ce n en la té cn ica .

E l térm ino "célu la h u ésp ed" se refiere a una c é lu la que p u ede a p o y a r la re p lica c ió n o ex p resió n del vecto r de e x p resió n . L a s c é lu la s h u é sp e d p u eden s e r c é lu la s p rocariotas, com o E. coli o c é lu la s e u ca rio ta s (por ejem plo, c é lu la s de levad ura, insecto, anfibio, a ve o m am ífero). La cre a ció n y el a is la m ie n to de lín e a s c e lu la re s h u é sp e d que co m p re n d e n un polinucleótido de la invención o que son c a p a c e s de p rod ucir una proteína de la inven ción se p u ed en lograr u sa n d o té c n ic a s e stá n d a r c o n o c id a s en la técn ica.

Las proteínas dentro del alcance de la presente invención pueden ser variantes o derivados de las proteínas descritas en este documento, dentro del alcance de las reivindicaciones, que son producidas por la modificación del polinucleótido que codifica una proteína descrita de la invención mediante la alteración de uno o más aminoácidos o eliminación o inserción de uno o más aminoácidos que pueden hacerla más adecuada para lograr las propiedades deseadas, tal como una expresión más óptima por una célula huésped.

VIII Dispositivos de administración y kits

En ciertas realizaciones, la descripción se refiere a un dispositivo que comprende una o más composiciones de materia de la invención, tal como una composición farmacéutica, para la administración a un sujeto. Por lo tanto, se pueden usar dispositivos de administración que comprenden uno o más compuestos de la invención para administrar a un paciente una composición de materia de la invención mediante diversos procedimientos de administración, que incluyen: inyección intravenosa, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal; administracion oral; administración transdérmica; administración pulmonar o transmucosa; administración por implante, bomba osmótica, cartucho o microbomba; o mediante otros medios reconocidos por una persona experta en la técnica. También dentro del alcance de la descripción están kits que comprenden al menos una composición de materia de la invención, y opcionalmente, el envase y las instrucciones de uso. Los kits pueden ser útiles para la administración de medicamentos y/o la recopilación de información de diagnóstico. Un kit de la descripción puede comprender opcionalmente al menos un reactivo adicional (por ejemplo, patrones, marcadores y similares). Los kits generalmente incluyen una etiqueta que indica el uso previsto del contenido del kit. El kit puede comprender además reactivos y otras herramientas para detectar un tipo de célula (por ejemplo, célula tumoral) en una muestra o en un sujeto, o para diagnosticar si un paciente pertenece a un grupo que responde a una estrategia terapéutica que hace uso de un compuesto, composición o procedimiento relacionado de la invención, tal como se describe en el presente documento.

IX. Procedimiento para usar una proteína de la invención o una composición de la misma

En general, un objeto de la invención es proporcionar agentes farmacológicamente activos, así como composiciones que los comprendan, que puedan usarse en la prevención y/o tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones, tales como ciertos tipos de cáncer, tumores, trastornos inmunes, infecciones microbianas u otras afecciones patológicas mencionadas en el presente documento. Por consiguiente, la presente invención proporciona procedimientos para usar las proteínas y las composiciones farmacéuticas de la invención para la eliminación dirigida de células, tal como se define en las reivindicaciones. La descripción también proporciona procedimientos para suministrar materiales exógenos adicionales en las células diana, para marcar los interiores de las células diana, para recopilar información de diagnóstico y para tratar enfermedades, trastornos y afecciones, tal como se describe en el presente documento.

En particular, un objeto de la invención es proporcionar dichos agentes farmacológicamente activos, composiciones y/o procedimientos que tienen ciertas ventajas en comparación con los agentes, composiciones y/o procedimientos que se conocen actualmente en la técnica. Por consiguiente, la presente invención proporciona procedimientos para usar proteínas de la invención caracterizadas por secuencias de polipéptidos específicas y composiciones farmacéuticas de las mismas, tal como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, cualquiera de las secuencias de polipéptidos en SEQ ID NOs: 1-31 puede utilizarse específicamente como un componente de la proteína utilizada en los siguientes procedimientos.

La presente invención proporciona procedimientos in vitro para destruir una célula que comprende la etapa de poner en contacto la célula, in vitro, con una proteína o composición farmacéutica de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones. Las proteínas y las composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse para matar un tipo de célula específico al contactar una célula o células con una de las composiciones de materia reivindicadas. En ciertas realizaciones, se puede usar una proteína o composición farmacéutica de la presente invención para matar tipos de células específicos en una mezcla de diferentes tipos de células, tales como mezclas que comprenden células cancerosas, células infectadas y/o células hematológicas. En ciertas realizaciones, una proteína o composición farmacéutica de la presente invención se puede usar para destruir células cancerosas en una mezcla de diferentes tipos de células. En ciertas realizaciones, se puede usar una proteína o composición farmacéutica de la presente invención para matar tipos de células específicos en una mezcla de diferentes tipos de células, tales como tejidos previos al trasplante. En ciertas realizaciones, una proteína o composición farmacéutica de la presente invención se puede usar para matar tipos de células específicos en una mezcla de tipos de células, tales como material tisular de preadministración con fines terapéuticos. En ciertas realizaciones, una proteína o composición farmacéutica de la presente invención puede usarse para matar selectivamente células infectadas por virus o microorganismos, o de otra manera, matar selectivamente células que expresan una biomolécula diana extracelular particular, tal como una biomolécula de superficie celular. Las proteínas y las composiciones farmacéuticas de la invención tienen aplicaciones variadas, que incluyen, por ejemplo, usos en el agotamiento de tipos de células no deseadas de tejidos in vitro o in vivo, usos en la modulación de respuestas inmunes para tratar la enfermedad de injerto contra huésped, usos como agentes antivirales, usos como agentes antiparasitarios y usos en la purga de tejidos de trasplante de tipos de células no deseadas.

En ciertas realizaciones, una proteína o composición farmacéutica de la presente invención, solas o en combinación con otros compuestos o composiciones farmacéuticas, pueden mostrar una potente actividad de eliminación celular cuando se administra a una población de células, in vitro o in vivo en un sujeto, tal como en un paciente que necesita tratamiento. Al dirigir el suministro de regiones de toxina Shiga enzimáticamente activas utilizando regiones de unión de tipo de inmunoglobulina de alta afinidad a los tipos de células cancerosas, esta potente actividad de eliminación celular puede restringirse a matar específica y selectivamente ciertos tipos de células dentro de un organismo, tales como ciertas células cancerosas, células neoplásicas, células malignas, células tumorales no malignas o células infectadas.

La presente descripción proporciona un procedimiento para matar una célula en un paciente, comprendiendo el procedimiento la etapa de administrar al paciente que lo necesita al menos una proteína de la presente invención o una composición farmacéutica de la misma.

Ciertas realizaciones de las proteínas de la invención o composiciones farmacéuticas de las mismas se pueden usar para matar una célula cancerosa y/o tumoral en un paciente reconociendo una biomolécula extracelular que se encuentra físicamente acoplada con una célula cancerosa y/o tumoral. Los términos "célula cancerosa" o "célula de cáncer" se refieren a varias células neoplásicas que crecen y se dividen de manera anormalmente acelerada y serán claras para la persona experta. El término "célula tumoral" incluye células malignas y no malignas (por ejemplo, células tumorales benignas no cancerosas, células madre "de cáncer" no cancerosas, células madre tumorales, células iniciadoras de cáncer premalignas, células iniciadoras de tumores, o células tumorigénicas, las cuales pueden dar lugar a células hijas que se convierten en células tumorales malignas y/o cancerosas, pero no pueden hacer metástasis por sí mismas (véase, por ejemplo, Martinez-Climent J et al., Haematologica 95: 293-302 (2010)) En general, los cánceres y/o tumores pueden definirse como enfermedades, trastornos o afecciones susceptibles de tratamiento y/o prevención. Los cánceres y tumores (ya sean malignos o no malignos) que están compuestos por células cancerosas y/o células tumorales que pueden beneficiarse de los procedimientos y composiciones de la invención serán claras para la persona experta. Las células neoplásicas a menudo se asocian con uno o más de los siguientes: crecimiento no regulado, falta de diferenciación, invasión local de tejidos, angiogénesis y metástasis. Ciertas realizaciones de las proteínas de la invención o composiciones farmacéuticas de las mismas pueden usarse para matar una célula inmune (ya sea sana o maligna) en un paciente reconociendo una biomolécula extracelular encontrada físicamente acoplada con una célula inmune.

Ciertas realizaciones de las proteínas de la invención o composiciones farmacéuticas de las mismas pueden usarse para matar una célula infectada en un paciente reconociendo una biomolécula extracelular que se encuentra físicamente acoplada con una célula infectada.

Está dentro del alcance de la presente descripción utilizar la proteína de la invención o la composición farmacéutica de la misma con el propósito de purgar poblaciones de células de pacientes (por ejemplo, médula ósea) de células B y/o células T malignas infectadas, neoplásicas o, en cualquier caso, no deseadas y a continuación reinfundir el material agotado de células B y/o células T en el paciente (véase, por ejemplo, van Heeckeren W et al., Br J Haematol 132: 42-55 (2006); Alpdogan O, van den Brink M, Semin Oncol 39: 629-42 (2012)).

Está dentro del alcance de la presente descripción utilizar la proteína de la invención o la composición farmacéutica de la misma con el propósito de agotar ex vivo de células B y/o células T de poblaciones de células aisladas extraídas de un paciente. En un ejemplo no limitativo, la proteína de la descripción puede usarse en un procedimiento para la profilaxis del rechazo de trasplante de órganos y/o tejidos en el que el órgano o tejido donante se perfunde antes del trasplante con una proteína citotóxica de la invención o una composición farmacéutica de la misma para purgar el órgano de las células B y/o células T de donantes no deseadas (véase, por ejemplo, Alpdogan O, van den Brink M, Semin Oncol 39: 629-42 (2012)).

También está dentro del alcance de la presente descripción utilizar la proteína de la invención o la composición farmacéutica de la misma con el propósito de agotar las células B y/o las células T de una población de células donantes como una profilaxis contra la enfermedad de injerto frente a huésped e inducción de tolerancia en un paciente para someterse a un trasplante de médula ósea o de células madre.

Ciertas realizaciones de la proteína de la invención o composiciones farmacéuticas de la misma pueden usarse para matar una célula infectada en un paciente al reconocer una biomolécula extracelular que se encuentra físicamente acoplada con una célula infectada.

Ciertas realizaciones de la proteína de la invención o composiciones farmacéuticas de la misma pueden usarse para matar una célula o células de un parásito multicelular. En ciertas realizaciones adicionales, la muerte celular tiene lugar mientras el parásito multicelular está presente en un organismo o sujeto huésped. En ciertas realizaciones adicionales, la proteína de la invención puede usarse para matar un helminto, tal como, por ejemplo, un plathelminto, nematelminto, cestodo, mongéneas, nematodo, y/o trematodo.

Además, la presente invención proporciona el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección en un paciente usando una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos una de las proteínas de la presente invención o una composición farmacéutica de la misma, tal como se describe en las reivindicaciones. Las enfermedades, trastornos y afecciones contemplados que se pueden tratar con este procedimiento incluyen cánceres, tumores malignos y tumores no malignos. La administración de una "dosificación terapéuticamente efectiva" de un compuesto de la invención puede dar como resultado una disminución en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad, o una prevención del deterioro o discapacidad debido a la afección de la enfermedad.

La cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención dependerá de la vía de administración, el tipo de mamífero a tratar, y las características físicas del paciente específico en consideración. Estos factores y su relación para determinar esta cantidad son bien conocidos por los profesionales expertos en las artes médicas. Esta cantidad y el procedimiento de administración pueden adaptarse para lograr una eficacia óptima, y pueden depender de factores, tales como el peso, la dieta, la medicación concurrente y otros factores, bien conocidos por los expertos en las técnicas médicas. Los tamaños de dosificación y el régimen de dosificación más apropiados para uso humano pueden guiarse por los resultados obtenidos por la presente invención, y pueden confirmarse en ensayos clínicos diseñados adecuadamente. Se pueden determinar una dosificación eficaz y protocolo de tratamiento por medios convencionales, comenzando con una dosis baja en animales de laboratorio y a continuación aumentando la dosis mientras se controlan los efectos, y también variando sistemáticamente el régimen de dosificación. El médico puede tener en cuenta numerosos factores al determinar una dosis óptima para un sujeto determinado. Dichas consideraciones son conocidas por la persona experta.

Una ruta de administración aceptable puede referirse a cualquier vía de administración conocida en la técnica, que incluye pero no se limita a aerosol, enteral, nasal, oftálmico, oral, parenteral, rectal, vaginal o transdérmico (por ejemplo, administración tópica de una crema, gel o pomada, o por medio de un parche transdérmico). La "administración parenteral" se asocia típicamente con la inyección en o en comunicación con el sitio de acción previsto, incluida la administración por inyección intratumoral, infraorbital, infusión, intraarterial, intracapsular, intracardíaca, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intrapulmonar, intraespinal, intraesternal, intratecal, intrauterina, intravenosa, subaracnoidea, subcapsular, subcutánea, transmucosa o transtraqueal.

Para la administración de una composición farmacéutica de la invención, el intervalo de dosificación será generalmente de aproximadamente 0,0001 a 100 miligramos por kilogramo (mg/kg), y más habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg, del peso corporal del huésped. Las dosis de ejemplo pueden ser de 0,25 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento de ejemplo es una administración una o dos veces al día, o una administración una o dos veces a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada dos o tres meses o una vez cada tres a 6 meses. Las dosis pueden ser seleccionadas y reajustadas por el profesional de la salud calificado según sea necesario para maximizar el beneficio terapéutico para un paciente en particular.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se administrarán típicamente al mismo paciente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones individuales pueden ser, por ejemplo, de 2 a 5 días, semanalmente, mensualmente, cada dos o tres meses, cada seis meses o anualmente. Los intervalos entre administraciones también pueden ser irregulares, en función de la regulación de los niveles en sangre u otros marcadores en el sujeto o paciente. Los regímenes de dosificación para un compuesto de la invención incluyen la administración intravenosa de 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal con el compuesto administrado cada dos o cuatro semanas durante seis dosis, a continuación cada tres meses a 3 mg/kg de peso corporal o 1 mg/kg de peso corporal.

Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse a través de una o más vías de administración, usando uno o más de una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Como entenderá el experto, la ruta y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Las rutas de administración para las proteínas de la presente invención o sus composiciones incluyen, por ejemplo, vías de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías parenterales, por ejemplo, mediante inyección o infusión en o en comunicación con el sitio de acción deseado (por ejemplo, inyección intratumoral). En otras realizaciones, una composición proteica o farmacéutica de la invención puede administrarse por una ruta no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, intranasalmente, oralmente, vaginalmente, rectalmente, sublingualmente o tópicamente.

Las proteínas o composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse con uno o más de una variedad de dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización, una composición farmacéutica de la invención puede administrarse con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja. Ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención se encuentran en la técnica, que incluyen, por ejemplo, bombas de microinfusión implantables para suministro de velocidad controlada; dispositivos para administrar a través de la piel; bombas de infusión para suministro a una velocidad de infusión precisa; dispositivos de infusión implantables de flujo variable para suministro continuo de fármacos; y sistemas de suministro de fármacos osmóticos. Estos y otros implantes, sistemas de suministro y módulos son conocidos por los expertos en la materia. Una proteína o composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse sola o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos o de diagnóstico. Una terapia de combinación puede incluir una proteína de la invención o una composición farmacéutica de la misma combinada con al menos otro agente terapéutico seleccionado en función del paciente particular, enfermedad o afección a tratar. Los ejemplos de otros agentes incluyen, entre otros, un agente citotóxico, anticancerígeno o quimioterapéutico, un agente antiinflamatorio o antiproliferativo, un agente antimicrobiano o antiviral, factores de crecimiento, citocinas, un analgésico, una molécula pequeña o polipéptido terapéuticamente activos, un anticuerpo de cadena única, un anticuerpo clásico o fragmento del mismo, o una molécula de ácido nucleico que modula una o más vías señalización, y agentes terapéuticos de modulación similares que pueden complementarse o ser beneficiosos en un régimen de tratamiento terapéutico o profiláctico.

El tratamiento de un paciente con una proteína o composición farmacéutica de la invención conduce preferiblemente a la muerte celular de las células diana y/o la inhibición del crecimiento de las células diana. Como tales, las proteínas de la invención y las composiciones farmacéuticas que las comprenden serán útiles en procedimientos para tratar una variedad de trastornos patológicos en los que matar o agotar las células diana puede ser beneficioso, tales como, entre otros, cánceres, tumores, trastornos inmunitarios e infecciones microbianas. La presente descripción proporciona procedimientos para suprimir la proliferación celular y tratar trastornos celulares, que incluyen neoplasia, células B hiperactivas y células T hiperactivas.

En ciertas realizaciones, las proteínas y las composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse para tratar o prevenir cánceres, tumores (malignos y no malignos), trastornos inmunitarios e infecciones microbianas. En otro aspecto, el procedimiento ex vivo anterior se puede combinar con el procedimiento in vivo anterior para proporcionar procedimientos de tratamiento o prevención del rechazo en receptores de trasplante de médula ósea, y para lograr tolerancia inmunológica.

En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona el tratamiento de tumores malignos o neoplasias y otros cánceres asociados a células sanguíneas en un sujeto mamífero, tal como un ser humano, usando una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína o composición farmacéutica de la invención, tal como se define en las reivindicaciones.

Las proteínas y composiciones farmacéuticas de la invención tienen aplicaciones variadas, que incluyen, por ejemplo, usos en la eliminación de células B y/o células T no deseadas, usos en la modulación de respuestas inmunes para tratar enfermedades de injerto contra huésped, usos como agentes antivirales, usos como agentes antimicrobianos y usos en la purga de tejidos de trasplante de tipos de células no deseados. Las proteínas y las composiciones farmacéuticas de la presente invención son comúnmente agentes antineoplásicos, lo que significa que son capaces de tratar y/o prevenir el desarrollo, la maduración o la propagación de células neoplásicas o malignas al inhibir el crecimiento y/o causar la muerte del cáncer o células tumorales.

En ciertas realizaciones, una proteína o composición farmacéutica de la presente invención se usa para tratar amiloidosis, espondilitis anquilosante, asma, enfermedad de Crohn, diabetes, rechazo del injerto, enfermedad de injerto contra huésped, tiroiditis de Hashimoto, síndrome urémico hemolítico, enfermedad relacionada con el VIH, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, poliarteritis nodosa, poliartritis, psoriasis, psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, esclerodermia, shock séptico, síndrome de Sjogren, colitis ulcerosa y vasculitis.

En otro aspecto, ciertas realizaciones de las proteínas y composiciones farmacéuticas de la presente invención son agentes antimicrobianos, lo que significa que son capaces de tratar y/o prevenir la adquisición, desarrollo o consecuencias de infecciones microbiológicas patógenas, tales como causadas por virus, bacterias, hongos, priones o protozoos.

Está dentro del alcance de la presente descripción proporcionar una profilaxis o tratamiento para enfermedades o afecciones mediadas por células B y/o células T, implicando la profilaxis o tratamiento administrar la proteína de la invención, o una composición farmacéutica de la misma, a un paciente que lo necesite con el fin de matar células B y/o células T en el paciente. Este uso es compatible con la preparación o el acondicionamiento de un paciente para trasplante de médula ósea, trasplante de células madre, trasplante de tejido o trasplante de órganos, independientemente de la fuente del material trasplantado, por ejemplo, fuentes humanas o no humanas.

Está dentro del alcance de la presente descripción proporcionar un receptor de médula ósea para la profilaxis o el tratamiento de la enfermedad del huésped contra el injerto a través de la eliminación dirigida de células B, células NK y/o células T del huésped usando una proteína o composición farmacéutica de la presente invención (véase, por ejemplo, Sarantopoulos S et al., Biol Blood Marrow Transplant 21: 16-23 (2015)).

Las proteínas y las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden utilizarse para tratar el cáncer que comprende administrar a un paciente, que lo necesite, una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína o una composición farmacéutica de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones. En ciertas realizaciones de los procedimientos de la presente invención, el cáncer que se trata se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de hueso (tal como mieloma múltiple o sarcoma de Ewing), cáncer de mama, cáncer del sistema nervioso central/periférico, cáncer gastrointestinal (tal como cáncer de estómago o cáncer colorrectal), cáncer de células germinales (tal como cánceres de ovario y de testículo), cáncer glandular (como cáncer de páncreas, cáncer de paratiroides, feocromocitoma, cáncer de glándulas salivales o cáncer de tiroides), cáncer de cabeza y cuello (como cáncer nasofaríngeo, cáncer oral o faríngeo), cáncer de riñón-tracto urinario (como cáncer de vejiga y cáncer renal), cáncer de hígado, cáncer de pulmón/pleura (como mesotelioma, carcinoma de pulmón de células pequeñas o carcinoma de pulmón de células no pequeñas), cáncer de próstata, sarcoma (como angiosarcoma, fibrosarcoma, sarcoma de Kaposi o sarcoma sinovial), cáncer de piel (como el carcinoma de células basales, el carcinoma de células escamosas o el melanoma) y el cáncer uterino.

Las proteínas y las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden utilizarse para tratar un trastorno inmunitario que comprende administrar a un paciente, que lo necesite, una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína o una composición farmacéutica de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones. En ciertas realizaciones de la presente invención, el trastorno inmunitario está relacionado con una inflamación asociada con una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: amiloidosis, espondilitis anquilosante, asma, enfermedad de Crohn, diabetes, rechazo de injerto, enfermedad de injerto contra huésped, tiroiditis de Hashimoto, síndrome urémico hemolítico, enfermedad relacionada con el VIH, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, poliarteritis nodosa, poliartritis, psoriasis, psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, esclerodermia, choque séptico, síndrome de Sjogren, colitis ulcerosa y vasculitis.

