KR20160127759A - 아미노-말단 근위 시가 독소 a 서브유닛 작동체 영역 및 세포-표적 면역글로불린-유형 결합 영역을 포함하는 단백질 - Google Patents

아미노-말단 근위 시가 독소 a 서브유닛 작동체 영역 및 세포-표적 면역글로불린-유형 결합 영역을 포함하는 단백질 Download PDF

Info

Publication number
KR20160127759A
KR20160127759A KR1020167025657A KR20167025657A KR20160127759A KR 20160127759 A KR20160127759 A KR 20160127759A KR 1020167025657 A KR1020167025657 A KR 1020167025657A KR 20167025657 A KR20167025657 A KR 20167025657A KR 20160127759 A KR20160127759 A KR 20160127759A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
cell
immunoglobulin
cancer
region
Prior art date
Application number
KR1020167025657A
Other languages
English (en)
Inventor
에릭 포마
에린 윌렛
Original Assignee
몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. filed Critical 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션.
Publication of KR20160127759A publication Critical patent/KR20160127759A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K47/48484—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/25—Shigella (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
    • C07K16/088—Varicella-zoster virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
    • C07K16/089—Cytomegalovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
    • C07K16/1063—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV env, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, PND, CD4 binding site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/20—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans from protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/286—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against neuromediator receptors, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2881—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD71
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Abstract

본 발명은 세포-유형 특이 표적화를 위한 면역글로불린-유형 결합 영역 및 시가 독소 작동체 기능(예: 세포 내재화, 준세포 경로화 주도, 및/또는 세포독성)을 위한 시가 독소 A 서브유닛 작동체 영역을 포함하고, 시가 독소 작동체 영역이 단백질의 아미노-말단에 근위에 있도록 결합 영역 및 시가 독소 작동체 영역이 결합된 단백질을 제공한다. 여기에 언급된 단백질은 항원, 세포독성제, 및 검출 촉진제와 같은 부가적인 외인성 물질을 포함할 수 있고, 이러한 부가적인 외인성 물질을 표적 세포 내부로 전달할 수 있다. 본 발명의 단백질은 표적 세포 표적화 사멸, 표적 세포 내부로 외인성 물질 전달, 표적 세포의 준세포 구획 표지, 및 암, 종양, 그 외 성장이상, 면역 장애, 및 미생물 감염을 포함한 여러 상태의 진단 및/또는 치료와 같은 방법의 용도를 가지고 있다.

