JP7370625B2 - 部位特異的コンジュゲーションのための志賀毒素aサブユニットエフェクターポリペプチド、志賀毒素エフェクター足場、及び細胞標的化分子 - Google Patents
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Description
ュゲート薬製造の鍵でありうる。なぜなら、均一な産物は、より良好な薬物動態プロファイル及び安全性プロファイルを一般に有するため、診療所でより良好に機能する可能性が高いからである。例えば、旧来の方法を使用して溶媒露出アミノ酸残基から生成されたタンパク質コンジュゲートは、様々なコンジュゲート化学量論比及び異なる残基位置結合部位を有するコンジュゲートの不均一な混合物をもたらしうる。さらに、生物学的薬物コンジュゲートの重要な品質基準は、販売のための政府の承認に必要とされうる均一性である(例えば、Kim E, Kim K, Biomol Ther23: 493-509 (2015);Zhou Q, Kim J, Anticancer Agents MedChem 15: 828-36 (2015)を参照されたい)。したがって、例えば、限定数
の既知残基部位との所望のコンジュゲート化学量論組成でのコンジュゲーションを強いる方法を使用することなどにより、タンパク質性生物学的分子へのコンジュゲーションを制御することが、望ましい。しかし、コンジュゲーションが単一の産物に限定される場合でも、コンジュゲートしていない物質からコンジュゲートを分離する精製は、非効率的であり且つ費用がかかりうる。
ある特定の実施形態では、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素ファミリーの少なくとも1つのメンバーのAサブユニットに由来し、ポリペプチド中の他の全てのアミノ酸残基と比べてユニークなアミノ酸残基を含む。ある特定のさらなる実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、1つ又は2つ以上の志賀毒素エフェクター機能を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態については、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、細胞内在化を促進すること、細胞侵入後にサイトゾルへの細胞内経路決定を指示すること、リボソームの触媒不活性化、及び細胞毒性から選択される、有意なレベルの1つ又は2つ以上の志賀毒素エフェクター機能を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態では、ユニークなアミノ酸残基は、異所的である。ある特定のさらなる実施形態では、ユニークなアミノ酸残基は、システイン、ヒスチジン、リジン、又は非天然アミノ酸残基である。ある特定のさらなる実施形態では、ユニークなアミノ酸残基は、核酸翻訳過程によって志賀毒素エフェクターポリペプチドに組み込まれうる。ある特定のさらなる実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ユニークなアミノ酸残基の官能基を介して、例えば、細胞標的化結合領域、リンカー、追加の外在性物質、カーゴ、細胞標的化を変化させる薬剤などの、異種分子と、共有結合で連結される。ある特定のさらなる実施形態では、異種分子は、抗生物質、抗原、抗原性物質、細胞毒性薬剤、放射性核種、細胞標的化分子を変化させる薬剤、検出促進剤、色素、T細胞エピトープ、フルオロフォア、免疫原、免疫原性物質、酵素、ジモキシン(zymoxin)、脂質、ポリマー
、ポリエチレングリコール、血清アルブミン結合剤、小分子化学療法剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、核酸、及びタンパク質-核酸複合体からなる群から選択される。
配列番号3の240~260、配列番号1若しくは配列番号2の243~257、配列番号1若しくは配列番号2の254~268、配列番号3の262~278、配列番号3の281~297、及び配列番号1若しくは配列番号2の285~293、又は志賀毒素Aサブユニット若しくはその誘導体中の同等の領域からなる、本来の位置にある志賀毒素Aサブユニット領域の群から選択される、内在性のB細胞及び/又はT細胞エピトープ領域を破壊する、埋め込まれた又は挿入された異種T細胞エピトープをさらに含む。
トープ領域の一部又は全てと重複する配列のアミノ末端トランケーションである破壊がない、配列番号3の240~260、配列番号1若しくは配列番号2の243~257、配列番号1若しくは配列番号2の254~268、配列番号3の262~278、配列番号3の281~297、及び配列番号1若しくは配列番号2の285~293、又は志賀毒素Aサブユニット若しくはその誘導体中の同等の領域からなる、本来の位置にある志賀毒素Aサブユニット領域の群から選択される、B細胞及び/又はT細胞エピトープ領域における変異をさらに含む。
び/又はT細胞エピトープ及び/又はエピトープ領域の一部又は全てと重複するアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションである破壊がない、配列番号3の240~260、配列番号1若しくは配列番号2の243~257、配列番号1若しくは配列番号2の254~268、配列番号3の262~278、配列番号3の281~297、及び配列番号1若しくは配列番号2の285~293、又は志賀毒素Aサブユニット若しくはその誘導体中の同等の領域からなる群から選択される、少なくとも3つの、内在性の、B細胞及び/又はT細胞エピトープ領域の破壊をさらに含む。
ある特定のさらなる実施形態では、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド足場は、i)志賀毒素エフェクターポリペプチド及びii)追加のタンパク質性構造を含み、追加のタンパク質性(proteinacoues)構造は、志賀毒素エフェクターポリペプチド中に存在
しないアミノ酸残基、例えば、ユニークなアミノ酸残基、及び/又は志賀毒素エフェクターポリペプチド足場の志賀毒素エフェクターポリペプチド成分(本書では志賀毒素エフェクターポリペプチド領域若しくは志賀毒素エフェクター領域とも称される)にとってユニークな官能基を有するアミノ酸残基を含む。志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素ファミリーの少なくとも1つのメンバーのAサブユニットに由来し、志賀ホロトキシンのいかなる細胞標的化ドメインも、志賀毒素Bサブユニットいかなる部分も含む必要がない。ある特定のさらなる実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド足場は、1つ又は2つ以上の志賀毒素エフェクター機能を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド足場は、細胞内在化を促進すること、細胞侵入後にサイトゾルへの細胞内経路決定を指示すること、リボソームを触媒不活性化、及び細胞毒性から選択される、有意なレベルの1つ又は2つ以上の志賀毒素エフェクター機能を示すことができる。
ある特定の実施形態では、本発明の細胞標的化分子は、(1)本発明の及び/又は上記の志賀毒素エフェクターポリペプチドと、(2)少なくとも1つの細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる細胞標的化剤又は細胞標的化結合領域とを含む。ある特定のさらなる実施形態では、細胞標的化分子は、コンジュゲートされている部分構造を含む。ある特定のさらなる実施形態では、コンジュゲートされている部分構造は、ペプチド、タンパク質、核酸、タンパク質-核酸複合体、細胞毒性薬剤、抗生物質、及び検出促進剤からなる群から選択される。ある特定のさらなる実施形態では、細胞標的化結合領域は、ポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態では、細胞標的化結合領域は、免疫グロブリン型結合領域を含む。ある特定のさらなる実施形態では、免疫グロブリン型結合領域は、自律VHドメイン、シングルドメイン抗体断片(sdAb)、ナノボディ、ラクダ科動物に由来する重鎖抗体ドメイン(VHH又はVHドメイン断片)、軟骨魚類に由来する重鎖抗体ドメイン(VHH又はVHドメイン断片)、免疫グロブリン新規抗原受容体(IgNAR)、VNAR断片、一本鎖可変断片(scFv)、抗体可変断片(Fv)、相補性決定領域3断片(CDR3)、拘束FR3-CDR3-FR4ポリペプチド(FR3-CDR3-FR4)、Fd断片、小モジュラー免疫薬(SMIP)ドメイン、抗原結合性断片(Fab)、アルマジロ反復ポリペプチド(ArmRP)、フィブロネクチン由来第10フィブロネクチンIII型ドメイン(10Fn3)、テネイシンIII型ドメイン(TNfn3)、アンキリン反復モチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Aドメイン(LDLR-A)、リポカリン(アンチカリン)、Kunitzドメイン、プロテインA由来Zドメイン、ガンマ-Bクリスタリン由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Sac7d由来ポリペプチド(アフィチン)、Fyn由来SH2ドメイン、ミニタンパク質、C型レクチン様ドメイン足場、改変抗体模倣物、及び結合機能性を保持する前述のもののいずれかの遺伝子操作されたあらゆる対応物からなる群から選択されるポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態では、結合領域は、CD20、PD-L1、CD22、CD40、CD79、CD25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前立腺特異的膜抗原、Cripto、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、Lewis-Y、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG-72、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合タンパク質、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、ガングリオシドLewis-Y2、VEGFR、アルファVベータ3、アルファ5ベータ1、ErbB1/EGFR、Erb3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、テネイシン、CD64、メソセリン、BRCA1、MART-1/MelanA、gp100、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、NY-ESO-1、CDK-4、ベータ-カテニン、MUM-1、カスパーゼ-8、KIAA0205、HPVE6、SART-1、PRAME、癌胎児抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパルチル(アスパラギニル)ベータ-ヒドロキシラーゼ、EphA2、HER3/ErbB-3、MUC1、MART-1/MelanA、gp100、チロシナーゼ関連抗原、ヒトチロシナーゼ関連タンパク質1、HPV-E7、エプスタイン・バーウイルス抗原、Bcr-Abl、アルファ-フェトプロテイン抗原、17-A1、膀胱腫瘍抗原、SAIL、CD38、CD15、CD23、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305;C3AR、FceRIa、ガレクチン-9、mrp-14、シグレック-8、シグレック-10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT-3、ガレクチン-3、CD11a-c、GITRL、MHCクラスII、CD284-TLR4、CD107-Mac3、CD195-CCR5、HLA-DR、CD16/32、CD282-TLR2、及び前述のもののいずれかのあらゆる免疫原性断片からなる群から選択される、細胞外標的生体分子と結合することができる。ある特定の実施形態では、結合領域は、配列番号844~1100のいずれか1つで示されるペプチド又はポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態では、本発明の細胞標的化分子は、配列番号773~817、835~837、及び1105~1108のいずれか1つで示されるポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる。ある特定のさらなる実施形態では、細胞標的化分子は、KDELファミリーのメンバーのカルボキシ末端小胞体保留/回収シグナルモチーフを含む。ある特定のさらなる実施形態では、カルボキシ末端小胞体保留/回収シグナルモチーフは、KDEL(配列番号1142)、HDEF(配列番号1143)、HDEL(配列番号1144)、RDEF(配列番号1145)、RDEL(配列番号1146)、WDEL(配列番号1147)、YDEL(配列番号1148)、HEEF(配列番号1149)、HEEL(配列番号1150)、KEEL(配列番号1151)、REEL(配列番号1152)、KAEL(配列番号1153)、KCEL(配列番号1154)、KFEL(配列番号1155)、KGEL(配列番号1156)、KHEL(配列番号1157)、KLEL(配列番号1158)、KNEL(配列番号1159)、KQEL(配列番号1160)、KREL(配列番号1161)、KSEL(配列番号1162)、KVEL(配列番号1163)、KWEL(配列番号1164)、KYEL(配列番号1165)、KEDL(配列番号1166)、KIEL(配列番号1167)、DKEL(配列番号1168)、FDEL(配列番号1169)、KDEF(配列番号1170)、KKEL(配列番号1171)、HADL(配列番号1172)、HAEL(配列番号1173)、HIEL(配列番号1174)、HNEL(配列番号1175)、HTEL(配列番号1176)、KTEL(配列番号1177)、HVEL(配列番号1178)、NDEL(配列番号1179)、QDEL(配列番号1180)、REDL(配列番号1181)、RNEL(配列番号1182)、RTDL(配列番号1183)、RTEL(配列番号1184)、SDEL(配列番号1185)、TDEL(配列番号1186)、SKEL(配列番号1187)、STEL(配列番号1188)、及びEDEL(配列番号1189)からなる群から選択される。ある特定のさらなる実施形態については、細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされている細胞への細胞標的化分子の投与は、次のうちの1つ又は2つ以上をもたらす:(1)細胞内部への細胞標的化分子の内在化、(2)細胞のサイトゾルへの細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチドの細胞内経路決定、(3)細胞のリボソーム機能の破壊、及び(4)細胞の殺滅。ある特定のさらなる実施形態については、本発明の細胞標的化分子は、細胞を殺滅することができる。ある特定のさらなる実施形態については、細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされている細胞に本発明の細胞標的化分子を投与すると、細胞標的化分子は、細胞死を引き起こすこと、すなわち、細胞を殺滅することができる。
3)、テネイシンIII型ドメイン(TNfn3)、アンキリン反復モチーフドメイン、低
密度リポタンパク質受容体由来Aドメイン(LDLR-A)、リポカリン(アンチカリン)、Kunitzドメイン、プロテインA由来Zドメイン、ガンマ-Bクリスタリン由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Sac7d由来ポリペプチド(アフィチン)、Fyn由来SH2ドメイン、ミニタンパク質、C型レクチン様ドメイン足場、改変抗体模倣物、及び結合機能性を保持する前述のもののいずれかの遺伝子操作されたあらゆる対応物からなる群から選択されるポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態では、結合領域は、CD20、PD-L1、CD22、CD40、CD79、CD25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前立腺特異的膜抗原、Cripto、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、Lewis-Y、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG-72、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合タンパク質、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、ガングリオシドLewis-Y2、VEGFR、アルファVベータ3、アルファ5ベータ1、ErbB1/EGFR、Erb3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、テネイシン、CD64、メソセリン、BRCA1、MART-1/MelanA、gp100、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、NY-ESO-1、CDK-4、ベータ-カテニン、MUM-1、カスパーゼ-8、KIAA0205、HPVE6、SART-1、PRAME、癌胎児抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパルチル(アスパラギニル)ベータ-ヒドロキシラーゼ、EphA2、HER3/ErbB-3、MUC1、MART-1/MelanA、gp100、チロシナーゼ関連抗原、ヒトチロシナーゼ関連タンパク質1、HPV-E7、エプスタイン・バーウイルス抗原、Bcr-Abl、アルファ-フェトプロテイン抗原、17-A1、膀胱腫瘍抗原、SAIL、CD38、CD15、CD23、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305;C3AR、FceRIa、ガレクチン-9、mrp-14、シグレック-8、シグレック-10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT-3、ガレクチン-3、CD11a-c、GITRL、MHCクラスII、CD284-TLR4、CD107-Mac3、CD195-CCR5、HLA-DR、CD16/32、CD282-TLR2、及び前述のもののいずれかのあらゆる免疫原性断片からなる群から選択される、細胞外標的生体分子と結合することができる。ある特定のさらなる実施形態では、本発明の細胞標的化分子は、配列番号773~817、835~837、及び844~1108のいずれか1つで示されるポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態では、細胞標的化分子は、KDELファミリーのメンバーのカルボキシ末端小胞体保留/回収シグナルモチーフを含む。ある特定のさらなる実施形態では、カルボキシ末端小胞体保留/回収シグナルモチーフは、KDEL(配列番号1142)、HDEF(配列番号1143)、HDEL(配列番号1144)、RDEF(配列番号1145)、RDEL(配列番号1146)、WDEL(配列番号1147)、YDEL(配列番号1148)、HEEF(配列番号1149)、HEEL(配列番号1150)、KEEL(配列番号1151)、REEL(配列番号1152)、KAEL(配列番号1153)、KCEL(配列番号1154)、KFEL(配列番号1155)、KGEL(配列番号1156)、KHEL(配列番号1157)、KLEL(配列番号1158)、KNEL(配列番号1159)、KQEL(配列番号1160)、KREL(配列番号1161)、KSEL(配列番号1162)、KVEL(配列番号1163)、KWEL(配列番号1164)、KYEL(配列番号1165)、KEDL(配列番号1166)、KIEL(配列番号1167)、DKEL(配列番号1168)、FDEL(配列番号1169)、KDEF(配列番号1170)、KKEL(配列番号1171)、HADL(配列番号1172)、HAEL(配列番号1173)、HIEL(配列番号1174)、HNEL(配列番号1175)、HTEL(配列番号1176)、KTEL(配列番号1177)、HVEL(配列番号1178)、NDEL(配列番号1179)、QDEL(配列番号1180)、REDL(配列番号1181)、RNEL(配列番号1182)、RTDL(配列番号1183)、RTEL(配列番号1184)、SDEL(配列番号1185)、TDEL(配列番号1186)、SKEL(配列番号1187)、STEL(配列番号1188)、及びEDEL(配列番号1189)からなる群から選択される。ある特定のさらなる実施形態については、細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされている細胞への細胞標的化分子の投与は、次のうちの1つ又は2つ以上をもたらす:(1)細胞内部への細胞標的化分子の内在化、(2)細胞のサイトゾルへの細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチドの細胞内経路決定、(3)細胞のリボソーム機能の破壊、及び(4)細胞の殺滅。ある特定のさらなる実施形態については、本発明の細胞標的化分子は、細胞を殺滅することができる。ある特定のさらなる実施形態については、細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされている細胞に本発明の細胞標的化分子を投与すると、細胞標的化分子は、細胞死を引き起こすこと、すなわち、細胞を殺滅することができる。
ネイシンIII型ドメイン(TNfn3)、アンキリン反復モチーフドメイン、低密度リポ
