CN107849096A - 去免疫化的志贺毒素a亚基支架和包含它们的细胞靶向分子 - Google Patents
去免疫化的志贺毒素a亚基支架和包含它们的细胞靶向分子 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107849096A CN107849096A CN201680038854.6A CN201680038854A CN107849096A CN 107849096 A CN107849096 A CN 107849096A CN 201680038854 A CN201680038854 A CN 201680038854A CN 107849096 A CN107849096 A CN 107849096A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- cell
- shiga toxin
- targeting molecule
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010079723 Shiga Toxin Proteins 0.000 title claims abstract description 683
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 572
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 509
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 501
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims abstract description 194
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims abstract description 190
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 66
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 31
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 16
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 574
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 372
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 182
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 claims description 164
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 claims description 164
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 claims description 114
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 claims description 114
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 104
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 101
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 101
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 96
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 95
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 93
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 93
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 87
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 84
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 84
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 claims description 78
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 75
- -1 radical amino acid Chemical group 0.000 claims description 64
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 62
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 55
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 47
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 43
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 42
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 38
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 claims description 36
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 29
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 claims description 28
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 claims description 26
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims description 26
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 26
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 26
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 25
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 22
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 18
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 18
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 18
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 15
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 15
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 14
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 13
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 12
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 11
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 10
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 claims description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 9
- 101001023095 Anemonia sulcata Delta-actitoxin-Avd1a Proteins 0.000 claims description 8
- 101000641989 Araneus ventricosus Kunitz-type U1-aranetoxin-Av1a Proteins 0.000 claims description 8
- 101001028691 Carybdea rastonii Toxin CrTX-A Proteins 0.000 claims description 8
- 101000685083 Centruroides infamatus Beta-toxin Cii1 Proteins 0.000 claims description 8
- 101000685085 Centruroides noxius Toxin Cn1 Proteins 0.000 claims description 8
- 101001028688 Chironex fleckeri Toxin CfTX-1 Proteins 0.000 claims description 8
- 101000644407 Cyriopagopus schmidti U6-theraphotoxin-Hs1a Proteins 0.000 claims description 8
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 claims description 8
- 101000679608 Phaeosphaeria nodorum (strain SN15 / ATCC MYA-4574 / FGSC 10173) Cysteine rich necrotrophic effector Tox1 Proteins 0.000 claims description 8
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 claims description 8
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 claims description 8
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 claims description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 6
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000633784 Homo sapiens SLAM family member 7 Proteins 0.000 claims description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108010010995 MART-1 Antigen Proteins 0.000 claims description 6
- 102000016200 MART-1 Antigen Human genes 0.000 claims description 6
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 claims description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100029198 SLAM family member 7 Human genes 0.000 claims description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 claims description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 claims description 6
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 claims description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 6
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 6
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 6
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 claims description 6
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 6
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 claims description 6
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 6
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 claims description 6
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 6
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 claims description 6
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 6
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 claims description 6
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 6
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 6
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 6
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 claims description 6
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 6
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 6
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 6
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims description 5
- 101000831567 Homo sapiens Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100024333 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 claims description 4
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 4
- 102100022430 Melanocyte protein PMEL Human genes 0.000 claims description 4
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 claims description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 claims description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 claims description 3
- NGNQZCDZXSOVQU-UHFFFAOYSA-N 8,16,18,26,34,36-hexahydroxyhentetracontane-2,6,10,14,24,28,32-heptone Chemical compound CCCCCC(O)CC(O)CC(=O)CCCC(=O)CC(O)CC(=O)CCCCCC(O)CC(O)CC(=O)CCCC(=O)CC(O)CC(=O)CCCC(C)=O NGNQZCDZXSOVQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100021305 Acyl-CoA:lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100035248 Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 claims description 3
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 claims description 3
- 101001005269 Arabidopsis thaliana Ceramide synthase 1 LOH3 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001005312 Arabidopsis thaliana Ceramide synthase LOH1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000939689 Araneus ventricosus U2-aranetoxin-Av1a Proteins 0.000 claims description 3
- 102100035526 B melanoma antigen 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 claims description 3
- 102000036365 BRCA1 Human genes 0.000 claims description 3
- 108700020463 BRCA1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101150072950 BRCA1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101000633673 Buthacus arenicola Beta-insect depressant toxin BaIT2 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100031172 C-C chemokine receptor type 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100024167 C-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100028990 C-X-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100021703 C3a anaphylatoxin chemotactic receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 101710102078 C3a anaphylatoxin chemotactic receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 102100032957 C5a anaphylatoxin chemotactic receptor 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 108700012439 CA9 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 102100035350 CUB domain-containing protein 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 101100005789 Caenorhabditis elegans cdk-4 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 claims description 3
- 101000654318 Centruroides noxius Beta-mammal toxin Cn2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001028695 Chironex fleckeri Toxin CfTX-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100032768 Complement receptor type 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010036395 Endoglin Proteins 0.000 claims description 3
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 claims description 3
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 claims description 3
- 108010008177 Fd immunoglobulins Proteins 0.000 claims description 3
- 102100039717 G antigen 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010001517 Galectin 3 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100039558 Galectin-3 Human genes 0.000 claims description 3
- 101710088083 Glomulin Proteins 0.000 claims description 3
- 102100030595 HLA class II histocompatibility antigen gamma chain Human genes 0.000 claims description 3
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 claims description 3
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 claims description 3
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001042227 Homo sapiens Acyl-CoA:lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001022185 Homo sapiens Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 claims description 3
- 101000874316 Homo sapiens B melanoma antigen 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000777564 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000980744 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000946926 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000916050 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000867983 Homo sapiens C5a anaphylatoxin chemotactic receptor 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101000737742 Homo sapiens CUB domain-containing protein 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000941929 Homo sapiens Complement receptor type 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000886137 Homo sapiens G antigen 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001082627 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen gamma chain Proteins 0.000 claims description 3
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 claims description 3
- 101000994375 Homo sapiens Integrin alpha-4 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 claims description 3
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 3
- 101001055219 Homo sapiens Interleukin-9 receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 101000984186 Homo sapiens Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 4 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000980823 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD53 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001138062 Homo sapiens Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims description 3
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 claims description 3
- 101001023379 Homo sapiens Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000934372 Homo sapiens Macrosialin Proteins 0.000 claims description 3
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 claims description 3
- 101000884270 Homo sapiens Natural killer cell receptor 2B4 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000897042 Homo sapiens Nucleotide pyrophosphatase Proteins 0.000 claims description 3
- 101000610551 Homo sapiens Prominin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001117314 Homo sapiens Prostaglandin D2 receptor 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 3
- 101000863884 Homo sapiens Sialic acid-binding Ig-like lectin 8 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000610605 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A Proteins 0.000 claims description 3
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 claims description 3
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 claims description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 3
- 102100032818 Integrin alpha-4 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 claims description 3
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 3
- 102100026244 Interleukin-9 receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 102100025578 Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 4 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100024221 Leukocyte surface antigen CD53 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100020943 Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 claims description 3
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100028198 Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 102100025136 Macrosialin Human genes 0.000 claims description 3
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 claims description 3
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010093825 Mucoproteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000001621 Mucoproteins Human genes 0.000 claims description 3
- 101100369076 Mus musculus Tdgf1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101000597780 Mus musculus Tumor necrosis factor ligand superfamily member 18 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 claims description 3
- 102100038082 Natural killer cell receptor 2B4 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100021969 Nucleotide pyrophosphatase Human genes 0.000 claims description 3
- 108060006580 PRAME Proteins 0.000 claims description 3
- 102000036673 PRAME Human genes 0.000 claims description 3
- 102100023832 Prolyl endopeptidase FAP Human genes 0.000 claims description 3
- 102100040120 Prominin-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100024218 Prostaglandin D2 receptor 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 claims description 3
- 101001039269 Rattus norvegicus Glycine N-methyltransferase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 3
- 102100027164 Sialic acid-binding Ig-like lectin 10 Human genes 0.000 claims description 3
- 101710143293 Sialic acid-binding Ig-like lectin 10 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100029964 Sialic acid-binding Ig-like lectin 8 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims description 3
- 101000668858 Spinacia oleracea 30S ribosomal protein S1, chloroplastic Proteins 0.000 claims description 3
- 101000898746 Streptomyces clavuligerus Clavaminate synthase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 229940100514 Syk tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 claims description 3
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100035283 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 18 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100040113 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A Human genes 0.000 claims description 3
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100027244 U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 101710155955 U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 3
- SRHNADOZAAWYLV-XLMUYGLTSA-N alpha-L-Fucp-(1->2)-beta-D-Galp-(1->4)-[alpha-L-Fucp-(1->3)]-beta-D-GlcpNAc Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](NC(C)=O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)O[C@H]2[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O2)O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O SRHNADOZAAWYLV-XLMUYGLTSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 3
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims description 3
- WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 3-[6-[4-(trifluoromethoxy)anilino]-4-pyrimidinyl]benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC(C=2N=CN=C(NC=3C=CC(OC(F)(F)F)=CC=3)C=2)=C1 WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 claims description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 claims description 2
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 claims description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 claims description 2
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001204 Hashimoto Disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 claims description 2
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 claims description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000019298 Lipocalin Human genes 0.000 claims description 2
- 108050006654 Lipocalin Proteins 0.000 claims description 2
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 claims description 2
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 claims description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 102000014400 SH2 domains Human genes 0.000 claims description 2
- 108050003452 SH2 domains Proteins 0.000 claims description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 claims description 2
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims description 2
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 claims description 2
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 claims description 2
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 claims description 2
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 claims description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 2
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- GIVLTTJNORAZON-HDBOBKCLSA-N ganglioside GM2 (18:0) Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 GIVLTTJNORAZON-HDBOBKCLSA-N 0.000 claims description 2
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 2
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000029255 peripheral nervous system cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 210000004224 pleura Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000010174 renal carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 claims description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 2
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 claims description 2
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 102100038126 Tenascin Human genes 0.000 claims 2
- DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N (2s)-4-hydroxy-2-(propylamino)butanoic acid Chemical compound CCCN[C@H](C(O)=O)CCO DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N 0.000 claims 1
- LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C=C(N)N=C2C LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 claims 1
- 208000037157 Azotemia Diseases 0.000 claims 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 108010055196 EphA2 Receptor Proteins 0.000 claims 1
- 108010055191 EphA3 Receptor Proteins 0.000 claims 1
- 108010055334 EphB2 Receptor Proteins 0.000 claims 1
- 102100030340 Ephrin type-A receptor 2 Human genes 0.000 claims 1
- 102100030324 Ephrin type-A receptor 3 Human genes 0.000 claims 1
- 102100031968 Ephrin type-B receptor 2 Human genes 0.000 claims 1
- 101000914324 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Proteins 0.000 claims 1
- 101000914321 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 7 Proteins 0.000 claims 1
- 101001034652 Homo sapiens Insulin-like growth factor 1 receptor Proteins 0.000 claims 1
- 101000617725 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Proteins 0.000 claims 1
- 102100039688 Insulin-like growth factor 1 receptor Human genes 0.000 claims 1
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 claims 1
- 101710093778 L-dopachrome tautomerase Proteins 0.000 claims 1
- 102100022019 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Human genes 0.000 claims 1
- 101710173693 Short transient receptor potential channel 1 Proteins 0.000 claims 1
- 101710173694 Short transient receptor potential channel 2 Proteins 0.000 claims 1
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 claims 1
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 claims 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 claims 1
- 206010003230 arteritis Diseases 0.000 claims 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 claims 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 claims 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 claims 1
- 102000014909 interleukin-1 receptor activity proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108040006732 interleukin-1 receptor activity proteins Proteins 0.000 claims 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims 1
- 101150047061 tag-72 gene Proteins 0.000 claims 1
- 208000009852 uremia Diseases 0.000 claims 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 10
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 8
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 5
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 58
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 47
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 36
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 35
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 31
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 31
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 28
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 28
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 230000008859 change Effects 0.000 description 28
- 210000001768 subcellular fraction Anatomy 0.000 description 28
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 23
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 16
- 241000251556 Chordata Species 0.000 description 15
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 15
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 15
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 14
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 14
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 13
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 13
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 239000002585 base Substances 0.000 description 10
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 10
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 7
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 7
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 6
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 6
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 5
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 102100039371 ER lumen protein-retaining receptor 1 Human genes 0.000 description 5
- 101000812437 Homo sapiens ER lumen protein-retaining receptor 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000639763 Homo sapiens Regulator of telomere elongation helicase 1 Proteins 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 102100034469 Regulator of telomere elongation helicase 1 Human genes 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 5
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 5
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 5
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 5
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 5
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 231100000935 short-term exposure limit Toxicity 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- 241000432824 Asparagus densiflorus Species 0.000 description 4
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 4
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- 101001103039 Homo sapiens Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Proteins 0.000 description 4
- 102100039615 Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Human genes 0.000 description 4
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 4
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108090000829 Ribosome Inactivating Proteins Proteins 0.000 description 4
- 101710084578 Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 4
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 description 4
- 101710182532 Toxin a Proteins 0.000 description 4
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 206010016165 failure to thrive Diseases 0.000 description 4
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 4
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 4
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000001902 CC Chemokines Human genes 0.000 description 3
- 108010040471 CC Chemokines Proteins 0.000 description 3
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 3
- KZBUYRJDOAKODT-UHFFFAOYSA-N Chlorine Chemical compound ClCl KZBUYRJDOAKODT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102220515626 Pterin-4-alpha-carbinolamine dehydratase 2_Y77S_mutation Human genes 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000010968 computed tomography angiography Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 3
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 3
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 241001614291 Anoplistes Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100026548 Caspase-8 Human genes 0.000 description 2
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000002090 Fibronectin type III Human genes 0.000 description 2
- 108050009401 Fibronectin type III Proteins 0.000 description 2
- 241000192016 Finegoldia magna Species 0.000 description 2
- 102220561158 Furin_R75A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 101001103036 Homo sapiens Nuclear receptor ROR-alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000830565 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Proteins 0.000 description 2
- 101000610604 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 102220569523 Olfactory receptor 4K15_A231E_mutation Human genes 0.000 description 2
- 101710120463 Prostate stem cell antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100036735 Prostate stem cell antigen Human genes 0.000 description 2
- 102000002727 Protein Tyrosine Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 241000607764 Shigella dysenteriae Species 0.000 description 2
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 102100040112 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Human genes 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 2
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 2
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 2
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N decanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC(O)=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000003458 notochord Anatomy 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 2
- 108020000494 protein-tyrosine phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010014402 tyrosinase-related protein-1 Proteins 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 206010002216 Anaphylactoid reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 239000005632 Capric acid (CAS 334-48-5) Substances 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000005853 Clathrin Human genes 0.000 description 1
- 108010019874 Clathrin Proteins 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 101100012887 Drosophila melanogaster btl gene Proteins 0.000 description 1
- 101100012878 Drosophila melanogaster htl gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008341 ER-associated protein catabolic process Effects 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010003471 Fetal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004641 Fetal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 208000032759 Hemolytic-Uremic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101001022148 Homo sapiens Furin Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- ZFOMKMMPBOQKMC-KXUCPTDWSA-N L-pyrrolysine Chemical compound C[C@@H]1CC=N[C@H]1C(=O)NCCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O ZFOMKMMPBOQKMC-KXUCPTDWSA-N 0.000 description 1
- 101150057659 Mlac1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical class CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 1
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 1
- 101100000406 Neosartorya fumigata (strain ATCC MYA-4609 / Af293 / CBS 101355 / FGSC A1100) abr2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102100034640 PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Human genes 0.000 description 1
- 108050007154 PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Proteins 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 102220637940 Probable cation-transporting ATPase 13A5_S96Y_mutation Human genes 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- RJFAYQIBOAGBLC-BYPYZUCNSA-N Selenium-L-methionine Chemical compound C[Se]CC[C@H](N)C(O)=O RJFAYQIBOAGBLC-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- RJFAYQIBOAGBLC-UHFFFAOYSA-N Selenomethionine Natural products C[Se]CCC(N)C(O)=O RJFAYQIBOAGBLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 241000218636 Thuja Species 0.000 description 1
- 102400000700 Tumor necrosis factor, membrane form Human genes 0.000 description 1
- 101800000716 Tumor necrosis factor, membrane form Proteins 0.000 description 1
- 101150011439 abr1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000000981 bystander Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- 229930193282 clathrin Natural products 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000027832 depurination Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 229930186900 holotoxin Natural products 0.000 description 1
- 150000001261 hydroxy acids Chemical group 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- BZUIJMCJNWUGKQ-BDAKNGLRSA-N hypusine Chemical compound NCC[C@@H](O)CNCCCC[C@H](N)C(O)=O BZUIJMCJNWUGKQ-BDAKNGLRSA-N 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008086 immune related sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 208000018937 joint inflammation Diseases 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000505 pernicious effect Effects 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 201000006292 polyarteritis nodosa Diseases 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 102220206439 rs373315466 Human genes 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002718 selenomethionine Drugs 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 229940007046 shigella dysenteriae Drugs 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000012447 xenograft mouse model Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/25—Shigella (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
Abstract
本发明涉及包含氨基酸置换的志贺毒素A亚基来源的多肽和细胞靶向分子，所述氨基酸置换给所述多肽提供：1)去免疫化；2)减少的蛋白酶切割敏感性；和/或3)异源表位载荷，同时保留志贺毒素功能，例如，高效的细胞毒性。本发明的某些多肽在哺乳动物中表现出减小的免疫原性潜力和/或能够将表位递送至所述多肽存在于其中的细胞的MHC类分子。某些包含本发明的多肽的分子被哺乳动物良好耐受，同时保留上述的一种或多种特征。本发明的志贺毒素多肽可以用作细胞靶向分子的组分，所述细胞靶向分子用于选择性地杀死特定细胞、用于将载荷选择性地递送至特定细胞和用作用于治疗和诊断多种病患(包括癌症、免疫病症和微生物感染)的治疗和/或诊断分子。
Description
技术领域
本发明涉及从天然存在的志贺毒素的A亚基来源的志贺毒素效应物多肽，其包含突变的组合，所述突变提供(1)去免疫化，(2)蛋白酶敏感性的下降，和/或(3)嵌入的T-细胞表位；其中所述志贺毒素效应物多肽保留一种或多种志贺毒素功能，例如，高效的细胞毒性。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽(1)在哺乳动物中表现出减小的免疫原性潜力和/或(2)各自能够将CD8+ T-细胞表位递送至所述多肽存在于其中的细胞的MHCI类系统。
本发明也涉及包含本发明的志贺毒素效应物多肽的细胞靶向分子。本发明的志贺毒素效应物多肽具有作为细胞靶向分子(例如，免疫毒素和配体-毒素融合体)的支架或组分的用途，所述细胞靶向分子用于杀死细胞和/或载荷向某些亚细胞区室的亚细胞递送，例如，嵌入的T-细胞表位向胞质溶胶的递送。一般而言，本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子可用于施用给多细胞生物，例如，当需要(1)消除或减小非特异性毒性、(2)消除或减小某些免疫应答和/或(3)靶向对递送给特定细胞类型的特定表位的有益免疫应答(例如，CD8+ T-细胞的募集)时。本发明的细胞靶向分子可用于(1)选择性地杀死在其它细胞中的特定细胞类型和(2)作为治疗分子用于治疗多种疾病、病症和病患，包括癌症、肿瘤、其它生长异常、免疫病症和微生物感染。
背景
“魔法子弹”概念是，可以发现仅特异性地攻击人患者内的患病细胞或病原体、同时使患者不受伤害的治疗剂。免疫毒素、配体-毒素杂合体、免疫-RNA酶和其它分子靶向药物是20世纪早期Paul Ehrlich博士的“魔法子弹”概念的后代(Strebhardt K，Ullrich A，Nat Rev Cancer 8：473-80(2008))。由痢疾志贺菌(S.dysenteriae)产生的毒素在Ehrlich博士的同事Kiyoshi Shiga以后被命名“志贺毒素”，因为他在1897年发现了该细菌。近年来，志贺毒素由于具有独特特征而变得受到赏识，所述独特特征有利于用在用于靶向疗法的细胞内化分子中(参见例如US20150259428)。志贺毒素可以与免疫球蛋白结构域、配体和其它靶向部分组合以建立靶向细胞的治疗剂(例如，免疫毒素和配体-毒素融合体)，其为“魔法子弹”。
志贺毒素可能具有用在治疗剂中的有利性能，例如，对真核细胞有效的高效毒素机制，驱动细胞内化的能力，和指导亚细胞按路线发送的能力。通过对毒素的结构、特征和生物活性的合理改变，已经为医学应用合成地工程改造志贺毒素(参见，例如WO 1999/040185、WO 2005/092917、EP1051482、DE69835695、WO 2007/033497、US2009/0156417、JP4339511、US7713915、EP1727827、DE602004027168、EP1945660、JP4934761、EP2228383、US2013/0196928、WO 2014/164680、WO 2014/164693、US20150259428、WO 2015/138435、WO2015/138452、WO 2015/113005、WO 2015/113007和WO 2015/191764，它们中的每一篇通过引用整体并入本文)。志贺毒素A亚基是稳定的、酶活性的和细胞毒性的，即使截短或与其它蛋白结构域融合。
涉及合成地工程改造从细菌毒素来源的分子的治疗用途的主要限制包括在接受者中的有害免疫原性应答和由有毒组分造成的非特异性毒性。治疗产物的不希望的免疫原性可以导致不利的后果，诸如降低的效力，中和抗体的产生，改变的药代动力学，一般免疫和超敏反应，过敏反应，过敏样反应，和关于接受者可以安全地接受的重复剂量的数目的约束。降低治疗分子的非特异性毒性可以改善它在施用给接受者时的安全性特征，以及通过增加可以安全地施用的最大剂量而改变它的潜在治疗窗。因为不希望的免疫应答和非特异性毒性可以造成药物疗法的显著安全性和/或效力问题，减小二者的可能性或使其最小化在开发治疗分子时经常是合乎需要的。
治疗或诊断分子随时间和在特定环境(例如人循环系统)中的稳定性是重要的特征，且可以影响可实际采用分子的用途。对于某些免疫毒素或配体-毒素融合体，毒素和其它组分之间的连接的稳定性可以影响由未靶向的毒素随时间在多细胞生物体内的释放造成的非特异性毒性的量。因而，对于包含毒素组分的分子，某些非特异性毒性与毒素组分和另一种组分(例如，细胞靶向组分)之间的连接的稳定性直接相关。
可以将志贺毒素与异源表位组合以建立靶向细胞的治疗剂，其为了诱导合乎需要的免疫应答的目的递送选择的表位载荷(参见WO 2015/113007)。这些免疫应答可以被治疗分子利用用于患者内的特定细胞类型的靶向杀死，以及敏化患者的免疫系统以将某些细胞鉴别为外来物(即破坏免疫耐受性)。例如，这样的方案可以利用主要组织相容性(MHC)I类呈递途径来诱导免疫细胞向患者内的肿瘤部位的募集和增强通过免疫监视机制对某些赘生性细胞的识别。
需要获得具有低抗原性、低免疫原性和/或包含异源表位的志贺毒素A亚基来源的多肽，但是其保留显著水平的志贺毒素功能，例如，高效的细胞毒性，驱动细胞内化的能力，和/或有效地按路线发送至期望的细胞内位置的能力。此外，需要获得包含志贺毒素A亚基来源的组分的治疗和/或诊断分子，其具有低抗原性、低免疫原性、高稳定性、低非特异性毒性和/或递送肽-表位载荷用于由靶细胞的MHC I类系统呈递的能力。具体地，需要获得包含志贺毒素A亚基来源的组分的细胞靶向分子，其维持高效的细胞毒性，同时1)减小不希望的抗原性和/或免疫原性的潜力，2)减小非特异性毒性的潜力，和/或3)具有递送肽-表位载荷用于由靶细胞的MHC I类系统呈递的能力。
发明内容
本发明的志贺毒素A亚基来源的支架各自包含使它们更有用的特征(例如，去免疫化的亚区域、包含异源表位的亚区域、蛋白酶切割抗性的亚区域和/或羧基端、内质网保留/取回信号基序)的组合，例如，作为细胞靶向分子如免疫毒素和配体-毒素融合体的组分。本发明的某些组合志贺毒素效应物多肽是更有用的，因为它们在单一多肽中提供几种志贺毒素效应物功能，例如，促进细胞内化、指导亚细胞按路线发送至胞质溶胶、核糖体灭活、和/或将异源T-细胞表位递送至细胞的MHC I类途径。本发明的某些细胞靶向分子是更有用的，因为它们在单一分子中提供几种性能的组合，例如，有效的细胞内化、高效的靶向细胞的细胞毒性、选择性细胞毒性、去免疫化、在高剂量的低非特异性毒性、高稳定性、CD+ T-细胞超免疫接种、和/或将异源T-细胞表位递送至靶细胞的MHC I类途径的能力。
在下面参考编号为#1-11的实施方案的组描述了本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子的不同实施方案。
实施方案组#1-包含嵌入的或插入的异源T-细胞表位的去免疫化的志贺毒素效应
物多肽
本发明提供了一种去免疫化的志贺毒素效应物多肽，其包含至少一个插入的或嵌入的异源表位(a)和至少一个被破坏的内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域(b)，其中所述异源表位没有与至少一个被破坏的内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域重叠；且其中所述志贺毒素效应物多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应物功能(参见例如图1，其描绘了被标记为志贺毒素效应物1、2和3的、该实施方案组#1的去免疫化的志贺毒素效应物多肽的三个示例性实施方案的示例性实施例)。在某些其它实施方案中，所述异源表位是能够被细胞的MHC I类分子呈递的CD8+ T-细胞表位。在某些其它实施方案中，在(a)中的异源表位被嵌入野生型志贺毒素多肽区域中并替代相等数目的氨基酸残基，使得所述志贺毒素效应物多肽具有与它的来源野生型志贺毒素多肽区域相同的氨基酸残基总数。在以上任一个的某些其它实施方案中，所述去免疫化的志贺毒素效应物多肽能够表现出至少一种选自以下的志贺毒素效应物功能：指导细胞内按路线发送至所述多肽存在于其中的细胞的胞质溶胶，抑制核糖体功能，酶促地灭活核糖体，和细胞毒性。
在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽包含(i)嵌入的或插入的异源T-细胞表位和(ii)至少一个内源性B-细胞和/或T-细胞表位的破坏，所述表位没有与嵌入的或插入的异源T-细胞表位重叠。在某些其它实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应物功能，例如，指导细胞内按路线发送至所述多肽存在于其中的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促地灭活核糖体、造成白细胞郁滞和/或造成细胞毒性。在某些其它实施方案中，所述异源T-细胞表位是CD8+ T-细胞表位，例如，就人免疫系统而言。在某些其它实施方案中，所述异源T-细胞表位能够被细胞的MHC I类分子呈递。在某些其它实施方案中，所述内源性T-细胞表位是CD4+ T-细胞表位，例如，就人免疫系统而言。
在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽包含(i)嵌入的或插入的异源T-细胞表位和(ii)至少一个内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域的破坏，所述表位区域没有与嵌入的或插入的异源T-细胞表位重叠。在某些其它实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应物功能，例如，指导细胞内按路线发送至所述多肽存在于其中的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促地灭活核糖体、造成白细胞郁滞和/或造成细胞毒性。在某些其它实施方案中，所述异源T-细胞表位是CD8+ T-细胞表位，例如，就人免疫系统而言。在某些其它实施方案中，所述异源T-细胞表位能够被细胞的MHC I类分子呈递。在某些其它实施方案中，所述内源性T-细胞表位区域是CD4+ T-细胞表位区域，例如，就人免疫系统而言。
在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽包含(i)嵌入的或插入的异源T-细胞表位和(ii)至少一个内源性B-细胞和/或T-细胞表位的破坏，所述表位没有与嵌入的或插入的异源T-细胞表位重叠。在某些其它实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应物功能，例如，指导细胞内按路线发送至所述多肽存在于其中的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促地灭活核糖体、造成白细胞郁滞和/或造成细胞毒性。在某些其它实施方案中，所述异源T-细胞表位是CD8+ T-细胞表位，例如，就人免疫系统而言。在某些其它实施方案中，所述异源T-细胞表位能够被细胞的MHC I类分子呈递。在某些其它实施方案中，所述内源性T-细胞表位是CD4+ T-细胞表位，例如，就人免疫系统而言。
在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽包含(i)嵌入的或插入的异源T-细胞表位和(ii)至少一个内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域的破坏，所述表位区域没有与嵌入的或插入的异源T-细胞表位重叠。在某些其它实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应物功能，例如，指导细胞内按路线发送至所述多肽存在于其中的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促地灭活核糖体、造成白细胞郁滞和/或造成细胞毒性。在某些其它实施方案中，所述异源T-细胞表位是CD8+ T-细胞表位，例如，就人免疫系统而言。在某些其它实施方案中，所述异源T-细胞表位能够被细胞的MHC I类分子呈递。在某些其它实施方案中，所述内源性T-细胞表位区域是CD4+ T-细胞表位区域，例如，就人免疫系统而言。
在实施方案组#1的某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述志贺毒素效应物多肽包含在B-细胞和/或T-细胞表位区域中的突变，所述表位区域选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1-15；SEQ IDNO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的27-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQ ID NO：3的42-48；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的53-66；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94-115；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的141-153；SEQ ID NO：3的140-156；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的179-190；SEQ ID NO：3的179-191；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205，和SEQ ID NO：3的210-218；SEQ ID NO：3的240-260；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的243-257；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的254-268；SEQ ID NO：3的262-278；SEQ ID NO：3的281-297；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的285-293；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的4-33；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的34-78；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的77-103；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的128-168；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的160-183；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的236-258；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的274-293；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些其它实施方案中，不存在破坏，其为与至少一个被破坏的内源性B-细胞和/或T-细胞表位和/或表位区域的部分或全部重叠的氨基酸残基的羧基端截短。
在实施方案组#1的某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述志贺毒素效应物多肽包含在B-细胞免疫原性的氨基酸残基中的突变，所述氨基酸残基选自天然地定位的志贺毒素A亚基氨基酸残基：L49、D197、D198、R204和R205。
在实施方案组#1的某些实施方案中，所述嵌入的或插入的异源T-细胞表位破坏选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组的内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域：(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1-15；SEQ ID NO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的27-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQ ID NO：3的42-48；和SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的53-66；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域，其中不存在破坏，其为与至少一个被破坏的表位区域的部分或全部重叠的序列的氨基端截短；(ii)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94-115；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的141-153；SEQ ID NO：3的140-156；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的179-190；SEQ ID NO：3的179-191；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205；和SEQ ID NO：3的210-218；和(iii)SEQ ID NO：3的240-260；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的243-257；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的254-268；SEQ ID NO：3的262-278；SEQ ID NO：3的281-297；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的285-293；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。
在实施方案组#1的某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述志贺毒素效应物多肽包含在B-细胞和/或T-细胞表位区域中的突变，所述表位区域选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组：(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1-15；SEQID NO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的27-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQ ID NO：3的42-48；和SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的53-66；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域，其中不存在破坏，其为与至少一个被破坏的表位区域的部分或全部重叠的序列的氨基端截短；(ii)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94-115；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的141-153；SEQ ID NO：3的140-156；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的179-190；SEQ ID NO：3的179-191；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205；和SEQ ID NO：3的210-218；和(iii)SEQ ID NO：3的240-260；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的243-257；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的254-268；SEQID NO：3的262-278；SEQ ID NO：3的281-297；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的285-293；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域，其中不存在破坏，其为与至少一个被破坏的表位区域的部分或全部重叠的序列的氨基端截短。
在实施方案组#1的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含至少一个内源性表位区域的破坏，所述表位区域选自天然地定位的志贺毒素A亚基：SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的94-115；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的141-153；SEQ ID NO：3的140-156；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的179-190；SEQ ID NO：3的179-191；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205；或SEQ ID NO：3的210-218。
在实施方案组#1的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽不包含异源的MHCI类限制的T-细胞表位。MHC I类限制的T-细胞表位是本领域已知的，或可以由技术人员预测。术语异源表示非天然地存在于野生型志贺毒素A亚基中的MHC I类限制的T-细胞表位，例如，与目标志贺毒素效应物多肽最密切相关的野生型志贺毒素A亚基。
在实施方案组#1的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含至少2、3、4、5、6、7、8个或更多个内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域的破坏。
在实施方案组#1的某些实施方案中，一个或多个破坏包含相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换。
在实施方案组#1的某些实施方案中，一个或多个内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域包含多个相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换。
在实施方案组#1的某些实施方案中，至少1、2、3或4个破坏包含在内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域中的多个相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换。
在实施方案组#1的某些实施方案中，至少一个破坏包含至少1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换，且任选地其中至少一个置换发生在选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基氨基酸残基处：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的4；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的6；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的8；SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的9；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的11；SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：3的12；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的33；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的43；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的44；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的45；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的46；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的47；SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的48；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的49；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的50；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的51；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的53；SEQID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的54；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的55；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的56；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的57；SEQID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的58；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的59；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的60；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的61；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的62；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的84；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的88；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3的96；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的104；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的105；SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的107；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的108；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的109；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的110；SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：3的111；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的112；SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的141；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的147；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的154；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的179；SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的180；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的181；SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的183；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的184；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的185；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的186；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的187；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的188；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的189；SEQID NO：3的197；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的198；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的205；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的247；SEQ ID NO：3的247；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的248；SEQ ID NO：3的250；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的251；SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：3的264；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的265；和SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的286；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同氨基酸残基。在某些其它实施方案中，至少两个破坏各自包含至少一个选自以下的相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的4；SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的8；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的9；SEQID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的11；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的33；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的43；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的45；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的47；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的48；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的49；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的53；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的55；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的58；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的59；SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的60；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的61；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的62；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的96；SEQID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的109；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的110；SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的112；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的147；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的179；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的180；SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的181；SEQ ID NO：1、SEQ ID SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的183；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的184；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的185；SEQID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的186；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的187；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的188；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的189；SEQ ID NO：3的204；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的205；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的247；SEQ ID NO：3的247；SEQ IDNO：3的250；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的264；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的265；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的286；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同氨基酸残基。
在实施方案组#1的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含至少三个内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域的破坏，所述表位区域选自：(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1-15；SEQ ID NO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的27-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQ ID NO：3的42-48；和SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的53-66，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域，其中不存在破坏，其为与至少一个被破坏的内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域的部分或全部重叠的氨基酸残基的氨基端截短；(ii)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94-115；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的141-153；SEQ ID NO：3的140-156；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的179-190；SEQ ID NO：3的179-191；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205；和SEQ IDNO：3的210-218；和(iii)SEQ ID NO：3的240-260；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的243-257；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的254-268；SEQ ID NO：3的262-278；SEQ ID NO：3的281-297；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的285-293；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域，其中不存在破坏，其为与至少一个被破坏的内源性B-细胞和/或T-细胞表位和/或表位区域的部分或全部重叠的氨基酸残基的羧基端截短。
在实施方案组#1的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含至少两个内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域的破坏，其中每个破坏包含一个或多个氨基酸残基置换，且其中所述内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的27-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQ ID NO：3的42-48；SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的53-66；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。
在实施方案组#1的某些实施方案中，所述嵌入的或插入的异源T-细胞表位没有破坏本文描述的任何内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域。
在实施方案组#1的某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，至少一个破坏包含一个或多个选自以下的氨基酸残基置换：D至A、D至G、D至V、D至L、D至I、D至F、D至S、D至Q、D至M、D至R、E至A、E至G、E至V、E至L、E至I、E至F、E至S、E至Q、E至N、E至D、E至M、E至R、F至A、F至G、F至V、F至L、F至I、G至A、G至P、H至A、H至G、H至V、H至L、H至I、H至F、H至M、I至A、I至V、I至G、I至C、K至A、K至G、K至V、K至L、K至I、K至M、K至H、L至A、L至V、L至G、L至C、N至A、N至G、N至V、N至L、N至I、N至F、P至A、P至G、P至F、R至A、R至G、R至V、R至L、R至I、R至F、R至M、R至Q、R至S、R至K、R至H、S至A、S至G、S至V、S至L、S至I、S至F、S至M、T至A、T至G、T至V、T至L、T至I、T至F、T至M、T至S、V至A、V至G、Y至A、Y至G、Y至V、Y至L、Y至I、Y至F、Y至M、和Y至T。在某些其它实施方案中，所述一个或多个相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换选自：D至A、D至G、D至V、D至L、D至I、D至F、D至S、D至Q、E至A、E至G、E至V、E至L、E至I、E至F、E至S、E至Q、E至N、E至D、E至M、E至R、G至A、H至A、H至G、H至V、H至L、H至I、H至F、H至M、K至A、K至G、K至V、K至L、K至I、K至M、K至H、L至A、L至G、N至A、N至G、N至V、N至L、N至I、N至F、P至A、P至G、P至F、R至A、R至G、R至V、R至L、R至I、R至F、R至M、R至Q、R至S、R至K、R至H、S至A、S至G、S至V、S至L、S至I、S至F、S至M、T至A、T至G、T至V、T至L、T至I、T至F、T至M、T至S、Y至A、Y至G、Y至V、Y至L、Y至I、Y至F、和Y至M。
在实施方案组#1的某些实施方案中，所述破坏中的至少一个包含一个或多个选自以下的相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换：K1至A、G、V、L、I、F、M和H；T4至A、G、V、L、I、F、M和S；D6至A、G、V、L、I、F、S、Q和R；S8至A、G、V、I、L、F和M；T9至A、G、V、I、L、F、M和S；S9至A、G、V、L、I、F和M；K11至A、G、V、L、I、F、M和H；T12至A、G、V、I、L、F、M、S和K；S12至A、G、V、I、L、F和M；S33至A、G、V、L、I、F、M和C；S43至A、G、V、L、I、F和M；G44至A或L；S45至A、G、V、L、I、F和M；T45至A、G、V、L、I、F和M；G46至A和P；D47至A、G、V、L、I、F、S、M和Q；N48至A、G、V、L、M和F；L49至A、V、C和G；Y49至A、G、V、L、I、F、M和T；F50至A、G、V、L、I和T；A51；D53至A、G、V、L、I、F、S和Q；V54至A、G、I和L；R55至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；G56至A和P；I57至A、G、V和M；L57至A、V、C、G、M和F；D58至A、G、V、L、I、F、S和Q；P59至A、G和F；E60至A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M、T和R；E61至A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M和R；G62至A；R84至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；V88至A和G；I88至A、V、C和G；D94至A、G、V、L、I、F、S和Q；S96至A、G、V、I、L、F和M；T104至A、G、V、L、I、F、M；和N；A105至L；T107至A、G、V、L、I、F、M和P；S107至A、G、V、L、I、F、M和P；L108至A、V、C和G；S109至A、G、V、I、L、F和M；T109至A、G、V、I、L、F、M和S；G110至A；S112至A、G、V、L、I、F和M；D111至A、G、V、L、I、F、S、Q和T；S112至A、G、V、L、I、F和M；D141至A、G、V、L、I、F、S和Q；G147至A；V154至A和G。R179至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；T180至A、G、V、L、I、F、M和S；T181至A、G、V、L、I、F、M和S；D183至A、G、V、L、I、F、S和Q；D184至A、G、V、L、I、F、S和Q；L185至A、G、V和C；S186至A、G、V、I、L、F和M；G187至A；R188至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；S189至A、G、V、I、L、F和M；D197至A、G、V、L、I、F、S和Q；D198至A、G、V、L、I、F、S和Q；R204至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R205至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；S247至A、G、V、I、L、F和M；Y247至A、G、V、L、I、F和M；R248至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R250至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R251至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；D264至A、G、V、L、I、F、S和Q；G264至A；和T286至A、G、V、L、I、F、M和S。
在实施方案组#1的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽基本上由SEQ IDNO：355-369中的任一个所示的多肽组成，其进一步包含至少一个内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域的破坏，所述表位区域没有与嵌入的或插入的异源CD8+ T-细胞表位重叠。
在实施方案组#1的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含SEQ ID NO：6-32、340-354和370-438中的任一个所示的多肽或基本上由其组成。
对于实施方案组#1的某些实施方案，所述志贺毒素效应物多肽能够表现出(i)与野生型志贺毒素A1片段或野生型志贺毒素效应物多肽可比较的催化活性水平，(ii)具有10,000皮摩尔或更低的半数最大抑制浓度(IC50)值的核糖体抑制活性，和/或(iii)显著水平的志贺毒素催化活性。
对于实施方案组#1的某些实施方案，所述志贺毒素效应物多肽能够表现出与野生型志贺毒素效应物多肽可比较的亚细胞按路线发送效率和/或能够表现出显著水平的从细胞的胞内体起始位置至内质网和/或胞质溶胶的细胞内按路线发送活性。
对于实施方案组#1的某些实施方案，所述志贺毒素效应物多肽能够实现所述嵌入的或插入的异源T-细胞表位从早期胞内体区室至所述志贺毒素效应物多肽存在于其中的细胞的MHC I类分子的细胞内递送。对于某些其它实施方案，所述志贺毒素效应物多肽能够表现出除了细胞内递送以外的一种或多种志贺毒素效应物功能，例如，以下志贺毒素效应物功能：促进细胞内化，指导亚细胞按路线发送至胞质溶胶，核糖体灭活，诱导胱天蛋白酶活性，造成白细胞郁滞，和/或造成细胞死亡。在某些其它实施方案中，所述异源T-细胞表位是CD8+ T-细胞表位，例如，就人免疫系统而言。
在实施方案组#1的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含至少两个内源性表位区域的破坏，所述内源性表位区域选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94-115；SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的141-153；SEQ ID NO：3的140-156；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的179-190；SEQ IDNO：3的179-191；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205；或SEQ ID NO：3的210-218；其中所述破坏并非仅由选自以下的氨基酸残基置换组成：SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的S96Y；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的Y114S；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的R179A；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的R179H；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的L185A；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的R188A；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的R205A；SEQ ID NO：1的R179A/R188A；或SEQ ID NO：2；或SEQ ID NO：3的A188V。
在实施方案组#1的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含在至少一个内源性表位区域中的包含至少一个氨基酸残基的突变的破坏，所述表位区域选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1-15；SEQ IDNO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的27-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQ ID NO：3的42-48；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的53-66；其中所述志贺毒素效应物多肽不包含与前述被破坏的表位区域重叠的氨基端截短。
在实施方案组#1的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含在至少两个内源性表位区域中的包含至少一个氨基酸残基的突变的破坏，所述表位区域选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1-15；SEQ IDNO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的27-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQ ID NO：3的42-48；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的53-66；其中所述破坏并非仅由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸残基置换R63W组成；且其中所述志贺毒素效应物区域不包含与前述两个被破坏的表位区域重叠的氨基端截短。
在实施方案组#1的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含在至少一个内源性表位区域中的包含至少一个氨基酸残基的突变的破坏，所述表位区域选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO：3的240-260；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的243-257；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的254-268；SEQ ID NO：3的262-278；SEQID NO：3的281-297；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的285-293；其中所述志贺毒素效应物多肽不包含与前述被破坏的表位区域重叠的羧基端截短。
在实施方案组#1的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含在至少两个内源性表位区域中的包含至少一个氨基酸残基的突变的破坏，所述表位区域选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO：3的240-260；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的243-257；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的254-268；SEQ ID NO：3的262-278；SEQID NO：3的281-297；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的285-293；其中所述志贺毒素效应物多肽不包含选自以下的突变：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的R248H；SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的A250V；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的R251H；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的A253G；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的S254T；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的C261A；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的R289K；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的R248H和R251H；SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的A253G和S254T；SEQ ID NO：1的S247-M252的缺失；SEQ ID NO：3的S246F；SEQ ID NO：3的A282V；SEQ ID NO：3的I291V；SEQ ID NO：3的S246F；且其中所述志贺毒素效应物多肽不包含与前述两个被破坏的表位区域重叠的羧基端截短。