Description

아미노-말단 근위 시가 독소 A 서브유닛 작동체 영역 및 세포-표적 면역글로불린-유형 결합 영역을 포함하는 단백질{PROTEINS COMPRISING AMINO-TERMINAL PROXIMAL SHIGA TOXIN A SUBUNIT EFFECTOR REGIONS AND CELL-TARGETING IMMUNOGLOBULIN-TYPE BINDING REGIONS}
본 발명은 세포 표적을 조정하기 위한 면역글로불린 타입 영역, 및 시가 독소 작동체 영역이 세포독성 단백질의 아미노-말단에 인접하도록 결합된 시가 독소 작동체 영역을 포함하는 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 단백질은 예를 들어 특이 세포의 선별적인 사멸과 같은, 표적세포 내에, 외인성 물질을 전달하고, 표적세포의 준세포 구역을 표지하는 용도, 및 암, 종양, 면역 장애, 및 세균감염을 포함한 각종 질병, 장애 및 질환의 치료를 위한 치료분자로서의 용도를 갖는다.
치료제로 효과적인 독소로부터 합성 융합 단백질을 개발하는 것은 수십년 동안 과학자들의 과제였다(Pastan I, et al., Annu Rev Med 58: 221-37(2007)). 그러나 박테리아 및 식물 독소로부터 유도된 합성 세포독성 단백질의 효소 독성 성분이 세포를 사멸하기 위하여 그들의 시토졸 표적 기질(substrate)에 도달해야 한다는 것이 하나의 장애물이었다. 많은 재조합 세포독성 단백질에 있어서, 세포독성의 효능은 세포내 경로화(intracellular routing) 내에서의 분자 효율에 달려 있다(Pirie C et al., J Biol Chem 286: 4165-72(2011)); 그러나 독소들이 어떻게 엔도솜(endosome)으로부터 시토졸까지 그들의 세포내에서 이동하는지를 이해하는 것은 과학적인 의문에 대한 도전으로 남아있다(Antignani A, Fitzgerald D, Toxins 5: 1486-502(2013)).
많은 단백질들은 도메인(domain)으로 불리는 보존된 폴리펩티드 서열을 포함하는데, 이들은 그 전체 단백질에 독립적으로 또는 하나의 이종상동성(orthologous) 단백질 속으로 재조합될 때 기능할 수 있도록 자체-구속되고, 접힘 단위(folding units)를 갖는 단백질 구조를 형성한다(Kirshner M, Gerhart J, Proc Nail Acad Sci USA 95: 8420-7(1988)). 신규한 단백질의 생성에 모듈화된 단백질 도메인을 사용하는 것은 거의 무한한 가능성을 제공한다(Nixon A et. al, Proc Natl Acad Sci USA. 94: 1069-73(1997)). 하나의 가능성은 표적 도메인 및 단백질 독성 도메인으로 구성되는 키메라 분자의 분자 조작이다. 자연적으로 발생하는 독소들 또는 절단된 독소 단편들은 세포-표적 치료 분자를 생성한다는 희망과 함께 화학 접합(conjugation) 또는 재조합 단백질 조작 기술을 통하여 면역글로불린 도메인 또는 수용체에 연결되거나 융합된다(Moolten F, Cooperband S, Science 169: 68-70(1970); Thorpe P et al., Nature 271: 752-5(1978); Krolick K et al., Proc Natl Acad Sci USA 77: 5419-23(1980); Krolick K et al., Cancer Immunol Immunother 12: 39-41(1981); Blythman H et al., Nature 290: 145-46(1981); Chaudhary V et al., Nature 339: 394-7(1989); Strom T et al., Semin Immunol 2: 467-79(1990); Pastan I et al., Anna Rev Biochem 61: 331-54(1992); Foss F et al., Curr Top Microbiol Immunol 234: 63-81(1998)). 이러한 분자 조작의 한 목적은 2중의 기능, 즉 1) 전신투여 후의 유기체 내에서 특이세포 타입 또는 특이 장소에 독소를 전달하고, 2) 진핵세포 내에서 효과적인 강력한 세포독성 메커니즘을 이용하여 특이세포에 표적 세포독성을 유발시키는 기능을 갖는 키메라 분자를 설계하기 위한 것이다.
관련된 단백질 독소의 시가 독소군, 특히 이질균(S. dysenteriae) 및 대장균(E. Coli)으로부터 분리된 독소의 시가 독소군은 구조적으로 그리고 기능적으로 관계되는 다양한 자연적으로 발생하는 독소로 구성된다(Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16(2010)). 예를 들어, 상기 시가 독소군은 이질균 세로타입(serotype) 1로부터 분리된 시가독소(Stx), 장관 출혈성 대장균의 세포타입으로부터 분리된 시가-유사 독소 1 이형(SLT1 또는 Stx1 또는 SLT-1 또는 Slt-1), 및 장관 출혈성 대장균의 세로타입으로부터 분리된 시가-유사 독소 2 이형(SLT2 또는 Stx로부터 단지 하나의 잔기만이 다르고, 이들은 모두 베로세포독소(vero cytotoxin) 또는 베로독소(verotoxin)(vts)로 명명된다(O'Brien A et al., Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94(1992)). 시가 독소군의 각각은 동일한 전체적인 구조 및 행동 메커니즘을 공유한다(Engedal N et al., Microbial Biotech 4: 32-46(2011)). 예를 들어, Stx, SLT-1 및 SLT-2는 무세포 시스템에서 구분할 수 없는 효소 활동을 나타낸다(Head S et al., J Biol Chem 266: 3617-21(1991); Tesh V et al., Infect Immun 61: 3392-402(1993); Brigotti M et al., Toxicon 35: 1431-1437(1997)). 시가 독소군의 개체는 상당한 숙주 세포의 표면에 존재하는 특이 글리코스핑고리피드 및 세포 내에서 리보솜을 영구 불활성 시킬 수 있는 효소 도메인에 우선적으로 결합하는 표적 도메인을 포함한다(Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16(2010)).
시가 독소군의 개체는 숙주의 감염중에 독성 요소로서 박테리아에 의해 사용된다(Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16(2010)). 감염된 숙주에서, 시가 독소는 단백질 합성을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 독소의 강력한 능력 때문에 세포독성이다(Johannes, Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010)). 숙주 세포에서의 시가 독소의 강력한 세포독성 효과는 출혈성 대장염 및 출혈성 요도증후군을 초래할 수 있다(Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16(2010)).
시가 독소군의 개체는 시가 단백질 서브유닛의 A(B)5 배열로 특징되는 공통의 다중결합 단백질 구조를 공유한다(Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16(2010)). 각각의 시가 독소는 두 개의 단백질 서브유닛, A 및 B로 구성되는데, 이들은 완전독소 단백질 복합체를 형성하도록 A(B)5 배열 내에서 관여한다. 시가독소 A서브유닛은 효소 도메인을 포함하는 32 킬로달톤 단량체(monomer)이며, 시가 독소 B 서브유닛은 7.7 킬로달튼 서브유닛이 4개의 다른 시가 독소 B 서브유닛과 결합하여 시가 독소 B 서브유닛의 5량체를 형성한다. 시가 독소 B 서브유닛의 5량체는 하나의 A서브유닛과 결합하여 시가 완전독소를 형성하는데, 이는 70 킬로달톤이다(O'Brien A, Holmes, R, Microbiol Rev 51 :206-20(1987)).
시가 독소군의 개체는 5개의 주요 상(phase)으로 분할될 수 있는 숙주 세포의 중독을 위한 공통의 공정을 공유하는데, 이 5개의 주요 상은 세포 표면결합, 세포 이물흡수, 소포체의 역행성 준세포 이동, 소포체로부터 시토졸까지의 위치변경, 및 시토졸 내에서 리보솜의 효소 불활성화이다. 첫째, 시가 완전독소는 CD70로도 알려진, 외형질성 막 리플렛(leaflet)에 존재하는 글리코스핑고리피드 글로보트리아오실세라마이드 Gb3와 특이적으로 결합하는 B 서브유닛 능력에 의해서 특이 숙주 세포의 세포표면에 유도된다(Ling, H et al, Biochemistry 37: 1777-88(1998); Thorpe C et al., Infect Immun 67: 5985-93(1999); Soltyk A et al., J Biol Chem 277: 5351-59(2002)). 둘째, 시가 완전 독소는 완전 독소가 엔도솜 내에 초기에 포함되는 숙주 세포 속으로 들어가기 위하여 숙주 세포의 세포 이물 흡수 기전을 이용한다(Sandvig K et al., J Cell Biol 108: 1331-43(1989); Sandvig K et al., Histochem Cell Biol 117: 131-141(2002)). 셋째, 시가 완전독소는 소포체에 도달하여 시토졸에 접근하도록 숙주 세포의 세포내-이동 기전을 이용한다.(Nichols B et al., J Cell Biol 153: 529-41(2001); Lauvrak S et al., J Cell Sci 117: 2321-31(2004); Saint-Poi A et al., Dev. Cell 6: 525-38(2004)). 넷째, 시가 완전독소의 효소 활성 단편들은 소포체로부터 시토졸로 위치 변경한다(Yu M, Haslam D, Inject Immun 73: 2524-32(2005); LaPomte P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005); Falguieres T, Johannes L, Biol Cell 98: 125-34(2006); Tarn P, Lingwood C, Microbiology 153: 2700-10(2007)). 다섯째, 시가독소 효소 활성 단편들의 시토졸 일부는 숙주세포 리보솜을 불활성화함으로써 세포독성을 유발시킨다(Tam, Microbiology 153: 2700- 10(2007)).
시가 독소 중독 과정에서, 시가 독소 A 서브유닛은 보존된 아르기닌 잔기와 메티오닌 잔기(예를 들어, StxA 및 SLT-1A에서 Arg251-Met252) 사이에서 숙주 세포 엔도프로테아제인 퓨린에 의해 단백질 가수분해 절개된다(Garred 0 et al., J Biol Chem 270: 10817-21(1995)). 이 퓨린-절개된 시가독소 A 서브유닛의 아미노-말단 단편은 시가 독소 "A1 단편"이라 한다(또는 Stxn-A1, SLTn-A1, SLT-nA1). 시가 독소 A1 단편은 시가 독소의 촉매 도메인을 함유하는 28킬로달톤 단백질이다(Fraser M et al., Not Struct Biol 1: 59-64(1994)). 숙주 세포에 대한 시가 독소 세포독성 기전은 진핵 세포 리보솜의 A1 단편의 강력한 촉매 불활성화 및 단백질 합성의 세포-광역 억제를 통하여 두드러진다(Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)).
시가 독소 A1 단편은 진핵세포 리보솜의 28S, 리보솜 RNA의 알파-사르신-리신 루프 내의 위치 4,324에서 보편적으로 보존된 아데닌 핵염기를 향하여 강력한 탈퓨린화 활성에 의하여 단백질 번역을 억제한다(Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16(2010)). 리보솜의 임계 개수가 불활성화된 후에, 숙주 세포는 경험을 통하여 세포사멸을 유도하도록 단백질 합성에서 충분한 감소를 경험하는 것으로 예측된다(Iordanov M et al., Mol Cell Biol 17: 3373-81(1997); Smith W et al., Infect Immun 71: 1497-504(2003); Lee S et al., Cell Microbiol 10: 770-80(2008); Tesh V, Future Microbiol 5: 431-53(2010)).
리보솜-불활성 A-B 독소는 1분당 약 1,500 리보솜의 속도로 동일 세포 내에서 하나의 리보솜에서 다른 리보솜을 영구적으로 불구화할 수 있다(Endo Y, Tsurugi K, Eur J Biochem 171: 45-50(1988); Endo Y et al., J Biol Chem 263: 8735-9(1988)). A-B 독소의 성능은 매우 강력한 것으로 보고되는데, 하나의 독소 분자라도 하나의 세포를 죽일 수 있다(Yamaizumi M et al., Cell 15: 245-50(1978); Antignani, Toxins 5: 1486-502(2013)). A-B 독소의 단일 분자가 35분 안에 300 리보솜을 비가역적으로 불활성화할 수 있고, 하나의 암세포를 죽이는데 충분한 것으로 추측된다(Weldon J, Fasten I, FEBS Journal 278: 4683-700(2011)). 이러한 수준의 강력한 세포독성이 시가 독소 A 서브유닛에 대해서도 예측되는데, 따라서 시토졸 속으로 위치변경된 하나의 분자가 하나의 세포를 죽이는데 충분한 것으로 제시되었다(Tam, Microbiology 153: 2700-10(2007)).
시가 독소군의 완전독소는 치료제로서의 표적 되지 않는 사용의 경우에 지나친 독성을 갖는 것으로 예측된다(Jain, R, Tumor physiology and antibody delivery, Front Radiat Ther Oncol 24: 32-46(1990)). 그러나, 시가 독소군의 개체는 독소 구조, 특성 및 생물학적 활성에 대한 합리적인 변경에 의하여 치료 적용을 위하여 인위적으로 조작 가능한 능력을 갖는다(Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16(2010); Engedal, Microbial Biotech 4: 32-46(2011)). 시가 완전 독소는 두 개의 비공유전자쌍 부착 모듈 부로 이루어진 2부 구조를 갖는데, 하나는 효소 활성 A1 단편을 함유하는 A-성분이고, 다른 하나는 세포-표면 표적 Gb3에 결합부위를 함유하는 B-성분이다. 시가 독소 서브유닛은 규격화된 모듈이기 때문에, 치료제 조성물이 A 및 B 성분의 분리된 구조 및 기능에 기초하여 생성될 수 있다는 가설이 성립되었다(U.S. application 20090156417 A1; Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16(2010); Engedal, Microbial. Biotech 4: 32-46(2011); E.P. application 2402367 A1; U.S. application 20130196928 A1; 이는 내용 전부가 참조로서 이곳에 포함되었다).
시가 독소군의 개체의 A-성분은 어떤 B-성분과도 무관하게 안정하고, 효소 활성이며, 세포독성이다(Engedal, Microbial Biotech 4: 32-46(2011)). 시가 독소 1A 서브유닛은, 절단되거나 다른 단백질 도메인에 융해될지라도 촉매 활성이고, 체외에서 리보솜을 효소 불활성화할 수 있고, 세포독성이다(Haddad J et al., J Bacteriol 175: 4970-8(1993); Al-Jaufy A et al., Infect Immun 62: 956-60 (1994); Al-Taufy A et al., Infect Immun 63: 3073-8(1995); LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18(2005); Di R et al., Toxicon 57: 535-39(2011)). 시가-유사 독소 1 A 서브유닛 절단물은 촉매활성이다. 시험관 내에서 리보솜을 효소 불활성화할 수 있고, 세포 내에서 발현될 때 세포독성이다(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18(2005)).
[13]암세포를 선별적으로 죽이는 키메라 분자를 제조하기 위하여 하나의 표적 도메인에 하나의 독소를 결합하는 기술은 새로운 것은 아니다(Strebhardt K, Ullrich A, Nat Rev Cancer 8: 473-80(2008)). 예를 들어, 1970년대 이후로, 박테리아 디프테리아 독소, 박테리아 슈도모나스 외독소(exotoxin), 및 류신에 의해 대표되는 식물독소의 3종 독소 후보군을 사용하는 면역독소가 개발되었다(Antignani, Toxins 5: 1486-502(2013)). 그러나, 2013년까지, 이들 세 독소는 "면역독소 개발을 위한 최고의 선택"으로 남아있었다(Antignani, Toxins 5: 1486-502(2013)). 오늘날까지, 어느 누구도 표적 세포를 특이적으로 그리고 선별적으로 죽일 수 있는 세포표적 면역글로불린-유형 결합 영역에 결합된 시가 독소로부터 유도된 아미노산 서열을 포함하는 세포독성 단백질을 설명하지 못하였다.
시가 독소 구조물의 세포독성 성능을 시토졸에 도달하는 효율에 달려있다(Tam, Microbiology 153: 2700-10(2007)); 그러나 시토졸에 독소를 경로화하는 분자 기전에 대한 오늘날의 이해는 아직까지 도전해야 할 과제로 남아있다(Antignani, Toxins 5: 1486-502(2013)). 암, 종양, 면역장애, 및 세균 감염과 같은 각종 질병의 치료에서 치료제로 사용하고 특이 세포를 표적 사멸하기 위하여 세표내 경로화를 자가-주도하고 강력한 세포독성을 나타내는 시가-독소-서브유닛 A유래 영역을 포함하는 세포-표적 세포독성 단백질을 개발한다면 바람직할 것이다. 그래서 세포표적을 위하여 이형 폴리펩티드 결합 영역에 연결된 후에, 자가-주도된 세포내 경로화 및 세포독성과 같은 독소 작동체 성능을 보유하는 시가-독소-서브유닛 A유래 영역을 포함하는 세포독성 단백질을 조작하는 방법이 필요하게 되었다
발명의 요약
본 발명은 1) 면역글로불린으로부터와 같은 면역글로불린-유형 결합 영역, 및 2) SLT1A로부터와 같은 시가 독소 작동체 영역을 포함하는 다양한 단백질을 제공한다. 시가-독소-서브유닛 A 유도 폴리펩티드 영역을 면역글로불린-유형 결합 영역에 연결하는 것은 시가독소 세포독성의 세포 특이 표적의 조작을 가능하게 하고, 이들 두 영역이 결합하여 면역글로불린-유형 결합 영역이 단백질의 아미노-말단에 대하여 시가 독소 영역에 비교적 근접하지 않을 때 세포독성이 가장 높다. 본 발명의 단백질은 예를 들어 표적 세포 사멸, 외인성 물질 전달 등과 같은 진단시약으로서의 용도, 및 암, 종양, 발육이상, 면역장애, 및 세균 감염을 포함하여 각종 질병, 장애 및 질환의 치료를 위한 치료제 분자로서의 용도를 갖는다.
본 발명에 따른 단백질은 (a) 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하고 최소한 하나의 세포외 표적 생체분자를 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린-유형 결합 영역, 및 (b) 시가 독소군의 최소한 하나의 A 서브유닛의 아미노산 서열로부터 유도된 폴리펩티드를 포함하는 시가 독소 작동체 영역을 포함하며, 상기 면역글로불린-유형 결합 영역과 상기 시가 독소 작동체 영역은 상기 면역글로불린-유형 결합 영역이 상기 시가 독소 작동체 영역의 아미노-말단에 근접하여 위치하지 않도록 세포독성 단백질 내에 물리적으로 배열되거나 배향된다.
본 발명에 따른 단백질은 (a) 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하고 최소한 하나의 세포외 표적 생체분자를 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린-유형 결합 영역, 및 (b) 시가 독소군의 최소한 하나의 A 서브유닛의 아미노산 서열로부터 유도된 폴리펩티드를 포함하는 시가 독소 작동체 영역을 포함하며, 상기 글로불린-유형 결합 영역과 상기 시가 독소 작동체 영역은 상기 글로불린-유형 결합 영역이 상기 시가 독소 작동체 영역에 관련된 단백질의 아미노-말단에 근접하여 위치하지 않도록 세포독성 단백질 내에 물리적으로 배열되거나 배향된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 단백질은 (a) 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하고 최소한 하나의 세포외 표적 생체분자를 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린-유형 결합 영역, 및 (b) 시가 독소군의 최소한 하나의 A 서브유닛의 아미노산 서열로부터 유도된 폴리펩티드를 포함하는 시가 독소 작동체 영역을 포함하며, 상기 면역글로불린-유형 결합 영역과 상기 시가 독소 작동체 영역은 상기 시가 독소 작동체 영역이 단백질의 아미노-말단에 근접하여 위치하도록 세포독성 단백질 내에 물리적으로 배열되거나 배향된다.
본 발명에 따른 단백질의 특정 구체 예에서, 면역글로불린-유형 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드이다: 단일-도메인 항체(sdAb)단편, 나노바디(nanobody), 카멜리드로부터 유도된 중쇄 항체 도메인(VHH 단편), 연골어류로부터 유도된 중쇄 항체 도메인, 면역글로불린 신규 항원 수용체(IgNARs), VNAR 단편, 단일-체인 가변성 단편(scFv), 항체 가변성 단편(Fv), 상보결정영역3(CDR3) 단편, 제약된 FR3-CDR3-FR4(FR3-CDR3-FR4) 폴리펩티드, Fd단편, 작은 모듈 면역약학(SMIP)도메인, 항원-결합단편(Fab), 피브로넥션-유도 10th 피브로넥틴 타입Ⅲ 도메인(10Fn3)(즉 모노바디), 테낙신 타입Ⅲ 도메인(즉 TNfn3), 안키린 반복 모티프 도메인(ARD), 저밀도-리포프로테인-수용체-유도 A 도메인(LDLR 또는 LDLR-A의 A도메인), 리포칼린(안티칼린), 쿠니츠 도메인, 단백질-A-유도 Z 도메인, 감마-B결정-유도 도메인, 유비퀴틴-유도 도메인, Sac7d-유도 폴리펩티드(아피틴), Fyn-유도 SH2 도메인, 미니단백질, C-유형 렉틴-형 도메인 스캐폴드 조작 모방 항체, 및 결합 기능을 보유하는 상기 전술한 어느 하나의 유전 조작 대응물.
어떤 구체예에서는, 본 발명의 단백질을 단백질 결합영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합한 세포에 투여함으로써, 그 단백질이 세포 사멸을 유발할 수 있다. 다른 구체 예에서는, 본 발명의 단백질을 세포외 표적 생체분자의 존재 또는 수준과 같은 다른 두 개의 세포군에 투여함으로써, 그 단백질이 그 단백질의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합하지 않은 세포에 CD50 보다 최소한 3배 또는 그 이하의 CD50에서 세포독성 단백질의 결합영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합한 세포에 세포사멸을 유발할 수 있다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 단백질을 그 단백질의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자에 물리적으로 결합된 제1 세포군, 및 상기 결합영역의 어떤 세포외 표적 생체분자에 물리적으로 결합되지 않은 제2 세포군에 투여함으로써, 상기 제2 세포군의 멤버에 관련한 상기 제1 세포군의 멤버에 대한 세포-표적 분자의 세포독성 효과가 최소한 3배 더 크다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 단백질을 그 단백질의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자에 물리적으로 결합된 제1 세포군, 및 상기 결합영역의 어떤 세포외 표적 생체분자에 물리적으로 결합되지 않은 제2 세포군에 투여함으로써, 상기 제2 세포군의 멤버에 관련한 상기 제1 세포군의 멤버에 대한 세포-표적 분자의 세포독성 효과가 최소한 3배 더 크다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 단백질을 표적 생체분자 양성세포의 제1 세포군 및 세포 표면에서 단백질의 결합영역의 표적 생체분자의 상당량을 발현하지 않는 제2 세포군에 투여함으로써, 제2 세포군의 멤버에 관련한 제1 세포군의 멤버에 대한 단백질의 세포독성 효과가 최소한 3배 더 크다.
어떤 구체 예에서는, 면역글로불린-유형 결합 영역이 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나의 세포외 표적 생체분자를 결합하는 성능에 의하여 설계되거나 선별된다: CD20, CD22, CD40, CD74, CD79, CD25, CD30, HER2/neu/ErbB2, EGFR, EpCAM, EphB2, 전립선 특이적 막항원(prostate-specific membrane antigen), 크립토(Cripto), CDCP1, 엔도글린, 섬유아세포 활성화 단백질, Lewis-Y, CD19, CD21, CS1/SLAMF7, CD33, CD52, CD133, EpCAM, CEA, gpA33, 뮤신, TAG-72, 타이로신-단백질 인산화효소 막관통수용체(ROR1 또는 NTRKR1), 탄산탈수효소 IX, 엽산 구속 단백질, 강글리오시드 GD2, 강글리오시드 GD3, 강글리오시드 GM2, 강글리오시드 Lewis-Y2, VEGFR, Alpha Vbeta3, Alpha5beta1, ErbB1/EGFR, Erb3, c-MET, IGF1R, EphA3, TRAIL-R1, TRAIL-R2, RANK, FAP, 테나신, CD64, 메소텔린, BRCA1, MART-1/MelanA, gp1OO, 티로시나아제, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, 베타-카테닌, MUM-1, 카스파제-8, KIAA0205, HPVE6, SART-1, PRAME, 암태아성 항원, 전립선 특이 항원, 전립선 줄기 세포 항원, 휴먼 아스파르틸 베타-수산화효소(human aspartyl(asparaginyl) beta-hydroxylase), EphA2, HER3/ErbB-3, MUC1, MART-1/MelanA, gp1OO, 티로시나아제 관련 항원, HPV-E7, 엡스타인바 바이러스 항원, Bcr-Abl, 알파태아단백질 항원, 17-A1, 방광 종양 항원, CD38, CD15, CD23, CD53, CD88, CD129, CD183, CD191, CD193, CD244, CD294, CD305; C3AR, FceRIa, 갈렉틴-9, mrp-14, 예정사-리간드 1(programmed death-ligand 1(PD-L1)), Siglec-8, Siglec-10, CD49d, CD13, CD44, CD54, CD63, CD69, CD123, CD193, TLR4, FceRIa, IgE, CD107a, CD203c, CD14, CD15, CD33, CD64, CD68, CD80, CD86, CD105, CD115, F4/80, ILT-3, 갈렉틴-3, CD11a-c, GITRL, MHC 클래스 I 분자(선택적으로 폴리펩티드와 집합된(complexed)), MHC 클래스 II 분자(선택적으로 폴리펩티드와 집합된), CD284-TLR4, CD107-Mac3, CD195-CCR5, HLA-DR, CD16/32, CD282-TLR2, CD11c, CD123, 및 상기 전술한 것들의 면역원성 단편(immunogenic fragment).
어떤 구체예에서는, 본 발명의 단백질은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 75 내지 251로부터 유도된 시가 독소 작동체 영역을 포함한다. 또한 어떤 구체예에서는, 본 발명의 단백질은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 1 내지 241로부터 유도된 시가 독소 작동체 영역을 포함한다. 또한 어떤 구체예에서는, 본 발명의 단백질은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 1 내지 251로부터 유도된 시가 독소 작동체 영역을 포함한다. 또한 어떤 구체예에서는, 본 발명의 단백질은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 1 내지 261로부터 유도된 시가 독소 작동체 영역을 포함한다.
어떤 구체예에서는, 본 발명의 단백질이 카복시-단말 소포체 잔류/회수 신호 모티프를 포함한다. 또한 어떤 구체예에서는, 본 발명의 단백질이 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된 카복시-단말 소포체 잔류/회수 신호 모티프를 포함한다: KDEL, HDEF, HDEL, RDEF, RDEL, WDEL, YDEL, HEEF, HEEL, KEEL, REEL, KAEL, KCEL, KFEL, KGEL, KHEL, KLEL, KNEL, KQEL, KREL, KSEL, KVEL, KWEL, KYEL, KEDL, KIEL, DKEL, FDEL, KDEF, KKEL, HADL, HAEL, HIEL, HNEL, HTEL, KTEL, HVEL, NDEL, QDEL, REDL, RNEL, RTDL, RTEL, SDEL, TDEL, SKEL, STEL, 및 EDEL.
또한 어떤 구체예에서는, 본 발명의 단백질이 SEQ ID NO:4-19의 어느 하나의 아미노산 269-508만으로 필수적으로 구성되거나 이를 포함하는 결합 영역을 포함한다.
어떤 구체예에서는, 본 발명의 단백질이 SEQ ID NO:4-31의 어느 하나에 나타난 폴리펩티드만으로 필수적으로 구성되거나 이를 포함한다.
어떤 구체 예에서는, 본 발명의 단백질이 시가 독소 작동체 영역의 효소 활성을 변화시키는 시가 독소군의 멤버의 자연적으로 발생하는 A 서브유닛에 관하여 돌연변이를 포함하는 시가 독소 작동체 영역을 포함한다. 어떤 구체 예에서는, 상기 돌연변이가 시가 독소 영역의 세포독성을 감소시키거나 제거하는 최소한 하나의 아미노산 잔기 제거, 삽입 또는 치환으로부터 선택된다. 어떤 구체 예에서는, 상기 단백질은, 세포 내재화 증진 및/또는 세포내 경로화 지휘 등과 같은, 촉매활성을 감소시키거나 제거하지만 다른 시가 독소 작동체 기능을 보유하는 돌연변이를 포함한다. 어떤 구체 예에서는, 상기 돌연변이는 하기와 같은 최소한 하나의 아미노산 잔기 치환으로부터 선택된다: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ NO:3의A231E, R75A, Y77S, Y114S, E167D, R170A, R176K 및/또는 W203A.
본 발명은 본 발명의 단백질 및 최소한 하나의 약학적으로 수용가능한 첨가제 또는 운반체를 포함하는 약학적 조성물; 및 상기 설명한 본 발명의 방법에서 본 발명의 단백질 또는 그 단백질을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 본 발명의 특정 구체예는 본 발명의 단백질 및 최소한 하나의 약학적으로 수용가능한 첨가제 또는 운반체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 어떤 구체예 중에서는 본 발명의 단백질, 및 세포, 조직, 기관, 질병, 장애, 질환 및/또는 환자에 관한 진료에 유용한 정보와 같은 정보 수집을 위한 검출 촉진제를 포함하는 진단 조성물을 제공한다.
본 발명의 단백질 및 그 조성물 외에, 본 발명의 단백질을 부호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 뿐만 아니라 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 숙주세포 및 본 발명의 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터도 본 발명의 영역 내에 포함된다.
본 발명은 또한 (a)하나 이상의 폴리펩티드를 포함하고 최소한 세포의 표적 생체분자를 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린-유형 결합 영역, 및 (b) 시가 독소군의 최소한 하나의 개체의 A 서브유닛의 아미노산 서열로부터 유도된 폴리펩티드를 포함하는 시가 독소 작동체 영역을 포함하는 단백질에 개선된 세포독성을 부여하는 시스템을 부여하는데, 이 시스템은 단백질 내에서 상기 시가 독소 작동체 영역의 카복시-말단 부위에 상기 면역글로불린-유형 결합 영역을 배열하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 (a) 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하고 최소한 세포의 표적 생체분자를 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린-유형 결합 영역, 및 (b) 시가 독소군의 최소한 하나의 개체의 A서브유닛의 아미노산 서열로부터 유래된 폴리펩티드를 포함하는 시가 독소 작동체 영역을 포함하는 단백질에 개선된 세포독성을 부여하는 시스템을 부여하는데, 이 시스템은 상기 시가 독소 작동체 영역에 관련된 단백질의 카복시-말단 부위에 상기 면역글로불린-유형 결합 영역을 배열하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 (a) 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하고 최소한 세포의 표적 생체분자를 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린-유형 결합 영역, 및 (b) 시가 독소군의 최소한 하나의 개체의 A 서브유닛의 아미노산 서열로부터 유래된 폴리펩티드를 포함하는 시가 독소 작동체 영역을 포함하는 단백질에 개선된 세포독성을 부여하는 시스템을 부여하는데, 이 시스템은 단백질의 카복시-말단 부위에 상기 면역글로불린-유형 결합 영역을 배열하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 단백질 또는 그 단백질을 포함하는 약학적 조성물이 세포에 접촉하는 단계를 포함하는 세포 사멸 방법을 제공한다. 어떤 구체 예에서는, 세포를 접촉하는 단계가 시험관 내에서 일어난다. 다른 구체 예에서는, 세포를 접촉하는 단계가 체내에서 일어난다. 세포 사멸 방법의 다른 구체 예에서는, 단백질의 결합 영역의 세포의 표적 생체분자의 세포외 존재 및/또는 발현 정도에 대하여 변화하는 세포 혼합물을 접촉할 때 다른 세포(들) 및/또는 다른 세포(들) 타입에 대하여 우선적으로 세포(들) 및/또는 세포(들) 타입을 선별적으로 사멸할 수 있다.
본 발명은 또한 환자에게 필요한 치료 효과량의 단백질 또는 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 단계로 이루어져, 환자의 질병, 장애, 및/또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 방법을 이용하여 치료되는 질병, 장애 또는 질환이 암, 종양, 성장이상, 면역장애, 또는 세균감염으로부터 선택된다. 이들 방법의 다른 구체 예에서는, 치료되는 암이 뼈암, 유방암, 중앙/말초 신경계 암, 위장암, 생식 세포암, 선암, 두경부암, 혈액암, 신장-요로암, 간암, 폐/흉막암, 전립선암, 육종, 피부암, 및 자궁암으로부터 선택된다. 다른 구체 예에서, 치료되는 면역 장애는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질병과 관련된 면역장애이다: 아밀로이드증, 강직성 척추염, 천식, 크론병, 당뇨병, 이식편거부반응, 이식편대숙주병, 하시모토 갑상선염, 용혈성요독증후군, HIV-관련 질병, 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 결절성다발성동맥염, 다관절염, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 피부경화증, 패혈증, 쇼그렌 증후군, 궤양성 대장염, 및 혈관염.
본 발명의 암, 종양, 성장이상, 및/또는 면역장애의 치료 및 예방을 위한 조성물의 용도도 본 발명의 범위이다. 본 발명의 어떤 구체예는 암, 종양, 성장이상, 면역장애, 및/또는 세균감염의 치료 또는 예방을 위한 단백질 및/또는 그 약학적 조성물이다. 본 발명의 어떤 구체예는 암, 종양, 성장이상, 면역장애, 및/또는 세균감염의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 사용되는 단백질 및/또는 약학적 조성물의 용도이다.
본 발명의 단백질의 몇몇 구체예는 본 발명의 단백질의 세포외 표적 생체분자에 물리적으로 결합된 세포속으로 부가적인 외인성 물질을 전달하기 위하여 사용될 수 있다. 부수적으로, 본 발명은 세포를, 체외에서 또는 체내에서, 본 발명의 단백질, 약학적 조성물, 및/또는 진단 조성물로 접촉하는 단계로 이루어지고, 세포 내로 외인성 물질을 전달하는 방법을 제공한다. 나아가 본 발명은 환자의 세포 내로 외인성 물질을 전달하는 방법을 제공하는데 이 방법은 본 발명의 단백질을 환자에 투여하는 단계로 이루어지고, 이때 표적 세포는 단백질의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합한다.
질병, 장애 및/또는 질환의 진단, 예측 및/또는 특성화를 위한 본 발명의 조성물의 용도도 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 구체예 중에는 질병, 장애 및/또는 질환의 진단, 예측 및/또는 특성화에 유용한 정보 수집을 위하여 검출 촉진제를 포함하는 본 발명의 단백질 및/또는 본 발명의 조성물(예를 들어, 진단용 조성물)을 사용하는 방법도 포함한다. 본 발명의 구체예 중에는 본 발명의 단백질 및/또는 진단 조성물을 사용하여 세포를 탐색하는 방법도 포함하는데, 그 방법은 세포를 상기 단백질 및/또는 진단 조성물로 접촉하고, 상기 세포-표적화 분자 및/또는 진단 조성물의 존재를 탐색하는 단계로 이루어진다. 어떤 구체예에서는, 세포를 접촉하는 단계가 시험관 내에서 발생한다. 어떤 구체예에서는, 세포를 접촉하는 단계가 체내에서 발생한다. 어떤 구체예에서는, 세포를 탐색하는 단계가 시험관 내에서 발생한다. 어떤 구체예에서는 세포를 탐색하는 단계가 체내에서 발생한다. 다른 구체예에서는, 기관에 단백질을 투여한 후에 하나 이상의 영상 절차를 사용하여 기관 내에서 단백질의 위치를 탐색하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 설명된 검출 촉진제를 결합한 본 발명의 단백질이 본 발명의 약학적 조성물에 의해 강력하게 치료될 수 있는 질병을 특성화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물(예를 들어, 단백질), 조성물(약학적 조성물 및 진단 조성물), 및 본 발명의 방법들이 어떤 환자가 본 발명의 약학적 조성물에 반응하는 그룹에 속하는지를 결정하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 어떤 구체예 중에는 본 발명의 조성물, 및 선택적으로, 사용법, 부가적인 시약, 및/또는 약학적 전달 수단으로 이루어지는 키트(kit)를 포함한다.
본 발명의 이러한 특징들, 장점 및 태양들이 하기 설명, 첨부된 특허청구범위 및 도면에 의해 더 명료하게 이해될 것이다. 본 발명의 상기 설명한 요소들이, 다른 반대되는 설명이 없는 한, 다른 구체예를 실시하도록 각각 자유롭게 결합되거나 또는 제외될 수 있다.
제1도는 시가 독소 작동체 영역을 포함하는 단백질 또는 그 단백질의 폴리펩티드 성분의 각각 아미노-말단 및 카복시-말단을 의미하는 "N" 및 "C"를 갖는 본 발명의 단백질의 일반적 배열을 도시한다.
제2도는 역 배향 αCD38SCFV::SLT-1A와 비교하여 향상된 세포독성을 갖는 SLT-1A::αCD38SCFV를 도시한다. 세포의 생존능력 퍼센트를 세포독성 단백질 농도의 베이스 10에 대한 로그값으로 표시하였다.
제3도는 역 배향 단백질 αHER2SCFV::SLT-1A와 비교하여 단백질 SLT-1A::αHER2SCFV의 향상된 표적 세포-유형 특이 세포독성을 도시한다. 세포의 생존능력 퍼센트를 세포독성 단백질 농도의 베이스 10에 대한 로그값으로 표시하였다.
제4도는 αHER2SCFV::SLT-1A 및 SLT-1A::αHER2SCFV의 세포 이하 국소화의 현미경 영상을 도시한다. 이 영상은 한 시간의 투여 내에 두 개의 세포독성 단백질이 투입된 표적 세포를 도시한다.
예시적이지만 제한하지 않는 구체예들 및 첨부된 도면을 참고로 본 발명을 하기에 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명은 많은 다른 형태로 구현될 수 있고 하기 설명되는 구체예에 한정되는 것으로 해석해서는 안 된다. 하기 구체예는 본 발명이 속하는 당업자에게 본 발명의 범위를 철저하게 전달하도록 제공되는 것이다.
본 발명을 보다 쉽게 이해하도록 용어해설을 첨가하고 ,부수적인 설명도 또한 본 발명의 상세한 설명에서 부기된다.
명세서 및 특허청구범위에서 사용된 부정관사나 정관사는 별도의 설명이 없으면 단수 또는 복수를 포함한다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 "및/또는"은 A 및 B의 두 종을 언급할 때, A 및 B의 최소한 하나를 의미한다. A, B, 및 C와 같이 두 종 이상인 경우에, "및/또는"은 A, B 또는 C의 최소한 하나 또는 A, B, 또는 C의 어떤 조합의 최소한 하나를 의미한다(각각의 종은 단수 또는 복수의 가능성도 포함한다).
명세서 전반에 걸쳐서, "포함(comprise, comprises, 또는 comprising)"의 의미는 언급된 요소나 요소들의 그룹을 포함하는 의미로 해석되며, 어떤 다른 요소나 다른 요소들의 그룹을 배제하는 것이 아니다.
명세서 전반에 걸쳐서, "포함하는(including)"은 "포함하지만 한정되지 않는(including but not limited to)"의 의미로 사용된다. 이 둘은 서로 호환하여 사용되기도 한다.
"아미노산 잔기(amino acid residue)" 또는 "아미노산(amino acid)"는 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드 속으로 결합된 아미노산의 의미를 포함한다. " 폴리펩티드"는 아미노산 또는 아미노산 잔기의 어떤 고분자를 포함한다. "폴리펩티드 서열"은 폴리펩티드가 물리적으로 구성되는 아미노산 또는 아미노산 잔기의 서열을 의미한다. "단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 체인을 포함하는 하나의 거대분자이다. "펩티드"는 전체 15~20 아미노산 잔기보다 더 적은 수의 작은 크기의 폴리펩티드이다. "아미노산 서열"은 길이에 따라 정의되는 펩티드 또는 폴리펩티드를 물리적으로 포함하는 아미노산 또는 아미노산 잔기의 서열을 의미한다. 별다른 설명이 없는 한, 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 및 단백질 서열은 아미노 말단에서부터 카복시 말단까지 순서를 표시하도록 왼쪽에서 오른쪽으로 표기된다.
"아미노산", "아미노산 잔기", "아미노산 서열" 또는 "폴리펩티드 서열"은 자연적으로 발생하는 아미노산(L 및 D 이소스테리오머(isosteriomer)를 포함하는)을 포함하고, 별도로 제한되지 않는 한, 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 기능을 갖는 천연의 아미노산의 공지된 유사체를 포함하며, 그들의 예로는 셀레노시스테인, 피롤리신, N-포밀메티오닌, 감마-카르복시글루타메이트, 히드록시프롤린히푸신, 피로글루탐산, 및 셀레노메티오닌이 있다. 여기 언급된 아미노산은 하기 표와 같이 약칭한다.
[표 A]
Figure pct00001
아미노산 표기
폴리펩티드와 관련한 "보존적 치환(conservative substitution)"은 전체적인 폴리펩티드의 기능 및 구조를 실질적으로 변경하지 않는 폴리펩티드의 아미노산 조성물 내에서의 변화를 의미한다(Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties(W. H. Freeman and Company, New York(2nd ed., 1992) 참조).
"발현(expressed, expressing, expresses)"의 의미는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산이 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 것을 의미한다. 발현된 폴리펩티드 또는 단백질은 세포내 잔류할 수 있고, 세포 표면 막의 성분이 되거나 또는 세포의 공간 속으로 분리될 수 있다.
세포외 표적 생체분자의 상당량을 발현하는 세포들은 "표적 양성 세포(target positive cell)" 또는 "표적+ 세포(target+ cell)"이고, 이들은 명시된 세포외 표적 생체분자에 물리적으로 결합된 세포들이다.
"α"는 생체분자에 결합할 수 있는 면역글로불린-유형 결합 영역의 약칭이다. "α는 생체분자에 결합할 수 있는 능력에 따라 면역글로불린-유형 결합 영역의 기능적 특성을 나타내는데 사용된다.
"::"는 연속적인 폴리펩티드를 형성하기 위하여 함께 물리적으로 결합되기 전과 후의 폴리펩티드 영역을 의미한다.
세포독성 단백질의 세포독성 활성과 관련한 "선택적 세포독성(selective cytotoxicity)"은 표적화 세포군과 비표적화 방관자 세포군 사이의 세포독성의 상대적 수준을 의미하며, 이는 표적화된 세포 타입의 세포사멸의 우위성을 나타내기 위하여 비표적화 세포 타입에 대한 CD50에 대하여 표적화 세포 타입에 대한 CD50(반 최고치 세포독성 농도)의 비율로 표현될 수 있다.
본 발명의 목적과 관련하여, "작동체(effector)"는 세포독성, 생물학적 신호, 효소 촉매작용, 준세포 경로화, 및/또는 인자 모집을 초래하는 분자간 결합과 같은 생물학적 활성, 및/또는 알로스테리(allosteric) 효과를 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서, "유도된(derived from)"은 폴리펩티드 영역이 단백질 내에서 본래 발견된 아미노산 서열을 포함하는 것을 의미하고, 이는 전체 기능과 구조가 실질적으로 보존되도록 최초 서열로부터의 다른 변경, 부가, 삭제, 또는 절단을 포함한다.
본 발명에서, 하나의 시가 독소 작동체 기능은 시가 독소 A 서브유닛에서 유도된 폴레펩티드 영역에 의해 부여되는 생물학적 활성이다. 시가 독소 작동체 기능의 제한되지 않는 예로는 세포 내재화, 준세포 경로화, 촉매 활성, 및 세포독성이 있다. 예를 들어, 시가 독소 촉매 활성은 리보솜 비활성, 단백질 합성억제, N-글로코시다아제 활성, 폴리뉴클레오티드:아데노신 글루코시다아제 활성, RNA아제 활성 및 DNA아제 활성을 포함한다. RIP는 핵산, 폴리뉴클레오시드, 폴리뉴클레오티드, rRNA, ssDNA, dsDNA, mRNA(및 폴리A), 및 바이러스성 핵산을 탈퓨린(depurinate)할 수 있다(Barbieri L et al., Biochem J 286: 1-4(1992); Barbieri L et al., Nature 372: 624(1994); Ling J et al., FEBS Lett 345: 143-6(1994); Barbieri L et al., Biochem J 319: 507-13(1996); Roncuzzi L, Gasperi-Campani A, FEBS Lett 392: 16-20(1996); Stirpe F et al., FEBS Lett 382: 309-12(1996); Barbieri L et al., Nucleic Acids Res 25: 518-22(1997); Wang P, Turner N, Nucleic Acids Res 27: 1900-5(1999); Barbieri L et al., Biochim Biophys Acta 1480: 258-66(2000); Barbieri L et al., J Biochem 128: 883-9(2000); Bagga S et al., J Biol Chem 278: 4813-20(2003); Picard D et al., J Biol Chem 280: 20069-75(2005)). 몇몇의 RIP는 항바이러스성 활성 및 과산화물 디스무타제 활성을 보인다(Erice A et al., Antimicrob Agents Chemother 37: 835-8(1993); Au T et al., FEBS Lett 471: 169-72(2000); Parikh B, Turner N, Mini Rev Med Chem 4: 523-43(2004); Sharma N et al., Plant Physiol 134: 171-81(2004)). 시가 독소 촉매 활성은 체내에서 그리고 시험관 내에서 모두 관측되었다. 시가 독소 작동체 활성에 대한 분석은 단백질 합성 억제 활성, 탈퓨린화 활성, 세포성장 억제, 세포독성, 초나선 DNA 이완 활성, 및/또는 뉴클레아제 활성을 측정할 수 있다.
본 발명에서, 시가 독소 작동체 기능의 보유는, 야생형 시가 독소 작동체 영역 제어와 비교할 수 있는 재현가능성을 갖는 적절한 분석법에 의해 측정되는 것과 같이, 시가 독소 기능 활성의 수준을 의미한다. 리보솜 억제를 위하여, 시가 독소 작동체 기능은 10,000 피코몰(PM) 또는 그 이하의 IC50을 나타낸다. 표적 양성 세포 사멸 분석법에서 세포독성을 위하여, 시가 독소 작동체 기능은 1,000 나노몰(nM) 또는 그 이하의 CD50을 나타내는데, 이는 세포의 종류 및 적절한 세포외 표적 생체분자의 발현과 관련이 있다.
세포독성 분자로서의 면역독소 및 리간드-독소 융합의 효율 및 효능은 표적 세포 표면에서의 그들의 표적 항원의 밀도(예: Decket T et al., Blood 103: 2718-26(2004); Du X et al., Blood 111: 338-43(2008); Baskar S et al., mAbs 4: 349-61(2012) 참조), 에피토프 위치(Press O et al., J Immunol 141: 4410-7(1988); Godal A et al., In J Cancer 52: 631-5(1992); Yazdi P et al., Cancer Res 55: 3763-71(1995)), 표면 결합 세포독성 분자의 내재화 속도(예: Du X et al., Cancer Res 68: 6300-5(2008) 참조), 및 세포내 이동 경로(itinerary)(Tortorella L et al., PLoS One 7: e47320(2012))에 영향을 받는다.
주어진 세포외 표적 생체분자의 세포 표면 표시 및/또는 밀도는 본 발명의 특정 단백질이 가장 적절하게 사용될 수 있는 응용에 영향을 미칠 수 있다. 세포 사이에서 주어진 표적 생체분자의 세포 표면 표시 및/또는 밀도의 차이는 본 발명의 주어진 단백질의 내재화 및/또는 세포독성을 정량적으로 그리고 정성적으로 변화시킬 수 있다. 주어진 표적 생체분자의 세포 표면 표시 및/또는 밀도는 세포 사이클 또는 세포 미분화에서의 다른 지점에서 동일 세포 상에서 또는 표적 생체분자 양성 세포 중에서 상당히 변할 수 있다. 특정의 세포 또는 세포군에서 주어진 표적 생체분자의 전체 세포 표면 표시는 형광-활성 세포 분류(FACS) 유동 세포분석법과 같은, 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
서 론
본 발명은 시토졸까지의 자가-주도 세포내 경로화와 같은 강력한 시가 독소 작동체 기능 및 세포독성을 보유하는 융합 단백질과 같은, 세포 표적화를 위한 이종결합 영역에 연결된 시가-독소-서브유닛-A 유도된 영역을 포함하는 강력한 세포독성 단백질을 조작하는 문제들을 해결한다. 본 발명은 시가-독소-서브유닛-A-유래 독소 영역과 이종 결합 영역 사이에서 특별한 구조적 관계가 조작된 시가 독소 기재, 세포독성 단백질에 대해 세포 사멸 효능에 영향을 줄 수 있다는 관찰에 기초를 두고 있다. 이들 폴리펩티드의 세포내 경로화는 세포 사멸을 유발하기 위하여 시토졸 구역에 효율적으로 도달하고 리보솜을 불활성화하도록 효소 활성 시가-독소-서브유닛-A-유래 폴리펩티드를 허용하기에 충분해야 한다. 실시예에서 상세히 설명하겠지만, 시가-독소-서브유닛-A-유래 독소 영역을 이종 세포 표적화 결합 영역에 대하여 아미노-말단 근위에 배열시킴으로써 반대 배향에 배열된 동일한 성분보다 상당히 더 강력한 세포 사멸 결과를 초래하였다. 본 발명은 세포독성 단백질 내에서 시가 독소 작동체 영역의 카복시-말단 근위에 세포-표적화 결합 영역을 배열함으로써 달성할 수 있는 세포독성 단백질의 특이 조작 방법을 제공한다. 이 특이 배향에서 이종의 세포-표적화 결합 영역을 시가-독소-서브유닛-A-영역에 결합함으로써 시가 독소 세포독성의 더 강력한 세포-유형 특이 표적화 및 소포체 및/또는 시토졸까지의 바람직한 세포내 경로화를 갖는 단백질의 조작을 가능하게 한다.
종전에는, 시가 독소 A 서브유닛 융합 구조물이 세포독성이고 시토졸까지 효소 활성 독소 단편을 전달하도록 그들 자신의 세포내 경로화를 자가-주도할 수 있는 것으로 나타났다(Al-Jaufy, Infect Immun 62: 956-60(1994); Al-Jaufy, Infect Immun 63: 3073-8(1995); Su, Protein Expr Purif 66: 149-57(2009)). 다중 세포독성 단백질이 생성되어 그들의 아미노-말단에서 면역글로불린 유도된 표적화 영역에 연결된 시가 독소 유래 영역으로 테스트 될 때, 이들 조작된 단백질들은 예상되는 수준의 세포독성을 나타내지 않았다(하기 실시예 참조). 그러나 이들 저급-세포독성 단백질들은 세포 표면 결합 및 투입뿐만 아니라, 다른 형상에서 결합된 동일한 폴리펩티드 영역을 갖는 더 많은 세포독성 변형물과 비교할 때 시험관 내에서 유사한 효소 활성 및 유사한 결합 친화도를 나타냈다(하기 실시예 참조).
하기 실시예에서 설명되는 바와 같이, 시가-독소-서브유닛-A-기재, 세포독성 단백질의 세포독성은 면역글로불린-유형 결합 영역이 시가 독소 영역의 카복시-근위 영역에 결합되도록 배향을 변화시킴으로써 개선되었다. 그러나, 조작의 배향은 시가-독소-유래 영역의 촉매활성이나 면역글로불린-유형 결합 영역의 결합 역학을 변화시키지 못했다. 폴리펩티드 성분을 조작하는 배향에 대한 시가 독소-기재 단백질의 세포독성(및 세포내 경로화)의 민감도는 예측되지 않았고 설명되지도 않았다. 이러한 결과는 단백질의 표적 결합 특성, 세포 결합 특성, 또는 촉매 활성의 차이에 의해 설명될 수 없었다.
I. 본 발명의 단백질의 일반적 구조
본 발명은 여러 가지 다양한 단백질을 제공하는데, 각각의 단백질은 1)세포 표적화를 위한 면역글로불린-유형 결합 영역, 및 2)세포 내재화, 세포내 경로화, 및/또는 세포 사멸을 위한 시가 독소 작동체 영역을 포함한다. 시가-독소-서브유닛-A-유래 영역을 갖는 세포 표적화 면역 글로불린-유형 결합 영역의 연결은 강력한 시가 독소 세포독성의 세포유형 특이 표적화의 조작을 가능하게 한다. 본 발명의 단백질은 세포 표면상에 발현된 표적 생체분자와 같은 세포와 물리적 관계가 있는 최소한 하나의 세포외 표적 생체분자에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린-유형 결합 영역에 연결된 시가독소군 멤버의 하나 이상의 A 서브유닛으로부터 유도된 시가 독소 작동체 영역을 포함한다. 이 일반적인 구조는 모듈식으로서 다양한 면역글로불린-유형 결합 영역의 특정 수는 동일한 일반 구조의 변형물을 생성하기 위하여 시가 독소 서브유닛 A 유래 작동체에 연결될 수 있다.
A. 면역글로불린-유형 결합 영역
본 발명의 단백질 결합 영역은 세포외 표적 생체분자와 선택적으로 그리고 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 면역글로불린-유형 결합 영역을 포함한다. "면역글로불린-유형 결합 영역"은 항원 또는 결정기(epitope)와 같은 하나 이상의 표적 생체분자와 결합할 수 있는 폴리펩티드 영역을 의미한다. 면역글로불린-유형 결합 영역은 표적분자에 결합하는 성능에 의하여 기능적으로 정의된다. 면역글로불린-유형 결합 영역은 항체 또는 항체-유사 구조물로부터 통상 유도되지만, 다른 소스로부터의 대체 스캐폴드(scaffolds)도 이 용어의 범위에 고려된다.
면역글로불린(Ig) 단백질은 Ig 도메인으로 알려진 구조 영역을 갖는다. Ig 도메인은 길이가 약 70-110 아미노산 잔기의 범위이고 Ig-fold 특성을 갖는데, 전형적으로 7 내지 9의 역평행 베타 스트랜드가 샌드위치-유사 구조를 형성하는 두장의 베타 시트(sheet) 속으로 배열한다. Ig-fold는 샌드위치의 내부 표면상에서 소수성 아미노산 상호작용에 의해 안정화되고 스트랜드 내에서 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합을 높게 유지한다. Ig 도메인으로는 변형물(IgV 또는 V-set), 일정물(IgC 또는 C-set) 또는 중간체(IgI 또는 I-set)가 있다. 어떤 Ig 도메인은 상보결정영역(CDR)과 관련이 있고, 이는 그들의 결정기에 결합하는 항체의 특이에 중요하다. Ig-유사 도메인은 또한 비-면역글로불린 단백질에서도 발견되는 단백질의 Ig 슈퍼군(superfamily)의 숫자로 분류된다. HUGO 유전자 명명 위원회(HGNC)는 Ig-유사도메인 함유군의 멤버 리스트를 제공한다.
면역글로불린-유형 결합 영역은 항체 또는 항원-결합 단편의 폴리펩티드 서열인데, 이 아미노산 서열은, 예를 들어 분자 조작 또는 라이브러리 스크리닝에 의한 선별에 의하여, 천연 항체 또는 비-면역글로불린 단백질의 Ig-유사 도메인의 서열로부터 변화된다. 면역글로불린-유형 결합 영역의 생성에 있어서 재조합 DNA 기술의 관련 및 시험관 내에서의 라이브러리 스크리닝 때문에, 항체가 더 작은 사이즈, 세포 침투(entry), 또는 다른 치료적 개선과 같은 바람직한 특성을 얻도록 재설계될 수 있다. 가능한 변형이 무한하고, 단지 하나의 아미노산을 변화시키는 것을 비롯하여 변형가능한 영역의 완전한 재설계도 가능하다. 전형적으로, 변형가능한 영역의 변화가 항원-결합 특성을 개선하고, 변형가능한 영역의 안정성을 개선하며, 또는 면역성 응답을 위한 잠재성을 감소시키도록 행해질 수 있다.
또한 본 발명의 단백질 성분으로 고려되는 수많은 면역글로불린-유형 결합 영역들이 있다. 어떤 구체예에서는, 면역글로불린-유형 결합 영역이 세포외 표적 생체분자와 결합할 수 있는 항체 파라토프(paratope)와 같은 면역글로불린 결합 영역으로부터 유도된다. 다른 구체예에서는, 면역글로불린-유형 결합 영역이 어떤 면역글로불린 도메인으로부터 유도되지 않은 조작된 폴리펩티드를 포함하지만 세포외 표적 생체분자에 결합하는 높은 친화도를 제공함으로써 면역글로불린 결합 영역과 같은 기능을 갖는다. 이들 조작된 폴리펩티드는 여기서 설명되는 면역글로불린으로부터 상보 결정 영역을 포함하거나 그 영역만으로 구성되는 폴리펩티드 스캐폴드를 선택적으로 포함할 수 있다.
높은 친화도 결합 성능을 통하여 특이 세포타입에 폴리펩티드를 표적화하는데 유용한 수많은 면역글로불린-유형 결합 영역 및 비-면역글로불린 조작 폴리펩티드가 종래 기술에 존재한다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 단백질의 면역글로불린-유사 결합 영역이 하기로부터 이루어진 군으로부터 선택된다: 단일-도메인 항체 도메인(sdAb), 나노바디, 카멜리드로부터 유도된 중쇄 항체 도메인 (VHH 단편), 2가 나노바디, 연골어류로부터 유도된 중쇄 항체 도메인, 면역글로불린 신규 항원 수용체(IgNARs), VNAR단편, 단쇄 변형성(scFv)단편, 다량체화 scFv단편 (2중체, 3중체, 4중체), 2특이 탄뎀 scFv단편, 이황화 안정화 항체 변형성(Fv)단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 이황화 안정화 항원-결합(Fab)단편, 2가 F(ab´)2 단편, 중쇄 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, 단일쇄 Fv-CH3 미니체, 2특이 미니체, 2량체 CH2 도메인 단편(CH2D), Fe 항원 결합 도메인(Fcabs), 분리된 상보결정 영역3(CDR3)단편, 제한된 기본틀(framework) 영역 3, CDR3, 기본틀 영역 4 (FR3-CDR3-FR4) 폴리펩티드, 작은 조절 면역 약물(SMIP) 도메인, scFv-Fc 융합체, 다량체화 scFv 단편(2중체, 3중체, 4중체), 이황화 안정화 항체 변형성(Fv) 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 이황화 안정화 항원-결합(Fab)단편, 2가 나노바디, 2가 미니바디(미니체), 2가 F(ab´)2 단편(Fab 이량체), 2특이 탄뎀 VHH 단편, 2특이 탠덤 scFv 단편, 2특이 나노바디, 2특이 미니바디, 및 파라토프와 결합 기능을 보유하는 상기 물질의 유전자 조작된 대응물(Saerens D et al., Curr. Opin. Pharmacol 8: 600-8(2008); Dimitrov D, MAbs 1: 26-8(2009); Weiner L, Cell 148: 1081-4(2012); Ahmad Z et al., Clin Dev Immunol 2012: 980250(2012) 참조). 하기의 면역글로불린의 일정한 영역으로부터 유도된 폴리펩티드를 포함하는 다양한 결합 영역들이 있다: 조작된 이량체 Fc 도메인, 단량체 Fcs(mFes), scFv-Fcs, VHH-Fes, CH2 도메인, 단량체 CH3s 도메인(mCH3s), 인공적으로 재편성된 면역글로불린 도메인, 및/또는 리간드를 갖는 면역글로불린 도메인의 하이브리드 융합물(Hofer T et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105: 12451-6(2008); Xiao J et al., J Am Chem Soc 131: 13616-13618(2009); Xiao X et al., Biochem Biophys Res Commun 387: 387-92(2009); Wozniak-Knopp G et al., Protein Eng Des Sel 23 289-97(2010); Gong R et al., PLoS ONE 7: e42288(2012); Wozniak-Knopp G et al., PLoS ONE 7: e30083(2012); Ying T et al., J Biol Chem 287: 19399-408(2012); Ying T et al., J Biol Chem 288: 25154-64(2013); Chiang M et al., J Am Chem Soc 136: 3370-3(2014); Rader C, Trends Biotechnol 32: 186-97(2014); Ying T et al., Biochimica Biophys Ada 1844: 1977-82(2014)).
다른 구체예에 따르면, 면역글로불린-유형 결합 영역은 면역글로불린 도메인에 조작된 대체 스캐폴드를 포함한다. 조작된 대체 스캐폴드는 높은 친화도 및 표적 생체분자의 특이 결합과 같은 면역글로불린-유형 구조물에 유사한 기능적 특성을 나타내는 기술분야에서 공지되어 있고, 더 큰 안정성 또는 감소된 면역원성과 같은 면역글로불린 도메인에 대한 향상된 특성을 제공한다. 일반적으로, 면역글로불린에 대한 대체 스캐폴드는 20킬로달톤보다 작고, 단일 폴리펩티드 체인으로 이루어지고, 시스테인 잔기가 없으며, 상대적으로 높은 열역학적 안정성을 나타낸다.
본 발명의 단백질의 특정 구체예에서는, 결합 영역이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 대체 스캐폴드를 포함한다: 조작된 피브로넥션-유래 10th 피브로넥틴 타입Ⅲ(10Fn3) 도메인(모노체, AdNectinsTM, 또는 AdNexinsTM); 조작된 테낙신-유래 테낙신 타입Ⅲ 도메인(CentrynsTM): 조작된 안키린 반복 모티프(motif) 함유 폴리펩티드(DARPinsTM); 조작된 저밀도 지질단백질-수용체-유래 A 도메인(LDLR-A)(AvimersTM); 리포칼린(안티칼린); 조작된 단백질분해효소 억제제-유래 쿠니츠 도메인; 조작된 단백질-A-유래, Z 도메인(AffibodiesTM); 조작된 감마-β결정체-유래 스캐폴드 또는 조작된 유비퀴틴-유래 스캐폴드(Affilins); Sac7d-유래 폴리펩티드(Nanffitins® 또는 affitins); 조작된 Fyn-유래 SH2 도메인(Fynomers®); 소형단백질; C-유형 렉틴-유사 도메인 스캐폴드; 조작된 항체 모방체, 및 결합 성능을 보유하는 상기 물질의 유전자 조작 대응물(Worn A, Pluckthun A, J Mol Biol 305: 989-1010(2001); Xu L et al., Chem Biol 9: 933-42(2002); Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17: 455-62(2004); Binz H et al., Nat Biotechnol 23: 1257-68(2005); Hey T et al., Trends Biotechnol 23 :514-522(2005); Holliger P, Hudson P, Nat Biotechnol 23: 1126-36(2005); Gill D, Damle N, Curr Opin Biotech 17: 653-8(2006); Koide A, Koide S, Methods Mol Biol 352: 95-109(2007); Byla P et al., J Biol Chem 285: 12096(2010); Zoller F et al., Molecules 16: 2467-85(2011)).
예를 들어, 수많은 대체 스캐폴드가 세포외 수용체 HER2에 결합되는 것으로 확인되었다(예: Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17: 455-62(2004); Orlova A et al. Cancer Res 66: 4339-8(2006); Ahlgren S et al., Bioconjug Chem 19: 235-43(2008); Feldwisch J et al., J Mol Biol 398: 232-47(2010); U.S. patents 5,578,482; 5,856,110; 5,869,445; 5,985,553; 6,333,169; 6,987,088; 7,019,017; 7,282,365; 7,306,801 ; 7,435,797; 7,446,185; 7,449,480; 7,560,111; 7,674,460; 7,815,906; 7,879,325; 7,884,194; 7,993,650; 8,241,630; 8,349,585; 8,389,227; 8,501,909; 8,512,967; 8,652,474; 및 U.S. patent application 2011/0059090 참조).
상기 면역글로불린-유형 결합 영역의 어느 것도 그 결합 영역 성분이 여기 설명되는 세포외 표적 생체분자를 향하여 10-5 내지 10-12moles/ℓ의 해리 상수, 바람직하게는 200nM 미만의 해리상수를 갖는 한 본 발명의 성분으로 사용될 수 있다.
세포외 표적 생체분자
본 발명의 단백질의 결합영역은 세포외 표적 생체분자에 특이적으로 결합할 수 있는, 바람직하게는 암세포, 종양세포, 형질세포, 감염세포 또는 세포내 병원균을 번식하는 숙주세포와 같은 문제세포의 표면에 물리적으로 결합된 폴리펩티드 영역을 포함한다.
"표적 생체분자"는 생물학적 분자를 의미하는 것으로, 통상 단백질 또는 당화와 같은 후-번역 변형에 의하여 변형된 단백질이고, 이들은 단백질을 유기체 내에서 특이 세포 또는 위치에 표적화하기 위하여 결합 영역에 의해 결합 될 수 있다. 세포외 표적 생체분자는 비변형된 폴리펩티드, 생화학적 기능기를 부가시켜 변형시킨 폴리펩티드, 및 글리코리피드를 포함하여, 다양한 결정기를 포함한다(US patent 5,091,178; EP 2431743). 세포외 생체분자를 본 발명 단백질로 상호작용할 때 내재화하도록 미리 강요하게 내부에서 내재화가 발생하도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서, 표적 생체분자를 변형하는 것과 관련한 "세포외"의 의미는 세포외 환경에 노출된 그 구조의 최소한 일부를 갖는 생체분자를 의미한다. 세포외 표적 생체분자는 세포 막 성분, 막횡단 나선형 단백질, 세포 막-결합 생체분자, 세포-표면-결합 생체분자, 및 분비된 생체분자를 포함한다.
본 발명에 관해서, 표적 생체분자를 설명할 때 쓰이는 "물리적인 결합"은, 표적 생체분자 및 세포 사이의 복수의 비공유 상호작용과 같은, 표적 생체분자와, 또는 그 일부를, 세포의 외부에 연결하는, 공유 및/또는 비공유 분자간 상호작용 양쪽 다 뜻하며, 각각의 단일 상호작용의 에너지는 대략 1-5 킬로칼로리이다(예: 정전결합, 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 소수성 힘(hydrophobic forces), 등). 모든 필수적인 막 단백질(membrane protein)은 부수적인 막 단백질과 함께 세포막에 물리적으로 결합돼 있다. 예를 들어, 세포외 표적 생체분자는 막횡단 영역(transmembrane spanning region), 지질 앵커(lipid anchor), 당지질 앵커, 및/또는 상기 전술된 것들에 포함된 요소와 비공유적으로 관련(예: 비특정(non-specific) 소수성 상호작용 및/또는 지질 결합 상호작용을 통해)되는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 단백질의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자는 암세포, 면역세포, 및 바이러스, 박테리아, 곰팡이류, 프리온, 또는 원충(protozoans)과 같은 세포내병원체에 감염된 세포에 비례 이상으로(over-proportionately) 또는 배타적으로 존재하는 생물 표지자(biomarkers)를 포함할 수 있다.
본 발명의 단백질의 결합 영역은 표적 생체분자의 세포-유형 특이 발현 및/또는 특이 세포 유형에 있어 표적 생체분자의 물리적 국소화와 같은 여러 가지 기준에 따라 설계 또는 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 어떤 단백질은 오로지 단 하나의 세포-유형에 의해 발현하는 세포-표면 표적을 세포 표면에 결합시킬 수 있는 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 단백질의 일반적인 구조는 모듈러식으로, 하나의 시가 독소 작동체 영역에 다양한 면역글로불린-유형 결합 영역을 사용해 다양한 세포외 표적 생체분자를 표적할 수 있게 제공하며, 이는 세포독성, 세포증식억제, 진단 제제, 및/또는 다양한 세포종에 외인성 물질 전달을 표적할 수 있게 한다.
B. 시가 독소군의 개체의 A 서브유닛으로부터 유도된 시가 독소 작동체 영역
본 발명의 목적을 위하여, "시가 독소 작동체 영역"은 최소 하나의 시가 독소 기능을 보일 수 있는 시가 독소군의 개체의 시가 독소 A 서브유닛으로부터 유도된 폴리펩티드 영역을 말한다. 시가 독소 기능은 세포 침투, 지질막 변형, 준세포 경로화 지휘, 분해 방지(avoiding degradation), 촉매 반응으로 리보솜 억제(catalytically inactivating ribosomes), 세포독성 유발, 및 세포 증식 억제 효과 유발을 포함한다.
시가 독소군의 개체란 구조적으로 그리고 기능적으로 관련된, 특히 이질균 및 대장균에서 분리된 독소와 같은, 자연적으로 발생하는 단백질 독소군의 개체를 뜻한다(Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16(2010)). 예를 들어, 시가 독소군은 이질균 혈청형 1, 장출혈성 대장균 혈청형으로부터 분리된 시가-유사 독소 1 이형(SLT1 또는 Stx1 또는 SLT-1 또는 Slt-I), 및 장출혈성 대장균 혈청형으로부터 분리된 시가-유사 독소 2 이형(SLT2 또는 Stx2 또는 SLT-2)으로부터 분리된 참(true) 시가 독소 (Stx)를 포함한다. SLT1는 Stx와 잔류물 하나 차이뿐이며, 둘 다 베로사이토톡신(Verocytotoxins) 또는 베로 독소(VTs)로 불렸었다(O'Brien, Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94(1992)). SLT1 및 SLT2 이형은 아미노산 서열이 서로 53-60%정도밖에 유사하지 않지만, 시가 독소군의 개체들에 흔한 효소 활동 및 세포독성 메커니즘을 가졌다(Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16(2010)). 정의된 아형 Stx 1a, Stx 1c, Stx 1d, 및 Stx 2a-g와 같은 39개 이상의 시가 독소들이 묘사되었다(Scheutz F et al., J Clin Microbiol 50: 2951-63(2012) 참조). 시가 독소군의 개체들은 시가 독소 부호화 유전자가 수평적 유전자전달로 세균종간에 확산 될 수 있기 때문에 특정 세균종에 자연적으로 한정되어 있지 않다(Strauch E et al., Infect Immun 69: 7588-95(2001); Zhaxybayeva O, Doolittle W, Curr Biol 21: R242-6(2011)). 이종간의 전달의 예로, 시가 독소는 환자에게서 추출된 아시네토박테르 용혈(A. haemolyticus) 균주에서 발견되었다(Grotiuz G et al., J Clin Microbiol 44: 3838-41(2006)). 시가 독소를 부호화하는 폴리뉴클레오티드가 새로운 아종 또는 종에 들어가면, 시가 독소 아미노산 서열은 시가 독소군의 개체의 공통된 세포독성의 메커니즘을 유지하는 동시에 유전변이 및/또는 선택압에 의하여 경미한 서열 변형을 할 수 있는 것으로 추정된다(Scheutz, J Clin Microbiol 50: 2951-63(2012) 참조).
본 발명의 시가 독소 작동체 영역은 근원(native)의 시가 독소 B 서브유닛의 어느 형태이든 그로부터 분리된 시가 독소 A 서브유닛에서 유도된 폴리펩티드만을 포함하거나 이를 포함하여 구성된다. 추가로, 본 발명의 단백질은 근원의 시가 독소 B 서브유닛의 기능적인 결합 도메인만을 포함하거나 이를 포함하여 구성된 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 더 정확하게는, 시가 독소 A 서브유닛으로부터 유도된 영역은 세포 표적화를 유발시키기 위해 이종(異種, heterologous) 면역글로불린-유형 결합 영역과 기능적으로 관련되어있다.
몇몇 구체예에서는, 본 발명의 시가 독소 작동체 영역은 시가 독소 A 서브유닛 전장(全長, full-length)(예: SLT-1A(SEQ ID NO:l), StxA(SEQ ID NO:2), 또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3))만을 포함하거나 또는 이들을 포함하여 구성될 수 있으며, 덧붙여 자연적으로 발생하는 시가 독소 A 서브유닛은 성숙(mature) 시가 독소 A 서브유닛을 생산하기 위해 제거되고 기술자라면 식별할 수 있는 아미노 말단에 약 22개의 아미노산의 신호순서(signal sequence)를 가진 전구체(precursor forms)를 포함할 수도 있다. 다른 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 시가 독소 작동체 영역은 시가 독소 A 서브유닛 전장보다 짧은, 절단된 시가 독소 A 서브유닛만을 포함하거나 이를 포함하여 구성된다.
시가-유사 독소 1 A 서브유닛 절단은 촉매적으로 활동적이고, 시험관 내에서 리보솜을 효소적으로 비활성화시킬 수 있으며, 세포 내에서 발현했을 때 세포독성이다(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18(2005)). 완전한 효소 활성을 나타내는 가장 작은 시가 독소 A 서브유닛 단편은 Slt1A의 잔기 1-239로 이루어진 폴리펩티드이다(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). 비록 상당한 촉매 활성을 유지한 것으로 보고된 가장 작은 시가 독소 A 서브유닛의 단편은 StxA의 75-247 잔기(Al-Jaufy, Infect Immun 62: 956-60(1994))이지만, 진핵세포 내에서 드 누보로 발현된 StxA 절단은 시토졸까지 도달하고 리보솜에 촉매적 비활성화를 가하는데에 잔기를 단 240만큼을 필요로한다(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18(2005)).
시가 독소 작동체 영역은 보통 A 서브유닛의 전장보다 짧을 수 있다. 시가 독소 작동체 영역은 아미노산 위치 77 내지 239(SLT-1A(SEQ ID NO:l) 또는 StxA(SEQ ID NO:2)), 또는 시가 독소 군의 다른 동등한 A 서브유닛(예: SEQ ID NO:3의 77 내지 238)의 폴리펩티드 영역을 유지하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 몇몇 구체예에서는, SLT-1A로부터 유도된 시가 독소 작동체 영역은 아미노산 SEQ ID NO:1의 75 내지 251, SEQ ID NO:1의 1 내지 241, SEQ ID NO:1의 1 내지 251, 또는 SEQ ID NO:1의 1 내지 261만을 포함하거나 이들을 포함하여 구성된다. 다른 몇몇 구체예에서는, StxA로부터 유도된 시가 독소 작동체 영역은 아미노산 SEQ ID NO:2의 75 내지 251, SEQ ID NO:2의 1 내지 241, SEQ ID NO:2의 1 내지 251, 또는 SEQ ID NO:2의 1 내지 261만을 포함하거나 이들을 포함하여 구성된다. 다른 몇몇 구체예에서는, SLT-2로부터 유도된 시가 독소 작동체 영역은 아미노산 SEQ ID NO:3의 75 내지 251, SEQ ID NO:3의 1 내지 241, SEQ ID NO:3의 1 내지 251, 또는 SEQ ID NO:3의 1 내지 261만을 포함하거나 이들을 포함하여 구성된다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 여러 이형(variants)을 제공하며, 상기 시가 독소 작동체 영역은 자연적으로 발생하는 시가 독소 A 서브유닛과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 그 이상까지의 아미노산 잔기 차이(하지만 이 이상의 최소 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열의 독자성(sequence identity)을 유지한 것은 없이)가 난다. 즉, 시가 독소 군의 개체로부터 유도된 폴리펩티드는 자연적으로 발생하는 시가 독소 A 서브유닛의 적어도 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이상의 아미노산 서열의 독자성을 유지한다면, 추가, 제거, 절단, 또는 이 외의 원래의 서열의 다른 변경을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 몇몇 구체예에서는, 시가 독소 작동체 영역은 SLT-1A(SEQ ID N0:1), Stx(SEQ ID N0:2), 및/또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3)와 같은 자연적으로 발생하는 시가 독소 A 서브유닛의 전체 서열의 독자성의 최소 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.7%을 가진 아미노산만을 포함하거나 이들을 포함하여 구성된다.
선택적으로, 전체 길이의 또는 절단된 시가 독소 A 서브유닛 어느 하나는 하나 또는 그 이상의 돌연변이(예: 치환, 제거, 삽입 또는 도치)를 포함할 수 있다. 본 발명의 몇몇 구체예에서는, 시가 독소 작동체 영역이 흔히 알려진 방법인 숙주 세포 변형, 핵산전달감염, 감염 또는 유도, 또는 시가 독소 작동체 영역과 연결된 세포 표적 면역글로불린-유형 결합 영역을 매개로한 내재화로 세포에 침투한 후 세포독성을 유지하기 위하여 자연적으로 발생하는 시가 독소 A 서브유닛의 충분한 서열 독자성을 가지는 것이 바람직하다. 시가 독소 A 서브유닛의 효소 활동 및/또는 세포독성에 가장 중요한 잔기의 잔기 위치는(residue-positions) 여러 가지 중에서도 아스파라긴-75, 타이로신-77, 글루탐산염-167, 아르지닌(arginine)-170, 및 아르지닌-176인 것으로 발견되었다(Di, Toxicon 57: 535-39(2011) 참조). 본 발명의 어떤 구체예에서든, 시가 독소 작동체 영역은 세포독성 활동에 일반적으로 필요한 StxA, SLT-1A의 위치 77, 167, 170, 및 176, 또는 다른 시가 독소 군의 동등한 보존위치(conserved position) 같은 위치에 있는 하나 또는 그 이상의 보존된 아미노산을 유지하는 것이 바람직하지만 필수는 아니다. 본 발명의 세포독성의 단백질의 세포독성과 같은 세포 사멸 능력은 당업계에 알려진 하나 이상의 분석으로 측정할 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 하나 또는 여러 개의 아미노산 잔기는 시가 독소 작동체 영역의 효소 활동을 높이기 위하여 돌연변이, 삽입, 또는 제거될 수 있다. 예를 들어, Stx1A의 잔기 위치 알라닌-231을 글루탐산염으로 변이시키자 시험관내의 효소 활동이 높아졌다(Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9(1998) 참조).