Entre ciertas realizaciones de la presente invención está usar la proteína de la invención como un componente de una composición farmacéutica o medicamento para el tratamiento o prevención de un cáncer, un tumor, un trastorno inmunitario y/o una infección microbiana, tal como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, los trastornos inmunes que se presentan en la piel de un paciente pueden tratarse con dicho medicamento en un esfuerzo por reducir la inflamación. En otro ejemplo, los tumores de piel pueden tratarse con dicho medicamento en un esfuerzo por reducir el tamaño del tumor o eliminarlo por completo.

Ciertas proteínas de la invención pueden usarse en aplicaciones de neurocirugía molecular, tales como inmunolesión y rastreo neuronal (véase, Wiley R, Lappi D, Adv Drug Deliv Rev 55: 1043-54 (2003), para revisión). Por ejemplo, el dominio de reconocimiento puede seleccionarse o derivarse de varios ligandos, tales como neurotransmisores y neuropéptidos, que reconocen tipos de células neuronales específicas mediante la unión a receptores de superficie neuronal, tales como un receptor acoplado a proteína G específico del circuito neuronal. De manera similar, el dominio de reconocimiento puede seleccionarse o derivarse de anticuerpos que se unen a receptores de superficie neuronal. Debido a que las toxinas Shiga dirigen de manera robusta su propio transporte axonal retrógrado, ciertas proteínas citotóxicas de la invención pueden usarse para matar una neurona o neuronas que expresan la diana extracelular en un sitio de inyección de proteína citotóxica distante del cuerpo celular (ver Llewellyn-Smith I et al., J. Neurosci Methods 103: 83-90 (2000)). Estas proteínas citotóxicas de reconocimiento específicas para el tipo de célula neuronal tienen usos en la investigación en neurociencia, tal como para dilucidar los mecanismos de las sensaciones (ver, por ejemplo, Mishra S, Hoon M, Science 340: 968-71 (2013)) y crear sistemas modelo de enfermedades neurodegenerativas, tales como como Parkinson y Alzheimer (ver, por ejemplo, Hamlin A et al., PLoS One e53472 (2013)).

Entre ciertas realizaciones de la presente descripción se encuentra un procedimiento de uso de una proteína, composición farmacéutica y/o composición de diagnóstico de la invención para detectar la presencia de un tipo celular con el fin de recopilar información con respecto a enfermedades, afecciones y/o trastornos. El procedimiento comprende poner en contacto una célula con una cantidad diagnósticamente suficiente de una proteína de la invención para detectar la proteína mediante un ensayo o técnica de diagnóstico. El término "cantidad diagnósticamente suficiente" se refiere a una cantidad que proporciona detección adecuada y medición precisa para fines de recopilación de información mediante el ensayo particular o la técnica de diagnóstico utilizada. En general, la cantidad diagnósticamente suficiente para el uso de diagnóstico in vivo de todo el organismo será una dosis no acumulativa de entre 0,1 mg y 100 mg de proteína unida al agente promotor de la detección por kg de sujeto por sujeto. Típicamente, la cantidad de proteína de la invención utilizada en estos procedimientos de recopilación de información será tan baja como sea posible siempre que sea una cantidad diagnósticamente suficiente. Por ejemplo, para la detección in vivo en un organismo, la cantidad de proteína de la invención administrada a un sujeto será lo más baja posible.

El reconocimiento específico de tipo celular de proteínas de la invención combinado con agentes promotores de detección proporciona una forma de detectar y formar imágenes de células físicamente acopladas con una biomolécula diana extracelular de una región de unión de las proteínas de la invención. La obtención de imágenes de células que usan las proteínas de la invención puede realizarse in vitro o in vivo mediante cualquier técnica adecuada conocida en el sector. Por ejemplo, la descripción proporciona un procedimiento para usar una proteína, composición farmacéutica o composición de diagnóstico de la invención para detectar la presencia de un tipo celular con el propósito de recopilar información que puede realizarse en células in vivo dentro de un paciente, incluyendo en células in situ, por ejemplo, en un lugar de enfermedad, en células in vitro y/o en un entorno ex vivo en células y tejidos extraídos de un organismo, por ejemplo, un material de biopsia.

La información de diagnóstico se puede recopilar usando varios procedimientos conocidos en la técnica, que incluyen imágenes de todo el cuerpo de un organismo o usando muestras ex vivo tomadas de un organismo. El término muestra que se usa en el presente documento se refiere a cualquier cantidad de cosas, pero no se limita a, fluidos, tales como sangre, orina, suero, linfa, saliva, secreciones anales, secreciones vaginales y semen, y tejidos obtenidos mediante procedimientos de biopsia. Por ejemplo, se pueden utilizar varios agentes promotores de detección para la obtención de imágenes de tumores in vivo no invasivos mediante técnicas, tales como imágenes de resonancia magnética (IRM), procedimientos ópticos (tales como imágenes directas, fluorescentes y bioluminiscentes), tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía computarizada de emisión de un solo fotón (SPECT), ultrasonido, tomografía computarizada de rayos X y combinaciones de las mencionadas anteriormente (ver Kaur S et al., Cancer Lett 315: 97-111 (2012), para revisión).

La descripción proporciona un procedimiento para usar una proteína, composición farmacéutica o composición de diagnóstico de la invención para detectar la presencia de un tipo de célula positiva en una biomolécula diana con el fin de recopilar información en células in vivo dentro de un paciente, en células in situ, por ejemplo, en un lugar de enfermedad, en células in vitro y/o en un entorno ex vivo en células y tejidos extraídos de un organismo, por ejemplo, un material de biopsia. La detección de células específicas, tipos de células y poblaciones de células usando una composición de la invención puede usarse para el diagnóstico y la obtención de imágenes de células, tales como, por ejemplo, células tumorales, cancerosas, inmunes e infectadas. Por ejemplo, las proteínas de la invención y las composiciones de diagnóstico de la descripción pueden emplearse para obtener imágenes o visualizar un sitio de posible acumulación de células que expresan biomoléculas diana en un organismo. Estos procedimientos pueden usarse para identificar sitios de desarrollo tumoral o células tumorales residuales después de una intervención terapéutica.

Ciertas realizaciones del procedimiento usado para detectar la presencia de un tipo de célula pueden usarse para recopilar información sobre enfermedades, trastornos y afecciones, tales como, por ejemplo, cáncer de hueso (tal como mieloma múltiple o sarcoma de Ewing), cáncer de mama, cáncer del sistema nervioso central/periférico (tal como cáncer cerebral, neurofibromatosis o glioblastoma), cáncer gastrointestinal (tal como cáncer de estómago o cáncer colorrectal), cáncer de células germinales (tal como cáncer de ovario y cáncer testicular, cáncer glandular (tal como cáncer pancreático), cáncer de paratiroides, feocromocitoma, cáncer de glándulas salivales o cáncer de tiroides), cáncer de cabeza y cuello (tal como cáncer nasofaríngeo, cáncer oral o de faringe), cánceres hematológicos (tal como leucemia, linfoma o mieloma), cáncer renal-tracto urinario (tal como cáncer renal y de vejiga), cáncer de hígado, cáncer de pulmón/pleura (tal como mesotelioma, carcinoma de pulmón de células pequeñas o carcinoma de pulmón de células no pequeñas), cáncer de próstata, sarcoma (tal como angiosarcoma, fibrosarcoma, sarcoma de Kaposi o sarcoma sinovial), cáncer de piel (tal como carcinoma basocelular, carcinoma de células escamosas o melanoma), cáncer uterino, SIDA, amiloidosis, espondilitis anquilosante, asma, autismo, cardiogénesis, enfermedad de Crohn, diabetes, eritematoso, gastritis, rechazo de injerto, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, síndrome urémico hemolítico, enfermedad relacionada con el VIH, lupus eritematoso sistémico, trastornos linfoproliferativos, esclerosis múltiple, miastenia gravis, neuroinflamación, poliarteritis nodosa, poliartritis, psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, esclerodermia, shock séptico, síndrome de Sjogren, lupus eritematoso sistémico, colitis ulcerosa, vasculitis, proliferación celular, inflamación, activación de leucocitos, leucocitos, quimiotaxis de leucocitos, maduración de leucocitos, migración de leucocitos, diferenciación neuronal, leucemia aguda linfoblástica (ALL), leucemia linfocítica aguda/linfoma T (ALL), leucemia mielógena aguda, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL), linfoma prolinfocítico de células B, linfoma de Burkitt (BL), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mielógena crónica (CML-BP), leucemia mieloide crónica (CML), linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, leucemia de células pilosas (HCL), linfoma de Hodgkin (HL), linfoma intravascular de células B grandes, granulomatosis linfomatoide, linfoma linfoplasmocítico, linfoma MALT, linfoma de células del manto, mieloma múltiple (MM), leucemia de células asesinas naturales, linfoma nodal marginal de células B, linfoma no Hodgkin (LNH), leucemia de células plasmáticas, plasmacitoma, linfoma de efusión primaria, leucemia prolinfocítica, leucemia promielocítica, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de la zona marginal esplénica, linfoma de células T (TCL), enfermedad de la cadena pesada, gammapatía monoclonal, enfermedad por depósito de inmunoglobulina monoclonal, síndromes mielodisplásicos (SMD), mieloma múltiple latente y macroglobulinemia de Waldenstrom.

Entre ciertas realizaciones de la presente descripción se encuentra un procedimiento de uso de una proteína, composición farmacéutica y/o composición de diagnóstico para marcar o detectar el interior de células neoplásicas y/o tipos de células inmunes (véase, por ejemplo, Koyama Y et al., Clin Cancer Res 13: 2936-45 (2007); Ogawa M et al., Cancer Res 69: 1268-72 (2009); Yang L et al., Small 5: 235-43 (2009)). En base a la capacidad de las proteínas y composiciones farmacéuticas de la invención para entrar en tipos de células específicas y enrutarse dentro de las células a través del transporte intracelular retrógrado, los compartimentos interiores de tipos de células específicos s e m arca n para su d etección . Esto se puede re a liz a r en c é lu la s in situ dentro de un pacien te o en c é lu la s y te jid os e x tra íd o s de un o rg a n ism o , por e jem p lo, m ateria l de b iopsia.

L a s c o m p o sic io n e s de d ia g n ó stico de la d e scrip c ió n pueden u s a rs e para c a ra c te riz a r una en ferm ed ad , trastorno o a fe cc ió n com o p o tencialm en te tratable por una co m p o sic ió n fa rm a cé u tica re la c io n a d a de la invención . C ie rta s c o m p o sic io n e s de la m ateria de la inven ción p u eden u s a rs e para d e te rm in a r si un pacien te perten ece a un grupo qu e resp o n d e a una e strateg ia tera p é u tica que h a ce uso de un co m p uesto , co m p o sic ió n o procedim iento re lac io n ad o de la invención , tal com o s e d e sc rib e en el p resen te d ocum ento, o si e s a d e c u a d o para u s a r un d isp o sitivo de su m in istro de la d e scrip c ió n .

L a s c o m p o sic io n e s de d ia g n ó stico de la d e scrip c ió n p u eden u s a rs e d e sp u é s de d etecta r un a en ferm ed ad , por e jem p lo , un c á n ce r, para ca ra c te riz a r la m ejor, tal com o para m o n itorizar m e tá sta s is d istante, h etero g en eid a d y etap a de p rogresión del cán ce r. L a e v a lu a c ió n fen o típ ica del trastorno de la en ferm ed ad o infección puede a y u d a r al pron óstico y la p redicción durante la tom a de d e c is io n e s te ra p é u ticas. E n la re cu rre n c ia de la en ferm ed ad , p ueden u s a rs e ciertos p roced im ien to s de d e scrip c ió n para d e te rm in a r si h a y un prob lem a local o s istém ico .

L a s c o m p o sic io n e s de d ia g n ó stico de la d e scrip c ió n p u eden u s a rs e para e v a lu a r la s re sp u e sta s a los a g e n te s te ra p é u tico s in d ep en d ien tem en te del tipo de a g en te terap éutico, por ejem p lo , fárm a co de m o lé cu la peq ueñ a, fárm a co biológico o te ra p ia b a sa d a en cé lu la s . P o r e jem p lo, c ie rta s re a liz a c io n e s de los d ia g n ó stico s de la d e scrip c ió n p ueden u sa rse para m edir c a m b io s en el tam a ñ o del tum or, c a m b io s en la s p o b la c io n e s de c é lu la s p o sitiva s para el antíg en o , in clu yen d o el núm ero y la d istribución, y/o contro lar un m a rca d o r diferente al an tíg en o d irigido por una tera p ia que y a se está a d m in istra n d o a un p a cien te (v é a se , por e jem p lo, S m ith -J o n e s P et al., Nat B iotech n o l 22 : 701 -6 (2004); E v a n s M et al., P ro c Natl A c a d S c i U S A 108 : 9578 -82 ( 2011 )) .

E n c ie rta s re a liz a c io n e s , la s prote ín as de la d e scrip c ió n o la s c o m p o sic io n e s fa rm a c é u tica s y/o d ia g n ó stic a s de la s m is m a s s e u sa n tanto para d ia g n ó stico com o para tratam iento, o para d ia g n ó stico solo.

L a p resen te invención , tal com o se d efine en la s re iv in d ic a c io n e s, s e ilustra a d ic io n a lm e n te m ed ian te los s ig u ie n te s e je m p lo s no lim itativos de p ro te ín a s se le ctiv a m e n te c itotóxicas que co m p re n d e n re g io n e s efecto ras de la toxina S h ig a d e riv a d a s de s u b u n id a d e s A de los m iem b ro s de la fam ilia de to xin a s S h ig a y re g io n e s de unión de tipo in m u n o g lo b u lin a c a p a c e s de unión a b io m o lé cu la s d ia n a e x tra ce lu la re s f ís ic a m e n te a c o p la d a s a tipos de c é lu la s e s p e c ífic a s .

EJEMPLOS

L o s s ig u ie n te s e je m p lo s d em u estran c ie rta s re a liz a c io n e s de la p resen te invención . S in em bargo , d eb e en te n d e rse qu e e sto s e je m p lo s son so lo para fin es ilustrativos y no pretenden, ni d eben interpretarse, com o co m p letam en te d efin itivos en cuanto a la s co n d ic io n e s y el a lc a n c e de esta invención , que se define en la s re iv in d ica c io n e s. Lo s e je m p lo s se llevaron a ca b o utilizand o té c n ic a s e stán d a r, qu e son bien c o n o c id a s y ru tin a rias p a ra los exp erto s en la té cn ica , excep to d on d e s e d e sc rib a lo contrario en detalle.

L o s s ig u ie n te s e je m p lo s d e m u estran la c a p a c id a d m e jo ra d a de prote ín as cito tó xicas de e jem p lo de d estru ir se le ctiv a m e n te c é lu la s a c o p la d a s f ís ic a m e n te con una b io m o lé cu la d ia n a e x tra ce lu la r de la región de unión de tipo in m u n o g lo b u lin a, en co m p ara ció n con s u s v a ria n te s de proteína de o rientación in versa . L a s p ro te ín a s c ito tó xicas de e jem p lo se unieron a la s b io m o lé cu la s d ia n a e x p re s a d a s por los tip os de c é lu la s d ia n a y entraron en la s c é lu la s d ia n a . L a s p ro te ín a s c itotóxicas in te rn a liza d a s enrutaron efectivam ente s u s re g io n e s efecto ras de toxina S h ig a al citosol para in a ctivar los rib o so m a s y posteriorm ente c a u sa ro n la m uerte apoptótica de la s c é lu la s d iana.

U n a proteína citotóxica de e jem p lo co m p ren d e un fragm ento de su b u n id a d A de toxina S h ig a reco m b in ad o con una región de unión de fragm ento v a ria b le de c a d e n a ú n ica c a p a z de un irse a C D 38 con alta afin id ad . E sta proteína citotóxica de e jem p lo e s c a p a z de d estru ir se le ctiva m e n te la s c é lu la s que e x p re sa n C D 38 en su su p erfic ie . U n a se g u n d a proteína citotóxica de e jem p lo co m p ren d e un fragm ento de su b u n id a d A de toxina S h ig a reco m b in ad o con un a región de unión de fragm en to v a ria b le de c a d e n a ú n ica c a p a z de u n irse a H E R 2 con alta afin id ad . E s ta se g u n d a proteína citotóxica de e jem p lo e s c a p a z de d estru ir se le ctiva m e n te la s c é lu la s que e x p re sa n H E R 2 en su su p erfic ie . U n a tercera proteína citotóxica de e jem p lo co m p ren d e un fragm ento de su b u n id a d A de toxina S h ig a re co m b in ad o con una región de unión de fragm ento v a ria b le de c a d e n a ún ica c a p a z de un irse a C D 19 con alta afin id ad . E sta tercera proteína citotóxica de e jem p lo e s c a p a z de d estru ir se le ctiva m e n te la s c é lu la s que e x p re sa n C D 19 en su su p e rfic ie . U n a cu a rta proteína citotóxica de e jem p lo co m p re n d e un fragm ento de su b u n id a d A de toxina S h ig a A reco m b in ad o con un a región de unión de fragm ento v a ria b le de c a d e n a ú n ica c a p a z de u n irse a C D 74 con alta afin id ad . E s ta cuarta p roteína citotóxica de e jem p lo e s c a p a z de d estru ir se le ctiv a m e n te la s c é lu la s que e x p re sa n C D 74 en su su p e rfic ie . O tra s p ro te ín a s c itotóxicas de e jem p lo in clu yen a q u e lla s con re g io n e s de unión d ir ig id a s a a n tíg e n o s de E p ste in -B a rr , a n tíg e n o s de L e ish m a n ia , re cep to res de n e u ro te n sin a , re cep to res de factor de crecim ien to e p id é rm ico y el receptor de c é lu la s in m u n e s C C R 5.

Ejemplo 1. Proteína citotóxica dirigida a CD38 derivada de la subunidad A de la toxina semejante a Shiga 1 (SLT1A::aCD38scFv)

L a prote ína citotóxica de e ste e je m p lo S L T -1 A : :a C D 38 s c F v co m p re n d e un fragm en to de la su b u n id a d A de la toxina S h ig a re co m b in a d a con un a región de unión de un fragm en to v a ria b le de c a d e n a ú n ica c a p a z de u n irse a C D 38 con alta afin id ad de m odo que la región efectora de la toxina S h ig a esté m á s próxim a al extrem o a m in o term in al de la proteína citotóxica qu e la región de unión a C D 38.

C o n stru cc ió n , prod ucció n y purificació n de la proteína citotóxica S L T -1 A : :a C D 38 s c F v

E n prim er lugar, se d ise ñ a ro n o se le c c io n a ro n una región efectiva de la toxina S h ig a y una región de unión de tipo in m uno glo b ulina. E n este ejem p lo , la región efectora de la toxina S h ig a se derivó de la su b u n id a d A de la toxina se m e ja n te a S h ig a 1 ( S L T -1 A ) . S e obtuvo un polinucleótido que co d ifica b a los a m in o á cid o s 1 -251 de S L T - 1 A (C h e u n g M et al, C a n c e r Mol. 9: 28 (2010 )). U n a región de unión de tipo in m un o g lo b ulin a a C D 38 s c F v s e d erivó del anticuerp o m o n o clo n al a C D 38 H B 7 (P e n g et al., Blood 101 : 2557 -62 (2003); v é a s e tam b ién G e n B a n k A c c e s s io n B D 376144 , C en tro N a cio n a l de Inform ación B io te cn o ló g ica , E E . U U .), de m odo qu e s e c re a un fragm ento v a ria b le de c a d e n a ún ica (s c F v ) con la s d o s re g io n e s v a ria b le s de inm u n o g lo b u lin a ( V L y V h) s e p a ra d a s por un e n la z a d o r co n o cid o en la té cn ica .

E n se g u n d o lugar, la región de unión de tipo in m u n o g lo b u lin a y la región efectora de toxina S h ig a s e unieron entre s í para fo rm ar una proteína de fusión. E n este e jem p lo, un polinucleótido que co d ifica la región efectora de la toxina S h ig a que co m p ren d e los a m in o á cid o s 1 - 251 de la S E Q ID N O : 1 se clonó en m arco con un polinucleótido que co d ifica un e n laza d o r, tal com o un a “b isa g ra m u rin a ”, d erivad o de un a m o lé cu la de Ig G 3 m urina (u otros e n la z a d o re s c o n o cid o s por el experto) y en m a rco con un p olinu cleótid o qu e co d ifica la región de unión de tipo in m un o g lo b ulin a a C D 38 s c F v qu e co m p re n d e los a m in o á c id o s 269 -508 de la S E Q ID N O : 4. E n c iertos exp erim entos, la s e c u e n c ia co d ifican te de longitud co m p leta de la p roteína citotóxica de este e jem p lo e m p e zó con un polinucleótido que co d ifica b a un S tre p -ta g ® para facilitar la d etecció n y p u rificació n. La s e c u e n c ia de polinucleótido que co d ifica la proteína citotóxica S L T -1 A : :a C D 38 -s c F v de este e jem p lo se optim izó en co d o n e s para la e x p re sió n e fica z en E. coli utilizando los se rv ic io s de D N A 2.0 , Inc. (M enlo P ark, C a , U S ).

E n te rce r lugar, se produjo una proteína de fusión m ediante la e x p resió n del po linucleótido que co difica la proteína citotóxica S L T -1 A : :a C D 38 -s c F v ( S E Q ID N O : 4). La e x p resió n de la p roteína citotóxica S L T -1 A : :a C D 38 -s c F v s e llevó a ca b o utilizando los s is te m a s de tra d u cció n de p ro te ín a s b a cte ria n o s y lib res de c é lu la s .