タンパク質受容体由来Aドメイン(LDLR-A)、リポカリン(アンチカリン)、Kunitzドメイン、プロテインA由来Zドメイン、ガンマ-Bクリスタリン由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Sac7d由来ポリペプチド(アフィチン)、Fyn由来SH2ドメイン、ミニタンパク質、C型レクチン様ドメイン足場、改変抗体模倣物、及び結合機能性を保持する前述のもののいずれかの遺伝子操作されたあらゆる対応物からなる群から選択されるポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態では、結合領域は、CD20、PD-L1、CD22、CD40、CD79、CD25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前立腺特異的膜抗原、Cripto、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、Lewis-Y、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG-72、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合タンパク質、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、ガングリオシドLewis-Y2、VEGFR、アルファVベータ3、アルファ5ベータ1、ErbB1/EGFR、Erb3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、テネイシン、CD64、メソセリン、BRCA1、MART-1/MelanA、gp100、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、NY-ESO-1、CDK-4、ベータ-カテニン、MUM-1、カスパーゼ-8、KIAA0205、HPVE6、SART-1、PRAME、癌胎児抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパルチル(アスパラギニル)ベータ-ヒドロキシラーゼ、EphA2、HER3/ErbB-3、MUC1、MART-1/MelanA、gp100、チロシナーゼ関連抗原、ヒトチロシナーゼ関連タンパク質1、HPV-E7、エプスタイン・バーウイルス抗原、Bcr-Abl、アルファ-フェトプロテイン抗原、17-A1、膀胱腫瘍抗原、SAIL、CD38、CD15、CD23、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305;C3AR、FceRIa、ガレクチン-9、mrp-14、シグレック-8、シグレック-10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT-3、ガレクチン-3、CD11a-c、GITRL、MHCクラスII、CD284-TLR4、CD107-Mac3、CD195-CCR5、HLA-DR、CD16/32、CD282-TLR2、及び前述のもののいずれかのあらゆる免疫原性断片からなる群から選択される、細胞外標的生体分子と結合することができる。ある特定の実施形態では、結合領域は、配列番号844~1100のいずれか1つで示されるペプチド又はポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態では、細胞標的化分子は、KDELファミリーのメンバーのカルボキシ末端小胞体保留/回収シグナルモチーフを含む。ある特定のさらなる実施形態では、カルボキシ末端小胞体保留/回収シグナルモチーフは、KDEL(配列番号1142)、HDEF(配列番号1143)、HDEL(配列番号1144)、RDEF(配列番号1145)、RDEL(配列番号1146)、WDEL(配列番号1147)、YDEL(配列番号1148)、HEEF(配列番号1149)、HEEL(配列番号1150)、KEEL(配列番号1151)、REEL(配列番号1152)、KAEL(配列番号1153)、KCEL(配列番号1154)、KFEL(配列番号1155)、KGEL(配列番号1156)、KHEL(配列番号1157)、KLEL(配列番号1158)、KNEL(配列番号1159)、KQEL(配列番号1160)、KREL(配列番号1161)、KSEL(配列番号1162)、KVEL(配列番号1163)、KWEL(配列番号1164)、KYEL(配列番号1165)、KEDL(配列番号1166)、KIEL(配列番号1167)、DKEL(配列番号1168)、FDEL(配列番号1169)、KDEF(配列番号1170)、KKEL(配列番号1171)、HADL(配列番号1172)、HAEL(配列番号1173)、HIEL(配列番号1174)、HNEL(配列番号1175)、HTEL(配列番号1176)、KTEL(配列番号1177)、HVEL(配列番号1178)、NDEL(配列番号1179)、QDEL(配列番号1180)、REDL(配列番号1181)、RNEL(配列番号1182)、RTDL(配列番号1183)、RTEL(配列番号1184)、SDEL(配列番号1185)、TDEL(配列番号1186)、SKEL(配列番号1187)、STEL(配列番号1188)、及びEDEL(配列番号1189)からなる群から選択される。ある特定のさらなる実施形態については、細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされている細胞への細胞標的化分子の投与は、次のうちの1つ又は2つ以上をもたらす:(1)細胞内部への細胞標的化分子の内在化、(2)細胞のサイトゾルへの細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチドの細胞内経路決定、(3)細胞のリボソーム機能の破壊、及び(4)細胞の殺滅。ある特定のさらなる実施形態については、本発明の細胞標的化分子は、細胞を殺滅することができる。ある特定のさらなる実施形態については、細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされている細胞に本発明の細胞標的化分子を投与すると、細胞標的化分子は、細胞死を引き起こすこと、すなわち、細胞を殺滅することができる。
は配列番号2の243~257、配列番号1若しくは配列番号2の254~268、配列番号3の262~278、配列番号3の281~297、及び配列番号1若しくは配列番号2の285~293、又は志賀毒素Aサブユニット若しくはその誘導体中の同等の領域からなる、本来の位置にある志賀毒素Aサブユニット領域の群から選択される内在性B細胞及び/又はT細胞エピトープ領域を破壊する。
1つの破壊されるエピトープ領域の一部又は全てと重複する配列のアミノ末端トランケーションである破壊がない、配列番号3の240~260、配列番号1若しくは配列番号2の243~257、配列番号1若しくは配列番号2の254~268、配列番号3の262~278、配列番号3の281~297、及び配列番号1若しくは配列番号2の285~293、又は志賀毒素Aサブユニット若しくはその誘導体中の同等の領域からなる、本来の位置にある志賀毒素Aサブユニット領域の群から選択されるB細胞及び/又はT細胞エピトープ領域における変異を含む。
指す。
に志賀毒素Aサブユニット又はその誘導体中の同等のアミノ酸残基からなる群から選択される、本来の位置にある志賀毒素Aサブユニットアミノ酸残基に存在してもよい。ある特定のさらなる実施形態では、少なくとも2つの破壊各々は、配列番号1又は配列番号2の1、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の4、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の8、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の9、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の11、配列番号1又は配列番号2の33、配列番号1又は配列番号2の43、配列番号1又は配列番号2の45、配列番号1又は配列番号2の47、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の48、配列番号1又は配列番号2の49、配列番号1又は配列番号2の53、配列番号1又は配列番号2の55、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の58、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の59、配列番号1又は配列番号2の60、配列番号1又は配列番号2の61、配列番号1又は配列番号2の62、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の94、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の96、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の109、配列番号1又は配列番号2の110、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の112、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の147、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の179、配列番号1又は配列番号2の180、配列番号1又は配列番号2の181、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の183、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の184、配列番号1又は配列番号2の185、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の186、配列番号1又は配列番号2の187、配列番号1又は配列番号2の188、配列番号1又は配列番号2の189、配列番号3の204、配列番号1又は配列番号2の205、配列番号1又は配列番号2の247、配列番号3の247、配列番号3の250、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の264、配列番号1又は配列番号2の265、及び配列番号1又は配列番号2の286、並びに志賀毒素Aサブユニット又はその誘導体中の同等のアミノ酸残基からなる群から選択される、野生型志賀毒素Aサブユニットに対する、少なくとも1つのアミノ酸残基置換を含む。
れた内在性のB細胞及び/又はT細胞エピトープ及び/又はエピトープ領域の一部又は全てと重複するアミノ酸残基のカルボキシ末端トランケーションである破壊がない、配列番号3の240~260、配列番号1若しくは配列番号2の243~257、配列番号1若しくは配列番号2の254~268、配列番号3の262~278、配列番号3の281~297、及び配列番号1若しくは配列番号2の285~293、又は志賀毒素Aサブユニット若しくはその誘導体中の同等の領域からなる群から選択される、少なくとも3つの内在性B細胞及び/又はT細胞エピトープ領域の破壊を含む。
48、配列番号3の42~48、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の53~66、及び志賀毒素Aサブユニット又はその誘導体中の同等の領域からなる、本来の位置にある志賀毒素Aサブユニット領域の群から選択される。
3のA、G、V、L、I、F、M及びCへの、S43のA、G、V、L、I、F及びMへの、G44のA又はLへの、S45のA、G、V、L、I、F及びMへの、T45のA、G、V、L、I、F及びMへの、G46のA及びPへの、D47のA、G、V、L、I、F、S、M及びQへの、N48のA、G、V、L、M及びFへの、L49のA、V、C及びGへの、Y49のA、G、V、L、I、F、M及びTへの、F50のA、G、V、L、I及びTへの、A51への、D53のA、G、V、L、I、F、S及びQへの、V54のA、G、I及びLへの、R55のA、G、V、L、I、F、M、Q、S、K及びHへの、G56のA及びPへの、I57のA、G、V及びMへの、L57のA、V、C、G、M及びFへの、D58のA、G、V、L、I、F、S及びQへの、P59のA、G及びFへの、E60のA、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M、T及びRへの、E61のA、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M及びRへの、G62のAへの、R84のA、G、V、L、I、F、M、Q、S、K及びHへの、V88のA及びGへの、I88のA、V、C及びGへの、D94のA、G、V、L、I、F、S及びQへの、S96のA、G、V、I、L、F及びMへの、T104のA、G、V、L、I、F、M及びNへの、A105のLへの、T107のA、G、V、L、I、F、M及びPへの、S107のA、G、V、L、I、F、M及びPへの、L108のA、V、C及びGへの、S109のA、G、V、I、L、F及びMへの、T109のA、G、V、I、L、F、M及びSへの、G110のAへの、S112のA、G、V、L、I、F及びMへの、D111のA、G、V、L、I、F、S、Q及びTへの、S112のA、G、V、L、I、F及びMへの、D141のA、G、V、L、I、F、S及びQへの、G147のAへの、V154のA及びGへの、R179のA、G、V、L、I、F、M、Q、S、K及びHへの、T180のA、G、V、L、I、F、M及びSへの、T181のA、G、V、L、I、F、M及びSへの、D183のA、G、V、L、I、F、S及びQへの、D184のA、G、V、L、I、F、S及びQへの、L185のA、G、V及びCへの、S186のA、G、V、I、L、F及びMへの、G187のAへの、R188のA、G、V、L、I、F、M、Q、S、K及びHへの、S189のA、G、V、I、L、F及びMへの、D197のA、G、V、L、I、F、S及びQへの、D198のA、G、V、L、I、F、S及びQへの、R204のA、G、V、L、I、F、M、Q、S、K及びHへの、R205のA、G、V、L、I、F、M、Q、S、K及びHへの、S247のA、G、V、I、L、F及びMへの、Y247のA、G、V、L、I、F及びMへの、R248のA、G、V、L、I、F、M、Q、S、K及びHへの、R250のA、G、V、L、I、F、M、Q、S、K及びHへの、R251のA、G、V、L、I、F、M、Q、S、K及びHへの、D264のA、G、V、L、I、F、S及びQへの、G264のAへの、並びにT286のA、G、V、L、I、F、M及びSへのアミノ酸残基置換からなる群から選択される、野生型志賀毒素Aサブユニットに対する1つ又は2つ以上のアミノ酸残基置換を含む。
ベルの志賀毒素触媒活性を示すことができる。
フェクターポリペプチドが存在する細胞の初期エンドソーム区画から、MHCクラスI分子に、エピトープを細胞内送達することができる。ある特定のさらなる実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞の表面へのMHCクラスI分子による提示のためにCD8+T細胞エピトープを細胞内送達することができる。
リペプチドに対して細胞標的化分子のアミノ末端の近位に位置しない。ある特定のさらなる実施形態では、結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドは、細胞標的化分子内で、結合領域が志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の近位に位置にないように物理的に配置又は配向される。ある特定のさらなる実施形態では、結合領域は、細胞標的化分子内の、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端より志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端の近位に位置する。ある特定のさらなる実施形態については、本発明の細胞標的化分子は、細胞毒性でなく、細胞に導入されたとき、例えば、アミノ末端を有し且つ結合領域を含む参照細胞標的化分子、及び前記参照細胞標的化分子のアミノ末端に又はその近位に位置しない志賀毒素エフェクターポリペプチドなどの、参照分子の細胞毒性と比較して、細胞外空間から小胞体の細胞内区画及び/又はサイトゾルへのより高い細胞内経路決定効率を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態については、本発明の細胞標的化分子は、例えば、参照細胞標的化分子の細胞毒性と比較して4倍、5倍、6倍、9倍、又はそれより強い細胞毒性などの、よりよく最適化された細胞毒性強度で細胞毒性を示す。ある特定のさらなる実施形態については、標的陽性細胞集団に対する本発明の細胞標的化分子の細胞毒性は、CD50値によりアッセイして、第二の標的陽性細胞集団に対する参照細胞標的化分子の細胞毒性より3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍又はそれより強い。ある特定のさらなる実施形態では、参照細胞標的化分子は、KDELファミリーのいかなるカルボキシ末端小胞体保留/回収シグナルモチーフも含まない。
生体分子の存在又はレベルに関して異なる2つの異なる細胞型集団への本発明の細胞標的化分子の投与である、ある特定のさらなる実施形態では、細胞標的化分子は、細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされている細胞型を、細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされていない細胞型に対するCD50の少なくとも1/3又はそれ未満のCD50で、細胞死させることができる。ある特定のさらなる実施形態、それによる、メンバーが細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされている第一の細胞集団、及びメンバーが結合領域のいかなる細胞外標的生体分子にも物理的にカップリングされていない第二の細胞集団への、本発明の細胞標的化分子の投与については、前記第二の細胞集団のメンバーと比べて前記第一の細胞集団のメンバーに対する細胞標的化分子の細胞毒性効果は、少なくとも3倍大きい。ある特定の実施形態、それによる、メンバーが細胞標的化分子の結合領域の有意な量の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされている第一の細胞集団、及びメンバーが結合領域の有意な量のいかなる細胞外標的生体分子にも物理的にカップリングされていない第二の細胞集団への、細胞標的化分子の投与については、前記第二の細胞集団のメンバーと比べて前記第一の細胞集団のメンバーに対する細胞標的化分子の細胞毒性効果は、少なくとも3倍大きい。ある特定の実施形態、それによる、標的生体分子陽性細胞の第一の集団、及びメンバーが細胞標的化分子の結合領域の有意な量の標的生体分子を細胞表面で発現しない第二の細胞集団への、細胞標的化分子の投与については、第二の細胞集団のメンバーと比べて第一の細胞集団のメンバーに対する細胞標的化分子の細胞毒性効果は、少なくとも3倍大きい。
すことができ、及び/又は有意なレベルの志賀毒素細胞毒性を示すことができる。
で述べられる適切なレベルの志賀毒素生物活性を保持することを条件に、例えば、少なくとも4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa、又はそれより高い質量を有する分子部分構造などを含む比較的大きい分子部分構造内に含まれる。
リペプチドも含まない。むしろ、本発明の細胞標的化分子の、ある特定の実施形態では、志賀毒素Aサブユニット由来領域は、細胞標的化を果たすために異種結合領域と機能的に会合している。
も、その受容体結合断片も、含まない。実施形態セット#3の、ある特定の実施形態では、結合領域は、ヒトケモカイン又はヒトTRAILも、その受容体結合断片も、含まない。実施形態セット#3の、ある特定の実施形態では、免疫グロブリン型結合領域は、リガンドも、その受容体結合断片も、含まない。実施形態セット#3の、ある特定の実施形態では、免疫グロブリン型結合領域は、ケモカイン又はTNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)も、それらの受容体結合断片も、含まない。実施形態セット#3の、ある特定の実施形態では、結合領域は、ヒトCCケモカインも、その受容体結合断片も、含まない。実施形態セット#1~#3の、ある特定の実施形態では、結合領域は、ヒトCCケモカインCCL2(Bose S, Cho J et al., Arch Pharm Res 36: 1039-50 (2013)を参照されたい)を含まない。実施形態セット#1~#3の、ある特定の実施形態では、結合領域は、ヒトCCケモカインCCL2も、その受容体結合断片も含まず、StxAのアミノ酸75~247からなるカルボキシ末端志賀毒素エフェクターポリペプチドを含まない。本発明の細胞標的化分子の、ある特定の実施形態では、結合領域は、StxA(配列番号2)のアミノ酸75~247からなるカルボキシ末端志賀毒素エフェクターポリペプチドと融合している、ヒトCCケモカインCCL2も、その受容体結合断片も含まない。実施形態セット#3の実施形態では、結合領域は、ヒトTRAILも、その受容体結合断片も、含まない。
cytotoxicity)、抗体依存性細胞毒性(ADCC,antibody-dependentcytotoxicity)、及びFc領域を含む分子が細胞外結合している細胞の貪食を開始させることを含む。
の外在性物質の送達に利用されうる。ある特定の実施形態では、本発明の細胞標的化分子は、コンジュゲートされている分子を含み、このコンジュゲートされている分子は、追加の外在性物質を表す。追加の外在性物質を含む、本発明の細胞標的化分子の、ある特定の実施形態については、細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされている1つ又は2つ以上の細胞に細胞標的化分子を投与すると、細胞標的化分子は、約5時間、4時間、3時間、2時間、1時間、30分、若しくはそれ未満で、細胞に適した生理的温度で、及び/又は約摂氏37度で、1つ又は2つ以上の細胞に内在化する。ある特定のさらなる実施形態については、1つ又は2つ以上の細胞は、標的陽性細胞である。ある特定の実施形態については、1つ又は2つ以上の細胞は、有意な量の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされている。
ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、及びタンパク質-核酸複合体からなる群から選択される、追加の外在性物質を表す。ある特定のさらなる実施形態では、追加の外在性物質は、酵素を含むタンパク質である。ある特定の他の実施形態では、追加の外在性物質は、低分子阻害RNA(siRNA,small inhibiting RNA)又はマイクロRNA(miRNA,microRNA)として機能するポリヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、追加の外在性物質は、例えば病原体からの抗原などの抗原である、ペプチドである。ある特定の実施形態では、抗原は、細菌タンパク質、がんの際に変異されるタンパク質、がんの際に異常に発現されるタンパク質、T細胞相補性決定領域ポリペプチド、及びウイルスタンパク質からなる群から選択される、分子に由来する。ある特定の実施形態では、細胞毒性薬剤は、化学療法剤、細胞毒性抗生物質、アルキル化剤、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害剤、及び/又はチューブリン阻害剤である。
触させるステップは、インビトロで行われる。ある特定の他の実施形態については、細胞を接触させるステップは、例えば患者体内などの、インビボで行われる。細胞内在化誘導方法の、ある特定のさらなる実施形態については、細胞標的化分子の細胞内在化は、約5時間、4時間、3時間、2時間、1時間、30分若しくはそれ未満で、細胞に適した生理的温度で、及び/又は約摂氏37度で行われる。ある特定のさらなる実施形態については、細胞は、標的陽性細胞である。ある特定の実施形態については、細胞は、有意な量の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされている。
プを含む方法を提供する。