在实施方案组#1的某些实施方案中，所述去免疫化的志贺毒素效应物多肽包含SEQ ID NO：6-27、29-32、340-354和370-438中的任一个所示的多肽或基本上由其组成。
在实施方案组#1的某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含一个或多个相对于志贺毒素家族的成员的天然存在的A亚基的突变，所述突变改变所述志贺毒素效应物多肽的酶活性，所述突变选自至少一个氨基酸残基缺失、插入或置换。在某些其它实施方案中，所述相对于天然存在的A亚基的突变会减小或消除所述志贺毒素效应物多肽的细胞毒性活性，但是所述志贺毒素效应物多肽保留至少一种其它的志贺毒素效应物功能，例如，促进细胞内化和/或指导细胞内按路线发送至某些亚细胞区室。在某些其它实施方案中，所述相对于天然存在的A亚基的突变选自至少一个氨基酸残基置换，例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中的A231E、R75A、Y77S、Y114S、E167D、R170A、R176K和/或W203A。
在实施方案组#1的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含(i)具有羧基端的志贺毒素A1片段来源的区域和(ii)在A1片段区域的羧基端处被破坏的弗林蛋白酶切割基序。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个相对于野生型志贺毒素A亚基的突变，所述突变改变特定区域中的至少一个氨基酸残基，所述特定区域天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)或志贺毒素(SEQ ID NO：2)的A亚基的248-251，或在志贺样毒素(SEQ ID NO：3)的A亚基的247-250；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序的最小弗林蛋白酶切割位点中包含一个或多个相对于野生型志贺毒素A亚基的突变。在某些其它实施方案中，所述最小弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列R/Y-x-x-R和/或R-x-x-R表示。
在实施方案组#1的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含(i)具有羧基端的志贺毒素A1片段来源的区域和(ii)在A1片段区域的羧基端处被破坏的弗林蛋白酶切割基序。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序在所述弗林蛋白酶切割基序中包含相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换。在某些其它实施方案中，所述弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基的置换是选自以下的非带正电荷的氨基酸残基对精氨酸残基的置换：丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基的置换是组氨酸对精氨酸残基的置换。
在实施方案组#1的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽单独地或作为第一种细胞靶向分子的组分当引入细胞时能够表现出与野生型志贺毒素A1多肽和/或第二种细胞靶向分子的细胞毒性可比较的细胞毒性，所述第二种细胞靶向分子由第一种细胞靶向分子组成，但是所有它的志贺毒素效应物多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段。
对于实施方案组#1的志贺毒素效应物多肽的某些实施方案，本发明的包含志贺毒素效应物多肽的细胞靶向分子当引入脊索动物时能够表现出与第二种细胞靶向分子相比改善的体内耐受性，所述第二种细胞靶向分子由第一种细胞靶向分子组成，但是所有它的志贺毒素效应物多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段和/或在它的A1片段区域的羧基端处的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。
在实施方案组#1的某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含从SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸75-251来源的志贺毒素效应物区域。
在实施方案组#1的某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含从SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸1-241来源的志贺毒素效应物区域。在某些其它实施方案中，所述志贺毒素效应物区域源自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸1-251。在某些其它实施方案中，所述志贺毒素效应物区域源自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸1-261。
实施方案组#2-包含去免疫化的志贺毒素效应物多肽的细胞靶向分子，所述多肽
包含嵌入的或插入的异源T-细胞表位和不重叠的去免疫化的亚区域
本发明提供了细胞靶向分子，各自包含(i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域和(ii)实施方案组#1的去免疫化的志贺毒素效应物多肽(参见例如图1，其描绘了该实施方案组#2的细胞靶向分子的四个示例性实施方案的示例性实施例)。例如，组#2的某些实施方案是这样的细胞靶向分子：其包含(i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域和(ii)包含至少一个插入的或嵌入的异源表位的去免疫化的志贺毒素效应物多肽(a)和至少一个被破坏的内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域(b)，其中所述异源表位没有与嵌入的或插入的异源T-细胞表位重叠。对于某些其它实施方案，所述志贺毒素效应物多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应物功能，例如，指导细胞内按路线发送至所述多肽存在于其中的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促地灭活核糖体、造成白细胞郁滞和/或造成细胞毒性。在某些其它实施方案中，所述异源T-细胞表位是CD8+T-细胞表位，例如，就人免疫系统而言。对于某些其它实施方案，所述异源T-细胞表位能够被细胞的MHC I类分子呈递。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够实现以下一项或多项：进入细胞，抑制核糖体功能，造成白细胞郁滞，造成细胞死亡，和/或将嵌入的或插入的异源T-细胞表位递送至MHC I类分子用于呈递在细胞表面上。对于某些其它实施方案，所述细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出与参比分子可比较或比其更好的细胞毒性，所述参比分子是例如由所述细胞靶向分子组成的第二种细胞靶向分子，但是所有它的志贺毒素效应物多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段。
对于实施方案组#2的某些实施方案，所述细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基端的羧基端的分子部分。
对于实施方案组#2的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子当引入脊索动物时能够表现出与参比分子相比改善的体内耐受性和/或稳定性，所述参比分子是例如由所述细胞靶向分子组成的第二种细胞靶向分子，但是所有它的志贺毒素效应物多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段和/或在它的A1片段区域的羧基端处的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。在某些其它实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽不是细胞毒性的，且所述分子部分是细胞毒性的。
在实施方案组#2的某些实施方案中，所述结合区域和志贺毒素效应物多肽直接地或间接地连接在一起。
在实施方案组#2的某些实施方案中，所述结合区域包含含有免疫球蛋白型结合区域的多肽。在某些其它实施方案中，所述结合区域包含选自以下的多肽：自主VH结构域、单结构域抗体片段(sdAb)、纳米体(nanobody)、从骆驼科来源的重链-抗体结构域(VHH或VH结构域片段)、从软骨鱼来源的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)、VNAR片段、单链可变片段(scFv)、抗体可变片段(Fv)、互补决定区3片段(CDR3)、受限的FR3-CDR3-FR4多肽(FR3-CDR3-FR4)、Fd片段、小模块免疫药物(SMIP)结构域、抗原结合片段(Fab)、犰狳重复多肽(ArmRP)、纤连蛋白来源的第10个纤连蛋白III型结构域(10Fn3)、生腱蛋白III型结构域(TNfn3)、锚蛋白重复基序结构域、低密度-脂蛋白-受体-来源的A-结构域(LDLR-A)、脂质运载蛋白(anticalin)、Kunitz结构域、蛋白-A-来源的Z结构域、γ-B晶体-来源的结构域、泛蛋白-来源的结构域、Sac7d-来源的多肽(affitin)、Fyn-来源的SH2结构域、小蛋白(miniprotein)、C-型凝集素-样结构域支架、经工程改造的抗体模拟物和前述任一种的保留结合功能性的任何遗传上操作的相应物。
对于实施方案组#2的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够表现出(i)与野生型志贺毒素A1片段或野生型志贺毒素效应物多肽可比较的催化活性水平，(ii)具有10,000皮摩尔或更低的半数最大抑制浓度(IC50)值的核糖体抑制活性，和/或(iii)显著水平的志贺毒素催化活性。
对于实施方案组#2的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子和/或它的志贺毒素效应物多肽能够表现出与参比细胞靶向分子可比较的亚细胞按路线发送效率，所述参比细胞靶向分子包含野生型志贺毒素A1片段或野生型志贺毒素效应物多肽和/或能够表现出显著水平的从细胞的胞内体起始位置至内质网和/或胞质溶胶的细胞内按路线发送活性。
对于实施方案组#2的某些实施方案，其中将本发明的细胞靶向分子施用给与所述细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理上连接的细胞，所述细胞靶向分子能够造成所述细胞的死亡。在某些其它实施方案中，将本发明的细胞靶向分子施用给就细胞外靶生物分子的存在或水平而言不同的两个不同细胞类型群体，所述细胞靶向分子能够造成这样的细胞死亡：与细胞毒性的细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理上连接的细胞类型的CD50是没有与所述细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理上连接的细胞类型的CD50的至少3倍或更小。对于某些实施方案，其中将本发明的细胞靶向分子施用给其成员与所述细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理上连接的第一细胞群体和其成员没有与所述结合区域的任何细胞外靶生物分子物理上连接的第二细胞群体，所述细胞靶向分子对所述第一细胞群体的成员相对于所述第二细胞群体的成员的细胞毒性效应至少3倍更大。对于某些实施方案，其中将本发明的细胞靶向分子施用给其成员与显著量的所述细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理上连接的第一细胞群体和其成员没有与显著量的所述结合区域的任何细胞外靶生物分子物理上连接的第二细胞群体，所述细胞靶向分子对所述第一细胞群体的成员相对于所述第二细胞群体的成员的细胞毒性效应至少3倍更大。对于某些实施方案，其中将本发明的细胞靶向分子施用给第一靶生物分子阳性细胞群体和其成员不在细胞表面处表达显著量的所述细胞靶向分子的结合区域的靶生物分子的第二细胞群体，所述细胞靶向分子对所述第一细胞群体的成员相对于所述第二细胞群体的成员的细胞毒性效应至少3倍更大。
对于实施方案组#2的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出具有300nM或更小的半数最大抑制浓度(CD50)值的细胞毒性和/或能够表现出显著水平的志贺毒素细胞毒性。
对于实施方案组#2的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够将嵌入的或插入的异源CD8+ T-细胞表位递送至细胞的MHC I类呈递途径用于被MHC I类分子结合的表位的细胞表面呈递。
在实施方案组#2的某些实施方案中，所述细胞靶向分子包含与志贺毒素效应物多肽的羧基端结合的分子部分。在某些实施方案中，所述分子部分包含所述结合区域或由其组成。在某些实施方案中，所述分子部分包含至少一个氨基酸，且所述志贺毒素效应物多肽连接至所述分子部分的至少一个氨基酸残基。在某些其它实施方案中，所述分子部分和所述志贺毒素效应物多肽融合从而形成连续多肽。
在实施方案组#2的某些实施方案中，所述细胞靶向分子还包含与所述志贺毒素效应物多肽的羧基端结合的细胞毒性分子部分。对于某些实施方案，所述细胞毒性分子部分是细胞毒性剂，例如，技术人员已知的和/或本文描述的小分子化学治疗剂、抗肿瘤剂、细胞毒性的抗生素、烷化剂、抗代谢剂、拓扑异构酶抑制剂和/或微管蛋白抑制剂。对于某些其它实施方案，所述细胞毒性分子部分在小于10,000、5,000、1,000、500或200pM的浓度是细胞毒性的。
在实施方案组#2的某些实施方案中，所述结合区域能够结合选自以下的细胞外靶生物分子：CD20、CD22、CD40、CD74、CD79、CD25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前列腺特异性的膜抗原、Cripto、CDCP1、内皮糖蛋白、成纤维细胞活化的蛋白、Lewis-Y、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、CD133、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体(ROR1或NTRKR1)、碳酸酐酶IX、叶酸结合蛋白、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2、神经节苷脂Lewis-Y2、VEGFR、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、Erb3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANK、FAP、生腱蛋白、CD64、间皮素、BRCA1、MART-1/MelanA、gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β-联蛋白、MUM-1、胱天蛋白酶-8、KIAA0205、HPVE6、SART-1、PRAME、癌胚抗原、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原、人天冬氨酰基(天冬酰胺酰基)β-羟化酶、EphA2、HER3/ErbB-3、MUC1、MART-1/MelanA、gp100、酪氨酸酶相关抗原、HPV-E7、EB病毒抗原、Bcr-Abl、甲胎蛋白抗原、17-A1、膀胱肿瘤抗原、CD38、CD15、CD23、CD45(蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型)、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305、C3AR、FceRIa、半乳糖凝集素-9、IL-1R(白介素-1受体)、mrp-14、NKG2D配体、程序性死亡-配体1(PD-L1)、Siglec-8、Siglec-10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT-3、半乳糖凝集素-3、CD11a-c、GITRL、MHC I类分子、MHC II类分子(任选地与肽形成复合物)、CD284(TLR4)、CD107-Mac3、CD195(CCR5)、HLA-DR、CD16/32、CD282(TLR2)、CD11c和前述任一种的任何免疫原性片段。
在实施方案组#2的某些实施方案中，所述结合区域通过至少一个不是二硫键的共价键直接地或间接地连接至所述志贺毒素效应物多肽。在某些其它实施方案中，所述结合区域直接地或间接地融合至所述志贺毒素效应物多肽的羧基端以形成单个连续多肽。在某些其它实施方案中，所述结合区域是免疫球蛋白型结合区域。
在实施方案组#2的某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序在最小弗林蛋白酶切割位点中包含一个或多个相对于野生型志贺毒素A亚基的突变。在某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序不是与最小弗林蛋白酶切割位点的至少一个氨基酸残基的部分或全部重叠的序列的氨基端截短。在某些实施方案中，所述在最小弗林蛋白酶切割位点中的突变是在R/Y-x-x-R弗林蛋白酶切割基序中的至少一个氨基酸残基的氨基酸缺失、插入和/或置换。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含至少一个相对于野生型志贺毒素A亚基的突变，所述突变改变特定区域中的至少一个氨基酸残基，所述特定区域天然地定位1)在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)或志贺毒素(SEQ IDNO：2)的A亚基的248-251，或2)在志贺样毒素2(SEQ ID NO：3)的A亚基的247-250，或任何志贺毒素A亚基中的等同氨基酸序列位置。在某些其它实施方案中，所述突变是非带正电荷的氨基酸残基对精氨酸残基的氨基酸残基置换。
在实施方案组#2的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出与参比分子的细胞毒性可比较的细胞毒性，所述参比分子是例如由所述细胞靶向分子组成的第二种细胞靶向分子，但是所有它的志贺毒素效应物多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段。
在实施方案组#2的某些实施方案中，所述结合区域包含在SEQ ID NO：83-339中的任一个中所示的肽或多肽。在某些其它实施方案中，所述结合区域包含由以下任一个表示的多肽或基本上由其组成：SEQ ID NO：33、64和65中的任一个的氨基酸1-245；SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：80的氨基酸269-513；SEQ ID NO：36、66和67中的任一个的氨基酸269-520或269-521；SEQ ID NO：47-119和176-248中的任一个的氨基酸1-232、1-233、1-234、1-235、1-236、1-242、1-243、1-244、1-245、1-246、1-252、1-253、1-254、1-255或1-256；SEQ ID NO：37-39、68-79和81中的任一个的氨基酸269-498或269-499；SEQ ID NO：34、35、41-56和82中的任一个的氨基酸269-499、269-512、269-513或280-510。
在实施方案组#2的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含SEQ ID NO：43-62、64-82和439-513中的任一个所示的多肽或基本上由其组成。
在实施方案组#2的某些实施方案中，所述结合区域在空间上覆盖A1片段区域的羧基端。
在实施方案组#2的某些实施方案中，所述分子部分在空间上覆盖A1片段区域的羧基端。在某些其它实施方案中，所述分子部分包含所述结合区域。
在实施方案组#2的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些其它实施方案中，所述结合区域和/或分子部分的质量是至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大。
在实施方案组#2的某些实施方案中，所述细胞靶向分子包含具有至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的质量的结合区域，只要所述细胞靶向分子保留适当水平的在本文中指出的志贺毒素生物活性(例如，细胞毒性和/或细胞内按路线发送)。
在实施方案组#2的某些实施方案中，所述结合区域被包含在相对大的分子部分内，所述相对大的分子部分包含例如具有至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的质量的分子部分，只要所述细胞靶向分子保留适当水平的在本文中指出的志贺毒素生物活性。
在实施方案组#2的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽的氨基端是在所述细胞靶向分子的多肽组分的氨基端处和/或近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域相对于所述志贺毒素效应物多肽不位于所述细胞靶向分子的氨基端的近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域和志贺毒素效应物多肽在所述细胞靶向分子内物理上排列或定向，使得所述结合区域不位于所述志贺毒素效应物多肽的氨基端的近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域位于所述细胞靶向分子内相对于所述志贺毒素效应物多肽的氨基端在所述志贺毒素效应物多肽的羧基端的更近侧。对于某些其它实施方案，本发明的细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出大于第三种细胞靶向分子的细胞毒性，所述第三种细胞靶向分子具有氨基端且包含结合区域和志贺毒素效应物多肽，所述志贺毒素效应物多肽没有位于所述第三种细胞靶向分子的氨基端处或近侧。对于某些其它实施方案，本发明的细胞靶向分子表现出具有更好的经优化的细胞毒性效能的细胞毒性，例如，与所述第三种细胞靶向分子的细胞毒性相比为4倍、5倍、6倍、9倍或更大的细胞毒性。对于某些其它实施方案，本发明的细胞靶向分子对靶阳性细胞群体的细胞毒性是所述第三种细胞靶向分子对第二靶阳性细胞群体的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大，如通过CD50值测定的。在某些其它实施方案中，所述第三种细胞靶向分子不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/取回信号基序。
在实施方案组#2的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽的氨基端是在所述细胞靶向分子的多肽组分的氨基端处和/或近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域相对于所述志贺毒素效应物多肽不位于所述细胞靶向分子的氨基端的近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域和志贺毒素效应物多肽在所述细胞靶向分子内物理上排列或定向，使得所述结合区域不位于所述志贺毒素效应物多肽的氨基端的近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域位于所述细胞靶向分子内相对于所述志贺毒素效应物多肽的氨基端在所述志贺毒素效应物多肽的羧基端的更近侧。对于某些其它实施方案，本发明的细胞靶向分子不是细胞毒性的，且当引入细胞时能够表现出与第三种细胞靶向分子的细胞毒性相比更大的从细胞外空间至内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的亚细胞按路线发送效率，所述第三种细胞靶向分子具有氨基端且包含结合区域和志贺毒素效应物多肽，所述志贺毒素效应物多肽没有位于所述第三种细胞靶向分子的氨基端处或近侧。在某些其它实施方案中，所述第三种细胞靶向分子不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/取回信号基序。
在实施方案组#2的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽的氨基端是在所述细胞靶向分子的多肽组分的氨基端处和/或近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域相对于所述志贺毒素效应物多肽不位于所述细胞靶向分子的氨基端的近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域和志贺毒素效应物多肽在所述细胞靶向分子内物理上排列或定向，使得所述结合区域不位于所述志贺毒素效应物多肽的氨基端的近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域位于所述细胞靶向分子内相对于所述志贺毒素效应物多肽的氨基端在所述志贺毒素效应物多肽的羧基端的更近侧。对于某些其它实施方案，本发明的细胞靶向分子表现出低细胞毒性效能(即当引入某些阳性靶细胞类型时不能在1000nM、500nM、100nM、75nM或50nM的细胞靶向分子浓度表现出大于1％的细胞群体细胞死亡的细胞毒性)，且当引入细胞时能够表现出与第三种细胞靶向分子的细胞毒性相比更大的从细胞外空间至内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的亚细胞按路线发送效率，所述第三种细胞靶向分子具有氨基端且包含结合区域和志贺毒素效应物多肽，所述志贺毒素效应物多肽没有位于所述第三种细胞靶向分子的氨基端处或近侧。在某些其它实施方案中，所述第三种细胞靶向分子不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/取回信号基序。
在实施方案组#2的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或其多肽组分包含KDEL家族成员的羧基端内质网保留/取回信号基序。对于某些其它实施方案，所述羧基端内质网保留/取回信号基序选自KDEL、HDEF、HDEL、RDEF、RDEL、WDEL、YDEL、HEEF、HEEL、KEEL、REEL、KAEL、KCEL、KFEL、KGEL、KHEL、KLEL、KNEL、KQEL、KREL、KSEL、KVEL、KWEL、KYEL、KEDL、KIEL、DKEL、FDEL、KDEF、KKEL、HADL、HAEL、HIEL、HNEL、HTEL、KTEL、HVEL、NDEL、QDEL、REDL、RNEL、RTDL、RTEL、SDEL、TDEL、SKEL、STEL和EDEL。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出比第四种细胞靶向分子更大的细胞毒性，所述第四种细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，但是它不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/取回信号基序。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的经优化的细胞毒性效能的细胞毒性，例如，是参比分子(例如，第四种细胞靶向分子)的4倍、5倍、6倍、9倍或更大的细胞毒性。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶阳性细胞群体的细胞毒性是所述第四种细胞靶向分子对第二靶阳性细胞群体的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大，如通过CD50值测定的。
实施方案组#3-包含羧基端内质网保留/取回信号基序和志贺毒素效应物多肽的
细胞靶向分子，所述志贺毒素效应物多肽包含嵌入的或插入的异源T-细胞表位
本发明提供了细胞靶向分子，各自包含(i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)包含插入的或嵌入的异源表位的志贺毒素效应物多肽；和(iii)羧基端内质网保留/取回信号基序。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(a)能够特异性地结合至少一种细胞外靶生物分子的结合区域；(b)包含嵌入的或插入的异源表位的志贺毒素效应物多肽；和(c)KDEL家族成员的羧基端内质网保留/取回信号基序。对于某些其它实施方案，所述志贺毒素效应物多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应物功能，例如，指导细胞内按路线发送至所述多肽存在于其中的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促地灭活核糖体、造成白细胞郁滞和/或造成细胞毒性。在某些其它实施方案中，所述异源T-细胞表位是CD8+ T-细胞表位，例如，就人免疫系统而言。对于某些其它实施方案，所述异源T-细胞表位能够被细胞的MHC I类分子呈递。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够实现以下一项或多项：进入细胞、抑制核糖体功能、造成白细胞郁滞、造成细胞死亡和/或将嵌入的或插入的异源T-细胞表位递送至MHC I类分子用于呈递在细胞表面上。
在实施方案组#3的某些实施方案中，所述羧基端内质网保留/取回信号基序选自KDEL、HDEF、HDEL、RDEF、RDEL、WDEL、YDEL、HEEF、HEEL、KEEL、REEL、KAEL、KCEL、KFEL、KGEL、KHEL、KLEL、KNEL、KQEL、KREL、KSEL、KVEL、KWEL、KYEL、KEDL、KIEL、DKEL、FDEL、KDEF、KKEL、HADL、HAEL、HIEL、HNEL、HTEL、KTEL、HVEL、NDEL、QDEL、REDL、RNEL、RTDL、RTEL、SDEL、TDEL、SKEL、STEL和EDEL。
在实施方案组#3的某些实施方案中，所述嵌入的或插入的异源T-细胞表位破坏选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组的内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域：(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1-15；SEQ ID NO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的27-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQ ID NO：3的42-48；和SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的53-66，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域；(ii)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94-115；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的141-153；SEQ ID NO：3的140-156；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的179-190；SEQ ID NO：3的179-191；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205；和SEQID NO：3的210-218；和(iii)SEQ ID NO：3的240-260；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的243-257；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的254-268；SEQ ID NO：3的262-278；SEQ ID NO：3的281-297；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的285-293，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。
在实施方案组#3的某些其它实施方案中，所述异源表位是能够由细胞的MHC I类分子呈递的CD8+ T-细胞表位。在某些其它实施方案中，所述异源表位被嵌入在野生型志贺毒素多肽区域中并替换相等数目的氨基酸残基，使得所述志贺毒素效应物多肽具有与它的来源野生型志贺毒素多肽区域相同的氨基酸残基总数。在以上任一个的某些其它实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽能够表现出至少一种选自以下的志贺毒素效应物功能：指导细胞内按路线发送至所述多肽存在于其中的细胞的胞质溶胶，抑制核糖体功能、酶促地灭活核糖体和细胞毒性。
在实施方案组#3的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出比第五种细胞靶向分子大的细胞毒性，所述第五种细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，但是它不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/取回信号基序。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的经优化的细胞毒性效能的细胞毒性，例如，与所述第五种细胞靶向分子相比为4倍、5倍、6倍、9倍或更大的细胞毒性。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶阳性细胞群体的细胞毒性是所述第五种细胞靶向分子对第二靶阳性细胞群体的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大，如通过CD50值测定的。
对于实施方案组#3的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够将嵌入的或插入的异源CD8+ T-细胞表位递送至细胞的MHC I类呈递途径用于被MHC I类分子结合的表位的细胞表面呈递。
在实施方案组#3的某些实施方案中，所述细胞靶向分子由于嵌入的或插入的异源表位而去免疫化。在某些其它实施方案中，所述细胞靶向分子能够表现出与参比分子相比更少的相对抗原性和/或相对免疫原性，所述参比分子是例如由所述细胞靶向分子组成的第六种细胞靶向分子，但是它缺少一个或多个存在于所述细胞靶向分子中的嵌入的或插入的表位。
对于实施方案组#3的某些其它实施方案，本发明的细胞靶向分子不是细胞毒性的，且当引入细胞时能够表现出与参比分子(例如，第五种细胞靶向分子)的细胞毒性相比更大的从细胞外空间至内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的亚细胞按路线发送效率。
实施方案组#4-包含志贺毒素效应物多肽的细胞靶向分子，所述志贺毒素效应物
多肽包含(i)嵌入的或插入的异源T-细胞表位和(ii)被破坏的弗林蛋白酶切割基序
本发明提供了细胞靶向分子，各自包含(i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)包含插入的或嵌入的异源表位的志贺毒素效应物多肽；和(iii)被破坏的弗林蛋白酶切割基序。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)志贺毒素效应物多肽，其包含(a)插入的或嵌入的异源表位；(b)具有羧基端的志贺毒素A1片段来源的区域；和(c)在A1片段区域的羧基端处被破坏的弗林蛋白酶切割基序。对于某些其它实施方案，所述志贺毒素效应物多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应物功能，例如，指导细胞内按路线发送至所述多肽存在于其中的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促地灭活核糖体、造成白细胞郁滞和/或造成细胞毒性。在某些其它实施方案中，所述异源T-细胞表位是CD8+ T-细胞表位，例如，就人免疫系统而言。对于某些其它实施方案，所述异源T-细胞表位能够被细胞的MHC I类分子呈递。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够实现以下一项或多项：进入细胞、抑制核糖体功能、造成白细胞郁滞、造成细胞死亡、和/或将嵌入的或插入的异源T-细胞表位递送至MHC I类分子用于呈递在细胞表面上。对于某些其它实施方案，所述细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出与参比分子可比较或比其更好的细胞毒性，所述参比分子是例如由所述细胞靶向分子组成的第二种细胞靶向分子，但是所有它的志贺毒素效应物多肽组分在它的A1片段区域的羧基端处包含野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。
在实施方案组#4的某些实施方案中，所述嵌入的或插入的异源T-细胞表位破坏选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组的内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域：(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1-15；SEQ ID NO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的27-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQ ID NO：3的42-48；和SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的53-66，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域；(ii)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94-115；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的141-153；SEQ ID NO：3的140-156；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的179-190；SEQ ID NO：3的179-191；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205；和SEQID NO：3的210-218；和(iii)SEQ ID NO：3的240-260；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的243-257；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的254-268；SEQ ID NO：3的262-278；SEQ ID NO：3的281-297；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的285-293，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。
在实施方案组#4的某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个相对于野生型志贺毒素A亚基的突变，所述突变改变特定区域中的至少一个氨基酸残基，所述特定区域天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)或志贺毒素(SEQ ID NO：2)的A亚基的248-251，或在志贺样毒素(SEQ ID NO：3)的A亚基的247-250；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序的最小弗林蛋白酶切割位点处包含一个或多个相对于野生型志贺毒素A亚基的突变。在某些其它实施方案中，所述最小弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列R/Y-x-x-R和/或R-x-x-R表示。
在实施方案组#4的某些实施方案中，所述细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基端的羧基端的分子部分。
在实施方案组#4的某些实施方案中，所述结合区域在空间上覆盖A1片段区域的羧基端。
在实施方案组#4的某些实施方案中，所述分子部分在空间上覆盖A1片段区域的羧基端。在某些其它实施方案中，所述分子部分包含所述结合区域。
在实施方案组#4的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些其它实施方案中，所述结合区域和/或分子部分的质量是至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大。
在实施方案组#4的某些实施方案中，所述细胞靶向分子包含具有至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的质量的结合区域，只要所述细胞靶向分子保留适当水平的在本文中指出的志贺毒素生物活性(例如，细胞毒性和/或细胞内按路线发送)。
在实施方案组#4的某些实施方案中，所述结合区域被包含在相对大的分子部分内，所述相对大的分子部分包含例如具有至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的质量的分子部分，只要所述细胞靶向分子保留适当水平的在本文中指出的志贺毒素生物活性。
在实施方案组#4的某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在所述弗林蛋白酶切割基序内相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换。在某些其它实施方案中，所述弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基的置换是选自以下的非带正电荷的氨基酸残基对精氨酸残基的置换：丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基的置换是组氨酸对精氨酸残基的置换。
在实施方案组#4的某些实施方案中，所述细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出与第七种细胞靶向分子的细胞毒性可比较的细胞毒性，所述第七种细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，但是所有它的志贺毒素效应物多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段和/或在它的A1片段区域的羧基端处的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出的细胞毒性是在所述第七种细胞靶向分子表现出的细胞毒性的0.1倍、0.5倍或0.75倍至1.2倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍或5倍的范围内。
在实施方案组#4的某些实施方案中，所述细胞靶向分子当引入脊索动物时能够表现出与所述第七种细胞靶向分子的体内耐受性相比改善的体内耐受性。
在实施方案组#4的某些实施方案中，所述细胞靶向分子由于嵌入的或插入的异源表位而去免疫化。在某些其它实施方案中，所述细胞靶向分子能够表现出与参比分子相比更少的相对抗原性和/或相对免疫原性，所述参比分子是例如由所述细胞靶向分子组成的第八种细胞靶向分子，但是它缺少一个或多个存在于所述细胞靶向分子中的嵌入的或插入的表位。
在实施方案组#4的某些实施方案中，所述细胞靶向分子由于所述弗林蛋白酶切割基序破坏而去免疫化。在某些其它实施方案中，所述细胞靶向分子能够表现出与第九种细胞靶向分子相比更少的相对抗原性和/或相对免疫原性，所述第九种细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，但是所述弗林蛋白酶切割基序是野生型和/或所有所述志贺毒素效应物多肽组分由野生型志贺毒素A1片段组成。
实施方案组#5-包含在氨基端处或近侧的志贺毒素效应物多肽的细胞靶向分子且
其中所述志贺毒素效应物多肽包含嵌入的或插入的异源T-细胞表位
本发明提供了细胞靶向分子，各自包含(i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)包含插入的或嵌入的异源表位的志贺毒素效应物多肽；其中所述志贺毒素效应物多肽是在多肽的氨基端处或近侧。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域，(ii)多肽组分，和(iii)包含插入的或嵌入的异源表位的志贺毒素效应物多肽；其中所述志贺毒素效应物多肽是在所述细胞靶向分子的多肽组分的氨基端处或近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域和志贺毒素效应物多肽在所述细胞靶向分子内物理上排列或定向，使得所述结合区域不位于所述志贺毒素效应物多肽的氨基端的近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域位于所述细胞靶向分子内相对于所述志贺毒素效应物多肽的氨基端在所述志贺毒素效应物多肽的羧基端的更近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域相对于所述志贺毒素效应物多肽不位于所述细胞靶向分子的氨基端近侧。对于某些其它实施方案，所述志贺毒素效应物多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应物功能，例如，指导细胞内按路线发送至所述多肽存在于其中的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促地灭活核糖体、造成白细胞郁滞和/或造成细胞毒性。在某些其它实施方案中，所述异源T-细胞表位是CD8+ T-细胞表位，例如，就人免疫系统而言。对于某些其它实施方案，所述异源T-细胞表位能够被细胞的MHCI类分子呈递。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够实现以下一项或多项：进入细胞、抑制核糖体功能、造成白细胞郁滞、造成细胞死亡、和/或将嵌入的或插入的异源T-细胞表位递送至MHC I类分子用于呈递在细胞表面上。
在实施方案组#5的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出比第十种细胞靶向分子的细胞毒性更大的细胞毒性，所述第十种细胞靶向分子具有氨基端且包含结合区域和志贺毒素效应物多肽区域，所述志贺毒素效应物多肽区域没有位于所述第十种细胞靶向分子的氨基端处或近侧。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的经优化的细胞毒性效能的细胞毒性，例如，与所述第十种细胞靶向分子相比为4倍、5倍、6倍、9倍或更大的细胞毒性。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶阳性细胞群体的细胞毒性是所述第十种细胞靶向分子对第二靶阳性细胞群体的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大，如通过CD50值测定的。
对于实施方案组#5的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够将嵌入的或插入的异源CD8+ T-细胞表位递送至细胞的MHC I类呈递途径用于被MHC I类分子结合的表位的细胞表面呈递。
在实施方案组#5的某些实施方案中，所述细胞靶向分子由于嵌入的或插入的异源表位而去免疫化。在某些其它实施方案中，所述细胞靶向分子能够表现出与参比分子相比更少的相对抗原性和/或相对免疫原性，所述参比分子是例如由所述细胞靶向分子组成的第十一种细胞靶向分子，但是它缺少一个或多个存在于所述细胞靶向分子中的嵌入的或插入的表位。
对于实施方案组#5的某些其它实施方案，本发明的细胞靶向分子不是细胞毒性的，且当引入细胞时能够表现出与参比分子(例如，第十种细胞靶向分子)的细胞毒性相比更大的从细胞外空间至内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的亚细胞按路线发送效率。
实施方案组#6-包含去免疫化的志贺毒素效应物多肽的细胞靶向分子，所述多肽
包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序
本发明提供了细胞靶向分子，各自包含(i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域和(ii)去免疫化的志贺毒素效应物多肽，其包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域和(ii)去免疫化的志贺毒素效应物多肽，其包含(a)具有羧基端的志贺毒素A1片段来源的区域，(b)在A1片段区域的羧基端处被破坏的弗林蛋白酶切割基序，和(c)至少一个被破坏的内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位和/或表位区域。对于某些其它实施方案，所述志贺毒素效应物多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应物功能，例如，指导细胞内按路线发送至所述多肽存在于其中的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促地灭活核糖体、造成白细胞郁滞和/或造成细胞毒性。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够实现以下一项或多项：进入细胞、抑制核糖体功能、造成白细胞郁滞和/或造成细胞死亡。对于某些其它实施方案，所述细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出与参比分子可比较或比其更好的细胞毒性，所述参比分子是例如由所述细胞靶向分子组成的第二种细胞靶向分子，但是所有它的志贺毒素效应物多肽组分在它的A1片段区域的羧基端处包含野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。
在实施方案组#6的某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述志贺毒素效应物多肽包含在B-细胞和/或T-细胞表位区域中的突变，所述表位区域选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1-15；SEQ IDNO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的27-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQ ID NO：3的42-48；SEQ ID NO：1、SEQ 1D NO：2或SEQ ID NO：3的53-66；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94-115；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的141-153；SEQ ID NO：3的140-156；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的179-190；SEQ ID NO：3的179-191；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205，和SEQ ID NO：3的210-218；SEQ ID NO：3的240-260；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的243-257；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的254-268；SEQ ID NO：3的262-278；SEQ ID NO：3的281-297；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的285-293；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的4-33；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的34-78；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的77-103；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的128-168；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的160-183；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的236-258；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的274-293；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些其它实施方案中，不存在破坏，其为与至少一个被破坏的内源性B-细胞和/或T-细胞表位和/或表位区域的部分或全部重叠的氨基酸残基的羧基端截短。
在实施方案组#6的某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个相对于野生型志贺毒素A亚基的突变，所述突变改变特定区域中的至少一个氨基酸残基，所述特定区域天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)或志贺毒素(SEQ ID NO：2)的A亚基的248-251，或在志贺样毒素(SEQ ID NO：3)的A亚基的247-250；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序的最小弗林蛋白酶切割位点处包含一个或多个相对于野生型志贺毒素A亚基的突变。在某些其它实施方案中，所述最小弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列R/Y-x-x-R和/或R-x-x-R表示。
在实施方案组#6的某些实施方案中，所述细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基端的羧基端的分子部分。
在实施方案组#6的某些实施方案中，所述结合区域在空间上覆盖A1片段区域的羧基端。
在实施方案组#6的某些实施方案中，所述分子部分在空间上覆盖A1片段区域的羧基端。在某些其它实施方案中，所述分子部分包含所述结合区域。
在实施方案组#6的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些其它实施方案中，所述结合区域和/或分子部分的质量是至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大。
在实施方案组#6的某些实施方案中，所述细胞靶向分子包含具有至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的质量的结合区域，只要所述细胞靶向分子保留适当水平的在本文中指出的志贺毒素生物活性(例如，细胞毒性和/或细胞内按路线发送)。
在实施方案组#6的某些实施方案中，所述结合区域被包含在相对大的分子部分内，所述相对大的分子部分包含例如具有至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的质量的分子部分，只要所述细胞靶向分子保留适当水平的在本文中指出的志贺毒素生物活性。
在实施方案组#6的某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在所述弗林蛋白酶切割基序内相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换。在某些其它实施方案中，所述弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基的置换是选自以下的非带正电荷的氨基酸残基对精氨酸残基的置换：丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基的置换是组氨酸对精氨酸残基的置换。
在实施方案组#6的某些实施方案中，所述细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出与参比分子的细胞毒性可比较的细胞毒性，所述参比分子是例如由所述细胞靶向分子组成的第十二种细胞靶向分子，但是所有它的志贺毒素效应物多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段和/或在它的A1片段区域的羧基端处的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子当引入细胞时能够表现的细胞毒性是在所述第十二种细胞靶向分子所表现出的细胞毒性的0.1倍、0.5倍或0.75倍至1.2倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍或5倍的范围内。
在实施方案组#4的某些实施方案中，所述细胞靶向分子当引入脊索动物时能够表现出与所述第十二种细胞靶向分子的体内耐受性相比改善的体内耐受性。
在实施方案组#4的某些实施方案中，所述细胞靶向分子由于所述弗林蛋白酶切割基序破坏而去免疫化。在某些其它实施方案中，所述细胞靶向分子能够表现出与参比细胞靶向分子相比更少的相对抗原性和/或相对免疫原性，所述参比细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，但是所述弗林蛋白酶切割基序是野生型和/或所有所述志贺毒素效应物多肽组分由野生型志贺毒素A1片段(例如，第十二种细胞靶向分子)组成。
实施方案组#7-包含羧基端内质网保留/取回信号基序和去免疫化的志贺毒素效
应物多肽的细胞靶向分子
本发明提供了细胞靶向分子，各自包含(i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)去免疫化的志贺毒素效应物多肽，和(iii)羧基端内质网保留/取回信号基序。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)去免疫化的志贺毒素效应物多肽，其包含至少一个被破坏的内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位和/或表位区域，和(iii)KDEL家族成员的羧基端内质网保留/取回信号基序。对于某些其它实施方案，所述志贺毒素效应物多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应物功能，例如，指导细胞内按路线发送至所述多肽存在于其中的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促地灭活核糖体、造成白细胞郁滞和/或造成细胞毒性。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够实现以下一项或多项：进入细胞、抑制核糖体功能、造成白细胞郁滞和/或造成细胞死亡。
在实施方案组#7的某些实施方案中，所述羧基端内质网保留/取回信号基序选自KDEL、HDEF、HDEL、RDEF、RDEL、WDEL、YDEL、HEEF、HEEL、KEEL、REEL、KAEL、KCEL、KFEL、KGEL、KHEL、KLEL、KNEL、KQEL、KREL、KSEL、KVEL、KWEL、KYEL、KEDL、KIEL、DKEL、FDEL、KDEF、KKEL、HADL、HAEL、HIEL、HNEL、HTEL、KTEL、HVEL、NDEL、QDEL、REDL、RNEL、RTDL、RTEL、SDEL、TDEL、SKEL、STEL和EDEL。
在实施方案组#7的某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述志贺毒素效应物多肽包含在B-细胞和/或T-细胞表位区域中的突变，所述表位区域选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1-15；SEQ IDNO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的27-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQ ID NO：3的42-48；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的53-66；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94-115；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的141-153；SEQ ID NO：3的140-156；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的179-190；SEQ ID NO：3的179-191；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205，和SEQ ID NO：3的210-218；SEQ ID NO：3的240-260；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的243-257；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的254-268；SEQ ID NO：3的262-278；SEQ ID NO：3的281-297；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的285-293；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的4-33；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的34-78；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的77-103；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的128-168；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的160-183；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的236-258；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的274-293；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些其它实施方案中，不存在破坏，其为与至少一个被破坏的内源性B-细胞和/或T-细胞表位和/或表位区域的部分或全部重叠的氨基酸残基的羧基端截短。
在实施方案组#7的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出大于第十三种细胞靶向分子的细胞毒性的细胞毒性，所述第十三种细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，但是它不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/取回信号基序。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的经优化的细胞毒性效能的细胞毒性，例如，与所述第十三种细胞靶向分子相比为4倍、5倍、6倍、9倍或更大的细胞毒性。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶阳性细胞群体的细胞毒性是所述第十三种细胞靶向分子对第二靶阳性细胞群体的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大，如通过CD50值测定的。
对于实施方案组#7的某些其它实施方案，本发明的细胞靶向分子不是细胞毒性的，且当引入细胞时能够表现出与参比分子(例如，第十三种细胞靶向分子)的细胞毒性相比更大的从细胞外空间至内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的亚细胞按路线发送效率。
实施方案组#8-细胞靶向分子，其包含在所述细胞靶向分子的氨基端处或近侧的
去免疫化的志贺毒素效应物多肽
本发明提供了细胞靶向分子，各自包含(i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域，(ii)去免疫化的志贺毒素效应物多肽；其中所述志贺毒素效应物多肽是在氨基端处或近侧。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)多肽组分；和(iii)去免疫化的志贺毒素效应物多肽，其包含至少一个被破坏的内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位和/或表位区域；其中所述志贺毒素效应物多肽是在所述细胞靶向分子的多肽组分的氨基端处或近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域和志贺毒素效应物多肽在所述细胞靶向分子内物理上排列或定向，使得所述结合区域不位于所述志贺毒素效应物多肽的氨基端的近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域位于所述细胞靶向分子内相对于所述志贺毒素效应物多肽的氨基端在所述志贺毒素效应物多肽的羧基端的更近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域相对于所述志贺毒素效应物多肽不位于所述细胞靶向分子的氨基端近侧。对于某些其它实施方案，所述志贺毒素效应物多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应物功能，例如，指导细胞内按路线发送至所述多肽存在于其中的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促地灭活核糖体、造成白细胞郁滞和/或造成细胞毒性。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够实现以下一项或多项：进入细胞、抑制核糖体功能、造成白细胞郁滞和/或造成细胞死亡。
在实施方案组#8的某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述志贺毒素效应物多肽包含在B-细胞和/或T-细胞表位区域中的突变，所述表位区域选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1-15；SEQ IDNO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的27-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQ ID NO：3的42-48；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的53-66；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94-115；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的141-153；SEQ ID NO：3的140-156；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的179-190；SEQ ID NO：3的179-191；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205，和SEQ ID NO：3的210-218；SEQ ID NO：3的240-260；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的243-257；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的254-268；SEQ ID NO：3的262-278；SEQ ID NO：3的281-297；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的285-293；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的4-33；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的34-78；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的77-103；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的128-168；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的160-183；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的236-258；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的274-293；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些其它实施方案中，不存在破坏，其为与至少一个被破坏的内源性B-细胞和/或T-细胞表位和/或表位区域的部分或全部重叠的氨基酸残基的羧基端截短。
在实施方案组#8的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出大于第十四种细胞靶向分子的细胞毒性的细胞毒性，所述第十四种细胞靶向分子具有氨基端且包含结合区域和志贺毒素效应物多肽区域，所述志贺毒素效应物多肽区域没有位于所述第十四种细胞靶向分子的氨基端处或近侧。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的经优化的细胞毒性效能的细胞毒性，例如，与所述第十四种细胞靶向分子相比为4倍、5倍、6倍、9倍或更大的细胞毒性。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶阳性细胞群体的细胞毒性是所述第十四种细胞靶向分子对第二靶阳性细胞群体的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大，如通过CD50值测定的。
对于实施方案组#8的某些其它实施方案，本发明的细胞靶向分子不是细胞毒性的，且当引入细胞时能够表现出与参比分子(例如，第十四种细胞靶向分子)的细胞毒性相比更大的从细胞外空间至内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的亚细胞按路线发送效率。
实施方案组#9-包含羧基端内质网保留/取回信号基序和志贺毒素效应物多肽的
细胞靶向分子，所述志贺毒素效应物多肽包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序
本发明提供了细胞靶向分子，各自包含(i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)志贺毒素效应物多肽，其包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序；和(iii)羧基端内质网保留/取回信号基序。本发明提供了细胞靶向分子，各自包含(i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域；(ii)志贺毒素效应物多肽，其包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序；和(iii)KDEL家族成员的羧基端内质网保留/取回信号基序。对于某些其它实施方案，所述志贺毒素效应物多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应物功能，例如，指导细胞内按路线发送至所述多肽存在于其中的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促地灭活核糖体、造成白细胞郁滞和/或造成细胞毒性。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够实现以下一项或多项：进入细胞、抑制核糖体功能、造成白细胞郁滞和/或造成细胞死亡。对于某些其它实施方案，所述细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出与参比分子可比较或比其更好的细胞毒性，所述参比分子是例如由所述细胞靶向分子组成的第二种细胞靶向分子，但是所有它的志贺毒素效应物多肽组分在它的A1片段区域的羧基端处包含野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。
在实施方案组#9的某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个相对于野生型志贺毒素A亚基的突变，所述突变改变特定区域中的至少一个氨基酸残基，所述特定区域天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)或志贺毒素(SEQ ID NO：2)的A亚基的248-251，或在志贺样毒素(SEQ ID NO：3)的A亚基的247-250；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序的最小弗林蛋白酶切割位点处包含一个或多个相对于野生型志贺毒素A亚基的突变。在某些其它实施方案中，所述最小弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列R/Y-x-x-R和/或R-x-x-R表示。
在实施方案组#9的某些实施方案中，所述细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基端的羧基端的分子部分。
在实施方案组#9的某些实施方案中，所述结合区域在空间上覆盖A1片段区域的羧基端。
在实施方案组#9的某些实施方案中，所述分子部分在空间上覆盖A1片段区域的羧基端。在某些其它实施方案中，所述分子部分包含所述结合区域。
在实施方案组#9的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些其它实施方案中，所述结合区域和/或分子部分的质量是至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大。
在实施方案组#9的某些实施方案中，所述细胞靶向分子包含具有至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的质量的结合区域，只要所述细胞靶向分子保留适当水平的在本文中指出的志贺毒素生物活性(例如，细胞毒性和/或细胞内按路线发送)。
在实施方案组#9的某些实施方案中，所述结合区域被包含在相对大的分子部分内，所述相对大的分子部分包含例如具有至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的质量的分子部分，只要所述细胞靶向分子保留适当水平的在本文中指出的志贺毒素生物活性。
在实施方案组#9的某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在所述弗林蛋白酶切割基序内相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换。在某些其它实施方案中，所述弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基的置换是选自以下的非带正电荷的氨基酸残基对精氨酸残基的置换：丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基的置换是组氨酸对精氨酸残基的置换。
在实施方案组#9的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出大于第十五种细胞靶向分子的细胞毒性的细胞毒性，所述第十五种细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，但是它不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/取回信号基序。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的经优化的细胞毒性效能的细胞毒性，例如，与所述第十五种细胞靶向分子相比为4倍、5倍、6倍、9倍或更大的细胞毒性。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶阳性细胞群体的细胞毒性是所述第十五种细胞靶向分子对第二靶阳性细胞群体的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大，如通过CD50值测定的。
在实施方案组#9的某些实施方案中，所述细胞靶向分子当引入脊索动物时能够表现出与第十六种细胞靶向分子的体内耐受性相比改善的体内耐受性，所述第十六种细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，但是所有它的志贺毒素效应物多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段和/或在它的A1片段区域的羧基端处的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。
在实施方案组#9的某些实施方案中，所述细胞靶向分子由于所述弗林蛋白酶切割基序破坏而去免疫化。在某些其它实施方案中，所述细胞靶向分子能够表现出与参比细胞靶向分子相比更少的相对抗原性和/或相对免疫原性，所述参比细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，但是所述弗林蛋白酶切割基序是野生型和/或所有所述志贺毒素效应物多肽组分由野生型志贺毒素A1片段(例如，第十六种细胞靶向分子)组成。
对于实施方案组#9的某些其它实施方案，本发明的细胞靶向分子不是细胞毒性的，且当引入细胞时能够表现出与参比分子(例如，第十五种细胞靶向分子)的细胞毒性相比更大的从细胞外空间至内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的亚细胞按路线发送效率。
实施方案组#10-细胞靶向分子，其包含在所述细胞靶向分子的氨基端处或近侧的
弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽
本发明提供了细胞靶向分子，各自包含(i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域和(ii)志贺毒素效应物多肽，其在它的志贺毒素A1片段区域的羧基端处包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序；其中所述志贺毒素效应物多肽的氨基端是在所述细胞靶向分子的多肽组分的氨基端处和/或近侧。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域，(ii)具有氨基端的志贺毒素效应物多肽和具有羧基端的志贺毒素A1片段来源的区域，和(iii)在A1片段区域的羧基端处被破坏的弗林蛋白酶切割基序；其中所述结合区域相对于所述志贺毒素效应物多肽没有位于所述细胞靶向分子的氨基端的近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域和志贺毒素效应物多肽在所述细胞靶向分子内物理上排列或定向，使得所述结合区域不位于所述志贺毒素效应物多肽的氨基端的近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域位于所述细胞靶向分子内相对于所述志贺毒素效应物多肽的氨基端在所述志贺毒素效应物多肽的羧基端的更近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域相对于所述志贺毒素效应物多肽不位于所述细胞靶向分子的氨基端近侧。对于某些其它实施方案，所述志贺毒素效应物多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应物功能，例如，指导细胞内按路线发送至所述多肽存在于其中的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促地灭活核糖体、造成白细胞郁滞和/或造成细胞毒性。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够实现以下一项或多项：进入细胞、抑制核糖体功能、造成白细胞郁滞和/或造成细胞死亡。对于某些其它实施方案，所述细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出与参比分子可比较或比其更好的细胞毒性，所述参比分子是例如由所述细胞靶向分子组成的第十七种细胞靶向分子，但是所有它的志贺毒素效应物多肽组分在它的A1片段区域的羧基端处包含野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。
在实施方案组#10的某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个相对于野生型志贺毒素A亚基的突变，所述突变改变特定区域中的至少一个氨基酸残基，所述特定区域天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)或志贺毒素(SEQ ID NO：2)的A亚基的248-251，或在志贺样毒素(SEQ ID NO：3)的A亚基的247-250；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序在弗林蛋白酶切割基序的最小弗林蛋白酶切割位点处包含一个或多个相对于野生型志贺毒素A亚基的突变。在某些其它实施方案中，所述最小弗林蛋白酶切割位点由共有氨基酸序列R/Y-x-x-R和/或R-x-x-R表示。
在实施方案组#10的某些实施方案中，所述细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基端的羧基端的分子部分。
在实施方案组#10的某些实施方案中，所述结合区域在空间上覆盖A1片段区域的羧基端。
在实施方案组#10的某些实施方案中，所述分子部分在空间上覆盖A1片段区域的羧基端。在某些其它实施方案中，所述分子部分包含所述结合区域。
在实施方案组#10的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些其它实施方案中，所述结合区域和/或分子部分的质量是至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大。
在实施方案组#10的某些实施方案中，所述细胞靶向分子包含具有至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的质量的结合区域，只要所述细胞靶向分子保留适当水平的在本文中指出的志贺毒素生物活性(例如，细胞毒性和/或细胞内按路线发送)。
在实施方案组#10的某些实施方案中，所述结合区域被包含在相对大的分子部分内，所述相对大的分子部分包含例如具有至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的质量的分子部分，只要所述细胞靶向分子保留适当水平的在本文中指出的志贺毒素生物活性。
在实施方案组#10的某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在所述弗林蛋白酶切割基序内相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换。在某些其它实施方案中，所述弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基的置换是选自以下的非带正电荷的氨基酸残基对精氨酸残基的置换：丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基的置换是组氨酸对精氨酸残基的置换。
在实施方案组#10的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出大于第十八种细胞靶向分子的细胞毒性的细胞毒性，所述第十八种细胞靶向分子具有氨基端且包含结合区域和志贺毒素效应物多肽区域，所述志贺毒素效应物多肽区域没有位于所述第十八种细胞靶向分子的氨基端处或近侧。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的经优化的细胞毒性效能的细胞毒性，例如，与所述第十八种细胞靶向分子相比为4倍、5倍、6倍、9倍或更大的细胞毒性。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶阳性细胞群体的细胞毒性是所述第十八种细胞靶向分子对第二靶阳性细胞群体的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大，如通过CD50值测定的。
在实施方案组#10的某些实施方案中，所述细胞靶向分子当引入脊索动物时能够表现出与第十九种细胞靶向分子的体内耐受性相比改善的体内耐受性，所述第十九种细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，但是所有它的志贺毒素效应物多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段和/或在它的A1片段区域的羧基端处的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。
在实施方案组#10的某些实施方案中，所述细胞靶向分子由于所述弗林蛋白酶切割基序破坏而去免疫化。在某些其它实施方案中，所述细胞靶向分子能够表现出与参比细胞靶向分子相比更少的相对抗原性和/或相对免疫原性，所述参比细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，但是所述弗林蛋白酶切割基序是野生型和/或所有所述志贺毒素效应物多肽组分由野生型志贺毒素A1片段(例如，第十九种细胞靶向分子)组成。
对于实施方案组#10的某些其它实施方案，本发明的细胞靶向分子不是细胞毒性的，且当引入细胞时能够表现出与参比分子(例如，第十九种细胞靶向分子)的细胞毒性相比更大的从细胞外空间至内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的亚细胞按路线发送效率。
实施方案组#11-细胞靶向分子，其包含羧基端内质网保留/取回信号基序和在所
述细胞靶向分子的氨基端处或近侧的志贺毒素效应物多肽
本发明提供了细胞靶向分子，各自包含(i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域，(ii)羧基端内质网保留/取回信号基序，和(iii)志贺毒素效应物多肽；其中所述志贺毒素效应物多肽的氨基端是在所述细胞靶向分子的多肽组分的氨基端处和/或近侧。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含(i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域，(ii)KDEL家族成员的羧基端内质网保留/取回信号基序，(iii)多肽组分，和(iv)志贺毒素效应物多肽；其中所述志贺毒素效应物多肽的氨基端是在所述细胞靶向分子的多肽组分的氨基端处和/或近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域和志贺毒素效应物多肽在所述细胞靶向分子内物理上排列或定向，使得所述结合区域不位于所述志贺毒素效应物多肽的氨基端的近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域位于所述细胞靶向分子内相对于所述志贺毒素效应物多肽的氨基端在所述志贺毒素效应物多肽的羧基端的更近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域相对于所述志贺毒素效应物多肽不位于所述细胞靶向分子的氨基端近侧。
对于某些其它实施方案，所述志贺毒素效应物多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应物功能，例如，指导细胞内按路线发送至所述多肽存在于其中的细胞的内质网和/或胞质溶胶、抑制核糖体功能、酶促地灭活核糖体、造成白细胞郁滞和/或造成细胞毒性。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够实现以下一项或多项：进入细胞、抑制核糖体功能、造成白细胞郁滞和/或造成细胞死亡。
在实施方案组#11的某些实施方案中，所述羧基端内质网保留/取回信号基序选自KDEL、HDEF、HDEL、RDEF、RDEL、WDEL、YDEL、HEEF、HEEL、KEEL、REEL、KAEL、KCEL、KFEL、KGEL、KHEL、KLEL、KNEL、KQEL、KREL、KSEL、KVEL、KWEL、KYEL、KEDL、KIEL、DKEL、FDEL、KDEF、KKEL、HADL、HAEL、HIEL、HNEL、HTEL、KTEL、HVEL、NDEL、QDEL、REDL、RNEL、RTDL、RTEL、SDEL、TDEL、SKEL、STEL和EDEL。
在实施方案组#11的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出大于第二十种细胞靶向分子的细胞毒性和/或大于第二十一种细胞靶向分子的细胞毒性的细胞毒性，所述第二十种细胞靶向分子具有氨基端且包含结合区域和志贺毒素效应物多肽区域，所述志贺毒素效应物多肽区域没有位于所述第二十种细胞靶向分子的氨基端处或近侧，所述第二十一种细胞靶向分子由所述细胞靶向分子组成，但是它不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/取回信号基序。在某些其它实施方案中，所述第二十种细胞靶向分子不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/取回信号基序。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的经优化的细胞毒性效能的细胞毒性，例如，与参比分子(例如，第二十种和/或第二十一种细胞靶向分子)相比为4倍、5倍、6倍、9倍或更大的细胞毒性。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶阳性细胞群体的细胞毒性是所述第二十种和/或第二十一种细胞靶向分子对第二靶阳性细胞群体的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大，如通过CD50值测定的。
对于实施方案组#11的某些其它实施方案，本发明的细胞靶向分子不是细胞毒性的，且当引入细胞时能够表现出与参比分子(例如，第二十种和/或第二十一种细胞靶向分子)的细胞毒性相比更大的从细胞外空间至内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的亚细胞按路线发送效率。
实施方案组#1-#11的其它实施方案
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽直接地或间接地(例如，经由技术人员已知的接头)与所述结合区域融合。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基端的羧基端的分子部分。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含具有羧基端的志贺毒素A1片段来源的区域，且进一步包含在A1片段区域的羧基端处被破坏的弗林蛋白酶切割基序。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或其多肽组分包含KDEL家族成员的羧基端内质网保留/取回信号基序。对于某些其它实施方案，所述羧基端内质网保留/取回信号基序选自KDEL、HDEF、HDEL、RDEF、RDEL、WDEL、YDEL、HEEF、HEEL、KEEL、REEL、KAEL、KCEL、KFEL、KGEL、KHEL、KLEL、KNEL、KQEL、KREL、KSEL、KVEL、KWEL、KYEL、KEDL、KIEL、DKEL、FDEL、KDEF、KKEL、HADL、HAEL、HIEL、HNEL、HTEL、KTEL、HVEL、NDEL、QDEL、REDL、RNEL、RTDL、RTEL、SDEL、TDEL、SKEL、STEL和EDEL。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出大于参比分子的细胞毒性的细胞毒性，所述参比分子是例如由所述细胞靶向分子组成的第二十二种细胞靶向分子，但是它不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/取回信号基序。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出具有更好的经优化的细胞毒性效能的细胞毒性，例如，与参比分子(例如，第二十二种细胞靶向分子)相比为4倍、5倍、6倍、9倍或更大的细胞毒性。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子对靶阳性细胞群体的细胞毒性是所述第二十二种细胞靶向分子对第二靶阳性细胞群体的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大，如通过CD50值测定的。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽还包含至少一个插入的或嵌入的异源表位。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽还包含至少1、2或3个被破坏的内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域。在某些其它实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含至少1、2或3个内源性B-细胞和/或T-细胞表位和/或表位区域的破坏。在某些其它实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽还包含至少一个被破坏的内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域，所述表位区域不与至少一个插入的或嵌入的异源表位重叠。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽的氨基端是在所述细胞靶向分子的多肽组分的氨基端处和/或近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域相对于所述志贺毒素效应物多肽不位于所述细胞靶向分子的氨基端的近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域和志贺毒素效应物多肽在所述细胞靶向分子内物理上排列或定向，使得所述结合区域不位于所述志贺毒素效应物多肽的氨基端的近侧。在某些其它实施方案中，所述结合区域位于所述细胞靶向分子内相对于所述志贺毒素效应物多肽的氨基端在所述志贺毒素效应物多肽的羧基端的更近侧。对于某些其它实施方案，本发明的细胞靶向分子不是细胞毒性的，且当引入细胞时能够表现出与参比分子的细胞毒性相比更大的从细胞外空间至内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的亚细胞按路线发送效率，所述参比分子是例如具有氨基端且包含结合区域和志贺毒素效应物多肽的第二十三种细胞靶向分子，所述志贺毒素效应物多肽没有位于所述第三种细胞靶向分子的氨基端处或近侧。对于某些其它实施方案，本发明的细胞靶向分子表现出具有更好的经优化的细胞毒性效能的细胞毒性，例如，与所述第二十三种细胞靶向分子的细胞毒性相比为4倍、5倍、6倍、9倍或更大的细胞毒性。对于某些其它实施方案，本发明的细胞靶向分子对靶阳性细胞群体的细胞毒性是所述第二十三种细胞靶向分子对第二靶阳性细胞群体的细胞毒性的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大，如通过CD50值测定的。在某些其它实施方案中，所述第二十三种细胞靶向分子不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/取回信号基序。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽还包含选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组的B-细胞和/或T-细胞表位区域中的破坏：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1-15；SEQ ID NO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的27-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQ ID NO：3的42-48；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的53-66；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94-115；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的141-153；SEQ ID NO：3的140-156；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的179-190；SEQ ID NO：3的179-191；SEQ ID NO：3的204；SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的205，和SEQ ID NO：3的210-218；SEQ ID NO：3的240-260；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的243-257；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的254-268；SEQ ID NO：3的262-278；SEQ ID NO：3的281-297；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的285-293；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的4-33；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的34-78；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的77-103；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的128-168；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的160-183；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的236-258；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的274-293；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。在某些其它实施方案中，不存在破坏，其为与至少一个被破坏的内源性B-细胞和/或T-细胞表位和/或表位区域的部分或全部重叠的氨基酸残基的羧基端截短。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽还包含在选自天然地定位的志贺毒素A亚基氨基酸残基的组的B-细胞免疫原性的氨基酸残基中相对于野生型志贺毒素A亚基的突变：L49、D197、D198、R204和R205。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述嵌入的或插入的异源T-细胞表位破坏选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组的内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域：(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1-15；SEQ ID NO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的27-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQID NO：3的42-48；和SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的53-66；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域，其中不存在破坏，其为与至少一个被破坏的表位区域的部分或全部重叠的序列的氨基端截短；(ii)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94-115；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的141-153；SEQ ID NO：3的140-156；SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的179-190；SEQ ID NO：3的179-191；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205；和SEQ ID NO：3的210-218；和(iii)SEQ ID NO：3的240-260；SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的243-257；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的254-268；SEQ ID NO：3的262-278；SEQ IDNO：3的281-297；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的285-293；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，所述志贺毒素效应物多肽包含在B-细胞和/或T-细胞表位区域中的突变，所述表位区域选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组：(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1-15；SEQ ID NO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的27-37；SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQ ID NO：3的42-48；和SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQID NO：3的53-66；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域，其中不存在破坏，其为与至少一个被破坏的表位区域的部分或全部重叠的序列的氨基端截短；(ii)SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：3的94-115；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的141-153；SEQ ID NO：3的140-156；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的179-190；SEQ ID NO：3的179-191；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205；和SEQ ID NO：3的210-218；和(iii)SEQ ID NO：3的240-260；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的243-257；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的254-268；SEQ ID NO：3的262-278；SEQ ID NO：3的281-297；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的285-293；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域，其中不存在破坏，其为与至少一个被破坏的表位区域的部分或全部重叠的序列的氨基端截短。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含至少一个内源性表位区域的破坏，所述表位区域选自天然地定位的志贺毒素A亚基：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94-115；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的141-153；SEQ ID NO：3的140-156；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的179-190；SEQ ID NO：3的179-191；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205；或SEQ ID NO：3的210-218。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽不包含异源的MHC I类限制的T-细胞表位。MHC I类限制的T-细胞表位是本领域已知的，或可以由技术人员预测。术语异源表示非天然地存在于野生型志贺毒素A亚基中的MHC I类限制的T-细胞表位，例如，与目标志贺毒素效应物多肽最密切相关的野生型志贺毒素A亚基。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含至少4、5、6、7、8个或更多个内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域的破坏。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，一个或多个破坏包含相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，一个或多个内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域包含多个相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，至少1、2、3或4个破坏包含在内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域中相对于野生型志贺毒素A亚基的多个氨基酸残基置换。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，至少一个破坏包含至少1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换，且任选地其中至少一个置换发生在选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基氨基酸残基：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的4；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的6；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的8；SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的9；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的11；SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：3的12；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的33；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的43；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的44；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的45；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的46；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的47；SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的48；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的49；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的50；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的51；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的53；SEQID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的54；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的55；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的56；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的57；SEQID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的58；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的59；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的60；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的61；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的62；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的84；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的88；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3的96；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的104；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的105；SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的107；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的108；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的109；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的110；SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：3的111；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的112；SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的141；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的147；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的154；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的179；SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的180；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的181；SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的183；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的184；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的185；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的186；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的187；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的188；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的189；SEQID NO：3的197；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的198；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的205；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的247；SEQ ID NO：3的247；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的248；SEQ ID NO：3的250；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的251；SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：3的264；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的265；和SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的286；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同氨基酸残基。在某些其它实施方案中，至少两个破坏各自包含至少一个选自以下的相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的4；SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的8；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的9；SEQID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的11；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的33；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的43；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的45；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的47；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的48；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的49；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的53；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的55；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的58；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的59；SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的60；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的61；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的62；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的96；SEQID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的109；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的110；SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的112；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的147；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的179；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的180；SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的181；SEQ ID NO：1、SEQ ID SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的183；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的184；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的185；SEQID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的186；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的187；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的188；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的189；SEQ ID NO：3的204；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的205；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的247；SEQ ID NO：3的247；SEQ IDNO：3的250；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的264；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的265；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的286；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同氨基酸残基。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含至少三个内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域的破坏，所述表位区域选自：(i)SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的1-15；SEQ ID NO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的27-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQ ID NO：3的42-48；和SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的53-66，或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域，其中不存在破坏，其为与至少一个被破坏的内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域的部分或全部重叠的氨基酸残基的氨基端截短；(ii)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94-115；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的141-153；SEQ ID NO：3的140-156；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的179-190；SEQ ID NO：3的179-191；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205；和SEQ ID NO：3的210-218；和(iii)SEQ ID NO：3的240-260；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的243-257；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的254-268；SEQ ID NO：3的262-278；SEQ ID NO：3的281-297；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的285-293；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域，其中不存在破坏，其为与至少一个被破坏的内源性B-细胞和/或T-细胞表位和/或表位区域的部分或全部重叠的氨基酸残基的羧基端截短。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含至少两个内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域的破坏，其中每个破坏包含一个或多个氨基酸残基置换，且其中所述内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组：SEQ ID NO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的27-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQ ID NO：3的42-48；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的53-66；或志贺毒素A亚基或其衍生物中的等同区域。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述嵌入的或插入的异源T-细胞表位没有破坏本文描述的任何内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，与野生型志贺毒素A亚基相比，至少一个破坏包含一个或多个选自以下的氨基酸残基置换：D至A、D至G、D至V、D至L、D至I、D至F、D至S、D至Q、D至M、D至R、E至A、E至G、E至V、E至L、E至I、E至F、E至S、E至Q、E至N、E至D、E至M、E至R、F至A、F至G、F至V、F至L、F至I、G至A、G至P、H至A、H至G、H至V、H至L、H至I、H至F、H至M、I至A、I至V、I至G、I至C、K至A、K至G、K至V、K至L、K至I、K至M、K至H、L至A、L至V、L至G、L至C、N至A、N至G、N至V、N至L、N至I、N至F、P至A、P至G、P至F、R至A、R至G、R至V、R至L、R至I、R至F、R至M、R至Q、R至S、R至K、R至H、S至A、S至G、S至V、S至L、S至I、S至F、S至M、T至A、T至G、T至V、T至L、T至I、T至F、T至M、T至S、V至A、V至G、Y至A、Y至G、Y至V、Y至L、Y至I、Y至F、Y至M、和Y至T。在某些其它实施方案中，所述一个或多个相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换选自：D至A、D至G、D至V、D至L、D至I、D至F、D至S、D至Q、E至A、E至G、E至V、E至L、E至I、E至F、E至S、E至Q、E至N、E至D、E至M、E至R、G至A、H至A、H至G、H至V、H至L、H至I、H至F、H至M、K至A、K至G、K至V、K至L、K至I、K至M、K至H、L至A、L至G、N至A、N至G、N至V、N至L、N至I、N至F、P至A、P至G、P至F、R至A、R至G、R至V、R至L、R至I、R至F、R至M、R至Q、R至S、R至K、R至H、S至A、S至G、S至V、S至L、S至I、S至F、S至M、T至A、T至G、T至V、T至L、T至I、T至F、T至M、T至S、Y至A、Y至G、Y至V、Y至L、Y至I、Y至F、和Y至M。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述破坏中的至少一个包含一个或多个选自以下的相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换：K1至A、G、V、L、I、F、M和H；T4至A、G、V、L、I、F、M和S；D6至A、G、V、L、I、F、S、Q和R；S8至A、G、V、I、L、F和M；T9至A、G、V、I、L、F、M和S；S9至A、G、V、L、I、F和M；K11至A、G、V、L、I、F、M和H；T12至A、G、V、I、L、F、M、S和K；S12至A、G、V、I、L、F和M；S33至A、G、V、L、I、F、M和C；S43至A、G、V、L、I、F和M；G44至A或L；S45至A、G、V、L、I、F和M；T45至A、G、V、L、I、F和M；G46至A和P；D47至A、G、V、L、I、F、S、M和Q；N48至A、G、V、L、M和F；L49至A、V、C和G；Y49至A、G、V、L、I、F、M和T；F50至A、G、V、L、I和T；A51；D53至A、G、V、L、I、F、S和Q；V54至A、G、I和L；R55至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；G56至A和P；I57至A、G、V和M；L57至A、V、C、G、M和F；D58至A、G、V、L、I、F、S和Q；P59至A、G和F；E60至A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M、T和R；E61至A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M和R；G62至A；R84至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；V88至A和G；I88至A、V、C和G；D94至A、G、V、L、I、F、S和Q；S96至A、G、V、I、L、F和M；T104至A、G、V、L、I、F、M；和N；A105至L；T107至A、G、V、L、I、F、M和P；S107至A、G、V、L、I、F、M和P；L108至A、V、C和G；S109至A、G、V、I、L、F和M；T109至A、G、V、I、L、F、M和S；G110至A；S112至A、G、V、L、I、F和M；D111至A、G、V、L、I、F、S、Q和T；S112至A、G、V、L、I、F和M；D141至A、G、V、L、I、F、S和Q；G147至A；V154至A和G。R179至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；T180至A、G、V、L、I、F、M和S；T181至A、G、V、L、I、F、M和S；D183至A、G、V、L、I、F、S和Q；D184至A、G、V、L、I、F、S和Q；L185至A、G、V和C；S186至A、G、V、I、L、F和M；G187至A；R188至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；S189至A、G、V、I、L、F和M；D197至A、G、V、L、I、F、S和Q；D198至A、G、V、L、I、F、S和Q；R204至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R205至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；S247至A、G、V、I、L、F和M；Y247至A、G、V、L、I、F和M；R248至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R250至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R251至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；D264至A、G、V、L、I、F、S和Q；G264至A；和T286至A、G、V、L、I、F、M和S。