E n este e jem p lo de p rod ucción de S L T -1 A : :a C D 38 -s c F v por un s iste m a de ex p resió n de E . coli, la s e c u e n c ia de “inserto ” de polinucleótido que co d ifica S L T -1 A : :a C D 38 -s c F v se clonó en el v e cto r p T xb 1 (N ew E n g la n d B io lab s, Ip sw ich , M A, E E .U U .) u sa n d o p ro ce d im ie n to s e s tá n d a r p a ra p rod u cir un a s e c u e n c ia de p o lin u cle ó tid o s qu e co d ifica la proteína citotóxica S L T -1 A : :a C D 38 -s c F v lig a d a en m arco a s e c u e n c ia s de po linu cleó tid os que co difican la inteína a m in o -te rm in al del vector. La s e c u e n c ia del po linucleótido de inserto del p lásm id o fue ve rifica d a m ediante se c u e n c ia c ió n de S a n g e r (F u n ctio n a l B io s c ie n c e s , M ad ison , W I, E E .U U .) y s e transform ó en c é lu la s T 7 S h u ffle ® (N ew E n g la n d B io la b s, Ip sw ich, MA, E E .U U .). La proteína S L T -1 A : :a C D 38 s c F v se produjo y se purificó de a cu e rd o con el m a n u a l d e s iste m a IM P A C T ™ (Intein M ediated Purificatio n with an Affinity C h it in -b in d in g T a g ) (N ew E n g la n d B io la b s, Ip sw ich, MA, E E .U U .). L a p u rificació n s e llevó a cab o utilizand o té c n ic a s e stá n d a r c o n o c id a s en la té cn ica , ta le s co m o u sa n d o d ia n a s in m o v iliz a d a s de S tre p -ta g ® o la región de unión de tipo inm uno glo b ulina.

E n e ste e jem p lo de prod ucció n de S L T -1 A : :a C D 38 s c F v m ed ian te un s iste m a de tra d u cció n de p ro te ín a s libre de cé lu la s , la s e c u e n c ia de “in serto ” de polinucleótido que co d ifica S L T -1 A : :a C D 38 se clonó en el v e cto r p IV E X 2.3 con un codón de term in ació n in m ed iatam en te d e sp u é s de la región de co d ifica ció n utilizando el kit de c lo n a ció n In -F u s io n ® H D (C lo n te ch , M ountain V iew , C A , E E .U U .) se g ú n la s in stru cc io n e s del fab ricante. L a s e c u e n c ia de polinucleótid o de inserto del p lásm id o fue v e rif ic a d a m ed ian te s e c u e n c ia c ió n de S a n g e r (Fu n ctio n a l B io s c ie n c e s, M ad ison , W I, E E .U U .). La proteína S L T -1 A : :a C D 38 s c F v se produjo u sa n d o el s iste m a de tra d u cció n rá p id a del kit 5 P r im e ™ R T S 100 E. coli D isu lfid e (5 Prim e, G a ith e rsb u rg , M D, E E .U U .) se g ú n la s in stru cc io n e s del fab ricante. La purificació n s e llevó a cab o utilizando té c n ic a s e stá n d a r c o n o c id a s en la té cn ica , ta le s com o u sa n d o d ia n a s in m o v iliz a d a s de S tre p -ta g ® o la región de unión de tipo inm uno glo b ulina.

D e te rm in a ció n de la unión e s p e c íf ic a m á x im a (B m ax ) y co n stan te de equilibrio de unión (Kn) de los tip os de c é lu la s d irig id a s a la unión de S L T -1 A : :a C D 38 s c F v

L a s c a ra c te ríst ic a s de unión de la proteína S L T -1 A : :a C D 38 s c F v prod ucida com o se d e scrib e anteriorm ente se d eterm inaron m ediante un e n sa yo de citom etría de flujo b a sa d o en f lu o re sce n c ia . L a s m u e stra s que contienen c é lu la s C D 38 p o sitiva s (+) y c é lu la s C D 38 n e g a tiva s (-) se su sp e n d ie ro n en 1 X P B S B S A al 1 % y se incubaron d urante 1 hora a 4 ° C con 100 |j L de v a r ia s d ilu c io n e s de la proteína S L T -1 A : :a C D 38 s c F v a a n a liz a r. L a s c o n ce n tra c io n e s m á s a ltas de proteína S L T -1 A : :a C D 38 s c F V se se le c c io n a ro n para co n d u cir a la satu rac ió n de la re a cció n de unión. D e s p u é s de un a hora de in cu b a ció n , la s m u e stra s c e lu la re s se lavaron d o s v e c e s con 1 X P B S 1 % de B S A . L a s m u e stra s de c é lu la s se incubaro n d urante 1 hora a 4 ° C con 100 j L de 1 X P B S 1 % B S A que co n te n ía 0 ,3 j g de m A b -F IT C a S tre p -ta g ® (# A 01736 -100 , G e n scrip t, P isc a ta w a y , N J, E E . UU.).

L a s m u e stra s c e lu la re s s e la va ro n a co n tin u ació n d o s v e c e s con IX P B S 1 % B S A , s e re su sp e n d ie ro n en 200 |il de IX P B S y se som etieron a citom etría de flujo b a sa d a en f lu o re sce n c ia . Lo s datos de in ten sid ad de flu o re sce n c ia m ed ia (M FI) para to d a s la s m u e stra s s e obtuvieron regulan d o los d ato s utilizand o una ú n ica m u estra de F I T C com o control negativo. L o s g rá fico s se rep resen taro n de M FI frente a "la co n cen trac ió n de la s cé lu las", utilizando el p rog ram a P rism (G ra p h P a d Softw are, S a n D iego, C A , E E .U U .). U tilizand o la función de softw are P rism de unión de un sitio [Y = B m a x * X /( K d X )] bajo el e n ca b e za m ie n to de unión de sa tu ra c ió n , s e ca lcu la ro n la B m a x y K d utilizand o datos co rre g id o s con la lín e a b a se . Lo s v a lo re s A b s se corrigieron por el ruido de fondo restan do los v a lo re s A b s m e d id o s para los p p ocillos so lo con P B S . B m a x e s la unión e s p e c íf ic a m áx im a d e scrita en M FI. K d e s la co n stan te de unión en equilib rio e x p re sa d a en n a n o m o lar (nM).

L a Bmax para la unión de S L T -1 A : :a C D 38 s c F v a c é lu la s C D 38 se m idió qu e fue de a p ro x im a d a m e n te 100.000 M FI con un a K d de a p ro x im a d a m e n te 13 nM (T a b la 1). E s te resultad o fue s im ila r a la Bmax para la unión de la prote ína de orientación in v e rsa a C D 38 s c F v : :S L T - 1 A a c é lu la s C D 38 que s e m idió que fue a p ro x im a d a m e n te 100.000 M FI con un a K d de ap ro x im a d a m e n te 17 nM (T a b la 1). N in g u n a proteína se unión a c é lu la s C D 38 -. Esto d e m u e stra que el efecto “orientación de d is e ñ o ” p rob ab lem en te no está re lac io n ad o con un a a ltera ció n de la s p ro p ie d a d e s de unión de la c é lu la d ia n a del d om inio d eriva d o de inm uno glo b ulina.

Tabla 1. Orientación del diseño no tuvo efecto significativo en las características de unión: los v a lo re s rep re se n tativo s para Bmax y K d p a ra S L T -1 A : :a C D 38 s c F v en co m p a ra c ió n con la orientación in ve rsa a C D 38 s c F v : :S L T - 1 A

D e te rm in a ció n de la co n cen trac ió n inh ib idora se m im á x im a (ICsn) de S L T -1 A : :a C D 38 -s c F V para rib o so m a s de e u ca rio ta s in v itro

L a c a p a c id a d de in a ctivac ió n de rib o so m a s de S L T -1 A : :a C D 38 s c F v se determ inó en un e n s a y o de tra d u cció n de p ro te ín a s libre de c é lu la s , in vitro, utilizand o el kit de tra n scrip ció n /tra d u cc ió n T N T ® Q u ic k C o u p le d ( L 1170 P ro m e g a, M ad ison , W I, U S ). E l kit in c lu ye A D N de control de T 7 lu cife ra sa y la m e z c la m ad re T N T ® Q u ick. La re a cció n de activ id a d de rib o so m a se preparó de a cu e rd o con la s in stru cc io n e s del fab rican te para cre a r m e z c la s de re a cció n “T N T ”.

U n a se rie de d ilu c io n e s de 10 v e c e s de S L T -1 A : :a C D 38 s c F v a e n s a y a r se preparó en tam p ón ap ro p iad o y se cre a ro n una se rie de co m p o n e n te s de la m e z c la de re a cció n T N T idén ticos para c a d a d ilución de S L T -1 A : :a C D 38 s c F v . C a d a m u estra en la se rie de d ilución de la p roteína S L T -1 A : :a C D 38 s c F v se com b in ó con ca d a una de la s m e z c la s de re a cc ió n T N T junto con el A D N de control de T 7 lu c ife ra sa . L a s m u e stra s de e n s a y o s e in cub aro n durante 1,5 ho ras a 30 °C . D e s p u é s de la in cu b a ció n , se a ñ ad ió reactivo de e n sa yo de lu c ife ra sa ( E 1483 P ro m e g a, M a d iso n , W I, E E .U U .) a to d a s la s m u e stra s de e n s a y o y s e m idió la ca n tid a d de tra d u cc ió n de la prote ína lu c ife ra sa m ed ian te lu m in isc e n c ia de a cu e rd o con la s in stru cc io n e s del fab ricante. E l n ivel de inhib ición de la tra d u cció n se determ inó por a n á lis is de regresió n no lineal de la s c o n c e n tra c io n e s tra n sfo rm a d a s lo g a rítm icam en te de la proteína total frente a u n id a d e s de lu m in isc e n c ia re lativas. U sa n d o softw are e sta d ístico (G ra p h P a d P rism , S a n D iego, C A , E E .U U .) , se c a lcu ló la co n cen trac ió n inh ib ido ra se m im á x im a ( IC ⁵⁰) para c a d a m uestra. A co n tin u ació n , los d ato s se n o rm alizaro n m ed ian te el cá lcu lo del "p orcentaje de proteína de control de S L T - 1 A sola" u sa n d o la función de softw are P rism de log (inhibidor) v s . re sp u e sta (tres p a rám etros) [Y = Inferior ((su p erio r-in ferio r)/(1 10 A (X -L o g IC 50 )))] bajo el título de inh ib ic ió n d o s is -re sp u e s ta . S e c a lcu ló la IC ⁵⁰ p a ra la s p ro te ín a s e x p e rim e n ta le s y la proteína de control con S L T - 1 A so la. E l po rcentaje de p roteína de control con S L T - 1 A so la se c a lcu ló m ed ian te [(IC 50 de proteína de control S L T -1 A / I C 50 de p roteína exp erim ental) x 100].

E l efecto inh ib idor de S L T -1 A : :a C D 38 s c F v en la s ín te s is de p ro te ín a s libre de c é lu la s fue fuerte. L o s exp erim entos d e p e n d ie n te s de la d o s is d eterm inaron qu e la IC ⁵⁰ de S L T -1 A : :a C D 38 s c F v en la s ín te s is de p ro te ín a s en este e n s a y o libre de c é lu la s fue de ap ro x im a d a m e n te 14 p ico m o lar (pM ) o dentro del 10 % del control positivo sólo con S L T - 1 A (T a b la 2). E ste resultad o no fue s u sta n c ia lm e n te d iferente de la IC ⁵⁰ para la proteína de o rientación in v e rsa a C D 38 s c F v : :S L T -1 A , qu e se m idió qu e fue a p ro x im a d a m e n te 15 pM o e q u iva le n te del control positivo con so lo S L T -1 A (tabla 2). Esto d e m u e stra que el efecto “o rientación de d ise ñ o ” prob ab lem ente no e stá re lac io n ad o con n in g u n a a lte ra ció n s ig n ificativa de la a ctiv id ad e n z im á tica de la su b u n id a A de la toxina S h ig a .

Tabla 2. Orientación del diseño no tuvo efecto significativo en la inactivación del ribosoma: co n cen tració n inh ib ido ra s e m im á x im a ( IC ⁵⁰) rep resen tativa de S L T -1 A : :a C D 38 -s c F V en co m p a ra c ió n con la o rientación in ve rsa a C D 38 -s c F V : :S L T - 1 A

D e te rm in a ció n de la citotoxicidad se le ctiv a y la C o n ce n tra c ió n citotóxica s e m im á x im a ÍCDñn) de S L T -1 A : :a C D 38 -s c F V utilizando un e n s a y o de e lim in a ció n ce lu la r

L a s c a ra c te ríst ic a s de citotoxicidad de S L T -1 A : :a C D 38 -s c F V s e d eterm inaron m ed ian te el s ig u ie n te e n s a y o de e lim in a ció n ce lu lar. E ste e n s a y o d eterm in a la c a p a c id a d de un a proteína citotóxica para e lim in a r la s c é lu la s que e x p re sa n la b io m o lé cu la d ia n a de la región de unión de tipo in m u n o g lo b u lin a de proteína citotóxica en co m p ara ció n con c é lu la s qu e no e x p re sa n la b io m o lé cu la d ia n a . L a s c é lu la s s e se m b ra ro n (2 x 103 c é lu la s por pocillo) en 20 |il de m edio en p la c a s de 384 pocillos. La proteína S L T -1 A : :a C D 38 -s c F V se diluyó 5 v e c e s o 10 v e c e s en 1 X P B S y se a ñ ad ie ro n 5 |il de la s d ilu c io n e s a la s c é lu la s . Lo s pocillos de control que co n te n ía n só lo m edio se utilizaron para la co rrecció n de la lín e a b a se . L a s m u e stra s de c é lu la s se in cub aro n con S L T -1 A : :a C D 38 -s c F V o s im p lem en te tam p ón, d urante 3 d ía s a 37 ° C y en un a a tm ó sfe ra de 5 % de dióxido de carb o n o ( C O ² ). La su p e rv iv e n c ia total de la s c é lu la s o p o rcentaje de v ia b ilid a d se d eterm inaron utilizando una lectura lu m in isce n te utilizando el e n sa y o de v ia b ilid a d C e llT it e r -G lo ® L u m in e sc e n t C e ll ( G 7573 P ro m e g a M ad ison , W I, E E .U U .) se g ú n la s in stru cc io n e s del fab ricante. E l p orcentaje de v ia b ilid a d de los pocillos e x p e rim e n tale s se ca lcu ló u sa n d o la s igu ien te e cu a ció n : (R L U de p rueba - R L U m ed ia p ro m e d io )/(R LU de c é lu la s prom edio - R L U m edia prom edio) * 100. La co n cen tració n de polipéptido en form a log frente a l p o rce n ta je de v ia b ilid a d s e rep resen tó en P rism (G ra p h P a d P rism , S a n D ieg o , C A , E E .U U .) y se utilizó el a n á lis is de log (inhibidor) v s . re sp u e sta n o rm a liza d a (p endiente va ria b le ) para d eterm in ar el v a lo r de co n cen trac ió n citotóxica se m im á x im a ( C D ⁵⁰) para S L T -1 A : :a C D 38 -s c F V .

L o s e x p erim en to s de d e p e n d e n c ia de la d o sis d eterm inaron qu e la C D ⁵⁰ de la proteína S L T -1 A : :a C D 38 s c F v era a p ro x im a d a m e n te 0 ,2 -0 ,7 nM para la s c é lu la s C D 38 d e p e n d ie n d o de la lín e a ce lu la r en co m p ara ció n con 470 nM p a ra un a lín e a ce lu la r C D 38 -, que era s im ila r a C D ⁵⁰ para el control negativo so lo con S L T - 1 A (T a b la 3; F ig u ra 2). La C D ⁵⁰ de S L T -1 A : :a C D 38 s c F v fue a p ro x im a d a m e n te 700 -3000 v e c e s m ayo r (m e n o s citotóxico) para la s c é lu la s que no se a co p laro n f ís ic a m e n te con la b io m olécu la d ia n a e x tra ce lu la r C D 38 en co m p ara ció n con la s c é lu la s que se aco p laro n f ís ic a m e n te con la b io m olécu la d ia n a e x tra ce lu la r C D 38 , por e jem p lo, la s lín e a s ce lu la re s que e x p re sa n C D 38 en su su p e rfic ie ce lu la r (T a b la 3; F ig u ra 2). S e m idió que la C D ⁵⁰ para los m ism o s d om in io s de proteína re co m b in a d o s en la o rien tación in ve rsa , a C D 38 s c F v : :S L T -1 A , fue de a p ro x im a d a m e n te 0 ,8 -3 ,2 nM (T a b la 3; F ig u ra 2). E sto dem ostró que la orientación m e jo ra d a del d iseñ o , don de la región de tipo inm u n o g lo b u lin a no se lo ca liza b a de form a próxim a al extrem o a m in o de la p roteína citotóxica en re lación con d ich a región efectora de la toxina S h ig a , confirió una m ejo ra en la citotoxicidad de a p ro x im a d a m e n te 4 -6 v e c e s h a c ia la s c é lu la s C D 38 (T a b la 3). E sto s re su ltad o s e jem p lifican el im pacto del efecto de "orientación de d iseño" tanto en la citotoxicidad com o en la citotoxicidad se le ctiva . L a s d ife re n c ia s en la e lim in a ció n ce lu la r de e sta s p ro te ín a s cito tó xicas no fueron p re d e cib le s en b a se a los re su ltad o s in v itro para la in a ctivac ió n de rib o so m a s o la s c a ra c te ríst ic a s de unión a c é lu la s d iana.

Tabla 3. Orientación del efecto de diseño en la citotoxicidad: C o n c e n tra c io n e s c itotóxicas se m im á x im a s re p re se n ta tiv a s ( C D ⁵⁰ ) para S L T -1 A : :a C D 38 -s c F v en co m p a ra c ió n con la o rientación in v e rsa a C D 38 -s c F v : :S L T - 1 A

D e te rm in a ció n de la in tern a liza ció n ce lu la r de S L T -1 A : :a C D 38 s c F v y su o rientación in v e rsa a C D 38 s c F v : :S L T - 1 A m ed ian te in m u n o flu o re sce n c ia

L a c a p a c id a d de la s p ro te ín a s cito tó xicas para entrar en la s c é lu la s d ia n a se investigó utilizando té c n ic a s in m u n o cito q u ím ica s e stá n d a r c o n o c id a s en la té cn ica . B revem en te, 0,8 x 106 c é lu la s de c a d a tipo de cé lu la (R a ji (C D 38 ), R a m o s ( C D 38 ), D a u d i (C D 38 ), B C -1 (C D 38 ) y U 266 (C D 38 -)) fueron re co g id a s y s u s p e n d id a s en 50 | jL de m edio de cultivo ce lu la r que co n te n ía un cóctel de in h ib id o res de la p ro tea sa (por e jem p lo, P 1860 S ig m a -A ld rich C o ., St. L o u is, M O, E E . U U .) y la prote ína d el recep to r F c h u m a n o p a ra re d u cir la tin ció n in m u n o flu o re sce n te no e s p e c ífic a . A co n tin u ació n , s e a ñ a d ie ro n 100 nM de la prote ína citotóxica a a n a liz a r a la s c é lu la s , y la s c é lu la s se in cu b a ro n a 37 ° C d urante 1 hora para perm itir qu e p ro g re sa ra la into xicación . A co ntinu ació n, la s c é lu la s s e "fijaron" y "permeabNizaron" utilizando el Kit Cytofix/Cytoperm ™ (BD Biosciences San Diego, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La región efectora de la toxina Shiga se "tiñó" usando un anticuerpo monoclonal de ratón (IgG anti-subunidad A de toxina Shiga 1 de ratón, BEI NR-867 BEI Refuentes, Manassas, VA, EE. UU.). La localización de anticuerpos monoclonales de ratón se detectó a continuación con el kit de etiquetado de anticuerpos monoclonales Alexa Fluor® 555 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En este ensayo, se observó la unión a la superficie celular y la internalización celular en células CD38 tanto para SLT-1A::aCD38scFv como para la proteína de orientación inversa aCD38scFv::SLT-1A. No se observó internalización celular para ninguna proteína a las células CD38. Esto demostró que las diferencias en la citotoxicidad (Tabla 3; Figura 2) entre estas dos variantes, que difieren solo en el orden relativo de su región de unión de tipo inmunoglobulina y la región efectora de la toxina Shiga, probablemente no estén relacionadas con ningún cambio significativo en la unión de la célula diana y/o entrada celular.

Determinación de los efectos in vivo de la proteína citotóxica aCD38scFv::SLT-1A utilizando modelos animales Se usan modelos animales para determinar los efectos in vivo de la proteína citotóxica aCD38scFv::SLT-1A en células neoplásicas CD38+ y/o inmunes. Se usan varias cepas de ratones para probar el efecto de la proteína citotóxica después de la administración intravenosa en tumores de xenoinjerto en ratones resultantes de la inyección en esos ratones de células neoplásicas humanas y/o inmunes humanas que expresan CD38 en sus superficies celulares.

Ejemplo 2. Una proteína citotóxica dirigida a HER2 derivada de la subunidad A de la toxina semejante a Shiga 1 (SLT-1A::aHER2scFv)

La proteína citotóxica de este ejemplo SLT-1A::aHER2scFv comprende un fragmento de subunidad de la toxina Shiga A recombinada con una región de unión de fragmento variable de cadena única capaz de unirse a HER2 con alta afinidad de modo que la región efectora de la toxina Shiga esté más próxima al extremo amino de la proteína citotóxica que la región de unión a HER2.

Construcción, producción y purificación de la proteína citotóxica SLT-1A::aHER2scFv

En este ejemplo, la región efectora de la toxina Shiga se derivó de la subunidad A de la Toxina semejante a Shiga 1 (SLT-1A). Se obtuvo un polinucleótido que codificaba los aminoácidos 1-251 de SLT-1A (Cheung M et al., Mol Cancer 9: 28 (2010)). Una región de unión de tipo inmunoglobulina es aHER2scFv derivado del anticuerpo monoclonal trastuzumab (comercializado como Herceptin®, Genentech, South San Francisco, CA) tal como se ha descrito (Zhao et al., J. Immunol 183: 5563-74, (2009)), de manera que un fragmento variable de cadena única (scFv) con las dos regiones variables de inmunoglobulina (V ^l y V ^h) separadas por un enlazador.