本発明のこれらの治療方法の、ある特定の実施形態については、本発明の 方法を使用して治療される疾患、障害又は状態は、がん、腫瘍、異常増殖状態、及び/又は免疫障害である。本発明のこれらの治療方法の、ある特定の実施形態については、治療される疾患は、骨がん(例えば、多発性骨髄腫又はユーイング肉腫)、乳がん、中枢/末梢神経系がん(例えば、脳がん、神経線維腫症、又は神経膠芽腫)、消化器がん(例えば、胃がん又は結腸直腸がん)、胚細胞がん(例えば、卵巣がん及び精巣がん)、腺がん(例えば、膵臓がん、副甲状腺がん、褐色細胞腫、唾液腺がん、又は甲状腺がん)、頭頸部がん(例えば、上咽頭がん、口腔がん、又は咽頭がん)、血液がん(例えば、白血病、リンパ腫、又は骨髄腫)、腎臓・尿路がん(例えば、腎がん及び膀胱がん)、肝臓がん、肺/胸膜がん(例えば、中皮腫、小細胞肺癌、又は非小細胞肺癌)、前立腺がん、肉腫(例えば、血管肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、又は滑膜肉腫)、皮膚がん(例えば、基底細胞癌、扁平上皮癌、又はメラノーマ)、子宮がん、AIDS、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、喘息、自閉症、心臓発生、クローン病、糖尿病、エリテマトーデス、胃炎、移植片拒絶反応、移植片対宿主病(GVHD,graft-versus-host disease)、グレーブス病、橋本甲状腺炎、溶血性尿毒症症候群、HIV関連疾患、ループスエリテマトーデス、リンパ増殖性障害、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎症、多発動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、全身性ループスエリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、血管炎、細胞増殖、炎症、白血球活性化、白血球接着、白血球走化性、白血球成熟、白血球遊走、ニューロン分化、急性リンパ芽球性白血病(ALL,acute lymphoblastic leukemia)、T細胞急性リンパ球性白血病/リンパ腫(ALL,acute lymphocytic leukemia/lymphoma)、急性骨髄性白血病、急性骨髄系白血病(AML,acutemyeloid leukemia)、B細胞慢性リンパ球性白血病(B-CLL,B-cell chroniclymphocytic leukemia)、B細胞前リンパ球性白血病、バーキットリンパ腫(BL,Burkitt’s lymphoma)、慢性リンパ球性白血病(CLL,chroniclymphocytic leukemia)、慢性骨髄性白血病(CML-BP,chronicmyelogenous leukemia)、慢性骨髄系白血病(CML,chronic myeloidleukemia)、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病(HCL,hairycell leukemia)、ホジキンリンパ腫(HL,Hodgkin’s Lymphoma)、血管内大細胞型B細胞リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、リンパ形質細胞性リンパ腫、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫(MM,multiplemyeloma)、ナチュラルキラー細胞白血病、節性辺縁帯B細胞リンパ腫(nodal marginalB-cell lymphoma)、非ホジキンリンパ腫(NHL,Non-Hodgkin’s lymphoma)、形質細胞白血病、形質細胞腫、原発性滲出性リンパ腫、前リンパ球性白血病、前骨髄球性白血病、小リンパ球性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、T細胞リンパ腫(TCL,T-cell lymphoma)、重鎖病、単クローン性免疫グロブリン血症、単クローン性免疫グロブリン沈着症、骨髄異形成症候群(MDS,myelodusplastic syndromes)、くすぶり型多発性骨髄腫、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症からなる群から選択される。本発明のこれらの治療方法の、ある特定の実施形態については、治療される疾患は、血液がん、白血病、リンパ腫、メラノーマ及び骨髄腫からなる群から選択される。本発明のこれらの治療方法の、ある特定の実施形態については、治療される免疫障害は、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、喘息、クローン病、糖尿病、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、グレーブス病、グレーブス眼症、橋本甲状腺炎、溶血性尿毒症症候群、HIV関連疾患、ループスエリテマトーデス、多発性硬化症、視神経脊髄炎スペクトラム障害、N-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA,N-methyl D-aspartate)受容体脳炎、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群(OMS,opsoclonus myoclonus syndrome)、発作性夜間ヘモグロビン尿症、結節性多発動脈炎、多発性関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強膜炎、強皮症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、及び血管炎からなる群から選択される。本発明のこれらの治療方法の、ある特定の実施形態については、治療されるがんは、急性骨髄系白血病(急性骨髄性白血病又はAML)、急性非リンパ球性白血病、B細胞慢性リンパ球性白血病(B細胞CLL,B-cell chronic lymphocytic leukemia)、B細胞リンパ腫、B細胞非ホジキンリンパ腫(B細胞NHL,B-cell non-Hodgkin’s lymphoma)、前駆B細胞急性リンパ芽球性白血病(BCP-ALL,B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia、又はB-ALL)、B細胞前リンパ球性白血病(B-PLL,B-cell prolymphocytic leukemia)、バーキットリンパ腫(BL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、慢性骨髄系白血病(CML)、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL,diffuse large B-cell lymphoma、又はDLBL)、濾胞性リンパ腫(FL,follicular lymphoma)、ヘアリー細胞白血病(HCL)、ホジキンリンパ腫(HL又はHD)、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、マントル細胞リンパ腫(MCL,mantle celllymphoma)、多発性骨髄腫(MM)、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫(NLPHL,nodularlymphocyte predominant Hodgkin’s lymphoma)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、形質芽球性リンパ腫、形質細胞新生物(plasma cell neoplasma)、形質細胞性骨髄腫、前駆Bリンパ芽球性リンパ腫(B-LBL,precursorB-lymphoblastic lymphoma)、小リンパ球性リンパ腫(SLL,smalllymphocytic lymphoma)、T細胞大顆粒リンパ球性白血病(T-LGLL,T-celllarge granular lymphocyte leukemia)、T細胞リンパ腫(TCL)、T細胞前リンパ球性白血病(T-PLL,T-cell prolymphocytic leukemia)、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症(WM,Waldenstrom’smacroglobulinemia)からなる群から選択される。
つの(an)」及び「その(the)」は、文脈による別段の明白な指図がない限り、単数及
び複数両方の指示対象を含む。
は「含むこと(comprising)」などの語尾変化形は、述べられている整数(若しくは成分)又は整数(若しくは成分)群の包含を含意するが、他のいかなる整数(若しくは成分)又は整数(若しくは成分)群の除外も含意しないと解されるものとする。
これらに限定されない」は、同義で使用される。
5~20アミノ酸残基未満のサイズの小さいポリペプチドである。用語「アミノ酸配列」は、その長さに依存してペプチド又はポリペプチドを物理的に含む一連のアミノ酸又はアミノ酸残基を指す。別段の指示がない限り、本書において開示されるポリペプチド及びタンパク質配列は、アミノ末端からカルボキシ末端へのそれらの順序を表すように左から右に記載される。
により記載される:
たい)。
発現すること/させること(expressing)」又は「発現する/させる(express)」及び
その文法上の異形は、ポリヌクレオチド又は核酸のタンパク質への翻訳を指す。発現されたタンパク質は、細胞内に残存し、細胞表面膜の成分になることもあり、又は細胞外空間に分泌されることもある。
理的にカップリングされている細胞である。標的生体分子の有意な量は、下記で定義される。
/している/された/されている/される(linked)」、又は「連結すること/させること(linking)」は、単一の分子を形成するように接合、結合、接続、若しくは別様にカ
ップリングした/している/された/されている/される分子の2つ又は3つ以上の成分の状態、又は2分子間の会合、連結、結合及び/若しくは任意の他の接続を生じさせることにより単一分子を形成するように2つの分子を互いに会合させる行為を指す。例えば、用語「連結した/している/された/されている/される」は、単一の分子を形成するように1つ又は2つ以上の原子相互作用により会合した/している/された/されている/される2つ又は3つ以上の成分を指し、原子相互作用は、共有結合性及び/又は非共有結合性でありうる。2成分間の共有結合性会合の非限定的な例は、ペプチド結合及びシステイン-システインジスルフィド結合を含む。2分子成分間の非共有結合性会合の非限定的な例は、イオン結合を含む。
)」は、ペプチド結合が、カルボキシル酸基の炭素原子の関与を伴うのか、それとも例えばα-炭素、β-炭素、γ-炭素、δ-炭素などの、別の炭素原子を伴うのかを問わず、ペプチド結合である少なくとも1つの共有結合により会合した/している/された/されている/される、2つ又は3つ以上のタンパク質性成分を指す。互いに融合した/している/された/されている/される2つのタンパク質性成分の非限定的な例は、例えば、結果として得られる分子が単一の連続したポリペプチドになるようにペプチド結合によってポリペプチドに融合した/している/された/されている/される、アミノ酸、ペプチド又はポリペプチドを含む。本発明の目的では、用語「融合すること/させること(fusing)」は、例えば、翻訳されたときに単一のタンパク質性分子を産生する遺伝領域の組換え融合から生じた融合タンパク質などの、上で説明したような融合タンパク質を生成する行為を指す。
内経路決定及び/又は分子間結合などの、生物活性を提供することを意味する。例えば、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素、志賀毒素成分、及び/又はその断片中に存在する1つ又は2つ以上の生物活性を提供する。
RNA、ssDNA、dsDNA、mRNA(及びポリA)、及びウイルス核酸を脱プリン化することができる(例えば、Brigotti M et al.,Toxicon 39: 341-8 (2001);Brigotti M et al., FASEB J 16: 365-72 (2002)を参照されたい)。一部のRIPは、抗ウイ
ルス活性及びスーパーオキシドジムスターゼ活性を示す。志賀毒素触媒活性は、インビトロでもインビボでも観察されている。志賀毒素エフェクター活性についてのアッセイの非限定的な例は、タンパク質合成阻害活性、脱プリン化活性、細胞増殖の阻害、細胞毒性、スーパーコイルDNA弛緩活性、及びヌクレアーゼ活性を測定するものである。
対照に匹敵する志賀毒素機能活性レベルを指す。インビトロでのリボソーム阻害について、有意な志賀毒素エフェクター機能は、リボソーム源(例えば、細菌、古細菌、又は真核生物(藻類、真菌、植物、若しくは動物))に依存して300pM以下のIC50を示すことである。これは、触媒不活性SLT-1A 1-251二重変異体(Y77S/E167D)についての100,000pMの近似的IC50と比較して有意に大きい阻害である。実験室細胞培養での標的陽性細胞殺滅アッセイにおける毒性について、有意な志賀毒素エフェクター機能は、細胞株、及び適切な細胞外標的生体分子のその発現に依存して、100、50若しくは30nM、又はそれ未満のCD50を示すことである。これは、細胞株に依存して100~10,000nMのCD50を有する、細胞標的化結合領域のない単独のSLT-1Aサブユニットと比較して、適切な標的細胞株に対する有意に大きい細胞毒性である。
、実際には、弱毒化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを使用する応用は、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドを使用するもの以上に有効でありうることに留意されたい。なぜなら、最高作用強度のバリアントは、望ましくない作用を示す可能性があり、作用強度が低下されたバリアントではそれが最小化又は低下されるからである。野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドは非常に強力であり、たった1分子がサイトゾルに達することで、又はことによると40分子が内在化されることで殺滅することができる(Tam P, Lingwood C, Microbiology 153:2700-10 (2007))。志賀毒素エフェクターポリペプ
チドは、例えば細胞内経路決定又は細胞毒性などの、志賀毒素エフェクター機能が、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドと比較してかなり低下されていたとしても、標的細胞殺滅及び/又は特異的細胞型のある特定の細胞内区画の検出を伴う実際の応用に十分な作用強度を依然として有しうる。またそのようなエフェクターポリペプチドは、ある特定の細胞内の位置又は細胞内区画へのカーゴ(例えば、追加の外在性物質)の送達にも有用でありうる。
化」は、当技術分野において公知の又は本書に記載される多数の細胞内在化アッセイのいずれか1つにより測定して、本発明の細胞標的化分子が、細胞外標的抗原又は細胞表面局在標的生体分子の細胞内在化の平均時間を、細胞外標的抗原又は細胞表面局在標的生体分子の細胞内在化に必要とされる平均時間と比較して減少させることができることを指す。
イオン性、非イオン性、双性イオン性及び/若しくはカオトロピックにかかわらず他の界面活性剤などの、化学的変性剤及び/若しくは界面活性剤の存在を特徴とするものなどの、ネイティブタンパク質フォールディング条件とは著しく異なる条件を含む。
ボソームにより合成されうる単一の連続したポリペプチドを共に形成しない、2つ又は3つ以上のポリペプチド(例えば、サブユニット)を含む。
ペプチド又はタンパク質を含むことがあり、したがって、本発明の細胞標的化分子は、複数のアミノ末端及びカルボキシ末端を含むことがある。例えば、細胞標的化分子の「アミノ末端」は、出発アミノ酸残基の第一級アミノ基を伴うか又はN-アルキル化アルファアミノ酸残基のクラスのメンバーである出発アミノ酸残基についてのものと同等の窒素を伴ういかなるアミノ酸残基ともペプチド結合していない出発アミノ酸残基を一般に特徴とする、ポリペプチドのアミノ末端に相当するポリペプチド鎖の最初のアミノ酸残基により定義されうる。同様に、細胞標的化分子の「カルボキシ末端」は、その第一級カルボキシル基とペプチド結合により連結されているいかなるアミノ酸残基も有さない最後のアミノ酸残基を一般に特徴とする、ポリペプチドのカルボキシル末端に相当するポリペプチドの最後のアミノ酸残基により定義されうる。
本発明は、他の分子とのコンジュゲーションのための特異的結合部位を含む、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子を提供する。志賀毒素エフェクターポリペ
プチド又は細胞標的化分子足場中の、溶媒に露出しているユニークな官能基を有するユニークなアミノ酸残基、及び/又は1つ若しくは2つ以上の位置異所性の残基は、様々な原子及び分子の部位特異的連結のための結合点を提供する。原子又は分子は、(1)一旦標的細胞内部に入ると、制御遊離用を含む、細胞内送達用に設計されたカーゴとして機能することができ、並びに/又は(2)例えば、脊椎動物において半減期を延長する、足場の免疫原性部分を隠蔽する、及び/若しくはタンパク質切断を阻止する、生物学的に不活性な部分などの、細胞外機能を有する薬剤として機能することができる。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子を、通例の方法を使用して、制御された簡便な手法で、様々な原子及び分子とコンジュゲートさせて、均一な産物を得ることができる。
本発明のある特定の実施形態は、例えば、(1)異種分子にコンジュゲートされた志賀毒素エフェクターポリペプチド、及び(2)野生型志賀毒素ポリペプチドと比べて1つ又は2つ以上の異所性アミノ酸残基を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドなどの、志賀毒素Aサブユニットエフェクターポリペプチドである。本発明は、(1)細胞標的化部分構造(例えば、細胞標的化剤及び/又は結合領域)及び(2)毒素エフェクターポリペプチド領域を含む細胞標的化分子を提供する。ある特定のさらなる実施形態は、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子である。加えて、本発明は、いかなる志賀毒素エフェクターポリペプチドも欠いているが、他の分子の部位特異的結合のための官能基を含むリンカー又は結合領域(例えば、免疫グロブリン型ポリペプチド)を含む細胞標的化分子を提供する。本発明の分子の全ては、例えば、細胞を標的とした送達のためのカーゴ、細胞標的化分子を変化させる薬剤、及び/又は追加の外在性物質などの、別の分子とコンジュゲートされていることがあってもよい。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素ファミリーの少なくとも1つのメンバーの志賀毒素Aサブユニットに由来するポリペプチドであって、志賀毒素エフェクター領域が、少なくとも1つの志賀毒素機能を示すことができるポリペプチドである。志賀毒素機能は、例えば、細胞侵入を促進すること、脂質膜を変形させること、クラスリン媒介エンドサイトーシスを刺激すること、逆行輸送を指示すること、細胞内経路決定を
指示すること、細胞内での分解を回避すること、リボソームを触媒不活性化すること、細胞毒性を果たすこと、及び細胞静止作用を果たすことを含む。
ノ末端リジンの除去は、その細胞毒性に影響を与えなかった(McCluskey, AJ, “Shiga-like Toxin 1: Molecular Mechanism of Toxicity and Discovery ofInhibitors”, thesis, University of Toronto, (2012),Appendix B)。したがって、SLT-1A、St
xA、及び/又はSLT-2A中の天然に存在するリジン残基の1つを除く全てをアミノ
酸残基置換により除去することによって、志賀毒素エフェクターポリペプチド中に本来存在するリジン残基1つだけを残すことができる。あるいは、SLT-1A、StxA、及び/又はSLT-2A中の天然に存在するリジン残基の全てをアミノ酸残基置換により志賀毒素エフェクターポリペプチドから除去することができ、部位特異的コンジュゲーション及び1つ又は2つ以上の志賀毒素機能の保持に適している位置内に異所性リジン残基を設計することができる。
本発明の細胞標的化分子は全て、例えば、本書に記載される結合領域などの、細胞標的化剤又は部分構造を含む。本発明の細胞標的化分子の細胞標的化剤又は部分構造は、各々の部分構造が、本発明のポリペプチドと連結されているとき、細胞標的化分子を特異的細胞に極めて接近した範囲内で、それらの特異的細胞の表面での分子相互作用に基づいて架橋させることができる、分子構造を含む。細胞標的化部分構造は、リガンドと、細胞表面標的と結合するポリペプチドとを含む。
はホルモン受容体を発現する特異的細胞型の細胞表面に細胞標的化分子を標的化することができる。
FR3、CDR3、及びFR4。ラクダ科動物VHH断片、軟骨魚類のIgNAR、VNAR断片、及びそれらの誘導体には、同じ基礎配置:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及びFR4を含む、単一の重鎖可変ドメインがある。
域の安定性を向上させるように、又は免疫原性応答の可能性を低下させるように、可変領域を変化させることになる。
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(2012);Richard G et al., PLoSOne 8: e69495 (2013)を参照されたい)。例えば、改変二量体Fcドメイン、単量体Fc(mFc,monomericFc)、VHH-Fc融合体、scFv-Fc融合体、CH2ドメイン、単量体CH3sドメイン(mCH3,monomeric CH3)、合成により再プログラムされた免疫グロブリンドメイン、及び/又は免疫グロブ
リンドメインとリガンドのハイブリッド融合体などの、免疫グロブリンの定常領域に由来するポリペプチドを含む様々な結合領域がある(Hofer T et al., Proc Natl Acad Sci USA105: 12451-6 (2008);Xiao J et al., J Am Chem Soc 131:13616-13618 (2009);Xi
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Nexins(商標))、改変された、テネイシン由来、テネイシンIII型ドメイン(C
entryns(商標))、改変された、アンキリン反復モチーフ含有ポリペプチド(DARPins(商標))、改変された、低密度リポタンパク質受容体由来、Aドメイン(LDLR-A)(Avimers(商標))、リポカリン(アンチカリン)、改変された、プロテアーゼ阻害剤由来、Kunitzドメイン、改変された、プロテインA由来、Zドメイン(Affibodies(商標))、改変された、ガンマ-Bクリスタリン由来足場又は改変された、ユビキチン由来足場(アフィリン)、Sac7d由来ポリペプチド(Nanoffitins(登録商標)又はアフィチン)、改変された、Fyn由来、SH2ドメイン(Fynomers(登録商標))、及び改変抗体模倣物、並びにその結合機能性を保持する前述のもののいずれかの遺伝子操作された対応物を含む群から選択される(Worn A, Pluckthun A, J Mol Biol 305:989-1010 (2001);Xu L et al., Chem Biol
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3若しくはHCDR3を含む、重鎖可変(VH)ドメイン、並びにb)(i)LABR1若しくはLCDR1、(ii)LABR2若しくはLCDR2、及び(iii)LABR3若
しくはLCDR3を含む、軽鎖可変(VL)ドメインからなる群から選択される、ポリペプチドであって、前述のABR及び/又はCDRの各々が、配列番号844~1100で示されるようなアミノ酸配列の1つを含むか又はそれから本質的になる、ポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態では、結合領域は、配列番号807~808及び812~813のいずれか1つの269~499を含むか若しくはそれらから本質的になり、
配列番号814~815及び818~829のいずれか1つの269~519のアミノ酸を含むか若しくはそれらから本質的になり、又は配列番号816~817のいずれか1つの268~386のアミノ酸を含むか若しくはそれらから本質的になる。
本発明の分子の結合領域は、細胞外標的生体分子と特異的に結合することができるポリペプチド領域、好ましくは、がん細胞、腫瘍細胞、形質細胞、感染細胞、又は細胞内病原体を内部に持つ宿主細胞などの、所望の細胞型の表面と物理的にカップリングされているポリペプチド領域を含む。
の細胞外標的生体分子、及びそのような標的生体分子に結合することが公知のポリペプチド結合ドメインがある(例えば、国際公開第2014/164680号パンフレット、国際公開第2014/164693号パンフレット、国際公開第2015/113005号パンフレット、国際公開第2015/113007号パンフレット、国際公開第2015/138435号パンフレット、国際公開第2015/138452号パンフレット、米国特許出願公開第20150259428号明細書、国際公開第2015/191764号パンフレット、米国特許出願公開第20160177284号明細書、国際公開第2016/126950号パンフレットを参照されたい)。
参照されたい)。他の実施形態に従って、結合領域は、がん細胞の細胞表面の表面抗原であって、非がん細胞と比較してがん細胞により過剰発現されるか又は優先的に発現される抗原との特異的な高親和性結合のために選択される。一部の代表的標的生体分子は、がん及び/又は特異的免疫細胞型に関連する下記に列挙される標的を含むが、それらに限定されない。
リアント鎖)、CD79(例えば、CD79a又はCD79b)、CD98、エンドグリン(END、CD105)、CD106(VCAM-1)、CD138、ケモカイン受容体4型(CDCR-4、フーシン、CD184)、CD200、インスリン様増殖因子1(CD221)ムチン1(MUC1、CD227、CA6、CanAg)、基底細胞接着分子(B-CAM、CD239)、CD248(エンドシアリン、TEM1)、腫瘍壊死因子受容体10b(TNFRSF10B、CD262)、腫瘍壊死因子受容体13B(TNFRSF13B、TACI)、血管内皮増殖因子受容体2(KDR、CD309)、上皮細胞接着分子(EpCAM、CD326)、ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2,human epidermal growth factor receptor 2 、Neu、ErbB2、CD340)、がん
抗原15-3(CA15-3)、がん抗原(CA19-9)、がん抗原125(CA125、MUC16)、CA242、癌胎児抗原関連細胞接着分子(例えば、CEACAM3(CD66d)及びCEACAM5)、癌胎児抗原(CEA,carcinoembryonic antigen)タンパク質、コリン輸送体様タンパク質4(SLC44A4)、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4(CSP4,chondroitin sulfate proteoglycan 4、MCSP、NG2)、CTLA4、デルタ様タンパク質(例えば、DLL3、DLL4)、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼタンパク質(例えば、ENPP3)、エンドセリン(ETBR)、上皮増殖因子受容体(EGFR,epidermal growth factor receptor、ErbB1)、エプスタイン・バーウイルス潜伏感染膜タンパク質1(LMP1,latent membrane protein 1)、葉酸受容体(FOLR、例えば、FRα)、G-28
、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、HLA-Dr10、HLA-DRB、ヒト上皮増殖因子受容体1(HER1,human epidermal growth factor receptor 1)、HER3/ErbB-3、エフリンB型受容体2(EphB2,Ephrin type-B receptor