对于实施方案组#2至#11的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子当引入脊索动物时能够表现出与参比分子相比改善的体内耐受性和/或稳定性，所述参比分子是例如由所述细胞靶向分子组成的第二十四种细胞靶向分子，但是所有它的志贺毒素效应物多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段和/或在它的A1片段区域的羧基端处的野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割位点。在某些其它实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽不是细胞毒性的，且所述分子部分是细胞毒性的。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述结合区域和志贺毒素效应物多肽直接地或间接地连接在一起。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述结合区域包含至少一种肽和/或多肽。在某些其它实施方案中，所述结合区域是或包含免疫球蛋白型结合区域。在某些其它实施方案中，所述结合区域包含选自以下的多肽：自主VH结构域、单结构域抗体片段(sdAb)、纳米体(nanobody)、从骆驼科来源的重链-抗体结构域(VHH或VH结构域片段)、从软骨鱼来源的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)、VNAR片段、单链可变片段(scFv)、抗体可变片段(Fv)、互补决定区3片段(CDR3)、受限的FR3-CDR3-FR4多肽(FR3-CDR3-FR4)、Fd片段、小模块免疫药物(SMIP)结构域、抗原结合片段(Fab)、犰狳重复多肽(ArmRP)、纤连蛋白来源的第10个纤连蛋白III型结构域(10Fn3)、生腱蛋白III型结构域(TNfn3)、锚蛋白重复基序结构域、低密度-脂蛋白-受体-来源的A-结构域(LDLR-A)、脂质运载蛋白(anticalin)、Kunitz结构域、蛋白-A-来源的Z结构域、γ-B晶体-来源的结构域、泛蛋白-来源的结构域、Sac7d-来源的多肽(affitin)、Fyn-来源的SH2结构域、小蛋白(miniprotein)、C-型凝集素-样结构域支架、经工程改造的抗体模拟物和前述任一种的保留结合功能性的任何遗传上操作的相应物。
对于实施方案组#2至#11的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够表现出(i)与野生型志贺毒素A1片段或野生型志贺毒素效应物多肽可比较的催化活性水平，(ii)具有10,000皮摩尔或更低的半数最大抑制浓度(IC50)值的核糖体抑制活性，和/或(iii)显著水平的志贺毒素催化活性。
对于实施方案组#2至#11的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子和/或它的志贺毒素效应物多肽能够表现出与参比细胞靶向分子可比较的亚细胞按路线发送效率，所述参比细胞靶向分子包含野生型志贺毒素A1片段或野生型志贺毒素效应物多肽和/或能够表现出显著水平的从细胞的胞内体起始位置至内质网和/或胞质溶胶的细胞内按路线发送活性。
对于实施方案组#2至#11的某些实施方案，其中将本发明的细胞靶向分子施用给与所述细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理上连接的细胞，所述细胞靶向分子能够造成所述细胞的死亡。在某些其它实施方案中，将本发明的细胞靶向分子施用给就细胞外靶生物分子的存在或水平而言不同的两个不同细胞类型群体，所述细胞靶向分子能够造成这样的细胞死亡：与细胞毒性的细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理上连接的细胞类型的CD50是没有与所述细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理上连接的细胞类型的CD50的至少3倍或更小。对于某些实施方案，其中将本发明的细胞靶向分子施用给其成员与所述细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理上连接的第一细胞群体和其成员没有与所述结合区域的任何细胞外靶生物分子物理上连接的第二细胞群体，所述细胞靶向分子对所述第一细胞群体的成员相对于所述第二细胞群体的成员的细胞毒性效应至少3倍更大。对于某些实施方案，其中将本发明的细胞靶向分子施用给其成员与显著量的所述细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理上连接的第一细胞群体和其成员没有与显著量的所述结合区域的任何细胞外靶生物分子物理上连接的第二细胞群体，所述细胞靶向分子对所述第一细胞群体的成员相对于所述第二细胞群体的成员的细胞毒性效应至少3倍更大。对于某些实施方案，其中将本发明的细胞靶向分子施用给第一靶生物分子阳性细胞群体和其成员在细胞表面处不表达显著量的所述细胞靶向分子的结合区域的靶生物分子的第二细胞群体，所述细胞靶向分子对所述第一细胞群体的成员相对于所述第二细胞群体的成员的细胞毒性效应至少3倍更大。
对于实施方案组#2至#11的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出具有300nM或更小的半数最大抑制浓度(CD50)值的细胞毒性和/或能够表现出显著水平的志贺毒素细胞毒性。
对于实施方案组#2至#11的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够将嵌入的或插入的异源CD8+ T-细胞表位递送至细胞的MHC I类呈递途径用于被MHC I类分子结合的表位的细胞表面呈递。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述细胞靶向分子包含与所述志贺毒素效应物多肽的羧基端结合的分子部分。在某些实施方案中，所述分子部分包含所述结合区域或由其组成。在某些实施方案中，所述分子部分包含至少一个氨基酸，且所述志贺毒素效应物多肽连接至所述分子部分的至少一个氨基酸残基。在某些其它实施方案中，所述分子部分和所述志贺毒素效应物多肽融合从而形成连续多肽。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述细胞靶向分子还包含与所述志贺毒素效应物多肽的羧基端结合的细胞毒性分子部分。对于某些实施方案，所述细胞毒性分子部分是细胞毒性剂，例如，技术人员已知的和/或本文描述的小分子化学治疗剂、抗肿瘤剂、细胞毒性的抗生素、烷化剂、抗代谢剂、拓扑异构酶抑制剂和/或微管蛋白抑制剂。对于某些其它实施方案，所述细胞毒性分子部分在小于10,000、5,000、1,000、500或200pM的浓度是细胞毒性的。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述结合区域能够结合选自以下的细胞外靶生物分子：CD20、CD22、CD40、CD74、CD79、CD25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前列腺特异性的膜抗原、Cripto、CDCP1、内皮糖蛋白、成纤维细胞活化的蛋白、Lewis-Y、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、CD133、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体(ROR1或NTRKR1)、碳酸酐酶IX、叶酸结合蛋白、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2、神经节苷脂Lewis-Y2、VEGFR、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、Erb3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANK、FAP、生腱蛋白、CD64、间皮素、BRCA1、MART-1/MelanA、gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β-联蛋白、MUM--1、胱天蛋白酶-8、KIAA0205、HPVE6、SART-1、PRAME、癌胚抗原、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原、人天冬氨酰基(天冬酰胺酰基)β-羟化酶、EphA2、HER3/ErbB-3、MUC1、MART-1/MelanA、gp100、酪氨酸酶相关抗原、HPV-E7、EB病毒抗原、Bcr-Ab1、甲胎蛋白抗原、17-A1、膀胱肿瘤抗原、CD38、CD15、CD23、CD45(蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型)、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305、C3AR、FceRIa、半乳糖凝集素-9、IL-1R(白介素-1受体)、mrp-14、NKG2D配体、程序性死亡-配体1(PD-L1)、Siglec-8、Siglec-10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT-3、半乳糖凝集素-3、CD11a-c、GITRL、MHCI类分子、MHC II类分子(任选地与肽形成复合物)、CD284(TLR4)、CD107-Mac3、CD195(CCR5)、HLA-DR、CD16/32、CD282(TLR2)、CD11c和前述任一种的任何免疫原性片段。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述结合区域直接地或间接地通过至少一个不是二硫键的共价键连接至所述志贺毒素效应物多肽。在某些其它实施方案中，所述结合区域直接地或间接地融合至所述志贺毒素效应物多肽的羧基端以形成单个连续多肽。在某些其它实施方案中，所述结合区域是免疫球蛋白型结合区域。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序在最小弗林蛋白酶切割位点中包含相对于野生型志贺毒素A亚基的一个或多个突变。在某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序不是与最小弗林蛋白酶切割位点的至少一个氨基酸残基的部分或全部重叠的序列的氨基端截短。在某些实施方案中，所述在最小弗林蛋白酶切割位点中的突变是在R/Y-x-x-R弗林蛋白酶切割基序中的至少一个氨基酸残基的氨基酸缺失、插入和/或置换。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含至少一个相对于野生型志贺毒素A亚基的突变，所述突变改变特定区域中的至少一个氨基酸残基，所述特定区域天然地定位1)在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)或志贺毒素(SEQID NO：2)的A亚基的248-251，或2)在志贺样毒素2(SEQ ID NO：3)的A亚基的247-250，或任何志贺毒素A亚基中的等同氨基酸序列位置。在某些其它实施方案中，所述突变是非带正电荷的氨基酸残基对精氨酸残基的氨基酸残基置换。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子当引入细胞时能够表现出与参比分子的细胞毒性可比较的细胞毒性，所述参比分子是例如由所述细胞靶向分子组成的第二十五种细胞靶向分子，但是所有它的志贺毒素效应物多肽组分各自包含野生型志贺毒素A1片段。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述结合区域包含在SEQ ID NO：83-339中的任一个中所示的肽或多肽。在某些其它实施方案中，所述结合区域包含由以下任一个表示的多肽或基本上由其组成：SEQ ID NO：33、64和65中的任一个的氨基酸1-245；SEQID NO：40或SEQ ID NO：80的氨基酸269-513；SEQ ID NO：36、66和67中的任一个的氨基酸269-520或269-521；SEQ ID NO：47-119和176-248中的任一个的氨基酸1-232、1-233、1-234、1-235、1-236、1-242、1-243、1-244、1-245、1-246、1-252、1-253、1-254、1-255或1-256；SEQ ID NO：37-39、68-79和81中的任一个的氨基酸269-498或269-499；SEQ ID NO：34、35、41-56和82中的任一个的氨基酸269-499、269-512、269-513或280-510。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述结合区域在空间上覆盖A1片段区域的羧基端。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述分子部分在空间上覆盖A1片段区域的羧基端。在某些其它实施方案中，所述分子部分包含所述结合区域。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含位于志贺毒素A1片段区域的羧基端的羧基端的结合区域和/或分子部分。在某些其它实施方案中，所述结合区域和/或分子部分的质量是至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述细胞靶向分子包含具有至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的质量的结合区域，只要所述细胞靶向分子保留适当水平的在本文中指出的志贺毒素生物活性(例如，细胞毒性和/或细胞内按路线发送)。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述结合区域被包含在相对大的分子部分内，所述相对大的分子部分包含例如具有至少4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa、50kDa、100kDa或更大的质量的分子部分，只要所述细胞靶向分子保留适当水平的在本文中指出的志贺毒素生物活性。
对于实施方案组#2至#11的某些实施方案，本发明的细胞靶向分子表现出低细胞毒性效能(即当引入某些阳性靶细胞类型时不能在1000nM、500nM、100nM、75nM或50nM的细胞靶向分子浓度表现出大于1％的细胞群体细胞死亡的细胞毒性)，且当引入细胞时能够表现出与参比分子的细胞毒性相比更大的从细胞外空间至内质网和/或胞质溶胶的亚细胞区室的亚细胞按路线发送效率，所述参比分子是例如具有氨基端且包含结合区域和志贺毒素效应物多肽的第二十六种细胞靶向分子，所述志贺毒素效应物多肽没有位于所述第三种细胞靶向分子的氨基端处或近侧。在某些其它实施方案中，所述第二十六种细胞靶向分子不包含KDEL家族的任何羧基端内质网保留/取回信号基序。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，在某些其它实施方案中，所述分子部分包含从天然存在的志贺毒素的志贺毒素A2片段来源的肽和/或多肽。
本发明的实施方案无意覆盖任何天然存在的志贺全毒素或志贺毒素A亚基。在实施方案组#2-11的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含天然存在的志贺毒素B亚基。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含含有天然志贺毒素B亚基的功能结合结构域或基本上由其组成的任何多肽。相反，在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述志贺毒素A亚基来源的区域在功能上与异源结合区域结合以实现细胞靶向。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述结合区域不包含与氨基酸残基19-183对应的人CD4的片段。在某些其它实施方案中，所述结合区域不包含人CD4、I型跨膜糖蛋白的片段。在某些其它实施方案中，所述结合区域不包含人免疫细胞表面共受体的片段。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子不包含含有免疫细胞表面受体的片段的羧基端结合区域。
在实施方案组#1至#11的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含至少两个嵌入的或插入的异源表位。
在实施方案组#1至#11的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽不包含选自以下组的相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换的组：(1)R248H和R251H；(2)R248G和R251G；(3)A246G、S247A、A253G和S254A；和(4)A246G、S247A、R248G、R251G、A253G和S254A。
在实施方案组#1至#11的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽不包含天然地定位在野生型志贺毒素A亚基的247-252中的区域的缺失。在实施方案组#2-11的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽不包含天然地定位在野生型志贺毒素A亚基的245-247和253-255中的区域的缺失。
在实施方案组#1至#11的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含相对于志贺毒素家族的成员的天然存在的A亚基的一个或多个突变，所述突变改变所述志贺毒素效应物多肽的酶活性，所述突变选自至少一个氨基酸残基缺失、插入或置换。在某些其它实施方案中，所述相对于天然存在的A亚基的突变会减小或消除所述志贺毒素效应物多肽的细胞毒性活性，但是所述志贺毒素效应物多肽保留至少一种其它的志贺毒素效应物功能，例如，促进细胞内化和/或指导细胞内按路线发送至某些亚细胞区室。在某些其它实施方案中，所述相对于天然存在的A亚基的突变选自至少一个氨基酸残基置换，例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中的A231E、R75A、Y77S、Y114S、E167D、R170A、R176K和/或W203A。
对于实施方案组#1至#11的某些实施方案，所述志贺毒素效应物多肽能够：(i)按路线发送至选自以下的所述志贺毒素效应物多肽存在于其中的细胞的亚细胞区室：胞质溶胶、内质网和溶酶体；(ii)所述表位从早期胞内体区室至所述志贺毒素效应物多肽存在于其中的细胞的蛋白酶体的细胞内递送；和/或(iii)所述表位从所述志贺毒素效应物多肽存在于其中的细胞的早期胞内体区室至MHC I类分子的细胞内递送。在某些其它实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽能够实现CD 8+ T-细胞表位的细胞内递送用于由MHC I类分子呈递在所述志贺毒素效应物多肽存在于其中的细胞的表面上。
在某些实施方案中，本发明的分子在志贺毒素效应物多肽的羧基端和/或志贺毒素A1片段区域的羧基端位置不包含代表抗原和/或异源CD8+ T-细胞表位肽的任何另外外源物质。
在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述结合区域不包含配体。在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述结合区域不包含趋化因子或TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)，也不包含其受体结合片段。在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述结合区域不包含人趋化因子或人TRAIL，也不包含其受体结合片段。在实施方案组#2至#11的实施方案中，所述免疫球蛋白型结合区域不包含配体，也不包含其受体结合片段。在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述免疫球蛋白型结合区域不包含趋化因子或TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)，也不包含其受体结合片段。在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述结合区域不包含人CC趋化因子，也不包含其受体结合片段。在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述结合区域不包含人CC趋化因子CCL2(参见Bose S，Cho J等人，Arch Pharm Res 36：1039-50(2013))。在实施方案组#2至#11的某些实施方案中，所述结合区域不包含人CC趋化因子CCL2，也不包含其受体结合片段，和羧基端由StxA的氨基酸75-247组成的志贺毒素效应物多肽。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区域不包含人CC趋化因子CCL2，也不包含其受体结合片段，和与羧基端融合的由StxA的氨基酸75-247(SEQ ID NO：2)组成的志贺毒素效应物多肽。在实施方案组#2至#11的实施方案中，所述结合区域不包含人TRAIL，也不包含其受体结合片段。
在本发明的某些实施方案中是一种药物组合物，其包含本发明的以上志贺毒素效应物多肽中的任一种和/或本发明的以上细胞靶向分子中的任一种；和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
在本发明的某些实施方案中是一种诊断组合物，其包含本发明的以上细胞靶向分子中的任一种和检测促进剂。某些其它实施方案是本发明的细胞靶向分子，其中所述检测促进剂是异源表位，且所述细胞靶向分子包含所述异源表位。
除了本发明的志贺毒素效应物多肽以外，本发明的细胞靶向分子及其组合物，能够编码本发明的志贺毒素效应物多肽或细胞靶向分子的多核苷酸，以及包含本发明的多核苷酸的表达载体和包含本发明的任意多核苷酸和/或表达载体的宿主细胞，是在本发明范围内。可以使用包含表达载体的宿主细胞，例如，在通过重组表达生产本发明的分子或其多肽组分或片段的方法中。
在本发明的某些实施方案中是一种杀死细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与本发明的以上细胞靶向分子或本发明的以上药物组合物组的任一种接触的步骤。在某些实施方案中，所述接触细胞的步骤在体外发生。在某些其它实施方案中，所述接触细胞的步骤在体内发生。在细胞杀死方法的其它实施方案中，当接触就细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子的细胞外存在和/或表达水平而言不同的细胞混合物时，所述方法能够相对于其它细胞和/或细胞类型优先地选择性地杀死细胞和/或细胞类型。
本发明还提供了治疗患者中的疾病、病症和/或病患的方法，所述方法包括下述步骤：给有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的细胞靶向分子和/或药物组合物。在某些实施方案中，要使用本发明的方法治疗的疾病、病症或病患选自：癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症或微生物感染。在这些方法的某些实施方案中，要治疗的癌症选自：骨癌、乳腺癌、中枢/周围神经系统癌症、胃肠癌、生殖细胞癌、腺癌、头颈癌、血液学癌症、肾-尿道癌、肝癌、肺/胸膜癌、前列腺癌、肉瘤、皮肤癌和子宫癌。在这些方法的某些实施方案中，要治疗的免疫病症是与选自以下的疾病有关的免疫病症：淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、克罗恩病、糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒症综合征、HIV相关的疾病、红斑狼疮、多发性硬化、结节性多动脉炎、多关节炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、溃疡性结肠炎和血管炎。
本发明的主题的任何组合物用于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常和/或免疫病症的用途是在本发明范围内。在本发明的某些实施方案中是用于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症和/或微生物感染的本发明的细胞靶向分子和/或其药物组合物。在本发明的某些实施方案中是本发明的细胞靶向分子和/或其药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症或微生物感染。
本发明的细胞靶向分子的某些实施方案可以用于将另外的外源物质递送进与本发明的细胞靶向分子的细胞外靶生物分子物理上连接的细胞中。另外，本发明提供了一种用于将外源物质递送至细胞内的方法，所述方法包括：使体外或体内细胞与本发明的细胞靶向分子、药物组合物和/或诊断组合物接触。本发明还提供了一种用于将外源物质递送至患者的细胞内的方法，所述方法包括下述步骤：给所述患者施用本发明的细胞靶向分子(具有或没有细胞毒性活性)，其中所述靶细胞与细胞靶向分子的细胞外靶生物分子物理上连接。
在本发明的某些实施方案中是一种向细胞中递送能够被所述细胞的MHC I类分子呈递的T-细胞表位的方法，所述方法包括下述步骤：使所述细胞与本发明的细胞靶向分子和/或其组合物(例如，本发明的药物或诊断组合物)接触，所述细胞靶向分子与异源T-细胞表位结合。
在本发明的某些实施方案中是一种用于“播种”于脊索动物内的组织部位的方法，所述方法包括下述步骤：给脊索动物施用本发明的细胞靶向分子、本发明的药物组合物和/或本发明的诊断组合物。在某些其它实施方案中，本发明的用于“播种”于组织部位的方法是用于“播种”于包含恶性的、患病的或发炎的组织的组织部位。在某些其它实施方案中，本发明的用于“播种”于组织部位的方法是用于“播种”于包含选自以下的组织的组织部位：患病组织、肿瘤块、癌性生长、肿瘤、感染的组织或异常细胞块。在某些其它实施方案中，本发明的用于“播种”于组织部位的方法包括给脊索动物施用本发明的细胞靶向分子、本发明的药物组合物或包含异源T-细胞表位的本发明的诊断组合物，所述异源T-细胞表位选自：MHCI类复合物中的细胞靶向分子的靶细胞非天然地呈递的肽、非天然地存在于靶细胞表达的任何蛋白内的肽、非天然地存在于靶细胞的蛋白质组内的肽、非天然地存在于要被播种的部位的细胞外微环境中的肽和非天然地存在于要靶向的肿瘤块或感染的组织部位中的肽。
本发明的主题的任何组合物用于诊断、预后和/或表征疾病、病症和/或病患的用途是在本发明范围内。在本发明的某些实施方案中是使用本发明的包含检测促进剂的细胞靶向分子和/或本发明的组合物(例如诊断组合物)收集信息的方法，所述信息在疾病、病症或病患的诊断、预后或表征中是有用的。在本发明的某些实施方案中是使用本发明的细胞靶向分子和/或诊断组合物检测细胞(或其亚细胞区室)的方法，所述方法包括以下步骤：使细胞与细胞靶向分子和/或诊断组合物接触，和检测所述细胞靶向分子和/或诊断组合物的存在。在某些实施方案中，所述接触细胞的步骤在体外发生。在某些实施方案中，所述接触细胞的步骤在体内发生。在某些实施方案中，所述检测细胞的步骤在体外发生。在某些实施方案中，所述检测细胞的步骤在体内发生。在某些其它实施方案中，所述方法包括在将细胞靶向分子施用给生物以后使用一个或多个成像操作检测所述细胞靶向分子在所述生物中的位置。例如，本发明的细胞靶向分子(其包含如本文中所述的检测促进剂)可以用于将疾病表征为通过本发明的有关药物组合物可潜在地治疗的。例如，本发明的某些细胞靶向分子及其组合物(例如本发明的药物组合物和诊断组合物)和本发明的方法可以用于确定患者是否属于对本发明的药物组合物做出应答的组。例如，本发明的某些细胞靶向分子及其组合物可以用于鉴别将递送的异源表位肽呈递在细胞表面上的细胞和/或鉴别含有特定细胞的受试者，所述特定细胞呈递由本发明的细胞靶向分子递送的异源表位肽。
在本发明的某些实施方案中是一种生产本发明的分子的方法，所述方法包括下述步骤：使用细菌细胞壁蛋白结构域相互作用，例如，来自大消化链球菌(P.magnus)的蛋白L或其衍生物和结合结构域片段，纯化本发明的分子或其多肽组分。在某些其它实施方案中，所述方法的纯化步骤包括志贺毒素效应物多肽，其包含在SEQ ID NO：6-32和340-383中所示的多肽中的任一种或基本上由其组成。在某些其它实施方案中，所述方法的纯化步骤包括细胞靶向分子，其包含在SEQ ID NO：43-82和439-513中所示的多肽中的任一种或基本上由其组成。
本发明的志贺毒素效应物多肽的某些实施方案可以用作免疫原或用作用于脊索动物的免疫接种和/或疫苗接种的免疫原的组分。在本发明的某些实施方案中是一种使用本发明的志贺毒素效应物多肽免疫脊索动物的方法，所述方法包括给脊索动物施用本发明的志贺毒素效应物多肽。在某些其它实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含在SEQ IDNO：6-32和340-383中所示的多肽中的任一种或基本上由其组成。
在本发明的某些实施方案中是试剂盒，其包含本发明的主题的组合物和任选的使用说明书、另外的试剂和/或药物递送装置。所述试剂盒还可以包含用于检测在样品中或在受试者中的细胞类型(例如肿瘤细胞)的试剂和其它工具。
参考以下描述、所附权利要求和附图，会更好地理解本发明的这些和其它特征、方面和优点。本发明的前述要素可以单个地组合或自由地除去以便形成本发明的其它实施方案，在下文中没有反对这样的合成或除去的任何陈述。
附图说明
图1描绘了本发明的示例性的志贺毒素A亚基效应物多肽(编号1-5)和包含它们的细胞靶向分子(例如“2/3”表示志贺毒素效应物多肽2或3)。图1中示例性分子的描绘是用于本发明的实施方案的限定组的结构特征的某些一般布置的例证目的。应当理解，这些示例性分子不意图、也不应当解释为关于本发明的分子的任何结构特征和/或组分的排列的整体限定。在图1的示意图中所示的特征的相对大小、位置或数目已经简化。例如，嵌入的异源表位的相对位置和内源性表位区域的破坏没有固定。类似地，嵌入的异源表位的总数和内源性表位区域的破坏没有固定。本发明的分子的某些实施方案包含在单一志贺毒素效应物多肽中的多个被破坏的内源性表位区域，例如，4、5、6、7、8、9个或更多个区域的破坏；其中这些被破坏的内源性表位区域可以遍布于志贺毒素效应物多肽中，包括与志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端区域的弗林蛋白酶切割基序重叠或在其内部的破坏(参见下面表8)。本发明的某些实施方案包含内源性表位区域的破坏，所述内源性表位区域是在志贺毒素A1片段或其衍生物的羧基端的羧基端，诸如，例如在任何被破坏的弗林蛋白酶切割位点基序的羧基端位置处。图1中的示意图无意准确地描绘关于本发明的任何实施方案中的分子结构的相对大小的任何信息。
图2用图形显示了本发明的示例性细胞靶向分子在体外和在浓度范围内的蛋白合成抑制活性。对于每种样品分子，将以相对发光单位(RLU)表示的在测定过程中表达的萤光素酶的发光强度相对于以皮摩尔试验的细胞靶向分子的浓度以10为底的对数绘图。这些示例性细胞靶向分子表现出与“对照”细胞靶向分子可比较的核糖体抑制活性，所述“对照”细胞靶向分子的志贺毒素效应物多肽组分由野生型志贺毒素A亚基片段组成，但是它在它的志贺毒素A1片段区域的羧基端处包含被破坏的弗林蛋白酶切割位点(SLT-1A-FR(SEQ IDNO：5))。图2表明，对天然存在的志贺毒素A亚基多肽的示例性改变，例如，去免疫化置换和嵌入的异源T-细胞表位，没有显著地损害志贺毒素催化活性。
图3-7和9-10用图形表明，本发明的示例性细胞靶向分子SLT-1A-combo(n)：：scFv-(n)表现出与“对照”细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-(n)可比较的靶向细胞的细胞毒性，所述“对照”细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-(n)的志贺毒素效应物多肽组分由野生型志贺毒素A亚基片段组成，但是它在它的志贺毒素A1片段区域的羧基端处包含被破坏的弗林蛋白酶切割位点(SLT-1A-FR(SEQ ID NO：5))。将每种细胞类型的靶阳性细胞的生存力百分比相对于施用给各种细胞的细胞靶向分子浓度的以10为底的对数绘图。
图3用图形表明，示例性细胞靶向分子SLT-1A-combo7：：scFv-1(SEQ ID NO：44)表现出与“对照”细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-1(SEQ ID NO：34)可比较的对两种不同细胞类型的细胞毒性。
图4用图形表明，示例性细胞靶向分子SLT-1A-combo7：：scFv-1(SEQ ID NO：44)表现出与“对照”细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-1(SEQ ID NO：34)可比较的对靶阳性细胞类型的细胞毒性。使用相同测定用scFv-1的靶生物分子的细胞表面表达阴性的细胞系表明细胞靶向的特异性。在关于细胞系H的图4中，将靶阴性细胞的生存力百分比相对于施用给细胞的细胞靶向分子浓度的以10为底的对数绘图。图4表明，细胞靶向分子SLT-1A-combo7：：scFv-1(SEQ ID NO：44)在试验的浓度没有表现出对靶阴性细胞类型的细胞毒性。
图5用图形表明，示例性细胞靶向分子SLT-1A-combo10：：scFv-1(SEQ ID NO：47)、SLT-1A-combo16：：scFv-1(SEQ ID NO：52)和SLT-1A-combo19：：scFv-1(SEQ ID NO：55)表现出与“对照”细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-1(SEQ ID NO：34)可比较的对两种不同细胞类型的细胞毒性。
图6用图形表明，示例性细胞靶向分子SLT-1A-combo17：：scFv-1(SEQ ID NO：53)表现出与“对照”细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-1(SEQ ID NO：34)可比较的对细胞系A的细胞毒性；而SLT-1A-combo17：：scFv-1(SEQ ID NO：53)表现出与对照相比减弱的对细胞系B的细胞毒性。图6表明，细胞靶向分子SLT-1A-combo18：：scFv-1(SEQ ID NO：54)在直到100nM的浓度没有表现出对试验的两种细胞类型的细胞毒性。还显示了替代细胞靶向分子的未靶向的野生型志贺毒素A1片段的来自该测定的细胞毒性结果。
图7用图形表明，示例性细胞靶向分子SLT-1A-combo2：：scFv-2(SEQ ID NO：58)表现出与“对照”细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-2(SEQ ID NO：35)可比较的对细胞系B和G的细胞毒性；而SLT-1A-combo2：：scFv-2(SEQ ID NO：58)表现出与对照相比稍微减弱的对细胞系A的细胞毒性。图7表明，细胞靶向分子SLT-1A-combo13：：scFv-2(SEQ ID NO：62)表现出与对照相比强烈地减弱的对试验的三种细胞类型的细胞毒性。
图8用图形表明，本发明的示例性细胞靶向分子scFv-3：：SLT-1A-combo5(SEQ IDNO：64)和scFv-3：：SLT-1A-combo6(SEQ ID NO：65)表现出与“对照”细胞靶向分子scFv-3：：SLT-1A-WT(SEQ ID NO：33)可比较的对两种不同靶阳性细胞类型的靶向细胞的细胞毒性，所述“对照”细胞靶向分子scFv-3：：SLT-1A-WT的志贺毒素A亚基组分是野生型志贺毒素A亚基片段。将两种不同细胞类型的靶阳性细胞的生存力百分比相对于施用给细胞的细胞靶向分子浓度的以10为底的对数绘图。对于细胞系B，scFv-3：：SLT-1A-combo5(SEQ ID NO：64)和scFv-3：：SLT-1A-combo6(SEQ ID NO：65)都表现出比对照的等同水平更小的细胞毒性效能，如通过CD50值测量的。使用相同测定用靶生物分子of scFv-3的细胞表面表达阴性的细胞系证实细胞靶向的特异性。在关于细胞系A的图8中，将靶阴性细胞的生存力百分比相对于施用给细胞的细胞靶向分子浓度的以10为底的对数绘图。图8表明，细胞靶向分子scFv-3：：SLT-1A-combo5(SEQ ID NO：64)和scFv-3：：SLT-1A-combo6(SEQ ID NO：65)表现出与对照可比较的对靶阴性细胞类型的未靶向细胞毒性。
图9用图形表明，示例性细胞靶向分子SLT-1A-combo7：：scFv-4(SEQ ID NO：66)和SLT-1A-combo14：：scFv-4(SEQ ID NO：67)表现出与“对照”细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-4(SEQ ID NO：36)可比较的对靶阳性细胞类型的靶向细胞的细胞毒性。使用相同测定用scFv-4的靶生物分子的细胞表面表达阴性的细胞系证实细胞靶向的特异性。在关于细胞系E的图9中，将靶阴性细胞的生存力百分比相对于施用给细胞的细胞靶向分子浓度的以10为底的对数绘图。图9表明，细胞靶向分子SLT-1A-combo7：：scFv-4(SEQ ID NO：66)和SLT-1A-combo 14：：scFv-4(SEQ ID NO：67)表现出与对照可比较的对靶阴性细胞类型的未靶向细胞毒性。
图10用图形表明，示例性细胞靶向分子SLT-1A-combo8：：scFv-5(SEQ ID NO：69)表现出与“对照”细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-5(SEQ ID NO：37)可比较的对靶阳性细胞类型的靶向细胞的细胞毒性。细胞靶向分子SLT-1A-combo9：：scFv-5(SEQ ID NO：70)表现出与对照相比减弱的对该细胞系的细胞毒性，且SLT-1A-combo11：：scFv-5(SEQ ID NO：71)表现出与对照相比非常低的细胞毒性效能。
图11-12用图形表明本发明的示例性细胞靶向分子SLT-1A-combo(n)：：scFv-1与“对照”细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-(n)相比诱导的胱天蛋白酶活性，所述“对照”细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-(n)的志贺毒素效应物多肽组分由野生型志贺毒素A亚基片段组成，但是它在它的志贺毒素A1片段区域的羧基端处包含被破坏的弗林蛋白酶切割位点(SLT-1A-FR(SEQ ID NO：5))。将胱天蛋白酶活性百分比相对于施用给细胞的细胞靶向分子浓度的以10为底的对数绘图。图11-12表明，示例性细胞靶向分子SLT-1A-combo7：：scFv-1(SEQ ID NO：44)、SLT-1A-combo14：：scFv-1(SEQ ID NO：50)和SLT-1A-combo7：：scFv-7(SEQ ID NO：81)诱导与对照细胞靶向分子可比较的对至少一种试验的细胞系的胱天蛋白酶活性。
图13显示了使用三种不同的识别志贺毒素A1片段的抗体在变性条件下通过蛋白质印迹分析揭示了本发明的示例性细胞靶向分子和对照细胞靶向分子的相对抗原性。图13显示了多个重复凝胶和膜的照片。用“MW标记”标记的第一泳道显示了蛋白分子量梯子的迁移图案，且每个梯子蛋白带的近似大小以千道尔顿(kDa)标记。在图例中指示了加载并在编号为1-4的泳道中泳动的样品：#1)SLT-1A：：combo7：：scFv-1(SEQ ID NO：44)；#2)SLT-1A-FR：：scFv-1(SEQ ID NO：34)；#3SLT-1A：：combo14：：scFv-1(SEQ ID NO：50)；和SLT-1A：：combo10：：scFv-1(SEQ ID NO：47)。顶图显示了考马斯染色的重复凝胶的照片；第二图(从顶)显示了用α-SLT-1A pAb1探测的重复膜的照片，第三图(从顶)显示了用α-SLT-1A pAb2探测的重复膜的照片，且最后图(从顶)显示了用α-StxA mAb1探测的重复膜的照片。图13表明，示例性细胞靶向分子SLT-1A-combo7：：scFv-1(SEQ ID NO：44)、SLT-1A-combo10：：scFv-1(SEQ ID NO：47)和SLT-1A-combo14：：scFv-1(SEQ ID NO：50)在该测定中各自具有与参比分子SLT-1A-FR：：scFv-1(SEQ ID NO：34)相比降低的抗原性。
图14用图形显示了使用两种不同的识别志贺毒素A1片段的抗体通过ELISA分析揭示的本发明的示例性细胞靶向分子和对照细胞靶向分子的相对抗原性。将归一化的ELISA吸光度信号图示为对照分子SLT-1A-FR：：scFv-1(SEQ ID NO：34)的百分比。图14表明，示例性细胞靶向分子SLT-1A-combo7：：scFv-1(SEQ ID NO：44)、SLT-1A-combo10：：scFv-1(SEQID NO：47)和SLT-1A-combo14：：scFv-1(SEQ ID NO：50)在该测定中各自具有与对照相比降低的抗原性。
图15-16用图形显示了从收集自哺乳动物模型的血清测量的本发明的示例性细胞靶向分子的相对免疫原性，并使用在溶液中(in-solution)ELISA测定来检测每只动物的血清中识别施用的志贺毒素A亚基来源的分子的抗体的量。用于相对对比的参比细胞靶向分子是SLT-1A-FR：：scFv-(n)，其志贺毒素效应物多肽组分由弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-FR(SEQ ID NO：5)组成。对于施用本发明的细胞靶向分子的每个动物治疗组，如下计算SLT-1A-FR：：scFv-(n)参比分子治疗组的百分比值：将在给定时间点细胞靶向分子治疗组中的所有受试者的平均ELISA信号除以SLT-1A-FR：：scFv-(n)参比治疗组中的受试者的平均ELISA信号。将每个实验治疗组的参考的百分比绘制在Y-轴上，并将血清收集天绘制在X-轴上。图15-16中的符号代表指示的组中的各个受试者的平均信号，并且误差棒指示在指定的时间点组中的受试者的平均值标准误差。图15-16表明，示例性细胞靶向分子SLT-1A-combo1：：scFv-1(SEQ ID NO：43)、SLT-1A-combo7：：scFv-1(SEQ ID NO：44)、SLT-1A-combo10：：scFv-1(SEQ ID NO：47)、SLT-1A-combo12：：scFv-1(SEQ ID NO：49)、SLT-1A-combo15：：scFv-1(SEQ ID NO：51)、SLT-1A-combo16：：scFv-1(SEQ ID NO：52)、SLT-1A-combo19：：scFv-1(SEQ ID NO：55)、SLT-1A-combo10：：scFv-2(SEQ ID NO：61)和SLT-1A-combo22：：scFv-2(SEQ ID NO：63)在该测定中表现出与适当的参比分子SLT-1A-FR：：scFv-(n)(SEQ ID NO：34或35)相比降低的免疫原性。
图17显示了细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-9的弗林蛋白酶切割抗性，与包含具有野生型弗林蛋白酶切割位点的野生型志贺毒素A1片段的几乎相同的细胞毒性细胞靶向分子(SLT-1A-WT：：scFv-9)相比，所述SLT-1A-FR：：scFv-9包含含有被破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应物多肽。图17显示了用经纯化的重组人弗林蛋白酶或各种阴性对照条件处理过的蛋白样品电泳以后的考马斯染色的聚丙烯酰胺凝胶。将凝胶的泳道编号，且图例指示将样品加载至凝胶之前每个细胞靶向分子样品的预处理条件：以摄氏度(℃)为单位的温度，以小时为单位的预处理持续时间，和通过指示加入的弗林蛋白酶活性单位(U)的量/微克(μg)细胞靶向分子(标记“U/μg弗林蛋白酶”)或“无弗林蛋白酶”(对于加入0U/μg弗林蛋白酶)说明是否加入任何弗林蛋白酶。用“MW标记”标记的第一泳道显示了蛋白分子量梯子的迁移图案，且每个梯子蛋白带的近似大小以千道尔顿(kDa)标记。图例指示哪种志贺毒素效应物区域存在于每个泳道的每个细胞靶向分子样品中：1)野生型弗林蛋白酶位点(WT)或2)被破坏的弗林蛋白酶基序(FR)。将经处理的样品用0.5弗林蛋白酶活性单位/微克细胞靶向分子(U/μg弗林蛋白酶)在30℃处理30小时。图17显示SLT-1A-FR：：scFv-9在30℃会耐受0.5弗林蛋白酶活性单位/微克SLT-1A-FR：：scFv-9。
图18用图形显示了与靶阴性细胞相比本发明的示例性细胞靶向分子(SEQ ID NO：82)对靶阳性细胞的特异性结合。将与细胞结合的细胞靶向分子的量计算为积分的平均荧光强度(iMFI)，并相对于细胞靶向分子的浓度图示。使用数据的曲线拟合来产生两种试验的靶阳性细胞类型的线。
图19用图形显示了接受本发明的示例性细胞靶向分子或仅赋形剂对照样品以后鼠异种移植物模型中的受试者组随时间的人肿瘤负荷的变化。将肿瘤负荷(测量为以光子/秒为单位的全身生物发光)相对于时间(肿瘤植入后的天数)绘图。细胞靶向分子SLT1-A-combo7：：αCD38-scFv-1(SEQ ID NO：82)的施用阻止了关于仅赋形剂对照组观察到的肿瘤负荷的增加。
具体实施方式
在下文中使用示例性的、非限制性的实施方案和参照附图更充分地描述本发明。但是，本发明可以以许多不同的形式实施，并且不应被理解为限于下面阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案使得本公开内容更透彻并且将本发明的范围传递给本领域技术人员。
为了可以更容易地理解本发明，在下面定义某些术语。在发明详述内可以发现另外的定义。
如在说明书和所附权利要求书中使用的，除非上下文另外清楚地指明，术语“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指示物。
如在说明书和所附权利要求书中使用的，当提及两种物质A和B时，术语“和/或”是指A和B中的至少一种。如在说明书和所附权利要求书中使用的，当提及超过两种物质诸如A、B和C时，术语“和/或”是指A、B、或C中的至少一种，或A、B、或C的任何组合中的至少一种(每种物质以单个或多个可能性存在)。
贯穿本说明书，词语“包含”或变体诸如“包括”或“含有”应理解为暗示包括所述的整数(或组分)或整数(或组分)的组，但是不排除任何其它整数(或组分)或整数(或组分)的组。
贯穿本说明书，术语“包括”用于指“包括、但不限于”。“包括”和“包括、但不限于”互换使用。
术语“氨基酸残基”或“氨基酸”包括对掺入蛋白、多肽或肽中的氨基酸的提及。术语“多肽”包括氨基酸或氨基酸残基的任何聚合物。术语“多肽序列”表示在物理上构成多肽的一系列氨基酸或氨基酸残基。“蛋白”是包含一个或多个多肽或多肽“链”的大分子。“肽”是尺寸小于约总计15-20个氨基酸残基的小多肽。术语“氨基酸序列”表示在物理上构成肽或多肽的一系列氨基酸或氨基酸残基，取决于长度。除非另有说明，本文中公开的多肽和蛋白序列从左至右书写，代表它们从氨基端至羧基端的次序。
术语“氨基酸”、“氨基酸残基”、“氨基酸序列”或多肽序列包括天然存在的氨基酸(包括L和D立体异构体)，且除非另有限制，也包括可以以与天然存在的氨基酸类似方式起作用的天然氨基酸的已知类似物，诸如硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、羟脯氨酸8-羟-2，7，10-三氨基癸酸(hypusine)、焦谷氨酸和硒代甲硫氨酸。用如下表A中的简写名称描述在本文中提及的氨基酸：
表A.氨基酸命名法
关于肽、肽区域、多肽区域、蛋白或分子的氨基酸残基，短语“保守置换”表示肽、肽区域、多肽区域、蛋白或分子的氨基酸组成的变化，所述变化没有实质上改变总肽、肽区域、多肽区域、蛋白或分子的功能和结构(参见Creighton，Proteins：Structures andMolecular Properties(W.H.Freeman and Company，New York(1992年第2版)))。
就本发明的目的而言，短语“来源于”当提及多肽或多肽区域时是指，所述多肽或多肽区域包含这样的氨基酸序列：其最初存在于“亲本”蛋白中，且其现在可能包含相对于原始多肽或多肽区域的某些氨基酸残基添加、缺失、截短、重排或其它改变，只要“亲本”分子的某些功能和结构是基本上保守的。技术人员将能够使用本领域已知的技术(例如，蛋白序列比对软件)鉴别来源于亲本分子的多肽或多肽区域。
为了要求保护的发明的目的和关于志贺毒素多肽序列或志贺毒素来源的多肽，术语“野生型”通常表示在活物种(例如，病原性细菌)中发现的天然存在的志贺毒素蛋白序列，其中该志贺毒素蛋白序列是最常存在的变体之一。这不同于极少存在的志贺毒素蛋白序列，其尽管是天然存在的，但是当取样包含至少一种志贺毒素蛋白变体的该物种的统计上庞大数目的天然存在的单个生物时存在于给定物种的小于1％的单个生物中。天然分离物在它的天然环境外的克隆繁殖(不论所述分离物是否是包含生物序列信息的生物或分子)不会改变天然存在的要求，只要所述克隆繁殖没有引入不存在于该物种的天然存在的群体中的新序列变种和/或没有改变序列变体彼此的相对比率。
关于要求保护的发明的术语“有关”、“结合”、“连接”或“关联”表示分子的两个或更多个组分结合、附接、连接或以其它方式偶联以形成单个分子的状态，或通过在两个分子之间建立结合、关联、附接和/或任意其它连接而使两个分子彼此结合以形成单个分子的动作。例如，术语“连接”可以表示通过一种或多种原子相互作用使两个或更多个组分结合从而形成单个分子，且其中所述原子相互作用可以是共价的和/或非共价的。两个组分之间的共价结合的非限制性例子包括肽键和半胱氨酸-半胱氨酸二硫键。两个分子组分之间的非共价结合的非限制性例子包括离子键。
就本发明的目的而言，术语“连接”表示通过一种或多种原子相互作用使两个或更多个分子组分结合从而形成单个分子，且其中所述原子相互作用包括至少一个共价键。就本发明的目的而言，术语“连接”表示建立如上所述的连接的分子的动作。
就本发明的目的而言，术语“融合”表示通过至少一个共价键(其为肽键)结合的两个或更多个蛋白性组分，不论所述肽键是否涉及羧酸基团的碳原子的参与或涉及另一种碳原子(例如，α-碳、β-碳、γ-碳、σ-碳等)。融合在一起的两种蛋白性组分的非限制性例子包括，例如，通过肽键与多肽融合的氨基酸、肽或多肽，使得得到的分子是单个连续多肽。就本发明的目的而言，术语“融合”表示建立如上所述的融合的分子(例如，从当被翻译时产生单一蛋白性分子的基因区域的重组融合产生的融合蛋白)的动作。
符号“：：”是指在它前面和后面的多肽区域物理地连接在一起以形成连续多肽。
本文中使用的术语“表达”及其语法变体表示多核苷酸或核酸翻译成蛋白。表达的蛋白可以保留在细胞内、变成细胞表面膜的组分或分泌进细胞外空间中。
如本文中使用的，在至少一个细胞表面上表达显著量的细胞外靶生物分子的细胞是“靶阳性细胞”或“靶+细胞”，且是与指定的细胞外靶生物分子物理上连接的细胞。
本文中使用的符号“α”是能够与该符号后的生物分子结合的免疫球蛋白型结合区域的简写。符号“α”用于表示免疫球蛋白型结合区域的功能特性，这基于它以10-5或更小的解离常数(KD)描述的结合亲和力与该符号后的生物分子结合的能力。
本文中使用的术语“重链可变(VH)结构域”或“轻链可变(VL)结构域”分别表示任何抗体VH或VL结构域(例如人VH或VL结构域)及其至少保留对应天然抗体的定性抗原结合能力的任何衍生物(例如从天然鼠VH或VL结构域来源的人源化的VH或VL结构域)。VH或VL结构域由被三个CDR或ABR中断的“框架”区域组成。所述框架区域用于对齐CDR或ABR以特异性地结合抗原的表位。从氨基端至羧基端，VH和VL结构域包含下述框架(FR)和CDR区域或ABR区域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4；或类似地，FR1、ABR1、FR2、ABR2、FR3、ABR3和FR4。本文中使用的术语“HCDR1”、“HCDR2”或“HCDR3”分别用于表示VH结构域中的CDR 1、2或3，且术语“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”分别用于表示VL结构域中的CDR 1、2或3。本文中使用的术语“HABR1”、“HABR2”或“HABR3”分别用于表示VH结构域中的ABR 1、2或3，且术语“LABR1”、“LABR2”或“LABR3”分别用于表示VL结构域中的CDR 1、2或3。对于骆驼科VHH片段、软骨鱼的IgNAR、VNAR片段、某些单结构域抗体、及其衍生物，存在包含相同基本排列的单个重链可变结构域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。本文中使用的术语“HCDR1”、“HCDR2”或“HCDR3”可以分别用于表示单个重链可变结构域中的CDR 1、2或3。
就本发明的目的而言，术语“效应物”是指提供生物活性，诸如细胞毒性、生物信号传递、酶促催化、亚细胞按路线发送、和/或导致一种或多种因子的变构效应和/或募集的分子间结合。
就本发明的目的而言，短语“志贺毒素效应物多肽”、“志贺毒素效应物多肽区域”和“志贺毒素效应物区域”表示从志贺毒素家族的成员的至少一个志贺毒素A亚基来源的多肽或多肽区域，其中所述多肽或多肽区域能够表现出至少一种志贺毒素功能。例如，SEQ IDNO：8、11-27、29-32、348、356-358、363、370-371、373、378-438源自StxA和SLT-1A。
就本发明的目的而言，志贺毒素效应物功能是由从志贺毒素A亚基来源的多肽区域赋予的生物活性。志贺毒素效应物功能的非限制性例子包括：促进细胞进入；脂质膜变形；促进细胞内化；刺激网格蛋白介导的胞吞作用；指导细胞内按路线发送至各种细胞内区室，例如，高尔基体、内质网和胞质溶胶；指导细胞内按路线发送载荷；抑制核糖体功能；催化活性，例如，N-糖苷酶活性和催化地抑制核糖体；减少蛋白合成，诱导胱天蛋白酶活性，活化效应物胱天蛋白酶，实现细胞生长抑制效应，和细胞毒性。志贺毒素催化活性包括，例如，核糖体灭活、蛋白合成抑制、N-糖苷酶活性、多核苷酸：腺苷糖苷酶活性、RNA酶活性和DNA酶活性。志贺毒素是核糖体灭活蛋白(RIP)。RIP可以将核酸、多核苷、多核苷酸、rRNA、ssDNA、dsDNA、mRNA(和聚腺苷酸)和病毒核酸脱嘌呤化(参见例如，Barbieri L等人，Biochem J286：1-4(1992)；Barbieri L等人，Nature 372：624(1994)；Ling J等人，FEBS Lett 345：143-6(1994)；Barbieri L等人，Biochem J 319：507-13(1996)；Roncuzzi L，Gasperi-Campani A，FEBS Lett 392：16-20(1996)；Stirpe F等人，FEBS Lett 382：309-12(1996)；Barbieri L等人，Nucleic Acids Res 25：518-22(1997)；Wang P，Tumer N，Nucleic AcidsRes 27：1900-5(1999)；Barbieri L等人，Biochim Biophys Acta 1480：258-66(2000)；Barbieri L等人，J Biochem 128：883-9(2000)；Brigotti M等人，Toxicon 39：341-8(2001)；Brigotti M等人，FASEB J 16：365-72(2002)；Bagga S等人，J Biol Chem 278：4813-20(2003)；Picard D等人，J Biol Chem 280：20069-75(2005))。有些RIP表现出抗病毒活性和超氧化物歧化酶活性(Erice A等人，Antimicrob Agents Chemother 37：835-8(1993)；Au T等人，FEBS Lett 471：169-72(2000)；Parikh B，Tumer N，Mini Rev Med Chem4：523-43(2004)；Sharma N等人，Plant Physiol 134：171-81(2004))。已经在体外和在体内观察到志贺毒素催化活性。关于志贺毒素效应物活性的测定的非限制性例子测量多种活性，例如，蛋白合成抑制活性、脱嘌呤化活性、细胞生长的抑制、细胞毒性、超螺旋化的DNA松弛活性和核酸酶活性。
本文中使用的志贺毒素效应物功能的保留表示在相同条件下能够表现出与野生型志贺毒素效应物多肽对照(例如志贺毒素A1片段)或包含野生型志贺毒素效应物多肽(例如志贺毒素A1片段)的细胞靶向分子可比较的志贺毒素功能活性的水平，如通过具有再现性的适当定量测定所测量的。关于核糖体灭活或核糖体抑制的志贺毒素效应物功能，保留的志贺毒素效应物功能是在体外场合中表现出10,000pM或更小的IC50，例如，通过使用技术人员已知的和/或本文描述的测定。关于在靶阳性细胞杀死测定中的细胞毒性的志贺毒素效应物功能，保留的志贺毒素效应物功能是表现出1,000nM或更小的CD50，取决于细胞类型和它对适当的细胞外靶生物分子的表达，如例如通过使用技术人员已知的和/或本文描述的测定证实的。
为了要求保护的发明的目的，关于核糖体抑制的术语“等同”是指，在相同条件下可再现地在参比分子(例如，第二种细胞靶向分子或第三种细胞靶向分子)的活性的10％或更小以内的经验地测量的核糖体抑制活性的水平，如通过具有再现性的适当定量测定所测量的。
为了要求保护的发明的目的，关于细胞毒性的术语“等同”是指，在相同条件下可再现地在参比分子(例如，第二种细胞靶向分子或第三种细胞靶向分子)的活性的10％或更小以内的经验地测量的细胞毒性的水平，如通过具有再现性的适当定量测定所测量的。
如本文中使用的，关于细胞毒性的术语“减弱”是指，分子表现出或表现过参比分子在相同条件下表现出的CD50的10倍至100倍之间的CD50。
当确定志贺毒素效应物功能活性的水平时，不应当考虑不准确的IC50和CD50值。对于有些样品，由于不能收集准确的曲线拟合所需的数据点，IC50或CD50的准确值可能是难以获得的。例如，在理论上，如果大于50％的核糖体抑制或细胞死亡分别没有发生在给定样品的浓度系列中，IC50和CD50都不可以确定。不足以准确地拟合曲线的数据(如在来自示例性志贺毒素效应物功能测定(例如，在以下实施例中描述的测定)的数据的分析中描述的)不应当视作实际志贺毒素效应物功能的代表。
检测志贺毒素效应物功能的活性的失败可能是由于不适当的表达、多肽折叠和/或蛋白稳定性，而不是缺乏细胞进入、亚细胞按路线发送和/或酶活性。关于志贺毒素效应物功能的测定可能不需要许多本发明的多肽来测量显著量的志贺毒素效应物功能活性。就经验地确定低或无效应物功能的根本原因与蛋白表达或稳定性有关而言，本领域技术人员可以能够使用本领域已知的蛋白化学和分子工程技术补偿这样的因子，使得可以恢复和测量志贺毒素功能效应物活性。作为例子，通过使用不同的表达控制序列可以补偿不适当的基于细胞的表达；和不适当的多肽折叠和/或稳定性可以受益于稳定化末端序列或在非效应物区域中稳定化分子的三维结构的补偿突变。
某些志贺毒素效应物功能不是容易测量的，例如亚细胞按路线发送功能。例如，没有常规定量测定来区分志贺毒素效应物多肽具有细胞毒性和/或递送异源表位的失败是否是由于不适当的亚细胞按路线发送，但是在试验可得到的时间，则可以相对于适当的野生型志贺毒素效应物多肽针对任何显著水平的亚细胞按路线发送来分析志贺毒素效应物多肽。但是，如果本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应物多肽组分表现出与野生型志贺毒素A亚基构建体可比较或等同的细胞毒性，那么推断亚细胞按路线发送活性水平至少在试验的条件下分别与野生型志贺毒素A亚基构建体的亚细胞按路线发送活性水平可比较或等同。
当各种志贺毒素功能的新测定变得可用时，可以针对那些志贺毒素效应物功能的任何水平分析志贺毒素效应物多肽和/或包含志贺毒素效应物多肽的细胞靶向分子，诸如是在野生型志贺毒素效应物多肽的活性的1000倍或100倍或更少内，或表现出与功能性的敲除的志贺毒素效应物多肽相比3倍至30倍或更大的活性。
可以仅仅通过在细胞毒性测定中观察分子的细胞毒性活性水平来推断足够的亚细胞按路线发送，所述细胞毒性测定是例如基于T-细胞表位呈递或基于毒素效应物功能(其涉及胞质溶胶的和/或定位于内质网的靶底物)的细胞毒性测定。
本文中使用的“显著的”志贺毒素效应物功能的保留表示，如通过具有再现性的适当定量测定所测量的，与野生型志贺毒素效应物多肽对照(例如志贺毒素A1片段)可比较的志贺毒素功能活性水平。关于体外核糖体抑制，显著的志贺毒素效应物功能表现出300pM或更小的IC50，取决于在测定中使用的核糖体的来源(例如细菌、古细菌或真核生物(藻、真菌、植物或动物)来源)。这是与催化地破坏的SLT-1A 1-251双重突变体(Y77S/E167D)的100,000pM的近似IC50相比显著更大的抑制。关于在实验室细胞培养中在靶阳性细胞杀死测定中的细胞毒性，显著的志贺毒素效应物功能表现出100、50、30nM或更小的CD50，取决于结合区域的靶生物分子和细胞类型，特别是该细胞类型对正在评价的分子所靶向的适当细胞外靶生物分子和/或细胞外表位的表达和/或细胞表面呈递。与具有100-10,000nM的CD50(取决于细胞系)的没有靶向细胞的结合区域的单独志贺毒素A亚基(或野生型志贺毒素A1片段)相比，这是对适当的靶阳性细胞群体的显著地更大的细胞毒性。
就本发明的目的而言和关于本发明的分子的志贺毒素效应物功能，术语“合理的活性”表示，相对于包含天然存在的志贺毒素的分子，至少表现出中等水平(例如在11倍至1,000倍内)的如本文中定义的志贺毒素效应物活性，其中所述志贺毒素效应物活性选自：内化效率、向胞质溶胶的亚细胞按路线发送效率、靶细胞对递送的表位的呈递、核糖体抑制和细胞毒性。关于细胞毒性，志贺毒素效应物活性的合理水平包括在野生型志贺毒素构建体的1,000倍内，例如，当野生型志贺毒素构建体表现出0.5nM的CD50(例如包含野生型志贺毒素A1片段的细胞靶向分子)时，表现出500nM或更小的CD50。
就本发明的目的而言和关于本发明的分子的细胞毒性，术语“最佳”表示这样的志贺毒素催化结构域介导的细胞毒性水平：其在包含野生型志贺毒素A1片段(例如志贺毒素A亚基或其某些截短变体)和/或天然存在的志贺毒素的分子的细胞毒性的2、3、4、5、6、7、8、9或10倍内。
应当指出，即使志贺毒素效应物多肽的细胞毒性与野生型志贺毒素A亚基或其片段相比降低，在实践中，使用减弱的志贺毒素效应物多肽的应用可能与使用野生型志贺毒素效应物多肽同样有效或比后者更有效，因为最高效能变体可能表现出在降低的细胞毒性效能变体中最小化或减小的不希望的效应。野生型志贺毒素是非常高效的，在仅一个毒素分子已经到达中毒细胞的胞质溶胶以后，或可能在仅四十个毒素分子已经被内化进中毒细胞以后，能够杀死中毒细胞。与野生型志贺毒素效应物多肽相比具有甚至大幅下降的志贺毒素效应物功能(例如，亚细胞按路线发送或细胞毒性)的志贺毒素效应物多肽仍然可以是对于实际应用而言足够高效的，例如，涉及靶向细胞杀死、异源表位递送和/或特定细胞和它们的亚细胞区室的检测的应用。另外，某些降低活性志贺毒素效应物多肽对于将载荷(例如另外的外源物质或T-细胞表位)递送至靶细胞的某些细胞内位置或亚细胞区室而言可以是特别有用的。
关于分子的细胞毒性活性的术语“选择性细胞毒性”表示，在生物分子靶标阳性的细胞群体(例如靶向的细胞类型)和非靶向的旁观细胞群体(例如生物分子靶标阴性的细胞类型)之间的细胞毒性相对水平，其可以表达为靶向的细胞类型的半数最大细胞毒性浓度(CD50)与未靶向的细胞类型的CD50之比，以提供细胞毒性的选择性的度量或靶向的细胞相对于未靶向的细胞的杀死优先性的指示。
给定的细胞外靶生物分子(或给定的靶生物分子的细胞外表位)的细胞表面呈递和/或密度可以影响本发明的某些细胞靶向分子可能最适当地使用的应用。细胞之间的给定靶生物分子的细胞表面呈递和/或密度的差异可能定量地和定性地改变本发明的给定细胞靶向分子的细胞内化效率和/或细胞毒性效能。给定的靶生物分子的细胞表面呈递和/或密度可以在靶生物分子阳性细胞之间或甚至在相同细胞上在细胞周期或细胞分化中的不同点处极大地变化。使用技术人员已知的方法，诸如涉及荧光激活细胞分选(FACS)流式细胞计量术的方法，可以确定给定靶生物分子和/或给定靶生物分子的某些细胞外表位在特定细胞或细胞群体上的总细胞表面呈递。
本文中使用的关于多肽区域或多肽内的部件的术语“被破坏的”、“破坏”及其语法变体表示，在所述区域内或组成被破坏的部件的至少一个氨基酸的改变。氨基酸改变包括多种突变，例如，改变多肽的氨基酸序列的缺失、倒位、插入或置换。氨基酸改变也包括化学变化，例如，改变氨基酸官能团中的一个或多个原子或向氨基酸官能团添加一个或多个原子。
本文中使用的“去免疫化”是指，施用给脊索动物以后与参比分子(例如，野生型肽区域、多肽区域或多肽)相比降低的抗原性和/或免疫原性潜力。这包括总抗原性和/或免疫原性潜力的下降，尽管与参比分子相比引入了一个或多个新生抗原性和/或免疫原性表位。对于某些实施方案，“去免疫化”是指，分子在施用给哺乳动物以后表现出与它的来源“亲本”分子相比降低的抗原性和/或免疫原性，例如，野生型志贺毒素A1片段。在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽能够表现出这样的相对于参比分子的相对抗原性：在相同条件下通过相同测定(例如，技术人员已知的和/或本文描述的测定，如定量ELISA或蛋白质印迹分析)测得，与参比分子的抗原性相比下降了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽能够表现出这样的相对于参比分子的相对免疫原性：在相同条件下通过相同测定(例如，技术人员已知的和/或本文描述的测定，如在给定时间点定量测量接受分子的胃肠外施用以后在哺乳动物中产生的抗-分子抗体)测得，与参比分子的免疫原性相比下降了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或更大。
在许多时间段内重复胃肠外施用以后使用对细胞靶向分子的体内抗体应答的测定确定示例性细胞靶向分子的相对免疫原性。
就本发明的目的而言，短语“B-细胞和/或CD4+ T-细胞去免疫化”是指，关于B-细胞抗原性或免疫原性和/或CD4+ T-细胞抗原性或免疫原性，所述分子在施用给哺乳动物以后具有降低的抗原性和/或免疫原性潜力。对于某些实施方案，“B-细胞去免疫化”是指，分子在施用给哺乳动物以后表现出与它的来源“亲本”分子(例如，野生型志贺毒素A1片段)相比降低的B-细胞抗原性和/或免疫原性。对于某些实施方案，“CD4+ T-细胞去免疫化”是指，分子在施用给哺乳动物以后表现出与它的来源“亲本”分子(例如，野生型志贺毒素A1片段)相比降低的CD4T-细胞抗原性和/或免疫原性。
关于志贺毒素效应物多肽中的B-细胞表位、CD4+ T-细胞表位、B-细胞表位区域或CD4+ T-细胞表位区域的术语“内源性”表示存在于野生型志贺毒素A亚基中的表位。
就本发明的目的而言，短语“CD8+ T-细胞超免疫”是指，当存在于活脊索动物内的有核脊索动物细胞中时，所述分子具有关于CD8+ T-细胞抗原性或免疫原性而言增加的抗原性和/或免疫原性潜力。通常，CD8+ T-细胞免疫的分子由于固有特征或作为细胞靶向分子的组分能够细胞内化至有核脊索动物细胞的早期胞内体区室。
就本发明的目的而言，术语“异源”是指除了天然存在的志贺毒素的A亚基以外的不同来源，例如异源多肽不作为天然志贺毒素的任何A亚基的部分天然地存在。关于本发明的多肽的T-细胞表位或T-细胞表位肽组分的术语“异源”表示这样的表位或肽序列：其最初不存在于要修饰的多肽中，但是其已经被添加至多肽，无论是通过如本文中所述的嵌入、融合、插入和/或氨基酸置换的方法添加，还是通过任意其它工程方式添加。结果是经修饰的多肽，其包含对于原始的未修饰的多肽而言外来的T-细胞表位，即T-细胞表位不存在于原始多肽中。
关于本发明的多肽的T-细胞表位或T-细胞表位肽组分的术语“嵌入”及其语法变体表示用不同的氨基酸对多肽区域内的一个或多个氨基酸的内部替换，以便产生与开始多肽区域共享相同的氨基酸残基总数的新多肽序列。因而，术语“嵌入”不包括任何另外氨基酸、肽或多肽组分向开始多肽的任何外部末端融合，也不包括任何另外氨基酸残基的任何另外内部插入，而是仅包括现有氨基酸的置换。内部替换可以仅仅通过氨基酸残基置换或通过一系列置换、缺失、插入和/或倒位完成。如果使用一个或多个氨基酸的插入，那么必须在所述插入以后删除相等数目的近侧氨基酸以产生嵌入的T-细胞表位。这不同于关于本发明的多肽内所含的T-细胞表位使用的术语“插入”，其表示在多肽内部插入一个或多个氨基酸，从而产生与开始多肽相比具有增加的氨基酸残基数目的新多肽。
关于本发明的多肽内所含的T-细胞表位的术语“插入”及其语法变体表示在多肽内插入一个或多个氨基酸从而产生与开始多肽相比具有增加的氨基酸残基数目的新多肽序列。T-细胞表位肽的“纯”插入是当得到的多肽的长度增加的氨基酸残基数目等于整个插入的T-细胞表位肽中的氨基酸残基数目时。关于本发明的多肽内所含的T-细胞表位的短语“部分地插入”、“嵌入和插入”、及其语法变体表示，得到的多肽增加了长度，但是增加的长度小于与整个插入的T-细胞表位肽的长度等同的氨基酸残基数目。插入(无论是“纯的”还是“部分的”)包括以前描述的插入中的任一种，即使不在多肽内的插入位点近侧的多肽的其它区域被删除，由此导致最终多肽的总长度的下降，因为最终的多肽仍然包含T-细胞表位肽的一个或多个氨基酸在多肽区域内的内部插入。
当描述分子的功能活性时，本文中使用的术语“T-细胞表位递送”是指，分子提供在细胞内定位至亚细胞区室的生物活性，所述亚细胞区室能够导致包含T-细胞表位肽的分子的蛋白性部分的蛋白酶体切割。通过观察分子的T-细胞表位肽载荷在外源施加所述分子的细胞的细胞表面上的MHC呈递，可以测定分子的“T-细胞表位递送”功能，或其中用在它的一个或多个胞内体区室中含有所述分子的细胞开始所述测定。通常，可以确定分子将T-细胞表位递送至蛋白酶体的能力，其中“T-细胞表位递送”分子的最初位置是细胞的早期胞内体区室，且然后，经验地证实分子将表位肽递送至细胞的蛋白酶体。但是，也可以确定“T-细胞表位递送”能力，其中所述分子在细胞外位置处开始，并经验地直接地或间接地证实将所述表位递送进细胞中和递送至细胞的蛋白酶体。例如，某些“T-细胞表位递送“分子穿过细胞的胞内体区室，诸如，例如内吞进入该细胞以后。可替换地，对于在细胞外位置处开始的分子可以观察“T-细胞表位递送”活性，其中所述分子没有进入细胞的任何胞内体区室-而是“T-细胞表位递送”分子进入细胞中并将T-细胞表位肽递送至细胞的蛋白酶体，据推测是因为“T-细胞表位递送”分子指导它自身按路线发送至能够导致它的T-细胞表位肽组分的蛋白酶体切割的亚细胞区室。
就本发明的目的而言，关于本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应物多肽区域的位置的短语“在氨基端的近侧”表示这样的距离：其中志贺毒素效应物多肽区域的至少一个氨基酸残基是在细胞靶向分子的氨基端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个(例如，多达18-20个氨基酸残基)内，只要所述细胞靶向分子能够表现出适当水平的在本文中指出的志贺毒素效应物功能活性(例如，某种水平的细胞毒性效能)。因而，对于本发明的某些实施方案，在氨基端与志贺毒素效应物多肽融合的任何氨基酸残基应当不会降低任何志贺毒素效应物功能(例如，通过在空间上阻碍志贺毒素效应物多肽区域的氨基端附近的结构)，使得志贺毒素效应物多肽的功能活性降低到本文所需的适当活性水平以下。
就本发明的目的而言，关于志贺毒素效应物多肽区域相对于另一种组分(例如，细胞靶向、结合区域、分子部分和/或另外的外源物质)在本发明的细胞靶向分子内的位置的短语“在氨基端的更近侧”表示这样的位置：其中志贺毒素效应物多肽的氨基端的至少一个氨基酸残基与其它提及的组分相比更靠近本发明的细胞靶向分子的直链多肽组分的氨基端。
就本发明的目的而言，短语“从志贺毒素家族的成员的一个A亚基来源的活性酶结构域”表示，具有通过催化性核糖体灭活机制抑制蛋白合成的能力。使用技术人员已知的测定，例如，涉及在没有活细胞存在下的RNA翻译的体外测定，或涉及在活细胞中的RNA翻译的体内测定，可以通过抑制蛋白翻译的能力来定义天然存在的志贺毒素的酶活性。使用技术人员已知的和/或本文描述的测定，可以如下评估志贺毒素酶活性的效能：通过观察对核糖体RNA(rRNA)的N-糖苷酶活性(例如，核糖体切割测定)直接地评估，和/或通过观察核糖体功能和/或蛋白合成的抑制间接地评估。
就本发明的目的而言，术语“志贺毒素A1片段区域”表示基本上由志贺毒素A1片段组成和/或从志贺毒素的志贺毒素A1片段来源的多肽区域。
就本发明的目的而言，关于细胞靶向分子的术语“末端”、“氨基端”或“羧基端”通常表示细胞靶向分子的多肽链(例如，单个连续多肽链)的最后一个氨基酸残基。细胞靶向分子可以包含超过一种多肽或蛋白，且因而，本发明的细胞靶向分子可以包含多个氨基端和羧基端。例如，细胞靶向分子的“氨基端”可以由代表多肽的氨基端端部的多肽链的第一个氨基酸残基限定，所述氨基端端部通常特征在于不具有与任何特定氨基酸残基的肽键的开始氨基酸残基，所述特定氨基酸残基涉及开始氨基酸残基的伯氨基或涉及是N-烷基化的α氨基酸残基类别的成员的开始氨基酸残基的等同氮。类似地，细胞靶向分子的“羧基端”可以由代表多肽的羧基端端部的多肽链的最后一个氨基酸残基限定，所述羧基端端部通常特征在于这样的最后氨基酸残基：其不具有通过肽键与它的伯羧基的α-碳连接的任何氨基酸残基。
就本发明的目的而言，关于多肽区域的术语“末端”、“氨基端”或“羧基端”表示该区域的区域边界，不论另外的氨基酸残基是否通过肽键连接在该区域的外面。换而言之，多肽区域的末端，不论该区域是否与其它肽或多肽融合。例如，包含两个蛋白性区域的融合蛋白，例如，包含肽或多肽和志贺毒素效应物多肽的结合区域，可能具有这样的志贺毒素效应物多肽区域：其在羧基端以志贺毒素效应物多肽区域的氨基酸残基251封端，尽管涉及残基251至在位置252处的氨基酸残基的肽键代表另一个蛋白性区域(例如，结合区域)的开始。在该实施例中，所述志贺毒素效应物多肽的羧基端区域表示残基251，其不是融合蛋白的末端，但是代表内部区域边界。因而，对于多肽区域，术语“末端”、“氨基端”和“羧基端”用于表示多肽区域的边界，不论所述边界是物理末端还是嵌入较大多肽链内的内部位置。
就本发明的目的而言，短语“志贺毒素A1片段的羧基端区域”表示从天然存在的志贺毒素A1片段来源的多肽区域，所述区域以疏水残基(例如，StxA-A1和SLT-1A1的V236，和SLT-2A1的V235)开始，其后面是疏水残基，且所述区域以在志贺毒素A1片段多肽中保守的弗林蛋白酶切割位点结束，并且在天然志贺毒素A亚基中在A1片段和A2片段之间的连接部处结束。就本发明的目的而言，志贺毒素A1片段的羧基端区域包括从志贺毒素A1片段多肽的羧基端来源的肽区域，例如，包含志贺毒素A1片段的羧基端或基本上由其组成的肽区域。从志贺毒素A1片段的羧基端来源的肽区域的非限制性例子包括天然地定位在以下位置的氨基酸残基序列：Stx1A(SEQ ID NO：2)或SLT-1A(SEQ ID NO：1)中的位置236至位置239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250或251；和SLT-2A(SEQ ID NO：3)中的位置235至位置239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250。
就本发明的目的而言，关于连接的分子部分和/或结合区域的短语“在A1片段多肽的羧基端的近侧”表示从限定志贺毒素A1片段多肽的最后一个残基的氨基酸残基开始在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基内。
就本发明的目的而言，短语“在空间上覆盖A1片段-来源的区域的羧基端”包括与A1片段-来源的区域的羧基端中的氨基酸残基(例如，从天然地定位在Stx1A(SEQ ID NO：2)或SLT-1A(SEQ ID NO：1)中的位置236-251或SLT-2A(SEQ ID NO：3)中的位置235-250中的任一个处的氨基酸残基来源的氨基酸残基)连接和/或融合的4.5kDa或更大的尺寸的任何分子部分(例如，免疫球蛋白型结合区域)。就本发明的目的而言，短语“在空间上覆盖A1片段-来源的区域的羧基端”也包括与A1片段-来源的区域的羧基端中的氨基酸残基(例如，在最后的氨基酸A1片段-来源的区域和/或志贺毒素效应物多肽的羧基端的氨基酸残基)连接和/或融合的4.5kDa或更大的尺寸的任何分子部分(例如，免疫球蛋白型结合区域)。就本发明的目的而言，短语“在空间上覆盖A1片段-来源的区域的羧基端”也包括在物理上阻止A1片段-来源的区域的羧基端的细胞识别(诸如，例如通过真核细胞的ERAD机制做出的识别)的4.5kDa或更大的尺寸的任何分子部分(例如，免疫球蛋白型结合区域)。
就本发明的目的而言，包含含有至少40个氨基酸的多肽且与包含A1片段-来源的区域的志贺毒素效应物多肽的羧基端区域连接(例如，融合)的结合区域(例如，免疫球蛋白型结合区域)是“在空间上覆盖A1片段-来源的区域的羧基端”的分子部分。
就本发明的目的而言，包含含有至少40个氨基酸的多肽且与包含A1片段-来源的区域的志贺毒素效应物多肽的羧基端区域连接(例如，融合)的结合区域(例如，免疫球蛋白型结合区域)是“妨碍A1片段-来源的区域的羧基端”的分子部分。
就本发明的目的而言，术语“志贺毒素家族的成员的A1片段”表示，在弗林蛋白酶切割位点(其在志贺毒素A亚基中是保守的且位于野生型志贺毒素A亚基中的A1片段和A2片段之间)处被弗林蛋白酶蛋白酶解以后，志贺毒素A亚基的剩余氨基端片段。
为了要求保护的发明的目的，短语“在A1片段区域的羧基端处的弗林蛋白酶切割基序”表示在志贺毒素A亚基中保守的且桥连天然存在的志贺毒素A亚基中的A1片段和A2片段之间的连接部的特定弗林蛋白酶切割基序。
就本发明的目的而言，短语“在A1片段区域的羧基端近侧的弗林蛋白酶切割位点”表示这样的任何可辨别的弗林蛋白酶切割位点：其具有在限定A1片段区域或A1片段来源的区域中的最后氨基酸残基的氨基酸残基的小于1、2、3、4、5、6、7个或更多个氨基酸残基的距离内的氨基酸残基，包括位于A1片段区域或A1片段来源的区域的羧基端的弗林蛋白酶切割基序，例如，在A1片段-来源的区域与分子的另一种组分(例如，本发明的细胞靶向分子的分子部分)的连接处近侧的位置。
就本发明的目的而言，短语“被破坏的弗林蛋白酶切割基序”表示(i)如本文中在部分I-B中描述的特定弗林蛋白酶切割基序，和(ii)其包含相对于参比分子的突变和/或截短，所述突变和/或截短可以给分子赋予弗林蛋白酶切割的减少，例如，可再现地观察到比在相同条件下在相同测定中观察到的参比分子的弗林蛋白酶切割少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或更多(包括100％，对于无切割)的弗林蛋白酶切割的减少。相对于参比分子的弗林蛋白酶切割的百分比可以表达为切割的：未切割的目标分子物质除以切割的：未切割的参比分子物质的比率(参见实施例，出处同上)。合适的参比分子的非限制性例子包括包含野生型志贺毒素弗林蛋白酶切割基序和/或弗林蛋白酶切割位点的某些分子(如本文中在部分I-B、部分IV-B和/或实施例中所述的)和/或在下面实施例中用作参比分子的分子。
就本发明的目的而言，短语“弗林蛋白酶切割抗性的”是指，分子或其特定多肽区域表现出与以下对象相比可再现地更少的弗林蛋白酶切割：(i)野生型志贺毒素A亚基中的志贺毒素A1片段的羧基端，或(ii)构建体的志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端，其中天然地定位在A1和A2片段之间的连接部处的天然存在的弗林蛋白酶切割位点没有被破坏；如通过技术人员可利用的任何方式(包括通过使用本文描述的方法)所测定的。
就本发明的目的而言，短语“从志贺毒素家族的成员的A亚基来源的活性酶结构域”表示，基于志贺毒素酶活性通过核糖体的催化灭活而具有抑制蛋白合成的能力的多肽结构。使用技术人员已知的各种测定，例如，涉及在没有活细胞存在下的RNA翻译测定的体外测定，或涉及活细胞的核糖体的体内测定，可以观察分子结构的表现出蛋白合成的抑制活性和/或核糖体的催化灭活的能力。例如，使用技术人员已知的测定，可以如下评估基于志贺毒素酶活性的分子的酶活性：通过观察对核糖体RNA(rRNA)的N-糖苷酶活性(例如，核糖体切割测定)直接地评估，和/或通过观察核糖体功能、RNA翻译和/或蛋白合成的抑制间接地评估。
如本文中关于志贺毒素效应物多肽使用的，“组合”描述了包含两个或更多个亚区域的志贺毒素效应物多肽，其中每个亚区域包含以下至少一个：(1)在内源性表位或表位区域中的破坏；(2)嵌入的异源T-细胞表位肽；(3)插入的异源T-细胞表位肽；和(4)在A1片段区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序。
引论
本发明提供了多种组合志贺毒素效应物多肽和包含它们的细胞靶向分子。本发明的志贺毒素效应物多肽的某些实施方案将结构元件组合从而在单一分子中产生两种或更多种性能，例如，以下能力：1)表现出与缺乏元件的该特定组合的分子变体相比降低的抗原性和/或免疫原性，2)表现出与缺乏元件的该特定组合的分子变体相比减少的蛋白酶切割，3)表现出与缺乏元件的该特定组合的分子变体相比在某些剂量减少的对多细胞生物的非特异性毒性，4)将嵌入的或插入的T-细胞表位递送至细胞的MHC I类系统用于细胞表面呈递，和/或5)表现出高效的细胞毒性。本发明的志贺毒素效应物多肽可以充当支架以建立多种细胞靶向分子，例如，靶向细胞的细胞毒性治疗分子；靶向细胞的无毒的递送赋形剂；和靶向细胞的诊断分子。
I.本发明的志贺毒素效应物多肽的一般结构
本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子包含至少一种从野生型志贺毒素A亚基来源的志贺毒素效应物多肽，但是包含一种或多种结构修饰，例如，突变如截短和/或氨基酸残基置换。对于某些实施方案，本发明涉及改进的志贺毒素A亚基效应物多肽的工程改造，所述多肽包含下述志贺毒素效应物多肽亚区域中的两个或更多个的组合：(1)去免疫化的亚区域，(2)在志贺毒素A1片段区域的羧基端附近的蛋白酶切割抗性的亚区域，和(3)T-细胞表位肽嵌入的或插入的亚区域。
志贺毒素效应物多肽是从志贺毒素家族的志贺毒素A亚基成员来源的多肽，其能够表现出一种或多种志贺毒素功能(参见例如，Cheung M等人，Mol Cancer 9：28(2010)；WO2014/164693；WO 2015/113005；WO 2015/113007；WO 2015/138452；WO 2015/191764)。志贺毒素功能包括，例如，增加细胞内化，指导从胞内体区室至胞质溶胶的亚细胞按路线发送，避免细胞内降解，催化地灭活核糖体，和实现细胞生长抑制效应和/或细胞毒性效应。
蛋白毒素的志贺毒素家族由多种在结构上和在功能上有关的天然存在的毒素(例如，志贺毒素、志贺样毒素1和志贺样毒素2)组成(Johannes L，W，Nat RevMicrobiol 8：105-16(2010))。志贺毒素家族的全毒素成员含有靶向结构域和酶促结构域，所述靶向结构域优先结合存在于一些宿主细胞的表面上的特定鞘糖脂，所述酶促结构域一旦在细胞内能够永久地灭活核糖体(Johannes L，W，Nat Rev Microbiol 8：105-16(2010))。志贺毒素家族的成员共享相同的总结构和作用机理(Engeda1 N等人，MicrobialBiotech 4：32-46(2011))。例如，Stx、SLT-1和SLT-2在无细胞系统中表现出不能辨别的酶活性(Head S等人，J Biol Chem 266：3617-21(1991)；Tesh V等人，Infect Immun 61：3392-402(1993)；Brigotti M等人，Toxicon 35：1431-1437(1997))。
志贺毒素家族包括从痢疾志贺菌血清型1分离的真实志贺毒素(Stx)、从肠出血性大肠杆菌的血清型分离的志贺样毒素1变体(SLT1或Stx1或SLT-1或Slt-I)和从肠出血性大肠杆菌的血清型分离的志贺样毒素2变体(SLT2或Stx2或SLT-2)。SLT1与Stx的差别在于仅一个氨基酸残基，且二者已经被称作佛罗细胞毒素或Vero细胞毒素(VT)(O’Brien A，CurrTop Microbiol Immunol 180：65-94(1992))。尽管SLT1和SLT2变体在基本氨基酸序列水平彼此具有仅约53-60％相似性，它们共享志贺毒素家族成员共有的酶活性和细胞毒性机制(Johannes L，W，Nat Rev Microbiol 8：105-16(2010))。已经描述了超过39种不同的志贺毒素，诸如定义的亚型Stx1a、Stx1c、Stx1d和Stx2a-g(Scheutz F等人，J ClinMicrobiol 50：2951-63(2012))。志贺毒素家族的成员不天然地限于任何细菌物种，因为编码志贺毒素的基因可以通过水平基因转移在细菌物种之间传播(Strauch E等人，InfectImmun 69：7588-95(2001)；Bielaszewska M等人，Appl Environ Micrbiol 73：3144-50(2007)；Zhaxybayeva O，Doolittle W，Curr Biol 21：R242-6(2011))。作为种间转移的一个例子，在从患者分离的溶血不动杆菌(A.haemolyticus)菌株中发现了志贺毒素(GrotiuzG等人，J Clin Microbiol 44：3838-41(2006))。一旦编码志贺毒素的多核苷酸进入新亚种或物种中，推测志贺毒素氨基酸序列能够由于遗传漂变和/或选择压力而发生轻微序列变异，同时仍然维持志贺毒素家族的成员共有的细胞毒性机制(参见Scheutz F等人，J ClinMicrobiol 50：2951-63(2012))。
A.去免疫化的志贺毒素A亚基效应物多肽
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽是去免疫化的，例如，相对于野生型志贺毒素、野生型志贺毒素多肽和/或仅包含野生型多肽序列的志贺毒素效应物多肽。本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽各自包含至少一个推定的内源性表位区域的破坏，以便在所述多肽施用给脊索动物以后降低所述志贺毒素效应物多肽的抗原性和/或免疫原性潜力。通过本文描述的、在WO 2015/113005和/或WO 2015/113007中描述的和/或技术人员已知的方法，可以将志贺毒素效应物多肽和/或志贺毒素A亚基多肽(无论是否天然存在的)去免疫化，其中得到的分子保留一种或多种志贺毒素A亚基功能。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含内源性表位或表位区域(例如，B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位)的破坏。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含本文描述的至少一个内源性表位区域的破坏，其中在将所述多肽施用给脊索动物以后所述破坏降低所述志贺毒素效应物多肽的抗原性和/或免疫原性潜力，且其中所述志贺毒素效应物多肽能够表现出一种或多种志贺毒素A亚基功能，例如，显著水平的志贺毒素细胞毒性。
本文中关于表位区域使用的术语“被破坏的”或“破坏”表示表位区域中至少一个氨基酸残基的缺失、两个或更多个氨基酸残基的倒位(其中倒转的氨基酸残基中的至少一个是在表位区域中)、至少一个氨基酸在表位区域中的插入和表位区域中的至少一个氨基酸残基的置换。突变对表位区域的破坏包括用非标准氨基酸和/或非天然氨基酸对氨基酸的置换。可替换地可以通过突变来破坏表位区域，所述突变包含通过添加共价地连接的化学结构对氨基酸的修饰，所述化学结构掩蔽表位区域中的至少一个氨基酸，参见，例如聚乙二醇化(参见Zhang C等人，BioDrugs 26：209-15(2012)、小分子佐剂(Flower D，ExpertOpin Drug Discov 7：807-17(2012)和位点特异性的白蛋白化(Lim S等人，J ControlRelease 207-93(2015))。
在本文中通过参考在序列表中提供的天然志贺毒素A亚基的特定氨基酸位置来指示某些表位区域和破坏，应当指出天然存在的志贺毒素A亚基可能包含在它们的氨基端处含有约22个氨基酸的信号序列的前体形式，所述信号序列被除去以产生成熟的志贺毒素A亚基且是技术人员可识别的。此外，在本文中通过参考具体氨基酸(例如S代表丝氨酸残基)来指示某些表位区域破坏，所述具体氨基酸天然地存在于天然志贺毒素A亚基内的特定位置(例如S33代表从氨基端开始在位置33处的丝氨酸残基)，随后是已经用于置换所讨论的特定突变中的该残基的氨基酸(例如S33I代表异亮氨酸对从氨基端开始在氨基酸残基33处的丝氨酸的氨基酸置换)。
在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽包含本文提供的至少一个表位区域的破坏(参见例如表1-7和/或12)。在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽包含在WO 2015/113005或WO 2015/113007中描述的至少一个表位区域的破坏。
在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽包含全长志贺毒素A亚基(例如SLT-1A(SEQ ID NO：1)、StxA(SEQ ID NO：2)或SLT-2A(SEQ ID NO：3))或基本上由其组成，所述全长志贺毒素A亚基包含选自由以下氨基酸组成的天然地定位的氨基酸的组的氨基酸序列的至少一个破坏：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1-15；SEQ ID NO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的27-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQ ID NO：3的42-48；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的53-66；SEQID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94-115；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的141-153；SEQ ID NO：3的140-156；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的179-190；SEQ ID NO：3的179-191；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205；SEQ ID NO：3的210-218；SEQ IDNO：3的240-258；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的243-257；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的254-268；SEQ ID NO：3的262-278；SEQ ID NO：3的281-297；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的285-293，或在志贺毒素A亚基多肽、保守的志贺毒素效应物多肽亚区域和/或非天然的志贺毒素效应物多肽序列中的等同位置。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成。志贺毒素A亚基的截短可能导致整个表位区域的缺失，而不影响志贺毒素效应物功能。经证实表现出显著的酶活性的最小志贺毒素A亚基片段是由StxA的残基75-247组成的多肽(Al-Jaufy A等人，Infect Immun 62：956-60(1994))。将SLT-1A、StxA或SLT-2A的羧基端截短至氨基酸1-251会除去两个预测的B-细胞表位区域、两个预测的CD4阳性的(CD4+)T-细胞表位和一个预测的不连续的B-细胞表位。将SLT-1A、StxA或SLT-2A的氨基端截短至75-293会除去至少三个预测的B-细胞表位区域和三个预测的CD4+ T-细胞表位。将SLT-1A、StxA或SLT-2A的氨基端和羧基端截短至75-251会删除至少五个预测的B-细胞表位区域；四个推定的CD4+ T-细胞表位；和一个预测的不连续的B-细胞表位。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽可以包含在提供的表位区域中具有至少一个突变(例如缺失、插入、倒位或置换)的全长或截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成。在某些其它实施方案中，所述多肽包含破坏，所述破坏包含所述表位区域内的至少一个氨基酸的缺失。在某些其它实施方案中，所述多肽包含破坏，所述破坏包含所述表位区域内的至少一个氨基酸的插入。在某些其它实施方案中，所述多肽包含破坏，所述破坏包含氨基酸的倒位，其中至少一个倒转的氨基酸是在表位区域内。在某些其它实施方案中，所述多肽包含破坏，所述破坏包含突变，诸如对非标准氨基酸的氨基酸置换，或具有化学修饰的侧链的氨基酸。在下面的实施例中提供了单个氨基酸置换的众多例子。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽可以包含与天然序列相比具有一个或多个突变的全长或截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成，所述突变包含选自以下的至少一个氨基酸置换：A、G、V、L、I、P、C、M、F、S、D、N、Q、H和K。在某些其它实施方案中，所述多肽可以包含与天然序列相比具有单个突变的全长或截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成，其中所述置换选自：D至A、D至G、D至V、D至L、D至I、D至F、D至S、D至Q、E至A、E至G、E至V、E至L、E至I、E至F、E至S、E至Q、E至N、E至D、E至M、E至R、G至A、H至A、H至G、H至V、H至L、H至I、H至F、H至M、K至A、K至G、K至V、K至L、K至I、K至M、K至H、L至A、L至G、N至A、N至G、N至V、N至L、N至I、N至F、P至A、P至G、P至F、R至A、R至G、R至V、R至L、R至I、R至F、R至M、R至Q、R至S、R至K、R至H、S至A、S至G、S至V、S至L、S至I、S至F、S至M、T至A、T至G、T至V、T至L、T至I、T至F、T至M、T至S、Y至A、Y至G、Y至V、Y至L、Y至I、Y至F、和Y至M。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含与天然氨基酸残基序列相比具有一个或多个突变的全长或截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成，所述突变包含免疫原性残基和/或在表位区域内的至少一个氨基酸置换，其中至少一个置换发生在天然地定位的选自以下的氨基酸组处：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1；SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的4；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的8；SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：3的9；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的11；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的33；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的43；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的44；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的45；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的46；SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的47；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的48；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的49；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的50；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的51；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的53；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的54；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的55；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的56；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的57；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的58；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的59；SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的60；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的61；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的62；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的84；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的88；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQID NO：3的94；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的96；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的104；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的105；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的107；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的108；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的109；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的110；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的111；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3的112；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的141；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的147；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的154；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的179；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的180；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的181；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的183；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的184；SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的185；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的186；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的187；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的188；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的189；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的198；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205；SEQ ID NO：3的241；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的242；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的247；SEQ ID NO：3的247；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的248；SEQ ID NO：3的250；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的251；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的264；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的265；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的286。
在某些其它实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含具有免疫原性残基和/或在表位区域内的至少一个置换的全长或截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成，其中至少一个氨基酸置换是相对于位于以下天然位置之一处的天然地存在的氨基酸针对非保守氨基酸(参见，例如，下面表C)：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1；SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的4；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的8；SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：3的9；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的11；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的33；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的43；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的44；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的45；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的46；SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的47；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的48；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的49；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的50；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的51；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的53；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的54；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的55；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的56；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的57；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的58；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的59；SEQ ID NO：I或SEQ IDNO：2的60；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的61；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的62；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的84；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的88；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQID NO：3的94；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的96；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的104；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的105；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的107；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的108；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的109；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的110；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的111；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3的112；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的141；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的147；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的154；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的179；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的180；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的181；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的183；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的184；SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的185；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的186；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的187；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的188；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的189；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的198；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205；SEQ ID NO：3的241；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的242；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的247；SEQ ID NO：3的247；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的248；SEQ ID NO：3的250；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的251；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的264；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的265；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的286。
在某些其它实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含具有至少一个选自以下的氨基酸置换的全长或截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成：K1至A、G、V、L、I、F、M和H；T4至A、G、V、L、I、F、M和S；D6至A、G、V、L、I、F、S和Q；S8至A、G、V、I、L、F和M；T8至A、G、V、I、L、F、M和S；T9至A、G、V、I、L、F、M和S；S9至A、G、V、L、I、F和M；K11至A、G、V、L、I、F、M和H；T12至A、G、V、I、L、F、M和S；S33至A、G、V、L、I、F和M；S43至A、G、V、L、I、F和M；G44至A和L；S45至A、G、V、L、I、F和M；T45至A、G、V、L、I、F和M；G46至A和P；D47至A、G、V、L、I、F、S和Q；N48至A、G、V、L和M；L49至A或G；F50；A51至V；D53至A、G、V、L、I、F、S和Q；V54至A、G和L；R55至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；G56至A和P；I57至A、G、M和F；L57至A、G、M和F；D58至A、G、V、L、I、F、S和Q；P59至A、G和F；E60至A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M和R；E61至A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M和R；G62至A；D94至A、G、V、L、I、F、S和Q；R84至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；V88至A和G；I88至A、G和V；D94；S96至A、G、V、I、L、F和M；T104至A、G、V、I、L、F、M和S；A105至L；T107至A、G、V、I、L、F、M和S；S107至A、G、V、L、I、F和M；L108至A、G和M；S109至A、G、V、I、L、F和M；T109至A、G、V、I、L、F、M和S；G110至A；D111至A、G、V、L、I、F、S和Q；S112至A、G、V、L、I、F和M；D141至A、G、V、L、I、F、S和Q；G147至A；V154至A和G；R179至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；T180至A、G、V、L、I、F、M和S；T181至A、G、V、L、I、F、M和S；D183至A、G、V、L、I、F、S和Q；D184至A、G、V、L、I、F、S和Q；L185至A、G和V；S186至A、G、V、I、L、F和M；G187至A；R188至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；S189至A、G、V、I、L、F和M；D197至A、G、V、L、I、F、S和Q；D198至A、G、V、L、I、F、S和Q；R204至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R205至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；C242至A、G、V和S；S247至A、G、V、I、L、F和M；Y247至A、G、V、L、I、F和M；R248至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R250至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R251至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；C262至A、G、V和S；D264至A、G、V、L、I、F、S和Q；G264至A；和T286至A、G、V、L、I、F、M和S。
在某些其它实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含至少一个下述氨基酸置换的全长或截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成：K1A、K1M、T4I、D6R、S8I、T8V、T9I、S9I、K11A、K11H、T12K、S33I、S33C、S43N、G44L、S45V、S45I、T45V、T45I、G46P、D47M、D47G、N48V、N48F、L49A、F50T、A51V、D53A、D53N、D53G、V54L、V54I、R55A、R55V、R55L、G56P、I57F、I57M、D58A、D58V、D58F、P59A、P59F、E60I、E60T、E60R、E61A、E61V、E61L、G62A、R84A、V88A、D94A、S96I、T104N、A105L、T107P、L108M、S109V、T109V、G110A、D111T、S112V、D141A、G147A、V154A、R179A、T180G、T181I、D183A、D183G、D184A、D184A、D184F、L185V、L185D、S186A、S186F、G187A、G187T、R188A、R188L、S189A、D198A、R204A、R205A、C242S、S247I、Y247A、R248A、R250A、R251A或D264A、G264A、T286A和/或T286I。这些破坏表位的置换可以组合以形成去免疫化的志贺毒素效应物多肽，其具有每个表位区域的多个置换和/或多个被破坏的表位区域，同时仍然保留志贺毒素效应物功能。例如，在天然地定位的K1A、K1M、T4I、D6R、S8I、T8V、T9I、S9I、K11A、K11H、T12K、S33I、S33C、S43N、G44L、S45V、S45I、T45V、T45I、G46P、D47M、D47G、N48V、N48F、L49A、F50T、A51V、D53A、D53N、D53G、V54L、V54I、R55A、R55V、R55L、G56P、I57F、I57M、D58A、D58V、D58F、P59A、P59F、E60I、E60T、E60R、E61A、E61V、E61L、G62A、R84A、V88A、D94A、S96I、T104N、A105L、T107P、L108M、S109V、T109V、G110A、D111T、S112V、D141A、G147A、V154A、R179A、T180G、T181I、D183A、D183G、D184A、D184A、D184F、L185V、L185D、S186A、S186F、G187A、G187T、R188A、R188L、S189A、D198A、R204A、R205A、C242S、S247I、Y247A、R248A、R250A、R251A或D264A、G264A、T286A和/或T286I处的置换在可能的情况下可以与在天然地定位的残基K1A、K1M、T4I、D6R、S8I、T8V、T9I、S9I、K11A、K11H、T12K、S33I、S33C、S43N、G44L、S45V、S45I、T45V、T45I、G46P、D47M、D47G、N48V、N48F、L49A、F50T、A51V、D53A、D53N、D53G、V54L、V54I、R55A、R55V、R55L、G56P、I57F、I57M、D58A、D58V、D58F、P59A、P59F、E60I、E60T、E60R、E61A、E61V、E61L、G62A、R84A、V88A、D94A、S96I、T104N、A105L、T107P、L108M、S109V、T109V、G110A、D111T、S112V、D141A、G147A、V154A、R179A、T180G、T181I、D183A、D183G、D184A、D184A、D184F、L185V、L185D、S186A、S186F、G187A、G187T、R188A、R188L、S189A、D198A、R204A、R205A、C242S、S247I、Y247A、R248A、R250A、R251A或D264A、G264A、T286A和/或T286I处的置换组合以建立本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽。
本文描述的去免疫化的志贺毒素效应物多肽亚区域和/或破坏表位的突变中的任一种可以单独地或组合地与本发明的每个单独实施方案(包括本发明的方法)一起使用。
B.蛋白酶切割抗性的志贺毒素A亚基效应物多肽
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含(1)具有羧基端的志贺毒素A1片段来源的区域和(2)在志贺毒素A1片段区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序。提高志贺毒素组分和细胞靶向分子的其它组分(例如，靶向细胞的结合区域)之间的连接的稳定性可以通过降低由连接的断裂和细胞靶向的丧失(例如，由于蛋白酶解)造成的非特异性毒性而改善它们在施用给生物体以后的毒性谱。
志贺毒素家族的成员的志贺毒素A亚基包含对于志贺毒素功能而言重要的在它们的A1片段区域的羧基端处的保守弗林蛋白酶切割位点。技术人员使用标准技术和/或通过使用本文中的信息可以鉴别弗林蛋白酶切割位点基序和弗林蛋白酶切割位点。
志贺毒素细胞毒性的模型是，中毒细胞中弗林蛋白酶对志贺毒素A亚基的细胞内蛋白水解性加工是以下过程所必需的：1)A1片段从志贺全毒素的其余部分释放，2)通过暴露A1片段的羧基端中的疏水结构域，A1片段从内质网的逃逸，和3)A1片段的酶促活化(参见Johannes L，W，Nat Rev Microbiol 8：105-16(2010))。在中毒细胞的内质网中志贺毒素A1片段从志贺全毒素的A2片段和其余组分的有效释放是有效的细胞内按路线发送至胞质溶胶、最大酶活性、有效的核糖体灭活和实现最佳细胞毒性所必需的，即与野生型志贺毒素可比较的(参见例如WO 2015/191764和其中的参考文献)。
在志贺毒素中毒过程中，弗林蛋白酶在保守精氨酸残基(例如在StxA和SLT-1A的位置251处的精氨酸残基和在Stx2A和SLT-2A的位置250处的精氨酸残基)的羧基键处蛋白水解地切割A亚基。志贺毒素A亚基的弗林蛋白酶切割发生在胞内体和/或高尔基区室中。弗林蛋白酶是一种专门的丝氨酸内切蛋白酶，其在所有检查的人组织中由多种细胞类型表达和由大多数动物细胞表达。弗林蛋白酶会切割包含可接近的基序的多肽，所述基序经常以最小的双碱性的共有基序R-x-(R/K/x)-R为中心。志贺毒素家族的成员的A亚基包含保守的表面暴露的延长环结构(例如StxA和SLT-1A中的242-261，和SLT-2中的241-260)，所述结构具有被弗林蛋白酶切割的保守S-R/Y-x-x-R基序。位于StxA的氨基酸残基242-261处的表面暴露的延长环结构是弗林蛋白酶诱导的StxA切割所需要的，包括侧接最小弗林蛋白酶切割基序R-x-x-R的部件。
技术人员使用标准方法和/或通过使用本文中的信息可以鉴别在志贺毒素A亚基和志贺毒素效应物多肽中的弗林蛋白酶切割基序和弗林蛋白酶切割位点。弗林蛋白酶会切割最小的共有基序R-x-x-R(Schalken J等人，J Clin Invest 80：1545-9(1987)；Bresnahan P等人，J Cell Biol 111：2851-9(1990)；Hatsuzawa K等人，JBiol Chem 265：22075-8(1990)；Wise R等人，Proc Natl Acad Sci USA 87：9378-82(1990)；Molloy S等人，J Biol Chem 267：16396-402(1992))。与此相一致，许多弗林蛋白酶抑制剂包含含有基序R-x-x-R的肽。弗林蛋白酶的合成抑制剂的一个例子是包含肽R-V-K-R(SEQ ID NO：537)的分子(Henrich S等人，Nat Struct Biol 10：520-6(2003))。一般而言，可以预测包含表面可接近的双碱性氨基酸基序(具有被两个氨基酸残基隔开的两个带正电荷的氨基酸)的肽或蛋白是对弗林蛋白酶切割敏感的，切割发生在所述基序的最后一个碱性氨基酸的羧基键处。
已经以某种程度的特异性鉴别出被弗林蛋白酶切割的底物中的共有基序。已经描述了一种弗林蛋白酶切割位点基序，其包含二十个连续氨基酸残基的区域，所述区域可以使用在Schechter I，Berger，A，Biochem Biophys Res Commun 32：898-902(1968)中描述的命名法标记为P14至P6’(Tian S等人，Int J Mol Sci 12：1060-5(2011))。根据该命名法，弗林蛋白酶切割位点是在命名为P1的氨基酸残基的羧基键处，且弗林蛋白酶切割基序的氨基酸残基在从该参比P1残基朝向氨基端的方向编号为P2、P3、P4等。从P1参比残基朝向羧基端的基序的氨基酸残基用主要标志P2’、P3’、P4’等编号。使用该命名法，P6至P2’区域描绘了以弗林蛋白酶的酶促结构域为边界的弗林蛋白酶切割基序的核心底物。两个侧接区域P14至P7和P3’至P6’经常富含极性的氨基酸残基以增加对位于它们之间的核心弗林蛋白酶切割位点的可达性。