En este ejemplo, la región de unión de tipo inmunoglobulina y la región efectora de toxina Shiga se unieron entre sí para formar una proteína de fusión. En este ejemplo, un polinucleótido que codifica la región efectora de toxina Shiga de SLT-1A (aminoácidos 1-251 de SEQ ID NO: 1) se clonó en marco con un polinucleótido que codifica un enlazador tal como una "bisagra murina" derivada de un molécula de IgG3 murina u otros enlazador conocido por el experto y en marco con un polinucleótido que codifica la región de unión de tipo inmunoglobulina aHEr2scFv que comprende los aminoácidos 269-512 de SEQ ID NO: 8. En ciertos experimentos, la secuencia de codificación de longitud completa de la proteína citotóxica de este ejemplo comenzó con un polinucleótido que codifica un Streptag® para facilitar la detección y purificación. La secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína citotóxica SLT1A::aHER2scFv de este ejemplo se optimizó en codones para la expresión eficiente en E. coli utilizando servicios de DNA 2.0, Inc. (Menlo Park, CA, E ^e . UU.).

Se produjo una proteína de fusión expresando el polinucleótido que codifica la proteína citotóxica SLT-1A::aHER2scFv (SEQ ID NO: 8). La expresión de la proteína citotóxica SLT-1A::aHER2scFv se realizó usando un sistema bacteriano conocido en la técnica.

En este ejemplo de producción de SLT-1A::aHER2scFv mediante un sistema de expresión de E. coli, la secuencia de "inserto" de polinucleótido que codifica SLT-1A::aHER2scFv se clonó en el vector pTxb1 (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE. UU.) utilizando procedimientos estándar para producir una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína citotóxica SLT-1A::aHER2scFv ligada en el marco a secuencias de polinucleótidos que codifican la inteína amino terminal del vector. La secuencia de polinucleótidos del inserto de plásmido se verificó mediante secuenciación de Sanger (Functional Biosciences, Madison, WI, EE. UU.) y se transformó en las células T7 Shuffle® (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE. UU.). La proteína SLT-1A::aHER2scFv se produjo y purificó de acuerdo con el manual del sistema IMPACT™ (Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag) (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU.). La purificación se llevó a cabo utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como usando dianas inmovilizadas de Strep-tag® o la región de unión de tipo inmunoglobulina.

E n este e jem p lo de p rod ucción de S L T -1 A : :a H E R 2 s c F v m ed ian te un s iste m a de tra d u cció n de p ro te ín a s libre de c é lu la s , la s e c u e n c ia de “in serto ” de p o linu cleótid o qu e co d ifica S L T -1 A : :a H E R 2 s c F v s e c lonó en el v e cto r p IV E X 2.3 con un codón de term in ació n in m ed ia ta m en te d e sp u é s de la región de co d ifica ció n utilizando el kit de c lo n a ció n In-F u s io n ® H D (C lo n te ch , M ountain V iew , C A , E E .U U .) se g ú n la s in stru cc io n e s del fab ricante. L a s e c u e n c ia de polinucleótid o de inserto del p lásm id o fue v e rif ic a d a m ed ian te s e c u e n c ia c ió n de S a n g e r (Fu n ctio n a l B io s c ie n c e s, M ad ison , W I, E E .U U .). La proteína S L T -1 A : :a H E R 2 s c F v se produjo u sa n d o el s iste m a de trad u cción rá p id a del kit 5 P r im e ™ R T S 100 E. coli D isu lfid e (5 Prim e, G a ith e rsb u rg , M D, E e .U U .) se g ú n la s in stru cc io n e s del fab ricante. La purificació n s e llevó a cab o utilizando té c n ic a s e stá n d a r c o n o c id a s en la té cn ica , ta le s com o u sa n d o d ia n a s in m o v iliz a d a s de S tre p -ta g ® o la región de unión de tipo inm uno glo b ulina.

D e te rm in a ció n de la unión e s p e c íf ic a m áx im a (B m ax ) y co n stan te de equilib rio de unión (Kn) de S L T -1 A : :a H E R 2 s c F v a un tipo de c é lu la s d irig ida

L a s c a ra c te ríst ic a s de unión de la proteína S L T -1 A : :a H E R 2 s c F v prod ucida com o se d e scrib e anteriorm ente se d eterm inaron m ediante un e n sa yo de citom etría de flujo b a sa d o en f lu o re sce n c ia . L a s m u e stra s que contienen c é lu la s H E R 2 p o sitiv a s (+) y c é lu la s H E R 2 n e g a tiv a s (-) se su sp e n d ie ro n en so lu ció n s a lin a tam p o n ad a con fosfato ( IX P B S ) (H yc lo n e B rand, F is c h e r S cie n tific , W a lth a m , M A, E s ta d o s U n id o s) qu e co n te n ía 1 por ciento de al bú m ina de su ero bovino (B S A ) (C a lb io c h e m , S a n D iego, C A , E s ta d o s U n id os), en lo s u c e s iv o referido co m o “1 X P B S 1 % B S A ” y s e incubaro n d urante 1 hora a 4 ° C con 100 |j L de v a r ia s d ilu c io n e s de la proteína S L T -1 A : : a H E R 2 s c F V a a n a liz a r. L a s c o n ce n tra c io n e s m á s a ltas de proteína S L T -1 A : :a H E R 2 s c F v se se le c c io n a ro n para co n d u cir a la satu rac ió n de la re a cció n de unión. D e s p u é s de una hora de in cu b a ció n , la s m u e stra s c e lu la re s se lavaron dos v e c e s con 1 X P B S 1 % de B S A . L a s m u e stra s de c é lu la s s e in cub aro n d urante 1 hora a 4 ° C con 100 j L de 1 X P B S 1 % B S A que co n te n ía 0 ,3 j g de m A b -F IT C a S tre p -ta g ® (# A 01736 -100 , G e n scrip t, P isc a ta w a y, N J, E E . UU.). L a s m u e stra s c e lu la re s se lavaro n a co n tin u ació n d o s v e c e s con 1 X P B S 1 % B S A , s e re su sp e n d ie ro n en 200 |il de 1 X P B S y s e so m etiero n a citom etría de flujo b a s a d a en flu o re sc e n c ia . Lo s d atos de inten sid ad de flu o re sce n c ia m ed ia (M FI) para to d a s la s m u e stra s s e obtuvieron regulan d o los d ato s utilizand o una ú n ica m u estra de F I T C com o control negativo. L o s g rá fico s se rep resen taro n de M FI frente a "la co n cen trac ió n de la s cé lu las", utilizando el p rog ram a P rism (G ra p h P a d Softw are, S a n D iego, C A , E E .U U .). U tilizand o la función de softw are P rism de unión de un sitio [Y = B m a x * X /( K d X )] bajo el e n ca b e za m ie n to de unión de sa tu ra c ió n , s e ca lcu la ro n la B m a x y K d utilizand o d ato s co rre g id o s con la lín e a b a se . L o s v a lo re s de A b s s e co rrig iero n de la b a s e m e d ia n te la resta de los v a lo re s de A b s m ed id os para po cillo s que co n te n ía n so lo P B S . B m ax e s la unión e s p e c ífic a m áx im a d e scrita en M FI. Kn e s la co n stan te de unión en equilibrio e x p re sa d a en n a n o m o la r (nM).

L a Bmax para la unión de S L T -1 A : :a H E R 2 s c F v a c é lu la s H E R 2 se m idió qu e fue de a p ro x im a d a m e n te 230.000 M FI con una Kn de a p ro x im a d a m e n te 110 nM (T a b la 4). E ste resultad o fue s im ila r a la Bmax para la unión de la proteína de o rientación in v e rsa a H E R 2 s c F v : :S L T - 1 A a c é lu la s H E R 2 que se m idió que fue a p ro x im a d a m e n te 140.000 M FI con un a Kn de a p ro x im a d a m e n te 180 nM (T a b la 4). S e o b se rvó qu e n in g u n a p roteína p re se n ta b a un a unión m edible a c é lu la s n e g a tiv a s H E R - en este e n sa yo . E sto d em u estra qu e el efecto “orientación de d is e ñ o ” prob ab lem ente no está re lac io n ad o con una a lteració n de la s p ro p ie d ad e s de unión de la c é lu la d ia n a del d om inio d erivad o de inm uno glo b ulina.

Tabla 4. Orientación del diseño no tuvo efecto significativo en las características de unión: los v a lo re s re p re se n tativo s p a ra Bmax y Kn para S L T -1 A : :H E R 2 s c F v en co m p a ra c ió n con la orientación in v e rsa a H E R 2 s c F v : :S L T -1 A

D e te rm in a ció n de la co n cen trac ió n inhib idora s e m im á x im a (ICñn) de “S L T -1 A : :a H E R 2 s c F v para rib o so m a s de e u ca rio ta s in v itro

L a s c a p a c id a d e s de in a ctivació n de rib o so m a s de S L T -1 A : :H E R 2 s c F v se d eterm inaro n en un e n s a y o de trad u cción de p ro te ín a s in v itro s in c é lu la s u sa n d o el Kit de T ra n s c rip c ió n /T ra d u c c ió n A c o p la d o R á p id o T N T ® ( L 1170 P ro m e g a , M a d iso n , W I, E E . UU.). E l kit in c lu ye A D N de control de L u c ife ra sa T 7 y la m e z c la m ad re T N T ® Q u ic k . L a re a cció n de activ idad rib o só m ica se preparó de a cu e rd o con las in stru cc io n e s del fab rica n te para cre a r m e z c la s de re a cció n "TN T".

S e preparó una se rie de d ilu c io n e s de 10 v e c e s de S L T -1 A : :H E R 2 s c F v para a n a liz a r en el tam p ón ap ro p iad o y se creó una se rie de co m p o n e n te s de m e z c la de re a cció n T N T id én ticos para c a d a d ilución de S L T -1 A : :a H E R 2 s c F v . C a d a m u e stra en la se r ie de d ilución de la prote ína S L T -1 A : :H E R 2 s c F v s e com b in ó con c a d a una de las mezclas de reacción TNT junto con el ADN de control Luciferasa T7. Las muestras de prueba se incubaron durante 1,5 horas a 30 °C. Después de la incubación, se agregó el reactivo de ensayo de luciferasa (E1483 Promega, Madison, WI, EE. UU.) a todas las muestras de prueba y la cantidad de traducción de la proteína luciferasa se midió por luminiscencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel de inhibición traslacional se determinó mediante análisis de regresión no lineal de las concentraciones transformadas logarítmicamente de la proteína total frente a las unidades de luminiscencia relativas. Usando software estadístico (GraphPad Prism, San Diego, CA, EE.UU.), se calculó el valor de la concentración inhibidora semimáxima (IC⁵⁰) para cada muestra. A continuación, los datos se normalizaron mediante el cálculo del "porcentaje de proteína de control de SLT-1A sola" usando la función de software Prism de log (inhibidor) vs. respuesta (tres parámetros) [Y = Inferior ((superior-inferior)/(1 10 A (X-Log IC50)))] bajo el título de inhibición dosis-respuesta. Se calculó la IC⁵⁰ para las proteínas experimentales y la proteína de control con SLT-1A sola. El porcentaje de proteína de control con SLT-1A sola se calculó mediante [(IC50 de proteína de control SLT-1A/IC50 de proteína experimental) x 100].

El efecto inhibidor de SLT-1A::aHER2scFv sobre la síntesis de proteínas libre de células fue fuerte. Los experimentos de dependencia de la dosis determinaron que la IC⁵⁰ SLT-1A::aHER2scFv en la síntesis de proteínas en este ensayo sin células fue de aproximadamente 110 pM o dentro del 19% del control positivo solo con SLT-1A (Tabla 5). Este resultado no fue sustancialmente diferente de la IC⁵⁰ para la proteína de orientación inversa aHER2scFv::SLT-1A, que se midió que fue del 108% del control positivo con solo SLT-1A (Tabla 5). Esto muestra que el efecto de "orientación de diseño" probablemente no esté relacionado con ninguna alteración significativa de la actividad enzimática de la subunidad A de la toxina Shiga.

Tabla 5. Orientación del diseño no tuvo efecto significativo en la inactivación del ribosoma: concentración inhibidora semimáxima (IC⁵⁰) representativa de SLT-1A::aHER2-scFV en comparación con la orientación inversa aHER2-scFV::SLT-1A

Determinación de la citotoxicidad selectiva y la concentración citotóxica semimáxima (CP5n) de SLT-1A::aHER2scFv utilizando un ensayo de eliminación de células

Las características de citotoxicidad de SLT-1A::aHER2scFv se determinaron mediante el siguiente ensayo de eliminación celular. Este ensayo determina la capacidad de una proteína citotóxica para eliminar las células que expresan la biomolécula diana de su región de unión de tipo inmunoglobulina en comparación con células que no expresan la biomolécula diana. Las células se sembraron (2 x 103 células por pocillo) en 20 |i l de medio en placas de 384 pocillos. La proteína SLT-1A::aHER2scFv se diluyó 5 veces o 10 veces en 1X PBS y se añadieron 5 |i l de las diluciones a las células. Los pocillos de control que contenían sólo medio se utilizaron para la corrección de la línea base. Las muestras de células se incubaron con SLT-1A::aHER2scFv o simplemente tampón, durante 3 días a 37°C y en una atmósfera de 5% de dióxido de carbono (CO² ). La supervivencia total de las células o porcentaje de viabilidad se determinaron utilizando una lectura luminiscente utilizando el ensayo de viabilidad CellTiter-Glo® Luminescent Cell (G7573 Promega Madison, WI, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. El porcentaje de viabilidad de los pocillos experimentales se calculó usando la siguiente ecuación: (RLU de prueba - RLU media promedio)/(RLU de células promedio - RLU media promedio) * 100. La concentración de polipéptido en forma log frente al porcentaje de viabilidad se representó en Prism (GraphPad Prism, San Diego, CA, EE.UU.) y se utilizó el análisis de log (inhibidor) vs. respuesta normalizada (pendiente variable) para determinar el valor de concentración citotóxica semimáxima (CD⁵⁰) para SLT-1A::aHER2scFv.

Los experimentos de dependencia de la dosis determinaron que la CD⁵⁰ de la proteína SLT-1A::aHER2scFv fue de aproximadamente 0,07 nM para las células HER2+ (Tabla 6; figura 3). La CD⁵⁰ para los mismos dominios de proteína recombinados en la orientación inversa aHER2scFv::SLT-1A se midió que fue de aproximadamente 0,64 (tabla 6; figura 3). Los resultados para la línea celular HER2- MDA-MB468 fueron ambiguos porque las curvas correctas no se pudieron ajustar a los datos. Los resultados en la tabal 6 y la figura 3 ejemplifican el impacto de la “orientación de diseño” en la citotoxicidad. Las diferencias en la eliminación celular para estas proteínas citotóxicas no eran predicibles en base a los resultados in vitro para la inactivación de ribosoma o las características de unión a células diana.

Tabla 6. La orientación del diseño afecta la citotoxicidad: Concentraciones citotóxicas semimáximas representativas (CD⁵⁰) para SLT-1A::aHER2scFv en comparación con la orientación inversa aHER2scFv::SLT-1A

D e te rm in a ció n de la in te rn a liza ció n c e lu la r de S L T -1 A : : a C D H E R 2 s c F v y su o rien tación in v e rsa a H E R 2 s c F v : :S L T - 1 A m ed ian te in m u n o flu o re sce n c ia

L a c a p a c id a d de la s prote ínas cito tó xicas para entrar en la s c é lu la s d ia n a s e investigó u sa n d o té c n ic a s in m u n o cito q u ím ica s e stá n d a r c o n o cid a s en la té cn ica . E n re su m e n , se recogieron 0,8 x 106 c é lu la s de c a d a tipo de c é lu la ( S K B R 3 ( H E R 2 ) y M D A -M B -231 ( H E R 2 -) ) y s e su sp e n d ie ro n en 50 |j L de m edio de cultivo ce lu la r que co n te n ía un cóctel de in h ib id o re s de la proteasa (por ejem p lo , P 1860 S ig m a -A ld ric h C o ., St. Lo u is, M O, E E . U U .) y la proteína del recepto r F c h u m ano para re d u cir la tinción in m u n o flu orescen te no e sp e c ífic a . A co ntinu ació n, se a ñ a d ie ro n 100 nM de la p roteína citotóxica a a n a liz a r a la s c é lu la s , y la s c é lu la s s e in cu b a ro n a 37 ° C d urante 1 hora p a ra perm itir que p ro g re sa ra la in toxicación . A co ntinu ació n, la s c é lu la s s e "fijaron" y "p erm ea b iliza ro n " utilizando el Kit C y to fix /C y to p e rm ™ (B D B io s c ie n c e s S a n D iego, C A , E E . U U .) de a cu e rd o con la s in stru cc io n e s del fab ricante. La región efectora de la toxina S h ig a s e "tiñó" u sa n d o un a n ticu erp o m o n o clo n al de ratón (Ig G de ratón a n ti-su b u n id a d a de toxina S h ig a 1, B E I N R -867 B E I R e fu en tes, M a n a s s a s , V A , E E . U U .). La lo calizac ió n de a n ticu erp o s m o n o clo n a le s de ratón s e detectó a con tin u ació n con el kit de etiq uetado de a n ticu e rp o s m o n o clo n a le s A le x a F lu o r® 555 (Life T e c h n o lo g ie s , C a r lsb a d , C A , E E . U U .) de a cu e rd o con la s in stru cc io n e s del fab ricante.

E n este e n sa yo , se o b servó unión a la su p e rfic ie ce lu la r y la in te rn a liza ció n ce lu la r en c é lu la s H E R 2 tanto para S L T -1 A : :a H E R 2 s c F v y la p roteína de o rientación in v e rsa a H E R 2 s c F v : :S L T - 1 A (F ig u ra 4). No s e observó in te rn a liza ció n ce lu la r para n in g u n a proteína a la s c é lu la s H E R 2. Esto m u estra la s d ife re n c ia s en la citotoxicidad (T a b la 6; F ig u ra 3) entre e sta s d os v a ria n te s de p ro te ín a s cito tó xicas que difieren solo en el orden relativo de su región de unión de tipo in m u n o g lo b u lin a y la región efectora de la toxina S h ig a p rob ab lem en te no estuvo re la c io n a d a con n ingún c a m b io sign ificativo en la unión a la c é lu la d ia n a y/o entrad a celular.

D e te rm in a ció n de los efecto s in v ivo de la proteína citotóxica a H E R 2 s c F v : : S L T - 1 A utilizando m o d elo s a n im a le s S e u san m o d elo s a n im a le s para d eterm in ar los efectos in v ivo de la proteína citotóxica a H E R 2 s c F v : :S L T - 1 A en c é lu la s n e o p lá s ic a s H E R 2 . S e u sa n v a r ia s c e p a s de raton es para p rob ar el efecto de la p roteína citotóxica d e sp u é s de la ad m in istra c ió n in tra ve n o sa en tu m o res de xenoin jerto en raton es resu ltan te s de la in ye cció n en e s o s ratones de c é lu la s n e o p lá s ic a s h u m a n a s qu e e x p re sa n H E R 2 en s u s su p e rfic ie s c e lu la re s.

Ejemplo 3. Una proteína citotóxica dirigida a CD19 derivada de la subunidad A de la toxina semejante a Shiga 1 (SLT-1A::aCD19scFv)

L a proteína citotóxica de este e jem p lo S L T -1 A : :a C D 19 s c F v co m p ren d e un fragm ento de su b u n id a d A de toxina S h ig a reco m b in ad o con una región de unión de fragm ento v a ria b le de c a d e n a ún ica c a p a z de un irse a C D 19 con alta afin id ad de m odo q u e la región efectora de la toxina S h ig a e stá m á s próxim aa al extrem o am ino de la proteína citotóxica que la región de unión a C D 19.

C o n stru cc ió n , prod ucció n y purificació n de la proteína citotóxica S L T -1 A : :a C D 19 s c F v

E n este e jem p lo , la región efectora de la toxina S h ig a s e d erivó de la su b u n id a d A de la T o x in a s e m e ja n te a S h ig a 1 ( S L T -1 A ) . S e obtuvo un polinucleótido qu e co d ifica b a los a m in o á c id o s 1 -251 de S L T - 1 A (C h e u n g M et al., Mol C a n c e r 9: 28 (2010 ). U n a región de unión de tipo in m un o g lo b ulin a a C D 19 s c F v s e d erivó del a n ticu erp o m o n o clo n al h u m a n iza d o a n t i-C D 19 4 G 7 (P e ip p M et al., J Im m un ol M ethods 285 : 265 -80 (2004 ) y re fe re n c ia s en la m ism a ) de m odo qu e s e c re a un fragm en to v a ria b le de c a d e n a ú n ica (s c F v ) con la s d o s re g io n e s v a r ia b le s de in m u n o g lo b u lin a ( V l y V h) s e p a ra d a s por un e n la z a d o r co n o cid o en la té cn ica .

L a región de unión y la región efectora de la toxina S h ig a s e unieron para fo rm ar una proteína de fusión. E n este e jem p lo , un polinu cleó tid o qu e co d ifica la región efecto ra de la toxina S h ig a de S L T - 1 A (a m in o á c id o s 1 - 251 de S E Q iD N O : 1 ) se clonó en el m arco con un polinucleótido que co d ifica un en laza d o r, tal com o una "b isag ra m urina" d e riv a d a de un m o lé cu la de Ig G 3 m urina (y otros e n la z a d o re s co n o cid o s por el experto) y en m arco con un polinucleótido que co difica la región de unión de tipo in m un o g lo b ulin a a C D 19 s c F v que co m p ren d e los a m in o á cid o s 26 9 -516 de S E Q ID N O : 12. L a s e c u e n c ia de p o lin u cleó tid o s qu e co d ifica la prote ína citotóxica S L T -1 A : :a C D 19 s c F v de este e je m p lo s e optim izó en c o d o n e s p a ra u n a e x p re s ió n efic iente en E. coli utilizand o se rv ic io s de D N A 2.0 , Inc. (M enlo P a rk, C A , E E . UU.).