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 시가 독소 작동체 영역의 촉매 및/또는 세포독성 활동은 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기 돌연변이 또는 제거로 감소 또는 제거될 수 있다. 시가 독소군 개체의 A 서브유닛의 촉매 및/또는 세포독성 활동은 돌연변이 또는 절단으로 감소 될 수 있다. 티로신-77, 글루탐산염-167, 아르기닌-170, 티로신- 114, 및 트립토판-203으로 표지된 위치는 Stx, Stx1, 및 Stx2의 촉매 활동에 중요한 것으로 보여졌었다(Hovde C et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72(1988); Deresiewicz R et al., Biochemistry 31: 3272-80(1992); Deresiewicz R et al., Mol Gen Genet 241: 467-73(1993); Ohmura M et al., Microb Pathog 15: 169-76(1993); Cao C et al., Microbiol Immunol 38: 441-7(1994); Suhan, Infect Immun 66: 5252-9(1998)). 무세포 리보솜 비활성 분석에서 글루탐산염-167 및 아르기닌-170 둘 다 돌연변이 시키자 Slt-I A1의 효소적 활동이 제거되었다(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18(2005)). 소포체 내에서 Slt-I A1의 드 노보(de novo) 발현을 사용한 다른 접근에서, 글루탐산염-167 및 아르기닌-170 둘 다 돌연변이 시키자 그 발현 레벨의 Slt-I A1 단편 세포독성이 제거되었다(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18(2005)). 절단 분석은 잔기 75-268의 StxA 단편이 생체 외에서도 높은 효소 활동을 유지한다는 것을 보여주었다(Haddad, J Bacteriol 175: 4970-8(1993)). 잔기 1-239를 포함하는 Slt-I A1의 절단 단편은 시험관 내에서 현저한 효소 활동과 시토졸 내의 드 노보 발현에 의한 세포독성을 보여주었다(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18(2005)). 소포체 내에서 잔기 1-239으로 절단된 Slt-I A1 단편의 발현은 시토졸까지 복귀해서 이동(retrotranslocate)할 수 없었기 때문에 세포독성이 아니었다(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18(2005)).
이 명세서에 쓰인 "주요" 시가 독소 작동체 기능 유지란, 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드 대조군과 비교 가능한 시가 독소 기능 활동성 레벨을 말하며 재현 가능한 적절한 정량 분석으로 측정한다. 시험관내 리보솜 억제에서는, 주요 시가 독소 작동체 기능은 박테리아, 고세균(archaea), 또는 진핵 생물(조류(藻類), 곰팡이류, 식물, 또는 동물)과 같은 리보솜의 자원에 따라 300pM 혹은 그 이하의 IC50을 보인다. 이는 촉매 반응으로 비활성화한 SLT-1A 1-251 이중변이(double mutant)(Y77S/E167D)의 약 100,000 pM IC50에 비해 확연한 차이가 나는 억제이다. 실험실에서의 세포 배양의 세포 표적 사멸의 세포독성 분석에서는, 세포주(cell line)와 그의 세포외 표적 생체분자 발현에 따라, 주요 시가 독소 작동체 기능은 100, 50, 또는 30 nM 혹은 그 이하의 CD50을 보였다. 이는 세포 표적 결합 영역이 없는 SLT-1A만의, 세포주에 따라, 100-10,000 nM CD50에 비해 확연한 차이가 나는 표적 세포주에 보이는 세포독성이다.
어떠한 예에서는, 정확한 곡선 적합에 필요한 측정점 수집에 실패할 경우 IC50 또는 CD50의 정확한 값은 얻을 수 없을 수도 있다. 주요 시가 독소 기능 활동성을 측정할 때에는 부정확한 IC50 및/또는 CD50 값은 배제해야한다. 하기에 명시된 실시예와 같이 시가 독소 작동체 기능 분석의 데이터 분석에서 곡선에 정확히 맞추기에 부족한 데이터는 실제 시가 독소 작동체 기능으로 봐서는 안 된다. 예를 들어, 이론적으로는 실험 샘플에서 50% 이상의 리보솜 억제 또는 세포 사멸이 일어나지 않으면 각각 IC50과 CD50을 알 수가 없다.
시가 독소 작동체 기능에서 활동을 측정하는데에 실패한다면 세포 침투, 준세포 경로화, 그리고/또는 효소 활동의 부재보다는 잘못된 발현, 폴리펩티드 폴딩(folding), 그리고/또는 폴리펩티드 안정성 때문일 수 있다. 시가 독소 작동체 기능 분석은 필요한 양의 시가 독소 작동체 기능 활성도를 측정하기 위해 많은 양의 본 발명의 폴리펩티드를 필요로 하지 않을 수 있다. 작동체 기능이 낮거나 아예 없는 것의 근본원인이 실증적으로 단백질 발현 또는 안정성에 의한 것으로 확인된다면, 당업계의 숙련자라면 그러한 요소들을 단백질 화학과 분자공학 기술로 보완하여 시가 독소 기능 작동체 활동을 회복시키고 측정하는 것도 가능하다. 예를 들어: 부적절한 세포 기반 발현은 다른 발현 조절 서열을 사용하여 보완; 부적절한 폴리펩티드 폴딩 및/또는 안정성은 말단 서열(terminal sequence), 또는 작동체 외의 영역의 보상변이를 안정시켜 단백질의 입체적인 구성구조를 안정시키는 것으로 해결, 등. 시가 독소 기능들 각각의 새로운 분석들이 생긴다면, 시가 독소 작동체 영역 또는 폴리펩티드는 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 특정-폴드 활동에 대한 것과 같은 어느 레벨의 시가 독소 작동체 기능이라도 분석될 수 있을 것이다. 중요 활동 차이의 예는: 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 것에 비해 1000배 또는 100배 또는 그 이하의 활동을 가진 시가 독소 작동체 영역; 또는 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 기능적인 녹다운(knock-down) 또는 녹아웃(knockout)에 비해 3배 내지 30배 또는 그 이상의 활동을 가진 시가 독소 작동체 폴리펩티드.
준세포 경로화 같은 특정 시가 독소 작동체 기능은 간단하게 측정할 수 없다. 현재로서는 시가 독소 작동체 폴리펩티드가 세포독성을 가지는데에 실패하는 요인이 부적절한 준세포 경로화 때문인지를 밝힐 수 있는 통상적인 정량분석이 없지만, 그를 위한 테스트가 생긴다면, 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 적절한 야생형 시가 독소 작동체 영역과 비교해 상당한 수준의 준세포 경로화를 위해 분석될 수 있을 것이다.
특히 주의할 것은, 시가 독소 작동체 폴리펩티드의 세포독성이 야생형과 비례하여 감소되어도, 실제로는, 약화된 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 사용하는 적용방법은 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드를 사용하는 것과 동일하게 또는 더 효과적일 수 있는데, 이는 제일 강한 효능의 이형들이 감소 된 효능의 이형에서는 최소화된 원치않는 효과를 보일 수 있기 때문이다. 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 시토졸에 도달하는 단 하나의 분자만으로, 또는 흡수되고 있는 40개의 분자로 사멸할 정도로 굉장히 강력하다. 준세포 경로화 또는 세포독성과 같은 시가 독소 작동체 기능이 크게 감소한 시가 독소 작동체 폴리펩티드는 야생형 시가 독소 작동체 폴리펩티드에 비했을 때, 표적 세포 사멸 및/또는 특정 세포 탐지에 실제로 응용하였을 때도 충분히 강력할 수 있다.
본 발명의 목적을 위하여, 시가 독소 작동체 영역 및 면역글로불린-유형 결합 영역의 특정순서 또는 배향(orientation)은 면역글로불린-유형 결합 영역이 시가 독소 작동체 영역의 아미노-말단에 비해 시가 독소 작동체 영역의 카복시-말단에 더 근위에 있는 단백질에 위치하도록 고정되어있다(도1 참조). 본 발명의 단백질의 상기 구체예에서는, 결합 영역, 시가 독소 작동체 영역(세포독성이거나 그리고/또는 촉매 활성 및/또는 세포독성을 감소 또는 제거하는 하나 또는 여러 개의 돌연변이를 가질 수 있는)은 서로에게 직접적으로 연결되었거나 또는 당업계에 널리 알려진 또는 이곳에 명시된 하나 또는 여러 개의 링커(linkers)와 같은 두 영역 사이에 오는 하나 또는 여러 개의 폴리펩티드 서열을 통해서 서로에게 적절하게 연결되었을 수 있다.
C. 본 발명의 폴피펩티드 구성성분 및/또는 그의 서브컴포넌트(subcomponents)를 연결하는 연쇄(linkages)
결합 영역 및 시가 독소 작동체 영역(세포독성이거나 그리고/또는 촉매 활성 및/또는 세포독성을 변형, 감소, 또는 제거하는 하나 또는 여러 개의 돌연변이를 가질 수 있는)과 같은 본 발명의 각각의 폴리펩티드 및/또는 단백질 구성성분은 당업계에 널리 알려진 그리고/또는 여기에 명시된 하나 또는 여러 개의 링커를 통해 서로에게 연결될 수 있다. CDR 및/또는 ABR 영역과 같은 결합 영역의 각각의 폴리펩티드 서브컴포넌트는 당업계에 널리 알려진 그리고/또는 여기에 명시된 하나 또는 여러 개의 링커를 통해 서로에게 적절하게 연쇄될 수 있다(Weisser N, Hall J, Biotechnol Adv 27: 502-20(2009); Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69(2013) 참조). 다연쇄 결합영역과 같은 본 발명의 단백질 구성성분은 당업계에 널리 알려진 그리고/또는 여기에 명시된 하나 또는 여러 개의 링커를 통해 서로에게 또는 본 발명의 다른 폴리펩티드 구성성분에 연결될 수 있다. KDEL군의 소포체 잔류/회복 시그널 모티프와 같은 본 발명의 펩티드 구성성분은 당업계에 널리 알려진 하나 또는 여러 개의 단백질성 링커(proteinaceous linker)와 같은 링커를 통해 본 발명의 다른 구성성분에 연결될 수 있다.
적합한 링커는 보통 각각의 본 발명의 폴리펩티드 구성성분이 링커나 다른 요소 없이 개별적으로 생산된 폴리펩티드 구성성분과 아주 유사한 3차원 구조와 폴드(fold)시키도록 하는 것이다. 적합한 링커는 단일 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 및 측쇄나 고리형의 여러 비-단백질성 탄소사슬(non-proteinaceous carbon chains)와 같은 상기 전술한 것들이 없는 링커를 포함한다(Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69(2013) 참조).
접합한 링커는 단백질성일 수 있으며 하나 또는 여러 개의 아미노산, 펩티드, 및/또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 단백질성 링커는 재조합 융합 단백질(recombinant fusion proteins) 및 화학적으로 연결된 결합체 모두에 적합하다. 단백질성 링커는 보통 약 2 내지 50개의 아미노산 잔기를 가지고 있다(예: 약 5 내지 30개 또는 약 6 내지 25개의 아미노산 잔기). 선택된 링커의 길이는 선택한 링커에서 얻고자하는 성질 또는 성질들과 같은 다양한 요인에 의해 결정된다(Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69(2013) 참조).
적합한 링커는 화학적 링커와 같이 비단백질성일 수 있다(Dosio F et al., Toxins 3: 848-83(2011); Feld J et al., Oncotarget 4: 397- 412(2013) 참조). 당업계에 알려진 여러 비단백질성 링커는 면역글로불린-유도된 폴리펩티드와 이종폴리펩티드(heterologous polypeptides)를 연결하는데에 흔히 사용되는 링커와 같이, 결합 영역을 시가 독소 작동체 영역에 결합시키는데에 사용할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 영역은 카복시, 아민, 설프하이드릴기(sulfhydryl), 카르복실산, 카르보닐기, 히드록실기, 및/또는 고리형 군(cyclic ring group)과 같은 해당 영역의 아미노산 잔기 및 탄수화물 부분의 기능성 곁사슬을 이용하여 연결할 수 있다. 예를 들어, 이황결합 및 티오에테르결합 모두 두 개 혹은 그 이상의 폴리펩티드를 연결하는데에 사용할 수 있다(Fitzgerald D et al., Bioconjugate Chem 1: 264-8(1990); Pasqualucci L et al., Haematologica 80: 546-56(1995) 참조). 덧붙여, 비천연 아미노산 잔기는 케톤계(ketone group)와 같은 다른 기능성 곁사슬과 함께 사용할 수 있다(Sun S et al., Chembiochem Jul 18(2014); Tian F et al., Proc Natl Acad Sci USA 111: 1766-71(2014) 참조). 비단백질성 화확적 링커의 예는 N-석신이미딜(4-아이오댁틸)-아미노벤조에이트(N-succinimidyl(4-iodoacetyl)-aminobenzoate), S-(N-석신이미딜)티오아세테이트(S-(N-succinimidyl) thioacetate)(SATA), N-석신이미딜-옥시카보닐-α-메틸-α-(2-파이리딜디티오)톨루엔(N-succinimidyl-oxycarbonyl-α-methyl-α-(2-pyridyldithio)toluene)(SMPT), N-석신이미딜4-(2-파이리딜디티오)-펜타노에이트(N-succinimidyl4-(2-pyridyldithio)-pentanoate)(SPP), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산 카르복시산염(succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane carboxylate)(SMCC 또는 MCC), 설포석신이미딜(4-아이오댁틸)-아미노벤조이트(sulfosuccinimidyl(4-iodoacetyl)-aminobenzoate), 4-석신이미딜-옥시카보닐-α-(2-파이리딜디티오) 톨루엔(4-succinimidyl-oxycarbonyl-α-(2-pyridyldithio) toluene), 설포석신이미딜-6-(α-메틸-α-(파이리딜디티올)-톨루미도) 헥사노에이트(sulfosuccinimidyl-6-(α-methyl-α-(pyridyldithiol)-toluamido) hexanoate), N-석신이미딜-3-(-2-파이리딜디티오)-프로프리오네이트(N-succinimidyl-3-(-2-pyridyldithio)-proprionate)(SPDP), 석신이미딜 6(3(-(-2-파이리딜디티오)-프로프리오나미도) 헥사노에트(succinimidyl 6(3(-(-2-pyridyldithio)-proprionamido) hexanoate), 설포석신이미딜 6(3(-(-2-파이리딜디티오)-프로피오나미도) 헥사노에이트(sulfosuccinimidyl 6(3(-(-2-pyridyldithio)-propionamido) hexanoate), 말레이미도카프로일(maleimidocaproyl)(MC), 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카보닐(maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyloxycarbonyl)(MC-vc-PAB), 3-말레이미도벤조익산 N-하이드록시석시미드 에스테르(3-maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester)(MBS), 알파-알킬 유도체(alpha-alkyl derivatives), 설포NHS-ATMBA(설포석신이미딜 N-[3-(아세틸티오)-3-메틸부티릴-베타-알라닌(sulfoNHS-ATMBA(sulfosuccinimidyl N-[3-(acetylthio)-3-methylbutyryl-beta-alanine])), 설포다이콜로르페놀(sulfodicholorphenol), 2-이미노티올레인(2-iminothiolane), 3-(2-파이리딜디티오)-프로피오닐 하이드라지드(3-(2-pyridyldithio)-propionyl hydrazide), 엘만 시약, 다이클로로트리아지닉산(dichlorotriazinic acid), 및 S-(2-티오피리딜)-L-시스테인(S-(2-thiopyridyl)-L-cysteine)을 포함하지만 이에 제한되어있지 않다(Thorpe P et al., Eur J Biochem 147: 197-206(1985); Thorpe P et al., Cancer Res 47: 5924-31(1987); Thorpe P et al., Cancer Res 48: 6396-403(1988); Grossbard M et al., Blood 79: 576-85(1992); Lui C et al., Proc Natl Acad Sci USA 93: 8618-23(1996); Doronina S et al., Nat Biotechnol 21: 778-84(2003); Feld J et al., Oncotarget 4: 397-412(2013) 참조).
적합한 링커는, 단백질성이든 비단백질성이든, 단백분해효소 민감성(sensitive), 환경 산화환원전위(environmental redox potential) 민감성, pH 민감성, 산으로 절개 가능(acid cleavable), 빛으로 절개 가능(photocleavable), 및/또는 열 민감성 링커를 포함할 수 있다(Dosio F et al., Toxins 3: 848-83(2011); Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69(2013); Feld J et al., Oncotarget 4: 397-412(2013) 참조).
단백질성 링커는 본 발명의 재조합 융합 단백질과 혼합하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 구성성분 또는 그에 따른 서브컴포넌트는 하나 이상의 아미노산, 펩티드, 및 또는 폴리펩티드를 포함한 하나 또는 그 이상의 링커로 연결될 수 있다. 본 발명의 재조합 융합 단백질에서는, 링커는 일반적으로 약 2 내지 50개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 5 내지 30개의 아미노산 잔기로 이루어져 있다(Argos P, J Mol Biol 211: 943-58(1990); Williamson M, Biochem J 297: 240-60(1994); George R, Heringa J, Protein Eng 15: 871-9(2002); Kreitman R, AAPS J 8: E532-51(2006)). 일반적으로, 단백질성 링커는 트레오닌, 프롤린, 글루타민, 글라이신, 및 알라닌과 같은 극성(polar), 무전하(uncharged), 및/또는 하전 잔기가 아미노산 잔기 대부분을 구성한다(Huston J et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85: 5879-83(1988); Pastan I et al., Annu Rev Med 58: 221-37(2007); Li J et al., Cell Immunol 118: 85-99(1989); Cumber A et al. Bioconj Chem 3: 397- 401(1992); Friedman P et al., Cancer Res 53: 334-9(1993); Whitlow M et al., Protein Engineering 6: 989-95(1993); Siegall C et al., J Immunol 152: 2377-84(1994); Newton et al. Biochemistry 35: 545-53(1996); Ladurner et al. J Mol Biol 273: 330-7(1997); Kreitman R et al., Leuk Lymphoma 52: 82-6(2011); U.S. 4,894,443 참조). 단백질성 링커의 비제한적인 예는 알라닌-세린-글라이신-글라이신-프롤린-글루탐산염(ASGGPE), 발린-메티오닌(VM), 알라닌-메티오닌(AM), AM(G2에서 4S)XAM(G는 글라이신, S는 세린, 그리고 x는 1에서 10까지의 정수)을 포함한다.
단백질성 링커는 얻고자하는 성질에 따라 선택할 수 있다. 단백질성 링커는 하나 또는 여러 개의 융합분자의 폴딩(folding), 안정도, 발현, 용해도, 약동학적인 성질, 약역학적인 성질, 및/또는 융합되지 않은 같은 도메인의 활동과 비교했을 때의 융합된 도메인의 활동을 최적화하는 것과 같은, 특정 기능을 원하는 기술자에게 선택될 수 있다. 예를 들어, 단백질성 링커는 유연성, 경직성, 및/또는 절개할 수 있는가(cleavability)에 따라 선택할 수 있다(Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69(2013) 참조). 기술자는 링커를 선택할 때 데이터베이스 및 링커 디자인 소프트웨어 도구를 사용할 수 있다. 특정 링커는 발현을 최적화하기 위해 선택될 수 있다(Turner D et al., J Immunl Methods 205: 43-54(1997) 참조). 특정 링커는 동질다합체를 형성하기 위해 동일한 폴리펩티드 또는 단백질 사이의, 또는 이질다합체를 형성하기 위해 다른 폴리펩티드 또는 단백질 사이의 상호작용을 촉진하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 단백질성 링커는 이합체(dimer) 및 더 고차(higher order)의 중합체 형성에 관련된 상호작용과 같이, 본 발명의 단백질의 폴리펩티드 구성성분 사이에서 얻고자하는 비공유 상호작용(non-covalent interactions)을 위해 선택될 수 있다(U.S. 4,946,778 참조).
유연한(flexible) 단백질성 링커는 보통 12 아미노산 잔기보다 더 길며, 글라이신, 세린, 및 트레오닌과 같은 작은, 비극성 아미노산 잔기, 극성 아미노산 잔기, 및/또는 친수성 아미노산 잔기가 풍부하다(Bird R et al., Science 242: 423-6(1988); Friedman P et al., Cancer Res 53: 334-9(1993); Siegall C et al., J Immunol 152: 2377-84(1994) 참조). 유연한 단백질성 링커는 구성성분들 사이의 공간 분리(spatial separation)를 증가를 위해 그리고/또는 구성성분 사이에 분자내(intramolecular) 상호작용을 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 여러 "GS" 링커는 숙련된 기술자에게 알려져 있으며 다수의 글라이신 및/또는 하나 이상의 세린, 때로는 (GxS)n, (SxG)n, (GGGGS)n, 및 (G)n(여기서 x는 1에서 6, n은 1 내지 30)와 같은 반복된 유닛으로 구성되어있다(WO 96/06641 참조). 유연한 단백질성의 링커의 비제한적인 예로는 GKSSGSGSESKS, GSTSGSGKSSEGKG, GSTSGSGKSSEGSGSTKG, GSTSGSGKSSEGKG, GSTSGSGKPGSGEGSTKG, EGKSSGSGSESKEF, SRSSG, 및 SGSSC가 있다.
경직된(rigid) 단백질성 링커는 보통 뻣뻣한 알파-나선형(alpha-helical) 구조물이며 프롤린 잔기 및/또는 하나 이상의 전략적으로 배치된(strategically placed) 프롤린이 풍부하다(Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013) 참조). 경직된 링커는 연결된 구성성분 사이에 분자내 상호작용을 방지하기 위해 선택될 수 있다.
적합한 링커는 예를 들어, 절개 및/또는 환경-특이 불안정과 같은 이유의 생체내에서 구성성분 분리를 감안하여 선택될 수 있다(Dosio F et al., Toxins 3: 848-83(2011); Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69(2013) 참조). 생체내에서 절개 가능한 단백질성 링커는 생물체 내의 특정 위치 또는 특정 세포 내에서 단백질분해 과정을 통해서 그리고/또는 주변에 환원 반응(reducing environment)을 일으켜 결합을 푸는 것이 가능하다(Doronina S et al., Bioconjug Chem 17: 144-24(2006); Erickson H et al., Cancer Res 66: 4426-33(2006) 참조). 생체내에서 절개 가능한 단백질형 링커는 보통 단백분해효소 민감성 모티프 및/또는 하나 이상의 시스테인 쌍(pair)이 형성한 이황결합을 포함한다(Pietersz G et al., Cancer Res 48: 4469-76(1998); The J et al., J Immunol Methods 110: 101-9(1998); Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69(2013) 참조). 생체내에서 절개 가능한 단백질형 링커는 유기체 내의, 세포 내 구간의 특정 위치에만 존재하는 단백질분해효소에 반응하게, 그리고/또는 특정 생리적인 또는 병리학적인 상태에서만 활성화 되도록(예를 들어, 비정상적으로 높은 수치를 가진 단백질분해효소, 특정 질병 위치에서 이상발현한(overexpressed) 단백질분해효소, 및 병원성 미생물에 특이 발현한 단백질분해효소) 설계될 수 있다. 예를 들어, 당업계에 알려진 단백질성 링커 중에는 세포 내에만 존재하는 단백질분해효소, 특정 세포종에만 존재하는 단백질분해효소, 및 암 또는 염증과 같은 병리학적인 상태에만 존재하는 단백질분해효소에 의해 절개된 링커도 있는데, 예로는 R-x-x-R 모티프 및 AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM가 있다.
본 발명의 단백질의 몇몇 구체예에서는, 단백질분해요소에 반응하는 부분 하나 또는 여려 개를 포함한 링커는 표적 세포 내에 단백질분해효소에 의한 절개를 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 단백질의 몇몇 구체예에서는, 절개되지 않는 링커는 척추 동물에게 투여 후 원치않는 독성효과를 감소시키기 위해 사용될 수 있다(Polson et al., Cancer Res 69: 2358-(2009) 참조).
적합한 링커는 단백질성이든 비단백질성이든, 단백질분해효소 민감성, 환경 산화환원전위 민감성, pH 민감성, 산으로 절개 가능, 빛으로 절개 가능, 및/또는 열 민감성 링커를 포함할 수 있다(Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69(2013) 참조).
적합한 절개가능 링커는 다음과 같은 당업계에 알려진 절개 가능한 군을 포함한 링커를 포함한다: Zarling D et al., J Immunol 124: 913-20(1980); Jung S, Moroi M, Biochem Biophys Acta 761: 152-62(1983); Bouizar Z et al., Eur J Biochem 155: 141-7(1986); Park L et al., J Biol Chem 261: 205-10(1986); Browning J, Ribolini A, J Immunol 143: 1859-67(1989); Joshi S, Burrows R, J Biol Chem 265: 14518-25(1990)에 언급된 링커.
적합한 링커는 pH 민감성 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 어떤 링커는, 표적 세포의 준세포 내 구간(subcellular compartment) 안에서의 분리(dissociation)를 위해 낮은 pH 상태에서의 그의 불안정성(instability) 때문에 선택될 수 있다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 트리틸기, 유도된(derivatized) 트리틸기, 비스말레이미디오톡시 프로판기(bismaleimideothoxy propane groups), 아디픽산 디하이드라자이드기(adipic acid dihydrazide groups), 및/또는 산 분해성 트랜스페린기(acid labile transferrin groups)를 포함한 링커는 본 발명의 단백질의 구성성분(예: 특정 pH 범위 안에 있는 폴리펩티드 요소) 분리(release)가 가능하게 할 수도 있다(Welhoner H et al., J Biol Chem 266: 4309-14(1991); Fattom A et al., Infect Immun 60: 584-9(1992) 참조). 선택될 수 있는 어떤 링커는, 종양 조직의 pH가 건강한 조직의 pH보다 낮은 것과 같은, 세포조직 간의 생리학적인 pH 차이와 일치하는 pH 범위에서 절개된 것 일수도 있다(U.S. 5,612,474 참조).
빛으로 절개가능한 링커는 가시거리 내의 빛과 같이 특정 파장 범위 내의 전자기 방사선 노출에 의하여 절개된 링커이다(Goldmacher V et al., Bioconj Chem 3: 104-7(1992) 참조). 빛으로 절개가능한 링커는 특정 파장 범위 내의 빛에 노출시켜 폴리펩티드 성분과 같은 본 발명의 단백질의 구성성분 분리에 사용될 수 있다. 빛으로 절개가능한 링커의 비제한적인 예는 시스테인을 위한 빛 절개가능 보호원자단(photocleavable protective group)으로서의 나이트로벤질기, 나이트로벤질옥시카보닐 염화물 교차연계자(cross-linkers), 하이드록시프로필메타크릴아마이드 공중합체(hydroxypropylmethacrylamide copolymer), 글라이신 공중합체, 플루오레세인 공중합체, 및 메틸로다민 공중합체(methylrhodamine copolymer)를 포함한다(Hazum E et al., Pept Proc Eur Pept Symp, 16th, Brunfeldt K, ed., 105-110(1981); Senter et al., Photochem Photobiol 42: 231-7(1985); Yen et al., Makromol Chem 190: 69-82(1989); Goldmacher V et al., Bioconj Chem 3: 104-7 (1992) 참조). 빛으로 절개가능한 링커는 광섬유를 사용해 빛에 노출 가능한 질병, 장애, 및 질환 치료를 위해 설계된 본 발명의 단백질 형성을 위해 구성성분을 연결하는 특정한 사용법을 갖고있을 수 있다.
본 발명의 단백질의 몇몇 구체예에서는, 세포-표적화 결합 영역은 공유 및 비공유 연쇄(covalent and noncovalent linkages)를 포함한 기술자에게 알려진 많은 방법으로 시가 독소 작동체 영역에 연결되어있다(Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69(2013); Behrens C, Liu B, MAbs 6: 46-53(2014) 참조).
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 단백질은 중쇄 가변(heavy chain variable (VH)) 도메인 및 경쇄 가변(light chain variable (VL)) 도메인이 링커로 연결된 scFv인 결합 영역을 포함한다. 당업계에는 15-잔기(residue) (Gly4Ser)3 펩티드와 같은 이 용도를 위한 여러 링커가 알려져 있다. 비공유 다가 구조(non-covalent multivalent structures)를 생성하는데에 적합한 scFv 링커는 GGS, GGGS(Gly3Ser 또는 G3S), GGGGS(G1y4Ser 또는 G4S), GGGGSGGG, GGSGGGG, GSTSGGGSGGGSGGGGSS, 및 GSTSGSGKPGSSEGSTKG를 포함한다(Pluckthun A, Pack P, Immunolechnology 3: 83- 105 (1997); Atwell J et al. Protein Eng 12: 597-604 (1999); Wu A et al, Protein Eng 14: 1025-33 (2001); Yazaki P et al, J Immunol Methods 253: 195-208 (2001); Carmichael J et al, J Mol Biol 326: 341 -51 (2003): Arndt M et al, FEBS Lett 578: 257-61 (2004); Bie C et al, World J Hepatol 2: 185-91 (2010)).
본 발명의 단백질의 구성성분 연쇄에 적합한 방법은, 연결이 여기에 설명된 분석을 포함한 적절한 분석으로 측정된 결합 영역의 결합 기능, 단백질의 세포 내재화, 및/또는 얻고자하는 시가 독소 작동체 영역의 독소 작동체 기능을 크게 저해하지 않는다면, 현재 당업계에 알려진 방법 어느 것이라도 사용할 수 있다.
II. 본 발명의 특이 구조적 변화의 실시예
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 단백질은 항원의 발현이 암세포에 한정된 암세포의 세포 표면의 표면항원과의 특이 및 고친화성 결합을 위해 선택된 면역글로불린-유형 폴리펩티드로부터 유도된 결합 영역을 포함한다(Glokler J et al, Molecules 15: 2478-90 (2010); Liu Y et al, Lab Chip 9: 1033-6 (2009) 참조). 다른 몇몇 구체예에 준거하여, 결합 영역은 항원이 비-암세포와 비교하였을 때 암세포에 의하여 이상발현 또는 우선적으로 발현하는 암세포의 세포 표면의 표면항원과의 특이 및 고친화성 결합을 위해 선택되었다. 대표적인 표적 생체분자는 몇은 다음에 열거된 암 및/또는 특정 면역 세포 유형과 관련된 표적을 포함하지만 이에 제한되어 있지 않다.
당업계에는 다음을(다른 이름은 괄호 안에 표기) 표적하는 결합 영역과 같이 암세포와 관련된 항원결정기를 인식하는 많은 면역글로불린-유형 결합 영역이 존재한다: 아넥신 AI, B3 흑색종 항원, B4 흑색종 항원, CD2, CD3, CD4, CD20(B-림프구 항원 단백질 CD20), CD22, CD25(인터루킨-2 수용체(interleukin-2 receptor IL2R)), CD30(TNFRSF8), CD38(사이클릭 에이디피 라이보스 하이드롤레이스(cyclic ADP ribose hydrolase)), CD40, CD44(히알루로난 수용체), ITGAV(CD51), CD66, CD71(트랜스페린 수용체), CD73, CD74(HLA-DR 항원관련 불변 사슬(antigens-associated invariant chain)), CD79, CD98, 엔도글린(END 또는 CD105), CD106(VCAM-1), 케모카인 수용체 타입 4(CDCR-4, 퓨신(fusin), CD184), CD200, 인슐린유사성장인자 1 수용체(CD221), 뮤신1(MUC1, CD227), 기저세포 부착분자(B-CAM, CD239), CD248(엔도시알린(endosialin) 또는 TEM1), 종양괴사인자 수용체 10b(TNFRSF10B, CD262), 종양괴사인자 수용체 13B(TNFRSF13B, TACI, CD276), 혈관내피성장인자 수용체 2(KDR, CD309), 상피세포 부착분자(EpCAM, CD326), 인간 표피성장인자 수용체 2(HER2/Neu/ErbB2/CD340), 암 항원 15-3(CA15-3), 암 항원 19-9(CA 19-9), 암 항원 125(CA125, MUC16), CA242, 암 배아항원-관련(carcinoembryonic antigen-related) 세포 부착분자(예: CEACAM3 (CD66d) 및 CEACAM5), 암배아항원 단백질(CEA), 콘드로이틴황산염 프로테오글리칸 4(CSP4, MCSP, NG2), CTLA4, DLL4, 표피성장인자(EGFR, ErbB1), 엽산염 수용체(FOLR), G-28, 강글리오시드 GD2, 강글리오시드 GD3, HLA-Dr1O, HLA-DRB, 인간 표피성장인자 수용체 1(HER1), 에프린(ephrin) 타입-B 수용체 2(EphB2), 상피세포 부착분자(EpCAM), 섬유모세포 활성 단백질(fibroblast activation protein)(FAP/세프라세(seprase)), 인슐린유사성장인자 1 수용체(IGF1R), 인터루킨 2 수용체(IL-2R), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 인테그린 알파-V 베타-3(αvβ3), 인테그린 알파-V 베타-5(αvβ5), 인테그린 알파-5 베타-1(α5β1), L6, MPG, 흑색종관련 항원 1 단백질(MAGE-1), 흑색종관련 항원 3(MAGE-3), 메소텔린(mesothelin)(MSLN), MPG, MS4A, p21, p97, 폴리오 바이러스 수용체-유사 4(PVRL4), 단백분해효소 활성 수용체(예: PAR1), 전립선 특이 막 항원 단백질(PSMA), 영양막 당단백질(TPGB), 및 종양-관련 칼슘 신호 변환기(transducers)(TACSTDs)(예: Lui B et al., Cancer Res: 64: 704- 10(2004); Novellino L et al., Cancer Immunol Immunother 54: 187-207(2005); Bagley R et al., Int. J Oncol 34: 619-27(2009); Gerber H et al., mAhs 1: 247-53(2009); Beck A et al., Nat Rev Immunol 10: 345-52(2010): Andersen J et al., J Biol Chem 287: 22927-37(2012); Nolan- Stevaux O et al., PLoS One 7: e50920(2012); Rust S et al., Mol Cancer 12: 11(2013) 참조). 이 표적 생체분자 목록은 비제한적이다. 숙련자라면 어떤 암세포 혹은 다른 특정 세포 유형과 관련된 어느 표적 생체분자라도 본 발명의 단백질을 생성하기 위해 시가 독소 작동체 영역과 결합할 결합 영역을 설계 또는 선택하는데에 사용할 수 있다.
암세포 및 그들을 결합하는 것으로 알려진 면역글로불린-유형 결합 영역과 강하게 연관된 다른 표적 생체분자의 예로는 BAGE 단백질(B 흑색종 항원), 기저세포 부착분자(BCAM 또는 루터란 혈액군(Lutheran blood group) 당단백질), 방광 종양 항원(BTA), 암-테스티스(cancer-testis) 항원 NY-ESO-1, 암-테스티스 항원 LAGE 단백질, CD19(B-림프구 항원 단백질 CD19), CD21(보체수용체-2 또는 보체 3d 수용체, CD26(디펩티딜펩티드가수분해효소-4(dipeptidyl peptidase-4), DPP4, 또는 아데노신탈아미노효소 복합단백질 2(adenosine deaminase complexing protein 2)), CD33(시알산-결합 면역글로불린-유형 렉틴-3, CD52(CAMPATH-1 항원), CD56(신경세포부착분자 또는 NCAM), CD133(프로미닌(prominin)-1), CS1(SLAM군 7번(SLAM family number 7) 또는 SLAMF7), 세포 표면 A33 항원 단백질(gpA33), 엡스테인바 바이러스 항원 단백질, GAGE/PAGE 단백질(흑색종 관련 암/테스티스 항원), 간세포성장인자 수용체(HGFR 또는 c-Met), MAGE 단백질, T-세포 1 단백질이 인식하는(recognized by) 흑색종 항원(MART-1/MelanA, MARTI), 뮤신(mucins), 흑색종의 우선적으로 발현된 항원(Preferentially Expressed Antigen of Melanoma)(PRAME) 단백질, 전립선특이항원 단백질(PSA), 전립선 줄기세포 항원 단백질(PSCA), 최종당화산물의 수용체(Receptor for Advanced Glycation Endroducts(RAGE)), 종양-관련 당단백질 72(TAG-72), 타이로신-단백질 인산화효소 막관통수용체(transmembrane recptor)(ROR1 또는 NTRKR1), 혈관내피성장인자 수용체(VEGFRs), 및 윌름스종양 항원이 있다.
암세포와 강하게 연관된 다른 표적 생체분자의 예로는 탄산탈수효소 IX(CA9/CAIX), 클라우딘(Claudin) 단백질(CLDN3, CLDN4), 에프린 A형 수용체3(ephrin type-A receptor 3(EphA3)), 엽산 결합(folate binding) 단백질(FBP), 강글리오시드 GM2, 인슐린유사성장인자 수용체, 인테그린(예: CD11a-c), 핵인자 카파 B 수용체 활성화제(receptor activator of nuclear factor kappa B(RANK)), 타이로신-단백질 인산화효소 수용체 erB-3, 종양괴사인자 수용체 10A(TRAIL-R1/DR4), 종양괴사인자 수용체 10B(TRAIL-R2), 테나신 C, 및 CD64(FcγRI)가 있다(Hough C et al, Cancer Res 60: 6281-7 (2000); Thepen T et al, Nat Biotechnol 18: 48-51 (2000); Pastan I et al, Nat Rev Cancer 6: 559-65 (2006); Pastan, Annu Rev Med 58: 221-37 (2007); Fitzgerald D et al, Cancer Res 71 : 6300-9 (2011); Scott A et al, Cancer Immun 12: 14-22 (2012) 참조). 이 표적 생체분자 목록은 비제한적이다.
그리고 또한, 다음과 같은 다른 표적 생체분자 예가 많다: ADAM 금속단백분해효소(metalloproteinases)(예: ADAM-9, ADAM-10, ADAM-12, ADAM-15, ADAM-17), ADP-리보실전달효소(ribosyltransferases)(ART1, ART4), 항원 F4/80, 골수 간질(stroma) 항원(BST1, BST2), 절단점군영역-c-abl 종양유전자(break point cluster region-c-abl oncogene(BCR-ABL)) 단백질, C3aR(보체성분 3a 수용체), CD7, CD13, CD14, CD15(루이스(Lewis) X 또는 단계특이 배아 항원 1), CD23(FC 엡실론 RII), CD49d, CD53, CD54(세포내 부착분자 1), CD63(테트라스패닌(tetraspanin)), CD69, CD80, CD86, CD88(보체성분 5a 수용체 1), CD115(집락자극인자 1 수용체), CD123(인터루킨-3 수용체), CD129(인터루킨 9 수용체), CD183(케모카인 수용체 CXCR3), CD191(CCR1), CD193(CCR3), CD195(케모카인 수용체 CCR5), CD203c, CD225(인터페론-유발 막관통단백질 1(interferon-induced transmembrane protein 1)), CD244(자연살해세포 수용체 2B4), CD282(톨-유사(toll-like) 수용체 2), CD284(톨-유사 수용체 4), CD294(GPR44), CD305(백혈구-관련 면역글로불린-유사 수용체 1), 에프린(ephrin) 타입-A 수용체 2(EphA2), FceRIa, 갈렉틴-9(galectin-9), 알파-태아단백질 항원 17-A1 단백질, 인간 아스파르틸(아스파라지닐(asparaginyl)) 베타-수산화효소(human aspartyl beta-hydroxylase(HAAH)), 면역글로불린-유사 전사(transcript) ILT-3, 라이소포스페이티들글레세롤 아실기전이효소 1(lysophosphatidlglycerol acyltransferase 1)(LPGAT1/IAA0205), 용해소체-관련(lysosome-associated) 막 단백질(CD107과 같은 LAMP), 멜라닌세포 단백질 PMEL(gp100), 골수성-관련 단백질-14(mrp-14), 예정사-리간드 1(programmed death-ligand 1(PD-L1)), 타이로신-단백질 인산화효소 수용체 erbB-3, SART 단백질, 청소제수용체(예를 들어 CD64 및 CD68), 시글렉(시알산-결합 면역글로불린-유형 렉틴), 신데칸(syndecans)(예를 들어 SDC1 또는 CD138), 티로시나제, 티로시나제-관련 단백질 1(tyrosinease-related protein 1(TRP-1)), 티로시나제-관련 단백질 2(TRP-2), 티로시나제 연관 항원(tyrosinase associated antigen(TAA)), APO-3, BCMA, CD2, CD3, CD4, CD8, CD18, CD27, CD28, CD29, CD41, CD49, CD90, CD95(Fas), CD103, CD104, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD152(CTLA-4), 케모카인 수용체, 보체 단백질, 시토카인 수용체, 조직적합성 단백질, ICOS, 인터페론-알파, 인터페론-베타, c-myc, 오스테오프로테그린(osteoprotegerin), PD-1, RANK, TACI, TNF 수용체 상과의 개체(superfamily member)(TNF-Rl, TNFR-2), Apo2/TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, 및 TRAIL-R4(표적 생체분자는 Scott A et al., Cancer Immunity 12: 14(2012); Cheever M et al., Clin Cancer Res 15: 5323-37(2009) 참조, 그리고 여기에 명시된 표적 생체분자는 비제한적인 예임을 주의할 것). 숙련자라면 원하는 어떤 표적 생체분자라도 본 발명의 단백질을 생성하기 위해 시가 독소 작동체 영역과 결합할 결합 영역을 설계 또는 선택하는데에 사용할 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 결합 영역은 면역체계의 세포 유형의 세포 표면과의 특이 및 고친화성 결합을 위해 선택된 면역글로불린-유형 폴리펩티드만을 포함하거나 또는 이들을 포함하여 구성된다. 예를 들어, 면역글로불린-유형 결합 도메인은 CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11, CD12, CD13, CD14, CD15, CD16, CD17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD40, CD41, CD56, CD61, CD62, CD66, CD95, CD117, CD123, CD235, CD146, CD326, 인터루킨-2 수용체(IL-2R), 핵인자 카파 B 수용체 활성화제(RANK), SLAM-관련 단백질(SAP), 및 TNFSF18(종양괴사인자 리간드 18 또는 GITRL)과 결합하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 결합 영역은 다음의 군에서 선택된 케모카인 수용체를 가진 표적 생체분자와 고친화성 결합을 한다: CXCR- 1, CXCR-2, CXCR-3 A, CXCR3B, CXCR-4, CXCR-5, CCR-I, CCR-2A, CCR-2B, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, CCR-10, CX3CR-1, XCR1, CXCR-6, CXCR-7, 케모카인 결합 단백질-2(CCBP2, D6 수용체), 및 더피(Duffy) 항원/케모카인 수용체(DARC, Fy 당단백질, FY, CD234). 더 많은 비제한적인 표적 생체분자는 하기의 실시예의 표 11을 참조.
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 단백질은 아미노산 SLT-1A(SEQ ID NO:l), StxA(SEQ ID NO:2), 및/또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 75 내지 251중의 하나로 구성, 혹은 하나를 포함하는 시가 독소 작동체 영역을 포함한다. 본 발명의 또다른 몇몇 구체예에서는, 단백질은 아미노산 SLT-1A(SEQ ID NO:l), StxA(SEQ ID NO:2), 및/또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 1 내지 241중의 하나로 구성, 혹은 하나를 포함하는 시가 독소 작동체 영역을 포함한다. 본 발명의 또다른 몇몇 구체예에서는, 단백질은 아미노산 SLT-1A(SEQ ID NO:l), StxA(SEQ ID NO:2), 및/또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 1 내지 251중의 하나로 구성, 혹은 하나를 포함하는 시가 독소 작동체 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 몇몇 구체예에서는, 단백질은 아미노산 SLT- 1A(SEQ ID NO:l), StxA(SEQ ID NO:2), 및/또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 1 내지 261중의 하나로 구성, 혹은 하나를 포함하는 시가 독소 작동체 영역을 포함한다.
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 단백질은 인간 CD38에 특이 고친화성 결합을 보이는 아미노산 SEQ ID NO:4의 269-508중의 하나로 구성, 혹은 하나를 포함하는 면역글로불린-유형 결합영역을 포함한다. 몇몇 다른 구체예는 SEQ ID NO:4-7중의 어느 폴리펩티드 하나로 구성, 혹은 하나를 포함하는 단백질이다.
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 단백질은 인간 HER2에 특이 고친화성 결합을 보이는 아미노산 SEQ ID NO:8의 269-512중의 하나로 구성, 혹은 하나를 포함하는 면역글로불린-유형 결합영역을 포함한다. 몇몇 다른 구체예는 SEQ ID NO:8-11중의 어느 폴리펩티드 하나로 구성, 혹은 하나를 포함하는 단백질이다.
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 단백질은 인간 CD19에 특이 고친화성 결합을 보이는 아미노산 SEQ ID NO:12의 269-516중의 하나로 구성, 혹은 하나를 포함하는 면역글로불린-유형 결합영역을 포함한다. 몇몇 다른 구체예는 SEQ ID NO:12-15중의 어느 폴리펩티드 하나로 구성, 혹은 하나를 포함하는 단백질이다.
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 단백질은 인간 CD74에 특이 고친화성 결합을 보이는 아미노산 SEQ ID NO:16의 269-518중의 하나로 구성, 혹은 하나를 포함하는 면역글로불린-유형 결합영역을 포함한다. 몇몇 다른 구체예는 SEQ ID NO:16-19중의 어느 폴리펩티드 하나로 구성, 혹은 하나를 포함하는 단백질이다.
본 발명의 단백질의 몇몇 구체예 중에서는, 결합영역은 U.S. 특허출원 2011/0059090에서 설명된 카멜리드 항체(VHH) 단백질 5F7의 단일 도메인 가변성 영역으로부터 유도된 것과 같은, HER2에 특이 고친화성 결합을 보이는 단일 도메인 면역글로불린으로부터 유도된 영역 VHH이다. 또 다른 몇몇 구체예에서는, 단백질은 인간 HER2에 특이 고친화성 결합을 보이는 아미노산 SEQ ID NO:20의 268-385중의 하나를 포함하거나 또는 이들을 포함하여 구성된 면역글로불린-유형 결합영역을 포함한다. 몇몇 다른 구체예는 SEQ ID NO:20-29중의 어느 폴리펩티드 하나로 구성, 혹은 하나를 포함하는 단백질이다.
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 단백질은 인간 CD20에 특이 고친화성 결합을 보이는 아미노산 SEQ ID NO:16의 269-365중의 하나를 포함하거나 또는 이들을 포함하여 구성된 면역글로불린-유형 결합영역을 포함한다. 몇몇 다른 구체예는 SEQ ID NO:30-31중의 어느 폴리펩티드 하나로 구성, 혹은 하나를 포함하는 단백질이다.
이 명세서 내의 "중쇄 가변(VH) 도메인" 또는 "경쇄 가변(VL) 도메인"은 각각 어느 항체 VH 또는 VL 도메인(예: 인간 VH 또는 VL 도메인) 및 각각에 해당하는 선천항체(native antibody)의 최소 질적인 항원 결합 능력을 유지한 그의 유도체(예: 쥐 근원(native murine)의 VH 또는 VL 도메인으로부터 유도된 인간화된(humanized) VH 또는 VL 도메인)를 뜻한다. VH 또는 VL 도메인은 세 개의 CDR 또는 ABR에 의하여 교란된 "기본틀(framework)" 영역으로 구성되어있다. 기본틀 영역은 항원의 항원결정기와 특이 결합을 위해 CDR을 정렬(align)하는 역할을 한다. 아미노-말단으로부터 카복시-터미널까지, VH 및 VL 도메인 둘 다 다음의 기본틀(FR) 및 CDR 영역을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 캠리드 VHH 파면, 연골어류의 IgNAR, VNAR 단편, 및 그의 유도체에서는, 단일 중쇄 가변 도메인은 동일한 기본 배열을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4.
사용 가능한 세포외 표적 생체분자 결합 부위를, 바람직하게는 표적 생체분자와 고친화성 결합 가능한 결합 부위를(예: KD 참조), 포함한 본 발명의 단백질의 폴리펩티드의 단편, 이형, 및/또는 유도체의 사용은 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어, 본 발명이 CD19, CD20, CD38, CD74, 및 HER2와 결합할 수 있는 폴리펩티드 서열을 제공하고, 해리상수 10-5 내지 10-12 mol/ℓ으로, 바람직하게는 200nM 이하로, 세포 표면에서 발현하는 세포외 CD38 또는 HER2와 결합하는 폴리펩티드를 포함한 어느 면역글로불린-유형 결합 영역은 본 발명의 단백질 생성 및 본 발명의 방법에 사용하기 위해 치환될 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예 중에서는, 면역글로불린-유형 결합 영역은 나노바디 또는 단일 도메인 면역글로불린-유래 영역 VHH으로부터 유도되었다. 일반적으로, 나노바디는 카멜리드 및 연골 어류(연골어강)에서 찾을 수 있는 자연적으로 발생하는 단일, 단량체 가변 도메인 항체(sdAbs)의 단편으로 구성된다. 나노바디는 이러한 자연적으로 발생하는 항체에서 단일, 단량체 가변 도메인을 절단하여 더 작고 안정적인 분자를 만드는 것으로 가공된다. 작은 크기 때문에, 나노바디는 모든 항체가 접근성을 가지지 않은 항원과 결합할 수 있다. 본 발명의 몇몇 구체예 중에서는, 면역글로불린-유형 결합 영역은 나노바디 또는 인간 HER2에 특이 친화성 결합을 보이는 단일 도메인 면역글로불린-유래 영역 VHH로부터 유도되었다.
III. 본 발명의 단백질의 일반적인 기능
본 발명은 각각이 다음을 포함하는 여러 단백질을 제공한다: 1) 세포 표적화를 위한 면역글로불린-유형 결합 영역, 및 2) 세포독성 시가 독소 작동체 영역. 세포 표적 면역글로불린-유형 결합 영역과 시가-독소-서브유닛-A-유래 영역의 연결은 시가 독소 세포독성의 세포-유형 특이 표적화의 조작(engineering)을 가능케 한다. 본 발명의 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 단백질은 특정 세포 유형의 세포 표면과 관련된 세포외 표적 생체분자들을 결합시키는 것과 그 세포에 침투하는 것이 가능하다. 표적인 세포 유형에 내재화하고 나면, 본 발명의 단백질의 몇몇 구체예는 세포독성 시가 독소 작동체 폴리펩티드 단편을 표적 세포의 시토졸 안으로 경로화할 수 있다. 표적 세포 유형의 시토졸 안에 침투하면, 본 발명의 세포독성 단백질은 효소로 리보솜 불활성화, 세포 항상성 방해, 그리고 궁극적으로 세포를 사멸할 수 있다. 이 시스템은 모듈러식으로, 다양한 면역글로불린-유형 결합 영역은 얼마든지 이런 강한 세포독성 또는 세포성 색전(cytostasis)을 여러, 다양한 세포 유형을 표적화하는데 사용할 수 있다. 또는, 본 발명의 무독성 변종은 표적 세포에 진단을 위한 정보수집 기능으로서 표적 세포의 내부를 표지(label)하기 위한 검출 촉진제와 같은 부가적인 외인성 물질을 전달하는데 사용할 수 있다.
A. 표적된 시가 독소 세포독성을 통한 세포 사멸
시가 독소군의 개체는 진핵세포 사멸을 위해 개조(adapted)되었기 때문에, 시가 독소 작동체 영역을 사용해 설계된 단백질은 강한 세포-사멸 활동을 보일 수 있다. 시가 독소군의 A 서브유닛 개체는 세포의 시토졸에 침투하면 진핵세포를 사멸할 수 있는 효소의(enzymatic) 도메인을 포함한다. 본 발명의 세포독성 단백질의 몇몇 구체예는 이러한 세포독성 메커니즘을 활용하지만 시가 독소 작동체 영역이 표적 세포 유형의 시토졸에 도달할 수 있게 해야한다. 조작의 배향은 아마 시가 독소 작동체 영역에 고유한 기능을 통한 시토졸로의 전달이 향상됨으로써 세포독성에 영향을 미친다.
본 발명의 세포독성 단백질의 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 세포독성 단백질의 면역글로불린-유형 결합 영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합한 세포와 접촉하면, 세포독성 단백질은 세포를 사멸할 수 있다. 세포 사멸은 체외에서 조작된(manipulated) 표적 세포, 시험관 내에서 배양된 표적 세포, 시험관 내에서 배양된 조직샘플내의 표적 세포, 또는 생체내의 표적 세포와 같은 표적 세포의 다양한 상태(conditions)의 본 발명의 세포독성 단백질을 사용하여 실행할 수 있다.
본 발명의 세포독성 단백질이 표적 세포를 사멸하기 위한 표적 생체분자의 발현은 선천적이지 않아도 된다. 표적 생체분자의 세포 표면 발현은 감염, 병원체 유무, 및/또는 세포내 미생물 병원체 유무의 결과일 수도 있다. 표적 생체분자의 발현은 인공적일 수도 있는데, 예를 들면 바이러스 발현 벡터 감염으로 인한 강제적인 또는 유발된 발현이 있다(아데노 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 및 레트로바이러스(retroviral) 참조). 표적 생체분자에 발현을 유발하는 예로는 올-트랜스 레티노산(all-trans retinoic acid) 및 다양한 합성 레티노이드, 또는 아무 레티노산 수용체(RAR) 작용제와 같은 레티노이드에 노출된 세포의 CD38 발현의 상향조절(upregulation)이 있다(Drach J et al., Cancer Res 54: 1746-52(1994); Uruno A et al., J Leukoc Biol 90: 235-47(2011) 참조). 또 다른 예에서는, CD20, HER2, 및 EGFR 발현은 세포를 이온화방사선에 노출시켜 발현을 유발할 수 있다(Wattenberg M et al., Br J Cancer 110: 1472-80 (2014)).
B. 세포 유형 가운데 선택적인 세포독성
고친화성 면역글로불린-유형 결합 영역을 사용한 특정 세포 유형에 효소적 활성의 시가 독소 영역 전달을 표적화함으로써, 이 강한 세포-사멸 활동을 우선적으로 선택된 세포 유형을 사멸하는 것으로 제한할 수 있다. 본 발명은 이 기능을 가진 여러 세포독성 단백질을 제공한다.
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 세포 유형의 혼합물에 대한 본 발명에 따른 단백질의 투여에 있어서, 상기 단백질은, 물리적으로 세포 외 표적 생체분자와 결합 되지 않은 세포 유형들과 비교하여 볼 때, 세포 외 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 세포들을 선택적으로 사멸하게 할 수 있다. 시가 독소군의 개체는 진핵세포 사멸을 위해 개조되었기 때문에, 시가 독소 작동체 영역을 사용해 설계된 세포독성 단백질은 강한 세포독성 활동을 보일 수 있다. 고친화성 면역글로불린-유형 결합 영역을 사용한 특정 세포 유형에 효소적 활성의 시가 독소 영역 전달을 표적화함으로써, 이 강한 세포-사멸 활동을 우선적으로 선택된 결합 영역으로 특이 결합된 표적 생체분자와 물리적 연결이 표적화된 세포 유형만을 사멸하는 것으로 제한할 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 세포독성 단백질은 두 가지 이상 다른 세포 유형의 혼합물 내에서 선택적으로 또는 우선적으로 특정 세포 유형을 사멸할 수 있다. 이것은 높은 우선권을 가진 특정 세포 유형에 세포독성 활동 표적화를 활성을 가능하게 하고, 표적 생체분자를 발현하지 않는“방관자(bystander)”세포 유형에 비해 3배의 세포독성 효과를 가능하게 할 수 있다. 또는, 결합 영역의 표적 생체분자의 발현은, 표적 생체분자가 충분히 낮은 양으로 발현 그리고/또는 작은 양으로 표적이 아닌 세포 유형과 물리적으로 결합한다면, 하나의 세포 유형에 제한되지 않을 수 있다. 이는 많은 양의 표적 생체분자를 발현하지 않거나 많은 양의 표적 생체분자와 물리적으로 결합하지 않은 "방관자" 세포 유형에 비해, 3배의 세포독성 효과와 같은 높은 우선권을 가진 특정 세포 유형의 표적된 세포-사멸을 가능하게 한다.
세포 표면에 있는 세포외 표적 생체분자의 레벨은 FACS 방법과 같은 숙련자에게 알려진 여러 방법을 사용하여 알 수 있다. 이 명세서 내에 쓰인바와 같이, 세포 표면에서 발현한 상당한 양의 세포외 표적 생체분자는 세포 유형에 따라서 FACS 분석으로 측정된 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 또는 70,000 평균형광강도(MFI)보다 높다.
본 발명의 다른 구체예에서는, 두 가지 다른 세포 유형의 집단(population)에 대한 본 발명의 세포독성 단백질의 투여에 있어서, 상기 세포독성 단백질은 표적 세포 집단에 대해 반 최고치 세포독성 농도(CD50) 값으로 정의된 세포 사멸 결과를 얻을 수 있는데, 상기 표적 세포 집단의 인자들은 세포독성 단백질의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자를 발현하며, 한 번 투여량에서 세포독성 단백질의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자를 발현하지 않는 세포군 인자에 동일한 세포독성 단백질의 상기 CD50 투여량보다 적어도 3배 이하 낮은 값을 얻을 수 있다.
몇몇 구체예에서는, 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 세포 유형 군에 대한 본 발명의 세포독성 활동은 상기 결합 영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합되지 않은 세포 유형 군에 대한 상기 세포독성 활성보다 적어도 3배 이상 높다. 본 발명에 따른, 선택적인 세포독성은 (a/b)의 비로 수량화될 수 있는데, (a)는 결합 영역의 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 특정한 세포 유형의 세포 집단에 대한 세포독성을 (b)는 상기 결합 영역의 표적 생체분자와 물리적으로 결합되지 않은 세포종의 세포 집단에 대한 세포독성을 의미한다. 몇몇 구체예에서는, 세포독성 비율은 선택적인 세포독성을 나타내는데, 이것은 결합 영역의 표적 생체분자와 물리적으로 결합되지 않은 세포 또는 세포 유형의 집단에 비교하여 결합 영역의 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 세포 또는 세포 유형 군이 적어도 3배, 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 50배, 75배, 100배, 25배, 500배, 750배, 또는 1000배 이상 높다는 것을 나타낸다.
이러한 우선적인 세포 사멸 기능은, 세포 유형의 체외 가공 혼합물, 세포 유형의 혼합물로 체내 배양된 조직, 다양한 세포 유형의 체내 존재(예를 들어, 다세포 생물 내에서의 환경 또는 그 발생적 장소에서)에서와 같은, 다양한 조건과 표적이 아닌 방관자 세포들의 존재 하에서, 본 발명에 따른 어떤 세포독성 단백질에 의해 표적화된 세포가 사멸되는 것을 허용한다.
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 세포 단백질은 두 가지 이상 다른 세포 유형의 혼합물 내에서 선택적으로 또는 우선적으로 특정 세포 유형을 사멸할 수 있다. 이것은 높은 우선권으로 특정 세포 유형에 표적화된 세포독성 활성을 가능하게 하고, 표적 생체분자를 발현하지 않는“방관자”세포 유형에 비해 3배의 세포독성 효과를 가능하게 할 수 있다. 만약 상기 표적 생체분자가 충분히 낮은 양에서 발현되고/또는 표적화 되지 않은 세포 유형과 충분히 낮은 양에서 물리적으로 결합하는 경우, 선택적으로, 상기 결합 영역에 대한 상기 표적 생체분자의 발현은 하나의 세포 유형에 비배타적일 수 있다. 이것은 높은 우선권으로 특정한 세포 유형의 표적화된 세포-사멸을 가능하게 할 수 있고, 표적 생체분자에 대해 유효한 양을 발현하지 않거나 상기 표적 생체분자에 대해 유효한 양으로 물리적으로 결합되지 않은 "방관자" 세포 유형에 비해 3배의 세포독성 효과를 가진다.
본 발명의 세포독성 단백질은 특정 세포 유형의 집단을 제거하는데 용이하다. 예를 들어, 상기 세포독성 단백질은 하나 또는 그 이상의 세포 표면에서 상승된 레벨의 표적 생체분자를 발현하는 "표적 생체분자+" 세포를 제거함으로써, 어떤 종양, 암, 및/또는 다른 성장이상(growth abnormalities)을 치료하는데에 용이하다.
몇몇 구체예에서는, 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 세포 유형 집단에 대한 상기 세포독성 활동은 상기 결합 영역의 세포 외 표적 생체분자와 물리적으로 결합되지 않은 세포 유형 집단에 대한 상기 세포독성 활성보다 적어도 3배 이상 높다. 본 발명에 따른, 선택적인 세포독성은 (a/b)의 비로 수량화될 수 있는데, (a)는 결합 영역의 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 특정한 세포 유형의 세포 집단에 대한 세포독성을 (b)는 상기 결합 영역의 표적 생체분자와 물리적으로 결합되지 않은 세포 유형의 세포 집단에 대한 세포독성을 의미한다. 몇몇 구체예에서는, 세포독성 비율은 선택적인 세포독성을 나타내는데, 이것은 세포외 표적 생체분자를 발현하지 않거나 상기 세포독성 단백질의 결합 영역에 생체외 표적 생체분자와 물리적으로 결합되지 않은 세포 또는 세포 유형의 집단에 비교하여 세포외 표적 생체분자를 발현하거나 상기의 세포독성 단백질의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 세포 또는 세포 유형의 집단이 적어도 3배, 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 50배, 75배, 100배, 250배, 500배, 750배, 또는 1000배 이상 높다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 세포외 표적 생체분자의 유무 및/또는 폴리펩티드 서열에 관하여 다른 두 가지 세포 유형의 집단에 대한 본 발명의 세포독성 단백질의 투여에 있어서, 상기 세포독성 단백질은 세포독성 단백질의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합하지 않은 세포 유형 또는 세포독성 단백질의 결합 영역의 결합특이성(binding specificity)을 교란시키는 서열 변형 또는 돌연변이를 포함한 세포외 표적 생체분자의 형태와만 물리적으로 결합된 세포 유형의 CD50에 비하여 적어도 그의 3배의 CD50으로 세포독성 단백질의 결합 영역에 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 세포 유형을 사멸할 수 있다.
본 발명의 세포독성 단백질의 몇몇 구체예에서는, 두 가지 세포 유형의 집단에 대한 상기 세포독성 단백질의 투여에 있어서, 상기 세포독성 단백질은 제1 세포 집단에 대해 반 최고치 세포독성 농도(CD50) 값으로 정의된 세포 사멸 결과를 얻을 수 있는데, 상기 세포 집단의 인자들은 세포 표면에서 어떤 표적 생체분자를 발현하며, 한 번 투여량에서 그 표적 생체분자를 발현하지 않고, 상당한 양의 표적 생체분자를 발현하지 않고, 또는 세포독성 단백질의 결합 영역에 결합된 표적 생체분자 상당한 양을 노출시키지 않는 제2 세포 집단 인자에 동일한 세포독성 단백질의 투여량보다도 상기 CD50이 적어도 3배 이하 낮은값으로 사멸할 수 있다.
C. 표적화된 세포의 내부 속으로 부가적인 외인성 물질의 전달
직접적인 세포 사멸 외에도, 본 발명의 단백질은 표적화된 세포의 내부 속으로 부가적인 외인성 물질을 전달하는데 선택적으로 사용할 수 있다. 부가적인 외인성 물질 전달은, 예를 들어, 세포독성, 세포증식 억제, 정보수집, 및/또는 진단적 기능에 사용할 수 있다. 본 발명의 세포독성 단백질의 무독성 변종은, 또는 선택적 독성 변종은, 본 발명의 단백질의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합한 세포의 내부에 부가적인 외인성 물질을 전달하고/또는 그 내부를 표지하는데 사용할 수 있다. 최소 하나의 세포 표면에 표적 생체분자를 발현하는 다양한 세포 유형 및/또는 세포 집단은 외인성 물질 수용을 위하여 본 발명에 따른 단백질에 의해 표적화된다. 본 발명에 따른 기능적인 구성성분들은 모듈식이며, 다양한 시가 독소 작동체 영역 및 부가적인 외인성 물질은, 종양 세포의 비침습적인 체내 영상과 같은, 다양한 적용을 제공하기 위하여 다양한 결합영역에 연결되어 있다.
독성이든 또는 무독성이든, 그리고 그것의 촉매 비활성 형태의, 본 발명의 단백질은 결합 영역으로 인식되는 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 세포에 침투할 수 있기 때문에, 본 발명의 단백질의 몇몇 구체예는 표적된 세포의 내부 속으로 부가적 외인성 물질을 전달하는데 사용할 수 있다. 어떤 의미에서는, 단백질 전체가 세포에 침투하는 외인성 물질이다; 그러므로, "부가적인" 외인성 물질은 핵심단백질 자체는 제외하고 연결된 이종물질(heterologous materials)이다.
상기에서 사용된 "부가적인 외인성 물질"은 하나 이상의 분자와 관련되어 있으며, 원래의 표적 세포 내에 일반적으로 존재하지 않고, 본 발명에 따른 상기 단백질은 세포의 내부 속에 그러한 물질을 특이적으로 전달하는 데 사용할 수 있다. 부가적인 외인성 물질의 비제한적인 예는 세포독성제, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드, 검출 촉진제, 및 소분자 화학요법제들이다.
부가적인 외인성 물질 전달을 위한 본 발명의 단백질의 몇몇 구체예에서는, 부가적인 외인성 물질은 다음과 같은 세포독성제이다: 소분자 화학요법제, 세포독성 항생제, 알킬화제, 항대사물질, 극소이성화효소 억제제, 및/또는 튜불린 억제제. 비제한적인 세포독성제 예는 다음을 포함한다: 아지리딘, 시스플라틴, 테트라진, 프로카바진, 헥사메틸멜라민, 빈카 알칼로이드, 탁산(taxanes), 캠토테신(camptothecins), 에토포시드, 독소루비신, 미톡산트론, 테니포시드, 노보비오신, 아클라루비신(aclarubicin), 안트라사이클린(anthracycline), 악티노마이신, 블레오마이신, 플리카마이신(plicamycin), 미토마이신, 다우노루비신, 에피루비신, 아이다루비신, 돌라스타틴(dolastatins), 메이탄신(maytansines), 도세탁셀(docetaxel), 아드리아마이신, 칼리키아마이신(calicheamicin), 아리스타틴(auristatins), 피롤로벤조다이아제핀(pyrrolobenzodiazepine), 카보플라틴, 5-불소유라실(5-FU), 카페시타빈(capecitabine), 미토마이신 C, 파클리탁셀, l,3-Bis(2-chloroethyl)-l-nitrosourea(BCNU), 리팜피신, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 및 젬시타빈.
몇몇 구체예에서, 상기 부가적인 외인성 물질은 효소를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드로 이루어진다. 어떤 다른 구체예에서는, 상기 부가적인 외인성 물질은 핵산, 예를 들어 소형 억제 RNA(siRNA) 또는 마이크로 RNA(miRNA)로서 기능을 하는 RNA와 같은 핵산이다. 몇몇 구체예에서는, 상기 부가적인 외인성 물질은 박테리아 단백질, 바이러스성 단백질, 암에서 돌연변이된 단백질, 암에서 비정상적으로 발현된 단백질, 또는 T-세포 상보적 결정 영역으로부터 유도된 항원과 같은 항원이다. 예를 들어, 외인성 물질은 외인성 항원으로서 기능 할 수 있는 박테리아, 및 T-세포 상보적 결정 영역에 의해 감염된 항원제시세포의 특성화와 같은 항원을 포함한다.
D. 진단 기능을 위한 정보수집
본 발명에 따른 어떤 단백질은 시험관내 및/또는 체내에서 특정 세포, 세포 유형, 및/또는 세포 집단을 탐지하는데 사용된다. 몇몇 구체예에서는, 상기 단백질은 진단 및 치료용 모두, 또는 독자적인 진단용으로 사용된다. 동일한 세포독성 단백질이 진단용 및 치료용 모두에 사용되는 경우, 진단용 검출 촉진제를 포함한 상기 세포독성 단백질 변종은 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 통해 시가 독성 작동체 영역의 촉매 불활성에 의해 무독성이 될 수 있다. 감별 촉진제에 결합된 본 발명의 세포독성 단백질의 무독성 형태는 동일한 또는 관련된 결합 영역을 포함하는 최적 투약 방식과 함께 실행하는 진단 프로그램으로 선택적으로 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 다양한 단백질에 종래 기술에서 알려진 검출 촉진제를 결합하는 능력은 암, 종양, 면역, 및 감염된 세포 탐지를 위한 유용한 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 단백질의 이러한 진단 구체예는 종래 기술에서 알려진 다양한 영상 기술 및 분석법을 통하여 정보 수집용으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 진단 구체예는 환자 또는 생체 조직 검사 샘플에 있어서 개별 암세포, 면역 세포, 또는 감염된 세포의 세포 내 세포소기관(예를 들어, 세포 내 이입, 골지체, 소포체, 및 시토졸 영역)의 영상을 통한 정보수집용을 위해 사용할 수 있다.
정보의 다양한 유형은 상기 단백질의 진단적 용도 및 기타 용도를 위해 본 발명의 단백질의 진단 구체예를 사용해 수집할 수 있다. 이러한 정보는 예를 들어, 종양 세포 유형 진단, 환자 질병의 치료 민감성 결정, 시간에 대한 항종양 치료의 진행 분석, 시간에 대한 면역조절 치료의 진행 분석, 시간에 대한 항균성 치료의 진행 분석, 이식 물질에서 감염된 세포 측정, 이식 물질에서 원치않는 세포 측정, 및/또는 종양 덩어리의 외과적 절제 후 잔여 종양 세포의 측정에서 유용할 수 있다.
예를 들어, 환자의 부분 모(母)집단은 본 발명에 따른 상기 단백질의 진단적 변종을 사용하여 수집된 정보를 사용해 확인할 수 있으며, 개별 환자는 그러한 진단 구체예를 사용하여 밝혀진 독특한 특성에 기반해 부분 모집단에 분류할 수 있다. 예를 들어, 특정한 의약 또는 치료의 효과는 환자 부분 모(母)집단을 정의하기 위하여 사용된 기준의 한 유형일 수 있었다. 예를 들어, 본 발명의 특정한 세포독성 단백질의 무독성 진단 변종은 환자가 본 발명의 동일한 단백질의 세포독성 변종에 적극적으로 반응할 것으로 예측된 환자의 한 집단 또는 부분 모집단에 속하는지를 구별하는데 사용된다. 따라서, 본 발명의 단백질 및/또는 그의 무독성 변종을 사용한 환자 식별, 환자 계층화, 및 진단을 위하여 관련된 방법은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
IV. 본 발명의 단백질의 전체적인 구조 및 기능을 유지하는 폴리펩티드 서열에서의 변형
숙련자는 본 발명의 단백질(및 그를 부호화하는 폴리뉴클레오티드)에 생물학적 활동의 감소 없이, 즉 본 발명의 단백질의 전체적인 구조 및 기능을 유지하면서, 변형을 시킬 수 있다. 예를 들어, 어떤 변형은 발현, 정제, 약동학적 특성, 및/또는 면역원성을 가능하게 한다. 그러한 변형은 숙련자에게 자명하며, 예를 들어, 개시 부위를 제공하기 위하여 아미노산 말단에 부가된 메티오닌, 편리하게 자리 잡은 제한 부위 또는 종말 코돈을 생성하기 위해 각 말단에 위치한 부가적인 아미노산, 및 편리한 감별 및/또는 정제를 제공하기 위하여 각 말단에 퓨즈를 단 생화학 친화성 태그를 포함한다.
또한, 항원결정기 태그 또는 성분을 위한 서열과 같은 상기 아미노 및/또는 카복시 말단에서 부가적인 아미노산 잔기 포함여부도 여기에서 고려된다. 상기 부가적인 아미노산 잔기는, 클로닝 용이, 발현 용이, 번역후 변형, 합성 용이, 정제, 검출 용이, 및/또는 투약 등과 같은 다양한 목적을 위하여 사용된다. 항원결정기 태그 및 부분들의 비제한적인 예로는 다음이 있다: 키틴질 결합 단백질 도메인, 엔테로펩티다아제 절단 부위, 인자 Xa 절단 부위, FIAsH 태그, FLAG 태그, 녹색 형광 단백질(GFP), 글루타치온-S-트렌스퍼라제 부위, HA 태그, 말토즈 결합 단백질 도메인, myc 태그, 폴리히스티딘 태그, ReAsH 태그, 연쇄상 구균-태그, 연쇄상 구균-태그 II, TEV 단백분해효소 부위, 티레오독신 도메인, 트롬빈 절단 부위, 및 V5 항원결정기 태그.
상기 구체예 중 어떤 것에서, 본 발명에 따른 단백질은 폴리펩티드 영역(들)에 하나 또는 그 이상의 보존적 아미노산 치환이 도입된 변종이다. 여기에 사용된 바와 같이, "보존적 치환"이라는 용어는 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른, 생물학적으로 유사한 아미노산 잔기에 의해서 대체되는 것을 뜻한다. 실시예들은, 예를 들어, 작은 아미노산, 산성 아미노산, 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 소수성 아미노산 및 방향성 아미노산(하기 표 B 참조) 등과 같이 유사한 특성을 가진 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 일반적으로 내인성 포유류 펩티드 및 단백질에서 찾을 수 없는 잔기를 가진 보존적 치환의 예로는, 예를 들어 오르니틴, 카나바닌, 아미노에틸시스테인, 또는 다른 염기성 아미노산을 가진, 아르기닌 또는 리신 잔기의 보존적 치환이다. 펩티드 및 단백질에서의 표현형적으로 잠재적인 치환에 관한 더 많은 정보는 Bowie J et al., Science 247: 1306-10 (1990)에서 얻을 수 있다.
표 B에서의 상기 보존적 치환에서, 아미노산의 모범적인 보존적 치환은 다음과 같은 물리화학적 성질에 의해 분류된다 - I: 중성, 친수성; II: 산성 및 아미드; III: 염기성; IV: 소수성; V: 방향성, 벌키 아미노산, VI 비전하성 친수성, VII 비전하성 지방족, VIII 비전하성 비극성, IX 싸이클로알케닐-연관, X 소수성, XI 극성, XII 작은, XIII 회전-허용되는, 및 XIV 신축성. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 다음과 같은 것을 포함한다: 1)S는 C를 대체할 수 있다; 2) M 또는 L은 F를 대체할 수 있다; 3) Y는 M을 대체할 수 있다; 4) Q 또는 E는 K를 대체할 수 있다; 5) N 또는 Q는 H를 대체할 수 있다; 및 6) H는 N을 대체할 수 있다.
[표 B]
Figure pct00002
보존적 아미노산 치환의 예들