一种一般的弗林蛋白酶切割位点经常由与P4-P3-P2-P1对应的共有基序R-x-x-R描述；其中“R”代表精氨酸残基(参见表A，出处同上)，破折号“-”代表肽键，且小写字母“x”代表任何氨基酸残基。但是，其它残基和位置可以帮助进一步定义弗林蛋白酶切割基序。一种稍微更精确的弗林蛋白酶切割位点共有基序经常被报告为共有基序R-x-[K/R]-R(其中向前的斜杠“/”是指“或”且分开在相同位置处的备选氨基酸残基)，其对应于P4-P3-P2-P1，因为观察到，弗林蛋白酶具有强烈的切割含有该基序的底物的偏好。
除了最小弗林蛋白酶切割位点R-x-x-R以外，已经描述了在某些位置具有某些氨基酸残基偏好的较大弗林蛋白酶切割基序。通过对比多种已知的弗林蛋白酶底物，已经针对20个氨基酸残基长的弗林蛋白酶切割位点基序中的氨基酸残基表征了某些物理化学性能。弗林蛋白酶切割基序的P6至P2’区域描绘了与弗林蛋白酶的酶促结构域物理地相互作用的核心弗林蛋白酶切割位点。两个侧接区域P14至P7和P3’至P6’经常是亲水的，富含极性的氨基酸残基以增加对位于它们之间的核心弗林蛋白酶切割位点的表面可达性。
一般而言，从位置P5至P1的弗林蛋白酶切割基序区域倾向于包含具有正电荷和/或高等电点的氨基酸残基。具体地，P1位置(其标记弗林蛋白酶蛋白酶解的位置)通常被精氨酸占据，但是其它带正电荷的氨基酸残基可能发生在该位置。位置P2和P3倾向于被柔性的氨基酸残基占据，且具体地P2倾向于被精氨酸、赖氨酸占据，或有时被非常小的和柔性的氨基酸残基如甘氨酸占据。P4位置倾向于被弗林蛋白酶底物中的带正电荷的氨基酸残基占据。但是，如果P4位置被脂族氨基酸残基占据，那么带正电荷的官能团的缺乏可以由位于位置P5和/或P6处的带正电荷的残基补偿。位置P1’和P2’通常被脂族和/或疏水氨基酸残基占据，其中P1’位置最常见地被丝氨酸占据。
两个亲水的侧接区域倾向于被极性的亲水的氨基酸残基占据，且具有较小的氨基酸官能团；但是，在某些经验证的弗林蛋白酶底物中，所述侧接区域不含有任何亲水的氨基酸残基(参见Tian S，Biochem Insights 2：9-20(2009))。
在某些志贺毒素中确定地表征了在天然志贺毒素A亚基中在志贺毒素A1片段和A2片段之间的连接部处发现的二十氨基酸残基的弗林蛋白酶切割基序和弗林蛋白酶切割位点。例如在StxA(SEQ ID NO：2)和SLT-1A(SEQ ID NO：1)中，该弗林蛋白酶切割基序天然地定位在L238至F257，且在SLT-2A(SEQ ID NO：3)中，该弗林蛋白酶切割基序天然地定位在V237至Q256。基于本文描述的氨基酸同源性、实验和/或弗林蛋白酶切割测定，技术人员可以鉴别在其它天然的志贺毒素A亚基或志贺毒素效应物多肽中的弗林蛋白酶切割基序，其中所述基序是实际的弗林蛋白酶切割基序或被预测在弗林蛋白酶切割真核细胞内的那些分子以后会导致A1和A2片段的产生。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含(1)具有羧基端的志贺毒素A1片段来源的多肽和(2)在志贺毒素A1片段来源的多肽的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序。技术人员使用本领域已知的技术，例如，通过使用蛋白序列比对软件来鉴别以下内容，可以鉴别志贺毒素A1片段来源的多肽的羧基端：(i)天然存在的志贺毒素保守的弗林蛋白酶切割基序，(ii)天然存在的志贺毒素保守的表面暴露的延长环，和/或(iii)可以被ERAD系统识别的一段氨基酸残基，其主要是疏水的(即疏水“片”)。
本发明的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽(1)可以在它的志贺毒素A1片段区域的羧基端处完全缺乏任何弗林蛋白酶切割基序，和/或(2)在它的志贺毒素A1片段区域的羧基端和/或从志贺毒素A1片段的羧基端来源的区域处包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序。弗林蛋白酶切割基序的破坏包括对弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基的各种改变，例如，翻译后修饰，氨基酸官能团中的一个或多个原子的改变，一个或多个原子向氨基酸官能团的添加，非蛋白性部分的结合，和/或与氨基酸残基、肽、多肽的连接，诸如产生支链蛋白性结构。
使用本文描述的、在WO 2015/191764中描述的和/或技术人员已知的方法，可以从志贺毒素效应物多肽和/或志贺毒素A亚基多肽(无论是否天然存在的)建立蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽，其中得到的分子仍然保留一种或多种志贺毒素A亚基功能。
就本发明的目的而言，关于弗林蛋白酶切割位点或弗林蛋白酶切割基序，术语“破坏”或“被破坏的”表示从天然存在的弗林蛋白酶切割位点和/或弗林蛋白酶切割基序改变(例如，突变)，与野生型志贺毒素A亚基或从仅包含野生型多肽序列的野生型志贺毒素A亚基来源的多肽的弗林蛋白酶切割相比，所述改变导致在志贺毒素A1片段区域的羧基端或其来源的可辨别区域近侧的弗林蛋白酶切割的减少。对弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基的改变包括在弗林蛋白酶切割基序中的突变，例如，弗林蛋白酶切割基序的缺失、插入、倒位、置换和/或羧基端截短，以及翻译后修饰(例如，由于糖基化、白蛋白化等)，其涉及将分子与氨基酸残基的官能团缀合或连接。因为弗林蛋白酶切割基序包含约二十个氨基酸残基，在理论上，涉及这二十个位置中的任一个的一个或多个氨基酸残基的改变、修饰、突变、缺失、插入和/或截短可能导致弗林蛋白酶切割敏感性的下降(Tian S等人，Sci Rep 2：261(2012))。弗林蛋白酶切割位点和/或弗林蛋白酶切割基序的破坏可能增加或不增加对其它蛋白酶(例如，在哺乳动物的血管系统中常见的胰蛋白酶和细胞外蛋白酶)的切割的抗性。技术人员使用本领域已知的技术可以试验给定破坏对给定蛋白酶的切割敏感性的影响。
就本发明的目的而言，“被破坏的弗林蛋白酶切割基序”是包含对从20氨基酸残基区域来源的一个或多个氨基酸残基的改变的弗林蛋白酶切割基序，所述区域代表在志贺毒素A1片段和A2片段区域之间的连接部处在天然志贺毒素A亚基中发现的保守弗林蛋白酶切割基序，且定位成使得志贺毒素A亚基的弗林蛋白酶切割导致A1和A2片段的产生；其中所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序以实验上可再现的方式表现出与参比分子相比减少的弗林蛋白酶切割，所述参比分子包含与羧基端多肽融合的野生型志贺毒素A1片段区域，所述羧基端多肽具有足够大的大小以使用技术人员已知的和/或本文描述的适当测定监测弗林蛋白酶切割。
可以破坏弗林蛋白酶切割位点和弗林蛋白酶切割基序的突变类型的例子是氨基酸残基缺失、插入、截短、倒位和/或置换，包括使用非标准的氨基酸和/或非天然的氨基酸的置换。另外，弗林蛋白酶切割位点和弗林蛋白酶切割基序可以被突变破坏，所述突变包含通过添加共价地连接的结构对氨基酸的修饰，所述结构掩蔽所述位点或基序中的至少一个氨基酸，例如，由于聚乙二醇化、小分子佐剂的偶联和/或位点特异性的白蛋白化。
如果弗林蛋白酶切割基序已经被突变和/或非天然的氨基酸残基的存在破坏，某些被破坏的弗林蛋白酶切割基序不可容易地识别为与任何弗林蛋白酶切割基序有关；但是，志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端将是可识别的，且将定义弗林蛋白酶切割基序将定位的地方，在此处它不会被破坏。例如，由于相对于志贺毒素A亚基和/或志贺毒素A1片段的羧基端截短，被破坏的弗林蛋白酶切割基序可以包含弗林蛋白酶切割基序的小于二十个氨基酸残基。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含(1)具有羧基端的志贺毒素A1片段来源的多肽，和(2)在志贺毒素A1片段多肽区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序；其中所述志贺毒素效应物多肽(和包含它的任何细胞靶向分子)与参比分子相比具有更大的弗林蛋白酶切割抗性，所述参比分子是例如包含A1片段的羧基端和/或在A1和A2片段之间的保守弗林蛋白酶切割基序的野生型志贺毒素多肽。例如，使用在下面实施例中描述的体外弗林蛋白酶切割测定，可以确定一种分子相对于参比分子的弗林蛋白酶切割的减少，所述测定使用相同条件进行，然后执行从切割产生的任何片段的带密度的定量以定量地测量弗林蛋白酶切割的变化。
在某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽与野生型志贺毒素A亚基相比更耐受体外和/或体内弗林蛋白酶切割。
一般而言，如下试验本发明的细胞靶向分子的蛋白酶切割敏感性：将它与相同分子对比，所述相同分子的弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽被包含志贺毒素A1片段的野生型志贺毒素效应物多肽替换。在某些实施方案中，本发明的包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序的分子表现出与参比分子相比30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％或更大的体外弗林蛋白酶切割减少，所述参比分子包含在它的羧基端处与肽或多肽融合的野生型志贺毒素A1片段，例如，在下面实施例2中描述的参比分子SLT-1A-WT：：scFv-1。
已经描述了几种弗林蛋白酶切割基序破坏。例如，在最小R-x-x-R基序中将两个保守精氨酸突变为丙氨酸会完全阻断弗林蛋白酶和/或弗林蛋白酶-样蛋白酶的加工(参见例如Duda A等人，J Virology 78：13865-70(2004))。因为弗林蛋白酶切割位点基序包含约二十个氨基酸残基，在理论上，涉及这二十个氨基酸残基位置中的任一个的一个或多个氨基酸残基的某些突变可能消除弗林蛋白酶切割或降低弗林蛋白酶切割效率(参见例如Tian S等人，Sci Rep 2：261(2012))。
在某些实施方案中，本发明的分子包含从志贺毒素家族的成员的至少一个A亚基来源的志贺毒素效应物多肽，其中所述志贺毒素效应物多肽包含从志贺毒素A亚基的保守的高度可接近的蛋白酶切割敏感环来源的一个或多个氨基酸中的破坏。例如，在StxA和SLT-1A中，该高度可接近的蛋白酶-敏感环天然地定位在氨基酸残基242-261，且在SLT-2A中，该保守环天然地定位在氨基酸残基241-260。基于多肽序列同源性，技术人员可以鉴别在其它志贺毒素A亚基中的该保守的高度可接近的环结构。对该环中的氨基酸残基的某些突变可以减小所述环内的某些氨基酸残基对蛋白水解性裂解的可达性，且这可能降低弗林蛋白酶切割敏感性。
在某些实施方案中，本发明的分子包含含有被破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应物多肽，所述基序包含在志贺毒素A亚基中保守的表面暴露的蛋白酶敏感环中的突变。在某些其它实施方案中，本发明的分子包含含有被破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应物多肽，所述基序包含在志贺毒素A亚基的该蛋白酶-敏感环中的突变，所述突变会降低所述环内的某些氨基酸残基的表面可达性，从而降低弗林蛋白酶切割敏感性。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽的被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在共有氨基酸残基P1和P4中的一个或两个(例如，在最小弗林蛋白酶切割基序R/Y-x-x-R的位置1和4中的氨基酸残基)的存在、位置或官能团方面的破坏。例如，将最小弗林蛋白酶共有位点R-x-x-R中的两个精氨酸残基中的一个或两个突变为丙氨酸将破坏弗林蛋白酶切割基序并阻止在该位点处的弗林蛋白酶切割。类似地，在最小弗林蛋白酶切割基序R-x-x-R中的精氨酸残基中的一个或两个向技术人员已知的任何非保守氨基酸残基的氨基酸残基置换将降低所述基序的弗林蛋白酶切割敏感性。具体地，精氨酸向缺乏正电荷的任何非碱性氨基酸残基(例如，A、G、P、S、T、D、E、Q、N、C、I、L、M、V、F、W和Y)的氨基酸残基置换将产生被破坏的弗林蛋白酶切割基序。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽的被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在共有氨基酸残基P4和P1之间的间距的破坏，其中插入氨基酸残基的数目不是2，且因而，将P4和/或P1改变至不同的位置和消除P4和/或P1命名。例如，在最小弗林蛋白酶切割位点的弗林蛋白酶切割基序或核心弗林蛋白酶切割基序内的缺失将降低弗林蛋白酶切割基序的弗林蛋白酶切割敏感性。
在某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或多个氨基酸残基置换，例如，对于StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应物多肽，用任何非带正电荷的氨基酸残基置换天然地定位的氨基酸残基R248，和/或用任何非带正电荷的氨基酸残基置换R251；和对于SLT-2A来源的志贺毒素效应物多肽，用任何非带正电荷的氨基酸残基置换天然地定位的氨基酸残基Y247，和/或用任何非带正电荷的氨基酸残基置换R250。
在某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含未破坏的最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R，而是包含被破坏的侧接区域，例如，在天然地定位在例如241-247和/或252-259处的弗林蛋白酶切割基序侧接区域中的一个或多个氨基酸残基的氨基酸残基置换。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含位于弗林蛋白酶切割基序的P1-P6区域中的一个或多个氨基酸残基的置换；将P1’突变为庞大的氨基酸，例如，R、W、Y、F和H；和将P2’突变为极性的和亲水的氨基酸残基；和用一个或多个庞大的且疏水的氨基酸残基置换位于弗林蛋白酶切割基序的P1’-P6’区域中的一个或多个氨基酸残基。
在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶切割基序的破坏包含在弗林蛋白酶切割基序内的至少一个氨基酸残基的缺失、插入、倒位和/或突变。在某些实施方案中，本发明的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽可以包含天然地定位在以下位置的氨基酸序列的破坏：志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)或志贺毒素(SEQ ID NO：2)的A亚基的249-251，或志贺样毒素2(SEQ ID NO：3)的A亚基的247-250，或保守的志贺毒素效应物多肽和/或非天然的志贺毒素效应物多肽序列中的等同位置。在某些其它实施方案中，蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽包含破坏，所述破坏包含弗林蛋白酶切割基序内的至少一个氨基酸的缺失。在某些其它实施方案中，蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽包含破坏，所述破坏包含蛋白酶切割基序区域内的至少一个氨基酸的插入。在某些其它实施方案中，所述蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽包含破坏，所述破坏包含氨基酸的倒位，其中至少一个倒转的氨基酸是在蛋白酶基序区域内。在某些其它实施方案中，所述蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽包含破坏，所述破坏包含突变，诸如向非标准氨基酸或具有化学修饰的侧链的氨基酸的氨基酸置换。在下面实施例中提供了单个氨基酸置换的例子。
在本发明的分子的某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含弗林蛋白酶切割基序内的9、10、11个或更多个羧基端氨基酸残基的缺失。在这些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序不包含弗林蛋白酶切割位点或最小弗林蛋白酶切割基序。换而言之，某些实施方案缺乏在A1片段区域的羧基端处的弗林蛋白酶切割位点。
在某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基缺失和氨基酸残基置换。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或多个氨基酸残基缺失和置换，例如，对于StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应物多肽，用任何非带正电荷的氨基酸残基置换的天然地定位的氨基酸残基R248和/或用任何非带正电荷的氨基酸残基置换的R251；和对于SLT-2A来源的志贺毒素效应物多肽，用任何非带正电荷的氨基酸残基置换的天然地定位的氨基酸残基Y247和/或用任何非带正电荷的氨基酸残基置换的R250。
在某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基缺失和氨基酸残基置换以及羧基端截短。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或多个氨基酸残基缺失和置换，例如，对于StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应物多肽，用任何非带正电荷的氨基酸残基置换的天然地定位的氨基酸残基R248和/或用任何非带正电荷的氨基酸残基置换的R251；和对于SLT-2A来源的志贺毒素效应物多肽，用任何非带正电荷的氨基酸残基置换的天然地定位的氨基酸残基Y247和/或用任何非带正电荷的氨基酸残基置换的R250。
在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的氨基酸置换和相对于野生型志贺毒素A亚基的羧基端截短，例如，对于StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应物多肽，在天然氨基酸位置249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291或更大处结束的截短，且包含在适当的情况下用任何非带正电荷的氨基酸残基置换的天然地定位的氨基酸残基R248和/或R251；和对于SLT-2A来源的志贺毒素效应物多肽，在天然氨基酸位置248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291或更大处结束的截短，且包含在适当的情况下用任何非带正电荷的氨基酸残基置换的天然地定位的氨基酸残基Y247和/或R250。
在某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型志贺毒素A亚基的一个或多个氨基酸残基的插入，只要插入的氨基残基不会建立新生弗林蛋白酶切割位点。在某些实施方案中，所述一个或多个氨基酸残基的插入会破坏在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R中的精氨酸残基之间的天然间距，例如，StxA和SLT-1A来源的多肽包含在249或250处和因而在R248和R251之间的一个或多个氨基酸残基的插入；或SLT-2A来源的多肽包含在248或249处和因而在Y247和R250之间的一个或多个氨基酸残基的插入。
在某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基插入和羧基端截短。在某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基插入和氨基酸残基置换。在某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基插入和氨基酸残基缺失。
在某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基缺失、氨基酸残基插入和氨基酸残基置换。
在某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基缺失、插入、置换和羧基端截短。
在某些实施方案中，包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序的志贺毒素效应物多肽通过肽键直接融合至包含氨基酸、肽和/或多肽的分子部分，其中融合的结构包含单个连续多肽。在这些融合实施方案中，在被破坏的弗林蛋白酶切割基序后面的氨基酸序列不会在融合连接部处建立新生弗林蛋白酶切割位点。
以上蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽亚区域和/或被破坏的弗林蛋白酶切割基序中的任一种可以单独地或组合地与本发明的每个单独实施方案(包括本发明的方法)一起使用。
C.T-细胞超免疫的志贺毒素A亚基效应物多肽
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含嵌入的或插入的表位肽。在某些其它实施方案中，所述表位肽是异源T-细胞表位肽，例如，被视作与志贺毒素A亚基异源的表位。在某些其它实施方案中，所述表位肽是CD8+ T-细胞表位。在某些其它实施方案中，所述CD8+ T-细胞表位肽具有以10-4摩尔或更小的解离常数(KD)为特征的对MHC I类分子的结合亲和力，和/或得到的MHC I类-表位肽复合物具有以10-4摩尔或更小的解离常数(KD)为特征的对T-细胞受体(TCR)的结合亲和力。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含嵌入的或插入的异源T-细胞表位，例如，人CD8+ T-细胞表位。在某些其它实施方案中，将异源T-细胞表位嵌入或插入以破坏在天然存在的志贺毒素多肽或本发明的志贺毒素效应物多肽的来源亲本志贺毒素效应物多肽中可辨别的内源性表位或表位区域(例如B-细胞表位和/或CD4+ T-细胞表位)。
对于本发明的某些实施方案，所述志贺毒素效应物多肽(和包含它的任何细胞靶向分子)是CD8+ T-细胞超免疫的，例如，相对于野生型志贺毒素多肽。本发明的CD8+ T-细胞超免疫的志贺毒素效应物多肽各自包含嵌入的或插入的T-细胞表位肽。使用本文描述的、在WO 2015/113007中描述的和/或技术人员已知的方法，可以从志贺毒素效应物多肽和/或志贺毒素A亚基多肽(无论是否天然存在)建立超免疫的志贺毒素效应物多肽，其中得到的分子仍然保留一种或多种志贺毒素A亚基功能。
为了要求保护的发明的目的，T-细胞表位是包含抗原肽的分子结构，且可以由直链氨基酸序列代表。T-细胞表位通常是8-11个氨基酸残基大小的肽(Townsend A，BodmerH，Annu Rev Immunol 7：601-24(1989))；但是，某些T-细胞表位肽具有小于8个或大于11个氨基酸长的长度(参见例如Livingstone A，Fathman C，Annu Rev Immunol 5：477-501(1987)；Green K等人，Eur J Immunol 34：2510-9(2004))。在某些实施方案中，所述嵌入的或插入的表位是至少7个氨基酸残基长度。在某些实施方案中，所述嵌入的或插入的表位被TCR以小于10mM(例如1-100μM)的KD为特征的结合亲和力结合，如使用在Stone J等人，Immunology 126：165-76(2009)中的公式所计算的。但是，应当指出，在MHC-表位和TCR之间在给定范围内的结合亲和力可能不会与抗原性和/或免疫原性关联(参见例如Al-Ramadi B等人，J Immunol 155：662-73(1995))，诸如由于因素如MHC-肽-TCR复合物稳定性、MHC-肽密度和TCR辅因子(诸如CD8)的MHC无关功能(Baker B等人，Immunity 13：475-84(2000)；Hornell T等人，J Immunol 170：4506-14(2003)；Woolridge L等人，J Immunol 171：6650-60(2003))。
异源T-细胞表位是尚未存在于野生型志贺毒素A亚基、天然存在的志贺毒素A亚基和/或用作来源多肽用于通过本文描述的、在WO 2015/113007中描述的和/或技术人员已知的方法进行修饰的亲本志贺毒素效应物多肽中的表位。
通过技术人员已知的众多方法可以将异源T-细胞表位肽掺入来源多肽中，所述方法包括，例如，在来源多肽内建立一个或多个氨基酸置换的方法，将一个或多个氨基酸与来源多肽融合的方法，将一个或多个氨基酸插入来源多肽中的方法，将肽与来源多肽连接的方法，和/或前述方法的组合。这样的方法的结果是来源多肽的经修饰的变体的建立，所述变体包含一个或多个嵌入的或插入的异源T-细胞表位肽。
可以从用于用在本发明中的许多来源分子选择或衍生出T-细胞表位。可以从多种天然存在的蛋白建立或衍生出T-细胞表位。可以从对于哺乳动物而言外来的多种天然存在的蛋白(例如，微生物的蛋白)建立或衍生出T-细胞表位。可以从突变的人蛋白和/或恶性人细胞异常地表达的人蛋白建立或衍生出T-细胞表位。可以从合成的分子合成地建立或衍生出T-细胞表位(参见例如，Carbone F等人，J Exp Med 167：1767-9(1988)；Del Val M等人，J Virol 65：3641-6(1991)；Appella E等人，Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1：177-84(1995)；Perez S等人，Cancer 116：2071-80(2010))。
尽管预见到任何T-细胞表位肽用作本发明的异源T-细胞表位，可以基于合乎需要的性能选择某些表位。本发明的一个目的是制备用于施用给脊椎动物的CD8+ T-细胞超免疫的志贺毒素效应物多肽，这意味着，所述异源T-细胞表位是高度免疫原性的，且当与MHCI类分子形成复合物一起展示在细胞表面上时可以在体内引起稳健的免疫应答。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含一个或多个嵌入的或插入的异源T-细胞表位，其为CD8+ T-细胞表位。本发明的包含异源CD8+ T-细胞表位的志贺毒素效应物多肽被视作CD8+ T-细胞超免疫的志贺毒素效应物多肽。
可以从许多已知能够引起脊椎动物免疫应答的来源分子选择或衍生出本发明的T-细胞表位组分。可以从对于脊椎动物而言外来的多种天然存在的蛋白(例如，病原性微生物的蛋白和非自身癌抗原)衍生出T-细胞表位。具体地，传染性微生物可以含有具有已知抗原性和/或免疫原性性能的众多蛋白。其它传染性微生物可以含有众多具有已知抗原性和/或免疫原性亚区域或表位的蛋白。
例如，具有哺乳动物宿主的细胞内病原体的蛋白是T-细胞表位的来源。存在众多具有充分研究的抗原性蛋白或肽的细胞内病原体，诸如病毒、细菌、真菌和单细胞真核生物。可以从人病毒或其它细胞内病原体(例如，细菌如分枝杆菌属、真菌如弓形虫属、和原生生物如锥虫)选择或鉴别T-细胞表位。
例如，存在许多来自对于人类而言传染性的病毒的病毒蛋白的免疫原性病毒肽组分。已经将众多人T-细胞表位映射至来自甲型流感病毒的蛋白内的肽，诸如在蛋白HA糖蛋白FE17、S139/1、CH65、C05、血凝素1(HA1)、血凝素2(HA2)、非结构蛋白1和2(NS1和NS 2)、基质蛋白1和2(M1和M2)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA))中的肽，且这些肽中的许多已经被证实会引起人免疫应答，诸如通过使用离体测定。类似地，已经将众多人T-细胞表位映射至来自人巨细胞病毒(HCMV)的蛋白的肽组分，诸如在蛋白pp65(UL83)、UL128-131、立即早期1(IE-1；UL123)、糖蛋白B、壳皮蛋白中的肽，且这些肽中的许多已经被证实会引起人免疫应答，诸如通过使用离体测定。
另一个实施例是，在人类中存在许多免疫原性的癌抗原。技术人员使用本领域已知的技术，例如，差别基因组学、差别蛋白组学、免疫蛋白组学、预测然后验证和基因方案如反向基因转染(参见例如，Admon A等人，Mol Cell Proteomics 2：388-98(2003)；PurcellA，Gorman J，Mol Cell Proteomics 3：193-208(2004)；Comber J，Philip R，Ther AdvVaccines 2：77-89(2014))，可以鉴别癌抗原和/或肿瘤细胞抗原的CD8+ T-细胞表位。存在许多已经被鉴别或预测发生在人癌症和/或肿瘤细胞中的抗原性的和/或免疫原性的T-细胞表位。例如，已经在赘生性细胞中通常突变或过表达的人蛋白中预测T-细胞表位，例如，ALK、CEA、N-乙酰基葡糖胺基-转移酶V(GnT-V)、HCA587、HER-2/neu、MAGE、Melan-A/MART-1、MUC-1、p53和TRAG-3(参见例如，van der Bruggen P等人，Science 254：1643-7(1991)；Kawakami Y等人，J Exp Med 180：347-52(1994)；Fisk B等人，J Exp Med 181：2109-17(1995)；Guilloux Y等人，J Exp Med 183：1173(1996)；Skipper J等人，J Exp Med 183：527(1996)；Brossart P等人，93：4309-17(1999)；Kawashima I等人，Cancer Res 59：431-5(1999)；Papadopoulos K等人，Clin Cancer Res 5：2089-93(1999)；Zhu B等人，ClinCancer Res 9：1850-7(2003)；Li B等人，Clin Exp Immunol 140：310-9(2005)；Ait-TaharK等人，Int J Cancer 118：688-95(2006)；Akiyama Y等人，Cancer Immunol Immunother61：2311-9(2012))。另外，已经制备了来自人癌细胞的T-细胞表位的合成变体(参见例如，Lazoura E，Apostolopoulos V，Curr Med Chem 12：629-39(2005)；Douat-Casassus C等人，J Med Chem 50：1598-609(2007))。
尽管任何T-细胞表位可以用在本发明的多肽和分子中，某些T-细胞表位基于它们的已知的和/或经验地确定的特征可以是优选的。例如，在许多物种中，在它的基因组中的MHC等位基因编码多种MHC-1分子变体。因为MHC I类蛋白多态性可以影响CD8+ T-细胞的抗原-MHC I类复合物识别，基于关于某些MHC I类多态性的知识和/或某些抗原-MHC I类复合物被具有不同基因型的T-细胞识别的能力可以选择T-细胞表位用在本发明中。
存在确定地定义的肽-表位，其已知是免疫原性的、MHC I类限制的和/或与特定人白细胞抗原(HLA)变体匹配的。就在人类中或涉及人靶细胞的应用而言，技术人员使用本领域已知的标准技术可以选择或鉴别HLA-I类-限制的表位。肽的结合人MHC I类分子的能力可以用于预测假定的T-细胞表位的免疫原性潜力。使用软件工具可以将肽的结合人MHC I类分子的能力评分。基于在某些人群体中更流行的等位基因编码的HLA变体的肽选择性，可以选择T-细胞表位用于用作本发明的异源T-细胞表位组分。例如，由于HLA基因的从个体至个体的变化的等位基因，人群体就MHC I类分子的α链而言是多态的。某些T-细胞表位可能被特定HLA分子更有效地呈递，例如，由HLA-A等位基因组HLA-A2和HLA-A3编码的常见的HLA变体。
当选择T-细胞表位用于用作本发明的异源T-细胞表位组分时，可以考虑多种因子，其可以影响表位产生和运输至接受的MHC I类分子，例如，下述因子在靶细胞中的存在和表位特异性：蛋白酶体、ERAAP/ERAP1、tapasin和TAPs。
当选择T-细胞表位用于用作本发明的异源T-细胞表位组分时，可以选择与存在于要靶向的细胞类型或细胞群体中的MHC I类分子最佳匹配的表位。不同的MHC I类分子表现出与特定肽序列的优先结合，且特定肽-MHC I类变体复合物被效应物T-细胞的t-细胞受体(TCR)特异性地识别。技术人员可以使用关于MHC I类分子特异性和TCR特异性的知识来优化用在本发明中的异源T-细胞表位的选择。
另外，用于MHC I类呈递的多种免疫原性的T-细胞表位可以嵌入在本发明的相同志贺毒素效应物多肽中，例如，用于用在多个T-细胞表位的同时靶向递送中。包含多个CD8+T-细胞表位的本发明的细胞靶向分子的一个例子是SEQ ID NO：26。
本文描述的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽亚区域和/或被破坏的弗林蛋白酶切割基序中的任一种可以单独地或组合地与本发明的每个单独实施方案(包括本发明的方法)一起使用。
II.本发明的细胞靶向分子的一般结构
本发明的志贺毒素效应物多肽提供了稳健的和强大的支架用于工程改造新的细胞靶向分子。靶向细胞的结合区域与本发明的志贺毒素效应物多肽的结合能够工程改造具有合乎需要的特征的治疗和诊断分子，例如，去免疫化、高效的细胞毒性、有效的细胞内按路线发送、T-细胞超免疫接种、分子稳定性和在高剂量的体内耐受性。
本发明提供了多种细胞靶向分子，各自包含(1)靶向细胞的结合区域和(2)本发明的志贺毒素效应物多肽。本发明的志贺毒素效应物多肽可以与多种不同的细胞靶向组分(例如分子部分和/或试剂)结合和/或偶联以建立本发明的细胞靶向分子。本发明的细胞靶向分子包含(1)能够特异性地结合靶生物分子的细胞外部分的结合区域和(2)包含本发明的志贺毒素效应物多肽的志贺毒素效应物多肽区域。
本发明的志贺毒素效应物多肽可以连接至一个或多个靶向细胞的结合区域，所述结合区域通过对靶生物分子(例如，与细胞的细胞表面物理上连接的靶生物分子)的细胞外部分的结合特异性来介导细胞靶向。本发明的细胞靶向分子的一种非限制性例子是与蛋白性的靶向细胞的结合区域(例如，免疫球蛋白型结合区域)融合的本发明的志贺毒素效应物多肽。
A.结合区域
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的结合区域是能够以高亲和力特异性地结合靶生物分子的细胞外部分(例如细胞外靶生物分子)的细胞靶向组分，例如，结构域、分子部分或试剂。存在众多类型的技术人员已知的结合区域，或其可以由技术人员使用本领域已知的技术发现。例如，表现出本文描述的必要结合特征的任何细胞靶向组分可以在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中用作结合区域。
靶生物分子的细胞外部分表示，当所述分子与细胞物理上连接时，例如，当靶生物分子由细胞在细胞表面处表达时，它的结构暴露于细胞外环境的部分。在该背景下，暴露于细胞外环境是指，靶生物分子的部分是可接近的，例如，被以下对象接近：抗体或至少比抗体更小的结合部分诸如单结构域抗体结构域、纳米体(nanobody)、从骆驼科或软骨鱼来源的重链抗体结构域、单链可变片段或任何数目的经工程改造的免疫球蛋白替代支架(参见下面)。技术人员使用本领域众所周知的方法可以经验地确定向细胞外环境的暴露或与细胞物理上连接的靶生物分子的部分的可达性。
本发明的细胞靶向分子的结合区域可以是，例如，配体、肽、免疫球蛋白型结合区域、单克隆抗体、经工程改造的抗体衍生物或经工程改造的抗体替代物。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的结合区域是能够以高亲和力特异性地结合靶生物分子的细胞外部分的蛋白性部分。本发明的细胞靶向分子的结合区域可以包含一个或多个不同的肽或多肽部分，诸如随机地产生的肽序列、天然存在的配体或其衍生物、免疫球蛋白来源的结构域、作为免疫球蛋白结构域的替代物的合成地工程改造的支架等(参见例如，WO 2005/092917；WO 2007/033497；Cheung M等人，Mol Cancer 9：28(2010)；US 2013/0196928；WO 2014/164693；WO 2015/113005；WO 2015/113007；WO 2015/138452；WO 2015/191764)。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含结合区域，所述结合区域包含一个或多个能够选择性地和特异性地结合细胞外靶生物分子的多肽。
存在众多本领域已知的可用于通过它们的结合特征将分子靶向特定细胞类型的结合区域，诸如某些配体、单克隆抗体、经工程改造的抗体衍生物和经工程改造的抗体替代物。
根据一个具体的、但是非限制性的方面，本发明的细胞靶向分子的结合区域包含保留对细胞外靶生物分子(通常是细胞表面受体)的结合功能性的天然存在的配体或其衍生物。例如，本领域已知的多种细胞因子、生长因子和激素可以用于将本发明的细胞靶向分子靶向至表达相应细胞因子受体、生长因子受体或激素受体的特定细胞类型的细胞表面。配体的某些非限制性例子包括(在括弧中指示替代名称)血管生成素、B-细胞活化因子(BAFF、APRIL)、集落刺激因子(CSF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素-样生长因子(IGF)、干扰素、白介素(诸如IL-2、IL-6和IL-23)、神经生长因子(NGF)、血小板来源的生长因子、转化生长因子(TGF)和肿瘤坏死因子(TNF)。
根据本发明的细胞靶向分子的某些其它实施方案，所述结合区域包含能够结合细胞外靶生物分子的合成配体(参见例如Liang S等人，J Mol Med 84：764-73(2006)；AhmedS等人，Anal Chem 82：7533-41(2010)；Kaur K等人，Methods Mol Biol 1248：239-47(2015))。
在某些实施方案中，所述结合区域包含肽拟似物，例如，AA肽、γ-AA肽和/或磺基-γ-AA肽(参见例如，Pilsl L，Reiser O，Amino Acids41：709-18(2011)；Akram O等人，MolCancer Res 12：967-78(2014)；Wu H等人，Chemistry 21：2501-7(2015)；Teng P等人，Chemistry 2016年3月4日))。
根据一个具体的、但是非限制性的方面，所述结合区域可以包含免疫球蛋白型结合区域。本文中使用的术语“免疫球蛋白型结合区域”表示能够结合一个或多个靶生物分子(诸如抗原或表位)的多肽区域。结合区域可以在功能上通过它们的结合靶分子的能力来定义。免疫球蛋白型结合区域通常源自抗体或抗体-样结构；但是，在该术语的范围内预见到来自其它来源的替代支架。
免疫球蛋白(Ig)蛋白具有被称作Ig结构域的结构域。Ig结构域在约70-110氨基酸残基的长度范围内，且具有特征性的Ig折叠，其中通常7-9个反平行的β链排列进2个形成夹心-样结构的β片中。Ig折叠通过所述夹心的内表面上的疏水氨基酸相互作用和在所述链中的半胱氨酸残基之间的高度保守的二硫键稳定化。Ig结构域可以是可变的(IgV或V-组)、恒定的(IgC或C-组)或中间的(IgI或I-组)。一些Ig结构域可以与互补性决定区(CDR)结合，所述互补性决定区(CDR)也称为“互补决定区”，对于抗体与它们的表位的结合特异性而言是重要的。Ig-样结构域也存在于非-免疫球蛋白蛋白中，且在此基础上分类为蛋白的Ig超家族的成员。HUGO基因命名委员会(HUGO Gene Nomenclature Committee，HGNC)提供了含有Ig-样结构域的家族的成员的列表。
免疫球蛋白型结合区域可以是抗体或其抗原结合片段的多肽序列，其中所述氨基酸序列已经从天然抗体或非-免疫球蛋白蛋白的Ig-样结构域的氨基酸序列改变，例如通过分子工程或文库筛选选择。因为重组DNA技术和体外文库筛选在免疫球蛋白型结合区域的制备中的关联性，可以将抗体重新设计以得到期望的特征，诸如更小的大小、细胞进入或对于体内和/或治疗用途而言的其它改善。可能的变异有许多，且可以在从仅一个氨基酸的改变至例如可变区的完全重新设计的范围内。通常，将做出可变区的变化，以便改善抗原结合特征、改善可变区稳定性或减少免疫原性应答的潜力。
存在众多预见到作为本发明的组分的免疫球蛋白型结合区域。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白型结合区域源自免疫球蛋白结合区域，诸如能够结合细胞外靶生物分子的抗体互补位。在某些其它实施方案中，所述免疫球蛋白型结合区域包含经工程改造的多肽，其并非源自任何免疫球蛋白结构域，但是其象免疫球蛋白结合区域一样通过提供与细胞外靶生物分子的高亲和力结合来起作用。该经工程改造的多肽可以任选地包括多肽支架，所述多肽支架包含如本文中所述的来自免疫球蛋白的互补决定区或基本上由其组成。
在现有技术中也存在众多可用于通过它们的高亲和力结合特征将多肽靶向至特定细胞类型的结合区域。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的结合区域选自包括以下成员的组：自主VH结构域、单结构域抗体结构域(sdAb)、从骆驼科来源的重链抗体结构域(VHH片段或VH结构域片段)、从骆驼科VHH片段或VH结构域片段来源的重链抗体结构域、从软骨鱼来源的重链抗体结构域、免疫球蛋白新抗原受体(IgNARs)、VNAR片段、单链可变(scFv)片段、纳米抗体(nanobodies)、由重链和CHl结构域组成的Fd片段、单链Fv-CH3微体、二聚体CH2结构域片段(CH2D)、Fc抗原结合结构域(Fcab)、分离的互补决定区3(CDR3)片段、受限的框架区3、CDR3、框架区4(FR3-CDR3-FR4)多肽、小模块免疫药物(SMIP)结构域、scFv-Fc融合体、多聚化scFv片段(双体、三体、四体)、二硫键稳定化的抗体可变(Fv)片段、二硫键稳定化的由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗原结合(Fab)片段、二价纳米抗体(nanobodies)、二价微体、二价F(ab’)2片段(Fab二聚体)、双特异性的串联VHH片段、双特异性的串联scFv片段、双特异性的纳米抗体(nanobodies)、双特异性的微体、和前述物质的保留它的互补位和结合功能的任何遗传上操作的相应物(参见Ward E等人，Nature 341：544-6(1989)；DaviesJ，Riechmann L，Biotechnology(NY)13：475-9(1995)；Reiter Y等人，Mol Biol 290：685-98(1999)；Riechmann L，Muyldermans S，J Immunol Methods 231：25-38(1999)；Tanha J等人，J Immunol Methods 263：97-109(2002)；Vranken W等人，Biochemistry 41：8570-9(2002)；Jespers L等人，JMol Biol 337：893-903(2004)；Jespers L等人，Nat Biotechnol22：1161-5(2004)；To R等人，J Biol Chem 280：41395-403(2005)；Saerens D等人，CurrOpin Pharmacol 8：600-8(2008)；Dimitrov D，MAbs 1：26-8(2009)；Weiner L，Cell 148：1081-4(2012)；Ahmad Z等人，Clin Dev Immunol 2012：980250(2012))。
存在多种包含从免疫球蛋白的恒定区来源的多肽的结合区域，例如，经工程改造的二聚体Fc结构域、单体Fc(mFc)、scFv-Fc、VHH-Fc、CH2结构域、单体CH3s结构域(mCH3s)、合成地重新程序化的免疫球蛋白结构域和/或免疫球蛋白结构域与配体的杂合融合体(HoferT等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A.105：12451-6(2008)；Xiao J等人，JAmChem Soc 131：13616-13618(2009)；Xiao X等人，Biochem Biophys Res Commun387：387-92(2009)；Wozniak-Knopp G等人，Protein Eng Des Sel 23 289-97(2010)；Gong R等人，PLoS ONE7：e42288(2012)；Wozniak-Knopp G等人，PLoS ONE 7：e30083(2012)；Ying T等人，J BiolChem 287：19399-408(2012)；Ying T等人，J Biol Chem 288：25154-64(2013)；Chiang M等人，J Am Chem Soc 136：3370-3(2014)；Rader C，Trends Biotechnol 32：186-97(2014)；Ying T等人，Biochimica Biophys Acta 1844：1977-82(2014))。
根据某些其它实施方案，所述结合区域包含经工程改造的免疫球蛋白结构域替代支架。经工程改造的替代支架是本领域已知的，其表现出与免疫球蛋白来源的结构类似的功能特征，诸如靶生物分子的高亲和力和特异性结合，且可以给某些免疫球蛋白结构域提供改善的特征，例如，更大的稳定性或降低的免疫原性。通常，免疫球蛋白替代支架小于20千道尔顿，由单个多肽链组成，缺乏半胱氨酸残基，且表现出相对较高的热力学稳定性。
对于本发明的某些实施方案的细胞靶向分子，所述结合区域包含选自包括以下成员的组的替代支架：自主VH结构域、单结构域抗体结构域(sdAb)、从骆驼科来源的重链抗体结构域(VHH片段或VH结构域片段)、从骆驼科VHH片段或VH结构域片段来源的重链抗体结构域、从软骨鱼来源的重链抗体结构域、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)、VNAR片段、单链可变(scFv)片段、纳米抗体(nanobodies)、由重链和CH1结构域组成的Fd片段、全突变的Fv(pFv)、单链Fv-CH3微体、二聚体CH2结构域片段(CH2D)、Fc抗原结合结构域(Fcab)、分离的互补决定区3(CDR3)片段、受限的框架区3、CDR3、框架区4(FR3-CDR3-FR4)多肽、小模块免疫药物(SMIP)结构域、scFv-Fc融合体、多聚化scFv片段(双体、三体、四体)、二硫键稳定化的抗体可变(Fv)片段、二硫键稳定化的由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗原结合(Fab)片段、二价纳米抗体(nanobodies)、二价微体、二价F(ab’)2片段(Fab二聚体)、双特异性的串联VHH片段、双特异性的串联scFv片段、双特异性的纳米抗体(nanobodies)、双特异性的微体和前述物质的保留它的结合功能性的任何遗传上操作的相应物(A，Plückthun A，J MolBiol 305：989-1010(2001)；Xu L等人，Chem Biol 9：933-42(2002)；Wikman M等人，Protein Eng Des Sel 17：455-62(2004)；Binz H等人，Nat Biotechnol 23：1257-68(2005)；Hey T等人，Trends Biotechnol23：514-522(2005)；Holliger P，Hudson P，NatBiotechnol 23：1126-36(2005)；Gill D，Damle N，Curr Opin Biotech 17：653-8(2006)；Koide A，Koide S，Methods Mol Biol 352：95-109(2007)；Byla P等人，J Biol Chem 285：12096(2010)；Zoller F等人，Molecules 16：2467-85(2011)；Alfarano P等人，ProteinSci 21：1298-314(2012)；Madhurantakam C等人，Protein Sci 21：1015-28(2012)；Varadamsetty G等人，JMol Biol 424：68-87(2012)；Reichen C等人，JStruct Biol 185：147-62(2014))。
例如，已经鉴别出众多结合细胞外受体HER2的替代支架(参见例如Wikman M等人，Protein Eng Des Sel 17：455-62(2004)；Orlova A等人.Cancer Res 66：4339-8(2006)；Ahlgren S等人，Bioconjug Chem 19：235-43(2008)；Feldwisch J等人，J Mol Biol 398：232-47(2010)；美国专利5,578,482；5,856,110；5,869,445；5,985,553；6,333,169；6,987,088；7,019,017；7,282,365；7,306,801；7,435,797；7,446,185；7,449,480；7,560,111；7,674,460；7,815,906；7,879,325；7,884,194；7,993,650；8,241,630；8,349,585；8,389,227；8,501,909；8,512,967；8,652,474；和美国专利申请2011/0059090)。除了替代抗体形式以外，非蛋白性化合物，例如，寡聚体、RNA分子、DNA分子、碳水化合物和多糖包被杯芳烃(参见例如Sansone F，Casnati A，Chem Soc Rev 42：4623-39(2013))，或部分地蛋白性的化合物，例如，与肽和杯芳烃-肽组合物偶联的苯酚-甲醛环状寡聚体(参见例如美国5,770,380)，可以赋予抗体-样结合能力。
以上结合区域结构中的任一种可以用作本发明的分子的组分，只要所述结合区域组分具有10-5至10-12mol/L、优选地小于200纳摩尔(nM)的与细胞外靶生物分子的解离常数。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含与结合区域连接和/或融合的本发明的志贺毒素效应物多肽，所述结合区域能够特异性地结合靶生物分子的细胞外部分或细胞外靶生物分子。基于众多标准，诸如本文描述的判据，可以选择细胞外靶生物分子。
B.被结合区域结合的细胞外靶生物分子
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子的结合区域包含蛋白性区域，所述蛋白性区域能够特异性地结合靶生物分子的细胞外部分或细胞外靶生物分子，优选地其物理上连接至目标细胞类型(例如，癌细胞、肿瘤细胞、浆细胞、被感染的细胞或携带细胞内病原体的宿主细胞)的表面。被本发明的细胞靶向分子的结合区域结合的靶生物分子可以包括超比例地(over-proportionately)或排它地存在于癌细胞、免疫细胞和/或被细胞内病原体(例如，病毒、细菌、真菌、朊病毒或原生动物)感染的细胞上的生物标志物。
术语“靶生物分子”表示这样的生物分子，通常是蛋白性分子或通过翻译后修饰(诸如糖基化)修饰的蛋白：其被本发明的细胞靶向分子的结合区域结合，从而导致细胞靶向分子向特定细胞、细胞类型和/或多细胞生物内的位置的靶向。
就本发明的目的而言，关于靶生物分子的术语“细胞外”表示这样的生物分子：其具有暴露于细胞外环境的它的结构的至少一部分。技术人员使用本领域众所周知的方法可以经验地确定向细胞外环境的暴露或向与细胞偶联的靶生物分子的部分的可达性。细胞外靶生物分子的非限制性例子包括细胞膜组分、跨膜蛋白、锚定细胞膜的生物分子、细胞表面-结合的生物分子和分泌的生物分子。
关于本发明，短语“物理上连接”当用于描述靶生物分子时是指，共价和/或非共价分子间相互作用将靶生物分子或其部分偶联至细胞外，诸如靶生物分子和细胞之间的多个非共价相互作用，其中每个单独相互作用的能量是在至少约1-5千卡的量级(例如，静电键、氢键、离子键、范德华相互作用、疏水力等)。可以发现所有嵌膜蛋白物理上连接至细胞膜、以及周围膜蛋白。例如，细胞外靶生物分子可能包含跨膜区域、脂质锚、糖脂锚和/或与包含前述任一个的因子非共价地结合(例如通过非特异性的疏水相互作用和/或结合脂质的相互作用)。
靶生物分子的细胞外部分可以包括多种表位，包括未修饰的多肽、通过添加生化官能团而修饰的多肽和糖脂(参见例如US 5,091,178；EP2431743)。
基于众多标准，诸如它们的靶生物分子的细胞类型特异性的表达、它们的靶生物分子关于特定细胞类型的物理定位和/或它们的靶生物分子的性能，可以设计或选择本发明的细胞靶向分子的结合区域。例如，本发明的某些细胞靶向分子包含能够结合细胞表面靶生物分子的结合区域，所述细胞表面靶生物分子由物种的仅一个细胞类型或多细胞生物内的仅一个细胞类型排它地在细胞表面处表达。合乎需要的、但是非必要的是，细胞外靶生物分子固有地内化或在与本发明的细胞靶向分子相互作用后容易地被迫内化。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，从免疫球蛋白型多肽衍生出结合区域，所述免疫球蛋白型多肽针对与癌或肿瘤细胞的细胞表面上的表面抗原的特异性和高亲和力结合进行选择，其中所述抗原在表达上限于癌或肿瘤细胞(参见Glokler J等人，Molecules 15：2478-90(2010)；Liu Y等人，Lab Chip 9：1033-6(2009)。根据其它实施方案，针对与癌细胞的细胞表面上的表面抗原的特异性和高亲和力结合选择结合区域，其中所述抗原由癌细胞相对于非癌细胞过表达或优先表达。一些代表性的靶生物分子包括、但不限于与癌症和/或特定免疫细胞类型有关的以下列举的靶标。
许多以高亲和力结合与癌细胞有关的细胞外表位的免疫球蛋白型结合区域是技术人员已知的，诸如结合下述靶生物分子中的任一种的结合区域：膜联蛋白AI、B3黑素瘤抗原、B4黑素瘤抗原、CD2、CD3、CD4、CD19、CD20(B-淋巴细胞抗原蛋白CD20)、CD22、CD25(白介素-2受体IL2R)、CD30(TNFRSF8)、CD37、CD38(环状ADP核糖水解酶)、CD40、CD44(透明质烷受体)、ITGAV(CD51)、CD56、CD66、CD70、CD71(转铁蛋白受体)、CD73、CD74(HLA-DR抗原相关的不变链)、CD79、CD98、内皮糖蛋白(END、CD105)、CD106(VCAM-1)、CD138、趋化因子受体类型4(CDCR-4、融合素、CD184)、CD200、胰岛素-样生长因子1受体(CD221)、粘蛋白1(MUC1、CD227、CA6、CanAg)、基底细胞粘附分子(B-CAM、CD239)、CD248(内皮唾酸蛋白、TEM1)、肿瘤坏死因子受体10b(TNFRSF10B、CD262)、肿瘤坏死因子受体13B(TNFRSF13B、TACI、CD276)、血管内皮生长因子受体2(KDR、CD309)、上皮细胞粘附分子(EpCAM、CD326)、人表皮生长因子受体2(HER2、Neu、ErbB2、CD340)、癌抗原15-3(CA15-3)、癌抗原19-9(CA19-9)、癌抗原125(CA125、MUC16)、CA242、癌胚抗原相关的细胞粘附分子(例如CEACAM3(CD66d)和CEACAM5)、癌胚抗原蛋白(CEA)、胆碱转运蛋白-样蛋白4(SLC44A4)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSP4、MCSP、NG2)、CTLA4、δ-样蛋白(例如DLL3、DLL4)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶蛋白(例如ENPP3)、内皮缩血管肽受体(ETBRs)、表皮生长因子受体(EGFR、ErbB1)、叶酸受体(FOLR，例如FRα)、G-28、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、HLA-Dr10、HLA-DRB、人表皮生长因子受体1(HER1)、HER3/ErbB-3、Ephrin B型受体2(EphB2)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、成纤维细胞活化蛋白(FAP/seprase)、鸟苷酸环化酶c(GCC)、胰岛素-样生长因子1受体(IGF1R)、白介素2受体(IL-2R)、白介素6受体(IL-6R)、整联蛋白α-Vβ-3(αvβ3)、整联蛋白α-Vβ-5(αvβ5)、整联蛋白α-5β-1(α5β1)、L6、锌转运蛋白(LIV-1)、MPG、黑素瘤-相关的抗原1蛋白(MAGE-1)、黑素瘤-相关的抗原3(MAGE-3)、间皮素(MSLN)、金属还原酶STEAP1、MPG、MS4A、NaPi2b、连接素(例如连接素-4)、p21、p97、脊髓灰质炎病毒受体-样4(PVRL4)、蛋白酶激活受体(诸如PAR1)、前列腺特异性的膜抗原蛋白(PSMA)、SLIT和NTRK-样蛋白(例如SLITRK6)、Thomas-Friedenreich抗原、跨膜糖蛋白(GPNMB)、滋养层糖蛋白(TPGB、5T4、WAIF1)和肿瘤相关的钙信号转换器(TACSTD，例如Trop-2、EGP-1等)(参见例如Lui B等人，Cancer Res 64：704-10(2004)；Novellino L等人，Cancer Immunol Immunother 54：187-207(2005)；Bagley R等人，Int J Oncol 34：619-27(2009)；Gerber H等人，mAbs 1：247-53(2009)；Beck A等人，Nat Rev Immunol 10：345-52(2010)；和ersen J等人，J Biol Chem 287：22927-37(2012)；Nolan-Stevaux O等人，PLoS One 7：e50920(2012)；Rust S等人，Mol Cancer 12：11(2013))。该靶生物分子列表意图是非限制性的。技术人员会明白，与癌细胞或其它期望的细胞类型有关的任何期望的靶生物分子可以用于设计或选择可能适合用作本发明的细胞靶向分子的组分的结合区域。
与癌细胞强相关且被已知的免疫球蛋白型结合区域以高亲和力结合的其它靶生物分子的例子包括BAGE蛋白(B黑素瘤抗原)、基底细胞粘附分子(BCAM或Lutheran血型糖蛋白)、膀胱肿瘤抗原(BTA)、癌症-睾丸抗原NY-ESO-1、癌症-睾丸抗原LAGE蛋白、CD19(B-淋巴细胞抗原蛋白CD19)、CD21(补体受体-2或补体3d受体)、CD26(二肽基肽酶-4、DPP4或腺苷脱氨酶络合蛋白2)、CD33(结合唾液酸的免疫球蛋白型凝集素-3)、CD52(阿仑单抗(CAMPATH)-1抗原)、CD56、CS1(SLAM家族编号7或SLAMF7)、细胞表面A33抗原蛋白(gpA33)、EB病毒抗原蛋白、GAGE/PAGE蛋白(黑素瘤有关的癌症/睾丸抗原)、肝细胞生长因子受体(HGFR或c-Met)、MAGE蛋白、被T-细胞1蛋白识别的黑素瘤抗原(MART-1/MelanA、MARTI)、粘蛋白、黑素瘤(PRAME)蛋白的优先表达抗原、前列腺特异性抗原蛋白(PSA)、前列腺干细胞抗原蛋白(PSCA)、高级糖化终产物的受体(RAGE)、肿瘤相关的糖蛋白72(TAG-72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)和威尔曼瘤抗原。
与癌细胞强相关的其它靶生物分子的例子是碳酸酐酶IX(CA9/CAIX)、封闭蛋白蛋白(CLDN3、CLDN4)、ephrin A型受体3(EphA3)、叶酸结合蛋白(FBP)、神经节苷脂GM2、胰岛素-样生长因子受体、整联蛋白(诸如CDlla-c)、核因子κB的受体活化剂(RANK)、受体酪氨酸-蛋白激酶erB-3、肿瘤坏死因子受体10A(TRAIL-R1/DR4)、肿瘤坏死因子受体10B(TRAIL-R2)、生腱蛋白C和CD64(FcγRI)(参见Hough C等人，Cancer Res 60：6281-7(2000)；ThepenT等人，Nat Biotechnol 18：48-51(2000)；Pastan I等人，Nat Rev Cancer 6：559-65(2006)；Pastan，Annu Rev Med 58：221-37(2007)；Fitzgerald D等人，Cancer Res 71：6300-9(2011)；Scott A等人，Cancer Immun 12：14-22(2012))。该靶生物分子列表意图是非限制性的。
另外，存在预见到的靶生物分子的众多其它例子，例如，ADAM金属蛋白酶(例如ADAM-9、ADAM-10、ADAM-12、ADAM-15、ADAM-17)、ADP-核糖基转移酶(ART1、ART4)、抗原F4/80、骨髓基质抗原(BST1、BST2)、断裂点簇区域-c-ab1癌基因(BCR-ABL)蛋白、C3aR(补体组分3a受体)、CD7、CD13、CD14、CD15(Lewis X或阶段特异性的胚胎抗原1)、CD23(FCsRII)、CD45(蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型)、CD49d、CD53、CD54(细胞间粘附分子1)、CD63(四次穿膜蛋白)、CD69、CD80、CD86、CD88(补体组分5a受体1)、CD115(集落刺激因子1受体)、IL-1R(白介素-1受体)、CD123(白介素-3受体)、CD129(白介素9受体)、CD183(趋化因子受体CXCR3)、CD191(CCR1)、CD193(CCR3)、CD195(趋化因子受体CCR5)、CD203c、CD225(干扰素诱导的跨膜蛋白1)、CD244(天然杀伤细胞受体2B4)、CD282(Toll-样受体2)、CD284(Toll-样受体4)、CD294(GPR44)、CD305(白细胞-相关的免疫球蛋白-样受体1)、ephrin A型受体2(EphA2)、FceRIa、半乳糖凝集素-9、甲胎蛋白抗原17-A1蛋白、人天冬氨酰基(天冬酰胺酰基)β-羟化酶(HAAH)、免疫球蛋白-样转录物ILT-3、溶血磷脂甘油酰基转移酶1(LPGAT1/IAA0205)、溶酶体-相关的膜蛋白(LAMP，诸如CD107)、黑素细胞蛋白PMEL(gp100)、骨髓相关蛋白-14(mrp-14)、NKG2D配体(例如，云母、MICB、ULBP1、ULBP2、UL-16-结合蛋白、H-60s、Rae-1s和其同系物)、受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-3、SART蛋白、清道夫受体(诸如CD64和CD68)、Siglecs(结合唾液酸的免疫球蛋白型凝集素)、多配体聚糖(诸如SDC1或CD138)、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP-1)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)、酪氨酸酶相关抗原(TAA)、APO-3、BCMA、CD2、CD3、CD4、CD8、CD18、CD27、CD28、CD29、CD41、CD49、CD90、CD95(Fas)、CD103、CD104、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD152(CTLA-4)、趋化因子受体、补体蛋白、细胞因子受体、组织相容性蛋白、ICOS、干扰素-α、干扰素-β、c-myc、骨保护素、PD-1、RANK、TACI、TNF受体超家族成员(TNF-R1、TNFR-2)、Apo2/TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3和TRAIL-R4(参见Scott A等人，Cancer Immunity 12：14(2012)；Cheever M等人，Clin Cancer Res 15：5323-37(2009))，对于靶生物分子，并且指出本文所述的靶生物分子是非限制性例子)。
在某些实施方案中，所述结合区域包含能够以高亲和力特异性地结合至免疫系统的细胞类型的细胞表面上的免疫球蛋白型结合区域或基本上由其组成。例如，已知结合免疫细胞表面因子的免疫球蛋白型结合结构域，例如，CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11、CD12、CD13、CD14、CD15、CD16、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD40、CD41、CD56、CD61、CD62、CD66、CD95、CD117、CD123、CD235、CD146、CD326、白介素-1受体(IL-1R)、白介素-2受体(IL-2R)、核因子κB的受体活化剂(RANKL)、SLAM-相关的蛋白(SAP)和TNFSF18(肿瘤坏死因子配体18或GITRL)。
关于预见到用于用在本发明的分子中的靶生物分子和结合区域的其它例子，参见WO 2005/092917、WO 2007/033497、US2009/0156417、JP4339511、EP1727827、DE602004027168、EP1945660、JP4934761、EP2228383、US2013/0196928、WO 2014/164680、WO2014/164693、WO 2015/138435、WO 2015/138452、WO 2015/113005、WO 2015/113007、WO2015/191764、US20150259428、62/168,758、62/168,759、62/168,760、62/168,761、62/168,762、62/168,763和PCT/US2016/016580。
技术人员会明白，任何期望的靶生物分子可以用于设计或选择要与志贺毒素效应物多肽结合和/或偶联的合适结合区域以产生本发明的细胞靶向分子。
本文描述的以上结合区域中的任一种可以单独地或组合地与本发明的每个单独实施方案(包括本发明的方法)一起使用。
本发明的细胞靶向分子的一般结构是模块，因为多种不同的靶向细胞的结合区域可以与本发明的多种志贺毒素效应物多肽结合以建立本发明的不同细胞靶向分子，所述分子由于它们的结合区域的差异而表现出它们的细胞靶向活性的差异。这使本发明的细胞靶向分子的不同实施方案能够表现出多种细胞靶向活性，使得不同实施方案靶向不同类型的具有志贺毒素效应物功能的细胞，例如，白细胞郁滞、细胞毒性和外源物质的细胞内递送。此外，本发明的细胞靶向分子的某些实施方案由于它们各自的志贺毒素效应物多肽区域的差异而表现出某些特征，例如，当施用给脊索动物时的低抗原性和/或免疫原性，对某些蛋白酶的蛋白水解性裂解的抗性，当施用给多细胞生物时的高稳定性，在高剂量的体内耐受性，将载荷递送至细胞内位置的能力，和/或将T-细胞表位递送至MHC I类分子用于呈递在细胞表面上的能力。
为了本发明的目的，志贺毒素效应物多肽区域和靶向细胞的结合区域的具体次序或取向相对于彼此或在本发明的细胞靶向分子内没有固定，除非明确地指出。例如，当本发明的细胞靶向分子是具有氨基端和羧基端的融合蛋白时，本发明的组分的不同排列可以是合适的(参见例如图1)。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，如本文中所述限制它们的组分相对于彼此或在细胞靶向分子内的排列。例如，某些内质网保留/取回信号基序通常定位在本发明的细胞靶向分子的羧基端和/或本发明的细胞靶向分子的蛋白组分的羧基端。
C.KDEL家族成员的内质网保留/取回信号基序
本发明的细胞靶向分子的某些实施方案包含KDEL家族成员的一个或多个羧基端内质网保留/取回信号基序。在WO 2015/138435中描述的任何内质网保留/取回信号基序可以适合用于用作本发明的某些细胞靶向分子的组分。
就本发明的目的而言，短语“内质网保留/取回信号基序”、KDEL-型信号基序或信号基序表示，能够在真核细胞内起作用以促进本发明的细胞靶向分子或其组分通过KDEL受体亚细胞定位至内质网的任何KDEL家族成员。
羧基端赖氨酸-天冬酰胺-谷氨酸-亮氨酸(KDEL)序列(SEQ ID NO：514)是真核细胞中的可溶性蛋白的规范内质网保留和取回信号基序，且被KDEL受体识别(关于综述，参见，Capitani M，Sallese M，FEBS Lett583：3863-71(2009))。信号基序的KDEL家族包括许多KDEL-样基序，诸如HDEL(SEQ ID NO：515)、RDEL(SEQ ID NO：516)、WDEL(SEQ ID NO：517)、YDEL(SEQ ID NO：518)、HEEL(SEQ ID NO：519)、KEEL(SEQ ID NO：520)、REEL(SEQ IDNO：521)、KFEL(SEQ ID NO：522)、KIEL(SEQ ID NO：523)、DKEL(SEQ ID NO：524)、KKEL(SEQID NO：525)、HNEL(SEQ ID NO：526)、HTEL(SEQ ID NO：527)、KTEL(SEQ ID NO：528)和HVEL(SEQ ID NO：529)，它们都存在于已知停留于遍布多个系统发生界的内质网腔的蛋白的羧基端(Munro S，Pelham H，Cell 48：899-907(1987)；Raykhel I等人，J Cell Biol 179：1193-204(2007))。KDEL信号基序家族包括至少46种使用合成的构建体证实的多肽变体(Raykhel，J Cell Biol 179：1193-204(2007))。另外的KDEL信号基序包括ALEDEL(SEQ IDNO：530)、HAEDEL(SEQ ID NO：531)、HLEDEL(SEQ ID NO：532)、KLEDEL(SEQ ID NO：533)、IRSDEL(SEQ ID NO：534)、ERSTEL(SEQ ID NO：535)和RPSTEL(SEQ ID NO：536)(Alanen H等人，J Mol Biol 409：291-7(2011))。代表大多数KDEL信号基序的泛化共有基序已经被描述为[KRHQSA]-[DENQ]-E-L(Hulo N等人，Nucleic Acids Res 34：D227-30(2006))。
含有KDEL家族信号基序的蛋白被遍布于高尔基复合体的KDEL受体结合，且通过微管依赖性机制运输至内质网用于释放进内质网的腔中(Griffiths G等人，J Cell Biol127：1557-74(1994)；G，Rothman J，J Cell Biol 129：309-19(1995))。KDEL受体在高尔基复合体和内质网之间动态地循环(Jackson M等人，EMBOJ.9：3153-62(1990)；Schutze M等人，EMBO J.13：1696-1705(1994))。
就本发明的目的而言，KDEL家族的成员包括合成的信号基序，其能够在真核细胞内起作用以促进蛋白通过KDEL受体向内质网的亚细胞定位。换而言之，KDEL家族的一些成员可能不存在于自然界中，或已经在自然界中观察到但是已经或可以由技术人员使用本领域已知的方法构建和经验地验证；参见例如，Raykhel I等人，J Cell Biol 179：1193-204(2007)。
作为本发明的某些细胞靶向分子的组分，KDEL-型信号基序在细胞靶向分子内物理地定位、朝向或排列，使得它是在本发明的细胞靶向分子的多肽组分的羧基端上。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，结合区域和志贺毒素效应物多肽区域和/或内质网保留/取回信号基序可以彼此直接连接和/或适当地通过一个或多个插入组分(诸如用技术人员众所周知的和/或本文描述的一个或多个接头)彼此连接。
D.另外的外源物质
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含另外的外源物质。本文中使用的“另外的外源物质”表示一个或多个原子或分子，其经常通常不存在于志贺毒素和天然靶细胞中，其中本发明的细胞靶向分子可以用于将这样的物质特异性地运输至细胞内部。在一个意义上，本发明的整个细胞靶向分子是将进入细胞中的外源物质；因而，“另外的”外源物质是与除核心细胞靶向分子本身以外连接的异源物质。另外的外源物质的非限制性例子是放射性核苷、肽、检测促进剂、蛋白、小分子化学治疗剂和多核苷酸。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述另外的外源物质是一种或多种放射性核苷，例如，211At、131I、125I、90y、111In、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32p、60C和/或镥的放射性同位素。
在某些实施方案中，所述另外的外源物质包含促细胞凋亡的肽、多肽或蛋白，例如，BCL-2、胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶-3或胱天蛋白酶-6的片段)、细胞色素、颗粒蛋白酶B、细胞凋亡诱导因子(AIF)、BAX、tBid(截短的Bid)和促细胞凋亡的片段或其衍生物(参见例如，Ellerby H等人，Nat Med 5：1032-8(1999)；Mai J等人，Cancer Res 61：7709-12(2001)；Jia L等人，Cancer Res 63：3257-62(2003)；Liu Y等人，Mol Cancer Ther 2：1341-50(2003)；Perea S等人，Cancer Res 64：7127-9(2004)；Xu Y等人，JImmunol 173：61-7(2004)；B等人，Cell Death Differ 13：576-85(2006)；Wang T等人，CancerRes 67：11830-9(2007)；Kwon M等人，Mol Cancer Ther 7：1514-22(2008)；Qiu X等人，MolCancer Ther 7：1890-9(2008)；Shan L等人，Cancer Biol Ther 11：1717-22(2008)；WangF等人，Clin Cancer Res 16：2284-94(2010)；Kim J等人，J Virol 85：1507-16(2011))。
在某些实施方案中，所述另外的外源物质包含蛋白或多肽，包括酶。在某些其它实施方案中，所述另外的外源物质是核酸，诸如，例如作为小抑制RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)起作用的核糖核酸。在某些实施方案中，所述另外的外源物质是抗原，诸如从以下对象来源的抗原：病原体、细菌蛋白、病毒蛋白、在癌症中突变的蛋白、在癌症中异常地表达的蛋白或T-细胞互补决定区。例如，外源物质包括抗原，诸如被细菌感染的抗原呈递细胞特有的那些，和能够作为外源抗原起作用的T-细胞互补决定区。包含多肽或蛋白的外源物质可以任选地包含一种或多种抗原，无论是技术人员已知的还是未知的。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所有与志贺毒素效应物多肽有关的异种抗原和/或表位在细胞靶向分子氨基端至志贺毒素效应物多肽的志贺毒素A1片段区域的羧基端排列。在某些其它实施方案中，所有与志贺毒素效应物多肽有关的异种抗原和/或表位在志贺毒素效应物多肽的志贺毒素A1片段区域的氨基端至羧基端位置直接地或间接地与志贺毒素效应物多肽结合。在某些其它实施方案中，所有另外的外源物质(其为抗原)排列在志贺毒素效应物多肽的氨基端，例如，与志贺毒素效应物多肽的氨基端直接地或间接地融合。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述另外的外源物质是细胞毒性剂，例如，小分子化学治疗剂、抗肿瘤剂、细胞毒性的抗生素、烷化剂、抗代谢剂、拓扑异构酶抑制剂和/或微管蛋白抑制剂。适合用于与本发明一起使用的细胞毒性剂的非限制性例子包括氮杂环丙烷、顺铂、四嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、长春花生物碱、紫杉烷、喜树碱、依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌、替尼泊苷、新生霉素、阿柔比星、蒽环类抗生素、放线菌素、鹅膏蕈碱、鹅膏毒肽、博来霉素、centanamycin(吲哚羧酰胺)、普卡霉素、丝裂霉素、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、多拉司他汀、美坦辛、maytansionoids、duromycin、多西他赛、多卡米星、阿霉素、卡奇霉素、耳他汀、吡咯并苯并二氮杂环庚三烯、吡咯并苯并二氮杂环庚三烯二聚体(PBD)、卡铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨、丝裂霉素C、紫杉醇、1，3-双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲(BCNU)、利福平、顺铂、甲氨蝶呤、吉西他滨、醋葡醛内酯、番荔枝内酯(例如布拉他辛和布拉他辛酮)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、AG1478、AG1571、醛磷酰胺糖苷、烷基磺酸酯(例如，白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡)、烷化剂(例如塞替派和环磷酰胺)、氨基酮戊酸、氨基蝶呤、安吖啶、安西他滨、安曲霉素、阿糖胞苷、阿扎胞苷、偶氮丝氨酸、氮杂环丙烷(例如，苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa))、阿扎尿苷、bestrabucil、比生群、二膦酸盐(例如氯膦酸盐)、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素、放线菌素C、callystatin、carabicin、洋红霉素、卡莫氟、卡莫司汀、嗜癌霉素、CC-1065、苯丁酸氮芥、瘤可宁、萘氮芥、氯脲菌素、chromomycinis、色蛋白烯二炔抗生素生色团、CPT-11、念珠藻环肽(例如念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、道诺霉素、地磷酰胺(defofamine)、秋水仙胺、地托比星、地吖醌、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、二脱氧尿苷、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、去氧氟尿苷、多柔比星(例如，吗啉代多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉并多柔比星(2-pyrrolinodoxorubicin)和脱氧多柔比星)、达内霉素、依达曲沙(edatraxate)、依达曲沙、软珊瑚醇、elformithine、依利醋铵、烯二炔抗生素(例如卡奇霉素)、恩尿嘧啶、依诺他滨、表柔比星、埃博霉素、依索比星、埃斯波霉素、雌莫司汀、乙烯亚胺、2-乙基酰肼、依托格鲁、氟达拉滨、叶酸类似物(例如，二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤和三甲曲沙)、叶酸补充剂(例如亚叶酸(frolinic acid))、福莫司汀、氟维司群、gacytosine、硝酸镓、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、伊班膦酸盐、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、厄洛替尼、氟维司群、来曲唑、PTK787/ZK 222584(Novartis、Basel、CH)、奥沙利铂、亚叶酸、雷帕霉素、拉帕替尼、洛那法尼、索拉非尼、methylamelamine(例如，六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酸胺和三轻甲蜜胺(trimethylomelamine))、水鬼蕉碱、sarcodictyins、spongistatins、氮芥(例如，苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和尿嘧啶氮芥)、硝基脲(例如，卡莫司汀、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀)、达内霉素、新制癌菌素生色团、安曲霉素、地托比星、表柔比星、麻西罗霉素、丝裂霉素(例如丝裂霉素C)、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星、嘌呤类似物(例如，氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤)、嘧啶类似物(例如，安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷)、醋葡醛内酯、香菇多糖、lonidainine、美坦辛类(例如maytansins和安丝菌素)、米托胍腙、米托蒽醌、mopidanmol、nitraerine、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、鬼臼酸、2-乙基酰肼、根霉素、西佐喃(sizofuran)、锗螺胺、替奴佐酸、三亚胺醌、2，2′，2”三氯三乙胺、单端孢霉烯(例如，T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A和蛇行菌素)、乌拉坦、长春地辛、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、阿糖胞苷、环磷酰胺、类毒素(例如紫杉醇和多西紫杉醇)、6-硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、铂、铂类似物(例如顺铂和卡铂)、依托泊苷(VP-16)、米托蒽醌、长春瑞滨、诺肖林、道诺霉素、希罗达、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000、维A酸类(例如视黄酸)、卡培他滨、洛莫司汀、洛索蒽醌、巯基嘌呤、尼莫司汀、nitraerine、雷帕霉素、雷佐生、杆孢菌素A、spongistatins、链黑霉素、链佐星、索坦、T-2毒素、硫咪嘌呤、塞替派、类毒素(例如紫杉醇和多西紫杉醇)、杀结核菌素、疣孢菌素(verracurin)A、长春碱、长春新碱和前述任一种的结构类似物(例如合成类似物)和/或前述任一种的衍生物(参见例如，Lindell T等人，Science 170：447-9(1970)；Remillard S等人，Science 189：1002-5(1975)；Ravry M等人，Am J Clin Oncol 8：148-50(1985)；Ravry M等人，Cancer TreatRep 69：1457-8(1985)；Sternberg C等人，Cancer 64：2448-58(1989)；Bai R等人，BiochemPharmacol 39：1941-9(1990)；Boger D，Johnson D，Proc Natl Acad Sci USA92：3642-9(1995)；Beck J等人，Leuk Lymphoma 41：117-24(2001)；Cassady J等人，Chem Pharm Bull(Tokyo)52：1-26(2004)；Sapra P等人，Clin Cancer Res 11：5257-64(2005)；Okeley N等人，Clinc Cancer Res 16：888-97(2010)；Oroudjev E等人，Mol Cancer Ther 9：2700-13(2010)；Ellestad G，Chirality 23：660-71(2011)；Kantarjian H等人，Lancet Oncol 13：403-11(2012)；Moldenhauer G等人，J Natl Cancer Inst 104：622-34(2012)；Meulendijks D等人，Invest New Drugs 34：119-28(2016))。
E.本发明的细胞靶向分子的结构-功能关系
对于本发明的某些实施方案的细胞靶向分子，已经观察了三种具体结构-功能关系，例如，组分相对取向对细胞毒性效能的影响；弗林蛋白酶切割敏感性对某些剂量的体内耐受性的影响；弗林蛋白酶切割敏感性对体外稳定性的影响；弗林蛋白酶切割敏感性对体内半衰期的影响；和弗林蛋白酶切割敏感性对在多细胞生物中的体内非特异性毒性的影响。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，志贺毒素效应物多肽区域和结合区域的具体次序或取向是固定的，使得所述结合区域位于所述细胞靶向分子内相对于所述志贺毒素效应物多肽区域的氨基端在所述志贺毒素效应物多肽的羧基端区域的更近侧。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，志贺毒素效应物多肽区域在细胞靶向分子内的排列限于在所述细胞靶向分子的多肽组分的氨基端处和/或其近侧(参见图1)。例如，本发明的细胞靶向分子的某些实施方案包含：1)在所述志贺毒素效应物多肽区域的羧基端位置处在细胞靶向分子内定向的结合区域，2)在所述志贺毒素效应物多肽区域的氨基端的远侧位置(例如50、100、200或250个氨基酸残基或更大的距离)处与志贺毒素效应物多肽区域结合的结合区域，3)没有在空间上覆盖所述志贺毒素效应物多肽区域的氨基端的结合区域，和/或4)没有在空间上阻碍在所述志贺毒素效应物多肽区域的氨基端附近的结构的结合区域(参见例如图1；WO 2015138452)。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够表现出更佳的细胞毒性效能，例如，表现出为包含相同志贺毒素A亚基效应物多肽区域和结合区域的有关细胞靶向参比分子的3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更高的CD50值，其中所述结合区域1)在志贺毒素A亚基效应物多肽区域的氨基端，2)在所述志贺毒素效应物多肽区域的氨基端的近侧位置(例如小于50、40、30、20或10个氨基酸残基或更少的距离)处与志贺毒素效应物多肽区域结合，3)没有在空间上覆盖所述志贺毒素效应物多肽区域的氨基端，和/或4)没有在空间上阻碍在所述志贺毒素效应物多肽区域的氨基端附近的结构(参见例如图1；WO 2015/138452)。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素A亚基效应物多肽包含志贺毒素A1片段来源的区域，所述区域包含在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序(诸如位于志贺毒素A1片段区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割位点)(参见例如图1；WO 2015/191764)。在某些其它实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽与有关的参比分子(例如，包含野生型志贺毒素A亚基或志贺毒素A1片段的分子)相比更耐受弗林蛋白酶切割(参见例如WO 2015/191764)。在某些其它实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽表现出弗林蛋白酶切割的减少，其可再现地观察为比在相同条件下在相同测定中观察到的参比分子的弗林蛋白酶切割少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或更多(包括对于无切割而言100％)。在某些其它实施方案中，与有关的参比分子(例如，包含野生型志贺毒素A亚基或志贺毒素A1片段的分子)相比，所述志贺毒素效应物多肽更耐受弗林蛋白酶以外的蛋白酶切割。
本发明的某些细胞靶向分子表现出在包含野生型志贺毒素效应物多肽区域的参比分子的100倍、20倍、10倍、5倍或更小以内的细胞毒性潜力，尽管在所述志贺毒素效应物多肽中缺乏被破坏的弗林蛋白酶切割基序的任何补偿结构特征。对于包含没有维持弗林蛋白酶切割事件的志贺毒素A亚基来源的区域的细胞靶向分子，即包含不被靶细胞中的弗林蛋白酶切割的志贺毒素A亚基来源的组分的分子，保留最大细胞毒性的一种替代方案是补偿。细胞毒性分子中志贺毒素A亚基区域的弗林蛋白酶切割的缺乏的补偿，可能通过以“预加工的”形式呈递志贺毒素A亚基区域来完成。例如，可以构建包含志贺毒素A亚基区域的细胞靶向分子，使得志贺毒素A亚基来源的多肽的羧基端1)在所述分子的羧基端的近侧，和2)在弗林蛋白酶切割以后匹配或类似于天然志贺毒素A1片段(参见WO 2015/191764)。在本发明的某些细胞靶向分子中不需要这样的补偿，而是有意地避免它，以便提供一种或多种功能，例如，在某些剂量提高的体内耐受性；增加的体外稳定性；增加的体内半衰期；和/或在多细胞生物中降低的体内非特异性毒性。对于某些实施方案，这些有益的功能存在，与包含野生型志贺毒素效应物多肽的参比分子相比，本发明的细胞靶向分子的细胞毒性效能没有任何显著下降。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含含有志贺毒素A1片段来源的区域的志贺毒素A亚基效应物多肽，所述区域包含在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序(诸如位于志贺毒素A1片段区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割位点)(参见例如图1；WO 2015/191764)，但是不包含在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端近侧和/或位于志贺毒素效应物多肽和相对大的分子部分之间的任何补偿蛋白酶切割位点(例如大于4.5kDa、6kDa、9kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、28kDa、30kDa、41kDa或50kDa的大小的结合区域)。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含与有关的参比分子相比更耐受弗林蛋白酶切割的志贺毒素效应物多肽，所述参比分子是例如包含野生型志贺毒素A亚基或志贺毒素A1片段的分子(参见例如WO 2015/191764)。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子表现出与在相同条件下在相同测定中观察到的参比分子的弗林蛋白酶切割相比少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的弗林蛋白酶切割的减少，同时所述细胞靶向分子表现出在包含野生型志贺毒素效应物多肽区域的参比分子的100倍、20倍、10倍、5倍或更小内的细胞毒性效能。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子表现出与有关的参比分子相比体内耐受性的提高，所述参比分子包含在它的志贺毒素A1片段区域的羧基端处具有野生型弗林蛋白酶切割基序和/或野生型弗林蛋白酶切割位点的志贺毒素效应物多肽(参见例如WO 2015/191764)。例如，通过在施用相同剂量的不同分子的实验动物组中对比死亡率、发病征象和/或某些临床征象的测量结果，可以确定体内耐受性的增加(参见例如下面实施例；WO 2015/191764)。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含含有志贺毒素A1片段来源的区域的志贺毒素A亚基效应物多肽，所述区域包含在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序(诸如位于志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割位点)(参见例如图1；WO 2015/191764)。对于某些其它实施方案，本发明的包含细胞毒性组分的细胞靶向分子，所述细胞靶向分子表现出与蛋白酶切割更敏感的变体相比降低的非特异性毒性，所述变体具有更大的分解并由此从结合区域释放细胞毒性组分的倾向，特别是当施用给活物质(例如，细胞群体、组织和/或生物体)时。此外，本发明的某些蛋白酶切割抗性的细胞靶向分子在施用给活物质(例如，某些脊索动物)以后可以表现出与蛋白酶切割更敏感的变体相比增加的体内半衰期，这基于在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序给细胞靶向分子赋予的蛋白酶切割抗性。
III.本发明的连接组分和/或它们的亚组分
本发明的细胞靶向分子的各个靶向细胞的结合区域、志贺毒素效应物多肽和/或组分可以通过本领域众所周知的和/或本文描述的一个或多个接头适当地彼此连接。结合区域的各个多肽亚组分，例如重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、CDR和/或ABR区域，可以通过本领域众所周知的和/或本文描述的一个或多个接头适当地彼此连接。本发明的蛋白性组分，例如，多链结合区域，可以适当地通过本领域众所周知的一个或多个接头彼此连接或与本发明的其它多肽组分连接。本发明的肽组分，例如，KDEL家族内质网保留/取回信号基序，可以适当地通过本领域众所周知的一个或多个接头(诸如蛋白性接头)与本发明的另一种组分连接。
合适的接头通常是允许本发明的每种多肽组分以三维结构折叠的那些接头，所述三维结构非常类似于没有任何接头或其它组分单独地生产的多肽组分。合适的接头包括单个氨基酸、肽、多肽和缺乏前述任一种的接头，诸如各种非蛋白性碳链，无论是支链的还是环状的。
合适的接头可以是蛋白性的，且包含一个或多个氨基酸、肽和/或多肽。蛋白性接头适合用于重组融合蛋白和化学连接的缀合物。蛋白性接头通常具有约2至约50个氨基酸残基，例如，约5至约30个或约6至约25个氨基酸残基。选择的接头的长度将取决于多种因素，例如，选择接头时所针对的期望的一种或多种性质。在某些实施方案中，所述接头是蛋白性的且连接在本发明的蛋白组分的末端附近，通常在末端的约20个氨基酸内。
合适的接头可以是非蛋白性的，诸如，例如化学接头。本领域已知的多种非蛋白性接头可以用于将靶向细胞的结合区域连接至本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应物多肽组分，诸如常用于将免疫球蛋白多肽缀合至异源多肽的接头。例如，使用它们的氨基酸残基和碳水化合物部分(例如，羧基、胺、巯基、羧酸、羰基、羟基和/或环状环基)的功能侧链，可以连接多肽区域。例如，可以使用二硫键和硫醚键来连接两个或更多个多肽。另外，非天然的氨基酸残基可以与其它功能侧链(诸如酮基)一起使用。非蛋白性的化学接头的例子包括、但不限于：N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯，S-(N-琥珀酰亚胺基)硫代乙酸酯(SATA)，N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-cu-甲基-a-(2-吡啶基二硫基)甲苯(SMPT)，N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)-戊酸酯(SPP)，琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(SMCC或MCC)，磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯，4-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯，磺基琥珀酰亚胺基-6-(α-甲基-α-(吡啶基二硫醇)-甲苯酰氨基)己酸酯，N-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫基)-丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基6(3(-(-2-吡啶基二硫基)-丙酰氨基)己酸酯，磺基琥珀酰亚胺基6(3(-(-2-吡啶基二硫基)-丙酰氨基)己酸酯，马来酰亚胺基己酰基(MC)，马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧基羰基(MC-vc-PAB)，3-马来酰亚胺基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)，α-烷基衍生物，磺基NHS-ATMBA(磺基琥珀酰亚胺基N-[3-(乙酰基硫基)-3-甲基丁酰基-β-丙氨酸])，磺基二氯苯酚，2-亚氨基硫杂环戊烷，3-(2-吡啶基二硫基)-丙酰基酰肼，Ellman氏试剂，二氯三嗪酸，和S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸。
合适的接头(无论是蛋白性的还是非蛋白性的)可以包括，例如，蛋白酶敏感的、环境氧化还原电位敏感的、pH敏感的、酸可切割的、光可裂解的和/或热敏感的接头。
可以选择蛋白性接头用于掺入本发明的重组融合细胞靶向分子中。对于本发明的重组融合细胞靶向蛋白，接头通常包含约2-50个氨基酸残基，优选约5-30个氨基酸残基。蛋白性接头通常包含大多数具有极性的、不带电荷的和/或带电荷的残基的氨基酸残基，例如，苏氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸。蛋白性接头的非限制性例子包括丙氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸(ASGGPE)(SEQ ID NO：538)、缬氨酸-甲硫氨酸(VM)、丙氨酸-甲硫氨酸(AM)、AM(G2-4S)xAM(SEQ ID NO：539)，其中G是甘氨酸，S是丝氨酸，且x是1-10的整数。
可以基于期望的性能选择蛋白性接头。技术人员可以记住特定特征来选择蛋白性接头，诸如为了优化以下的一种或多种：融合分子的折叠、稳定性、表达、溶解度、药代动力学性能、药效动力学性能和/或在融合构建体的背景下与相同结构域本身的活性相比融合的结构域的活性。例如，可以基于柔性、刚度和/或可切割性来选择蛋白性接头。当选择接头时，技术人员可以使用数据库和接头设计软件工具。可以选择某些接头来优化表达。可以选择某些接头来促进相同多肽或蛋白之间的分子间相互作用以形成同多聚体或不同的多肽或蛋白以形成杂多聚体。例如，可以选择蛋白性接头，其允许本发明的细胞靶向分子的多肽组分之间的期望的非共价相互作用，例如，与二聚体和其它更高级多聚体的形成有关的相互作用。
柔性的蛋白性接头经常是大于12个氨基酸残基的长度，且富含小的、非极性的氨基酸残基、极性的氨基酸残基和/或亲水的氨基酸残基，例如，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸。可以选择柔性的蛋白性接头来增加组分之间的空间分离和/或允许组分之间的分子内相互作用。例如，多种“GS”接头是技术人员已知的，且由多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸组成，有时在重复单元中，例如，(GxS)n(SEQ ID NO：540)、(SxG)n(SEQ ID NO：541)、(GGGGS)n(SEQID NO：542)和(G)n(SEQ ID NO：543)，其中x是1-6，且n是1-30。柔性的蛋白性接头的非限制性例子包括GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO：544)、EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO：545)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO：546)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQ ID NO：547)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：548)、SRSSG(SEQ ID NO：549)和SGSSC(SEQ ID NO：550)。
刚性的蛋白性接头经常是硬的α-螺旋结构且富含脯氨酸残基和/或一个或多个在战略上放置的脯氨酸。可以选择刚性的接头来阻止连接的组分之间的分子内相互作用。
可以选择合适的接头以允许组分的体内分离，例如，由于切割和/或环境特异性的不稳定性。体内可切割的蛋白性接头能够在生物体内或在某个细胞类型中通过蛋白水解性加工和/或还原环境而解链，经常在特定位点处。体内可切割的蛋白性接头经常包含蛋白酶敏感的基序和/或由一个或多个半胱氨酸对形成的二硫键。可以将体内可切割的蛋白性接头设计成对仅存在于生物体内的某些位置、细胞内的区室处的蛋白酶敏感，和/或仅在某些生理学或病理学状况下变得有活性(例如，涉及具有异常高水平的蛋白酶，在某些疾病部位过表达的蛋白酶，和由病原性微生物特异性地表达的蛋白酶)。例如，存在本领域已知的被仅存在于细胞内的蛋白酶、仅存在于特定细胞类型内的蛋白酶和仅在病理学状况如癌症或炎症下存在的蛋白酶切割的蛋白性接头，例如，R-x-x-R基序和AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM(SEQ ID NO：551)。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，可以使用包含一个或多个蛋白酶敏感的位点的接头以提供存在于靶细胞内的蛋白酶的切割。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，可以使用不可切割的接头来降低在施用给脊椎动物生物以后不希望的毒性。
合适的接头可以包括，例如，蛋白酶敏感的、环境氧化还原电位敏感的、pH敏感的、酸可切割的、光可裂解的和/或热敏感的接头，无无论是蛋白性的还是非蛋白性的(参见例如，Doronina S等人，Bioconjug Chem 17：114-24(2003)；Saito G等人，Adv Drug DelivRev 55：199-215(2003)；Jeffrey S等人，J Med Chem 48：1344-58(2005)；Sanderson R等人，Clin Cancer Res 11：843-52(2005)；Erickson H等人，Cancer Res 66：4426-33(2006)；Chen X等人，Adv Drug Deliv Rev 65：1357-69(2013))。合适的可切割的接头可以包括包含本领域已知的可切割基团的接头。
合适的接头可以包括pH敏感的接头。例如，可以由于它们在较低pH环境中的不稳定性而选择某些合适的接头以提供在靶细胞的亚细胞区室内的解离(参见例如，van DerVelden V等人，Blood 97：3197-204(2001)；Ulbrich K，Subr V，Adv Drug Deliv Rev 56：1023-50(2004))。例如，包含一个或多个三苯甲基、衍生化的三苯甲基、bismaleimideothoxy丙烷基、己二酸二酰肼基和/或酸不稳定的转铁蛋白基团的接头可以提供本发明的细胞靶向分子的组分(例如多肽组分)在具有特定pH范围的环境中的释放。可以选择某些接头，其在与组织之间的生理pH差异对应的pH范围中被切割，例如，肿瘤组织的pH低于在健康的组织中。
光可裂解的接头是在暴露于某些波长范围的电磁辐射(诸如在可见范围中的光)后被切割的接头。光可裂解的接头可以用于在暴露于某些波长的光以后释放本发明的细胞靶向分子的组分，例如多肽组分。光可裂解的接头的非限制性例子包括硝基苄基(作为半胱氨酸的光可裂解的保护基)、硝基苄氧基碳酰氯交联剂、羟丙基甲基丙烯酰胺共聚物、甘氨酸共聚物、荧光素共聚物和甲基罗丹明共聚物。光可裂解的接头可以在连接组分中具有特定用途以形成为治疗疾病、病症和病患而设计的本发明的细胞靶向分子，其可以使用纤维光学暴露于光。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，使用任何数目的技术人员已知的方式，包括共价和非共价键，将靶向细胞的结合区域连接至本发明的志贺毒素效应物多肽。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述分子包含结合区域，所述结合区域是具有连接重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域的接头的scFv。存在众多本领域已知适合用于此目的的接头，例如，15-残基(Gly4Ser)3肽(SEQ ID NO：552)。可以用于形成非共价多价结构的合适的scFv接头包括GGS(SEQ ID NO：553)、GGGS(SEQ ID NO：554)、GGGGS(SEQ ID NO：555)、GGGGSGGG(SEQ ID NO：556)、GGSGGGG(SEQ ID NO：557)、GSTSGGGSGGGSGGGGSS(SEQ ID NO：558)和GSTSGSGKPGSSEGSTKG(SEQ ID NO：559)。
用于连接本发明的细胞靶向分子的组分的合适方法可以是通过本领域目前已知的用于完成该目的的任意方法，只要所述连接不会实质上阻碍靶向细胞的结合区域的结合能力、志贺毒素效应物多肽组分的细胞内化和/或通过适当测定(包括本文描述的测定)测量的适当的期望的志贺毒素效应物功能。
为了本发明的细胞靶向分子的目的，具体次序或取向对于以下组分而言不是固定的：志贺毒素效应物多肽、结合区域和任何任选的接头，相对于彼此或整个细胞靶向分子(参见例如图1)，除非特别指出。本发明的细胞靶向分子的组分可以以任何次序排列，前提条件是，不会消除结合区域和志贺毒素效应物多肽的期望活性。
IV.本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子的结构变体的例子
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽可以包含截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成。志贺毒素A亚基的截短可能导致整个表位和/或表位区域、B-细胞表位、CD4+ T-细胞表位和/或弗林蛋白酶切割位点的缺失，而不影响志贺毒素效应物功能，例如，催化活性和细胞毒性。经证实会表现出完全酶活性的最小志贺毒素A亚基片段是由Slt1A的残基1-239组成的多肽(LaPointe P等人，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。经证实会表现出显著酶活性的最小志贺毒素A亚基片段是由StxA的残基75-247组成的多肽(Al-Jaufy A等人，Infect Immun 62：956-60(1994))。
尽管本发明的志贺毒素效应物多肽通常可能小于全长志贺毒素A亚基，优选的是，本发明的细胞靶向分子的志贺毒素效应物多肽区域维持氨基酸位置77-239的多肽区域(SLT-1A(SEQ ID NO：1)或StxA(SEQ ID NO：2))或志贺毒素家族的成员的其它A亚基中的等同区域(例如77-238(SEQ ID NO：3))。例如，在本发明的分子的某些实施方案中，从SLT-1A来源的本发明的志贺毒素效应物多肽可以包含SEQ ID NO：1的氨基酸75-251、SEQ ID NO：1的氨基酸1-241、SEQ ID NO：1的氨基酸1-251、或SEQ ID NO：1的氨基酸1-261或基本上由其组成，其中与野生型志贺毒素A亚基相比，至少一个氨基酸残基发生突变或已经在内源性表位和/或表位区域中删除，和/或其中在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处存在被破坏的弗林蛋白酶切割基序区域。类似地，从StxA来源的志贺毒素效应物多肽区域可以包含SEQID NO：2的氨基酸75-251、SEQ ID NO：2的氨基酸1-241、SEQ ID NO：2的氨基酸1-251或SEQID NO：2的氨基酸1-261或基本上由其组成，其中与野生型志贺毒素A亚基相比，至少一个氨基酸残基发生突变或已经在内源性表位和/或表位区域中删除，和/或其中在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处存在被破坏的弗林蛋白酶切割基序区域。另外，从SLT-2来源的志贺毒素效应物多肽区域可以包含SEQ ID NO：3的氨基酸75-251、SEQ ID NO：3的氨基酸1-241、SEQ ID NO：3的氨基酸1-251或SEQ ID NO：3的氨基酸1-261或基本上由其组成，其中与野生型志贺毒素A亚基相比，至少一个氨基酸残基发生突变或已经在内源性表位和/或表位区域中删除，和/或其中在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处存在被破坏的弗林蛋白酶切割基序区域。
本发明还提供了本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子的变体，其中所述志贺毒素效应物多肽与天然存在的志贺毒素A亚基的差别在于仅或多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40个或更多个氨基酸残基(但是不超过保留至少85％、90％、95％、99％或更多氨基酸序列同一性的程度)。因而，从志贺毒素家族的成员的A亚基来源的本发明的分子可以包含从原始序列的添加、缺失、截短或其它改变，只要维持与天然存在的志贺毒素A亚基的至少85％、90％、95％、99％或更多氨基酸序列同一性，且其中与野生型志贺毒素A亚基相比至少一个氨基酸残基发生突变或已经在内源性表位和/或表位区域中删除，和/或其中在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处存在被破坏的弗林蛋白酶切割基序区域。
因此，在某些实施方案中，本发明的分子的志贺毒素效应物多肽包含与天然存在的志贺毒素A亚基具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％总序列同一性的氨基酸序列或基本上由其组成，诸如SLT-1A(SEQ ID NO：1)、StxA(SEQ ID NO：2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO：3)，其中与野生型志贺毒素A亚基相比，至少一个氨基酸残基发生突变或已经在内源性表位和/或表位区域中删除，和/或其中在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处存在被破坏的弗林蛋白酶切割基序区域。
任选地，志贺毒素A亚基的全长或截短形式可以包含本发明的分子的志贺毒素效应物多肽区域，其中所述志贺毒素来源的多肽包含相对于天然存在的志贺毒素的一个或多个突变(例如置换、缺失、插入或倒位)。在本发明的某些实施方案中优选的是，所述志贺毒素效应物多肽具有与天然存在的志贺毒素A亚基的足够序列同一性以保留在进入细胞以后的细胞毒性，无论是通过众所周知的宿主细胞转化、转染、感染或诱导的方法，还是通过由与志贺毒素效应物多肽连接的靶向细胞的结合区域介导的内化。已经将对于志贺毒素A亚基的酶活性和/或细胞毒性而言最关键的残基映射至下述残基-位置：天冬酰胺-75、酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170和精氨酸-176以及其它(Di R等人，Toxicon 57：525-39(2011))。在本发明的任一个实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽可以优选地但不一定在某些位置维持一个或多个保守氨基酸，诸如在StxA、SLT-1A中的位置77、167、170和176处发现的那些，或在志贺毒素家族的其它成员中的细胞毒性活性通常所需的等同保守位置。使用本领域众所周知的许多测定中的任意一个或多个，可以测量本发明的细胞毒性分子的造成细胞死亡的能力，例如它的细胞毒性。
A.去免疫化的志贺毒素效应物多肽的例子
在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽可以基本上由具有两个或更多个突变的截短的志贺毒素A亚基组成。志贺毒素A亚基的截短可能导致整个表位和/或表位区域、B-细胞表位、CD4+T-细胞表位和/或弗林蛋白酶切割位点的缺失，而不影响志贺毒素效应物功能，例如，催化活性和细胞毒性。将SLT-1A、StxA或SLT-2A的羧基端截短至氨基酸1-251会除去两个预测的B-细胞表位区域、两个预测的CD4阳性的(CD4+)T-细胞表位和一个预测的不连续的B-细胞表位。将SLT-1A、StxA或SLT-2A的氨基端截短至75-293会除去至少三个预测的B-细胞表位区域和三个预测的CD4+ T-细胞表位。将SLT-1A、StxA或SLT-2A的氨基端和羧基端截短至75-251会删除至少五个预测的B-细胞表位区域、四个假定的CD4+ T-细胞表位和一个预测的不连续的B-细胞表位。
在某些实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽可以包含在提供的内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域中具有至少一个突变(相对于野生型志贺毒素多肽)(例如缺失、插入、倒位或置换)的全长或截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含含有突变(相对于野生型志贺毒素多肽)的破坏，所述突变包括在内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域内的至少一个氨基酸残基的缺失。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含破坏，所述破坏包含在内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域内的至少一个氨基酸残基的插入。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含含有氨基酸残基的倒位的破坏，其中至少一个倒转的氨基酸残基是在内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域内。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含含有突变(相对于野生型志贺毒素多肽)的破坏，所述突变是例如，氨基酸置换、对非标准氨基酸的氨基酸置换和/或具有化学修饰的侧链的氨基酸残基。适合用在本发明中的去免疫化的志贺毒素效应物亚区域的非限制性例子描述在WO2015/113005、WO 2015/113007和WO 2015/191764中。在实施例中提供了包含氨基酸置换的本发明的志贺毒素效应物多肽的众多非限制性例子。
在其它实施方案中，本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽包含比全长志贺毒素A亚基更短的截短的志贺毒素A亚基，其中在实施例(参见例如表1-7和/或表B)所提供的天然地定位的B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域中破坏了至少一个氨基酸残基。
为了制备去免疫化的志贺毒素效应物多肽，原则上通过多种方式修饰所提供的表位区域中的任何氨基酸残基可以导致表位的破坏，例如，代表相对于野生型志贺毒素多肽的缺失、插入、倒位、重排、置换和侧链化学修饰的修饰。但是，修饰某些氨基酸残基和使用某些氨基酸修饰更可能成功地降低抗原性和/或免疫原性，同时维持某种水平的志贺毒素效应物功能。例如，末端截短和内部氨基酸置换是优选的，因为这些类型的修饰会维持志贺毒素效应物多肽中的氨基酸残基的总间距，且因而更可能维持志贺毒素效应物多肽结构和功能。
在本发明的某些实施方案中，所述去免疫化的志贺毒素效应物多肽包含SLT-1A(SEQ ID NO：1)、StxA(SEQ ID NO：2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO：3)的氨基酸75-251或基本上由其组成，其中在实施例(参见例如表1-7和/或12)所提供的天然地定位的表位区域中破坏至少一个氨基酸残基。在某些其它实施方案中是包含SLT-1A(SEQ ID NO：1)、StxA(SEQ IDNO：2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO：3)的氨基酸1-241或基本上由其组成的去免疫化的志贺毒素效应物多肽，其中在实施例(参见例如表1-7和/或12)所提供的天然地定位的表位区域中破坏至少一个氨基酸残基。其它实施方案是包含SLT-1A(SEQ ID NO：1)、StxA(SEQ ID NO：2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO：3)的氨基酸1-251或基本上由其组成的去免疫化的志贺毒素效应物多肽，其中在实施例(参见例如表1-7和/或12)所提供的天然地定位的表位区域中破坏至少一个氨基酸残基。其它实施方案是包含SLT-1A(SEQ ID NO：1)、StxA(SEQ ID NO：2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO：3)的氨基酸1-261的志贺毒素效应物多肽，其中在实施例(参见例如表1-7和/或12)所提供的天然地定位的表位区域中破坏至少一个氨基酸残基。
存在众多不同的可以用于建立本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽的内部氨基酸置换。在要用在表位区域内的可能置换氨基酸中，预测下述置换氨基酸残基最可能降低表位的抗原性和/或免疫原性-G、D、E、S、T、R、K和H。除了甘氨酸以外，这些氨基酸残基都可以归类为极性的和/或带电荷的残基。在要置换的可能氨基酸中，预测下述氨基酸A、G、V、L、I、P、C、M、F、S、D、N、Q、H和K最可能降低抗原性和/或免疫原性，同时保留显著水平的志贺毒素效应物功能，取决于要置换的氨基酸。通常，所述置换会将极性的和/或带电荷的氨基酸残基改变为非极性的和不带电荷的残基(参见例如WO 2015/113005)。另外，可能有益的是，减小氨基酸残基的R-基团功能侧链的总大小和/或长度的表位破坏(参见例如WO2015/113005)。但是，尽管置换的这些一般性最可能赋予表位破坏，因为目标是保留显著的志贺毒素效应物功能，如果置换氨基酸类似于被置换的氨基酸，它可能更可能保留志贺毒素效应物功能，例如，类似大小的非极性的和/或不带电荷的残基置换极性的和/或带电荷的残基。
在下面实施例中和在WO 2015/113005中，已经经验地试验了许多突变对多种志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子的志贺毒素效应物功能的影响。表B总结了在实施例中和在WO 2015/113005中描述的结果，其中氨基酸置换(单独地或与一个或多个其它置换组合地)没有阻止志贺毒素效应物功能的高效水平的表现。表B使用在下面实施例中描述的表位区域编号方案(参见下面实施例1-表7)。
表B.在志贺毒素效应物多肽中的氨基酸置换
基于在本文实施例中和在WO 2015/113005中的实验证据，预测志贺毒素的A亚基中的某些氨基酸位置会耐受表位破坏，同时仍然保留显著的志贺毒素效应物功能。例如，下述天然地存在的位置耐受氨基酸置换(单独地或组合地)，同时保留志贺毒素效应物功能诸如细胞毒性-SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的4；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的8；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的9；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的11；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的33；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的43；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的44；SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的45；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的46；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的47；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的48；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的49；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的50；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的51；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的53；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的54；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的55；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的56；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的57；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的58；SEQID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的59；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的60；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的61；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的62；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的84；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的88；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94；SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的96；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的104；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的105；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的107；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的108；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的109；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的110；SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的111；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的112；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的141；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的147；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的154；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的179；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的180；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的181；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3的183；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的184；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的185；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的186；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的187；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的188；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的189；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的198；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205；SEQ ID NO：3的241；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的242；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的247；SEQ ID NO：3的247；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的248；SEQ ID NO：3的250；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的251；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的264；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的265；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的286。
在实施例中和在WO 2015/113005中的经验数据指向其它破坏表位的置换和破坏表位的置换的组合，它们可以降低志贺毒素效应物多肽的抗原性和/或免疫原性，同时保留志贺毒素效应物多肽的表现出显著志贺毒素效应物功能的能力，例如，前述截短和耐受置换的位置以及在有关志贺毒素A亚基的相同位置或保守位置处的新置换的新组合。