S e produjo una p roteína de fusión e x p re sa n d o el po linucleótid o qu e co d ifica la p roteína citotóxica S L T -1 A : :a C D 19 s c F v ( S E Q ID N O : 12 ) . La ex p resió n de la proteína citotóxica S L T -1 A : :a C D 19 s c F v se realizó u sa n d o un s iste m a b acterian o co n o cid o en la té cn ica .

E n este e jem p lo de p rod ucción de S L T -1 A : :a C D 19 s c F v m e d ia n te un s iste m a de e x p resió n de E. coli, la s e c u e n c ia de " in serción" p o lin u cle o tíd ica qu e co d ifica S L T - 1 A : : a C D 19 s c F v s e c lonó en el vecto r p T x b l (N ew E n g la n d B io lab s, Ip sw ich, M A, E E . U U .) utilizando p roced im ien to s e stá n d a r para p rod ucir un a s e c u e n c ia de polinu cleó tid os que co d ifica la proteína citotóxica S L T -1 A : :a C D 19 s c F v lig a d a en m arco a s e c u e n c ia s de po linu cleó tid os qu e co d ifica n la in te ín a am in o term in al del vector. L a s e c u e n c ia de polinu cleó tid os del inserto de p lásm id o s e verificó m ediante se c u e n c ia c ió n de S a n g e r (F u n ctio n a l B io s c ie n c e s , M adison , W I, E E . U U .) y s e transform ó en c é lu la s T 7 S h u ffle ® (N ew E n g la n d B io la b s, Ip sw ich, M A, E E . U U .). L a p roteína S L T - 1 A : : a C D 19 s c F v s e produjo y purificó de a cu e rd o con el m a n u a l del s iste m a IM P A C T ™ (P u rifica c ió n m e d ia d a por in te ín a con un a etiq ueta de unión a q u itina de afin id ad ) (N ew E n g la n d B io la b s, Ip sw ich, MA, E E . U U .). La purificació n s e re a lizó utilizand o té c n ic a s e stá n d a r c o n o c id a s en el sector, tal com o la cro m ato g rafía de afin idad.

D e te rm in a ció n de la co n cen trac ió n inhibitoria se m im á x im a (ICsn) de S L T -1 A : :a C D 19 s c F v a rib o so m a s e u ca rio ta s in v itro

L a s c a p a c id a d e s de in a ctivac ió n de r ib o so m a s de S L T -1 A : : a C D 19 s c F v s e d eterm in aro n en un e n s a y o de tra d u cció n de p ro te ín a s in v itro s in c é lu la s u sa n d o el Kit de T ra n s c r ip c ió n /T ra d u c c ió n A c o p la d o R á p id o T N T ® ( L 1170 P ro m e g a, M a d iso n , W I, E E . UU.). E l kit in c lu ye A D N de control de L u c ife ra s a T 7 y la m e z c la m ad re T N T ® Q u ick . L a re a cció n de activ idad rib o só m ica se preparó de a cu e rd o con las in stru cc io n e s del fab rica n te para cre a r m e z c la s de re a cció n "TN T".

S e preparó una se rie de d ilu c io n e s de 10 v e c e s de S L T -1 A : : a C D 19 s c F v para a n a liz a r en el tam p ón ap ro p iad o y se creó una se rie de co m p o n e n te s de m e z c la de re a cció n T N T id én tico s para c a d a d ilución de S L T -1 A : :a C D 19 s c F v . C a d a m u estra en la se rie de d ilución de la p roteína S L T -1 A : :a C D 19 s c F v se co m b in ó con ca d a una de la s m e z c la s de re a cció n T N T junto con el A D N de control L u c ife ra s a T 7. L a s m u e stra s de p rueb a s e incubaron durante 1,5 h o ras a 30 °C . D e s p u é s de la in cu b a ció n , se ag reg ó el reactivo de e n sa yo de lu cife ra sa ( E 1483 P ro m e g a , M a d iso n , W I, E E . U U .) a to d a s la s m u e stra s de prueb a y la can tid ad de tra d u cció n de la proteína lu c ife ra sa se m idió por lu m in isc e n c ia de a cu e rd o con la s in stru cc io n e s del fab ricante. E l nivel de inhibición tra s la c io n a l s e determ inó m ed ian te a n á lis is de regresió n no lineal de la s co n ce n tra c io n e s tra n sfo rm a d a s lo g a rítm icam e n te de la proteína total frente a la s u n id a d e s de lu m in isc e n c ia re lativas. U sa n d o softw are e sta d ístico (G ra p h P a d P rism , S a n D iego , C A , E E .U U .), se ca lcu ló el v a lo r de la co n cen trac ió n inhibidora se m im á x im a (ICsn) para c a d a m uestra.

E l efecto inh ib idor de S L T -1 A : :a C D 19 s c F v so b re la s ín te s is de p ro te ín a s libre de c é lu la s fue fuerte. Lo s e x p erim en tos de d e p e n d e n c ia de la d o sis d eterm inaron qu e la IC ⁵⁰ S L T -1 A : :a C D 19 s c F v en la s ín te s is de prote ín as en este e n s a y o sin c é lu la s fue de a p ro x im a d a m e n te 5 ,2 pM (T a b la 7). E ste resultad o no fue su sta n cia lm e n te d iferente de la IC ⁵⁰ para la proteína de o rientación in v e rsa a C D 19 s c F v : :S L T - 1 A , que s e m idió que fue de a p ro x im a d a m e n te 3.2 pM o e q u iva le n te del control positivo con so lo S L T - 1 A (T a b la 7). E sto m u estra qu e el efecto de "orientación de d iseño" prob ab lem ente no esté re lac io n ad o con n in g u n a a lteració n s ig n ificativa de la activ idad e n z im á tica de la su b u n id a d A de la toxina S h ig a .

Tabla 7. Orientación del diseño no tuvo efecto significativo en la inactivación del ribosoma: co n cen tració n inh ib ido ra s e m im á x im a ( IC ⁵⁰) rep resen tativa de S L T - 1 A : : a C D 19 - s c F V en co m p a ra c ió n con la o rientación in ve rsa a C D 19 - s c F V : : S L T - 1 A

D e te rm in a ció n de la citotoxicid ad s e le c t iv a y la co n cen trac ió n citotóxica se m im á x im a ( C D sq) de S L T -1 A : : a C D 19 s c F v utilizando un e n s a y o de e lim in a ció n ce lu la r

L a s c a ra c te ríst ic a s de citotoxicidad de S L T -1 A : :a C D 19 s c F v se d eterm inaron m ed ian te el s igu ien te e n s a y o de e lim in a ció n ce lu lar. E s te e n s a y o d e te rm in a la c a p a c id a d de un a prote ína citotóxica para m ata r c é lu la s qu e e x p re sa n la b io m o lé cu la d ia n a de su región de unión de tipo in m u n o g lo b u lin a en co m p a ra c ió n con la s c é lu la s qu e no e x p re sa n la b io m o lé cu la d ian a. L a s c é lu la s s e co lo ca ro n en p la c a s (2 x 103 c é lu la s por pocillo) en 20 pl de m edio de cultivo ce lu la r en p la c a s de 384 pocillos. La proteína S L T -1 A : :a C D 19 s c F v se d iluyó 10 v e c e s en tam p ón y se a ñ ad ie ro n 5 p L d e la s d ilu c io n e s a la s c é lu la s . L o s p o cillo s de control qu e co n te n ía n so lo m ed io de cultivo ce lu la r s e u sa ro n para la co rre cció n b a sa l. L a s m u e stra s de c é lu la s s e in cu b a ro n con S L T -1 A : :a C D 19 s c F v , o s im p le m e n te tam p ón , d urante 3 d ía s a 37 ° C y en una atm ó sfera de 5 % de C O ². La s u p e rv iv e n c ia ce lu la r total o el p orcentaje de v ia b ilid a d se determ inó u sa n d o una lectura lu m in isce n te u sa n d o el e n s a y o de v ia b ilid a d ce lu la r lu m in isce n te C e llT it e r -G lo ® ( G 7573 P ro m e g a M ad ison , W I, E E . U U .) de a cu e rd o con la s in stru cc io n e s del fab ricante. E l p o rcen taje de v iab ilid a d de los po cillo s e x p e rim e n ta le s s e c a lcu ló utilizando la s ig u ie n te e cu a ció n : (R L U de prueb a - R L U m ed ia p ro m e d io )/(R LU de c é lu la s prom edio - R L U m ed ia prom edio) * 100. La co n cen trac ió n de polipéptido en form a log frente al po rcentaje de v ia b ilid a d s e rep resen tó en P rism (G ra p h P a d P rism , S a n D iego , C A , E E .U U .) y s e utilizó el a n á lis is de log (inhibidor) vs. re sp u e sta (tres p a rám etros) para d eterm in ar el v a lo r de co n cen tració n citotóxica se m im á x im a ( C D ⁵⁰ ) para S L T -1 A : :a C D 19 -s c F V .

L o s e x p erim en tos de d e p e n d e n c ia de la d o sis d eterm inaron que la C D ⁵⁰ de la proteína S L T -1 A : :a C D 19 s c F v era de a p ro x im a d a m e n te 0 ,28 nM para la s c é lu la s D a u d i C D 19 (T a b la 8; F ig u ra 5). La C D ⁵⁰ para el control negativo de S L T - 1 A so lo y los m ism o s d o m in io s de p ro te ín a s re co m b in a d o s en la o rientación in ve rsa , a C D 19 s c F v : :S L T - 1 A , no p u diero n m e d irse con p re cis ió n en función d e la form a de la cu rva . L a C D ⁵⁰ de S L T -1 A : : a C D 19 s c F v para la s c é lu la s U 266 n e g a tiv a s para C D 19 no se pudo c a lc u la r d ebido a la form a de la cu rva ; e sta s c é lu la s no están fís ica m e n te a c o p la d a s con la b io m olécu la d ia n a e x tra ce lu la r C D 19. E sto s re su ltad o s m ostraron que una o rientación e s p e c ífic a de la in g e n ie ría de prote ínas, donde la región de tipo in m un o g lo b ulin a no e sta b a u b ica d a de form a próxim a al extrem o am in o de la p roteína citotóxica en re lació n con d ich a región efectora de toxina S h ig a , confirió un a m ejo ra en la citotoxicidad h a c ia la s c é lu la s C D 19 (T a b la 8; F ig u ra 5). L a s d ife re n c ia s en la e lim in a ció n de c é lu la s para e sta s p ro te ín a s c ito tó xicas no fueron p re d e c ib le s en función de los re su lta d o s in v itro p a ra la in a ctivac ió n de los rib o so m a s y no s e e sp e ra qu e se a n p re d e c ib le s en función de la s c a ra c te ríst ic a s de unión a la s c é lu la s d iana.

Tabla 8. La orientación de diseño afectó a la citotoxicidad: C o n c e n tra c io n e s cito tó xicas se m im á x im a s re p re se n ta tiv a s ( C D ⁵⁰ ) de S L T - 1 A : : a C D 19 - s c F V en co m p a ra c ió n con la o rientación in v e rsa a C D 19 - s c F V : : S L T - 1 A

D e te rm in a ció n de los efecto s in v ivo de la proteína citotóxica S L T -1 A : : a C D 19 s c F v utilizando m o d elo s a n im a le s L o s m o d elo s a n im a le s s e u sa n para d e te rm in a r los efecto s in v ivo de la proteína citotóxica S L T -1 A : : a C D 19 s c F v en c é lu la s n e o p lá s ic a s y /o in m u n es. S e u sa n v a r ia s c e p a s de raton es para p rob ar el efecto de la proteína citotóxica d e sp u é s de la ad m in istra c ió n in tra v e n o sa en tu m o res de x enoin jerto en raton es re su ltan tes de la in ye cció n en e so s raton es de c é lu la s n e o p lá s ic a s h u m a n a s y/o in m u n e s h u m a n a s qu e e x p re sa n C D 19 en s u s su p e rfic ie s ce lu la re s. E je m p lo 4. U n a proteína citotóxica d irig ida a C D 74 d e riva d a de la su b u n id a d A de la toxina se m e ja n te a S h ig a 1 ( S L T -1 A : :a C D 74 s c F v )

L a proteína citotóxica de este e jem p lo S L T -1 A : :a C D 74 s c F v co m p ren d e un fragm ento de su b u n id a d A de toxina S h ig a A reco m b in ad o con un a región de unión de fragm ento v a ria b le de c a d e n a ún ica c a p a z de u n irse a C D 74 con alta afin id ad de m odo que la región efectora de la toxina S h ig a esté m á s próxim a al extrem o am in o de la proteína citotóxica que la región de unión a C D 74.

C o n stru cc ió n , prod ucció n y purificació n de la proteína citotóxica S L T -1 A : :a C D 74 s c F v

E n e ste e jem p lo , la región efecto ra de la toxina S h ig a s e d erivó de la su b u n id a d A de la T o x in a s e m e ja n te a S h ig a 1 ( S L T -1 A ) . S e obtuvo un polinucleótido qu e co d ifica b a los a m in o á c id o s 1 -251 de S L T - 1 A (C h e u n g M et al., Mol C a n c e r 9: 28 (2010 ). U n a región de unión de tipo in m u n o g lo b u lin a a C D 74 s c F v s e obtuvo del an ticu e rp o m o n o clo n al h u m a n iza d o a n t i-C D 74 , M ilatu zu m ab (S a p ra P et al., C lin C a n c e r R e s 11 : 5257 -64 (2005 ) y s u s re fe re n c ia s) de m odo qu e s e c re a un fragm en to v a ria b le de c a d e n a ú n ica (s c F v ) con la s d o s re g io n e s v a r ia b le s de in m u n o g lo b u lin a ( V l y V h) s e p a ra d a s por un e n la z a d o r co n o cid o en la té cn ica .

L a región de unión y la región efectora de la toxina S h ig a s e unieron para fo rm ar una proteína de fusión. E n este e jem p lo , un po lin u cleó tid o q u e co d ifica la región efecto ra d e la to xin a S h ig a de S L T - 1 A (a m in o á c id o s 1 - 251 de S E Q iD N O : 1 ) se clonó en el m arco con un polinucleótido que co d ifica un en laza d o r, tal com o una "b isag ra m urina" d e riv a d a de un m o lé cu la de Ig G 3 m urina (y otros e n la z a d o re s co n o cid o s por el experto) y en m arco con un polinucleótido que co difica la región de unión de tipo in m un o g lo b ulin a a C D 74 s c F v que co m p ren d e los a m in o á cid o s 26 9 -518 de la S E Q ID N O : 16. L a s e c u e n c ia de polinu cleó tid os qu e co d ifica la proteína citotóxica S L T -1 A : :a C D 74 s c F v de este e jem p lo se optim izó en c o d o n e s para la e x p re sió n efic ien te en E. coli utilizand o los s e rv ic io s de D N A 2.0 , Inc. (M enlo P a rk, C A , E E . UU.).

S e produjo una p roteína de fusión e x p re sa n d o el po linucleótid o qu e co d ifica la p roteína citotóxica S L T -1 A : :a C D 74 s c F v ( S E Q ID N O : 16 ). La ex p resió n de la proteína citotóxica S L T -1 A : :a C D 74 s c F v se realizó u sa n d o un s iste m a b acterian o co n o cid o en la té cn ica .

E n este e jem p lo de p rod ucción de S L T -1 A : :a C D 74 s c F v m ed ian te un s iste m a de e x p resió n de E. coli, la se c u e n c ia de " in serción" p o lin u cle o tíd ica qu e co d ifica S L T -1 A : :a C D 74 s c F v s e c lonó en el vecto r p T x b l (N ew E n g la n d B io lab s, Ip sw ich, M A, U S ) u sa n d o p roced im ien to s e stá n d a r para prod ucir un a s e c u e n c ia de polinu cleó tid os que co d ifica la proteína citotóxica S L T -1 A : :a C D 74 s c F v lig ad a en m arco a s e c u e n c ia s de polinu cleó tid os qu e co d ifican la inteína a m in o term in al del vector. L a s e c u e n c ia de po linu cleó tid os del inserto de p lásm id o se verificó m ediante se c u e n c ia c ió n de S a n g e r (F u n ctio n a l B io s c ie n c e s , M adison , W I, E E . U U .) y s e transform ó en c é lu la s T 7 S h u ffle ® (N ew E n g la n d B io la b s, Ipsw ich, M A, E E . U U .). L a p roteína S L T -1 A : :a C D 74 s c F v s e produjo y purificó de a cu e rd o con el m a n u a l del s iste m a IM P A C T ™ (P u rifica c ió n m e d ia d a por in te ín a con un a etiq ueta de unión a q u itina de afin id ad ) (N ew E n g la n d B io la b s, Ip sw ich, MA, E E . U U .). La purificació n s e re a lizó utilizand o té c n ic a s e s tá n d a r c o n o c id a s en el sector, tal com o la cro m ato g rafía de afin idad.

D e te rm in a ció n de la co n cen trac ió n inhibitoria se m im á x im a (ICsn) de S L T -1 A : :a C D 74 s c F v a rib o so m a s e u ca rio ta s in v itro

L a s c a p a c id a d e s de in a ctivac ió n de r ib o so m a s de S L T -1 A : :a C D 74 s c F v s e d eterm in aro n en un e n s a y o de tra d u cció n de p ro te ín a s in v itro s in c é lu la s u sa n d o el Kit de T ra n s c rip c ió n /T ra d u c c ió n A c o p la d o R á p id o T N T ® ( L 1170 P ro m e g a , M a d iso n , W I, E E . UU.). E l kit in c lu ye A D N de control de L u c ife ra sa T 7 y la m e z c la m ad re T N T ® Q u ic k . L a re a cció n de activ idad rib o só m ica se preparó de a cu e rd o con las in stru cc io n e s del fab rica n te para cre a r m e z c la s de re a cció n "TN T".

S e preparó una se rie de d ilu c io n e s de 10 v e c e s de S L T -1 A : :a C D 74 s c F v para a n a liz a r en el tam p ón ap ro p iad o y se creó una se rie de co m p o n e n te s de m e z c la de re a cció n T N T id én ticos para c a d a d ilución de S L T -1 A : :a C D 19 s c F v . C a d a m u estra en la se rie de d ilución de la p roteína S L T -1 A : :a C D 74 s c F v se co m b in ó con ca d a una de la s m e z c la s de re a cció n T N T junto con el A D N de control L u c ife ra sa T 7. L a s m u e stra s de p rueb a s e incubaron durante 1,5 h o ras a 30 °C . D e s p u é s de la in cu b a ció n , se ag reg ó el reactivo de e n sa yo de lu cife ra sa ( E 1483 P ro m e g a , M a d iso n , W I, E E . U U .) a to d a s la s m u e stra s de prueb a y la can tid ad de tra d u cció n de la proteína lu c ife ra sa se m idió por lu m in isc e n c ia de a cu e rd o con la s in stru cc io n e s del fab ricante. E l nivel de inhibición tra s la c io n a l s e determ inó m ed ian te a n á lis is de regresió n no lineal de la s co n ce n tra c io n e s tra n sfo rm a d a s lo g a rítm icam e n te de la proteína total frente a la s u n id a d e s de lu m in isc e n c ia re lativas. U sa n d o softw are e sta d ístico (G ra p h P a d P rism , S a n D iego , C A , E E .U U .), se ca lcu ló el v a lo r de la co n cen trac ió n inhibidora se m im á x im a (ICsn) para c a d a m uestra.

E l efecto inhibidor de S L T -1 A : :a C D 74 s c F v so b re la s ín te s is de prote ín as libre de c é lu la s fue fuerte. Lo s e x p erim en tos de d e p e n d e n c ia de la d o sis d eterm inaron qu e la IC ⁵⁰ S L T -1 A : :a C D 74 s c F v en la s ín te s is de prote ín as en este e n s a y o sin c é lu la s fue de a p ro x im a d a m e n te 8 ,7 pM (T a b la 9). E ste resultad o no fue su sta n cia lm e n te d iferente de la IC ⁵⁰ para la proteína de o rientación in v e rsa a C D 74 s c F v : :S L T -1 A , que s e m idió que fue de a p ro x im a d a m e n te 3 ,6 pM o e q u iva le n te del control positivo con so lo S L T - 1 A (T a b la 9). E sto m u estra qu e el efecto de "orientación de d iseño" prob ab lem ente no esté re lac io n ad o con n in g u n a a lteración s ig n ificativa de la activ idad e n z im á tica de la su b u n id a d A de la toxina S h ig a .

Tabla 9. Orientación del diseño no tuvo efecto significativo en la inactivación del ribosoma: co n cen tració n inh ib ido ra s e m im á x im a ( IC ⁵⁰) rep resen tativa de S L T -1 A : :a C D 74 -s c F V en co m p a ra c ió n con la o rientación in ve rsa a C D 74 - s c F V : : S L T - 1 A

D e te rm in a ció n de la citotoxicid ad s e le c t iv a y la co n cen trac ió n citotóxica se m im á x im a ( C D sq) de S L T -1 A : :a C D 74 s c F v utilizand o un e n s a y o de e lim in a ció n ce lu la r

L a s c a ra c te ríst ic a s de citotoxicidad de S L T -1 A : :a C D 74 s c F v se d eterm inaron m ed ian te el s igu ien te e n s a y o de e lim in a ció n ce lu lar. E s te e n s a y o d e te rm in a la c a p a c id a d de un a prote ína citotóxica p a ra m ata r c é lu la s qu e e x p re sa n la b io m o lé cu la d ia n a de su región de unión de tipo inm u n o g lo b u lin a en co m p a ra c ió n con la p roteína S L T - 1 A que no p o se e la región de unión. L a s c é lu la s se co lo caro n en p la c a s (2 x 103 c é lu la s por pocillo) en 20 pl de m edio de cultivo ce lu la r en p la c a s de 384 pocillos. La proteína S L T -1 A : :a C D 74 s c F v se d iluyó 10 v e c e s en tam pón y se a ñ a d ie ro n 5 p L de la s d ilu c io n e s a la s c é lu la s . L o s p o cillo s de control q u e co n te n ía n so lo m ed io de cultivo c e lu la r se u sa ro n para la co rrecció n b a sa l. L a s m u e stra s de c é lu la s s e incubaron con S L T -1 A : :a C D 74 s c F v , o sim p le m e n te tam pón, d urante 3 d ía s a 37 ° C y en una atm ó sfera de 5 % de C O ². La s u p e rv iv e n c ia c e lu la r total o el p orcentaje de v ia b ilid a d se determ inó u sa n d o una lectura lu m in isce n te u sa n d o el e n sa y o de v ia b ilid a d ce lu la r lu m in iscen te C e llT it e r -G lo ® ( G 7573 P ro m e g a M ad ison , W I, E E . U U .) de a cu e rd o con la s in stru cc io n e s del fab ricante. E l po rcentaje de v iab ilid a d de los pocillos e x p e rim e n tale s se ca lcu ló utilizando la s ig u ie n te e c u a c ió n (R L U de prueba -R L U m e d ia p ro m e d io )/(R L U de c é lu la s prom edio - R L U m ed ia prom edio) * 100. La co n cen trac ió n de polipéptido en form a log frente al p o rcen taje de v ia b ilid a d s e rep resen tó en P rism (G ra p h P a d P rism , S a n D iego, C A , E E .U U .) y se utilizó el análisis de log (inhibidor) vs. respuesta (tres parámetros) para determinar el valor de la concentración citotóxica semimáxima (CD⁵⁰) para SLT-1A::aCD74scFv.