몇몇 구체예에서, 본 발명의 단백질은 치환된 폴리펩티드 영역이 측정가능한 생물학적 활동을 단독으로 또는 본 발명의 단백질의 구성성분으로서 유지하는 한, 여기에서 나열된 폴리펩티드 서열과 비교해서 많아야 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 아미노산이 치환된, 본 발명의 폴리펩티드 영역의 기능적인 단편과 변종을 포함한다. 본 발명의 단백질의 변종은, 상기 면역글로불린-유형 결합 영역 또는 상기 시가 독소 작동체 영역 내에서, 변화된 세포독성, 변화된 세포분열억제 효과, 변화된 면역원성, 및/또는 변화된 혈청 반감기와 같은 바람직한 성질을 얻기 위해, 하나 또는 그 이상의 아미노산의 변형 또는 제거 또는 삽입에 의해, 본 발명의 단백질의 폴리펩티드를 변화시키는 결과로서 본 발명의 범위 내에 있다. 발명의 단백질의 폴리펩티드는 신호 서열과 함께 또는 신호 서열 없이 존재할 수 있다.
몇몇 구체예에서는, 본 발명의 단백질은 세포독성, 세포 외 표적 생체분자 결합, 효소 촉매작용, 또는 준세포 경로화 같은 생물학적 활동을 측정할 수 있는 한, 여기에서 언급된 단백질의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가진다. 면역글로불린-유형 결합 영역은 그의 세포외 표적 생체분자에 결합 기능을 유지하는 한, 여기에서 언급된 아미노산 서열과 다를 수 있다. 결합 기능은 CDR 또는 ABR의 아미노산 서열이 동일하다면 유지될 가능성이 크다. 예를 들어, 하나의 단백질이, 아미노산 동일성의 정도를 결정하기 위해 CDR 또는 ABR를 형성하는 아미노산 잔기는 제외하고, 여기에서 언급된 단백질에 85% 아미노산 동일성을 포함하거나 또는 이를 포함하여 구성되었다면 발명의 범위 내에 있다. 결합 기능은 숙련자라면 일반적인 기술을 사용하여 알 수 있다.
몇몇 구체예에서는, 시가 독소 작동체 영역이 하나 또는 그 이상의 시가 독소 작동체 기능을 유지하고 있는 한, 시가 독소 작동체 영역은 효소 활동 및/또는 세포독성을 변화시키기 위하여 변형할 수 있다. 이러한 변화는, 결과적으로, 개조된 시가 독소 작동체 영역이 구성성분인 세포독성 단백질의 세포독성 내에서의 변화를 야기하거나 또는 야기하지 않을 수도 있다. 가능한 변형은 절단, 제거, 도치, 삽입, 재배열, 및 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 시가 독소 작동체 영역에 대한 돌연변이를 포함한다.
[165] 시가 독소군 개체의 상기 A 서브유닛의 세포독성은 돌연변이 또는 절단에 의해 변형, 감소, 또는 제거된다. 티로신-77, 글루탐산염-167, 아르기닌-170, 티로신- 114, 및 트립토판-203으로 표지된 위치는 Stx, Stx1, 및 Stx2의 촉매 활동에 중요한 것으로 나타났다(Hovde C et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72(1988); Deresiewicz R et al., Biochemistry 31: 3272-80(1992); Deresiewicz R et al., Mol Gen Genet 241 : 467-73(1993); Ohmura M et al., Microb Pathog 15: 169-76(1993); Cao C et al., Microbiol Immunol 38: 441-7(1994); Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9(1998)). 글루탐산염-167 및 아르기닌-170 양자의 돌연변이는 무세포 리보솜 비활성 분석 내에서 Slt-I A1의 효소적 활동을 제거하였다(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18(2005)). 소포체 내에서 Slt-I A1의 드 노보(de novo) 발현을 사용한 다른 접근에서, 글루탐산염-167 및 아르기닌-170 양자의 돌연변이는 그 발현 레벨에서 Slt-I A1 단편 세포독성을 제거하였다(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18(2005)). 절단 분석은 75-268의 StxA 잔기 단편이 생체 외에서도 높은 효소 활동을 보유한다는 것을 보여주었다(Haddad, J Bacteriol 175: 4970-8(1993)). 잔기 1-239를 포함하는 Slt-I A1의 절단 단편은 생체 외에서 현저한 효소 활동과 시토졸 내에서 드 노보 발현에 의한 세포독성을 보여주었다(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18(2005)). 소포체 내에서 잔기 1-239에 대하여 절단된 Slt-I A1 단편의 발현은 그것이 시토졸까지 복귀해서 이동할 수 없기 때문에 세포독성이 아니었다(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18(2005)).
시가 독소 A 서브유닛 내에서 효소 활동 및/또는 세포독성에 있어 가장 중요 잔기들은 다음과 같은 잔기 위치에 멥핑 되었다: 아스파라긴-75, 티로신-77, 글루탐산염-167, 아르기닌-170, 및 아르기닌-176 등등(Di, Toxicon 57: 535-39 (2011)). 특히, 글루탐산염-E167에서 리신 및 아르기닌-176에서 리신 돌연변이를 포함하는 Stx2A의 이중-돌연변이 구조는 완벽히 비활성화되었다: 반면, Stx1 및 Stx2 내에서의 많은 단일 돌연변이는 세포독성에 있어서 10배 감소를 보여주었다. 나아가, 1-239 또는 1-240에 대한 Stx1A의 절단은 그것의 세포독성을 감소시켰으며, 유사하게, 보존된 소수성 잔기에 대한 Stx2A의 절단은 그의 세포독성을 감소시켰다.
시가 독소 A 서브유닛 내에서 진핵세포 리보솜 결합 및/또는 진행세포 리보솜 억제에 대한 가장 중요한 잔기는 다음 잔기 위치에 지도화(mapping)되었다: 아르기닌-172, 아르기닌-176, 아르기닌-179, 아르기닌-188, 티로신-189, 발린-191, 및 류신-233 등등(McCluskey A et al, PLoS One 7: e31191(2012)).
시가-유사 독소 1 A 서브유닛 절단은 세포 내에서 발현될 때 촉매적으로 활성화되며, 시험관 내에서 리보솜을 효소적으로 비활성화할 수 있고, 세포독성을 가진다(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18(2005)). 완전한 효소 활성을 보이는 가장 작은 시가 독소 A 서브유닛 단편은 Slt1A의 잔기 1-239로 이루어진 폴리펩티드이다(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18(2005)). 비록 실체적 촉매 활성을 보유한 것으로 보고된 가장 작은 시가 독소 A 서브유닛의 단편은 StxA의 75-247 잔기(Al-Jaufy, Infect Immun 62: 956-60(1994))이지만, 진핵세포 내에서 드 누보로 발현된 StxA 절단은 시토졸까지 도달하기 위하여 잔기 240까지를 필요로 하고 리보솜의 촉매 비활성화를 행사한다(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18(2005)).
SLT-1A(SEQ ID NO:1) 또는 StxA (SEQ ID NO:2)로부터 유도된 몇몇 구체예에서는, 이러한 변화는 위치 75에서 아스파라긴, 위치 77에서 티로신, 위치 114에서 티로신, 위치 167에서 글루탐산염, 위치 170에서 아르기닌, 위치 176에서 아르기닌, 및/또는 위치 203에서 상기 트립토판의 치환을 포함한다. 그러한 치환의 예들은 위치 75에서의 아스파라긴을 알라닌으로, 위치 77에서의 티로신을 세린으로, 위치 167에서의 글루탐산염에서 글루탐산염으로, 위치 170에서의 아르기닌을 알라닌으로, 위치 176에서의 아르기닌을 리신으로, 및/또는 위치 204에서의 트립토판을 알라닌으로 하는 것과 같은 선행기술에 기초한 것으로 본 발명이 속한 기술 분야의 숙련자들에게는 자명하게 알려진 사실이다.
본 발명의 단백질은 선택적으로 하나 또는 그 이상의 부가적인 물질과 결합할 수 있고, 이 물질은 이 명세서에 설명된 물질도 포함된 본 발명에 속한 기술 분야에서 치료 및/또는 진단적 물질을 포함할 수 있다.
V. 본 발명의 단백질의 생산, 제조, 및 정제
본 발명의 단백질은 본 발명이 속한 기술 분야에서 잘 알려진 생화학적 제조 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 세포독성은 표준 합성 방법, 재조합 발현 시스템의 사용, 또는 다른 적절한 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 단백질은 융합 단백질, 화학적으로 결합된 결합체, 및/또는 그의 조합물(예:하나 또는 그 이상의 구성성분과 공유 결합한 융합 단백질 구성성분)로 생산될 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질은 다음과 같은 과정을 포함한 다양한 경로로 합성될 수 있다: (1) 표준 고상 또는 액상 방법론, 단계적 또는 단편 조합, 및 최종 펩티드 화합물 격리 및 정제를 사용한 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 구성성분 합성; (2) 숙주 세포 내에서 본 발명의 단백질의 폴리펩티드 성분을 부호화하는 폴리뉴클레오티드 발현 및 숙주 세포 또는 숙주 세포 배지로부터 상기 발현 산물 회수(recover); 또는 (3) 본 발명의 단백질의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 무세포 시험관내 발현, 및 상기 발현 산물 회수; 또는 상기 펩티드 성분의 단편을 얻은 다음, 상기 펩티드 성분을 얻기 위해 단편들을 연결(예: 결찰), 그리고 상기 펩티드 성분을 회수하기 위한 (1), (2) 또는 (3)의 방법의 조합.
고체상 또는 액체상 폴리펩티드 합성 방법에 의하여 본 발명의 단백질의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 성분을 합성하는 것이 더 바람직할 수 있다. 본 발명의 단백질은 표준 합성 방법으로 적합하게 제조할 수 있다. 따라서, 펩티드는 표준 고체상 또는 액체상 방법론, 단계적 또는 단편 조합, 및 최종 펩티드 산물 격리 및 정제에 의해 상기 펩티드를 합성하는 것을 포함한 방법 등으로 합성할 수 있다. 이러한 맥락에서, 참고문헌은 WO 1998/11125 또는, 그 중에서도, Fields G et al, 고상 펩티드 합성의 원리 및 실습(Synthetic Peptides, Grant G, ed., Oxford University Press, U.K., 2nd ed., 2002) 및 그에 따른 상기 합성 실시예들로 이루어졌다.
본 발명의 단백질은 당업계에서 잘 알려진 재조합 기술을 사용하여 제조(생산 및 정제)된다. 일반적으로, 상기 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡타로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포 배양 및 세포 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 것은 Sambrook J 등이 서술한 "분자 클로닝: 실험실 메뉴얼"(Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, U.S., 1989)과 Dieffenbach C 등의 "PCR 프라이머: 실험실 메뉴얼("Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., U.S., 1995)등에 기재되어 있다. 적합한 숙주 세포라면 어느 것이라도 본 발명의 단백질을 생산하기 위해 사용할 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리펩티드를 발현을 유도하는 하나 또는 그 이상의 벡터로 인하여 안정적이거나 일시적으로 형질감염, 형질전환, 형질도입 또는 감염될 수 있다. 나아가, 본 발명의 단백질은, 변화된 세포독성, 변화된 세포분열억제 효과, 변화된 면역원성, 및/또는 변화된 혈청 반감기와 같은, 바람직한 성질을 얻기 위해서 하나 이상의 아미노산 변형 또는 하나 이상 아미노산의 제거 또는 삽입 결과를 야기하는 본 발명의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 변형에 의해 생산될 수 있다.
본 발명의 단백질을 생산하기 위해 선택될 수 있는 광범위하고 다양한 발현 시스템이 존재한다. 예를 들어서, 본 발명의 단백질의 발현을 위한 숙주 유기체는 대장균 및 B 서브틸리스와 같은 원핵생물 및 효모, 곰팡이(S. cerevisiae, P. pastoris, A. awamori, 및 K. lactis)같은 진핵세포, 조류(C. reinhardtii), 곤충 세포주, (CHO 세포와 같은)포유류 세포, 식물 세포주, 및 형질전환 식물(A. thaliana and N. benthamiana)과 같은 진핵세포 유기체를 포함한다.
따라서, 본 발명은 상기 언급된 방법 및 (i) 본 발명의 단백질 또는 그의 폴리펩티드 구성성분을 전부 또는 부분적으로 부호화하는 폴리뉴클레오티드, (ii) 적합한 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템에 도입되었을 때 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드 구성성분의 일부 또는 전부 부호화할 수 있는 최소 하나의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한 발현 벡터, 및/또는 (iii) 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함한 숙주세포를 사용하여 본 발명의 단백질을 생산하는 방법 또한 제공한다.
폴리펩티드 또는 단백질이 숙주 세포 또는 무세포 시스템에서 재조합 기술을 사용하여 발현되는 경우에 있어서, 그것은 숙주 세포 인자와 같은, 숙주 세포 다른 구성성분으로부터, 고순도 또는 실질적으로 균질한 제제를 얻기 위하여 바람직한 폴리펩티드 또는 단백질을 분리(또는 정제)하는 것이 유리하다. 정제는 원심분리 기술, 추출 기술, 크로마토그라픽 및 분별 기술(예를 들어, 겔 여과에 의한 크기 분리, 이온-교환 컬럼에 의한 전하 분리, 실리카 및 DEAE 등과 같은 양이온-교환 수지 상 크로마토그라피, 크로마토포커싱, 및 오염물질 제거를 위한 단백질 A 세파로오스 크로마토그라피), 및 침전 기술(예를 들어, 에탄올 침전 또는 황산 암모늄 침전)과 같은 당업계에서 잘 알려진 방법에 의해 실행될 수 있다. 수많은 생화학적 정제 기술은 본 발명에 따른 시가 독소 작동체 영역 폴리펩티드 및 단백질의 순도를 증가시키기 위해 사용할 수 있다. 몇몇 구체예에서는, 본 발명에 따른 상기 폴리펩티드 및 단백질은 선택적으로 호모-다중결합 형식(즉, 두 가지 이상의 동일한 단백질의 단백질 복합체) 또는 헤테로-다중결합 형식(즉, 두 가지 이상의 다른 단백질의 단백질 복합체)으로 정제할 수 있다.
하기의 실시예는 본 발명의 단백질 생산 방법의 비제한적인 예를 설명하며, 또한 모범적인 세포독성 단백질 생산을 위한 상세하지만 비제한적인 측면의 기재이다.
VI. 본 발명의 단백질을 포함하는 약학적 및 진단 조성물
본 발명은 약학적 조성물 내에서, 단독으로 또는 하나 이상의 부가적인 치료 제제와 결합해서, 증상, 질병, 장애, 또는 하기에 상세히 기재된 증상(예를 들어, 암, 악성 종양, 비-악성 종양, 성장 이상, 면역 장애, 및 미생물 감염)의 치료 또는 예방을 위한 용도로 사용되는 단백질을 제공한다. 나아가 본 발명은, 본 발명의 단백질, 또는 약학적으로 적용 가능한 염 또는 그에 따른 용매화합물과 적어도 하나의 본 발명에 따른 약학적으로 적용 가능한 운반체, 부형체, 또는 매개체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 단백질의 호모-다중결합 및/또는 헤테로-다중결합 형태을 포함한다. 상기 약학적 조성물은 질병, 증상, 장애, 또는 하기에 상세히 기재된 이상징후에 대한 치료, 개선, 또는 예방의 방법에 유용할 것이다. 그러한 질병, 증상, 장애, 또는 징후 각각은 본 발명에 따른 약학적 조성물 용도의 관점에서 분리된 구체예로 구상된다. 나아가, 본 발명은 하기에 더욱 상세히 기재되는, 본 발명에 따른 적어도 하나의 치료 방법에서의 사용을 위한 약학적 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는, "환자(patient)" 및 "피험체(subject)" 라는 용어는, 적어도 하나의 질병, 장애, 또는 증상의 징후, 신호, 및/또는 조짐을 나타내는, 인간 및 동물과 같은 보통의 척추동물인 어느 유기체와 관련하여 교대해서 사용된다. 이러한 용어는 영장류, 가축(예를 들어, 소, 말, 돼지, 양, 염소 등), 애완 동물(예를 들어, 고양이, 개 등) 및 실험 동물(예를 들어, 생쥐, 토끼, 쥐 등)의 비제한적 실시예로서 포유류를 포함한다.
이 명세서에 기재된 "치료" "처치" 또는 "치료법" 및 그와 유사한 단어는 유용하거나 바람직한 임상 결과를 얻기 위한 접근방법과 관련되어 있다. 상기 용어는 증상, 질병 또는 장애의 발병 또는 발달 속도를 지연시키고, 그것과 관련된 증상을 감소시키거나 약화시키고, 상기 증상의 완벽하거나 부분적인 퇴행을 생성하거나, 상기 언급된 방법의 조합을 하는 것과 관련되어 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 유용하거나 바람직한 임상 결과들은, 감지되든 감지되지 않든, 증상의 감소 또는 약화, 질병 규모의 감소, 질병 상태의 안정화(예를 들어, 악화가 아닌), 질병 진행의 지연 또는 속도 감소, 상기 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 차도(부분적 또는 전체)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. "치료", "처치", 또는 "치료법"은 또한 만약 치료를 받지 않는 경우, 예상 생존기간에 상대적인 생명연장을 의미할 수도 있다. 치료가 필요한 피험체(예를 들어, 인간)는 따라서 상기 질병 또는 장애를 가진 피험체이다. 상기 "치료", "처치", 또는 "치료법"은 병적 상태 또는 치료의 부재에 상대적인 증상의 강도를 억제하거나 감소하는 것을 포함하며, 반드시 상기 관련된 질병, 장애, 또는 증상의 완벽한 중단을 의미하는 것은 아니다. 종양 및/또는 암과 관련하여, 치료는 전체적인 종양 덩어리 및/또는 개개 종양 사이즈에서의 감소를 포함한다.
이 명세서에 기재된, "방지" 또는 "예방" 및 그와 유사한 용어는 증상, 질병, 또는 장애의 발달을 예방하거나 병리학적으로 변형시키기 위한 접근방법과 관련된다. 따라서, "예방"은 예방적인 조치와 관련된다. 본 발명의 목적을 위하여, 유용하거나 바람직한 임상 결과들은, 감지되든 감지되지 않든, 질병 진행 또는 발전, 증상의 예방 또는 속도 감소를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 예방이 필요한 피험체(예를 들어, 인간)는 따라서 상기 질병 또는 장애가 아직 없는 피험체이다. 상기 "예방"은 병적 상태 또는 치료의 부재에 상대적으로 발병을 늦추는 것을 포함하며, 반드시 상기 관련된 질병, 장애, 또는 증상의 완벽한 예방을 의미하는 것은 아니다. 따라서 증상의 "방지" 또는 "예방"은 어떤 문맥에서는 상기 증상 발생의 위험도를 감소시키거나, 상기 증상과 연관된 징후의 발전을 방지하거나 지연하는 것과 관련된다.
이 명세서에서 사용된, "효과적인 용량" 또는 "치료적으로 효과적인 용량"은, 표적 증상을 예방하거나 치료하고 또한 상기 증상과 연관된 징후를 이롭게 완화 시키는 것과 같이, 개체에 적어도 하나의 바람직한 치료 효과를 생산하는 조성물(예를 들어, 치료적 조성물 또는 제제)의 용량 또는 복용량이다. 가장 바람직한 치료적으로 효과적인 용량은 주어진 필요로 하는 피험체에 따라서 본 발명에 속한 기술 분야의 숙련자가 선택한 특정한 치료의 바람직한 효험을 보이는 용량이 될 것이다. 이러한 용량은, 치료 화합물(활성, 약리성, 약력학, 및 생물학적 이용가능성을 포함한)의 특성, 상기 개체의 생리학적 조건(연령, 성별, 질병 유형, 질병 단계, 일반적인 물리적 조건, 주어진 복용량에 반응정도, 및 약물 유형), 혼합제에서 상기 약학적으로 적용가능한 캐리어, 및 투약 경로에 의해 정해지는 것을 포함한, 하지만 이에 한정되는 것은 아닌, 상기 숙련자가 이해한 다양한 요인에 의하여 다를 것이다. 임상 및 약학 분야의 숙련자는 일정한 실험, 즉 화합물의 적용과 복용량의 적정에 대한 피험체의 반응을 모니터하여 치료적으로 효과적인 용량을 결정할 수 있을 것이다(Remington: The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro A, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, U.S., 19th ed., 1995) 참조).
본 발명의 진단 조성물은 본 발명의 단백질 및 하나 이상의 검출 촉진제를 포함한다. 동위원소, 염료, 비색 제제, 조영 강화 제제, 형광 제제, 생물발광제, 및 자기 제제와 같은 다양한 검출 촉진제가 당업계에 알려져 있다. 이러한 제제들은 어떠한 위치에서도 본 발명의 단백질 내부 속으로 합체될 수 있다. 상기 제제의 합체는 본 발명의 단백질의 아미노산 잔기를 통하거나 링커 및/또는 킬레이터(chelator)를 통해서일 수 있다. 상기 제제의 합체는 검진(screen), 분석, 진단 과정, 및/또는 영상 기술 내에서 상기 진단 조성물 제재의 검출을 가능하게 하는 방법이다.
본 발명의 진단 조성물을 생성 또는 제조할 때, 본 발명의 단백질은 직접적으로 또는 간접적으로 하나 이상의 검출 촉진제와 연결될 수 있다. 숙련자들에게는 기관의 질병, 장애, 또는 증상에 대한 진단 및/또는 예측 적용과 같은 것을 위한 정보를 수집을 위해 본 발명의 단백질에 연결할 수 있는 수많은 검출 촉진제들이 알려져 있다(예: Cai W et al., J Nucl Med 48: 304-10(2007); Nayak T, Brechbiel M, Bioconjug Chem 20: 825-41(2009); Paudyal P et al., Oncol Rep 22: 115-9(2009); Qiao J et al., PLoS ONE 6: el8103(2011); Sano K et al., Breast Cancer Res 14: R61(2012) 참조). 예를 들어, 검출촉진제는 다음을 포함한다: 형광 색소(예: 알렉사680, 인도시아닌녹색, 및 Cy5.5)와 같은 영상 조영제; 11C, 13N, 15O, 18F, 32P, 51Mn, 52mMn, 52Fe, 55Co, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 72As, 73Se, 75Br, 76Br, 82mRb, 83Sr, 86Y, 90Y, 89Zr, 94mTc, 94Tc, 99mTc, 110In, 111In, 120I, 123I, 1241, 125I, 131I, 154Gd, 155Gd, 156Gd, 157Gd, 158Gd, 177Lu, 186Re, 188Re, 및 223R과 같은 방사성 동위원소; 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐 (II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III) 또는 에르븀(III)과 같은 상자성 이온; 라타늄(III), 금 (III), 납(II), 및 창연(III)과 같은 금속; 리포솜과 같은 초음파-조영제; 바리움, 갈리움 및 탈리움 화합물과 같은 방사선 불투과성 제제. 검출 촉진제는 2-벤질 DTPA, PAMAM, NOTA, DOTA, TETA, 그에 따른 유사체와 같은 킬레이터, 및 상기 언급한 것들과 기능적 균등체와 같은 매개체 기능 그룹을 사용하여 직접적으로 또는 간접적으로 합체할 수 있다(Leyton J et al., Clin Cancer Res 14: 7488-96 (2008)).
본 발명이 속한 기술분야의 숙련자들에게는, 특히 면역글로불린 및 면역글로불린-유도 도메인에, 다양한 감별 촉진 제제를 단백질에 합체, 접착, 및/또는 결합(conjugate)하는 수많은 표준 기술들이 있다(Wu A, Methods 65: 139-47 (2014)). 유사하게, 의학 분야에 흔히 사용되는 비침습적인 생체 내 영상 기술과 같은, 수많은 영상 접근법이 당업자들에게 알려져 있으며, 예로는: 토모그라피 화상 분석기(CT 스캐닝), 광학 촬영(직접 촬영, 형광 촬영, 및 생물발광 촬영 포함), 자기 공명 촬영(MRI), 양전자 방사 단층 촬영(PET), 단일-광자 방출 단층 촬영(SPECT), 초음파, 및 x-선 전산화 단층 촬영이 있다(Kaur S et al., Cancer Lett 315: 97-111(2012) 참조).
본 발명의 단백질을 포함한 약학적 및/또는 진단 조성물 생성 및 제조
본 발명의 단백질의 약학적으로 적용가능한 염 또는 용매화합물은 마찬가지로 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 내용 중 “용매 화합물”이라는 용어는 용질(본 발명에 따른 펩티드 화합물 또는 약학적으로 적용가능한 염) 및 용매 사이에 형성된 화학량론으로 정의되는 복합체를 말한다. 이러한 연결에서 상기 용매는, 예를 들어, 물, 에탄올 또는 다른 약학적으로 적용가능한, 아세트산 또는 젖산과 같은 하지만 이에 제한되지 않는, 전형적으로 소형-분자의 유기 종류일 수 있다. 상기 용매가 물인 경우, 그러한 용매 화합물은 일반적으로 수화물이라 언급된다.
본 발명의 단백질, 또는 그에 따른 염들은 약학적으로 허용가능한 운반체 내에서 본 발명의 화합물 또는 그에 따른 염의 일반적으로 치료적으로 효과적인 용량을 포함한 보존 및 투약을 위한 약학적 조성물로 배합(formulated)할 수 있다. 상기“약학적으로 허용가능한 운반체”는 표준 약학적 운반체를 모두 포함한다. 치료용의 약학적으로 허용가능한 운반체는 약학 기술 분야에서 널리 알려져 있으며, 예를 들어, 레밍톤의 '제약학'에 기재되어 있다(A. Gennaro, ed., 1985). 상기“약학적으로 허용가능한 운반체”는 예를 들어, 호환제, 용매, 분산매, 코팅제, 항미생물제, 등장제성, 및 흡수지연제, 및 그와 유사한 제제와 같은 모든 생리학적으로 허용가능한 운반체를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 운반체 또는 희석제는 경구용, 항문용, 비강용 또는 비경구용(피하조직, 근육, 정맥, 피부 내, 및 경피를 포함) 투약을 위하여 적절한 배합으로 사용하는 것을 포함한다. 모범적인 약학적으로 허용가능한 운반체는 멸균 주사액 또는 분산제의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산제 및 멸균 분말을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 쓸 수 있는 적절한 수성 및 비수성 운반체의 예는 물, 에탄올, 폴리올스(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 및 그와 유사체와 같은), 및 그에 따른 적정 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 및 에틸올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르를 포함한다. 적정한 유동성은, 예를 들어, 분산제의 경우 필요 입자 크기를 유지하기 위한 레세틴과 같은 코팅 물질을 사용하는 것과 계면활성제를 사용하는 것으로 유지할 수 있다. 본 발명의 몇몇 구체예에서는, 상기 운반체는 정맥, 근육내, 피하, 비경구용, 척추용 또는 표피 투약(예를 들어, 주사 또는 수액에 의해)에 적절하다. 선택된 투약 경로에 따라서, 본 발명의 단백질 또는 다른 약학적 성분은 특정 투약 경로로 환자에게 투약했을 때 겪을 수 있는 낮은 pH 및 다른 자연적 불활성 증상으로부터 상기 화합물을 방어하기 위한 목적 물질로 코팅될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 배합은 편리하게 단위 투약 제제 형태로 낼 수 있으며, 약학 분야에서 널리 알려진 방법으로 만들 수 있다. 그러한 형태에서는, 조성물은 활성 성분의 적정 함량을 포함한 단위 투약 제제로 나눠진다. 상기 단위 투약 제제는, 예를 들어, 포장된 타블렛형, 캡슐형, 및 병 또는 앰플 분말형과 같이 개별 포장을 포함한 패키지형일 수 있다. 상기 단위 투약 제제는 캡슐형, 카시에형, 또는 자체 타블렛형일 수도 있으며, 포장 형식 중 어느 것이든 그것의 적절한 수량일 수 있다. 이는 펜 형식과 같은 단일 투약 주사 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 투약의 적절한 경로 및 수단을 위하여 배합될 수 있다. 피하 또는 경피 투약 방법은 여기에 기술된 치료 단백질에 특히 적합할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제 또한 포함할 수 있다. 미생물이 생기지 않도록 하는 예방은 멸균 과정 및, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산, 및 그와 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 포함하는 것으로 보장될 수 있다. 설탕, 염화나트륨 등과 같은 등장액 또한 바람직하다. 나아가, 주사 가능한 약제 형태의 장기 지속형 흡수는 알루미늄 스테아린산염 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 제제를 포함함으로써 유발할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 선택적으로 약학적으로 허용가능한 산화방지제 또한 포함한다. 모범적인 약학적으로 허용가능한 산화방지제는 아스코르브산, 염화수소 시스테인, 황산수소나트륨, 메티중아황산 나트륨, 아황산 나트륨과 같은 수용성 산화방지제; 아스코르빌 팔미트산염, 뷰틸하이드록시아니솔(BHA), 부틸 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필갈레이트, 알파-토코페롤 등과 같은 지용성 산화방지제; 및 구연산, 에틸렌디아민 티트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 주석산, 인산 등과 같은 금속 킬레이트제 등이 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 단백질 하나 또는 다른 단백질의 조합, 또는 에스테르, 앞서 기재된 것의 염 또는 아미드, 및 최소 하나의 약학적으로 허용가능한 운반체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
치료 조성물은 일반적으로 멸균상태이며 제조 및 보존의 환경하에서 안정적이다. 상기 조성물은 용액, 마이크로 에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정돈된 구조로서 배합할 수 있다. 상기 운반체는 예를 들어, 물 또는 알코올 또는 적정한 혼합물을 포함한 용매 또는 분산제가 될 수 있으며, 상기 알코올은 에탄올, 폴리올(예를 들어, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜) 등이 될 수 있다. 적정한 유동성은 당업계에 잘 알려진 배합 화학(formulation chemistry)에 따라, 예를 들어, 분산제의 경우 필요 입자 크기를 유지하기 위한 레세틴과 같은 코팅을 사용하는 것과 계면활성제를 사용하는 것으로 유지할 수 있다. 본 발명의 몇몇 구체예에서는, 설탕, 마니톨, 소르비톨과 같은 폴리알코올, 또는 염화 나트륨과 같은 등장액이 조성물에 바람직할 수 있다. 주사 가능한 조성물의 지속적인 흡수는 스테아린산 염 및 젤라틴과 같은 조성물 내에서 흡수를 지연시키는 제제를 포함시킴에 의해 발생시킬 수 있다.
피내 또는 피하 적용을 위하여 사용되는 용액 또는 현탁액은 일반적으로 하나 이상의 다음과 같은 물질을 포함한다: 주사용 증류수, 식염수, 불휘발성유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르빅산 또는 황산수소나트륨과 같은 산화방지제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 구연산염, 또는 인산염과 같은 완충제; 및 염화나트륨 또는 덱스트로즈와 같은 긴장성 조절제. 상기 pH는 염산, 수산화 나트륨과 같은 산성 또는 염기성, 또는 구연산염, 인산, 아세트산 및 그와 유사한 염을 가진 완충제로 조절할 수 있다. 그러한 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 주사기 또는 주사액 병 내에 밀봉될 수 있다.
멸균된 주사 가능한 용액은, 상기에 언급된 성분 또는 그 성분들의 조합에 본 발명의 단백질을 필요 용량을 함유한 적절한 용매를 더하여 제조할 수 있으며, 이에 뒤이어 멸균 여과 과정을 거쳐야 한다. 분산제는 분산매 및 상기에 명시된 것과 같은 그 외 요소를 포함한 멸균 전파체에 활동적인 화합물을 합체시켜 제조할 수 있다. 무균 주사 가능액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 멸균-여과 용액으로부터 바람직한 첨가 성분에 더불어 활성 성분의 분말을 생산하는, 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)하는 것이다.
본 발명의 단백질의 치료적으로 효과적인 용량이 예를 들어, 정맥, 피부 또는 피하 주사로 투여되도록 설계되었을 경우, 결합제제는 무발열원(pyrogen-free), 비경구적으로 허용가능한 수용성 용액의 형태일 것이다. 적정 pH, 등장액, 안정성 등을 고려한 비경구적으로 허용가능한 단백질 용액 제조 방법은 당업계에 포함된 기술이다. 정맥, 피부 또는 피하 주사를 위한 바람직한 약학적 조성물은 결합체와 더불어, 염화 나트륨 주사와 같은 등장성 전파체, 링거 주사, 덱스트로즈 주사, 덱스트로즈 및 염화 나트륨 주사, 유산을 가한 링거 주사(lactated Ringer's injection), 또는 당업계에 알려진 다른 전파체를 포함할 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 안정제, 보존제, 완충에, 산화방지제, 또는 본 기술 분야에서 널리 알려진 다른 첨가제 또한 포함할 수 있다.
이 명세서의 다른 부분에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 단백질 또는 그것의 합성물(예: 약학적 또는 진단 조성물)은 임플란트, 경피 패치, 및 미립캡슐화된 전달 시스템을 포함한 조절된 방출 제제와 같은 급속제 방출로부터 상기 화합물을 보호할 운반체를 포함하여 제조되었을 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오소에스테르, 및 폴리 유산과 같은 생물분해성, 생체적합성 폴리머가 사용할 수 있다. 그러한 제제의 수많은 제조 방법은 특허를 받았거나 본 기술 분야의 전문가들에게 일반적으로 널리 알려져 있다(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(Robinson J, ed., Marcel Dekker, Inc., NY, U.S., 1978) 참조).
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 합성물(예: 약학적 또는 진단 조성물)은 생체 내에서 바람직한 분포(distribution)를 보장하기 위해 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 혈액 뇌관문은 많은 커다란 및/또는 소수성 화합물을 배제한다. 생체 내 특정 위치에서 본 발명의 치료적 단백질 또는 화합물을 표적화 하기 위하여, 예를 들어, 특정 세포 또는 기관에 운반되는 하나 이상의 모이어티들(moieties)을 포함한 리포솜 내에서 제조될 수 있고, 따라서 표적 약물 전달을 강화한다. 모범적인 표적 모이어티는 엽산 또는 비오틴; 메노사이드; 항체; 계면활성제 단백질 A 수용체; p120 카테닌 및 그의 유사체를 포함한다.
약학적 조성물은 임플란트 또는 미립자 시스템으로 사용하기 위하여 설계된 비경구적인 제제를 포함한다. 임플란트의 예는 유탁액, 이온 교환 수지, 및 용해성 염 용액과 같은 고분자 또는 소수성 성분으로 이루어진 데포(depot) 제제이다. 미립자 시스템의 예는 덴드리머, 리포솜, 마이크로스피어, 극미립자, 나노캡슐, 나노입자, 나노로드, 나노스피어, 중합의 미셀(polymeric micelles), 및 나노튜브이다(Honda M et al., Int J Nanomedicine 8: 495-503(2013); Sharma A et al., Biomed Res Int 2013: 960821(2013); Ramishetti S, Huang L, Ther Deliv 3: 1429-45(2012) 참조). 방출 조절형 제제는 리포솜, 폴락사머 407, 및 수산화인회석과 같은 이온에 민감한 폴리머를 사용하여 제조될 수 있다. 미립자 및 폴리머 제제는 예를 들어, 세포용해소, 독소-유래 제제, 바이러스 유래 제제, 합성 생체 모방 펩티드, 및 화학제제와 같은, 다양한 펩티드 및 단백질 같은 형질막 투과성 변형제(altering agent)를 포함할 수 있다(Varkouhi et al., J Control Release 151: 220-8(2011); J Pirie C et al., Mol Cancer Ther 12: 1774-82(2013) 참조).
VII. 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 및 숙주 세포
본 발명의 단백질 외에, 상기 단백질 또는 그것의 기능 부분을 부호화하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 범위 내에 있다. 상기 "폴리뉴클레오티드" 라는 용어는 DNA의 중합체, RNA의 중합체, 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성된 이러한 DNA, RNA의 유사체, 및 유도체, 단편 및 그에 따른 상동체를 포함하는 "핵산"이라는 용어와 동등하다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 단일-, 이중-, 또는 삼중-나선 일 수 있다. 서술된 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, RNA 코돈의 세번째 위치에서는 용인되는 것으로 알려진 흔들림(wobble)을 고려하여, 표본적인 본 발명의 단백질을 인코딩하면서, 다른 RNA 코돈으로서 동일한 아미노산을 코딩할 수 있는 모든 폴리뉴클레오티드를 포함도록 명확하게 개시되어 있다(Stothard P, Biotechniques 28: 1102-4(2000) 참조).
하나의 관점에서, 본 발명은 본 발명의 단백질, 또는 단편 또는 그의 유도체를 부호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 본 발명의 단백질의 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 폴리펩티드와 적어도 50%, 55% , 60% , 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 이상 동일한 폴리펩티드를 부호화하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명은 본 발명의 단백질, 또는 단편 또는 그에 따른 유도체, 또는 그러한 서열의 안티센스 또는 보충제를 부호화하는 폴리뉴클레오티드에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화되는 뉴클레오티드 서열로 이뤄지는 폴리뉴클레오티드 또한 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드(또는 단백질)의 유도체 또는 유사체는, 그 중에서도, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 단백질에 실질적으로 상동하는 영역, 예를 들어, 본 기술 분야에서 전산화 상동성 프로그램으로 알려진 방법에 의해 실행된 정렬에서 정렬된 서열과 비교해볼 때, 또는 상기 동일 사이즈의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 약 45%, 50%, 70%, 80%, 95%, 98%, 또는 심지어 99%의 동일성을 가진 영역을 가진 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 모범적인 프로그램은 Smith T, Waterman M, Adv. Appl. Math. 2: 482-9(1981)의 상기 알고리즘을 사용하고, 디폴트 세팅을 사용한, GAP 프로그램이다(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI, U.S.). 또한 엄격한 조건하에서 본 발명의 단백질을 부호화하는 서열의 성분에 혼성화 할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다(Ausubel F et al, Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, New York, NY, U.S., 1993) 참조). 엄격한 조건은 당업계의 숙련자들에게 널리 알려져 있으며 분자 생물학에서 현재의 규약을 발견할 수도 있다(John Wiley & Sons, NY, U.S., Ch. Sec. 6.3.1-6.3.6(1989)).
나아가 본 발명은 본 발명의 범위 내의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 단백질을 부호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터를 생산하는 기술 분야에서 널리 알려진 물질과 방법을 사용하여, 박테리아 플라스미드, 바이러스 벡터 및 파지 벡터를 포함한 알려진 벡터 속으로 삽입될 수 있다. 그러한 발현 벡터는 어떠한 선택된 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템 내에서 본 발명의 단백질의 생산을 지원하기 위해서는 필수인 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다(하기 실시예에서 설명된 pTxb1 및 pIVEX2.3). 특정한 유형의 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템에 사용되는 발현 벡터를 포함한 특정 폴리뉴클레오티드는 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있으며, 규칙적인 실험을 사용하여 결정될 수 있고, 구매될 수 있다.
이 명세서에서 사용되는 "발현 벡터”라는 용어는 하나 이상의 발현 단위를 포함하는, 선형 또는 원형의 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 상기 “발현 단위”는 대상 폴리펩티드를 부호화하는 폴리뉴클레오티드 조각을 의미하고, 숙주 세포 내에서 핵산 부분의 발현을 제공할 수 있다. 발현 단위는 일반적으로, 작동되는 형태의, 전사 프로모터, 대상 폴리펩티드를 부호화하는 오픈 리딩 프레임, 및 전사 종결 인자를 포함한다. 발현 벡터는 하나 이상의 발현 단위를 포함한다. 따라서, 본 발명에서, 단일 폴리펩티드 사슬(예를 들어, 시가 독소 작동체 영역과 유전적으로 재조합된 scFv)를 포함하는 단백질을 인코딩하는 발현 벡터는 적어도 하나의 단일 폴리펩티드 사슬용 발현 단위를 포함하는데 반면, 예를 들어 두 가지 이상의 폴리펩티드 사슬(예를 들어, VL 도메인을 포함하는 한 사슬 및 독소 작동체 영역에 연결된 VH 도메인을 포함한 두 번째 사슬)을 포함하는 단백질은, 단백질의 두 개의 폴리펩티드 사슬 각각을 위한, 최소 두 개의 발현 단위를 포함한다. 본 발명의 다중-사슬 단백질의 발현을 위하여, 각 폴리펩티드 사슬용 발현 단위는 다른 발현 벡터 상에 따로 포함될 수 있다(예를 들어, 발현은 각 폴리펩티드 사슬을 위한 발현 벡터와 숙주 세포와 함께 이루어질 수 있다).
폴리펩티드 및 단백질의 일시적이거나 안정적인 발현을 지휘할 수 있는 발현 벡터는 본 기술 분야에 널리 알려져 있다. 상기 발현 벡터는 일반적으로 다음의 것들을 하나 이상 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다: 이종신호순서(heterologous signal sequence) 또는 펩티드, 복제 원형, 하나 이상의 표지유전자, 개선제, 촉진제, 및 전사 종결 시퀸스, 이들 모두 본 기술 분야에 널리 알려져 있다. 선택적으로 사용할 수 있는 조절 제어 순서(regulatory control sequences), 통합 순서 및 유용한 마커들은 본 발명이 속한 기술 분야에 알려져 있다.
상기의 “숙주 세포”란 용어는 발현 벡터의 복제 또는 발현을 지지할 수 있는 세포를 뜻한다. 숙주 세포는 대장균과 같은 원핵세포일 수도 있고, 진핵세포(예를 들어, 효모, 곤충, 양서류, 조류, 또는 포유류 세포)일 수도 있다. 본 발명의 단백질을 생산할 수 있거나 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포주의 생성 및 분리는 본 기술 분야에서 표준적인 기술을 사용하여 완수할 수 있다.
본 발명의 범위 내에 있는 단백질은, 숙주 세포의 최상의 발현과 같은 바람직한 성질을 얻는데 더 적합하게 만들기 위하여 본 발명의 단백질을 부호화하는 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 아미노산을 변형 또는 삭제 또는 하나 이상의 아미노산을 삽입하여 조정하는 것으로 생산된, 여기에 기술된 단백질의 변종 또는 유도체일 수 있다.
VIII. 전달 장치 및 키트
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 본 발명은 피험체에 전달을 위한 약학적 조성물과 같은, 본 발명에 따른 하나 이상의 구성 성분을 포함하는 장치와 관련된다. 따라서, 본 발명의 하나 이상의 화합물을 포함하는 전달 장치는 다음과 같은 다양한 전달 방법으로 본 발명의 조성물을 환자에 투여하는데 사용할 수 있다: 정맥, 피하, 근육 또는 복강 주사; 경구 투약; 경피 투약; 폐 또는 점막 투약; 임플란트, 삼투압 펌프, 카트리지 또는 미세 펌프; 또는 본 기술 분야의 숙련자에게 알려진 다른 수단에 의한 방법.
적어도 하나의 본 발명에 따른 조성물을 포함한 키트 또한 본 발명의 범위 내에 있으며, 선택적으로, 사용을 위한 포장 및 설명서도 본 발명의 범위 내에 있다. 키트는 약물 투약 및 진단정보 수집에 유용할 수 있다. 본 발명의 키트는 선택적으로 적어도 하나의 부가적인 시약(예를 들어, 표준 시약, 마커 등과 같은)을 포함할 수 있다. 키트는 전형적으로 상기 키트의 내용물의 의도된 사용법을 명시하는 표를 포함한다. 나아가 상기 키트는 여기에 기재된 바와 같은 본 발명의 화합물, 조성물 또는 관련된 방법을 사용하는 치료적인 전략에 반응하는 군에 환자가 속하는지 여부를 진단하거나, 샘플 또는 피험체 내에서, 세포 유형(예를 들어, 종양 세포)을 검출하기 위한 시약 및 다른 수단을 포함한다.
IX. 본 발명의 단백질 또는 그에 따른 조성물을 사용하기 위한 방법
일반적으로, 본 발명의 목적은 약리적인 활성제를 제공하며 또한 그것을 포함한 조성물을 제공하는 것인데, 이것은 질병, 장애, 및 어떠한 암, 종양, 성장 이상, 면역 장애, 또는 여기에서 언급된 병리적인 증상과 같은 증상의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 표적화된 세포의 사멸, 표적화된 세포 속으로 부가적인 외인성 물질 전달, 표적화된 세포 내부의 표지, 진단 정보 수집, 및 질병, 장애, 및 여기에서 언급된 증상의 치료를 위하여 본 발명의 단백질 및 약학적 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
특히, 본 발명의 목적은 본 기술 분야에서 현재 알려진 제제, 조성물, 및/또는 방법과 비교했을 때 이점이 있는, 그러한 약리적인 활성화제, 조성물, 및/또는 방법을 제공하기 위함이다. 따라서, 본 발명은 특정한 폴리펩티드 서열과 그의 약학적 조성물로 특정 지을 수 있는 본 발명의 단백질을 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, SEQ ID NO: 1-31 내의 폴리펩티드 서열 중 어떤 것은 다음 방법에서 사용된 단백질 성분으로서 특정하게 사용할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 단백질, 또는 약학적 조성물을 사용하여 시험관내 또는 체내에서의 세포 접촉 단계를 포함하여 세포를 사멸하는 방법을 제공한다. 본 발명의 단백질 및 약학적 조성물은 청구된 조성물로 세포 또는 세포들을 접촉하여 특정 세포 유형을 사멸시키는데 사용할 수 있다. 본 발명의 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 단백질 또는 약학적 조성물은 암 세포, 감염된 세포, 및/또는 이형 세포와 같은, 다른 세포 유형들의 혼합물 내에서 특정한 세포 유형을 사멸시키는데 사용할 수 있다. 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 단백질 또는 약학적 조성물은 다른 세포 유형들의 혼합물 내에서 암 세포를 사멸시키는데 사용할 수 있다. 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 단백질 또는 약학적 조성물은 이식 전 조직과 같은 다른 세포 유형들의 혼합물 내에서 특정한 세포 유형을 사멸시키는데 사용할 수 있다. 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 단백질 또는 약학적 조성물은 치료 목적을 위한 투약 전 조직과 같은, 세포 유형들의 혼합물 내에서 특정한 세포 유형을 사멸시키는데 사용할 수 있다. 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 단백질 또는 약학적 조성물은 바이러스 또는 미생물에 감염된 세포를 선택적으로 사멸시키거나, 세포 표면 생체분자와 같은, 특정 세포 외 표적 생체분자를 발현하는 세포를 선택적으로 사멸시키는데 사용할 수 있다. 본 발명의 단백질 또는 약학적 조성물은, 예를 들어, 시험관내 또는 생체내 조직으로부터 원하지 않는 세포 유형의 감소 용도, 이식편대 숙주병 치료를 위한 면역 반응 조절 용도, 항균제 용도, 항기생충제 용도, 및 원치 않는 세포 유형의 이식 조직 제거 용도를 포함한 다양한 응용이 가능하다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 본 발명의 단백질 또는 약학적 조성물은 단독으로 또는 다른 화합물 또는 약학적 조성물과 결합하여, 치료가 필요한 환자와 같은 피험체의 생체내 또는 시험관내의 세포 집단에 투약하였을때 강한 세포 사멸 활성을 나타낼 수 있다. 고친화성 면역글로불린-유형 결합 영역을 사용해 암 세포 유형으로 효소적으로 활성화된 시가 독소 영역 전달을 표적화함으로써, 이 강한 세포 사멸 활동은 특이적으로 그리고 선택적으로, 암세포, 신생 종양 세포, 악성 세포, 비악성 종양 세포, 또는 감염된 세포와 같은, 유기체 내의 특정 세포 유형을 사멸하도록 제한할 수 있다.
본 발명은 환자의 필요에 따라서, 본 발명의 최소 하나의 단백질 또는 그에 따른 약학적 조성물을 환자에 투약하는 단계를 포함하여, 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 단백질 또는 그에 따른 약학적 조성물의 몇몇 구체예는 암 및/또는 종양 세포와 물리적으로 결합한 세포외 생체분자를 표적하여 환자 내에 있는 암 및/또는 종양 세포를 사멸하는데 사용할 수 있다. 상기의 "암 세포" 또는 "암의 세포" 라는 용어는 비정상적인 속도로 성장하고 분열하는 다양한 종양 세포에 적용될 수 있으며, 당업자들에게는 자명하게 알려져 있을 것이다. 상기의 "종양 세포"라는 용어는 악성 및 비악성 세포 모두를 포함한다(예: 비-암성(non-cancerous), 양성 종양 세포, 비암성 "암" 줄기 세포, 종양 줄기 세포, 전암 암-유발 세포(pre-malignant cancer-initiating cells) 종양-유발 세포, 또는 종양 형성 세포 모두 딸세포가 악성 종양 및/또는 암세포가 되게 할 수 있지만 스스로는 전이할 수 없다(Martinez-Climent J et al., Haematologica 95: 293-302(2010) 참조)). 일반적으로 암 및/또는 종양은 치료 및/또는 예방을 할 수 있는 질병, 장애, 및 증상으로 정의될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물이 이로울 수 있는 암 세포 및/또는 종양 세포로 이뤄진 암 및 종양(악성 또는 비악성)들은 숙련자에게는 자명하게 알려져 있을 것이다. 종양 세포는 흔히 하나 이상의 다음과 같은 성질과 관련이 있다: 규제되지 않는 성장, 분화의 결여, 국소 조직 침윤, 혈관형성, 및 전이.
본 발명의 단백질 또는 그에 따른 약학적 조성물의 어떠한 구체예는 면역 세포와 물리적으로 결합된 세포외 생체분자를 표적화하여 환자 내의 면역 세포(건강하거나 악성이거나)를 사멸시키는 데 사용할 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 그에 따른 약학적 조성물의 어떠한 구체예는 감염된 세포와 물리적으로 결합된 세포외 생체분자를 표적화하여 환자 내의 감염된 세포를 사멸시키는 데 사용할 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 그에 따른 약학적 조성물을 환자 세포 집단(예를 들어, 골수)에서 감얌된 악성, 종양, 또는 다른 원치않는 T-세포 및/또는 B-세포를 제거하고 B-세포 및/또는 T-세포가 제거된 물질을 환자에게 재주입하는 데에 사용하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다(van Heeckeren W et al., Br J Haematol 132: 42-55(2006); Alpdogan O, van den Brink M, Semin Oncol 39: 629-42(2012) 참조).
본 발명의 단백질 또는 그에 따른 약학적 조성물을 환자로부터 척출해 분리된 세포 집단으로부터 T-세포 및/또는 B-세포를 생체 외에서 제거하는데에 사용하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 하나의 비제한적인 예에서는, 본 발명의 단백질은 기관 및/또는 조직 이식 거부의 예방을 위한 방법에서 사용할 수 있는데, 공여 기관으로부터 원치않는 공여 T-세포 및/또는 B-세포를 제거하기 위하여 이식 전에 공여 기관 또는 조직에 본 발명의 세포독성 단백질 또는 그에 따른 약학적 조성물이 주입된다(Alpdogan O, van den Brink M, Semin Oncol 39: 629-42(2012) 참조).
골수 및 줄기 세포 이식을 받을 환자의 이식편대숙주병에 대한 예방 및 내성의 유도로서, 공여 세포 집단으로부터 T-세포 및/또는 B-세포를 제거하기 위하여 본 발명의 단백질 또는 그에 따른 약학적 조성물을 이용하는 것 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 단백질 또는 그에 따른 약학적 조성물의 몇몇 구체예는 감염된 세포와 물리적으로 결합된 세포외 생체분자를 표적화하여 환자 내의 감염된 세포를 사멸시키는데 사용할 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 그에 따른 약학적 조성물의 몇몇 구체예는 다세포 기생충의 세포를 사멸시키는데 사용할 수 있다. 다른 구체예에서는, 세포 사멸은 다세포 기생충이 숙주 유기체 또는 피험체에 존재할때 일어난다. 다른 구체예에서는, 본 발명의 단백질은 편형 동물(plathelminth), 선형 동물(nemathelminth), 촌충류, 단생흡충(mongenean), 선충류, 및 또는 흡충과 같은 연충을 사멸하는데 사용할 수 있다.
나아가, 본 발명은 최소 하나의 본 발명의 단백질 또는 그에 따른 조성물을 치료적으로 효과적인 용량만큼 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한 질병, 장애, 또는 증상을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법을 사용하여 치료할 수 있는 것으로 고려되는 질병, 장애, 및 증상은 암, 악성 종양, 비악성 종양, 성장 이상, 면역 장애, 및 미생물 감염을 포함한다. 본 발명의 화합물의 "치료적으로 효과적인 용량(dosage)"의 투약은 질병 증상의 강도(severity)를 감소시킬 수 있으며, 질병의 증상이 없는 기간 및 빈도수를 증가시키거나, 상기 질병의 영향에 기인한 손상 또는 장애를 예방할 수 있다.
본 발명의 화합물의 상기의 치료적으로 효과적인 용량은 투약의 경로, 치료받는 포유동물의 유형, 및 고려되는 특정 환자의 신체적인 특징에 따라 정해질 것이다. 이 복용량을 결정하기 위한 이러한 요소 및 그들의 관계는 의학 분야에서 숙련된 종사자들에게는 널리 알려져 있는 사실이다. 이러한 용량 및 투약 방법은 최상의 효율성을 달성하기 위하여 맞출 수 있는데, 무게, 식습관, 동시 복용하는 약물 및 기타 요소와 같은 요소들에 의해서 결정될 수 있으며, 의학 분야 종사자들에게 이러한 사실은 널리 알려져 있다. 인간에게 가장 적절한 사용을 위한 복용량 및 복용 형태는 본 발명에서 얻은 결과를 참고할 수 있고, 적절히 설계된 임상 시험으로 확정지을 수 있다. 효과적인 복용 및 치료 방침은 관례적인 수단에 의해 결정될 수 있는데, 실험실의 동물에게 소량을 적용하고 효과를 모니터하면서 그 복용량을 증가시키고, 복용 방법 역시 체계적으로 변화시킬 수 있다. 주어진 개체를 위한 선택적인 복용량을 결정함에 있어서, 임상의는 다양한 요소들을 고려할 수 있다. 그러한 고려들은 숙련자들에 있어서는 자명한 사실이다.
본 기술 분야에서 알려진, 허용되는 투약의 경로는 분무제(aerosol), 장내, 비강, 눈, 경구, 비경구, 직장, 질내, 또는 경피(예를 들어, 크림, 젤 또는 연고의 국소 투약, 또는 경피 패치로)를 통한 투약을 포함하지만 이에 한정되는 것을 아니다. "비경구 투약"은 일반적으로 종양내 주사, 눈 아래, 주입, 동맥 내, 관절낭 내(intracapsular), 심장 내, 피(皮) 내, 근육 내, 복강 내, 폐 내, 척수 내, 흉골 내, 척추 강내, 자궁 내, 정맥 내, 지주막 아래, 피막 밑, 피하, 경점막, 또는 경기관 투약을 포함한 의도된 작용점(site of action)과 관련되어있거나 그와 통신중에 있다.
본 발명의 약학적 조성물 투약을 위하여, 복용 범위는 일반적으로 약 1 키로그램 당 0.0001 에서 100 밀리그램(mg/kg)까지, 및 더 흔하게는 숙주의 몸무게 1 키로그램 당 0.01 에서 5 밀리그램(mg/kg)일 것이다. 표본적인 복용량은 몸무게 1 키로그램 당 0.25 밀리그램, 1 밀리그램, 3 밀리그램, 5 밀리그램 또는 10 밀리그램, 또는 1-10 밀리그램(mg/kg)의 범위 내가 될 수 있다. 표본적인 치료 요법(regime)은 하루 한번 또는 두 번의 투약, 또는 일주일에 한번 또는 두 번의 투약, 2주에 한번, 3주에 한번, 4주에 한번, 한 달에 한번, 2 또는 3달에 한번 또는 3달에서 6달에 한번 투약할 수 있다. 복용량은 특정한 환자를 위하여 치료적인 효과를 극대화하기 위해서 필요에 따라 건강관리 전문가에 의해 선택되고 재조정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 일반적으로 여러 차례 동일한 환자에 투여될 것이다. 단일 복용 사이의 간격은, 2-5일, 한 주, 한 달, 2 또는 3달, 6달, 또는 1년을 예로 들 수 있다. 투약 사이의 간격은 피험체나 환자 내의 규칙적인 혈중 농도 또는 마커에 따라 불규칙적일 수도 있다. 본 발명의 화합물의 복용 요법은 2주에서 4주마다 몸무게 1 킬로그램당 1 밀리그램 또는 3 밀리그램을 정맥에 총 6번 투여하고, 이후 3달마다 몸무게 1 킬로그램마다 3 밀리그램 또는 1 밀리그램을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 기술 분야에서 잘 알려진 하나 이상의 다양한 방법을 사용하여 하나 이상의 투약 경로를 통해 투약할 수 있다. 상기의 투약 경로 및/또는 방식은 얻고자하는 결과에 따라 다를 것이며, 이는 전문가도 인정할 것이다. 본 발명의 단백질 또는 그에 따른 약학적 조성물의 투약 경로는 정맥 내, 근육 내, 피 내, 복강 내, 피하, 척추, 또는 의도된 작용점(예: 종양내 주사)과 통신중에 있거나 또는 그에 주사 또는 주입과 같은 다른 비경구 투약 경로를 예로써 포함한다. 다른 구체예에서는, 본 발명의 단백질 및 약학적 조성물은 국소, 상피 또는 비강 내, 경구로, 질 동맥으로, 직장으로, 혀 밑으로, 또는 국소적인 점막 경로와 같은 비-비경구 경로로 투약할 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 약학적 조성물은 본 기술 분야에서 알려진 하나 이상의 다양한 의료기기로 투여될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구체예에서는, 본 발명의 약학적 조성물은 무바늘 피하 주사기로 투여할 수 있다. 본 발명이 속한 기술 분야에서 널리 알려진 임플란트 및 모듈의 예들은, 제어된 속도의 전달을 위한 매몰식 미세-주입 펌프; 피부를 통한 투약 수단; 정확한 주입 속도의 전달을 위한 주입 펌프; 연속적인 약물 전달을 위한 가변 유량 임플란트 주입; 및 삼투 약물 전달 시스템 등을 포함한다. 상기 및 기타 다른 임플란트, 전달 시스템, 및 모듈은 본 기술 분야의 숙련자들에게 널리 알려져 있다.
본 발명의 단백질 또는 약학적 조성물은 하나 이상의 치료적 또는 진단 제제와 병용하거나 단독으로 투여할 수 있다. 병용 요법은 치료할 특정 환자, 질병 또는 증상에 따라 선택된 최소 하나의 다른 치료 제제와 병용된 본 발명의 단백질 또는 그에 따른 약학적 조성물을 포함할 수 있다. 다른 제제의 예로는, 그 중에서도, 세포독성, 항암 또는 화학요법제, 소염제 또는 항증식제, 항균제 또는 항바이러스제, 성장인자, 시토카인, 진통제, 치료적으로 활성화된 소분자 또는 폴리펩티드, 단일 사슬 항체, 고전적(classical) 항체 또는 그에 따른 단편, 또는 하나 이상의 신호 경로(signaling pathways)를 조절하는 핵산 분자, 및 치료적 또는 예방적 치료 요법에서 보충적이거나 이로움을 줄 수 있는 유사한 조절 치료법(modulating therapeutics)을 포함한다.
본 발명의 단백질 또는 약학적 조성물로 환자를 치료하는 것은 바람직하게는 표적화된 세포의 세포 사멸 및/또는 표적화된 세포의 성장 억제하는 것으로 이어진다. 예를 들어, 본 발명의 단백질, 및 그것을 포함하는 약학적 조성물은 표적 세포를 사멸시키거나 제거하는 것이 이로운 다양한 병리적 장애를, 그중에서도 암, 종양, 성장 이상, 면역 장애, 및 감염된 세포를, 치료하는데 유용할 것이다. 본 발명은, 종양 형성, 과활동 B-세포, 및 과활동 T-세포를 포함한 세포 질병 치료, 및 세포 증식 억제를 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 단백질 및 약학적 조성물은 암, 종양(악성 및 비악성), 성장 이상, 면역 장애, 및 미생물 감염을 치료하거나 예방하는데 사용할 수 있다. 나아가, 상기의 생체 외 방법은, 골수 이식 수용자 내에서 거부현상을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하기 위하여, 그리고 면역글로불린 내성을 달성하기 위하여, 상기의 생체 내 방법과 병용될 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 본 발명은 악성 종양 또는 신생 종양 및 인간과 같은 포유동물 개체 내의 그외 혈액 세포 관련 암을 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 필요로 하는 피험체에게 본 발명의 단백질 또는 약학적 조성물을 치료적으로 효과적인 용량만큼 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 단백질 및 약학적 조성물은, 원치 않는 B-세포 및/또는 T-세포 제거 용도, 이식편대숙주병을 치료하기 위한 면역 반응을 조절하는 용도, 항바이러스제로서의 용도, 항균제로서의 용도, 및 원치 않는 세포 유형을 이식 조직으로부터 제거하는 용도 등을 포함한 다양한 응용 방법이 있다. 본 발명의 단백질 및 약학적 조성물은 흔히 항종양제이며, 이는 암 또는 종양 세포의 성장을 저해 및/또는 사멸을 유도하여 종양 또는 악성 세포의 성장, 변이, 또는 증식을 치료하고/하거나 예방할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 몇몇 구체예에서는, 본 발명의 단백질 또는 약학적 조성물은 B-세포-, 형질 세포-, T-세포, 또는 항체-매개 질환 또는 장애, 예를 들어 백혈병, 림프종, 골수종, 아밀로이드증, 강직척추염, 천식, 크론병, 당뇨병, 이식편거부반응, 이식편대숙주병, 하시모토 갑상선염, 용혈요독증후군, HIV-관련 질병, 홍반 루푸스, 다발경화증, 결절다발동맥염, 다관절염, 건선, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 피부경화증, 패혈쇼크, 쇼그렌 증후군, 궤양성대장염, 및 혈관염과 같은 질병을 치료하는데 사용된다.
다른 관점에서는, 본 발명의 단백질 및 약학적 조성물의 몇몇 구체예는 항균제이며, 이는 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 프리온, 또는 원생동물로 인한 미생물학적 병원성 감염의 시작, 성장, 또는 결과를 치료하고/하거나 예방할 수 있다는 것을 의미한다.
B-세포 및/또는 T-세포를 매개로한 질병 또는 증상의 예방 또는 치료, 환자 내의 T-세포 또는 B-세포를 사멸시킬 목적으로, 필요로 하는 환자에게 본 발명의 단백질, 또는 그에 따른 약학적 조성물을 투여하는 것을 제공하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 사용은, 예를 들어, 인간 또는 비인적자원과 같은 이식된 물질의 원천에 상관없이, 골수 이식, 줄기 세포 이식, 조직 이식, 또는 기관 이식을 위하여 환자를 준비시키거나 조정(conditioning)하는 데 적합하다.
골수 수용자에게 본 발명의 단백질 또는 약학적 조성물을 사용한 숙주 B-세포, NK 세포, 및/또는 T-세포의 표적화된 세포 사멸을 통해 이식편대숙주 질환의 예방 또는 치료를 제공하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다(Sarantopoulos S et al., Biol Blood Marrow Transplant 21: 16-23(2015) 참조).
본 발명의 단백질 및 약학적 조성물은 필요로 하는 환자에게 본 발명의 단백질 또는 약학적 조성물의 치료적으로 효과적인 용량을 투약하는 과정을 포함하는 암을 치료하는 방법에 사용할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 몇몇 구체예는, 다음과 같이 이루어진 군으로부터 선택된 암을 치료하는 방법을 제공한다: 골수암(다발성 골수종 또는 유잉 육종), 유방암, 중앙/말초 신경계 암(뇌암, 신경섬유종증, 또는 교아종), 위장암(위암 또는 대장암), 생식 세포암(난소암 및 고환암), 선암(췌장암, 부갑상선암, 크롬친화세포종, 침샘암, 또는 갑상선암), 두경부암(비인두암, 구강암, 또는 인두암), 혈액암(백혈병, 림프종, 또는 골수종), 신장-요로암(신장암 및 방광암), 간암, 폐/흉막암(흉막중피증, 폐소세포암종, 또는 비소세포성폐암), 전립선암, 육종(혈관 육종, 섬유 육종, 카포시 육종, 또는 활막 육종), 피부암(기저 세포암, 편편세포암종, 또는 흑색종), 및 자궁암.
본 발명의 단백질 및 약학적 조성물은 필요로 하는 환자에게 본 발명의 단백질 또는 약학적 조성물의 치료적으로 효과적인 용량을 투약하는 과정을 포함한 면역 장애를 치료하는 방법에 사용할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 몇몇 구체예에서는, 다음과 같이 이루어진 군으로부터 선택된 질병과 연관된 염증과 관련된 면역 장애를 치료하는 방법을 제공한다: 아밀로이드증, 강직성 척추염, 천식, 크론병, 당뇨병, 이식편거부반응, 이식편대숙주병, 하시모토 갑상선염, 용혈요독증후군, HIV-관련 질병, 홍반 루푸스, 다발경화증, 결절다발동맥염, 다관절염, 건선, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 피부경화증, 패혈쇼크, 쇼그렌 증후군, 궤양성대장염, 및 혈관염.
본 발명에 따른 몇몇 구체예 중에는 본 발명의 단백질을 암, 종양, 성장 이상, 면역 장애. 및/또는 미생물 감염의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물 또는 약제의 구성 성분으로서 사용한다. 예를 들어, 환자의 피부 위에서 나타나는 면역 장애는 염증을 감소시키기 위하여 상기 약제로 치료할 수 있다. 다른 예에서는, 피부 종양은 종양의 크기를 감소시키거나 완전하게 제거하기 위하여 상기 약제로 치료할 수 있다.
본 발명의 특정 단백질은 분자(molecular) 신경외과 수술에서 면역병소화(immunolesioning) 및 신경 추적과 같은 응용방법으로 사용할 수 있다(Wiley R, Lappi D, Adv Drug Deliv Rev 55: 1043-54(2003) 참고). 예를 들어서, 표적 도메인은, 뉴런 회로(neuronal circuit) 특이 G-단백질과 연결된 수용체와 같은 뉴런 표면 수요에와 결합하여 특정 뉴런 세포 유형을 표적화하는 신경 전달 물질 및 신경 펩티드와 같은 다양한 리간드로 부터 선택하거나 유도할 수 있다. 유사하게, 상기의 표적 도메인은 뉴런 표면 수용체를 결합하는 항체로부터 선택되거나 유도될 수 있다. 시가 독소가 자신들의 역행성 축삭운반을 강하게 지시하기 때문에, 본 발명의 어떤 세포독성 단백질은 세포체로부터 떨어진 세포독성 단백질 주사부위에서 세포외 표적을 발현하는 뉴런을 사멸시키는데 사용할 수 있다(Llewellyn-Smith I et al., J Neurosci Methods 103: 83-90(2000) 참조). 이러한 신경 세포-유형-특이적-표적 세포독성 단백질은 감각 메커니즘(Mishra S, Hoon M, Science 340: 968-71(2013) 참조) 및 파킨슨씨 및 알츠하이머와 같은 퇴행성 질환의 생성 모델 시스템(Hamlin A et al., PLoS One e53472(2013) 참조)을 설명하기 위함과 같은 신경과학 연구에 사용된다.
본 발명의 구체예 중에서는, 본 발명의 단백질, 약학적 조성물, 및/또는 진단 조성물을 질병, 증상 및/또는 장애에 대한 정보수집을 위한 세포 유형을 검출하는데에 사용하는 방법이다. 상기의 방법은 분석 또는 진단 기술로 단백질을 검출하기 위해 진단적(diagnostically)으로 충분한 양의 본 발명의 단백질이 세포에 접촉하는 것을 포함한다. 상기의 "진단적으로 충분한 양"은 사용되는 특정 분석법 또는 진단 기술로 정보수집을 할 때 충분한 검출 및 정확한 측정치를 제공하는 양을 뜻한다. 일반적으로, 생체 내 진단적 사용에서 유기체 전체를 위한 진단적으로 충분한 양은 피험체 당 피험체의 무게 1kg 당 단백질과 연결된 검출 촉진제 0.1 mg 에서 100 mg 사이의 비누적 복용일 것이다. 전형적으로, 이러한 정보 수집 방법에서 사용되는 본 발명의 단백질의 양은 진닥적으로 충분한 양이되 가능한 적은 양일 것이다. 예를 들어, 유기체 안에서의 생체내 검출을 위해서 피험체에 투여되는 본 발명의 단백질의 양은 실행 가능한 최소의 양일 것이다.
검출 촉진제와 결합된 본 발명의 단백질의 세포-유형 특이적 표적화는 본 발명의 단백질의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 세포를 검출하고 촬영하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 단백질을 사용한 세포 영상화는 본 기술 분야에서 널리 알려진 기술로 시험관 내 또는 생체 내에서 시행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단백질, 약학적 조성물, 또는 진단 조성물을 정보 수집 목적으로 세포 유형을 검출하는데에 사용하는 방법은 질병 자리(locus)에서, 시험관 내 세포에서, 및/또는 생체 검사 물질과 같이 유기체로부터 척출된 세포 및 조직의 체외 환경에서와 같은 제자리(in situ)의 세포를 포함한, 환자의 생체 내의 세포에서 실행될 수 있다.
진단 정보는 유기체의 전신 영상화(imaging) 또는 유기체로부터 채취한 체외 샘플을 사용하는 것과 같은 본 기술 분야에서 널리 알려진 다양한 방법을 사용하여 수집할 수 있다. 상기의 샘플이라는 용어는 혈액, 소변, 혈청, 림프, 타액, 항문 분비물, 질 분비물, 및 정액, 및 생체 조직 검사로 얻은 조직과 같은 수많은 것들을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 다양한 감별 촉진제는 자기 공명 촬영(MRI), 광학적 방법(직접, 형광, 및 생물 발광 촬영과 같은), 양전자 방사 단층 촬영(PET), 단일광자방출단층촬영(SPECT), 초음파, x-선 컴퓨터 단층 촬영, 및 상기 언급한 것들의 조합과 같은 기술로 비침습적 생체 내 종양 촬영에 사용할 수 있다(Kaur S et al., Cancer Lett 315: 97-111(2012) 참조).
본 발명의 단백질, 약학적 조성물, 또는 진단 조성물을 정보 수집 목적으로 표적 생체분자 양성(positive) 세포 유형의 존재를 검출하는데에 사용하는 방법은 질병 자리(locus)에서, 시험관 내 세포에서, 및/또는 생체 검사 물질과 같이 유기체로부터 척출된 세포 및 조직의 체외 환경에서와 같은 제자리(in situ)의 세포를 포함한, 환자의 생체 내의 세포에서 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물을 사용한 특정 세포, 세포 유형, 및 세포 집단 검출은 종양, 암, 면역, 및 감염된 세포와 같은 세포를 진단 및 영상화하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단백질 및 진단 조성물은 유기체 내에 있을 수 있는 표적 생체분자 발현 세포의 축적 장소를 영상화 또는 시각화(visualize)하는데에 사용할 수 있다. 이러한 방법들은 치료적 개입 이후 종양 발달 또는 잔여(residual) 종양 세포 부위를 찾는데에 사용할 수 있다.
세포 유형의 존재를 감별하는데 사용되는 상기 방법의 몇몇 구체예는 다음과 같은 질병, 장애, 및 증상에 관한 정보를 수집하는데 사용된다: 골육종(다발성 골수종 또는 유잉 육종), 유방암, 중앙/말초 신경계 암(뇌암, 신경섬유종증, 또는 교아종), 위장암(위암 또는 대장암), 생식 세포암(난소암 및 고환암), 선암(췌장암, 부갑상선암, 크롬친화세포종, 침샘암, 또는 갑상선암), 두경부암(비인두암, 구강암, 또는 인두암), 혈액암(백혈병, 림프종, 또는 골수종), 신장-요로암(신장암 및 방광암), 간암, 폐/흉막암(중피종, 폐소세포암종, 또는 비소세포성폐암), 전립선암, 육종(혈관 육종, 섬유 육종, 카포시 육종, 또는 활막 육종), 피부암(기저 세포암, 편편세포암종, 또는 흑색종), 자궁암, AIDS, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 천식, 자폐증, 심장발생, 크론병, 당뇨병, 홍반성, 위염, 이식편거부반응, 이식편대숙주병, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 용혈요독증후군, HIV-관련 질환, 홍반 루푸스, 림프증식성 질환, 다발성 경화증, 중증근무력증, 신경세포염증, 다발동맥염, 다관절염, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 경피증, 패혈 쇼크, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 궤양성 대장염, 혈관염, 세포 증식, 염증, 백혈구 성숙, 백혈구 이동, 신경분화, 급성 림프구성 백혈병(ALL), T 급성 림프구성 백혈병/림프종(ALL), 급성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병(AML), B-세포 만성 림프구 백혈병(B-CLL), B-세포 전림프구성 림프종, 버키트 림프종(BL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML-BP), 만성 골수성 백혈병(CML), 대세포성 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 털세포백혈병(HCL), 호지킨스 림프종(HL), 혈관 대형 B-세포 림프종, 림프종양육아종증, 림프구 형질세포의 림프종, MALT 림프종, 외투세포 림프종, 다발성 골수종(MM), 자연살해세포백혈병, 림프절외변연 B-세포 림프종, 비-호지킨스 림프종(NHL), 형질 세포성 백혈병, 형질세포종, 소림프구 림프종, 비장변연부 림프종, T-세포 림프종(TCL), 중쇄병, 단세포군감마글로불린병증, 단세포군 면역글로불린 퇴적 병, 골수형성이상증후군(MDS), 연쇄 다발성 골수증, 및 발덴스트롬 고대글로불린혈증.
본 발명의 몇몇 구체예 중에서는, 본 발명의 단백질, 약학적 조성물, 및/또는 진단 조성물을 신생세포 또는 면역 세포 유형의 내부를 표지하거나 검출하는데 사용하는 방법이다(Koyama Y et al., Clin Cancer Res 13: 2936-45(2007); Ogawa M et al., Cancer Res 69: 1268-72(2009); Yang L et al., Small 5: 235-43(2009) 참조). 역행성 세포내 수송을 통해 특이 세포 유형에 침투하고 세포 내에서 경로화할 수 있는 본 발명의 단백질 및 약학적 조성물의 능력에 근거하여, 특이적 세포 유형의 내부 구획은 검출을 위하여 표지 된다. 이는 환자 내에 제자리하고 있는 세포에서 또는 생체 조직 검사 물질과 같은 유기체로부터 척출된 세포 및 조직에서 시행될 수 있다.
본 발명의 진단적 조성물은 본 발명의 약학적 조성물로 치료 가능성이 있는 질병, 장애, 또는 증상의 특징을 짓는데 사용할 수 있다. 본 발명의 어떤 물질의 조성물은 환자가 이 명세서에 설명된 본 발명의 화합물, 조성물 또는 관련된 방법을 사용하거나 본 발명의 전달 장치를 사용하는데에 적절한 치료 전략에 반응하는 그룹에 속하는지 여부를 결정하는데 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 진단적 조성물은 암과 같은 질병이 검출된 후에 원격전이, 이종성, 및 암의 진행 단계를 모니터하는 것과 같은 것으로 질병을 더 잘 특징 지을 수 있도록 사용할 수 있다. 질병 장애 또는 감염에 대한 표현형 평가는 치료적 의사 결정이 이루어지는 동안 진단 및 예측에 도움을 줄 수 있다. 질병 재발에 있어서, 본 발명의 어떤 방법은 문제가 국소적(local) 문제인지 계통(systematci) 문제인지 알아내는데 사용할 수 있다.
본 발명의 진단적 조성물은 소분자 약물, 생물학적 약물, 또는 세포기반 치료와 같은 치료 유형과 무관하게 치료에 대한 반응을 평가하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 진단법의 몇몇 구체예는 종양 크기 변화, 항원 양성 세포 집단의 수와 분포를 포함한 변화를 측정, 그리고/또는 환자에게 이미 투약되고 있는 치료에 의해 표적화된 항원 이외의 마커를 모니터하는데에 사용할 수 있다(Smith- Jones P et al., Nat. Biotechnol 22: 701-6(2004); Evans M et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108: 9578-82(2011) 참조).
어떤 구체예에서는, 본 발명의 단백질 또는 그에 따른 약학적 및/또는 진단 조성물은 진단 및 치료 모두를 위하여 사용되거나, 또는 진단만을 위하여 사용된다.
본 발명은 시가 독소군 개체의 A 서브유닛으로부터 유도된 시가 독소 작동체 영역 및 특정 세포 유형과 물리적으로 결합된 세포외 표적 생체분자를 결합할 수 있는 면역글로불린-유형 결합 영역을 포함하는 선택적 세포독성 단백질의 하기 비제한적인 실시예에 의해서 더 설명된다.
실시예