可预测的是，对本文试验的置换的保守官能团的氨基酸残基的其它氨基酸置换可以降低抗原性和/或免疫原性，同时保留显著的志贺毒素效应物功能。例如，技术人员已知与K1A、K1M、T4I、D6R、S8I、T8V、T9I、S9I、K11A、K11H、T12K、S33I、S33C、S43N、G44L、S45V、S45I、T45V、T45I、G46P、D47M、D47G、N48V、N48F、L49A、F50T、A51V、D53A、D53N、D53G、V54L、V54I、R55A、R55V、R55L、G56P、I57F、I57M、D58A、D58V、D58F、P59A、P59F、E60I、E60T、E60R、E61A、E61V、E61L、G62A、R84A、V88A、D94A、S96I、T104N、A105L、T107P、L108M、S109V、T109V、G110A、D111T、S112V、D141A、G147A、V154A、R179A、T180G、T181I、D183A、D183G、D184A、D184A、D184F、L185V、L185D、S186A、S186F、G187A、G187T、R188A、R188L、S189A、D198A、R204A、R205A、C242S、S247I、Y247A、R248A、R250A、R251A或D264A、G264A、T286A和/或T286I中的任一个类似的其它置换可以破坏内源性表位，同时维持至少一种志贺毒素效应物功能。具体地，与K1A、K1M、T4I、S8I、T8V、T9I、S9I、K11A、K11H、S33I、S33C、S43N、G44L、S45V、S45I、T45V、T45I、G46P、D47M、N48V、N48F、L49A、A51V、D53A、D53N、V54L、V54I、R55A、R55V、R55L、G56P、I57F、I57M、D58A、D58V、D58F、P59A、E60I、E60T、E61A、E61V、E61L、G62A、R84A、V88A、D94A、S96I、T104N、T107P、L108M、S109V、T109V、G110A、D111T、S112V、D141A、G147A、V154A、R179A、T180G、T181I、D183A、D183G、D184A、D184F、L185V、S186A、S186F、G187A、R188A、R188L、S189A、D198A、R204A、R205A、C242S、S247I、Y247A、R248A、R250A、R251A、D264A、G264A、T286A和T286I类似的对保守氨基酸残基的氨基酸置换可以具有相同的或类似的效果。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽可以包含与经验地试验的那些类似的保守氨基酸置换，例如，K1至G、V、L、I、F和H；T4至A、G、V、L、F、M和S；S8至A、G、V、L、F和M；T9至A、G、L、F、M和S；S9至A、G、L、I、F和M；K11至G、V、L、I、F和M；S33至A、G、V、L、F和M；S43至A、G、V、L、I、F和M；S45至A、G、L、F和M；T45至A、G、L、F和M；D47至A、V、L、I、F、S和Q；N48至A、G、L和M；L49至G；Y49至A；D53至V、L、I、F、S和Q；R55至G、I、F、M、Q、S、K和H；D58至G、L、I、S和Q；P59至G；E60至A、G、V、L、F、S、Q、N、D和M；E61至G、I、F、S、Q、N、D、M和R；R84至G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；V88至G；I88至G；D94至G、V、L、I、F、S和Q；S96至A、G、V、L、F和M；T107至A、G、V、L、I、F、M和S；S107至A、G、V、L、I、F和M；S109至A、G、I、L、F和M；T109至A、G、I、L、F、M和S；S112至A、G、L、I、F和M；D141至V、L、I、F、S和Q；V154至G；R179至G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；T180至A、V、L、I、F、M和S；T181至A、G、V、L、F、M和S；D183至V、L、I、F、S和Q；D184至G、V、L、I、S和Q；S186至G、V、I、L和M；R188至G、V、I、F、M、Q、S、K和H；S189至G、V、I、L、F和M；D197至V、L、I、F、S和Q；D198至A、V、L、I、F、S和Q；R204至G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R205至G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；S247至A、G、V、I、L、F和M；Y247至A、G、V、L、I、F和M；R248至G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R250至G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R251至G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；D264至A、G、V、L、I、F、S和Q；和T286至A、G、V、L、I、F、M和S。
类似地，除去电荷、极性和/或减小侧链长度的氨基酸置换可以破坏表位，同时维持至少一种志贺毒素效应物功能。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽可以包含一个或多个被置换破坏的表位，使得侧链电荷被除去，极性被除去，和/或侧链长度减小，例如，用选自下述组A、G、V、L、I、P、C、M、F、S、D、N、Q、H或K的适当氨基酸置换在以下位置处的氨基酸残基：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3的4；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的6；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的8；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的9；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的11；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的12；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的33；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的43；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的44；SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的45；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的46；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的47；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的48；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的49；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的50；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的51；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的53；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的54；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的55；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的56；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的57；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3的58；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的59；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的60；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的61；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的62；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的84；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的88；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的96；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的104；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的105；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3的107；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的108；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的109；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的110；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的111；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的112；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的141；SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：3的147；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的154；SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的179；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的180；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的181；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的183；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQID NO：3的184；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的185；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3的186；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的187；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的188；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的189；SEQ ID NO：3的197；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的198；SEQ IDNO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205；SEQ ID NO：3的241；SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的242；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的247；SEQ ID NO：3的247；SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的248；SEQ ID NO：3的250；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的251；SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的264；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的265；和SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的286。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽可以包含下述氨基酸置换中的一个或多个：K1至A、G、V、L、I、F、M和H；T4至A、G、V、L、I、F、M和S；D6至A、G、V、L、I、F、S和Q；S8至A、G、V、I、L、F和M；T8至A、G、V、I、L、F、M和S；T9至A、G、V、I、L、F、M和S；S9至A、G、V、L、I、F和M；K11至A、G、V、L、I、F、M和H；T12至A、G、V、I、L、F、M和S；S33至A、G、V、L、I、F和M；S43至A、G、V、L、I、F和M；G44至A和L；S45至A、G、V、L、I、F和M；T45至A、G、V、L、I、F和M；G46至A和P；D47至A、G、V、L、I、F、S和Q；N48至A、G、V、L和M；L49至A或G；F50；A51至V；D53至A、G、V、L、I、F、S和Q；V54至A、G和L；R55至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；G56至A和P；I57至A、G、M和F；L57至A、G、M和F；D58至A、G、V、L、I、F、S和Q；P59至A、G和F；E60至A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M和R；E61至A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M和R；G62至A；D94至A、G、V、L、I、F、S和Q；R84至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；V88至A和G；I88至A、G和V；D94；S96至A、G、V、I、L、F和M；T104至A、G、V、I、L、F、M和S；A105至L；T107至A、G、V、I、L、F、M和S；S107至A、G、V、L、I、F和M；L108至A、G和M；S109至A、G、V、I、L、F和M；T109至A、G、V、I、L、F、M和S；G110至A；D111至A、G、V、L、I、F、S和Q；S112至A、G、V、L、I、F和M；D141至A、G、V、L、I、F、S和Q；G147至A；V154至A和G；R179至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；T180至A、G、V、L、I、F、M和S；T181至A、G、V、L、I、F、M和S；D183至A、G、V、L、I、F、S和Q；D184至A、G、V、L、I、F、S和Q；L185至A、G和V；S186至A、G、V、I、L、F和M；G187至A；R188至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；S189至A、G、V、I、L、F和M；D197至A、G、V、L、I、F、S和Q；D198至A、G、V、L、I、F、S和Q；R204至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R205至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；C242至A、G、V和S；S247至A、G、V、I、L、F和M；Y247至A、G、V、L、I、F和M；R248至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R250至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R251至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；C262至A、G、V和S；D264至A、G、V、L、I、F、S和Q；G264至A；和T286至A、G、V、L、I、F、M和S。
另外，在志贺毒素效应物多肽的一个表位区域中破坏表位、同时保留显著志贺毒素效应物功能的任何氨基酸置换可与相同或不同的表位区域中的任意其它氨基酸置换组合，所述其它氨基酸置换破坏表位、同时保留显著的志贺毒素效应物功能以形成具有多个被破坏的表位区域的去免疫化的志贺毒素效应物多肽，同时仍然保留显著水平的志贺毒素效应物功能。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽可以包含前述置换中的两个或更多个的组合和/或在WO 2015/113005中描述的置换的组合。
基于在实施例中和在WO 2015/113005中的实验证据，预测志贺毒素的A亚基中的某些氨基酸区域会耐受表位破坏，同时仍然保留显著的志贺毒素效应物功能。例如，天然地定位在1-15、39-48、53-66、55-66、94-115、180-190、179-190和243-257处的表位区域耐受多种氨基酸置换组合，同时不会损害志贺毒素酶活性和细胞毒性。
B.弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽的例子
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽可以在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序和/或弗林蛋白酶切割位点。在某些其它实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽不包含可以在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端的近侧提供弗林蛋白酶切割的任何已知补偿结构。在WO 2015/191764中描述了适合用在本发明中的被破坏的弗林蛋白酶切割基序和弗林蛋白酶切割位点的非限制性例子。
在本文中参考在序列表中所提供的天然志贺毒素A亚基的具体氨基酸位置指出了某些弗林蛋白酶切割基序破坏，应当指出，天然存在的志贺毒素A亚基包括在它们的氨基端处含有约22个氨基酸的信号序列的前体形式，所述信号序列被除去以产生成熟的志贺毒素A亚基且是技术人员可识别的。此外，在本文中通过参考具体氨基酸(例如R代表精氨酸残基)来指示某些包含突变的弗林蛋白酶切割基序破坏，所述具体氨基酸天然地存在于天然志贺毒素A亚基内的特定位置(例如R251代表从氨基端开始在位置251处的精氨酸残基)，随后是已经用于置换所讨论的特定突变中的该残基的氨基酸(例如R251A代表丙氨酸对从氨基端开始在氨基酸残基251处的精氨酸的氨基酸置换)。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序，且这样的实施方案在本文中被称作“弗林蛋白酶切割抗性的”或“蛋白酶切割抗性的”志贺毒素效应物多肽以描述它们相对于野生型志贺毒素A亚基和/或野生型志贺毒素A1片段融合蛋白的性质。
在某些实施方案中，本发明的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽基本上由具有两个或更多个突变的截短的志贺毒素A亚基组成。
在某些实施方案中，本发明的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序，所述基序包含A、G或H对在最小弗林蛋白酶切割位点共有基序中的精氨酸残基中的一个或两个的氨基酸残基置换(相对于野生型志贺毒素多肽)。在某些实施方案中，本发明的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽包含破坏，所述破坏包含在弗林蛋白酶切割基序区域内的氨基酸置换，其中所述置换发生在选自由以下组成的组的天然地定位的氨基酸处：SEQ ID NO：3的247，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的248，SEQ ID NO：3的250，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的251，或在保守的志贺毒素效应物多肽和/或非天然的志贺毒素效应物多肽序列中的等同位置。在某些其它实施方案中，所述置换是针对任何非保守的氨基酸，且所述置换发生在天然地定位的氨基酸残基位置处。在某些其它实施方案中，所述突变包含选自以下的氨基酸置换：R247A、R248A、R250A、R251A、或在保守的志贺毒素效应物多肽和/或非天然的志贺毒素效应物多肽序列中的等同位置。
在某些实施方案中，本发明的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽包含含有突变的被破坏的弗林蛋白酶切割基序，所述突变是缺失。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含突变，所述突变是：天然地定位在StxA(SEQ ID NO：2)和SLT-1A(SEQ ID NO：3)中的247-252的区域、或天然地定位在SLT-2A(SEQ ID NO：3)中的246-251的区域的缺失；天然地定位在StxA(SEQ ID NO：2)和SLT-1A(SEQ ID NO：3)中的244-246的区域、或天然地定位在SLT-2A(SEQ ID NO：3)中的243-245的区域的缺失；或天然地定位在StxA(SEQ ID NO：2)和SLT-1A(SEQ ID NO：3)中的253-259的区域、或天然地定位在SLT-2A(SEQ ID NO：3)中的252-258的区域的缺失。
在本发明的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽的某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含突变，所述突变是相对于野生型志贺毒素A亚基的羧基端截短，所述截短导致弗林蛋白酶切割基序内的一个或多个氨基酸残基的缺失。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含羧基端截短，所述截短删除最小切割位点Y/R-x-x-R内的一个或多个氨基酸残基，例如，对于StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应物多肽，在天然氨基酸残基位置250、249、248、247、246、245、244、243、242、241、240或更少处终止的截短；和对于SLT-2A来源的志贺毒素效应物多肽，在天然氨基酸残基位置249、248、247、246、245、244、243、242、241或更少处终止的截短。某些其它实施方案包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序，所述基序包含前述突变的任意组合(在可行时)。
在某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含突变，所述突变是弗林蛋白酶切割基序的部分羧基端截短；但是，本发明的某些分子不包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序，所述基序是完整20个氨基酸残基弗林蛋白酶切割基序的完全羧基端截短。例如，本发明的某些志贺毒素效应物多肽包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序，所述基序包含直到StxA(SEQ ID NO：2)或SLT-1A(SEQ ID NO：1)中的天然位置240的志贺毒素A1片段区域的部分羧基端截短，但是不包含在位置239或更小处的羧基端截短。类似地，本发明的某些志贺毒素效应物多肽包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序，所述基序包含直到SLT-2A(SEQID NO：3)中的天然位置239的志贺毒素A1片段区域的部分羧基端截短，但是不包含在位置238或更小处的羧基端截短。在本发明的弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽的最大羧基端截短中，包含弗林蛋白酶切割基序的被破坏的弗林蛋白酶切割基序位置P14和P13的突变仍然存在。
在某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在弗林蛋白酶切割基序内的氨基酸残基置换和相对于野生型志贺毒素A亚基的羧基端截短。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的氨基酸残基置换和相对于野生型志贺毒素A亚基的羧基端截短，例如，对于StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应物多肽，在天然氨基酸残基位置249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291或更大处终止且包含在适当的情况下用任何非带正电荷的氨基酸残基置换的天然地定位的氨基酸残基R248和/或R251的截短；和对于SLT-2A来源的志贺毒素效应物多肽，在天然氨基酸残基位置248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291或更大处终止且包含在适当的情况下用任何非带正电荷的氨基酸残基置换的天然地定位的氨基酸残基Y247和/或R250的截短。在某些实施方案中，包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序的截短的志贺毒素效应物多肽也包含在位置P9、P8和/或P7处的弗林蛋白酶切割基序氨基酸残基以便维持最佳细胞毒性。
在某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含突变，所述突变是相对于野生型志贺毒素A亚基的一个或多个内部氨基酸残基缺失。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含突变，所述突变具有在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的一个或多个氨基酸残基缺失。例如，StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应物多肽包含天然地定位的氨基酸残基R248和/或R251的内部缺失，其可以与周围残基例如249、250、247、252等的缺失相组合；和SLT-2A来源的志贺毒素效应物多肽包含天然地定位的氨基酸残基Y247和/或R250的内部缺失，其可以与周围残基例如248、249、246、251等的缺失相组合。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含突变，所述突变是删除了最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R的四个连贯氨基酸残基的缺失，例如，StxA和SLT-1A来源的缺乏R248-R251的志贺毒素效应物多肽和SLT-2A来源的缺乏Y247-R250的志贺毒素效应物多肽。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含突变，所述突变具有在侧接核心弗林蛋白酶切割基序的氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基缺失，例如，在SLT-1A或StxA中的244-247和/或252-255的缺失。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含突变，所述突变是相对于野生型志贺毒素A亚基的整个表面暴露的蛋白酶切割敏感环的内部缺失，例如，对于StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应物多肽，天然地定位的氨基酸残基241-262的缺失；和对于SLT-2A来源的志贺毒素效应物多肽，天然地定位的氨基酸残基240-261的缺失。
在某些实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含两个突变：是弗林蛋白酶切割基序内的内部氨基酸残基缺失的突变，和是相对于野生型志贺毒素A亚基的羧基端截短的突变。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含两个突变：是在最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R内的氨基酸残基缺失的突变，和是相对于野生型志贺毒素A亚基的羧基端截短的突变。例如，蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽可以包含含有突变的被破坏的弗林蛋白酶切割基序，所述突变是截短的StxA或SLT-1A多肽中的天然地定位的氨基酸残基248-249和/或250-251的缺失，其仍然具有在截短的SLT-2A中的氨基酸残基247和/或252、或氨基酸残基247-248和/或249-250，其仍然具有氨基酸残基246和/或251。在某些其它实施方案中，所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含具有删除了最小弗林蛋白酶切割位点R/Y-x-x-R的四个连贯氨基酸残基缺失和相对于野生型志贺毒素A亚基的羧基端截短的突变，例如，对于StxA和SLT-1A来源的志贺毒素效应物多肽，在天然氨基酸残基位置252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291或更大处终止且缺乏R248-R251的截短；和对于SLT-2A来源的志贺毒素效应物多肽，在天然氨基酸残基位置251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291或更大处终止且缺乏Y247-R250的截短。
C.具有嵌入的表位的志贺毒素效应物多肽的例子
在某些实施方案中，为了去免疫化和/或递送至靶细胞的MHC I类呈递途径的目的，本发明的志贺毒素效应物多肽可以包含一个或多个嵌入的或插入的异源T-细胞表位。对于某些实施方案和/或某些志贺毒素效应物多肽亚区域，嵌入或部分嵌入T-细胞表位可以是比插入T-细胞表位优选的，因为例如，嵌入型修饰在志贺毒素效应物多肽的不同亚区域中更可能成功，而成功的插入可以更限于志贺毒素效应物多肽亚区域的较小子集。术语“成功”在这里用于指，对志贺毒素效应物多肽的修饰(例如异源T-细胞表位的引入)会产生在必要的活性水平的保留一种或多种志贺毒素效应物功能的经修饰的志贺毒素效应物多肽，无论是单独的还是作为细胞靶向分子的组分。
在WO 2015/113007中描述的任何志贺毒素效应物多肽亚区域可以适合用于本发明的某些实施方案，且在WO 2015/113007中描述的任何志贺毒素效应物多肽可以用于修饰成本发明的志贺毒素效应物多肽，例如，为了去免疫化(诸如如本文中所述的那种)和/或弗林蛋白酶切割基序破坏(诸如本文描述的那种)而添加一个或多个新表位区域破坏。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽基本上由截短的志贺毒素A亚基组成，所述亚基包含嵌入的或插入的异源T-细胞表位和一个或多个其它突变。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含嵌入的或插入的异源T-细胞表位，且小于全长志贺毒素A亚基，例如，由SLT-1A(SEQ ID NO：1)或StxA(SEQ ID NO：2)的氨基酸77-239或在志贺毒素家族的成员的其它A亚基中的等同氨基酸(例如SLT-2A(SEQ ID NO：3)的氨基酸77-238)代表的多肽组成。例如，在本发明的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽源自SEQ ID NO：1的氨基酸75-251、SEQ ID NO：1的氨基酸1-241、SEQ ID NO：1的氨基酸1-251或SEQ ID NO：1的氨基酸1-261，其中所述志贺毒素效应物多肽包含至少一个嵌入的或插入的异源T-细胞表位，且在实施例(参见例如表1-7和/或12)所提供的内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域中破坏了至少一个氨基酸，且其中所述被破坏的氨基酸没有与嵌入的或插入的表位重叠。类似地，在其它实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽源自SEQ IDNO：2的氨基酸75-251、SEQ ID NO：2的氨基酸1-241、SEQ ID NO：2的氨基酸1-251、或SEQ IDNO：2的氨基酸1-261，其中所述志贺毒素效应物多肽包含至少一个嵌入的或插入的异源T-细胞表位，且在实施例(参见例如表1-7和/或12)所提供的内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域中破坏了至少一个氨基酸，且其中所述被破坏的氨基酸没有与嵌入的或插入的表位重叠。另外，所述志贺毒素效应物多肽可以源自SEQ ID NO：3的氨基酸75-251、SEQ IDNO：3的氨基酸1-241、SEQ ID NO：3的氨基酸1-251、或SEQ ID NO：3的氨基酸1-261，其中所述志贺毒素效应物多肽包含至少一个嵌入的或插入的异源T-细胞表位，且在在实施例(参见例如表1-7和/或12)所提供的内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域中破坏了至少一个氨基酸，且其中所述被破坏的氨基酸没有与嵌入的或插入的表位重叠。在本发明的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽包含嵌入的或插入的异源T-细胞表位和在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序。例如在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽源自SEQ ID NO：1的氨基酸75-251、SEQ ID NO：1的氨基酸1-241、SEQ ID NO：1的氨基酸1-251、或SEQ ID NO：1的氨基酸1-261，其中所述志贺毒素效应物多肽包含至少一个嵌入的或插入的异源T-细胞表位和在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序。类似地，在其它实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽源自SEQ ID NO：2的氨基酸75-251、SEQ ID NO：2的氨基酸1-241、SEQ ID NO：2的氨基酸1-251、或SEQ ID NO：2的氨基酸1-261，其中所述志贺毒素效应物多肽包含至少一个嵌入的或插入的异源T-细胞表位和在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序。另外，所述志贺毒素效应物多肽可以源自SEQ ID NO：3的氨基酸75-251、SEQ ID NO：3的氨基酸1-241、SEQ ID NO：3的氨基酸1-251、或SEQ ID NO：3的氨基酸1-261，其中所述志贺毒素效应物多肽包含至少一个嵌入的或插入的异源T-细胞表位和在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序。
D.组合志贺毒素效应物多肽的例子
本发明的组合志贺毒素效应物多肽包含两个或更多个亚区域(即不重叠的亚区域)，其中每个亚区域包含以下至少一个：(1)在内源性表位或表位区域中的破坏；(2)嵌入的异源T-细胞表位肽；(3)插入的异源T-细胞表位肽；和(4)在A1片段来源的区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序。
本发明的组合志贺毒素效应物多肽的某些实施方案包含(1)在内源性表位或表位区域中的破坏和(2)在A1片段来源的区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序。预测在下面实施例中描述的或在WO 2015/113005(参见例如表B，出处同上)中描述的各个去免疫化的志贺毒素效应物亚区域中的任一个通常可以与本文描述的、在WO 2015/191764中描述的和/或本领域已知的包含被破坏的弗林蛋白酶切割基序的任何志贺毒素效应物亚区域组合，以便制备本发明的志贺毒素效应物多肽。
在本发明的某些实施方案中，所述志贺毒素效应物多肽基本上由SEQ ID NO：355-438中的任一个所示的多肽组成，其进一步包含至少一个内源性B-细胞和/或T-细胞表位区域的破坏，所述表位区域没有与嵌入的或插入的异源CD8+ T-细胞表位重叠；其中所述破坏包含相对于野生型志贺毒素的一个或多个氨基酸残基置换。在某些其它实施方案中，所述置换选自：K1至A、G、V、L、I、F、M和H；T4至A、G、V、L、I、F、M和S；D6至A、G、V、L、I、F、S、Q和R；S8至A、G、V、I、L、F和M；T9至A、G、V、I、L、F、M和S；S9至A、G、V、L、I、F和M；K11至A、G、V、L、I、F、M和H；T12至A、G、V、I、L、F、M、S和K；S12至A、G、V、I、L、F和M；S33至A、G、V、L、I、F、M和C；S43至A、G、V、L、I、F和M；G44至A或L；S45至A、G、V、L、I、F和M；T45至A、G、V、L、I、F和M；G46至A和P；D47至A、G、V、L、I、F、S、M和Q；N48至A、G、V、L、M和F；L49至A、V、C和G；Y49至A、G、V、L、I、F、M和T；F50至A、G、V、L、I和T；A51；D53至A、G、V、L、I、F、S和Q；V54至A、G、I和L；R55至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；G56至A和P；I57至A、G、V和M；L57至A、V、C、G、M和F；D58至A、G、V、L、I、F、S和Q；P59至A、G和F；E60至A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M、T和R；E61至A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M和R；G62至A；R84至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；V88至A和G；I88至A、V、C和G；D94至A、G、V、L、I、F、S和Q；S96至A、G、V、I、L、F和M；T104至A、G、V、L、I、F、M；和N；A105至L；T107至A、G、V、L、I、F、M和P；S107至A、G、V、L、I、F、M和P；L108至A、V、C和G；S109至A、G、V、I、L、F和M；T109至A、G、V、I、L、F、M和S；G110至A；S112至A、G、V、L、I、F和M；D111至A、G、V、L、I、F、S、Q和T；S112至A、G、V、L、I、F和M；D141至A、G、V、L、I、F、S和Q；G147至A；V154至A和G。R179至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；T180至A、G、V、L、I、F、M和S；T181至A、G、V、L、I、F、M和S；D183至A、G、V、L、I、F、S和Q；D184至A、G、V、L、I、F、S和Q；L185至A、G、V和C；S186至A、G、V、I、L、F和M；G187至A；R188至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；S189至A、G、V、I、L、F和M；D198至A、G、V、L、I、F、S和Q；R204至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R205至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；S247至A、G、V、I、L、F和M；Y247至A、G、V、L、I、F和M；R248至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R250至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R251至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；D264至A、G、V、L、I、F、S和Q；G264至A；和T286至A、G、V、L、I、F、M和S。在某些其它实施方案中，存在多个内源性B-细胞和/或CD8+ T-细胞表位区域的多个破坏，其中每个破坏涉及选自以下的至少一个氨基酸残基置换：K1至A、G、V、L、I、F、M和H；T4至A、G、V、L、I、F、M和S；D6至A、G、V、L、I、F、S、Q和R；S8至A、G、V、I、L、F和M；T9至A、G、V、I、L、F、M和S；S9至A、G、V、L、I、F和M；K11至A、G、V、L、I、F、M和H；T12至A、G、V、I、L、F、M、S和K；S12至A、G、V、I、L、F和M；S33至A、G、V、L、I、F、M和C；S43至A、G、V、L、I、F和M；G44至A或L；S45至A、G、V、L、I、F和M；T45至A、G、V、L、I、F和M；G46至A和P；D47至A、G、V、L、I、F、S、M和Q；N48至A、G、V、L、M和F；L49至A、V、C和G；Y49至A、G、V、L、I、F、M和T；F50至A、G、V、L、I和T；A51；D53至A、G、V、L、I、F、S和Q；V54至A、G、I和L；R55至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；G56至A和P；I57至A、G、V和M；L57至A、V、C、G、M和F；D58至A、G、V、L、I、F、S和Q；P59至A、G和F；E60至A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M、T和R；E61至A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M和R；G62至A；R84至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；V88至A和G；I88至A、V、C和G；D94至A、G、V、L、I、F、S和Q；S96至A、G、V、I、L、F和M；T104至A、G、V、L、I、F、M；和N；A105至L；T107至A、G、V、L、I、F、M和P；S107至A、G、V、L、I、F、M和P；L108至A、V、C和G；S109至A、G、V、I、L、F和M；T109至A、G、V、I、L、F、M和S；G110至A；S112至A、G、V、L、I、F和M；D111至A、G、V、L、I、F、S、Q和T；S112至A、G、V、L、I、F和M；D141至A、G、V、L、I、F、S和Q；G147至A；V154至A和G。R179至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；T180至A、G、V、L、I、F、M和S；T181至A、G、V、L、I、F、M和S；D183至A、G、V、L、I、F、S和Q；D184至A、G、V、L、I、F、S和Q；L185至A、G、V和C；S186至A、G、V、I、L、F和M；G187至A；R188至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；S189至A、G、V、I、L、F和M；D198至A、G、V、L、I、F、S和Q；R204至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R205至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；S247至A、G、V、I、L、F和M；Y247至A、G、V、L、I、F和M；R248至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R250至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；R251至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；D264至A、G、V、L、I、F、S和Q；G264至A；和T286至A、G、V、L、I、F、M和S。
本发明的志贺毒素效应物多肽的某些实施方案包含(1)嵌入的或插入的异源T-细胞表位肽和(2)在A1片段来源的区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序。在下面实施例中或在WO 2015/113007中描述的包含嵌入的或插入的异源T-细胞表位的任何志贺毒素效应物多肽亚区域通常可以与任何蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽亚区域(例如，本文描述的、在WO 2015/191764中描述的和/或本领域已知的经修饰的志贺毒素A亚基亚区域)组合，以便制备组合志贺毒素效应物多肽，其作为细胞靶向分子的组分，是蛋白酶切割抗性的且能够将异源T-细胞表位递送至靶细胞的MHC I类呈递途径。这类组合志贺毒素效应物多肽的非限制性例子显示在SEQ ID NO：6-27、29-32、340-355和370-438中。
本发明的组合志贺毒素效应物多肽的某些实施方案包含(1)在内源性表位或表位区域中的破坏和(2)嵌入的异源T-细胞表位肽。但是，在本文中或在WO 2015/191764中描述的包含插入的或嵌入的异源T-细胞表位的志贺毒素效应物亚区域通常不可与本文描述的每种去免疫化的志贺毒素效应物亚区域组合，除非经验表明成功地组合使得得到的组合分子保留足够水平的志贺毒素效应物功能。本文公开内容显示了可以如何制备和试验这样的实施方案以经验地证实成功。
术语“成功”在这里用于指，志贺毒素效应物多肽中的两个或更多个氨基酸残基置换产生功能特征，例如，去免疫化、减少的弗林蛋白酶切割和/或递送嵌入的或插入的表位的能力，同时经修饰的志贺毒素效应物多肽保留一种或多种志贺毒素效应物功能。本文描述的方案和测定表明如何设计、制作和经验地试验本发明的实施方案，其代表组合志贺毒素效应物多肽和包含它们的细胞靶向分子。
本发明的组合志贺毒素效应物多肽组合了它们的各个亚区域的特征，例如，弗林蛋白酶切割基序破坏、各个表位破坏和/或异源T-细胞表位载荷，并且这些组合有时产生这样的志贺毒素效应物多肽：其具有与它们的部分地去免疫化的亚区域的总和相比免疫原性的协同降低。具体地，在SEQ ID NO：13、16和21中所示的示例性志贺毒素效应物多肽由于两个或更多个亚区域的组合而被协同地去免疫化，其中一个亚区域包含嵌入的异源T-细胞表位，且其中另一个亚区域包含被一个或多个氨基酸残基置换破坏的内源性表位。
对于某些实施方案，本发明的志贺毒素效应物多肽包含SEQ ID NO：6-32、340-354和370-438中的任一个所示的多肽或基本上由其组成。对于某些实施方案，本发明的包含嵌入的T-细胞表位的组合去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽包含由SEQ IDNO：6-10、13-32、340-354和370-438代表的多肽之一或基本上由其组成。
在某些浓度没有表现出细胞毒性或表现出降低的细胞毒性的本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽(例如包含R179A的志贺毒素效应物多肽)仍然可以用作去免疫化的志贺毒素效应物多肽用于将外源物质递送进细胞中。类似地，在某些浓度没有表现出细胞毒性或表现出降低的细胞毒性的本发明的CD8+ T-细胞超免疫的志贺毒素效应物多肽，例如包含嵌入它的催化结构域中的表位的志贺毒素效应物多肽(参见例如WO 2015/113007，实施例1-F)，仍然可以用于将T-细胞表位递送至所述志贺毒素效应物多肽存在于其中的细胞的期望亚细胞区室或用作细胞靶向分子的组分用于将T-细胞表位递送进靶细胞中。
E.本发明的细胞靶向分子的例子
本发明的志贺毒素效应物多肽可以用作靶向各种细胞外靶生物分子的细胞靶向分子的组分。以下实施例更详细地描述了本发明的示例性细胞-靶分子的某些结构，所述细胞-靶分子靶向表达细胞外靶生物分子(例如，CD19、CD20、CD22、CD30、CD38、CD45、HER2、PD-L1和TYRP1)的细胞。
1.靶向人CD19的细胞靶向分子
CD19(在本领域中也称作B4)是一种95kDa B-谱系特异性的I型跨膜糖蛋白，其存在于发育中的B-细胞的表面上，但是终末分化的浆细胞不表达。尽管名称CD19可能表示多种具有有关结构的蛋白和来自不同物种的多肽序列，为了该部分的结构实施例的目的，术语“CD19”表示存在于人类中的B-淋巴细胞抗原CD19蛋白，其精确序列可能基于异形体且随个体不同而稍微变化。关于人类，CD19表示由优势多肽序列UniProt P15391和(NationalCenter Biotechnology Institute，U.S.)(NCBI)登录号AAA69966.1或AAB60697.1代表的蛋白；但是，由于剪接、多态性和/或突变而存在不同的异形体和变体(参见例如，Kuroki K等人，Genes Immun Supp1 1：S21-30(2002)；Tsuchiya N等人，Arthritis Rheum 50：4002-7(2004)；Dawidowicz K等人，Clin Exp Rheumatol 29：839-42(2011))。技术人员将能够鉴别人类中的其它CD19蛋白，即使它们不同于所述序列。
CD19是靶向癌症治疗的一种有吸引力的靶标，例如，因为B-细胞谱系的赘生性细胞和肿瘤对CD19的普遍存在的细胞表面表达。例如，发现大多数恶性B-细胞会表达CD19(参见例如，Anderson K等人，Blood 63：1424(1984)；Uckun F等人，Blood 71：13(1988)；Bradbury L等人，J Immunol 149：2841-50(1992)；Haas K，Tedder T，Adv Exp Med Biol560：125-39(2005)；Tedder T，Nat Rev Rheumatol 5：572-7(2009))。尽管CD19被视作在B-细胞发育中表达的泛B-细胞标志物，已经观察到B-细胞谱系的成熟B-细胞和肿瘤细胞表达比未成熟的B-细胞多3倍的CD19。具体地，在非霍奇金淋巴瘤(NHL)的无痛和侵袭性亚型、B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)和急性成淋巴细胞性白血病的形式中观察到CD19表达。此外，由于CD19表达相对于CD20表达的差异，CD19-靶向疗法相对于CD20-靶向疗法可以能够靶向在早期阶段的B-细胞肿瘤。
存在众多技术人员已知的CD19结合区域，其可以与本发明的志贺毒素效应物多肽结合以建立本发明的细胞靶向分子。就本发明的目的而言，术语“CD19结合区域”表示能够以高亲和力特异性地结合CD19分子的细胞外部分的分子部分(例如蛋白性分子)或试剂，例如，就CD20而言具有10-5至10-12mol/L的解离常数。本文中使用的结合CD19表示结合人CD19的异形体或变体的细胞外部分的能力。
在某些实施方案中，所述CD19结合区域是免疫球蛋白型结合区域。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白型CD19结合区域源自免疫球蛋白CD19结合区域，诸如能够结合CD19的细胞外部分的抗体互补位。在某些其它实施方案中，所述免疫球蛋白型CD19结合区域包含这样的经工程改造的多肽：其不是源自任何免疫球蛋白结构域，但是其通过提供与CD19的细胞外部分的高亲和力结合象免疫球蛋白CD19结合区域那样起作用。该经工程改造的多肽可以任选地包括如本文中所述的包含来自免疫球蛋白互补决定区和/或抗原结合区域或基本上由其组成的多肽支架。
存在众多预见到作为本发明的组分的CD19结合区域。免疫球蛋白型CD19结合区域的非限制性例子包括结合CD19的单克隆抗体及其衍生物，诸如人源化的变体和重组免疫球蛋白结构域，例如，B4(例如克隆eBiolD3)、Leu-12(Leu12)、HD37、B43、CLB-CD19、MOPC 21组分、FMC63、MB19-1、cCD19、B489B、SJ25-C1、hA19、huB4、hBU12、XmAb5574、MOR208、MEDI-551、SAR3419、AFM11、GBR 401、XmAb5871、Hm2E8b、B-1、5F3、2E2、1G9、C-20、F-3、HD237、H-300、M-20、R-20、PDR134、BCE19、HIB19、LE-CD19、LT19、CB19、6D5、4G7、AB-1、F974A2、J3-119、MDX-1342、MAB7489(克隆771404)和MAB4867(克隆4G7-2E3)(参见例如，Caligaris-Cappio F等人，J Clin Invest 76：1243-51(1985)；Chen Z等人，Leuk Res10：1411-7(1986)；PezzuttoA等人，J Immunol138：2793-9(1987)；De Rie M等人，Leuk Res12；135-41(1988)；Uckun F等人，Blood 71：13-29(1988)；Vuist W等人，Cancer Res49：3783-8(1989)；Carter R等人，J Immunol 147：3663-71(1991)；Zola H等人，Immunol Cell Biol69：411-22(1991)；Holder M等人，Eur J Immunol 22：2725-8(1992)；Engel P等人，Immunity 3：39-50(1995)；Pietersz G等人，Cancer Immunol Immunother41：53-60(1995)；Tisone J等人，AmJ Clin Pathol 107：283-91(1997)；WO 2005/012493；Lutz R等人，Proc Am Assoc CancerRes 47：3731(2006)；Horton H等人，Cancer Res68：8049-57(2008)；Gerber H等人，Blood113：4352-61(2009)；Awan F等人，Blood 115：1204-13(2010)；Herbst R等人，J PharmacolExp Ther 335：213-22(2010)；Coiffier B等人，J Clin Oncol 29：1182-9(2011)；ReuschU等人，Blood 122：4405(2013)；Breton C等人，J Hematol Oncol 7：33(2014)；Horton H等人，J Immunol186：4223-33(2014)；Shen D等人，Monoclon Antib ImmunodiagnImmunother33：215-20(2014))。CD19结合区域的非限制性例子包括scFv，例如，FVS191、FVS192、scFv-HD37、scFv-FMC63、HD37-C、HD37-CCH、FMC63-28Z、4G7mut、4G7-移植物(参见例如，Bejeck B等人，Cancer Res55：2346-51(1995)；Kipriyanov等人，J ImmunolMeth196：51-62(1996)；Nicholson I等人，Mol Immunol34：1157-65(1997)；WO 2002/050118；Peipp M等人，J Immunol Methods 285：265-80(2004)；Cheng W等人，BiochimBiophys Acta 1768：21-9(2007)；Kochenderfer J等人，J Immunother 32：689-702(2009)；Kügler M等人，Protein Eng Des Sel 22：135-47(2009)；WO 2012/079000；Kneissi S等人，PLoS One 8：e79047(2013))。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含含有免疫球蛋白型多肽的结合区域，所述免疫球蛋白型多肽针对与人CD19和/或CD19+细胞的细胞表面的特异性和高亲和力结合而选择。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区域包含选自以下的多肽：a)重链可变(VH)结构域，其包含(i)HABR1，其包含如在SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：96中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；(ii)HABR2，其包含如在SEQID NO：84、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：97中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和(iii)HABR3，其包含如在SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：98中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和b)轻链可变(VL)结构域，其包含(i)LABR1，其包含如在SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：99中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；(ii)LABR2，其包含如在SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：100中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和(iii)LABR3，其包含如在SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：101中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含含有SEQ ID NO：47-119和176-248中的任一个的氨基酸1-232、1-233、1-234、1-235、1-236、1-242、1-243、1-244、1-245、1-246、1-252、1-253、1-254、1-255或1-256或基本上由其组成的结合区域。
根据一个具体的、但是非限制性的方面，本发明的细胞靶向分子的结合区域包含保留与CD19的细胞外部分的结合功能性的配体(无论天然存在的还是合成的)或其衍生物。已知天然CD19结合至少一种配体CD19-L，即高运动基团(HMG)盒蛋白(参见例如，Uckun F等人，Br J Haematol 153：15-23(2011)；US 20120141505)。
前述CD19结合分子中的任一种可以适合用作CD19结合区域或经修饰以建立用于用在本发明的细胞靶向分子中的一个或多个CD19结合区域。
2.靶向人CD20的细胞靶向分子
CD20(B-淋巴细胞抗原CD20)尽管名称CD20可能表示来自不同物种的具有有关结构和多肽序列的多种蛋白，为了该部分的结构实施例的目的，术语“CD20”表示存在于人类中的B-淋巴细胞抗原CD20蛋白，其精确序列可能基于异形体且随个体不同而稍微变化。关于人类，CD20表示由优势多肽序列UnitProt P11836和NCBI登录号NP 690605.1代表的蛋白；但是，由于剪接、多态性和/或突变而存在不同的异形体和变体(参见例如，DawidowiczK等人，Clin Exp Rheumatol 29：839-42(2011)；Fang C等人，Int J Clin Exp Med 8：11235-43(2015))。技术人员将能够鉴别人类中的其它CD20蛋白，即使它们不同于所述序列。
CD20是由在某些细胞发育阶段内的正常B-细胞谱系细胞以及众多成熟B-细胞肿瘤的细胞(诸如NHL和慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞)表达的细胞表面糖蛋白。另外，CD20由成熟的T-细胞和NK-细胞肿瘤表达。CD20由正常的T-细胞以及恶性的T-细胞的子集表达，例如，在T-细胞淋巴瘤(TCL)(包括蕈样肉芽肿病(MF))、天然杀伤细胞淋巴瘤(NK-细胞淋巴瘤)、周围T-细胞淋巴瘤(PTCL)、皮肤T-细胞淋巴瘤和T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病(T-LGLL)中。细胞表面CD20与恶性细胞的结合使它成为细胞靶向疗法的有吸引力的靶标。
存在众多技术人员已知的CD20结合区域，其可以与本发明的志贺毒素效应物多肽结合以制备本发明的细胞靶向分子。就本发明的目的而言，术语“CD20结合区域”表示能够以高亲和力特异性地结合CD20分子的细胞外部分的分子部分(例如蛋白性分子)或试剂，例如，就CD20而言具有10-5至10-12mol/L的解离常数。本文中使用的结合CD20表示结合人CD20的异形体或变体的细胞外部分的能力。
在某些实施方案中，所述CD20结合区域是免疫球蛋白型结合区域。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白型CD20结合区域源自免疫球蛋白CD20结合区域，诸如能够结合CD20的细胞外部分的抗体互补位。在某些其它实施方案中，所述免疫球蛋白型CD20结合区域包含经工程改造的多肽，其并非源自任何免疫球蛋白结构域，但是其象免疫球蛋白CD20结合区域一样通过提供与CD20的细胞外部分的高亲和力结合来起作用。该经工程改造的多肽可以任选地包括多肽支架，所述多肽支架包含如本文中所述的来自免疫球蛋白的互补决定区和/或抗原结合区域或基本上由其组成。
存在众多预见到作为本发明的组分的CD20结合区域，诸如，例如在PCT/US2016/016580中描述的CD20结合区域。免疫球蛋白型CD20结合区域的非限制性例子包括单克隆抗体和衍生物(例如，人源化的变体和scFv)，例如，1F5、1H4、1K1791、2B8、Leu16、Leuδ、2F2、2H7、7D8、8E4、11B8、AME-133v、LY2469298、B9E9、BM-ca、C2B8、CKI、GA101、RO5072759、LT20、替伊莫单抗、HB20-1-25、MB20-1-18、阿托珠单抗、ocaratuzumab、奥瑞珠单抗、PRO70769、奥法木单抗、OUBM1-OUBM8、PRO131921、利妥昔单抗、TGLA、托西莫单抗、TRU-015、ublituximab、维妥珠单抗、IMMU-106、hA20、结合CD20的纤连蛋白结构域FN3CD20和HL23-scFv：scFv-1、scFv-3、scFv-5和scFv-8(参见例如Golay J等人，J Immunol 135：3795-801(1985)；Tedder T等人，Eur J Immunol 16：881-7(1986)；Liu A等人，Proc Natl Acad SciUSA 84：3439-43(1987)；Press O等人，Blood 69：584-91(1987)；Maloney D等人，Blood84：2457-66(1994)；ReffM等人，Blood 83：435-45(1994)；Hooijberg E等人，Cancer Res55：840-6(1995)；Hooijberg E等人，Hybridoma 15：23-31(1996)；和erson D等人，BiochemSoc Trans 25：705-8(1997)；Haisma H等人，Blood 92：184-90(1998)；Wiseman G等人，Clin Cancer Res 5：3281s-3286s(1999)；Schultz J等人，Cancer Res 60：6663-9(2000)；Cardarelli P等人，Cancer Immunol Immunother 51：15-24(2002)；Cheson B，Curr OpinInvestig Drugs 3：165-70(2002)；Polyak M等人，Blood 99：3256-62(2002)；Teeling J等人，Blood 104：1793-800(2004)；Geng S等人，Cell Mol Immunol 3：439-43(2006)；deBoer O等人，PLoS One 2：e779(2007)；Burge D等人，Clin Ther 30：1806-16(2008)；Hagenbeek A等人，Blood 111：5486-95(2008)；Nishida M等人，Intl J Oncol 32：1263-74(2008)；Morschhauser F等人，J Clin Oncol 27：3346-53(2009)；Lim S等人，Haematologica 95：135-43(2010)；Lv M等人，Cancer Lett 294：66-73(2010)；Morschhauser F等人，Ann Oncol 21：1870-6(2010)； E等人，Blood 115：4393-402(2010)；Olafesn T等人，Protein Eng Des Sel 23：243-9(2010)；Uchiyama S等人，Cancer Sci 101：201-9(2010)；Wu L等人，Cancer Lett292：208-14(2010)；Alduaij W等人，Blood 117：4519-29(2011)；Boross P等人，Haematologica 96：1822-30(2011)；Fang H等人，Sci China Life Sci 54：255-62(2011)；Nickerson-Nutter C等人，Rheumatology50：1033-44(2011)；Robak T，Robak E，BioDrugs 25：13-25(2011)；Cang S等人，J HematolOncol5：64(2012)；Salles G等人，Blood 119：5126-32(2012)；Abdelwahed R等人，InvestOphthalmol Vis Sci 54：3657-65(2013)；Golay J等人，Blood 122：3482-91(2013)；Kinder M等人，J Biol Chem 288：3084-54(2013)；Kobayashi H等人，Cancer Med 2：130-43(2013)；Natarajan A等人，Clin Cancer Res 19：6820-9(2013)；Zhang H等人，CellPhysiol Biochem32：645-54(2013)；Ahmadzadeh V等人，Protein Expr Purif 102：45-41(2014)；Ellbrecht C等人，JAMA Dermattol 1939(2014)；Garff-Tavernier M等人，Leukemia 28：230-3(2014)；美国专利4,861,579；5,500,362；5,595,721；5,677,180；5,721,108；5,736,137；5,776,456；5,843,398；5,849,898；6,015,542；6,090,365；6,120,767；6,171,586；6,194,551；6,224,866；6,242,195；6,287,537；6,306,393；6,368,596；6,399,061；6,410,391；6,455,043；6,528,624；6,538,124；6,565,827；6,652,852；6,682,734；7,879,984；8,101,179；8,153,125；8,337,844；和专利申请公开WO 1995/03770；WO1998/58964；WO 1999/22764；WO 2000/09160；WO 2000/27428；WO 2000/27433；WO 2000/42072；WO 2000/44788；WO 2000/67795；WO 2000/67796；WO 2000/76542；WO 2001/03734；WO 2001/10460；WO 2001/10461；WO 2001/10462；WO 2001/13945；WO 2001/72333；WO2001/80884；WO 2001/97858；WO 2002/060955；WO 2002/079255；WO 2002/096948；WO2002/102312；WO 2003/002607；WO 2003/061694；WO 2004/032828；WO 2005/000901；WO2005016969；WO 2006/106959；WO 2009/031230；WO 2014/076292；US 2011/0091483；US12/0941,583；PCT/US2010/055826；EP20140151932；PCT/GB2012/052532；US 13/048,135；EP20140151932；PCT/GB2012/052532；US 13/048,135；PCT/US2006/046034)。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含含有免疫球蛋白型多肽的结合区域，所述免疫球蛋白型多肽针对与人CD20和/或CD20+细胞的细胞表面的特异性和高亲和力结合而选择。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区域包含选自以下的多肽：a)重链可变(VH)结构域，其包含(i)HCDR1，其包含如在SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：120或SEQ ID NO：124中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；(ii)HCDR2，其包含如在SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：115或SEQ ID NO：125中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和(iii)HCDR3，其包含如在SEQ ID NO：104、SEQ IDNO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：121或SEQ ID NO：126中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和b)轻链可变(VL)结构域，其包含(i)LCDR1，其包含如在SEQID NO：105、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：117或SEQ ID NO：127中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；(ii)LCDR2，其包含如在SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：122或SEQ rD NO：128中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和(iii)LCDR3，其包含如在SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：123或SEQID NO：129中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成。在某些其它实施方案中，所述结合区域包含SEQ ID NO：33、64和65中的任一个的氨基酸1-245或基本上由其组成。
前述CD20结合分子中的任一种可以适合用作CD20结合区域或经修饰以建立用于用在本发明的细胞靶向分子中的一个或多个CD20结合区域。
3.靶向人CD22的细胞靶向分子
CD22(在本领域中也被称作Siglec-2、SIGLEC2、BL-CAM、B3、Leu-14和Lyb-8)是结合唾液酸配体的约120-140kDa(取决于剪接形式)的跨膜糖蛋白。CD22由在发育过程中的B-细胞和成熟B-细胞的特定子集特异性地表达。尽管名称CD22可能表示来自不同物种的具有有关结构和多肽序列的多种蛋白，为了该部分的结构实施例的目的，术语“CD22”表示存在于人类中的结合唾液酸的凝集素蛋白，其精确序列可能基于异形体且随个体不同而稍微变化。关于人类，CD22表示由优势多肽序列UniProt P20273和NCBI登录号NP_001265346.1代表的蛋白；但是，由于剪接、多态性和/或突变而存在不同的异形体和变体(参见例如，Hitomi Y等人，Tissue Antigens 69：242-9(2007)；Dawidowicz K等人，Clin ExpRheumatol 29：839-42(2011))。技术人员将能够鉴别人类中的其它CD22蛋白，即使它们不同于所述序列。
作为B-细胞特异性的标志物，CD22是涉及B-细胞的疾病和病患(例如，涉及过度活跃的B-细胞、升高的B-细胞群体、B-细胞介导的自身免疫疾病、白血病和淋巴瘤的病患)的细胞靶向疗法的一种有吸引力的靶标(参见例如Nitschke L，Glycobiology 24：807-17(2014))。另外，CD22可能由多种恶性的B-细胞过表达，例如，已经分析其大多数的B-细胞肿瘤表达细胞表面CD22。
存在众多技术人员已知的CD22结合区域，其可以与本发明的志贺毒素效应物多肽结合以制备本发明的细胞靶向分子。就本发明的目的而言，术语“CD22结合区域”表示能够以高亲和力特异性地结合CD22分子的细胞外部分的分子部分(例如蛋白性分子)或试剂，例如，就CD22而言具有10-15至10-12mol/L的解离常数。本文中使用的结合CD22表示结合人CD22的异形体或变体的细胞外部分的能力。
在某些实施方案中，所述CD22结合区域是免疫球蛋白型结合区域。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白型CD22结合区域源自免疫球蛋白CD22结合区域，诸如能够结合CD22的细胞外部分的抗体互补位。在某些其它实施方案中，所述免疫球蛋白型CD22结合区域包含经工程改造的多肽，其并非源自任何免疫球蛋白结构域，但是其象免疫球蛋白CD22结合区域一样通过提供与CD22的细胞外部分的高亲和力结合来起作用。该经工程改造的多肽可以任选地包括多肽支架，所述多肽支架包含如本文中所述的来自免疫球蛋白的互补决定区和/或抗原结合区域或基本上由其组成。
存在众多预见到作为本发明的组分的CD22结合区域。免疫球蛋白型CD22结合区域的非限制性例子包括结合CD22的单克隆抗体及其衍生物，诸如人源化的变体和重组免疫球蛋白结构域，例如，RFB4、oS-HCL-1(aLeu-14)、HD39、To15、4KB128、HD37、EPB、HD6、LL2、HA22-LR、HB22.7、Hu10F4(MCDT2219A或pinatuzumab)、依帕珠单抗、伊珠单抗、CAT-3888(BL22)、CAT-8015(moxetumomab)和scFv-4KB 128(参见例如，Campana D等人，J Immunol134：1524-30(1985)；Schwarting R等人，Blood 65：974-83(1985)；Dorken B等人，JImmunol 136：4470-9(1986)；Mason D等人，Blood 69：836-40(1987)；Ghetie M等人，Cancer Res 48：2610-7(1988)；Pawlak-Byczkowska E等人，Cancer Res 49：4568-77(1989)；Press O等人，Cancer Res 49：4906-12(1989)；Stein R等人，Cancer ImmunolImmunother 37：293-8(1993)；Leung S等人，Hybridoma 13：469-76(1994)；WO 1994/027638；Leung S等人，Mol Immunol 32：1413-27(1995)；WO 1998/041641；WO 2000/074718；Coleman M等人，Clin Cancer Res 9：3991S-4S(2003)；WO 2003/027135；WO 2003/072036；Arndt M等人，FEBS Lett 578：257-61(2004)；Furman等人，Curr Treat OptionsOncol 5：283-8(2004)；WO 2005/012493；Ho M等人，Proc Natl Acad Sci USA 103：9637-42(2006)；U.S.7,074,403；WO 2008/070569；O’Donnell等人，Caner Immunol Immunother58：1715-22(2009)；Mussai等人，Br J Haematol 150：352-8(2010)；Poison A等人，Leukemia 24：1566-73(2010)；Wayne等人，Clin Cancer Res 16：1894-903(2010)；Wong等人，Expert Opin Biol Ther 10：1251-8(2010)；US 20140248278；JP201518404)。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含含有免疫球蛋白型多肽的结合区域，所述免疫球蛋白型多肽针对与人CD22和/或CD22+细胞的细胞表面的特异性和高亲和力结合而选择。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区域包含选自以下的多肽：a)重链可变(VH)结构域，其包含(i)HABR1，其包含如在SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：142或SEQ ID NO：148中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；(ii)HABR2，其包含如在SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：149中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和(iii)HABR3，其包含如在SEQ ID NO：132、SEQID NO：138、SEQ ID NO：144或SEQ ID NO：150中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和b)轻链可变(VL)结构域，其包含(i)LABR1，其包含如在SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：151中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；(ii)LABR2，其包含如在SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：152中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和(iii)LABR3，其包含如在SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：147或SEQ ID NO：153中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成。可替换地，所述结合区域可以由CDR描述，其在很大程度上与ABR重叠，且描述在SEQ ID NO：154-165中。在某些其它实施方案中，所述结合区域包含SEQ ID NO：40或80的氨基酸269-513或基本上由其组成。
根据一个具体的、但是非限制性的方面，本发明的细胞靶向分子的结合区域包含保留对CD22的结合功能性的配体(无论天然存在的还是合成的)或其衍生物，例如，唾液酸、含有唾液酸的糖缀合物和可溶型-M免疫球蛋白(IgM)的结构域(参见例如Bakker T等人，Eur J Immunol 32：1924-32(2002)；Chen W等人，Blood 115：4778-86(2010)；Chen W等人，Leuk Lymphoma 53：208-10(2012)；Schweizer A等人，Eur J Immunol 42：2792-802(2012))。已经设计了具有高结合亲合力的合成CD22配体并可以用于细胞靶向(参见例如，Razi N，Varki A等人，Proc Natl Acad Sci USA 95：7469-74(1998)；Sliedregt L等人，Bioorg Med Chem 9：85-97(2001)；van Rossenberg S等人，J Biol Chem 276：12967-73(2001)；Kelm S等人，J Exp Med 195：1207-13(2002)；Collins B等人，J Immunol 177：2994-3003(2006)；Yu J等人，Biochem Biophys Res Commun 360：759-64(2007)；Abdu-Allah H等人，J Med Chem 51：6665-81(2008)；O’Reilly M等人，J Am Chem Soc 130：7736-45(2008)；Abdu-Allah H等人，Bioorg Med Chem Lett 19：5573-5(2009)；Chen W等人，Blood 115：4778-86(2010)；Lepenies B等人，Curr Opin Chem Biol 14：404-11(2010)；Abdu-Allah H等人，Bioorg Med Chem 19：1966-71(2011)；Chen W等人，LeukLymphoma 53：208-10(2012)；Mesch S等人，ChemMedChem 7：134-43(2012)；Kelm S等人，Angew Chem Iht Ed Engl 52：3616-20(2013)；Macauley M等人，J Clin Invest 123：3074-83(2013)；Preshcer H等人，ACS Chem Biol 9：1444-50(2014))。
前述CD22结合分子中的任一种可以适合用作CD22结合区域或经修饰以建立用于用在本发明的细胞靶向分子中的一个或多个CD22结合区域。
4.靶向人CD30的细胞靶向分子
CD30(在本领域中也被称作肿瘤坏死因子受体超家族8(TNFRSF8)或Ki-1/120)是约90-120kDa大小的I型跨膜糖蛋白。CD30作为肿瘤坏死因子受体家族的细胞表面受体(或共受体)起作用并结合配体CD30L。最初将CD30抗原描述为经典霍奇金淋巴瘤和存在于霍奇金病患者中的Reed-Sternberg细胞的标志物(Schwab U等人，Nature 299：65-7(1982)；Stein H等人，Int J Cancer 30：445-459(1982))，并在以后在非霍奇金淋巴瘤细胞上观察到CD30抗原(参见例如Stein H等人，Blood 66：848-58(1985))。尽管名称CD30可能表示来自不同物种的具有有关结构和多肽序列的多种蛋白，为了该部分的结构实施例的目的，术语“CD30”表示存在于人类中的肿瘤坏死因子受体蛋白，其精确序列可能基于异形体且随个体不同而稍微变化。关于人类，CD30表示由优势多肽序列UniProt P28908和NCBI登录号AAA51947.1代表的蛋白；但是，由于剪接、多态性和/或突变而存在不同的异形体和变体。技术人员将能够鉴别人类中的其它CD30蛋白，即使它们不同于所述序列。
CD30是靶向细胞的治疗剂的一种有吸引力的靶标，例如，因为它的表达主要限于活化的和/或增殖中的淋巴细胞和恶性细胞。在正常的或发炎的组织中，CD30表达主要限于产生Th2-型细胞因子的中/大活化的B-细胞和/或活化的T-细胞(Chiarle R等人，ClinImmunol 90：157-64(1990)；Werner B等人，J Cutan Pathol 35：1100-7(2008)；Buchan S，A1-Shamkhani A，PLoS One 7：e45244(2012))。CD30由某些细胞类型(例如，某些淋巴瘤细胞、其它恶性淋巴样细胞和非-淋巴样肿瘤细胞)高度表达，而健康细胞的仅有限子集表达CD30且在较低水平(Deutsch Y等人，Leuk Lymphoma 52：1641-54(2011))。CD30由涉入淋巴组织增生病症、淋巴样肿瘤和骨髓肿瘤的细胞表达。例如，CD30在非霍奇金淋巴瘤细胞的子集上表达，所述子集包括伯基特氏淋巴瘤细胞、间变性大细胞淋巴瘤细胞(ALCL)、T-细胞淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤细胞、结节性小核裂细胞型淋巴瘤细胞、淋巴细胞性淋巴瘤细胞、周围T-细胞淋巴瘤细胞、Lennert氏淋巴瘤细胞、免疫母细胞性淋巴瘤细胞、T-细胞leukemidymphoma细胞(ATLL)、成年T-细胞白血病(T-ALL)、中心母细胞的/中央细胞的(cb/cc)滤泡淋巴瘤细胞和淋巴瘤样丘疹病细胞(参见例如，Stein H等人，Blood 66：848-58(1985)；Stein等人，Neoplastic Hematophathology，第675页，(Baltimore，Williams&Wilkins，Knowles D，编)(1985)；Stein H等人，Pathology of Cells Receptors andTumor Markers，第121页(Stuttgart，Gustav Fischer Verlag，Sefert G，Hubner K(编)(1987)；Suchi T等人，J Clin Pathol 40：995(1987)；Eckert F等人，Am J Dermatopathol11：345-52(1989)；Moller P等人，Am J Clin Pathol 91：18-23(1989)；Burns B，DardickI，Am J Clin Pathol 93：327-32(1990)；Piris M等人，Histopathology 17：211-8(1990)；Miettinen M，Arch Pathol Lab Med 116：1197-201(1992)；Norduyn L等人，J ClinPathol 47：33-7(1994)；Sabattini E等人，Haematologica 98：e8 1-2(2013))。已经在胚胎性癌、非胚胎性癌、恶性黑素瘤、间质瘤和髓系细胞系和处于分化晚期的巨噬细胞中观察到CD30表达(参见例如，Andreesen R等人，Blood 63：1299-1302(1984)；Schaadt M等人，Int Rev Exp Pathol 27：185-202(1985)；Stein H等人，Haematol Blood Transfus 29：441-4(1985)；Froese P等人，J Immunol 139：2081-7(1987)；Pallesen G，Hamilton-Dutoit S，Am J Pathol 133：446-50(1988)；和reesen R等人，Am J Pathol 134：187-92(1989)；Hansen H等人，Biol Chem Hoppe-Seyler 370：409-16(1989)；Schwarting R等人，Blood 74：1678-89(1989)；Mechtersheimer G，Cancer 66：1732-7(1990)；Pallesen G，Histopathology 16：409-13(1990)；Dürkop H等人，Cell 68：421-7(1992)；Latza U等人，Am JPathol 146：463-71(1995))。CD30表达似乎被晚期肿瘤(例如，涉入肥大细胞增多和全身性肥大细胞增多的肿瘤)的肿瘤肥大细胞上调(参见例如，Soltar K等人，Mod Pathol 24：585-95(2011)；Valent P等人，Leuk Lymphoma 52：740-4(2011))。还已经报告CD30表达在多种自身免疫和炎性疾病中增加，所述疾病是例如淋巴样肿瘤、骨髓肿瘤、特应性的变态反应(特应性皮炎、特应性哮喘、鼻炎结膜炎、变应性鼻炎)、系统性红斑狼疮、系统性硬化症(硬皮病)、移植物抗宿主病、HIV感染、EB病毒感染、麻疹、单核细胞增多症感染、Omen氏综合征、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、多发性硬化、银屑病、桥本甲状腺炎、原发性胆汁性肝硬化、舍格伦综合征、弓形虫病、韦格纳氏肉芽肿病和结核病(参见例如，Ralfkiaer E等人，Arch Dermatol Res 279：28-292(1987)；Romagnani S等人，JLeukocyte Biol 57：726-30(1995)；Gruss H等人，Immunol Today 18：156-63(1997)；Horie R，Watababe T，Semin Immunol 10：457-70(1998)；Bengtsson A，Allergy 561：593-603(2001)；Gerli R等人，Trends Immunol 22：72-7(2001))。CD30表达是肥大细胞增多的标志物(参见例如Maric J，Calvo K，Leuk Lymphoma 52：732-3(2011))。
存在众多技术人员已知的CD30结合区域，其可以与本发明的志贺毒素效应物多肽结合以制备本发明的细胞靶向分子。就本发明的目的而言，术语“CD30结合区域”表示能够以高亲和力特异性地结合CD30分子的细胞外部分的分子部分(例如蛋白性分子)或试剂，例如，就CD30而言具有10-5至10-12mol/L的解离常数。本文中使用的结合CD30表示结合人CD30的异形体或变体的细胞外部分的能力。
在某些实施方案中，所述CD30结合区域是免疫球蛋白型结合区域。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白型CD30结合区域源自免疫球蛋白CD30结合区域，诸如能够结合CD30的细胞外部分的抗体互补位。在某些其它实施方案中，所述免疫球蛋白型CD30结合区域包含经工程改造的多肽，其并非源自任何免疫球蛋白结构域，但是其象免疫球蛋白CD30结合区域一样通过提供与CD30的细胞外部分的高亲和力结合来起作用。该经工程改造的多肽可以任选地包括多肽支架，所述多肽支架包含如本文中所述的来自免疫球蛋白的互补决定区和/或抗原结合区域或基本上由其组成。
存在众多预见到作为本发明的组分的CD30结合区域。免疫球蛋白型CD30结合区域的非限制性例子包括结合CD30的单克隆抗体及其衍生物，诸如人源化的变体和重组免疫球蛋白结构域，例如，Ki-1、HeFi-1、Ber-H2、Ber-H4、Ber-H6、Ber-H8、Ber-H10、小时-1、小时-3、小时-4、AC10、C10、Ki-2、Ki-3、Ki-4、Ki-5、Ki-6、Ki-7、M44、M67、scFv-Ki-4、scFv 4E3、T6、T7、T13、T14、T21、T24、T25、T104、T105、T107、T112、T201、T214、T215、T405、T406、T408、T411、T420、T426、T427(参见例如，Schwab U等人，Nature 299：65-7(1982)；Hecht T等人，JImmunol 134：4231-6(1985)；Schwarting R等人，Issue Sections.In：J.A.McMichael(编).Leucocyte Typing 3：574-75.Oxford：Oxford University Press，(1987)；Schwarting R等人，Leucocyte Typing IV：419-22.Oxford，UK，Oxford University(1989)；Bowen M等人，J Immunol 151：5896-906(1993)；Gruss H等人，Blood 83：2045-56(1994)；Horn-Lohrens O等人，Int J Cancer 60：539-44(1995)；WO 1996/022384；Barth S等人，Blood 95：3909-14(2000)；Klimka A等人，Br J Cancer 83：252-60(2000)；WO 2002/043661；WO 2003/059282；US 2004/018194；WO 2005/001038；WO 2007/040653；WO 2008/025020；WO 2015/028444)。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含含有免疫球蛋白型多肽的结合区域，所述免疫球蛋白型多肽针对与人CD30和/或CD30+细胞的细胞表面的特异性和高亲和力结合而选择。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区域包含选自以下的多肽：a)重链可变(VH)结构域，其包含(i)HABR1，其包含如在SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：1 78或SEQ ID NO：184中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；(ii)HABR2，其包含如在SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：179或SEQ ID NO：185中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和(iii)HABR3，其包含如在SEQ ID NO：168、SEQID NO：174或SEQ ID NO：180中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和b)轻链可变(VL)结构域，其包含(i)LABR1，其包含如在SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：181或SEQ ID NO：186中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；(ii)LABR2，其包含如在SEQID NO：170、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：182或SEQ ID NO：187中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和(iii)LABR3，其包含如在SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：183或SEQ ID NO：188中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成。在某些其它实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含含有SEQ ID NO：452、472、487和503中的任一个的氨基酸268-500或基本上由其组成的结合区域。
根据一个具体的、但是非限制性的方面，本发明的细胞靶向分子的结合区域包含保留与CD30的细胞外部分的结合功能性的配体(无论天然存在的还是合成的)或其衍生物(参见例如Powell I等人，J Leukoc Biol 63：752-7(1998)；Gruss H等人，Eur J Immunol25：2083(1995)；Gattei V等人，Leuk Lymphoma 35：21-35(1999)；Zhang P等人，LabInvest 89：1423-32(2009)；Parekh P等人，Biomaterials 34：8909-17(2013)；Shinoda K等人，J Autoimmun 57：14-23(2015)；WO 1993/024135)。
前述CD30结合分子中的任一种可以适合用作CD30结合区域或经修饰以建立用于用在本发明的细胞靶向分子中的一个或多个CD30结合区域。
5.靶向人CD38的细胞靶向分子
CD38是被表征为细胞表面受体和细胞外环状ADP核糖水解酶(ADP-核糖基化酶)的跨膜蛋白。尽管名称CD38可能表示来自不同物种的具有有关结构和多肽序列的多种蛋白，为了该部分的结构实施例的目的，术语“CD38”表示存在于人类中的环状ADP核糖水解酶蛋白，其精确序列可能基于异形体且随个体不同而稍微变化。关于人类，CD38表示由优势多肽序列UniProt P28907和NCBI登录号BAA18964代表的蛋白；但是，由于剪接、多态性和/或突变可能存在不同的异形体和变体(参见例如Ferrero E等人，Immunogenetics 49：597-604(1999)；Gonzalez-Escribano M等人，Hum Immunol 65：660-664(2004)；Drummond F等人，JBone Miner Metab 24：28-35(2006)；Aydin S等人，Blood 111：5646-53(2008)；WO 2006/099875)。技术人员将能够鉴别人类中的其它CD38蛋白，即使它们不同于所述序列。
存在众多技术人员已知的CD38结合区域，其可以与本发明的志贺毒素效应物多肽结合以制备本发明的细胞靶向分子。就本发明的目的而言，术语“CD38结合区域”表示能够以高亲和力特异性地结合CD38分子的细胞外部分的分子部分(例如蛋白性分子)或试剂，例如，就CD38而言具有10-5至10-12mol/L的解离常数。本文中使用的结合CD38表示结合人CD38的异形体或变体的细胞外部分的能力。
在某些实施方案中，所述CD38结合区域是免疫球蛋白型结合区域。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白型CD38结合区域源自免疫球蛋白CD38结合区域，诸如能够结合CD38的细胞外部分的抗体互补位。在某些其它实施方案中，所述免疫球蛋白型CD38结合区域包含经工程改造的多肽，其并非源自任何免疫球蛋白结构域，但是其象免疫球蛋白CD38结合区域一样通过提供与CD38的细胞外部分的高亲和力结合来起作用。该经工程改造的多肽可以任选地包括多肽支架，所述多肽支架包含如本文中所述的来自免疫球蛋白的互补决定区和/或抗原结合区域或基本上由其组成。
存在众多预见到作为本发明的组分的CD38结合区域。免疫球蛋白型CD38结合区域的非限制性例子包括结合CD38的单克隆抗体和scFv，诸如，例如，达雷木单抗、isatuximab、和MOR202(参见例如Deaglio S等人，Trends Mol Med 14：210-8(2008)；van de Donk N等人，Immunol Rev 270：95-112(2016)；WO 1996/016990；WO 2002/006347；WO 2005/103083；WO 2008/047242；WO 2012/092612；WO 2012/092616；US20020164788；US20100285004；US201 50118251)。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含含有免疫球蛋白型多肽的结合区域，所述免疫球蛋白型多肽针对与人CD38和/或CD38+细胞的细胞表面的特异性和高亲和力结合而选择。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区域包含选自以下的多肽：a)重链可变(VH)结构域，其包含(i)HABR1，其包含如在SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：213或SEQ ID NO：219中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；(ii)HABR2，其包含如在SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：196、SEQ IDNO：202、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：214或SEQ ID NO：220中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和(iii)HABR3，其包含如在SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：215或SEQ ID NO：221中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和b)轻链可变(VL)结构域，其包含(i)LABR1，其包含如在SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：216或SEQ ID NO：222中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；(ii)LABR2，其包含如在SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：199、SEQ IDNO：205、SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：217或SEQ ID NO：223中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和(iii)LABR3，其包含如在SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：212、SEQ ID NO：218或SEQ ID NO：224中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成。可替换地，所述结合区域可以由CDR描述，其在很大程度上与ABR重叠，且描述在SEQID NO：225-242中。在某些其它实施方案中，所述结合区域包含SEQ ID NO：34、35、41-56和82中的任一个的氨基酸269-499、269-512、269-513或280-510或基本上由其组成。
天然的CD38配体或其衍生物可以用作本发明的细胞靶向分子的结合区域。已知天然CD38结合至少一种配体CD38L，即也被称作血小板内皮细胞粘附分子1(PECAM1)或CD31的Ig蛋白(Cesano A等人，J Immunol 160：1106-15(1998)；Deaglio S等人，J Immunol 160：395-402(1998))。CD31或CD31的与CD38或其衍生物相互作用的部分可以与本发明的志贺毒素效应物多肽融合以构建结合CD38的细胞外部分的靶向CD38的细胞靶向分子。
前述CD38结合分子中的任一种可以适合用作CD38结合区域或经修饰以建立用于用在本发明的细胞靶向分子中的一个或多个CD38结合区域。
6.靶向人CD45的细胞靶向分子
CD45(在本领域中也被称作PTPRC(蛋白酪氨酸磷酸酶受体类型C)和白细胞共同抗原(LCA))是在许多分化的造血细胞、特别是恶性血液细胞(例如，淋巴瘤、B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、毛细胞白血病和急性非淋巴细胞白血病(AML)细胞)的细胞表面上表达的I型跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶。尽管名称CD45可能表示来自不同物种的具有有关结构和多肽序列的多种蛋白，为了该部分的结构实施例的目的，术语“CD45”表示存在于人类中的蛋白酪氨酸磷酸酶蛋白，其精确序列可能基于异形体且随个体不同而稍微变化。关于人类，CD45表示由优势多肽序列UniProt Q6QIQ5和例如NCBI登录号NP_563578.2或NP_002829.3代表的蛋白；但是，由于剪接、多态性和/或突变而存在不同的异形体和变体(参见例如Motta-Mena L等人，J Biol Chem 286：20043-53(2011)；MarméF等人，Breast Cancer ResTreat 132：819-31(2012)；Pokoyski C等人，Genes Immun 16：519-27(2015))。技术人员将能够鉴别人类中的其它CD45蛋白，即使它们不同于所述序列。
存在众多技术人员已知的CD45结合区域，其可以与本发明的志贺毒素效应物多肽结合以制备本发明的细胞靶向分子。就本发明的目的而言，术语“CD45结合区域”表示能够以高亲和力特异性地结合CD45分子的细胞外部分的分子部分(例如蛋白性分子)或试剂，例如，就CD45而言具有10-5至10-12mol/L的解离常数。本文中使用的结合CD45表示结合人CD45的异形体或变体的细胞外部分的能力。
在某些实施方案中，所述CD45结合区域是免疫球蛋白型结合区域。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白型CD45结合区域源自免疫球蛋白CD45结合区域，诸如能够结合CD45的细胞外部分的抗体互补位。在某些其它实施方案中，所述免疫球蛋白型CD45结合区域包含经工程改造的多肽，其并非源自任何免疫球蛋白结构域，但是其象免疫球蛋白CD45结合区域一样通过提供与CD45的细胞外部分的高亲和力结合来起作用。该经工程改造的多肽可以任选地包括多肽支架，所述多肽支架包含如本文中所述的来自免疫球蛋白的互补决定区和/或抗原结合区域或基本上由其组成。
存在众多预见到作为本发明的组分的CD45结合区域。免疫球蛋白型CD45结合区域的非限制性例子包括结合CD45的单克隆抗体和scFv，例如，抗-CD45RB(参见例如，Luke P等人，Curr Mol Med 1：533-43(2001)；Lin Y等人，Cancer Res 66：3884-92(2006))。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含含有免疫球蛋白型多肽的结合区域，所述免疫球蛋白型多肽针对与人CD45和/或CD45+细胞的细胞表面的特异性和高亲和力结合而选择。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区域包含选自以下的多肽：a)重链可变(VH)结构域，其包含(i)HABR1，其包含如在SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：249或SEQ ID NO：255中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；(ii)HABR2，其包含如在SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：250或SEQ ID NO：256中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和(iii)HABR3，其包含如在SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：251或SEQ ID NO：257中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和b)轻链可变(VL)结构域，其包含(i)LABR1，其包含如在SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：252或SEQ ID NO：258中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；(ii)LABR2，其包含如在SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：253或SEQ ID NO：259中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和(iii)LABR3，其包含如在SEQ ID NO：248、SEQ IDNO：254或SEQ ID NO：260中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成。
前述CD45结合分子中的任一种可以适合用作CD45结合区域或经修饰以建立用于用在本发明的细胞靶向分子中的一个或多个CD45结合区域。
7.靶向人HER2的细胞靶向分子
HER2(在本领域中也被称作受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-2)是作为细胞表面受体起作用的跨膜蛋白，其用于跨细胞膜向细胞增殖和细胞凋亡的细胞内调节剂转导信号。HER2在本领域中也被称作Neu、erbB-2、p185、CD340、NGL和HER2/neu(Coussens L等人，Science230：1132-39(1985)；King C等人，Science 229：974-6(1985)；Semba K等人，Proc NadAcad Sci USA 82：6497-501(1985)；Yamamoto T等人，Nature 319：230-234(1986)；KokaiY等人，Proc Natl Acad Sci USA 85：5389-93(1988)；Disis M等人，Cancer Res 54：16-20(1994)；Yoshino I等人，J Immunol 152：2393-400(1994)参见，例如，GenBankAcc.Nos.X03363；M17730；NM_004448；SEG_HUMHER20)。尽管名称HER2可能表示来自不同物种的具有有关结构和多肽序列的多种蛋白，为了该部分的结构实施例的目的，术语“HER2”表示存在于人类中的表皮生长因子受体蛋白，其精确序列可能基于异形体且随个体不同而稍微变化。例如，HER2表示由示例性多肽序列UniProt P04626和NCBI登录号NP_004439.2、NP_001005862.1、NP_001276865.1、NP_001276866.1和NP_001276867.1代表的人蛋白；但是，由于剪接、多态性和/或突变而存在不同的异形体和变体(参见例如Siddig A等人，AnnN Y Acad Sci 1138：84-94(2008)；Poole E等人，Int J Mol Epidemiol Genet 2：300-15(2011)；WO 2000/020579)。技术人员将能够鉴别人类中的其它HER2蛋白，即使它们不同于所述序列。
HER2由许多癌细胞、特别是乳腺癌细胞过表达，且它的过表达与增加的转移、增加的疾病复发和预后不良强相关(参见例如Slamon D等人，Science 235：177-82(1987))。
存在众多技术人员已知的HER2结合区域，其可以与本发明的志贺毒素效应物多肽结合以制备本发明的细胞靶向分子。就本发明的目的而言，术语“HER2结合区域”表示能够以高亲和力特异性地结合HER2分子的细胞外部分的分子部分(例如蛋白性分子)或试剂，例如，就CD20而言具有10-5至10-12mol/L的解离常数。本文中使用的结合HER2表示结合人HER2的异形体或变体的细胞外部分的能力。
在某些实施方案中，所述HER2结合区域是免疫球蛋白型结合区域。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白型HER2结合区域源自免疫球蛋白HER2结合区域，诸如能够结合HER2的细胞外部分的抗体互补位。在某些其它实施方案中，所述免疫球蛋白型HER2结合区域包含经工程改造的多肽，其并非源自任何免疫球蛋白结构域，但是其象免疫球蛋白HER2结合区域一样通过提供与HER2的细胞外部分的高亲和力结合来起作用。该经工程改造的多肽可以任选地包括多肽支架，所述多肽支架包含如本文中所述的来自免疫球蛋白的互补决定区和/或抗原结合区域或基本上由其组成。
存在众多预见到作为本发明的组分的HER2结合区域。免疫球蛋白型HER2结合区域的非限制性例子包括结合HER2的单克隆抗体及其衍生物，例如，抗-ErbB2、4D5、2C4、7F3、7C2、mumAb 4D5、chmAb 4D5、(rhu)mAb 4D5、huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7、huMAb4D5-8、曲妥珠单抗、人源化的520C9、4D5Fc8、无铰链的rhu4D5、未糖基化的具有突变半胱氨酸残基的rhu4D5、培妥珠单抗和人源化的2C4(Hudziak R等人，Mol Cell Biol 9：1165-72(1989)；McKenzie S等人，Oncogene 4：543-8(1989)；Bacus S等人，Molecular Carcinogenesis 3：350-62(1990)；Hancock M等人，Cancer Res 51：4575-80(1991)；Maier L等人，Cancer Res 51：5361-5369(1991)；Stancovski I等人，Proc Natl Acad Sci USA 88：8691-5(1991)；Tagliabue E等人，Int J Cancer 47：933-937(1991)；Bacus S等人，Cancer Res 52：2580-9(1992)；Carter P等人，Proc Natl Acad Sci USA 89：4285-89(1992)；Harwerth I等人.J BiolChem 267：15160-7(1992)；Kasprzyk P等人，Cancer Res 52：2771-6(1992)；Lewis G等人，Cancer Immunol Immunother 37：255-63(1993)；Xu F等人，Int J Cancer 53：401-8(1993)；Arteaga C等人，Cancer Res 54：3758-65(1994)；Shawver L等人，Cancer Res 54：1367-73(1994)；Klapper L等人.Oncogene 14：2099-109(1997)；WO 1993/21319；WO 1994/00136；WO 1997/00271；WO 1998/77797；US 5,772,997；US 5,783，186；US 5,821,337；US5,840,525；US 6,949,245；和US 7,625,859)。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含含有免疫球蛋白型多肽的结合区域，所述免疫球蛋白型多肽针对与人HER2和/或HER2+细胞的细胞表面的特异性和高亲和力结合而选择。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区域包含选自以下的多肽：a)重链可变(VH)结构域，其包含(i)HABRI，其包含如在SEQ ID NO：261、SEQ ID NO：268或SEQ ID NO：274中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；(ii)HABR2，其包含如在SEQ ID NO：262、SEQ ID NO：269或SEQ ID NO：275中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和(iii)HABR3，其包含如在SEQ ID NO：263、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：270或SEQ IDNO：276中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和b)轻链可变(VL)结构域，其包含(i)LABR1，其包含如在SEQ ID NO：264、SEQ ID NO：271或SEQ ID NO：277中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；(ii)LABR2，其包含如在SEQ ID NO：265、SEQ ID NO：272或SEQ IDNO：278中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和(iii)LABR3，其包含如在SEQ IDNO：266、SEQ ID NO：273或SEQ ID NO：279中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成。可替换地，所述结合区域可以由CDR描述，其在很大程度上与ABR重叠，且描述在SEQ ID NO：283-303中。在本发明的细胞靶向分子的其它实施方案中，所述结合区域包含选自以下的多肽：a)重链仅可变(VHH)结构域，其包含(i)HABR1，其包含如在SEQ ID NO：280中所示的氨基酸序列或基本上由其组成；(ii)HABR2，其包含如在SEQ ID NO：281中所示的氨基酸序列或基本上由其组成；和(iii)HABR3，其包含如在SEQ ID NO：282中所示的氨基酸序列或基本上由其组成。在某些其它实施方案中，所述结合区域包含SEQ ID NO：36、66和67中的任一个的氨基酸269-520或269-521或基本上由其组成。
天然的配体或其衍生物可以用作用于本发明的细胞靶向分子的HER2结合区域。已知天然HER2会在结合配体(诸如表皮生长因子如表皮调节素和调蛋白)后与ErbB家族的其它成员异源二聚化(Moasser M，Oncogene 26：6469-87(2007)；Riese D，Cullum R，SeminCell Dev Biol 28：49-56(2014)；Sollome J等人，Cell Signal 26：70-82(2014))。结合ErbB家族的成员的ErbB配体包括EGF、TGF-α、双调蛋白、β动物纤维素、HB-EGF、表皮调节素、HER2-68和HER2-100、调蛋白、herstatin、NRG-2、NRG-3和NRG-4(Justman Q等人，J BiolChem 277：20618-24(2002)；Jhabvala-Romero F.，等人，Oncogene 22：8178-86(2003))。ErbB配体的例子包括调蛋白(HRG)，诸如在美国专利5,641,869和Marchionni M等人，Nature 362：312-8(1993)中公开的原型调蛋白。调蛋白的例子包括调蛋白-α、调蛋白-β1、调蛋白-β2和调蛋白-β3(Holmes W等人，Science 256：1205-10(1992)；US 5,641,869)；neu分化因子(NDF)(Peles等人，Cell 69：205-16(1992))；乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)(Falls D等人，Cell 72：801-15(1993))；神经胶质生长因子(GGF)(Marchionni M等人，Nature 362：312-8(1993))；感觉和运动神经元来源的因子(SMDF)(Ho W等人，J Biol Chem270：14523-32(1995))；γ-调蛋白(Schaefer G等人，Oncogene 15：1385-94(1997))。
根据本发明的ErbB配体也可以是合成的ErbB配体。所述合成的配体可以是对特定ErbB受体特异性的，或可以识别特定ErbB受体复合物。合成的配体的一个例子是合成的调蛋白/EGF嵌合体biregulin(Jones J等人，FEBSLett，447：227-31(1999))和EGF-样结构域片段HRGβ1177-244。ErbB配体或ErbB配体的与HER2或其衍生物相互作用的部分可以与本发明的志贺毒素效应物多肽融合以构建本发明的靶向HER2的细胞靶向分子，其结合HER2的细胞外部分。
结合HER2的细胞外部分的合成肽可以用作用于靶向的结合区域。已经描述了许多能够结合HER2的肽(参见例如美国专利5,578,482；5,856,110；5,869,445；5,985,553；6,333，169；6,987,088；7,019,017；7,282,365；7,306,801；7,435,797；7,446,185；7,449,480；7,560,111；7,674,460；7,815,906，7,879,325；7,884,194；7,993,650；8,241,630；8,349,585；8,389,227；8,501,909；8,512,967；8,652,474；和US 2011/0059090)。
在某些实施方案中，结合HER2的细胞外部分的小分子可以用作用于靶向的结合区域。已经描述了许多能够结合HER2的小分子诸如酪氨酸激酶抑制剂、AZD8931、拉帕替尼、奈拉替尼(HKI-272)、dacomitinib(PF-00299804)、阿法替尼(BIBW 2992)(Barlaam B等人，ACS Med Chem Lett 4：742-6(2013)；Yu H，Riley G，J Natl Compr Canc Netw 11：161-9(2013)；Roskoski R，Pharmacol Res 87C：42-59(2014))。使用本领域技术人员众所周知的方法，诸如通过衍生化已知的EGFR结合剂如吉非替尼、厄洛替尼、AEE788、AG1478、AG1571(SU-5271)、AP26113、CO-1686、XL647、凡他尼布和BMS-690514(Kurokawa H，Arteaga C，Clin Cancer Res 7：4436s-4442s(2001)；Yigitbasi 0等人，Cancer Res 64：7977-84(2004)；Yu H，Riley G，J Natl Compr Canc Netw 11：161-9(2013)；Roskoski R，Pharmacol Res 87C：42-59(2014))，可以鉴别结合HER2的细胞外部分的其它小分子。
前述HER2结合分子中的任一种可以适合用作HER2结合区域或经修饰以建立用于用在本发明的细胞靶向分子中的一个或多个HER2结合区域。
8.靶向人PD-L1的细胞靶向分子
PD-L1(在本领域中也被称作PDL1、程序性细胞死亡1配体1、PDCD1配体1、PDCD1L1、PDCD1LG1、B7同系物1(B7-H1)和CD274)是T-和B-细胞的程序性细胞死亡-1受体(Dong H等人，Nat Med 5：1365-9(1999)；Freeman G等人，JExp Med 192：1027-34(2000)；Latchman Y等人，Nat Immunol 2：261-8(2001))和在T-细胞上发现的B7-1受体和CD80受体(Butte M等人，Immunity 27：111-22(2007)；Park J等人，Blood 116：1291-8(2010))的配体。尽管名称PD-L1可能表示来自不同物种的具有有关结构和多肽序列的多种蛋白，为了该部分的结构实施例的目的，术语“PD-L1”表示存在于人类中的PD-1配体，其精确序列可能基于异形体且随个体不同而稍微变化。关于人类，PD-L1表示由优势多肽序列UniProt Q9NZQ7或Q9EP73和NCBI登录号AAI13735.1代表的蛋白；但是，由于剪接、多态性和/或突变而存在不同的异形体和变体(参见例如Abelson A等人，Genes Immun 8：69-74(2007)；Wang S等人，J ClinImmunol 27：563-7(2007)；Hayashi M等人，Eur J Endocrinol 158：817-22(2008)；Mitchell A等人，J Clin Endocrinol Metab 94：5139-45(2009)；Yang Q等人，Clin ExpRheumatol 29：13-8(2011)；Ma Y等人，Int J Clin Exp Med 15：16585-91(2015))。技术人员将能够鉴别人类中的其它PD-L1蛋白，即使它们不同于所述序列。
PD-L1在处于正常条件下的大多数健康组织中不存在；但是，通过将大多数有核的哺乳动物细胞暴露于干扰素可以诱导PD-L1表达(参见例如，Dong H等人，Nat Med 8：793-800(2002)；Chen L，Nat Rev Immunol 4：336-47(2004)；Hirano F等人，Cancer Res 65：1089-96(2005)；Zou W，Chen L，Nat Rev Immunol 8：467-7(2008)；Flies D等人，Yale JBiol Med 84：409-21(2011)；Chen J等人，Immunobiology 217：385-93(2012)：Spranger S等人.Sci Transl Med 5：200ra116(2013))。在某些恶性肿瘤过程中，肿瘤微环境中的PD-L1上调可能导致对肿瘤细胞的免疫应答的过度抑制，这符合关于PD-L1参与肿瘤细胞对宿主的免疫系统的适应性免疫抗性的普通观念(参见例如，Zou W，Chen L，Nat Rev Immunol8：467-7(2008)；Zheng P，Zho Z，Biomark Cancer 7：15-8(2015))。
PD-L1是疗法的一种有吸引力的靶标，因为PD-L1被某些肿瘤细胞和浸润肿瘤的淋巴细胞强烈地表达，而健康的人组织和细胞很少在细胞表面处表达高水平的PD-L1(参见例如Dong H等人，Nat Mead 8：793-800(2002)；Chen L，Nat Rev Immunol 4：336-47(2004)；Hirano F等人，Cancer Res 65：1089-96(2005)；Chen L，Han X，J Clin Invest 125：3384-91(2015))。在人类中，已经在许多通过免疫组织化学评估的原发肿瘤活组织检查和肿瘤细胞培养的细胞中观察到肿瘤细胞对细胞表面PD-L1的表达，包括与例如癌、神经胶质瘤、B-细胞淋巴瘤、成年T-细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、血管免疫母细胞的T-细胞淋巴瘤(AITL)、膀胱癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、上皮恶性肿瘤、口腔鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌(ESCC)、肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、胰腺癌、肾细胞癌(RCC)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、头和颈的鳞状细胞癌(SCCHN)和病毒相关的恶性肿瘤有关的细胞和组织(参见例如，BrownJ等人，Immunol 170：1257-66(2003)：Strome S等人，Cancer Res 63：6501-5(2003)；Wintterle等人，Cancer Res 63：7462-7(2003)：Thompson R等人，Cancer Res 66：3381-5(2006)：Nomi T等人，Clin Cancer Res 13：2151-7(2007)；Thompson等人，Clin CancerRes 13：1757-61(2007)；和orsky D等人，Clin Cancer Res 17：4232-44(2011)：Chen B等人，Clin Cancer Res 19：3462-73(2013)；Chen M等人，Oncotarget 7：7913-24(2016)：WuC等人，Sci Rep 6：19740(2016))。
存在众多技术人员已知的PD-L1结合区域，其可以与本发明的志贺毒素效应物多肽结合以制备本发明的细胞靶向分子。就本发明的目的而言，术语“PD-L1结合区域”表示能够以高亲和力特异性地结合PD-L1分子的细胞外部分的分子部分(例如蛋白性分子)或试剂，例如，就PD-L1而言具有10-5至10-12mol/L的解离常数。本文中使用的结合PD-L1表示结合人PD-L1的异形体或变体的细胞外部分的能力。
在某些实施方案中，所述PD-L1结合区域是免疫球蛋白型结合区域。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白型PD-L1结合区域源自免疫球蛋白PD-L1结合区域，诸如能够结合PD-L1的细胞外部分的抗体互补位。在某些其它实施方案中，所述免疫球蛋白型PD-L1结合区域包含经工程改造的多肽，其并非源自任何免疫球蛋白结构域，但是其象免疫球蛋白PD-L1结合区域一样通过提供与PD-L1的细胞外部分的高亲和力结合来起作用。该经工程改造的多肽可以任选地包括多肽支架，所述多肽支架包含如本文中所述的来自免疫球蛋白的互补决定区和/或抗原结合区域或基本上由其组成。
存在众多预见到作为本发明的组分的PD-L1结合区域。免疫球蛋白型PD-L1结合区域的非限制性例子包括众多已知结合存在于细胞表面处的PD-L1的细胞外部分的抗体和免疫球蛋白结构域，包括MDX-1105、MOM-18534-S(P)和various scFv(参见例如，Latchman Y等人，Nat Immunol 2：261-8(2001)：Xerri L等人，Human Pathol 39：1050-8(2008)：ChenB等人，Clin Cancer Res 19：3462-73(2013)；Drees J等人，Protein Expr Purif 94：60-6(2014)；WO 2007/005874；WO 2010/036959；WO 2013/019906；US 7,943,743；US 8,552,154；US 9,102,727；US 9,273,135，和美国专利申请US20110271358和US20160075782)。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子包含含有免疫球蛋白型多肽的结合区域，所述免疫球蛋白型多肽针对与人PD-L1和/或PD-L1+细胞的细胞表面的特异性和高亲和力结合而选择。在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，所述结合区域包含选自以下的多肽：a)重链可变(VH)结构域，其包含(i)HCDR1，其包含如在SEQ ID NO：304、SEQ ID NO：310、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：322或SEQ ID NO：328中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；(ii)HCDR2，其包含如在SEQ ID NO：305、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：317、SEQ IDNO：323或SEQ ID NO：329中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和(iii)HCDR3，其包含如在SEQ ID NO：306、SEQ ID NO：312、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：324或SEQ ID NO：330中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和b)轻链可变(VL)结构域，其包含(i)LCDR1，其包含如在SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：313、SEQ ID NO：319、SEQ ID NO：325或SEQ ID NO：331中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；(ii)LCDR2，其包含如在SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：314、SEQ ID NO：320、SEQ ID NO：326或SEQ ID NO：332中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成；和(iii)LCDR3，其包含如在SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：315、SEQ IDNO：321、SEQ ID NO：327或SEQ ID NO：333中所示的氨基酸序列之一或基本上由其组成。在某些其它实施方案中，所述结合区域包含SEQ ID NO：37-39、68-79和81中的任一个的氨基酸269-498或269-499或基本上由其组成。