2)、上皮細胞接着分子(EpCAM,epithelial cell adhesion molecule)、線維芽
細胞活性化タンパク質(FAP,fibroblast activation protein/セプラーゼ)、グア
ニリルシクラーゼc(GCC,guanylyl cyclase c)、インスリン様増殖因子1受容体(IGF1R,insulin-like growth factor 1 receptor)、インターロイキン2受容体(
IL-2R)、インターロイキン6受容体(IL-6R)、インテグリンアルファ-Vベータ-3(αVβ3)、インテグリンアルファ-Vベータ-5(αvβ5)、インテグリンアルファ-5ベータ-1(α5β1)、L6、亜鉛輸送体(LIV-1)、MPG、メラノーマ関連抗原1タンパク質(MAGE-1)、メラノーマ関連抗原3(MAGE-3)、メソテリン(MSLN)、メタロレダクターゼSTEAP1、MPG、MS4A、NaPi2b、ネクチン(例えば、ネクチン-4)、p21、p97、ポリオウイルス受容体様4(PVRL4,polio virus receptor-like 4)、プロテアーゼ活性化受容体(例
えば、PAR1)、前立腺特異的膜抗原(PSMA,prostate-specific membraneantigen)タンパク質、SAIL(C16orf54)、SLIT及びNTRK様タンパク質(例えば、SLITRK6)、Thomas-Friedenreich抗原、膜貫通糖タンパク質(GPNMB)、栄養膜糖タンパク質(TPGB、5T4、WAIF1)、及び腫瘍関連カルシウムシグナル伝達因子(TACSTD,tumor-associated calcium signal transducer、例えば、Trop-2、EGP-1など)を標的とする結合領域は、先行技術の中に存在する(例えば、Lui B et al., Cancer Res 64: 704-10 (2004);NovellinoL et al., Cancer Immunol Immunother 54: 187-207(2005);Bagley R et al., Int J
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がん-精巣抗原LAGEタンパク質、CD19(Bリンパ球抗原タンパク質CD19)、CD21(補体受容体-2又は補体3d受容体)、CD26(ジペプチジルペプチダーゼ-4(DPP4)又はアデノシンでアミラーゼ複合体形成受容体2)、CD33(シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン-3)、CD52(CAMPATH-1抗原)、CD56、CS1(SLAMファミリーメンバー7又はSLAMF7)、細胞表面A33抗原タンパク質(gpA33)、エプスタイン・バーウイルス抗原タンパク質、GAGE/PAGEタンパク質(メラノーマ関連がん/精巣抗原)、肝細胞増殖因子受容体(HGFR,hepatocyte growth factor receptor、又はc-Met)、MAGEタンパク質、T細胞
1タンパク質により認識されるメラノーマ抗原(MART-1/MelanA、MARTI)、ムチン、優先的に発現されるメラノーマ抗原(PRAME,Preferentially Expressed Antigen of Melanoma)タンパク質、前立腺特異的抗原(PSA,prostate specific antigen)タンパク質、前立腺幹細胞抗原(PSCA,prostate stem cell antigen)
タンパク質、終末糖化産物受容体(RAGE,Receptor for Advanced Glycation Endroduct)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG-72,tumor-associatedglycoprotein 72
)、血管内皮増殖因子受容体(VEGFR,vascular endothelial growth factorreceptor)、ウィルムス腫瘍抗原を含む。
、エフリンA型受容体3(EphA3,ephrin type-A receptor 3)、葉酸結合タンパク質(FBP,folate binding protein)、ガングリオシドGM2,インスリン様増殖因子受容体、インテグリン(例えばCD11a~c)、核因子カッパB活性化受容体(RANK)、受容体型チロシンプロテインキナーゼerB-3、SAIL(c16orf54)、腫瘍壊死因子受容体10A(TRAIL-R1/DR4)、腫瘍壊死因子受容体10B(TRAIL-R2)、テネイシンC、及びCD64(FcγRI)である(Hough C et
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る。
antigen,1、BST2)、破断点クラスター領域-c-abl(BCR-ABL,break pointcluster region-c-abl)がん遺伝子タンパク質、補体成分3a受容体(C3aR,complement component 3a receptor)、CD7、CD13、CD14、CD15(Lewis X又はステージ特異的胎児抗原1)、CD23(FCイプシロンRII)、CD49d、CD53、CD54(細胞間接着分子1)、CD63(テトラスパニン)、CD69、CD80、CD86、CD88(補体成分5a受容体1)、CD115(コロニー刺激因子1受容体)、IL-1R(インターロイキン-1受容体)、CD123(インターロイキン-3受容体)、CD129(インターロイキン9受容体)、CD183(ケモカイン受容体CXCR3)、CD191(CCR1)、CD193(CCR3)、CD195(ケモカイン受容体CCR5)、CD203c、CD225(インターフェロン誘導膜貫通タンパク質1)、CD244(ナチュラルキラー細胞受容体2B4)、CD282(
Toll様受容体2)、CD284(Toll様受容体4)、CD294(GPR44)、CD305(白血球関連免疫グロブリン様受容体1)、エフリンA型受容体2(EphA2,ephrin type-A receptor 2)、FceRIa、ガレクチン-9、アルファ-フェトプロテイン抗原17-A1タンパク質、ヒトアスパルチル(アスパラギニル)ベータ-ヒドロキシラーゼ(HAAH)、免疫グロブリン様転写物ILT-3、リゾホスファチジルグリセロールアセチルトランスフェラーゼ1(LPGAT1,lysophosphatidlglycerol acyltransferase 1/IAA0205)、リソソーム膜タンパク質(LAMP,lysosome-associated membrane protein、例えばCD107)、メラニン細胞タンパク質PMEL
(gp100)、骨髄関連タンパク質-14(mrp-14,myeloid-related protein-14)、NKG2Dリガンド(例えば、MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、UL-16結合タンパク質、H-60、Rae-1、及びそれらのホモログ)、受容体型チロシンプロテインキナーゼerbB-3、SARTタンパク質、スカベンジャー受容体(例えばCD64及びCD68)、シグレック(シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン)、シンデカン(例えばSDC1又はCD138)、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1(TRP-1,tyrosinease-relatedprotein 1)、チロシナーゼ関連タンパク
質2(TRP-2,tyrosinease-related protein 2)、チロシナーゼ関連抗原(TAA
,tyrosinase associated antigen)、APO-3、BCMA、CD2、CD3、CD4
、CD8、CD18、CD27、CD28、CD29、CD41、CD49、CD90、CD95(Fas)、CD103、CD104、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD152(CTLA-4)、ケモカイン受容体、補体タンパク質、サイトカイン受容体、組織適合性タンパク質、ICOS、インターフェロン-アルファ、インターフェロン-ベータ、c-myc、破骨細胞分化抑制因子、PD-1、RANK、TACI、TNF受容体スーパーファミリーメンバー(TNF-R1、TNFR-2)、Apo2/TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3及びTRAIL-R4などの、考えられる標的生体分子の非常に多くの他の例がある(標的生体分子については、Scott A et al., Cancer Immunity 12: 14 (2012);Cheever M et al., Clin Cancer Res
15: 5323-37 (2009)を参照されたく、そこに記載されている標的分子は、非限定的な例
であることに留意されたい)。本発明の細胞標的化分子を産生するために、毒素エフェクターポリペプチドとカップリングさせる結合領域を、任意の所望の標的生体分子を使用して設計又は選択することができることは、当業者には理解されるであろう。
、CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11、CD12、CD13、CD14、CD15、CD16、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD40、CD41、CD56、CD61、CD62、CD66、CD95、CD117、CD123、CD235、CD146、CD326、インターロイキン-2受容体(IL-2R)、核因子カッパB活性化受容体(RANKL)、SLAM結合タンパク質(SAP)及びTNFSF18(腫瘍壊死因子リガンド18又はGITRL)と結合する免疫グロブリン型結合ドメインは公知である。
チドと連結させることができる点で、モジュラーである。
ある特定の実施形態では、本発明の細胞標的化分子は、志賀毒素以外のタンパク質性毒素に由来する毒素エフェクターポリペプチド領域を含む。ある特定の実施形態では、本発明の細胞標的化分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含まない。ある特定の実施形態では、本発明の細胞標的化分子は、例えば、志賀毒素以外のABx毒素、志賀毒素以外のリボソーム不活性化タンパク質毒素、アブリン、炭疽毒素、Aspf1、ブーゲニン、ブリオジン、コリックス毒素、クローディン、ジフテリア毒素、ゲロニン、易熱性エンテロトキシン、ミトギリン、百日咳毒素、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、プルケリン、緑膿菌(Pseudomonas)外毒素A、レストリクトシン、リシン、サポリン、サルシン、
及びスブチラーゼ細胞毒素に由来するものなど、志賀毒素ファミリーのメンバー以外の毒素に由来する毒素エフェクター領域を含む(例えば、国際公開第2015/113005号パンフレット、国際公開第2015/120058号パンフレットを参照されたい)。ある特定の実施形態では、本発明の細胞標的化分子は、毒素エフェクター領域も、毒素に由来するいかなるポリペプチドも含まない。
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生体直交型反応性部分構造(例えば、側鎖又は官能基)を有するいずれのアミノ酸残基も、本発明の分子におけるコンジュゲーション部位として適切でありうる。当業者は、先行技術から適用可能な且つ適切なアミノ酸を選択することができ、又は通例の技術を使用して、実験によって、本発明の分子における使用に適用可能且つ適切である新規アミノ酸を同定することができる。ある特定の実施形態では、本発明の分子は、異所性位置にあることもあり又はその位置に天然に存在することもあるユニークなアミノ酸残基を有する志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。ある特定の他の実施形態では、本発明は、ユニークなアミノ酸、又はユニークに到達可能である、すなわち、同じアミノ酸タイプの他の全ての残基のようにタンパク質性構造の内部に埋まってはいない、ユニークでないアミノ酸残基を含みうる。
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ーションに使用することができる。
321-2 (2007);Rabuka D, et al., Nat Protoc 7: 1052-67 (2012)を参照されたい)。
に、カーゴ又はリンカー中に存在する、例えばヨードアセトアミド又はマレイミドなどの、ハロアルキル誘導体を使用して、作製される。ある特定の実施形態では、チロシン、ヒスチジン及び/又はメチオニン残基とのコンジュゲーションを回避するために、マレイミド剤が特に使用される。
させることができる。ポリペプチドのカルボキシル基は、例えば、カルボキシ末端残基、アスパラギン酸、及び/又はグルタミン酸などの、表面露出アミノ酸残基の一部でありうる。
連結される。
ある特定の実施形態では、本発明の分子は、例えば、異種分子、カーゴ、追加の外在性物質、及び/又は細胞標的化分子を変化させる薬剤などの、コンジュゲートされている分子を含む。ある特定のさらなる実施形態では、本発明の分子は、1つ又は2つ以上のリンカーを介して間接的にコンジュゲートされ、リンカーは、本書では「コンジュゲーションリンカー」と称される。当業者は、先行技術からコンジュゲーションリカーを選択することができ、又は通例の技術を使用して、実験によって、本発明の分子における使用に適している新規コンジュゲーションリンカーを同定することができる。ある特定の実施形態では、コンジュゲーション連結には、アミン反応性化合物及び/又はスルフヒドリル反応性化合物、例えばチオールなど、が関与する。
子の残部との間の連結の破断が可能になる。
使用に適しているホモ二官能性及び/又はヘテロ二官能性リンカーの例は、スベリン酸ビス(スルホスクシンイミジル)、スベリン酸ジスクシンイミジル、ビス(スクシンイミジル)ペンタ(エチレングリコール)、ビス(スクシンイミジル)ノナ(エチレングリコール)、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、2-ピリジルジチオール-テトラオキサオクタトリアコンタン-N-ヒドロスクシンイミド、及びスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-テトラコサエチレングリコール]エステルを含む。
19: 759-65 (2008) Ducry L, Stump B, Bioconjug Chem 21: 5-13 (2010);ChenX et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)を参照されたい)。
)。加えて、非天然アミノ酸残基を、例えばケトンなどの、他の官能性側鎖とともに使用することができる(例えば、Axup J et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109: 16101-6 (2012);Sun S et al., ChembiochemJul 18 (2014);Tian F et al., Proc Natl Acad Sci USA 111: 1766-71 (2014)を参照されたい)。非タンパク質性の化学的リンカーの例は、N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)-アミノベンゾエート、S-(N-スクシンイミジル)チオアセテート(SATA)、N-スクシンイミジル-オキシカルボニル-cu-メチル-a-(2-ピリジルジチオ)トルエン(SMPT)、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルジチオ)-ペンタノエート(SPP)、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート(SMCC又はMCC)、スルホスクシンイミジル(4-ヨードアセチル)-アミノベンゾエート、4-スクシンイミジル-オキシカルボニル-α-(2-ピリジルジチオ)トルエン、スルホスクシンイミジル-6-(α-メチル-α-(ピリジルジチオール)-トルアミド)ヘキサノエート、N-スクシンイミジル-3-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオネート(SPDP)、スクシンイミジル6(3(-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド)ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル6(3(-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド)ヘキサノエート、マレイミドカプロイル(MC)、マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-P-アミノベンジルオキシカルボニル(MC-vc-PAB)、3-マレイミド安息香酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、アルファ-アルキル誘導体、スルホNHS-ATMBA(スルホスクシンイミジルN-[3-(アセチルチオ)-3-メチルブチリル-ベータ-アラニン])、スルホジクロロフェノール、2-イミノチオラン、3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオニルヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロトリアジン酸、及びS-(2-ジピリジル)-L-システインを含むが、これらに限定されない(例えば、Thorpe P et al., Eur J Biochem147: 197-206 (1985);Thorpe P et al., Cancer Res 47:5924-31 (1987);Thorpe P et al., Cancer Res 48: 6396-403(1988);Grossbard M et al., Blood 79: 576-85 (1992);Lui C etal., Proc Natl Acad Sci
USA 93: 8618-23 (1996);Doronina S et al., Nat Biotechnol 21: 778-84(2003);Feld J et al., Oncotarget4: 397-412 (2013)を参照されたい)。
Mol Biol 211: 943-58 (1990);Williamson M, Biochem J 297: 240-60 (1994);George
R, Heringa J, Protein Eng15: 871-9 (2002);Kreitman R, AAPS J 8: E532-51 (2006))。一般に、タンパク質性リンカーは、例えばトレオニン、プロリン、グルタミン、グリシン及びアラニンなどの、極性、非荷電及び/又は荷電残基を伴う、アミノ酸残基の大部分を含む(例えば、HustonJ et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85: 5879-83 (1988);Pastan I et al., Annu Rev Med 58: 221-37 (2007);Li Jet al., Cell Immunol 118: 85-99 (1989);Cumber A et al. Bioconj Chem 3: 397-401 (1992);FriedmanP et al., Cancer Res 53: 334-9 (1993);Whitlow M et al.,Protein Engineering 6: 989-95 (1993);Siegall C et al., J Immunol 152:2377-84 (1994);Newton et al. Biochemistry 35: 545-53(1996);Ladurner et al. J Mol Biol 273: 330-7 (1997);Kreitman R et al., Leuk Lymphoma 52:82-6 (2011);米国特許第4,894,443号明細書を参照されたい)。タンパク質性リンカーの非限定的な例は、アラニン-セリン-グリシン-グリシン-プロリン-グルタメート(ASGGPE)(配列番号1190)、バリン-メチオニン(VM)、アラニン-メチオニン(AM)、AM(G2-4S)XAM(配列番号1191)(式中、Gはグリシンであり、Sはセリンであり、xは1~10の整数である)を含む。
65: 1357-69 (2013)を参照されたい)。特に脊索動物の循環系の血漿中のような細胞外
環境では安定しているが、ユニークな特性を有するある特定の細胞内環境では、例えば、ある特定の細胞型及び/又は細胞内の区画などでは、ある特定のタンパク質分解活性、酸化還元環境、及び/又はpH環境の存在に起因して切断され、それによって本発明の分子の連結されている成分を分離するように設計されたリンカーを作製及び使用する方法は、当業者には公知である。
ること及び/又は環境を還元することができる(例えば、Doronina S et al., Bioconjug
Chem 17: 144-24 (2006);Erickson H et al., Cancer Res66: 4426-33 (2006)を参照
されたい)。インビボで切断性のタンパク質性リンカーは、1つ又は2つ以上システイン対により形成されたプロテアーゼ感受性モチーフ及び/又はジスルフィド結合を含むことが多い(例えば、Pietersz G et al.,Cancer Res 48: 4469-76 (1998);The J et al., J ImmunolMethods 110: 101-9 (1998)を参照されたい;Chen X et al., AdvDrug Deliv
Rev 65: 1357-69 (2013)を参照されたい)。インビボで切断性のタンパク質性リンカー
を、生物体内のある特定の位置、細胞内の区画、のみに存在する、及び/又はある特定の生理的若しくは病的条件下でのみ活性になる、プロテアーゼ(例えば、異常に高レベルのプロテアーゼ、ある特定の患部で過剰発現されるプロテアーゼ、及び病原性微生物により特異的に発現されるプロテアーゼなど)に対して、感受性であるように設計することができる。例えば、細胞内のみに存在するプロテアーゼ、特異的細胞型内にのみ存在するプロテアーゼ、及びがん若しくは炎症のような病的条件下でのみ存在するプロテアーゼにより切断されるタンパク質性リンカー、例えば、R-x-x-Rモチーフ、及びAMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM(配列番号1203)などは、当技術分野において公知である。
ク性であるかにかかわらず、含みうる(Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)を参照されたい)。
おいて公知である切断性基を含むリンカーを含みうる。
(1992)を参照されたい)。光切断性リンカーを使用して、本発明の細胞標的化分子の成
分、例えばポリペプチド成分を、ある特定の波長の光への曝露時に放出させることができる。光切断性リンカーの非限定的な例は、システインの光切断性保護基のようなニトロベンジル基、ニトロベンジルオキシカルボニルクロリド架橋剤、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドコポリマー、グリシンコポリマー、フルオレセインコポリマー、及びメチルローダミンコポリマーを含む(Hazum E et al., Pept Proc Eur PeptSymp, 16th, Brunfeldt K,ed., 105-110 (1981);Senter et al., Photochem Photobiol42: 231-7 (1985);Yen et al., MakromolChem 190: 69-82 (1989);Goldmacher V et al., Bioconj Chem 3: 104-7 (1992))。光切断性リンカーは、ファイバーオプティクスを使用して光に曝露することができる疾患、障害及び状態を治療するために設計される本発明の細胞標的化分子を形成するための連結成分において特に使用されうる。
ある特定の実施形態では、本発明の分子は、例えば、カーゴ、コンジュゲートされている分子、追加の外在性物質、及び/又は細胞標的化分子を変化させる薬剤などの、志賀毒素にとって異種の物を含む。細胞標的化分子とコンジュゲートされる分子は、コンジュゲートされる部分構造に相当する。志賀毒素エフェクターポリペプチドと連結されるそのよ