Los experimentos de dependencia de la dosis determinaron que la CD⁵⁰ de la proteína SLT-1A::aCD74scFv fue de aproximadamente 18,7 nM para las células Daudi CD74+ (Tabla 10; figura 6). La CD⁵⁰ para el control negativo solo con SLT-1A fue de 2026 nM y los mismos dominios de proteína recombinados en la orientación inversa aCD74scFv::SLT-1A se midió que fue de 95,3 (tabla 10; figura 6). Esto demostró que una orientación particular del diseño de proteínas citotóxicas, donde la región de tipo inmunoglobulina no estaba ubicada de manera próxima al extremo amino de la proteína citotóxica en relación con dicha región efectora de toxina Shiga, confirió una mejora en la citotoxicidad hacia las células CD74+. Las diferencias en la eliminación celular para estas proteínas citotóxicas no fueron predecibles en base a los resultados in vitro para la inhibición de la síntesis de proteínas y no se espera que sean predecibles en base a las características de unión a las células diana.

Tabla 10. La orientación del diseño afecta la citotoxicidad: Concentraciones citotóxicas semimáximas representativas (CD⁵⁰) para SLT-1A::aCD74scFv en comparación con la orientación inversa aCD74scFv::SLT-1A

Determinación de los efectos in vivo de la proteína citotóxica SLT-1A::aCD74scFv utilizando modelos animales Se usan modelos animales para determinar los efectos in vivo de la proteína citotóxica SLT-1A::aCD74scFv en células neoplásicas CD74+ y/o inmunes. Se usan varias cepas de ratones para probar el efecto de la proteína citotóxica después de la administración intravenosa en tumores de xenoinjerto en ratones que resultan de la inyección en esos ratones de células neoplásicas humanas y/o inmunes humanas que expresan CD74 en sus superficies celulares.

Resumen

Cuando se probaron cuatro proteínas citotóxicas diferentes que comprendían regiones derivadas de la subunidad A de la toxina Shiga y regiones de reconocimiento derivadas de inmunoglobulina en sus extremos amino terminales, estas proteínas no mostraron la citotoxicidad esperada predicha por sus características in vitro de inactivación de ribosomas y/o unión a diana. Sorprendentemente, se observó que la unión de regiones de unión heterólogas próximas al extremo amino de una fusión de proteínas que comprende una región efectora de toxina Shiga no dio como resultado una citotoxicidad potente en comparación con las mismas dos regiones de polipéptidos unidas en la orientación inversa.

Ejemplo 5. Una proteína citotóxica derivada de la subunidad A de la toxina semejante a Shiga 1 y el anticuerpo aEpstein-Barr-antígeno

En este ejemplo, la región efectora de la toxina Shiga deriva de la subunidad A de la toxina semejante a Shiga 1 (SLT-1A). Una región de unión de tipo inmunoglobulina aEpstein-Barr-antígeno deriva de un anticuerpo monoclonal contra un antígeno de Epstein Barr (Fang C et al, Immunol Methods J 287: 21-30 (2004)), que comprende una región de unión de tipo inmunoglobulina capaz de unirse a una célula humana infectada por el virus de Epstein-Barr o una célula transformada que expresa un antígeno de Epstein-Barr. El antígeno de Epstein-Barr se expresa en varios tipos de células, tales como células infectadas por un virus de Epstein-Barr y células del cáncer (por ejemplo, células de linfoma y de cáncer de nasofaríngeo). Además, la infección por Epstein-Barr se asocia con otras enfermedades, por ejemplo, esclerosis múltiple.

Construcción, producción y purificación de la proteína citotóxica SLT-1A::aEpsteinBarr

La región de unión de tipo inmunoglobulina aEpstein-Barr-antígeno y la región efectora de la toxina Shiga se unen entre sí para formar una proteína en la que la región de unión de tipo inmunoglobulina no está situada de forma próxima al extremo amino de la proteína en comparación con la región efectora de la toxina Shiga. Por ejemplo, se produce una proteína de fusión mediante la expresión de un polinucleótido que codifica la proteína de unión a antígeno de aEpsteinBarr SLT-1A::aEpsteinBarr. La expresión de la proteína citotóxica SLT-1A::aEpsteinBarr se logra usando sistemas de traducción de proteínas bacterianas y/o libres de células, tal como se describe en los ejemplos anteriores.

D e te rm in a c ió n d e la s c a ra c te r ís t ic a s in v itro d e la p ro te ín a c ito tó x ic a S L T -1 A : :a E p s te in B a r r

L a s c a ra c te r íst ic a s de unión de la prote ína citotóxica de e ste e je m p lo p a ra c é lu la s p o sitiv a s de a n tíg e n o de E p s te in -B a rr y c é lu la s n e g a tiv a s de an tíg e n o de E p s te in -B a rr se d eterm inan m ediante un e n s a y o de c itom etría de flujo b a s a d a en f lu o re sce n c ia , tal com o se d e scrib e anteriorm ente en los e je m p lo s a nterio res. L a B m a x para S L T -1A ::a E p s t e in B a r r con resp ecto a c é lu la s p o sitiv a s de a n tíg e n o de E p s te in -B a rr s e m id e q u e e s de a p ro x im a d a m e n te 50 .000 - 200.000 M FI con una K d dentro del intervalo de 0 ,01 -100 nM, m ien tras que no h a y unión s ig n ificativa a c é lu la s n e g a tiv a s de an tíg e n o de E p s te in -B a rr en este e n sa yo .

L a c a p a c id a d de in a ctivac ió n de rib o so m a s de la proteína citotóxica S L T -1 A ::a E p s t e in B a r r se d eterm ina en una tra d u cció n de p ro te ín a s libre de c é lu la s in vitro, tal com o se d e sc rib e anteriorm ente en los e je m p lo s a nterio res. El efecto inh ib id o r de la proteína citotóxica de este e jem p lo en la s ín te s is de p ro te ín a s libre de c é lu la s e s sign ificativo . La IC ⁵⁰ de S L T -1 A ::a E p s t e in B a r r en la s ín te s is de p ro te ín a s en este e n sa y o libre de c é lu la s e s de a p ro x im a d a m e n te 0 ,1 -100 pM.

D e te rm in a ció n de la citotoxicid ad de la p roteína citotóxica S L T -1 A : :a E p s t e in B a r r utilizand o un e n s a y o de e lim in a ció n ce lu la r

L a s c a ra c te ríst ic a s de citotoxicidad de S L T -1 A ::a E p s t e in B a r r se d eterm inan m ed ian te el e n s a y o g e n e ra l de e lim in a ció n ce lu lar, tal com o se d e scrib e anteriorm ente en los e je m p lo s an te rio re s utilizando c é lu la s p o sitiva s de an tíg e n o de E p ste in -B a rr . A d e m á s, la s c a ra c te ríst ic a s de citotoxicidad se le ctiv a de S L T -1 A ::a E p s t e in B a r r se d eterm inan m ediante el m ism o e n sa yo g e n e ra l de e lim in ació n ce lu la r u sa n d o c é lu la s n e g a tiva s de an tíg en o de E p s te in -B a rr com o una co m p ara ció n con la s c é lu la s p o sitiva s de an tíg en o de E p ste in -B a rr . La C D ⁵⁰ de la proteína citotóxica de este e jem p lo e s de ap ro x im a d a m e n te 0 ,01 -100 nM para c é lu la s p o sitiva s de an tíg en o de E p ste in -B a rr, d e p e n d ie n d o de la lín e a ce lu lar. La C D ⁵⁰ de la proteína citotóxica e s a p ro x im a d a m e n te 10 -10.000 v e c e s m ayo r (m e n o s citotóxica) para c é lu la s que no e x p re sa n el an tíg en o de E p s te in -B a rr en una su p e rfic ie ce lu lar, en co m p a ra c ió n con c é lu la s qu e e x p re sa n el an tíg e n o de E p s te in -B a rr en un a su p e rfic ie celular.

D e te rm in a ció n de los efecto s in v ivo de la proteína citotóxica S L T -1 A : :a E p s t e in B a r r utilizando m o d e lo s a n im a le s S e utilizan m o d elo s a n im a le s para d e te rm in a r los efecto s in v ivo de la proteína citotóxica S L T -1 A ::a E p s t e in B a r r en c é lu la s n e o p lá s ic a s . S e utilizan v a r ia s c e p a s de raton es p a ra p rob ar el efecto de la prote ína citotóxica d e sp u é s de la a d m in istra c ió n in tra ve n o sa en tu m o res de xeno in jerto en raton es re su ltan tes de la in yecció n en los raton es de c é lu la s n e o p lá s ic a s h u m a n a s que e x p re sa n a n tíg e n o s de E p s te in -B a rr en s u s su p e rfic ie s ce lu la re s.

Ejemplo 6. Proteína citotóxica derivada de la subunidad A de la toxina semejante a Shiga 1 y el anticuerpo aLeishmania-antígeno

E n este ejem p lo , la región efectora de la toxina S h ig a d eriva de la su b u n id a d A de la toxina se m e ja n te a S h ig a 1 ( S L T -1 A ) . U n a región de unión de tipo in m un o g lo b ulin a a L e is h m a n ia -a n t íg e n o d e riva de un anticuerpo g en erad o , utilizand o té c n ic a s c o n o cid a s en la té cn ica , a un an tíg en o de L e is h m a n ia de la su p e rfic ie ce lu la r p resen te en la s c é lu la s h u m a n a s que a lb e rg a n protozoos trip a n o so m á tid o s in tra ce lu la re s (v é a se B e rm an J, D w yer, C lin E x p Im m unol 44: 342 -348 ( 1981 ) ; K e n n e r J et al, J C u ta n Pathol 26 : 130 -6 (1999 ); S ilv e ira T et al, Int J P a rasito l. 31 : 14 51 -8 (2001)).

C o n stru cc ió n , prod ucció n y purificació n de la proteína citotóxica S L T -1 A ::a L e is h m a n ia

L a región de unión de tipo in m un o g lo b ulin a a L e is h m a n ia -a n t íg e n o y la región efectora de la toxina S h ig a se unen entre s í para fo rm ar una p roteína en la que la región de unión de tipo in m un o g lo b ulin a no está s itu ad a de form a próxim a al extrem o a m in o de la prote ína en co m p ara ció n con la región efectora de la toxina S h ig a . P o r e jem p lo , se prod uce un a p roteína de fusión m ed ian te la e x p resió n de un polinucleótido qu e co d ifica la p roteína de unión a a L e is h m a n ia -a n t íg e n o S L T -1 A ::a L e is h m a n ia . La ex p resió n de la proteína citotóxica S L T -1 A ::a L e is h m a n ia s e logra u sa n d o s iste m a s de tra d u cció n de p ro te ín a s b a cte ria n o s y/o libres de c é lu la s , tal com o se d e scrib e en los e je m p lo s an teriores.

D e te rm in a ció n de la s c a ra c te ríst ic a s in v itro de la p roteína citotóxica S L T -1 A ::a L e is h m a n ia

L a s c a ra c te ríst ic a s de unión de la proteína citotóxica de este e jem p lo para c é lu la s p o sitiva s de an tíg en o de L e is h m a n ia y c é lu la s n e g a tiv a s de a n tíg e n o de L e is h m a n ia s e d eterm in an m ed ia n te un e n s a y o de c itom etría de flujo b a s a d a en f lu o re sce n c ia , tal com o s e d e sc rib e anteriorm ente en los e je m p lo s a nterio res. L a B m a x para S L T -1 A : : a L e is h m a n ia con resp ecto a c é lu la s p o sitiva s de an tíg en o de L e is h m a n ia s e m ide que e s de ap ro x im a d a m e n te 50 .000 - 200.000 M FI con una K d dentro del intervalo de 0 ,01 -100 nM, m ien tras que no h a y unión s ig n ificativa a c é lu la s n e g a tiv a s de an tíg e n o de L e is h m a n ia en este e n sa yo .

L a c a p a c id a d de in a ctivac ió n de rib o so m a s de la proteína citotóxica S L T -1 A ::a L e is h m a n ia s e d eterm ina en una tra d u cció n de p ro te ín a s libre de c é lu la s in vitro, tal com o se d e sc rib e anteriorm ente en los e je m p lo s a nterio res. El efecto inh ib id o r de la proteína citotóxica de este e jem p lo en la s ín te s is de p ro te ín a s libre de c é lu la s e s sign ificativo . L a IC ⁵⁰ de S L T -1 A ::a L e is h m a n ia en la s ín te s is de prote ín as en este e n s a y o libre de c é lu la s e s de a p ro x im a d a m e n te 0 ,1 -100 pM.

D e te rm in a ció n de la citotoxicid ad de la prote ína citotóxica S L T -1 A : :a L e is h m a n ia utilizand o un e n s a y o de e lim in a ció n ce lu la r

L a s c a ra c te ríst ic a s de citotoxicidad de S L T -1 A ::a L e is h m a n ia s e d eterm inan m ediante el e n s a y o g e n e ra l de e lim in a ció n ce lu lar, tal com o se d e scrib e anteriorm ente en los e je m p lo s an te rio re s utilizando c é lu la s p o sitiva s de an tíg e n o de L e ish m a n ia . A d e m á s, la s c a ra c te ríst ic a s de citotoxicidad se le ctiv a de S L T -1 A ::a L e is h m a n ia se d eterm inan m ediante el m ism o e n sa yo g e n e ra l de e lim in ació n ce lu la r u sa n d o c é lu la s n e g a tiva s de an tíg en o de L e is h m a n ia com o un a co m p ara ció n con la s c é lu la s p o sitiva s de an tíg e n o de L e ish m a n ia . La C D ⁵⁰ de la proteína citotóxica de este e jem p lo e s de a p ro x im a d a m e n te 0 ,01 -100 nM para c é lu la s p o sitiva s de an tíg e n o de L e ish m a n ia , d e p e n d ie n d o de la lín e a ce lu lar. La C D ⁵⁰ de la proteína citotóxica e s a p ro x im a d a m e n te 10 -10.000 v e c e s m ayo r (m e n o s citotóxica) para c é lu la s que no e x p re sa n el an tíg en o de L e ish m a n ia en una su p e rfic ie ce lu lar, en co m p a ra c ió n con c é lu la s qu e e x p re sa n el an tíg e n o de L e is h m a n ia en un a su p e rfic ie celular.

Ejemplo 7. Una proteína citotóxica derivada de la subunidad A de la toxina semejante a Shiga 1 y la región de unión de tipo inmunoglobulina aNeurotensina-Receptor

E n este ejem p lo , la región efectora de la toxina S h ig a d eriva de la su b u n id a d A de la toxina se m e ja n te a S h ig a 1 ( S L T -1 A ) . U n a región de unión de tipo inm u n o g lo b u lin a a N e u ro te n s in a -R e c e p to r d eriva de D A R P in ™ (G e n B a n k A c c e s o : 2 P 2 C _ R ) o un anticuerpo m o n o clo n al (O v ig n e J et al, N euro p e p tid e s 32 : 247 -56 (1998 )) qu e s e une el recepto r de n e u ro te n sin a hu m a n a . E l receptor de n e u ro ten sin a e s e x p re sa d o por v a r ia s c é lu la s c a n c e ro s a s , ta le s com o c é lu la s de c á n c e r de m am a , c á n c e r de colon, c á n c e r de pulm ón, m e la n o m a y c á n c e r pancreático .

C o n stru cc ió n , prod ucció n y purificació n de la proteína citotóxica S L T -1 A ::a N e u r o t e n s in R

L a región de unión de tipo in m un o g lo b ulin a a N e u ro te n s in R y la región efectora de la toxina S h ig a se unen entre s í p a ra fo rm ar una proteína en la qu e la región de unión de tipo inm u n o g lo b u lin a no está s itu a d a de form a próxim a al extrem o a m in o de la p roteína en co m p a ra c ió n con la región efectora de la toxina S h ig a . P o r e jem p lo, s e prod uce una proteína de fusión m ediante la ex p resió n de un polinucleótid o que co d ifica la p roteína de unión al receptor de n e u ro te n sin a S L T -1 A : : a N e u ro te n sin R . La ex p resió n de la proteína citotóxica S L T -1 A ::a N e u r o t e n s in R se logra u sa n d o s iste m a s de tra d u cció n de p ro te ín a s b a cte ria n a s y/o libres de c é lu la s , tal com o se d e scrib e en los e je m p lo s an teriores.

D e te rm in a ció n de la s c a ra c te ríst ic a s in v itro de la p roteína citotóxica S L T -1 A ::a N e u r o t e n s in R

L a s c a ra c te ríst ic a s de unión de la proteína citotóxica de este e jem p lo para c é lu la s p o sitiva s de recepto r de n e u ro te n sin a y c é lu la s n e g a tiv a s de receptor de n e u ro te n sin a s e d eterm inan m ed ian te un e n s a y o de c itom etría de flujo b a s a d a en f lu o re sce n c ia , tal com o s e d e scrib e anteriorm ente en los e je m p lo s a nterio res. La B m a x para S L T -1A :: a N e u ro te n s in a R con resp ecto a c é lu la s p o sitiva s de receptor de n e u ro ten sin a se m ide que e s de a p ro x im a d a m e n te 50.000 -200.000 M FI con una K d dentro del intervalo de 0 ,01 -100 nM, m ien tras que no h a y unión s ig n ificativa a c é lu la s n e g a tiv a s de receptor de n e u ro te n sin a en este e n sa yo .

L a c a p a c id a d de in a ctivac ió n de rib o so m a s de la proteína citotóxica S L T -1 A : :a N e u ro te n sin a R se d eterm in a en una tra d u cció n de p ro te ín a s libre de c é lu la s in vitro, tal com o se d e sc rib e anteriorm ente en los e je m p lo s a nterio res. El efecto inh ib id o r de la proteína citotóxica de este e jem p lo en la s ín te s is de p ro te ín a s libre de c é lu la s e s sign ificativo . L a IC ⁵⁰ de S L T -1 A ::a N e u r o t e n s in a R en la s ín te s is de p ro te ín a s en este e n sa y o libre de c é lu la s e s de a p ro x im a d a m e n te 0 ,1 -100 pM.

D e te rm in a ció n de la citotoxicidad de la proteína citotóxica S L T -1 A ::a N e u r o t e n s in a R utilizando un e n s a y o de e lim in a ció n ce lu la r

L a s c a ra c te ríst ic a s de citotoxicidad de S L T -1 A : : a N e u ro te n s in a R se d eterm inan m ed ian te el e n sa yo g e n e ra l de e lim in a ció n ce lu lar, tal com o se d e scrib e anteriorm ente en los e je m p lo s an te rio re s utilizando c é lu la s p o sitiva s de recepto r de n eu ro ten sin a . A d e m á s, la s c a ra c te ríst ic a s de citotoxicidad se le c tiv a de S L T -1 A : : a N e u ro te n s in a R se d eterm inan m ed ian te el m ism o e n sa y o g e n e ra l de e lim in ació n ce lu la r u sa n d o c é lu la s n e g a tiv a s de recepto r de n e u ro te n sin a com o una co m p ara ció n con la s c é lu la s p o sitiva s de rceptor de neu ro ten sin a. La C D ⁵⁰ de la proteína citotóxica de este e jem p lo e s de ap ro x im a d a m e n te 0 ,01 -100 nM para c é lu la s p o sitiva s de receptor de neu ro ten sin a, d e p e n d ie n d o de la lín e a ce lu lar. La C D ⁵⁰ de la proteína citotóxica e s a p ro x im a d a m e n te 10 -10.000 v e c e s m ayo r (m e n o s citotóxica) para c é lu la s que no e x p re sa n el recepto r de n e u ro ten sin a en un a su p e rfic ie ce lu lar, en co m p a ra c ió n con c é lu la s que e x p re sa n el receptor de n e u ro te n sin a en un a su p e rfic ie celular.

D e te rm in a c ió n d e lo s e fe c to s in v ivo d e la p ro te ín a c ito tó x ic a S L T -1 A : :a N e u ro te n s in a R u t il iz a n d o m o d e lo s a n im a le s S e utilizan m o d elo s a n im a le s para d e te rm in a r los efectos in v ivo de la proteína citotóxica S L T -1 A ::a N e u r o t e n s in a R en c é lu la s n e o p lá s ic a s . S e utilizan v a r ia s c e p a s de raton es para p rob ar el efecto de la proteína citotóxica d e sp u é s de la a d m in istra c ió n in tra ve n o sa en tum o res de xenoin jerto en raton es re su ltan tes de la in ye cció n en los raton es de c é lu la s n e o p lá s ic a s h u m a n a s qu e e x p re sa n re cep to res de n e u ro te n sin a en s u s su p e rfic ie s ce lu la re s.

Ejemplo 8. Una proteína citotóxica derivada de la subunidad A de la toxina semejante a Shiga 1 y una región de unión de tipo inmunoglobulina aEGFR

E n este ejem p lo , la región efectora de la toxina S h ig a d eriva de la su b u n id a d A de la toxina se m e ja n te a S h ig a 1 ( S L T -1 A ) . La región de unión de tipo in m un o g lo b ulin a a E G F R d e riva de A d N e c t in ™ (G e n B a n k a c c e s o : 3 Q W Q _ B ), A ff ib o d y ™ (G e n B a n k a c c e s o : 2 K Z I_ A ; patente de E E .U U . 8.598.113 ) , o un anticuerpo, todos e llo s s e unen a uno o m á s recep to res del factor de crecim ien to ep id érm ico hum ano. L a ex p resió n de los recep to res del factor de crecim ien to ep id érm ico se a so c ia con c é lu la s de c á n c e r h u m a n a s, ta le s com o, por e jem p lo, c é lu la s de c á n c e r de pulm ón, c é lu la s de c á n c e r de m a m a y c é lu la s de c á n c e r de colon.

C o n stru cc ió n , prod ucció n y purificació n de la proteína citotóxica S L T - 1 A : : a E G F R

L a región de unión de tipo in m un o g lo b ulin a a E G F R y la región efectora de la toxina S h ig a se unen entre s í para fo rm ar una proteína en la que la región de unión de tipo in m u n o g lo b u lin a no está s itu ad a de form a próxim a al extrem o a m in o de la p roteína en co m p a ra c ió n con la región efectora de la toxina S h ig a . P o r e jem p lo, s e prod uce una proteína de fusión m ed ian te la e x p resió n de un polinucleótid o que co d ifica la proteína de unión a E G F R S L T -1 A : :a E G F R . L a ex p resió n de la proteína citotóxica S L T - 1 A : : a E G F R se logra u sa n d o s iste m a s de tra d u cció n de p ro te ín a s b a cte ria n o s y/o lib res de c é lu la s , tal com o s e d e sc rib e en los e je m p lo s a nterio res.

D e te rm in a ció n de la s c a ra c te ríst ic a s in v itro de la p roteína citotóxica S L T - 1 A : : a E G F R

L a s c a ra c te ríst ic a s de unión de la proteína citotóxica de este e jem p lo para c é lu la s E G F R y c é lu la s E G F R - se d eterm in an m ed ia n te un e n sa y o de c ito m etría de flujo b a sa d o en flu o re sc e n c ia , tal co m o s e d e scrib e anteriorm ente en los e je m p lo s anterio res. L a B m a x para S L T - 1 A : : a E G F R con resp ecto a c é lu la s E G F R s e m id e que e s de a p ro x im a d a m e n te 50.000 -200.000 M FI con una K d dentro del intervalo de 0 ,01 -100 nM, m ien tras que no h a y unión s ig n ificativa a c é lu la s E G F R - en este e n sa yo .

L a c a p a c id a d de in a ctivació n de rib o so m a s de la proteína citotóxica S L T - 1 A : :a E G F R se d eterm ina en una tra d u cció n de p ro te ín a s libre de c é lu la s in vitro, tal com o se d e sc rib e anteriorm ente en los e je m p lo s a nterio res. El efecto inh ib id o r de la proteína citotóxica de este e jem p lo en la s ín te s is de p ro te ín a s libre de c é lu la s e s sign ificativo . La IC ⁵⁰ de S L T - 1 A : : a E G F R en la s ín te s is de prote ín as en este e n sa y o libre de c é lu la s e s de a p ro x im a d a m e n te 0 ,1 -100 pM.

D e te rm in a ció n de la citotoxicidad de la proteína citotóxica S L T - 1 A : : a E G F R utilizando un e n sa y o de e lim in ació n ce lu la r

L a s c a ra c te ríst ic a s de citotoxicidad de S L T - 1 A : : a E G F R se d eterm inan m ediante el e n s a y o g e n e ra l de e lim in ació n ce lu lar, tal com o se d e scrib e anteriorm ente en los e je m p lo s an terio res utilizando c é lu la s E G F R . A d e m á s, la s c a ra c te ríst ic a s de citotoxicidad se le c tiv a de S L T - 1 A : : a E G F R s e d eterm inan m ed ian te el m ism o e n s a y o g e n e ra l de e lim in a ció n ce lu la r u sa n d o c é lu la s E G F R - com o una co m p ara ció n con la s c é lu la s p o sitiva s de an tíg en o de L e ish m a n ia . L a C D ⁵⁰ de la proteína citotóxica de este e jem p lo e s de a p ro x im a d a m e n te 0 ,01 -100 nM para c é lu la s E G F R , d e p e n d ie n d o de la lín e a ce lu lar. L a C D ⁵⁰ de la proteína citotóxica e s a p ro x im a d a m e n te 10 -10.000 v e c e s m a yo r (m e n o s citotóxica) para c é lu la s qu e no e x p re sa n E G F R en un a su p e rfic ie ce lu lar, en co m p a ra c ió n con c é lu la s qu e e x p re sa n E G F R en un a su p e rfic ie celular.

D e te rm in a ció n de los efecto s in v ivo de la proteína citotóxica S L T - 1 A : : a E G F R utilizando m o d elo s a n im a le s

S e utilizan m o d e lo s a n im a le s p a ra d e te rm in a r los efecto s in v ivo de la p roteína citotóxica S L T - 1 A : : a E G F R en c é lu la s n e o p lá s ic a s . S e utilizan v a r ia s c e p a s de raton es para probar el efecto de la proteína citotóxica d e sp u é s de la a d m in istra c ió n in tra ve n o sa en tu m o res de xeno in jerto en raton es re su ltan tes de la in yecció n en los raton es de c é lu la s n e o p lá s ic a s h u m a n a s qu e e x p re sa n E G F R ( s ) en s u s su p e rfic ie s ce lu la re s.

Ejemplo 9. Una proteína citotóxica derivada de la subunidad A de la toxina semejante a Shiga 1 y el anticuerpo aCCR5

E n este ejem p lo , la región efectora de la toxina S h ig a d eriva de la su b u n id a d A de la toxina se m e ja n te a S h ig a 1 ( S L T -1 A ) . U n a región de unión de tipo in m un o g lo b ulin a a C C R 5 d eriva de un anticuerpo m o n o clo n al contra C C R 5 h u m a n o ( C D 195 ) (B e rn sto n e L et al, H yb rid o m a 31 : 7 - 19 (2012 )) . C C R 5 s e e x p re sa pred o m in antem ente en la s c é lu la s T , m acró fa g o s, c é lu la s d e n d rít ica s y m icroglia. A d e m á s, C C R 5 ju e g a un papel en la p a to g é n e sis y la p ro p ag a ció n del v iru s de in m u n o d e fic ien cia h u m a n a (V IH ).

C o n stru cc ió n , prod ucció n y p u rificación de la proteína citotóxica S L T - 1 A : : a C C R 5

L a región de unión de tipo inm u n o g lo b u lin a a C C R 5 y la región efectora de la toxina S h ig a se unen entre s í para fo rm ar un a proteína, en la qu e la región de unión de tipo in m u n o g lo b u lin a no está s itu a d a de form a próxim a al extrem o a m in o term in al de la proteína en co m p ara ció n con la región efectora de la toxina S h ig a . P o r e jem p lo, se prod uce un a p roteína de fusión m ed ian te la e x p resió n de un polinucleótido qu e co d ifica la p roteína de unión a aC C R 5 S L T -1 A : : a C C R 5. L a ex p re sió n de la p roteína citotóxica S L T - 1 A : : a C C R 5 s e logra u sa n d o s iste m a s de tra d u cció n de p ro te ín a s b a cte ria n o s y/o lib res de cé lu la s , tal co m o s e d e sc rib e en los e je m p lo s a nterio res.

D e te rm in a ció n de la s c a ra c te ríst ic a s in v itro de la p roteína citotóxica S L T - 1 A : : a C C R 5

L a s c a ra c te ríst ic a s de unión de la proteína citotóxica de este e jem p lo para c é lu la s C C R 5 y c é lu la s C C R 5 - se d eterm in an m ed ia n te un e n sa y o de c ito m etría de flujo b a sa d a en f lu o re sc e n c ia , tal co m o s e d e scrib e anteriorm ente en los e je m p lo s anterio res. La B m a x para S L T - 1 A : : a C C R 5 a c é lu la s p o sitiva s C C R 5 se m ide que e s de a p ro x im a d a m e n te 50.000 -200.000 M FI con una K d dentro del intervalo de 0 ,01 -100 nM, m ien tras que no h a y unión s ig n ificativa a c é lu la s C C R 5 - en este e n sa yo .

L a c a p a c id a d de in a ctivac ió n de rib o so m a s de la p roteína citotóxica S L T - 1 A : :aC C R 5 s e d eterm ina en una trad u cción de p ro te ín a s libre de c é lu la s in vitro, tal com o se d e scrib e anteriorm ente, en los e je m p lo s a nterio res. E l efecto inh ib id o r de la proteína citotóxica de este e jem p lo en la s ín te s is de p ro te ín a s libre de c é lu la s e s s ign ificativo. La IC ⁵⁰ de S L T - 1 A : : a C C R 5 en la s ín te s is de prote ín as en este e n s a y o libre de c é lu la s e s de a p ro x im a d a m e n te 0 ,1 -100 pM.

D e te rm in a ció n de la citotoxicidad de la proteína citotóxica S L T - 1 A : : a C C R 5 utilizando un e n s a y o de e lim in ació n ce lu la r

L a s c a ra c te ríst ic a s de citotoxicidad de S L T - 1 A : : a C C R 5 se d eterm inan m ediante el e n sa y o g e n e ra l de e lim in ació n ce lu lar, tal com o se d e scrib e anteriorm ente en los e je m p lo s an terio res utilizando c é lu la s C C R 5 . A d e m á s, la s c a ra c te ríst ic a s de citotoxicidad se le c tiv a de S L T -1 A : : a C C R 5 s e d eterm inan m ed ian te el m ism o e n s a y o g e n e ra l de e lim in a ció n ce lu la r u sa n d o c é lu la s C C R 5 - com o una co m p ara ció n con la s c é lu la s C C R 5 . La C D ⁵⁰ de la proteína citotóxica de este e jem p lo e s de ap ro x im a d a m e n te 0 ,01 -100 nM para c é lu la s C C R 5 , d ep e n d ie n d o de la lín ea ce lu lar. L a C D ⁵⁰ de la proteína citotóxica e s a p ro x im a d a m e n te 10 -10.000 v e c e s m a yo r (m e n o s citotóxica) para c é lu la s que no e x p re sa n C C R 5 en una su p e rfic ie ce lu lar, en co m p ara ció n con c é lu la s qu e e x p re sa n C C R 5 en una su p e rfic ie ce lu lar.

D e te rm in a ció n de los efecto s in v ivo de la proteína citotóxica S L T - 1 A : : a C C R 5 utilizando m o d elo s a n im a le s

S e utilizan m o d e lo s a n im a le s s e utilizan p a ra d e te rm in a r los efecto s in v ivo de la proteína citotóxica S L T - 1 A : : a C C R 5 en el a g ota m ien to de c é lu la s T de m a te ria le s d o n a n te s (ve r T s ir ig o tis P et al, Im m u n o th e rap y 4: 407 -24 (2012 )) . Lo s prim ates no h u m a n o s se utilizan para d e te rm in a r los efectos in v ivo de S L T -1 A : :a C C R 5. La enferm ed ad de injerto contra h u é sp e d se a n a liz a en m a c a c o s rh e su s d e sp u é s del tra sp la n te ren al cu a n d o los ó rg a n o s d o n ad o s se tratan p revia m en te con S L T - 1 A : : a C C R 5 (v é a se W e a v e r T et al, Nat M ed. 15 : 746 -9 (2009)). S e o b se rv a agotam iento in v ivo de linfocitos T de sa n g re periférica en p rim ates cyn o m o lg u s d e sp u é s de la a d m in istra c ió n parenteral de d iferentes d o sis de S L T -1 A : :a C C R 5. E l uso de S L T - 1 A : : a C C R 5 para b lo q u e a r la infección por V IH s e p rueba a d m in istra n d o una d o sis a g u d a de S L T - 1 A : : a C C R 5 a p rim ates no h u m a n o s con el fin de agotar se v e ra m e n te la s c é lu la s T c ircu la n te s tra s la e x p o sic ió n a un v iru s d e la in m u n o d e fic ie n cia de s im io s (V IS ) (ve r S e llie r P et al, P L o S O n e 5:. e 10570 (2010 )).

Ejemplo 10. Una proteína citotóxica derivada de la subunidad A de la toxina Shiga y un dominio de inmunoglobulina anti-Env

E n este e jem p lo, la región efectora de la toxina S h ig a s e d e riva de la su b u n id a d A de la toxina S h ig a (S tx -A ). U n a región de unión de tipo in m u n o g lo b u lin a a E n v s e d e riva de los a n ticu e rp o s e x iste n te s qu e s e u n en a la g licop ro te ín a de la envo ltu ra del V IH (E n v), tal com o G P 41, G P 120 , G P 140 o G P 160 (v é a se , por e jem p lo , C h e n W et al., J Mol Bio 38 2 : 779 -89 (2008 ); C h e n W et al., E x p e rt O p in B iol T h e r 13 : 657 -71 (2013 ) ; v a n den K e rk h o f T et al., R etro viro log y 10 : 102 ( 2013 ) o de a n ticu e rp o s g e n e ra d o s u sa n d o té c n ic a s e stá n d a r (ver P ra b a k a ra n et al., Front M icrobiol 3: 277 (20 12 )) . L a s E n v s son p ro te ín a s de la su p e rfic ie del V IH qu e tam b ién se m u estran en la s su p e rfic ie s c e lu la re s de la s c é lu la s in fecta d a s por el V IH d urante la rep licació n del V IH . A u n q u e la s E n v s se e x p re sa n en c é lu la s in fectad as pred o m in an tem en te en co m p artim ento s e n d o só m ico s, p u eden e sta r p re se n te s c a n tid a d e s su fic ie n te s de E n v s en un a su p e rfic ie ce lu la r para s e r d irig id a s por una proteína citotóxica altam ente potente A d e m á s, la s p ro te ín a s c ito tó xicas que d irigen E n v p o d rían un irse a los v ir io n e s del V IH y entrar en la s c é lu la s recién in fe cta d a s durante la fusión de los v ir io n e s con un a c é lu la h u ésp ed .

D eb id o a qu e el V IH m u estra una alta ta s a de m utación, e s preferible u s a r un d om inio de in m un o g lo b ulin a qu e se un a a un a parte fu n c io n a l lim itad a de un a E n v , co m o lo d e m u e stran los a n ticu e rp o s a m p lia m e n te n e u tra liz a n te s que s e unen a E n v de m últip les c e p a s de V 1H (van den K e rkh o fT et al. al., R etro viro log y 10 : 102 (2013 )) . D eb id o a que s e cre e qu e la s E n v p re se n te s en la su p e rfic ie de un a cé lu la in fectad a p resen ta n ep íto p o s restrin g id o s esté rica m e n te (C h e n W et al., J V iro l 88: 1125 - 39 (2014 )), e s preferible u s a r re g io n e s de unión m e n o re s de 100 kD e idealm ente m á s p e q u e ñ a s que 25 kD, tal com o frag m en to s de s d A b s com o d o m in io s V h H.

C o n stru cc ió n , prod ucció n y purificació n de la proteína citotóxica a E n v : :S L T - 1 A

L a región de unión de tipo inm u n o g lo b u lin a a E n v y la región efectora de toxina S h ig a están u n id a s para fo rm ar una proteína citotóxica. P o r ejem p lo , una proteína de fusión se prod uce al e x p re sa r un polinucleótido qu e co d ifica la proteína de unión a E n E n v S L T -1 A : :a E n v . L a ex p re sió n de la proteína citotóxica S L T -1 A : :a E n v s e logra utilizando s iste m a s de tra d u cció n de p ro te ín a s b a cte ria n o s y/o libres de c é lu la s , tal com o se d e sc rib e en los e je m p lo s an teriores.

D e te rm in a ció n de la s c a ra c te ríst ic a s in v itro de la p roteína citotóxica S L T -1 A : :a E n v

L a s c a ra c te ríst ic a s de unión de la proteína citotóxica de este e jem p lo para c é lu la s E n v y c é lu la s E n v - se d eterm in an m ed ia n te un e n sa y o de c ito m etría de flujo b a sa d o en f lu o re sc e n c ia com o se d e scrib ió anterio rm ente en los e je m p lo s a nterio res. La Bmax para S L T -1 A : :a E n v con resp ecto a la s c é lu la s p o sitiva s E n v se m id e en a p ro x im a d a m e n te 50.000 -200.000 M FI con un a K d dentro del rango de 0.01 -100 nM, m ie n tras q u e no h a y un a unión s ig n ificativa a la s c é lu la s E n v - en este e n sa yo .

L a s c a p a c id a d e s de in a ctivació n de rib o so m a s de la proteína citotóxica S L T -1 A : :a E n v se d eterm inan en una tra d u cció n de p ro te ín a s in v itro s in c é lu la s com o se d e scrib ió anteriorm ente en los e je m p lo s an teriores. E l efecto inh ib id o r de la proteína citotóxica de este e jem p lo so b re la s ín te s is de p ro te ín a s libres de c é lu la s e s s ign ificativo. La IC ⁵⁰ de S L T -1 A : :a E n v en la s ín te s is de p ro te ín a s en este e n s a y o sin c é lu la s e s de a p ro x im a d a m e n te 0 , 1 -100 pM. D e te rm in a ció n de la citotoxicidad de la proteína citotóxica S L T -1 A : :a E n v utilizando un e n s a y o de e lim in a ció n ce lu la r L a s c a ra c te ríst ic a s de citotoxicidad de S L T -1 A : :a E n v se d eterm inan m ediante el e n sa yo g e n e ra l de e lim in ació n ce lu lar, tal com o s e d e sc rib e anteriorm ente en los e je m p lo s an terio res u sa n d o c é lu la s E n v . A d e m á s, la s c a ra c te ríst ic a s de citotoxicidad se le c tiv a de S L T -1 A : :a E n v s e d eterm inan m ediante el m ism o e n sa y o g e n e ra l de e lim in a ció n ce lu la r u sa n d o c é lu la s E n v - en co m p a ra c ió n con la s c é lu la s E n v . La C D ⁵⁰ de la p roteína citotóxica de este e jem p lo e s de a p ro x im a d a m e n te 0.01 -100 nM p a ra la s c é lu la s E n v d e p e n d ie n d o de la lín e a c e lu la r y/o la ce p a del V 1H u tiliza d a p a ra infectar la s c é lu la s p a ra h a c e rla s E n v . La C D ⁵⁰ de la prote ína citotóxica e s a p ro x im a d a m e n te 10 -10.000 v e c e s m a yo r (m e n o s citotóxica) para la s c é lu la s que no e x p re sa n E n v en una su p e rfic ie ce lu la r en co m p a ra c ió n con la s c é lu la s que e x p re sa n E n v en un a su p e rfic ie celu lar.

D e te rm in a ció n de los efecto s in v ivo de la proteína citotóxica S L T -1 A : :a E n v utilizando m o d elo s a n im a le s

E l uso de S L T -1 A : :a E n v para in h ib ir la infección por V IH s e p rueba a d m in istra n d o S L T -1 A : :a E n v a prim ates no h u m a n o s infectado s con el v iru s de la in m u n o d e fic ien cia s im ia (S IV ) (v é a se S e llie r P et al., P L o S O n e 5: e 10570 (20 10 )).

Ejemplo 11. Una proteína citotóxica derivada de la subunidad A de la toxina semejante a Shiga 1 y el anticuerpo aUL18

E n este ejem p lo , la región efectora de la toxina S h ig a d eriva de la su b u n id a d A de la toxina se m e ja n te a S h ig a 1 ( S L T -1 A ) . U n a región de unión de tipo in m u n o g lo b u lin a a U L 18 d e riva de un a n ticu erp o g e n e ra d o , utilizand o té c n ic a s c o n o c id a s en la té cn ica , para la proteína de c ito m e g alo v iru s de su p e rfic ie ce lu la r U L 18 , que está p resen te en las c é lu la s h u m a n a s in fecta d a s con c ito m e g alo v iru s (Y a n g Z, B jo rkm an P, P ro c Natl A c a d S c i U S A . 105 : 10095 -100 (2008)). L a infección por c ito m e g alo v iru s hu m a n o s e a s o c ia con v a rio s tipos de c á n c e r y trasto rn o s inflam atorios. C o n stru cc ió n , prod ucció n y purificació n de la proteína citotóxica S L T - 1 A : :a U L 18

L a región de unión de tipo inm u n o g lo b u lin a a U L 18 y la región efectora de la toxina S h ig a se unen entre s í para fo rm ar un a proteína, en la qu e la región de unión de tipo in m u n o g lo b u lin a no está s itu a d a de form a próxim a al extrem o a m in o term in al de la proteína en co m p ara ció n con la región efectora de la toxina S h ig a . P o r e jem p lo, se prod uce un a p roteína de fusión m ed ian te la ex p re sió n de un polinucleótido qu e co d ifica la p roteína de unión a a U L 18 S L T -1 A : :a U L 18. La ex p re sió n de la p roteína citotóxica S L T -1 A : :a U L 18 s e logra u sa n d o s iste m a s de tra d u cció n de p ro te ín a s b a c te ria n a s y/o lib res de c é lu la s , tal com o s e d e sc rib e en los e je m p lo s a nterio res.

D e te rm in a ció n de la s c a ra c te ríst ic a s in v itro de la p roteína citotóxica S L T -1 A : :a U L 18

L a s c a ra c te ríst ic a s de unión de la proteína citotóxica de este e jem p lo para c é lu la s p o sitiva s de la proteína de c ito m e g alo v iru s U L 18 y c é lu la s n e g a tiv a s de la proteína de c ito m e g alo v iru s U L 18 s e d eterm inan m ediante un e n sa y o de c itom etría de flujo b a s a d a en flu o re sc e n c ia , tal com o se d e sc rib e anteriorm ente en los e je m p lo s an teriores. La B m a x para S L T -1 A : :a U L 18 a c é lu la s p o sitiva s de proteína de c ito m e g alo v iru s U L 18 se m ide que e s de a p ro x im a d a m e n te 50.000 -200.000 M FI con una K d dentro del intervalo de 0 ,01 -100 nM, m ien tras que no h a y unión s ig n ificativa a c é lu la s n e g a tiv a s de p roteína de c ito m e g a lo v iru s U L 18 en este e n sa yo .

L a c a p a c id a d de in a ctivac ió n de r ib o so m a s de la prote ína citotóxica S L T -1 A : :a U L 18 s e d e te rm in a en un a tra d u cció n de prote ín as libre de c é lu la s in vitro, tal com o se d e scrib e anteriorm ente en los e je m p lo s a nterio res. E l efecto inh ib id o r de la proteína citotóxica de este e jem p lo en la s ín te s is de p ro te ín a s libre de c é lu la s e s s ign ificativo. La IC ⁵⁰ de S L T -1 A : :a U L 18 en la s ín t e s is de p ro te ín a s en e ste e n s a y o libre de c é lu la s e s de a p ro x im a d a m e n te 0 , 1 -100 pM.

D e te rm in a ció n de la citotoxicidad de la p roteína citotóxica S L T -1 A : :a U L 18 utilizand o un e n sa yo de e lim in ació n ce lu la r

L a s c a ra c te ríst ic a s de citotoxicidad de S L T -1 A : :a U L 18 s e d eterm inan m ediante el e n sa y o g e n e ra l de e lim in ació n ce lu lar, tal com o se d e sc rib e anteriorm ente en los e je m p lo s a n te rio re s utilizand o c é lu la s p o sitiva s de la proteína de c ito m e g alo v iru s U L 18. A d e m á s, la s c a ra c te ríst ic a s de citotoxicidad se le ctiv a de S L T -1 A : :a U L 18 se d eterm inan m ed ian te el m ism o e n sa yo g e n e ra l de e lim in ació n ce lu la r u sa n d o c é lu la s n e g a tiv a s de p roteína de c ito m e g alo v iru s U L 18 com o una co m p a ra c ió n con la s c é lu la s p o sitiva s de p roteína de c ito m e g a lo v iru s U L 18. La C D ⁵⁰ de la proteína citotóxica de este e jem p lo e s de ap ro x im a d a m e n te 0 ,01 -100 nM para c é lu la s p o sitiva s de la proteína de c ito m e g alo v iru s U L 18 , d ep e n d ie n d o de la lín e a ce lu lar. La C D ⁵⁰ de la proteína citotóxica e s ap ro x im a d a m e n te 10 ­ 10.0 00 v e c e s m a yo r (m e n o s citotóxica) para c é lu la s que no e x p re sa n la proteína de c ito m e g alo viru s U L 18 en una su p e rfic ie ce lu lar, en co m p a ra c ió n con c é lu la s qu e e x p re sa n la p roteína de c ito m e g alo v iru s U L 18 en u n a su p erfic ie ce lu lar.

Ejemplo 12. Una proteína citotóxica derivada de la subunidad A de la toxina semejante a Shiga 1 y el antígeno intestinal de ahelminto del anticuerpo

E n e ste e jem p lo , la región efecto ra de la toxina S h ig a s e d e riva de la su b u n id a d A de la toxina 1 s e m e ja n te a S h ig a ( S L T -1 A ) . U n a región de unión del tipo de in m un o g lo b ulin a an tíg en o de ahelm into intestinal s e d eriva de un a n ticu erp o g en era d o , utilizando té c n ic a s c o n o c id a s en la té cn ica , para el helm into ortólogo de un recepto r de tra n sferrin a h u m a n o (v é a se , por ejem p lo , el gen n em atod o g c p -2.1 U n iP ro t G 8 J Y E 4 _ C A E E L ; R o s a B et al. , Mol C e ll P ro te o m ics M 114.046227 (2015 )).

C o n stru cc ió n , prod ucció n y purificació n de la proteína citotóxica S L T -1 A ::a n t íg e n o de a H e lm in to intestinal

L a región de unión del tipo de in m un o g lo b ulin a an tíg en o de ahelm into intestinal y la región efectora de la toxina S h ig a s e unen p a ra fo rm ar un a p roteína en la qu e la región de unión del tipo de in m u n o g lo b u lin a no e stá u b ic a d a de m a n e ra próxim a al extrem o am ino term in al de la proteína en co m p ara ció n con la región efectora de la toxina S h ig a . P o r e jem p lo, un a p roteína de fusión s e prod uce al e x p re sa r un polinucleótid o qu e co d ifica la p roteína de unión al a n tíg e n o de a H e lm in to intestinal S L T -1 A ::a n t íg e n o de a H e lm in to intestinal. L a e x p resió n de la proteína citotóxica S L T -1 A : :a L e is h m a n ia se logra utilizand o s iste m a s de tra d u cció n de p ro te ín a s lib res de c é lu la s y/o b a cte ria n o s com o s e d e sc rib e en los e je m p lo s a nterio res.

D e te rm in a ció n de la s c a ra c te ríst ic a s in v itro de la p roteína citotóxica S L T -1 A ::a n t íg e n o de a H e lm in to intestinal L a s c a ra c te ríst ic a s de unión de la proteína citotóxica de este e jem p lo se d eterm inan m ediante un e n s a y o de unión m o le cu la r co no cid o en la té cn ica u sa n d o una proteína d ia n a reco m b in an te purificad a. L a K d para S L T -S L T -1A ::a n t íg e n o de a H e lm in to intestinal para la prote ína d ia n a s e m id e en a p ro x im a d a m e n te 100 nM, m ien tras qu e no h a y una unión s ig n ificativa a una proteína de control negativo (por e jem p lo, recepto r de tra n sferrin a h u m a n a p urificad a, reco m b in an te) en este e n sa yo .

L a s c a p a c id a d e s de in a ctivac ió n de r ib o so m a s de la p ro te ín a cito tó xica S L T -1 A ::a n t íg e n o de a H e lm in to intestinal se d eterm inan en una trad u cción de p ro te ín a s in v itro sin c é lu la s , com o se d e scrib ió anteriorm ente en los e je m p lo s anterio res. E l efecto inh ib id o r de la p roteína citotóxica de este e jem p lo so b re la s ín te s is de p ro te ín a s libres de c é lu la s e s s ign ificativo. La IC ⁵⁰ de S L T -1 A ::a n t íg e n o de a H e lm in to intestinal en la s ín te s is de p ro te ín a s en este e n s a y o sin c é lu la s e s de a p ro x im a d a m e n te 0 , 1 -100 pM.

D e te rm in a c ió n d e la to x ic id a d d e la p ro te ín a c ito tó x ic a S L T -1 A : :a n t íg e n o d e a H e lm in to in te s t in a l u s a n d o h e lm in to s L a to xicid ad de S L T -1 A ::a n t íg e n o de a H e lm in to intestinal a los helm into s se d eterm ina u sa n d o helm intos m odelo (v é a se , por e jem p lo Iatsenko I et al., T o x in a s 2050 -63 (2014 )). A l helm into se p uede a d m in istra r S L T -1 A ::a n t íg e n o de a Helm into intestinal purificado m ed ian te rem ojo o, a lternativam ente, a lim en ta n d o el helm into con b a cte ria s que e x p re sa n la proteína de fusión S L T -1 A ::a n t íg e n o de a h elm in to intestinal.

A d e m á s , a los a n im a le s de laboratorio que a lb erg a n helm intos y/o que presen tan e n fe rm e d a d e s re la c io n a d a s con helm into s se les a d m in istra S L T -1 A ::a n t íg e n o de a helm into intestinal y se m onitorea la red ucció n o e lim in ació n de he lm in to s y/o s ín to m a s a so c ia d o s de helm into s parásito s.

Ejemplo 13. Proteínas citotóxicas dirigidas a varios tipos de células.

E n e ste e jem p lo , la región efecto ra de la to xin a S h ig a s e d e riva de la su b u n id a d A de la to xin a 1 se m e ja n te a S h ig a ( S L T -1 A ) , la toxina S h ig a (S tx A ) y/o la toxina 2 se m e ja n te a S h ig a ( S L T -2 A ) . U n a región de unión de tipo in m u n o g lo b u lin a s e d e riva del d om inio de in m un o g lo b ulin a de la m o lé cu la e le g id a de la co lu m n a 1 de la T a b la 11 y qu e s e une a la b io m o lé cu la d ia n a e x tra ce lu la r in d ic a d a en la co lu m n a 2 de la T a b la 11. L a s p ro te ín a s c ito tó xicas de e jem p lo de este e jem p lo se crea n con re g io n e s efecto res de la toxina S h ig a p róx im as am in o te rm in a le s utilizando té c n ic a s c o n o cid a s en el se c to r y o p c io n a lm e n te s e unen con un a gente o a g e n te s prom otores de la d etección . L a s p ro te ín a s cito tó xicas de e jem p lo de este e jem p lo s e cre a n y prueb an com o se d e sc rib e en los e je m p lo s anterio res u sa n d o c é lu la s que e x p re sa n la s b io m o lé cu la s d ia n a e x tra ce lu la re s a p ro p ia d a s. L a s p ro te ín a s de e jem p lo de este e je m p lo p u e d e n u s a rs e , por e jem p lo , p a ra d ia g n o stic a r y tratar la s e n fe rm e d a d e s, a fe c c io n e s o tra sto rn o s in d ica d o s en la co lu m n a 3 de la T a b la 11.

Tabla 11. Varias regiones de unión de tipo inmunoglobulina para el reconocimiento celular de proteínas citotóxicas

:

;

_______________________

MKEFTLDF ST AKT Y VD SLN VIRS AIGTPFQTISSGGTSFFMIDSGTG DNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLR LIVERNNLYVTGFVNRTNNVFY RFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSS YTTLQRVAGISRTGMQINRHSLT TSYLDLMSHSGTSLTQSVARAM LRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTT LDDLS GRS YVMT AED VDLTLN WGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRI SFGSINAILGSVALILNSHHHASR VAREFPKPSTPPGSSGGAPGILGF VFTLDIQFTQSPLSFPVTLGQPAS ISCRSSQSLVHRNGNTYLHWFQ QRPGQSPRLLIYTV SNRFSGVPD RFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV G V YF C S Q S SH VPPTF G AGTRLEI KGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQ LQQSGSELKKPGASVKVSCKAS GYTFTNY GVNWIKQAPGQGLQ WMGWINPNT GEPTFDDDFKGRF AFSLDTSVSTAYLQISSLKADDT AVYFCSRSRGKNEAWFAYWGQ

GTLVTVSS

MKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRS AIGTPFQTISSGGTSFFMIDSGSG DNFFAVDVRGIDPEEGRFNNFR FIVERNNFYVTGFVNRTNNVFY RFADFSHVTFPGTTAVTFSGDSS YTTFQRVAGISRTGMQINRHSFT TSYFDFMSHSGTSFTQSVARAM FRFVTVTAEAFRFRQIQRGFRTT FDDFSGRS YVMT AED VDFTFN WGRFS SVFPDYHGQDS VRV GRI SFGSINAIFGSVAFIFNCHHHASR VARAHHSEDPS SKAPKAPEV QF VESGGGFVQAGGSFRFSCAASG ITFSINTMGWYRQAPGKQREFV AFISSIGDTYYADSVKGRFTISRD NAKNT VYFQMNSFKPEDT AVY Y CKRFRTAAQGTDYWGQGTQV

TVSS

Claims (26)

REIVINDICACIONES

1. Proteína citotóxica que comprende:

a) una región de unión de tipo inmunoglobulina que comprende uno o más polipéptidos y es capaz de unirse específicamente a al menos una biomolécula diana extracelular, en la que dicha región de unión de tipo inmunoglobulina deriva de un anticuerpo, en la que dicha biomolécula diana extracelular es CD38; y

b) una región efectora de la toxina Shiga que comprende un polipéptido que es capaz de efectuar la citotoxicidad de la Subunidad A de la toxina Shiga, y comprende:

una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3; o

una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

(i) aminoácidos 75 a 251 de la SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2 o SEQ ID No: 3;

(ii) aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3;

(iii) aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; y

(iv) aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3,

en la que la proteína es capaz de causar la muerte de una célula físicamente acoplada con CD38; y

en la que la región de unión y la región efectora de la toxina Shiga están orientadas dentro de la proteína de manera que la región de unión se encuentra en una posición que está más próxima al extremo carboxi terminal de la región efectora de la toxina Shiga que al extremo amino terminal de la región efectora de la toxina Shiga.

2. Proteína citotóxica de la reivindicación 1, en la que la proteína exhibe una citotoxicidad que es al menos 3 veces mayor a una primera población de células cuyos miembros están físicamente acoplados con CD38, en comparación con una segunda población de células cuyos miembros no están físicamente acoplados con CD38.

3. Proteína citotóxica de la reivindicación 2, en la que dicha primera población de células está físicamente acoplada con CD38 mediante interacciones intermoleculares covalentes y/o no covalentes que acoplan CD38, o una porción del mismo, al exterior de una célula; o en la que CD38 es una proteína de membrana integral o proteína de membrana periférica expresada por la primera población de células.

4. Proteína citotóxica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la región efectora de la toxina Shiga comprende:

(i) aminoácidos 75 a 251 de la SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, o SEQ ID No: 3;

(ii) aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3;

(iii) aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; o

(iv) aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

5. Proteína citotóxica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la región efectora de la toxina Shiga comprende una mutación relativa a una Subunidad A de origen natural de un miembro de la familia de toxinas Shiga que cambia la actividad enzimática de la región efectora de la toxina Shiga, la mutación seleccionada de al menos una eliminación, inserción o sustitución de residuo de aminoácido; en la que la subunidad A de origen natural de un miembro de la familia de toxinas Shiga comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID No: 1-3.

6. Proteína citotóxica de la reivindicación 5, en la que la mutación reduce la citotoxicidad de la región efectora de la toxina Shiga.

7. Proteína citotóxica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la región de unión de tipo inmunoglobulina comprende un fragmento variable de cadena única (scFv).

8. Proteína citotóxica de la reivindicación 7, en la que la región de unión de tipo inmunoglobulina comprende los aminoácidos 269-508 de la SEQ ID No: 4.

9. Proteína citotóxica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la región de unión de tipo inmunoglobulina comprende un fragmento de anticuerpo de dominio único (sdAb).

10. Proteína citotóxica de la reivindicación 9, en la que el fragmento de anticuerpo de dominio único es un fragmento V hH.

11. Proteína citotóxica de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en forma de un homomultímero o heteromultímero.

12. Proteína citotóxica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en forma de una sal o solvato farmacéuticamente aceptable.

13. C o m p o s ic ió n fa rm a cé u tica qu e co m p re n d e un a prote ína citotóxica, se g ú n un a c u a lq u ie ra de la s re iv in d ic a c io n e s 1-12 y al m e n o s un e x cip ien te o v e h íc u lo fa rm a cé u tica m e n te a cep tab le .

14. C o m p o sic ió n fa rm a cé u tica de la re iv in d icac ió n 13 , en la que el v e h íc u lo farm a cé u tica m e n te ace p tab le co m p re n d e un d iso lven te o m edio de d isp e rsió n fis io ló g ica m e n te a cep tab le ; y/o en la que el v e h íc u lo farm a cé u tica m e n te a ce p tab le co m p re n d e a g u a , a lcoh o l, un poliol y m e z c la s a d e c u a d a s de los m ism o s; un ace ite ve g etal; o un éste r o rg á n ico inyectable.

15. C o m p o sic ió n fa rm a cé u tica de la re iv in d icac ió n 13 o 14 , que co m p ren d e a d e m á s un a d yu van te; un recub rim iento; un a gente antim icro biano , a n tib acterian o o antifúngico; un a gente isotónico; un polialcohol; un agente retard ad o r de la a b so rc ió n ; un estab ilizad o r; un tam p ón; un ten sioa ctivo ; y /o un antioxid ante fa rm a cé u tica m e n te a cep tab le .

16. C o m p o sic ió n fa rm a cé u tica de la re iv in d icac ió n 15 , en la que:

el a d y u v a n te e s un co n se rva n te , a g en te hum ectante, a g en te e m u lsio n a n te o a g en te d isp e rsa n te ;

el recub rim iento e s lecitina;

el a g en te a n tib acterian o o antifúngico e s un p a ra b en o , c lorobutanol, fenol o á cid o sórbico;

el a g en te isotónico e s un a z ú c a r o cloruro de sodio;

el po lia lco ho l e s m anitol o sorbitol; y/o

el antio xid ante fa rm a cé u tica m e n te a ce p ta b le e s un antio xid ante so lu b le en a g u a , un antio xid ante so lu b le en a ce ite o un a g en te q u elan te de m etales.

17. C o m p o sic ió n fa rm a cé u tica de la re iv in d icac ió n 16 , en la que:

el antio xid ante so lu b le en a g u a e s ácid o a scó rb ico , clorhidrato de c iste ín a , bisulfato de sodio , m etabisulfito de sodio o sulfito de sodio;

el antioxid ante so lu b le en a ce ite e s palm itato de a sco rb ilo , h id rox ian iso l butilado, hidroxitolueno butilado, lecitina, galato de propilo o a lfa-tocoferol; y/o

el a g en te qu elante de m e tale s e s á cid o cítrico, á cid o e tilen d ia m in otetra acético (E D T A ), sorbitol, á cid o tartárico o á cid o fosfórico.

18. P o lin u cleó tid o que co difica una proteína citotóxica, se g ú n una cu a lq u ie ra de la s re iv in d ic a c io n e s 1 - 12 o un co m p lem en to de la m ism a.

19. V e cto r de ex p re sió n qu e co m p re n d e un polinucleótid o se g ú n la re iv in d icac ió n 18.

20. C é lu la h u é sp e d qu e co m p re n d e un polinucleótido, se g ú n la re iv in d ica c ió n 18 , o un v e cto r de e x p re sió n , se g ú n la re iv in d ica c ió n 19.

21. P ro ce d im ie n to in v itro para d estru ir u n a c é lu la qu e e x p re sa C D 38 , co m p re n d ie n d o el proced im iento la e tap a de p o n er en contacto la cé lu la con una proteína citotóxica, se g ú n cu a lq u ie ra de la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 12 , o una co m p o sic ió n fa rm a cé u tica , se g ú n una cu a lq u ie ra de la s re iv in d ic a c io n e s 13 - 17.

22. P ro te ín a citotóxica, se g ú n cu a lq u ie ra de la s re iv in d ic a c io n e s 1 - 12 , o una co m p o sic ió n fa rm a cé u tica , se g ú n c u a lq u ie ra de la s re iv in d ic a c io n e s 13 - 17 , para u sa r en el tratam iento o preven ció n de un a e n ferm ed ad , trastorno o a fe cc ió n en un p acie n te que lo n e ce site , en la qu e la en ferm ed ad , trastorno o a fe cc ió n s e caracteriza por c é lu la s qu e e x p re sa n C D 38.

23. P ro te ín a citotóxica, se g ú n cu a lq u ie ra de la s re iv in d ic a c io n e s 1 - 12 , o una co m p o sic ió n farm a cé u tica , se g ú n una c u a lq u ie ra de la s re iv in d ic a c io n e s 13 - 17 , p a ra u sa r, se g ú n la re iv in d ica c ió n 22 , en la q u e la en fe rm e d ad , trastorno o a fe cc ió n e s c á n c e r o un tum or caracterizado por c é lu la s qu e e x p re sa n C D 38.

24. P ro te ín a citotóxica, se g ú n cu a lq u ie ra de la s re iv in d ic a c io n e s 1 - 12 , o una co m p o sic ió n farm a cé u tica , se g ú n una c u a lq u ie ra de la s re iv in d ic a c io n e s 13 - 17 , p a ra usar, se g ú n la re iv in d ica c ió n 23 , en la qu e el c á n c e r s e s e le c c io n a del grupo que co n siste en: c á n c e r de hu eso , c á n c e r de m am a, c á n c e r del s iste m a n ervio so centra l/periférico, c á n c e r gastro intestinal, c á n c e r de c é lu la s g e rm in a le s, c á n c e r g lan d u lar, c á n c e r de c a b e z a y cuello, c á n c e r hem atológico, c á n c e r de riñón-tracto urinario, c á n c e r de hígad o , c á n c e r de p u lm ó n/p leura, c á n c e r de próstata, sa rco m a , c á n c e r de piel y c á n c e r uterino.

25. P ro te ín a citotóxica, se g ú n cu a lq u ie ra de la s re iv in d ic a c io n e s 1 - 12 , o una co m p o sic ió n fa rm a cé u tica , se g ú n una c u a lq u ie ra de la s re iv in d ic a c io n e s 13 - 17 , p a ra u sa r, se g ú n la re iv in d ic a c ió n 22 , en la qu e la e n fe rm e d ad , trastorno o a fe cc ió n e s un trastorno inm unitario o infección m icro b ia n a caracterizado por c é lu la s qu e e x p re sa n C D 38.

26. P ro te ín a citotóxica, se g ú n cu a lq u ie ra de la s re iv in d ic a c io n e s 1 - 12 , o una co m p o sic ió n fa rm a cé u tica , se g ú n una cu a lq u ie ra de la s re iv in d ic a c io n e s 13 - 17 , para usar, se g ú n la re iv in d icac ió n 25 , en la qu e el trastorno inm unitario está a so c ia d o con u n a e n fe rm e d ad s e le c c io n a d a del grupo qu e co n siste en: a m ilo id o sis , e sp o n d ilit is a n q u ilo sa n te , a sm a , enfermedad de Crohn, diabetes, rechazo de injerto, enfermedad de injerto contra huésped, tiroiditis de Hashimoto, síndrome urémico hemolítico, enfermedad relacionada con el V1H, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, poliarteritis nodosa, poliartritis, psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, esclerodermia, choque séptico, síndrome de Sjogren, colitis ulcerosa, y vasculitis.