前述PD-L1结合分子中的任一种可以适合用作PD-L1结合区域或经修饰以建立用于用在本发明的细胞靶向分子中的一个或多个PD-L1结合区域。
其它结构变体
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，以前已经描述了所述结合区域，例如，在WO 2005/092917、WO 2007/033497、US2009/0156417、JP4339511、EP1727827、DE602004027168、EP1945660、JP4934761、EP2228383、US2013/0196928、WO 2014/164680、WO2014/164693、WO 2015/138435、WO 2015/138452、WO 2015/113005、WO 2015/113007、WO2015/191764、US20150259428、62/168,758、62/168,759、62/168,760、62/168,761、62/168,762、62/168,763和PCT/US2016/016580中。
在本发明的细胞靶向分子的某些其它实施方案中，所述结合区域包含选自以下的多肽：(a)重链可变(VH)结构域，其包含含有如在SEQ ID NO：334中所示的氨基酸序列或基本上由其组成的HCDR1，含有如在HCDR2中所示的氨基酸序列或基本上由其组成的HCDR2，和含有如在SEQ ID NO：336中所示的氨基酸序列或基本上由其组成的HCDR3；和(b)轻链可变(VL)结构域，其包含含有如在SEQ ID NO：337中所示的氨基酸序列或基本上由其组成的LCDR1，含有如在SEQ ID NO：338中所示的氨基酸序列或基本上由其组成的LCDR2，和含有如在SEQ ID NO：339中所示的氨基酸序列或基本上由其组成的LCDR3。
使用本发明的细胞靶向分子的片段、变体和/或衍生物是在本发明范围内，所述片段、变体和/或衍生物含有与靶生物分子的任何细胞外部分的功能结合位点，且甚至更优选地能够以高亲和力(例如如通过KD证实的)结合靶生物分子。例如，为了用在制备本发明的细胞靶向分子和本发明的方法中，可以置换以10-5至10-12摩尔/升、优选地小于200nM的解离常数(KD)结合靶生物分子的细胞外部分的任何结合区域。
技术人员会认识到，可以对本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子以及编码前述任一种的多核苷酸做出变化，而不减少它们的生物活性，例如，通过维持志贺毒素效应物多肽的总结构和功能，诸如与以下一种或多种结合：1)减少抗原性和/或免疫原性潜力的内源性表位破坏，2)减少蛋白水解性裂解的弗林蛋白酶切割基序破坏，和/或3)嵌入的或插入的表位，其减少抗原性和/或免疫原性潜力或能够被递送至MHC 1分子用于呈递到细胞表面上。例如，一些修饰可以促进表达，促进纯化，改善药代动力学性能，和/或改善免疫原性。这样的修饰是技术人员众所周知的，且包括，例如，添加在氨基端以提供起始位点的甲硫氨酸，放在任一个末端上以建立方便地定位的限制位点或终止密码子的另外氨基酸，和与任一个末端融合以提供方便的检测和/或纯化的生化亲和标签。改善使用非脊索动物系统(例如原核细胞)生产的多肽的免疫原性的一种常见修饰是，在多肽生产以后，除去开始甲硫氨酸残基，其可能在生产过程中(例如，在细菌宿主系统中)甲酰基化，例如，因为N-甲酰基甲硫氨酸(fMet)的存在可能在脊索动物中诱导不希望的免疫应答。
在本文中也预见到在本发明的志贺毒素效应物多肽、本发明的细胞靶向分子或本发明的细胞靶向分子的蛋白性组分的氨基和/或羧基末端处包括另外的氨基酸残基，诸如表位标签或其它部分的序列。所述另外的氨基酸残基可以用于多种目的，包括，例如，促进克隆，促进表达、翻译后修饰，促进合成、纯化，促进检测和施用。表位标签和部分的非限制性例子是甲壳质结合蛋白结构域、肠肽酶切割位点、因子Xa切割位点、FIAsH标签、FLAG标签、绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽-S-转移酶部分、HA标签、麦芽糖结合蛋白结构域、myc标签、聚组氨酸标签、ReAsH标签、strep-标签、strep-标签II、TEV蛋白酶位点、硫氧还蛋白结构域、凝血酶切割位点和V5表位标签。
在以上实施方案的某些中，通过引入多肽区域中的一个或多个保守氨基酸置换来改变本发明的志贺毒素效应物多肽和/或细胞靶向分子的多肽序列，只要所有需要的结构特征仍然存在且所述志贺毒素效应物多肽能够表现出任何需要的功能，无论单独地还是作为细胞靶向分子的组分。本文中使用的术语“保守置换”表示，将一个或多个氨基酸用另一种生物学上类似的氨基酸残基替换。例子包括具有类似特征的氨基酸残基的置换，例如小氨基酸、酸性氨基酸、极性氨基酸、碱性氨基酸、疏水氨基酸和芳族氨基酸(参见，例如，表C)。在内源性哺乳动物肽和蛋白中通常不存在的残基的保守置换的一个例子是用例如鸟氨酸、刀豆氨酸、氨基乙基半胱氨酸或另一种碱性氨基酸对精氨酸或赖氨酸残基的保守置换。关于肽和蛋白中表现型上沉默的置换的其它信息，参见，例如，Bowie J等人，Science 247：1306-10(1990)。
表C.保守氨基酸置换的例子
在表C的保守置换方案中，示例性的保守氨基酸置换根据物理化学性质进行分组—-I：中性的、亲水的；II：酸和酰胺；Ⅲ：碱性的；IV：疏水的；V：芳族的、庞大氨基酸，VI亲水的、不带电荷的，VII脂族不带电荷的，VIII非极性的不带电荷的，IX环烯基相关的、X疏水的，XI极性的，XII小的，XIII允许旋转的，和XIV柔性的。例如，保守氨基酸置换包括以下的：1)S可以置换C；2)M或L可以置换F；3)Y可以置换M；4)Q或E可以置换K；5)N或Q可以置换H；和6)H可以置换N。
另外的保守氨基酸置换包括以下的：1)S可以置换C；2)M或L可以置换F；3)Y可以置换M；4)Q或E可以置换K；5)N或Q可以置换H；和6)H可以置换N。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子可以包含本文描述的本发明的多肽区域的功能片段或变体，其与本文列举的多肽序列相比具有最多20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸置换，只要它(1)包含至少一个嵌入的或插入的异源T-细胞表位和在实施例(参见例如表1-7和/或12)所提供的内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域中破坏了至少一个氨基酸，其中所述被破坏的氨基酸没有与嵌入的或插入的表位重叠；(2)包含至少一个嵌入的或插入的异源T-细胞表位和在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序；或(3)包含在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序，且包含在实施例(参见例如表1-7和/或12)所提供的内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域中破坏了至少一个氨基酸，其中所述被破坏的氨基酸没有与所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序重叠。作为如下改变本文描述的多肽的结果，本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子的变体是在本发明范围内：改变一个或多个氨基酸残基或删除或插入一个或多个氨基酸残基(诸如在结合区域或志贺毒素效应物多肽区域内)，以便实现期望的性能，诸如改变的细胞毒性、改变的细胞生长抑制作用、改变的免疫原性和/或改变的血清半衰期。本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子可以进一步具有或没有信号序列。
因此，在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽包含与天然存在的志贺毒素A亚基或其片段(例如，志贺毒素A亚基，诸如SLT-1A(SEQ ID NO：1)、StxA(SEQ ID NO：2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO：3))具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％、总序列同一性的氨基酸序列或基本上由其组成，其中所述志贺毒素效应物多肽(1)包含至少一个嵌入的或插入的异源T-细胞表位和在实施例(参见例如表1-7和/或12)所提供的内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域中破坏了至少一个氨基酸，且其中所述被破坏的氨基酸没有与嵌入的或插入的表位重叠；(2)包含至少一个嵌入的或插入的异源T-细胞表位和在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序；或(3)包含在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序，且包含在实施例(参见例如表1-7和/或12)所提供的内源性B-细胞和/或CD4+T-细胞表位区域中破坏了至少一个氨基酸，且其中所述被破坏的氨基酸没有与所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序重叠。
在本发明的志贺毒素效应物多肽的某些实施方案中，可以突变、插入或删除一个或多个氨基酸残基，以便增加志贺毒素效应物多肽的酶活性。在本发明的志贺毒素效应物多肽的某些实施方案中，可以突变或删除一个或多个氨基酸残基，以便减少或消除所述志贺毒素效应物多肽的催化和/或细胞毒性活性。例如，通过突变或截短可以减少或消除志贺毒素家族的成员的A亚基的催化和/或细胞毒性活性。
通过突变和/或截短可以改变、减少或消除志贺毒素家族成员的A亚基的细胞毒性。已经证实标记为酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、酪氨酸-114和色氨酸-203的位置对于Stx、Stx1和Stx2的催化活性而言是重要的(Hovde C等人，Proc Natl Acad Sci USA85：2568-72(1988)；Deresiewicz R等人，Biochemistry 31：3272-80(1992)；DeresiewiczR等人，Mol Gen Genet 241：467-73(1993)；Ohmura M等人，Microb Pathog 15：169-76(1993)；Cao C等人，Microbiol Immunol 38：441-7(1994)；Suhan M，Hovde C，InfectImmun 66：5252-9(1998))。在无细胞核糖体灭活测定中将谷氨酸-167和精氨酸-170突变会消除Slt-I A1的酶活性(LaPointe P等人，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。在使用内质网中Slt-I A1的从头表达的另一个方案中，将谷氨酸-167和精氨酸-170突变会在该表达水平消除Slt-I A1片段细胞毒性(LaPointe P等人，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。截短分析证实，StxA的残基75-268的片段仍然保留显著的体外酶活性(Haddad J等人，JBacteriol 175：4970-8(1993))。通过细胞溶胶中的从头表达，含有残基1-239的Slt-I A1的截短片段显示出显著的体外酶活性和细胞毒性(LaPointe P等人，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。截短至残基1-239的Slt-I A1片段在内质网中的表达不是细胞毒性的，因为它不能逆转移至细胞溶胶(LaPointe P等人，J Biol Chem 280：23310-18(2005))。
在志贺毒素A亚基中对酶活性和/或细胞毒性而言最关键的残基被映射至以下残基位置：天冬酰胺-75、酪氨酸-77、酪氨酸-114、谷氨酸-167、精氨酸-170、精氨酸-176和色氨酸-203等(Di R等人，Toxicon 57：525-39(2011))。具体地，含有谷氨酸-E167-至-赖氨酸和精氨酸-176-至-赖氨酸突变的Stx2A的双突变构建体被完全灭活；而Stx1和Stx2中的许多单一突变显示出细胞毒性的10倍降低。此外，将Stx1A截短至1-239或1-240会降低它的细胞毒性，并且类似地，将Stx2A截短至保守疏水残基会降低它的细胞毒性。在志贺毒素A亚基中对于结合真核核糖体和/或真核核糖体抑制而言最关键的残基已经映射至以下残基-位置：精氨酸-172、精氨酸-176、精氨酸-179、精氨酸-188、酪氨酸-189、缬氨酸-191和亮氨酸-233等(McCluskey A等人，PLoS One 7：e31191(2012)。但是，某种修饰可能增加本发明的志贺毒素效应物多肽表现出的志贺毒素功能活性。例如，将Stx1A中的残基-位置丙氨酸-231突变为谷氨酸会增加Stx1A的体外酶活性(Suhan M，Hovde C，Infect Immun 66：5252-9(1998))。
在从SLT-1A(SEQ ID NO：1)或StxA(SEQ ID NO：2)来源的本发明的志贺毒素效应物多肽的某些实施方案中，一个或多个突变的氨基酸残基包括位置75处的天冬酰胺、位置77处的酪氨酸、位置114处的酪氨酸、位置167处的谷氨酸、位置170处的精氨酸、位置176处的精氨酸的置换，和/或位置203处的色氨酸的置换。对于技术人员而言，基于现有技术，这种置换的例子将是已知的，诸如位置75处的天冬酰胺置换为丙氨酸、位置77处的酪氨酸置换为丝氨酸、位置114处的酪氨酸置换为丝氨酸、位置167处的谷氨酸置换为谷氨酸、位置170处的精氨酸置换为丙氨酸、位置176处的精氨酸置换为赖氨酸、位置203处的色氨酸置换为丙氨酸和/或用谷氨酸置换在231处的丙氨酸。增强或减小志贺毒素酶活性和/或细胞毒性的其它突变是在本发明范围内，且可以使用本文中公开的众所周知的技术和测定来确定。
本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子可以任选地缀合至一种或多种另外的试剂，所述另外的试剂可以包括本领域已知的治疗剂、诊断剂和/或其它另外的外源物质，包括诸如本文中所述的试剂。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽或细胞靶向分子是聚乙二醇化的或白蛋白化的，例如，以提供去免疫化、通过掩蔽延长环和/或在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处的弗林蛋白酶切割基序来破坏弗林蛋白酶切割、改善药代动力学性能和/或改善免疫原性(参见例如，Wang Q等人，Cancer Res 53：4588-94(1993)；Tsutsumi Y等人，Proc Natl Acad Sci USA 97：8548-53(2000)；Buse J，E1-AneedA，Nanomed 5：1237-60(2010)；Lim S等人，J Control Release 207-93(2015))。
V.本发明的细胞靶向分子的一般功能
本发明的志贺毒素效应物多肽与靶向细胞的结合区域的功能关联能够建立选择性地杀死特定细胞类型、抑制特定细胞类型的生长、将外源物质递送至特定细胞类型和/或检测特定细胞类型的细胞靶向分子。本发明的志贺毒素效应物多肽的性能能够建立与先前的志贺毒素效应物多肽相比在脊索动物中具有改善的治疗窗的细胞靶向分子。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子在施用给脊索动物以后会提供以下的一种或多种：1)在低施用剂量对靶向的细胞(例如，被感染的或恶性的细胞)的高效和选择性杀死，2)当细胞靶向分子存在于细胞外空间中时，靶向细胞的结合区域和志贺毒素效应物多肽区域之间的连接稳定性，3)低水平的脱靶细胞死亡和/或不希望的组织损伤，和4)用于被靶细胞呈递的异源CD8+ T-细胞表位的细胞靶向递送，以便开始合乎需要的T-细胞介导的免疫应答，例如，CD8+ T-细胞的募集和细胞因子在组织部位处的定位释放。
本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子在多种应用中是有用的，所述应用涉及，例如，细胞杀死；细胞生长抑制；细胞内载荷递送；生物信息收集；免疫应答刺激，和/或健康情况的补救。本发明的志贺毒素效应物多肽可用作多种治疗和/或诊断分子(诸如，例如配体-毒素融合体、免疫毒素和/或免疫-缀合物)的组分。本发明的细胞靶向分子可用作治疗和/或诊断分子，例如，用作靶向细胞的细胞毒性治疗分子；靶向细胞的无毒递送赋形剂；和/或靶向细胞的诊断分子；例如在涉及特定细胞类型的体内靶向的应用中用于诊断或治疗多种疾病，包括癌症、免疫病症和微生物感染。
取决于实施方案，本发明的志贺毒素效应物多肽或细胞靶向分子可以具有或提供下述特征或功能性中的一种或多种：(1)去免疫化，(2)蛋白酶切割抗性，(3)在某些浓度的高效细胞毒性，(4)由另外的物质(例如异源T-细胞表位)组成的载荷的细胞内递送，(5)选择性细胞毒性，(6)在某些用量或剂量在多细胞生物中的低脱靶毒性，(7)异源T-细胞表位向靶细胞的MHC I类呈递途径的递送，和/或(8)CD8+ T-细胞免疫应答的刺激。本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子的某些实施方案是多功能的，因为所述分子具有本文描述的特征或功能性中的两种或更多种。本发明的细胞靶向分子的某些其它实施方案会在单个分子中提供所有前述特征和功能性。
本发明的靶向细胞的结合区域与志贺毒素效应物多肽的结合、偶联和/或连接能够工程改造具有志贺毒素功能的细胞靶向分子，其在以某些用量或剂量施用给多细胞生物(诸如哺乳动物)以后可以产生更少的不良作用。不良作用的非限制性例子包括脱靶毒性、未靶向细胞毒性和/或不希望的免疫应答。因为功能性质，例如，去免疫化、降低的脱靶毒性和/或合乎需要的免疫应答的靶向刺激(诸如通过细胞靶向分子递送的CD8+ T-细胞表位的细胞表面呈递)，本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子的某些实施方案在涉及志贺毒素效应物多肽和/或细胞靶向分子向脊索动物的施用的应用中是特别有用的。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子能够结合与特定细胞类型的细胞表面结合的细胞外靶生物分子并进入那些细胞中。一旦内化到靶向的细胞类型内，本发明的细胞靶向分子的某些实施方案能够将酶活性的细胞毒性的志贺毒素效应物多肽片段按路线发送进靶细胞的胞质溶胶中并最终杀死所述细胞。可替换地，本发明的细胞靶向分子的无毒或降低毒性变体可以用于将另外的外源物质递送进靶细胞中，诸如表位、肽、蛋白、多核苷酸和检测促进剂。该系统是模块的，因为任何数目的不同结合区域可以用于将本发明的志贺毒素效应物多肽靶向至多种不同细胞类型。
A.用于涉及施用给脊索动物的用途的去免疫化
通过工程改造志贺毒素A亚基或志贺毒素效应物多肽的一个或多个内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域的破坏，包括通过突变和/或截短或通过共价地连接的化学结构的缀合，完成本发明的志贺毒素效应物多肽的去免疫化。因为B-细胞表位经常与成熟的CD4+ T-细胞的表位重合或重叠，内源性B-细胞表位区域的破坏经常同时破坏内源性CD4+T-细胞表位或反之亦然。
本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子的某些实施方案就一种或多种B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位而言去免疫化，这意味着，这些分子表现出与先前的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子相比降低的抗原性和/或免疫原性潜力，所述先前的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子缺乏对相同B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位或表位区域的相同破坏和/或缺乏对相同B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位或表位区域的任何破坏。某些其它实施方案表现出高效的(如果不是野生型水平的)志贺毒素A亚基催化结构域依赖性的细胞毒性，尽管存在提供去免疫化的性质的多个突变。因为减小的产生由施用的分子引起的不希望免疫应答的可能性，本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子对于涉及志贺毒素效应物多肽和/或细胞靶向分子向脊索动物(例如，哺乳动物、两栖动物、鸟、鱼、爬行动物或鲨鱼)的胃肠外施用的应用是有用的。
当施用给不同脊索动物物种时，本发明的各种去免疫化的志贺毒素效应物多肽可能在它们的抗原性谱方面不同，但是本发明的所有去免疫化的多肽在至少一种生物中表现出降低的抗原性和/或免疫原性，如通过至少一种定量测定所测得的。具体地，本发明的细胞靶向分子的某些实施方案就哺乳动物接受者而言去免疫化，例如，当施用给该哺乳动物时所述分子引起与参比分子(例如包含野生型志贺毒素A1片段的有关细胞靶向分子)相比更低量和/或频率的“抗-细胞靶向分子”抗体。另外，预期具有多个内源性表位区域的破坏的本发明的志贺毒素效应物多肽更大地减小了这样的多肽在脊索动物接受者中发生不希望的免疫应答的概率。
对于本发明的某些实施方案的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子，所述去免疫化性质是结构变化的结果，所述结构变化包括在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序。
对于本发明的某些实施方案的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子，所述去免疫化性质是结构变化的结果，所述结构变化包括嵌入和/或插入破坏内源性B-细胞和/或CD4+T-细胞表位区域的T-细胞表位。
对于某些实施方案，保留去免疫化的志贺毒素效应物多肽的来源亲本志贺毒素多肽的期望生物学功能，例如，促进细胞内化的志贺毒素A亚基功能、指导细胞内按路线发送和高效的细胞毒性。保留表示如本文中所述的最小活性水平的保持。
B.减小的蛋白酶切割敏感性
与包含野生型志贺毒素A1片段区域的有关分子相比，本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子的某些实施方案表现出降低的蛋白酶切割敏感性。某些其它实施方案表现出高效的(如果不是最佳的)志贺毒素A亚基催化结构域依赖性的细胞毒性，不论该降低的蛋白酶切割敏感性和规范弗林蛋白酶切割事件在中毒细胞内的缺乏。
与包含野生型志贺毒素A1片段区域的有关分子相比，本发明的蛋白酶切割抗性的细胞靶向分子(即包含志贺毒素效应物多肽的细胞靶向分子，所述志贺毒素效应物多肽包含在它的志贺毒素A1片段区域的羧基端处的被破坏的弗林蛋白酶切割基序)的某些实施方案表现出改善的体内耐受性。某些其它实施方案表现出高效的(如果不是最佳的)志贺毒素A亚基催化结构域依赖性的细胞毒性，不论该降低的蛋白酶切割敏感性和规范弗林蛋白酶切割事件在中毒细胞内的缺乏。
以前认为，包含志贺毒素A1片段催化区域的细胞毒性的志贺毒素A亚基构建体必须维持或以某种方式补偿中毒细胞内通过弗林蛋白酶实现的天然存在的蛋白水解性加工，以便维持志贺毒素为了有效的和高效的细胞毒性的天然适应。意外地发现，高效的细胞毒性不需要弗林蛋白酶切割事件，因为在志贺毒素A1片段的羧基端没有任何弗林蛋白酶切割事件存在下实现了在野生型志贺毒素对照构建体的水平的高效志贺毒素细胞毒性，不论羧基端部分的存在(参见下文实施例和WO 2015/191764)。中毒细胞内弗林蛋白酶切割事件的缺乏可能阻止志贺毒素A1片段-样区域的有效释放，且因而导致相对大的部分(例如大于28kDa大小)与志贺毒素A1片段区域的继续连接。但是，不论该可能性，用包含志贺毒素效应物多肽区域且缺乏任何已知补偿特征的弗林蛋白酶切割缺陷型构建体实现了高效的志贺毒素细胞毒性，例如，提供在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端近侧的细胞内切割(参见下文实施例；WO 2015/191764)。
这提示与A1片段区域连接的相对大的分子部分的持续和/或无效释放不一定降低志贺毒素细胞毒性的效能。这是惊人的，因为认为最佳志贺毒素中毒过程需要志贺毒素A1片段从所有其它大分子部分释放以将释放的A1片段从内质网有效地回转至胞质溶胶，在此处所述A1片段可以形成酶活性结构，其催化地灭活中毒细胞的核糖体。具体地，预期覆盖志贺毒素A1片段的羧基端的相对大的分子部分的持续和/或无效释放会干扰志贺毒素A1片段的有效接近胞质溶胶的天然机制，这涉及A1片段的疏水羧基端结构域的暴露和ERAD系统对该结构域的识别(参见DiR等人，Toxicon 57：525-39(2011)；Li S等人，PLoS One 7：e41119(2012))。
可以假定地补偿对于包含志贺毒素A亚基衍生物的分子而言中毒细胞介导的弗林蛋白酶切割事件的缺乏。潜在补偿方案的非限制性例子包括1)用志贺毒素A1片段-样多肽区域的羧基端终止所述构建体的一个羧基端，2)产生志贺毒素来源的构建体，使得志贺毒素A亚基多肽在它的志贺毒素A1片段-样多肽的羧基端附近已经切口，3)工程改造异源和/或异位蛋白酶位点，其可以在功能上置换天然志贺毒素弗林蛋白酶切割事件的缺乏，和4)方案3和4的组合。
在第一个方案中，志贺毒素A1片段-样多肽的羧基端没有被任何羧基端部分覆盖，且因而，志贺毒素A1片段-样多肽的羧基端永久地暴露用于通过内质网中的ERAD机制识别。在最后三个方案中，可以设计志贺毒素A1片段-样多肽以在所述分子到达中毒细胞的内质网的时间之前从所述构建体的一种或多种其它组分细胞内地解离，使得在内质网中，志贺毒素A1片段-样多肽的羧基端变得暴露用于通过ERAD机制识别。例如，可以在接触靶细胞之前用蛋白酶预处理包含志贺毒素A亚基效应物多肽的细胞毒性分子以在A1片段-样区域的羧基端附近将所述多肽区域切口。可替换地，可以将细胞毒性分子工程改造成包含被靶细胞的细胞内蛋白酶切割的蛋白酶位点。
与仅包含野生型序列(其包括最佳的天然存在的弗林蛋白酶切割位点)的野生型志贺全毒素或志贺毒素A亚基构建体相比，这些用于设计志贺毒素A亚基效应物多肽(其补偿中毒细胞-介导的弗林蛋白酶切割事件的缺乏)的假定方案可以显著地改变细胞毒性的效率和效能。例如，当前不知道依赖于除了弗林蛋白酶以外的靶细胞内切蛋白酶的补偿方案，其可以提供与弗林蛋白酶切割等同的完全补偿细胞毒性，并且已经证实弗林蛋白酶的替代细胞蛋白酶如钙蛋白酶在促进志贺毒素细胞毒性方面具有更低的效率(Garred O等人，Exp Cell Res 218：39-49(1995)；Garred O等人，J Biol Chem 270：10817-21(1995)；Kurmanova A等人，Biochem Biophys Res Commun 357：144-9(2007))。
本发明提供了弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素A亚基效应物多肽，其具有有效的细胞毒性，无论是由于对中毒细胞内弗林蛋白酶切割事件的缺乏的补偿，还是由于某种不可解释的原因。本发明的某些细胞靶向分子至少象包含蛋白酶切割敏感的野生型志贺毒素效应物多肽区域的细胞靶向分子一样具有有效的和高效的细胞毒性(参见下文实施例)。
C.改善的稳定性和体内耐受性
在某些实施方案中，与弗林蛋白酶切割更敏感的类似物和/或更少去免疫化的类似物(类似物是缺少本发明的一个或多个结构特征的密切相关分子)相比，本发明的分子(例如本发明的细胞靶向分子)表现出增加的稳定性和/或改善的体内耐受性。
细胞靶向分子与参比分子相比增加的稳定性可以在体外和/或在体内表现出来。治疗或诊断分子随时间的稳定性是一个重要的特征，且可以影响所述分子可能在实践中用于的用途。分子稳定性包括体外和体内，例如，在施用以后在生物体内和在贮存过程中在一定温度和浓度范围内的稳定性。对于某些免疫毒素或配体-毒素融合体，在毒素和其它组分之间的连接的稳定性可以影响由未靶向的毒素的存在和/或量随时间在生物体内造成的非特异性毒性的量。
本发明的某些细胞靶向分子表现出降低的体内非特异性毒性，表现为与蛋白酶切割更敏感的变体相比增加的体内耐受性。技术人员使用本领域已知的和/或本文描述的技术可以确定体内耐受性。除了使用死亡率评估体内耐受性以外，可以使用发病征象来评估体内耐受性，例如，体重、身体外观、可测量的临床征象、未受刺激的行为和对外部刺激的应答的方面(参见例如Morton D，Griffiths P，Vet Rec 116：431-43(1985)；Montgomery C，Cancer Bull 42：230-7(1990)；Ullman-CulleréM，Foltz C，Lab Anim Sci 49：319-23(1999)；Clingerman K，Summers L，JAm Assoc Lab Anim Sci 51：31-6(2012))。响应于发病和/或morbundity的征象可以使用安乐死，且因而，建立死亡时间点。例如，在2-3天中15-20％的体重下降可以用作啮齿类动物中的发病迹象和用作安乐死的理由(参见例如Institute of Laboratory Animal Research 2011.Guide for the care and use oflaboratory animals，第8版，Washington，DC，U.S.：National Academies Press)。
与弗林蛋白酶切割更敏感的类似物相比针对本发明的示例性细胞靶向分子观察到的改善的体内耐受性提示，与包含弗林蛋白酶切割敏感的志贺毒素效应物多肽区域的有关分子的剂量相比，可以将高得多的剂量的本发明的这些细胞靶向分子安全地施用给哺乳动物。本发明的某些细胞靶向分子可能表现出与更多蛋白酶敏感变体相比降低的非特异性毒性，因为所述蛋白酶抗性用于保护和维持志贺毒素效应物组分和细胞靶向部分组分之间的连接。
另外，本发明的细胞靶向分子的体内耐受性可以与给定的细胞靶向分子的去免疫化性能有关。因而，与包含“未去免疫化”或更少去免疫化的志贺毒素效应物多肽(例如野生型志贺毒素A1片段)的有关分子的剂量相比，可以将更高剂量的本发明的这样的去免疫化的细胞靶向分子安全地施用给哺乳动物。
另外，本发明的某些分子表现出与蛋白酶切割更敏感的变体相比增加的体外和/或体内半衰期。通过确定目标分子关于它的组分的结合的的半衰期，可以测定分子稳定性。本发明的分子的某些实施方案将具有与弗林蛋白酶切割敏感变体相比更长的半衰期，特别是关于志贺毒素效应物多肽组分和一种或多种其它组分的继续结合。例如，与弗林蛋白酶切割敏感变体(其中一个或多个弗林蛋白酶切割敏感位点位于那两种组分之间)相比，就志贺毒素效应物多肽组分和另一种组分(例如靶向细胞的结合区域)的继续结合而言，本发明的分子的某些实施方案将具有更长的半衰期。
D.通过志贺毒素A亚基细胞毒性实现的细胞杀死
本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子的某些实施方案是细胞毒性的。本发明的细胞靶向分子的某些其它实施方案仅仅由于一个或多个志贺毒素效应物多肽组分的存在而是细胞毒性的。志贺毒素家族的成员的A亚基各自包含一旦进入细胞的胞质溶胶中就能杀死真核细胞的酶活性多肽区域。因为志贺毒素家族的成员适合杀死真核细胞，从志贺毒素来源的分子，例如，包含本发明的志贺毒素效应物多肽的某些实施方案的分子，可以表现出高效的细胞杀死活性。
对于本发明的某些实施方案的细胞靶向分子，在接触与细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理上连接的细胞(例如靶阳性细胞)后，所述细胞靶向分子能够造成所述细胞的死亡。对于某些其它实施方案，所述细胞靶向分子的CD50值小于5、2.5、1、0.5或0.25nM，其比未靶向的野生型志贺毒素效应物多肽(例如SEQ ID NO：4)远远更高效。
使用本发明的分子在不同的靶细胞条件(例如，离体操作的靶细胞、体外培养的靶细胞、在体外培养的组织样品内的靶细胞或在体内场合中如在多细胞生物内的靶细胞)下可以完成细胞杀死。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子包含(1)去免疫化的志贺毒素效应物亚区域，(2)在志贺毒素A1片段来源的区域的羧基端附近的蛋白酶切割抗性的区域，(3)羧基端内质网保留/取回信号基序；和/或(4)异源T-细胞表位嵌入的或插入的区域；但是，对于某些其它实施方案，与包含野生型志贺毒素A亚基多肽(例如，野生型志贺毒素A1片段)的参比分子相比，这些结构修饰不会显著地改变志贺毒素细胞毒性的效能。因而，本发明的去免疫化的、蛋白酶切割抗性的和/或携带嵌入的或插入的异源表位的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子可以维持高效的细胞毒性，同时提供一种或多种不同的其它功能性或性能。
技术人员使用本文提供的信息和方法可以将包含志贺毒素效应物多肽的已经细胞毒性的细胞靶向分子工程改造成更有细胞毒性和/或具有通过完全不同的机制运行的多余后援细胞毒性。这些多种细胞毒性机制可以通过它们的功能多样性(诸如通过经由直接和间接细胞杀死的两种机制以及对局部区域的免疫刺激机制来提供高效杀死)彼此补充，多余地彼此后援(诸如通过在没有其它机制存在下提供一种细胞杀死机制-比如如果靶细胞对以前的活跃机制子集有抗性或获得对以前的活跃机制子集的某种免疫)，和/或保护免于发生的抗性(通过将抗性限制于同时阻断多种不同细胞杀死机制的恶性的或被感染的细胞的更低可能情形)。
E.递送T-细胞表位用于细胞表面上的MHC I类呈递
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子包含T-细胞表位，其能够实现“T-细胞表位递送”分子的工程改造，具有用于递送的表位肽载荷的实际上无限选择和有核脊索动物细胞的细胞表面呈递。对于某些实施方案，本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子各自能够将一种或多种与志贺毒素效应物多肽和/或细胞靶向分子结合的T-细胞表位递送至细胞的蛋白酶体。然后将递送的T-细胞表位进行蛋白水解处理，并通过MHC I类途径呈递在细胞的表面上。通过将MHC I类表位工程改造进细胞靶向分子中，可以完成免疫刺激性抗原的靶向递送和呈递，以便利用和指导脊索动物免疫系统的有益功能。
对于某些实施方案，本发明的志贺毒素效应物多肽或细胞靶向分子能够将T-细胞表位递送至细胞的MHC I类分子用于细胞表面呈递。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽或细胞靶向分子包含异源T-细胞表位，无论作为另外的外源物质还是嵌入或插入在志贺毒素效应物多肽内。对于某些其它实施方案，本发明的志贺毒素效应物多肽或细胞靶向分子能够将嵌入的或插入的T-细胞表位递送至MHC I类分子用于细胞表面呈递。
对于某些实施方案，本发明的志贺毒素效应物多肽能够将嵌入或插入在志贺毒素效应物多肽中的T-细胞表位递送至所述志贺毒素效应物多肽存在于其中的细胞的MHC I类分子用于由所述细胞的表面上的MHC I类分子进行T-细胞表位的呈递。对于某些其它实施方案，所述T-细胞表位是异源T-细胞表位。对于某些其它实施方案，所述T-细胞表位作为CD8+ T-细胞表位起作用，无论是已知的还是在将来使用当前对于技术人员而言常规的方法鉴别的。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子能够将与细胞靶向分子结合的T-细胞表位递送至细胞的MHC I类分子用于由所述细胞的表面上的MHC I类分子进行T-细胞表位的呈递。对于某些其它实施方案，所述T-细胞表位是嵌入或插入在志贺毒素效应物多肽中的异源T-细胞表位。对于某些其它实施方案，所述T-细胞表位作为CD8+ T-细胞表位起作用，无论是已知的还是在将来使用当前对于技术人员而言常规的方法鉴别的。
对于某些实施方案，在使细胞与本发明的细胞靶向分子接触后，所述细胞靶向分子能够将与细胞靶向分子结合的T-细胞表位肽递送至细胞的MHC I类分子用于由所述细胞的表面上的MHC I类分子进行T-细胞表位肽的呈递。对于某些其它实施方案，所述T-细胞表位肽是嵌入或插入在志贺毒素效应物多肽中的异源表位。对于某些其它实施方案，所述T-细胞表位肽作为CD8+ T-细胞表位起作用，无论是已知的还是在将来使用当前对于技术人员而言常规的方法鉴别的。
异源表位向本发明的细胞靶向分子中的添加或异源表位在本发明的细胞靶向分子中的存在(无论作为另外的外源物质还是嵌入或插入在志贺毒素效应物多肽内)使得使用这样的细胞靶向分子的方法能够实现选择的表位的细胞靶向递送用于脊索动物内的有核靶细胞的细胞表面呈递。
本发明的某些CD8+ T-细胞超免疫的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子的一种功能是将一种或多种T-细胞表位肽递送至MHC I类分子用于细胞的MHC I类呈递。外源T-细胞表位肽向靶细胞的MHC I类系统的递送可以用于诱导靶细胞将与MHC I类分子结合的T-细胞表位肽呈递在细胞表面上，其随后导致CD8+效应物T-细胞的活化以攻击靶细胞。
技术人员使用本领域已知的技术可以将本发明的某些志贺毒素效应物多肽结合、偶联和/或连接至多种其它靶向细胞的结合区域以建立本发明的细胞靶向分子，其靶向与细胞物理上连接的特定细胞外靶生物分子并促进这些细胞靶向分子的靶细胞内化。认为所有有核的脊椎动物细胞能够使用MHC I类系统呈递细胞内表位。因而，本发明的细胞靶向分子的细胞外靶生物分子原则上可以靶向任何有核脊椎动物细胞用于将T-细胞表位递送至这样的细胞的MHC I类呈递途径。
通过本领域技术人员已知的和/或本文描述的多种标准方法，可以检测和监测本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子的表位递送功能。例如，使用多种体外和体内测定，包括，例如，MHC I类/肽复合物的直接检测/可视化、测量异源T-细胞表位肽对MHC I类分子的结合亲合力和/或通过监测细胞毒性的T-淋巴细胞(CTL)应答(参见例如下文实施例)测量靶细胞上的MHC I类-肽复合物呈递的功能后果，可以研究本发明的细胞靶向分子递送T-细胞表位肽并驱动靶细胞的MHC I类系统对表位肽的呈递的能力。
用于监测本发明的多肽和分子的这种功能的某些测定涉及在体外或离体直接检测特定MHC I类/肽抗原复合物。用于肽-MHC I类复合物的直接可视化和定量的常见方法涉及技术人员已知的多种免疫检测试剂。例如，可以开发特异性的单克隆抗体来识别特定MHC/I类/肽抗原复合物。类似地，可溶性的多聚体T细胞受体诸如TCR-STAR试剂(AltorBioscience Corp.，Mirmar，FL，U.S.)可以用于直接显示或量化特定MHC I/抗原复合物(Zhu x等人，J Immunol 176：3223-32(2006))。这些特异性的mAb或可溶性的多聚体T-细胞受体可以与多种检测方法(包括、例如免疫组织化学、流式细胞计量术和酶联免疫测定(ELISA))一起使用。
用于直接鉴别和定量MHC I/肽复合物的一种替代方法涉及质谱法分析，例如，ProPresent抗原呈递测定(ProPresent Antigen Presentation Assay，ProImmune，Inc.，Sarasota，FL，U.S.)，其中从细胞表面提取肽-MCH I类复合物，然后通过测序质谱法纯化和鉴别所述肽(Falk K等人，Nature 351：290-6(1991))。
用于监测本发明的多肽和分子的T-细胞表位递送和MHC I类呈递功能的某些测定涉及计算和/或实验方法以监测MHC I类和肽结合和稳定性。几种软件程序可供技术人员使用，用于预测肽对MHC I类等位基因的结合应答，例如，The Immune Epitope Database andAnalysis Resource (IEDB)Analysis Resource MHC-I binding prediction Consensustool(Kim Y等人，Nucleic Acid Res 40：W525-30(2012)。几种实验性测定已经常规地应用，例如，细胞表面结合测定和/或表面等离子体共振测定，以定量和/或对比结合动力学(Miles K等人，Mol Immunol 48：728-32(2011))。另外，已经开发了其它MHC-肽结合测定(例如，来自ProImmmune，Inc.的MHC-肽结合测定)，与已知的对照对比，其基于肽的稳定给定MHC I类等位基因的三元MHC-肽复合物的能力的量度。
可替换地，通过监测对特定复合物的细胞毒性T细胞(CTL)应答，可以执行细胞表面上的MHC I类/肽抗原复合物呈递的后果的测量。这些测量包括用MHC I类四聚体或五聚体试剂直接标记CTL。四聚体或五聚体直接结合以特定特异性的T细胞受体，取决于主要组织相容性复合物(MHC)等位基因和肽复合物。另外，通常测定ELISA或酶联免疫斑点(ELIspot)对释放的细胞因子(诸如干扰素γ或白介素)的定量以鉴别特定CTL应答。使用许多测定，包括经典的51铬(Cr)释放测定或替代性的非放射性的细胞毒性测定(例如，非放射性的试剂盒和试剂盒，可得自PromegaCorp.，Madison，WI，U.S.)、Granzyme B ELISpot、Caspase Activity Assays或LAMP-1易位流式细胞计数测定，可以测量CTL的细胞毒性能力。为了特异性地监测靶细胞的杀死，二乙酸羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)可以用于容易地和快速地标记目标细胞群体用于体外或体内研究以监测表位特异性的CSFE标记的靶细胞的杀死(Durward M等人，J Vis Exp45 pii 2250(2010))。
可以如下跟踪对MHC I类呈递的体内应答：施用MHC I类/抗原促进剂(例如，肽、蛋白或灭活的/减弱的病毒疫苗)，然后用活性剂(例如病毒)攻击，并监测对该试剂的应答，典型地与未接种疫苗的对照进行对比。用与前述的那些(例如CTL细胞毒性测定和细胞因子释放的定量)类似的方法，可以针对CTL活性监测离体样品。
使用免疫亲和力(例如，抗-MHC抗体“下拉”纯化)从裂解以后的中毒细胞分离HLA-A、HLA-B和/或HLA-C分子，并从纯化的复合物回收有关的肽(即，分离的MHC分子呈递的肽)。通过测序质谱法分析回收的肽。将质谱法数据与蛋白数据库文库进行对比，所述蛋白数据库文库由外源(非自身)肽(T-细胞表位X)的序列和国际人类蛋白索引(代表“自身的”或非免疫原性的肽)组成。根据概率数据库，将所述肽按照重要性排序。将所有检测的抗原(非自身)肽序列列出。通过检索乱序诱饵数据库来验证数据以减少伪命中(参见例如Ma B，Johnson R，Mol Cell Proteomics 11：O111.014902(2012))。结果证实，来自T-细胞表位X的肽在MHC复合物中呈递到中毒靶细胞的表面上。
由于表达的抗原-特异性的HLA分子，呈递的肽-抗原-MHC复合物的组可以在细胞之间变化。T-细胞然后可以使用具有不同抗原特异性的不同TCR分子识别在细胞表面上展示的特定肽-抗原-MHC复合物。
因为本发明的细胞靶向分子可以递送多个T-细胞表位，例如，通过将两个或更多个不同的T-细胞表位嵌入在单个蛋白酶体递送效应物多肽中，所以本发明的单个细胞靶向分子可以在具有不同MHC类别变体的相同物种的脊索动物中(例如，在具有不同HLA等位基因的人类中)是有效的。这可能允许基于MHC复合物蛋白多样性和多态性在单一分子内组合在不同的受试者亚群中具有不同有效性的不同T-细胞表位。例如，人MHC复合物蛋白、HLA蛋白基于遗传世系在人类中变化，例如非洲人(亚撒哈拉)、美国印第安人、高加索人、蒙古人、新几内亚人和澳大利亚人或太平洋岛人。
涉及本发明的递送T-细胞表位的多肽和分子的应用是巨大的。哺乳动物生物体中的每个有核细胞可以能够在它们的细胞外表面上进行与MHC I类分子形成复合物的免疫原性T-细胞表位肽的MHC I类途径呈递。另外，T-细胞表位识别的敏感性如此精密，以致于仅需要呈递几个MHC-I肽复合物即可导致免疫应答，例如，即使单个复合物的呈递可以足以被效应物T-细胞识别(Sykulev Y等人，Immunity 4：565-71(1996))。
T-细胞应答的活化是某些抗癌、抗赘生物、抗肿瘤和/或抗-微生物生物药物的期望特征，以刺激患者自身的针对靶向细胞的免疫系统。稳健的和强烈的T-细胞应答的活化也是许多疫苗的期望特征。生物体内靶细胞对T-细胞表位的呈递可以导致针对生物体靶细胞和/或它的一般场所的稳健免疫应答的活化。因而，可以利用用于呈递的T-细胞表位的靶向递送作为在治疗方案期间激活T-细胞应答的机制。
MHC I类系统对T-细胞免疫原性表位肽的呈递靶向呈递细胞用于通过CTL介导的裂解来杀死，并且也触发局部微环境中的免疫刺激。通过工程改造内化靶细胞的治疗分子的志贺毒素效应物多肽组分内的免疫原性表位序列，可以完成免疫刺激性抗原的靶向递送和呈递。靶细胞对免疫刺激性的非自身抗原(例如具有高免疫原性的已知病毒抗原)的呈递会向其它免疫细胞发信号以破坏靶细胞以及将更多免疫细胞募集至该区域。
MHC I类复合物对免疫原性的T-细胞表位肽的呈递会靶向呈递细胞用于通过CTL介导的细胞裂解来杀死。靶向的细胞对免疫刺激性的非自身抗原(例如，具有高免疫原性的已知病毒表位肽)的呈递可以向其它免疫细胞发信号以破坏靶细胞以及将更多免疫细胞募集至脊索动物内的靶细胞部位。
因而，使用本发明的方法可以将已经细胞毒性的分子(例如包含志贺毒素效应物多肽的治疗性的或潜在治疗性的分子)工程改造成更细胞毒性的分子和/或具有通过效应物T-细胞的T-细胞表位递送、呈递和刺激而运行的另外细胞毒性机制。这些多种细胞毒性机制可以彼此补充(诸如通过提供直接靶细胞杀死和间接(CTL-介导的)细胞杀死，多余地彼此后援(诸如在没有其它细胞杀死机制存在下提供一种细胞杀死机制)，和/或保护免于治疗抗性的发生(通过将抗性限制于同时阻断两种不同细胞杀死机制的恶性的或被感染的细胞的更低可能情形)。
另外，技术人员使用常规方法可以将包含志贺毒素效应物多肽区域的细胞毒性分子(其表现出基于催化的细胞毒性)工程改造成无酶活性的变体。例如，可以如下给细胞毒性分子的细胞毒性志贺毒素效应物多肽组分赋予降低的活性和/或使得无活性：引入一个或多个突变和/或截短，使得得到的分子通过它的将T-细胞表位递送至靶细胞的MHC I类系统并随后呈递至靶细胞表面的能力可以仍然是细胞毒性的。在另一个实施例中，可以将T-细胞表位插入或嵌入志贺毒素效应物多肽，使得所述志贺毒素效应物多肽被添加的表位灭活(参见例如WO 2015/113007)。该方案会除去一种细胞毒性机制，同时保留或添加另一种，并且也可以提供这样的分子：其能够经由递送的T-细胞表位呈递或“抗原播种”表现出对生物体内的靶细胞的局部区域的免疫刺激。此外，包含嵌入的或插入的异源T-细胞表位的本发明的细胞靶向分子的非细胞毒性变体可以在涉及脊索动物内的免疫刺激和/或用MHC I类分子展示的表位标记脊索动物内的靶细胞的应用中是有用的。
在不同条件下和在有非靶向的旁观细胞(例如，离体操作的靶细胞、体外培养的靶细胞、在体外培养的组织样品内的靶细胞或在体内场合中如在多细胞生物内的靶细胞)存在下，可以完成本发明的某些志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子的递送T-细胞表位的能力。
F.细胞毒性T-细胞经由靶向细胞毒性和/或接合的细胞杀死
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子可以提供1)T-细胞表位的递送用于靶细胞的MHC I类呈递和/或2)高效的细胞毒性。对于本发明的某些实施方案的细胞靶向分子，在接触与靶向细胞的结合区域的细胞外靶生物分子物理上连接的细胞后，本发明的细胞靶向分子能够造成所述细胞的死亡。细胞杀死机制可以是直接的(例如经由毒素效应物多肽区域的酶活性)或间接的(经由CTL介导的细胞裂解)。
1.经由T-细胞表位递送和MHC I类呈递的间接细胞杀死
本发明的细胞靶向分子的某些实施方案是细胞毒性的，因为它们包含能够被递送至靶细胞的MHC I类呈递途径并呈递在靶细胞的细胞表面上的CD8+ T-细胞表位。例如，本发明的递送T-细胞表位的CD8+ T-细胞超免疫的志贺毒素效应物多肽(经过或未经过内源性表位去免疫化)可以用作细胞靶向分子的组分用于涉及间接细胞杀死的应用。
在本发明的细胞靶向分子的某些实施方案中，在接触与靶向细胞的结合区域的细胞外靶生物分子物理上连接的细胞后，本发明的细胞靶向分子能够间接地造成细胞的死亡，例如，经由靶细胞对一种或多种T-细胞表位的呈递和杀死靶细胞的CTL的随后募集。
细胞对与MHC I类分子形成复合物的抗原肽的呈递会敏化呈递细胞以经由细胞凋亡、裂解和/或坏死的诱导而被细胞毒性T-细胞(CTL)靶向杀死。另外，识别靶细胞的CTL可以释放免疫刺激性细胞因子，例如，干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF)、巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)和白介素诸如IL-17、IL-4和IL-22。此外，通过呈递的表位的识别而活化的CTL可以无差别地杀死在呈递细胞近侧的其它细胞，不论由那些近侧细胞呈递的肽-MHC I类复合物清单(Wiedemann A等人，Proc Natl Acad Sci USA 103：10985-90(2006))。
因为不同物种内的MHC等位基因多样性，仅包含单个表位的本发明的细胞靶向分子可以表现出对相同物种的不同患者或受试者的不同有效性。但是，本发明的细胞靶向分子的某些实施方案可以各自包含多种能够同时递送至靶细胞的MHC I类系统的T-细胞表位。因而，对于本发明的细胞靶向分子的某些实施方案，使用细胞靶向分子来治疗在他们的MHC分子的表位肽结合亲合力方面存在显著差异(即在他们的MHC等位基因和/或MHC基因型方面的显著差异)的不同受试者。另外，通过同时使用多种细胞杀死机制(例如同时经由多种不同T-细胞表位的直接杀死和间接杀死)，本发明的细胞靶向分子的某些实施方案减少或阻止靶细胞适应以逃逸杀死(例如靶癌细胞突变以逃逸治疗有效性或“突变体逃逸”)。
2.经由靶向细胞的志贺毒素细胞毒性的直接细胞杀死
本发明的细胞靶向分子的某些实施方案是细胞毒性的，因为它们包含催化活性的志贺毒素效应物多肽，且不论免疫原性的CD8+ T-细胞表位在分子中的存在。例如，本发明的CD8+ T-细胞超免疫的志贺毒素效应物多肽(经过或未经过内源性表位去免疫化)可以用作细胞靶向分子的组分用于涉及直接细胞杀死的应用。例如，经由志贺毒素效应物多肽的核糖体毒性酶活性或由于非催化机制引起的核糖体结合和核糖体功能干扰。
对于本发明的CD8+ T-细胞超免疫的细胞靶向分子的某些实施方案，在接触与靶向细胞的结合区域的细胞外靶生物分子物理上连接的细胞后，本发明的细胞靶向分子能够直接造成细胞的死亡，例如，不涉及未靶向的细胞毒性T-细胞(参见部分V-D，出处同上)。
G.在细胞类型之间的选择件细胞毒性
本发明的某些细胞靶向分子用于在有未靶向的旁观细胞存在下选择性地杀死特定靶细胞。通过经由靶向细胞的结合区域将本发明的志贺毒素效应物多肽的递送靶向特定细胞，本发明的细胞靶向分子可以表现出细胞类型特异性的、局限性的细胞杀死活性，从而导致在有未靶向的细胞存在下排它地或优先地杀死选择的细胞类型。类似地，通过将免疫原性的T-细胞表位的递送靶向靶细胞的MHC I类途径，可以将由本发明的细胞靶向分子诱导的T-细胞表位随后呈递和CTL介导的靶细胞的细胞裂解限制为在有未靶向的细胞存在下排它地或优先地杀死选择的细胞类型。另外，本发明的单个细胞靶向分子可以完成细胞毒性的志贺毒素效应物多肽区域和免疫原性的T-细胞表位的细胞靶向递送，使得在有未靶向的细胞存在下潜在细胞毒性组分的递送排它地或优先地限于靶细胞。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子在某些浓度是细胞毒性的。在某些实施方案中，在将本发明的细胞靶向分子施用给细胞类型的混合物后，细胞毒性的细胞靶向分子能够相对于与细胞外靶生物分子没有物理上连接的细胞类型选择性地杀死与细胞外靶生物分子物理上连接的那些细胞。对于某些实施方案，本发明的细胞毒性的细胞靶向分子能够选择性地或优先地造成两个或更多个不同细胞类型的混合物内的特定细胞类型的死亡。这能够实现与不表达靶生物分子的“旁观者”细胞类型相比高优先的对特定细胞类型的靶向细胞毒性活性，诸如3倍细胞毒性效应。可替换地，如果靶生物分子以足够低的量表达和/或以小量与未靶向的细胞类型物理上连接，结合区域的靶生物分子的表达可以非专属于一种细胞类型。这能够实现与不表达显著量的靶生物分子或没有与显著量的靶生物分子物理上连接的“旁观者”细胞类型相比高优先的对特定细胞类型的靶向细胞杀死，诸如3倍细胞毒性效应。
对于某些其它实施方案，在将细胞毒性的细胞靶向分子施用给两个不同的细胞类型群体后，细胞毒性的细胞靶向分子能够造成细胞死亡，如通过靶细胞群体(其成员表达细胞毒性的细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子)上的半数最大细胞毒性浓度(CD50)所确定的，其剂量比相同细胞毒性的细胞靶向分子对于其成员不表达细胞毒性的细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子的细胞群体的CD50剂量低至少3倍。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子对与细胞外靶生物分子物理上连接的细胞类型的群体的细胞毒性活性是没有与结合区域的任何细胞外靶生物分子物理上连接的细胞类型群体的细胞毒性活性的至少3倍高。根据本发明，可以以下述比率(a/b)的方式定量选择性的细胞毒性：(a)对与结合区域的靶生物分子物理上连接的特定细胞类型的细胞群体的细胞毒性，除以(b)对没有与结合区域的靶生物分子物理上连接的细胞类型的细胞群体的细胞毒性。在某些实施方案中，所述细胞毒性比率指示，相对于没有与结合区域的靶生物分子物理上连接的细胞群体或细胞类型，对与结合区域的靶生物分子物理上连接的细胞群体或细胞类型的选择性的细胞毒性高至少3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍、750倍或1000倍。
对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子的优先细胞杀死功能或选择性细胞毒性是由于另外的外源物质(例如细胞毒性的物质)和/或存在于本发明的志贺毒素效应物多肽中的异源T-细胞表位，且不一定是志贺毒素效应物多肽区域的催化活性的结果。
该优先细胞杀死功能允许本发明的某些细胞毒性的细胞靶向分子在不同条件下和在有非靶向的旁观者细胞(诸如离体操纵的细胞类型的混合物、体外培养的含有细胞类型混合物的组织)存在下、或在体内在有多个细胞类型存在下(例如原位或在多细胞生物体内的其天然位置)杀死靶向细胞。
H.另外的外源物质向靶向细胞的内部的递送
除了细胞毒性应用、细胞生长抑制性应用和免疫刺激性应用以外，本发明的细胞靶向分子任选地可以用于靶向的细胞内递送功能，例如，在涉及信息收集和诊断功能的应用中。
因为本发明的细胞靶向分子(包括其降低的细胞毒性和/或无毒形式)能够进入与细胞外靶生物分子(其被细胞靶向分子的结合区域识别)物理上连接的细胞中，本发明的细胞靶向分子的某些实施方案可以用于将另外的外源物质递送进靶向细胞类型的内部。例如，本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的无毒变体或任选地细胞毒性的变体可以用于将另外的外源物质递送至与细胞靶向分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理上连接的细胞的内部和/或标记所述细胞。本发明的用于接收外源物质的细胞靶向分子可以靶向表达靶生物分子到至少一个细胞表面的不同类型的细胞和/或细胞群体。本发明的功能组分是模块化的，因为不同的志贺毒素效应物多肽、另外的外源物质和结合区域可以彼此结合以提供适合用于多种涉及载荷递送(例如，肿瘤细胞的非侵袭性体内成像)的应用的细胞靶向分子。
本发明的某些细胞靶向分子的这种外源物质递送功能可以在不同条件下和在有非靶向的旁观细胞(例如，离体操作的靶细胞、体外培养的靶细胞、在体外培养的组织样品内的靶细胞或在体内场合中如在多细胞生物内的靶细胞)存在下完成。此外，本发明的某些细胞靶向分子将外源物质向某些细胞的选择性递送可以在不同条件下和在有非靶向的旁观细胞(诸如细胞类型的离体操作混合物、含有细胞类型的混合物的体外培养组织或在有多种细胞类型存在下在体内(例如在原位或在多细胞生物内的天然位置))存在下完成。
不能(诸如在某些浓度范围)杀死靶细胞和/或递送嵌入的或插入的表位用于由靶细胞的MHC分子进行细胞表面呈递的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子仍然可以用于将外源物质递送进细胞中，例如，检测促进剂。
对于某些实施方案，本发明的志贺毒素效应物多肽表现出低至零细胞毒性，且因而在本文中被称作“非细胞毒性的和/或降低的细胞毒性的”。对于某些实施方案，本发明的细胞靶向分子表现出低至零细胞毒性，且可以被称作“非细胞毒性的”和/或“降低的细胞毒性的变体”。例如，本发明的分子的某些实施方案不会表现出显著水平的基于志贺毒素的细胞毒性，其中在小于1000nM、500nM、100nM、75nM、50nM的剂量，与适当的参比分子相比不存在显著量的细胞死亡，例如，如通过技术人员已知的和/或本文描述的测定所测量的。对于某些其它实施方案，本发明的分子在1-100μg/千克哺乳动物接受者的剂量没有表现出任何毒性。降低的细胞毒性的变体在某些浓度或剂量仍然可以是细胞毒性的，但是表现出降低的细胞毒性，例如，在某些情形不能表现出显著水平的志贺毒素细胞毒性。
可以使本发明的志贺毒素效应物多肽和某些包含它们的细胞靶向分子成为非细胞毒性的，例如，通过将技术人员已知的一个或多个氨基酸置换添加给无活性的志贺毒素A亚基和/或志贺毒素效应物多肽，包括本文描述的示例性置换。与更细胞毒性的变体相比，本发明的细胞靶向分子的非细胞毒性的和降低的细胞毒性的变体在某些情形下可以更适合用于递送另外的外源物质。
用于诊断功能的信息收集
本发明的某些细胞靶向分子具有在特定细胞、细胞类型和/或细胞群体、以及前述任一种的特定亚细胞区室的体外和/或体内检测中的应用。与检测促进剂缀合的本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的降低的细胞毒性和/或无毒形式任选地可以用于诊断功能，诸如用于与包含相同或有关结合区域(例如，以高亲和力结合相同靶生物分子、重叠表位和/或相同表位的结合区域)的治疗方案结合使用的伴侣诊断。
在某些实施方案中，将本文描述的细胞靶向分子用于诊断和治疗，或用于单独诊断。当将相同的细胞毒性的细胞靶向分子用于诊断和治疗时，对于本发明的某些实施方案，包含用于诊断的检测促进剂的细胞靶向分子变体可能具有降低的它的细胞毒性，或可以通过一个或多个氨基酸置换(包括本文描述的示例性置换)对它的志贺毒素效应物多肽区域的催化灭活而变得无毒。例如，本发明的细胞靶向分子的某些无毒变体在小于1mg/kg的剂量施用以后表现出小于5％、4％、3％、2％或1％的靶细胞死亡。降低的细胞毒性变体在某些浓度或剂量仍然可能是细胞毒性的，但是表现出降低的细胞毒性，例如，不能表现出显著水平的如本文中所述的志贺毒素细胞毒性。
将本领域已知的检测促进剂与本发明的各种细胞靶向分子缀合的能力会提供用于检测某些细胞(例如，癌症、肿瘤、免疫和/或被感染的细胞)的有用组合物。通过本领域已知的各种成像技术和测定，本发明的细胞靶向分子的这些诊断实施方案可以用于信息收集。例如，通过患者或活组织检查样品中各个癌细胞、免疫细胞和/或受感染的细胞的细胞内细胞器(例如内吞区室、高尔基区室、内质网区室和细胞溶质区室)的成像，本发明的细胞靶向分子的诊断实施方案可以用于信息收集。
使用本发明的细胞靶向分子的诊断实施方案可以收集不同类型的信息，无论用于诊断用途还是其它用途。该信息可用于，例如，诊断赘生性细胞类型，确定患者的疾病的治疗敏感性，测定抗肿瘤治疗随时间的进展，测定免疫调节治疗随时间的进展，测定抗微生物治疗随时间的进展，评价受感染的细胞在移植物中的存在，评价不希望的细胞类型在移植物中的存在，和/或评价肿瘤块的外科手术切除以后残余肿瘤细胞的存在。
例如，使用用本发明的细胞靶向分子的诊断变体收集的信息，可能确定患者亚群，然后可以基于使用那些诊断实施方案揭示的他们的独特特征将各个患者进一步分类成亚群。例如，特定药物或治疗的有效性可能是用于定义患者亚群的一种判据。例如，可以使用本发明的特定细胞毒性的细胞靶向分子的无毒诊断变体区分哪些患者属于预期对本发明的该细胞靶向分子的细胞毒性变体做出阳性应答的患者的类别或亚群。因此，使用本发明的细胞靶向分子(包括本发明的细胞毒性的细胞靶向分子的无毒变体)进行患者鉴别、患者分级和诊断的有关方法被认为是在本发明范围内。
为了本发明的细胞靶向分子的细胞靶向，例如，用于直接细胞杀死、间接细胞杀死、外源物质(如T-细胞表位)的递送和/或信息收集，细胞对靶生物分子的表达不需要是天然的。靶生物分子的细胞表面表达可以是感染、病原体的存在和/或细胞内微生物病原体的存在的结果。靶生物分子的表达可以是人工的，例如，通过病毒表达载体感染以后的被迫或诱导表达，参见例如腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒系统。诱导靶生物分子的表达的一个例子是暴露于维A酸类(如全反式视黄酸和各种合成的维A酸类)或任何视黄酸受体(RAR)激动剂的细胞的CD38表达的上调(Drach J等人，Cancer Res 54：1746-52(1994)；Uruno A等人，J Leukoc Biol 90：235-47(2011))。通过暴露于促分裂原、植物凝集素(PHA)、葡萄球菌蛋白A、EBV病毒、人T-细胞白血病病毒1或2(HTLV-1或HTLV-2)，可以在B-细胞和T-细胞中诱导CD30的表达(参见例如Stein H等人，Blood 66：848-58(1985))。在另一个实施例中，通过将细胞暴露于电离辐射可以诱导CD20、HER2和EGFR表达(Wattenberg M等人，Br J Cancer110：1472-80(2014))。此外，PSMA表达响应于雄激素剥夺而上调(参见例如Chang S等人，Cancer 88：407-15(2000)；Meller B等人，EJNMMIRes 5：66(2015))。
VI.本发明的志贺毒素效应物多肽和包含它们的细胞靶向分子的生产、制备和纯
化
使用本领域技术人员众所周知的技术可以生产本发明的志贺毒素效应物多肽和某些细胞靶向分子。例如，通过标准合成方法、通过使用重组表达系统或通过任意其它合适的方法，可以制备本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子。因而，可以以许多方式合成本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子，所述方式包括、例如包括以下步骤的方法：(1)使用标准固相或液相方法(分步地或通过片段组装)来合成细胞靶向分子的多肽或多肽组分，并且分离和纯化最终的多肽化合物产物；(2)在宿主细胞中表达编码本发明的细胞靶向分子的蛋白或蛋白组分的多核苷酸，并且从宿主细胞或宿主细胞培养物中回收表达产物；或(3)进行编码本发明的细胞靶向分子的多肽或多肽组分的多核苷酸的无细胞体外表达，并且回收表达产物；或者通过(1)、(2)或(3)的方法的任意组合以获得蛋白组分的片段，随后将肽或多肽片段结合(例如连接)以获得多肽组分，并且回收所述多肽组分。
可能优选的是，借助于固相或液相肽合成合成本发明的志贺毒素效应物多肽、本发明的细胞靶向分子或本发明的细胞靶向分子的蛋白组分。可以适当地通过标准合成方法生产本发明的多肽和细胞靶向分子。因而，可以通过例如这样的方法来合成肽：所述方法包括通过标准固相或液相方法、分步地或通过片段组装来合成肽，并且将最终的肽产物分离并纯化。在该背景下，可以参考WO 1998/011125，或尤其是Fields G等人，Principles andPractice of Solid-Phase Peptide Synthesis(Synthetic Peptides，Grant G，编，Oxford University Press，U.K.，第2版，2002)以及其中的合成实施例。
使用本领域众所周知的重组技术，可以制备(生产和纯化)本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子。一般而言，通过培养用包含编码多核苷酸的载体转化或转染的宿主细胞并且从细胞培养物中纯化或回收蛋白来制备所述蛋白的方法被描述于，例如Sambrook J等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press，NY，U.S.，1989)；Dieffenbach C等人，PCR Primer：A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.，U.S.，1995)。任意合适的宿主细胞可以用于生产本发明的多肽和/或细胞靶向蛋白。宿主细胞可以是用一种或多种驱动本发明的多肽表达的表达载体稳定地或瞬时地转染、转化、转导或感染的细胞。此外，通过修饰编码本发明的多肽或细胞靶向蛋白的多核苷酸，可以生产本发明的志贺毒素效应物多肽和/或细胞靶向分子，所述修饰导致改变一个或多个氨基酸或者删除或插入一个或多个氨基酸，以便实现期望的性能，诸如改变的细胞毒性、改变的细胞生长抑制作用和/或改变的血清半衰期。
存在多种可以选择用来生产本发明的多肽或细胞靶向蛋白的表达系统。例如，用于表达本发明的细胞靶向蛋白的宿主生物包括：原核生物，诸如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，真核细胞，诸如酵母和丝状真菌(如酿酒酵母(S.cerevisiae)，巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、泡盛曲霉(A.awamori)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis))，藻类(如莱茵衣藻(C.reinhardtii))，昆虫细胞系，哺乳动物细胞(如CHO细胞)，植物细胞系，和真核生物诸如转基因植物(如拟南芥(A.thaliana)和本赛姆氏烟草(N.benthamiana))。
因此，本发明还提供了根据以上所述方法并且使用编码本发明的多肽的部分或全部或本发明的细胞靶向蛋白的蛋白组分的多核苷酸、包含当被引入到宿主细胞中时能够编码本发明的多肽或细胞靶向蛋白的部分或全部的本发明的至少一种多核苷酸的表达载体、和/或包含本发明的多核苷酸或表达载体的宿主细胞来生产本发明的志贺毒素效应物多肽和/或细胞靶向分子的方法。
当使用重组技术在宿主细胞或无细胞系统中表达蛋白时，有利的是，从其它组分诸如宿主细胞因子中分离(或纯化)出期望的蛋白，从而获得高纯度的或基本均质的制品。纯化可以通过本领域众所周知的方法完成，诸如离心技术、萃取技术、色谱和分级分离技术(例如，通过凝胶过滤的尺寸分离、通过离子交换柱的电荷分离、疏水相互作用色谱法、反相色谱法、在硅胶或阳离子交换树脂诸如DEAE等上的色谱法、色谱聚焦、和蛋白A琼脂糖色谱法，以除去污染物)，以及沉淀技术(例如乙醇沉淀或硫酸铵沉淀)。任何数量的生物化学纯化技术可以用于增加本发明的多肽和/或细胞靶向分子的纯度。在某些实施方案中，本发明的多肽和细胞靶向分子可以任选地以同多聚体形式(例如包含两个或更多个本发明的多肽或细胞靶向分子的分子复合物)纯化。
在下面的实施例中是用于生产本发明的示例性志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子的方法的非限制性实施例的描述，以及生产方法的具体的、但是非限制性的方面。
VII.包含本发明的细胞靶向分子的药物和诊断组合物
本发明提供了志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子，其单独地或与一种或多种另外的治疗剂组合地在药物组合物中用于治疗或预防以下更详细地描述的病患、疾病、病患或症状(例如癌症、恶性肿瘤、非恶性肿瘤、生长异常、免疫病症和微生物感染)。本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的志贺毒素多肽或细胞靶向分子或根据本发明的其药学上可接受的盐或溶剂合物，以及至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或赋形剂。在某些实施方案中，本发明的药物组合物可以包含本发明的志贺毒素效应物多肽或细胞靶向分子的同多聚体和/或异多聚体形式。本发明的药物组合物可用在治疗、改善、或预防以下更详细地描述的疾病、病患、病患或症状的方法中。预期每种这样的疾病、病患、病患或症状是就根据本发明的药物组合物的应用而言的单独实施方案。本发明还提供了用在至少一种如以下更详细地描述的根据本发明的治疗方法中的药物组合物。
本文中使用的术语“患者”和“受试者”互换使用以表示表现出至少一种疾病、病症或病患的症状、征象和/或指征的任何生物体，通常是脊椎动物诸如人类和动物。这些术语包括哺乳动物诸如灵长类动物、家畜动物(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)、伴侣动物(例如猫、狗等)和实验动物(例如小鼠、兔、大鼠等)的非限制性例子。
本文中使用的“治疗”或“处理”及其语法变体表示用于获得有益的或期望的临床结果的方案。该术语可以表示延缓病患、病患或疾病的发作或发展速度，减轻或缓解与其有关的症状，产生病患的全部或部分消退，或者以上任何的一些组合。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括、但不限于：症状的减轻或缓解、疾病程度的降低、疾病状态的稳定(例如不恶化)、疾病进展的推迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及康复(无论是部分的还是完全的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”或“处理”还可以是指相对于在不接受治疗的情况下预期的存活时间延长存活。需要治疗的受试者(例如人)因此可以是已经罹患所讨论的疾病或病患的受试者。术语“治疗”或“处理”包括相对于不存在治疗的情况抑制或减轻病理学状态或症状的严重程度的增加，并且不一定意味着暗示相关疾病、病症或病患的完全停止。关于肿瘤和/或癌症，治疗包括总肿瘤负荷和/或单个肿瘤大小的减小。
本文中使用的术语“防止”、“预防”及其语法变体表示用于预防病患、疾病或病患的发展或者改变病患、疾病或病患的病理学的方案。因此，“预防”可以表示预防或防止的措施。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括、但不限于：预防或减慢疾病的症状、进展或发展，无论是否是可检测的还是不可检测的。需要预防的受试者(例如人)因此可以是尚未罹患所讨论的疾病或病患的受试者。术语“预防”包括相对于不存在治疗的情况减慢疾病的发作，并且不一定意图暗示相关疾病、病症或病患的永久性预防。因此病患的“预防”在某些上下文中可以表示降低发展病患的风险，或者预防或延迟与该病患有关的症状的发展。
本文中使用的“有效量”或“治疗有效量”是在受试者中产生至少一种期望的治疗效果的组合物(例如治疗组合物、化合物或试剂)的量或剂量，诸如预防或治疗靶病患或有益地缓解与该病患有关的症状。最合乎需要的治疗有效量是将会产生由本领域技术人员为有此需要的给定受试者选择的具体治疗的期望效力的量。该量将随技术人员理解的多种因素变化，包括、但不限于，治疗性组合物的特征(包括活性、药代动力学、药效动力学和生物利用度)，受试者的生理条件(包括年龄、性别、疾病类型、疾病阶段、一般身体状况、对给定剂量的应答性、和药物的类型)，制剂中一种或多种药学上可接受的载体的性质，和施用途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过例行实验确定治疗有效量，即通过监测受试者对组合物的施用的应答并且相应地调节剂量(参见例如Remington：The Science andPractice of Pharmacy(Gennaro A，编，Mack Publishing Co.，Easton，PA，U.S.，第19版，1995))。
本发明的诊断组合物包含本发明的细胞靶向分子和一种或多种检测促进剂。当生产或制备本发明的诊断组合物时，可以将本发明的细胞靶向分子直接地或间接地连接至一种或多种检测促进剂。存在众多技术人员已知的用于将多种检测促进剂掺入、固定和/或缀合至蛋白或分子的蛋白性组分(特别是免疫球蛋白和免疫球蛋白来源的结构域)的标准技术。
存在众多技术人员已知的检测促进剂，诸如同位素、染料、比色测量剂、反差增强剂、荧光剂、生物发光剂和磁性试剂，其可以可操作地连接至本发明的多肽或细胞靶向分子用于信息收集方法，诸如用于生物体的疾病、病症或病患的诊断和/或预后应用(参见例如Cai W等人，J Nucl Med 48：304-10(2007)；Nayak T，Brechbiel M，Bioconjug Chem 20：825-41(2009)；Paudyal P等人，Oncol Rep 22：115-9(2009)；Qiao J等人，PLoS ONE 6：e18103(2011)；Sano K等人，Breast Cancer Res 14：R61(2012))。这些试剂可以在任意合适的位置与本发明的多肽或细胞靶向分子结合、连接和/或掺入其中。例如，检测促进剂的连接或掺入可以是经由本发明的分子的氨基酸残基或经由本领域已知的某种类型的连接，包括经由接头和/或螯合剂。所述试剂的掺入是以这样的方式：能够在筛选、测定、诊断操作和/或成像技术中检测诊断组合物的存在。
类似地，存在技术人员已知的众多成像方案，诸如在医学领域中常用的非侵袭性体内成像技术，例如：计算机体层摄影术成像(CT scanning)、光学成像(包括直接的、荧光的和生物发光的成像)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机体层摄影术(SPECT)、超声和x-射线计算机体层摄影术成像。
VIII.包含本发明的细胞靶向分子的药物和/或诊断组合物的生产或制备
本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子中的任一种的药学上可接受的盐或溶剂合物是在本发明范围内。
术语“溶剂合物”在本发明的上下文中表示在溶质(在本发明中，根据本发明的蛋白性化合物或其药学上可接受的盐)和溶剂之间形成的确定化学计量的复合物。在这方面的溶剂可以是，例如，水、乙醇或另一种药学上可接受的、典型地为小分子的有机物质，例如，但不限于，乙酸或乳酸。当所讨论的溶剂是水时，这样的溶剂合物通常被称为水合物。
可以将本发明的多肽和蛋白或其盐配制成为了贮存或施用而制备的药物组合物，所述药物组合物典型地包含在药学上可接受的载体中的治疗有效量的本发明的分子或其盐。术语“药学上可接受的载体”包括任何标准的药物载体。用于治疗分子用途的药学上可接受的载体是制药领域中众所周知的，并且描述于例如Remington’s PharmaceuticalSciences(Mack Publishing Co.(A.Gennaro，编，1985)中。本文中使用的“药学上可接受的载体”包括任意的和所有的生理上可接受的(即相容的)溶剂、分散介质、包衣剂、抗微生物剂等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体或稀释剂包括在适合用于口服、直肠、鼻或胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内、真皮内和透皮)施用的制剂中使用的那些。示例性的药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。可以在本发明的药物组合物中采用的合适水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、和它们的合适混合物，植物油诸如橄榄油，以及可注射的有机酯诸如油酸乙酯。可以维持适当的流动性，例如，通过使用包衣材料如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂。在某些实施方案中，所述载体适合用于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于所选择的施用途径，可以将所述蛋白或其它药物组分包被在物质中，所述物质意图保护化合物免于当通过特定施用途径施用给患者时活性蛋白可能遇到的低pH和其它天然灭活条件的作用。
本发明的药物组合物的制剂可以方便地以单位剂型呈现，并且可以通过药学领域众所周知的任何方法制备。以这种形式，将组合物分入含有适当量的活性组分的单位剂量中。单位剂型可以是包装的制剂，含有离散量的制剂的包装，例如，小包片剂、胶囊剂、和在管形瓶或安瓿瓶中的粉剂。单位剂型还可以是胶囊剂、扁囊剂、或片剂本身，或者它可以是适当数量的这些包装形式中的任一种。它可以以单次剂量可注射形式例如以笔的形式提供。可以为任意合适的施用途径和方式配制组合物。皮下或透皮施用模式可以特别适用于本文描述的治疗性蛋白。
本发明的药物组合物还可以含有佐剂诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌操作，和通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等，可以确保防止微生物的存在。组合物中的等渗剂，诸如糖、氯化钠等，也可能是合乎需要的。此外，通过包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射药物形式的延长吸收。
本发明的药物组合物还任选地包括药学上可接受的抗氧化剂。示例性的药学上可接受的抗氧化剂是水溶性的抗氧化剂诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；油溶性的抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴香醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的不同的多肽和/或细胞靶向分子或前述任一种的酯、盐或酰胺中的一种或组合，以及至少一种药学上可接受的载体。
治疗组合物典型地在制造和储存条件下是无菌和稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳液、脂质体、或适合高药物浓度的其它有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，包括，例如，水、醇诸如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇)、或任何合适的混合物。可以维持适当的流动性，例如，通过使用包衣诸如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒尺寸，以及通过本领域众所周知的制剂化学使用表面活性剂。在某些实施方案中，等渗剂(例如糖类和多元醇诸如甘露醇、山梨醇，或氯化钠)可以是在组合物中合乎需要的。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。
用于真皮内或皮下应用的溶液或混悬液典型地包括以下一种或多种：无菌稀释剂诸如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和张度调节剂例如，氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱(诸如盐酸或氢氧化钠)或者含有柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐等的缓冲液调节pH。这样的制品可以封装在安瓿瓶、一次用弃注射器或由玻璃或塑料制成的多次剂量管形瓶中。
可以如下制备无菌注射溶液：将所需量的本发明的多肽或细胞靶向分子掺入含有上述成分中的一种或组合的适当溶剂中，当需要时，随后灭菌微滤。通过将活性化合物掺入含有分散介质和其它成分(诸如上述的那些)的无菌赋形剂中，可以制备分散体。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(低压冻干法)，其产生活性成分以及来自其无菌过滤溶液的任何另外期望成分的粉末。
当将治疗有效量的本发明的多肽和/或细胞靶向分子设计为通过例如静脉内、皮肤或皮下注射来施用时，结合剂将呈无热原的、胃肠外可接受的水溶液的形式。考虑到适当的pH、等渗性、稳定性等，用于制备胃肠外可接受的蛋白溶液的方法是在本领域技术内。除了结合剂之外，用于静脉内、皮肤、或皮下注射的优选药物组合物将含有等渗赋形剂诸如氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、含有乳酸盐的林格氏注射液、或本领域已知的其它赋形剂。本发明的药物组合物还可以含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂、或本领域技术人员众所周知的其它添加剂。
如本文别处所述，本发明的多肽和/或细胞靶向分子可以用保护活性治疗剂免于快速释放的载体来制备，诸如受控释放制剂，包括植入物、透皮贴剂、和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多用于制备这样的制剂的方法被授予专利或是本领域技术人员通常已知的(参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(Robinson J，编，Marcel Dekker，Inc.，NY，U.S.，1978))。
在某些实施方案中，可以配制本发明的组合物(例如药物和/或诊断组合物)以确保本发明的细胞靶向分子的期望体内分布。例如，血脑屏障排除许多大的和/或亲水的化合物。为了将本发明的治疗分子或组合物靶向至特定体内位置，可以将它们配制在例如脂质体中，所述脂质体可以包含被选择性地运输进特定细胞或器官中的一个或多个部分，从而增强靶向药物递送。示例性的靶向部分包括叶酸盐或生物素；甘露糖苷；抗体；表面活性蛋白A受体；p120联蛋白等。
药物组合物包括被设计成用作植入物或微粒系统的胃肠外制剂。植入物的例子是由聚合的或疏水的组分(诸如乳剂、离子交换树脂和可溶性的盐溶液)组成的贮库制剂。微粒系统的例子是微球、微粒、纳米囊、纳米球和纳米颗粒(参见例如Honda M等人，Int JNanomedicine 8：495-503(2013)；Sharma A等人，BiomedRes Int 2013：960821(2013)；Ramishetti S，Huang L，Ther Deliv 3：1429-45(2012))。使用对离子敏感的聚合物，例如，脂质体、polaxamer 407和羟磷灰石，可以制备控释制剂。
IX.本发明的多核苷酸、表达载体和宿主细胞
除了本发明的多肽和细胞靶向分子以外，在本发明范围内还包括编码本发明的多肽和细胞靶向分子或其功能部分的多核苷酸。术语“多核苷酸”等同于术语“核酸”，其中的每一个包括以下的一个或多个：脱氧核糖核酸(DNA)的聚合物、核糖核酸(RNA)的聚合物、使用核苷酸类似物产生的这些DNA或RNA的类似物、以及它们的衍生物、片段和同源物。本发明的多核苷酸可以是单链的、双链的或三链的。这样的多核苷酸被具体公开为包括所有能够编码示例性蛋白的多核苷酸，例如，考虑已知在RNA密码子的第三位中可容忍的但是编码与不同RNA密码子相同的氨基酸的摆动(wobble)(参见Stothard P，Biotechniques 28：1102-4(2000))。
在一个方面，本发明提供了多核苷酸，其编码本发明的志贺毒素效应物多肽和/或细胞靶向分子、或其片段或衍生物。所述多核苷酸可以包括，例如，这样的核酸序列：其编码与包含本发明的多肽或细胞靶向分子的氨基酸序列之一的多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多同一性的多肽。本发明还包括这样的多核苷酸：其包含在严谨条件下与编码本发明的志贺毒素效应物多肽和/或细胞靶向分子、或其片段或衍生物的多核苷酸杂交的核苷酸序列，或者任何这样的序列的反义物或互补物。
本发明的分子(例如，本发明的志贺毒素效应物多肽和包含它们的细胞靶向分子)的衍生物或类似物尤其包括这样的多核苷酸(或多肽)分子：其具有与所述多核苷酸(或本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子)基本上同源的区域，例如与相同大小的多核苷酸(或多肽)序列具有至少约45％、50％、70％、80％、95％、98％或甚至99％同一性(具有80-99％的优选同一性)，或当与比对序列进行对比时，其中所述比对通过本领域已知的计算机同源性程序进行。一种示例性的程序是使用默认设置的GAP程序(Wisconsin SequenceAnalysis Package，Version 8 for UNIX，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，Madison，WI，U.S.)，其使用Smith T，Waterman M，Adv.Appl.Math.2：482-9(1981)的算法。还包括能够在严谨条件下与编码本发明的细胞靶向蛋白的序列的的互补物杂交的多核苷酸(参见例如Ausubel F等人，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons，New York，NY，U.S.，1993))，以及以下。严谨条件是本领域技术人员已知的，并且可以在例如Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons，NY，U.S.，Ch.Sec.6.3.1-6.3.6(1989))中找到。
本发明还提供了包含本发明范围内的多核苷酸的表达载体。使用本领域众所周知的材料和方法，可以将能够编码本发明的志贺毒素效应物多肽和/或细胞靶向分子的多核苷酸插入已知载体(包括细菌质粒、病毒载体和噬菌体载体)中以产生表达载体。这样的表达载体将包括支持在任何选择的宿主细胞或无细胞表达系统(例如pTxb1和pIVEX2.3)内生产本发明的预见到的志贺毒素效应物多肽和/或细胞靶向分子所必需的多核苷酸。用于与特定类型的宿主细胞或无细胞表达系统一起使用的、包含特定多核苷酸的表达载体是本领域普通技术人员众所周知的，可以使用例行实验确定，和/或可以购买。
本文中使用的术语“表达载体”表示包含一个或多个表达单元的直线或环形的多核苷酸。术语“表达单元”表示编码目标多肽并且能够提供核酸区段在宿主细胞中的表达的多核苷酸区段。表达单元典型地包含均处于可操作构型的转录启动子、编码目标多肽的开放读码框和转录终止子。表达载体含有一个或多个表达单元。因而，在本发明的上下文中，编码包含单个多肽链的本发明的志贺毒素效应物多肽和/或细胞靶向分子的表达载体至少包括所述单个多肽链的表达单元，而包含例如两个或更多个多肽链(例如一个链包含VL结构域，且第二个链包含与毒素效应物多肽连接的VH结构域)的蛋白至少包括两个表达单元，所述蛋白的两个多肽链中的每一个具有一个表达单元。对于本发明的多链细胞靶向蛋白的表达，每个多肽链的表达单元还可以单独地包含在不同的表达载体上(例如，可以用已经在其中引入每个多肽链的表达载体的单个宿主细胞实现表达)。
能够指导多肽和蛋白的瞬时或稳定表达的表达载体是本领域众所周知的。表达载体通常包括，但不限于以下一个或多个：异源信号序列或肽、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列，其中的每一个均为本领域众所周知的。任选的调节控制序列、整合序列、和可以采用的可用标记物是本领域已知的。
术语“宿主细胞”表示可以支持表达载体的复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞诸如大肠杆菌，或者真核细胞(例如酵母、昆虫、两栖动物、鸟或哺乳动物细胞)。使用本领域已知的标准技术，可以实现包含本发明的多核苷酸或能够生产本发明的多肽和/或细胞靶向分子的宿主细胞系的创建和分离。
在本发明范围内的志贺毒素效应物多肽和/或蛋白可以是如下产生的本文描述的多肽和分子的变体或衍生物：通过改变一个或多个氨基酸或者删除或插入一个或多个氨基酸(这可以使它更适合实现期望的性能，诸如被宿主细胞更佳地表达)，修饰编码细胞靶向分子的多肽和/或蛋白性组分的多核苷酸。
X.被固定化在固体基质上的本发明的分子
本发明的某些实施方案包括被固定化在固体基质上的本发明的分子(例如本发明的志贺毒素效应物多肽、细胞靶向分子、融合蛋白或多核苷酸)或其任何效应物片段。在本文中预见到的固体基质包括、但不限于微珠、纳米颗粒、聚合物、基体材料、微阵列、微孔滴定板或本领域已知的任何固体表面(参见例如US 7,771,955)。根据这些实施方案，使用技术人员已知的技术，可以将本发明的分子共价地或非共价地连接至固体基质，例如，珠子、颗粒或平板(参见例如Jung Y等人，Analyst 133：697-701(2008))。本发明的固定化的分子可以用于使用本领域已知的技术的筛选用途(参见例如Bradbury A等人，Nat Biotechnol29：245-54(2011)；Sutton C，Br J Pharmacol 166：457-75(2012)；Diamante L等人，Protein Eng Des Sel 26：713-24(2013)；Houlihan G等人，JImmunol Methods405：47-56(2014))。
本发明的分子可以在其上面固定化的固体基质的非限制性例子包括：微珠、纳米颗粒、聚合物、纳米聚合物、纳米管、磁珠、顺磁珠子、超顺磁珠子、抗生蛋白链菌素包被的珠子、反相磁珠、羧基封端的珠子、肼封端的珠子、硅石(钠硅石)珠子和亚氨基二乙酸(IDA)修饰的珠子、醛修饰的珠子、环氧活化的珠子、二氨基二丙胺(DADPA)修饰的珠子(具有伯胺表面基团的珠子)、可生物降解的聚合物珠子、聚苯乙烯基质、氨基-聚苯乙烯颗粒、羧基-聚苯乙烯颗粒、环氧-聚苯乙烯颗粒、二甲基氨基-聚苯乙烯颗粒、羟基-聚苯乙烯颗粒、有色的颗粒、流式细胞计量术颗粒、磺酸盐-聚苯乙烯颗粒、硝酸纤维素表面、补强的硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃表面、活化的玻璃表面、活化的石英表面、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、基于聚丙烯酰胺的底物、聚氯乙烯基质、聚甲基丙烯酸甲酯基质、聚(二甲基硅氧烷)基质、和含有能形成共价键的光反应性物质(诸如氮烯、碳烯和羰基(ketyl)残基)的光聚合物。本发明的分子可以在其上面固定化的固体基质的其它例子是在分子展示系统中常用的，例如，细胞表面、噬菌体和病毒颗粒。
XI.递送装置和试剂盒
在某些实施方案中，本发明涉及一种装置，其包含用于递送给有此需要的受试者的本发明的主题的一种或多种组合物，诸如药物组合物或诊断组合物。因而，包含本发明的一种或多种组合物的递送装置可以用于通过多种递送方法给患者施用本发明的物质组合物，所述递送方法包括：静脉内、皮下、肌肉内或腹膜内注射；口服施用；透皮施用；肺或透粘膜施用；通过植入物、渗透泵、筒或微量泵施用；或通过本领域技术人员公知的其它方式。
试剂盒也在本发明范围内，所述试剂盒包含本发明的主题的至少一种组合物和任选的包装和使用说明书。试剂盒可用于药物施用和/或诊断信息收集。本发明的试剂盒可以任选地包含至少一种另外的试剂(例如，标准品、标志物等)。试剂盒典型地包括标签，所述标签指示试剂盒的内容物的预期用途。所述试剂盒还可以包含用于检测在样品中或在受试者中的细胞类型(例如肿瘤细胞)或用于诊断患者是否属于对利用本发明的化合物、组合物或有关方法(例如，诸如本文描述的方法)的治疗策略做出应答的群体的试剂和其它工具。
XII.使用本发明的细胞靶向分子和/或其药物和/或诊断组合物的方法
通常，本发明的一个目的是提供药理学上有活性的试剂、以及包含它们的组合物，它们可以用于预防和/或治疗疾病、病症和病患，诸如某些癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症、或在本文中提及的其它病理学状况。因此，本发明提供了使用本发明的多肽、细胞靶向分子和药物组合物的方法，其用于靶向杀死细胞，用于将另外的外源物质递送进靶向细胞中，用于标记靶向细胞的内部，用于收集诊断信息，用于将T-细胞表位递送至靶细胞的MHC I类呈递途径，和用于治疗如本文中所述的疾病、病症和病患。例如，本发明的方法可以用于预防或治疗癌症、癌症起始、肿瘤起始、转移和/或疾病复发。
具体地，本发明的一个目的是提供这样的药理学上有活性的试剂、组合物和/或方法，其与本领域目前已知的试剂、组合物和/或方法相比具有某些优点。因此，本发明提供了使用具有指定蛋白序列的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子及其药物组合物的方法。例如，在SEQ ID NO：6-354和370-513中的任一个氨基酸序列可以具体地用作在下述方法或使用技术人员已知的细胞靶向分子的任何方法中使用的细胞靶向分子的组分，例如，WO2014/164680、WO 2014/164693、WO 2015/138435、WO 2015/138452、WO 2015/113005、WO2015/113007、WO 2015/191764、US20150259428、62/168,758、62/168,759、62/168,760、62/168,761、62/168,762、62/168,763和PCT/US2016/016580中使用的各种方法。
本发明提供了杀死细胞的方法，所述方法包括下述步骤：使体外或体内细胞与本发明的志贺毒素效应物多肽、细胞靶向分子或药物组合物接触。在使一个或多个细胞与要求保护的物质组合物之一接触以后，本发明的志贺毒素效应物多肽、细胞靶向分子和药物组合物可以用于杀死特定细胞类型。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可以用于杀死不同细胞类型的混合物中的特定细胞类型，诸如包含癌细胞、受感染的细胞和/或血液细胞的混合物。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可以用于杀死不同细胞类型的混合物中的癌细胞。在某些实施方案中，本发明的细胞毒性的志贺细胞靶向分子或药物组合物可以用于杀死不同细胞类型的混合物中的特定细胞类型，诸如移植前组织。在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽、细胞靶向分子或药物组合物可以用于杀死细胞类型的混合物中的特定细胞类型，诸如用于治疗目的的施用前组织材料。在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可以用于选择性地杀死被病毒或微生物感染的细胞，或以其它方式选择性地杀死表达特定细胞外靶生物分子(诸如细胞表面生物分子)的细胞。本发明的志贺毒素效应物多肽、细胞靶向分子和药物组合物具有多种应用，包括，例如，用于从体外或体内组织除去不希望的细胞类型，用于调节免疫应答以治疗移植物抗宿主病，用作抗病毒剂，用作抗寄生虫剂，和用于净化不希望的细胞类型的移植组织。
在某些实施方案中，当施用给受试者中(诸如需要治疗的患者中)的体外或体内细胞群体时，本发明的某些志贺毒素效应物多肽、细胞靶向分子和药物组合物(单独地或与其它化合物或药物组合物组合地)可以表现出有效细胞杀死活性。通过使用高亲和力结合区域使酶活性志贺毒素A亚基效应物多肽和/或T-细胞表位的递送靶向特定细胞类型，可以将细胞杀死活性限于特异性地和选择性地杀死生物体内的特定细胞类型，诸如某些癌细胞、赘生性细胞、恶性细胞、非恶性肿瘤细胞或受感染的细胞。
本发明提供了一种在有此需要的患者中杀死细胞的方法，所述方法包括下述步骤：给所述患者施用至少一种本发明的细胞靶向分子或其药物组合物。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或其药物组合物可以用于通过靶向被发现与癌症或肿瘤细胞物理上连接的细胞外生物分子而杀死患者中的癌细胞。术语“癌细胞”或“癌性细胞”表示以异常加速的和/或失调的方式生长和分裂的各种赘生性细胞，且是技术人员显而易见的。术语“肿瘤细胞”包括恶性的和非恶性的细胞。通常，癌症和/或肿瘤可以定义为适合治疗和/或预防的疾病、病症或病患。可能受益于本发明的方法和组合物的、由癌细胞和/或肿瘤细胞构成的癌症和肿瘤(恶性的或非恶性的)是技术人员显而易见的。赘生性细胞经常与以下一种或多种相关：失调的生长、分化的缺失、局部组织侵入、血管生成和转移。技术人员将显而易见可能受益于本发明的靶向某些癌细胞和/或肿瘤细胞的方法和组合物的、由癌症和/或肿瘤(恶性的或非恶性的)引起的疾病、病症和病患。
本发明的细胞靶向分子和组合物的某些实施方案可以用于杀死癌症干细胞、肿瘤干细胞、恶化前的癌症起始细胞和肿瘤起始细胞，它们通常缓慢地分裂且耐受癌症治疗如化学疗法和辐射。例如，通过杀死AML干细胞和/或静止的AML祖细胞(参见例如Shlush L等人，Blood 120：603-12(2012))，可以用本发明治疗急性髓性白血病(AML)。癌症干细胞经常过表达细胞表面靶标，例如，CD44、CD200和本文中列出的其它靶标，它们可以是本发明的细胞靶向分子的某些实施方案的某些结合区域的靶标(参见例如Kawasaki B等人，BiochemBiophys Res Commun 364：778-82(2007)；Reim F等人，CancerRes 69：8058-66(2009))。
因为基于志贺毒素A亚基的作用机理，本发明的物质组合物可以更有效地用在涉及它们与其它疗法(例如，化学疗法、免疫疗法、辐射、干细胞移植和免疫检验点抑制剂)的组合或互补方式的方法中，和/或对化学抗性的/辐射抗性的和/或静止的肿瘤细胞/肿瘤起始细胞/干细胞是有效的。类似地，本发明的物质组合物可以更有效地用在涉及与其它细胞靶向疗法的组合的方法中，所述其它细胞靶向疗法靶向相同疾病、病症或病患的不重叠或不同靶标上的相同表位以外。
本发明的细胞靶向分子或其药物组合物的某些实施方案可以用于通过靶向被发现与免疫细胞物理上连接的细胞外生物分子而杀死患者中的免疫细胞(无论是健康的还是恶性的)。
为了以下目的利用本发明的细胞靶向分子或其药物组合物是在本发明范围内：净化患者细胞群体(例如骨髓)的恶性的、肿瘤性的、或在其它方面不希望的T-细胞和/或B-细胞，然后将除去了T-细胞和/或B-细胞的物质重新输入患者中(参见例如van Heeckeren W等人，Br J Haematol 132：42-55(2006)；(参见例如Alpdogan O，van den Brink M，SeminOncol 39：629-42(2012))。
为了以下目的利用本发明的细胞靶向分子或其药物组合物是在本发明范围内：从取自患者的分离的细胞群体离体除去T细胞和/或B-细胞。在一个非限制性实施例中，本发明的细胞靶向分子可以用在用于预防器官和/或组织移植排斥的方法中，其中在移植本发明的细胞毒性的、细胞靶向分子或其药物组合物之前灌注供体器官或组织，以便净化供体T-细胞和/或B-细胞的器官(参见例如Alpdogan O，van den Brink M，Semin Oncol 39：629-42(2012))。
为了以下目的利用本发明的细胞靶向分子或其药物组合物也是在本发明范围内：从供体细胞群体除去T-细胞和/或B-细胞作为要接受骨髓和/或干细胞移植的患者中针对移植物抗宿主病和耐受性诱导的预防(参见例如van Heeckeren W等人，Br J Haematol132：42-55(2006)；(参见例如Alpdogan O，van den Brink M，Semin Oncol 39：629-42(2012))。
本发明的志贺毒素效应物多肽或细胞靶向分子或其药物组合物的某些实施方案可以用于通过靶向被发现与受感染的细胞物理上连接的细胞外生物分子而杀死患者中受感染的细胞。
本发明的细胞靶向分子或其药物组合物的某些实施方案可以用于给脊索动物内的部位“播种”非自身的T-细胞表位肽呈递细胞，以便活化免疫系统从而增强所述部位的控制。在本发明的这种“播种”方法的某些其它实施方案中，所述部位是肿瘤块或感染的组织部位。在本发明的这种“播种”方法的优选实施方案中，所述非自身的T-细胞表位肽选自：尚未被细胞靶向分子的靶细胞呈递的肽，没有存在于靶细胞表达的任何蛋白内的肽，没有存在于靶细胞的蛋白质组或转录组内的肽，没有存在于要播种的部位的细胞外微环境中的肽，和没有存在于要靶向的肿瘤块或感染的组织部位中的肽。
这种“播种”方法的功能是用一个或多个MHC I类呈递的T-细胞表位标记脊索动物内的一个或多个靶细胞，所述T-细胞表位用于被效应物T-细胞识别和活化下游免疫应答。通过利用本发明的细胞靶向分子的细胞内化功能、细胞内按路线发送功能和T-细胞表位递送功能，展示递送的T-细胞表位的靶细胞被利用来诱导宿主T-细胞对呈递的靶细胞的识别和其它免疫应答的诱导，包括CTL对靶细胞的杀死。使用本发明的细胞靶向分子的这种“播种”方法可以通过诱导适应性免疫应答以攻击播种的微环境(例如，肿瘤块或感染的组织部位，无论是否呈递递送细胞靶向分子的T-细胞表位)内的细胞来提供暂时的疫苗接种效应。这种“播种”方法还可以诱导对脊索动物内的靶细胞群体、肿瘤块和/或感染的组织部位的免疫耐受性的破坏。
涉及给脊索动物内的部位播种一种或多种抗原性和/或免疫原性表位的本发明的某些方法可以与免疫学佐剂的施用(无论局部地还是全身性地施用以刺激对某些抗原的免疫应答)相组合，例如，本发明的组合物与一种或多种免疫学佐剂如细胞因子、细菌产物或植物皂苷的共同施用。可以适合用在本发明中的方法中的免疫学佐剂的其它例子包括铝盐和油，例如，明矾、氢氧化铝、矿物油、角鲨烯、石蜡油、花生油和硫柳汞。
另外，本发明提供了治疗患者中疾病、病症或病患的方法，所述方法包括下述步骤：给有此需要的患者施用治疗有效量的至少一种本发明的细胞靶向分子或其药物组合物。可以使用该方法治疗的预见到的疾病、病症和病患包括癌症、恶性肿瘤、非恶性肿瘤、生长异常、免疫病症和微生物感染。“治疗上有效剂量”的本发明的组合物的施用可以导致疾病患状的严重程度的降低，无疾病患状阶段的频率和持续时间的增加，或由疾病折磨而导致的损害或残疾的预防。
本发明的组合物的治疗有效量将取决于施用途径、所治疗的生物的类型、和在考虑中的特定患者的体格特征。这些因素以及它们与确定这种量的关系是医学领域的技术从业人员众所周知的。这种量和施用方法可以进行调节以实现最佳效力，并且可以取决于医学领域的技术人员众所周知的因素，如重量、饮食、并存的药物和其它因素。最适用于人类用途的剂量大小和定量施用方案可以由通过本发明得到的结果指导，并且可以在适当地设计的临床试验中确认。通过常规方式，在实验动物中以低剂量开始并且然后在监测效果的同时增加剂量、以及系统性地改变给药方案，可以确定有效剂量和治疗方案。当为给定受试者确定最佳剂量时，临床医师可以考虑许多因素。这样的考虑因素是技术人员已知的。
可接受的施用途径可以表示在本领域中已知的任何施用途径，包括但不限于气雾剂、肠内、鼻、眼、口服、胃肠外、直肠、阴道或透皮(例如，乳膏、凝胶或软膏的局部施用，或借助于透皮贴剂)。“胃肠外施用”典型地与在预期作用部位处的注射有关或与预期作用部位连通，包括眶下、输注、动脉内、囊内、心内、真皮内、肌肉内、腹膜内、肺内、椎管内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、透粘膜或经气管施用。
关于本发明的药物组合物的施用，剂量范围通常将为约0.001-10毫克/千克(mg/kg)受试者体重，并且更通常为0.001-0.5mg/kg受试者体重。示例性剂量可以是0.01mg/kg体重、0.03mg/kg体重、0.07mg/kg体重、0.9mg/kg体重或0.1mg/kg体重或在0.01-0.1mg/kg的范围内。一个示例性的治疗方案是每天一次或两次施用，或每周一次或两次施用，每两周一次，每三周一次，每四周一次，每月一次，每两个月或三个月一次或者每三至6个月一次。剂量可以由熟练的健康护理专业人员根据需要选择并重新调节以使对于特定患者而言的治疗益处最大化。
本发明的药物组合物典型地将会在多种情形下施用给相同患者。单次剂量之间的间隔可以是，例如，2-5天、每周、每月、每两个月或三个月、每六个月、或每年。基于调节受试者或患者中的血液水平或其它标志物，施用之间的间隔也可以是不规律的。本发明的组合物的剂量方案包括1mg/kg体重或3mg/kg体重的静脉内施用，其中将组合物每两至四周施用一次达六个剂量，然后以3mg/kg体重或1mg/kg体重每三个月施用一次。
使用本领域已知的多种方法中的一种或多种，可以经由一种或多种施用途径施用本发明的药物组合物。如技术人员将会理解的，施用的途径和/或模式将会根据期望的结果而变化。本发明的细胞靶向分子和药物组合物的施用途径包括，例如静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其它胃肠外施用途径，例如通过注射或输注。对于其它实施方案，本发明的细胞靶向分子或药物组合物可以通过非胃肠外途径施用，诸如局部、表皮或粘膜施用途径，例如，鼻内地、口服地、阴道地、直肠地、舌下地或局部地。
利用本领域已知的多种医疗装置中的一种或多种，可以施用本发明的治疗性细胞靶向分子或药物组合物。例如，在一个实施方案中，可以利用无针皮下注射装置施用本发明的药物组合物。在本领域中具有可用于本发明的众所周知的植入物和模块的例子，包括例如，用于受控速率递送的可植入微量输液泵；用于穿过皮肤施用的装置；用于以精确的输注速率递送的输液泵；用于连续药物递送的可变流可植入输注装置；以及渗透药物递送系统。这些和其它这样的植入物、递送系统、和模块是本领域技术人员已知的。
本发明的细胞靶向分子或药物组合物可以单独施用或者与一种或多种其它治疗剂或诊断剂联合施用。联合治疗可以包括与至少一种其它治疗剂组合的本发明的细胞靶向分子或其药物组合物，所述其它治疗剂基于待治疗的特定患者、疾病或病患而选择。其它这样的药剂的例子包括，尤其是，细胞毒性的抗癌剂或化学治疗剂、抗炎或抗增殖剂、抗微生物或抗病毒剂、生长因子、细胞因子、镇痛药、治疗活性的小分子或多肽、单链抗体、经典抗体或其片段、或调节一个或多个信号传递途径的核酸分子、以及在治疗性或预防性处理方案中互补的或在其它方面有益的类似调节治疗分子。
用本发明的细胞靶向分子或药物组合物对患者的治疗优选地导致靶向细胞的细胞死亡和/或靶向细胞的生长的抑制。这样，本发明的细胞毒性的细胞靶向分子和包含它们的药物组合物将可用在治疗多种病理学病患(其中杀死或除去靶细胞可能是有益的，例如尤其是癌症、肿瘤、其它生长异常、免疫病症和受感染的细胞)的方法中。本发明提供了用于抑制细胞增殖和治疗细胞病患(包括瘤形成、过度活跃的B-细胞和过度活跃的T-细胞)的方法。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子和药物组合物可以用于治疗或预防癌症、肿瘤(恶性的和非恶性的)、生长异常、免疫病症和微生物感染。在另一个方面，以上离体方法可以与以上体内方法组合以提供治疗或预防骨髓移植接受者中的排斥的方法和用于实现免疫耐受的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了治疗哺乳动物受试者(诸如人)中的恶性肿瘤或肿瘤和其它血细胞相关癌症的方法，所述方法包括下述步骤：给有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的细胞毒性的细胞靶向分子或药物组合物。
本发明的细胞靶向分子和药物组合物具有多种用途，包括，例如，用于除去不希望的T-细胞，用于调节免疫应答以治疗移植物抗宿主病，用作抗病毒剂，用作抗微生物剂，和用于净化不希望的细胞类型的移植组织。本发明的细胞靶向分子和药物组合物通常是抗肿瘤剂——意味着它们能够通过抑制癌症或肿瘤细胞的生长和/或造成癌症或肿瘤细胞的死亡而治疗和/或预防肿瘤或恶性细胞的发育、成熟或传播。
在某些实施方案中，本发明的细胞靶向分子或药物组合物用于治疗B-细胞-、浆细胞-或抗体-介导的疾病或病患，例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、人免疫缺陷病毒相关的疾病、淀粉样变性、溶血性尿毒性综合征、多动脉炎、脓毒性休克、克罗恩病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、溃疡性结肠炎、银屑病、哮喘、舍格伦综合征、移植物抗宿主病、移植排斥、糖尿病、血管炎、硬皮病和系统性红斑狼疮。
在另一个方面，本发明的细胞靶向分子和药物组合物的某些实施方案是抗微生物剂——意味着它们能够治疗和/或预防微生物致病感染(诸如由病毒、细菌、真菌、朊病毒或原生动物造成)的获得、发展或后果。
为了杀死患者中T-细胞或B-细胞的目的，通过将本发明的细胞靶向分子或其药物组合物施用给患者而提供由T-细胞或B-细胞介导的疾病或病患的预防或治疗，是在本发明范围内。该用法与准备或调理患者用于骨髓移植、干细胞移植、组织移植或器官移植相容，无论移植的物质的来源，例如人或非人来源。
使用本发明的细胞毒性的细胞靶向分子或药物组合物通过宿主T-细胞的靶向细胞杀死而提供骨髓接受者用于预防或治疗宿主抗移植物疾病，是在本发明范围内。
本发明的细胞靶向分子和药物组合物的某些实施方案可以用在治疗癌症的方法中，所述方法包括：给有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的细胞靶向分子和/或药物组合物。在本发明的方法的某些实施方案中，正在治疗的癌症选自：骨癌(诸如多发性骨髓瘤或尤因肉瘤)、乳腺癌、中枢/周围神经系统癌症(诸如脑癌、神经纤维瘤病或胶质母细胞瘤)、胃肠癌(诸如胃癌或结直肠癌)、生殖细胞癌(诸如卵巢癌和睾丸癌、腺癌(诸如胰腺癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、唾液腺癌或甲状腺癌)、头颈癌(诸如鼻咽癌、口癌或咽癌)、血液学癌症(诸如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)、肾-尿道癌(诸如肾癌和膀胱癌)、肝癌、肺/胸膜癌(诸如间皮瘤、小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、前列腺癌、肉瘤(诸如血管肉瘤、纤维肉瘤、卡波西氏肉瘤或滑膜肉瘤)、皮肤癌(诸如基底细胞癌、鳞状细胞癌或黑素瘤)和子宫癌。
本发明的细胞靶向分子和药物组合物的某些实施方案可以用在治疗免疫病症的方法中，所述方法包括：给有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的细胞靶向分子和/或药物组合物。在本发明的方法的某些实施方案中，所述免疫病症与炎症有关，所述炎症与选自的疾病有关：淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、克罗恩病、糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒性综合征、HIV相关的疾病、红斑狼疮、多发性硬化、多动脉炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、溃疡性结肠炎和血管炎。
在本发明的某些实施方案中是使用本发明的志贺毒素效应物多肽或细胞靶向分子作为药物组合物或药物的组分，所述药物组合物或药物用于治疗或预防癌症、肿瘤、其它生长异常、免疫病症和/或微生物感染。例如，在减少炎症的努力中，可以用这样的药物治疗在患者的皮肤上呈现的免疫病症。在另一个实施例中，在减小肿瘤大小或完全消除肿瘤的努力中，可以用这样的药物治疗皮肤肿瘤。
本发明的某些细胞毒性的细胞靶向分子及其组合物可以用在分子神经外科应用中，诸如免疫损伤(immunolesioning)和神经元示踪(关于综述，参见，Wiley R，Lappi D，Adv Drug Deliv Rev 55：1043-54(2003))。例如，可以从各种配体(诸如神经递质和神经肽)选择或衍生出靶向结构域，其通过结合神经元表面受体(诸如神经元回路特异性的G-蛋白偶联的受体)而靶向特定神经元细胞类型。类似地，所述靶向结构域可以选自或源自结合神经元表面受体的抗体。因为某些志贺毒素效应物多肽稳健地指导它们自身的逆向轴突运输，本发明的某些细胞靶向分子可以用于杀死在远离细胞体的细胞毒性蛋白注射部位处表达所述细胞外靶标的神经元(参见Llewellyn-Smith I等人，J Neurosci Methods 103：83-90(2000))。特异性地靶向神经元细胞类型的本发明的这些靶向的细胞毒性分子用在神经科学研究中，诸如用于阐明感觉的机制(参见例如Mishra S，Hoon M，Science 340：968-71(2013)，和建立神经变性疾病(诸如帕金森氏病和阿尔茨海默氏病)的模型系统(参见例如Hamlin A等人，PLoS One e53472(2013))。
在本发明的某些实施方案中是使用本发明的志贺毒素效应物多肽、细胞靶向分子、药物组合物和/或诊断组合物标记或检测赘生性细胞和/或免疫细胞类型的内部的方法。该方法可以是基于本发明的某些细胞靶向分子进入特定细胞类型和通过逆向细胞内运输在细胞内按路线发送的能力，特定细胞类型的内部区室被标记用于检测。这可以在患者内在原位细胞上执行，或在从生物体取出的细胞和组织(例如活组织检查材料)上执行。
为了关于疾病、病患和/或病患的信息收集的目的，在本发明的某些实施方案中是使用本发明的志贺毒素效应物多肽、细胞靶向分子、药物组合物和/或诊断组合物检测细胞类型的存在的方法。所述方法包括使细胞与诊断足够量的本发明的细胞靶向分子接触以通过测定或诊断技术检测所述分子。短语“诊断足够量”表示为了信息收集目的通过利用的特定测定或诊断技术提供适当检测和准确测量的量。通常，对于完整生物体内诊断应用而言，诊断足够量是每位受试者在0.001-10毫克本发明的检测促进剂连接的细胞靶向分子/千克受试者之间的非累积剂量。典型地，在这些信息收集方法中使用的本发明的志贺毒素效应物多肽或细胞靶向分子的量将尽可能地低，前提条件是，它仍然是诊断足够量。例如，对于在生物体中的体内检测，施用给受试者的本发明的志贺毒素效应物多肽、细胞靶向分子或药物组合物的量将可行地尽可能地低。
与检测促进剂组合的本发明的细胞靶向分子的细胞类型特异性的靶向会提供检测细胞并获取其图像的方式，所述细胞与本发明的分子的结合区域的细胞外靶生物分子物理上连接。使用本发明的细胞靶向分子对细胞的成像可以通过本领域已知的任意合适的技术在体外或在体内执行。使用本领域已知的各种方法，包括生物体的全身成像或使用取自生物体的离体样品，可以收集诊断信息。本文中使用的术语“样品”表示任意数目的物品，但不限于，流体诸如血液、尿、血清、淋巴液、唾液、肛门分泌物、阴道分泌物和精液，以及通过活组织检查操作得到的组织。例如，通过技术诸如磁共振成像(MRI)、光学方法(诸如直接的、荧光的和生物发光的成像)、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机体层摄影术(SPECT)、超声、x-射线计算机体层摄影术和前述技术的组合，多种检测促进剂可以用于非侵袭性体内肿瘤成像(关于综述，参见，Kaur S等人，Cancer Lett 315：97-111(2012))。
在本发明的某些实施方案中是在诊断组合物中使用本发明的志贺毒素效应物多肽、细胞靶向分子或药物组合物来标记或检测血液学细胞、癌症细胞、肿瘤细胞、被感染的细胞和/或免疫细胞的内部的方法(参见例如，Koyama Y等人，Clin Cancer Res 13：2936-45(2007)；Ogawa M等人，Cancer Res 69：1268-72(2009)；Yang L等人，Small 5：235-43(2009))。基于本发明的某些细胞靶向分子进入特定细胞类型并通过逆向细胞内运输在细胞内按路线发送的能力，特定细胞类型的内部区室被标记用于检测。这可以在患者内在原位细胞上执行，或在从生物体取出的细胞和组织(例如活组织检查材料)上执行。
本发明的诊断组合物可以用于将疾病、病症或病患表征为本发明的有关药物组合物潜在地可治疗的。本发明的主题的某些组合物可以用于确定患者是否属于对利用如本文中所述的本发明的化合物、组合物或有关方法的治疗策略做出应答的组或非常适合使用本发明的递送装置。
可以在检测出疾病(例如癌症)以后使用本发明的诊断组合物以便更好地表征它，诸如以监测远距离转移、异质性和癌症进展阶段。疾病、病患或感染的表型评估可以帮助在做出治疗决策的过程中的预后和预测。在疾病复发中，本发明的某些方法可以用于确定是否是局部或全身问题。
本发明的诊断组合物可以用于评估对治疗的应答，无论治疗的类型，例如小分子药物、生物药物或基于细胞的疗法。例如，本发明的诊断的某些实施方案可以用于测量肿瘤大小的变化、抗原阳性细胞群体(包括数目和分布)的变化、或监测已经施用给患者的疗法所靶向的抗原以外的标志物(参见Smith-Jones P等人，Nat.Biotechnol 22：701-6(2004)；Evans M等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108：9578-82(2011))。
用于检测细胞类型的存在的方法的某些实施方案可以用于收集关于疾病、病症和病患的信息，例如，骨癌(诸如多发性骨髓瘤或尤因肉瘤)、乳腺癌、中枢/周围神经系统癌症(诸如脑癌、神经纤维瘤病或胶质母细胞瘤)、胃肠癌(诸如胃癌或结直肠癌)、生殖细胞癌(诸如卵巢癌和睾丸癌、腺癌(诸如胰腺癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、唾液腺癌或甲状腺癌)、头颈癌(诸如鼻咽癌、口癌或咽癌)、血液学癌症(诸如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)、肾-尿道癌(诸如肾癌和膀胱癌)、肝癌、肺/胸膜癌(诸如间皮瘤、小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、前列腺癌、肉瘤(诸如血管肉瘤、纤维肉瘤、卡波西氏肉瘤或滑膜肉瘤)、皮肤癌(诸如基底细胞癌、鳞状细胞癌或黑素瘤)、子宫癌、AIDS、淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、孤独症、心脏生成、克罗恩病、糖尿病、红斑(erythematosus)、胃炎、移植排斥、移植物抗宿主病、格雷夫斯氏病、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒性综合征、HIV相关的疾病、红斑狼疮、淋巴组织增生的病患(包括移植后淋巴组织增生的病患)、多发性硬化、重症肌无力、神经炎症、多动脉炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、血管炎、细胞增殖、炎症、白细胞活化、白细胞粘附、白细胞趋化性、白细胞成熟、白细胞迁移、神经元分化、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤(ALL)、急性髓性白血病、急性髓性白血病(AML)、B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、B-细胞前淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(BL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML-BP)、慢性髓性白血病(CML)、弥漫性大B细胞性淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、血管内大B-细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)、天然杀伤细胞白血病、结节边缘B-细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、浆细胞白血病、浆细胞瘤、原发性渗出性淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病、早幼粒细胞性白血病、小淋巴细胞性淋巴瘤、脾边缘带淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤(TCL)、重链病、单克隆丙种球蛋白病、单克隆免疫球蛋白沉积病、骨髓增生异常综合征(MDS)、郁积型多发性骨髓瘤和Waldenstrom巨球蛋白血症。
在某些实施方案中，本发明的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子或其药物组合物用于诊断和治疗，或仅用于诊断。在某些情形下，合乎需要的是，在选择本发明的志贺毒素效应物多肽或细胞靶向分子用于治疗之前，确定或验证在受试者和/或来自受试者(例如，需要治疗的患者)的患病组织中表达的HLA变体和/或HLA等位基因。
本发明的志贺毒素效应物多肽和本发明的细胞靶向分子的任何实施方案(例如在发明内容中的实施方案组#1-11的实施方案)可以与本发明的方法的每个单独实施方案一起使用。
以下非限制性实施例进一步例证了本发明：1)本发明的志贺毒素效应物多肽，2)本发明的细胞靶向分子，和3)本发明的细胞毒性的细胞靶向分子，其包含前述多肽且能够特异性地靶向某些细胞类型。
实施例
以下实施例证实了本发明的某些实施方案。但是，应当理解，这些实施例仅仅用于解释目的，且不意图、也不应当解释为对本发明的条件和范围的一概限制。除了另外描述以外，使用本领域技术人员众所周知的且常规的标准技术进行以下实施例中的实验。
以下实施例描述了几种示例性的细胞毒性的志贺毒素A亚基来源的多肽支架，其包含本发明的志贺毒素效应物多肽。将所述实施例中的志贺毒素效应物多肽去免疫化，同时保留催化活性和/或细胞毒性活性。
以下实施例也描述了几种细胞毒性的细胞靶向分子，每种分子包含与靶向细胞的结合区域直接地或间接地连接的志贺毒素效应物多肽，所述靶向细胞的结合区域能够结合与细胞的细胞表面物理上结合的靶生物分子的细胞外部分。下述的示例性细胞毒性细胞靶向分子结合被靶向的肿瘤细胞类型表达的细胞表面靶生物分子并进入那些靶向的细胞中。内化的细胞靶向分子将它们的志贺毒素效应物多肽有效地按路线发送至靶细胞的胞质溶胶，在此处所述志贺毒素效应物多肽将核糖体灭活并随后造成靶向的细胞的细胞凋亡性死亡。本发明的示例性细胞靶向分子能够将免疫原性的T-细胞表位有效地递送至靶细胞的MHC I类途径。
另外，一些示例性细胞靶向分子包含蛋白酶切割抗性的去免疫化的志贺毒素效应物多肽，其表现出与包含弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽(其没有通过另外的内源性表位区域的破坏进一步去免疫化)的亲本细胞毒性分子相比改善的体内免疫原性谱(抗体应答的减少)。此外，这些示例性的、蛋白酶切割抗性的、去免疫化的细胞靶向分子表现出与包含蛋白酶切割更敏感的志贺毒素效应物多肽区域的有关细胞靶向分子相比改善的体内耐受性。
下面的实施例描述了本发明的某些志贺毒素效应物多肽和它们的性能。某些实施例描述了包含嵌入的异源CD8+ T-细胞表位的、本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽。某些实施例描述了弗林蛋白酶切割抗性的、本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽。某些实施例描述了弗林蛋白酶切割抗性的、包含嵌入的异源CD8+ T-细胞表位的、本发明的去免疫化的志贺毒素效应物多肽。某些实施例描述了弗林蛋白酶切割抗性的、包含嵌入的异源CD8+ T-细胞表位(仅具有最小去免疫化)的、本发明的志贺毒素效应物多肽。此外，下面的实施例描述了本发明的某些细胞靶向分子和它们的性能。某些实施例描述了本发明的细胞靶向分子，其中志贺毒素效应物多肽组分(1)被去免疫化；(2)是在所述细胞靶向分子的多肽组分的氨基端上或近侧；(3)是弗林蛋白酶切割抗性的；和/或(4)包含嵌入的或插入的T-细胞表位。某些实施例描述了细胞靶向分子，其中所述细胞靶向分子的多肽组分包含羧基端内质网保留/取回信号基序。
实施例1.鉴别志贺毒素A亚基效应物多肽中的内源性表位区域
分析了来自志贺毒素家族的多种志贺毒素的A亚基的多肽序列以鉴别推定的抗原性的和/或免疫原性表位。本实施例显示了可以如何在志贺毒素A亚基和有关多肽中鉴别抗原性的和免疫原性表位(也参见WO 2015/113005；WO 2015/113007)。使用计算方法来预测在不同的志贺毒素A亚基中的抗原性的和/或免疫原性表位，包括利用公众可得到的关于蛋白结构的数据。在计算机环境中预测具有引起免疫应答的潜力的B-细胞表位和CD4+ T-细胞表位。经验地验证表位预测(参见下文实施例2；WO 2015/113005；WO 2015/113007)。
由ProImmune Inc.(Sarasota，FL，U.S.)使用它们的系统从志贺样毒素链A(PDB ID：1DM0_A)的多肽序列和3D结构数据预测志贺样毒素1的成熟A亚基(SLT-1A；SEQ ID NO：1)的直链B-细胞表位。
另外，使用BcePred网络服务器(Saha S，Raghava G，Lecture Notes in ComputSci 3239：197-204(2004))、Bepipred Linear Epitope Prediction(Larsen J等人，Immunome Res 2∶2(2006))和ElliPro Antibody表位预测(Haste Andersen P等人，Protein Sci 15：2558-67(2006)；Ponomarenko J，Bourne P，BMC Struct Biol 7：64(2007))，预测志贺毒素(StxA；SEQ ID NO：2)、志贺样毒素1(SLT-1A；SEQ ID NO：1)和志贺样毒素2(Stx2A；SEQ ID NO：3)的A亚基的多肽序列中的B-细胞表位。各种计算方法揭示了三种原型志贺毒素A亚基中的B-细胞表位区域的类似预测(表1-3)。
表1.志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)的成熟天然A亚基的B-细胞表位预测
表2.志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟天然A亚基的B-细胞表位预测
表3.志贺样毒素2(SEQ ID NO：3)的成熟天然A亚基的B-细胞表位预测
在SLT-1A中存在9个预测的B-细胞表位区域，它们通过超过一种方法鉴别为重叠区域(表4)。
表4.原型志贺毒素A亚基中的推定的B-细胞表位区域
另外，使用用于预测B-细胞表位和免疫原性残基的Epitopia网络服务器来分析志贺毒素A亚基(Rubinstein N等人，BMC Bioinformatics 10：287(2009))。基于直链氨基酸残基区域内的大多数氨基酸残基的4或5(“高”)的Epitopia评分，使用Epitopia鉴别在SLT-1A中预测为免疫原性的直链氨基酸残基区域。
Epitopia分析预测的免疫原性区域发生在SLT-1A中的氨基酸残基1-15(命名为“表位区域1”，参见表5)。基于Epitopia分析，在SLT-1A中的免疫原性表位区域39-48(参见表4)可能包括位置49(命名为“表位区域3”，参见表5)。基于Epitopia分析，在SLT-1A中的免疫原性表位区域55-66(参见表4)可能包括位置53并延伸至位置62-66附近(命名为“表位区域4”，参见表5)，在SLT-1A中的表位区域96-115(参见表4)可能包括位置94(命名为“表位区域5”，参见表5)，且在SLT-1A中的表位区域180-190(参见表4)可能开始于位置179并延伸至位置188-190附近(命名为“表位区域7”，参见表5)。
表5.原型志贺毒素A亚基共享10个推定的B-细胞表位区域
通过由ProImmune Inc.(Sarasota，FL，U.S.)执行的REVEALTMImmunogenicitySystem(IS)T-细胞测定，预测了志贺样毒素1的成熟A亚基(SEQ ID NO：1)的T-细胞表位。该测定使用来自目标蛋白的多个重叠肽以试验来自除去了CD8+ T-细胞的健康供体细胞样品的哺乳动物CD4+ T-细胞对任何免疫应答的引起。ProImmune的REVEALTM测定预测了SLT-1A中的7种T-细胞表位(表6)。