다음 예들은 본 발명에 따른 구체적인 실시예들을 제공한다. 그러나, 이러한 실시예들은 단지 입증 목적을 위한 것으로서 반드시 이에 한정되지 않으며 본 발명의 범위 및 조건을 제한하기 위한 것은 아니다. 실시예들은 표준 기술을 사용하여 실시되었으며, 상세하게 기술된 다른 부분을 제외하고 본 발명이 속한 기술 분야에서 자명한 기술을 사용하였다.
다음 실시예들은 역방향 단백질 변종과 비교해서 면역글로불린-유형 결합 영역의 세포 외 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 세포를 선택적으로 사멸시키기 위하여 표준적인 세포독성 단백질의 향상된 능력을 제시하고 있다. 표준적인 세포독성 단백질은 표적화된 세포 유형에 의해 발현된 표적 생체분자에 결합하고 상기의 표적화된 세포로 들어간다. 상기의 내면화된 세포 독성 단백질은 리보솜을 불활성화하기 위하여 시토졸까지 시가 독소 작동체 영역을 경로화하고 그 다음 상기의 표적화된 세포의 사멸을 야기시킨다.
하나의 표준적인 세포독성 단백질은 단일-사슬, 가변성 단편, 고친화도로 CD38과 결합 가능한 결합 영역으로 재조합된 시가 독소 A 서브유닛 단편으로 이루어진다. 이러한 표준적인 세포독성 단백질은 그들의 표면에서 CD38을 발현하는 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있다. 두번째 표준적인 세포독성 단백질은 단일-사슬, 가변적인 단편, 고친화도로 HER2과 결합 가능한 결합 영역으로 재조합된 시가 독소 A 서브유닛 단편으로 이루어진다. 이러한 표준적인 세포독성 단백질은 그들의 표면에서 HER2을 발현하는 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있다. 세번째 표준적인 세포독성 단백질은 단일-사슬, 가변성 단편, 고친화도로 CD19와 결합 가능한 결합 영역으로 재조합된 시가 독소 A 서브유닛 단편으로 이루어진다. 이러한 표준적인 세포독성 단백질은 그들의 표면에서 CD19를 발현하는 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있다. 네번째 표준적인 세포독성 단백질은 단일-사슬, 가변성 단편, 고 친화도로 CD74와 결합 가능한 결합 영역으로 재조합된 시가 독소 A 서브유닛 단편으로 이루어진다. 이러한 표준적인 세포독성 단백질은 그들의 표면에서 CD74를 발현하는 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있다. 다른 표준적인 세포독성 단백질은 엡스타인바 항체, 리슈만편모충(Leishmania) 항체, 뉴로텐신 수용체, 표피 성장 인자 수용체, 및 면역 세포 수용체 CCR5를 표적화하는 결합 영역으로 그것을 포함한다.
실시예 1. CD38 - 표적화된 , 시가-유사 독소-1의 A 서브유닛으로부터 유도된 세포독성 단백질( SLT -1A::α CD38scFv )
이러한 실시예의 세포독성 단백질 SLT-1A::αCD38scFv은 단일-사슬, 가변성 단편, 고친화도로 CD38과 결합 가능한 결합 영역으로 재조합된 시가 독소 A 서브유닛 단편으로 이루어지며,상기의 시가 독소 작동체 영역은 상기의 CD38 결합 영역보다 상기의 세포독성 단백질의 아미노-말단에 더욱 근접하게 된다.
세포독성 단백질 SLT-1A::αCD38scFv의 구성, 생산, 및 정제
첫 번째, 시가 독소 작동체 영역 및 면역글로불린-유형 결합 영역은 설계되거나 선택된다. 이러한 실시예에서, 상기 시가 독소 작동체 영역은 시가-유사 독소 1의 A 서브유닛(SLT-1A)으로부터 유도되었다. SLT-1A의 아미노산 1-251을 부호화하는 폴리뉴클레오티드가 구해졌다(Cheung M et al., Mol Cancer 9: 28(2010)). 면역글로불린-유형 결합 영역 αCD38scFv는 단일클론성 항체 항-CD38 HB7로부터 유도되었으며(Peng et al., Blood 101: 2557-62 (2003); GenBank Accession BD376144, National Center for Biotechnology Information, U.S. 참조) 단일-사슬 가변성 단편(scFv)은 본 발명의 기술 분야에서 링커에 의해 분리되는 상기의 두 개의 면역글로불린 가변 영역(VL and VH)으로 생성된다.
두 번째, 상기의 결합 영역과 시가 독소 작동체 영역은 융합 단백질을 형성하기 위하여 함께 연결되었다. 이러한 실시예에서, SLT-1A(SEQ ID NO:1의 아미노산 1-251)로부터 상기의 시가 독소 작동체 영역을 부호화하는 폴리뉴클레오티드는, 쥐 IgG3 분자로부터 유도된 "쥐 힌지(murine hinge)"와 같은 링커(또는 전문가에게 알려진 그외의 링커)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 SEQ ID NO:4의 아미노산 269-508로 이루어진 상기의 면역글로불린-유형 결합 영역αCD38scFv를 부호화하는 폴리뉴클레오티드와 함께 프레임 내에서 복제되었다. 어떤 실험에서, 이러한 예의 세포독성 단백질의 전장(full-length) 코딩 서열은 검출 및 정제를 용이하게 하기 위하여 Strep-tag®를 부호화하는 폴리뉴클레오티드로 개시된다. 이러한 실시예의 세포독성 단백질 SLT-1A::αCD38scFv을 부호화하는 상기의 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 2.0, Inc.의 서비스를 사용한 대장균에서의 효과적인 발현을 위하여 최적화된 코돈이었다(Menlo Park, CA, U.S.).
세 번째, 융합 단백질은 상기의 세포독성 단백질 SLT-1A::αCD38scFv (SEQ ID NO:4)을 인코딩하는 상기의 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산되었다. 상기의 SLT-1A::αCD38scFv 세포독성 단백질의 발현은 박테리아, 및 무세포 양자의 단백질 번역 시스템을 사용하여 실행되었다.
대장균 발현 시스템에 의한 SLT-1A::αCD38scFv 생산의 이러한 실시예에서, SLT-l A::αCD38scFv를 부호화하는 상기의 폴리뉴클레오티드 "삽입"은 상기 벡터의 아미노-말단 인테인(intein)을 부호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 결합된 세포독성 단백질 SLT-1A::αCD38scFv을 부호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 생산하기 위한 표준적인 과정을 사용하여 상기의 pTxbl 벡터(New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.) 속으로 복제되었다. 상기의 플라스미드 삽입 폴리뉴클레오티드 서열은 생거 시퀀싱 방법에 의해 입증되었으며(Functional Biosciences, Madison, WI, U.S.) T7 Shuffle® 세포속으로 변형되었다(New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.). 상기의 SLT-1A::αCD38scFv 단백질은 IMPACT™(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag) 시스템 메뉴얼(New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.)에 따라서 생산되었고 정제되었다. 정제는 Strep-tag®의 부동형 표적 또는 상기의 면역글로불린-유형 결합 영역을 사용한 것과 같은, 본 기술 분야에서 알려진 표준적인 기술을 사용하여 실행되었다.
무세포, 단백질 번역 시스템에 의한 SLT-1A::αCD38scFv 생산의 이러한 실시예에서, SLT-1A::αCD38scFv 를 부호화하는 상기의 폴리뉴클레오티드 "삽입" 서열은 제조자의 지시에 따라서 In-Fusion® HD Cloning Kit(Clonetech, Mountain View, CA, U.S.)를 사용한 상기의 코딩 영역 후 종결 코돈과 함께 pIVEX2.3 벡터 속으로 복제되었다. 상기의 플라스미드 삽입 폴리뉴클레오티드 서열은 생거(Sanger) 시퀀싱에 의해서 입증되었다(Functional Biosciences, Madison, WI, U.S.). SLT-1A::αCD38scFv 단백질은 제조자의 지시에 따라서 신속한 번역 시스템 5 Prime™ RTS 100 대장균 이황화 키트(5 Prime, Gaithersburg, MD, U.S.) 를 사용하여 생산되었다. 정제는 Strep-tag®의 부동형 표적 또는 상기의 면역글로불린-유형 결합 영역을 사용한 것과 같은, 본 기술 분야에서 알려진 표준적인 기술을 사용하여 실행되었다.
표적 세포 유형에 결합하는 SLT -1A::α CD38scFv 의 최대 특이적 결합( B max ) 및 평형 결합 상수(K D ) 결정
상기에 기술된 것과 같이 생산된 상기의 SLT-1A::αCD38scFv 단백질의 결합 특성은 형광 분석법 및 유동 세포 분석법에 의해 분석되었다. CD38 양성(+) 세포 및 CD38 음성(-) 세포를 함유하는 샘플은 분석을 위하여 1X PBS+1%BSA 내에서 현탁되었으며 SLT-1A::αCD38scFv 단백질의 다양한 희석액 100μL로 4°C에서 1시간 동안 배양되었다. SLT-1A::αCD38scFv 단백질의 최고 농도는 상기의 결합 반응의 포화를 이끌어내기 위해 선택되었다. 1시간 동안의 배양 후에, 세포 샘플은 1X PBS+1% BSA로 두 번 세척되었다. 상기의 세포 샘플은 항-Strep-tag® mAb-FITC(# AO1736-100, Genseript, Piscataway, NJ, U.S.) 0.3 μg을 포함한 1XPBS+1%BSA 100 ㎕로 4°C에서 1시간 동안 배양되었다.
상기의 샘플은 1X PBS+1%BSA로 두 번 세척한 다음, 1X PBS 200 ㎕로 재현탁되었고 형광분석법 및 유동 세포 분석법에 따라 분석되었다. 모든 샘플에 대한 평균 형광 강도(MFI) 데이터는 네거티브 조절로서 FITC만의 샘플을 사용한 데이터를 게이트(gating)하여 얻어졌다. 그래프는 프리즘 소프트웨어를 사용한 "세포 농도" 대 MFI로 나타내었다(GraphPad Software, San Diego, CA, U.S.). 결합-포화도 제목(heading)하에서 프리즘 소프트웨어의 한-부위 결합의 함수[Y=Bmax*X/(KD+X)]를 사용하여, Bmax 및 KD는 보정된 베이스라인 데이터를 사용하여 계산되었다. Abs 값은 PBS만을 담은 홈에 대하여 측정된 Abs 값을 빼는 것으로 배경(background)을 위해 보정되었다. Bmax는 MFI 내에서 보고된 최대 특이적 결합이다. KD 는 nM 내에서 보고된, 평형 결합 상수이다.
CD38+ 세포에 결합하는 SLT-1A::αCD38scFv 에 대한 Bmax는 약 13nM의 KD로 약 100,000 MFI로 측정되었다(표 1). 이러한 결과는 약 17nM의 KD로 약 110,000 MFI로 측정된 CD38+에 결합하는 역방향 단백질 αCD38scFv::SLT-1A에 대한 Bmax와 유사하다(표 1 ). 어떠한 단백질도 CD38-에 결합하지 않았다. 이것은 "가공의 방향" 효과가 아마도 면역글로불린-유래 표적 세포 결합 성질의 변화와 관계되지 아니함을 보여준다.
표적 양성 세포
세포독성 단백질 표적 생체분자 B max ( MFI ) K D (nM)
SLT -1A::αCD38scFv CD38 104,000 13.4
αCD38scFv :: SLT -1A CD38 108,000 17.0
가공의 방향은 결합 특성에 대하여 어떠한 중요한 효과를 가지지 않았다: 역방향 αCD38scFv::SLT-1A에 비교한 SLT-1A::αCD38scFv 에 대한 Bmax 및 KD 대표값
시험관 내에서 진핵 리보솜에 대한 SLT -1A::α CD38scFv 의 반-최고치 억제 농도(IC 50 ) 측정
SLT-1A::αCD38scFv의 리보솜 불활성 능력은, TNT® 신속 결합 전사/번역 키트(L1170 Promega, Madison, WI, U.S.)를 사용한 무세포, 시험관 내 단백질 번역 분석으로 측정되었다. 상기의 키트는 루시퍼라아제 T7 조절 DNA 및 TNT® Quick Master Mix를 포함한다. 상기의 리보솜 활성 반응은 "TNT" 반응 혼합물을 생성하기 위하여 제조자의 지시에 따라서 준비되었다.
실험을 위한 SLT-1A::αCD38scFv의 10배 희석액 시리즈는 적당한 완충액 내에서 제조되었으며 동일한 TNT 반응 혼합물 성분의 시리즈는 각각의 SLT-1A::αCD38scFv의 희석액을 위하여 생성되었다. SLT-1A::αCD38scFv 단백질의 희석액 내에서의 각 샘플은 루시퍼라아제 T7 조절 DNA와 함께 TNT 반응 혼합물 각각과 결합되었다. 상기의 실험 샘플은 30°C에서 1.5시간 동안 배양되었다. 배양 후, 발광효소 분석 시약(E1483 Promega, Madison, Wl, U.S.)이 모든 실험용 샘플에 첨가되었고 루시퍼라아제 단백질 번역 용량은 제조자의 지시에 따라서 발광으로 측정되었다. 상기의 번역 억제 레벨은 전체 단백질에 대한 비교 발광 단위의 로그-변형된 농도의 비-선형 회귀 분석에 의하여 측정되었다. 통계 소프트웨어(GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.)를 사용하여, 상기의 반 최고치 억제 농도(IC50)값이 각 샘플에 대하여 계산되었다. 그런 다음, 상기 데이터는 프리즘 소프트웨어의 로그(저해제) 대 반응(세개 변수)[Y = Bottom + ((Top-Bottom)/(l+10^(X-LogIC50)))] 함수를 사용하여 "SLT-1A-유일 조절 단백질 %"을 계산함에 의해 정규화되었다. 실험의 단백질 및 SLT-1A-유일 조절 단백질에 대한 상기의 IC50이 계산되었다. SLT-1A-유일 조절 단백질의 %는 [(SLT-1A 조절 단백질의 IC50/실험의 단백질의 IC50)x100]으로 계산되었다.
무세포 단백질 합성에 대한 SLT-1A::αCD38scFv의 억제 효과는 강력하였다. 복용량 의존 실험은 이러한 무세포 분석 내에서 단백질 합성에 대한 SLT-1A::αCD38scFv IC5O이 약 14pM 또는 상기 SLT-1A-유일 양성 조절의 109%임을 밝혀내었다(표 2). 이러한 결과는 역방향 단백질 αCD38scFv::SLT-1A에 대한 IC50과 현저히 상이하지 않았으며, 이것은 약 15pM 또는 SLT-1A-유일 양성 조절과 등가의 값으로 측정되었다(표 2). 이것은 상기의 "가공의 방향" 효과가 아마도 시가 독소 A 서브유닛 효소적 활성의 현저한 변화와 관련되지 아니함을 보여준다.
세포독성 단백질 IC 50 (pM) SLT -1A 유일 양성 조절의 IC 50 (pM) IC 50 of SLT -1A 조절 단백질의 %
SLT -1A::α CD38scFv 13.7 15.0 109.0%
α CD38scFv :: SLT -1A 14.8 15.0 99.0%
가공의 방향은 리보솜 불활성에 대한 어떠한 현저한 효과도 가지지 아니한다: 역방향 αCD38scFv::SLT-1A와 비교한 SLT-1A::αCD38scFv에 대한 대표적인 반-최고치 억제 농도(IC50)
세포-사멸 분석을 사용한 SLT -1A::α CD38scFv 의 선택적인 세포독성 및 반-최고치 세포독성 농도(CD 50 ) 분석
SLT-1A::αCD38scFv의 세포독성 특성은 하기의 세포-사멸 분석에 의하여 측정되었다. 이러한 분석은 표적 생체분자를 발현하지 않는 세포와 비교하여 세포독성 단백질의 면역글로불린-유형 결합 영역의 표적 생체분자를 발현하는 세포를 사멸시키기 위한 세포독성 단백질의 능력을 측정한다. 세포는 384-홈 플레이트 내 세포 배양 배지 20μL 내에 플레이트되었다(홈 하나당 2 x 103 세포). 상기의 SLT-1A::αCD38scFv 단백질은 1X PBS 내에서 5배 또는 10배 희석되었고 희석액 5 μL가 세포에 첨가되었다. 세포 배양 배지만을 담은 통제 집단 홈은 베이스라인 수정을 위하여 사용되었다. 상기 세포 샘플은 SLT-1A::αCD38scFv, 또는 완충액만과, 함께 5% C02 공기에서 37°C로 3일간 배양되었다. 전체 세포 생존 또는 생존율은 제조자의 지시에 따라서 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존율 분석(G7573 Promega Madison, WI, U.S.)을 사용하여 발광 출력법으로 측정되었다. 상기의 실험 홈(well)의 생존율 %는 하기의 방정식:(Test RLU - Average Media RLU) / (Average Cells RLU - Average Media RLU) * 100을 사용하여 계산되었다. 로그 폴리펩티드 농도 대 생존율 %는 프리즘(GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.)에 표시되었고 로그(저해제) 대 정규화된 반응(가변 기울기) 분석은 SLT-1A::αCD38scFv에 대한 반-최고치 세포독성 농도(CD50) 값을 측정하기 위하여 사용되었다.
용량 의존 실험은 상기의 SLT-1A::αCD38scFv의 CD50이 CD38- 세포주의 470 nM과 비교하여 세포주에 따라 CD38+ 세포의 약 0.2-0.7 nM임을 밝혔는데, 이것은 상기의 SLT-lA-유일 음성제어의 CD50과 유사하다(표 3; 도 2). 상기의 SLT-1A::αCD38scFv의 CD50은, 세포외 표적 생체분자 CD38과 물리적으로 결합된 세포(예를 들어, 세포 표면에서 CD38을 발현하는 세포주)와 비교하여 생체외 표적 생체분자 CD38과 물리적으로 결합하지 않은 세포에 대하여 약 700-3000배 크다(더 적은 세포독성)(표 3; 도 2). 상기의 역방향으로 재조합된 동일한 단백질 도메인 αCD38scFv:: SLT-1A에 대한 CD50은 약 0.8-3.2 nM으로 측정되었다(표 3; 도 2). 이것은 가공의 개선된 방향, 면역글로불린-유형 영역이 상기의 세포독성 단백질의 아미노-말단에 근위적으로 위치하지 않았고, CD38 세포에 대하여 약 4-6배 세포독성 증진이 이루어졌음을 보여준다(표 3). 이러한 결과는 세포독성 및 선택적인 세포독성 양자에 대한 "가공의 방향" 효과의 영향을 전형적으로 보여주는 예시이다. 이러한 세포독성 단백질에 대한 세포-사멸의 차이는 리보솜 불활성 또는 표적 세포-결합 특성에 대한 시험관 내 결과에 근거하여 예측할 수 없었다.
CD 50 (nM)
세포주 CD38 status SLT -1A:: αCD38scFv α CD38scFv :: SLT-1A SLT -1A 유일
음성제어
Daudi 양성 0.28 1.08 750
Raji 양성 0.68 3.21 1,100
ST486 양성 0.21 0.75 940
BC-1 양성 0.18 1.08 510
U226 음성 470.00 674.00 490
세포독성에 대한 가공 효과의 방향: 역방향 αCD38scFv::SLT-1A와 비교하여 SLT-1A::αCD38scFv에 대한 대표적인 반-최고치 세포독성 농도(CD50)
면역형광법( immunofluorescence )을 사용한 SLT -1A::α CD38scFv 및 그의 역방향 α CD38scFv :: SLT -1A의 세포 내재화 측정
표적 세포에 대한 세포독성 단백질의 능력은 본 기술 분야에서 알려진 표준적인 면역 세포 화학적 기술을 사용하여 조사되었다. 간단히, 각 세포 유형(Raji (CD38+), Ramos(CD38+), Daudi(CD38+), BC-1(CD38+), 및U266 (CD38-))의 0.8 x 106 세포는 수확되었고 단백질 분해효소 저해제(e.g. P1860 Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, U.S.)의 혼합제 및 비-특이적 면역 발광 염색을 감소하기 위한 인간 Fc 수용체 단백질을 함유한 50μL 세포 배양 배지에 현탁되었다. 다음 단계에서, 분석되기 위한 100 nM의 세포독성 단백질이 상기의 세포에 첨가되었으며, 상기 세포는 진행을 위한 마취용으로 허용되기 위하여 37°C에서 1시간 동안 배양되었다. 그런 다음, 세포는 제조자의 지시에 따라서 Cytofix/Cytoperm™ 키트(BD Biosciences San Diego, CA, U.S.)를 사용하여 "고정"되고 "침투"되어졌다. 상기의 시가 독소 작동체 영역은 쥐 단일클론성 항체(mouse IgG anti-Shiga toxin 1 Subunit A, BEI NR-867 BEI Resources, Manassas, VA, U.S.)를 사용하여 "염색"되었다. 그리고 나서, 상기의 쥐 단일클론성 항체 위치는 제조자의 지시에 따른 Alexa Fluor® 555 단일클론성 항체 표지 키트(Life Technologies, Carlsbad, CA, U.S.)로 검출되었다.
이러한 분석에서, 세포 표면 결합 및 세포 내재화는 SLT-1A::αCD38scFv 및 역방향 단백질 αCD38scFv::SLT-1A 양자의 CD38+ 세포 내에서 관측되었다. 어떠한 세포 내재화도 CD38- 세포에 대한 단백질에서는 관찰되지 않았다. 이것은 이러한 두가지 변종 사이에서 세포독성에 있어서의 차이점(표 3; 도 2)을 보여주는데, 이것은 아마도 그들의 면역글로불린-유형 결합 영역 및 시가 독소 작동체 영역의 연관되는 순서에 있어서 단지 상이한 것이며, 표적 세포 결합 및/또는 세포 진입에 있어서의 어떠한 현저한 차이점과 관련된 것은 아니다라는 것이다.
동물 모델을 사용한 세포독성 단백질 α CD38scFv :: SLT -1A의 생체 내 효과 측정
동물 모델은 종양세포 및/또는 면역 세포 CD38+에 대한 상기의 세포독성 단백질 αCD38scFv::SLT-1A의 생체 내 효과를 측정하는데 사용된다. 다양한 쥐 균주(strains)는 세포 표면에서 CD38을 발현하는 인간 종양세포 및/또는 인간 면역 세포를 쥐에게 투여하여 생겨난 이종이식 종양에 정맥내 투여 후 세포독성 단백질의 효과를 시험하기 위해 사용된다.
실시예 2. 시가-유사 독소-1의 A 서브유닛으로부터 유도된 HER2 - 표적화된 , 세포독성 단백질( SLT -1A::α HER2scFv )
이 실시예의 SLT-1A::αHER2scFv의 세포독성 단백질은 단일-사슬, 가변 단편, 고친화도로 HER2를 결합할 수 있는 결합 영역으로 재조합된 시가 독소 A 서브유닛 단편으로 이루어지며, 상기의 시가 독소 작동체 영역은 상기의 HER2 결합 영역보다 상기 세포독성 단백질의 아미노-말단에 대하여 더욱 근위적이다.
세포독성 단백질 SLT-1A::αHER2scFv의 구성, 생산, 및 정제
이 실시예에서는, 상기의 시가 독소 작동체 영역은 시가-유사 독소-1의 A 서브유닛(SLT- 1A)으로부터 유도되었다. SLT-1A의 아미노산 1-251을 부호화하는 폴리뉴클레오티드가 얻어졌다(Cheung M et al., Mol Cancer 9: 28(2010)). 면역글로불린-유형 결합 영역 αHER2scFv은 트루스투주맵(trastuzumab)(Herceptin®으로 시판되고 있는, Genentech, South San Francisco, CA) 상기에 기재된 바와 같은 단일클론성 항체(Zhao et al., J Immunol 183: 5563-74 (2009))로부터 유도되었으며, 단일-사슬 가변 단편(scFv)은 링커에 의해 분리된 두 개의 면역글로불린 가변 영역(VL 및 VH)으로 생성된다.
이 실시예에서는, 상기의 면역글로불린-유형 결합 영역 및 시가 독소 작동체 영역은 융합 단백질을 형성하기 위하여 연결되었다. 이 실시예에서는, SLT-1A(SEQ ID NO:1의 아미노산 1-251)로부터 유도된 상기 시가 독소 작동체 영역을 부호화하는 폴리뉴클레오티드는 쥐 IgG3 분자로부터 유도된 "쥐 힌지" 또는 당업자에게 알려진 다른 링커와 같은, 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 SEQ ID NO:8의 아미노산 269-512로 이루어진 면역글로불린-유형 결합 영역 αHER2scFv를 부호화하는 폴리뉴클레오티드로 복제되었다. 어떤 실험에서는, 이 실시예의 세포독성 단백질의 전장(full-length) 코딩 서열은 검출 및 정제가 되게하기 위하여 Strep-tag®를 부호화하는 폴리뉴클레오티드로 시작한다. 이 실시예의 상기 세포독성 단백질 SLT-1A::αHER2scFv를 부호화하는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 DMA 2.0, Inc.(Menlo Park, CA, U.S.)로부터의 서비스를 사용해 대장균 내에서 효과적인 발현을 위하여 최적화된 코돈이다(Menlo Park, CA, U.S.).
융합 단백질은 상기 세포독성 단백질 SLT-1A::αHER2scFv(SEQ ID NO:8)을 부호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산되었다. SLT-1A::αHER2scFv 세포독성 단백질의 발현은 박테리아 및 무세포 양자의, 단백질 번역 시스템을 사용하여 실행되었다.
이 대장균 발현 시스템에 의한 SLT-1A::αHER2scFv 생산의 실시예에서는, SLT-1A::αHER2scFv를 부호화하는 상기 폴리뉴클레오티드 "삽입" 서열은, 벡터의 아미노-말단 인테인을 부호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 결합된 세포독성 단백질 SLT-1A::αHER2scFv을 부호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 생산을 위한 표준적인 과정을 사용하여, pTxbl 벡터(New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.) 속으로 복제되었다. 상기의 플라스미드 삽입 폴리뉴클레오티드 서열은 생거 시퀀싱 방법(Functional Biosciences, Madison, WI, U.S.)에 의해 입증되었고 T7 Shuffle® 세포로 형질전환되었다(New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.). 상기의 SLT-1A::αHER2scFv 단백질이 생산되었고 IMPACT™(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag) 시스템 메뉴얼에 따라서 정제되었다(New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.). 정제는 Strep-tag®의 부동화 표적 또는 면역글로불린-유형 결합 영역을 사용하는 것과 같은, 본 기술분야에서 알려진 표준 기술을 사용하여 실행되었다.
이 무세포 단백질 번역 시스템에 의한 SLT-1A::αHER2scFv 생산의 실시예에서는, SLT-1A::αHER2scFv을 부호화하는 상기의 폴리뉴클레오티드 "삽입" 서열은 제조자의 지시에 따라 In-Fusion® FID 클로닝 키트(Clonetech, Mountain View, CA, U.S.)를 사용한 코딩 영역 직후에 종결 코돈이 있는 pIVEX2.3 벡터 속으로 복제되었다. 상기의 플라스미드 삽입 폴리뉴클레오티드 서열은 생거 시퀀싱 방법(Functional Biosciences, Madison, WI, U.S.)에 의해 입증되었다. SLT-1A::αHER2scFv 단백질은 제조자의 지시에 따른 신속한 번역 시스템 5 Prime™ RTS 100 대장균 이황화 키트(5 Prime, Gaithersburg, MD, U.S.)를 사용하여 생산되었다. 정제는 Strep-tag®의 부동화 표적 또는 면역글로불린-유형 결합 영역을 사용하는 것과 같은, 본 기술분야에서 알려진 표준 기술을 사용하여 실행되었다.
표적 세포 유형에 결합하는 SLT -1A::α HER2scFv 의 최대 특이적 결합( B max ) 및 평형 결합 상수(K D ) 결정
상기에 기술된 것과 같이 생산된 상기의 SLT-1A::αHER2scFv 단백질의 결합 특성은 형광 분석법 및 유동 세포 분석법에 의해 분석되었다. HER2 양성(+) 세포 및 HER2 음성(-) 세포를 함유하는 샘플은 1% 소혈청 알부민(BSA) (Calbiochem, San Diego, CA, U.S.)을 함유한 인산 완충 식염수(1X PBS)(Hyclone Brand, Fisher Scientific, Waltham, MA, U.S.)로 현탁 되었는데, 이후 "1X PBS+1%BSA"로 언급되며 분석을 위하여 SLT-1A::αHER2scFv 단백질의 다양한 희석액 100 μL로 4°C에서 1시간 동안 배양되었다. SLT-1A::αHER2scFv 단백질의 최고 농도는 상기의 결합 반응의 포화도를 위해 선택되었다. 1시간 동안의 배양 후에, 세포 샘플은 1X PBS+1%BSA로 두 번 세척되었다. 상기의 세포 샘플은 항-Strep-tag® mAb-FITC(#AO1736-100, Genseript, Piscataway, NJ, U.S.) 0.3 μg을 포함한 1X PBS+1%BSA 100 μL로 4°C에서 1시간 동안 배양되었다.
상기의 샘플은 1X PBS+1%BSA로 두 번 세척한 다음, 1X PBS의 200 μL로 재현탁되었고 형광 분석법 및 유동 세포 분석법에 따라 분석되었다. 모든 샘플에 대한 평균 형광 강도(MFI) 데이터는 음성제어로 FITC가 유일한 샘플을 사용한 데이터를 게이트하여 얻어졌다. 그래프는 프리즘 소프트웨어를 사용해 "세포 농도" 대 MFI로 나타내었다(GraphPad Software, San Diego, CA, U.S.). 결합-포화도 제목 하에서 프리즘 소프트웨어의 한-부위 결합 함수[Y = Bmax*X / (KD + X)]를 사용하여, 상기 Bmax 및 KD는 보정된 베이스라인 데이터를 사용하여 계산되었다. Abs 값은 PBS만을 담은 홈에 대하여 측정된 Abs 값을 빼는 것으로 배경에 대하여 보정되었다. Bmax는 MFI 내에서 보고된 최대 특이적 결합이다. KD 는 나노몰(nM) 내에서 보고된, 평형 결합 상수이다.
HER2+ 세포에 결합하는 SLT-1A::αHER2scFv의 Bmax는 약 110nM의 KD로 약 230,000 MFI로 측정되었다(표 4). 이러한 결과는 약 180 nM의 KD로 약 140,000 MFI로 측정된 HER2+에 결합하는 역방향 단백질 αHER2scFv:: SLT-1A에 대한 Bmax와 유사하다(표 4). 이 분석에 있어서 어떠한 단백질도 HER2-에 결합하지 않음이 관찰되었다. 이것은 "가공의 방향" 효과가 아마도 면역글로불린-유래 표적 세포 결합 성질의 변화와 관계되지 아니함을 보여준다.
표적 양성 세포
세포독성 단백질 표적 생체분자 B max ( MFI ) K D (nM)
SLT -1A::α HER2scFv HER2 231,000 110
α HER2scFv :: SLT -1A HER2 141,000 182
가공의 방향은 결합 특성에 대하여 어떠한 효과를 가지지 않는다: 역방향 αHER2scFv::SLT-1A와 비교한 SLT-1A::αHER2scFv에 대한 Bmax 및 KD 대표값
시험관 내에서 진핵 리보솜에 대한 SLT -1A::α HER2scFv 의 반-최대치 억제 농도(IC 50 ) 측정
SLT-1A::αHER2scFv의 리보솜 불활성 능력은 무세포 내에서, TNT® 신속 결합 전사/번역 키트(L1170 Promega, Madison, WI, U.S.)를 사용한 시험관 내 단백질 번역 분석으로 측정되었다. 상기의 키트는 루시퍼라아제 T7 조절 DNA 및 TNT® Quick Master Mix를 포함한다. 상기의 리보솜 활성 반응은 "TNT" 반응 혼합물을 생성하기 위하여 제조자의 지시에 따라서 준비되었다.
실험을 위한 SLT-1A::αHER2scFv의 10배 희석액 시리즈는 적당한 완충액 내에서 제조되었으며 동일한 TNT 반응 혼합물 성분의 시리즈는 각각의 SLT-1A::αHER2scFv의 희석액을 위하여 생성되었다. SLT-1A::αHER2scFv 단백질의 희석액 내에서의 각 샘플은 루시퍼라아제 T7 조절 DNA와 함께 TNT 반응 혼합물 각각과 결합되었다. 상기의 실험 샘플은 30°C에서 1.5시간 동안 배양되었다. 배양 후, 발광효소 분석 시약(E1483 Promega, Madison, Wl, U.S.)이 모든 실험용 샘플에 첨가되었고 루시퍼라아제 단백질 번역 용량은 제조자의 지시에 따라서 발광으로 측정되었다. 상기의 번역 억제 레벨은 전체 단백질에 대한 비교 발광 단위의 로그-변형된 농도의 비-선형 회귀 분석에 의하여 측정되었다. 통계 소프트웨어를 사용하여, 상기의 반 최고치 억제 농도(IC50)값이 각 샘플에 대하여 계산되었다. 그런 다음, 상기 데이터는 프리즘 소프트웨어의 용량-반응-저해하의 로그(저해제) 대 반응(세 개 변수)[Y = Bottom + ((Top-Bottom) / (l+10^(X-LogIC50)))] 함수를 사용하여 "SLT-1A-유일 조절 단백질 %"을 계산함에 의해 정규화되었다. 실험 단백질 및 SLT-1A-유일 조절 단백질에 대한 상기의 IC50이 계산되었다. SLT-1A-유일 조절 단백질의 %는 [(SLT-1A 조절 단백질의 IC50 / 실험 단백질의 IC50) x 100]으로 계산되었다.
무세포 단백질 합성에 대한 SLT-1A::αHER2scFv의 억제 효과는 강력하였다. 용량 의존 실험은 이러한 무세포 분석 내에서 단백질 합성에 대한 SLT-1A::αHER2scFv IC5O이 약 110pM 또는 상기 SLT-1A-유일 양성제어의 19% 내임을 밝혀내었다(표 5). 이러한 결과는 역방향 단백질 αHER2scFv::SLT-1A에 대한 IC50과는 현저히 상이하지 않았으며, 이것은 108% SLT-1A-유일 양성제어로 측정되었다(표 5). 이것은 상기의 "가공의 방향" 효과가 아마도 시가 독소 A 서브유닛 효소적 활성의 현저한 변화와 관련되지 아니함을 보여준다.
세포독성 단백질 SLT -1A 조절 단백질의
IC 50 의 %
SLT -1A::α HER2scFv 119%
α HER2scFv :: SLT -1A 108%
가공의 방향은 리보솜 불활성에 대한 어떠한 효과도 가지지 아니한다: 역방향 αHER2scFv::SLT-1A와 비교한 SLT-1A::αHER2scFv에 대한 대표적인 반-최고치 억제 농도(IC50)
세포-사멸 분석을 사용한 SLT -1A::α HER2scFv 의 선택적인 세포독성 및 반-최고치 세포독성 농도( CD 50 ) 분석
SLT-1A::αHER2scFv의 세포독성 특성은 하기의 세포-사멸 분석에 의하여 측정되었다. 이러한 분석은 표적 생체분자를 발현하지 않는 세포와 비교하여 세포독성 단백질의 면역글로불린-유형 결합 영역의 표적 생체분자를 발현하는 세포를 사멸시키기 위한 세포독성 단백질의 능력을 측정한다. 세포는 384-홈 플레이트 내 세포 배양 배지 20μL에 플레이트 되었다(홈 하나당 2 x 103 세포). 상기의 SLT-1A::αHER2scFv 단백질은 1X PBS 내에서 5배 또는 10배 희석되었고 희석액 5μL가 세포에 첨가되었다. 세포 배양 배지만을 담은 통제 집단 홈은 베이스라인 수정을 위하여 사용되었다. 상기의 샘플은 SLT-1A::αHER2scFv, 또는 단순히 완충액만과 함께 5% C02 공기에서 37°C로 3일간 배양되었다. 전체 세포 생존 또는 생존율은 제조자의 지시에 따라서 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존율 분석(G7573 Promega Madison, WI, U.S.)을 사용하여 발광 출력법으로 측정되었다. 상기의 실험 홈(well)의 생존율 %는 하기의 방정식:(Test RLU - Average Media RLU) / (Average Cells RLU - Average Media RLU) * 100을 사용하여 계산되었다. 로그 폴리펩티드 농도 대 생존율 %는 프리즘(GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.)에 나타내졌고 로그(저해제) 대 정규화된 반응(가변 기울기) 분석은 SLT-1A::αHER2scFv에 대한 반-최고치 세포독성 농도(CD50) 값을 구하기 위하여 사용되었다.
용량 의존 실험은 상기의 SLT-1A::αHER2scFv의 CD50이 HER2+ 세포에 대하여 약 0.07nM임이 밝혀졌다(표 6; 도 3). 역방향 내에서 동일한 단백질 도메인인, αHER2scFv:: SLT-1A에 대한 CD50은 약 0.64nM로 측정되었다(표 6; 도 3). HER2- 세포주 MDA-MB468에 대한 결과는 데이터에 맞는 커브를 맞출 수 없기에 불확실하였다. 표 6 및 도 3에서의 이러한 결과는 세포독성에 대한 "가공의 방향" 효과의 영향을 전형적으로 보여주는 예시가 될 것이다. 이러한 세포독성 단백질에 대한 세포-사멸의 차이는 리보솜 불활성 또는 표적 세포-결합 특성에 대한 시험관 내 결과에 근거하여 예측할 수 없었다.
CD 50 (nM)
세포주 HER2
상태 		SLT -1A:: αHER2scFv α HER2scFv :: SLT -1A SLT -1A 유일 음성제어
HCC-1954 양성 0.070 0.640 2.00
MDA-MB-468 음성 불확실 불확실 불확실
가공의 방향은 세포독성에 영향을 미친다: 역방향 αHER2scFv:: SLT-1A와 비교한 SLT-1A::αHER2scFv에 대한 대표적인 반-최고치 세포독성 농도(CD50)
면역형광법을 사용한 SLT -1A::α HER2scFv 및 그의 역방향 α HER2scFv :: SLT-1A의 세포 내재화 분석
표적 세포로 침투하는 세포독성 단백질의 능력은 본 기술 분야에서 알려진 표준적인 면역 세포 화학적 기술을 사용하여 조사되었다. 간단히, 각 세포 유형(SKBR3(HER2+) 및 MDA-MB-231(HER2-))의 0.8 x 106 세포는 수확되었고 단백질 분해효소 저해제(e.g. P1860 Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, U.S.)의 혼합제 및 비-특이적 면역 발광 염색을 감소하기 위한 인간 Fc 수용체 단백질을 함유한 50μL 세포 배양 배지에서 현탁되었다. 다음 단계에서, 분석되기 위한 100 nM의 세포독성 단백질이 상기의 세포에 첨가되었으며, 상기 세포는 진행을 위한 마취용으로 허용되기 위하여 37°C에서 1시간 동안 배양되었다. 그런 다음, 세포는 제조자의 지시에 따라서 Cytofix/Cytoperm™ 키트(BD Biosciences San Diego, CA, U.S.)를 사용하여 "고정"되고 "침투"되어졌다. 상기의 시가 독소 작동체 영역은 쥐 단일클론성 항체(mouse IgG anti-Shiga toxin 1 Subunit A, BEI NR-867 BEI Resources, Manassas, VA, U.S.)를 사용하여 "염색"되어졌다. 그리고 나서, 상기의 쥐 단일클론성 항체 위치는 제조자의 지시에 따른 Alexa Fluor® 555 단일클론성 항체 표지 키트(Life Technologies, Carlsbad, CA, U.S.)로 검출되었다.
이 분석에서, 세포 표면 결합 및 세포 내재화는 SLT-1A::αHER2scFv 및 역방향 단백질 αHER2scFv:: SLT-1A 양자에 대한 HER2+ 세포 내에서 관측되었다(도 4). 어떠한 세포 내재화도 HER2- 세포에 대한 단백질에 대해서는 관찰되지 않았다. 이것은 이러한 두 가지 세포독성 변종 사이에 있어서의 차이(표 6; 도 3)를 보여주었는데, 이것은 그들의 면역글로불린-유형 결합 영역 및 시가 독소 작동체 영역의 연관되는 순서에 있어서 단지 상이한 것이며, 아마도 표적 세포 결합 및/또는 세포 진입에 있어서의 어떠한 현저한 차이점과 관련된 것은 아니다 라는 것이다.
동물 모델을 사용한 세포독성 단백질 α HER2scFv :: SLT -1A의 생체 내 효과 측정
동물 모델은 HER2+ 종양세포에 대한 상기의 세포독성 단백질 αHER2scFv:: SLT-1A의 생체 내 효과를 측정하는데 사용된다. 다양한 쥐 균주(strains)는 세포 표면에서 HER2를 발현하는 인간 종양세포 및/또는 인간 면역 세포를 쥐에게 투여하여 생겨난 이종이식 종양에 정맥내 투여 후 세포독성 단백질의 효과를 시험하기 위해 사용된다.
실시예 3. 시가-유사 독소-1의 A 서브유닛으로부터 유도된 CD19 - 표적화된 , 세포독성 단백질( SLT -lA::α CD19scFv )
이러한 실시예 SLT-lA::αCD19scFv의 세포독성 단백질은 단일-사슬, 가변 단편, 고친화도로 CD19를 결합할 수 있는 결합 영역으로 재조합된 시가 독소 A 서브유닛 단편으로 이루어지며, 상기의 시가 독소 작동체 영역은 상기의 CD19 결합 영역보다 상기 세포독성 단백질의 아미노-말단에 대하여 더욱 근위적이다.
세포독성 단백질 SLT-lA::αCD19scFv의 구성, 생산, 및 정제
이 실시예에서는, 상기의 시가 독소 작동체 영역은 시가-유사 독소-1의 A 서브유닛(SLT- 1A)으로부터 유도되었다. SLT-1A의 아미노산 1-251을 부호화하는 폴리뉴클레오티드가 얻어졌다(Cheung M et al., Mol Cancer 9: 28 (2010)). 면역글로불린-유형 결합 영역 αCD19scFv은 인간화된 단일클론성 항체 항-CD19 4G7(Peipp M et al., J Immunol Methods 285: 265-80(2004) 및 그의 참조)로부터 유도되었으며, 단일-사슬 가변 단편(scFv)은 본 기술분야에서 알려진 링커에 의해 분리된 두 개의 면역글로불린 가변 영역(VL 및 VH)으로 생성된다.
상기의 면역글로불린-유형 결합 영역 및 시가 독소 작동체 영역은 융합 단백질을 형성하기 위하여 함께 연결되었다. 이 실시예에서는, SLT-1A(SEQ ID NO:1의 아미노산 1-251)로부터 유도된 상기 시가 독소 작동체 영역을 부호화하는 폴리뉴클레오티드는 쥐 IgG3 분자로부터 유도된 "쥐 힌지"(및 당업자에게 알려진 다른 링커)와 같은, 링커를 부호화하는 폴리뉴클레오티드 및 SEQ ID NO:12의 아미노산 269-516으로 이루어진 면역글로불린-유형 결합 영역 αCD19scFv를 부호화하는 폴리뉴클레오티드로 복제되었다. 이 실시예의 상기 세포독성 단백질 SLT-lA::αCD19scFv를 부호화하는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 DMA 2.0, Inc.(Menlo Park, CA, U.S.)로부터의 서비스를 사용한 대장균 내에서 효과적인 발현을 위하여 최적화된 코돈이다.
융합 단백질은 상기 세포독성 단백질 SLT-lA::αCD19scFv(SEQ ID NO:12)을 부호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산되었다. SLT-lA::αCD19scFv 단백질의 발현은 본 기술 분야에서 알려진 박테리아 시스템을 사용하여 실행되었다.
대장균 발현 시스템에 의한 이 SLT-lA::αCD19scFv의 실시예에서는, SLT-lA::αCD19scFv를 부호화하는 상기 폴리뉴클레오티드 "삽입" 서열은, 벡터의 아미노-말단 인테인을 부호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 결합된 세포독성 단백질 SLT-lA::αCD19scFv을 부호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 생산하기 위하여 표준적인 과정을 사용하여, pTxbl 벡터(New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.)로 복제되었다. 상기의 플라스미드 삽입 폴리뉴클레오티드 서열은 생거 시퀀싱 방법(Functional Biosciences, Madison, WI, U.S.)에 의해 입증되었고 T7 Shuffle® 세포로 형질전환되었다(New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.). 상기의 SLT-lA::αCD19scFv 단백질이 생산되었고 IMPACT™(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitsn-binding Tag) 시스템 메뉴얼에 따라서 정제되었다(New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.). 정제는 친화성 크로마토그라피와 같이, 본 기술분야에서 알려진 표준 기술을 사용하여 실행되었다.
시험관 내에서 진핵 리보솜에 대한 SLT -lA::α CD19scFv 의 반-최고치 억제 농도(IC 50 ) 측정
SLT-lA::αCD19scFv의 리보솜 불활성 능력은 TNT® 신속 결합 전사/번역 키트(L1170 Promega, Madison, WI, U.S.)를 사용한 무세포 시험관 내 단백질 번역 분석으로 측정되었다. 상기의 키트는 루시퍼라아제 T7 조절 DNA 및 TNT® Quick Master Mix를 포함한다. 상기의 리보솜 활성 반응은 "TNT" 반응 혼합물을 생성하기 위하여 제조자의 지시에 따라서 준비되었다.
실험을 위한 SLT-lA::αCD19scFv의 10배 희석액 시리즈는 적당한 완충액 내에서 제조되었으며 동일한 TNT 반응 혼합물 성분의 시리즈는 각각의 SLT-lA::αCD19scFv의 희석액을 위하여 생성되었다. SLT-lA::αCD19scFv 단백질의 희석액 내에서의 각 샘플은 루시퍼라아제 T7 조절 DNA와 함께 TNT 반응 혼합물 각각과 결합되었다. 상기의 실험 샘플은 30°C에서 1.5시간 동안 배양되었다. 배양 후, 발광효소 분석 시약(E1483 Promega, Madison, Wl, U.S.)이 모든 실험용 샘플에 첨가되었고 루시퍼라아제 단백질 번역 용량은 제조자의 지시에 따라서 발광으로 측정되었다. 상기의 번역 억제 레벨은 전체 단백질에 대한 비교 발광 단위의 로그-변형된 농도의 비-선형 회귀 분석을 측정되었다. 각 샘플의 상기의 반 최고치 억제 농도(IC50)값은 통계 소프트웨어(GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.)를 사용하여 계산되었다.
무세포 단백질 합성에 대한 SLT-lA::αCD19scFv의 억제 효과는 강력하였다. 용량 의존 실험은 이러한 무세포 분석 내에서 단백질 합성에 대한 SLT-lA::αCD19scFv IC5O이 약 5.2pM임을 밝혔다(표 7). 이러한 결과는 역방향 단백질 αCD19scFv:: SLT-1A에 대한 IC50과는 현저히 상이하지는 않았으며, 이것은 약 3.2 pM 또는 SLT-1A-유일 양성제어와 등가로 측정되었다(표 7). 이것은 상기의 "가공의 방향" 효과가 아마도 시가 독소 A 서브유닛 효소적 활성의 현저한 변화와 관련되지 아니함을 보여준다.
세포독성 단백질 IC 50 (pM) SLT -1A 유일
양성제어의 IC 50 (pM)
SLT -1A::α CD19scFv 5.2 7.9
α CD19scFv :: SLT -1A 3.2 7.9
가공의 방향은 리보솜 불활성에 대한 어떠한 효과도 가지지 아니한다: 역방향 αCD19scFv::SLT-1A와 비교한 SLT-1A::αCD19scFv에 대한 대표적인 반-최고치 억제 농도(IC50)
세포-사멸 분석을 사용한 SLT -1A::α CD19scFv 의 선택적인 세포독성 및 반-최고치 세포독성 농도(CD 50 ) 분석
SLT-1A::αCD19scFv의 세포독성 특성은 하기의 세포-사멸 분석에 의하여 측정되었다. 이러한 분석은 표적 생체분자를 발현하지 않는 세포와 비교하여 세포독성 단백질의 면역글로불린-유형 결합 영역의 표적 생체분자를 발현하는 세포를 사멸시키기 위한 세포독성 단백질의 능력을 측정한다. 세포는 384-홈 플레이트 내 세포 배양 배지 20μL에서 플레이트 되었다(홈 하나당 2 x 103 세포). 상기의 SLT-1A::αCD19scFv 단백질은 완충액 내에서 10배 희석되었고 희석액 5μL가 세포에 첨가되었다. 세포 배양 배지만을 담은 통제 집단 홈은 베이스라인 수정을 위하여 사용되었다. 상기의 샘플은 SLT-1A::αCD19scFv, 또는 단순히 완충액만과 함께 5% C02 공기에서 37°C로 3일간 배양되었다. 전체 세포 생존 또는 생존율은 제조자의 지시에 따라서 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존율 분석(G7573 Promega Madison, WI, U.S.)을 사용하여 발광 출력법으로 측정되었다. 상기의 실험 홈(well)의 생존능력 %는 하기의 방정식:(Test RLU - Average Media RLU) / (Average Cells RLU - Average Media RLU) * 100을 사용하여 계산되었다. 로그 폴리펩티드 농도 대 생존능력 %는 프리즘에 그려졌고(GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.) 로그(저해제) 대 반응(세개 매개 변수) 분석은 SLT-1A::αCD19scFv에 대한 반-최고치 세포독성 농도(CD50) 값을 측정하기 위하여 사용되었다.
용량 의존 실험은 CD19 + Daudi 세포의 SLT-1A::αCD19scFv의 CD50이 약 0.28 nM임을 밝혔다(표 8; 도 5). 상기의 SLT-lA-유일 음성제어 및 역방향 내에서 재조합된 동일 단백질 도메인 αCD19scFv:: SLT-1A은 곡선의 형태에 근거해서 정확하게 측정할 수 없었다. CD19 음성 U266 세포의 SLT-1A::αCD19scFv의 CD50은 곡선의 형태에 기인하여 계산될 수 없었다; 이러한 세포는 생체외 표적 생체분자 CD19과 물리적으로 결합되어 있지 않다. 이러한 결과는 단백질 가공의 특이적 방향, 상기 면역글로불린-유형 영역은 상기 시가 독소 작동체 영역과 관련하여 상기 세포독성 단백질의 아미노-말단에 근위적으로 위치한 것은 아니며, CD19+ 세포에 대한 세포독성 증진을 부여한다(표 8, 도 5). 이러한 세포독성 단백질에 대한 세포-사멸에 있어서의 차이점은 리보솜 불활성에 대한 시험관 내 결과에 근거하여 예측되지 않았으며 표적 세포-결합 특성에 근거하여 예측 가능하다 생각되지 않는다.
CD 50 (nM)
세포주 CD19 상태 SLT -1A::α CD19
scFv 		α CD19scFv ::
SLT -1A 		SLT -1A 유일 음성제어
Daudi 양성 0.28 NC NC
U266 음성 NC NC NC
* "NC" 는 계산할 수 없음을 나타낸다.
가공의 방향은 세포독성에 영향을 미친다: 역방향 αCD19scFv::SLT-1A와 비교한 SLT-1A::αCD19scFv에 대한 대표적인 반-최고치 세포독성(CD50)
동물 모델을 사용한 세포독성 단백질 SLT -1A::α CD19scFv 의 생체 내 효과 측정
동물 모델은 종양세포 및/또는 면역세포에 대한 상기의 세포독성 단백질 SLT-1A::αCD19scFv의 생체 내 효과를 측정하는데 사용된다. 다양한 쥐 균주(strains)는 세포 표면에서 CD19를 발현하는 인간 종양세포 및/또는 인간 면역 세포를 쥐에게 투여하여 생겨난 이종이식 종양에 정맥내 투여 후 세포독성 단백질의 효과를 시험하기 위해 사용된다.
실시예 4. 시가-유사 독소-1의 A 서브유닛으로부터 유도된 CD74 - 표적화된 , 세포독성 단백질( SLT -1A::α CD74scFv )
이 실시예의 SLT-1A::αCD74scFv의 세포독성 단백질은 단일-사슬, 가변 단편, 고친화도로 CD74를 결합할 수 있는 결합 영역으로 재조합된 시가 독소 A 서브유닛 단편으로 이루어지며, 상기의 시가 독소 작동체 영역은 상기의 CD74 결합 영역보다 상기 세포독성 단백질의 아미노-말단에 대하여 더욱 근위적이다.
세포독성 단백질 SLT-1A::αCD74scFv의 구성, 생산, 및 정제
이 실시예에서는, 상기의 시가 독소 작동체 영역은 시가-유사 독소-1의 A 서브유닛(SLT- 1A)으로부터 유도되었다. SLT-1A의 아미노산 1-251을 부호화하는 폴리뉴클레오티드가 얻어졌다(Cheung M et al., Mol Cancer 9: 28 (2010)). 면역글로불린-유형 결합 영역 αCD74scFv은 인간화된 단일클론성 항체 항-CD74, 미라투주맵 (Sapra P et al., Clin Cancer Res 11: 5257-64(2005) 및 그의 참조)로부터 유도 되었으며, 단일-사슬 가변 단편(scFv)은 링커에 의해 분리된 두 개의 면역글로불린 가변 영역(VL 및 VH)으로 생성된다.
상기의 면역글로불린-유형 결합 영역 및 시가 독소 작동체 영역은 융합 단백질을 형성하기 위하여 함께 연결되었다. 이 실시예에서는, SLT-1A(SEQ ID NO:1의 아미노산 1-251)로부터 유도된 상기 시가 독소 작동체 영역을 부호화하는 폴리뉴클레오티드는 쥐 IgG3 분자로부터 유도된 "쥐 힌지"(및 당업자에게 알려진 다른 링커)와 같은, 링커를 부호화하는 폴리뉴클레오티드 및 SEQ ID NO:16의 아미노산 269-518로 이루어진 면역글로불린-유형 결합 영역 αCD74scFv를 부호화하는 폴리뉴클레오티드로 복제되었다. 이 실시예의 상기 세포독성 단백질 SLT-1A::αCD74scFv를 부호화하는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 DMA 2.0, Inc.(Menlo Park, CA, U.S.)의 서비스를 사용한 대장균 내에서 효과적인 발현을 위하여 최적화된 코돈이다.
융합 단백질은 상기 세포독성 단백질 SLT-1A::αCD74scFv(SEQ ID NO:16)을 부호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산되었다. SLT-1A::αCD74scFv단백질의 발현은 본 기술 분야에서 알려진 박테리아 시스템을 사용하여 실행되었다.
대장균 발현 시스템에 의한 이 SLT-1A::αCD74scFv의 실시예에서는, SLT-1A::αCD74scFv를 부호화하는 상기 폴리뉴클레오티드 "삽입" 서열은, 벡터의 아미노-말단 인테인을 부호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 결합된 세포독성 단백질 SLT-1A::αCD74scFv을 부호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 생산하기 위하여 표준적인 과정을 사용하여, pTxbl 벡터(New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.)로 복제되었다. 상기의 플라스미드 삽입 폴리뉴클레오티드 서열은 생거 시퀀싱 방법(Functional Biosciences, Madison, WI, U.S.)에 의해 입증되었고 T7 Shuffle® 세포로 형질전환 되었다(New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.). 상기의 SLT-1A::αCD74scFv 단백질이 생산되었고 IMPACT™(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitsn-binding Tag) 시스템 메뉴얼에 따라서 정제되었다(New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.). 정제는 친화성 크로마토그라피와 같은, 본 기술 분야에서 알려진 표준 기술을 사용하여 실행되었다.
시험관 내에서 진핵 리보솜에 대한 SLT -1A::α CD74scFv 의 반-최고치 억제 농도(IC 50 ) 측정
SLT-1A::αCD74scFv의 리보솜 불활성 능력은 TNT® 신속 결합 전사/번역 키트(L1170 Promega, Madison, WI, U.S.)를 사용한 무세포 시험관 내 단백질 번역 분석으로 측정되었다. 상기의 키트는 루시퍼라아제 T7 조절 DNA 및 TNT® Quick Master Mix를 포함한다. 상기의 리보솜 활성 반응은 "TNT" 반응 혼합물을 생성하기 위하여 제조자의 지시에 따라서 준비되었다.
실험을 위한 SLT-1A::αCD74scFv의 10배 희석액 시리즈는 적당한 완충액 내에서 제조되었으며 동일한 TNT 반응 혼합물 성분의 시리즈는 각각의 SLT-1A::αCD74scFv의 희석액을 위하여 생성되었다. SLT-1A::αCD74scFv 단백질의 희석액 내에서의 각 샘플은 루시퍼라아제 T7 조절 DNA와 함께 TNT 반응 혼합물 각각과 결합되었다. 상기의 실험 샘플은 30°C에서 1.5시간 동안 배양되었다. 배양 후, 발광효소 분석 시약(E1483 Promega, Madison, Wl, U.S.)이 모든 실험용 샘플에 첨가되었고 루시퍼라아제 단백질 번역 용량은 제조자의 지시에 따라서 발광으로 측정되었다. 상기의 번역 억제의 수준은 전체 단백질에 대한 비교 발광 단위의 로그-변형된 농도의 비-선형 회귀 분석에 의하여 측정되었다. 통계 소프트웨어(GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.)를 사용하여, 상기의 반수 최대 억제 농도(IC50)값이 각 샘플에 대하여 계산되었다.
무세포 단백질 합성에 대한 SLT-1A::αCD74scFv의 억제 효과는 강력하였다. 용량 의존 실험은 이러한 무세포 분석 내에서 단백질 합성에 대한 SLT-1A::αCD74scFv IC5O이 약 3.6 pM 또는 SLT-1A-유일 양성제어와 등가로 측정되었다(표 9). 이것은 상기의 "가공의 방향" 효과가 아마도 시가 독소 A 서브유닛 효소적 활성의 현저한 변화와 관련되지 아니함을 보여준다.
세포독성 단백질 IC 50 (pM) SLT -1A 유일 양성 제어의 IC 50 (pM)
SLT -1A::α CD74scFv 8.7 7.9
α CD74scFv :: SLT -1A 3.6 7.9
세포-사멸 분석을 사용한 SLT -1A::α CD74scFv 의 선택적인 세포독성 및 반-최고치 억제 농도(IC 50 ) 분석
SLT-1A::αCD74scFv의 세포독성 특성은 하기의 세포-사멸 분석에 의하여 측정되었다. 이러한 분석은 상기의 결합 영역을 가지지 않는 SLT-1A 단백질과 비교하여 면역글로불린-유형 결합 영역의 표적 생체분자를 발현하는 세포를 사멸시키기 위한 세포독성 단백질의 능력을 측정한다. 세포는 384-홈 플레이트 내 세포 배양 배지 20μL에 플레이트 되었다(홈 하나당 2 x 103). 상기의 SLT-1A::αCD74scFv 단백질은 완충액 내에서 10배 희석되었고 희석액 5μL가 세포에 첨가되었다. 세포 배양 배지만을 담은 통제 집단 홈은 베이스라인 수정을 위하여 사용되었다. 상기의 샘플은 SLT-1A::αCD74scFv, 또는 단순히 완충액과 함께 5% C02 공기에서 37°C로 3일간 배양되었다. 전체 세포 생존 또는 생존율은 제조자의 지시에 따라서 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존율 분석(G7573 Promega Madison, WI, U.S.)을 사용하여 발광 출력법으로 측정되었다. 상기의 실험 홈(well)의 생존율 %는 하기의 방정식:(Test RLU - Average Media RLU) / (Average Cells RLU - Average Media RLU) * 100을 사용하여 계산되었다. 로그 폴리펩티드 농도 대 생존율 %는 프리즘 에 표시되었고(GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.) 로그(저해제) 대 반응(세개 매개변수) 분석은 SLT-1A::αCD74scFv에 대한 반-최고치 세포독성 농도(CD50) 값을 측정하기 위하여 사용되었다.
용량 의존 실험은 상기의 SLT-1A::αCD74scFv의 CD50이 CD74 + Daudi 세포에 대하여 약 18.7nM임이 밝혀졌다(표 10; 도 6). 역방향 내에서 재조합된 동일한 단백질 도메인인, αCD74scFv::SLT-1A에 대한 CD50은 95.3nM로 측정되었다(표 6; 도 3). 이것은 단백질 가공의 하나의 특이적 방향, 상기 면역글로불린-유형 영역은 상기 시가 독소 작동체 영역과 관련하여 상기 세포독성 단백질의 아미노-말단에 근위적으로 위치한 것은 아니며, CD74+ 세포에 대한 세포독성 증진을 부여하는 것을 보여준다. 이러한 세포독성 단백질에 대한 세포-사멸에 있어서의 차이점은 단백질 합성 억제에 대한 생체 외 결과에 근거하여 예측되지 않았으며 표적 세포-결합 특성에 근거하여 예측 가능하다 생각되지 않는다.
CD 50 (nM)
세포주 CD74
상태 		SLT -1A:: αCD74scFv α CD74scFv :: SLT-1A SLT -1A 유일
음성제어
Daudi 양성 18.7 95.3 2026
가공의 방향은 세포독성에 영향을 미쳤다: 역방향 αCD74scFv:: SLT-1A와 비교한 SLT-1A::αCD74scFv에 대한 대표적인 반-최고치 세포독성 농도(CD50)
동물 모델을 사용한 세포독성 단백질 SLT -1A::α CD74scFv 의 생체 내 효과 측정
동물 모델은 종양세포 및/또는 면역세포에 대한 상기의 세포독성 단백질 SLT-1A::αCD74scFv의 생체 내 효과를 측정하는데 사용된다. 다양한 쥐 균주(strains)는 세포 표면에서 CD74를 발현하는 인간 종양세포 및/또는 인간 면역 세포를 쥐에게 투여하여 생겨난 이종이식 종양에 정맥내 투여 후 세포독성 단백질의 효과를 시험하기 위해 사용된다.
요약
시가 독소 서브유닛 A 유도 영역 및 아미노-말단에 있는 영역을 표적화하는 유도된 면역글로불린으로 이루어진, 네 가지 다른 세포독성 단백질을 검사했을 때, 이러한 단백질은 리보솜 불활성 및/또는 표적 결합에 대한 그들의 시험관 내 특성에 의해서 예측된 세포독성을 보이지 않았다. 놀랍게도, 그것은 시가 독소 작동체 영역을 포함한 단백질 융합의 아미노-말단에 근위적인 이형 결합 영역 연결은, 반대 방향으로 연결된 동일한 두 가지 폴리펩티드와 비교하였을때, 강한 세포독성을 야기하지 않았다.
실시예 5. 시가-유사 독소-1의 A 서브유닛으로부터 유도된 세포독성 단백질 및 항체 α 엡스타인바 -항원
이 실시예에서는, 상기 시가 독소 작동체 영역은 시가-유사 독소 1의 A 서브유닛(SLT-1 A)으로부터 유도되었다. 면역글로불린-유형 결합 영역 α엡스타인바 항원은 엡스타인바 항원에 대한 단일클론성 항체로부터 유도되었는데(Fang C et al., J Immunol Methods 287: 21-30(2004)), 이것은 앱스타인바 바이러스 또는 엡스타인바 항원을 발현하는 형질전환 세포에 의해 감염된 인간 세포를 결합할 수 있는 면역글로불린-유형 결합 영역으로 이루어진다. 상기의 엡스타인바 항원은, 엡스타인바 바이러스 또는 엡스타인바 항원을 발현하는 형질전환 세포에 의해 감염된 세포와 같은, 다세포 유형 상에서 발현된다(예: 림프종 및 비강인두 암 세포). 나아가, 엡스테인바 감염은 다발성 경화증과 같은, 다른 질병과 관련된다.
세포독성 단백질 SLT -1A::α 엡스타인바의 구성, 생산, 및 정제
상기의 면역글로불린-유형 결합 영역 및 시가 독소 작동체 영역은 융합 단백질을 형성하기 위하여 함께 연결되었는데, 상기 면역글로불린-유형 결합 영역은 시가 독소 작동체 영역에 비교해서 상기 단백질의 아미노-말단에 근위적으로 위치하지 않았다. 예를 들어서, 융합 단백질은 상기의 α엡스타인바-항원-결합 단백질 SLT-1A::α엡스타인바를 부호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 의해 생산된다. SLT-1A::α엡스타인바 세포독성 단백질의 발현은 상기 실시예에서 언급된 박테리아 및/또는 무세포 양자의, 단백질 번역 시스템을 사용하여 실행된다.
엡스타인바 항원 양성 세포 및 엡스타인바 항원 음성 세포에 대한 이 실시예의 세포독성 단백질의 결합 특성은 상기 실시예에서 언급된 형광분석, 및 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 이러한 분석에서 엡스타인바 항원 음성 세포에 대해서는 어떠한 현저한 결합이 없는 반면, α앱스테인-바-항원양성 세포에 대한 SLT-1A::α엡스타인바의 Bmax는 0.01-1OOnM의 KD로 약 50,000-200,000 MFI임이 측정되었다.
SLT-1A::α엡스타인바 세포독성 단백질의 리보솜 불활성 능력은 상기 언급된 실시예와 같은 무세포 시험관 내 단백질 번역 내에서 측정되었다. 무세포 단백질 합성에 대한 이러한 실시예의 세포독성 단백질의 억제 효과는 현저하였다. 이러한 무세포 분석에서 단백질 합성에 대한 SLT-1A::α엡스타인바의 IC50은 약 0.1-100pM이다.
세포-사멸 분석법을 사용한 세포독성 단백질 SLT -1A::α 엡스타인바의 세포독성 분석
SLT-1A::α엡스타인바의 세포독성 특성은 엡스타인바 항원 양성 세포를 사용한 상기 실시예에서 언급된 일반적인 세포-사멸 분석으로 측정된다. 나아가, 상기 SLT-1A::α엡스타인바의 선택적인 세포독성 특성은 상기의 엡스타인바 항원 양성 세포와 비교한 엡스타인바 항원 음성 세포를 사용한 동일한 일반적 세포-사멸 분석법에 의해 측정된다. 세포주에 의존적인 엡스타인바 항원 양성 세포에 대하여 이 실시예의 상기 세포독성 단백질의 CD50은 약 0.01-100nM이다. 상기의 세포독성 단백질의 CD50은 세포 표면상 엡스타인바 항원을 발현하는 세포와 비교해서 세포 표면상 엡스타인바 항원을 발현하지 않는 세포에 대하여 약 10-10,000 배 크다(세포 독성이 덜함).
동물 모델을 사용한 세포독성 단백질 SLT -1A::α 엡스타인바의 생체 내 효과 측정
동물 모델은 종양세포에 대한 상기의 세포독성 단백질 SLT-1A::α엡스타인바의 생체 내 효과를 측정하는데 사용된다. 다양한 쥐 균주는 세포 표면에서 엡스타인바 항원을 발현하는 인간 종양세포 및/또는 인간 면역 세포를 쥐에게 투여하여 생겨난 이종이식 종양에 정맥내 투여 후 세포독성 단백질의 효과를 시험하기 위해 사용된다.
실시예 6. 시가-유사 독소-1의 A 서브유닛으로부터 유도된 세포독성 단백질 및 항체 α 리슈만편모충 -항원
이 실시예에서는, 상기 시가 독소 작동체 영역은 시가-유사 독소 1의 A 서브유닛(SLT-1A)으로부터 유도되었다. 면역글로불린-유형 결합 영역 α리슈만편모충 항원은 파동편모충류 원생동물 세포 간 잠복이 있는 인간 세포 상에 존재하는 세포-표면 리슈만편모충 항원에 대하여, 본 기술 분야에서 알려진 기술을 사용하여 생성된 항체로부터 유도된다(Silveira T et al., Int J Parasitol 31: 1451-8(2001); Kenner J et al., J Cutan Pathol 26: 130-6(1999); Berman J and Dwyer, Clin Exp Immunol 44: 342-348(1981) 참조).
세포독성 단백질 SLT-1A::α리슈만편모충의 구성, 생산, 및 정제
상기의 면역글로불린-유형 결합 영역 α리슈만편모충-항원 및 시가 독소 작동체 영역은 단백질을 형성하기 위하여 함께 연결되었는데, 상기 면역글로불린-유형 결합 영역은 시가 독소 작동체 영역에 비교해서 상기 단백질의 아미노-말단에 근위적으로 위치하지 않았다. 예를 들어서, 융합 단백질은 상기의 리슈만편모충-항원-결합 단백질 SLT-1A::α리슈만편모충를 부호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산된다. SLT-1A::α리슈만편모충 세포독성 단백질의 발현은 상기 전 실시예에서 언급된 박테리아 및/또는 무세포 양자의, 단백질 번역 시스템을 사용하여 실행된다.
세포독성 단백질 SLT -1A::α 리슈만편모충의 시험관 내 특성의 측정
리슈만편모충 항원 양성 세포 및 리슈만편모충 항원 음성 세포에 대한 이 실시예의 세포독성 단백질의 결합 특성은 상기 실시예에서 언급된 형광분석, 및 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 이러한 분석에서 리슈만편모충 항원 음성 세포에 대해서는 어떠한 현저한 결합이 없는 반면, α리슈만편모충-항원 양성 세포에 대한 SLT-1A::α리슈만편모충의 Bmax는 0.01-1OOnM의 KD로 약 50,000-200,000 MFI임이 측정되었다.
SLT-1A::α리슈만편모충 세포독성 단백질의 리보솜 불활성 능력은 상기 언급된 실시예와 같은 무세포 시험관 내 단백질 번역 내에서 측정되었다. 무세포 단백질 합성에 대한 이 실시예의 세포독성 단백질의 억제 효과는 현저하였다. 이러한 무세포 분석에서 단백질 합성에 대한 SLT-1A::α리슈만편모충의 IC50은 약 0.1-100pM이다.
세포-사멸 분석법을 사용한 세포독성 단백질 SLT -1A::α 리슈만편모충의 세포독성 분석
SLT-1A::α리슈만편모충의 세포독성 특성은 리슈만편모충 항원 양성 세포를 사용한 상기 언급된 실시예로서 일반적인 세포-사멸 분석에 의해 측정된다. 나아가, 상기 SLT-1A::α리슈만편모충의 선택적인 세포독성 특성은 상기의 리슈만편모충 항원 양성 세포와 비교한 리슈만편모충 항원 음성 세포를 사용한 동일한 일반적 세포-사멸 분석법에 의해 측정된다. 이 실시예의 상기 세포독성 단백질의 CD50은 세포주에 의존적인 리슈만편모충 항원 양성 세포에 대하여 약 0.01-100 nM이다. 상기의 세포독성 단백질의 CD50은 세포 표면상 리슈만편모충 항원을 발현하는 세포와 비교해서 세포 표면상 리슈만편모충 항원을 발현하지 않는 세포에 대하여 약 10-10,000 배 크다(세포 독성이 덜함).
실시예 7. 시가-유사 독소-1의 A 서브유닛으로부터 유도된 세포독성 단백질 및 면역글로불린 결합 영역 α 뉴로텐신 -수용체
이러한 실시예에서, 상기 시가 독소 작동체 영역은 시가-유사 독소 1의 A 서브유닛(SLT-1 A)으로부터 유도되었다. 면역글로불린-유형 결합 영역 α뉴로텐신-수용체는 DARPin™(GenBank Accession: 2P2C_R) 또는 인간 뉴로텐신 수용체에 결합하는 단일클론성 항체로부터 유도된다. 상기의 뉴로텐신 수용체는 유방암, 대장암, 폐암, 흑색종 및 췌장암 세포와 같은 다양한 암 세포에 의해 발현된다.
세포독성 단백질 SLT-1A::α뉴로텐신R의 구성, 생산, 및 정제
상기의 면역글로불린-유형 결합 영역 α뉴로텐신R 및 시가 독소 작동체 영역은 단백질을 형성하기 위하여 함께 연결되었는데, 상기 면역글로불린-유형 결합 영역은 시가 독소 작동체 영역에 비교해서 상기 단백질의 아미노-말단에 근위적으로 위치하지 않았다. 예를 들어서, 융합 단백질은 상기의 α뉴로텐신-수용체-결합 단백질 SLT-1A::α뉴로텐신R을 부호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산된다. SLT-1A::α뉴로텐신R 세포독성 단백질의 발현은 상기 전 실시예에서 언급된 박테리아 및/또는 무세포 양자의, 단백질 번역 시스템을 사용하여 실행된다.
세포독성 단백질 SLT -1A::α 뉴로텐신 R의 시험관 내 특성의 측정
뉴로텐신 수용체 항원 양성 세포 및 뉴로텐신 수용체 음성 세포에 대한 이러한 실시예의 세포독성 단백질의 결합 특성은 상기 실시예에서 언급된 형광분석, 및 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 이러한 분석에서 뉴로텐신 수용체 음성 세포에 대해서는 어떠한 현저한 결합이 없는 반면, 뉴로텐신 수용체 양성 세포에 대한 SLT-1A::α뉴로텐신R의 Bmax는 0.01-1OO nM의 KD로 약 50,000-200,000 MFI임이 측정되었다.
SLT-1A::α뉴로텐신R 세포독성 단백질의 리보솜 불활성 능력은 상기 언급된 실시예와 같은 무세포 시험관 내 단백질 번역 내에서 측정되었다. 무세포 단백질 합성에 대한 이 실시예의 세포독성 단백질의 억제 효과는 현저하였다. 이러한 무세포 분석에서 단백질 합성에 대한 SLT-1A::α뉴로텐신R의 IC50은 약 0.1-100pM이다.
세포-사멸 분석법을 사용한 세포독성 단백질 SLT -1A::α 뉴로텐신 R의 세포독성 분석
SLT-1A::α뉴로텐신R의 세포독성 특성은 뉴로텐신 수용체 양성 세포를 사용한 상기 언급된 실시예로서 일반적인 세포-사멸 분석에 의해 측정된다. 나아가, 상기 SLT-1A::α뉴로텐신R의 선택적인 세포독성 특성은 상기의 엡스타인바 항원 양성 세포와 비교한 뉴로텐신 수용체 음성 세포를 사용한 동일한 일반적 세포-사멸 분석법에 의해 측정된다. 이 실시예의 상기 세포독성 단백질의 CD50은 세포주에 의존적인 뉴로텐신 수용체 양성 세포에 대하여 약 0.01-100 nM이다. 상기의 세포독성 단백질 CD50은 세포 표면상 뉴로텐신 수용체를 발현하는 세포와 비교해서 세포 표면상 뉴로텐신 수용체를 발현하지 않는 세포에 대하여 약 10-10,000 배 크다(세포 독성이 덜함).
동물 모델을 사용한 세포독성 단백질 SLT -1A::α 뉴로텐신 R의 생체 내 효과 측정
동물 모델은 종양세포에 대한 상기의 세포독성 단백질 SLT-1A::α뉴로텐신R의 생체 내 효과를 측정하는데 사용된다. 다양한 쥐 균주는 세포 표면에서 뉴로텐신 수용체를 발현하는 인간 종양세포 및/또는 인간 면역 세포를 쥐에게 투여하여 생겨난 이종이식 종양에 정맥내 투여 후 세포독성 단백질의 효과를 시험하기 위해 사용된다.
실시예 8. 시가-유사 독소-1의 A 서브유닛으로부터 유도된 세포독성 단백질 및 면역글로불린-유형 결합 영역 α EGFR
이 실시예에서는, 상기 시가 독소 작동체 영역은 시가-유사 독소 1의 A 서브유닛(SLT-1A)으로부터 유도되었다. 면역글로불린-유형 결합 영역 αEGFR은 AdNectin™(GenBank Accession: 3QWQ_B), Affibody™(GenBank Accession: 2KZI_A; U.S. patent 8,598,113), 또는 하나 이상의 인간 상피세포 성장 인자 수용체에 결합하는 모든 항체로부터 유도된다. 상피세포 성장 인자 수용체의 발현은 폐암 세포, 유방암 세포, 및 대장암 세포와 같은 인간 암 세포와 연관되어 있다.
세포독성 단백질 SLT -1A::α EGFR 의 구성, 생산, 및 정제
상기의 면역글로불린-유형 결합 영역αEGFR 및 시가 독소 작동체 영역은 단백질을 형성하기 위하여 함께 연결되었는데, 상기 면역글로불린-유형 결합 영역은 시가 독소 작동체 영역에 비교해서 상기 단백질의 아미노-말단에 근위적으로 위치하지 않았다. 예를 들어서, 융합 단백질은 상기의 EGFR 결합 단백질 SLT-1A::αEGFR를 부호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산된다. SLT-1A::αEGFR 세포독성 단백질의 발현은 상기 전 실시예에서 언급된 박테리아 및/또는 무세포 양자의, 단백질 번역 시스템을 사용하여 실행된다.
세포독성 단백질 SLT -1A::α EGFR 의 시험관 내 특성의 측정
EGFR+ 세포 및 EGFR- 세포에 대한 이 실시예의 세포독성 단백질의 결합 특성은 상기 실시예에서 언급된 형광분석, 및 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 이러한 분석에서 EGFR- 세포에 대해서는 어떠한 현저한 결합이 없는 반면, EGFR+ 세포에 대한 SLT-1A::αEGFR의 Bmax는 0.01 -1OO nM의 KD로 약 50,000-200,000 MFI임이 측정되었다.
SLT-1A::αEGFR 세포독성 단백질의 리보솜 불활성 능력은 상기 언급된 실시예와 같은 무세포 시험관 내 단백질 번역 내에서 측정되었다. 무세포 단백질 합성에 대한 이러한 실시예의 세포독성 단백질의 억제 효과는 현저하였다. 이러한 무세포 분석에서 단백질 합성에 대한 SLT-1A::αEGFR의 IC50은 약 0.1 - 100pM이다.
세포-사멸 분석법을 사용한 세포독성 단백질 SLT -1A::α EGFR 의 세포독성 분석
SLT-1A::αEGFR의 세포독성 특성은 EGFR+ 세포를 사용한 상기 언급된 실시예로서 일반적인 세포-사멸 분석에 의해 측정된다. 나아가, 상기 SLT-1A::αEGFR의 선택적인 세포독성 특성은 상기의 EGFR+ 세포와 비교한 EGFR- 세포를 사용한 동일한 일반적 세포-사멸 분석법에 의해 측정된다. 이러한 실시예의 상기 세포독성 단백질의 CD50은 세포주에 의존적인 EGFR+ 세포에 대하여 약 0.01-100 nM이다. 상기의 세포독성 단백질 CD50은 세포 표면상 EGFR을 발현하는 세포와 비교해서 세포 표면상 EGFR을 발현하지 않는 세포에 대하여 약 10-10,000 배 크다(세포 독성이 덜함).
동물 모델을 사용한 세포독성 단백질 SLT -1A::α EGFR 의 생체 내 효과 측정
동물 모델은 종양세포에 대한 상기의 세포독성 단백질 SLT-1A::αEGFR의 생체 내 효과를 측정하는데 사용된다. 다양한 쥐 균주는 세포 표면에서 EGFR을 발현하는 인간 종양세포 및/또는 인간 면역 세포를 쥐에게 투여하여 생겨난 이종이식 종양에 정맥내 투여 후 세포독성 단백질의 효과를 시험하기 위해 사용된다.
실시예 9. 시가-유사 독소-1의 A 서브유닛으로부터 유도된 세포독성 단백질 및 항체 α CCR5
이 실시예에서는, 상기 시가 독소 작동체 영역은 시가-유사 독소 1의 A 서브유닛(SLT-1A)으로부터 유도되었다. 면역글로불린-유형 결합 영역 αCCR5은 CCR5에 대한 단일클론성 항체로부터 유도되었다(CD195)(Bernstone L et al., Hybridoma 31: 7-19(2012)). CCR5은, 대개 T-세포, 마크로파아지, 수상돌기 세포, 및 소교세포 상에서 발현된다(예: 림프종 및 비강인두 암 세포). 나아가, CCR5은 발병의 역할을 하고 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)를 전파시키는 역할을 한다.
세포독성 단백질 SLT-1A::αCCR5의 구성, 생산, 및 정제
상기의 면역글로불린-유형 결합 영역 CCR5 및 시가 독소 작동체 영역은 단백질을 형성하기 위하여 함께 연결되었는데, 상기 면역글로불린-유형 결합 영역은 시가 독소 작동체 영역에 비교해서 상기 단백질의 아미노-말단에 근위적으로 위치하지 않았다. 예를 들어서, 융합 단백질은 상기의 αCCR5-결합 단백질 SLT-1A::αCCR5를 부호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산된다. SLT-1A::αCCR5 세포독성 단백질의 발현은 상기 전 실시예에서 언급된 박테리아 및/또는 무세포 양자의, 단백질 번역 시스템을 사용하여 실행된다.
세포독성 단백질 SLT -1A::α CCR5 의 시험관 내 특성의 측정
CCR5+ 세포 및 CCR5- 세포에 대한 이 실시예의 세포독성 단백질의 결합 특성은 상기 실시예에서 언급된 형광분석, 및 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 이러한 분석에서 CCR5- 세포에 대해서는 어떠한 현저한 결합이 없는 반면, CCR5+ 세포에 대한 SLT-1A::αCCR5의 Bmax는 0.01 -1OOnM의 KD로 약 50,000-200,000 MFI임이 측정되었다.
SLT-1A::αCCR5 세포독성 단백질의 리보솜 불활성 능력은 상기 언급된 실시예와 같은 무세포 시험관 내 단백질 번역 내에서 측정되었다. 무세포 단백질 합성에 대한 이 실시예의 세포독성 단백질의 억제 효과는 현저하였다. 이러한 무세포 분석에서 단백질 합성에 대한 SLT-1A::αCCR5의 IC50은 약 0.1-100pM이다.
세포-사멸 분석법을 사용한 세포독성 단백질 SLT -1A::α CCR5 의 세포독성 분석
SLT-1A::αCCR5의 세포독성 특성은 CCR5+ 세포를 사용한 상기 언급된 실시예로서 일반적인 세포-사멸 분석에 의해 측정된다. 나아가, 상기 SLT-1A:: αCCR5의 선택적인 세포독성 특성은 상기의 CCR5+ 세포와 비교한 CCR5- 세포를 사용한 동일한 일반적 세포-사멸 분석법에 의해 측정된다. 이 실시예의 상기 세포독성 단백질의 CD50은 세포주에 의존적인 CCR5+ 세포에 대하여 약 0.01-100nM이다. 상기의 세포독성 단백질 CD50은 세포 표면상 CCR5을 발현하는 세포와 비교해서 세포 표면상 CCR5을 발현하지 않는 세포에 대하여 약 10-10,000 배 크다(세포 독성이 덜함).
동물 모델을 사용한 세포독성 단백질 SLT -1A::α CCR5 의 생체 내 효과 측정
동물 모델은 도너 물질(donor material)로부터 T-세포를 제거하는데 있어서 상기의 세포독성 단백질 SLT-1A::αCCR5의 생체 내 효과를 측정하는데 사용된다(Tsirigotis P et al., Immunotherapy 4: 407-24(2012) 참조). 비-인간 영장류는 SLT-1A::αCCR5의 생체 내 효과를 측정하기 위하여 사용된다. 이식편대숙주 질환은 증여된 기관이 SLT-1A::αCCR5로 사전 처리되었을 때 신장 이식 후의 히말라야 원숭이에서 분석된다(Weaver T et al., Nat Med 15: 746-9(2009) 참조). 게먹이 원숭이에 있어서의 말초혈 T 림프구의 생체 내 방혈은 SLT-1A::αCCR5의 다른 용량의 비경구 투약 이후에 관찰되었다. HIV 감염을 차단하기 위한 SLT-1A::αCCR5의 사용은 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)에 노출된 순환하는 T-세포를 엄격하게 제거하기 위하여 비-인간 영장류에 대한 격심한(acute) 양의 SLT-1A::αCCR5를 줌에 의해 실험된다(Seilier P et al., PLoS One 5: e10570(2010) 참조).
실시예 10. 시가-유사 독소-1의 A 서브유닛으로부터 유도된 세포독성 단백질 및 항-Env 면역글로불린 도메인
이 실시예에서는, 상기 시가 독소 작동체 영역은 시가 독소의 A 서브유닛(Stx-A)으로부터 유도되었다. 면역글로불린-유형 결합 영역 αEnv은 GP41, GP120, GP140, 또는 GP160(예: Chen W et al., J Mol Bio 382: 779-89(2008); Chen W et al., Expert Opin Biol Ther 13: 657-71(2013); van den Kerkhof T et al., Retrovirology 10: 102(2013))과 같은 HIV 외피 당단백질을 결합하는 존재하는 항체 또는 표준적인 기술(Prabakaran et al., Front Microbiol 3: 277(2012) 참조)을 사용하여 생성된 항체로부터 유도되었다. Env는 HIV 복제 과정 동안 HIV-감염된 세포의 세포 표면상에서 또한 나타나는 HIV 표면 단백질이다. 비록 Env가 대개 엔도조말 구획 내의 감염된 세포 내에서 발현된다 하더라도, 세포 표면상에 본 발명의 매우 강력한 단백질에 의해 표적화 될수 있는 충분항 양의 Env가 있을 수 있다. 나아가, Env-표적화 세포독성 단백질은 HIV 바이러스 입자를 결합할 수 있고 숙주세포와 함께 바이러스의 융합과정 동안 새롭게 감염된 세포 속으로 들어갈 수 있다.
HIV가 매우 높은 돌연변율을 나타내기 때문에, 그것은 복수의 HIV 균주로부터의 Env를 결합하는 광범위한 중화항체가 보이는 것과 같은, Env의 기능적인 제한 부분을 결합하는 면역글로불린 도메인을 사용하는 것이 바람직하다(van den Kerkhof T et al., Retrovirology 10: 102(2013)). 상기의 감염된 세포의 표면상에 존재하는 Env는 입체적으로(sterically) 제한된 항원결정기를 나타내는 것으로 믿어지기 때문에(Chen W et al., J Virol 88: 1125-39(2014)), VHH 도메인 같은 sdAb의 단편과 같이, 100 kD보다 작은, 이상적으로는 25 kD보다 작은 결합 영역을 사용하는 것이 바람직하다.
세포독성 단백질 αEnv::SLT-1A의 구성, 생산, 및 정제
상기의 면역글로불린-유형 결합 영역 αEnv 및 시가 독소 작동체 영역은 단백질을 형성하기 위하여 함께 연결되었다. 예를 들어서, 융합 단백질은 상기의 αEnv-결합 단백질 SLT-1A::αEnv를 부호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산된다. SLT-1A::αEnv 세포독성 단백질의 발현은 상기 전 실시예에서 언급된 박테리아 및/또는 무세포 양자의, 단백질 번역 시스템을 사용하여 실행된다.
세포독성 단백질 SLT -1A::α Env 의 시험관 내 특성의 측정
Env+ 세포 및 Env- 세포에 대한 이 실시예의 세포독성 단백질의 결합 특성은 상기 실시예에서 언급된 형광분석, 및 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 이러한 분석에서 Env- 세포에 대해서는 어떠한 현저한 결합이 없는 반면, Env+ 세포에 대한 SLT-1A::αEnv의 Bmax는 0.01 -1OO nM의 KD로 약 50,000-200,000 MFI임이 측정되었다.
SLT-1A::αEnv 세포독성 단백질의 리보솜 불활성 능력은 상기 언급된 실시예와 같은 무세포 시험관 내 단백질 번역 내에서 측정되었다. 무세포 단백질 합성에 대한 이러한 실시예의 세포독성 단백질의 억제 효과는 현저하였다. 이러한 무세포 분석에서 단백질 합성에 대한 SLT-1A::αEnv의 IC50은 약 0.1 - 100 pM이다.
세포-사멸 분석을 사용한 세포독성 단백질 SLT -1A::α Env 의 세포독성 측정
SLT-1A::αEnv의 세포독성 특성은 Env+ 세포를 사용한 상기 언급된 실시예의 일반적인 세포-사멸 분석에 의해 측정된다. 나아가, 상기 SLT-1A:: αEnv의 선택적인 세포독성 특성은 상기의 Env+ 세포와 비교한 Env- 세포를 사용한 동일한 일반적 세포-사멸 분석법에 의해 측정된다. 이러한 실시예의 상기 세포독성 단백질의 CD50은 세포주에 의존적인 Env+ 세포 및/또는 그들을 Env+로 만들기 위하여 세포를 감염시키는데 사용된 HIV에 대하여 약 0.01 - 100 nM이다. 상기의 세포독성 단백질의 CD50은 세포 표면상 Env을 발현하는 세포와 비교해서 세포 표면상 Env을 발현하지 않는 세포에 대하여 약 10-10,000 배 크다(세포 독성이 덜함).
동물 모델을 사용한 세포독성 단백질 SLT -1A::α Env 의 생체 내 효과 측정
HIV 감염을 억제하기 위한 SLT-1A::αEnv의 사용은 유인원 면역결핍 바이러스(SIV) 감염된 비-인간 영장류에 SLT-1A::αEnv를 투약하여 실험된다(Seilier P et al., PLoS One 5: e10570(2010) 참조).
실시예 11. 시가-유사 독소-1의 A 서브유닛으로부터 유도된 세포독성 단백질 및 항체 α UL18
이 실시예에서는, 상기 시가 독소 작동체 영역은 시가-유사 독소 1의 A 서브유닛(SLT-1A)으로부터 유도되었다. 면역글로불린-유형 결합 영역 αUL18은 세포-표면 거대세포 바이러스 단백질 UL18에 대하여, 본 기술분야에서 알려진 기술을 사용하여 생산된 항체로부터 유도되는데, 그것은 거대세포에 감염된 인간 세포 상에 존재한다(Yang Z, Bjorkman P, Proc Natl Acad Sci USA 105: 10095-100(2008)). 상기의 인간 거대세포 감염은 다양한 암 및 염증성 장애와 연관되어있다.
세포독성 단백질 SLT-1A::αUL18의 구성, 생산, 및 정제
상기의 면역글로불린-유형 결합 영역 αUL18 및 시가 독소 작동체 영역은 단백질을 형성하기 위하여 함께 연결되었는데, 상기 면역글로불린-유형 결합 영역은 시가 독소 작동체 영역에 비교해서 상기 단백질의 아미노-말단에 근위적으로 위치하지 않았다. 예를 들어서, 융합 단백질은 상기의 αUL18-결합 단백질 SLT-1A::αUL18를 부호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산된다. SLT-1A::αUL18 세포독성 단백질의 발현은 상기에서 전 실시예에서 언급된 박테리아 및/또는 무세포의, 단백질 번역 시스템을 사용하여 완성된다.
세포독성 단백질 SLT -1A::α UL18 의 시험관 내 특성의 측정
거대세포 단백질 UL18+ 세포 및 거대세포 단백질 UL18- 세포에 대한 이 실시예의 세포독성 단백질의 결합 특성은 상기 실시예에서 언급된 형광분석, 및 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 이러한 분석에서 거대세포 단백질 UL18- 세포에 대해서는 어떠한 현저한 결합이 없는 반면, 거대세포 단백질 UL18+ 세포에 대한 SLT-1A::αUL18의 Bmax는 0.01-1OO nM의 KD로 약 50,000 - 200,000 MFI임이 측정되었다.
SLT-1A::αUL18 세포독성 단백질의 리보솜 불활성 능력은 상기 언급된 실시예와 같은 무세포 시험관 내 단백질 번역 내에서 측정되었다. 무세포 단백질 합성에 대한 이러한 실시예의 세포독성 단백질의 억제 효과는 현저하였다. 이러한 무세포 분석에서 단백질 합성에 대한 SLT-1A::αUL18의 IC50은 약 0.1-100 pM이다.
세포-사멸 분석법을 사용한 세포독성 단백질 SLT -1A::α UL18 의 세포독성 분석
SLT-1A::αUL18의 세포독성 특성은 거대세포 단백질 UL18+ 세포를 사용한 상기 언급된 실시예의 일반적인 세포-사멸 분석에 의해 측정된다. 나아가, 상기 SLT-1A::αUL18의 선택적인 세포독성 특성은 상기의 UL18+ 세포와 비교한 거대세포 단백질 UL18- 세포를 사용한 동일한 일반적 세포-사멸 분석법에 의해 측정된다. 이러한 실시예의 상기 세포독성 단백질의 CD50은 세포주에 의존적인 UL18+ 세포에 대하여 약 0.01-100 nM이다. 상기의 세포독성 단백질 CD50은 세포 표면상 UL18을 발현하는 세포와 비교해서 세포 표면상 UL18을 발현하지 않는 세포에 대하여 약 10-10,000 배 크다(세포 독성이 덜함).
실시예 12. 시가-유사 독소-1의 A 서브유닛으로부터 유도된 세포독성 단백질 및 항체 α 연충 -창자-항원
이 실시예에서는, 상기 시가 독소 작동체 영역은 시가-유사 독소 1의 A 서브유닛(SLT-1A)으로부터 유도되었다. 면역글로불린-유형 결합 영역 α연충-창자-항원(αHelminth-Intestinal-Antigen)은 인간 트랜스페린 수용체의 기생충 오르소로그에 대하여, 본 기술분야에서 알려진 기술을 사용하여 생성된 항체로부터 유도된다(예: 선충 유전자 gcp-2.1 UniProt G8JYE4_CAEEL; Rosa B et al., Mol Cell Proteomics M114.046227(2015) 참조).
세포독성 단백질 SLT -1A::α 연충 -창자-항원의 구성, 생산, 및 정제
상기의 면역글로불린-유형 결합 영역 α연충-창자-항원 및 시가 독소 작동체 영역은 단백질을 형성하기 위하여 함께 연결되었는데, 상기 면역글로불린-유형 결합 영역은 시가 독소 작동체 영역에 비교해서 상기 단백질의 아미노-말단에 근위적으로 위치하지 않았다. 예를 들어서, 융합 단백질은 상기의 α연충-창자-항원 결합 단백질 SLT-1A::α연충-창자-항원을 부호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 생산된다. SLT-1A::α연충-창자-항원 세포독성 단백질의 발현은 상기에서 전 실시예에서 언급된 박테리아 및/또는 무세포 양자의, 단백질 번역 시스템을 사용하여 실행된다.
세포독성 단백질 SLT -1A::α 연충 -창자-항원의 시험관 내 특성의 측정
이 실시예의 세포독성 단백질의 결합 특성은 본 기술분야에서 알려진 정제된 재조합 표적 단백질을 사용한 분자 결합 분석법에 의해 측정되었다. 이러한 분석에서, 음성제어 단백질(예를 들어, 정제된, 재조합, 인간 전달 수용체)에 대해서는 어떠한 현저한 결합이 없는 반면, 표적 단백질에 대한 SLT-1A::α연충-창자-항원의 KD는 약 100 nM으로 측정되었다.
SLT-1A::α연충-창자-항원 세포독성 단백질의 리보솜 불활성 능력은 상기 언급된 실시예와 같은 무세포 시험관 내 단백질 번역 내에서 측정되었다. 무세포 단백질 합성에 대한 이러한 실시예의 세포독성 단백질의 억제 효과는 현저하였다. 이러한 무세포 분석에서 단백질 합성에 대한 SLT-1A::α연충-창자-항원의 IC50은 약 0.1-100 pM이다.
연충을 사용한 세포독성 단백질 SLT -1A::α 연충 -창자-항원의 독성 효과 측정
연충에 대한 SLT-1A::α연충-창자-항원의 독성 효과는 연충 모델을 사용하여 측정된다(예: Iatsenko I et al., Toxins 2050-63(2014) 참조). 상기의 연충은 소킹(soaking) 또는 SLT-1A::α연충-창자-항원 융합 단백질을 발현하는 박테리아를 상기 연충에게 피딩(feeding)하여 정제된 SLT-1A::α연충-창자-항원을 투여할 수 있다.
나아가, 연충을 갖고 있고/또는 연충과 관련된 질병을 보이는 실험실 동물은 연충 및/또는 연충으로 인한 관련 증상의 감소 또는 제거를 위하여 SLT-1A::α연충-창자-항원을 투여하고 모니터한다.
실시예 13. 다양한 세포 유형을 표적화하는 세포독성 단백질
이 실시예에서는, 상기 시가 독소 작동체 영역은 시가-유사 독소 1의 A 서브유닛(SLT-1A), 시가 독소(StxA), 및/또는 시가-유사 독소 2의 A 서브유닛(SLT-2A)으로부터 유도되었다. 면역글로불린-유형 결합 영역은 표 11의 세로열 2가 명시한 세포외 표적 생체분자를 결합하는 표 11의 세로열 1로부터 선택된 분자의 면역글로불린 도메인으로부터 유도된다. 이 실시예의 모범적인 세포독성 단백질은 본 기술 분야에서 알려진 기술을 사용하여 아미노-말단 근위 시가 독소 작동체 영역으로 생성되며, 선택적으로 검출 촉진제와 연결된다. 이 실시예의 모범적인 세포독성 단백질은 전 실시예에서 언급된 것과 같이 적절한 세포 외 표적 생체분자를 발현하는 세포를 사용하여 생성되고 실험된다. 이 실시예의 모범적인 단백질은 예를 들어, 표 11의 세로열 3에 명시된 질병, 장애, 및/또는 증상을 진단하고 치료하는데 사용된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
세포독성 단백질의 세포 표적화에 대한 다양한 면역글로불린-유형 결합 영역
본 발명의 어떤 구체예가 도해의 방식에 의해 기술되는 동안, 본 발명은 다양한 변형, 변이 및 적용으로 실행될 수 있고, 본 발명의 정신을 벗어나지 않고 청구범위를 넘지 않는 한도 내에서 본 발명이 속한 기술 분야의 전문가에 의한 수많은 균등체 또는 선택적인 해결책의 사용으로 실행될 수 있다.
모든 공개된 간행물, 특허, 및 특허 출원은 만약 개인적인 공개, 특허 또는 특허 출원이 특별하게 개인적으로 그것의 전체에서 선행기술로 기술될 수 있다면 동일한 범위에 대하여 선행기술로 여기에서 기술된다. 국제 특허 출원 공개 WO 제2014164680 A1호 및 WO 제2014164693 A2호는 각각 그것의 전체로 선행기술로서 본 발명에 기술되었다. 미국 특허 출원 제61/951,110호, 제61/951,121호, 및 제62/010,918호는 각각 그것 전체로 선행기술로서 본 발명에 기술되었다. 국제 PCT 특허 출원 번호 제PCT/US2014/023,198호, 제PCT/US2014/023,231호, 제PCT/US2015 /012,968호, 제PCT/US2015/012,970호, 및 제PCT/US2015/14,472호는 각각 전체로서 선행기술로 참증되었다. 본 발명에서 인용된 아미노산 및 뉴클레오티드 서열에 대해서 GenBank(National Center for Biotechnology Information, U.S.)로부터의 모든 전자적으로 허용가능한 생물학적 서열 정보의 완벽한 개재가 각각 참증자료로서 본문에 있다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
SEQUENCE LISTING <110> MOLECULAR TEMPLATES, INC. <120> PROTEINS COMPRISING AMINO-TERMINAL PROXIMAL SHIGA TOXIN A SUBUNIT EFFECTOR REGIONS AND CELL-TARGETING IMMUNOGLOBULIN-TYPE BINDING REGIONS <130> 14-04PCT <140> PCT/US2015/019708 <141> 2015-03-10 <150> 61/951,121 <151> 2014-03-11 <160> 101 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 293 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 1 5 10 15 Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser 20 25 30 Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp Asn 35 40 45 Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60 Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80 Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95 His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110 Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125 Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140 His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160 Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg 165 170 175 Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190 Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205 Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile 210 215 220 Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu 225 230 235 240 Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu 245 250 255 Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His 260 265 270 Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Met Arg 275 280 285 Arg Thr Ile Ser Ser 290 <210> 2 <211> 293 <212> PRT <213> Shigella dysenteriae <400> 2 Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 1 5 10 15 Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser 20 25 30 Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45 Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60 Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80 Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95 His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110 Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125 Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140 His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160 Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg 165 170 175 Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190 Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205 Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile 210 215 220 Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu 225 230 235 240 Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu 245 250 255 Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His 260 265 270 Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Met Arg 275 280 285 Arg Thr Ile Ser Ser 290 <210> 3 <211> 297 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 3 Asp Glu Phe Thr Val Asp Phe Ser Ser Gln Lys Ser Tyr Val Asp Ser 1 5 10 15 Leu Asn Ser Ile Arg Ser Ala Ile Ser Thr Pro Leu Gly Asn Ile Ser 20 25 30 Gln Gly Gly Val Ser Val Ser Val Ile Asn His Val Leu Gly Gly Asn 35 40 45 Tyr Ile Ser Leu Asn Val Arg Gly Leu Asp Pro Tyr Ser Glu Arg Phe 50 55 60 Asn His Leu Arg Leu Ile Met Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Ala Gly 65 70 75 80 Phe Ile Asn Thr Glu Thr Asn Ile Phe Tyr Arg Phe Ser Asp Phe Ser 85 90 95 His Ile Ser Val Pro Asp Val Ile Thr Val Ser Met Thr Thr Asp Ser 100 105 110 Ser Tyr Ser Ser Leu Gln Arg Ile Ala Asp Leu Glu Arg Thr Gly Met 115 120 125 Gln Ile Gly Arg His Ser Leu Val Gly Ser Tyr Leu Asp Leu Met Glu 130 135 140 Phe Arg Gly Arg Ser Met Thr Arg Ala Ser Ser Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160 Phe Val Thr Val Ile Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg 165 170 175 Gly Phe Arg Pro Ala Leu Ser Glu Ala Ser Pro Leu Tyr Thr Met Thr 180 185 190 Ala Gln Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Ile Ser Asn Val 195 200 205 Leu Pro Glu Tyr Arg Gly Glu Glu Gly Val Arg Ile Gly Arg Ile Ser 210 215 220 Phe Asn Ser Leu Ser Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Val Ile Leu Asn 225 230 235 240 Cys His Ser Thr Gly Ser Tyr Ser Val Arg Ser Val Ser Gln Lys Gln 245 250 255 Lys Thr Glu Cys Gln Ile Val Gly Asp Arg Ala Ala Ile Lys Val Asn 260 265 270 Asn Val Leu Trp Glu Ala Asn Thr Ile Ala Ala Leu Leu Asn Arg Lys 275 280 285 Pro Gln Asp Leu Thr Glu Pro Asn Gln 290 295 <210> 4 <211> 508 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 4 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Asp Ile Glu Leu 260 265 270 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr 275 280 285 Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Trp Tyr 290 295 300 Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr 305 310 315 320 Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 325 330 335 Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala 340 345 350 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Thr Phe Gly Gly Gly 355 360 365 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly 370 375 380 Ser Gly Glu Gly Ser Lys Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu 385 390 395 400 Val Gln Pro Ser Gln Arg Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe 405 410 415 Ser Leu Ile Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys 420 425 430 Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr 435 440 445 Asn Ala Ala Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys 450 455 460 Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala 465 470 475 480 Ile Tyr Phe Cys Ala Lys Thr Leu Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Met Asp 485 490 495 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 500 505 <210> 5 <211> 517 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 5 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly 260 265 270 Phe Val Phe Thr Leu Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Phe 275 280 285 Ser Val Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu 290 295 300 Asp Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala 305 310 315 320 Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro 325 330 335 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile 340 345 350 Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 355 360 365 Trp Ser Thr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly 370 375 380 Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Lys Val 385 390 395 400 Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Gln Pro Ser Gln Arg Leu 405 410 415 Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Ser Tyr Gly Val 420 425 430 His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val 435 440 445 Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met Ser Arg 450 455 460 Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met 465 470 475 480 Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Lys Thr 485 490 495 Leu Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 500 505 510 Val Thr Val Ser Ser 515 <210> 6 <211> 508 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 6 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Ser His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Asp Ile Glu Leu 260 265 270 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr 275 280 285 Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Trp Tyr 290 295 300 Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr 305 310 315 320 Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 325 330 335 Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala 340 345 350 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Thr Phe Gly Gly Gly 355 360 365 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly 370 375 380 Ser Gly Glu Gly Ser Lys Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu 385 390 395 400 Val Gln Pro Ser Gln Arg Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe 405 410 415 Ser Leu Ile Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys 420 425 430 Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr 435 440 445 Asn Ala Ala Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys 450 455 460 Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala 465 470 475 480 Ile Tyr Phe Cys Ala Lys Thr Leu Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Met Asp 485 490 495 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 500 505 <210> 7 <211> 517 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 7 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Ser His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly 260 265 270 Phe Val Phe Thr Leu Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Phe 275 280 285 Ser Val Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu 290 295 300 Asp Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala 305 310 315 320 Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro 325 330 335 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile 340 345 350 Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 355 360 365 Trp Ser Thr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly 370 375 380 Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Lys Val 385 390 395 400 Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Gln Pro Ser Gln Arg Leu 405 410 415 Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Ser Tyr Gly Val 420 425 430 His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val 435 440 445 Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met Ser Arg 450 455 460 Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met 465 470 475 480 Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Lys Thr 485 490 495 Leu Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 500 505 510 Val Thr Val Ser Ser 515 <210> 8 <211> 512 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 8 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Asp Ile Gln Met 260 265 270 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 275 280 285 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr 290 295 300 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser 305 310 315 320 Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly 325 330 335 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 340 345 350 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln 355 360 365 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly 370 375 380 Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 385 390 395 400 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 405 410 415 Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala 420 425 430 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly 435 440 445 Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala 450 455 460 Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 465 470 475 480 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe 485 490 495 Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 500 505 510 <210> 9 <211> 521 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 9 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly 260 265 270 Phe Val Phe Thr Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 275 280 285 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 290 295 300 Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 305 310 315 320 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro 325 330 335 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 340 345 350 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 355 360 365 Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 370 375 380 Arg Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly 385 390 395 400 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 405 410 415 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp 420 425 430 Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 435 440 445 Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser 450 455 460 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala 465 470 475 480 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 485 490 495 Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly 500 505 510 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 515 520 <210> 10 <211> 512 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 10 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Ser His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Asp Ile Gln Met 260 265 270 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 275 280 285 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr 290 295 300 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser 305 310 315 320 Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly 325 330 335 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 340 345 350 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln 355 360 365 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly 370 375 380 Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 385 390 395 400 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 405 410 415 Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala 420 425 430 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly 435 440 445 Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala 450 455 460 Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 465 470 475 480 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe 485 490 495 Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 500 505 510 <210> 11 <211> 521 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 11 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Ser His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly 260 265 270 Phe Val Phe Thr Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 275 280 285 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 290 295 300 Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 305 310 315 320 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro 325 330 335 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 340 345 350 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 355 360 365 Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 370 375 380 Arg Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly 385 390 395 400 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 405 410 415 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp 420 425 430 Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 435 440 445 Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser 450 455 460 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala 465 470 475 480 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 485 490 495 Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly 500 505 510 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 515 520 <210> 12 <211> 516 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 12 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Asp Ile Val Met 260 265 270 Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser 275 280 285 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr 290 295 300 Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu 305 310 315 320 Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 325 330 335 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu 340 345 350 Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro 355 360 365 Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Ser Thr Ser 370 375 380 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln 385 390 395 400 Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser 405 410 415 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val 420 425 430 Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro 435 440 445 Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr 450 455 460 Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser 465 470 475 480 Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr 485 490 495 Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 500 505 510 Thr Val Ser Ser 515 <210> 13 <211> 525 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 13 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly 260 265 270 Phe Val Phe Thr Leu Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile 275 280 285 Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys 290 295 300 Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln 305 310 315 320 Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu 325 330 335 Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala 340 345 350 Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr 355 360 365 Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr 370 375 380 Lys Leu Glu Leu Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser 385 390 395 400 Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile 405 410 415 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 420 425 430 Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly 435 440 445 Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr 450 455 460 Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser 465 470 475 480 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 485 490 495 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Phe 500 505 510 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 515 520 525 <210> 14 <211> 516 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 14 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Ser His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Asp Ile Val Met 260 265 270 Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser 275 280 285 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr 290 295 300 Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu 305 310 315 320 Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 325 330 335 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu 340 345 350 Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro 355 360 365 Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Ser Thr Ser 370 375 380 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln 385 390 395 400 Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser 405 410 415 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val 420 425 430 Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro 435 440 445 Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr 450 455 460 Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser 465 470 475 480 Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr 485 490 495 Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 500 505 510 Thr Val Ser Ser 515 <210> 15 <211> 525 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 15 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Ser His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly 260 265 270 Phe Val Phe Thr Leu Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile 275 280 285 Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys 290 295 300 Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln 305 310 315 320 Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu 325 330 335 Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala 340 345 350 Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr 355 360 365 Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr 370 375 380 Lys Leu Glu Leu Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser 385 390 395 400 Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile 405 410 415 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 420 425 430 Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly 435 440 445 Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr 450 455 460 Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser 465 470 475 480 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 485 490 495 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Phe 500 505 510 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 515 520 525 <210> 16 <211> 518 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 16 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Asp Ile Gln Leu 260 265 270 Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser 275 280 285 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg Asn Gly Asn Thr 290 295 300 Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu 305 310 315 320 Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 325 330 335 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu 340 345 350 Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Ser His Val Pro 355 360 365 Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser 370 375 380 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val 385 390 395 400 Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val 405 410 415 Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Val 420 425 430 Asn Trp Ile Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Met Gly Trp 435 440 445 Ile Asn Pro Asn Thr Gly Glu Pro Thr Phe Asp Asp Asp Phe Lys Gly 450 455 460 Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln 465 470 475 480 Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ser Arg 485 490 495 Ser Arg Gly Lys Asn Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 500 505 510 Leu Val Thr Val Ser Ser 515 <210> 17 <211> 527 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 17 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly 260 265 270 Phe Val Phe Thr Leu Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu 275 280 285 Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln 290 295 300 Ser Leu Val His Arg Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln 305 310 315 320 Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg 325 330 335 Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 340 345 350 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr 355 360 365 Phe Cys Ser Gln Ser Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr 370 375 380 Arg Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser 385 390 395 400 Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser 405 410 415 Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 420 425 430 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Val Asn Trp Ile Lys Gln Ala Pro 435 440 445 Gly Gln Gly Leu Gln Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Glu 450 455 460 Pro Thr Phe Asp Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp 465 470 475 480 Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp 485 490 495 Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ser Arg Ser Arg Gly Lys Asn Glu Ala 500 505 510 Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 515 520 525 <210> 18 <211> 518 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 18 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Ser His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Asp Ile Gln Leu 260 265 270 Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser 275 280 285 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg Asn Gly Asn Thr 290 295 300 Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu 305 310 315 320 Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 325 330 335 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu 340 345 350 Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Ser His Val Pro 355 360 365 Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser 370 375 380 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val 385 390 395 400 Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val 405 410 415 Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Val 420 425 430 Asn Trp Ile Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Met Gly Trp 435 440 445 Ile Asn Pro Asn Thr Gly Glu Pro Thr Phe Asp Asp Asp Phe Lys Gly 450 455 460 Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln 465 470 475 480 Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ser Arg 485 490 495 Ser Arg Gly Lys Asn Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 500 505 510 Leu Val Thr Val Ser Ser 515 <210> 19 <211> 527 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 19 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Ser His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly 260 265 270 Phe Val Phe Thr Leu Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu 275 280 285 Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln 290 295 300 Ser Leu Val His Arg Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln 305 310 315 320 Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg 325 330 335 Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 340 345 350 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr 355 360 365 Phe Cys Ser Gln Ser Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr 370 375 380 Arg Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser 385 390 395 400 Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser 405 410 415 Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 420 425 430 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Val Asn Trp Ile Lys Gln Ala Pro 435 440 445 Gly Gln Gly Leu Gln Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Glu 450 455 460 Pro Thr Phe Asp Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp 465 470 475 480 Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp 485 490 495 Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ser Arg Ser Arg Gly Lys Asn Glu Ala 500 505 510 Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 515 520 525 <210> 20 <211> 385 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 20 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Ala His His Ser 245 250 255 Glu Asp Pro Ser Ser Lys Ala Pro Lys Ala Pro Glu Val Gln Leu Val 260 265 270 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 275 280 285 Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Asn Thr Met Gly Trp Tyr 290 295 300 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Leu Ile Ser Ser 305 310 315 320 Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 325 330 335 Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 340 345 350 Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Arg Phe Arg Thr Ala 355 360 365 Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 370 375 380 Ser 385 <210> 21 <211> 386 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 21 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Glu Val Gln Leu 260 265 270 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu 275 280 285 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Asn Thr Met Gly Trp 290 295 300 Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Leu Ile Ser 305 310 315 320 Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 325 330 335 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser 340 345 350 Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Arg Phe Arg Thr 355 360 365 Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 370 375 380 Ser Ser 385 <210> 22 <211> 394 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 22 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Ala His His Ser 245 250 255 Glu Asp Pro Ser Ser Lys Ala Pro Lys Ala Pro Gly Ile Leu Gly Phe 260 265 270 Val Phe Thr Leu Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 275 280 285 Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr 290 295 300 Phe Ser Ile Asn Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln 305 310 315 320 Arg Glu Leu Val Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala 325 330 335 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 340 345 350 Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val 355 360 365 Tyr Tyr Cys Lys Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp 370 375 380 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 385 390 <210> 23 <211> 395 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 23 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly 260 265 270 Phe Val Phe Thr Leu Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 275 280 285 Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile 290 295 300 Thr Phe Ser Ile Asn Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys 305 310 315 320 Gln Arg Glu Leu Val Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr 325 330 335 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys 340 345 350 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala 355 360 365 Val Tyr Tyr Cys Lys Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr 370 375 380 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 385 390 395 <210> 24 <211> 385 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 24 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Ala His His Ser 245 250 255 Glu Asp Pro Ser Ser Lys Ala Pro Lys Ala Pro Glu Val Gln Leu Val 260 265 270 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 275 280 285 Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Asn Thr Met Gly Trp Tyr 290 295 300 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Leu Ile Ser Ser 305 310 315 320 Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 325 330 335 Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 340 345 350 Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Arg Phe Arg Thr Ala 355 360 365 Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 370 375 380 Ser 385 <210> 25 <211> 386 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 25 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Glu Val Gln Leu 260 265 270 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu 275 280 285 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Asn Thr Met Gly Trp 290 295 300 Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Leu Ile Ser 305 310 315 320 Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 325 330 335 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser 340 345 350 Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Arg Phe Arg Thr 355 360 365 Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 370 375 380 Ser Ser 385 <210> 26 <211> 394 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 26 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Ser His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Ala His His Ser 245 250 255 Glu Asp Pro Ser Ser Lys Ala Pro Lys Ala Pro Gly Ile Leu Gly Phe 260 265 270 Val Phe Thr Leu Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 275 280 285 Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr 290 295 300 Phe Ser Ile Asn Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln 305 310 315 320 Arg Glu Leu Val Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala 325 330 335 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 340 345 350 Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val 355 360 365 Tyr Tyr Cys Lys Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp 370 375 380 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 385 390 <210> 27 <211> 395 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 27 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Ser His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly 260 265 270 Phe Val Phe Thr Leu Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 275 280 285 Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile 290 295 300 Thr Phe Ser Ile Asn Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys 305 310 315 320 Gln Arg Glu Leu Val Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr 325 330 335 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys 340 345 350 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala 355 360 365 Val Tyr Tyr Cys Lys Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr 370 375 380 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 385 390 395 <210> 28 <211> 365 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 28 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Ala Ser Val Ser 260 265 270 Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 275 280 285 Leu Ile Ser Trp Cys Arg Gln Arg Cys Ala Asp Ser Tyr Arg Ile Thr 290 295 300 Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro 305 310 315 320 Gly Ser Trp Lys Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp 325 330 335 Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Val Val Thr His Tyr Tyr Gly Trp Asp Arg 340 345 350 Tyr Ser His Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Gly Ser 355 360 365 <210> 29 <211> 374 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 29 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly 260 265 270 Phe Val Phe Thr Leu Ala Ser Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu 275 280 285 Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Cys Arg Gln 290 295 300 Arg Cys Ala Asp Ser Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn 305 310 315 320 Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Trp Lys Thr Ala Thr 325 330 335 Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Val 340 345 350 Val Thr His Tyr Tyr Gly Trp Asp Arg Tyr Ser His Pro Ile Ser Ile 355 360 365 Asn Tyr Arg Thr Gly Ser 370 <210> 30 <211> 365 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 30 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Ser His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Ala Ser Val Ser 260 265 270 Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 275 280 285 Leu Ile Ser Trp Cys Arg Gln Arg Cys Ala Asp Ser Tyr Arg Ile Thr 290 295 300 Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro 305 310 315 320 Gly Ser Trp Lys Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp 325 330 335 Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Val Val Thr His Tyr Tyr Gly Trp Asp Arg 340 345 350 Tyr Ser His Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Gly Ser 355 360 365 <210> 31 <211> 374 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 31 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly 260 265 270 Phe Val Phe Thr Leu Ala Ser Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu 275 280 285 Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Cys Arg Gln 290 295 300 Arg Cys Ala Asp Ser Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn 305 310 315 320 Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Trp Lys Thr Ala Thr 325 330 335 Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Val 340 345 350 Val Thr His Tyr Tyr Gly Trp Asp Arg Tyr Ser His Pro Ile Ser Ile 355 360 365 Asn Tyr Arg Thr Gly Ser 370

Claims (33)

  1. a) 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하고 적어도 하나의 세포 외 표적 생체분자와 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린-유형 결합 영역; 및
    b) 시가 독소 군 중 적어도 하나의 인자에서 A 서브유닛의 아미노산 서열로부터 유도된, 아미노-말단을 가진, 폴리펩티드를 포함하는 시가 독소 작동체 영역;
    으로 이루어진 단백질에서,
    상기 면역글로불린-유형 결합 영역이 상기 시가 독소 작동체 영역의 아미노-말단에 근위적으로 위치하지 않도록 상기 면역글로불린-유형 결합 영역과 상기 시가 독소 작동체 영역이 물리적으로 상기의 단백질 내에 방향 지어지는 것을 특징으로 하는 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린-유형 결합 영역은 상기 폴리펩티드가;
    단일-도메인 항체 파편, 단쇄 가변성 파편, 항체 가변성 파편, 상보결정영역3 파편, 제약된 FR3-CDR3-FR4 폴리펩티드, Fd파편, 항원-결합파편, 피브로넥션-유래 10th 피브로넥틴 타입Ⅲ 도메인, 테낙신 타입Ⅲ 도메인, 안키린 반복 모티프 도메인, 저밀도-리포프로테인-수용체-유래 A-도메인, 리포칼린, 쿠니츠 도메인, 단백질-A-유래 Z 도메인, 감마-B결정-유래 도메인, 유비퀴틴-유래 도메인, Sac7d-유래 폴리펩티드, Fyn-유래 SH2 도메인, 미니단백질, C-타입 렉틴-유사 도메인 스캐폴드, 조작 모방 항체, 및 결합 기능을 보유하는 상기 전술한 어느 하나의 유전 조작 대응물;로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 단백질.
  3. 제1항 내지 제2항의 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질의 면역글로불린-유형 결합 영역의 세포 외 표적 생체분자와 물리적으로 결합되기 위한 상기 단백질의 세포에 대한 투여에 의하여, 상기 단백질은 상기 세포의 사멸을 야기시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 단백질의 투여는, 상기 단백질의 면역글로불린-유형 결합 영역의 생체 외 표적 생체분자와 물리적으로 결합되는 제1세포군 인자 및 상기 면역글로불린-유형 결합 영역의 생체 외 표적 생체분자와 물리적으로 결합되지 않는 제2세포군 인자에 대하여 투여하여, 상기 제1세포군 군 인자에 대한 상기 단백질의 세포독성 효과가 상기 제2세포군 인자와 비교하여 적어도 3배 이상 큰 것을 특징으로 하는 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항의 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린-유형 결합 영역이 결합 가능한 상기 생체외 표적 생체분자는:
    CD20, CD22, CD40, CD74, CD79, CD25, CD30, HER2/neu/ErbB2, EGFR, EpCAM, EphB2, 전립선 특이적 막 항원 (prostate-specific membrane antigen), 크립토(Cripto), CDCP1, 엔도글린, 섬유아세포 활성화 단백질, Lewis-Y, CD19, CD21, CS1/SLAMF7, CD33, CD52, CD133, EpCAM, CEA, gpA33, 뮤신, TAG-72, 타이로신-단백질 인산화효소 막관통수용체, 탄산탈수효소 IX, 엽산 구속 단백질, 강글리오사이드 GD2, 강글리오사이드 GD3, 강글리오사이드 GM2, 강글리오사이드 Lewis-Y2, VEGFR, Alpha Vbeta3, Alpha5beta1, ErbB1/EGFR, Erb3, c-MET, IGF1R, EphA3, TRAIL-R1, TRAIL-R2, RANK, FAP, 테나신, CD64, 메소텔린, BRCA1, MART-1/MelanA, gp1OO, 티로시나아제, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, 베타-카테닌, MUM-1, 카스파제-8, KIAA0205, HPVE6, SART-1, PRAME, 암태아성 항원, 전립선 특이 항원, 전립선 줄기 세포 항원, 인간 아스파르틸(아스파라진일) 베타-수산화효소, EphA2, HER3/ErbB-3, MUC1, MART-1/MelanA, gp1OO, 티로시나아제 관련 항원, HPV-E7, 엡스타인바 바이러스 항원, Bcr-Abl, 알파-태아단백질 항원, 17-A1, 방광 종양 항원, CD38, CD15, CD23, CD53, CD88, CD129, CD183, CD191, CD193, CD244, CD294, CD305; C3AR, FceRIa, 갈렉틴-9, mrp-14, PD-L1, siglec-8, siglec-10, CD49d, CD13, CD44, CD54, CD63, CD69, CD123, CD193, TLR4, FceRIa, IgE, CD107a, CD203c, CD14, CD15, CD33, CD64, CD68, CD80, CD86, CD105, CD115, F4/80, ILT-3, 갈렉틴-3, CD11a-c, GITRL, MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, CD284-TLR4, CD107-Mac3, CD195-CCR5, HLA-DR, CD16/32, CD282-TLR2, CD11c, CD123, 및 상기 전술한 것들의 면역원성 단편(immunogenic fragment);
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 생체외 표적 생체분자인 것을 특징으로 하는 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항의 어느 한 항에 있어서, 상기의 시가 독소 작동체 영역은, SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 75-251을 포함하거나 또는 SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 75-251로 필수적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 단백질.
  7. 제1항 내지 제5항의 어느 한 항에 있어서, 상기의 시가 독소 작동체 영역은, SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 1-241을 포함하거나 또는 SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 1-241로 필수적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기의 시가 독소 작동체 영역은, SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 1-251을 포함하거나 또는 SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 1-251로 필수적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기의 시가 독소 작동체 영역은, SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 1-261을 포함하거나 또는 SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 1-261로 필수적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 단백질.
  10. 제5항에 있어서, 상기 면역글로불린-유형 결합 영역은 SEQ ID NOs:4, 8, 12, 16 중 어느 하나의 아미노산 269-508을 포함하거나 또는 SEQ ID NOs:4, 8, 12, 16 중 어느 하나의 아미노산 269-508로 필수적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 단백질.
  11. 제6항 내지 제9항의 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린-유형 결합 영역은 SEQ ID NOs:4, 8, 12, 16 중 어느 하나의 아미노산 269-508을 포함하거나 또는 SEQ ID NOs:4, 8, 12, 16 중 어느 하나의 아미노산 269-508로 필수적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 단백질.
  12. 제5항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NOs: 4-31 중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하거나 SEQ ID NOs: 4-31 중 어느 하나의 폴리펩티드로 필수적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시가 독소 작동체 영역은 시가 독소 작동체 영역의 효소적 활성을 변화시키는 시가 독소군 인자의 A 서브유닛을 자연적으로 발생시키는 것과 관련된 돌연변이를 포함하고, 상기 돌연변이는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 또는 치환으로부터 선택되는 돌연변이인 것을 특징으로 하는 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 상기 돌연변이는 상기 시가 독소 작동체 영역의 세포독성을 감소시키거나 제거하는 것을 특징으로 하는 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서의 단백질 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 첨가제 또는 운반체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서의 단백질 및 검출 촉진제로 이루어진 진단적 조성물.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서의 단백질을 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드 또는 그에 따른 보충물, 또는 상기 전술한 것의 단편.
  18. 제17항의 상기 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  19. 제17항 내지 제18항의 상기 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터 중 어느 하나를 포함하는 숙주 세포.
  20. a) 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하고 적어도 하나의 세포외 표적 생체분자와 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린-유형 결합 영역; 및
    b) 시가 독소 군 중 적어도 하나의 인자의 A 서브유닛의 아미노산 서열로부터 유도된, 카복시-말단을 가진 폴리펩티드를 포함하는 시가 독소 작동체 영역;으로 이루어진 단백질에 증진된 세포독성을 부여하는 시스템에서,
    상기 시스템은 상기 면역글로불린-유형 결합 영역이 상기 시가 독소 작동체 영역의 카복시-말단에 근위적으로 위치하도록 상기의 단백질 내에 배열되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단백질 또는 제15항의 약학적 조성물로 세포와 접촉하는 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 사멸 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 접촉은 시험관 내에서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제20항에 있어서, 상기 접촉은 생체 내에서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단백질 또는 제15항의 약학적 조성물의 치료적으로 효과적인 용량을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자의 질병, 장애, 또는 증상을 치료하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기의 질병, 장애, 또는 증상은 암, 종양, 면역 장애, 및 미생물 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기의 암은: 뼈암, 유방암, 중앙/말초 신경계 암, 위장암, 생식 세포암, 선암, 두경부암, 혈액암, 신장-요로암, 간암, 폐/흉막암, 전립선암, 육종, 피부암, 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기의 면역 장애는: 아밀로이드증, 강직성 척추염, 천식, 크론병, 당뇨병, 이식편거부반응, 이식편대숙주병, 하시모토 갑상선염, 용혈요독증후군, HIV-관련 질병, 홍반 루푸스, 다발경화증, 결절다발동맥염, 다관절염, 건선, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 피부경화증, 패혈증, 쇼그렌 증후군, 궤양성대장염, 및 혈관염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 물질의 조성물은 암, 종양, 면역 장애, 또는 미생물 감염의 치료 또는 예방용인 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 암, 종양, 면역 장애, 또는 미생물 감염의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 물질의 조성물의 용도.
  30. 제16항의 진단적 조성물로 세포와 접촉하는 단계 및 상기 진단적 시약의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질의 면역글로불린-유형 결합 영역의 세포외 표적과 물리적으로 결합된 세포의 존재에 관한 정보를 수집하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 접촉은 생체 내에서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 검출은 생체 내에서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 물질의 조성물 및 부가적인 시약 및/또는 약학적 전달 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
KR1020167025657A 2014-03-11 2015-03-10 아미노-말단 근위 시가 독소 a 서브유닛 작동체 영역 및 세포-표적 면역글로불린-유형 결합 영역을 포함하는 단백질 KR20160127759A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461951121P 2014-03-11 2014-03-11
US61/951,121 2014-03-11
PCT/US2015/019708 WO2015138452A1 (en) 2014-03-11 2015-03-10 Proteins comprising amino-terminal proximal shiga toxin a subunit effector regions and cell-targeting immunoglobulin-type binding regions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20160127759A true KR20160127759A (ko) 2016-11-04

Family

ID=52737411

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167025657A KR20160127759A (ko) 2014-03-11 2015-03-10 아미노-말단 근위 시가 독소 a 서브유닛 작동체 영역 및 세포-표적 면역글로불린-유형 결합 영역을 포함하는 단백질

Country Status (20)

Country Link
US (1) US20160376328A1 (ko)
EP (3) EP3604333B1 (ko)
JP (2) JP6856378B2 (ko)
KR (1) KR20160127759A (ko)
CN (1) CN106414503A (ko)
AU (2) AU2015229583B2 (ko)
CA (1) CA2940218A1 (ko)
CY (1) CY1124541T1 (ko)
DK (1) DK3604333T3 (ko)
ES (2) ES2882274T3 (ko)
HR (1) HRP20211084T1 (ko)
HU (1) HUE054529T2 (ko)
IL (2) IL247298B (ko)
LT (1) LT3604333T (ko)
MX (1) MX2016011821A (ko)
PL (1) PL3604333T3 (ko)
PT (1) PT3604333T (ko)
RS (1) RS62143B1 (ko)
SI (1) SI3604333T1 (ko)
WO (1) WO2015138452A1 (ko)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2015012808A (es) 2013-03-12 2016-05-31 Molecular Templates Inc Inmunotoxinas de union a cd20 para inducir internalizacion celular y metodos que usan las mismas.
IL294746B2 (en) 2014-01-27 2024-04-01 Molecular Templates Inc SHIGA toxin-free effector subunit-containing polypeptides for mammalian applications
WO2017019623A2 (en) 2015-07-26 2017-02-02 Molecular Templates, Inc. Cell-targeting molecules comprising shiga toxin a subunit effectors and cd8+ t-cell epitopes
US11142584B2 (en) 2014-03-11 2021-10-12 Molecular Templates, Inc. CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same
MX2017010072A (es) 2015-02-05 2017-11-09 Molecular Templates Inc Moleculas multivalentes que se enlazan a cd20, las cuales comprenden regiones efectoras de la subunidad a de la toxina shiga, y composiciones enriquecidas de las mismas.
DK3303373T3 (da) 2015-05-30 2020-06-02 Molecular Templates Inc Deimmuniserede Shiga toksin A-underenhedsstilladser og cellemålrettede molekyler omfattende samme
MX2019006656A (es) * 2016-12-07 2019-09-09 Molecular Templates Inc Polipeptidos efectores de la sub-unidad a de la toxina shiga andamiajes de los efectores de la toxina shiga y moleculas con direccion hacia las celulas para la conjugacion especifica del sitio.
MX2019008840A (es) 2017-01-25 2019-09-09 Molecular Templates Inc Moleculas con direccion hacia las celulas que comprenden efectores de la sub-unidad a de la toxina shiga desinmunizados y epitopos de las celulas t cd8+.
BR112020003945A2 (pt) * 2017-09-05 2020-09-08 GLAdiator Biosciences, Inc. entrega de cargas úteis a células-tronco
CN109971725B (zh) * 2017-12-28 2024-02-02 上海细胞治疗研究院 抗体修饰的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途
CN110612117B (zh) 2018-04-17 2024-04-12 分子模板公司 包含去免疫化的志贺毒素a亚基支架的her2靶向分子
WO2020047501A1 (en) * 2018-08-30 2020-03-05 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
WO2020081493A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
CN109829489A (zh) * 2019-01-18 2019-05-31 刘凯欣 一种基于多层特征的文物碎片重组方法及装置
CA3127624A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-cd38 antibodies
MX2021008790A (es) * 2019-01-23 2021-08-24 Millennium Pharm Inc Proteinas de union a cd38 que comprenden efectores de la subunidad a de la toxina shiga desinmunizada.
WO2020154475A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 Molecular Templates, Inc. Proteins comprising modified immunoglobulin variable light chains
CN110142068B (zh) * 2019-06-12 2024-02-02 杭州华得森生物技术有限公司 一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒及方法
MX2022003195A (es) * 2019-09-18 2022-04-11 Molecular Templates Inc Moleculas de union a pd-l1 que comprenden andamios de la subunidad a de la toxina shiga.
WO2021055816A1 (en) 2019-09-18 2021-03-25 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding molecules comprising shiga toxin a subunit scaffolds
WO2021102445A1 (en) 2019-11-24 2021-05-27 Molecular Templates, Inc. Uses of cd20-binding molecules and additional therapeutic agents
EP4308242A1 (en) 2021-03-17 2024-01-24 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins comprising shiga toxin a subunit scaffolds and cd8+ t cell antigens
CN114410588B (zh) * 2022-01-29 2022-11-04 西安电子科技大学 一种α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞及其制备方法和应用
WO2023154829A2 (en) * 2022-02-09 2023-08-17 Absci Corporation Unlocking de novo antibody design with generative artificial intelligence

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4894443A (en) 1984-02-08 1990-01-16 Cetus Corporation Toxin conjugates
US5091178A (en) 1986-02-21 1992-02-25 Oncogen Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies
US7838216B1 (en) 1986-03-05 2010-11-23 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Human gene related to but distinct from EGF receptor gene
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
EP0474727B1 (en) 1989-05-19 1997-07-23 Genentech, Inc. Her2 extracellular domain
US5578482A (en) 1990-05-25 1996-11-26 Georgetown University Ligand growth factors that bind to the erbB-2 receptor protein and induce cellular responses
US5834229A (en) 1991-05-24 1998-11-10 Genentech, Inc. Nucleic acids vectors and host cells encoding and expressing heregulin 2-α
US5869445A (en) 1993-03-17 1999-02-09 University Of Washington Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein
US5612474A (en) 1994-06-30 1997-03-18 Eli Lilly And Company Acid labile immunoconjugate intermediates
WO1996006641A1 (en) 1994-08-29 1996-03-07 Prizm Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of vascular endothelial growth factor with targeted agents
AU723268B2 (en) 1996-09-09 2000-08-24 Zealand Pharma A/S Improved solid-phase peptide synthesis and agent for use in such synthesis
AU4184597A (en) * 1996-09-10 1998-04-02 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Histidine-tagged shiga toxins, toxoids, and protein fusions with such toxins and toxoids, methods for the purification and preparation thereof
WO2000006194A2 (en) * 1997-02-05 2000-02-10 Biotransplant, Inc. Depletion of cells responsible for antibody-mediated graft rejection
WO2001001748A2 (en) 1999-07-02 2001-01-11 Genentech, Inc. Peptide compounds that bind her2
US7306801B2 (en) 2000-05-15 2007-12-11 Health Research, Inc. Methods of therapy for cancers characterized by overexpression of the HER2 receptor protein
US7446185B2 (en) 2001-07-18 2008-11-04 The Regents Of The University Of California Her2/neu target antigen and use of same to stimulate an immune response
DE60333004D1 (de) * 2002-02-04 2010-07-29 Yoshida Hideo Antikrebsmittel mit verotoxinvarianten
EP1483294B2 (en) * 2002-03-01 2019-10-30 Immunomedics, Inc. Internalizing anti-cd74 antibodies and methods of use
US20040248151A1 (en) 2002-04-05 2004-12-09 Ventana Medical Systems, Inc. Method for predicting the response to HER2-directed therapy
EP2289942B1 (en) 2002-04-10 2013-07-31 Genentech, Inc. Anti-HER2 antibody variants
WO2003097855A2 (en) 2002-05-14 2003-11-27 Baylor College Of Medicine Small molecule inhibitors of her2 expression
US7449480B2 (en) 2002-05-14 2008-11-11 Baylor College Of Medicine Small molecule inhibitors of HER2 expression
CA2512365A1 (en) 2003-01-03 2004-07-22 Gennaro Ciliberto Rhesus her2/neu, nucleotides encoding same, and uses thereof
ATE416190T1 (de) 2003-07-04 2008-12-15 Affibody Ab Polypeptide mit bindungsaffinität für her2
WO2005011590A2 (en) 2003-08-01 2005-02-10 A & G Pharmaceutical, Inc. Compositions and methods for restoring sensitivity to treatment with her2 antagonists
KR20160096228A (ko) 2004-07-22 2016-08-12 제넨테크, 인크. Ｈｅｒ２ 항체 조성물
CN112480257A (zh) * 2005-03-23 2021-03-12 根马布股份公司 用于治疗多发性骨髓瘤的cd38抗体
FI20055417A0 (fi) 2005-07-20 2005-07-20 Glykos Finland Oy Syöpäpesifiset glykaanit ja niiden käyttö
EP1945660B1 (en) 2005-09-26 2014-05-07 Molecular Templates, Inc. Library from toxin mutants, and methods of using same
GB0524788D0 (en) 2005-12-05 2006-01-11 Affibody Ab Polypeptides
AU2007339753A1 (en) * 2006-12-29 2008-07-10 Osprey Pharmaceuticals Usa, Inc. Methods of selecting and producing modified toxins, conjugates containing modified toxins and uses thereof
WO2008153933A2 (en) 2007-06-06 2008-12-18 Avi Biopharma, Inc. Soluble her2 and her3 splice variant proteins, splice-switching oligonucleotides, and their use in the treatment of disease
EP2215125A1 (en) 2007-11-27 2010-08-11 Ablynx N.V. Method for obtaining polypeptide constructs comprising two or more single domain antibodies
EP2072525A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 Affibody AB New polypeptides having affinity for HER2
TWI472339B (zh) 2008-01-30 2015-02-11 Genentech Inc 包含結合至ｈｅｒ２結構域ii之抗體及其酸性變異體的組合物
ES2342646B1 (es) 2008-06-02 2011-04-26 Institut De Recerca Hospital Universitari Vall Hebron Metodo de diagnostico de canceres que expresan el receptor her-2 o sus variantes truncadas.
US8349585B2 (en) 2010-04-15 2013-01-08 Alper Biotech, Llc Monoclonal antibodies against HER2 antigens, and uses therefor
US9862769B2 (en) * 2010-05-27 2018-01-09 Genmab A/S Monoclonal antibodies against HER2
WO2012101235A1 (en) * 2011-01-26 2012-08-02 Cenix Bioscience Gmbh Delivery system and conjugates for compound delivery via naturally occurring intracellular transport routes
JP2015509501A (ja) * 2012-02-23 2015-03-30 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 剤を細胞へ送達するための改変型微生物毒素受容体
MX2015012808A (es) 2013-03-12 2016-05-31 Molecular Templates Inc Inmunotoxinas de union a cd20 para inducir internalizacion celular y metodos que usan las mismas.

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20211084T1 (hr) 2021-10-15
AU2015229583A1 (en) 2016-09-15
LT3604333T (lt) 2021-06-10
IL282834A (en) 2021-06-30
EP3604333A1 (en) 2020-02-05
JP6856378B2 (ja) 2021-04-07
IL247298B (en) 2021-05-31
EP3116904B1 (en) 2020-05-06
CN106414503A (zh) 2017-02-15
AU2015229583B2 (en) 2020-07-09
CY1124541T1 (el) 2022-07-22
AU2020250234A1 (en) 2020-11-05
PT3604333T (pt) 2021-06-07
JP2020089385A (ja) 2020-06-11
SI3604333T1 (sl) 2021-08-31
CA2940218A1 (en) 2015-09-17
ES2882274T3 (es) 2021-12-01
HUE054529T2 (hu) 2021-09-28
MX2016011821A (es) 2017-04-27
RS62143B1 (sr) 2021-08-31
EP3872090A1 (en) 2021-09-01
EP3604333B1 (en) 2021-05-05
IL247298A0 (en) 2016-09-29
DK3604333T3 (da) 2021-06-21
PL3604333T3 (pl) 2021-11-08
ES2809729T3 (es) 2021-03-05
JP2017518027A (ja) 2017-07-06
WO2015138452A1 (en) 2015-09-17
EP3116904A1 (en) 2017-01-18
US20160376328A1 (en) 2016-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7152035B2 (ja) 結合領域、志賀毒素ａサブユニットのエフェクター領域、及びカルボキシ末端小胞体局在化シグナルモチーフを含むタンパク質
AU2019240612B2 (en) Protease-cleavage resistant, Shiga toxin A Subunit effector polypeptides and cell-targeted molecules comprising the same
EP3116904B1 (en) Proteins comprising amino-terminal proximal shiga toxin a subunit effector regions and cell-targeting immunoglobulin-type binding regions capable of specifically binding her2/neu/erbb2
US11406692B2 (en) Cell-targeting molecules comprising de-immunized, Shiga toxin a subunit effectors and CD8+ t-cell epitopes
KR102500408B1 (ko) 포유류에 적용하기 위한 탈면역된 시가 독소 a 서브유닛 작동체 폴리펩티드
US20180291359A1 (en) Cell-targeting molecules comprising amino-terminus proximal or amino-terminal, shiga toxin a subunit effector regions

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application