うな異種の物(例えば、原子又は分子)は、標的細胞にとって異物である物、及び/又は対象となる細胞中に望ましい量で存在しない物であることもある。ある特定の実施形態では、コンジュゲートされる物は、原子若しくは分子カーゴ、異種分子、追加の外在性物質、及び/又は細胞標的化分子を変化させる薬剤、例えば、CD8+T細胞エピトープ及び/若しくは抗原、放射性核種、ペプチド、検出促進剤、タンパク質、小分子化学療法剤、及び/又はポリヌクレオチドなどである。
たい)。ある特定の実施形態では、本発明の細胞標的化分子は、細胞標的化分子の標的細胞内在化前又は中に機能するように意図された、分子を変化させる薬剤である、コンジュゲートされている物を含む。ある特定の実施形態では、本発明の細胞標的化分子は、細胞標的化分子の標的細胞内在化後に機能するように意図された、カーゴ(例えば、追加の外在性物質)である、コンジュゲートされている物を含む。ある特定の実施形態では、本発明の細胞標的化分子は、例えば、例えばカスパーゼ-3、カスパーゼ-6、グランザイムB、tBid、及びアポトーシス誘導因子(AIF,apoptosis inducing factor)のよ
うな、アポトーシス促進エフェクターを含むポリペプチドなどの、追加の外在性物質又はカーゴである、コンジュゲートされている物を含む(例えば、Jia L et al., Cancer Res
63: 3257-62 (2003);Xu Y et al., J Immunol 173: 61-7(2004);Wang T et al., Cancer Res 67: 11830-9 (2007);Shan L et al., Cancer Biol Ther 11:1717-22 (2008);Qiu X et al., Mol Cancer Ther 7: 1890-9(2008)を参照されたい)。ある特定の実施形態では、コンジュゲートされる物は、CD8+T細胞エピトープ及び/若しくは抗原を含むか又はそれらから本質的になる、ペプチドである。
システイン残基と共有結合で連結されている。ある特定のさらなる実施形態では、カーゴ分子は、小胞体又は還元環境を有する別の区画への到達時に、カーゴと志賀毒素エフェクターポリペプチド間のジスルフィド結合の還元に起因して細胞標的化分子から放出される(例えば、El Alaoui A et al., AngewChem Int Ed Engl 46: 6469-72 (2007)を参照さ
れたい)。
al., Cancer Res 61: 7709-12 (2001);Jia L et al., CancerRes 63: 3257-62 (2003);Liu Y et al., Mol Cancer Ther 2: 1341-50 (2003);Perea S et al., Cancer Res 64: 7127-9(2004);Xu Y et al., J Immunol 173: 61-7 (2004);Dalken B et al.,Cell Death Differ 13: 576-85 (2006);Wang T et al.,Cancer Res 67: 11830-9 (2007);Kwon M et al., Mol CancerTher 7: 1514-22 (2008);Qiu X et al., Mol Cancer Ther 7:
1890-9 (2008);Shan L et al., Cancer Biol Ther 11: 1717-22 (2008);Wang F etal., Clin Cancer Res 16: 2284-94 (2010);Kim J et al., JVirol 85: 1507-16 (2011)
を参照されたい)。
、アドリアマイシン、カリケアマイシン、アウリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン、ピロロベンゾジアゼピン二量体(PBD,pyrrolobenzodiazepine dimers)、カルボプラチン、5-フルオロウラシル(5-FU)、カペシタビン、マイトマイシンC、パクリタキセル、1,3-ビス(2-クロロエチル)-1-ニトロソウレア(BCNU)、リファンピシン、シスプラチン、メトトレキサート、ゲムシタビン、アセグラトン、アセトゲニン(例えば、ブラタシン及びブラタシノン)、アクラシノマイシン(aclacinomysin)、A
G1478、AG1571、アルドホスファミドグリコシド、アルキルスルホン酸(例えば、ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン)、アルキル化剤(例えば、チオテパ及びシクロホスファミド)、アミノレブリン酸、アミノプテリン、アムサクリン、アンシタビン、アントラマイシン、アラビノシド、アザシチジン、アザセリン、アジリジン(例えば、ベンゾデパ、カルボコン、メツレドパ、及びウレドパ(uredopa))、
アザウリジン、ベストラブシル、ビサントレン、ビスホスホネート(例えば、クロドロネート)、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン、カクチノマイシン、カリスタチン、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルモフール、カルムスチン、カ
ルジノフィリン、CC-1065、クロラムブシル、クロランブシル(chloranbucil)、クロルナファジン、クロロゾトシン、クロモマイシン、色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア、CPT-11、クリプトフィシン(例えば、クリプトフィシン1及びクリプトフィシン8)、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノマイシン、デフォファミン(defofamine)、デメコルシン、デトルビシン、ジアジクオン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ジデオキシウリジン、ジフルオロメチルオルニチン(DMFO)、ドキシフルリジン、ドキソルビシン(例えば、モルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロロリノドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシン)、ダイネマイシン、エダトラキサート(edatraxate)、エダトレキサート、エリュテロビン、エルフォルミチン(elformithine)、酢酸エリプチニウム、エンジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン)、エニルウラシル、エノシタビン、エピルビシン、エポチロン、エソルビシン、エスペラミシン、エストラムスチン、エチレンイミン、2-エチルヒドラジド、エトグルシド、フルダラビン、葉酸アナログ(例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、及びトリメトレキサート)、葉酸補充薬(例えば、フォリン酸(frolinic acid))、ホテムスチン、フルベス
トラント、ガシトシン(gacytosine)、硝酸ガリウム、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イバンドロネート、イホスファミド、イマチニブメシル酸塩、エルロチニ
ブ、フルベストラント、レトロゾール、PTK787/ZK 222584(Novartis社製、Basel、CH)、オキサリプラチン、ロイコボリン、ラパマイシン、ラパチニブ、ロナ
ファルニブ、ソラフェニブ、メチルメラミン(例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン(triethy lenemelamine)、トリエチレンホスホルアミド(triethy lenephosphoramide)、トリエチレンチオホルホルアミド及びトリメチロメラミン)、パンクラチスタ
チン、サルコジクチン(sarcodictyin)、スポンギスタチン、ナイトロジェンマスタード(例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノボエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、及びウラシルマスタード)、ニトロソウレア(nitrosurea)(例えば、カルムスチン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン(ranimnustine))、ダイネマイシン、ネオカルジノスタチンクロモフォア、アントラマイシン、デトルビシン、エピルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン(例えば、マイトマイシンC)、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィオマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン(rodorubicin)、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン、プリン類似体
(例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、及びチオグアニン)、ピリミジン類似体(例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、及びフロクスウリジン)、アセグラトン、レンチナン、ロニダミン(lonidainine)、メイタンシノイド(例えば、メイタンシン
及びアンサマイトシン)、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール(mopidanmol)、ニトラエリン(nitraerine)、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ポドフィリン酸、2-エチルヒドラジン、リゾキシン、シゾフィラン(sizofuran)、スピ
ロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジコン、2,2’,2”トリクロロトリエチルアミン、トリコテセン(例えば、T-2トキシン、ベルカリンA(verracurin A)、ロジン、及びアングイジン)、ウレタン、ビンデシン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、アラビノシド、シクロホスファミド、トキソイド(例えば、パクリタキセル及びドキセタキセル)、6-チオグアニン、メルカプトプリン、白金、白金類似体(例えば、シスプラチン及びカルボプラチン)、エトポシド(VP-16)、ミトキサントロン、ビノレルビン、ノバントロン、ダウノマイシン、ゼローダ、トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000、レチノイド(例えば、レチノイン酸)、カペシタビン、ロムスチン、ロソキサントロン、メルカプトプリン、ニムスチン、ニトラエリン(nitraerine)、ラパマイシン、ラゾキサン、ロリジンA、スポンギスタチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スーテント、T-2トキシン、チアミプリン、チオテパ、トキソイド(例えば、パクリタキセル及びドキセタキセル)、ツベルシジン、ベルカリンA(verracurin A)、ビンブラスチン、ビンクリスチン、並びに前述のもののいずれかについての構造類似体(例えば、合成類似体)、及び/又は前述のもののいずれかについての誘導体を含む(例えば、Lindell T et al., Science 170: 447-9 (1970);Remillard S etal., Science 189: 1002-5 (1975);Ravry M et al., Am J Clin Oncol 8: 148-50 (1985);Ravry M et al.,Cancer Treat Rep 69: 1457-8 (1985);Sternberg C et al.,Cancer 64: 2448-58 (1989);Bai R et al., Biochem Pharmacol 39: 1941-9(1990);Boger D, Johnson D, Proc Natl Acad Sci USA 92: 3642-9 (1995);BeckJ et al., Leuk Lymphoma 41: 117-24 (2001);Cassady J etal., Chem Pharm Bull(Tokyo) 52: 1-26 (2004);Sapra P et al.,Clin Cancer Res 11: 5257-64 (2005);Okeley N et al., Clinc Cancer Res 16: 888-97(2010);Oroudjev E et al., Mol Cancer Ther 9: 2700-13(2010)
;Ellestad G, Chirality 23: 660-71 (2011);Kantarjian H et al., Lancet Oncol 13:
403-11 (2012);Moldenhauer G et al., J Natl Cancer Inst104: 622-34 (2012);Gromek S, Balunas M, CurrTop Med Chem 14: 2822-34 (2015);Meulendijks D et al., Invest New Drugs 34: 119-28 (2016)を参照されたい)。
様々な分子の送達効率が高いと見なされているポリペプチドであり、そのようなポリペプチドは、「細胞膜透過性ペプチド」(CPP,cell penetrating peptide)又は「タンパク質形質導入ドメイン」(PTD,protein transduction domain)としても公知である
(Futaki S et al., Biochemistry 41: 7925-30 (2002);Wender P et al., JAm Chem Soc 124: 13382-3 (2002);Dietz G, Bahr M, MolCell Neurosci 27: 85-131 (2004);Vives E, J Control Release 109: 77-85 (2005);Vives E et al., Biochim Biophys Acta
17866: 126-38 (2008);van den Berg A, Dowdy S, Curr Opin Biotechnol22: 888-93 (2011);Copolovici D et al., ACS Nano 8: 1972-94 (2014);KauffmanW et al., Trends Biochem Sci 40: 749-64 (2015);国際公開第2003106491号パフレット;米国特許第7,579,318号明細書;米国特許第7,943,581号明細書;米国特許第8,242,081号明細書を参照されたい)。ある特定の実施形態では、追加の外在性物質は、CPP及び/又はPTDと核酸の両方を含み、カチオン性ペプチドを含んでもよい(例えば、Lehto T et al.,Expert Opin Drug Deliv 9:823-36 (2012);Shukla R et al., Mol Pharm 11: 3395-408(2014);Beloor J et al., Ther Deliv6: 491-507 (2015);Chuah J et al., Biomacromolecules 10.1021/acs.biomac.6b01056 (2016);Cerrato C et al., Expert Opin Drug Deliv 1-11 (2016);Tai W, Gao X, AdvDrug Deliv Rev pii:S0169-409X: 30236-8 (2016);Wada S et al., Bioorg Med Chem 15: 4478-85 (2016)を参照されたい)。ある特定の実施形態では、追加の外在性物質は、別の追加の外在性物質の細胞内標的化のためのCPP及び/又はPTDを含む(例えば、Sakhrani N, Padh H, Drug Des Devel Ther 7: 585-99 (2013);Li H et al.,Int J Mol Sci 16: 19518-36 (2015);Cerrato C et al.,Expert Opin Drug Deliv 1-11(2016)を参照されたい)。
本発明の細胞標的化分子の、ある特定の実施形態では、結合領域、リンカー及び/又は毒素エフェクターポリペプチドなどの、分子の成分の多くは、既に記載されている(例えば、国際公開第2005/092917号パンフレット、国際公開第2007/033497号パンフレット、米国特許出願公開第2009/0156417号明細書、特許第4339511号公報、欧州特許第1727827号明細書、ドイツ特許第602004027168号明細書、欧州特許第1945660号明細書、特許第4934761号公報、欧州特許第2228383号明細書、米国特許出願公開第2013/0196928号明細書、国際公開第2014/164680号パンフレット、国際公開第2014/164693号パンフレット、国際公開第2015/138435号パンフレット、国際公開第2015/138452号パンフレット、国際公開第2015/113005号パンフレット、国際公開第2015/113007号パンフレット、米国特許出願公開第20150259428号明細書、国際公開第2015/191764号パンフレット、国際公開第2016/126950号パンフレットを参照されたい)。
置される追加のアミノ酸、並びに簡便な検出及び/又は精製をもたらすためにどちらかの末端と融合される生化学的親和性タグを含む。非脊索動物系(例えば、原核細胞)を使用して産生されるポリペプチドの免疫原性を向上させるための一般的な修飾は、例えば細菌宿主系における産生などの産生中にホルミル化されうる出発メチオニン残基の、ポリペプチドの産生後の除去である。なぜなら、例えば、N-ホルミルメチオニン(fMet)は、脊索動物における望ましくない免疫応答を低減させる可能性があるからである。
ンスフェラーゼ部分構造、HAタグ、マルトース結合タンパク質ドメイン、mycタグ、ポリヒスチジンタグ、ReAsHタグ、strep-tag、strep-tag II、TEVプロテアーゼ部位、チオレドキシンドメイン、トロンビン切断部位、及びV5エピトープタグである。
水性;V:芳香族の嵩高いアミノ酸;VI:親水性非荷電、VII 脂肪族非荷電、VIII 非
極性非荷電、IX シクロアルケニル会合、X 疎水性、XI 極性、XII 小型、XIII 回
転許容;及びXIV 柔軟。例えば、保存的アミノ酸置換は、以下を含む:1)SをCで置
換することができる;2)M又はLをFで置換することができる、3)YをMで置換することができる、4)Q又はEをKで置換することができる、5)N又はQをHで置換することができる;及び6)HをNで置換することができる。
残基を変化させること、又は1つ若しくは2つ以上のアミノ酸残基を欠失させるか若しくは挿入することによる、本書に記載されるポリペプチドの変更の結果としての、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子のバリアントは、本発明の範囲内である。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は、さらに、シグナル配列を伴うこともあり、又は伴わないこともある。
小胞体におけるSlt-I A1の新規発現を使用する別の手法では、グルタメート-167とアルギニン-170の両方を変異させることにより、その発現レベルでSlt-I
A1断片細胞毒性が除去された(LaPointe P et al., J Biol Chem 280:23310-18 (2005))。トランケーション分析により、残基75~268のStxAの断片はインビトロ
で有意な触媒活性を依然として保持することが実証された(Haddad J et al., J Bacteriol 175: 4970-8 (1993))。残基1~239を含有するSlt-I A1のトランケーシ
ョンされた断片は、サイトゾルにおける新規発現により、有意な酵素活性をインビトロで呈し、細胞毒性を呈した(LaPointeP et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005))。
トランケーションされて残基1~239となったSlt-I A1断片の小胞体における発現は、それを逆行輸送することができないので、細胞毒性でなかった(LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005))。
リペプチドにより示される志賀毒素機能活性を増大させることができる。例えば、Stx1Aにおける残基位置アラニン-231からグルタメートへの変異は、Stx1Aの酵素活性をインビトロで増大させた(Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9(1998))。
ーポリペプチドの外部に存在する単一のユニークなシステイン又はリジン残基があることを条件に、足場の志賀毒素エフェクターポリペプチド成分は、配列番号233~756のいずれか1つから選択され、志賀毒素エフェクターポリペプチド足場は、配列番号757~761のいずれか1つから選択されるリンカーをさらに含む。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド足場の、ある特定のさらなる実施形態では、志賀毒素エフェクターポリペプチド足場は、配列番号762~767のいずれか1つを含むか又はそれから本質的になる。
7、883、889、895、901、907、913、919、925、931、937、948、954、960、966、972、978、984、990、996、1002、1008、1014、1020、1026、1033、1039、1048、1054、1060、1069、1075、1081、1087、1093及び1099のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含むか若しくはこれから本質的になるLCDR2と、配列番号849、855、862、868、884、890、896、902、908、914、920、926、932、938、949、955、961、967、973、979、985、991、997、1003、1009、1015、1021、1027、1034、1040、1049、1055、1061、1070、1076、1082、1088、1094及び1100のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含むか若しくはこれらから本質的になるLCDR3とを含む、軽鎖可変(VL)ドメインからなる群から選択されるポリペプチドを含む。
本発明の分子は、細胞標的化分子が関与する様々な応用に有用である(例えば、国際公開第2014/164680号パンフレット、国際公開第2014/164693号パンフレット、国際公開第2015/113005号パンフレット、国際公開第2015/113007号パンフレット、国際公開第2015/120058号パンフレット、国際公開第2015/138435号パンフレット、国際公開第2015/138452号パンフレット、米国特許出願公開第2015/0259428号明細書、国際公開第2015/191764号パンフレット、米国特許出願公開第2016/177284明細書、国際公開第2016/126950号パンフレット、国際公開第2016/196344号パンフレット、及び国際公開第2017/019623号パンフレットを参照されたい)。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、結合領域ポリペプチド及びリンカーは、特性が向上された細胞標的化分子を生成するための成分として使用することができる(例えば、国際公開第2014/164680号パンフレット、国際公開第2014/164693号パンフレット、国際公開第2015/113005号パンフレット、国際公開第2015/113007号パンフレット、国際公開第2015/120058号パンフレット、国際公開第2015/138435号パンフレット、国際公開第2015/138452号パンフレット、米国特許出願公開第2015/0259428号明細書、国際公開第2015/191764号パンフレット、米国特許出願公開第2016/177284明細書、国際公開第2016/126950号パンフレット、国際公開第2016/196344号パンフレット、及び国際公開第2017/019623号パンフレットを参照されたい)。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、結合領域ポリペプチド及びリンカーは、例えば、リガンド-毒素融合体、免疫毒素、及びイムノコンジュゲートなどの、様々な治療用及び/又は診断用分子の成分として有用である(例えば、国際公開第2015/113005号パンフレット、国際公開第2015/113007号パンフレッ
ト、国際公開第2015/138435号パンフレット、米国特許出願公開第2015/0259428号明細書、国際公開第2015/191764号パンフレット、米国特許出願公開第2016/177284明細書、国際公開第2016/126950号パンフレット、国際公開第2016/196344号パンフレット、及び国際公開第2017/019623号パンフレットを参照されたい)。志賀毒素エフェクターポリペプチドと細胞標的化結合領域の機能的会合は、特異的細胞型を選択的に殺滅する、それらの増殖を阻害する、それらに外在性物質を送達する、及び/又はそれらを検出する、細胞標的化分子の生成を可能にする。例えば、本発明のある特定の細胞標的化分子は、サイトゾルに有効に経路決定することができる触媒活性志賀毒素エフェクターポリペプチドを、標的発現細胞の内部に効率的に送達するそれらの能力によって、標的発現細胞に対して強力に細胞毒性でありうる。
薬量での多細胞生物における低いオフターゲット毒性(国際公開第2015/191764号パンフレットを参照されたい)、(7)標的細胞のMHCクラスI提示経路への異種T細胞エピトープの送達(例えば、国際公開2015/113005号パンフレットを参照されたい)、及び/又は(8)CD8+T細胞免疫応答の刺激。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子の、ある特定の実施形態では、分子が、本書に記載される特性又は機能性の2つ又は3つ以上を有するため、多機能性である。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子の、ある特定の実施形態は、細胞毒性である。本発明の細胞標的化分子の、ある特定のさらなる実施形態は、1つ又は2つ以上の志賀毒素エフェクターポリペプチド成分の存在に専ら起因して、細胞毒性である。志賀毒素ファミリーのメンバーのAサブユニットは各々、真核細胞を、ひとたび細胞のサイトゾルに入れば、殺滅することができる、酵素的に活性なポリペプチド領域を含む。志賀毒素ファミリーのメンバーは、真核細胞の殺滅に適応するため、例えば、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドのある特定の実施形態を含む分子などの、志賀毒素に由来する分子は、強力な細胞殺滅活性を示すことができる。
供することができる。
ある特定の実施形態では、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は、T細胞エピトープを含み、これにより、送達及び有核脊索動物細胞による細胞表面提示のためのエピトープ-ペプチドカーゴの事実上無制限の選択肢がある「T細胞エピトープ送達」分子の改変が可能になる。ある特定の実施形態については、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は各々、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び/又は細胞標的化分子と会合している1つ又は2つ以上のT細胞エピトープを、細胞のプロテアソームに送達することができる。すると、送達されたT細胞エピトープは、タンパク質分解性プロセシングを受け、MHCクラスI経路により細胞の表面に提示される。MHCクラスIエピトープを細胞標的化分子とコンジュゲートさせることにより、免疫賦活抗原の標的送達及び提示を遂行して、脊索動物免疫系の有益な機能を利用すること及び指示することができる。
T細胞エピトープは、当業者にとって既知であるのか、当業者にとって現在通例である方法を使用して将来同定されるのかにかかわらず、CD8+T細胞エピトープとして機能する。
は可溶性多量体T細胞受容体は、例えば、免疫組織化学的検査、フローサイトメトリー、
及び酵素結合イムノアッセイ(ELISA、enzyme-linked immunoassay)を含む、様々な検出方法とともに使用することができる。
を含む(Falk K et al., Nature 351: 290-6 (1991))。
析資源MHC-I結合予測コンセンサスツール(Kim Y et al., Nucleic Acid Res40: W525-30 (2012))などの、幾つかのソフトウェアプログラムを使用することができる。例
えば、細胞表面結合アッセイ及び/又は表面プラズモン共鳴アッセイなどの、幾つかの実験アッセイは、結合反応速度を定量及び/又は比較するために、日常的に使用されている(Miles K et al., Mol Immunol 48: 728-32 (2011))。加えて、公知対照との比較とし
て、所与のMHCクラスIアレルについて三元MHC-ペプチド複合体を安定させるペプチドの能力の程度に基づく他のMHC-ペプチド結合アッセイ(例えば、ProImmmune社からのMHC-ペプチド結合アッセイ)が、開発された。
(登録商標)キット)、グランザイムB ELISpot、カスパーゼ活性アッセイ又はLAMP-1転移フローサイトメトリー分析を含む、多数のアッセイを使用して測定することができる。標的細胞の殺滅を特異的にモニターするために、カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル(CFSE)を使用して、インビトロ又はインビボでの研究のために所望の細胞集団を容易且つ迅速に標識して、エピトープ特異的CSFE標識標的細胞の殺滅をモニターすることができる(Durward M et al., J Vis Exp 45 pii 2250(2010))。
に中毒細胞から単離され(例えば、抗MHC抗体「プルダウン」精製)、会合しているペプチド(すなわち、単離されたMHC分子により提示されるペプチド)が、精製複合体から回収される。回収されたペプチドは、シークエンシング質量分析により分析される。質量分析データは、外在性(非自己)ペプチド(T細胞エピトープX)の配列及びヒトについての国際タンパク質インデックス(international protein index)からなるタンパク
質データベースと比較される(「自己」又は非免疫原性ペプチドを表す)。ペプチドは、確率データベースに従って有意性により順位付けされる。検出された全ての抗原性(非自己)ペプチド配列が列挙される。データは、偽ヒットを低減させるためにスクランブルデコイデータベースに対する検索により検証される(例えば、Ma B, Johnson R, Mol Cell Proteomics 11: O111.014902 (2012)を参照されたい)。それらの結果により、T細胞エ
ピトープXからのペプチドはMHC複合体で中毒標的細胞の表面に提示されることが実証されるであろう。
活自己抗原の提示は、他の免疫細胞に、標的細胞を破壊するように、及びより多くの免疫細胞をその領域に動員するように、シグナル伝達する。
志賀毒素エフェクターポリペプチド成分に活性低下をもたらすこと及び/又は成分を不活性にさせることができる。別の例では、T細胞エピトープを志賀毒素エフェクターポリペプチドに挿入する又は埋め込むことができ、その結果、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、付加されたエピトープにより不活性化される(例えば、国際公開第2015/113005号パンフレットを参照されたい)。この手法は、一方の細胞毒性機序を除去する一方で、もう一方の細胞毒性機序を保持又は付加し、そしてまた、送達されたT細胞エピトープの提示又は「抗原播種(antigen seeding)」によって生物体内の標的細胞の局所
領域に対する免疫賦活を示すことができる分子を提供する。さらに、埋め込まれた又は挿入された異種T細胞エピトープを含む本発明の細胞標的化分子の非細胞毒性バリアントは、脊索動物体内の免疫刺激、及び/又はMHCクラスI分子により提示されるエピトープでの脊索動物体内の標的細胞の標識を伴う応用に有用でありうる。
ある特定の実施形態については、本発明の細胞標的化分子は、1)標的細胞によるMHCクラスI提示のためのT細胞エピトープの送達、及び/又は2)強力な細胞毒性、をもたらすことができる。本発明の細胞標的化分子の、ある特定の実施形態については、細胞標的化結合領域の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされている細胞の接触時、本発明の細胞標的化分子は、細胞死を引き起こすことができる。細胞殺滅の機序は、例え
ば、毒素エフェクターポリペプチド領域の酵素活性による、直接的なものであることもあり、又はCTL媒介細胞溶解による間接的なものであることもある。
本発明の細胞標的化分子の、ある特定の実施形態は、標的細胞のMHCクラスI提示経路に送達されて標的細胞の細胞表面で提示されうるCD8+T細胞エピトープを含むため、細胞毒性である。例えば、内在性エピトープの脱免疫化を伴う又は伴わない本発明のT細胞エピトープ送達志賀毒素エフェクターポリペプチドは、間接的細胞殺滅を伴う応用に細胞標的化分子の成分として使用することができる(例えば、国際公開第2015/113005号パンフレットを参照されたい)。
クロファージ炎症性タンパク質-1ベータ(MIP-1ベータ,macrophage inflammatoryprotein-1 beta)、並びにインターロイキン、例えばIL-17、IL-4及びIL-22などの、免疫賦活性サイトカインを放出しうる。さらに、提示されたエピトープの認識により活性化されたCTLは、提示細胞の近位の他の細胞を、それらの近位の細胞により提示されるペプチド-MHCクラスI複合体レパートリーを問わず、無差別に殺滅しうる(Wiedemann A et al., Proc Natl Acad Sci USA103: 10985-90 (2006))。
本発明の細胞標的化分子の、ある特定の実施形態は、触媒活性志賀毒素エフェクターポリペプチドを含むため、また分子中のいかなる細胞毒性剤又は免疫原性CD8+T細胞エピトープの存在にも関係なく、細胞毒性である。例えば、内在性エピトープの脱免疫化を伴う又は伴わない本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば、志賀毒素エフェクターポリペプチドのリボ毒性(ribotoxic)、酵素活性、又は非触媒機序に起因する
リボソーム結合及びリボソーム機能への干渉などの、間接的細胞殺滅を伴う応用に、細胞標的化分子の成分として使用することができる。本発明のCD8+T細胞高度免疫化細胞標的化分子の、ある特定の実施形態については、細胞標的化結合領域の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされている細胞の接触時、本発明の細胞標的化分子は、直接的
にそれらの細胞を、例えば、標的でない細胞毒性T細胞エピトープを巻き込むことなく、死滅させることができる(上記セクションIII-Dを参照されたい)。
本発明のある特定の細胞標的化分子は、標的でないバイスタンダー細胞の存在下での特異的細胞の選択的殺滅に使用される。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド送達を細胞標的化結合領域によって特異的細胞に標的化することにより、本発明の細胞標的化分子は、選択された細胞型を標的でない細胞の存在下で排他的又は優先的に殺滅する結果となる、細胞型特異的な限定的細胞殺滅活性を示すことができる。同様に、免疫原性T細胞エピトープの送達を標的細胞のMHCクラスI経路に標的化することにより、本発明の細胞標的化分子により誘導される標的細胞のその後のT細胞エピトープ提示及びCTL媒介細胞溶解を、標的でない細胞の存在下での、選択された細胞型の排他的又は優先的殺滅に限定することができる。加えて、細胞毒性志賀毒素エフェクターポリペプチド領域及び免疫原性T細胞エピトープの細胞への標的送達両方を、本発明の単一の細胞標的化分子により遂行することができ、その結果、両方の潜在的細胞毒性成分の送達は、標的でない細胞の存在下で標的細胞に排他的又は優先的に限定される。
5倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍、750倍、又は1000倍高い、選択的細胞毒性を示す。
細胞毒性、細胞分裂停止、及び免疫刺激応用に加えて、本発明の細胞標的化分子を、標的化された細胞送達機能のために、例えば、情報収集及び診断機能を伴う応用に、使用することができる。
乃至ゼロの細胞毒性を示し、したがって、本書では「非細胞毒性(の)及び/又は細胞毒性低下(の)」と称される。ある特定の実施形態については、本発明の細胞標的化分子は、低い乃至ゼロの細胞毒性を示し、したがって、「非細胞毒性」及び/又は「細胞毒性低下バリアント」と称されることもある。例えば、本発明の分子の、ある特定の実施形態は、志賀毒素に基づく有意なレベルの細胞毒性を示さず、1,000nM未満、500nM、100nM、75nM、50nMの用量では、例えば、当業者に公知の及び/又は本書に記載されるアッセイにより測定されたときなどの、適切な参照分子と比較されたときに、有意な量の細胞死がない。ある特定のさらなる実施形態については、本発明の分子は、哺乳動物レシピエント1キログラム(kg)当り1~100マイクログラム(μg)の投薬量で、いかなる毒性も示さない。毒性低下バリアントは、それでも、ある特定の濃度又は投薬量では細胞毒性であることもあるが、例えば、ある特定の状況では有意な志賀毒素細胞毒性レベルを示すことができないなどの、細胞毒性低下を示す。
本発明のある特定の細胞標的化分子は、特異的細胞、細胞型及び/又は細胞集団、並びに前述のもののいずれかの特異的細胞内区画のインビトロ及び/又はインビボでの検出に使用される。検出促進剤とコンジュゲートされている本発明の細胞毒性細胞標的化分子の細胞毒性低下及び/又は非毒性形態は、診断機能に、例えば、同じ結合領域、又は関連結合領域、例えば、同じ標的生体分子、重複エピトープ、及び/若しくは同じエピトープと高親和性で結合する結合領域などを含む、治療レジメンとともに使用されるコンパニオン診断に使用されることがあってもよい。
HER2及びEGFR発現を細胞の電離放射線への曝露により誘導することができる(Wattenberg M etal., Br J Cancer 110: 1472-80 (2014))。さらに、PSMA発現は、アンドロゲン枯渇に応答してアップレギュレートされる(例えば、Chang S et al., Cancer
88: 407-15 (2000);Meller B et al., EJNMMI Res 5: 66 (2015)を参照されたい)。
本発明は、下記でより詳細に説明される状態、疾患、障害又は症状(例えば、がん、悪性腫瘍、非悪性腫瘍、増殖異常、免疫障害、及び微生物感染症)の治療又は発症予防のために、医薬組成物において、単独で又は1つ若しくは2つ以上の治療剤と組み合わせて使用するための、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子を提供する。本発明は、少なくとも1つの薬学的に許容される担体、賦形剤又は媒体とともに、本発明に従
って、本発明の志賀毒素ポリペプチド若しくは細胞標的化分子、又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を含む、本発明による医薬組成物をさらに提供する。ある特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド又は細胞標的化分子のホモ多量体及び/又はヘテロ多量体形態を含みうる。本発明の医薬組成物は、下記でさらに詳細に説明される疾患、状態、障害又は症状を治療、改善又は予防する方法に有用である。各々のそのような疾患、状態、障害又は症状は、本発明による医薬組成物の使用に関する別の実施形態であると考えられる。本発明は、下記でより詳細に説明されるような、本発明による少なくとも1つの治療方法において使用するための医薬組成物をさらに提供する。
必要とする所与の対象のために当業者により選択された特定の治療の所望の有効性を生じさせることになる量である。この量は、当業者により理解されている様々な因子に依存して変わることになり、そのような因子は、治療用組成物の特性(活性、薬物動態、薬力学、及びバイオアベイラビリティを含む)、対象の生理的状態(年齢、性別、病型、病期、全身健康状態、所与の投薬量に対する応答性、及び薬物療法の種類を含む)、製剤中の薬学的に許容される担体(単数又は複数)の性質、及び投与経路を含むが、これらに限定されない。臨床及び薬理学技術分野の当業者は、通例の実験によって、すなわち、組成物の投与に対する対象の応答をモニターし、それに応じて投薬量を調整することにより、治療有効量を決定することができるであろう(例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro A, ed.,Mack Publishing Co., Easton, PA, U.S., 19th ed., 1995)を参照されたい)。
Med 48: 304-10 (2007);Nayak T, BrechbielM, Bioconjug Chem 20: 825-41 (2009);Paudyal P et al.,Oncol Rep 22: 115-9 (2009);Qiao J et al., PLoS ONE 6: e18103 (2011);Sano K et al., Breast Cancer Res 14: R61 (2012)を参照されたい)。これら
の薬剤を、任意の適切な位置で本発明のポリペプチド又は細胞標的化分子と会合させてもよく、それに連結させること及び/又はその中に組み込むことができる。例えば、検出促進剤の連結又は組込みは、本発明の分子のアミノ酸残残基を介してであってもよく、又はリンカー及び/若しくはキレーターを介するものを含む、当技術分野において公知の何らかの種類の連結を介してであってもよい。薬剤の組込みは、スクリーニング、アッセイ、診断手順、及び/又はイメージング技術での診断用組成物の存在の検出を可能にするような方法での組込みである。
)、光学イメージング(ダイレクト、蛍光及び生物発光イメージングを含む)、磁気共鳴イメージング(MRI,magneticresonance imaging)、ポジトロン放出断層撮影(PET,positron emissiontomography)、単一光子放射型コンピューター断層撮影(SPECT,single-photonemission computed tomography)、超音波、及びX線コンピューター断層撮影イメージングなどの、当業者に公知の非常に多くのイメージング手法がある。
本発明のある特定の実施形態は、固体支持体上に固定化された本発明の分子(例えば、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、志賀毒素エフェクターポリペプチド足場、細胞標的化分子、融合タンパク質、若しくはポリヌクレオチド)又はそれらのあらゆるエフェクター断片を含む。本明細書において企図される固体支持体は、マイクロビーズ、ナノ粒子、ポリマー、マトリックス材料、マイクロアレイ、マイクロタイタープレート、又は当技術分野において公知の任意の固体表面を含むが、これらに限定されない(例えば、米国特許第7,771,955号明細書を参照されたい)。これらの実施形態に従って、
当業者に公知の技術を使用して、本発明の分子を、例えばビーズ、粒子又はプレートなどの、固体支持体に、共有結合又は非共有結合で連結させることができる(例えば、Jung Y
et al., Analyst 133: 697-701 (2008)を参照されたい)。本発明の固定化された分子は、当技術分野において公知の技術を使用するスクリーニング応用に使用することができる(例えば、Bradbury A et al., Nat Biotechnol 29:245-54 (2011);Sutton C, Br J Pharmacol166: 457-75 (2012);Diamante L et al., Protein Eng Des Sel 26: 713-24 (2013);Houlihan G et al., J Immunol Methods 405: 47-56 (2014)を参照されたい)。
マイクロビーズ、ナノ粒子、ポリマー、ナノポリマー、ナノチューブ、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、ストレプトアビジン被覆ビーズ、逆相磁性ビーズ、カルボキシ末端基を有するビーズ、ヒドラジン末端基を有するビーズ、シリカ(ナトリウムシリカ)ビーズ及びイミノ二酢酸(IDA)修飾ビーズ、アルデヒド修飾ビーズ、エポキシ活性化ビーズ、ジアミノジプロピルアミン(DADPA)修飾ビーズ(第一級アミン表面基を有するビーズ)、生分解性ポリマービーズ、ポリスチレン支持体、アミノ-ポリスチレン粒子、カルボキシル-ポリスチレン粒子、エポキシ-ポリスチレン粒子、ジメチルアミノ-ポリスチレン粒子、ヒドロキシ-ポリスチレン粒子、着色粒子、フローサイトメトリー粒子、スルホネート-ポリスチレン粒子、ニトロセルロース表面、強化ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ガラス表面、活性化ガラス表面、活性化石英表面、ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜、ポリアクリルアミド系支持体、ポリ塩化ビニル支持体、ポリメチルメタクリレート支持体、ポリ(ジメチルシロキサン)支持体、及び共有結合性連結を形成できる光活性種(例えばニトレン、カルベン及びケチルラジカル)を含有するフォトポリマーを含む。本発明の分子を固定化することができる固体支持体の他の例、例えば、細胞表面、ファージ及びウイルス粒子などは、分子ディスプレイシステムで一般に使用される。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、志賀毒素エフェクターポリペプチド足場、及び細胞標的化分子のいずれかについての薬学的に許容される塩又は溶媒和物は、本発明の範囲内である。加えて、本発明の細胞標的化分子の塩又は溶媒和物を含む医薬組成物は、本発明の範囲内である。
物に利用することができる適切な水性及び非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及びこれらに類するもの)、及びそれらの適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、並びに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルを含む。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散液の場合は必要粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により、維持することができる。ある特定の実施形態では、担体は、(例えば、注射又は注入による)静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与に適している。選択される投与経路に依存して、タンパク質又は他の医薬成分は、低pHの作用から、及び活性タンパク質が特定の投与経路により患者に投与されたときに遭遇することがある他の自然不活性化条件から、化合物を保護することを目的とする材料で、コーティングされうる。
又は乳化剤の非限定的な例は、例えば、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウリン酸エステル(ポリソルベート20)、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウリパルミチン酸エステル(ポリソルベート40)、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアリン酸エステル(ポリソルベート60)、及びポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレイン酸エステル(ポリソルベート80)などの、ポリソルベートを含む。ある特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、水性担体、並びに薬学的に許容される界面活性剤及び/又は乳化剤を含む。ある特定の他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、例えば、薬学的に許容される界面活性剤及び/又は乳化剤を含むフリーズドライ、凍結乾燥、脱水及び/又は昇華乾燥組成物などの、塩及び/又は粉末を含む。本発明の細胞標的化分子の凝集を防止するために役立つように、本発明の医薬組成物において1つ又は2つ以上の界面活性剤及び/又は乳化剤が望ましいこともありうる。
上記のものなどの他の必要成分とを含有する滅菌媒体に活性化合物を混ぜ入れることにより調製することができる。滅菌注射用液剤の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、任意の追加の所望成分に加えて活性成分の粉末をそれらの滅菌濾過溶液から生じさせる、真空乾燥及びフリーズドライ(凍結乾燥)である。ある特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、ソルビトール、トレハロース、クエン酸ナトリウム、及びポリソルベート-20を含む粉末を含み、さらにグリセロール及び/又はメチオニンを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、クエン酸ナトリウム、トレハロース、及びポリソルベート-20を含み、さらにグリセロール及び/又はメチオニンを含んでいてもよい。
J, ed., Marcel Dekker社、NY, U.S., 1978)を参照されたい)。
本発明のポリペプチド及び細胞標的化分子に加えて、本発明のポリペプチド、タンパク質及び細胞標的化分子又はそれらの機能性部分をコードするポリヌクレオチドも、本発明の範囲内である。用語「ポリヌクレオチド」は、用語「核酸」と同意義であり、これらの各々は、デオキシリボ核酸(DNA)のポリマー、リボ核酸(RNA)のポリマー、ヌクレオチド類似体を使用して生成されたこれらのDNA又はRNAの類似体、並びにそれら
の誘導体、断片及びホモログのうちの1つ又は2つ以上を含む。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖状であってもよく、二本鎖状であってもよく、又は三本鎖状であってもよい。具体的には、例示的タンパク質をコードすることができる、例えば、RNAコドンの第3位において許容されることが公知のゆらぎを考慮に入れて、異なるRNAコドンと同じアミノ酸をさらにコードすることができる、全てのポリヌクレオチドを含むようなポリヌクレオチドが開示される(例えば、Stothard P,Biotechniques 28: 1102-4 (2000)を参
照されたい)。
ットを含む、直鎖状又は環状の、ポリヌクレオチドを指す。用語「発現ユニット」は、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントであって、宿主細胞において核酸セグメントの発現をもたらすことができるポリヌクレオチドセグメントを示す。発現ユニットは、通常、転写プロモーター、所望のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、及び転写ターミネーターを、全て、作動可能構造で含む。発現ベクターは、1つ又は2つ以上の発現ユニットを含有する。したがって、本発明に関して、単一のポリペプチド鎖を含む本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び/又は細胞標的化分子をコードする発現ベクターは、その単一のポリペプチド鎖についての発現ユニットを少なくとも含むが、例えば2本又は3本以上のポリペプチド鎖(例えば、VLドメインを含む1本の鎖、及び毒素エフェクターポリペプチドと連結されているVHドメインを含む第2の鎖)を含む、タンパク質は、そのタンパク質の2本のポリペプチド鎖の各々に1つずつ、少なくとも2つの発現ユニットを含む。本発明の多鎖細胞標的化タンパク質の発現のために、各ポリペプチド鎖についての発現ユニットが、異なる発現ベクター上に別々に含有されることもある(例えば、各ポリペプチド鎖の発現ベクターを導入した単一の宿主細胞で発現を果たすことができる)。
ば、酵母、昆虫、両生類、鳥類若しくは哺乳類の細胞)であってもよい。本発明のポリヌクレオチドを含む又は本発明のポリペプチド及び/若しくは細胞標的化分子を産生することができる宿主細胞株の生成及び単離は、当技術分野において公知の標準的技術を使用して遂行することができる。
ある特定の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に送達するための本発明の1つ又は2つ以上の物の組成物、例えば医薬組成物又は診断用組成物、を含むデバイスに関する。例えば、本発明の1つ又は2つ以上の組成物を含む送達デバイスを使用して、静脈内、皮下、筋肉内若しくは腹腔内注射、経口投与、経皮投与、肺若しくは経粘膜投与、インプラント、浸透圧ポンプ、カートリッジ若しくはマイクロポンプによる又は当業者に認知されている他の手段による投与を含む、様々な送達方法により本発明の物の組成物を患者に投与することができる。
、基準物質、マーカー及びこれらに類するもの)を含むことがあってもよい。キットは、通常、キットの内容の使用目的を示すラベルを含む。キットは、試料中又は対象体内の細胞型(例えば、腫瘍細胞)を検出するための、又は本発明の化合物、組成物、若しくは本発明の関連方法、例えば本書に記載される方法など、を使用する治療戦略に対して反応する群に患者が属するのかを診断するための、試薬及び他のツールをさらに含むこともある。
一般に、ある特定のがん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、又は本書において言及されるさらなる病的状態などの、疾患、障害及び状態の予防及び/又は治療に使用することができる薬理活性薬剤及びそれらを含む組成物を提供することが、本発明の目的である。したがって、本発明は、細胞の標的殺滅のために、標的とする細胞に追加の外在性物質を送達するために、標的とする細胞の内部を標識するために、診断情報を収集するために、標的細胞のMHCクラスI提示経路にT細胞エピトープを送達するために、並びに本書に記載されるような疾患、障害及び状態を治療するために、本発明のポリペプチド、細胞標的化分子及び医薬組成物を使用する方法を提供する。例えば、本発明の方法を使用して、がん、がん発生、腫瘍発生、転移、及び/又は疾患再発を予防又は治療することができる。
とができ、又は細胞表面生体分子などの特定の細胞外標的生体分子を発現する細胞を別様に選択的に殺滅することができる。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、細胞標的化分子、及び医薬組成物には、例えば、インビトロ又はインビボどちらかで組織から望ましくない細胞型を枯渇させる際の使用、移植片対宿主を治療するために免疫応答を調節する際の使用、抗ウイルス剤としての使用、抗寄生虫剤としての使用、及び望ましくない細胞型の移植組織を一掃する際の使用を含む、多様な応用がある。
施形態の、ある特定の結合領域の標的でありうる、例えばCD44、CD200及び本書に列挙される他のものなどの、細胞表面標的を過剰発現することが多い(例えば、Kawasaki B et al., Biochem Biophys Res Commun 364:778-82(2007);Reim F et al., CancerRes 69: 8058-66 (2009)を参照されたい)。
性及び/若しくは休止腫瘍細胞/腫瘍始原細胞/幹細胞に対して有効である。同様に、同じ疾患、障害又は状態のための、同じエピトープ以外の標的、重複しない標的又は異なる標的を標的とする他の細胞標的療法と組み合わせでのものを含む方法で、本発明の物の組成物をより有効に使用することができる。
;例えば、Alpdogan O, van den Brink M, Semin Oncol 39: 629-42 (2012)を参照されたい)。
I提示T細胞エピトープで標識するように働く。本発明の細胞標的化分子の細胞内在化機能、細胞内の経路決定機能、及びT細胞エピトープ送達機能を活用することにより、送達されたT細胞エピトープを提示する標的細胞を利用して、宿主T細胞による提示T細胞の認識、及びCTLによる標的細胞殺滅を含む、さらなる免疫応答の誘導を誘導することができる。本発明の細胞標的化分子を使用するこの「播種」方法は、例えば、腫瘍塊又は感染組織部位などの、播種された微小環境内の細胞を、細胞標的化分子により送達されたT細胞エピトープを提示しているか否かに関わらず、攻撃するように適応免疫を誘導することにより、一時的なワクチン接種効果をもたらすことができる。この「播種」方法は、脊索動物体内の標的細胞集団、腫瘍塊、及び/又は感染組織部位に対する免疫寛容の破綻も誘導することができる。
1~0.5mg/kgである。例示的投薬量は、体重1kg当り0.01mg、体重1kg当り0.03mg、体重0.07mg、体重1kg当り0.9mg、若しくは体重1kg当り0.1mgでありうる、又は0.01~0.1mg/kgの範囲内でありうる。例示的投薬レジメンは、1日1回若しくは2回の投与、又は週に1回若しくは2回の投与、2週間に1回、3週間に1回、4週間に1回、1カ月に1回、2若しくは3カ月に1回、又は3~6カ月に1回である。投薬量は、熟練した医療専門家により、必要に応じて、特定の患者についての治療的有用性を最大にするように、選択及び再調整されうる。
療するための、方法を提供する。
巣がん及び精巣がん)、腺がん(例えば、膵臓がん、副甲状腺がん、褐色細胞腫、唾液腺がん、又は甲状腺がん)、頭頸部がん(例えば、上咽頭がん、口腔がん、又は咽頭がん)、血液がん(例えば、白血病、リンパ腫、又は骨髄腫)、腎臓・尿路がん(例えば、腎がん及び膀胱がん)、肝臓がん、肺/胸膜がん(例えば、中皮腫、小細胞肺癌、又は非小細胞肺癌)、前立腺がん、肉腫(例えば、血管肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、又は滑膜肉腫)、皮膚がん(例えば、基底細胞癌、扁平上皮癌、又はメラノーマ)、及び子宮がんからなる群から選択される。
る。例えば、標的化ドメインは、神経回路特異的Gタンパク質共役型受容体などの、ニューロン表面受容体に結合することにより特異的神経細胞型を標的とする、神経伝達物質及び神経ペプチドなどの、様々なリガンドから選択してもよく、又はそれらに由来してもよい。同様に、標的化ドメインは、ニューロン表面受容体に結合する抗体から選択してもよく、又はそれらに由来してもよい。ある特定の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、それら自体の逆行軸索輸送を強固に指示するため、本発明のある特定の細胞標的化分子を使用して、細胞体から離れた細胞毒性タンパク質注射部位で細胞外標的を発現するニューロンを殺滅することができる。神経細胞型を特異的に標的とする、本発明のこれらの標的化された細胞毒性分子は、神経科学研究において、例えば、知覚の機序を解明するために、並びにパーキンソン病及びアルツハイマー病などの神経変性疾患のモデルシステムを作出するために使用される。
本発明の細胞標的化分子の診断的に十分な量と細胞を接触させて、アッセイ又は診断技術により分子を検出するステップを含む。句「診断的に十分な量」は、利用される特定のアッセイ又は診断技術による情報収集のために妥当な検出及び正確な測定を行える量を指す。一般に、全生物のインビボでの診断使用のための診断的に十分な量は、1対象につき、対象1kg当り、検出促進剤が連結された本発明の細胞標的化分子0.001~10ミリグラムの非累積用量であるであろう。通常、これらの情報収集方法において使用される本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド又は細胞標的化分子の量は、可能な限り低い量であろうが、それでも診断的に十分な量であることを条件とする。例えば、生物におけるインビボでの検出のために、対象に投与される本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、細胞標的化分子物又は医薬組成物の量は、実行可能な限り低いであろう。
細胞型に侵入し、細胞内逆行輸送による細胞内の経路を決定する本発明のある特定の細胞標的化分子の能力に基づいて、特異的細胞型の内部区画が、検出のために標識される。これを、患者体内の生体内原位置の細胞に対して、又は生物から除去した細胞及び組織、例えば、生検試料に対して行うことができる。
法の、ある特定の実施形態を使用して、腫瘍サイズの変化を測定すること、数及び分布を含む、抗原陽性細胞集団の変化を測定すること、又は既に患者に投与した治療により標的とされた抗原以外の、異なるマーカーをモニタリングすることができる(例えば、Smith-Jones P et al., Nat. Biotechnol 22:701-6 (2004);Evans M et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA108: 9578-82 (2011)を参照されたい)。
[実施例]
素エフェクターポリペプチド
この実施例では、1つの異所性システイン残基を各々が含む、本発明の例示的な志賀毒素Aサブユニットエフェクターポリペプチド(SLT-1A-Cys(p)-バリアント(ここで、Cys(p)は、ユニークな位置における改変されたシステイン残基を表す))を、本発明の例示的な細胞標的化分子の成分として生成し、試験した。
このセクションは、1つの異所性システイン残基を各々が含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む、様々な足場の生成を説明する。異所性システイン残基を、ポリペプチド中のアミノ酸残基の総数を変化させない遺伝的にコードされた置換として、志賀毒素エフェクターポリペプチドに改変により導入した。これらの志賀毒素エフェクターポリペプチドを使用して、本発明の例示的な細胞標的化分子(例えば、SLT-1A-Cys(p)-バリアント::scFv(n))を生成した。
志賀毒素エフェクターポリペプチド及びそれらを含む分子を、当業者に公知の技術を使用して志賀毒素機能について試験することができる(例えば、国際公開第2014/164680号パンフレット、国際公開第2014/164693号パンフレット、国際公開第2015/113005号パンフレット、国際公開第2015/113007号パンフレット、国際公開第2015/138435号パンフレット、国際公開第2015/138452号パンフレット、国際公開第2015/191764号パンフレット、米国特許出願公開20160177284号明細書、国際公開第2016/126950号パンフレットを参照されたい)。例示的な細胞標的化分子を、志賀毒素Aサブユニット機能について試験した。分析した志賀毒素Aサブユニット機能は、触媒活性、真核生物リボソーム機能の阻害、細胞毒性、及び推論によりサイトゾルへの自律的細胞内経路決定であった。
例示的な細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチド成分の触媒活性を、リボソーム阻害アッセイを使用して試験した。本発明の例示的な志賀毒素エフェクターポリペプチド(配列番号9、11及び14)を含む例示的な細胞標的化分子についての触媒活性
を試験した。
例示的な細胞標的化分子の細胞毒性活性の作用強度及び特異性を試験して、それらの志賀毒素エフェクターポリペプチド成分の機能を評定した。志賀毒素エフェクターポリペプチドSLT-1A-Cys(p)を各々が含む例示的な細胞標的化分子の細胞毒性活性を、当業者に公知の組織培養細胞に基づく細胞毒性アッセイ(「細胞殺滅アッセイ」)を使用して判定した。例示的な細胞標的化分子の細胞毒性を、結合領域scFv1、scFv2、scFv3及び/又はscFv4の標的などの適切な細胞外標的生体分子の有意な量を細胞表面で発現する細胞を使用して判定した。この実施例で使用した細胞は、ATCC(Manassas VA、U.S.)、米国国立がん研究所(National Cancer Institute of the U.S.)(Frederick、MD、U.S.)、及び/又はDSZM(Braunschweig、DE)から入手可能な
、不死化、ヒト腫瘍細胞であった。下で言及する細胞は、HCC-1954、MDA-MB-231、H929、ST486、L1236、HCC827、Daudi、HDLM-2、及びU-266、又はより単純に、それぞれ、細胞株A、B、C、D、E、F、G、H及びIであった。各細胞標的化分子の結合領域の標的生体分子に対して陽性の標的生体分子と陰性の標的生体分子の両方を含む細胞殺滅アッセイを使用して、ある特定の細胞標的化分子を試験した。
対してプロットし、log(阻害剤)対応答(3変数)解析及びlog(阻害剤)対正規化応答解析を使用して、被験分子の半最大細胞毒性濃度(CD50)を決定した。試験した各分子のCD50値を、可能な場合、算出し、表3に示した。試験した濃度についての
曲線の形状に基づいてCD50値を算出できなかった場合には、最大CD50値は、試験した最大値を超える、例えば、試験した最高試料濃度、例えば100又は200ナノモル濃度(nM)で細胞の50%を殺滅しなかった試料については100ナノモル濃度より高い(「>100nM」)又は200ナノモル濃度より高い(「>200nM」)、と記した。一部の実験では、細胞標的化分子の最大濃度で処理した生体分子標的陰性細胞は、緩衝剤だけの対照と比較して生存率のいかなる変化も示さなかった。本書において実施例で報告する場合、参照分子により示されるCD50の10倍以内のCD50を示す分子は、その参照分子に匹敵する細胞毒性性を示すと見なす。生体分子標的陽性細胞集団に対して、同じ結合領域と、いかなるシステイン残基も欠いている関連志賀毒素エフェクターポリペプチド成分とを含む参照分子の100倍~10倍以内のCD50を示した細胞標的化分子を、本書では、「弱毒化されている」が活性と言う。例示的な細胞標的化分子についてのCD50値を表3に示し、関連する細胞殺滅アッセイデータを図2~3に示す。この実施例において細胞毒性活性について試験した分子は、SLT-1A-Cys5::scFv1(配列番号781)、SLT-1A-Cys7::scFv1(配列番号782)、SLT-1A-Cys10::scFv1(配列番号783)、SLT-1A-Cys2-D1::scFv2(配列番号773)、SLT-1A-Cys2-D1::scFv3(配列番号780)、SLT-1A-Cys3-D1::scFv3(配列番号779)、SLT-1A-Cys5-D1::scFv3(配列番号778)、SLT-1A-Cys6-D1::scFv2(配列番号774)、SLT-1A-Cys7-D1::scFv2(配列番号775)、SLT-1A-Cys8-D1::scFv2(配列番号776)、SLT-1A-Cys9-D1::scFv2(配列番号777)、SLT-1A1-WT(配列番号830)、SLT-1A-D1::scFv2(配列番号838)、SLT-1A-D1(配列番号831)、SLT-1A-D1-C242::scFv3(配列番号837)、及びSLT-1A-D1::scFv3(配列番号839)を含むか又はこれらからなる細胞標的化分子を含んだ。
-1A-Cys2-D1::scFv3(配列番号780)、SLT-1A-Cys3-D1::scFv3(配列番号779)、SLT-1A-Cys5-D1::scFv3(配列番号778)、SLT-1A-Cys6-D1::scFv2(配列番号774)、SLT-1A-Cys7-D1::scFv2(配列番号775)、SLT-1A-Cys8-D1::scFv2(配列番号776)、及びSLT-1A-Cys9-D1::scFv2(配列番号777)により表される本発明の例示的な細胞標的化分子は、各々、標的陽性細胞に対して毒性であり、一般に、100nM未満のCD50値を示した。表3で報告した結果は、志賀毒素エフェクターポリペプチドSLT-1A-Cys5(配列番号9)、SLT-1A-Cys7(配列番号11)、SLT-1A-Cys10(配列番号14)のいずれかを含む細胞標的化分子が、試験した細胞株に依存して一般に100nM~5マイクロモル濃度(μM)未満のCD50値を伴う作用強度で、標的陽性細胞に対して細胞毒性であったことを示す(表3;図2~3を参照されたい)。細胞標的化分子の成分として試験した志賀毒素エフェクターポリペプチドの多くについての細胞毒性は、関連細胞標的化分子(配列番号837)の成分としての関連志賀毒素エフェクターポリペプチド(いかなるシステイン残基も欠いている(配列番号831)か、又は242位に内在性システインを有する(配列番号832)、どちらか)の細胞毒性に匹敵した(表3;図2~3)。
分子
この実施例では、いずれかの毒素エフェクター領域の外部に1つの遊離システイン残基を各々が含む本発明の例示的な細胞標的化分子を生成し、試験した。
このセクションは、遊離システイン残基を含む様々な細胞標的化分子の生成を説明する。標準的技術を使用して、システイン残基を、細胞標的化タンパク質中のアミノ酸残基の総数を変化させない遺伝的にコードされた置換として、細胞標的化タンパク質に改変により導入した。この実施例では、試験した各細胞標的化分子は、細胞外標的生体分子と高い親和性で結合することができるポリペプチドを含む、細胞標的化、免疫グロブリン型、結合領域を含んだ(表4を参照されたい)。当業者に公知の及び/又は以前に記載されたような標準的技術(例えば、国際公開第2014/164680号パンフレット、国際公開第2014/164693号パンフレット、国際公開第2015/138435号パンフレット、国際公開第2015/138452号パンフレット、国際公開第2015/191764号パンフレット、及び国際公開第2016/126950号パンフレットを参照されたい)を使用して、例えばCapto(商標)-L(GE Healthcare社、Marlborough、MA、U.S.)を使用して、これらの細胞標的化分子のタンパク質発現及び精製を行った。
本発明の例示的な細胞標的化分子の細胞毒性活性の作用強度及び特異性を試験して、そ
れらの志賀毒素エフェクターポリペプチド成分の機能性を評定した。リンカー-Cys(p)、scFv(n)-リンカー-Cys(p)、又はscFv(n)-Cys(p)成分の1つを各々が含む例示的な細胞標的化分子の細胞毒性活性を、実施例1(上記)で説明した細胞殺滅アッセイを使用して判定した。scFv2の適切な細胞外標的生体分子の有意な量を細胞表面で発現する細胞を使用して、例示的な細胞標的化分子の細胞毒性を判定した。細胞毒性アッセイを使用して、試験した各分子のCD50値を算出した(表5)。関連する細胞殺滅アッセイデータを図4に示す。試験した濃度についての曲線の形状に基づいてCD50値を算出できなかった場合には、最大CD50値は、試験した最大値を超える、例えば、試験した最高試料濃度、例えば100nMで細胞の50%を殺滅しなかった試料については100nMより高い(「>100nM」)、と記した。例えば、配列番号803、807及び812を含むか又はそれらからなる細胞標的化分子などの、本発明の例示的な細胞標的化分子について、細胞毒性活性を試験した。
を示す。これらの細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチド成分(SLT-1A-D1(配列番号831))の細胞毒性は、陽性対照、参照分子SLT-1A-D1::scFv2(配列番号837)の成分と同一の志賀毒素エフェクターポリペプチド(SLT-1A-D1(配列番号831))の細胞毒性に匹敵した(表5;図4を参照されたい)。
当業者に公知の通例の方法を使用して、この実施例の、ある特定の例示的な細胞標的化分子を、産生し、精製し、次いで、分子間ジスルフィド結合について分析した。この実施例において試験した細胞標的化分子は、単一の遊離システイン残基を含むもの、例えば、#1)SLT-1A-D1-C242::scFv3(配列番号838)、#2)SLT-1A-Cys2-D1::scFv2(配列番号773)、#3)SLT-1A-Cys2-D1::scFv3(配列番号780)、#4)SLT-1A-Cys3-D1::scFv3(配列番号779)、#5)SLT-1A-Cys5-D1::scFv3(配列番号778)、#6)SLT-1A-Cys6-D1::scFv2(配列番号774)、#7)SLT-1A-Cys7-D1::scFv2(配列番号775)、#8)SLT-1A-Cys8-D1::scFv2(配列番号776)、#9)SLT-1A-Cys9-D1::scFv2(配列番号777)、#10)SLT-1A-D1::リンカー-Cys1::scFv2(配列番号803)、#11)SLT-1A-D1::scFv2-リンカー-Cys1(配列番号807)、及び#12)SLT-1A-D1::scFv2-Cys-C2(配列番号812)、並びに様々な対照として使用した他の細胞標的化分子、例えば、SLT-1A-D1::scFv2(配列番号838)及びSLT-1A-D1::scFv3(配列番号839)を含んだ。
Cys9-D1::scFv2(配列番号777)、#6)SLT-1A-D1::リンカー-Cys1::scFv2(配列番号803)、#7)SLT-1A-D1::scFv2-リンカー-Cys1(配列番号807)、#8)SLT-1A-D1::scFv2-Cys-C2(配列番号812)、#9)SLT-1A-Cys7-D1::scFv2(配列番号775)、及び#10)SLT-1A-D1::scFv2(配列番号838)。
-1A-Cys7-D1:scFv2の2分子間の共有結合性相互作用を媒介した。したがって、志賀毒素エフェクターポリペプチドの45位のシステイン残基が表面露出性であり、より一般的には、他の分子中のシステイン残基との対合に利用不能であると、推測することができる。
当業者に公知の常例的方法を使用して、本発明の例示的な細胞標的化分子(配列番号789、791~793、804、808、813、及び1141)を産生し、精製し、マレイミド活性化蛍光色素とコンジュゲートさせた。使用したマレイミド活性化蛍光色素は、Alexa Fluor(商標)488 C5マレイミド及びAlexa Fluor(商標)555 C2マレイミド(Thermo FisherScientific社、Waltham、MA、U.S.)
であった。
って使用して未結合色素からタンパク質を分離し、280nMの波長に光に対する各試料の吸光度を測定することによりタンパク質濃度を推定した。
al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988);Jackson M et al., J Bacteriol 172: 3346-50(1990);Gordon V et al., Infect Immun60: 485-90 (1992);Ohmura M et
al., Microb Pathog 15:169-76 (1993)を参照されたい)。E167D変異を含む志賀
毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子:IA-SLT-1A-D1(配列番号834)、IA-SLT-1A-Cys5-D1バリアント2(配列番号1101)、IA-SLT-1A-Cys7-D1(配列番号1102)、IA-SLT-1A-Cys8-D1(配列番号1103)、又はIA-SLT-1A-Cys9-D1(配列番号1104))を含む、例示的な細胞標的化分子を生成し、実施例5で試験した。
当業者に公知の標準的技術を使用して、カーゴ連結細胞標的化分子を細胞標的化分子機
能(例えば、標的結合、細胞結合、細胞内在化、細胞内の経路決定効率、及び細胞殺滅)について試験した(例えば、国際公開第2014/164680号パンフレット、国際公開第2014/164693号パンフレット、国際公開第2015/113005号パンフレット、国際公開第2015/113007号パンフレット、国際公開第2015/138435号パンフレット、国際公開第2015/138452号パンフレット、米国特許出願公開2015/0259428号明細書、及び国際公開第2015/191764号パンフレットを参照されたい)。例示的な細胞標的化分子を、細胞内在化及び細胞毒性、並びに推論により触媒活性、真核生物リボソーム機能の阻害、及びサイトゾルへの自律細胞内経路決定の、志賀毒素Aサブユニット機能について試験した。本発明の例示的なカーゴ連結細胞標的化分子の細胞毒性活性の作用強度及び特異性を、配列番号789を含むか又はそれからなる例示的な細胞標的化分子に基づいて試験した。加えて、カーゴ連結細胞標的化分子によるカーゴの細胞内在化を、特異的システイン残基と連結されているカーゴを各々が含む細胞標的化分子のカーゴ送達機能性を実証するために、試験した。
当業者に公知の通例の技術を使用して、例示的なカーゴ連結細胞標的化分子を、細胞結合、及び推論により標的生体分子結合機能について試験した。細胞標的化分子の標的を細胞表面でどちらかが発現する不死化ヒト細胞株(細胞株C及びG)、又は陰性対照として、試験した細胞標的化分子の標的を細胞表面で発現しない細胞株(細胞株H)を使用して、当業者に公知の標準的フローサイトメトリーアッセイ(例えば、蛍光標識細胞分取(FACS))により、各々の色素連結細胞標的化分子の細胞結合能力を測定した。
プ陰性対照試料を使用して測定したときの陰性集団を示し、黒色の線は、色素連結細胞標的化分子又は抗体陽性対照(抗抗体2 mAb-FITC)を示す。表6には、陽性ゲートで計数した細胞のパーセンテージを、試験した細胞株ごとに「陽性パーセント」として示す。表6には、試験した各標的陽性細胞株についての、MFIと陽性パーセンテージの積である、蛍光強度の指標(iMFI,indexed mean fluorescent intensity)も収載する。表6中の、「N/A」は、「該当せず」を指す。ここに収載したモノクローナル抗体は、実験細胞標的化分子の標的生体分子との細胞表面結合についての陽性対照として使用したからである。
例示的なカーゴ連結細胞標的化分子を、当業者に公知の通例の顕微鏡法に基づく蛍光技術を使用して細胞内在化について試験した(例えば、国際公開第2014/164680号パンフレット、国際公開第2015/138452号パンフレット、米国特許出願公開第20150259428号明細書を参照されたい)。細胞に投与した蛍光分子の挙動及び局在を、蛍光顕微鏡法を使用して観察した。本発明の例示的な細胞標的化分子の細胞内在化を検査するために、蛍光顕微鏡法に基づくアッセイを使用して、細胞への投与後のカーゴ連結細胞標的化分子の局在を観察した。このセクションで試験した分子は、Alexa-488又はAlexa-555などのAlexa Fluor色素とコンジュゲートされたSLT-1A-Cys5-D1(配列番号29)又はIA-SLT-1A-Cys5-D1バリアント2(配列番号1101)のどちらかの志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む、scFv2標的化分子の活性又は不活性バージョン(SLT-1A-Cys5-D1::scFv2(配列番号789)及びIA-SLT-1A-Cys5-D1::scFv2(配列番号1141))であった。
、BD Cytofix/Cytoperm(商標)(BD Biosciences社、San Jose、CA、U.S.)で固定した。次いで、細胞試料をPBSに再懸濁させ、ポリL-リジン被覆スライドガラスに塗り広げた。スライドごとに、4’,6-ジアミノ-2-フェニルインドール(DAPI)含有VECTASHIELD(登録商標)溶液(カタログ番号NC9524612、Fisher Scientific社、Waltham、MA、U.S.)を使用してカバースリップを封入し、蛍光顕微鏡法を使用してスライドを見た。
コンジュゲートしていない分子より大きい質量を有するコンジュゲートを観察する試みの中で、カーゴ連結細胞標的化分子試料をSDS-PAGEにより分析した。
例示的なカーゴ連結細胞標的化分子を、細胞に標的化された細胞毒性、並びに推論により触媒活性、真核生物リボソーム機能の阻害、及びサイトゾルへの自律細胞内経路決定の、志賀毒素Aサブユニット機能について試験した。細胞毒性アッセイは、実施例1及び実施例2で説明した通りに行った。表7及び図16は、本発明の例示的なカーゴ連結細胞標的化分子についての細胞殺滅アッセイの結果を示す。実施例1~2の場合とは異なり、カーゴ連結細胞標的化分子の試料の細胞毒性を、コンジュゲートされたいかなるカーゴも欠いている同じ細胞標的化分子の試料の細胞毒性と比較した。
この実施例は、1つのユニークなリジン残基を各々が含有する志賀毒素エフェクターポリペプチド(SLT-1A-Lys(p)-バリアント(ここで、Lys(p)は、ユニークな位置のリジン残基を表す))を含む様々な足場の生成を説明するものであり、これらの足場を生成し、本発明の例示的な細胞標的化分子の成分として試験した。全ての他のリジン残基を、ポリペプチド中のアミノ酸残基の総数を変化させない遺伝的にコードされた置換として、志賀毒素エフェクターポリペプチドから除去した。これらの志賀毒素エフェクターポリペプチドを使用して、本発明の例示的な細胞標的化分子(例えば、SLT-1A-Lys(p)::scFv(n))を生成した。
、200~202、及び205を参照されたい)を含む細胞標的化分子(例えば、配列番号818~823を参照されたい)を、標準的技術を使用して作製し、実施例1で説明したように志賀毒素Aサブユニット機能の保持について試験した。
VA、U.S.)、米国国立がん研究所(Frederick、MD、U.S.)、及び/又はDSZM(Braunschweig、DE)から入手可能な、不死化、ヒト腫瘍細胞、例えば、HCC-1954、MDA-MB-231、Daudi、及びU-266細胞、又はより単純に、それぞれ、細胞株A、B、G及びIであった。各細胞標的化分子の結合領域の標的生体分子に対して、陽性の標的生体分子と陰性の標的生体分子の両方を含むある特定の細胞標的化分子を、細胞殺滅アッセイを使用して試験した。
又はRealTime-Glo(登録商標)MT Cell Viability Assay(Promega社、Madison、WI、U.S.)を製造業者の使用説明書に従って使用して、発光の読出し情報を使用して、総細胞生存数又は生存パーセントを決定した。
この実施例は、1つのユニークなリジン残基を各々が含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む、様々な足場の生成を説明する。全ての他のリジン残基を、ポリペプチド中のアミノ酸残基の総数を変化させなかった遺伝的にコードされた置換として、志賀毒素エフェクターポリペプチドから除去する。これらの志賀毒素エフェクターポリペプチドを使用して、本発明の例示的な細胞標的化分子(例えば、scFv(n)::SLT-1A-Lys(p)及びSLT-1A-Lys(p)::scFv(n)(ここで、「p」は、ユニークなリジン残基に番号を付ける)を生成する。
連結細胞標的化分子が、作用強度及び活性の点でこれらの細胞標的化分子のコンジュゲートしていないバリアントに匹敵する、標的陽性細胞に対する強力且つ特異的な細胞毒性を保持することを示す。この実施例における実験の結果は、カーゴ分子を、本発明の細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチドのユニークなリジン残基とコンジュゲートさせることができること、並びにさらに、そのようなコンジュゲートさせた細胞標的化分子が、標的陽性細胞の内部へのカーゴ分子の有用な送達レベル及び/又は標的とした細胞に対する有用な細胞毒性レベルを示すことを実証する。
この実施例は、ゼロ個のリジン残基を各々が含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む、様々な足場の生成を説明する。全ての他のリジン残基それぞれを、ポリペプチド中のアミノ酸残基の総数を変化させなかった遺伝的にコードされた置換として、志賀毒素エフェクターポリペプチドから除去する。これらの志賀毒素エフェクターポリペプチドを使用して、本発明の例示的な細胞標的化分子(例えば、SLT-1A-Lys(null)::scFv(n)(ここで、「null」は、志賀毒素Aサブユニット成分中の一切のリジン残基の欠如を指す))を生成する。
を評定した。例示的な細胞標的化分子についてのCD50値を表12に示し、関連する細胞殺滅アッセイデータを図17~19に示す。
ドだけを含む本発明の細胞標的化分子の成分の遊離リジン残基とコンジュゲートさせることができること、並びにさらに、そのようなコンジュゲートさせた細胞標的化分子が、標的陽性細胞の内部へのカーゴ分子の有用な送達レベル及び/又は標的とした細胞に対する有用な細胞毒性レベルを示すことを実証する。
この実施例は、各々がいかなるシステイン残基も又はいかなるリジン残基も欠いている、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む、様々な足場の生成を説明する。これらの足場の多くは、いかなるシステイン又はリジン残基も欠いている志賀毒素Aサブユニットエフェクターポリペプチドと直接融合しているペプチド又はポリペプチドからなる、リンカー又は伸長部を含む。この実施例で使用する場合、「リンカー」は、細胞外標的生体分子に結合することができる細胞標的化結合領域と志賀毒素エフェクターポリペプチドを連結する細胞標的化分子における構造を表し、この場合のリンカーは、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域構造の一部でも、細胞標的化結合領域構造の一部でもない。
プチド足場を生成し、細胞標的化分子に関して、実施例1及び6の場合のように志賀毒素Aサブユニット機能の保持について試験した。この実施例において試験した本発明の各々の例示的な志賀毒素エフェクター足場は、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域の外部の追加のタンパク質性構造を含んだ(表13を参照されたい)。
細胞標的化分子のタンパク質発現及び精製を行った。
2(配列番号812))からの実験結果を示す。SLT-1A-D1::リンカー-Cys1::scFv2(配列番号803)、SLT-1A-D1::scFv2-リンカー-Cys1(配列番号807)、及びSLT-1A-D1::scFv2-Cys-C2(配列番号812)の細胞毒性活性は、その志賀毒素エフェクターポリペプチド成分中のいかなるシステイン残基も欠いている親分子SLT-1A-D1::scFv2(配列番号838)の活性に匹敵した。表15で報告した結果は、SLT-1A-D1::リンカー-Cys1::scFv2、SLT-1A-D1::scFv2-リンカー-Cys1及びSLT-1A-D1::scFv2-Cys-C2を含むか又はそれらからなる細胞標的化分子が全て、30pM未満のCD50値で、標的陽性細胞に対して細胞毒性であったことを示す。これらの細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチド成分(SLT-1A-D1(配列番号831))の細胞毒性は、陽性対照、参照分子SLT-1A-D1::scFv2(配列番号837)の成分と同一の志賀毒素エフェクターポリペプチド(SLT-1A-D1(配列番号831))の細胞毒性に匹敵した(表15;図4を参照されたい)。
この実施例では、1つの異所性セレノシステイン残基を各々が含む、本発明の例示的な志賀毒素Aサブユニットエフェクターポリペプチド(SLT-1A-Sec(p)-バリアント(ここで、Sec(p)は、ユニークな位置における改変されたセレノシステイン残基を表す))を、本発明の例示的な細胞標的化分子の成分として生成し、試験する。異所性セレノシステイン残基を、ポリペプチド中のアミノ酸残基の総数を変化させなかった遺伝的にコードされた置換として、志賀毒素エフェクターポリペプチドに改変により導入する。これらの志賀毒素エフェクターポリペプチドを使用して、本発明の例示的な細胞標的化分子(例えば、SLT-1A-Sec(p)-バリアント::scFv(n)、scFv(n)::SLT-1A-Sec(p)-バリアント、StxA-Sec(p)-バリアント::scFv(n)、及びscFv(n)::StxA-Sec(p)-バリアント)を生成する。
列番号1若しくは配列番号2のアミノ酸1~251、又は配列番号3のアミノ酸1~250)を含む、同様に脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドの触媒活性と同等である。
この実施例では、1つの異所性ピロリン-カルボキシ-リジン残基を各々が含む、本発明の例示的な志賀毒素Aサブユニットエフェクターポリペプチド(SLT-1A-Pcl(p)-バリアント(ここで、Pcl(p)は、ユニークな位置における改変されたピロリン-カルボキシ-リジン残基を表す))を、本発明の例示的な細胞標的化分子の成分として生成し、試験する。異所性ピロリン-カルボキシ-リジン残基を、ポリペプチド中のアミノ酸残基の総数を変化させなかった遺伝的にコードされた置換として、志賀毒素エフェクターポリペプチドに改変により導入する。これらの志賀毒素エフェクターポリペプチドを使用して、本発明の例示的な細胞標的化分子(例えば、SLT-1A-Pcl(p)-バリアント::scFv(n)、scFv(n)::SLT-1A-Pcl(p)-バリアント)、StxA-Pcl(p)-バリアント::scFv(n)、及びscFv(n)::StxA-Pcl(p)-バリアント)を生成する。
術を使用し、親志賀毒素エフェクターポリペプチドを使用して、各々が1つのユニークな異所性のピロリン-カルボキシ-リジン残基を有し、リジン残基を有さなくてもよい、様々な志賀毒素エフェクターポリペプチドを作製する(表17を参照されたい)。表17に記載する、正確に1つの異所性ピロリン-カルボキシ-リジン残基を有する志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子を、標準的技術を使用して生成し、上記実施例で説明したように試験する。表17中のコード「Pcl」は、ピロリン-カルボキシ-リジンを指す。
この実施例では、本発明の細胞標的化分子を、本書に記載する1つ又は2つ以上の志賀毒素エフェクターポリペプチドを使用して、カーゴ、及び/又は細胞標的化分子を変化させる薬剤の、部位特異的結合のための、ユニークなアミノ酸残基をもたらすように生成し、ここで、志賀毒素エフェクターポリペプチドはまた、1)脱免疫化、2)プロテアーゼ切断耐性、及び/又は3)埋め込まれた若しくは挿入された異種T細胞エピトープのうちの2つ又は3つ以上ももたらす。免疫グロブリン型結合領域は、表18の縦列1から選択される分子に由来し、表18の縦列2に示す細胞外標的生体分子に結合する。選択された免疫グロブリン型結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドを互いに会合させる。この実施例の例示的タンパク質を、当技術分野において公知の技術を使用して、カルボキシ末端KDEL型シグナルモチーフ(配列番号1142として開示される「KDEL」)とともに生成してもよく、追加の外在性物質、例えば、有用な薬剤:ポリエチレングリコール若しくは血清アルブミンのような、検出促進剤、溶解度を変化させる薬剤、薬物動態を変化させる薬剤、免疫原性を変化させる薬剤、及び/若しくは薬力学的変化をもたらす薬剤など、並びに/又は追加の外在性物質:抗原、酵素若しくはメッセンジャーRNAのような、ペプチド、タンパク質、核酸、タンパク質-核酸複合体、細胞毒性薬剤若しくは抗生物質と、連結させてもよい。得られた分子を、適切な細胞外標的生体分子を発現する細胞を使用して、前の実施例で説明したような、本発明の細胞標的化分子としてカテゴリー化されるのに必要な任意の機能について試験する。
Claims (8)
- 配列番号828のポリペプチド配列を含む、又はそれからなるHER2/neu/ErbB2標的化分子。
- 薬学的に許容される溶媒和物又は塩の形態の、請求項1に記載のHER2/neu/ErbB2標的化分子。
- 請求項1又は2に記載のHER2/neu/ErbB2標的化分子と、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤又は担体とを含む医薬組成物。
- 請求項1若しくは2に記載のHER2/neu/ErbB2標的化分子をコードするポリヌクレオチド、又はその相補体。
- 請求項4に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項4に記載のポリヌクレオチド又は請求項5に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1若しくは2に記載のHER2/neu/ErbB2標的化分子又は請求項3に記載の医薬組成物を含む、患者の疾患、障害又は状態の治療剤。
- 疾患、障害又は状態が、がん、腫瘍、異常増殖状態、免疫障害若しくは微生物感染症である、請求項7に記載の治療剤。
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