表6.原型志贺毒素A亚基中的推定的CD4+ T-细胞表位
| 天然地定位的氨基酸位置 | T-细胞表位# |
| 4-33 | 1 |
| 34-78 | 2 |
| 77-103 | 3 |
| 128-168 | 4 |
| 160-183 | 5 |
| 236-258 | 6 |
| 274-293 | 7 |
所有10种预测的B-细胞表位区域(表5)与通过REVEALTM测定预测出的至少一个CD4+ T-细胞表位(表7)重叠。
表7.原型志贺毒素A亚基中的B-细胞表位区域与预测的CD4+ T-细胞表位重叠
为了改善用于脊索动物中的治疗和诊断应用的志贺毒素来源的多肽，将不同的志贺毒素A亚基效应物多肽构建成去免疫化的和弗林蛋白酶切割抗性的，以及在某些情况下包含嵌入的异源CD8+ T-细胞表位(在本文中被称作“CD8+ T-细胞超免疫的”)。通过将志贺毒素效应物多肽的内部亚区域工程改造成包含异源T-细胞表位(参见例如WO 2015/113007)，将CD8+ T-细胞表位嵌入或插入志贺毒素效应物多肽。可以使用异源T-细胞表位的嵌入或插入来破坏内源性B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域以便将志贺毒素A亚基来源的支架进一步去免疫化(WO 2015/113007)。在表7中的所有预测的B-细胞表位区域和T-细胞表位在以下实施例中单个地或组合地被破坏和/或删除。
实施例2.构建和试验本发明的示例性的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子
本实施例描述了多种包含去免疫化的志贺毒素效应物多肽(例如，如通过相对于其它志贺毒素效应物多肽的抗原性和/或免疫原性的下降所证实的)的支架的建立和试验。另外，本实施例的一些志贺毒素效应物多肽比野生型志贺毒素效应物多肽更耐受蛋白酶切割，和/或包含嵌入的或插入的异源CD8+ T-细胞表位。将本实施例的志贺毒素效应物多肽作为本发明的各种细胞靶向分子的组分进行试验。
示例性的志贺毒素效应物多肽(SLT-1A-combo(n))和包含它们的细胞靶向分子
(SLT-1A-combo(n)：：scFv-(n))的构建
在细胞靶向分子的背景下建立和试验去免疫化的志贺毒素A亚基效应物多肽，所述细胞靶向分子各自包含与志贺毒素效应物多肽区域连接的靶向细胞的免疫球蛋白型结合区域。
为了将蛋白酶切割抗性工程改造进志贺毒素A亚基来源的多肽中，将氨基酸残基置换R248A和/或R251A引入志贺毒素效应物多肽中(参见例如WO 2015/191764)。R248A和R251A置换单独地或组合地破坏在志贺毒素A1片段区域的羧基端处的弗林蛋白酶切割基序，并代表最小弗林蛋白酶切割基序与野生型志贺毒素A亚基相比的一个或多个突变(参见WO 2015/191764)。
对于本实施例，将R248A和R251A引入从志贺样毒素1(SLT-1A)的A亚基来源的志贺毒素效应物多肽中，其包含SLT-1A的氨基酸1-251(SEQ ID NO：4)。SLT-1A 1-251 R248A/R251A双重突变体(SEQ ID NO：5)在本文中被称作弗林蛋白酶切割抗性的SLT-1A，或更简单地称作“SLT-1A-FR”。R248A和R251A在志贺毒素A1片段区域的羧基端处对弗林蛋白酶切割基序中的最小弗林蛋白酶切割位点R-x-x-R的破坏导致减少的弗林蛋白酶切割(参见下面实施例3；WO 2015/191764)。预测在StxA和SLT-1A中天然地定位在氨基酸残基238-257处的弗林蛋白酶切割基序中的最小弗林蛋白酶切割位点R-x-x-R的破坏会降低该区域对其它蛋白酶(例如，前蛋白转化酶和高度杂乱的蛋白酶)的蛋白酶解的敏感性。另外，R248A和/或R251A突变会破坏(1)B-细胞表位区域#8，其天然地定位在StxA和SLT-1A中的氨基酸残基243-259处，和(2)CD4+ T-细胞表位，其天然地定位在StxA和SLT-1A中的氨基酸残基236-258处。
通过添加多个氨基酸残基置换以破坏预测的B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域，包括产生嵌入的异源CD8+ T-细胞表位的修饰(参见表8；WO 2015/113005；WO 2015/113007)，建立去免疫化的志贺毒素效应物多肽。为了建立进一步去免疫化的志贺毒素效应物多肽，将SLT-1A-FR(SEQ ID NO：5)修饰成包括多个氨基酸残基置换以破坏预测的B-细胞和/或CD4+ T-细胞表位区域，包括产生嵌入的异源CD8+ T-细胞表位的修饰(参见表8；WO2015/113005；WO 2015/113007)。表8显示了二十种不同的去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素A亚基效应物多肽，其命名为SLT-1A-combo(n)，其中n代表诸如0、1、2、3等的整数，以表示不同的变化。在表8中提及的内源性表位区域的编号是根据在表6-7中的编号方案。如在以后的部分中所述试验在表8中的志贺毒素效应物多肽。
表8.本发明的示例性的、去免疫化的、CD8+ T-细胞超免疫的志贺毒素效应物多肽
每种去免疫化的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)(SEQ ID NO：6-21、23-27和29-32)包含一个或多个去免疫化的亚区域与一个或多个包含嵌入的异源CD8+ T-细胞表位的区域的组合。这些多肽中的大多数也具有在它们的志贺毒素A1片段亚区域的羧基端处的被破坏的最小弗林蛋白酶切割基序(SEQ ID NO：6-10、13-21、23-27和29-32)。计算机环境计算分析预测：(1)对于在表8中提及的所有志贺毒素效应物多肽combo(n)，将消除存在于野生型志贺毒素StxA或SLT-1A中的至少两个B-细胞表位，和(2)在表8所列的任何志贺毒素效应物多肽combo(n)中没有建立新的B-细胞表位。对志贺毒素效应物多肽combo(n)中的各个亚区域的许多修饰的性能和功能后果描述在实施例3、WO 2015/113005、WO 2015/113007和WO 2015/191764中。
使用技术人员已知的技术建立编码志贺毒素A亚基效应物多肽组合构建体的多核苷酸并与编码靶向细胞的免疫球蛋白型结合区域的构建体融合。得到的多核苷酸编码细胞靶向分子，每种多肽包含(1)组合志贺毒素效应物多肽区域SLT-1A-combo(n)，(2)靶向细胞的结合区域“scFv-(n)”，其中n代表诸如1、2、3等的整数以表示不同的scFv，和(3)本领域已知的位于所述志贺毒素效应物多肽区域和所述结合区域之间的接头。
使用本领域已知的细菌表达系统，在一种或多种细胞靶向分子的背景下使用这些多核苷酸来生产至少二十七种组合去免疫化的志贺毒素效应物多肽(表8；SEQ ID NO：6-21、23-27和29-32)。与靶向细胞的结合区域连接以后，二十七种支架SLT-1A-combo(n)中的二十六种产生了稳定的全长催化活性细胞靶向分子。但是，细胞靶向分子SLT-1A-combo18：：scFv-1(SEQ ID NO：54)表现出不稳定性的证据，因为通过凝胶的十二烷基硫酸钠(SDS)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析观察到SLT-1A-combo18：：scFv-1降解，所述凝胶加载了SLT-1A-combo18：：scFv-1的制品和作为参照的分子量梯子并一起泳动。
A.试验包含志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)的示例性细胞靶向分子的核糖
体抑制活性
使用技术人员已知的体外核糖体抑制测定(Quick CoupledTranscription/Translation Kit，Promega Corp.，Madison，WI，U.S.)，在细胞靶向分子的背景下试验了不同组合去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽的酶活性。使用该无细胞体外蛋白翻译测定来确定SLT-1A-combo10：：scFv-1(SEQ ID NO：47)、SLT-1A-combo16：：scFv-1(SEQ ID NO：52)、SLT-1A-combo19：：scFv-1(SEQ ID NO：55)、SLT-1A-combo0：：scFv-2(SEQ ID NO：57)、SLT-1A-combo2：：scFv-2(SEQ ID NO：58)、SLT-1A-combo3：：scFv-2(SEQ ID NO：59)、SLT-1A-combo4：：scFv-2(SEQ ID NO：60)和SLT-1A-combo13：：scFv-2(SEQ ID NO：62)的核糖体灭活能力。
根据生产商的说明书准备核糖体活性反应。在适当的缓冲液中制备一系列待测细胞靶向分子的10倍稀释液，并且为每个稀释液产生一系列相同的反应混合物组分。将在稀释系列中的每个样品与反应混合物中的每一个以及荧光素酶T7对照DNA(Promega Corp.，Madison，WI，U.S.)合并。将试验样品在30摄氏度(℃)温育1.5小时。在温育之后，将荧光素酶测定试剂(Promega Corp.，Madison，WI，U.S.)加入所有试验样品，并且根据生产商的说明书通过发光测量荧光素酶蛋白翻译的量。使用了3种阳性对照：野生型、SLT-1A1片段(SLT-1A1-WT)(SEQ ID NO：4)和包含蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-FR(SEQ ID NO：5)的两种细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-1(SEQ ID NO：34)和SLT-1A-FR：：scFv-2(SEQ ID NO：35)(参见WO 2015/191764)。
通过总细胞靶向分子的对数转化浓度相对于相对发光单位的非线性回归分析，确定蛋白合成抑制的水平。使用统计软件(GraphPad Prism，San Diego，CA，U.S.)，使用Prism软件在标题剂量-响应-抑制下的log(抑制剂)相对于响应(三参数)的函数[Y＝底部+((顶部-底部)/(1+10^(X-Log IC50)))]计算每个样品的半数最大抑制浓度(IC50)值。计算每个样品的IC50并显示在表9中。在该测定中，蛋白合成抑制的测量代表样品分子的核糖体灭活活性，其为志贺毒素效应物多肽或志贺毒素A亚基的催化活性的一种度量。如在实施例中报道的，表现出在参比分子所表现的IC50的10倍内的IC50的分子被认为会表现出与该参比分子可比较的核糖体抑制活性。如在实施例中报道的，表现出小于参比分子所表现的IC50的10％或在其内的IC50的分子被认为会表现出与该参比分子等同的核糖体抑制活性。
表9.组合去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽表现出与野生型志贺毒素A1片段可比较的核糖体抑制活性
作为细胞靶向分子的组分，试验的所有志贺毒素效应物多肽combo(n)的核糖体灭活活性是与野生型志贺毒素A1片段(SEQ ID NO：4)和/或SLT-1A-FR多肽(SEQ ID NO：5)的催化活性可比较的(表9；图2)。作为细胞靶向分子的组分，SLT-1A-combo10：：scFv-1、SLT-1A-combo16：：scFv-1、SLT-1A-combo19：：scFv-1、SLT-1A-combo0：：scFv-2、SLT-1A-combo2：：scFv-2、SLT-1A-combo4：：scFv-1和SLT-1A-combo13：：scFv2的核糖体灭活活性是与野生型志贺毒素A1片段(SEQ ID NO：4)和/或SLT-1A-FR多肽(SEQ ID NO：5)的催化活性相当的(表9；图2)。
这些结果证实，在细胞靶向分子的背景下某些示例性组合去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽的核糖体抑制活性是与在细胞靶向分子的背景下单独的野生型志贺毒素A1片段(SEQ ID NO：4)或志贺毒素效应物多肽SLT-1A-FR(SEQ ID NO：5)的催化活性可比较的(表9；图2)。因而，在细胞靶向分子的背景下某些示例性组合去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽的催化活性在该测定中似乎是与野生型志贺毒素A亚基的催化活性可比较的(表9；图2)。
B.试验包含志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)的示例性细胞靶向分子的靶向
细胞毒性
针对作为构建不同细胞靶向分子的支架的本发明的组合去免疫化的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)，试验了细胞毒性的效能和特异性。使用技术人员已知的靶生物分子阳性细胞杀死测定，确定包含组合去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)的示例性细胞靶向分子的细胞毒性活性。使用该靶阳性细胞杀死测定来确定不同细胞靶向分子的细胞毒性活性，各自包含在遗传上与组合志贺毒素效应物多肽SLTA-1A-combo(n)(SEQ ID NO：6-32)之一融合以形成细胞靶向分子SEQ ID NO：43-81的靶向细胞的结合区域scFv-(n)(关于这样的分子的代表性子集，参见表8)。
使用在细胞表面处表达显著量的适当细胞外靶生物分子(例如，结合区域scFv-1-8的靶标)的细胞，确定包含去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽的细胞靶向分子的细胞毒性。免疫球蛋白来源的结合区域scFv-1、scFv-2、scFv-3、scFv-4、scFv-5、scFv-6、scFv-7、scFv-8和scFv-9各自以高亲和力结合与某些人细胞的细胞表面物理上连接的人靶生物分子。在该实施例中使用的细胞是可从ATCC(Manassas VA，U.S.)、美国国立癌症研究所(Frederick，MD，U.S.)和/或DSZM(Braunschweig，DE)得到的永生化的人肿瘤细胞。在下面提及的细胞是H929、Daudi、NCI-ADR/RES(从转染的载体表达HER-2)、HCC1419、MDA-MB-231、MOLP-8、ST486、HDLM-2和L1236，或更简单地分别称作细胞系A、B、C、D、E、F、G、H和I。使用技术人员已知的方法，将在该实施例中使用的来自细胞系C的细胞用表达载体转染并使得表达显著量的细胞表面HER-2。
如下执行细胞杀死测定。将某些人肿瘤细胞系细胞在20微升(μL)细胞培养基中铺板(在约2-8x 103个细胞/孔)在384-孔平板中。在适当的缓冲液中制备要试验的细胞靶向分子的一系列10倍稀释液，将5μL稀释液或缓冲液对照加给铺板的细胞。将仅含有细胞培养基的对照孔用于基线校正。将细胞样品与细胞靶向分子或仅缓冲液一起在37℃和在5％二氧化碳(CO2)气氛下温育3或5天。根据生产商的说明书，使用LuminescentCell Viability Assay(G7573，Promega Corp.，Madison，WI，U.S.)使用发光读出确定总细胞存活或生存力百分比。
使用下述方程式计算实验孔的生存力百分比：(试验RLU-平均培养基RLU)/(平均仅细胞RLU-平均培养基RLU)*100。在Prism(GraphPad Prism，San Diego，CA，U.S.)中绘制细胞靶向分子浓度的对数相对于生存力百分比，并使用log(抑制剂)相对于响应(3参数)分析来确定试验的细胞靶向分子的半数最大细胞毒性浓度(CD50)值。计算每个样品的CD50并显示在表10中。当基于相对于试验浓度的曲线的形状不可计算CD50值时，那么将最大CD50值记录为超过最大试验值，例如，对于在最高试验样品浓度(例如，100.000nM或200.000nM)没有杀死50％的细胞的样品，大于100nM(“＞100.000nM”)或200nM(“＞200.000nM”)。如果测定中的细胞生存力在最高试验样品浓度是大约50％，那么该分子的CD50值在表10中记录为细胞生存力是大约50％时的大约试验的最大浓度，例如，“～100.000nM”。如在实施例中报道的，表现出在参比分子所表现的CD50的10倍内的CD50的分子被认为表现出与该参比分子可比较的细胞毒性活性。
表10.示例性的、去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽表现出高效的细胞毒性
表10(续)
表10.(续)
表10.(续)
表10.(续)
示例性的、基于SLT-1A-combo支架的细胞靶向分子的CD50值显示在表10中，且有关的细胞杀死测定数据显示在图3-10中。这些结果显示了至少三十四种独特的细胞靶向分子的细胞杀死测定结果，每种包含选自至少二十六种志贺毒素效应物多肽(SEQ ID NO：6-27和29-32)的组合去免疫化的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)。三十四种组合去免疫化的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(0-12、14-17、19-21、23-27和29-32)中的三十二种在细胞靶向分子的背景下实现了特征在于等于或小于100nM的CD50值的细胞毒性，而两种包含SLT-1A-combo13(SEQ ID NO：19)和SLT-1A-combo18(SEQ ID NO：24)的细胞靶向分子表现出特征在于对两种试验细胞系的大于100nM的CD50值的细胞毒性(表10；图6-7)。
在表10中报告的结果表明，包含SLT-1A-combo0、SLT-1A-combo1、SLT-1A-combo4、SLT-1A-combo7、SLT-1A-combo8、SLT-1A-combo9、SLT-1A-combo10、SLT-1A-combo11、SLT-1A-combo12、SLT-1A-combo14、SLT-1A-combo15、SLT-1A-combo16、SLT-1A-combo17、SLT-1A-combo19或SLT-1A-combo25的细胞靶向分子表现出特征在于0.2nM或更小的CD50值的高效细胞毒性，取决于试验的细胞系(表10；图3-10)。作为细胞靶向分子的组分试验的大多数志贺毒素效应物多肽combo(n)的细胞毒性是与作为有关细胞靶向分子的组分的SLT-1A-FR多肽(SEQ ID NO：5)的细胞毒性可比较的(表10；图3-7；9-10)。例如，包含志贺毒素效应物多肽combo(0-2、4、7-8、10、12、14-19或23-26)之一的至少一种细胞靶向分子对试验的至少一种细胞类型的细胞毒性是与包含SLT-1A-FR多肽(SEQ ID NO：5)的有关细胞靶向分子的细胞毒性可比较的(表10；图3-7；9-10)。
使用技术人员已知的靶阴性细胞杀死测定，确定包含某些组合去免疫化的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)的示例性细胞靶向分子的细胞毒性的特异性。除了使用的细胞类型以外，靶生物分子阴性的细胞杀死测定与靶阳性细胞杀死测定相同。使用不表达显著量的被正在试验的细胞靶向分子的各种结合区域scFv-(n)以高亲和力结合的细胞外靶生物分子的细胞执行靶阴性细胞杀死测定。通过将来自靶阳性细胞杀死测定的结果与来自靶阴性细胞杀死测定的结果进行对比，确定包含某些组合去免疫化的志贺毒素效应物多肽支架SLT-1A-combo(n)的示例性细胞靶向分子的细胞毒性特异性(参见例如表10；图8-9)。包含去免疫化的志贺毒素效应物多肽SLT1-A-combo(5-7、14或21)或SLT-1A-FR(SEQ IDNO：5)的细胞毒性的细胞靶向分子在相同的细胞靶向分子浓度没有杀死与靶阳性细胞相比可比较的百分比的靶阴性细胞(表10；图8-9)。
C.试验由包含志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)的示例性细胞靶向分子诱导
的胱天蛋白酶活化
细胞凋亡是涉及胱天蛋白酶对细胞组分的降解的程序性细胞死亡。通过监测效应物胱天蛋白酶3和7的活性，例如，胱天蛋白酶3或胱天蛋白酶7的活化状态，可以检测细胞凋亡。使用技术人员已知的靶生物分子阳性的细胞胱天蛋白酶活性测定，确定本发明的包含组合去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)的示例性细胞靶向分子的胱天蛋白酶活化。靶阳性细胞胱天蛋白酶活性测定的方法与上述的靶阳性细胞杀死测定类似。
志贺毒素催化活性可以通过固有途径诱导志贺毒素中毒的哺乳动物细胞的细胞凋亡(参见例如，Inward C等人，J Infect 30：213-8(1995)；Fujii J等人，Infect Immun71：2724-35(2003)；Jandhyala D等人，Curr Top Microbiol Immunol 357：41-65(2012)；Tesh V，Curr Top Microbiol Immunol 357：137-78(2012))。胱天蛋白酶活化可以用作导致细胞死亡的细胞凋亡机制的活化的读出(参见Pop C，Salvesen G，J Biol Chem 284：21777-81(2009)；Nicholls S，Hyman B，Methods Enzymol 544：251-69(2014))。如下确定了在细胞靶向分子的背景下由组合去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo7和SLT-1A-combo14诱导的胱天蛋白酶活化的效能和特异性。
使用在细胞表面处表达显著量的结合区域scFv-1或scFv-6的细胞外靶生物分子的细胞，确定包含去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽支架的细胞靶向分子的胱天蛋白酶活化。
如下执行胱天蛋白酶活化测定。将某些人肿瘤细胞系细胞在20微升(μL)细胞培养基中铺板(在约2-8x 103个细胞/孔)在384-孔平板中。在适当的缓冲液中制备要试验的细胞靶向分子的一系列10倍稀释液，并将5μL稀释液或缓冲液对照加给铺板的细胞。将仅含有细胞培养基的对照孔用于基线校正。将细胞样品与细胞靶向分子或仅缓冲液一起在37℃和在5％CO2气氛下温育18-20小时。根据生产商的说明书，使用Caspase-GloLuminescentCell Viability Assay(Promega Corp.，Madison，WI，U.S.)使用发光读出确定胱天蛋白酶活化。
使用以下方程式计算实验孔中胱天蛋白酶活化的量：((试验RLU-平均培养基RLU)/(平均细胞RLU-平均培养基RLU))*100。在Prism(GraphPad Prism，San Diego，CA，U.S.)中绘制细胞靶向分子浓度的对数相对于胱天蛋白酶活化，并将log(激动剂)相对于响应(3参数)分析用于每种试验的细胞靶向分子以计算测定中胱天蛋白酶活化的半数最大有效浓度(EC50)值(图11-12；表11)。使用来自具有“仅细胞”的样品的胱天蛋白酶活化测量作为基线，计算每个实验的最大胱天蛋白酶活性百分比(相对于“仅细胞”对照测量的活化百分比)(最大活性)(表11)。示例性细胞靶向分子的胱天蛋白酶活化的EC50和最大活性显示在表11中。
表11.示例性的、去免疫化的、蛋白酶切割抗性的、细胞靶向分子诱导的胱天蛋白酶活化
由志贺毒素效应物多肽combos 7和14(各自作为细胞靶向分子的组分进行试验)诱导的靶细胞中的胱天蛋白酶活性是与由SLT-1A-FR多肽(SEQ ID NO：5)诱导的胱天蛋白酶活性可比较的(表11；图11-12)，所述SLT-1A-FR多肽作为试验的大多数细胞系的有关细胞靶向分子(分别是SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：39)的组分。
D.志贺毒素效应物多肽中的内源性表位破坏性突变
本实施例表明，志贺毒素A亚基效应物多肽可以用某些截短和氨基酸残基置换的组合去免疫化。在从表12所列的志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)来源的志贺毒素效应物多肽的推定B-细胞和/或T-细胞表位中做出缺失和/或氨基酸置换。在该实施例中和在WO 2015/113005中，已经针对对不同志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子的志贺毒素效应物功能的影响经验地试验了许多突变。表12总结了在实施例中和在WO 2015/113005中描述的结果，其中氨基酸置换或氨基酸置换的组合没有阻止高效水平的志贺毒素效应物功能的表现。表12使用在实施例1中描述的表位区域编号方案(参见表7，出处同上)，并列出了通过BcePred软件预测的B-细胞表位中的任何变化。
表12.经验地验证了置换和置换的组合不会阻止高效的志贺毒素效应物功能的表现
在表位区域1-5和7-8中，已经制造和试验了不同的氨基酸置换(参见表12)。在表位区域#1中(参见表7)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置1处的赖氨酸被突变为丙氨酸(K1A)和甲硫氨酸(K1M))。在表位区域#1中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置4处的苏氨酸被突变为异亮氨酸(T4I)。在表位区域#1中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置6处的天冬氨酸被突变为精氨酸(D6R)。在表位区域#1中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置8处的丝氨酸被突变为异亮氨酸(S8I)。在表位区域#1中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置9处的苏氨酸被突变为异亮氨酸(T9I)和缬氨酸(T9V)。在表位区域#1中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置11处的赖氨酸被突变为丙氨酸(K11A)和组氨酸(K11H)。在表位区域#1中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置12处的苏氨酸被突变为赖氨酸(T12K)。
在表位区域#2中(参见表7)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置33处的丝氨酸被突变为异亮氨酸(S33I)。
在表位区域#3中(参见表7)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)的成熟A亚基中的位置43处的丝氨酸被突变为天冬酰胺(S43N)。在表位区域#3中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)的成熟A亚基中的位置44处的甘氨酸被突变为亮氨酸(G44L)。在表位区域#3中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)的成熟A亚基中的位置45处的丝氨酸被突变为缬氨酸(S45V)和异亮氨酸(S45I)。在表位区域#3中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置45处的苏氨酸被突变为缬氨酸(T45V)和异亮氨酸(T45I)。在表位区域#3中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)的成熟A亚基中的位置46处的甘氨酸被突变为脯氨酸(G46P)。在表位区域#3中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQID NO：1)的成熟A亚基中的位置47处的天冬氨酸被突变为甘氨酸(D47G)和甲硫氨酸(D47M)。在表位区域#3中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)的成熟A亚基中的位置48处的天冬酰胺被突变为缬氨酸(N48V)和苯丙氨酸(N48F)。
在表位区域#4中(参见表7)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置53处的天冬氨酸被突变为丙氨酸(D53A)、甘氨酸(D53G)和天冬酰胺(D53N)。通过Epitopia网络服务器预测D53残基是溶剂暴露的且具有5或“高”的免疫原性量表值。在表位区域#4中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置54处的缬氨酸被突变为异亮氨酸(V54I)。在表位区域#4中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置55处的精氨酸被突变为丙氨酸(R55A)、缬氨酸(R55V)和亮氨酸(R55L)。在表位区域#4中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置56处的甘氨酸被突变为脯氨酸(G56P)。在表位区域#4中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置57处的异亮氨酸被突变为甲硫氨酸(D57M)和苯丙氨酸(D57F)。在表位区域#4中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置58处的天冬氨酸被突变为丙氨酸(D58A)、缬氨酸(D58V)和苯丙氨酸(D58F)。在表位区域#4中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置59处的脯氨酸被突变为丙氨酸(P59A)。在表位区域#4中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置60处的谷氨酸被突变为异亮氨酸(E60I)、苏氨酸(E60T)和精氨酸(E60R)。在表位区域#4中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置61处的谷氨酸被突变为丙氨酸(E61A)、缬氨酸(E61V)和亮氨酸(E61L)。在表位区域#4中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置62处的甘氨酸被突变为丙氨酸(G62A)。
在表位区域#5中(参见表7)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置94处的天冬氨酸被突变为丙氨酸(D94A)。在表位区域#5中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置96处的丝氨酸被突变为异亮氨酸(S96I)。在表位区域#5中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置104处的苏氨酸被突变为天冬酰胺(T104N)。在表位区域#5中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置105处的丙氨酸被突变为亮氨酸(A105L)。在表位区域#5中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置107处的苏氨酸被突变为脯氨酸(T107P)。在表位区域#5中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置108处的亮氨酸被突变为甲硫氨酸(L108M)。在表位区域#5中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置109处的丝氨酸被突变为缬氨酸(S109V)。在表位区域#5中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置110处的甘氨酸被突变为丙氨酸(G110A)。在表位区域#5中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置111处的天冬氨酸被突变为苏氨酸(D111T)。在表位区域#5中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置112处的丝氨酸被突变为缬氨酸(S112V)。
在表位区域#6中(参见表7)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置141处的天冬氨酸被突变为丙氨酸(D141A)。在表位区域#6中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置147处的甘氨酸被突变为丙氨酸(G147A)。
在表位区域#7中(参见表7)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置179处的精氨酸被突变为丙氨酸(R179A)。通过Epitopia网络服务器预测该R179残基是暴露的且具有5或“高”的免疫原性值。在表位区域#7中(参见表7)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置180处的苏氨酸被突变为甘氨酸(T180G)。在表位区域#7中(参见表7)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置181处的苏氨酸被突变为异亮氨酸(T181T)。在表位区域#7中(参见表7)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置183处的天冬氨酸被突变为丙氨酸(D183A)和甘氨酸(D183G)。在表位区域#7中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置184处的天冬氨酸被突变为丙氨酸(D184A)或苯丙氨酸(D184F)。在表位区域#7中(参见表7)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置185处的亮氨酸被突变为缬氨酸(L185V)或天冬氨酸(L185D)。在表位区域#7中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置186处的丝氨酸被突变为丙氨酸(S186A)和苯丙氨酸(S186F)。在表位区域#7中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置187处的甘氨酸被突变为丙氨酸(G187A)和苏氨酸(G187T)。在表位区域#7中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置188处的精氨酸被突变为丙氨酸(R188A)和亮氨酸(R188L)。在表位区域#7中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ IDNO：2)的成熟A亚基中的位置189处的丝氨酸被突变为丙氨酸(S189A)。
在表位区域#8(参见表7)中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置248处的精氨酸被突变为丙氨酸(R248A)。在表位区域#8中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置251处的精氨酸被突变为丙氨酸(R251A)。
天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置49处的亮氨酸被突变为丙氨酸(L49A)。通过Epitopia网络服务器预测该L49残基是溶剂暴露的且具有4的免疫原性值且存在于T-细胞表位#2中(参见表7)。天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置198处的谷氨酸被突变为丙氨酸(D198A)。通过Epitopia网络服务器预测该D198残基是溶剂暴露的且具有5或“高”的免疫原性值。天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ IDNO：2)的成熟A亚基中的位置205处的精氨酸被突变为丙氨酸(R205A)。通过Epitopia网络服务器预测该R205残基是溶剂暴露的且具有5或“高”的免疫原性值。
在T-细胞表位#1至#6中，已经做出和试验了不同的氨基酸置换(参见表12)。
在T-细胞表位#1(参见表7)中，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置4处的苏氨酸被突变为异亮氨酸(T4I)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置6处的天冬氨酸被突变为精氨酸(D6R)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQID NO：2)的成熟A亚基中的位置8处的丝氨酸被突变为异亮氨酸(S8I)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置9处的苏氨酸被突变为异亮氨酸(T9I)和缬氨酸(T9V)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置11处的赖氨酸被突变为丙氨酸(K11A)和组氨酸(K11H)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置12处的苏氨酸被突变为赖氨酸(T12K)，且天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置33处的丝氨酸被突变为异亮氨酸(S33I)。
在T-细胞表位#2中(参见表7)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)的成熟A亚基中的位置43处的丝氨酸被突变为天冬酰胺(S43N)；天然地定位在志贺样毒素1(SEQ IDNO：1)的成熟A亚基中的位置44处的甘氨酸被突变为亮氨酸(G44L)；天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)的成熟A亚基中的位置45处的丝氨酸被突变为缬氨酸(S45V)和异亮氨酸(S45I)；天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)的成熟A亚基中的位置46处的甘氨酸被突变为脯氨酸(G46P)；天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)的成熟A亚基中的位置47处的天冬氨酸被突变为甘氨酸(D47G)和甲硫氨酸(D47M)；天然地定位在志贺样毒素1(SEQID NO：1)的成熟A亚基中的位置48处的天冬酰胺被突变为缬氨酸(N48V)和苯丙氨酸(N48F)；天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置50处的苯丙氨酸被突变为丙氨酸(F50T)；天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置51处的丙氨酸被突变为缬氨酸(A51V)；天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置53处的天冬氨酸被突变为丙氨酸(D53A)、甘氨酸(D53G)和天冬酰胺(D53N)；天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置56处的缬氨酸被突变为亮氨酸(V54L)；天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQID NO：2)的成熟A亚基中的位置55处的精氨酸被突变为丙氨酸(R55A)、缬氨酸(R55V)和亮氨酸(R55L)；天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置56处的甘氨酸被突变为脯氨酸(G56P)；天然地定位在志贺样毒素1(SEQ IDNO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置57处的异亮氨酸被突变为甲硫氨酸(D57M)和苯丙氨酸(D57F)；天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ IDNO：2)的成熟A亚基中的位置58处的天冬氨酸被突变为丙氨酸(D58A)、缬氨酸(D58V)和苯丙氨酸(D58F)；天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置59处的脯氨酸被突变为丙氨酸(P59A)；天然地定位在志贺样毒素1(SEQ IDNO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置60处的谷氨酸被突变为异亮氨酸(E60I)、苏氨酸(E60T)和精氨酸(E60R)；天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置61处的谷氨酸被突变为丙氨酸(E61A)、缬氨酸(E61V)和亮氨酸(E61L)；天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ IDNO：2)的成熟A亚基中的位置62处的甘氨酸被突变为丙氨酸(G62A)。
在T-细胞表位#3中(参见表7)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置94处的天冬氨酸被突变为丙氨酸(D94A)，且天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置96处的丝氨酸被突变为异亮氨酸(S96I)。
在T-细胞表位#4中(参见表7)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置147处的甘氨酸被突变为丙氨酸(G147A)。
在T-细胞表位#5中(参见表7)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置179处的精氨酸被突变为丙氨酸(R179A)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置180处的苏氨酸被突变为甘氨酸(T180G)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置181处的苏氨酸被突变为异亮氨酸(T181I)，且天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置183处的天冬氨酸被突变为丙氨酸(D183A)和甘氨酸(D183G)。
在T-细胞表位#6中(参见表7)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置242处的半胱氨酸被突变为丝氨酸(C242S)，天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置248处的精氨酸被突变为丙氨酸(R248A)，且天然地定位在志贺样毒素1(SEQ ID NO：1)和志贺毒素(SEQ ID NO：2)的成熟A亚基中的位置251处的精氨酸被突变为丙氨酸(R251A)。
此外，将SLT-1A的羧基端截短至SEQ ID NO：1的氨基酸1-251会除去最后两个表位区域(表7、#9和#10)、最后的CD4+ T-细胞表位(表6、#7)和通过ElliPro预测的最高评分的不连续的B-细胞表位(289-293)。另外，在位置251处的截短会破坏T-细胞表位#6和表位区域#8(表7)。
本实施例的一种示例性的去免疫化的志贺毒素效应物多肽是SLT-1A-combo22(SEQ ID NO：28)，其具有相对于野生型志贺样毒素1A亚基(SEQ ID NO：1)的7个氨基酸残基置换，且预测所有这些置换都会破坏内源性表位。根据表8中的标记，志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo22包含：破坏表位区域4的置换；破坏表位区域5的置换；破坏表位区域6的置换；破坏表位区域7的置换；破坏表位区域8的置换；被截短破坏的表位区域8、9和10；和破坏在A1片段-来源的区域的羧基端处的弗林蛋白酶切割位点的置换。另外，SLT-1A-combo22包含：破坏T-细胞表位#2的置换，破坏T-细胞表位#4的置换，破坏表位#6的置换，和被截短破坏的T-细胞表位#6和#7。
E.使用ELISA和蛋白质印迹测定来试验示例性的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-
combo(n)的抗原性的下降
可以使用常规方法来评价在细胞靶向分子的背景下志贺毒素效应物多肽的相对抗原性(参见例如WO 2015/113005；WO 2015/113007)。使用以高亲和力结合野生型志贺样毒素A1片段(SLT-1A1)的多克隆和单克隆抗体，通过蛋白质印迹和ELISA评估了包含某些组合去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)的示例性细胞靶向分子的抗原性。将细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-1(SEQ ID NO：34)用作参比分子。
本文中使用的蛋白质印迹分析确定在变性条件下的相对抗原性，而本文中使用的ELISA分析测量在天然蛋白折叠条件下的相对抗原性。
对于蛋白质印迹分析，将包含志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo7、SLT-1A-combo10或SLT-1A-combo14的示例性细胞靶向分子进行试验，并与参比分子SLT-1A-FR：：scFv-1的结果进行对比。给前述分子的样品加载等量重复的4-20％SDS聚丙烯酰胺凝胶(Lonza，Basel，CH)，并在变性条件下电泳。将得到的凝胶通过考马斯染色进行分析或根据生产商的说明书使用(Life Technologies，Carlsbad，CA，U.S.)系统转移至聚二氟乙烯(PVDF)膜。将得到的膜在标准条件下使用下述抗体进行探测：小鼠单克隆α-Stx(mAb1)(BEI NR-867BEI Resources，Manassas，VA，U.S.；可与志贺样毒素1A亚基交叉反应)，兔多克隆抗体α-SLT-1A(pAb1)(Harlan Laboratories，Inc.Indianapolis，IN，U.S.，针对野生型SLT-1A1产生的定制抗体生产)，和针对来自野生型志贺毒素A1片段的肽RGIDPEEGRFNN和HGQDSVRVGR产生的兔多克隆抗体α-SLT-1A(pAb2)(Genscript，Piscataway，NJ，U.S.，定制抗体生产)。肽序列RGIDPEEGRFNN位于氨基酸55-66处，且肽序列HGQDSVRVGR位于SLT-1A和StxA中的氨基酸214-223处。使用标准条件，且当适当时使用辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的第二抗体(山羊抗-兔-HRP或山羊抗-小鼠-HRP，Thermo Scientific，Rockford，IL，U.S.)，检测膜结合的抗体。图13显示了蛋白质印迹，其中将凝胶和/或膜的泳道编号，且图例用相同的各个编号指示哪种志贺毒素效应物多肽区域存在于加载进每个泳道中的细胞靶向分子。将考马斯染色的泳道显示为样品加载对照。
图13表明，在变性条件下，示例性细胞靶向分子SLT-1A-combo7：：scFv-1、SLT-1A-combo10：：scFv-1和SLT-1A-combo14：：scFv-1在该测定中表现出与SLT-1A-FR：：scFv-1相比降低的抗原性。这些结果证实，SLT-1A-combo7、SLT-1A-combo10和SLT-1A-combo14具有与SLT-1A-FR相比或通过参照SLT-1A-WT(当使用相同接头通过相同方式连接至相同靶向结构域(scFv-1)时)降低的抗原性。另外，显示在图13中的结果提示，SLT-1A-combo7在试验条件下在该测定中具有与SLT-1A-combo10和SLT-1A-combo14相比降低的相对抗原性。
使用标准的ELISA测量α-SLT-1A mAb1在细胞靶向分子的背景下的识别不同去免疫化的志贺毒素效应物多肽的能力，每种多肽具有多个被破坏的表位区域。在所述测定中利用了试验的每种细胞靶向分子的结合它的scFv结合区域的靶生物分子的能力。将在磷酸盐缓冲盐水(1X PBS)(Hyclone Brand，Fisher Scientific，Waltham，MA，U.S.)中的Nunc平板的孔用结合区域(scFv-1)的重组人靶生物分子包被。将平板在4℃温育过夜。将孔用1X PBS 0.05％吐温-20(PBS-T)洗涤，并通过将孔与3％的奶在PBS-T中的溶液一起在室温温育1小时来阻断非特异性结合。将示例性细胞靶向分子加入孔中，其中某些孔接受仅一种细胞靶向分子，其包含仅一种组合去免疫化的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)：SLT-1A-combo7：：scFv-1、SLT-1A-combo10：：scFv-1或SLT-1A-combo14：：scFv-1。另外，将细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-1加入某些孔中作为参比分子。将所有细胞靶向分子以被确定为高于以前用ELISA确定的最大结合(Bmax)的浓度加入孔中，所述ELISA使用与HRP缀合的蛋白L来检测SLT-1A-FR：：scFv-1，从而允许100％的可利用的靶生物分子被过量的细胞靶向分子样品结合。将平板在室温温育1小时以允许细胞靶向分子在非变性条件下结合靶生物分子。将孔用PBS-T洗涤，并然后与缀合至HRP的抗-SxtA小鼠单克隆抗体(抗-SLT-1A mAb1-HRP)或缀合至HRP的兔多克隆抗体α-SLT-1A(抗-SLT-1A pAb2-HRP)或蛋白L-HRP(其结合scFv-1且用作加载对照)一起在室温温育1小时。将孔在PBS-T中洗涤，然后与Pierce TMB Ultra(Thermo Scientific Inc.，Rockford，IL，U.S.)一起温育。用250mM盐酸(HCl)停止反应。如下检测孔中的HRP活性：加入产色HRP底物，并然后检测由化学发光引起的光发射，其中使用设定至450纳米(nm)波长的平板读出装置测量光的吸光度(Abs)。
通过减去与仅PBS(而不是任何细胞靶向分子样品)一起温育的包被的、封闭的孔的吸光度值，针对背景校正测量的吸光度值。为了归一化来自三种不同检测抗体的信号，将来自SLT-1A-FR：：scFv1的信号设定在100％，并且通过计算(样品的Abs信号/对照的平均Abs信号)x 100为试验的每种细胞靶向分子样品确定作为该对照的百分比的相对信号。ELISA结果显示在图14中。
图14表明，在天然条件下，示例性细胞靶向分子SLT-1A-combo7：：scFv-1(SEQ IDNO：44)、SLT-1A-combo10：：scFv-1(SEQ ID NO：47)或SLT-1A-combo14：：scFv-1(SEQ IDNO：50)表现出与SLT-1A-FR：：scFv-1(SEQ ID NO：34)相比降低的抗原性。这些结果证实，SLT-1A-combo7、SLT-1A-combo10和SLT-1A-combo14表现出与SLT-1A-FR(SEQ ID NO：5)相比或通过参照SLT-1A1-WT(SEQ ID NO：4)(当使用相同接头通过相同方式连接至相同靶向结构域(scFv-1)时)降低的抗原性。另外，在图14中显示的结果提示，SLT-1A-combo7和SLT-1A-combo14在该ELISA测定的天然条件下具有与SLT-1A-combo10相比降低的相对抗原性。
F.试验示例性的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)的CD4+ T-细胞去免疫化
使用人CD4+ T-细胞增殖测定(在有外源施加的多肽存在下)和人CD4+树突T-细胞刺激测定(在有用施加的多肽处理过的人单核细胞存在下)，针对CD4+ T-细胞免疫原性的降低试验了预测的CD4+ T-细胞表位区域中的破坏。
使用技术人员已知的T-细胞增殖测定来试验志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)的CD4+ T-细胞表位去免疫化的有效性。本实施例的T-细胞增殖测定涉及CD4+ T-细胞的标记，并然后使用流式细胞计数法测量响应于不同肽的施用的增殖变化，所述不同肽源自志贺毒素效应物多肽combo(n)或参比分子，例如，野生型志贺毒素A1片段、SLT-1A-FR和/或包含前述物质的有关细胞靶向分子。
合成了一系列从选择的分子来源的重叠肽，并在CFSE CD4+ T细胞增殖测定(ProImmune Inc.，Sarasota，FL，U.S)中进行了试验。将人CD8+ T-细胞除去的、用CFSE标记的外周血单核细胞(PBMC)与5μM每种目标肽一起在6个重复孔中培养7天。每个测定板包括一组未经处理的对照孔。所述测定还包括参比抗原对照，其包含已知MHC II类抗原或agretopes的合成肽。
如通过流式细胞计量术直接测量的，响应于施用的肽而增殖的CD8+ T-细胞除去的PBMC将表现出CFSE荧光强度的下降。对于原初T-细胞分析，通过与来自未刺激的样品的结果进行对比，诸如通过关于荧光信号排序为阴性的、暗淡的或高的，为每个刺激的样品确定在背景以上的刺激百分比。将每个样品中关于CD4+ CFSE T-细胞暗淡群体的计数表达为总CD4+ T-细胞群体的比例。使用重复值来计算在背景以上的刺激百分比(具有抗原刺激的CD4+ T-细胞CFSE暗淡细胞的比例减去没有抗原刺激的CD4+ T-细胞CFSE暗淡细胞的比例)。从重复值计算平均值和平均值标准误差。如果背景以上的刺激百分比大于0.5％且也大于背景以上的标准误差的2倍，则认为结果是“阳性的”。为了允许对比肽，计算了响应指数。该指数是基于将每种肽的响应的量级(背景以上的刺激百分比)乘以每种肽的响应供体的数目(抗原性百分比)。
G.确定示例性的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)的相对CD4+ T-细胞免疫
原性
使用下述树突细胞(DC)T-细胞增殖测定来确定本发明的分子的相对CD4+ T-细胞免疫原性。该DC T-细胞测定测量对外源施加的多肽或蛋白的CD4+ T-细胞应答。使用ProImmune的DC-T测定服务执行DC T-细胞测定以确定本发明的蛋白和细胞靶向分子之间CD4+ T-细胞驱动的免疫原性相对于参比分子的相对水平。本实施例的DC T-细胞测定涉及针对从施用的多肽、蛋白或细胞靶向分子样品来源的肽的抗原呈递来试验人树突细胞。
简而言之，基于高分辨率MHC II类组织分类，使用健康的人供体组织来分离分类的样品。使用20、40或50个供体的组群。首先，在确定成分培养基中培养得自人供体PBMC的单核细胞以产生未成熟的树突细胞。然后，将未成熟的树突细胞用明确定义的对照抗原进行刺激，并通过在确定成分培养基中进一步培养而诱导成更成熟的表型。接着，将来自相同人供体样品的、CD8+ T-细胞除去的供体PBMC用CFSE标记。然后将CFSE标记的、CD8+ T-细胞除去的PBMC与抗原预处理的树突细胞一起培养7天以允许CD4+树突细胞刺激，此后试验每个样品的8个重复。作为阴性对照，每个树突细胞培养物系列还包括一组未处理的树突细胞。对于阳性对照，所述测定包含两种明确定义的参比抗原，每种包含全长蛋白。
为了评价基于树突细胞的免疫原性，在研究组群之间分析了供体细胞应答的频率。认为测定中的阳性应答指示潜在体内CD4+ T-细胞应答。将阳性应答(其测量为在背景以上的刺激的百分比)定义为在2个或更多个独立供体样品中大于0.5百分比％的。通过取在每个样品的接受供体之间得到的背景以上的平均刺激百分比，确定阳性供体细胞应答的强度。通过将应答强度值乘以供体应答的频率来计算应答指数，以确定每个样品的CD4+ T-细胞免疫原性的水平。另外，通过对比来自以下两个样品的结果确定代表相对CD4+ T-细胞免疫原性的应答指数：一个涉及志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)，且第二个变体是作为参比分子的缺乏CD4+ T-细胞表位和/或表位区域的一个或多个预测破坏的有关分子。
H.试验包含志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)的示例性细胞靶向分子的免疫
原性的下降
使用小鼠来研究本发明的某些示例性分子的免疫原性潜力。在许多周的时间段内在重复胃肠外施用以后，使用关于对细胞靶向分子的体内抗体应答的测定来确定示例性细胞靶向分子的相对免疫原性(参见例如WO 2015/113005)。使用在溶液中ELISA来确定对不同细胞靶向分子特异性的血清鼠抗体的相对量。该免疫原性测定涉及小鼠的使用，所述小鼠一般地指示哺乳动物中的分子的相对免疫原性。
使用该测定来确定包含SLT-1A-combo(n)：：scFv-(n)的示例性细胞靶向分子相对于更少去免疫化的细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv(n)或参比分子scFv-3：：SLT-1A-WT(SEQID NO：33)的相对免疫原性。以在相对免疫原性测定中试验的本发明的示例性细胞靶向分子的相反氨基-羧基融合取向构建参比分子scFv-3：：SLT-1A-WT，和由野生型志贺毒素A1片段(SEQ ID NO：4)(其代表“未去免疫化的”志贺毒素效应物多肽)组成的scFv-3：：SLT-1A-WT的志贺毒素效应物多肽组分。
进行了4个不同的小鼠研究，其中将BALB/c或C57BL/6小鼠随机地分配至由每组6只小鼠组成的治疗组，且其中给不同治疗组中的小鼠施用不同的细胞靶向分子。首先，在暴露于细胞靶向分子之前从每只小鼠收集血清样品。接着，通过腹膜内注射(每周3次，持续2周)每剂样品细胞靶向分子，给治疗组中的每只小鼠施用0.25毫克样品分子/千克体重(mg/kg)。没有施用任何样品的1周以后，施用0.25mg/kg的每剂样品细胞靶向分子的腹膜内注射，每周3次，持续另外2周，导致在5周期间中共12剂细胞靶向分子。对于所有研究，施用的分子SLT-1A-combo1：：scFv-1(SEQ ID NO：43)、SLT-1A-combo7：：scFv-1(SEQ ID NO：44)、SLT-1A-combo10：：scFv-1(SEQ ID NO：47)、SLT-1A-combo10：：scFv-2(SEQ ID NO：61)、SLT-1A-combo12：：scFv-1(SEQ ID NO：49)、SLT-1A-combo15：：scFv-1(SEQ ID NO：51)、SLT-1A-combo16：：scFv-1(SEQ ID NO：52)、SLT-1A-combo19：：scFv-1(SEQ ID NO：55)、SLT-1A-combo22：：scFv-2(SEQ ID NO：63)和参比分子SLT-1A-FR：：scFv-1(SEQ ID NO：34)和SLT-1A-FR：：scFv-2(SEQ ID NO：35)是良好耐受的，对体重没有产生影响或产生仅最小的影响，且没有产生临床征象。在5周施用期间中和以后，从所有小鼠收集血清以使用在溶液中ELISA观察靶向施用的细胞靶向分子的抗体。在Piedmont，NC，U.S.的Charles RiverLaboratories进行小鼠研究。这些研究的结果显示在表13-16和图15-16中。
用于检测识别施用的细胞靶向分子的抗体的在溶液中ELISA是对正在试验的细胞靶向分子的结合区域scFv-(n)特异性的，且如下执行。对于每种细胞靶向分子和它的各个小鼠-治疗组，执行不同的ELISA测定，但是使用相同的一般在溶液中ELISA测定方案。对照每种细胞靶向分子和它的各个小鼠-治疗组，在溶液中ELISA测定方案仅涉及该组的细胞靶向分子的scFv-(n)的适当靶生物分子。对于所有的在溶液中ELISA测定，用靶向细胞的结合区域scFv-(n)的靶生物分子包被ELISA板孔。将用于小鼠-治疗组的注射的相同细胞靶向分子在含有血清(其收集自来自该组的单个小鼠)的溶液中在4℃温育过夜，然后使用经包被的ELISA板孔捕获形成的任何复合物(例如包含细胞靶向分子和存在于血清中的抗体的复合物)。使用与辣根过氧化物酶缀合的抗-小鼠IgG第二抗体检测经捕获的包含鼠免疫球蛋白G分子(IgG)的免疫复合物。通过加入产色HRP底物并然后检测由化学发光引起的光发射，检测所述孔中的HRP活性。通过加入HCl来停止反应，并使用平板读数器在450nM测量HRP活性或“ELISA信号”。减去从“无血清”阴性对照孔测得的背景信号以后，将ELISA信号值计算为吸光度值(450nM吸光度)。将血清稀释以允许低于测定的饱和水平的吸光度值读出，且稀释比对于在给定天测量的所有治疗组中的所有小鼠而言是相同的。关于这些在溶液中ELISA测定的一般方案，更大的ELISA信号值指示更多的识别施用的细胞靶向分子的鼠IgG抗体的存在，或换而言之，更大的免疫原性。
基于这些在溶液中ELISA测定，观察到四个研究的任何治疗组中的小鼠在通过注射暴露之前都不具有预先形成的识别试验的细胞靶向分子的血清抗体。因而，使用在溶液中ELISA测定对这些研究的小鼠血清中的抗-“细胞靶向分子”IgG抗体的任何施用后检测代表施用细胞靶向分子以后诱导的新生抗体产生。
使用适当的在溶液中ELISA测定在不同的时间点在四个研究中测量对施用的细胞靶向分子的鼠IgG抗体应答，且将结果报告在表13-16和图15-16中。在每个时间点，稀释血清样品，使得ELISA信号值保持在测定的动态范围内。对个单个研究中的单个时间点，将所有血清样品相同地稀释。计算每个小鼠-治疗组在各个血清收集时间点的平均ELISA吸光度值(“平均ELISA信号”)。在进行这些相对免疫原性研究时，将注射进特定治疗组的小鼠中的相同细胞靶向分子用在ELISA测定中以捕获来自仅从相同组的小鼠收集的血清的血清抗体。换而言之，在特异性地且仅用SLT-1A-FR：：scFv-1设计的ELISA测定中捕获和检测存在于来自施用SLT-1A-FR：：scFv-1的小鼠(SLT-1A-FR：：scFv-1参比组)的血清中的抗-“细胞靶向分子”IgG抗体，且类似地，在特异性地且仅用SLT-1A-combo7：：scFv-1设计的在溶液中ELISA测定中捕获和检测存在于来自施用SLT-1A-combo7：：scFv-1的小鼠(例如SLT-1A-combo7：：scFv-1组)的血清中的抗-“细胞靶向分子”IgG抗体。
计算每个小鼠-治疗组在各个血清收集时间点的平均ELISA信号值，然后计算每个组在每个时间点相对于用如上所述的参比细胞靶向分子治疗的参比组在相同的各个时间点的平均ELISA吸光度值的相对免疫原性。使用以下公式计算每种经试验的示例性细胞靶向分子(SLT-1A-combo(n)：：scFv-(n))在给定的研究中在某个时间点相对于参比分子(例如，SLT-1A-FR：：scFv-(n)或scFv-3：：SLT-1A-WT)的免疫原性的相对免疫原性：(细胞靶向分子的ELISA信号-“无血清”对照的平均ELISA信号)/(参比分子的平均ELISA信号-“无血清”对照的平均ELISA信号)x100。为了制备图15-16，将每个小鼠-治疗组的参比分子ELISA信号的百分比绘在Y-轴上，并将血清收集天绘在X-轴上。为了测量对每种细胞靶向分子的哺乳动物IgG应答，为每个小鼠-治疗组计算平均ELISA信号（“平均信号”)和参比分子SLT-1A-FR：：scFv-(n)的平均信号百分比（“参比百分比”)(表13-16)。
来自第一个小鼠研究的相对免疫原性测定的结果呈现在图15-组A和表13中。术语“N/A”用于指示“不适用”，因为在第1天的计算涉及具有0的ELISA信号值的预处理血清。
表13.示例性细胞靶向分子SLT-1A-combo7：：scFv-1相对于SLT-1A-FR：：scFv-1的相对免疫原性
第一个相对免疫原性小鼠研究的结果是，示例性细胞靶向分子SLT-1A-combo7：：scFv-1在所有时间点表现出相对于参比细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-1的降低的免疫原性。在第1天以后的所有时间点，SLT-1A-combo7：：scFv-1治疗组的平均ELISA吸光度值低于SLT-1A-FR：：scFv-1治疗组(在第1天预处理收集血清)。对于试验的细胞靶向分子，首先在第15天(第6剂施用以后3天)观察到抗-“细胞靶向分子”IgG应答，并然后在所有以后的时间点观察到鼠IgG应答：第22天(第6剂施用以后10天，第7剂施用之前)，第29天(第9剂施用以后3天，第10剂施用之前)，第36天(最后一剂施用以后3天)，第43天(第11剂施用以后10天)，和第50天(最后一剂施用以后17天)(图15-组A；表13)。表13中的数据表明，包含去免疫化的、弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽combo7的细胞靶向分子SLT-1A-combo7：：scFv-1具有与包含野生型志贺毒素A1片段的细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-1相比降低的免疫原性。这些结果提示，仅包含由组合去免疫化的、蛋白酶切割抗性的、志贺毒素效应物多肽支架combo7组成的志贺毒素效应物多肽的分子表现出与包含含有(1)野生型志贺样毒素A1片段或(2)弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-FR的志贺毒素效应物多肽的分子相比降低的免疫原性。
来自第二个小鼠研究的相对免疫原性测定的结果显示在图15-组B和表14中。
表14.包含去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽的示例性细胞靶向分子的相对免疫原性
第二个相对免疫原性小鼠研究的结果是，试验的示例性细胞靶向分子(SLT-1A-combo10：：scFv-1、SLT-1A-combo16：：scFv-1和SLT-1A-combo19：：scFv-1)在第36天之前的所有时间点表现出与参比细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-1相比降低的免疫原性(图15-组B；表14)。对于试验的细胞靶向分子，首先在第15天观察到抗-“细胞靶向分子”IgG应答(第6剂施用以后3天)，并然后，在所有以后的时间点观察到鼠IgG应答：第22天(第6剂施用以后10天，第7剂施用之前)，第29天(第9剂施用以后3天，第10剂施用之前)，第36天(最后一剂施用以后3天)，和第40天(最后一剂施用以后7天)(图15-组B；表14)。在第15天和第22天，在施用了参比细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-1的组中的小鼠表现出比施用包含去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物支架(SLT-1A-combo10、SLT-1A-combo16和SLT-1A-combo19)的示例性细胞靶向分子的组中的小鼠更高量级的总IgG抗体应答，如通过ELISA信号所证实的(图15；表14)。在第29、36和40天，施用SLT-1A-combo16：：scFv-1和SLT-1A-combo19：：scFv-1的组的平均ELISA信号值的平均参比ELISA信号的百分比高于施用SLT-1A-combo1：：scFv-1的组。在所有时间点，SLT-1A-combo19：：scFv-1组的平均ELISA信号值的平均参比ELISA信号的百分比高于施用SLT-1A-combo10：：scFv-1或SLT-1A-combo16：：scFv-1的组的平均ELISA信号值的百分比。
来自第三个小鼠研究的相对免疫原性测定的结果展示在表15和图15-组C中。
表15.示例性细胞靶向分子相对于参比分子和彼此的相对免疫原性
在第1天以后直到第29天在所有时间点SLT-1A-combo10：：scFv-2和SLT-1A-combo22：：scFv-2治疗组的平均ELISA吸光度值低于SLT-1A-FR：：scFv-2和scFv-3：：SLT-1A-WT治疗组。表15中的数据表明，细胞靶向分子SLT-1A-combo10：：scFv-2和SLT-1A-combo22：：scFv-2(各自包含去免疫化的、弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽)在相反羧基-氨基融合取向的不同scFv(scFv-3)的背景下表现出与细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv2和野生型SLT-IA1片段相比降低的免疫原性。这些结果提示，其志贺毒素效应物多肽区域由组合去免疫化的、蛋白酶切割抗性的、志贺毒素效应物多肽支架combo10或combo22组成的细胞靶向分子表现出与其志贺毒素效应物多肽区域由(1)野生型志贺毒素效应物多肽或(2)弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-FR组成的细胞靶向分子相比降低的免疫原性。
来自第四个小鼠研究的相对免疫原性测定的结果显示在图16和表16中。
表16.示例性细胞靶向分子相对于SLT-1A-FR：：scFv-1的相对免疫原性
第四个免疫原性研究的结果是，试验的示例性细胞靶向分子至少在较早的时间点表现出与参比细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-1相比降低的免疫原性(图14-组A；表16)。在第1天预处理收集血清。对于试验的细胞靶向分子，首先在第15天观察到抗-“细胞靶向分子”IgG应答(第6剂施用以后3天)，并然后，在所有以后的时间点观察到鼠IgG应答：第22天(第6剂施用以后10天，第7剂施用之前)，第29天(第9剂施用以后3天，第10剂施用之前)，第36天(最后一剂施用以后3天)，和第40天(最后一剂施用以后7天)(图14；表16)。在第15天、第22天和第29天，施用参比细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-1的组中的小鼠表现出与施用包含去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物支架(SLT-1A-combo1、SLT-1A-combo10、SLT-1A-combo12和SLT-1A-combo15)的示例性细胞靶向分子的组中的小鼠相比更高量级的总IgG抗体应答，如通过ELISA信号证实的(图16；表16)。在所有时间点，SLT-1A-combo1：：scFv-1治疗组的平均ELISA信号值的平均参比ELISA信号的百分比高于施用SLT-1A-combo10：：scFv-1、SLT-1A-combo12：：scFv-1和SLT-1A-combo15：：scFv-1的治疗组的平均ELISA信号值的百分比。在第36和40天，施用SLT-1A-combo12：：scFv-1的治疗组的平均ELISA信号值的平均参比ELISA信号的百分比高于施用SLT-1A-combo10：：scFv-1和SLT-1A-combo15：：scFv-1的治疗组。这些结果提示，其志贺毒素效应物多肽区域由组合去免疫化的、蛋白酶切割抗性的、志贺毒素效应物多肽支架SLT-1A-combo1、SLT-1A-combo10、SLT-1A-combo12和SLT-1A-combo15组成的细胞靶向分子表现出与其志贺毒素效应物多肽区域由(1)野生型志贺毒素效应物多肽或(2)弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-FR组成的细胞靶向分子相比降低的免疫原性。
在第二个、第三个和第四个小鼠研究中所试验的细胞靶向分子中，组合去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物支架SLT-1A-combo10似乎在试验条件下被该相对免疫原性测定最大地去免疫化(参见图15-16；表14-16)。该志贺毒素效应物支架包含：(1)5个被破坏的表位区域，其中2个涉及多个氨基酸残基置换，和(2)被嵌入的异源T-细胞表位破坏的内源性表位区域。在第二个研究中，组合去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物支架SLT-1A-combo16似乎比组合去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物支架SLT-1A-combo19更多地去免疫化，特别是在较早的时间点(参见图15-组B；表14)。在第四个研究中，组合去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物支架SLT-1A-combo1似乎在试验的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(1、10、12和15)中最低地去免疫化(参见图16-组A；表16)。在第四个研究中，组合去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物支架SLT-1A-combo15似乎比SLT-1A-combo12更多地去免疫化，特别是在较晚的时间点(参见图16-组A；表16)。
这些免疫原性研究的结果指示，两类表位区域破坏(氨基酸残基置换和嵌入的异源CD8+ T-细胞表位)可以促进志贺毒素效应物多肽的去免疫化。此外，两类破坏在相同志贺毒素效应物多肽中的组合可以产生更多去免疫化的志贺毒素效应物多肽。施用包含这些组合去免疫化的、CD8+ T-细胞超免疫的蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽的示例性细胞毒性细胞靶向分子的组中的小鼠的抗体诱导的总量级，与施用包含蛋白酶切割抗性的、但是另外野生型志贺毒素效应物多肽区域的细胞靶向分子的组中的小鼠的抗体诱导的量级相比减小。包含某些组合去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物支架的细胞靶向分子的ELISA信号值的下降证实，这些特定支架被成功地去免疫化(即在哺乳动物中具有降低的免疫原性潜力)。因而，志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo1、SLT-1A-combo7、SLT-1A-combo10、SLT-1A-combo12、SLT-1A-combo15、SLT-1A-combo16和SLT-1A-combo19在哺乳动物中表现出降低的免疫原性潜力，且与仅包含野生型或仅仅蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽的类似分子相比，包含这些多肽的任何示例性细胞靶向分子将被去免疫化，这是由于StxA和SLT-1A中来自氨基酸残基238-257的天然地定位的区域中的弗林蛋白酶切割基序突变。
在试验的不同组合去免疫化的、蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽的免疫原性潜力中观察到的差异表明，去免疫化的亚区域和/或嵌入的T-细胞表位亚区域的某些组合会使免疫原性降低不同的量级。例如在研究2中，SLT-1A-combo10比SLT-1A-combo16和SLT-1A-combo 19更多地去免疫化，特别是在较晚的时间点(表14；图15-组B)，尽管combo16和combo19包含与SLT-1A-combo10所包含的野生型志贺毒素A亚基相比更多被破坏的表位区域和总氨基酸残基置换(表8)。在研究4中，SLT-1A-combo10比SLT-1A-combo12更多地去免疫化，特别是在较晚的时间点(表16；图16-组A)，尽管SLT-1A-combo12和SLT-1A-combo15包含与SLT-1A-combo10所包含的野生型志贺毒素A亚基相比更多被破坏的表位区域和总氨基酸残基置换(表8)。因而，另外的B-细胞表位区域破坏的累积组合不一定导致免疫原性的另外下降，但是倒可能导致不希望的免疫原性的增加，例如，在较晚的时间点(参见图15-组B，并将SLT-1A-combo10的结果与SLT-1A-combo16和SLT-1A-combo19的结果进行对比)。
I.试验示例性细胞靶向分子将T-细胞表位肽递送至细胞的MHC I类途径用于呈递
的能力
MHC I类系统对T-细胞表位的呈递靶向呈递细胞用于通过CTL介导的裂解进行杀死，并且也触发局部区域中的免疫刺激。通过工程改造包含含有异源免疫原性表位的志贺毒素效应物多肽的细胞靶向分子，可以完成免疫刺激性抗原的靶向递送和呈递。靶细胞对免疫刺激性的非自身抗原(例如具有高免疫原性的已知病毒抗原)的呈递会向其它免疫细胞发信号以破坏靶细胞以及将更多免疫细胞募集至生物体内的该区域。
为了在相同志贺毒素效应物多肽区域内同时去免疫化和提供在靶细胞表面上的T-细胞表位呈递，如下破坏预测的B-细胞表位区域：将其中的氨基酸残基用预测会结合人MHC I类分子的免疫原性的T-细胞表位区域替代。
在该实施例中，研究了本发明的示例性细胞靶向分子将T-细胞表位递送至靶细胞的MHC I类途径用于呈递至靶细胞表面的能力。另外，通过观察由MHC 1分子对递送的表位肽的呈递诱导的不同免疫应答，研究了靶细胞对由本发明的示例性细胞靶向分子递送的T-细胞表位的MHCI类呈递的功能后果。
1.试验分子将T-细胞表位肽递送至MHC I类途径用于呈递在细胞表面上的能力
使用本领域已知的常规测定来研究本发明的示例性分子将T-细胞表位递送至MHCI类分子的能力(参见例如WO 2015/113007)。具体地，使用流式细胞计量方法来证实与MHCI类分子形成复合物的T-细胞表位肽(插入或嵌入在志贺毒素效应物多肽中)在靶细胞的表面上的递送和细胞外展示。该流式细胞计量方法利用可溶性的人T-细胞受体(TCR)多聚体试剂(Soluble T-Cell Antigen Receptor STARTMMultimer，Altor Bioscience Corp.，Miramar，FL，U.S.)，各自具有对不同表位-人HLA复合物的高亲和力结合。
每种STARTMTCR多聚体试剂源自特定T-细胞受体，并允许基于选择的TCR识别在特定MHC I类分子的背景下存在的特定肽而检测特定肽-MHC复合物。这些TCR多聚体由已经用抗生蛋白链菌素生物素化和多聚化的重组人TCR组成。用藻红蛋白(PE)标记TCR多聚体。这些TCR多聚体试剂允许检测存在于人细胞表面上的特定肽-MHC I类复合物，因为每种可溶性的TCR多聚体类型在不同条件下识别并稳定地结合特定肽-MHC复合物(Zhu X等人，JImmunol 176：3223-32(2006))。这些TCR多聚体试剂允许通过流式细胞计量术鉴别和定量存在于细胞表面上的肽-MHC I类复合物。
在该实施例中使用的靶细胞可得自ATCC(Manassas VA，U.S.)、美国国立癌症研究所(Frederick，MD，U.S.)和/或DSZM(Braunschweig，DE)。使用本领域已知的标准流式细胞计量方法，证实靶细胞在它们的细胞表面上表达适当的MHC-I类分子和在该实施例中使用的细胞靶向分子的细胞靶向部分的细胞外靶生物分子。
将靶细胞用本发明的示例性细胞靶向分子处理，每种包含含有嵌入的或插入的T-细胞表位的志贺毒素效应物多肽。在该实施例中试验的本发明的某些示例性分子通过下述突变中的一个或两个的添加而催化上受损或灭活：Y77S和E167D。考虑到对志贺毒素的细胞类型特异性敏感性，通过在与其他人所用浓度类似的浓度外源施用本发明的不同示例性细胞靶向分子来处理靶细胞组(参见例如Noakes K等人，FEBS Lett 453：95-9(1999))。然后将处理过的细胞在标准条件(包括在37℃和含有5％二氧化碳的气氛)下温育6小时，以允许志贺毒素效应物多肽区域介导的中毒。然后，将细胞用细胞培养基洗涤，再悬浮于新鲜细胞培养基中，并在用适当的STARTM多聚体试剂染色之前温育20小时。还试验了另外的时间点和方案条件。
作为对照，在三种条件下处理靶细胞组：1)没有任何处理(“未处理”)，意味着没有添加外源分子，2)用外源施加的对照抗原-肽，和3)用外源施加的与Peptide LoadingEnhancer(“PLE”，Altor Bioscience Corp.，Miramar，FL，U.S.)组合的对照抗原-肽。与PLE处理组合的对照抗原-肽允许外源肽加载和充当阳性对照。展示适当MHC I类单元型的细胞可以被迫从细胞外空间(即在没有施加的肽的细胞内化存在下)或在有PLE(它是B2-微球蛋白和其它组分的混合物)存在下加载适当的外源施加的肽。
处理以后，将所有细胞组洗涤并与适当的STAR多聚体试剂一起在冰上温育1小时。将细胞洗涤，并使用AccuriTMC6流式细胞计(BD Biosciences，San Jose，CA，U.S.)通过流式细胞计量术测量样品的荧光以检测与群体中的细胞结合的任何STARTM多聚体的存在并定量(有时在本文中被称作“染色”)。
未经处理的对照组用于通过采用门控来鉴别阳性和阴性细胞群体，所述门控导致小于1％的来自未经处理的对照组的细胞处于“阳性”门控(代表背景信号)中。然后将相同的门控应用于其它样品以表征每个样品的阳性群体。
与人MHC I类分子形成复合物的、外源施加的嵌入的或插入的T-细胞表位在中毒的靶细胞的细胞表面上的检测证实，包含嵌入的或插入的T-细胞表位肽的细胞靶向分子能够进入靶细胞、执行充分的亚细胞按路线发送和将足够的T-细胞表位递送至MHC I类途径用于在靶细胞表面上进行表面呈递。
2.试验分子的诱导细胞毒性T-细胞介导的靶细胞的细胞裂解和其它免疫应答的能力
使用本领域已知的常规测定来研究靶细胞对由本发明的示例性细胞靶向分子递送的T-细胞表位的MHC I类呈递的功能后果(参见例如WO 2015/113007)。要研究的功能后果包括CTL活化、CTL介导的靶细胞杀死和CTL的细胞因子释放。
使用一种基于CTL的细胞毒性测定来评估表位呈递的后果。所述测定包括组织培养的靶细胞和T-细胞。如在WO 2015/113007中所述，使靶细胞中毒。简而言之，将靶细胞在含有不同的外源施加的细胞靶向分子的标准条件下温育6小时，其中某些细胞靶向分子包含本发明的志贺毒素效应物多肽。接着，将CTL加给中毒的靶细胞并温育以允许T-细胞识别和结合展示表位肽/MHC I类复合物的任何靶细胞。然后，使用技术人员已知的标准方法研究了某些功能后果，包括CTL与靶细胞的结合、通过CTL介导的细胞裂解实现的靶细胞杀死和细胞因子(诸如干扰素γ或白介素)的释放(通过ELISA或ELIspot)。
使用商购可得的CTL应答测定，例如非放射性测定(PromegaCorp.，Madison，WI，U.S.)、Granzyme B ELISpot测定(Mabtech，Inc.，Cincinnati，OH，U.S.)、胱天蛋白酶活性测定和LAMP-1易位流式细胞计数测定，定量了展示表位肽/MHC I类复合物的靶细胞对CTL的活化。为了特异性地监测CTL介导的靶细胞杀死，如本领域所述(参见例如Durward M等人，J Vis Exp 45 pii 2250(2010))，使用羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)进行靶细胞的体外和体内研究。
实施例2的总结
将包含具有多个B-细胞表位区域破坏的组合志贺毒素效应物多肽的示例性细胞靶向分子去免疫化，如抗原性和免疫原性相对于参比分子的下降所证实的。另外，本实施例表明，包含组合志贺毒素效应物多肽(其含有多个B-细胞表位区域破坏、弗林蛋白酶切割基序破坏和/或嵌入的T-细胞表位)的某些去免疫化的细胞靶向分子保留显著水平的一种或多种志贺毒素效应物功能，例如，催化核糖体抑制、细胞内按路线发送和细胞毒性。
表17总结了来自实施例2的关于本发明的示例性的、蛋白酶切割抗性的、去免疫化的、细胞靶向分子的结果，它们包含志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo1、SLT-1A-combo7、SLT-1A-combo10、SLT-1A-combo12、SLT-1A-combo15、SLT-1A-combo16或SLT-1A-combo19。
表17.针对在哺乳动物中的细胞毒性和降低的免疫原性潜力经验地试验的示例性细胞靶向分子的总结
在表17中所示的本发明的示例性的蛋白酶切割抗性的去免疫化的细胞靶向分子都表现出显著水平的细胞毒性，其是与包含野生型志贺毒素A1片段的细胞靶向分子可比较的。本发明的这些示例性的蛋白酶切割抗性的去免疫化的细胞靶向分子表现出核糖体对翻译的催化抑制，与野生型志贺毒素A亚基和/或A1片段可比较的细胞内按路线发送，和与包含野生型志贺毒素A1片段和/或A亚基的细胞靶向分子可比较的细胞毒性。本发明的这些示例性的蛋白酶切割抗性的去免疫化的细胞靶向分子表现出与野生型志贺毒素A亚基和/或A1片段可比较的催化活性水平。本发明的这些示例性的蛋白酶切割抗性的去免疫化的细胞靶向分子表现出与野生型志贺毒素A亚基和/或A1片段可比较的细胞毒性水平。与包含由(1)野生型志贺毒素A1片段和/或(2)弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-FR组成的志贺毒素效应物多肽区域的细胞靶向分子相比，本发明的这些细胞靶向分子都在哺乳动物中表现出降低的免疫原性。此外，本发明的某些细胞靶向分子表现出增加的稳定性、改善的体内耐受性和/或递送异源T-细胞表位用于被靶细胞进行MHC I类呈递的能力。
在实施例2中显示的结果增强了以下理论：不同的示例性表位区域破坏可以一起组合在单个分子中以建立抗原性和/或免疫原性的较大下降，同时仍然保留显著水平的一种或多种志贺毒素效应物功能(参见例如WO 2015/113005)，且有时提供不存在于野生型志贺毒素A亚基中的另一种功能特征，例如，弗林蛋白酶切割抗性和/或将异源T-细胞表位递送至靶细胞的能力。本发明的某些组合去免疫化的志贺毒素A亚基效应物多肽表现出与它们的部分地去免疫化的亚区域(例如，SLT-1A-combo7SLT-1A-combo10和SLT-1A-combo15)的总和相比免疫原性的协同降低。
已经在至少一种保留显著水平的体外核糖体抑制和/或细胞毒性的志贺毒素效应物多肽中制作下述置换并进行试验：K1A、K1M、T4I、S8I、T9I、K11A、S33I、S33C、S43N、G44L、S45V、T45V、S45I、T45I、G46P、D47M、N48V、L49A、F50T、A51V、D53A、D53N、V54L、V54I、R55A、R55V、R55L、G56P、I57F、I57M、D58A、D58V、D58F、P59A、P59F、E60I、E60T、E60R、E61A、E61V、E61L、G62A、D94A、S96I、T104N、A105L、T107P、L108M、S109V、G110A、D111T、D141A、V154A、G147A、T180G、T181I、D183A、D183G、D184A、D184A、D184F、L185D、S186A、S186F、G187A、G187T、R188A、S189A、D198A、R205A、C242S、R248A和R251A。
尽管存在预测推演的成功置换的挑战，在本文实施例中提供的数据给出了认为某些氨基酸置换可能成功地降低抗原性和/或免疫原性并同时维持显著的志贺毒素效应物功能的理由。术语“成功”在这里用于指在预测的表位区域中的一个或多个氨基酸残基置换产生保留一种或多种志贺毒素效应物功能的志贺毒素效应物多肽。例如，在本文中被证实成功地耐受置换的特定氨基酸位置处的置换当被某些其它氨基酸置换时可能对于保留至少一种志贺毒素效应物功能而言是成功的。成功的单氨基酸置换通常可以与在不同表位区域中的其它成功的氨基酸置换组合以产生保留显著的志贺毒素效应物功能的去免疫化的志贺毒素效应物多肽。类似地，证实了包含志贺毒素效应物多肽区域(其具有在相同表位区域内的多个单氨基酸置换)的细胞靶向分子保留酶活性，这提示在相同表位区域中的成功的单氨基酸置换通常可以与相同表位区域中的其它单氨基酸置换组合以产生保留显著的志贺毒素效应物功能的去免疫化的志贺毒素效应物多肽。
已经经验地证实，某些置换(K1A、K1M、T4I、S8I、T9I、K11A、S33I、S33C、S43N、G44L、S45V、T45V、S45I、T45I、G46P、D47M、N48V、L49A、F50T、A51V、D53A、D53N、V54L、V54I、R55A、R55V、R55L、G56P、I57F、I57M、D58A、D58V、D58F、P59A、P59F、E60I、E60T、E60R、E61A、E61V、E61L、G62A、D94A、S96I、T104N、A105L、T107P、L108M、S109V、G110A、D111T、D141A、G147A、V154A、G147A、T180G、T181I、D183A、D183G、D184A、D184A、D184F、L185D、S186A、S186F、G187A、G187T、R188A、S189A、D198A、R205A、C242S、R248A、R251A和/或它们的组合)和某些位置耐受置换(1、4、8、9、11、33、43、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、94、96、104、105、107、108、109、110、111、141、147、154、180、181、183、184、185、186、187、188、189、198、205、242、248和251)，同时保留对于至少一种志贺毒素效应物功能而言显著的活性水平。该经验数据提示某些其它破坏表位的置换和破坏表位的置换的组合可以用来产生保留显著的志贺毒素效应物功能的去免疫化的志贺毒素效应物多肽。可预测的是，还将耐受对保守官能团的氨基酸残基的其它氨基酸置换。例如，技术人员已知与K1A、K1M、T4I、S8I、T9I、K11A、S33I、S33C、S43N、G44L、S45V、T45V、S45I、T45I、G46P、D47M、N48V、L49A、F50T、A51V、D53A、D53N、V54L、V54I、R55A、R55V、R55L、G56P、I57F、I57M、D58A、D58V、D5SF、P59A、P59F、E60I、E60T、E60R、E61A、E61V、E61L、G62A、D94A、S96I、T104N、A105L、T107P、L108M、S109V、G110A、D111T、D141A、G147A、V154A、G147A、T180G、T181I、D183A、D183G、D184A、D184A、D184F、L185D、S186A、S186F、G187A、G187T、R188A、S189A、D198A、R205A、C242S、R248A或R251A中的任一个类似的其它置换还将能够破坏表位，同时维持至少一种志贺毒素效应物功能。
实施例3.弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素A亚基效应物多肽和包含它们的细胞靶向分子
制备了弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素A亚基效应物多肽并作为细胞靶向分子的组分进行了试验，其中每种细胞靶向分子包含靶向细胞的免疫球蛋白型结合区域。为了将蛋白酶抗性工程改造进志贺毒素效应物多肽中，将两个氨基酸残基置换R248A和R251A引入如在实施例2中所述的志贺毒素效应物多肽中。使用志贺毒素效应物多肽SLT-1A-FR(SEQID NO：5)来制备细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-9(SEQ ID NO：41)。
A.定量本发明的分子相对于参比分子的弗林蛋白酶切割
使用技术人员已知的方法使用体外弗林蛋白酶切割测定试验了细胞靶向分子SLT-1A-FR：：scFv-9(SEQ ID NO：41)以相对于野生型对照定量弗林蛋白酶切割(参见例如WO 2015/191764)。为了评估弗林蛋白酶的切割SLT-1A-FR：：scFv-9的能力，在弗林蛋白酶切割缓冲液(100毫摩尔(mM)HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，pH 7，1mM CaCl2)中以0.5弗林蛋白酶活性单位(U)/微克(μg)样品蛋白将在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的纯化的蛋白样品与弗林蛋白酶(New England Biolabs，Ipswich，MA，U.S.)一起在30℃温育30小时。将对照样品在没有弗林蛋白酶存在下在相同缓冲液中在4℃或30℃温育。将不同的细胞靶向分子样品在变性条件下在SDS、聚丙烯酰胺凝胶上电泳并用考马斯染色(图17)。
图17显示了凝胶的照片，其中泳道被编号，且图例指示给哪个泳道加载哪种样品：包含野生型志贺毒素效应物多肽区域(SLT-1A-WT)或弗林蛋白酶切割位点被破坏的志贺毒素效应物多肽(SLT-1A-FR)的细胞靶向分子。用“MW标记”标记的泳道显示了蛋白分子量梯子的迁移图案以及用于用作内部分子量参比的以千道尔顿(kDa)为单位的各个梯子蛋白带的近似大小，所述内部分子量参比允许估计编号的泳道中的蛋白的大小。图例指示细胞靶向分子样品的预处理条件：以摄氏度(℃)为单位的温度，持续时间，和是否加入任何弗林蛋白酶(通过指出每微克的弗林蛋白酶活性单位量(标记为“U/μg弗林蛋白酶”)或对于0单位的“无弗林蛋白酶”)。
图17表明，SLT-1A-FR：：scFv-9(SEQ ID NO：41)可耐受人弗林蛋白酶的蛋白水解性裂解。在该测定中试验的细胞靶向分子都是约56kDa大小，且包含与羧基端接头和结合区域(它们一起是约28kDa大小)连接的约28kDa的志贺毒素效应物多肽(对于SLT-1A-WT或SLT-1A-FR而言，大小是相等的)。如果弗林蛋白酶切割已经发生在SLT-1A的表面暴露的延长环242-251中，那么预见到的结果将是具有各自约28kDa的近似相等分子量的两个蛋白带。如果弗林蛋白酶切割精确地发生在SLT-1A-WT：：scFv-9中的WT支架的位置251处的精氨酸的羧基肽键，那么产生的两个蛋白带将具有对于SLT-1A(WT或FR)而言27.5kDa和对于scFv-9而言28.3kDa的分子量。
使用GelAnalyzer 2010软件分析凝胶。该软件检测在图17中显示的凝胶的泳道和在每个泳道内的带。使用背景减去模式，自动地定义背景并从使用滚球背景减去(将球半径设定在25)分析的所有带的体积减去。在图17中显示的凝胶的该定量带分析结果总结在表18中。表18显示了在图17中显示的凝胶中迁移至泳道1-6中的约56kDa的某些带的相对迁移率和粗体积值。包含野生型志贺毒素效应物多肽的细胞靶向分子(SLT-1A-WT：：scFv-9)(SEQ ID NO：42)的“无弗林蛋白酶”4℃处理产生泳道#2，将其用作对照以确定在没有或有弗林蛋白酶存在下在30℃未切割的物质的百分比(分别是泳道#2和#3)。对于SLT-1A-FR：：scFv-9样品，使用“无弗林蛋白酶”4℃泳道(泳道#4)来确定在没有或有弗林蛋白酶存在下在30℃未切割的物质的百分比(分别是泳道#5和#6)。对于每种分子，通过下式计算每种弗林蛋白酶处理过的样品的约56kDa带的“未切割百分比”：(约56kDa样品带的粗体积)/(来自“无弗林蛋白酶”4℃处理的约56kDa带的粗体积)x100(参见表18)。
表18.弗林蛋白酶切割相对于参比分子的定量
对于野生型弗林蛋白酶位点样品，与弗林蛋白酶一起温育的样品的约56kDa带中的蛋白的量相对于“无弗林蛋白酶”样品的约56kDa带中的蛋白的量下降(表18；图17，泳道#3相对于泳道#1和#2)。SLT-1A-WT：：scFv-9的弗林蛋白酶处理导致约28kDa的两个新带的产生(图17，泳道#3)，其匹配在SLT-1A-WT：：scFv-9的志贺毒素A1片段区域的羧基端处的切割所产生的弗林蛋白酶切割产物的预期大小。对于SLT-1A-FR：：scFv-9样品，与弗林蛋白酶泳道一起温育的样品中的约55kDa带的蛋白量似乎与“无弗林蛋白酶”样品的约55kDa带中的蛋白量相比没有变化(表18；图17，泳道#6相对于泳道#4和#5)。
该定量分析表明，用野生型志贺毒素效应物多肽SLT-1A-WT和羧基端结合区域设计的细胞靶向分子表现出约67.3％切割，约32.7％的SLT-1A-WT：：scFv-9保持未被切割。弗林蛋白酶切割相对于参比分子的百分比可以表达为目标分子的[(可用物质-未切割的)/可用物质]与参比分子的[(可用物质-未切割的)/可用物质]的比率。在该测定中，SLT-1A-FR：：scFv-9表现出[(985-1000)/1000]/[(766-246)/766]＝-1.5％参比切割或大约0切割。
该测定表明，用志贺毒素效应物多肽SLT-1A-FR设计的细胞靶向分子表现出0％切割，100％的细胞靶向分子保持未切割。因而，SLT-1A-FR支架在该测定中在试验条件下似乎耐受弗林蛋白酶切割。
B.使用实验动物试验本发明的细胞靶向分子的体内耐受性
使用小鼠试验了本发明的示例性细胞靶向分子的体内耐受性以便确定在细胞靶向分子样品的不同剂量检测到的明显不良作用的程度。使用技术人员已知的和/或本文描述的方法执行耐受性研究(参见例如WO 2015/191764)。例如，给小鼠注射在0.25-5.00毫克/千克体重/注射(mg/kg/inj)范围内的剂量的细胞靶向分子样品或赋形剂对照，每周3次持续几周。为了评估体内耐受性，针对健康和临床征象的变化，例如，发病率、morbundity、体重、身体外观、可测量的临床征象、未受刺激的行为和对外部刺激的应答等方面，监测经注射的小鼠(参见例如Morton D，Griffiths P，Vet Rec 116：431-43(1985)；MontgomeryC，Cancer Bull 42：230-7(1990)；Ullman-CulleréM，Foltz C，Lab Anim Sc 49：319-23(1999)；Clingerman K，Summers L，J Am Assoc Lab Anim Sci 51：31-6(2012))。响应于发病和/或morbundity的征象可以使用安乐死，且因而，建立死亡时间点。例如，在2-3天中15-20％的体重下降可以用作啮齿类动物中的发病迹象和用作安乐死的理由(参见例如Institute of Laboratory Animal Research 2011.Guide for the care and use oflaboratory animals，第8版，Washington，DC，U.S.：National Academies Press)。
与包含野生型志贺毒素A1片段的有关参比分子相比，包含弗林蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物多肽的本发明的细胞靶向分子表现出改善的耐受性(例如改善的非特异性毒性谱)(参见例如WO 2015/191764)。这样的改善的体内耐受性可以是由于志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子的结合区域和/或有毒组分之间的连接的稳定性增加。
C.使用动物模型试验本发明的示例性细胞靶向分子在体内的靶向细胞毒性和效
力
使用动物模型来确定示例性的志贺毒素效应物多肽combo(n)和包含前述物质的细胞靶向分子的靶向阳性赘生性细胞的体内效应。使用不同小鼠品系来试验将每种分子静脉内施用给那些小鼠以后细胞靶向分子对小鼠中的异种移植肿瘤的影响。在某些实验中，使用人肿瘤的弥散性异种移植模型来确定本发明的示例性细胞靶向分子在携带人肿瘤的小鼠中的体内效力。在该异种移植模型中使用组成性地表达萤光素酶且表现出适当scFv-(n)的靶标的细胞表面表达的人肿瘤细胞。使用技术人员已知的方法来试验本发明的分子的靶向细胞毒性(参见例如WO 2014/164680、WO 2014/164693、WO 2015/191764)。本发明的某些细胞靶向分子能够显著地减少用人肿瘤细胞攻击的小鼠中的人肿瘤负荷。
如在实施例1-4中所示，本发明的组合志贺毒素A亚基效应物多肽可以用作支架来建立细胞靶向分子，其表现出：1)增加的稳定性，2)改善的在脊索动物中的体内耐受性，2)施用给脊索动物以后降低的免疫原性潜力，和/或递送嵌入的或插入的T-细胞表位用于由有核脊索动物细胞进行MHC I类呈递的能力。在某些组合中，得到的去免疫化水平代表组合在一起的单独地去免疫化的亚区域的协同作用。
实施例4.一种示例性的靶向CD38+细胞的细胞靶向分子
通过基于荧光的流式细胞计量测定，确定“SLT-1A-combo7：：αCD38-scFv-1”蛋白(SEQ ID NO：82)与细胞外人CD38靶标的结合特征。将含有CD38阳性(CD38+)细胞(属于细胞系A或F)的样品悬浮于含有1％牛血清白蛋白(BSA)(Calbiochem，San Diego，CA，U.S.)的1XPBS(在下文中被称作“1X PBS+1％BSA”)中，并与100μL的SLT-1A-combo7：：αCD38-scFv-1的不同稀释液一起在4℃温育1小时。选择在测定中试验的SLT-1A-combo7：：αCD38-scFv-1的最高浓度以饱和所有的结合可能性。将CD38阴性的(CD38-)细胞(属于细胞系H和I)用在该测定中在靶阳性细胞上试验的最高浓度的SLT-1A-combo7：：αCD38-scFv-1处理。1小时温育以后，将细胞样品用1X PBS+1％BSA洗涤2次。将细胞样品与100μL含有α-SLT-1A pAb1的1XPBS+1％BSA一起在4℃温育1小时，然后再次洗涤并与100μL含有与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗-兔第二抗体的1X PBS+1％BSA溶液一起在4℃温育1小时。
将细胞样品用1X PBS+1％BSA洗涤2次，再悬浮于200μL 1XPBS中，并进行基于荧光的流式细胞计量术以测定被足够第二抗体结合的细胞的百分比，其指示SLT-1A-combo7：：αCD38-scFv-1与每个样品中的细胞的结合水平。通过使用没有用任何细胞靶向分子处理、但是与如上所述的α-SLT-1A pAb1第一抗体和抗-兔第二抗体一起温育的细胞的阴性对照样品门控数据，得到以平均荧光强度单位(MFI)、以相对荧光单位表示的所有样品的数据。通过将阳性细胞的百分比乘以MFI，计算积分MFI(iMFI)。使用Prism软件(GraphPadSoftware，San Diego，CA，U.S.)绘制iMFI相对于以纳摩尔为单位的“蛋白浓度”的图。使用在标题结合饱和度下的一位点结合的Prism软件函数[Y＝Bmax*X/(KD+X)]，使用基线校正数据计算Bmax和KD。Bmax是以iMFI为单位报告的最大特异性结合。KD是以纳摩尔为单位报告的平衡结合常数。
结合两种不同CD38+细胞类型的SLT-1A-combo7：：αCD38-scFv-1(SEQ ID NO：82)的Bmax被测量为大约100,000iMFI，且结合那些CD38+细胞的SLT-1A-combo7：：αCD38-scFv-1的KD被测量为大约2-7nM(表19；图18)。SLT-1A-combo7：：αCD38-scFv-1在该测定中在描述的条件下没有表现出与CD38-细胞的特异性结合或与CD38-细胞的高亲和力结合(图18)。
表19.结合特征：本发明的示例性细胞靶向分子的细胞结合的Bmax和KD的代表性值
针对如在实施例2中所述的催化活性试验了示例性的靶向CD38的细胞靶向分子SLT-1A-combo7：：αCD38-scFv-1。SLT-1A-combo7：：αCD38-scFv-1(SEQ ID NO：82)表现出与野生型可比较的核糖体灭活活性。
针对如在实施例2中所述的细胞毒性试验了示例性的靶向CD38的细胞靶向分子SLT-1A-combo7：：αCD38-scFv-1。SLT-1A-combo7：：αCD38-scFv-1(SEQ ID NO：82)对CD38+细胞是有效地细胞毒性的。
针对如在实施例2中所述的降低的免疫原性试验了示例性的靶向CD38的细胞靶向分子SLT-1A-combo7：：αCD38-scFv-1。SLT-1A-combo7：：αCD38-scFv-1(SEQ ID NO：82)表现出与对照SLT-1A-FR：：αCD38-scFv-1相比降低的免疫原性。
使用表达CD38的人细胞和技术人员已知的测定在人癌症的异种移植模型中试验了示例性的靶向CD38的细胞靶向分子SLT-1A-combo7：：αCD38-scFv-1(参见例如WO 2014/164693)。与对照赋形剂治疗组相比，SLT-1A-combo7：：αCD38-scFv-1(SEQ ID NO：82)表现出减少注射了CD38阳性的人赘生性细胞的小鼠中的肿瘤负荷的能力。在该研究中，给小鼠注射2.5x 106Daudi-Luc细胞(人CD38阳性的肿瘤细胞系，其已经被工程改造成表达萤光素酶基因)。肿瘤注射以后4天，将小鼠随机分成每组8只小鼠的组，并开始处理。在对照组和细胞靶向分子治疗组中的小鼠分别接受仅赋形剂或细胞靶向分子，在5周中12剂(每周3次持续2周，停用1周，然后再每周3次持续2周)。在研究的不同天，按照每秒的光子数测量全身生物发光(BLI)以通过检测表达萤光素酶的Daudi细胞随时间监测肿瘤负荷。在治疗之前，使用它们的BLI读出将小鼠随机化，以便建立具有类似平均和中位BLI值的小鼠组。该研究的结果报告在表20和图19中。表20列出了细胞靶向分子治疗组和仅赋形剂对照组的平均BLI信号以及由下式定义的“治疗相对于对照”百分比(％T/C)：(治疗组的中位BLI信号)/(仅赋形剂对照组的中位BLI信号)x 100。第4天涉及治疗前测量。
表20.使用示例性细胞靶向分子SLT-1A-combo7：：αCD38-scFv-1的治疗减轻了体内肿瘤负荷
在研究第7、14、22、36和40天做出的BLI测量表明，仅赋形剂对照组具有比用每剂0.5毫克SLT-1A-combo7：：αCD38-scFv-1/千克体重治疗的组更高的肿瘤负荷。在最终的时间点(第40天)，治疗组相对于仅赋形剂对照的BLI的百分比(T/C)是11％，从而指示在用SLT-1A-combo7：：αCD38-scFv-1(SEQ ID NO：82)治疗的组中存在89％的中位肿瘤负荷下降。
实施例5.包含与HER2结合区域连接的本发明的志贺毒素效应物多肽(与SLT-1A-combo(n)融合的αHER2-VHH)的细胞靶向分子
在该实施例中，将如上所述的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo0-26中的任一种可操作地连接至免疫球蛋白结合区域抗-HER2，后者特异性地且以高亲和力结合人HER2上的细胞外抗原，诸如如在美国专利申请公开2011/59,090中描述的骆驼科抗体5F7(αHER2-VHH)的单结构域可变区，以形成本发明的示例性细胞靶向分子。
细胞毒性的结合HER2的融合蛋白“SLT-1A-combo(n)：：αHER2-VHH”的构建、生产和
纯化
对于某些实施方案，将免疫球蛋白来源的结合区域αHER2-VHH和志贺毒素效应物多肽融合在一起以形成单个连续多肽“SLT-1A-combo(n)：：αHER2-VHH”。在该实施例中，将编码αHER2-VHH(包含从免疫球蛋白5F7来源的VHH可变结构域的结合区域)的多核苷酸与本领域已知的编码接头的多核苷酸一起在框架内和与编码志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)的多核苷酸一起在框架内克隆。使用技术人员已知的和/或如在以前的实施例中所述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统，完成细胞靶向分子SLT-1A-combo(n)：：αHER2-VHH的表达。
确定SLT-1A-combo(n)：：αHER2-VHH的体外特征
通过基于荧光的流式细胞计量术，确定本实施例的细胞靶向分子对HER2+细胞和HER2-细胞的结合特征。SLT-1A-combo(n)：：αHER2-VHH对HER2+细胞的Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM范围内的KD，然而在该测定中不存在与HER2-细胞的显著结合。
在上面在以前实施例中描述的无细胞体外蛋白翻译中确定SLT-1A-combo(n)：：αHER2-VHH细胞靶向分子的核糖体灭活能力。本实施例的细胞靶向分子对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。在该无细胞测定中SLT-1A-combo(n)：：αHER2-VHH对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。
使用HER2+细胞杀死测定来确定SLT-1A-combo(n)：：αHER2-VHH的细胞毒性
使用HER2+细胞通过上面在以前实施例中描述的一般细胞杀死测定来确定SLT-1A-combo(n)：：αHER2-VHH的细胞毒性特征。另外，使用HER2-细胞作为与HER2+细胞的对比，通过相同的一般细胞杀死测定来确定SLT-1A-combo(n)：：αHER2-VHH的选择性细胞毒性特征。对于HER2+细胞，依赖于细胞系，本实施例的细胞靶向分子的CD50是大约0.01-100nM。与在细胞表面上表达HER2的细胞相比，SLT-1A-combo(n)：：αHER2-VHH对在细胞表面上不表达HER2的细胞的CD50大了大约10-10,000倍(更小的细胞毒性)。另外，使用技术人员已知的和/或本文描述的测定，针对T-细胞表位递送和呈递(其导致CTL介导的细胞毒性)的直接细胞毒性和间接细胞毒性，研究了SLT-1A-combo(n)：：αHER2-VHH的细胞毒性。
使用动物模型确定示例性细胞靶向分子SLT-1A-combo(n)：：αHER2-VHH的体内效
应
使用动物模型来确定细胞靶向分子SLT-1A-combo(n)：：αHER2-VHH对赘生性细胞的体内效应。使用不同小鼠品系来试验SLT-1A-combo(n)：：αHER2-VHH在静脉内施用后对小鼠中的异种移植肿瘤的效应，所述异种移植肿瘤源自在它们的细胞表面上表达HER2的人赘生性细胞在那些小鼠中的注射。使用技术人员已知的和/或本文描述的测定，针对T-细胞表位递送和呈递(其导致CTL介导的细胞毒性)的直接细胞毒性和间接细胞毒性，研究了细胞杀死。
实施例6.包含本发明的志贺毒素A亚基效应物多肽、融合的T-细胞表位肽和对IL-2R特异性的配体结合区域的细胞靶向分子
在该实施例中，所述志贺毒素效应物多肽源自如上所述的志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)，任选地具有赋予弗林蛋白酶切割抗性的氨基酸残基置换，例如，R248A/R251A(参见实施例3，出处同上)。基于MHCI分子结合预测、HLA类型、已经表征的免疫原性和如上所述的容易得到的试剂，诸如表位GVMTRGRLK(SEQ ID NO：560)，选择人CD8+ T-细胞表位肽。结合区域源自人白介素2受体(IL-2R)的配体(细胞因子白介素2或IL-2)，其能够特异性地结合人IL-2R的细胞外部分。IL-2R是由多种免疫细胞类型(诸如T-细胞和天然杀伤细胞)表达的细胞表面受体。
细胞靶向融合蛋白T-表位：：SLT-1A：：IL-2和IL-2：：T-表位：：SLT-1A的构建、生产
和纯化
将配体-型结合区域αIL-2R、志贺毒素效应物多肽和T-细胞表位连接在一起以形成单个连续多肽，诸如“T-表位：：SLT-1A：：IL-2”或“IL-2：：T-表位：：SLT-1A”，并任选地，将KDEL添加至得到的多肽的羧基端。例如，通过从编码T-表位：：SLT-1A：：IL-2和IL-2：：T-表位：：SLT-1A的多核苷酸表达来生产融合蛋白。使用如在以前实施例中描述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统，完成T-表位：：SLT-1A：：IL-2或IL-2：：T-表位：：SLT-1A细胞靶向分子的表达。
确定细胞靶向分子SLT-1A：：T-表位：：IL-2和IL-2：：SLT-1A：：T-表位的体外特征
通过基于荧光的流式细胞计量术确定本实施例的细胞靶向分子对IL-2R阳性细胞和IL-2R阴性细胞的结合特征。T-表位：：SLT-1A：：IL-2和IL-2：：T-表位：：SLT-1A对IL-2R阳性细胞的Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM范围内的KD，然而在该测定中不存在与IL-2R阴性细胞的显著结合。
在上面在以前实施例中描述的无细胞体外蛋白翻译中确定T-表位：：SLT-1A：：IL-2和IL-2：：T-表位：：SLT-1A的核糖体灭活能力。本实施例的细胞靶向分子对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。对于T-表位：：SLT-1A：：IL-2和IL-2：：T-表位：：SLT-1A，在该无细胞测定中对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。
使用细胞杀死测定来确定细胞靶向分子T-表位：：SLT-1A：：IL-2或IL-2：：T-表
位：：SLT-1A的细胞毒性
使用IL-2R阳性细胞通过上面在以前实施例中描述的一般细胞杀死测定来确定T-表位：：SLT-1A：：IL-2或IL-2：：T-表位：：SLT-1A的细胞毒性特征。另外，使用IL-2R阴性细胞作为IL-2R阳性细胞的对比，通过相同的一般细胞杀死测定来确定T-表位：：SLT-1A：：IL-2或IL-2：：T-表位：：SLT-1A的选择性细胞毒性特征。对于IL-2R阳性细胞，依赖于细胞系，本实施例的细胞靶向分子的CD50是大约0.01-100nM。与在细胞表面上表达IL-2R的细胞相比，T-表位：：SLT-1A：：IL-2或IL-2：：T-表位：：SLT-1A对在细胞表面上不表达IL-2R的细胞的CD50大了大约10-10,000倍(更小的细胞毒性)。另外，使用技术人员已知的和/或本文描述的测定，针对T-细胞表位递送和呈递(其导致CTL介导的细胞毒性)的直接细胞毒性和间接细胞毒性，研究了T-表位：：SLT-1A：：IL-2或IL-2：：T-表位：：SLT-1A的细胞毒性。
使用动物模型确定细胞靶向分子T-表位：：SLT-1A：：IL-2或IL-2：：T-表位：：SLT-
1A的体内效应
使用动物模型来确定细胞靶向分子T-表位：：SLT-1A：：IL-2和IL-2：：T-表位：：SLT-1A对赘生性细胞的体内效应。使用不同小鼠品系来试验T-表位：：SLT-1A：：IL-2和IL-2：：T-表位：：SLT-1A在静脉内施用后对小鼠中的异种移植肿瘤的效应，所述异种移植肿瘤源自在它们的细胞表面上表达IL-2R的人赘生性细胞在那些小鼠中的注射。使用技术人员已知的和/或本文描述的测定，针对T-细胞表位递送和呈递(其导致CTL介导的细胞毒性)的直接细胞毒性和间接细胞毒性，研究了细胞杀死。
实施例7.包含与CEA结合区域连接的本发明的志贺毒素效应物多肽(与SLT-1A-combo(n)融合的αCEA-(Fn3)结合区域)的细胞靶向分子
在该实施例中，将如上所述的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)可操作地连接至免疫球蛋白型结合区域抗-CEA(Fn3)结合区域，其特异性地且以高亲和力结合人癌胚抗原(CEA)上的细胞外抗原，诸如在Pirie C等人，J Biol Chem 286：4165-72(2011)中描述的第十个人纤连蛋白III型结构域来源的结合区域C743，形成本发明的示例性细胞靶向分子。另外，将免疫原性的CD8+ T-细胞表位与本实施例的志贺毒素效应物多肽的氨基端融合以形成表位-SLT-1A-combo(n)。
细胞毒性的结合CEA的融合蛋白“与表位-SLT-1A-combo(n)融合的αCEA-(Fn3)”的
构建、生产和纯化
对于某些实施方案，将免疫球蛋白型结合区域αCEA-(Fn3)和志贺毒素效应物多肽融合在一起以形成单个连续多肽“与表位-SLT-1A-combo(n)融合的αCEA-(Fn3)”。在该实施例中，如在以前实施例中所述设计和生产融合蛋白“与表位-SLT-1A-combo(n)融合的αCEA-(Fn3)”。
确定“与表位-SLT-1A-combo(n)融合的αCEA-(Fn3)”的体外特征
通过基于荧光的流式细胞计量术，确定本实施例的细胞靶向分子对CEA+细胞和CEA-细胞的结合特征。与表位-SLT-1A-combo(n)融合的αCEA-(Fn3)对CEA+细胞的Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM范围内的KD，然而在该测定中不存在与CEA-细胞的显著结合。
在上面在以前实施例中描述的无细胞体外蛋白翻译中确定与表位-SLT-1A-combo(n)融合的αCEA-(Fn3)细胞靶向分子的核糖体灭活能力。本实施例的细胞靶向分子对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。与表位-SLT-1A-combo(n)融合的αCEA-(Fn3)在该无细胞测定中对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。
使用CEA+细胞杀死测定来确定“与表位-SLT-1A-combo(n)融合的αCEA-(Fn3)”的
细胞毒性
使用CEA+细胞通过上面在以前实施例中描述的一般细胞杀死测定来确定与表位-SLT-1A-combo(n)融合的αCEA-(Fn3)的细胞毒性特征。另外，使用CEA-细胞作为与CEA+细胞的对比，通过相同的一般细胞杀死测定来确定与表位-SLT-1A-combo(n)融合的αCEA-(Fn3)的选择性细胞毒性特征。对于CEA+细胞，依赖于细胞系，本实施例的细胞靶向分子的CD50是大约0.01-100nM。与在细胞表面上表达CEA的细胞相比，与表位-SLT-1A-combo(n)融合的αCEA-(Fn3)对在细胞表面上不表达CEA的细胞的CD50大了大约10-10,000倍(更小的细胞毒性)。另外，使用技术人员已知的和/或本文描述的测定，针对T-细胞表位递送和呈递(其导致CTL介导的细胞毒性)的直接细胞毒性和间接细胞毒性，研究了与表位-SLT-1A-combo(n)融合的αCEA-(Fn3)的细胞毒性。
使用动物模型确定示例性细胞靶向分子“与表位-SLT-1A-combo(n)融合的αCEA-
(Fn3)”的体内效应
使用动物模型来确定细胞靶向分子与表位-SLT-1A-combo(n)融合的αCEA-(Fn3)对赘生性细胞的体内效应。使用不同小鼠品系来试验与表位-SLT-1A-combo(n)融合的αCEA-(Fn3)在静脉内施用后对小鼠中的异种移植肿瘤的效应，所述异种移植肿瘤源自在它们的细胞表面上表达CEA的人赘生性细胞在那些小鼠中的注射。使用技术人员已知的和/或本文描述的测定，针对T-细胞表位递送和呈递(其导致CTL介导的细胞毒性)的直接细胞毒性和间接细胞毒性，研究了细胞杀死。
实施例8.包含志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)和抗体α蠕虫肠抗原的细胞毒性的细胞靶向分子
在该实施例中，将如上所述的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo0-26中的任一种可操作地连接至靶向蠕虫抗原的免疫球蛋白型结合区域。免疫球蛋白型结合区域α蠕虫肠抗原源自使用本领域已知的技术制备的针对人转铁蛋白受体的蠕虫直系同源物的抗体(参见例如线虫基因gcp-2.1UniProt G8JYE4_CAEEL；Rosa B等人，Mol Cell ProteomicsM114.046227(2015))。
细胞毒性的细胞靶向分子“SLT-1A-combo(n)：：α蠕虫肠抗原”的构建、生产和纯化
将免疫球蛋白型结合区域α蠕虫肠抗原和志贺毒素效应物区域(其任选地是蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物区域)连接到一起以形成蛋白，其中所述免疫球蛋白型结合区域与所述志贺毒素效应物区域相比没有位于所述蛋白的氨基端的近侧。例如，通过表达编码与氨基端SLT-1A-combo0-26融合的α蠕虫肠抗原-结合蛋白的多核苷酸，生产融合蛋白。使用如在以前实施例中描述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统，完成SLT-1A-combo(n)：：α蠕虫肠抗原-结合蛋白的表达。
确定细胞毒性的细胞靶向分子SLT-1A-combo(n)：：α蠕虫肠抗原的体外特征
使用经纯化的重组靶蛋白通过本领域已知的分子结合测定来确定本实施例的细胞毒性的细胞靶向分子的结合特征。SLT-1A：：α蠕虫肠抗原和/或SLT-1A-FR：：α蠕虫肠抗原对靶蛋白的KD被测量为大约100nM，然而在该测定中不存在与阴性对照蛋白(例如人转铁蛋白受体的经纯化重组蠕虫直系同源物)的显著结合。
在上面在以前实施例中描述的无细胞体外蛋白翻译中确定SLT-1A：：α蠕虫肠抗原的核糖体灭活能力。本实施例的细胞毒性的细胞靶向分子对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。在该无细胞测定中SLT-1A：：α蠕虫肠抗原对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。
确定细胞毒性的细胞靶向分子SLT-1A-combo(n)：：α蠕虫肠抗原的毒性
使用模型蠕虫确定SLT-1A：：α蠕虫肠抗原对蠕虫的毒性(参见例如Iatsenko I等人，Toxins 2050-63(2014))。通过浸泡或可替换地通过给蠕虫饲喂表达SLT-1A：：α蠕虫肠抗原融合蛋白的细菌，可以给蠕虫施用经纯化的SLT-1A：：α蠕虫肠抗原。
另外，给携带蠕虫和/或表现出蠕虫相关疾病的实验动物施用SLT-1A：：α蠕虫肠抗原，并监测蠕虫和/或寄生蠕虫的有关征状的减少或消除。
实施例9.包含与免疫球蛋白型结合区域(其对HIV-1 Gag是特异性的)融合的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)的细胞靶向分子
在该实施例中，如上所述的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo0-26中的任一种可操作地连接至免疫球蛋白型结合区域αGag-抗原，其源自识别HIV衣壳蛋白HIV-1Gag多蛋白的免疫球蛋白型结构域(参见例如Nagola S等人，Retrovirology 9：17(2012))且其包含能够结合Gag的细胞外部分的人工锚蛋白结构域重复多肽。Gag是在HIV病毒装配中涉及的主要结构蛋白并且寡聚化成多达700-5000个拷贝/病毒粒子的晶格以形成圆锥形CA核心(参见例如Chen Y等人，Biophys J 96：1961-9(2009)；Pornillos O等人，Nature 469：424-7(2011))。
细胞靶向分子“与αGag连接的SLT-1A-combo(n)”的构建、生产和纯化
将免疫球蛋白型结合区域αGag和志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo(n)融合以形成细胞毒性的蛋白。例如，通过表达编码αGag-抗原-结合蛋白SLT-1A-combo(n)：：αGag的多核苷酸来生产融合蛋白。使用如在以前实施例中描述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统，完成SLT-1A-combo(n)：：αGag细胞毒性的蛋白的表达。
确定细胞靶向分子“SLT-1A-combo(n)：：αGag”的体外特征
通过本领域已知的测定，诸如酶联免疫吸附测定，确定本实施例的细胞毒性的蛋白对经纯化的重组HIV-1 Gag的结合特征。SLT-1A-combo(n)：：αGag与Gag的结合的KD被测量为大约在0.01-100纳摩尔(nM)的范围内。
在上面在以前实施例中描述的无细胞体外蛋白翻译中确定SLT-1A-combo(n)：：αGag细胞毒性的蛋白的核糖体灭活能力。本实施例的细胞毒性蛋白对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。在该无细胞测定中SLT-1A-combo(n)：：αGag对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。
使用细胞杀死测定来确定细胞靶向分子“SLT-1A-combo(n)：：αGag”的细胞毒性
使用HIV感染的人T-细胞通过上面在以前实施例中描述的一般细胞杀死测定来确定SLT-1A-combo(n)：：αGag的细胞毒性特征。另外，使用未感染的T-细胞作为受感染的T-细胞的对比，通过相同的一般细胞杀死测定来确定SLT-1A-combo(n)：：αGag的选择性细胞毒性特征。对于含有活跃复制病毒的受感染的T-细胞，本实施例的细胞毒性蛋白的CD50是大约0.01-100nM。细胞毒性的蛋白对未感染的T-细胞的CD50大了大约10-10,000倍(更少的细胞毒性)。
使用动物模型来确定细胞毒性的细胞靶向分子“SLT-1A-combo(n)：：αGag”的体内
效应
通过将SLT-1A-combo(n)：：αGag施用给猿猴免疫缺陷病毒(SIV)感染的非人灵长类动物，试验SLT-1A-combo(n)：：αGag用于抑制HIV感染进展的用途(参见Sellier P等人，PLoS One 5：e10570(2010))。
实施例10.从志贺毒素的A亚基和抗体α组织胞浆菌抗原来源的细胞毒性的细胞靶向分子
在该实施例中，将如上所述的志贺毒素效应物多肽SLT-1A-combo0-26中的任一种可操作地连接至免疫球蛋白型结合区域α组织胞浆菌抗原，其源自已知的抗体或使用本领域已知的技术制备的针对荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)表面抗原的抗体(参见例如，荚膜组织胞浆菌H抗原(Deepe G，Durose G，Infect Immun 63：3151-7(1995))和mAb H1C(Lopes L等人，Clin Vaccine Immunol 17：1155-8(2010)；荚膜组织胞浆菌细胞表面组蛋白-样蛋白H2B(Nosanchuk J等人，J Clin Invest 112：1164-1175(2003)))。
细胞毒性的细胞靶向分子SLT-1A-combo(n)：：α组织胞浆菌抗原的构建、生产和纯
化
将免疫球蛋白型结合区域α蠕虫肠抗原和志贺毒素效应物多肽(其任选地是蛋白酶切割抗性的志贺毒素效应物区域)连接在一起以形成蛋白，其中所述免疫球蛋白型结合区域与所述志贺毒素效应物多肽相比没有位于所述蛋白的氨基端的近侧。例如，通过表达编码与氨基端SLT-1A-combo(n)融合的组织胞浆菌表面抗原-结合蛋白的多核苷酸，生产融合蛋白。使用如在以前实施例中描述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统，完成SLT-1A-combo(n)：：α组织胞浆菌抗原-结合蛋白的表达。
确定细胞毒性的细胞靶向分子SLT-1A-combo(n)：：α组织胞浆菌抗原的体外特征
使用经纯化的重组靶蛋白，通过本领域已知的分子结合测定来确定本实施例的细胞毒性的细胞靶向分子的结合特征。SLT-1A-combo(n)：：α组织胞浆菌抗原与靶蛋白(例如经纯化的重组荚膜组织胞浆菌表面抗原)的KD被测量为大约100nM，然而在该测定中不存在与阴性对照蛋白的显著结合。
在上面在以前实施例中描述的无细胞体外蛋白翻译中确定SLT-1A-combo(n)：：α组织胞浆菌抗原细胞毒性蛋白的核糖体灭活能力。本实施例的细胞毒性的细胞靶向分子对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。在该无细胞测定中SLT-1A-combo(n)：：α组织胞浆菌抗原对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。
使用真菌确定细胞毒性的细胞靶向分子SLT-1A-combo(n)：：α组织胞浆菌抗原的
抗真菌活性
确定了SLT-1A-combo(n)：：α组织胞浆菌抗原对真菌细胞的杀真菌活性。将经纯化的StxA：：α组织胞浆菌抗原和/或StxA-FR：：α组织胞浆菌抗原直接施用给真菌培养物以便测量杀真菌活性(参见例如Li R等人，Antimicrob Agents Chemother 44：1734-6(2000))。另外，给被真菌(例如荚膜组织胞浆菌)感染和/或表现出组织胞浆菌病、全身性真菌病和/或其它荚膜组织胞浆菌相关疾病的实验动物施用SLT-1A-combo(n)：：α组织胞浆菌抗原，并监测真菌病原体和/或真菌感染的有关征状的减少或消除(参见例如Kobayashi G等人，Antimicrob Agents Chemother 34：524-8(1990))。
实施例11.靶向不同细胞类型的细胞毒性的细胞靶向分子
在该实施例中，志贺毒素效应物区域源自志贺样毒素1(SLT-1A)、志贺毒素(StxA)和/或志贺样毒素2(SLT-2A)的A亚基，使得它包含本文描述的亚区域的组合，以提供以下两种或更多种：1)去免疫化，2)蛋白酶切割抗性，和/或3)嵌入的或插入的异源T-细胞表位。结合区域源自选自表21的第1列的分子，且其结合在表21的第2列中指示的细胞外靶生物分子。将得到的组合志贺毒素效应物多肽和结合区域融合在一起以形成不同的单链多肽。任选地使用本领域已知的技术用羧基端KDEL-型信号基序建立本实施例的示例性蛋白，并任选地与另外的外源物质(例如，检测促进剂)连接。使用表达适当的细胞外靶生物分子的细胞如在以前实施例中所述试验本实施例的示例性蛋白。可以使用本实施例的示例性蛋白，例如，标记靶细胞的亚细胞区室和诊断和治疗在表21的第3列中指出的疾病、病患和/或病症。
表21.用于细胞毒性蛋白的细胞靶向的不同结合区域
尽管已经通过举例说明的方式描述了本发明的一些实施方案，显而易见，可以利用许多修改、变化和改编以及利用在本领域技术人员范围内的众多等同或替代方案实施本发明，而不背离本发明的精神或超出权利要求的范围。
所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文，达到如同明确地且单独地指出每篇单独的出版物、专利或专利申请通过引用整体并入的程度。国际专利申请公开WO2014/164680、WO 2014/164693、WO 2015/138435、WO 2015/138452、WO 2015/113005、WO2015/113007和WO 2015/191764各自通过引用整体并入本文。美国专利申请US20150259428、62/168,758、62/168,759、62/168,760、62/168,761、62/168,762和62/168,763的公开内容各自通过引用整体并入本文。国际PCT专利申请系列号PCT/US2016/016580的公开内容通过引用整体并入本文。关于在本文中引用的氨基酸和核苷酸序列的来自GenBank(国家生物技术信息中心，U.S.)的所有可电子获得的生物序列信息的完整公开内容各自通过引用整体并入本文。
Claims (51)
1.一种志贺毒素效应物多肽，其包含
i)嵌入的或插入的异源CD8+T-细胞表位，和
ii)没有与所述嵌入的或插入的异源CD8+T-细胞表位重叠的至少一个内源性B-细胞和/或CD4+T-细胞表位区域的破坏；
其中所述志贺毒素效应物多肽能够表现出志贺毒素效应物功能。
2.根据权利要求1所述的志贺毒素效应物多肽，其中所述破坏包含在选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组中的B-细胞和/或CD4+T-细胞表位区域中的相对于野生型志贺毒素A亚基的突变：
SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1-15；SEQ ID NO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的27-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQ ID NO：3的42-48；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的53-66；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQID NO：3的94-115；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的141-153；SEQ ID NO：3的140-156；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的179-190；SEQ ID NO：3的179-191；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205，和SEQ ID NO：3的210-218；SEQ ID NO：3的240-260；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的243-257；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的254-268；SEQ ID NO：3的262-278；SEQ ID NO：3的281-297；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的285-293；SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的4-33；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的34-78；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的77-103；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的128-168；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的160-183；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的236-258；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的274-293。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的志贺毒素效应物多肽，其中所述嵌入的或插入的异源CD8+T-细胞表位破坏选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组的内源性B-细胞表位和/或CD4+T-细胞表位区域：
SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1-15；SEQ ID NO：3的3-14；SEQ ID NO：3的26-37；SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的27-37；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的39-48；SEQ ID NO：3的42-48；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的53-66；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQID NO：3的94-115；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的141-153；SEQ ID NO：3的140-156；SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的179-190；SEQ ID NO：3的179-191；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205，和SEQ ID NO：3的210-218；SEQ ID NO：3的240-260；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的243-257；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的254-268；SEQ ID NO：3的262-278；SEQ ID NO：3的281-297；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的285-293；SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的4-33；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的34-78；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的77-103；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的128-168；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的160-183；SEQ IDNO：1或SEQ 1D NO：2的236-258；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的274-293。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽，其包含至少2、3、4、5、6、7、8个或更多个内源性B-细胞和/或CD4+T-细胞表位区域的破坏。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽，其中至少一个破坏包含相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽，其中至少一个破坏包含与野生型志贺毒素A亚基相比在所述表位区域中的多个氨基酸残基置换。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽，其中至少一个破坏包含与野生型志贺毒素A亚基相比至少1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个氨基酸残基置换，且任选地其中至少一个置换发生在选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基氨基酸残基处：
SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的4；SEQID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的6；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的8；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的9；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的11；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的12；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的33；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的43；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的44；SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的45；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的46；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的47；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的48；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3的49；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的50；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的51；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的53；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的54；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的55；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的56；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的57；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的58；SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的59；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的60；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的61；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的62；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的84；SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：3的88；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的94；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的96；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的104；SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的105；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的107；SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的108；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的109；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的110；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的111；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQID NO：3的112；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的141；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的147；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的154；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的179；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的180；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的181；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的183；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的184；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的185；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的186；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的187；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的188；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的189；SEQ ID NO：3的197；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的198；SEQ ID NO：3的204；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的205；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的247；SEQ ID NO：3的247；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的248；SEQ ID NO：3的250；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的251；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的264；SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的265；和SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的286。
8.根据权利要求5-7中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽，其中所述置换中的至少一个选自由以下组成的组：
D至A、D至G、D至V、D至L、D至I、D至F、D至S、D至Q、D至M、D至R、E至A、E至G、E至V、E至L、E至I、E至F、E至S、E至Q、E至N、E至D、E至M、E至R、F至A、F至G、F至V、F至L、F至I、G至A、G至P、H至A、H至G、H至V、H至L、H至I、H至F、H至M、I至A、I至V、I至G、I至C、K至A、K至G、K至V、K至L、K至I、K至M、K至H、L至A、L至V、L至G、L至C、N至A、N至G、N至V、N至L、N至I、N至F、P至A、P至G、P至F、R至A、R至G、R至V、R至L、R至I、R至F、R至M、R至Q、R至S、R至K、R至H、S至A、S至G、S至V、S至L、S至I、S至F、S至M、T至A、T至G、T至V、T至L、T至I、T至F、T至M、T至S、V至A、V至G、Y至A、Y至G、Y至V、Y至L、Y至I、Y至F、Y至M、和Y至T。
9.根据权利要求8所述的志贺毒素效应物多肽，其中一个或多个置换选自由以下组成的组的在志贺毒素A亚基中的天然位置处的置换的组：
K1至A、G、V、L、I、F、M和H；T4至A、G、V、L、I、F、M、和S；D6至A、G、V、L、I、F、S、Q和R；S8至A、G、V、I、L、F、和M；T9至A、G、V、I、L、F、M、和S；S9至A、G、V、L、I、F、和M；K11至A、G、V、L、I、F、M和H；T12至A、G、V、I、L、F、M、S、和K；S12至A、G、V、I、L、F、和M；S33至A、G、V、L、I、F、M、和C；S43至A、G、V、L、I、F、和M；G44至A或L；S45至A、G、V、L、I、F、和M；T45至A、G、V、L、I、F、和M；G46至A和P；D47至A、G、V、L、I、F、S、M、和Q；N48至A、G、V、L、M和F；L49至A、V、C、和G；Y49至A、G、V、L、I、F、M、和T；F50至A、G、V、L、I、和T；A51；D53至A、G、V、L、I、F、S、和Q；V54至A、G、I、和L；R55至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K、和H；G56至A和P；I57至A、G、V、和M；L57至A、V、C、G、M、和F；D58至A、G、V、L、I、F、S、和Q；P59至A、G、和F；E60至A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M、T、和R；E61至A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M、和R；G62至A；R84至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K、和H；V88至A和G；I88至A、V、C、和G；D94至A、G、V、L、I、F、S、和Q；S96至A、G、V、I、L、F、和M；T104至A、G、V、L、I、F、M；和N；A105至L；T107至A、G、V、L、I、F、M、和P；S107至A、G、V、L、I、F、M、和P；L108至A、V、C、和G；S109至A、G、V、I、L、F、和M；T109至A、G、V、I、L、F、M、和S；G110至A；S112至A、G、V、L、I、F、和M；D111至A、G、V、L、I、F、S、Q、和T；S112至A、G、V、L、I、F、和M；D141至A、G、V、L、I、F、S、和Q；G147至A；V154至A和G。R179至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K、和H；T180至A、G、V、L、I、F、M、和S；T181至A、G、V、L、I、F、M、和S；D183至A、G、V、L、I、F、S、和Q；D184至A、G、V、L、I、F、S、和Q；L185至A、G、V和C；S186至A、G、V、I、L、F、和M；G187至A；R188至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K、和H；S189至A、G、V、I、L、F、和M；D198至A、G、V、L、I、F、S、和Q；R204至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K、和H；R205至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K和H；S247至A、G、V、I、L、F、和M；Y247至A、G、V、L、I、F、和M；R248至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K、和H；R250至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K、和H；R251至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K、和H；D264至A、G、V、L、I、F、S、和Q；G264至A；和T286至A、G、V、L、I、F、M、和S。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽，其中所述志贺毒素效应物多肽包含SEQ ID NO：355-369中的任一个所示的多肽或基本上由其组成，其进一步包含没有与嵌入的或插入的异源CD8+T-细胞表位重叠的至少一个内源性B-细胞和/或CD4+T-细胞表位的破坏。
11.根据权利要求1-10中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽，其中所述志贺毒素效应物多肽包含SEQ ID NO：6-32、340-354和370-438中的任一个所示的多肽或基本上由其组成。
12.根据权利要求1-11中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽，其中所述志贺毒素效应物多肽能够表现出核糖体抑制活性，具有10,000皮摩尔或更低的半数最大抑制浓度(IC50)值。
13.根据权利要求1-12中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽，其中所述志贺毒素效应物多肽包含相对于志贺毒素家族的成员的天然存在的A亚基的一个或多个突变，所述突变改变所述志贺毒素效应物多肽的酶活性，所述突变选自至少一个氨基酸残基缺失、插入或置换。
14.根据权利要求13所述的志贺毒素效应物多肽，其中改变所述志贺毒素效应物多肽的酶活性的相对于天然存在的A亚基的突变减少或消除所述志贺毒素效应物多肽的细胞毒性。
15.根据权利要求1-14中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽，其中所述志贺毒素效应物多肽能够将嵌入的或插入的异源CD8+T-细胞表位从所述志贺毒素效应物多肽存在于其中的细胞的早期胞内体区室细胞内递送至所述细胞的MHC I类分子。
16.根据权利要求15所述的志贺毒素效应物多肽，其除了将嵌入的异源CD8+T-细胞表位从所述志贺毒素效应物多肽存在于其中的细胞的早期胞内体区室细胞内递送至所述细胞的MHC I类分子以外，还能够表现出一种或多种志贺毒素效应物功能。
17.根据权利要求1-16中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽，其中所述志贺毒素效应物多肽包含
具有羧基端的志贺毒素A1片段区域，和
在A1片段区域的羧基端处被破坏的弗林蛋白酶切割基序。
18.根据权利要求17所述的志贺毒素效应物多肽，其中所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含一个或多个相对于野生型志贺毒素A亚基的突变，所述突变改变天然地定位在
志贺样毒素1的A亚基(SEQ ID NO：1)或志贺毒素的A亚基(SEQ ID NO：2)的248-251处，或者在
志贺样毒素2的A亚基(SEQ ID NO：3)的247-250处
的区域中的至少一个氨基酸残基。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的志贺毒素效应物多肽，其中所述被破坏的弗林蛋白酶切割基序包含在所述弗林蛋白酶切割基序中相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换。
20.根据权利要求19所述的志贺毒素效应物多肽，其中所述在弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸残基的置换是选自由以下组成的组的非带正电荷的氨基酸残基对精氨酸残基的置换：
丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
21.一种细胞靶向分子，其包含
i)能够特异性地结合细胞外靶生物分子的结合区域，和
ii)根据权利要求1-20中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽。
22.根据权利要求21所述的细胞靶向分子，其中所述结合区域包含免疫球蛋白型结合区域。
23.根据权利要求22所述的细胞靶向分子，其中所述免疫球蛋白型结合区域包含选自由以下组成的组的多肽：
单结构域抗体片段、单链可变片段、抗体可变片段、互补决定区3片段、受限的FR3-CDR3-FR4多肽、Fd片段、抗原结合片段、犰狳重复多肽、纤连蛋白来源的第10个纤连蛋白III型结构域、生腱蛋白III型结构域、锚蛋白重复基序结构域、低密度-脂蛋白-受体-来源的A-结构域、脂质运载蛋白、Kunitz结构域、蛋白-A-来源的Z结构域、γ-B晶体-来源的结构域、泛蛋白-来源的结构域、Sac7d-来源的多肽、Fyn-来源的SH2结构域、小蛋白、C-型凝集素-样结构域支架、经工程改造的抗体模拟物和前述任一种的保留结合功能性的任何遗传上操作的相应物。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的细胞靶向分子，其中将所述细胞靶向分子施用给其成员与所述结合区域的细胞外靶生物分子物理上连接的第一细胞群体和其成员没有与所述结合区域的任何细胞外靶生物分子物理上连接的第二细胞群体时，所述细胞靶向分子对所述第一细胞群体的成员相对于所述第二细胞群体的成员的细胞毒性效应至少3倍更大。
25.根据权利要求24所述的细胞靶向分子，其包含与所述志贺毒素效应物多肽的羧基端结合的分子部分。
26.根据权利要求25所述的细胞靶向分子，其中所述分子部分包含所述结合区域或由其组成。
27.根据权利要求26所述的细胞靶向分子，其中所述分子部分是细胞毒性的。
28.根据权利要求26或权利要求27所述的细胞靶向分子，其中所述分子部分包含至少一个氨基酸，且所述志贺毒素效应物多肽连接至所述分子部分的至少一个氨基酸残基。
29.根据权利要求28所述的细胞靶向分子，其中所述分子部分和所述志贺毒素效应物多肽融合，形成连续多肽。
30.根据权利要求21-29中的任一项所述的细胞靶向分子，其中所述结合区域能够结合选自由以下组成的组的细胞外靶生物分子：
CD20、CD22、CD40、CD74、CD79、CD25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前列腺特异性的膜抗原、Cripto、CDCP1、内皮糖蛋白、成纤维细胞活化的蛋白、Lewis-Y、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、CD133、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体、碳酸酐酶IX、叶酸结合蛋白、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2、神经节苷脂Lewis-Y2、VEGFR、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、Erb3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANK、FAP、生腱蛋白、CD64、间皮素、BRCA1、MART-1/MelanA、gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β-联蛋白、MUM--1、胱天蛋白酶-8、KIAA0205、HPVE6、SART-1、PRAME、癌胚抗原、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原、人天冬氨酰基(天冬酰胺酰基)β-羟化酶、EphA2、HER3/ErbB-3、MUC1、MART-1/MelanA、gp100、酪氨酸酶相关抗原、HPV-E7、EB病毒抗原、Bcr-Abl、甲胎蛋白抗原、17-A1、膀胱肿瘤抗原、CD38、CD15、CD23、CD45、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305、C3AR、FceRIa、IL-1R、半乳糖凝集素-9、mrp-14、NKG2D、PD-L1、Siglec-8、Siglec-10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT-3、半乳糖凝集素-3、CD11a-c、GITRL、MHC I类分子、MHC II类分子、CD284、CD107-Mac3、CD195、HLA-DR、CD16/32、CD282、CD11c和前述任一种的任何免疫原性片段。
31.根据权利要求21-30中的任一项所述的细胞靶向分子，其中所述细胞靶向分子能够表现出与除了所述志贺毒素效应物多肽由野生型志贺毒素A1多肽组成以外由所述细胞靶向分子组成的第二种细胞靶向分子的细胞毒性可比较的细胞毒性。
32.根据权利要求21-31中的任一项所述的细胞靶向分子，其中所述结合区域包含由以下任一个表示的多肽或基本上由其组成：SEQ ID NO：33、64和65中的任一个的氨基酸1-245；SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：80的氨基酸269-513；SEQ ID NO：36、66和67中的任一个的氨基酸269-520或269-521；SEQ ID NO：47-119和176-248中的任一个的氨基酸1-232、1-233、1-234、1-235、1-236、1-242、1-243、1-244、1-245、1-246、1-252、1-253、1-254、1-255或1-256；SEQ ID NO：37-39、68-79和81中的任一个的氨基酸269-498或269-499；SEQ ID NO：34、35、41-56和82中的任一个的氨基酸269-499、269-512、269-513或280-510。
33.根据权利要求21-32中的任一项所述的细胞靶向分子，其包含SEQ ID NO：43-62、64-82和439-513中的任一个所示的多肽或基本上由其组成。
34.根据权利要求21-33中的任一项所述的细胞靶向分子，其中所述细胞靶向分子能够表现出与除了所述志贺毒素效应物多肽由野生型志贺毒素A1多肽组成以外由所述细胞靶向分子组成的第三种细胞靶向分子相比改善的体内耐受性。
35.根据权利要求34所述的细胞靶向分子，其中所述志贺毒素效应物多肽不是细胞毒性的，且所述分子部分是细胞毒性的。
36.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-20中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽或根据权利要求21-35中的任一项所述的细胞靶向分子，和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
37.一种诊断组合物，其包含
根据权利要求21-35中的任一项所述的细胞靶向分子，和
检测促进剂。
38.一种多核苷酸，其能够编码根据权利要求1-20中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽和/或根据权利要求21-35中的任一项所述的细胞靶向分子、或其互补物、或前述任一种的片段。
39.一种表达载体，其包含权利要求38的多核苷酸。
40.一种宿主细胞，其包含权利要求38-39的多核苷酸或表达载体中的任一种。
41.一种杀死细胞的方法，所述方法包括下述步骤：
使所述细胞与根据权利要求1-20中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽、根据权利要求21-35中的任一项所述的细胞靶向分子或根据权利要求36所述的药物组合物接触。
42.一种将T-细胞表位递送至细胞的MHC I类分子的方法，所述方法包括下述步骤：
使所述细胞与以下物质接触：与T-细胞表位结合的根据权利要求1-20中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽，与T-细胞表位结合的根据权利要求21-35中的任一项所述的细胞靶向分子，和/或包含前述物质的药物组合物。
43.根据权利要求41或权利要求42所述的方法，其中所述接触在体外发生。
44.根据权利要求41或权利要求42所述的方法，其中所述接触在体内发生。
45.一种治疗患者中的疾病、病症或病患的方法，所述方法包括下述步骤：
给有此需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求1-20中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽、根据权利要求21-35中的任一项所述的细胞靶向分子或根据权利要求36所述的药物组合物。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述疾病、病症或病患选自癌症、肿瘤、免疫病症和微生物感染。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述疾病、病症或病患选自由以下组成的组：
骨癌、乳腺癌、中枢/周围神经系统癌症、胃肠癌、生殖细胞癌、腺癌、头颈癌、血液学癌症、肾-尿道癌、肝癌、肺/胸膜癌、前列腺癌、肉瘤、皮肤癌、子宫癌、淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、克罗恩病、糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒症综合征、HIV相关的疾病、红斑狼疮、多发性硬化、多动脉炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、溃疡性结肠炎和血管炎。
48.一种用于治疗或预防癌症、肿瘤、免疫病症或微生物感染的组合物，其包含根据权利要求1-20中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽和/或根据权利要求21-35中的任一项所述的细胞靶向分子。
49.权利要求1-40中的任一项的物质组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防癌症、肿瘤、免疫病症或微生物感染。
50.权利要求1-40中的任一项的物质组合物在疾病、病症或病患的诊断、预后或表征中的用途。
51.一种试剂盒，其包含权利要求1-40中的任一项的物质组合物和另外的试剂和/或药物递送装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210426334.XA CN114656573A (zh) | 2015-05-30 | 2016-05-27 | 去免疫化的志贺毒素a亚基支架和包含它们的细胞靶向分子 |
Applications Claiming Priority (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562168759P | 2015-05-30 | 2015-05-30 | |
| US201562168758P | 2015-05-30 | 2015-05-30 | |
| US201562168760P | 2015-05-30 | 2015-05-30 | |
| US201562168763P | 2015-05-30 | 2015-05-30 | |
| US201562168761P | 2015-05-30 | 2015-05-30 | |
| US201562168762P | 2015-05-30 | 2015-05-30 | |
| US62/168,760 | 2015-05-30 | ||
| US62/168,763 | 2015-05-30 | ||
| US62/168,759 | 2015-05-30 | ||
| US62/168,758 | 2015-05-30 | ||
| US62/168,761 | 2015-05-30 | ||
| US62/168,762 | 2015-05-30 | ||
| PCT/US2016/034778 WO2016196344A1 (en) | 2015-05-30 | 2016-05-27 | De-immunized, shiga toxin a subunit scaffolds and cell-targeting molecules comprising the same |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210426334.XA Division CN114656573A (zh) | 2015-05-30 | 2016-05-27 | 去免疫化的志贺毒素a亚基支架和包含它们的细胞靶向分子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107849096A true CN107849096A (zh) | 2018-03-27 |
| CN107849096B CN107849096B (zh) | 2022-05-24 |
Family
ID=56133070
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201680038854.6A Active CN107849096B (zh) | 2015-05-30 | 2016-05-27 | 去免疫化的志贺毒素a亚基支架和包含它们的细胞靶向分子 |
| CN202210426334.XA Pending CN114656573A (zh) | 2015-05-30 | 2016-05-27 | 去免疫化的志贺毒素a亚基支架和包含它们的细胞靶向分子 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210426334.XA Pending CN114656573A (zh) | 2015-05-30 | 2016-05-27 | 去免疫化的志贺毒素a亚基支架和包含它们的细胞靶向分子 |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20180258143A1 (zh) |
| EP (3) | EP3303373B1 (zh) |
| JP (4) | JP6771492B2 (zh) |
| KR (2) | KR20240038121A (zh) |
| CN (2) | CN107849096B (zh) |
| AU (3) | AU2016271124C1 (zh) |
| CA (1) | CA2984635A1 (zh) |
| CY (1) | CY1123315T1 (zh) |
| DK (1) | DK3303373T3 (zh) |
| ES (1) | ES2847373T3 (zh) |
| HK (1) | HK1246309A1 (zh) |
| HR (1) | HRP20200640T1 (zh) |
| HU (1) | HUE051246T2 (zh) |
| IL (3) | IL292708B1 (zh) |
| LT (1) | LT3303373T (zh) |
| MX (2) | MX2017015493A (zh) |
| PL (1) | PL3303373T3 (zh) |
| PT (1) | PT3303373T (zh) |
| RS (1) | RS60441B1 (zh) |
| SI (1) | SI3303373T1 (zh) |
| WO (1) | WO2016196344A1 (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110612117A (zh) * | 2018-04-17 | 2019-12-24 | 分子模板公司 | 包含去免疫化的志贺毒素a亚基支架的her2靶向分子 |
| CN113454108A (zh) * | 2019-01-23 | 2021-09-28 | 米伦纽姆医药公司 | 包含去免疫化志贺菌毒素a亚基效应子的cd38结合蛋白 |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2800630T3 (es) * | 2013-03-12 | 2021-01-04 | Molecular Templates Inc | Proteínas citotóxicas que comprenden regiones de unión de reconocimiento celular y regiones de la subunidad A de la toxina Shiga para la eliminación selectiva de tipos de células específicas |
| EP3099704B1 (en) | 2014-01-27 | 2021-03-17 | Molecular Templates, Inc. | Mhc class i epitope delivering polypeptides |
| US11142584B2 (en) | 2014-03-11 | 2021-10-12 | Molecular Templates, Inc. | CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same |
| EP3137488B1 (en) | 2014-06-11 | 2019-01-02 | Molecular Templates, Inc. | Protease-cleavage resistant, shiga toxin a subunit effector polypeptides and cell-targeting molecules comprising the same |
| MX2017010072A (es) | 2015-02-05 | 2017-11-09 | Molecular Templates Inc | Moleculas multivalentes que se enlazan a cd20, las cuales comprenden regiones efectoras de la subunidad a de la toxina shiga, y composiciones enriquecidas de las mismas. |
| KR20240038121A (ko) | 2015-05-30 | 2024-03-22 | 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. | 탈면역된 시가 독소 a 서브유닛 스캐폴드 및 이를 포함하는 세포-표적화 분자 |
| KR102557126B1 (ko) | 2016-12-07 | 2023-07-18 | 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. | 부위 특이적 접합을 위한 시가 독소 a 서브유닛 작동체 폴리펩타이드, 시가 독소 작동체 스캐폴드, 및 세포-표적화 분자 |
| IL267990B2 (en) * | 2017-01-25 | 2024-04-01 | Molecular Templates Inc | Cell-targeted molecules containing Shiga toxin A subunit activators and nonimmune CD8 T-cell epitopes |
| IT201800003464A1 (it) * | 2018-03-13 | 2019-09-13 | Ospedale Pediatrico Bambino Gesu | Cellule T CAR-CD30 per il trattamento di tumori CD30+ |
| WO2020081493A1 (en) | 2018-10-16 | 2020-04-23 | Molecular Templates, Inc. | Pd-l1 binding proteins |
| CN113710324A (zh) | 2019-01-23 | 2021-11-26 | 千禧制药公司 | 抗cd38抗体 |
| WO2020154475A1 (en) | 2019-01-23 | 2020-07-30 | Molecular Templates, Inc. | Proteins comprising modified immunoglobulin variable light chains |
| WO2021055816A1 (en) | 2019-09-18 | 2021-03-25 | Molecular Templates, Inc. | Pd-l1 binding molecules comprising shiga toxin a subunit scaffolds |
| CN114423793A (zh) | 2019-09-18 | 2022-04-29 | 分子模板公司 | 包含志贺菌毒素a亚基支架的pd-l1结合分子 |
| US20210155671A1 (en) * | 2019-11-24 | 2021-05-27 | Molecular Templates, Inc. | Uses of cd20-binding molecules and additional therapeutic agents |
| JP2024501581A (ja) * | 2020-12-08 | 2024-01-12 | メモリアル スローン－ケタリング キャンサー センター | ガレクチン－３に対する抗体及びその使用方法 |
| WO2022133092A1 (en) | 2020-12-16 | 2022-06-23 | Molecular Templates, Inc. | Clinical methods for use of a pd-l1-binding molecule comprising a shiga toxin effector |
| CA3213295A1 (en) | 2021-03-17 | 2022-09-22 | Molecular Templates, Inc. | Pd-l1 binding proteins comprising shiga toxin a subunit scaffolds and cd8+ t cell antigens |
| WO2023168436A1 (en) * | 2022-03-03 | 2023-09-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Anti-cd19 and anti-cd79b chimeric antigen receptors and methods of use thereof |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013080147A2 (en) * | 2011-11-28 | 2013-06-06 | Adamed Sp. Z O.O. | Anticancer fusion protein |
| WO2014164680A1 (en) * | 2013-03-12 | 2014-10-09 | Molecular Templates, Inc. | Cd20-binding immunotoxins for inducing cellular internalization and methods using same |
Family Cites Families (221)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4934761B1 (zh) | 1969-03-10 | 1974-09-18 | ||
| US5080898A (en) | 1982-05-12 | 1992-01-14 | The University Hospital | Enzymatically active toxin coupled to a cell-specific ligand |
| US6022950A (en) | 1984-06-07 | 2000-02-08 | Seragen, Inc. | Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region |
| US5668255A (en) | 1984-06-07 | 1997-09-16 | Seragen, Inc. | Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region |
| US5091178A (en) | 1986-02-21 | 1992-02-25 | Oncogen | Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies |
| US7838216B1 (en) | 1986-03-05 | 2010-11-23 | The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services | Human gene related to but distinct from EGF receptor gene |
| US6893625B1 (en) | 1986-10-27 | 2005-05-17 | Royalty Pharma Finance Trust | Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen |
| IL85035A0 (en) | 1987-01-08 | 1988-06-30 | Int Genetic Eng | Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same |
| JP3040121B2 (ja) | 1988-01-12 | 2000-05-08 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法 |
| US5506126A (en) | 1988-02-25 | 1996-04-09 | The General Hospital Corporation | Rapid immunoselection cloning method |
| US4861579A (en) | 1988-03-17 | 1989-08-29 | American Cyanamid Company | Suppression of B-lymphocytes in mammals by administration of anti-B-lymphocyte antibodies |
| US5135736A (en) | 1988-08-15 | 1992-08-04 | Neorx Corporation | Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging |
| CA2055441C (en) | 1989-05-19 | 2003-01-07 | Robert M. Hudziak | Her2 extracellular domain |
| CA2071969A1 (en) | 1989-12-22 | 1991-06-23 | John R. Murphy | Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region |
| US5578482A (en) | 1990-05-25 | 1996-11-26 | Georgetown University | Ligand growth factors that bind to the erbB-2 receptor protein and induce cellular responses |
| US5635384A (en) | 1990-06-11 | 1997-06-03 | Dowelanco | Ribosome-inactivating proteins, inactive precursor forms thereof, a process for making and a method of using |
| IL101943A0 (en) | 1991-05-24 | 1992-12-30 | Genentech Inc | Structure,production and use of heregulin |
| US5834229A (en) | 1991-05-24 | 1998-11-10 | Genentech, Inc. | Nucleic acids vectors and host cells encoding and expressing heregulin 2-α |
| JP4124480B2 (ja) | 1991-06-14 | 2008-07-23 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 免疫グロブリン変異体 |
| US5621083A (en) | 1991-11-04 | 1997-04-15 | Xoma Corporation | Immunotoxins comprising ribosome-inactivating proteins |
| US6146850A (en) | 1991-11-04 | 2000-11-14 | Xoma Corporation | Proteins encoding gelonin sequences |
| US5552144A (en) * | 1992-01-22 | 1996-09-03 | Microcarb, Inc. | Immunogenic shiga-like toxin II variant mutants |
| WO1993021319A1 (en) | 1992-04-08 | 1993-10-28 | Cetus Oncology Corporation | HUMANIZED C-erbB-2 SPECIFIC ANTIBODIES |
| CA2131003A1 (en) | 1992-05-26 | 1993-12-09 | Raymond G. Goodwin | Novel cytokine that binds cd30 |
| AU687346B2 (en) | 1992-06-30 | 1998-02-26 | Oncologix, Inc. | A combination of anti-erbB-2 monoclonal antibodies and method of using |
| EP0752248B1 (en) | 1992-11-13 | 2000-09-27 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma |
| US5736137A (en) | 1992-11-13 | 1998-04-07 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma |
| US5869445A (en) | 1993-03-17 | 1999-02-09 | University Of Washington | Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein |
| CA2162689C (en) | 1993-05-12 | 2000-07-18 | Marc D. Better | Immunotoxins comprising gelonin and an antibody |
| US5484892A (en) | 1993-05-21 | 1996-01-16 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Monoclonal antibodies that block ligand binding to the CD22 receptor in mature B cells |
| US5417972A (en) | 1993-08-02 | 1995-05-23 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method of killing B-cells in a complement independent and an ADCC independent manner using antibodies which specifically bind CDIM |
| US5595721A (en) | 1993-09-16 | 1997-01-21 | Coulter Pharmaceutical, Inc. | Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20 |
| GB9424449D0 (en) | 1994-12-02 | 1995-01-18 | Wellcome Found | Antibodies |
| US20020164788A1 (en) | 1994-12-02 | 2002-11-07 | The Wellcome Foundation Limited | Humanized antibodies to CD38 |
| WO1996022384A1 (en) | 1995-01-18 | 1996-07-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Anti-cd 30 antibodies preventing proteolytic cleavage and release of membrane-bound cd 30 antigen |
| JPH11506424A (ja) | 1995-03-24 | 1999-06-08 | オフィディアン ファーマシューティカルズ インコーポレーテッド | ベロ毒素産生大腸菌に対する治療 |
| US5667786A (en) | 1995-06-07 | 1997-09-16 | Novavax, Inc. | Method for treating tumors with a toxin |
| AU6113396A (en) | 1995-06-14 | 1997-01-15 | Regents Of The University Of California, The | Novel high affinity human antibodies to tumor antigens |
| AU6777596A (en) | 1995-08-25 | 1997-03-19 | Dana-Farber Cancer Institute | Treatment of human prostate disease with beta-lapachone derivatives |
| US5783186A (en) | 1995-12-05 | 1998-07-21 | Amgen Inc. | Antibody-induced apoptosis |
| US5858682A (en) | 1996-08-02 | 1999-01-12 | Pharmingen | E2A/pbx1 fusion protein specific monoclonal antibodies |
| CZ295838B6 (cs) | 1996-09-09 | 2005-11-16 | Zealand Pharma A/S | Způsob výroby peptidů |
| JP2001500730A (ja) | 1996-09-10 | 2001-01-23 | ヘンリー エム ジャクソン ファンデーション フォージ アドバンスメント オブ ミリタリー メディシン | ヒスチジン―タグ付き志賀毒素およびトキソイド、該毒素およびトキソイドとの融合タンパク質ならびにそれらの精製及び調製方法 |
| US5770380A (en) | 1996-09-13 | 1998-06-23 | University Of Pittsburgh | Synthetic antibody mimics--multiple peptide loops attached to a molecular scaffold |
| BR9712410A (pt) | 1996-10-18 | 1999-10-19 | Genentech Inc | Anticorpo isolado, composição, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método para fazer um anticorpo anti-erbb2, método para a determinação da presença de erbb2, kit, método paa a indução da morte celular e artigo manufaturado |
| ES2300122T3 (es) | 1997-03-20 | 2008-06-01 | The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of Department Of Health And Human Services | Anticuerpos recombinantes e inmunoconjugados dirigidos contra celulas y tumores portadores de cd-22. |
| US6306393B1 (en) | 1997-03-24 | 2001-10-23 | Immunomedics, Inc. | Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies |
| AU6919798A (en) | 1997-04-24 | 1998-11-13 | Crisplant A/S | A conveyor unit for use in a closed loop conveyor system and a conveyor system |
| US6171586B1 (en) | 1997-06-13 | 2001-01-09 | Genentech, Inc. | Antibody formulation |
| CA2293829C (en) | 1997-06-24 | 2011-06-14 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for galactosylated glycoproteins |
| WO1999002567A2 (en) | 1997-07-08 | 1999-01-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Compositions and methods for producing homoconjugates of antibodies which induce growth arrest or apoptosis of tumor cells |
| FR2766193B1 (fr) * | 1997-07-18 | 2001-09-14 | Inst Curie | Polypeptide chimerique comprenant le fragment b de la toxine shiga et des peptides d'interet therapeutique |
| AU759779B2 (en) | 1997-10-31 | 2003-05-01 | Genentech Inc. | Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms |
| CA2222993A1 (en) | 1998-02-04 | 1999-08-04 | The Ontario Cancer Institute | A method for using a ribosome-inactivating protein complex as a structural template and a molecular search engine in the design, construction and screening of combinatorial protein libraries |
| US6194551B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-02-27 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
| US6528624B1 (en) | 1998-04-02 | 2003-03-04 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
| US6242195B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-06-05 | Genentech, Inc. | Methods for determining binding of an analyte to a receptor |
| AU770718B2 (en) | 1998-06-05 | 2004-02-26 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Use of genetically engineered antibodies to CD38 to treat multiple myeloma |
| US7157418B1 (en) * | 1998-07-22 | 2007-01-02 | Osprey Pharmaceuticals, Ltd. | Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders |
| EP1346731B1 (en) | 1998-07-22 | 2006-12-06 | Osprey Pharmaceuticals Limited | Conjugates for treating inflammatory disorders and associated tissue damage |
| US6770456B1 (en) | 1998-07-29 | 2004-08-03 | Ludwig Institute For Cancer Research | Endogenous retrovirus tumor associated nucleic acids and antigens |
| MY136203A (en) | 1998-08-11 | 2008-08-29 | Idec Pharma Corp | Combination therapies for b-cell lymphomas comprising administration of anti-cd20 antibody |
| WO2000020579A1 (en) | 1998-10-02 | 2000-04-13 | Mcmaster University | Spliced form of erbb-2/neu oncogene |
| US6224866B1 (en) | 1998-10-07 | 2001-05-01 | Biocrystal Ltd. | Immunotherapy of B cell involvement in progression of solid, nonlymphoid tumors |
| CA2350064C (en) | 1998-11-09 | 2012-05-08 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Chimeric anti-cd20 antibody treatment of patients receiving bmt or pbsc transplants |
| EP1616572B1 (en) | 1998-11-09 | 2010-09-01 | Biogen Idec Inc. | Chimeric anti-CD20 antibody, rituxan, for use in the treatment of chronic lymphocytic leukemia |
| ES2694002T3 (es) | 1999-01-15 | 2018-12-17 | Genentech, Inc. | Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante |
| US7625859B1 (en) | 2000-02-16 | 2009-12-01 | Oregon Health & Science University | HER-2 binding antagonists |
| US6897044B1 (en) | 1999-01-28 | 2005-05-24 | Biogen Idec, Inc. | Production of tetravalent antibodies |
| EP1161455B1 (en) * | 1999-03-16 | 2008-09-03 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | A novel chimeric protein for prevention and treatment of hiv infection |
| PL200134B1 (pl) | 1999-05-07 | 2008-12-31 | Genentech Inc | Zastosowanie przeciwciała anty-CD20 |
| US7527787B2 (en) | 2005-10-19 | 2009-05-05 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies |
| US7144991B2 (en) | 1999-06-07 | 2006-12-05 | Aletheon Pharmaceuticals, Inc. | Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof |
| ES2331644T3 (es) | 1999-06-09 | 2010-01-12 | Immunomedics, Inc. | Inmunoterapia de trastornos autoinmunes usando anticuerpos cuya diana son celulas b. |
| ITMI991299A1 (it) | 1999-06-11 | 2000-12-11 | Consiglio Nazionale Ricerche | Uso di anticorpi contro antigeni di superficie per il trattamento della malattia trapianto contro ospite |
| US6949245B1 (en) | 1999-06-25 | 2005-09-27 | Genentech, Inc. | Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies |
| DE19930748C2 (de) | 1999-07-02 | 2001-05-17 | Infineon Technologies Ag | Verfahren zur Herstellung von EEPROM- und DRAM-Grabenspeicherzellbereichen auf einem Chip |
| JP4387625B2 (ja) | 1999-07-02 | 2009-12-16 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | Ｈｅｒ２に結合する化合物 |
| WO2001003734A1 (en) | 1999-07-12 | 2001-01-18 | Genentech, Inc. | Blocking immune response to a foreign antigen using an antagonist which binds to cd20 |
| JP2003513012A (ja) | 1999-08-11 | 2003-04-08 | アイデック ファーマスーティカルズ コーポレイション | 抗ｃｄ２０抗体による骨髄病変を伴う非ホジキンリンパ腫を有する患者の治療 |
| US8557244B1 (en) | 1999-08-11 | 2013-10-15 | Biogen Idec Inc. | Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody |
| US6451284B1 (en) | 1999-08-11 | 2002-09-17 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Clinical parameters for determining hematologic toxicity prior to radioimmunotheraphy |
| AU6929100A (en) | 1999-08-23 | 2001-03-19 | Biocrystal Limited | Methods and compositions for immunotherapy of b cell involvement in promotion ofa disease condition comprising multiple sclerosis |
| US6492498B1 (en) | 1999-11-15 | 2002-12-10 | Regents Of The University Of Minnesota | Multimeric immunotoxins |
| US20010031485A1 (en) | 2000-03-22 | 2001-10-18 | Sibtech, Inc. | Recombinant proteins containing Shiga-like toxin and vascular endothelial growth factor fragments |
| US7267973B2 (en) | 2000-03-22 | 2007-09-11 | Sibtech, Inc. | Nucleic acids encoding recombinant proteins containing Shiga-like toxin and vascular endothelial growth factor |
| WO2001072333A1 (en) | 2000-03-24 | 2001-10-04 | Chiron Corporation | Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma using a combination_of an antibody to cd20 and interleuking-2 |
| NZ521540A (en) | 2000-04-11 | 2004-09-24 | Genentech Inc | Multivalent antibodies and uses therefor |
| AU5914201A (en) | 2000-04-25 | 2001-11-07 | Idec Pharma Corp | Intrathecal administration of rituximab for treatment of central nervous system lymphomas |
| US7306801B2 (en) | 2000-05-15 | 2007-12-11 | Health Research, Inc. | Methods of therapy for cancers characterized by overexpression of the HER2 receptor protein |
| EP2052742A1 (en) | 2000-06-20 | 2009-04-29 | Biogen Idec Inc. | Treatment of B-cell associated diseases such as malignancies and autoimmune diseases using a cold anti-CD20 antibody/radiolabeled anti-CD22 antibody combination |
| EP1174440A1 (en) | 2000-07-19 | 2002-01-23 | U-BISys B.V. | A selectively-expressed epitope on the human CD38 molecule detected by a phage display library-derived human scFv antibody fragment |
| US20020127247A1 (en) | 2000-11-17 | 2002-09-12 | Allergen Sales, Inc. | Modified clostridial neurotoxins with altered biological persistence |
| US20040018194A1 (en) | 2000-11-28 | 2004-01-29 | Francisco Joseph A. | Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof |
| US7090843B1 (en) | 2000-11-28 | 2006-08-15 | Seattle Genetics, Inc. | Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof |
| DE10063048A1 (de) | 2000-12-18 | 2002-07-11 | Deutsches Krebsforsch | Einzelketten-Antikörper mit verbesserter Stabilität |
| US7829084B2 (en) | 2001-01-17 | 2010-11-09 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding constructs and methods for use thereof |
| WO2002096948A2 (en) | 2001-01-29 | 2002-12-05 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Engineered tetravalent antibodies and methods of use |
| CA2436092A1 (en) | 2001-01-29 | 2002-08-08 | Idec Pharmaceutical Corporation | Modified antibodies and methods of use |
| WO2002079255A1 (en) | 2001-04-02 | 2002-10-10 | Idec Pharmaceuticals Corporation | RECOMBINANT ANTIBODIES COEXPRESSED WITH GnTIII |
| WO2003061694A1 (en) | 2001-05-10 | 2003-07-31 | Seattle Genetics, Inc. | Immunosuppression of the humoral immune response by anti-cd20 antibodies |
| AU2002315168A1 (en) | 2001-06-14 | 2003-01-02 | Intermune, Inc. | Combination therapy of gamma-interferon and b cell specific antibodies |
| US7321026B2 (en) | 2001-06-27 | 2008-01-22 | Skytech Technology Limited | Framework-patched immunoglobulins |
| US7446185B2 (en) | 2001-07-18 | 2008-11-04 | The Regents Of The University Of California | Her2/neu target antigen and use of same to stimulate an immune response |
| WO2003027135A2 (en) | 2001-09-26 | 2003-04-03 | The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Mutated anti-cd22 antibodies with increased affinity to cd22-expressing leukemia cells |
| US7387776B2 (en) | 2002-01-09 | 2008-06-17 | Medarex, Inc. | Human monoclonal antibodies against CD30 |
| DE60333004D1 (de) | 2002-02-04 | 2010-07-29 | Yoshida Hideo | Antikrebsmittel mit verotoxinvarianten |
| EP1485130A4 (en) | 2002-02-21 | 2006-11-22 | Univ Duke | REAGENTS AND TREATMENT PROCEDURES FOR AUTOIMMUNE DISEASES |
| CA2476890C (en) | 2002-02-26 | 2013-07-16 | Genencor International, Inc. | Subtilisin carlsberg proteins with reduced immunogenicity |
| CN1649902B (zh) | 2002-03-01 | 2011-04-13 | 免疫医疗公司 | 内在化抗-cd74抗体和使用方法 |
| US20040248151A1 (en) | 2002-04-05 | 2004-12-09 | Ventana Medical Systems, Inc. | Method for predicting the response to HER2-directed therapy |
| ES2429112T3 (es) | 2002-04-10 | 2013-11-13 | Genentech, Inc. | Variantes de anticuerpos anti-HER2 |
| US7449480B2 (en) | 2002-05-14 | 2008-11-11 | Baylor College Of Medicine | Small molecule inhibitors of HER2 expression |
| EP1509226A4 (en) | 2002-05-14 | 2008-04-09 | Baylor College Medicine | SMALL MOLECULAR INHIBITORS OF THE HER2 EXPRESSION |
| US20050180972A1 (en) | 2002-07-31 | 2005-08-18 | Wahl Alan F. | Anti-CD20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders |
| EP1572744B1 (en) | 2002-12-16 | 2010-06-09 | Genentech, Inc. | Immunoglobulin variants and uses thereof |
| AU2003303374A1 (en) | 2002-12-20 | 2004-07-22 | The Johns Hopkins University | Treatment of metastatic cancer with the b-subunit of shiga toxin |
| AU2003294023B2 (en) | 2003-01-03 | 2008-01-31 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti Spa | Rhesus HER2/neu, nucleotides encoding same, and uses thereof |
| KR101412271B1 (ko) | 2003-05-09 | 2014-06-25 | 듀크 유니버시티 | Ｃｄ２０-특이적 항체 및 이를 이용한 방법 |
| AR044388A1 (es) | 2003-05-20 | 2005-09-07 | Applied Molecular Evolution | Moleculas de union a cd20 |
| US7834258B2 (en) | 2003-06-30 | 2010-11-16 | Mu-Hyeon Choe | Dimer of chimeric recombinant binding domain-functional group fusion formed via disulfide-bond-bridge and the processes for producing the same |
| JP4871126B2 (ja) | 2003-07-04 | 2012-02-08 | アフィボディ・アーベー | Ｈｅｒ２に対する結合親和性を有するポリペプチド |
| EP1648512A4 (en) | 2003-07-31 | 2009-01-21 | Immunomedics Inc | ANTI-CD19 ANTIBODIES |
| ES2426916T3 (es) | 2003-08-01 | 2013-10-25 | A & G Pharmaceutical, Inc. | Composiciones y procedimientos para restaurar la sensibilidad al tratamiento con antagonistas de HER2 |
| US8147832B2 (en) | 2003-08-14 | 2012-04-03 | Merck Patent Gmbh | CD20-binding polypeptide compositions and methods |
| ES2343965T3 (es) | 2003-11-25 | 2010-08-13 | The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Anticuerpos anti-cd22 e inmunocongujados mutados. |
| US7585942B2 (en) | 2003-11-25 | 2009-09-08 | Anjin Corporation | Diphtheria toxin variant |
| AU2005235811B2 (en) | 2004-02-06 | 2011-11-03 | Morphosys Ag | Anti-CD38 human antibodies and uses therefor |
| EP1720907B1 (en) | 2004-02-06 | 2015-04-08 | MorphoSys AG | Anti-cd38 human antibodies and uses therefor |
| EP1727827B1 (en) | 2004-03-26 | 2010-05-12 | Molecular Templates, Inc. | Library of toxin mutants, and methods of using same |
| US7560111B2 (en) | 2004-07-22 | 2009-07-14 | Genentech, Inc. | HER2 antibody composition |
| SG10201912554TA (en) | 2005-03-23 | 2020-02-27 | Genmab As | Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma |
| KR101188117B1 (ko) | 2005-03-31 | 2012-10-09 | 바이오메딕스 인코포레이티드 | 항ｃｄ20 모노클로날 항체 |
| WO2007040653A2 (en) | 2005-05-16 | 2007-04-12 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services National Institutes Of Health | Anti-cd30 antibodies that bind to intact cd30 but not soluble cd30 |
| US7771955B2 (en) | 2005-06-09 | 2010-08-10 | University Of Maryland | Affinity membrane for capture of a target biomolecule and formation thereof by site-directed immobilization of a capture biomolecule |
| CN104356236B (zh) | 2005-07-01 | 2020-07-03 | E.R.施贵宝&圣斯有限责任公司 | 抗程序性死亡配体1(pd-l1)的人单克隆抗体 |
| FI20055417A0 (fi) | 2005-07-20 | 2005-07-20 | Glykos Finland Oy | Syöpäpesifiset glykaanit ja niiden käyttö |
| EP1919505A2 (en) | 2005-07-25 | 2008-05-14 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Single dose use of cd20-specific binding molecules |
| WO2007033497A1 (en) * | 2005-09-26 | 2007-03-29 | University Health Network | Library from toxin mutants, and methods of using same |
| EP1969165A4 (en) | 2005-12-23 | 2010-05-19 | Viventia Biotech Inc | METHODS FOR GENERATING AND SCREENING HYBRID PROTEIN LIBRARIES, AND USES THEREOF |
| JP5409014B2 (ja) | 2006-02-16 | 2014-02-05 | ザ ヘンリー エム． ジャクソン ファウンデーション フォー ザ アドヴァンスメント オブ ミリタリー メディシン インコーポレイテッド | 志賀トキソイドキメラタンパク質 |
| US7373982B2 (en) | 2006-03-21 | 2008-05-20 | Halliburton Energy Services, Inc. | Cements for use across formations containing gas hydrates |
| WO2008073160A2 (en) * | 2006-08-17 | 2008-06-19 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for converting or inducing protective immunity |
| US8257706B2 (en) | 2006-08-25 | 2012-09-04 | Seattle Genetics, Inc. | CD30 binding agents and uses thereof |
| EP1914242A1 (en) | 2006-10-19 | 2008-04-23 | Sanofi-Aventis | Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer |
| BRPI0717902A2 (pt) | 2006-12-01 | 2013-10-29 | Medarex Inc | "anticorpo monoclonal humano isolado, composição, conjugado anticorpo-molécula parceria, imunoconjugado, molécula de ácido nucléico isolada, vetor de expressão, célula hospedeira, método para prepar um anticorpo anti-cd22, método para inibir o desenvolvimento de uma célula tumoral que expressa cd22 e método para tratar uma doença inflamatória ou autoimuneem um indivíduo" |
| CA2673668A1 (en) | 2006-12-29 | 2008-07-10 | Osprey Pharmaceuticals Usa, Inc. | Methods of selecting and producing modified toxins, conjugates containing modified toxins and uses thereof |
| ES2798758T3 (es) | 2007-06-06 | 2020-12-14 | Sarepta Therapeutics Inc | Proteínas variantes de empalme her2 y her3 solubles, oligonucleótidos de cambio de empalme y su uso en el tratamiento de enfermedades |
| JP2010530895A (ja) | 2007-06-21 | 2010-09-16 | アンジェリカ セラピューティックス，インク． | 修飾毒素 |
| US7887801B2 (en) | 2007-07-13 | 2011-02-15 | Topotarget Germany Ag | Optimized DNA and protein sequence of an antibody to improve quality and yield of bacterially expressed antibody fusion proteins |
| DK2178916T3 (en) | 2007-07-31 | 2015-01-12 | Regeneron Pharma | Human antibodies to human cd20 and method thereof for use |
| WO2009017823A2 (en) | 2007-08-01 | 2009-02-05 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health Of Human Services, National Institutes Of Health | A fold-back diabody diphtheria toxin immunotoxin and methods of use |
| CA2698357C (en) | 2007-09-04 | 2017-06-06 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Deletions in domain ii of pseudomonas exotoxin a that reduce non-specific toxicity |
| WO2009031230A1 (ja) | 2007-09-06 | 2009-03-12 | Osaka University | 抗ｃｄ２０モノクローナル抗体 |
| US20100298238A1 (en) | 2007-10-08 | 2010-11-25 | Rutgers, The State University | Nontoxic shiga-like toxin mutant compositions and methods |
| CA2705289A1 (en) | 2007-11-13 | 2009-05-22 | The Scripps Research Institute | Production of cytotoxic antibody-toxin fusion in eukaryotic algae |
| WO2009068630A1 (en) | 2007-11-27 | 2009-06-04 | Ablynx N.V. | Immunoglobulin constructs |
| US8315343B2 (en) | 2007-12-17 | 2012-11-20 | Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) | Multi-antenna receiver interference cancellation method and apparatus |
| EP2072525A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-06-24 | Affibody AB | New polypeptides having affinity for HER2 |
| TWI472339B (zh) | 2008-01-30 | 2015-02-11 | Genentech Inc | 包含結合至ｈｅｒ２結構域ii之抗體及其酸性變異體的組合物 |
| WO2009110944A1 (en) | 2008-02-29 | 2009-09-11 | Angelica Therapeutics, Inc. | Modified toxins |
| ES2342646B1 (es) | 2008-06-02 | 2011-04-26 | Institut De Recerca Hospital Universitari Vall Hebron | Metodo de diagnostico de canceres que expresan el receptor her-2 o sus variantes truncadas. |
| UA108735C2 (uk) | 2008-07-21 | 2015-06-10 | Структурні варіанти антитіл для покращення терапевтичних характеристик | |
| CA2744523A1 (en) | 2008-09-22 | 2010-03-25 | Calmune Corporation | Methods and vectors for display of molecules and displayed molecules and collections |
| AU2009296392B2 (en) | 2008-09-26 | 2016-06-02 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Human anti-PD-1, PD-L1, and PD-L2 antibodies and uses therefor |
| RU2011126896A (ru) | 2009-01-23 | 2013-02-27 | Дзе Хенри М. Джексон Фаундейшн Фо Дзе Эдвенсмент Оф Милитэри Медисин, Инк. | Композиция и полипептид для стимулирования иммунологической реакции на шига токсин 2 типа |
| RU2011142230A (ru) | 2009-04-20 | 2013-05-27 | Пфайзер Инк. | Контроль гликозилирования белка и композиции и способы, касающиеся этого |
| US20120258104A1 (en) | 2009-07-22 | 2012-10-11 | Cenix Bioscience Gmbh | Delivery System and Conjugates For Compound Delivery Via Naturally Occurring Intracellular Transport Routes |
| US9174169B2 (en) | 2009-08-14 | 2015-11-03 | Unifrax I Llc | Mounting mat for exhaust gas treatment device |
| EP2496604B1 (en) | 2009-11-06 | 2017-08-23 | IDEXX Laboratories, Inc. | Canine anti-cd20 antibodies |
| US9616120B2 (en) | 2010-03-04 | 2017-04-11 | Vet Therapeutics, Inc. | Monoclonal antibodies directed to CD20 |
| EP2371864A1 (en) | 2010-03-23 | 2011-10-05 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Monoclonal antibodies for treatment of cancer |
| KR20130108069A (ko) | 2010-04-15 | 2013-10-02 | 알퍼 바이오테크, 엘엘씨 | Ｈｅｒ2 항원에 대한 모노클로날 항체 및 그를 위한 용도 |
| WO2011147986A1 (en) | 2010-05-27 | 2011-12-01 | Genmab A/S | Monoclonal antibodies against her2 |
| GB201013989D0 (en) | 2010-08-20 | 2010-10-06 | Univ Southampton | Biological materials and methods of using the same |
| US20120141505A1 (en) | 2010-11-01 | 2012-06-07 | Fatih M. Uckun | Cd19-ligand and use |
| CN106220739A (zh) | 2010-12-09 | 2016-12-14 | 宾夕法尼亚大学董事会 | 嵌合抗原受体‑修饰的t细胞治疗癌症的用途 |
| JOP20210044A1 (ar) | 2010-12-30 | 2017-06-16 | Takeda Pharmaceuticals Co | الأجسام المضادة لـ cd38 |
| PL219845B1 (pl) | 2011-01-05 | 2015-07-31 | Adamed Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością | Przeciwnowotworowe białko fuzyjne |
| US20140065172A1 (en) | 2011-01-26 | 2014-03-06 | Cenix Bioscience Gmbh | Delivery system and conjugates for compound delivery via naturally occurring intracellular transport routes |
| SG191977A1 (en) | 2011-02-01 | 2013-08-30 | Genmab As | Human antibodies and antibody-drug conjugates against cd74 |
| US8895006B2 (en) | 2011-03-04 | 2014-11-25 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Ricin ribosome binding protein compositions and methods of use thereof |
| ES2641877T3 (es) | 2011-05-06 | 2017-11-14 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Inmunotoxina recombinante dirigida a mesotelina |
| CN103717236A (zh) | 2011-06-08 | 2014-04-09 | 加利福尼亚大学董事会 | 治疗肺癌和前列腺癌的抗-cd22抗原结合分子 |
| MY193562A (en) | 2011-08-01 | 2022-10-19 | Genentech Inc | Methods of treating cancer using pd-1 axis binding antagonists and mek inhibitors |
| WO2013126690A1 (en) | 2012-02-23 | 2013-08-29 | President And Fellows Of Harvard College | Modified microbial toxin receptor for delivering agents into cells |
| US10590202B2 (en) | 2012-11-19 | 2020-03-17 | Baliopharm Ag | Recombinant bispecific antibody binding to CD20 and CD95 |
| EP2740493A1 (en) * | 2012-12-05 | 2014-06-11 | Institut Curie | Conjugates of the B-subunit of Shiga toxin for anticancer therapies |
| EP2778173A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-17 | Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies | Antibody directed against anthrax toxins and its uses |
| JP6090020B2 (ja) | 2013-07-10 | 2017-03-08 | 富士ゼロックス株式会社 | 画像形成システム |
| US10808035B2 (en) | 2013-08-26 | 2020-10-20 | Markus Chmielewski | Anti CD30 chimeric antigen receptor and its use |
| GB2519786A (en) | 2013-10-30 | 2015-05-06 | Sergej Michailovic Kiprijanov | Multivalent antigen-binding protein molecules |
| CA2927099A1 (en) | 2013-10-31 | 2015-05-07 | Sanofi | Specific anti-cd38 antibodies for treating human cancers |
| US20160177284A1 (en) | 2014-01-27 | 2016-06-23 | Molecular Templates, Inc. | Cell-targeted molecules comprising amino-terminus proximal or amino-terminal shiga toxin a subunit effector regions |
| US20210138076A2 (en) | 2014-01-27 | 2021-05-13 | Molecular Templates, Inc. | Cell-targeting molecules comprising shiga toxin a subunit effectors and cd8+ t-cell epitopes |
| EP3099704B1 (en) | 2014-01-27 | 2021-03-17 | Molecular Templates, Inc. | Mhc class i epitope delivering polypeptides |
| EP3102245B1 (en) | 2014-02-05 | 2021-09-08 | Molecular Templates, Inc. | Methods of screening, selecting, and identifying cytotoxic recombinant polypeptides based on an interim diminution of ribotoxicity |
| US11142584B2 (en) | 2014-03-11 | 2021-10-12 | Molecular Templates, Inc. | CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same |
| EP3872090A1 (en) | 2014-03-11 | 2021-09-01 | Molecular Templates, Inc. | Proteins comprising amino-terminal proximal shiga toxin a subunit effector regions and cell-targeting immunoglobulin-type binding regions |
| JP6935195B2 (ja) | 2014-03-11 | 2021-09-15 | モレキュラー テンプレーツ, インク.Molecular Templates, Inc. | 結合領域、志賀毒素ａサブユニットのエフェクター領域、及びカルボキシ末端小胞体局在化シグナルモチーフを含むタンパク質 |
| TWI674257B (zh) | 2014-03-14 | 2019-10-11 | 日商拉夸里亞創藥股份有限公司 | 作為ｔｒｐｍ８拮抗劑之氮雜螺衍生物 |
| EP3137488B1 (en) | 2014-06-11 | 2019-01-02 | Molecular Templates, Inc. | Protease-cleavage resistant, shiga toxin a subunit effector polypeptides and cell-targeting molecules comprising the same |
| CN113332449B (zh) | 2014-06-12 | 2023-12-22 | 石药集团巨石生物制药有限公司 | 酶法制备同质的抗体-药物缀合物 |
| US10550197B2 (en) | 2014-06-18 | 2020-02-04 | Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus | CAR-expressing NK-92 cells as cell therapeutic agents |
| CN105713087B (zh) | 2014-11-12 | 2020-05-08 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 人乳头瘤病毒58型单克隆抗体及其应用 |
| MX2017010072A (es) | 2015-02-05 | 2017-11-09 | Molecular Templates Inc | Moleculas multivalentes que se enlazan a cd20, las cuales comprenden regiones efectoras de la subunidad a de la toxina shiga, y composiciones enriquecidas de las mismas. |
| DK3265575T3 (da) | 2015-03-04 | 2021-05-31 | Igm Biosciences Inc | Cd20-bindende molekyler og anvendelser deraf |
| KR20240038121A (ko) | 2015-05-30 | 2024-03-22 | 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. | 탈면역된 시가 독소 a 서브유닛 스캐폴드 및 이를 포함하는 세포-표적화 분자 |
| AU2016297920A1 (en) | 2015-07-26 | 2018-01-18 | Molecular Templates, Inc. | Cell-targeting molecules comprising shiga toxin A subunit effectors and CD8+ T-cell epitopes |
| US11660352B2 (en) | 2016-03-29 | 2023-05-30 | Stcube, Inc. | Dual function antibodies specific to glycosylated PD-L1 and methods of use thereof |
| WO2017189959A1 (en) | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions for the treatment of disease |
| CA3041078A1 (en) | 2016-10-30 | 2018-05-03 | Shanghai Henlius Biotech, Inc. | Anti-pd-l1 antibodies and variants |
| KR102557126B1 (ko) | 2016-12-07 | 2023-07-18 | 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. | 부위 특이적 접합을 위한 시가 독소 a 서브유닛 작동체 폴리펩타이드, 시가 독소 작동체 스캐폴드, 및 세포-표적화 분자 |
| WO2018124642A2 (ko) | 2016-12-26 | 2018-07-05 | 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 | 치수줄기세포의 상아 모전구세포로의 분화용 조성물 및 상아모전구세포 표면에 특이적으로 결합하는 IgG 또는 IgM 타입 단일 클론 항체 |
| IL267990B2 (en) | 2017-01-25 | 2024-04-01 | Molecular Templates Inc | Cell-targeted molecules containing Shiga toxin A subunit activators and nonimmune CD8 T-cell epitopes |
| JP7201599B2 (ja) | 2017-02-28 | 2023-01-10 | 中外製薬株式会社 | プロテインｌを用いたタンパク質精製 |
| US20200239579A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-07-30 | Genmab A/S | Antibodies against pd-l1 |
| CN111108113B (zh) | 2017-09-25 | 2024-02-23 | Jsr株式会社 | 免疫球蛋白结合蛋白质和使用其的亲和载体 |
| WO2020081493A1 (en) | 2018-10-16 | 2020-04-23 | Molecular Templates, Inc. | Pd-l1 binding proteins |
| WO2020154475A1 (en) | 2019-01-23 | 2020-07-30 | Molecular Templates, Inc. | Proteins comprising modified immunoglobulin variable light chains |
| CN114423793A (zh) | 2019-09-18 | 2022-04-29 | 分子模板公司 | 包含志贺菌毒素a亚基支架的pd-l1结合分子 |
-
2016
- 2016-05-27 KR KR1020247007951A patent/KR20240038121A/ko active Application Filing
- 2016-05-27 IL IL292708A patent/IL292708B1/en unknown
- 2016-05-27 AU AU2016271124A patent/AU2016271124C1/en active Active
- 2016-05-27 WO PCT/US2016/034778 patent/WO2016196344A1/en active Application Filing
- 2016-05-27 JP JP2017561629A patent/JP6771492B2/ja active Active
- 2016-05-27 HU HUE16729701A patent/HUE051246T2/hu unknown
- 2016-05-27 SI SI201630763T patent/SI3303373T1/sl unknown
- 2016-05-27 RS RS20200732A patent/RS60441B1/sr unknown
- 2016-05-27 EP EP16729701.9A patent/EP3303373B1/en active Active
- 2016-05-27 DK DK16729701.9T patent/DK3303373T3/da active
- 2016-05-27 MX MX2017015493A patent/MX2017015493A/es unknown
- 2016-05-27 CN CN201680038854.6A patent/CN107849096B/zh active Active
- 2016-05-27 LT LTEP16729701.9T patent/LT3303373T/lt unknown
- 2016-05-27 EP EP19212988.0A patent/EP3660035A1/en active Pending
- 2016-05-27 PT PT167297019T patent/PT3303373T/pt unknown
- 2016-05-27 PL PL16729701T patent/PL3303373T3/pl unknown
- 2016-05-27 CA CA2984635A patent/CA2984635A1/en active Pending
- 2016-05-27 ES ES16729701T patent/ES2847373T3/es active Active
- 2016-05-27 CN CN202210426334.XA patent/CN114656573A/zh active Pending
- 2016-05-27 US US15/577,827 patent/US20180258143A1/en not_active Abandoned
- 2016-05-27 EP EP19210151.7A patent/EP3636660A1/en active Pending
- 2016-05-27 KR KR1020177037081A patent/KR102647100B1/ko active IP Right Grant
-
2017
- 2017-11-07 IL IL255492A patent/IL255492B/en unknown
- 2017-11-07 IL IL285032A patent/IL285032B/en unknown
- 2017-11-30 MX MX2021005092A patent/MX2021005092A/es unknown
-
2018
- 2018-04-28 HK HK18105551.0A patent/HK1246309A1/zh unknown
-
2020
- 2020-03-12 AU AU2020201807A patent/AU2020201807B2/en active Active
- 2020-04-22 HR HRP20200640TT patent/HRP20200640T1/hr unknown
- 2020-06-23 CY CY20201100573T patent/CY1123315T1/el unknown
- 2020-09-29 JP JP2020163491A patent/JP7079522B2/ja active Active
-
2021
- 2021-04-19 US US17/233,911 patent/US11365223B2/en active Active
- 2021-10-01 AU AU2021240294A patent/AU2021240294B2/en active Active
- 2021-12-22 JP JP2021207738A patent/JP7228931B2/ja active Active
-
2022
- 2022-05-17 US US17/746,106 patent/US20220281926A1/en active Pending
-
2023
- 2023-02-06 JP JP2023016025A patent/JP2023052919A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013080147A2 (en) * | 2011-11-28 | 2013-06-06 | Adamed Sp. Z O.O. | Anticancer fusion protein |
| WO2014164680A1 (en) * | 2013-03-12 | 2014-10-09 | Molecular Templates, Inc. | Cd20-binding immunotoxins for inducing cellular internalization and methods using same |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BEVERLEY J. BURGESS等: ""Proteolytic cleavage at arginine residues within the hydrophilic disulphide loop of the Escherichia coli Shiga-like toxin I A subunit is not essential for cytotoxicity"", 《MOLECULAR MICROBIOLOGY》 * |
| NICHOLAS H. CARBONETTI等: ""Intracellular Delivery of a Cytolytic T-Lymphocyte Epitope Peptide by Pertussis Toxin to Major Histocompatibility Complex Class I without Involvement of the Cytosolic Class I Antigen Processing Pathway"", 《INFECTION AND IMMUNITY》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110612117A (zh) * | 2018-04-17 | 2019-12-24 | 分子模板公司 | 包含去免疫化的志贺毒素a亚基支架的her2靶向分子 |
| CN110612117B (zh) * | 2018-04-17 | 2024-04-12 | 分子模板公司 | 包含去免疫化的志贺毒素a亚基支架的her2靶向分子 |
| CN113454108A (zh) * | 2019-01-23 | 2021-09-28 | 米伦纽姆医药公司 | 包含去免疫化志贺菌毒素a亚基效应子的cd38结合蛋白 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107849096A (zh) | 去免疫化的志贺毒素a亚基支架和包含它们的细胞靶向分子 | |
| US11857628B2 (en) | Shiga toxin A subunit effector polypeptides, Shiga toxin effector scaffolds, and cell-targeting molecules for site-specific conjugation | |
| EP3573648B1 (en) | Cell-targeting molecules comprising de-immunized, shiga toxin a subunit effectors and cd8+ t-cell epitopes | |
| CN106103489A (zh) | Mhc i类表位递送多肽 | |
| CN107922493A (zh) | 包含志贺毒素a亚基效应物和cd8+ t‑细胞表位的细胞靶向分子 | |
| CN106604934A (zh) | 耐受蛋白酶切割的志贺毒素a亚基效应子多肽和包含其的细胞靶向分子 | |
| CN108064247A (zh) | 包含志贺毒素a亚基效应物区域的多价cd20结合分子及其富集组合物 | |
| CN106414503A (zh) | 包含邻近氨基酸端的志贺毒素a亚基效应子区和细胞靶向性免疫球蛋白型结合区的蛋白 | |
| JP7323200B2 (ja) | 脱免疫化志賀毒素ａサブユニット足場を含むｈｅｒ２ターゲティング分子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |