JP2021020905A - 脱免疫化された志賀毒素ａサブユニット足場及びそれを含む細胞標的化分子 - Google Patents

脱免疫化された志賀毒素ａサブユニット足場及びそれを含む細胞標的化分子 Download PDF

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Abstract

【課題】特異的な細胞にカーゴを選択的に送達するための細胞標的化分子の成分として、並びにがん、免疫障害、及び微生物感染を含む様々な状態を治療及び診断するための治療及び／又は診断用分子としての用途を有する、志賀毒素ポリペプチド及び細胞標的化分子の提供。【解決手段】細胞毒性などの志賀毒素の機能を保持しながら、１）脱免疫化；２）低減したプロテアーゼ切断感受性；及び／又は３）異種エピトープカーゴを付与するアミノ酸置換を含む、志賀毒素Ａサブユニット由来のポリペプチド及び細胞標的化分子であって、哺乳動物において低減した免疫原性を示すか、及び／又はポリペプチドが存在する細胞のＭＨＣクラス分子にエピトープを送達することができる、志賀毒素ポリペプチド及び細胞標的化分子。【選択図】なし

Description

本発明は、（１）脱免疫化（de-immunization）、（２）プロテアーゼ感受性の低減、
及び／又は（３）組み込まれたＴ細胞エピトープを提供する変異の組合せを含む、天然に存在する志賀毒素のＡサブユニット由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドであって、例えば強力な細胞毒性などの１つ又は２つ以上の志賀毒素の機能を保持する、志賀毒素エフェクターポリペプチドに関する。ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（１）哺乳動物において低減した免疫原性を示すか、及び／又は（２）それぞれ、そのポリペプチドが存在する細胞のＭＨＣクラスＩ系にＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達することが可能である。
また本発明は、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子にも関する。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、細胞を死滅させるための、及び／又は例えば組み込まれたＴ細胞エピトープのサイトゾルへの送達などのある特定の細胞内区画へのカーゴの細胞内送達のための、例えば免疫毒素及びリガンド−毒素融合体などの細胞標的化分子の足場又は構成要素としての用途を有する。一般的に、例えば、（１）非特異的な毒性を除去又は低減すること、（２）ある特定の免疫応答を除去又は低減すること、及び／又は（３）例えばＣＤ８＋Ｔ細胞の動員などの特異的な細胞型に送達された特異的なエピトープに有益な免疫応答を標的化することが望ましい場合、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は多細胞生物への投与に有用である。本発明の細胞標的化分子は、（１）他の細胞に対して特異的な細胞型を選択的に死滅させることに関して、並びに（２）がん、腫瘍、他の増殖異常、免疫障害、及び微生物感染を含む様々な疾患、障害、及び状態を治療するための治療用分子として有用である。
「魔法の弾丸」という概念は、患者を傷付けないままでヒト患者内の罹患した細胞又は病原体のみを特異的に攻撃する治療剤を発見できるということである。免疫毒素、リガンド−毒素ハイブリッド、イムノＲＮアーゼ、及び他の分子標的薬は、２０世紀初期のPaul
Ehrlich博士の「魔法の弾丸」概念の派生物である（Strebhardt K, Ullrich A, Nat Rev
Cancer 8: 473-80 (2008)）。志賀赤痢菌（S. dysenteriae）によって産生された毒素は、Ehrlich博士の共同研究者であった志賀潔博士が１８９７年にこの細菌を発見したこと
から彼にちなんで「志賀毒素」と命名された。近年、志賀毒素は、標的療法のための細胞内在化分子における使用に好都合な独特な特徴を有することで評価されるようになってきた（例えば米国特許第２０１５０２５９４２８号明細書を参照）。「魔法の弾丸」である細胞標的治療剤（例えば、免疫毒素及びリガンド−毒素融合体）を作り出すために、志賀毒素は、免疫グロブリンドメイン、リガンド、及び他の標的部分と組み合わせることができる。
志賀毒素は、例えば、真核細胞に有効な強力な毒素メカニズム、細胞内在化を駆動させる能力、及び細胞内経路を直接決定する能力などの、治療剤における使用に関して有利な特性を有する可能性がある。志賀毒素は、毒素の構造、特徴、及び生物活性を合理的に変更することによって医療用途のために合成的に改変されてきた（例えば、これらのそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み入れられる国際公開第１９９９／０４０１８５号パンフレット、国際公開第２００５／０９２９１７号パンフレット、欧州特許第１０５１４８２号明細書、独国特許第６９８３５６９５号明細書、国際公開第２００７／０３３４９７号パンフレット、米国特許第２００９／０１５６４１７号明細書、日本特許第４３３９５１１号明細書、米国特許第７７１３９１５号明細書、欧州特許第１７２７８２７号
明細書、独国特許第６０２００４０２７１６８号明細書、欧州特許第１９４５６６０号明細書、日本特許第４９３４７６１号明細書、欧州特許第２２２８３８３号明細書、米国特許第２０１３／０１９６９２８号明細書、国際公開第２０１４／１６４６８０号パンフレット、国際公開第２０１４／１６４６９３号パンフレット、米国特許第２０１５０２５９４２８号明細書、国際公開第２０１５／１３８４３５号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８４５２号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット、及び国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）。志賀毒素Ａサブユニットは、短縮されたり又は他のタンパク質ドメインに融合されたりしても、安定であり、酵素的に活性であり、細胞毒性を有する。
細菌毒素由来の合成的に改変された分子に関する治療用途への主な限界としては、レシピエントにおける有害な免疫原性応答と毒性要素によって引き起こされる非特異的な毒性の両方が挙げられる。治療製品の不要な免疫原性は、都合の悪い結果、例えば効能の低減、中和抗体の産生、薬物動態の変更、全身の免疫及び超過敏反応、アナフィラキシー、アナフィラキシー様反応、並びにレシピエントが安全に受けることができる繰り返し投与の回数に対する制約を引き起こす可能性がある。治療用分子の非特異的な毒性を低減することは、レシピエントに投与されたときにその安全性の特徴を改善できることに加えて、安全に投与できる最大投薬量を増加させることによってその可能な治療域を変更することができる。不要な免疫応答と非特異的な毒性はどちらも、薬物療法にとって有意な安全性及び／又は効能の問題を引き起こす可能性があることから、治療用分子を開発する場合に、両方が生じる可能性を低減又は最小化することが望ましいことが多い。
長期にわたる特定の環境（例えばヒト循環系）での治療又は診断用分子の安定性は重要な特色であり、分子が実質的に採用される可能性がある用途に影響を与えることができる。ある特定の免疫毒素又はリガンド−毒素融合体にとって、毒素と他の要素との間の連結の安定性は、多細胞生物の体内の長期にわたる非標的化毒素の放出によって引き起こされる非特異的な毒性の量に影響を与える可能性がある。したがって、毒素要素を含む分子にとって、ある特定の非特異的な毒性は、毒素要素と例えば細胞標的化要素などの別の構成要素との間の接続の安定性に直接関連する。
志賀毒素は、異種エピトープと組み合わせて、望ましい免疫応答を誘導する目的で選択されたエピトープカーゴを送達する細胞標的化治療剤を作り出すことができる（国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレットを参照）。これらの免疫応答は、患者内における特異的な細胞型の標的化された殺滅のために、加えて患者の免疫系を感作してある特定の細胞を外来と同定するために（すなわち免疫寛容を壊すために）治療用分子によって利用される可能性がある。例えば、主要組織適合（ＭＨＣ）クラスＩ提示経路は、このようなアプローチによって、患者内の腫瘍巣への免疫細胞の動員を誘導したり、免疫監視メカニズムによるある特定の新生細胞の認識を強化したりするのに活用される可能性がある。
低い抗原性、低い免疫原性を有し、及び／又は異種エピトープを含むが、例えば強力な細胞毒性、細胞内在化させる能力、及び／又は望ましい細胞内位置に効率的に経路決定する能力などの有意なレベルの志賀毒素の機能を保持する、志賀毒素Ａサブユニット由来のポリペプチドを有することが望ましいと考えられる。さらに、低い抗原性、低い免疫原性、高い安定性、低い非特異的な毒性を有し、及び／又は標的細胞のＭＨＣクラスＩ系に提示させるためにペプチド−エピトープカーゴを送達する能力を有する志賀毒素Ａサブユニット由来の要素を含む治療及び／又は診断用分子を有することが望ましいと考えられる。特定には、１）不要な抗原性及び／又は免疫原性が生じる可能性を低減しながら、２）非特異的な毒性が生じる可能性を低減しながら、及び／又は３）標的細胞のＭＨＣクラスＩ系に提示させるためにペプチド−エピトープカーゴを送達する能力を有しながら、強力な
細胞毒性を維持する志賀毒素Ａサブユニット由来の要素を含む細胞標的化分子を有することが望ましいと考えられる。
米国特許第２０１５０２５９４２８号明細書 国際公開第１９９９／０４０１８５号パンフレット 国際公開第２００５／０９２９１７号パンフレット 欧州特許第１０５１４８２号明細書 独国特許第６９８３５６９５号明細書 国際公開第２００７／０３３４９７号パンフレット 米国特許第２００９／０１５６４１７号明細書 日本特許第４３３９５１１号明細書 米国特許第７７１３９１５号明細書 欧州特許第１７２７８２７号明細書 独国特許第６０２００４０２７１６８号明細書 欧州特許第１９４５６６０号明細書 日本特許第４９３４７６１号明細書 欧州特許第２２２８３８３号明細書 米国特許第２０１３／０１９６９２８号明細書 国際公開第２０１４／１６４６８０号パンフレット 国際公開第２０１４／１６４６９３号パンフレット 国際公開第２０１５／１３８４３５号パンフレット 国際公開第２０１５／１３８４５２号パンフレット 国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット 国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット 国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット
Strebhardt K, Ullrich A, Nat Rev Cancer 8: 473-80 (2008)
本発明の志賀毒素Ａサブユニット由来の足場はそれぞれ、例えば免疫毒素及びリガンド−毒素融合体のような細胞標的化分子の要素などとしてそれらをより有用にする機構（例えば、脱免疫化された部分領域、部分領域を含む異種エピトープ、プロテアーゼ切断耐性の部分領域、及び／又はカルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフ）の組合せを含む。ある特定の本発明の組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドは、単一のポリペプチドに、例えば、細胞内在化を促進すること、サイトゾルへの細胞内経路決定を指示すること、リボソーム不活性化、及び／又は細胞のＭＨＣ Ｉクラス経路に異種Ｔ細胞エピトープを送達することなどの数々の志賀毒素エフェクター機能を提供することから、それらはより有用である。本発明のある特定の細胞標的化分子は、単一分子中に、例えば、効率的な細胞内在化、強力な細胞標的化細胞毒性、選択的な細胞毒性、脱免疫化、高い投薬量での低い非特異的な毒性、高い安定性、ＣＤ＋Ｔ細胞で過免疫化、及び／又は標的細胞のＭＨＣ Ｉクラス経路に異種Ｔ細胞エピトープを送達する能力などの数々の特性の組合せを提供することから、それらはより有用である。
番号１〜１１と番号付けされた実施形態のセットを参照しながら、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子の異なる実施形態を後述する。
実施形態セット番号１−組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含む、脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチド
本発明は、少なくとも１つの挿入された又は組み込まれた異種エピトープ（ａ）並びに少なくとも１つの破壊された内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域（ｂ）を含む、脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドであって、異種エピトープは、少なくとも１つの破壊された内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域とオーバーラップしておらず、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能を示すことができる、志賀毒素エフェクターポリペプチドを提供する（例えば、志賀毒素エフェクター１、２、及び３と標識された、この実施形態セット番号１の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドの３つの例示的な実施形態の説明に役立つ例を表示する図１を参照）。ある特定のさらなる実施形態において、異種エピトープは、細胞のＭＨＣクラスＩ分子によって提示されることが可能なＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである。ある特定のさらなる実施形態において、（ａ）における異種エピトープは、組み込まれており、志賀毒素エフェクターポリペプチドがその由来となる野生型志賀毒素ポリペプチド領域が有するのと同じアミノ酸残基総数を有するように、野生型志賀毒素ポリペプチド領域における同等の数のアミノ酸残基を置き換えている。上記したもののいずれかのある特定のさらなる実施形態において、脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ポリペプチドが存在する細胞のサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、及び細胞毒性から選択される少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能を示すことができる。
ある特定の実施形態において、本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（ｉ）組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープ、並びに（ii）組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープとオーバーラップしない、少なくとも１つの内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープの破壊を含む。ある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び／又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、異種Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープであり、例えばヒト免疫系に関するものなどである。ある特定のさらなる実施形態において、異種Ｔ細胞エピトープは、細胞のＭＨＣクラスＩ分子によって提示されることが可能である。ある特定のさらなる実施形態において、内因性Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープであり、例えばヒト免疫系に関するものなどである。
ある特定の実施形態において、本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（ｉ）組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープ、並びに（ii）組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープとオーバーラップしない、少なくとも１つの内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域の破壊を含む。ある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び／又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、異種Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープであり、例えばヒト免疫系に関するものなどである。ある特定のさらなる実施形態において、異種Ｔ細胞エピトープは、細胞のＭＨＣクラスＩ分子によって提示されることが可能である。ある特定のさらなる実施形態において、内因性Ｔ細
胞エピトープ領域は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域であり、例えばヒト免疫系に関するものなどである。
ある特定の実施形態において、本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（ｉ）組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープ、並びに（ii）組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープとオーバーラップしない、少なくとも１つの内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープの破壊を含む。ある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び／又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、異種Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープであり、例えばヒト免疫系に関するものなどである。ある特定のさらなる実施形態において、異種Ｔ細胞エピトープは、細胞のＭＨＣクラスＩ分子によって提示されることが可能である。ある特定のさらなる実施形態において、内因性Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープであり、例えばヒト免疫系に関するものなどである。
ある特定の実施形態において、本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（ｉ）組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープ、並びに（ii）組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープとオーバーラップしない、少なくとも１つの内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域の破壊を含む。ある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び／又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、異種Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープであり、例えばヒト免疫系に関するものなどである。ある特定のさらなる実施形態において、異種Ｔ細胞エピトープは、細胞のＭＨＣクラスＩ分子によって提示されることが可能である。ある特定のさらなる実施形態において、内因性Ｔ細胞エピトープ領域は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域であり、例えばヒト免疫系に関するものなどである。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２の１〜１５；配列番号３の３〜１４；配列番号３の２６〜３７；配列番号１又は配列番号２の２７〜３７；配列番号１又は配列番号２の３９〜４８；配列番号３の４２〜４８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５３〜６６；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４〜１１５；配列番号１又は配列番号２の１４１〜１５３；配列番号３の１４０〜１５６；配列番号１又は配列番号２の１７９〜１９０；配列番号３の１７９〜１９１；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５、及び配列番号３の２１０〜２１８；配列番号３の２４０〜２６０；配列番号１又は配列番号２の２４３〜２５７；配列番号１又は配列番号２の２５４〜２６８；配列番号３の２６２〜２７８；配列番号３の２８１〜２９７；配列番号１又は配列番号２の２８５〜２９３；配列番号１又は配列番号２の４〜３３；配列番号１又は配列番号２の３４〜７８；配列番号１又は配列番号２の７７〜１０３；配列番号１又は配列番号２の１２８〜１６８；配列番号１又は配列番号２の１６０〜１８３；配列番号１又は配列番号２の２３６〜２５８；及び配列番号１又は配列番号２の２７４〜２９３；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域からなる天然に位置する志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択されるＢ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域中の、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する変異を含む。ある特定のさらなる実施形態において、少
なくとも１つの破壊された内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ及び／又はエピトープ領域の一部又は全てとオーバーラップするアミノ酸残基のカルボキシ末端のトランケーションである破壊は存在しない。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、天然に位置する志賀毒素Ａサブユニットのアミノ酸残基の群：Ｌ４９、Ｄ１９７、Ｄ１９８、Ｒ２０４、及びＲ２０５から選択されるＢ細胞の免疫原性のアミノ酸残基において、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する変異を含む。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープは、（ｉ）配列番号１又は配列番号２の１〜１５；配列番号３の３〜１４；配列番号３の２６〜３７；配列番号１又は配列番号２の２７〜３７；配列番号１又は配列番号２の３９〜４８；配列番号３の４２〜４８；及び配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５３〜６６；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域であって、少なくとも１つの破壊されたエピトープ領域の一部又は全てとオーバーラップする配列のアミノ末端のトランケーションである破壊は存在しない、領域；（ii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４〜１１５；配列番号１又は配列番号２の１４１〜１５３；配列番号３の１４０〜１５６；配列番号１又は配列番号２の１７９〜１９０；配列番号３の１７９〜１９１；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；及び配列番号３の２１０〜２１８；並びに（iii）配列番号３の２４０
〜２６０；配列番号１又は配列番号２の２４３〜２５７；配列番号１又は配列番号２の２５４〜２６８；配列番号３の２６２〜２７８；配列番号３の２８１〜２９７；及び配列番号１又は配列番号２の２８５〜２９３；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域からなる天然に位置する志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択される、内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域を破壊させる。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（ｉ）配列番号１又は配列番号２の１〜１５；配列番号３の３〜１４；配列番号３の２６〜３７；配列番号１又は配列番号２の２７〜３７；配列番号１又は配列番号２の３９〜４８；配列番号３の４２〜４８；及び配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５３〜６６；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域であって、少なくとも１つの破壊されたエピトープ領域の一部又は全てとオーバーラップする配列のアミノ末端のトランケーションである破壊は存在しない、領域；（ii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４〜１１５；配列番号１又は配列番号２の１４１〜１５３；配列番号３の１４０〜１５６；配列番号１又は配列番号２の１７９〜１９０；配列番号３の１７９〜１９１；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；及び配列番号３の２１０〜２１８；並びに（iii）配列番号３の２４０〜２６０；配列
番号１又は配列番号２の２４３〜２５７；配列番号１又は配列番号２の２５４〜２６８；配列番号３の２６２〜２７８；配列番号３の２８１〜２９７；及び配列番号１又は配列番号２の２８５〜２９３；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域であって、少なくとも１つの破壊されたエピトープ領域の一部又は全てとオーバーラップする配列のアミノ末端のトランケーションである破壊は存在しない、領域からなる天然に位置する志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択されるＢ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域中の、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する変異を含む。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４〜１１５；配列番号１又は配列番号２の１４１〜１５３；配列番号３の１４０〜１５６；配列番号１又は配列番号２の１７９〜１９０；配列番号３の１７９〜１９１；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；又は配列番号３の２１０〜２１８からなる天然に位置する志賀毒素Ａサ
ブユニットの群から選択される少なくとも１つの内因性エピトープ領域の破壊を含む。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、異種のＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞エピトープを含まない。ＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞エピトープは当業界において公知であるか、又は熟練者であれば予測が可能である。異種という用語は、野生型志賀毒素Ａサブユニット、例えば目的の志賀毒素エフェクターポリペプチドに最も密接に関連する野生型志賀毒素Ａサブユニットなどに天然に存在しないＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞エピトープを指す。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又は９つ以上の内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域の破壊を含む。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、１つ又は２つ以上の破壊は、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対するアミノ酸残基の置換を含む。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、１つ又は２つ以上の内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域は、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する複数のアミノ酸残基の置換を含む。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの破壊は、内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域中の、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する複数のアミノ酸残基の置換を含む。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、少なくとも１つの破壊は、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又は９つ以上のアミノ酸残基の置換を含み、少なくとも１つの置換は、配列番号１又は配列番号２の１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の６；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１２；配列番号１又は配列番号２の３３；配列番号１又は配列番号２の４３；配列番号１又は配列番号２の４４；配列番号１又は配列番号２の４５；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４６；配列番号１又は配列番号２の４７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４９；配列番号１又は配列番号２の５０；配列番号１又は配列番号２の５１；配列番号１又は配列番号２の５３；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５４；配列番号１又は配列番号２の５５；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５６；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５９；配列番号１又は配列番号２の６０；配列番号１又は配列番号２の６１；配列番号１又は配列番号２の６２；配列番号１又は配列番号２の８４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の８８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９６；配列番号１又は配列番号２の１０４；配列番号１又は配列番号２の１０５；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１０７；配列番号１又は配列番号２の１０８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１０９；配列番号１又は配列番号２の１１０；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１２；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１４１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１４７；配列番号１又は配列番号２の１５４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１７９；配列番号１又は配列番号２の１８０；配列番号１又は配列番号２の１８１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８３；配
列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８４；配列番号１又は配列番号２の１８５；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８６；配列番号１又は配列番号２の１８７；配列番号１又は配列番号２の１８８；配列番号１又は配列番号２の１８９；配列番号３の１９７；配列番号１又は配列番号２の１９８；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；配列番号１又は配列番号２の２４７；配列番号３の２４７；配列番号１又は配列番号２の２４８；配列番号３の２５０；配列番号１又は配列番号２の２５１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の２６４；配列番号１又は配列番号２の２６５；及び配列番号１又は配列番号２の２８６；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当するアミノ酸残基からなる群から選択される天然に位置する志賀毒素Ａサブユニットのアミノ酸残基で生じていてもよい。ある特定のさらなる実施形態において、少なくとも２つの破壊はそれぞれ、配列番号１又は配列番号２の１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１；配列番号１又は配列番号２の３３；配列番号１又は配列番号２の４３；配列番号１又は配列番号２の４５；配列番号１又は配列番号２の４７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４８；配列番号１又は配列番号２の４９；配列番号１又は配列番号２の５３；配列番号１又は配列番号２の５５；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５９；配列番号１又は配列番号２の６０；配列番号１又は配列番号２の６１；配列番号１又は配列番号２の６２；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９６；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１０９；配列番号１又は配列番号２の１１０；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１２；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１４７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１７９；配列番号１又は配列番号２の１８０；配列番号１又は配列番号２の１８１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８３；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８４；配列番号１又は配列番号２の１８５；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８６；配列番号１又は配列番号２の１８７；配列番号１又は配列番号２の１８８；配列番号１又は配列番号２の１８９；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；配列番号１又は配列番号２の２４７；配列番号３の２４７；配列番号３の２５０；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の２６４；配列番号１又は配列番号２の２６５；及び配列番号１又は配列番号２の２８６；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当するアミノ酸残基からなる群から選択される、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を含む。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（ｉ）配列番号１又は配列番号２の１〜１５；配列番号３の３〜１４；配列番号３の２６〜３７；配列番号１又は配列番号２の２７〜３７；配列番号１又は配列番号２の３９〜４８；配列番号３の４２〜４８；及び配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５３〜６６、又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域であって、少なくとも１つの破壊された内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域の一部又は全てとオーバーラップするアミノ酸残基のアミノ末端のトランケーションである破壊は存在しない、領域；（ii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４〜１１５；配列番号１又は配列番号２の１４１〜１５３；配列番号３の１４０〜１５６；配列番号１又は配列番号２の１７９〜１９０；配列番号３の１７９〜１９１；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；及び配列番号３の２１０〜２１８；並びに（iii）配列番号３の２４０〜２６０；配列番号１又は配列番号２の２４３〜２５７；配列番
号１又は配列番号２の２５４〜２６８；配列番号３の２６２〜２７８；配列番号３の２８１〜２９７；及び配列番号１又は配列番号２の２８５〜２９３；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域であって、少なくとも１つの破壊された内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ及び／又はエピトープ領域の一部又は全てと
オーバーラップするアミノ酸残基のカルボキシ末端のトランケーションである破壊は存在しない、領域からなる群から選択される少なくとも３つの内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域の破壊を含む。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも２つの内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域の破壊を含み、各破壊は、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の置換を含み、内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域は、配列番号３の３〜１４；配列番号３の２６〜３７；配列番号１又は配列番号２の２７〜３７；配列番号１又は配列番号２の３９〜４８；配列番号３の４２〜４８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５３〜６６；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域からなる天然に位置する志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択される。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープは、本明細書に記載されるいかなる内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域も破壊しない。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、少なくとも１つの破壊は、ＤからＡ、ＤからＧ、ＤからＶ、ＤからＬ、ＤからＩ、ＤからＦ、ＤからＳ、ＤからＱ、ＤからＭ、ＤからＲ、ＥからＡ、ＥからＧ、ＥからＶ、ＥからＬ、ＥからＩ、ＥからＦ、ＥからＳ、ＥからＱ、ＥからＮ、ＥからＤ、ＥからＭ、ＥからＲ、ＦからＡ、ＦからＧ、ＦからＶ、ＦからＬ、ＦからＩ、ＧからＡ、ＧからＰ、ＨからＡ、ＨからＧ、ＨからＶ、ＨからＬ、ＨからＩ、ＨからＦ、ＨからＭ、ＩからＡ、ＩからＶ、ＩからＧ、ＩからＣ、ＫからＡ、ＫからＧ、ＫからＶ、ＫからＬ、ＫからＩ、ＫからＭ、ＫからＨ、ＬからＡ、ＬからＶ、ＬからＧ、ＬからＣ、ＮからＡ、ＮからＧ、ＮからＶ、ＮからＬ、ＮからＩ、ＮからＦ、ＰからＡ、ＰからＧ、ＰからＦ、ＲからＡ、ＲからＧ、ＲからＶ、ＲからＬ、ＲからＩ、ＲからＦ、ＲからＭ、ＲからＱ、ＲからＳ、ＲからＫ、ＲからＨ、ＳからＡ、ＳからＧ、ＳからＶ、ＳからＬ、ＳからＩ、ＳからＦ、ＳからＭ、ＴからＡ、ＴからＧ、ＴからＶ、ＴからＬ、ＴからＩ、ＴからＦ、ＴからＭ、ＴからＳ、ＶからＡ、ＶからＧ、ＹからＡ、ＹからＧ、ＹからＶ、ＹからＬ、ＹからＩ、ＹからＦ、ＹからＭ、及びＹからＴからなる群から選択される、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の置換を含む。ある特定のさらなる実施形態において、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の置換は、ＤからＡ、ＤからＧ、ＤからＶ、ＤからＬ、ＤからＩ、ＤからＦ、ＤからＳ、ＤからＱ、ＥからＡ、ＥからＧ、ＥからＶ、ＥからＬ、ＥからＩ、ＥからＦ、ＥからＳ、ＥからＱ、ＥからＮ、ＥからＤ、ＥからＭ、ＥからＲ、ＧからＡ、ＨからＡ、ＨからＧ、ＨからＶ、ＨからＬ、ＨからＩ、ＨからＦ、ＨからＭ、ＫからＡ、ＫからＧ、ＫからＶ、ＫからＬ、ＫからＩ、ＫからＭ、ＫからＨ、ＬからＡ、ＬからＧ、ＮからＡ、ＮからＧ、ＮからＶ、ＮからＬ、ＮからＩ、ＮからＦ、ＰからＡ、ＰからＧ、ＰからＦ、ＲからＡ、ＲからＧ、ＲからＶ、ＲからＬ、ＲからＩ、ＲからＦ、ＲからＭ、ＲからＱ、ＲからＳ、ＲからＫ、ＲからＨ、ＳからＡ、ＳからＧ、ＳからＶ、ＳからＬ、ＳからＩ、ＳからＦ、ＳからＭ、ＴからＡ、ＴからＧ、ＴからＶ、ＴからＬ、ＴからＩ、ＴからＦ、ＴからＭ、ＴからＳ、ＹからＡ、ＹからＧ、ＹからＶ、ＹからＬ、ＹからＩ、ＹからＦ、及びＹからＭからなる群から選択される。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、破壊の少なくとも１つは、Ｋ１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ及びＨ；Ｔ４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ及びＲ；Ｓ８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｋ１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ及びＨ；Ｔ１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、Ｓ、及びＫ；Ｓ１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｓ３３からＡ
、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＣ；Ｓ４３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４４からＡ又はＬ；Ｓ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｔ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４６からＡ及びＰ；Ｄ４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｍ、及びＱ；Ｎ４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｍ及びＦ；Ｌ４９からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｙ４９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＴ；Ｆ５０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、及びＴ；Ａ５１；Ｄ５３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｖ５４からＡ、Ｇ、Ｉ、及びＬ；Ｒ５５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｇ５６からＡ及びＰ；Ｉ５７からＡ、Ｇ、Ｖ、及びＭ；Ｌ５７からＡ、Ｖ、Ｃ、Ｇ、Ｍ、及びＦ；Ｄ５８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｐ５９からＡ、Ｇ、及びＦ；Ｅ６０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、Ｔ、及びＲ；Ｅ６１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、及びＲ；Ｇ６２からＡ；Ｒ８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｖ８８からＡ及びＧ；Ｉ８８からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｄ９４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｓ９６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ；及びＮ；Ａ１０５からＬ；Ｔ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＰ；Ｓ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＰ；Ｌ１０８からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｓ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｇ１１０からＡ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、及びＴ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１４１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ１４７からＡ；Ｖ１５４からＡ及びＧ。Ｒ１７９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｔ１８０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｔ１８１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ１８３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｌ１８５からＡ、Ｇ、Ｖ及びＣ；Ｓ１８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｇ１８７からＡ；Ｒ１８８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｓ１８９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１９７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１９８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｒ２０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２０５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ及びＨ；Ｓ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｙ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｒ２４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｄ２６４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ２６４からＡ；並びにＴ２８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳからなる群から選択される、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の置換を含む。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、組み込まれた又は挿入された異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープとオーバーラップしない少なくとも１つの内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域の破壊をさらに含む配列番号３５５〜３６９のいずれか１つに示されるポリペプチドから本質的になる。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号６〜３２、３４０〜３５４、及び３７０〜４３８のいずれか１つに示されるポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（ｉ）野生型志賀毒素Ａ１断片又は野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドと同程度の触媒活性レベル、（ii）半数阻害濃度（ＩＣ５０）値が１０，０００ピコモーラー（molar）以下のリボソーム阻害活性、及び／又は（iii）有意なレベルの志賀毒素の触媒活性を示すことができる。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドと同程度の細胞内経路決定効率を示すことができ、及び／又は細胞のエンドソーム開始位置から小胞体及び／又はサイトゾルへの有意なレベルの細胞内の経路決定活性を示すことができる。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、初期エンドソーム区画から志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞のＭＨＣクラスＩ分子への組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープの細胞内の送達が可能である。ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、細胞内の送達に加えて、１つ又は２つ以上の志賀毒素エフェクター機能、例えば、細胞内在化を促進すること、サイトゾルへの細胞内経路決定を指示すること、リボソーム不活性化、カスパーゼ活性を誘導すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞死を引き起こすことなどの志賀毒素エフェクター機能を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、異種Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、例えばヒト免疫系に関するものなどである。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４〜１１５；配列番号１又は配列番号２の１４１〜１５３；配列番号３の１４０〜１５６；配列番号１又は配列番号２の１７９〜１９０；配列番号３の１７９〜１９１；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；又は配列番号３の２１０〜２１８からなる天然に位置する志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択される少なくとも２つの内因性エピトープ領域の破壊を含み、破壊は、配列番号１又は配列番号２のＳ９６Ｙ；配列番号１又は配列番号２のＹ１１４Ｓ；配列番号１又は配列番号２のＲ１７９Ａ；配列番号１又は配列番号２のＲ１７９Ｈ；配列番号１又は配列番号２のＬ１８５Ａ；配列番号１又は配列番号２のＲ１８８Ａ；配列番号１又は配列番号２のＲ２０５Ａ；配列番号１又は配列番号２のＲ１７９Ａ／Ｒ１８８Ａ；又は配列番号３のＡ１８８Ｖからなる群から選択されるアミノ酸残基の置換だけからなるものではない。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２の１〜１５；配列番号３の３〜１４；配列番号３の２６〜３７；配列番号１又は配列番号２の２７〜３７；配列番号１又は配列番号２の３９〜４８；配列番号３の４２〜４８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５３〜６６からなる天然に位置する志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択される少なくとも１つの内因性エピトープ領域において少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含む破壊を含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、上述の破壊されたエピトープ領域とオーバーラップするアミノ末端のトランケーションを含まない。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２の１〜１５；配列番号３の３〜１４；配列番号３の２６〜３７；配列番号１又は配列番号２の２７〜３７；配列番号１又は配列番号２の３９〜４８；配列番号３の４２〜４８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５３〜６６からなる天然に位置する志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択される少なくとも２つの内因性エピトープ領域において少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含む破壊を含み、破壊は、配列番号１又は配列番号２のＲ６３Ｗのアミノ酸残基の置換だけからなるものではなく、さらに志賀毒素エフェクター領域は、上述の２つの破壊されたエピトープ領域とオーバーラップするアミノ末端のトランケーションを含まない。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号３の２４０〜２６０；配列番号１又は配列番号２の２４３〜２５７；配
列番号１又は配列番号２の２５４〜２６８；配列番号３の２６２〜２７８；配列番号３の２８１〜２９７；及び配列番号１又は配列番号２の２８５〜２９３からなる天然に位置する志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択される少なくとも１つの内因性エピトープ領域において少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含む破壊を含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、上述の破壊されたエピトープ領域とオーバーラップするカルボキシ末端のトランケーションを含まない。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号３の２４０〜２６０；配列番号１又は配列番号２の２４３〜２５７；配列番号１又は配列番号２の２５４〜２６８；配列番号３の２６２〜２７８；配列番号３の２８１〜２９７；及び配列番号１又は配列番号２の２８５〜２９３からなる天然に位置する志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択される少なくとも２つの内因性エピトープ領域における少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含む破壊を含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のＲ２４８Ｈ；配列番号１又は配列番号２のＡ２５０Ｖ；配列番号１又は配列番号２のＲ２５１Ｈ；配列番号１又は配列番号２のＡ２５３Ｇ；配列番号１又は配列番号２のＳ２５４Ｔ；配列番号１又は配列番号２のＣ２６１Ａ；配列番号１又は配列番号２のＲ２８９Ｋ；配列番号１又は配列番号２のＲ２４８Ｈ及びＲ２５１Ｈ；配列番号１又は配列番号２のＡ２５３Ｇ及びＳ２５４Ｔ；配列番号１のＳ２４７〜Ｍ２５２；配列番号３のＳ２４６Ｆ；配列番号３のＡ２８２Ｖ；配列番号３のＩ２９１Ｖ；配列番号３Ｓ２４６Ｆの欠失からなる群から選択される変異を含まず、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、上述した２つの破壊されたエピトープ領域とオーバーラップするカルボキシ末端のトランケーションを含まない。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号６〜２７、２９〜３２、３４０〜３５４、及び３７０〜４３８のいずれか１つに示されるポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチドの酵素活性を変化させる、志賀毒素ファミリーのメンバーの天然に存在するＡサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含み、変異が、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換から選択される。ある特定のさらなる実施形態において、天然に存在するＡサブユニットに対する変異は、志賀毒素エフェクターポリペプチドの細胞毒性活性を低減又は除去するが、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば細胞内在化を促進すること、及び／又はある特定の細胞内の区画への細胞内の経路決定を指示することなどの少なくとも１つの他の志賀毒素エフェクター機能を保持する。ある特定のさらなる実施形態において、天然に存在するＡサブユニットに対する変異は、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、例えば、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３におけるＡ２３１Ｅ、Ｒ７５Ａ、Ｙ７７Ｓ、Ｙ１１４Ｓ、Ｅ１６７Ｄ、Ｒ１７０Ａ、Ｒ１７６Ｋ、及び／又はＷ２０３Ａなどから選択される。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（ｉ）カルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片由来の領域、及び（ii）Ａ１断片領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン（furin）切断モチーフを含む。あ
る特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含み、変異は、志賀様毒素１のＡサブユニット（配列番号１）若しくは志賀毒素のＡサブユニット（配列番号２）の２４８〜２５１、又は志賀様毒素のＡサブユニット（配列番号３）の２４７〜２５０；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域における天然に位置する領域で、少なくとも１つのアミノ酸残基を変更する。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断モチーフの最小のフーリン切断部
位中に、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含む。ある特定のさらなる実施形態において、最小のフーリン切断部位は、コンセンサスアミノ酸配列Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ及び／又はＲ−ｘ−ｘ−Ｒによって表される。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（ｉ）カルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片由来の領域、及び（ii）Ａ１断片領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含む。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換を含む。ある特定のさらなる実施形態において、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換は、アラニン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンからなる群から選択される正電荷を有さないアミノ酸残基でのアルギニン残基の置換である。ある特定の実施形態において、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換は、ヒスチジンでのアルギニン残基の置換である。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、単独で又は第１の細胞標的化分子の構成要素としてのいずれかで、細胞に導入された場合、野生型志賀毒素Ａ１ポリペプチド、及び／又はその志賀毒素エフェクターポリペプチド構成要素の全てがそれぞれ野生型志賀毒素Ａ１断片を含むことを除いた第１の細胞標的化分子からなる第２の細胞標的化分子の細胞毒性と同程度の細胞毒性を示すことができる。
実施形態セット番号１の志賀毒素エフェクターポリペプチドのある特定の実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む本発明の細胞標的化分子は、脊索動物に導入された場合、その志賀毒素エフェクターポリペプチド要素の全てがそれぞれ、そのＡ１断片領域のカルボキシ末端に野生型志賀毒素Ａ１断片及び／又は野生型志賀毒素のフーリン切断部位を含むことを除いた第１の細胞標的化分子からなる第２の細胞標的化分子と比較してインビボ忍容性（tolerability）の改善を示すことができる。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸７５〜２５１由来の志賀毒素エフェクター領域を含む。
実施形態セット番号１のある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２４１由来の志賀毒素エフェクター領域を含む。ある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクター領域は、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２５１に由来する。ある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクター領域は、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２６１に由来する。
実施形態セット番号２−組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープ及びオーバーラップしない脱免疫化された部分領域を含む脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子
本発明は、それぞれ（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、及び（ii）実施形態セット番号１の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子を提供する（例えば、この実施形態セット番号２の細胞標的化分子の４つの例示的な実施形態の説明に役立つ例を表示する図１を参照）。例えば、ある特定の実施形態のセット番号２は、（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、並びに（ii）少なくとも１つの挿入された又は組み込まれた異種エピトー
プ（ａ）及び少なくとも１つの破壊された内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域（ｂ）を含む、脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドであって、異種エピトープは、組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープとオーバーラップしない、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子である。ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び／又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、異種Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、例えばヒト免疫系に関するものなどである。ある特定のさらなる実施形態に関して、異種Ｔ細胞エピトープは、細胞のＭＨＣクラスＩ分子によって提示されることが可能である。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に入ること、リボソーム機能を阻害すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、細胞死を引き起こすこと、及び／又は細胞表面上での提示のために組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープをＭＨＣクラスＩ分子に送達することのうち１つ又は２つ以上が可能である。ある特定のさらなる実施形態に関して、細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、参照分子、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド要素の全てがそれぞれ野生型志賀毒素Ａ１断片を含むことを除く細胞標的化分子からなる第２の細胞標的化分子などと同程度か又はそれより優れた細胞毒性を示すことができる。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態に関して、細胞標的化分子は、カルボキシ末端を志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に位置させた分子部分を含む。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、脊索動物に導入された場合、参照分子、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド要素の全てがそれぞれ、そのＡ１断片領域のカルボキシ末端に野生型志賀毒素Ａ１断片及び／又は野生型志賀毒素のフーリン切断部位を含むことを除く細胞標的化分子からなる第２の細胞標的化分子などと比較してインビボ忍容性及び／又は安定性の改善を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは細胞毒性ではなく、分子部分は細胞毒性である。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態において、結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドは、直接的又は間接的のいずれかで一緒に連結されている。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態において、結合領域は、免疫グロブリン型の結合領域を含むポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、自律的なＶＨドメイン、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、ナノボディ、ラクダ科動物由来の重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ又はＶＨドメイン断片）、軟骨魚類由来の重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ又はＶＨドメイン断片）、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、ＶＮＡＲ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗体可変断片（Ｆｖ）、相補性決定領域３断片（ＣＤＲ３）、拘束ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ポリペプチド（ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）、Ｆｄ断片、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）ドメイン、抗原結合断片（Ｆａｂ）、アルマジロ反復ポリペプチド（ＡｒｍＲＰ）、フィブロネクチン由来第１０フィブロネクチンIII型ドメイン（１０Ｆｎ３）、テネイシンIII型ドメイン（ＴＮｆｎ３）、アンキリン反復モチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Ａドメイン（ＬＤＬＲ−Ａ）、リポカリン（アンチカリン）、クニッツドメイン、プロテインＡ由来Ｚドメイン、ガンマ−Ｂ結晶由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Ｓａｃ７ｄ由来ポリペプチド（アフィチン）、Ｆｙｎ由来ＳＨ２ドメイン、ミニタンパク質、Ｃ型レクチン様ドメイン足場、改変抗体模倣物、及び結合機能を保持する前述のもののいずれかのあらゆる遺伝子操作された対応物からなる群から選択されるポリペプチドを含む。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、（ｉ）野生型志賀毒素Ａ１断片又は野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドと同程度の触媒活性レベル、（ii）半数阻害濃度（ＩＣ５０）値が１０，０００ピコモーラー以下のリボソーム阻害活性、及び／又は（iii）有意なレベルの志賀毒素の触媒活性を示すことが
できる。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子及び／又はその志賀毒素エフェクターポリペプチドは、野生型志賀毒素Ａ１断片又は野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む参照細胞標的化分子と同程度の細胞内経路決定効率を示すことができ、及び／又は細胞のエンドソーム開始位置から小胞体及び／又はサイトゾルへの有意なレベルの細胞内の経路決定活性を示すことができる。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態に関して、細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞に本発明の細胞標的化分子を投与することにより、細胞標的化分子は、細胞の死滅を引き起こすことが可能である。ある特定のさらなる実施形態において、細胞外標的生体分子の存在又はレベルに関して異なる、２種の異なる細胞型の集団に本発明の細胞標的化分子を投与することにより、細胞標的化分子は、細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合していない細胞型に対するＣＤ５０の少なくとも３倍又はそれ未満のＣＤ５０で、細胞毒性細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞型に細胞死をもたらすことが可能である。ある特定の実施形態に関して、そのメンバーが細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子に結合している第１の細胞集団、及びそのメンバーが結合領域のいずれの細胞外標的生体分子にも物理的に結合していない第２の細胞集団に本発明の細胞標的化分子を投与することにより、前記第１の細胞集団のメンバーに対する細胞標的化分子の細胞毒性効果が、前記第２の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果に比べて少なくとも３倍大きい。ある特定の実施形態に関して、そのメンバーが有意な量の細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子に結合している第１の細胞集団、及びそのメンバーが有意な量の結合領域のいずれの細胞外標的生体分子にも物理的に結合していない第２の細胞集団に本発明の細胞標的化分子を投与することにより、前記第１の細胞集団のメンバーに対する細胞標的化分子の細胞毒性効果が、前記第２の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果に比べて少なくとも３倍大きい。ある特定の実施形態に関して、第１の標的生体分子陽性細胞集団、及びそのメンバーが細胞表面において有意な量の細胞標的化分子の結合領域の標的生体分子を発現しない第２の細胞集団に本発明の細胞標的化分子を投与することにより、第１の細胞集団のメンバーに対する細胞標的化分子の細胞毒性効果が、第２の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果に比べて少なくとも３倍大きい。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、半数阻害濃度（ＣＤ５０）値が３００ｎＭ以下の細胞毒性を示すことができる、及び／又は有意なレベルの志賀毒素の細胞毒性を示すことができる。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、ＭＨＣクラスＩ分子によって結合したエピトープの細胞表面提示のために、細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に、組み込まれた又は挿入された異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達することが可能である。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端と会合した分子部分を含む。ある特定の実施形態において、分子部分は、結合領域を含むか又はからなる。ある特定の実施形態において、分子部分は、少なくとも１つのアミノ酸を含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドは
、分子部分の少なくとも１つのアミノ酸残基に連結されている。ある特定のさらなる実施形態において、分子部分及び志賀毒素エフェクターポリペプチドは融合されて、連続的なポリペプチドを形成している。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端と会合した細胞毒性分子部分をさらに含む。ある特定の実施形態に関して、細胞毒性分子部分は、細胞毒性剤、例えば、熟練者公知の及び／又は本明細書に記載される、低分子化学療法剤、抗新生物剤、細胞毒性抗生物質、アルキル化剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、及び／又はチューブリン阻害剤などである。ある特定のさらなる実施形態に関して、細胞毒性分子部分は、１０，０００、５，０００、１，０００、５００、又は２００ｐＭ未満の濃度で細胞毒性である。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態において、結合領域は、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ２、前立腺特異的膜抗原、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤＣＰ１、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、ルイス−Ｙ、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通型受容体（ＲＯＲ１又はＮＴＲＫＲ１）、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合タンパク質、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドルイス−Ｙ２、ＶＥＧＦＲ、アルファＶベータ３、アルファ５ベータ１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、Ｅｒｂ３、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫ、ＦＡＰ、テネイシン、ＣＤ６４、メソテリン、ＢＲＣＡ１、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、ベータ−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ６、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパルチル（アスパラギニル）ベータ−ヒドロキシラーゼ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ−３、ＭＵＣ１、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ関連抗原、ＨＰＶ−Ｅ７、エプスタイン−バーウイルス抗原、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、アルファ−フェトプロテイン抗原、１７−Ａ１、膀胱腫瘍抗原、ＣＤ３８、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ４５（タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｃ型）、ＣＤ５３、ＣＤ８８、ＣＤ１２９、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１、ＣＤ１９３、ＣＤ２４４、ＣＤ２９４、ＣＤ３０５、Ｃ３ＡＲ、ＦｃｅＲＩａ、ガレクチン−９、ＩＬ−１Ｒ（インターロイキン−１受容体）、ｍｒｐ−１４、ＮＫＧ２Ｄリガンド、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、シグレック−８、シグレック−１０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ１２３、ＴＬＲ４、ＦｃｅＲＩａ、ＩｇＥ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＩＬＴ−３、ガレクチン−３、ＣＤ１１ａ−ｃ、ＧＩＴＲＬ、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスII分子（ペプチドと複合体化していてもよい）、ＣＤ２８４（ＴＬＲ４）、ＣＤ１０７−Ｍａｃ３、ＣＤ１９５（ＣＣＲ５）、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６／３２、ＣＤ２８２（ＴＬＲ２）、ＣＤ１１ｃ、及び前述のもののいずれかのあらゆる免疫原性断片からなる群から選択される細胞外標的生体分子に結合することができる。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態において、結合領域は、直接的又は間接的のいずれかで、ジスルフィド結合ではない少なくとも１つの共有結合により志賀毒素エフェクターポリペプチドに連結されている。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、直接的又は間接的のいずれかで、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端に融合されて、単一の連続的なポリペプチドを形成している。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、免疫グロブリン型の結合領域である。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小のフーリン切断部位中に、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含む。ある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小のフーリン切断部位の少なくとも１つのアミノ酸残基の一部又は全てとオーバーラップする配列のアミノ末端のトランケーションではない。ある特定の実施形態において、最小のフーリン切断部位中の変異は、フーリン切断モチーフＲ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ中の少なくとも１つのアミノ酸残基のアミノ酸欠失、挿入、及び／又は置換である。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する少なくとも１つの変異を含み、前記変異は、１）志賀様毒素１のＡサブユニット（配列番号１）若しくは志賀毒素のＡサブユニット（配列番号２）の２４８〜２５１、又は２）志賀様毒素２のＡサブユニット（配列番号３）の２４７〜２５０、若しくはあらゆる志賀毒素Ａサブユニットにおいて相当するアミノ酸配列配置における天然に位置する領域中で、少なくとも１つのアミノ酸残基を変更する。ある特定のさらなる実施形態において、変異は、正電荷を有さないアミノ酸残基でのアルギニン残基のアミノ酸残基置換である。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、参照分子、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド要素の全てがそれぞれ野生型志賀毒素Ａ１断片を含むことを除く細胞標的化分子からなる第２の細胞標的化分子などの細胞毒性と同程度の細胞毒性を示すことができる。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態において、結合領域は、配列番号８３〜３３９のいずれか１つに示されるペプチド又はポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、配列番号３３、６４、及び６５のいずれか１つのアミノ酸１〜２４５；配列番号４０又は配列番号８０の２６９〜５１３；配列番号３６、６６、及び６７のいずれか１つのアミノ酸２６９〜５２０又は２６９〜５２１；配列番号４７〜１１９及び１７６〜２４８のいずれか１つのアミノ酸１〜２３２、１〜２３３、１〜２３４、１〜２３５、１〜２３６、１〜２４２、１〜２４３、１〜２４４、１〜２４５、１〜２４６、１〜２５２、１〜２５３、１〜２５４、１〜２５５、又は１〜２５６；配列番号３７〜３９、６８〜７９、及び８１のいずれか１つのアミノ酸２６９〜４９８又は２６９〜４９９；配列番号３４、３５、４１〜５６、及び８２のいずれか１つのアミノ酸２６９〜４９９、２６９〜５１２、２６９〜５１３、又は２８０〜５１０のいずれかによって表されるポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、配列番号４３〜６２、６４〜８２、及び４３９〜５１３のいずれか１つに示されるポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態において、結合領域は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態において、分子部分は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。ある特定のさらなる実施形態において、分子部分は、結合領域を含む。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、カルボキシ末端を志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に位置させた結合領域及び／又は分子部分を含む。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域及び／又は分子部分の質量は、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０
ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａであるか、又はそれより大きい。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、細胞標的化分子が本明細書で言及される適切なレベルの志賀毒素生物活性（例えば、細胞毒性及び／又は細胞内の経路決定）を保持する限り、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａであるか、又はそれより大きい質量を有する結合領域を含む。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態において、結合領域は、細胞標的化分子が本明細書で言及される適切なレベルの志賀毒素生物活性を保持する限り、例えば、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａであるか、又はそれより大きい質量を有する分子部分を含む、相対的に大きい分子部分内に含まれる。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端は、細胞標的化分子のポリペプチド要素のアミノ末端にある、及び／又はその近位にある。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドと比べて、細胞標的化分子のアミノ末端の近位に位置していない。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドは、結合領域が志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の近位に位置しないように、細胞標的化分子内に物理的に配列又は配向されている。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、細胞標的化分子内において、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端より志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端の近位に位置する。ある特定のさらなる実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、アミノ末端を有し、さらに結合領域と第３の細胞標的化分子のアミノ末端に又はその近位に配置されていない志賀毒素エフェクターポリペプチドとを含む、第３の細胞標的化分子の細胞毒性より大きい細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、よりよく最適化された細胞毒性効力を有する細胞毒性、例えば第３の細胞標的化分子の細胞毒性と比較して４倍、５倍、６倍、９倍、又はそれより大きい細胞毒性を表す。ある特定のさらなる実施形態に関して、標的陽性細胞集団に対する本発明の細胞標的化分子の細胞毒性は、ＣＤ５０値によってアッセイした場合、第２の標的陽性細胞集団に対する第３の細胞標的化分子の細胞毒性の、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍であるか、又はそれより大きい。ある特定のさらなる実施形態において、第３の細胞標的化分子は、ＫＤＥＬファミリーのいずれのカルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフも含まない。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端は、細胞標的化分子のポリペプチド要素のアミノ末端にある、及び／又はその近位にある。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドと比べて、細胞標的化分子のアミノ末端の近位に位置していない。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドは、結合領域が志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の近位に位置しないように、細胞標的化分子内に物理的に配列又は配向されている。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、細胞標的化分子内において、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端より志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端の近位に位置する。ある特定のさらなる実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、細胞毒性ではなく、細胞に導入された場合、アミノ末端を有し、さらに結合領域と第３の細胞標的化分子のアミノ末端に又はその近位に配置されていない志賀毒素エフェクターポリペプチドとを含む、第３の細胞標的化分子の細胞内経路決定効率と比較してより大きい細胞外空間から小胞体及び／又はサイトゾルの細胞内区画への細胞内経路決定効率を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、第３の細胞標的化分子は、ＫＤＥＬファミリーのいずれのカルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフも含まない。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端は、細胞標的化分子のポリペプチド要素のアミノ末端にある、及び／又はその近位にある。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドと比べて、細胞標的化分子のアミノ末端の近位に位置していない。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドは、結合領域が志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の近位に位置しないように、細胞標的化分子内に物理的に配列又は配向されている。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、細胞標的化分子内において、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端より志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端の近位に位置する。ある特定のさらなる実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、低い細胞毒性効力を表し（すなわちある特定の陽性標的細胞型に導入された場合、１０００ｎＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、又は５０ｎＭの細胞標的化分子濃度で細胞集団の１％細胞死より大きい細胞毒性を示すことができない）、細胞に導入された場合、アミノ末端を有し、さらに結合領域と第３の細胞標的化分子のアミノ末端に又はその近位に配置されていない志賀毒素エフェクターポリペプチドとを含む、第３の細胞標的化分子の細胞内経路決定効率と比較してより大きい細胞外空間から小胞体及び／又はサイトゾルの細胞内区画への細胞内経路決定効率を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、第３の細胞標的化分子は、ＫＤＥＬファミリーのいずれのカルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフも含まない。
実施形態セット番号２のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子、又はそれらのポリペプチド要素は、ＫＤＥＬファミリーのメンバーのカルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフを含む。ある特定のさらなる実施形態に関して、カルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＦ、ＨＤＥＬ、ＲＤＥＦ、ＲＤＥＬ、ＷＤＥＬ、ＹＤＥＬ、ＨＥＥＦ、ＨＥＥＬ、ＫＥＥＬ、ＲＥＥＬ、ＫＡＥＬ、ＫＣＥＬ、ＫＦＥＬ、ＫＧＥＬ、ＫＨＥＬ、ＫＬＥＬ、ＫＮＥＬ、ＫＱＥＬ、ＫＲＥＬ、ＫＳＥＬ、ＫＶＥＬ、ＫＷＥＬ、ＫＹＥＬ、ＫＥＤＬ、ＫＩＥＬ、ＤＫＥＬ、ＦＤＥＬ、ＫＤＥＦ、ＫＫＥＬ、ＨＡＤＬ、ＨＡＥＬ、ＨＩＥＬ、ＨＮＥＬ、ＨＴＥＬ、ＫＴＥＬ、ＨＶＥＬ、ＮＤＥＬ、ＱＤＥＬ、ＲＥＤＬ、ＲＮＥＬ、ＲＴＤＬ、ＲＴＥＬ、ＳＤＥＬ、ＴＤＥＬ、ＳＫＥＬ、ＳＴＥＬ、及びＥＤＥＬからなる群から選択される。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、ＫＤＥＬファミリーのいずれのカルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフも含まないことを除く細胞標的化分子からなる第４の細胞標的化分子の細胞毒性より大きい細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、よりよく最適化された細胞毒性効力を有する細胞毒性、例えば第４の細胞標的化分子などの参照分子と比較して４倍、５倍、６倍、９倍、又はそれより大きい細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、標的陽性細胞集団に対する本発明の細胞標的化分子の細胞毒性は、ＣＤ５０値によってアッセイした場合、第２の標的陽性細胞集団に対する第４の細胞標的化分子の細胞毒性の、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍であるか、又はそれより大きい。
実施形態セット番号３−カルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフ及び組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む、細胞標的化分子
本発明は、それぞれ（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領
域；（ii）挿入された又は組み込まれた異種エピトープを含む志賀毒素エフェクターポリペプチド；及び（iii）カルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフを含む、細
胞標的化分子を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、（ａ）少なくとも１つの細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域；（ｂ）組み込まれた又は挿入された異種エピトープを含む志賀毒素エフェクターポリペプチド；及び（ｃ）ＫＤＥＬファミリーのメンバーのカルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフを含む。ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び／又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、異種Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、例えばヒト免疫系に関するものなどである。ある特定のさらなる実施形態に関して、異種Ｔ細胞エピトープは、細胞のＭＨＣクラスＩ分子によって提示されることが可能である。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に入ること、リボソーム機能を阻害すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、細胞死を引き起こすこと、及び／又は細胞表面上での提示のために組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープをＭＨＣクラスＩ分子に送達することのうち１つ又は２つ以上が可能である。
実施形態セット番号３のある特定の実施形態において、カルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＦ、ＨＤＥＬ、ＲＤＥＦ、ＲＤＥＬ、ＷＤＥＬ、ＹＤＥＬ、ＨＥＥＦ、ＨＥＥＬ、ＫＥＥＬ、ＲＥＥＬ、ＫＡＥＬ、ＫＣＥＬ、ＫＦＥＬ、ＫＧＥＬ、ＫＨＥＬ、ＫＬＥＬ、ＫＮＥＬ、ＫＱＥＬ、ＫＲＥＬ、ＫＳＥＬ、ＫＶＥＬ、ＫＷＥＬ、ＫＹＥＬ、ＫＥＤＬ、ＫＩＥＬ、ＤＫＥＬ、ＦＤＥＬ、ＫＤＥＦ、ＫＫＥＬ、ＨＡＤＬ、ＨＡＥＬ、ＨＩＥＬ、ＨＮＥＬ、ＨＴＥＬ、ＫＴＥＬ、ＨＶＥＬ、ＮＤＥＬ、ＱＤＥＬ、ＲＥＤＬ、ＲＮＥＬ、ＲＴＤＬ、ＲＴＥＬ、ＳＤＥＬ、ＴＤＥＬ、ＳＫＥＬ、ＳＴＥＬ、及びＥＤＥＬからなる群から選択される。
実施形態セット番号３のある特定の実施形態において、組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープは、（ｉ）配列番号１又は配列番号２の１〜１５；配列番号３の３〜１４；配列番号３の２６〜３７；配列番号１又は配列番号２の２７〜３７；配列番号１又は配列番号２の３９〜４８；配列番号３の４２〜４８；及び配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５３〜６６、又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域；（ii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４〜１１５；配列番号１又は配列番号２の１４１〜１５３；配列番号３の１４０〜１５６；配列番号１又は配列番号２の１７９〜１９０；配列番号３の１７９〜１９１；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；及び配列番号３の２１０〜２１８；並びに（iii）配列
番号３の２４０〜２６０；配列番号１又は配列番号２の２４３〜２５７；配列番号１又は配列番号２の２５４〜２６８；配列番号３の２６２〜２７８；配列番号３の２８１〜２９７；及び配列番号１又は配列番号２の２８５〜２９３、又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当するにおいて相当する領域からなる天然に位置する志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択される内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域を破壊させる。
実施形態セット番号３のある特定のさらなる実施形態において、異種エピトープは、細胞のＭＨＣクラスＩ分子によって提示されることが可能なＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである。ある特定のさらなる実施形態において、異種エピトープは、組み込まれており、志賀毒素エフェクターポリペプチドがその由来となる野生型志賀毒素ポリペプチド領域が有するのと同じアミノ酸残基総数を有するように、野生型志賀毒素ポリペプチド領域における同等の数のアミノ酸残基を置き換えている。上記したもののいずれかのある特定のさらな
る実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ポリペプチドが存在する細胞のサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、及び細胞毒性から選択される少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能を示すことができる。
実施形態セット番号３のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、ＫＤＥＬファミリーのいずれのカルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフも含まないことを除く細胞標的化分子からなる第５の細胞標的化分子の細胞毒性より大きい細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、よりよく最適化された細胞毒性効力を有する細胞毒性、例えば第５の細胞標的化分子と比較して４倍、５倍、６倍、９倍、又はそれより大きい細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、標的陽性細胞集団に対する本発明の細胞標的化分子の細胞毒性は、ＣＤ５０値によってアッセイした場合、第２の標的陽性細胞集団に対する第５の細胞標的化分子の細胞毒性の、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍であるか、又はそれより大きい。
実施形態セット番号３のある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、ＭＨＣクラスＩ分子によって結合したエピトープの細胞表面提示のために、細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に、組み込まれた又は挿入された異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達することが可能である。
実施形態セット番号３のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、組み込まれた又は挿入された異種エピトープにより脱免疫化されている。ある特定のさらなる実施形態において、細胞標的化分子は、参照分子、例えば、細胞標的化分子中に存在する１つ又は２つ以上の組み込まれた又は挿入されたエピトープが欠失していることを除く細胞標的化分子からなる第６の細胞標的化分子などと比較してより低い相対的な抗原性及び／又は相対的な免疫原性を示すことができる。
実施形態セット番号３のある特定のさらなる実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、細胞毒性ではなく、細胞に導入された場合、参照分子、例えば第５の細胞標的化分子などの細胞内経路決定効率と比較してより大きい細胞外空間から小胞体及び／又はサイトゾルの細胞内区画への細胞内経路決定効率を示すことができる。
実施形態セット番号４−（ｉ）組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープ、及び（ii）破壊されたフーリン切断モチーフを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子
本発明は、それぞれ（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域；（ii）挿入された又は組み込まれた異種エピトープを含む志賀毒素エフェクターポリペプチド；及び（iii）破壊されたフーリン切断モチーフを含む、細胞標的化分子を提供
する。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域；（ii）（ａ）挿入された又は組み込まれた異種エピトープ；（ｂ）カルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片由来の領域；及び（ｃ）Ａ１断片領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び／又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、異種Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、例えばヒト免疫系に関するものなどである。ある特定のさらなる実施形態に関し
て、異種Ｔ細胞エピトープは、細胞のＭＨＣクラスＩ分子によって提示されることが可能である。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に入ること、リボソーム機能を阻害すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、細胞死を引き起こすこと、及び／又は細胞表面上での提示のために組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープをＭＨＣクラスＩ分子に送達することのうち１つ又は２つ以上が可能である。ある特定のさらなる実施形態に関して、細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、参照分子、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド要素の全てが、そのＡ１断片領域のカルボキシ末端に野生型志賀毒素のフーリン切断部位を含むことを除く細胞標的化分子からなる第２の細胞標的化分子などと同程度か又はそれより優れた細胞毒性を示すことができる。
実施形態セット番号４のある特定の実施形態において、組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープは、（ｉ）配列番号１又は配列番号２の１〜１５；配列番号３の３〜１４；配列番号３の２６〜３７；配列番号１又は配列番号２の２７〜３７；配列番号１又は配列番号２の３９〜４８；配列番号３の４２〜４８；及び配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５３〜６６、又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域；（ii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４〜１１５；配列番号１又は配列番号２の１４１〜１５３；配列番号３の１４０〜１５６；配列番号１又は配列番号２の１７９〜１９０；配列番号３の１７９〜１９１；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；及び配列番号３の２１０〜２１８；並びに（iii）配列
番号３の２４０〜２６０；配列番号１又は配列番号２の２４３〜２５７；配列番号１又は配列番号２の２５４〜２６８；配列番号３の２６２〜２７８；配列番号３の２８１〜２９７；及び配列番号１又は配列番号２の２８５〜２９３、又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域からなる天然に位置する志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択される内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域を破壊させる。
実施形態セット番号４のある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含み、変異は、志賀様毒素１のＡサブユニット（配列番号１）若しくは志賀毒素のＡサブユニット（配列番号２）の２４８〜２５１、又は志賀様毒素のＡサブユニット（配列番号３）の２４７〜２５０；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域における天然に位置する領域で、少なくとも１つのアミノ酸残基を変更する。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断モチーフの最小のフーリン切断部位中に、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含む。ある特定のさらなる実施形態において、最小のフーリン切断部位は、コンセンサスアミノ酸配列Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ及び／又はＲ−ｘ−ｘ−Ｒによって表される。
実施形態セット番号４のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、カルボキシ末端を志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に位置させた分子部分を含む。
実施形態セット番号４のある特定の実施形態において、結合領域は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。
実施形態セット番号４のある特定の実施形態において、分子部分は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。ある特定のさらなる実施形態において、分子部分は、結合領域を含む。
実施形態セット番号４のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、カルボキシ末端を志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に位置させた結合領域及び／又は分子部分を含む。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域及び／又は分子部分の
質量は、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａであるか、又はそれより大きい。
実施形態セット番号４のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、細胞標的化分子が本明細書で言及される適切なレベルの志賀毒素生物活性（例えば、細胞毒性及び／又は細胞内の経路決定）を保持する限り、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａであるか、又はそれより大きい質量を有する結合領域を含む。
実施形態セット番号４のある特定の実施形態において、結合領域は、細胞標的化分子が本明細書で言及される適切なレベルの志賀毒素生物活性を保持する限り、例えば、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａであるか、又はそれより大きい質量を有する分子部分を含む、相対的に大きい分子部分内に含まれる。
実施形態セット番号４のある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換を含む。ある特定のさらなる実施形態において、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換は、アラニン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンからなる群から選択される正電荷を有さないアミノ酸残基でのアルギニン残基の置換である。ある特定の実施形態において、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換は、ヒスチジンでのアルギニン残基の置換である。
実施形態セット番号４のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、その志賀毒素エフェクターポリペプチド要素の全てがそれぞれ、そのＡ１断片領域のカルボキシ末端に野生型志賀毒素Ａ１断片及び／又は野生型志賀毒素のフーリン切断部位を含むことを除く細胞標的化分子からなる第７の細胞標的化分子の細胞毒性と同程度の細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、第７の細胞標的化分子によって表される細胞毒性の、０．１倍、０．５倍、又は０．７５倍から、１．２倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、又は５倍の範囲である細胞毒性を示すことができる。
実施形態セット番号４のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、脊索動物に導入された場合、第７の細胞標的化分子のインビボ忍容性と比較してインビボ忍容性の改善を示すことができる。
実施形態セット番号４のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、組み込まれた又は挿入された異種エピトープにより脱免疫化されている。ある特定のさらなる実施形態において、細胞標的化分子は、参照分子、例えば、細胞標的化分子中に存在する１つ又は２つ以上の組み込まれた又は挿入されたエピトープが欠失していることを除く細胞標的化分子からなる第８の細胞標的化分子などと比較してより低い相対的な抗原性及び／又は相対的な免疫原性を示すことができる。
実施形態セット番号４のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、フーリン切断モチーフ破壊により脱免疫化されている。ある特定のさらなる実施形態において、細胞標的化分子は、フーリン切断モチーフが野生型である、及び／又は全ての志賀毒素エフェ
クターポリペプチド要素が野生型志賀毒素Ａ１断片からなることを除いた細胞標的化分子からなる第９の細胞標的化分子と比較してより低い相対的な抗原性及び／又は相対的な免疫原性を示すことができる。
実施形態セット番号５−組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドをアミノ末端に又はその近位に含む、細胞標的化分子
本発明は、（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域；（ii）挿入された又は組み込まれた異種エピトープを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドをそれぞれ含む、細胞標的化分子であって、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ末端に又はその近位にある、細胞標的化分子を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、（ii）ポリペプチド要素、及び（iii）挿入された又は組み
込まれた異種エピトープを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、細胞標的化分子のポリペプチド要素のアミノ末端に又はその近位にある。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドは、結合領域が志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の近位に位置しないように、細胞標的化分子内に物理的に配列又は配向されている。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、細胞標的化分子内において、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端より志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端の近位に位置する。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドに比べて、細胞標的化分子のアミノ末端の近位に位置していない。ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び／又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、異種Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、例えばヒト免疫系に関するものなどである。ある特定のさらなる実施形態に関して、異種Ｔ細胞エピトープは、細胞のＭＨＣクラスＩ分子によって提示されることが可能である。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に入ること、リボソーム機能を阻害すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、細胞死を引き起こすこと、及び／又は細胞表面上での提示のために組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープをＭＨＣクラスＩ分子に送達することのうち１つ又は２つ以上が可能である。
実施形態セット番号５のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、アミノ末端を有し、結合領域と第１０の細胞標的化分子のアミノ末端に又はその近位に配置されていない志賀毒素エフェクターポリペプチド領域とを含む、第１０の細胞標的化分子の細胞毒性より大きい細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、よりよく最適化された細胞毒性効力を有する細胞毒性、例えば第１０の細胞標的化分子と比較して４倍、５倍、６倍、９倍、又はそれより大きい細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、標的陽性細胞集団に対する本発明の細胞標的化分子の細胞毒性は、ＣＤ５０値によってアッセイした場合、第２の標的陽性細胞集団に対する第１０の細胞標的化分子の細胞毒性の、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍であるか、又はそれより大きい。
実施形態セット番号５のある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、ＭＨＣクラスＩ分子によって結合したエピトープの細胞表面提示のために、細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に組み込まれた又は挿入された異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達することが可能である。
実施形態セット番号５のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、組み込まれた又は挿入された異種エピトープにより脱免疫化されている。ある特定のさらなる実施形態において、細胞標的化分子は、参照分子、例えば、細胞標的化分子中に存在する１つ又は２つ以上の組み込まれた又は挿入されたエピトープが欠失していることを除いた細胞標的化分子からなる第１１の細胞標的化分子などと比較してより低い相対的な抗原性及び／又は相対的な免疫原性を示すことができる。
実施形態セット番号５のある特定のさらなる実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、細胞毒性ではなく、細胞に導入された場合、参照分子、例えば第１０の細胞標的化分子などの細胞内経路決定効率と比較してより大きい細胞外空間から小胞体及び／又はサイトゾルの細胞内区画への細胞内経路決定効率を示すことがでる。
実施形態セット番号６−破壊されたフーリン切断モチーフを含む脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子
本発明は、（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、及び（ii）破壊されたフーリン切断モチーフを含む脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドをそれぞれ含む細胞標的化分子を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、並びに（ii）（ａ）カルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片由来の領域、（ｂ）Ａ１断片領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフ、及び（ｃ）少なくとも１つの破壊された内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及び／又はエピトープ領域を含む、脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び／又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に入ること、リボソーム機能を阻害すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞死をもたらすことの１つ又は２つ以上が可能である。ある特定のさらなる実施形態に関して、細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、参照分子、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド要素の全てが、そのＡ１断片領域のカルボキシ末端に野生型志賀毒素のフーリン切断部位を含むことを除く細胞標的化分子からなる第２の細胞標的化分子などと同程度か又はそれより優れた細胞毒性を示すことができる。
実施形態セット番号６のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２の１〜１５；配列番号３の３〜１４；配列番号３の２６〜３７；配列番号１又は配列番号２の２７〜３７；配列番号１又は配列番号２の３９〜４８；配列番号３の４２〜４８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５３〜６６；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４〜１１５；配列番号１又は配列番号２の１４１〜１５３；配列番号３の１４０〜１５６；配列番号１又は配列番号２の１７９〜１９０；配列番号３の１７９〜１９１；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５、及び配列番号３の２１０〜２１８；配列番号３の２４０〜２６０；配列番号１又は配列番号２の２４３〜２５７；配列番号１又は配列番号２の２５４〜２６８；配列番号３の２６２〜２７８；配列番号３の２８１〜２９７；配列番号１又は配列番号２の２８５〜２９３；配列番号１又は配列番号２の４〜３３；配列番号１又は配列番号２の３４〜７８；配列番号１又は配列番号２の７７〜１０３；配列番号１又は配列番号２の１２８〜１６８；配列番号１又は配列番号２の１６０〜１８３；配列番号１又は配列番号２の２３６〜２５８；及び配列番号１又は配列番号２の２７４〜２９３；又は志賀毒素Ａサブユニ
ット若しくはそれらの派生物において相当する領域からなる天然に位置する志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択されるＢ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域中の、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する変異を含む。ある特定のさらなる実施形態において、少なくとも１つの破壊された内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ及び／又はエピトープ領域の一部又は全てとオーバーラップするアミノ酸残基のカルボキシ末端のトランケーションである破壊は存在しない。
実施形態セット番号６のある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含み、変異は、志賀様毒素１のＡサブユニット（配列番号１）若しくは志賀毒素のＡサブユニット（配列番号２）の２４８〜２５１、又は志賀様毒素のＡサブユニット（配列番号３）の２４７〜２５０；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域における天然に位置する領域で、少なくとも１つのアミノ酸残基を変更する。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断モチーフの最小のフーリン切断部位中に、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含む。ある特定のさらなる実施形態において、最小のフーリン切断部位は、コンセンサスアミノ酸配列Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ及び／又はＲ−ｘ−ｘ−Ｒによって表される。
実施形態セット番号６のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、カルボキシ末端を志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に位置させた分子部分を含む。
実施形態セット番号６のある特定の実施形態において、結合領域は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。
実施形態セット番号６のある特定の実施形態において、分子部分は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。ある特定のさらなる実施形態において、分子部分は、結合領域を含む。
実施形態セット番号６のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、カルボキシ末端を志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に位置させた結合領域及び／又は分子部分を含む。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域及び／又は分子部分の質量は、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａであるか、又はそれより大きい。
実施形態セット番号６のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、細胞標的化分子が本明細書で言及される適切なレベルの志賀毒素生物活性（例えば、細胞毒性及び／又は細胞内の経路決定）を保持する限り、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａであるか、又はそれより大きい質量を有する結合領域を含む。
実施形態セット番号６のある特定の実施形態において、結合領域は、細胞標的化分子が本明細書で言及される適切なレベルの志賀毒素生物活性を保持する限り、例えば、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａであるか、又はそれより大きい質量を有する分子部分を含む、相対的に大きい分子部分内に含まれる。
実施形態セット番号６のある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基
の置換を含む。ある特定のさらなる実施形態において、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換は、アラニン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンからなる群から選択される正電荷を有さないアミノ酸残基でのアルギニン残基の置換である。ある特定の実施形態において、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換は、ヒスチジンでのアルギニン残基の置換である。
実施形態セット番号６のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、参照分子、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド要素の全てがそれぞれ、そのＡ１断片領域のカルボキシ末端に野生型志賀毒素Ａ１断片及び／又は野生型志賀毒素のフーリン切断部位を含むことを除く細胞標的化分子からなる第１２の細胞標的化分子などの細胞毒性と同程度の細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、第１２の細胞標的化分子によって表される細胞毒性の、０．１倍、０．５倍、又は０．７５倍から、１．２倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、又は５倍の範囲である細胞毒性を示すことができる。
実施形態セット番号４のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、脊索動物に導入された場合、第１２の細胞標的化分子のインビボ忍容性と比較してインビボ忍容性の改善を示すことができる。
実施形態セット番号４のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、フーリン切断モチーフ破壊により脱免疫化されている。ある特定のさらなる実施形態において、細胞標的化分子は、参照細胞標的化分子、例えば、フーリン切断モチーフが野生型である、及び／又は全ての志賀毒素エフェクターポリペプチド要素が野生型志賀毒素Ａ１断片からなることを除く細胞標的化分子からなる第１２の細胞標的化分子などと比較してより低い相対的な抗原性及び／又は相対的な免疫原性を示すことができる。
実施形態セット番号７−カルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフ及び脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む、細胞標的化分子
本発明は、（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域；（ii）脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチド、及び（iii）カルボキシ末端の小
胞体保留／回収シグナルモチーフをそれぞれ含む細胞標的化分子を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域；（ii）少なくとも１つの破壊された内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及び／又はエピトープ領域を含む脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチド、並びに（iii）ＫＤＥＬファミリーのメンバーのカルボキシ末
端の小胞体保留／回収シグナルモチーフを含む。ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び／又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に入ること、リボソーム機能を阻害すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞死をもたらすことの１つ又は２つ以上が可能である。
実施形態セット番号７のある特定の実施形態において、カルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＦ、ＨＤＥＬ、ＲＤＥＦ、ＲＤＥＬ、ＷＤＥＬ、ＹＤＥＬ、ＨＥＥＦ、ＨＥＥＬ、ＫＥＥＬ、ＲＥＥＬ、ＫＡＥＬ、ＫＣＥＬ、ＫＦＥ
Ｌ、ＫＧＥＬ、ＫＨＥＬ、ＫＬＥＬ、ＫＮＥＬ、ＫＱＥＬ、ＫＲＥＬ、ＫＳＥＬ、ＫＶＥＬ、ＫＷＥＬ、ＫＹＥＬ、ＫＥＤＬ、ＫＩＥＬ、ＤＫＥＬ、ＦＤＥＬ、ＫＤＥＦ、ＫＫＥＬ、ＨＡＤＬ、ＨＡＥＬ、ＨＩＥＬ、ＨＮＥＬ、ＨＴＥＬ、ＫＴＥＬ、ＨＶＥＬ、ＮＤＥＬ、ＱＤＥＬ、ＲＥＤＬ、ＲＮＥＬ、ＲＴＤＬ、ＲＴＥＬ、ＳＤＥＬ、ＴＤＥＬ、ＳＫＥＬ、ＳＴＥＬ、及びＥＤＥＬからなる群から選択される。
実施形態セット番号７のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２の１〜１５；配列番号３の３〜１４；配列番号３の２６〜３７；配列番号１又は配列番号２の２７〜３７；配列番号１又は配列番号２の３９〜４８；配列番号３の４２〜４８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５３〜６６；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４〜１１５；配列番号１又は配列番号２の１４１〜１５３；配列番号３の１４０〜１５６；配列番号１又は配列番号２の１７９〜１９０；配列番号３の１７９〜１９１；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５、及び配列番号３の２１０〜２１８；配列番号３の２４０〜２６０；配列番号１又は配列番号２の２４３〜２５７；配列番号１又は配列番号２の２５４〜２６８；配列番号３の２６２〜２７８；配列番号３の２８１〜２９７；配列番号１又は配列番号２の２８５〜２９３；配列番号１又は配列番号２の４〜３３；配列番号１又は配列番号２の３４〜７８；配列番号１又は配列番号２の７７〜１０３；配列番号１又は配列番号２の１２８〜１６８；配列番号１又は配列番号２の１６０〜１８３；配列番号１又は配列番号２の２３６〜２５８；及び配列番号１又は配列番号２の２７４〜２９３；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域からなる天然に位置する志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択されるＢ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域中の、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する変異を含む。ある特定のさらなる実施形態において、少なくとも１つの破壊された内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ及び／又はエピトープ領域の一部又は全てとオーバーラップするアミノ酸残基のカルボキシ末端のトランケーションである破壊は存在しない。
実施形態セット番号７のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、ＫＤＥＬファミリーのいずれのカルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフも含まないことを除く細胞標的化分子からなる第１３の細胞標的化分子の細胞毒性より大きい細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、よりよく最適化された細胞毒性効力を有する細胞毒性、例えば第１３の細胞標的化分子と比較して４倍、５倍、６倍、９倍、又はそれより大きい細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、標的陽性細胞集団に対する本発明の細胞標的化分子の細胞毒性は、ＣＤ５０値によってアッセイした場合、第２の標的陽性細胞集団に対する第１３の細胞標的化分子の細胞毒性の、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍であるか、又はそれより大きい。
実施形態セット番号７のある特定のさらなる実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、細胞毒性ではなく、細胞に導入された場合、参照分子、例えば第１３の細胞標的化分子などの細胞内経路決定効率と比較してより大きい細胞外空間から小胞体及び／又はサイトゾルの細胞内区画への細胞内経路決定効率を示すことができる。
実施形態セット番号８−細胞標的化分子のアミノ末端に又はその近位に脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む、細胞標的化分子
本発明は、（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、（ii）脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドをそれぞれ含む細胞標的化分子であって、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、アミノ末端に又はその近位にある、細胞標的化分子を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域；（ii）ポリペプチド要素
；及び（iii）少なくとも１つの破壊された内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピ
トープ及び／又はエピトープ領域を含む脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、細胞標的化分子のポリペプチド要素のアミノ末端に又はその近位にある。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドは、結合領域が志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の近位に位置しないように、細胞標的化分子内に物理的に配列又は配向されている。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、細胞標的化分子内において、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端より志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端の近位に位置する。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドに比べて、細胞標的化分子のアミノ末端の近位に位置していない。ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び／又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に入ること、リボソーム機能を阻害すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞死をもたらすことの１つ又は２つ以上が可能である。
実施形態セット番号８のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２の１〜１５；配列番号３の３〜１４；配列番号３の２６〜３７；配列番号１又は配列番号２の２７〜３７；配列番号１又は配列番号２の３９〜４８；配列番号３の４２〜４８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５３〜６６；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４〜１１５；配列番号１又は配列番号２の１４１〜１５３；配列番号３の１４０〜１５６；配列番号１又は配列番号２の１７９〜１９０；配列番号３の１７９〜１９１；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５、及び配列番号３の２１０〜２１８；配列番号３の２４０〜２６０；配列番号１又は配列番号２の２４３〜２５７；配列番号１又は配列番号２の２５４〜２６８；配列番号３の２６２〜２７８；配列番号３の２８１〜２９７；配列番号１又は配列番号２の２８５〜２９３；配列番号１又は配列番号２の４〜３３；配列番号１又は配列番号２の３４〜７８；配列番号１又は配列番号２の７７〜１０３；配列番号１又は配列番号２の１２８〜１６８；配列番号１又は配列番号２の１６０〜１８３；配列番号１又は配列番号２の２３６〜２５８；及び配列番号１又は配列番号２の２７４〜２９３；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域からなる天然に位置する志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択されるＢ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域中の、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する変異を含む。ある特定のさらなる実施形態において、少なくとも１つの破壊された内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ及び／又はエピトープ領域の一部又は全てとオーバーラップするアミノ酸残基のカルボキシ末端のトランケーションである破壊は存在しない。
実施形態セット番号８のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、アミノ末端を有し、さらに結合領域と第１４の細胞標的化分子のアミノ末端に又はその近位に配置されていない志賀毒素エフェクターポリペプチド領域とを含む、第１４の細胞標的化分子の細胞毒性より大きい細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、よりよく最適化された細胞毒性効力を有する細胞毒性、例えば第１４の細胞標的化分子と比較して４倍、５倍、６倍、９倍、又はそれより大きい細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、標的陽性細胞集団に対する本発明の細胞標的化分子の細胞毒性は、ＣＤ５０値によってアッセイした場合、第２の標的陽性細胞集団に対する第１４の細胞標的化分子の細胞毒性の、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍であるか、又はそれ
より大きい。
実施形態セット番号８のある特定のさらなる実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、細胞毒性ではなく、細胞に導入された場合、参照分子、例えば第１４の細胞標的化分子などの細胞内経路決定効率と比較してより大きい細胞外空間から小胞体及び／又はサイトゾルの細胞内区画への細胞内経路決定効率を示すことができる。
実施形態セット番号９−カルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフ及び破壊されたフーリン切断モチーフを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子
本発明は、（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域；（ii）破壊されたフーリン切断モチーフを含む志賀毒素エフェクターポリペプチド；及び（iii）カルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフをそれぞれ含む、細胞標的化分
子を提供する。本発明は、（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域；（ii）破壊されたフーリン切断モチーフを含む志賀毒素エフェクターポリペプチド；及び（iii）ＫＤＥＬファミリーのメンバーのカルボキシ末端の小胞体保留／回収シ
グナルモチーフをそれぞれ含む細胞標的化分子を提供する。ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び／又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に入ること、リボソーム機能を阻害すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞死をもたらすことの１つ又は２つ以上が可能である。ある特定のさらなる実施形態に関して、細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、参照分子、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド要素の全てが、そのＡ１断片領域のカルボキシ末端に野生型志賀毒素のフーリン切断部位を含むことを除く細胞標的化分子からなる第２の細胞標的化分子などと同程度か又はそれより優れた細胞毒性を示すことができる。
実施形態セット番号９のある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含み、変異は、志賀様毒素１のＡサブユニット（配列番号１）若しくは志賀毒素のＡサブユニット（配列番号２）の２４８〜２５１、又は志賀様毒素のＡサブユニット（配列番号３）の２４７〜２５０；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域における天然に位置する領域で、少なくとも１つのアミノ酸残基を変更する。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断モチーフの最小のフーリン切断部位中に、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含む。ある特定のさらなる実施形態において、最小のフーリン切断部位は、コンセンサスアミノ酸配列Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ及び／又はＲ−ｘ−ｘ−Ｒによって表される。
実施形態セット番号９のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、カルボキシ末端を志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に位置させた分子部分を含む。
実施形態セット番号９のある特定の実施形態において、結合領域は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。
実施形態セット番号９のある特定の実施形態において、分子部分は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。ある特定のさらなる実施形態において、分子部分は、結合領域を含む。
実施形態セット番号９のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、カルボキシ末端を志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に位置させた結合領域及び／又は分子部分を含む。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域及び／又は分子部分の質量は、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａであるか、又はそれより大きい。
実施形態セット番号９のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、細胞標的化分子が本明細書で言及される適切なレベルの志賀毒素生物活性（例えば、細胞毒性及び／又は細胞内の経路決定）を保持する限り、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａであるか、又はそれより大きい質量を有する結合領域を含む。
実施形態セット番号９のある特定の実施形態において、結合領域は、細胞標的化分子が本明細書で言及される適切なレベルの志賀毒素生物活性を保持する限り、例えば、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａであるか、又はそれより大きい質量を有する分子部分を含む、相対的に大きい分子部分内に含まれる。
実施形態セット番号９のある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換を含む。ある特定のさらなる実施形態において、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換は、アラニン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンからなる群から選択される正電荷を有さないアミノ酸残基でのアルギニン残基の置換である。ある特定の実施形態において、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換は、ヒスチジンでのアルギニン残基の置換である。
実施形態セット番号９のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、ＫＤＥＬファミリーのいずれのカルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフも含まないことを除いた細胞標的化分子からなる第１５の細胞標的化分子の細胞毒性より大きい細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、よりよく最適化された細胞毒性効力を有する細胞毒性、例えば第１５の細胞標的化分子と比較して４倍、５倍、６倍、９倍、又はそれより大きい細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、標的陽性細胞集団に対する本発明の細胞標的化分子の細胞毒性は、ＣＤ５０値によってアッセイした場合、第２の標的陽性細胞集団に対する第１５の細胞標的化分子の細胞毒性の、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍であるか、又はそれより大きい。
実施形態セット番号９のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、脊索動物に導入された場合、その志賀毒素エフェクターポリペプチド要素の全てがそれぞれ、そのＡ１断片領域のカルボキシ末端に野生型志賀毒素Ａ１断片及び／又は野生型志賀毒素のフーリン切断部位を含むことを除いた細胞標的化分子からなる第１６の細胞標的化分子のインビボ忍容性と比較してインビボ忍容性の改善を示すことができる。
実施形態セット番号９のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、フーリン切断モチーフ破壊により脱免疫化されている。ある特定のさらなる実施形態において、細胞標的化分子は、参照細胞標的化分子、例えば、フーリン切断モチーフが野生型であるか、
及び／又は全ての志賀毒素エフェクターポリペプチド要素が野生型志賀毒素Ａ１断片からなることを除く細胞標的化分子からなる第１６の細胞標的化分子などと比較してより低い相対的な抗原性及び／又は相対的な免疫原性を示すことができる。
実施形態セット番号９のある特定のさらなる実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、細胞毒性ではなく、細胞に導入された場合、参照分子、例えば第１５の細胞標的化分子などの細胞内経路決定効率と比較してより大きい細胞外空間から小胞体及び／又はサイトゾルの細胞内区画への細胞内経路決定効率を示すことができる。
実施形態セット番号１０−細胞標的化分子のアミノ末端に又はその近位にフーリン切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子
本発明は、（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、及び（ii）その志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドをそれぞれ含む細胞標的化分子であって、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端は、細胞標的化分子のポリペプチド成分のアミノ末端にある、及び／又はその近位にある、細胞標的化分子を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、（ii）アミノ末端を有する志賀毒素エフェクターポリペプチド及びカルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片由来の領域、並びに（iii）Ａ１断
片領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含み、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドと比べて、細胞標的化分子のアミノ末端の近位に配置されていない。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドは、結合領域が志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の近位に位置しないように、細胞標的化分子内に物理的に配列又は配向されている。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、細胞標的化分子内において、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端より志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端の近位に位置する。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドに比べて、細胞標的化分子のアミノ末端の近位に位置していない。ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び／又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に入ること、リボソーム機能を阻害すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞死をもたらすことの１つ又は２つ以上が可能である。ある特定のさらなる実施形態に関して、細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、参照分子、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド要素の全てが、そのＡ１断片領域のカルボキシ末端に野生型志賀毒素のフーリン切断部位を含むことを除いた細胞標的化分子からなる第１７の細胞標的化分子などと同程度か又はそれより優れた細胞毒性を示すことができる。
実施形態セット番号１０のある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含み、変異は、志賀様毒素１のＡサブユニット（配列番号１）若しくは志賀毒素のＡサブユニット（配列番号２）の２４８〜２５１、又は志賀様毒素のＡサブユニット（配列番号３）の２４７〜２５０；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域における天然に位置する領域で、少なくとも１つのアミノ酸残基を変更する。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断モチーフの最小のフーリン切断部位中に、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含む。ある特定のさらなる実施形態において、最小のフーリン切断部位は、コン
センサスアミノ酸配列Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ及び／又はＲ−ｘ−ｘ−Ｒによって表される。
実施形態セット番号１０のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、カルボキシ末端を志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に位置させた分子部分を含む。
実施形態セット番号１０のある特定の実施形態において、結合領域は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。
実施形態セット番号１０のある特定の実施形態において、分子部分は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。ある特定のさらなる実施形態において、分子部分は、結合領域を含む。
実施形態セット番号１０のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、カルボキシ末端を志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に位置させた結合領域及び／又は分子部分を含む。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域及び／又は分子部分の質量は、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａであるか、又はそれより大きい。
実施形態セット番号１０のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、細胞標的化分子が本明細書で言及される適切なレベルの志賀毒素生物活性（例えば、細胞毒性及び／又は細胞内の経路決定）を保持する限り、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａであるか、又はそれより大きい質量を有する結合領域を含む。
実施形態セット番号１０のある特定の実施形態において、結合領域は、細胞標的化分子が本明細書で言及される適切なレベルの志賀毒素生物活性を保持する限り、例えば、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａであるか、又はそれより大きい質量を有する分子部分を含む、相対的に大きい分子部分内に含まれる。
実施形態セット番号１０のある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換を含む。ある特定のさらなる実施形態において、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換は、アラニン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンからなる群から選択される正電荷を有さないアミノ酸残基でのアルギニン残基の置換である。ある特定の実施形態において、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換は、ヒスチジンでのアルギニン残基の置換である。
実施形態セット番号１０のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、アミノ末端を有し、さらに結合領域と第１８の細胞標的化分子のアミノ末端に又はその近位に配置されていない志賀毒素エフェクターポリペプチド領域とを含む第１８の細胞標的化分子の細胞毒性より大きい細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、よりよく最適化された細胞毒性効力を有する細胞毒性、例えば第１８の細胞標的化分子と比較して４倍、５倍、６倍、９倍、又はそれより大きい細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、標的陽性細胞集団に対する本発明の細胞標的化分子の細胞毒性は、ＣＤ５０
値によってアッセイした場合、第２の標的陽性細胞集団に対する第１８の細胞標的化分子の細胞毒性の、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍であるか、又はそれより大きい。
実施形態セット番号１０のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、脊索動物に導入された場合、その志賀毒素エフェクターポリペプチド要素の全てがそれぞれ、そのＡ１断片領域のカルボキシ末端に野生型志賀毒素Ａ１断片及び／又は野生型志賀毒素のフーリン切断部位を含むことを除いた細胞標的化分子からなる第１９の細胞標的化分子のインビボ忍容性と比較してインビボ忍容性の改善を示すことができる。
実施形態セット番号１０のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、フーリン切断モチーフ破壊により脱免疫化されている。ある特定のさらなる実施形態において、細胞標的化分子は、フーリン切断モチーフが野生型である、及び／又は全ての志賀毒素エフェクターポリペプチド要素が野生型志賀毒素Ａ１断片からなることを除く細胞標的化分子からなる参照細胞標的化分子、例えば第１９の細胞標的化分子などと比較してより低い相対的な抗原性及び／又は相対的な免疫原性を示すことができる。
実施形態セット番号１０のある特定のさらなる実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、細胞毒性ではなく、細胞に導入された場合、参照分子、例えば第１９の細胞標的化分子などの細胞内経路決定効率と比較してより大きい細胞外空間から小胞体及び／又はサイトゾルの細胞内区画への細胞内経路決定効率を示すことができる。
実施形態セット番号１１−細胞標的化分子のアミノ末端に又はその近位にカルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフ及び志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子
本発明は、（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、（ii）カルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフ、及び（iii）志賀毒素エフェク
ターポリペプチドをそれぞれ含む細胞標的化分子であって、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端は、細胞標的化分子のポリペプチド成分のアミノ末端にある、及び／又はその近位にある、細胞標的化分子を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、（ｉ）細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、（ii）ＫＤＥＬファミリーのメンバーのカルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフ、（iii）ポリペプチド成分、及び（iv）志賀毒素エフェクターポリペプチドを
含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端は、細胞標的化分子のポリペプチド成分のアミノ末端にある、及び／又はその近位にある。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドは、結合領域が志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の近位に位置しないように、細胞標的化分子内に物理的に配列又は配向されている。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、細胞標的化分子内において、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端より志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端の近位に位置する。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドに比べて、細胞標的化分子のアミノ末端の近位に位置していない。
ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び／又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び／又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に入ること、リボソーム機能を阻害すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、細胞死を引き起こすことの１つ又は２つ以上が可能である。
実施形態セット番号１１のある特定の実施形態において、カルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＦ、ＨＤＥＬ、ＲＤＥＦ、ＲＤＥＬ、ＷＤＥＬ、ＹＤＥＬ、ＨＥＥＦ、ＨＥＥＬ、ＫＥＥＬ、ＲＥＥＬ、ＫＡＥＬ、ＫＣＥＬ、ＫＦＥＬ、ＫＧＥＬ、ＫＨＥＬ、ＫＬＥＬ、ＫＮＥＬ、ＫＱＥＬ、ＫＲＥＬ、ＫＳＥＬ、ＫＶＥＬ、ＫＷＥＬ、ＫＹＥＬ、ＫＥＤＬ、ＫＩＥＬ、ＤＫＥＬ、ＦＤＥＬ、ＫＤＥＦ、ＫＫＥＬ、ＨＡＤＬ、ＨＡＥＬ、ＨＩＥＬ、ＨＮＥＬ、ＨＴＥＬ、ＫＴＥＬ、ＨＶＥＬ、ＮＤＥＬ、ＱＤＥＬ、ＲＥＤＬ、ＲＮＥＬ、ＲＴＤＬ、ＲＴＥＬ、ＳＤＥＬ、ＴＤＥＬ、ＳＫＥＬ、ＳＴＥＬ、及びＥＤＥＬからなる群から選択される。
実施形態セット番号１１のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、アミノ末端を有し、さらに結合領域と第２０の細胞標的化分子のアミノ末端に又はその近位に配置されていない志賀毒素エフェクターポリペプチド領域とを含む第２０の細胞標的化分子の細胞毒性より大きい、及び／又はＫＤＥＬファミリーのいずれのカルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフも含まないことを除く細胞標的化分子からなる第２１の細胞標的化分子の細胞毒性より大きい細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、第２０の細胞標的化分子は、ＫＤＥＬファミリーのいずれのカルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフも含まない。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、よりよく最適化された細胞毒性効力を有する細胞毒性、例えば第２０及び／又は第２１の細胞標的化分子などの参照分子と比較して４倍、５倍、６倍、９倍、又はそれより大きい細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、標的陽性細胞集団に対する本発明の細胞標的化分子の細胞毒性は、ＣＤ５０値によってアッセイした場合、第２の標的陽性細胞集団に対する第２０の細胞標的化分子及び／又は第２１の細胞標的化分子の細胞毒性の、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍であるか、又はそれより大きい。
実施形態セット番号１１のある特定のさらなる実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、細胞毒性ではなく、細胞に導入された場合、参照分子、例えば第２０及び／又は第２１の細胞標的化分子などの細胞内経路決定効率と比較してより大きい細胞外空間から小胞体及び／又はサイトゾルの細胞内区画への細胞内経路決定効率を示すことができる。
実施形態セット番号１〜番号１１のさらなる実施形態
実施形態セット番号２〜番号１１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、直接的又は間接的のいずれかで、例えば熟練した作業者公知のリンカーを介して結合領域に融合されている。
実施形態セット番号２〜番号１１のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、カルボキシ末端を志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に配置された分子部分を含む。
実施形態セット番号２〜番号１１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、カルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片由来の領域を有し、Ａ１断片領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフをさらに含む。
実施形態セット番号２〜番号１１のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子、又はそれらのポリペプチド成分は、ＫＤＥＬファミリーのメンバーのカルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフを含む。ある特定のさらなる実施形態に関して、カルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＦ、ＨＤＥＬ、ＲＤＥＦ、ＲＤＥＬ、ＷＤＥＬ、ＹＤＥＬ、ＨＥＥＦ、ＨＥＥＬ、ＫＥＥＬ、ＲＥＥＬ、ＫＡＥＬ、ＫＣＥＬ、ＫＦＥＬ、ＫＧＥＬ、ＫＨＥＬ、ＫＬＥＬ、ＫＮＥＬ、ＫＱＥＬ、ＫＲＥＬ、ＫＳＥＬ、ＫＶＥＬ、ＫＷＥＬ、ＫＹＥＬ、ＫＥＤＬ、ＫＩＥＬ、ＤＫＥＬ
、ＦＤＥＬ、ＫＤＥＦ、ＫＫＥＬ、ＨＡＤＬ、ＨＡＥＬ、ＨＩＥＬ、ＨＮＥＬ、ＨＴＥＬ、ＫＴＥＬ、ＨＶＥＬ、ＮＤＥＬ、ＱＤＥＬ、ＲＥＤＬ、ＲＮＥＬ、ＲＴＤＬ、ＲＴＥＬ、ＳＤＥＬ、ＴＤＥＬ、ＳＫＥＬ、ＳＴＥＬ、及びＥＤＥＬからなる群から選択される。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、参照分子、例えば、ＫＤＥＬファミリーのいずれのカルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフも含まないことを除く細胞標的化分子からなる第２２の細胞標的化分子などの細胞毒性より大きい細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、よりよく最適化された細胞毒性効力を有する細胞毒性、例えば第２２の細胞標的化分子などの参照分子と比較して４倍、５倍、６倍、９倍、又はそれより大きい細胞毒性を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、標的陽性細胞集団に対する本発明の細胞標的化分子の細胞毒性は、ＣＤ５０値によってアッセイした場合、第２の標的陽性細胞集団に対する第２２の細胞標的化分子の細胞毒性の、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍であるか、又はそれより大きい。
実施形態セット番号２〜番号１１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの挿入された又は組み込まれた異種エピトープをさらに含む。
実施形態セット番号２〜番号１１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つ、２つ、又は３つの破壊された内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域をさらに含む。ある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つ、２つ、又は３つの内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ及び／又はエピトープ領域の破壊を含む。ある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの挿入された又は組み込まれた異種エピトープとオーバーラップしない少なくとも１つの破壊された内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域をさらに含む。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端は、細胞標的化分子のポリペプチド要素のアミノ末端にある、及び／又はその近位にある。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドと比べて、細胞標的化分子のアミノ末端の近位に位置していない。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドは、結合領域が志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の近位に位置しないように、細胞標的化分子内に物理的に配列又は配向されている。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、細胞標的化分子内において、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端より志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端の近位に位置する。ある特定のさらなる実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、細胞毒性ではなく、細胞に導入された場合、参照分子、例えば、アミノ末端を有し、さらに結合領域と第３の細胞標的化分子のアミノ末端に又はその近位に配置されていない志賀毒素エフェクターポリペプチドとを含む第２３の細胞標的化分子などの細胞内経路決定効率と比較してより大きい細胞外空間から小胞体及び／又はサイトゾルの細胞内区画への細胞内経路決定効率を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、よりよく最適化された細胞毒性効力を有する細胞毒性、例えば第２３の細胞標的化分子の細胞毒性と比較して４倍、５倍、６倍、９倍、又はそれより大きい細胞毒性を表す。ある特定のさらなる実施形態に関して、標的陽性細胞集団に対する本発明の細胞標的化分子の細胞毒性は、ＣＤ５０値によってアッセイした場合、第２の標的陽性細胞集団に対する第２３の細胞標的化分子の細胞毒性の、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍であるか、又はそれより大きい。ある特定のさらなる実施形態において、第２３の細胞標的化分子は、ＫＤＥＬファミリーのいずれのカルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフも含まない。
実施形態セット番号２〜番号１１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２の１〜１５；配列番号３の３〜１４；配列番号３の２６〜３７；配列番号１又は配列番号２の２７〜３７；配列番号１又は配列番号２の３９〜４８；配列番号３の４２〜４８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５３〜６６；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４〜１１５；配列番号１又は配列番号２の１４１〜１５３；配列番号３の１４０〜１５６；配列番号１又は配列番号２の１７９〜１９０；配列番号３の１７９〜１９１；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５、及び配列番号３の２１０〜２１８；配列番号３の２４０〜２６０；配列番号１又は配列番号２の２４３〜２５７；配列番号１又は配列番号２の２５４〜２６８；配列番号３の２６２〜２７８；配列番号３の２８１〜２９７；配列番号１又は配列番号２の２８５〜２９３；配列番号１又は配列番号２の４〜３３；配列番号１又は配列番号２の３４〜７８；配列番号１又は配列番号２の７７〜１０３；配列番号１又は配列番号２の１２８〜１６８；配列番号１又は配列番号２の１６０〜１８３；配列番号１又は配列番号２の２３６〜２５８；及び配列番号１又は配列番号２の２７４〜２９３；又は志賀毒素Ａサブユニット又はそれらの派生物において相当する領域からなる天然に位置する志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択されるＢ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域において破壊をさらに含む。ある特定のさらなる実施形態において、少なくとも１つの破壊された内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ及び／又はエピトープ領域の一部又は全てとオーバーラップするアミノ酸残基のカルボキシ末端のトランケーションである破壊は存在しない。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、天然に位置する志賀毒素Ａサブユニットのアミノ酸残基の群：Ｌ４９、Ｄ１９７、Ｄ１９８、Ｒ２０４、及びＲ２０５から選択されるＢ細胞の免疫原性のアミノ酸残基において、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する変異をさらに含む。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープは、（ｉ）配列番号１又は配列番号２の１〜１５；配列番号３の３〜１４；配列番号３の２６〜３７；配列番号１又は配列番号２の２７〜３７；配列番号１又は配列番号２の３９〜４８；配列番号３の４２〜４８；及び配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５３〜６６；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域であって、少なくとも１つの破壊されたエピトープ領域の一部又は全てとオーバーラップする配列のアミノ末端のトランケーションである破壊は存在しない、領域；（ii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４〜１１５；配列番号１又は配列番号２の１４１〜１５３；配列番号３の１４０〜１５６；配列番号１又は配列番号２の１７９〜１９０；配列番号３の１７９〜１９１；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；及び配列番号３の２１０〜２１８；並びに（iii）配列番号３の
２４０〜２６０；配列番号１又は配列番号２の２４３〜２５７；配列番号１又は配列番号２の２５４〜２６８；配列番号３の２６２〜２７８；配列番号３の２８１〜２９７；及び配列番号１又は配列番号２の２８５〜２９３；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域からなる天然に位置する志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択される、内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域を破壊させる。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（ｉ）配列番号１又は配列番号２の１〜１５；配列番号３の３〜１４；配列番号３の２６〜３７；配列番号１又は配列番号２の２７〜３７；配列番号１又は配列番号２の３９〜４８；配列番号３の４２〜４８；及び配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５３〜６６；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当す
る領域であって、少なくとも１つの破壊されたエピトープ領域の一部又は全てとオーバーラップする配列のアミノ末端のトランケーションである破壊は存在しない、領域；（ii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４〜１１５；配列番号１又は配列番号２の１４１〜１５３；配列番号３の１４０〜１５６；配列番号１又は配列番号２の１７９〜１９０；配列番号３の１７９〜１９１；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；及び配列番号３の２１０〜２１８；並びに（iii）配列番号３の２４０〜２６０
；配列番号１又は配列番号２の２４３〜２５７；配列番号１又は配列番号２の２５４〜２６８；配列番号３の２６２〜２７８；配列番号３の２８１〜２９７；及び配列番号１又は配列番号２の２８５〜２９３；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域であって、少なくとも１つの破壊されたエピトープ領域の一部又は全てとオーバーラップする配列のアミノ末端のトランケーションである破壊は存在しない、領域からなる天然に位置する志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択されるＢ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域中の、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する変異を含む。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４〜１１５；配列番号１又は配列番号２の１４１〜１５３；配列番号３の１４０〜１５６；配列番号１又は配列番号２の１７９〜１９０；配列番号３の１７９〜１９１；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；又は配列番号３の２１０〜２１８からなる天然に位置する志賀毒素Ａサブユニットの群から選択される少なくとも１つの内因性エピトープ領域の破壊を含む。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、異種のＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞エピトープを含まない。ＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞エピトープは当業界において公知であるか、又は熟練者であれば予測が可能である。異種という用語は、野生型志賀毒素Ａサブユニット、例えば所望の志賀毒素エフェクターポリペプチドに最も密接に関連する野生型志賀毒素Ａサブユニットなどに天然に存在しないＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞エピトープを指す。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又は９つ以上の内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域の破壊を含む。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、１つ又は２つ以上の破壊は、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対するアミノ酸残基の置換を含む。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、１つ又は２つ以上の内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域は、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する複数のアミノ酸残基の置換を含む。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの破壊は、内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域中の、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する複数のアミノ酸残基の置換を含む。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、少なくとも１つの破壊は、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又は９つ以上のアミノ酸残基の置換を含み、少なくとも１つの置換は、配列番号１又は配列番号２の１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の６；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９；配列番号１、配列番号２、又は配列
番号３の１１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１２；配列番号１又は配列番号２の３３；配列番号１又は配列番号２の４３；配列番号１又は配列番号２の４４；配列番号１又は配列番号２の４５；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４６；配列番号１又は配列番号２の４７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４９；配列番号１又は配列番号２の５０；配列番号１又は配列番号２の５１；配列番号１又は配列番号２の５３；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５４；配列番号１又は配列番号２の５５；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５６；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５９；配列番号１又は配列番号２の６０；配列番号１又は配列番号２の６１；配列番号１又は配列番号２の６２；配列番号１又は配列番号２の８４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の８８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９６；配列番号１又は配列番号２の１０４；配列番号１又は配列番号２の１０５；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１０７；配列番号１又は配列番号２の１０８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１０９；配列番号１又は配列番号２の１１０；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１２；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１４１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１４７；配列番号１又は配列番号２の１５４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１７９；配列番号１又は配列番号２の１８０；配列番号１又は配列番号２の１８１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８３；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８４；配列番号１又は配列番号２の１８５；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８６；配列番号１又は配列番号２の１８７；配列番号１又は配列番号２の１８８；配列番号１又は配列番号２の１８９；配列番号３の１９７；配列番号１又は配列番号２の１９８；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；配列番号１又は配列番号２の２４７；配列番号３の２４７；配列番号１又は配列番号２の２４８；配列番号３の２５０；配列番号１又は配列番号２の２５１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の２６４；配列番号１又は配列番号２の２６５；及び配列番号１又は配列番号２の２８６；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当するアミノ酸残基からなる群から選択される天然に位置する志賀毒素Ａサブユニットのアミノ酸残基で生じていてもよい。ある特定のさらなる実施形態において、少なくとも２つの破壊はそれぞれ、配列番号１又は配列番号２の１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１；配列番号１又は配列番号２の３３；配列番号１又は配列番号２の４３；配列番号１又は配列番号２の４５；配列番号１又は配列番号２の４７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４８；配列番号１又は配列番号２の４９；配列番号１又は配列番号２の５３；配列番号１又は配列番号２の５５；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５９；配列番号１又は配列番号２の６０；配列番号１又は配列番号２の６１；配列番号１又は配列番号２の６２；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９６；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１０９；配列番号１又は配列番号２の１１０；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１２；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１４７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１７９；配列番号１又は配列番号２の１８０；配列番号１又は配列番号２の１８１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８３；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８４；配列番号１又は配列番号２の１８５；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８６；配列番号１又は配列番号２の１８７；配列番号１又は配列番号２の１８８；配列番号１又は配列番号２の１８９；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；配列番号１又は配列番号２の２４７；配列番号３の２４７；配列番号３の２５０；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の２６４；配列番号１又は配列番号２の２６５；及び配列番号１
又は配列番号２の２８６；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当するアミノ酸残基からなる群から選択される、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を含む。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（ｉ）配列番号１又は配列番号２の１〜１５；配列番号３の３〜１４；配列番号３の２６〜３７；配列番号１又は配列番号２の２７〜３７；配列番号１又は配列番号２の３９〜４８；配列番号３の４２〜４８；及び配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５３〜６６、又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域であって、少なくとも１つの破壊された内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域の一部又は全てとオーバーラップするアミノ酸残基のアミノ末端のトランケーションである破壊は存在しない、領域；（ii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４〜１１５；配列番号１又は配列番号２の１４１〜１５３；配列番号３の１４０〜１５６；配列番号１又は配列番号２の１７９〜１９０；配列番号３の１７９〜１９１；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；及び配列番号３の２１０〜２１８；並びに（iii）配列番号３の２４０〜２６０；配列番号１又は配列番号２の２４３〜２５７；
配列番号１又は配列番号２の２５４〜２６８；配列番号３の２６２〜２７８；配列番号３の２８１〜２９７；及び配列番号１又は配列番号２の２８５〜２９３；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域であって、少なくとも１つの破壊された内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ及び／又はエピトープ領域の一部又は全てとオーバーラップするアミノ酸残基のカルボキシ末端のトランケーションである破壊は存在しない、領域からなる群から選択される少なくとも３つの内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域の破壊を含む。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも２つの内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域の破壊を含み、各破壊は、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の置換を含み、内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域は、配列番号３の３〜１４；配列番号３の２６〜３７；配列番号１又は配列番号２の２７〜３７；配列番号１又は配列番号２の３９〜４８；配列番号３の４２〜４８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５３〜６６；又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物において相当する領域からなる天然に位置する志賀毒素Ａサブユニット領域の群から選択される。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープは、本明細書に記載されるいかなる内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域も破壊しない。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、少なくとも１つの破壊は、ＤからＡ、ＤからＧ、ＤからＶ、ＤからＬ、ＤからＩ、ＤからＦ、ＤからＳ、ＤからＱ、ＤからＭ、ＤからＲ、ＥからＡ、ＥからＧ、ＥからＶ、ＥからＬ、ＥからＩ、ＥからＦ、ＥからＳ、ＥからＱ、ＥからＮ、ＥからＤ、ＥからＭ、ＥからＲ、ＦからＡ、ＦからＧ、ＦからＶ、ＦからＬ、ＦからＩ、ＧからＡ、ＧからＰ、ＨからＡ、ＨからＧ、ＨからＶ、ＨからＬ、ＨからＩ、ＨからＦ、ＨからＭ、ＩからＡ、ＩからＶ、ＩからＧ、ＩからＣ、ＫからＡ、ＫからＧ、ＫからＶ、ＫからＬ、ＫからＩ、ＫからＭ、ＫからＨ、ＬからＡ、ＬからＶ、ＬからＧ、ＬからＣ、ＮからＡ、ＮからＧ、ＮからＶ、ＮからＬ、ＮからＩ、ＮからＦ、ＰからＡ、ＰからＧ、ＰからＦ、ＲからＡ、ＲからＧ、ＲからＶ、ＲからＬ、ＲからＩ、ＲからＦ、ＲからＭ、ＲからＱ、ＲからＳ、ＲからＫ、ＲからＨ、ＳからＡ、ＳからＧ、ＳからＶ、ＳからＬ、ＳからＩ、ＳからＦ、ＳからＭ、ＴからＡ、ＴからＧ、ＴからＶ、ＴからＬ、ＴからＩ、ＴからＦ、ＴからＭ、ＴからＳ、ＶからＡ、ＶからＧ、ＹからＡ、ＹからＧ、ＹからＶ、ＹからＬ、ＹからＩ、ＹからＦ、ＹからＭ、及びＹか
らＴからなる群から選択される、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の置換を含む。ある特定のさらなる実施形態において、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の置換は、ＤからＡ、ＤからＧ、ＤからＶ、ＤからＬ、ＤからＩ、ＤからＦ、ＤからＳ、ＤからＱ、ＥからＡ、ＥからＧ、ＥからＶ、ＥからＬ、ＥからＩ、ＥからＦ、ＥからＳ、ＥからＱ、ＥからＮ、ＥからＤ、ＥからＭ、ＥからＲ、ＧからＡ、ＨからＡ、ＨからＧ、ＨからＶ、ＨからＬ、ＨからＩ、ＨからＦ、ＨからＭ、ＫからＡ、ＫからＧ、ＫからＶ、ＫからＬ、ＫからＩ、ＫからＭ、ＫからＨ、ＬからＡ、ＬからＧ、ＮからＡ、ＮからＧ、ＮからＶ、ＮからＬ、ＮからＩ、ＮからＦ、ＰからＡ、ＰからＧ、ＰからＦ、ＲからＡ、ＲからＧ、ＲからＶ、ＲからＬ、ＲからＩ、ＲからＦ、ＲからＭ、ＲからＱ、ＲからＳ、ＲからＫ、ＲからＨ、ＳからＡ、ＳからＧ、ＳからＶ、ＳからＬ、ＳからＩ、ＳからＦ、ＳからＭ、ＴからＡ、ＴからＧ、ＴからＶ、ＴからＬ、ＴからＩ、ＴからＦ、ＴからＭ、ＴからＳ、ＹからＡ、ＹからＧ、ＹからＶ、ＹからＬ、ＹからＩ、ＹからＦ、及びＹからＭからなる群から選択される。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、破壊の少なくとも１つは、Ｋ１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ及びＨ；Ｔ４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ及びＲ；Ｓ８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｋ１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ及びＨ；Ｔ１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、Ｓ、及びＫ；Ｓ１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｓ３３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＣ；Ｓ４３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４４からＡ又はＬ；Ｓ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｔ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４６からＡ及びＰ；Ｄ４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｍ、及びＱ；Ｎ４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｍ及びＦ；Ｌ４９からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｙ４９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＴ；Ｆ５０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、及びＴ；Ａ５１；Ｄ５３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｖ５４からＡ、Ｇ、Ｉ、及びＬ；Ｒ５５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｇ５６からＡ及びＰ；Ｉ５７からＡ、Ｇ、Ｖ、及びＭ；Ｌ５７からＡ、Ｖ、Ｃ、Ｇ、Ｍ、及びＦ；Ｄ５８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｐ５９からＡ、Ｇ、及びＦ；Ｅ６０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、Ｔ、及びＲ；Ｅ６１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、及びＲ；Ｇ６２からＡ；Ｒ８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｖ８８からＡ及びＧ；Ｉ８８からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｄ９４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｓ９６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ；及びＮ；Ａ１０５からＬ；Ｔ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＰ；Ｓ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＰ；Ｌ１０８からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｓ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｇ１１０からＡ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、及びＴ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１４１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ１４７からＡ；Ｖ１５４からＡ及びＧ；Ｒ１７９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｔ１８０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｔ１８１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ１８３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｌ１８５からＡ、Ｇ、Ｖ及びＣ；Ｓ１８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｇ１８７からＡ；Ｒ１８８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｓ１８９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１９７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１９８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｒ２０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２０５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ及びＨ；Ｓ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｙ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｒ２４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５０からＡ、Ｇ、
Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｄ２６４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ２６４からＡ；並びにＴ２８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳからなる群から選択される、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の置換を含む。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、脊索動物に導入された場合、参照分子、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド要素の全てがそれぞれ、そのＡ１断片領域のカルボキシ末端に野生型志賀毒素Ａ１断片及び／又は野生型志賀毒素のフーリン切断部位を含むことを除く細胞標的化分子からなる第２４の細胞標的化分子などと比較してインビボ忍容性及び／又は安定性の改善を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは細胞毒性ではなく、分子部分は細胞毒性である。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドは、直接的又は間接的のいずれかで一緒に連結されている。
実施形態セット番号２〜番号１１のある特定の実施形態において、結合領域は、少なくとも１つのペプチド及び／又はポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、免疫グロブリン型の結合領域であるか又はそれを含む。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、自律的なＶＨドメイン、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、ナノボディ、ラクダ科動物由来の重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ又はＶＨドメイン断片）、軟骨魚類由来の重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ又はＶＨドメイン断片）、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、ＶＮＡＲ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗体可変断片（Ｆｖ）、相補性決定領域３断片（ＣＤＲ３）、拘束ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ポリペプチド（ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）、Ｆｄ断片、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）ドメイン、抗原結合断片（Ｆａｂ）、アルマジロ反復ポリペプチド（ＡｒｍＲＰ）、フィブロネクチン由来第１０フィブロネクチンIII型ドメイン（１０Ｆｎ３）、テネイシ
ンIII型ドメイン（ＴＮｆｎ３）、アンキリン反復モチーフドメイン、低密度リポタンパ
ク質受容体由来Ａドメイン（ＬＤＬＲ−Ａ）、リポカリン（アンチカリン）、クニッツドメイン、プロテインＡ由来Ｚドメイン、ガンマ−Ｂ結晶由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Ｓａｃ７ｄ由来ポリペプチド（アフィチン）、Ｆｙｎ由来ＳＨ２ドメイン、ミニタンパク質、Ｃ型レクチン様ドメイン足場、改変抗体模倣物、及び結合機能を保持する前述のもののいずれかのあらゆる遺伝子操作された対応物からなる群から選択されるポリペプチドを含む。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、（ｉ）野生型志賀毒素Ａ１断片又は野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドと同程度の触媒活性レベル、（ii）半数阻害濃度（ＩＣ５０）値が１０，０００ピコモーラー以下のリボソーム阻害活性、及び／又は（iii）有意なレベルの志賀毒素の触媒活性を示す
ことができる。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子及び／又はその志賀毒素エフェクターポリペプチドは、野生型志賀毒素Ａ１断片又は野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む参照細胞標的化分子と同程度の細胞内経路決定効率を示すことができ、及び／又は細胞のエンドソーム開始位置から小胞体及び／又はサイトゾルへの有意なレベルの細胞内の経路決定活性を示すことができる。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態に関して、細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞に本発明の細胞標的化分子を投与す
ることにより、細胞標的化分子は、細胞の死滅を引き起こすことが可能である。ある特定のさらなる実施形態において、細胞外標的生体分子の存在又はレベルに関して異なる２種の異なる細胞型の集団に本発明の細胞標的化分子を投与すると、細胞標的化分子は、細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合していない細胞型に対するＣＤ５０の少なくとも３倍又はそれ未満のＣＤ５０で、細胞毒性細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞型に細胞死をもたらすことが可能である。ある特定の実施形態に関して、そのメンバーが細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子に物理的に結合している第１の細胞集団、及びそのメンバーが結合領域のいずれの細胞外標的生体分子にも物理的に結合していない第２の細胞集団に本発明の細胞標的化分子を投与することにより、前記第１の細胞集団のメンバーに対する細胞標的化分子の細胞毒性効果が、前記第２の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果に比べて少なくとも３倍大きい。ある特定の実施形態に関して、そのメンバーが有意な量の細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子に物理的に結合している第１の細胞集団、及びそのメンバーが有意な量の結合領域のいずれの細胞外標的生体分子にも物理的に結合していない第２の細胞集団に本発明の細胞標的化分子を投与することにより、前記第１の細胞集団のメンバーに対する細胞標的化分子の細胞毒性効果が、前記第２の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果に比べて少なくとも３倍大きい。ある特定の実施形態に関して、第１の標的生体分子陽性細胞集団、及びそのメンバーが細胞表面において有意な量の細胞標的化分子の結合領域の標的生体分子を発現しない第２の細胞集団に本発明の細胞標的化分子を投与することにより、第１の細胞集団のメンバーに対する細胞標的化分子の細胞毒性効果が、第２の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果に比べて少なくとも３倍大きい。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、半数阻害濃度（ＣＤ５０）値が３００ｎＭ以下の細胞毒性を示すことができる、及び／又は有意なレベルの志賀毒素の細胞毒性を示すことができる。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、ＭＨＣクラスＩ分子によって結合したエピトープの細胞表面提示のために、細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に組み込まれた又は挿入された異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達することが可能である。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端と会合した分子部分を含む。ある特定の実施形態において、分子部分は、結合領域を含むか又はからなる。ある特定の実施形態において、分子部分は、少なくとも１つのアミノ酸を含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、分子部分の少なくとも１つのアミノ酸残基に連結されている。ある特定のさらなる実施形態において、分子部分及び志賀毒素エフェクターポリペプチドは融合されて、連続的なポリペプチドを形成している。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端と会合した細胞毒性分子部分をさらに含む。ある特定の実施形態に関して、細胞毒性分子部分は、細胞毒性剤、例えば、熟練者公知の及び／又は本明細書に記載される、低分子化学療法剤、抗新生物剤、細胞毒性抗生物質、アルキル化剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、及び／又はチューブリン阻害剤などである。ある特定のさらなる実施形態に関して、細胞毒性分子部分は、１０，０００、５，０００、１，０００、５００、又は２００ｐＭ未満の濃度で細胞毒性である。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、結合領域は、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ２、前立腺特異的膜抗原、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｃ
ＤＣＰ１、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、ルイス−Ｙ、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通型受容体（ＲＯＲ１又はＮＴＲＫＲ１）、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合タンパク質、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドルイス−Ｙ２、ＶＥＧＦＲ、アルファＶベータ３、アルファ５ベータ１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、Ｅｒｂ３、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫ、ＦＡＰ、テネイシン、ＣＤ６４、メソテリン、ＢＲＣＡ１、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、ベータ−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ６、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパルチル（アスパラギニル）ベータ−ヒドロキシラーゼ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ−３、ＭＵＣ１、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ関連抗原、ＨＰＶ−Ｅ７、エプスタイン−バーウイルス抗原、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、アルファ−フェトプロテイン抗原、１７−Ａ１、膀胱腫瘍抗原、ＣＤ３８、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ４５（タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｃ型）、ＣＤ５３、ＣＤ８８、ＣＤ１２９、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１、ＣＤ１９３、ＣＤ２４４、ＣＤ２９４、ＣＤ３０５、Ｃ３ＡＲ、ＦｃｅＲＩａ、ガレクチン−９、ＩＬ−１Ｒ（インターロイキン−１受容体）、ｍｒｐ−１４、ＮＫＧ２Ｄリガンド、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、シグレック−８、シグレック−１０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ１２３、ＴＬＲ４、ＦｃｅＲＩａ、ＩｇＥ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＩＬＴ−３、ガレクチン−３、ＣＤ１１ａ−ｃ、ＧＩＴＲＬ、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスII分子（ペプチドと複合体化していてもよい）、ＣＤ２８４（ＴＬＲ４）、ＣＤ１０７−Ｍａｃ３、ＣＤ１９５（ＣＣＲ５）、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６／３２、ＣＤ２８２（ＴＬＲ２）、ＣＤ１１ｃ、及び前述のもののいずれかのあらゆる免疫原性断片からなる群から選択される細胞外標的生体分子に結合することができる。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、結合領域は、直接的又は間接的のいずれかで、ジスルフィド結合ではない少なくとも１つの共有結合により志賀毒素エフェクターポリペプチドに連結されている。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、直接的又は間接的のいずれかで、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端に融合されて、単一の連続的なポリペプチドを形成している。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、免疫グロブリン型の結合領域である。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小のフーリン切断部位中に、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含む。ある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小のフーリン切断部位の少なくとも１つのアミノ酸残基の一部又は全てとオーバーラップする配列のアミノ末端のトランケーションではない。ある特定の実施形態において、最小のフーリン切断部位中の変異は、フーリン切断モチーフＲ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ中の少なくとも１つのアミノ酸残基のアミノ酸欠失、挿入、及び／又は置換である。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する少なくとも１つの変異を含み、変異は、１）志賀様毒素１のＡサブユニット（配列番号１）若しくは志賀毒素のＡサブユニット（配列番号２）の２４８〜２５１、又は２）志賀様毒素２のＡサブユニット（配列番号３）の２４７〜２５０、又はあらゆる志賀毒素Ａサブユニットにおいて相当するアミノ酸配列配置における天然に位置する領域中で、少なくとも１つのアミノ酸残基を変更する。ある特定のさらなる実施形態において、変異は、正電荷を有さないアミノ酸残基でのアルギニン残基のアミノ酸残基置換
である。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、参照分子、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド要素の全てがそれぞれ野生型志賀毒素Ａ１断片を含むことを除いた細胞標的化分子からなる第２５の細胞標的化分子などの細胞毒性と同程度の細胞毒性を示すことができる。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、結合領域は、配列番号８３〜３３９のいずれか１つに示されるペプチド又はポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、配列番号３３、６４、及び６５のいずれか１つのアミノ酸１〜２４５；配列番号４０又は配列番号８０の２６９〜５１３；配列番号３６、６６、及び６７のいずれか１つのアミノ酸２６９〜５２０又は２６９〜５２１；配列番号４７〜１１９及び１７６〜２４８のいずれか１つのアミノ酸１〜２３２、１〜２３３、１〜２３４、１〜２３５、１〜２３６、１〜２４２、１〜２４３、１〜２４４、１〜２４５、１〜２４６、１〜２５２、１〜２５３、１〜２５４、１〜２５５、又は１〜２５６；配列番号３７〜３９、６８〜７９、及び８１のいずれか１つのアミノ酸２６９〜４９８又は２６９〜４９９；配列番号３４、３５、４１〜５６、及び８２のいずれか１つのアミノ酸２６９〜４９９、２６９〜５１２、２６９〜５１３、又は２８０〜５１０のいずれかによって表されるポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、結合領域は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、分子部分は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする。ある特定のさらなる実施形態において、分子部分は、結合領域を含む。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、カルボキシ末端を志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に位置させた結合領域及び／又は分子部分を含む。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域及び／又は分子部分の質量は、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａであるか、又はそれより大きい。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、細胞標的化分子が本明細書で言及される適切なレベルの志賀毒素生物活性（例えば、細胞毒性及び／又は細胞内の経路決定）を保持する限り、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａであるか、又はそれより大きい質量を有する結合領域を含む。
実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、結合領域は、細胞標的化分子が本明細書で言及される適切なレベルの志賀毒素生物活性を保持する限り、例えば、少なくとも４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａであるか、又はそれより大きい質量を有する分子部分を含む、相対的に大きい分子部分内に含まれる。
実施形態セット番号２〜番号１１のある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、低い細胞毒性効力を表し（すなわちある特定の陽性標的細胞型に導入された場合、１０００ｎＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、又は５０ｎＭの細胞標的化分子濃度で細胞集団の１％細胞死より大きい細胞毒性を示すことができない）、細胞に導入された場合、参照分子、例えば、アミノ末端を有し、さらに結合領域と第３の細胞標的化分子のアミノ末端に又はその近位に配置されていない志賀毒素エフェクターポリペプチドとを含む第２６の細胞標的化分子などの細胞内経路決定効率と比較してより大きい細胞外空間から小胞体及び／又はサイトゾルの細胞内区画への細胞内経路決定効率を示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、第２６の細胞標的化分子は、ＫＤＥＬファミリーのいずれのカルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフも含まない。
実施形態セット番号２〜番号１１のある特定の実施形態において、ある特定のさらなる実施形態において、分子部分は、天然に存在する志賀毒素の志賀毒素Ａ２断片由来のペプチド及び／又はポリペプチドを含む。
本発明の実施形態は、全ての天然に存在する志賀ホロトキシン又は志賀毒素Ａサブユニットを網羅することは意図されていない。実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、天然に存在する志賀毒素Ｂサブユニットを含まない。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、天然の志賀毒素Ｂサブユニットの機能的な結合ドメインを含むか又はそれから本質的になるいかなるポリペプチドも含まない。それよりもむしろ、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、志賀毒素Ａサブユニット由来の領域は、細胞標的化を実現するために異種結合領域と機能的に会合している。
実施形態セット番号２〜番号１１のある特定の実施形態において、結合領域は、アミノ酸残基１９〜１８３に対応するヒトＣＤ４の断片を含まない。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、Ｉ型膜貫通糖タンパク質であるヒトＣＤ４の断片を含まない。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、ヒト免疫細胞表面の補助受容体の断片を含まない。
実施形態セット番号２〜番号１１のある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、カルボキシ末端、免疫細胞表面の受容体の断片を含む結合領域を含まない。
実施形態セット番号１〜番号１１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも２つの組み込まれた又は挿入された異種エピトープを含む。
実施形態セット番号１〜番号１１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、以下のセット：（１）Ｒ２４８Ｈ及びＲ２５１Ｈ；（２）Ｒ２４８Ｇ及びＲ２５１Ｇ；（３）Ａ２４６Ｇ、Ｓ２４７Ａ、Ａ２５３Ｇ、及びＳ２５４Ａ；並びに（４）Ａ２４６Ｇ、Ｓ２４７Ａ、Ｒ２４８Ｇ、Ｒ２５１Ｇ、Ａ２５３Ｇ、及びＳ２５４Ａから選択される野生型志賀毒素Ａサブユニットに対するアミノ酸残基の置換のセットを含まない。
実施形態セット番号１〜番号１１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、野生型志賀毒素Ａサブユニット中の２４７〜２５２における天然に位置する領域の欠失を含まない。実施形態セット番号２〜１１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、野生型志賀毒素Ａサブユニット中の２４５〜２４７及び２５３〜２５５における天然に位置する領域の欠失を含まない。
実施形態セット番号１〜１１のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチドの酵素活性を変化させる、志賀毒素フ
ァミリーのメンバーの天然に存在するＡサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含み、変異が、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換から選択される。ある特定のさらなる実施形態において、天然に存在するＡサブユニットに対する変異は、志賀毒素エフェクターポリペプチドの細胞毒性活性を低減又は除去するが、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば細胞内在化を促進すること、及び／又はある特定の細胞内の区画への細胞内の経路決定を指示することなどの少なくとも１つの他の志賀毒素エフェクター機能を保持する。ある特定のさらなる実施形態において、天然に存在するＡサブユニットに対する変異は、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、例えば、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３におけるＡ２３１Ｅ、Ｒ７５Ａ、Ｙ７７Ｓ、Ｙ１１４Ｓ、Ｅ１６７Ｄ、Ｒ１７０Ａ、Ｒ１７６Ｋ、及び／又はＷ２０３Ａなどから選択される。
実施形態セット番号１〜番号１１のある特定の実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（ｉ）サイトゾル、小胞体、及びリソソームから選択される、志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞の細胞内区画への経路決定；（ii）初期エンドソーム区画から志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞のプロテアソームへのエピトープの細胞内の送達；及び／又は（iii）志賀毒素エフェクターポリペプチドが
存在する細胞の初期エンドソーム区画からＭＨＣクラスＩ分子へのエピトープの細胞内の送達が可能である。ある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子に提示させるために、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを細胞内送達することができる。
ある特定の実施形態において、本発明の分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端及び／又は志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端の位置に、いかなる追加の抗原を表示する外因性物質及び／又は異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドも含まない。
実施形態セット番号２〜番号１１のある特定の実施形態において、結合領域は、リガンドを含まない。実施形態セット番号２〜番号１１のある特定の実施形態において、結合領域は、ケモカイン又はＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）も、それらの受容体結合断片も含まない。実施形態セット番号２〜番号１１のある特定の実施形態において、結合領域は、ヒトケモカイン又はヒトＴＲＡＩＬも、それらの受容体結合断片も含まない。実施形態セット番号２〜番号１１の実施形態において、免疫グロブリン型の結合領域は、リガンドも、それらの受容体結合断片も含まない。実施形態セット番号２〜番号１１のある特定の実施形態において、免疫グロブリン型の結合領域は、ケモカイン又はＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）も、それらの受容体結合断片も含まない。実施形態セット番号２〜番号１１のある特定の実施形態において、結合領域は、ヒトＣＣケモカインも、それらの受容体結合断片も含まない。実施形態セット番号２〜番号１１のある特定の実施形態において、結合領域は、ヒトＣＣケモカインＣＣＬ２を含まない（Bose S, Cho J et al., Arch Pharm Res 36: 1039-50 (2013)を参照）。実施形態セッ
ト番号２〜番号１１のある特定の実施形態において、結合領域は、ヒトＣＣケモカインＣＣＬ２も、それらの受容体結合断片、及びＳｔｘＡのアミノ酸７５〜２４７からなる志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端も含まない。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、結合領域は、ＳｔｘＡ（配列番号２）のアミノ酸７５〜２４７からなる志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端に融合した、ヒトＣＣケモカインＣＣＬ２も、それらの受容体結合断片も含まない。実施形態セット番号２〜番号１１の実施形態において、結合領域は、ヒトＴＲＡＩＬも、それらの受容体結合断片も含まない。
本発明のある特定の実施形態のなかでも、上記した本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドのいずれか１つ及び／又は上記した本発明の細胞標的化分子のいずれか１つ、並
びに少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む医薬組成物が挙げられる。
本発明のある特定の実施形態のなかでも、上記した本発明の細胞標的化分子のいずれか１つ及び検出促進剤を含む診断用組成物が挙げられる。ある特定のさらなる実施形態は、検出促進剤が異種エピトープであり、細胞標的化分子が異種エピトープを含む、本発明の細胞標的化分子である。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、本発明の細胞標的化分子、及びそれらの組成物の他にも、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド又は細胞標的化分子をコードすることができるポリヌクレオチド、加えて本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに本発明のいずれかのポリヌクレオチド及び／又は発現ベクターを含む宿主細胞も、本発明の範囲内である。発現ベクターを含む宿主細胞は、例えば、本発明の分子又はそれらのポリペプチド成分若しくは断片を組換え発現により産生するための方法で使用されてもよい。
本発明のある特定の実施形態のなかでも、上記した本発明の細胞標的化分子又は上記した本発明の医薬組成物のいずれかと細胞を接触させるステップを含む、細胞を死滅させる方法が挙げられる。ある特定の実施形態において、細胞を接触させるステップはインビトロで行われる。ある特定の他の実施形態において、細胞を接触させるステップはインビボで行われる。細胞を死滅させる方法のさらなる実施形態において、本方法は、細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子の細胞外における存在及び／又は発現レベルに関して異なる細胞の混合物を接触させた場合に、他の細胞及び／又は細胞型よりも優先的に細胞及び／又は細胞型を選択的に死滅させることができる。
本発明はさらに、患者における疾患、障害、及び／又は状態を治療する方法であって、それを必要とする患者に、本発明の細胞標的化分子及び／又は医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の方法を使用して治療しようとする疾患、障害、又は状態は、がん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、又は微生物感染から選択される。これらの方法のある特定の実施形態において、治療しようとするがんは、骨がん、乳がん、中枢／末梢神経系がん、消化器がん、生殖細胞がん、腺がん、頭頸部がん、血液がん、腎臓から尿道のがん、肝臓がん、肺／胸膜がん、前立腺がん、肉腫、皮膚がん、及び子宮がんからなる群から選択される。これらの方法のある特定の実施形態において、治療しようとする免疫障害は、アミロイド症、強直性脊椎炎、喘息、クローン病、糖尿病、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、橋本甲状腺炎、溶血尿毒症症候群、ＨＩＶ関連の疾患、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、結節性多発性動脈炎、多発関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、強皮症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、及び脈管炎からなる群から選択される疾患に関連する免疫障害である。
がん、腫瘍、増殖異常、及び／又は免疫障害を治療又は予防するためのいずれかの本発明の物質の合成物の使用は、本発明の範囲内である。本発明のある特定の実施形態のなかでも、がん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、及び／又は微生物感染を治療又は予防するための本発明の細胞標的化分子及び／又はそれらの医薬組成物が挙げられる。本発明のある特定の実施形態のなかでも、がん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、又は微生物感染を治療又は予防するための医薬品の製造における本発明の細胞標的化分子及び／又はそれらの医薬組成物の使用が挙げられる。
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、本発明の細胞標的化分子の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞への追加の外因性物質の送達のために利用しても
よい。加えて、本発明は、細胞の内部に外因性物質を送達するための方法であって、インビトロ又はインビボのいずれかで、細胞を、本発明の細胞標的化分子、医薬組成物、及び／又は診断用組成物と接触させるステップを含む、方法を提供する。本発明はさらに、患者における細胞の内部に外因性物質を送達するための方法であって、患者に、本発明の細胞標的化分子（細胞毒性活性を有する又は有さない）を投与するステップを含み、標的細胞は、細胞標的化分子の細胞外標的生体分子と物理的に結合している、方法を提供する。
本発明のある特定の実施形態のなかでも、細胞のＭＨＣクラスＩ分子による提示が可能なＴ細胞エピトープを細胞に送達する方法であって、細胞を、異種Ｔ細胞エピトープに会合する本発明の細胞標的化分子及び／又はそれらの組成物（例えば、本発明の医薬品又は診断用組成物）と接触させるステップを含む、方法が挙げられる。
本発明のある特定の実施形態のなかでも、脊索動物内の組織の場所を「シーディング（seeding）」するための方法であって、脊索動物に、本発明の細胞標的化分子、本発明の
医薬組成物、及び／又は本発明の診断用組成物を投与するステップを含む、方法が挙げられる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の組織の場所を「シーディング」する方法は、悪性の、罹患した、又は炎症を起こした組織を含む組織の場所を「シーディング」するための方法である。ある特定のさらなる実施形態において、組織の場所を「シーディング」するための本発明の方法は、罹患した組織、腫瘤、がん性の増殖、腫瘍、感染した組織、又は異常な細胞塊からなる群から選択される組織を含む組織の場所を「シーディング」するための方法である。ある特定のさらなる実施形態において、組織の場所を「シーディング」するための本発明の方法は、脊索動物に、ＭＨＣクラスＩ複合体において細胞標的化分子の標的細胞によって天然に提示されないペプチド、標的細胞によって発現されるいずれのタンパク質中にも天然に存在しないペプチド、標的細胞のプロテオーム中に天然に存在しないペプチド、シーディングしようとする部位の細胞外の微環境中に天然に存在しないペプチド、及び標的化しようとする腫瘤又は感染した組織部位中に天然に存在しないペプチドからなる群から選択される異種Ｔ細胞エピトープを含む本発明の細胞標的化分子、本発明の医薬組成物、又は本発明の診断用組成物を投与することを含む。
疾患、障害、及び／又は状態の診断、予後予測、及び／又は特徴付けのためのいずれかの本発明の物質の合成物の使用は、本発明の範囲内である。本発明のある特定の実施形態のなかでも、疾患、障害、又は状態の診断、予後予測、又は特徴付けにおいて有用な情報収集のための、検出促進剤を含む本発明の細胞標的化分子及び／又は本発明の組成物（例えば診断用組成物）を使用する方法が挙げられる。本発明のある特定の実施形態のなかでも、本発明の細胞標的化分子及び／又は診断用組成物を使用して細胞（又はそれらの細胞内区画）を検出する方法であって、細胞を、細胞標的化分子及び／又は診断用組成物と接触させるステップ、並びに前記細胞標的化分子及び／又は診断用組成物の存在を検出するステップを含む、方法が挙げられる。ある特定の実施形態において、細胞を接触させるステップはインビトロで行われる。ある特定の実施形態において、細胞を接触させるステップはインビボで行われる。ある特定の実施形態において、細胞を検出するステップはインビトロで行われる。ある特定の実施形態において、細胞を検出するステップはインビボで行われる。ある特定のさらなる実施形態において、本方法は、生物への細胞標的化分子の投与後に１つ又は２つ以上のイメージング手順を使用して、前記生物における細胞標的化分子の位置を検出することを含む。例えば、本明細書に記載される検出促進剤を取り込む本発明の細胞標的化分子を使用して、本発明の関連する医薬組成物によって治療できる可能性があるとして疾患を特徴付けることができる。例えば、本発明のある特定の細胞標的化分子及びそれらの組成物（例えば本発明の医薬組成物及び診断用組成物）、並びに本発明の方法を使用して、患者が本発明の医薬組成物に応答するグループに属するかどうかを決定することができる。例えば、本発明のある特定の細胞標的化分子及びそれらの組成物を使用して、細胞表面上に送達された異種エピトープ−ペプチドを提示する細胞を同定し
、及び／又は本発明の細胞標的化分子により送達された異種エピトープ−ペプチドを提示する細胞を含有する対象を同定することができる。
本発明のある特定の実施形態のなかでも、本発明の分子を産生する方法であって、細菌細胞壁タンパク質ドメインの相互作用、例えばＰ．マグヌス（P. magnus）由来のプロテ
インＬ又はそれらの派生物及び結合ドメイン断片などを使用して、本発明の分子又はそれらのポリペプチド成分を精製するステップを含む、方法が挙げられる。ある特定のさらなる実施形態において、本方法の精製するステップは、配列番号６〜３２及び３４０〜３８３に示されるポリペプチドのいずれか１つを含むか又はそれから本質的になる志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態において、本方法の精製するステップは、配列番号４３〜８２及び４３９〜５１３に示されるポリペプチドのいずれか１つを含むか又はそれから本質的になる細胞標的化分子を含む。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドのある特定の実施形態は、脊索動物の免疫化及び／又はワクチン接種のための、免疫原又は免疫原の要素として利用されてもよい。本発明のある特定の実施形態のなかでも、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドを使用して脊索動物を免疫化する方法であって、脊索動物に、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドを投与することを含む、方法が挙げられる。ある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号６〜３２及び３４０〜３８３に示されるポリペプチドのいずれか１つを含むか又はそれから本質的になる。
本発明のある特定の実施形態のなかでも、本発明の物質の合成物を含み、任意選択で使用説明書、追加の試薬、及び／又は医薬送達デバイスを含むキットが挙げられる。キットは、試料又は対象中で細胞型（例えば腫瘍細胞）を検出するための試薬及び他のツールをさらに含んでいてもよい。
これら及び他の本発明の特色、態様及び利点は、以下の説明、添付の特許請求の範囲、及び添付の図面に関してよりよく理解されるようになると予想される。上述した本発明の要素は、以降、合成又は除去の目的についてまったく述べられていなくても、本発明の他の実施形態を作製するために自由に個々に組み合わせたり又は除去したりすることができる。
本発明の例示的な志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド（番号１〜５）及びそれを含む細胞標的化分子を示す図である（例えば、「２／３」は、志賀毒素エフェクターポリペプチド２又は３のいずれかを指す）。図１における例示的な分子の図は、本発明の実施形態の限られたセットの構造上の特徴をある特定の一般的な配置で例示するためのものである。これらの例示的な分子は、決して、本発明の分子の任意の構造上の特徴及び／又は構成要素の配置に関して、完全に限定的であることを意図するものでも、そのように見なされるものでもないことを理解されたい。図１の概略図に示される特徴の相対的なサイズ、位置、又は数は、簡略化されている。例えば、組み込まれた異種エピトープ及び内因性エピトープ領域の破壊の相対的な位置は、固定されない。同様に、組み込まれた異種エピトープ及び内因性エピトープ領域の破壊の総数は、固定されない。本発明の分子のある特定の実施形態は、単一の志賀毒素エフェクターポリペプチドにおける複数の破壊された内因性エピトープ領域、例えば、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上の領域の破壊などを含み、ここで、これらの破壊された内因性エピトープ領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチド全体にわたって分布していてもよく、これには、志賀毒素Ａ１断片に由来する領域のカルボキシ末端領域のフーリン切断モチーフとオーバーラップする破壊又はその内部にある破壊が含まれる（以下の表８を参照されたい）。本発明のある特定の実施形態は、志賀毒素Ａ１断片又はその派生物のカルボキシ末端に対してカルボキシ末端側、例えば、任意の破壊されたフーリン切断部位モチーフに対してカルボキシ末端側の位置などにある、内因性エピトープ領域の破壊を含む。図１の概略図は、本発明の任意の実施形態における分子構造の相対的なサイズに関する任意の情報を正確に表現することを意図するものではない。 インビトロでの濃度範囲にわたる本発明の例示的な細胞標的化分子のタンパク質合成阻害活性を示す図である。各試料分子について、アッセイ中に発現されたルシフェラーゼの発光強度を相対発光単位（ＲＬＵ，relative luminescent unit）で、底を１０として、試験した細胞標的化分子のピコモル単位の濃度の対数でプロットした。これらの例示的な細胞標的化分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分が志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に破壊されたフーリン切断部位を含むこと以外は野生型の志賀毒素Ａサブユニット断片（ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ（配列番号５））からなる「対照」細胞標的化分子と同程度のリボソーム阻害活性を呈した。図２は、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニットポリペプチドに対する例示的な変更、例えば、脱免疫化置換及び組み込まれた異種Ｔ細胞エピトープなどが、志賀毒素の触媒活性を大幅に損なわせることがなかったことを示す。 本発明の例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：ｓｃＦｖ−（ｎ）が、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分が志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に破壊されたフーリン切断部位を含むこと以外は野生型の志賀毒素Ａサブユニット断片（ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ（配列番号５））からなる「対照」細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−（ｎ）と同程度の細胞標的化細胞毒性を呈したことを示す図である。各細胞型について標的陽性細胞の生存率パーセントを、底を１０として、それぞれの細胞に投与した細胞標的化分子の濃度の対数でプロットした。図３は、例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４４）が、２つの異なる細胞型に対して、「対照」細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１（配列番号３４）と同程度の細胞毒性を呈したことを図示する。 本発明の例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：ｓｃＦｖ−（ｎ）が、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分が志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に破壊されたフーリン切断部位を含むこと以外は野生型の志賀毒素Ａサブユニット断片（ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ（配列番号５））からなる「対照」細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−（ｎ）と同程度の細胞標的化細胞毒性を呈したことを示す図である。各細胞型について標的陽性細胞の生存率パーセントを、底を１０として、それぞれの細胞に投与した細胞標的化分子の濃度の対数でプロットした。図４は、例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４４）が、標的陽性細胞型に対して、「対照」細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１（配列番号３４）と同程度の細胞毒性を呈したことを図示する。細胞標的化の特異性を、ｓｃＦｖ−１の標的生体分子の細胞表面発現が陰性の細胞株を用いた同じアッセイを使用して示した。図４では、細胞株Ｈについて、標的陰性細胞の生存率パーセントを、底を１０として、細胞に投与した細胞標的化分子の濃度の対数でプロットした。図４は、細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４４）が、試験した濃度において、標的陰性細胞型に対する細胞毒性を呈さなかったことを示す。 本発明の例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：ｓｃＦｖ−（ｎ）が、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分が志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に破壊されたフーリン切断部位を含むこと以外は野生型の志賀毒素Ａサブユニット断片（ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ（配列番号５））からなる「対照」細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−（ｎ）と同程度の細胞標的化細胞毒性を呈したことを示す図である。各細胞型について標的陽性細胞の生存率パーセントを、底を１０として、それぞれの細胞に投与した細胞標的化分子の濃度の対数でプロットした。図５は、例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４７）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１６：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５２）、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１９：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５５）が、２つの異なる細胞型に対して、「対照」細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１（配列番号３４）と同程度の細胞毒性を呈したことを図示する。 本発明の例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：ｓｃＦｖ−（ｎ）が、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分が志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に破壊されたフーリン切断部位を含むこと以外は野生型の志賀毒素Ａサブユニット断片（ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ（配列番号５））からなる「対照」細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−（ｎ）と同程度の細胞標的化細胞毒性を呈したことを示す図である。各細胞型について標的陽性細胞の生存率パーセントを、底を１０として、それぞれの細胞に投与した細胞標的化分子の濃度の対数でプロットした。図６は、例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１７：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５３）が、細胞株Ａに対して、「対照」細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１（配列番号３４）と同程度の細胞毒性を呈したが、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１７：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５３）は、細胞株Ｂに対しては、対照と比較して減弱化した細胞毒性を呈したことを図示する。図６は、細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１８：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５４）が、試験したいずれの細胞型に対しても、１００ｎＭまでの濃度で細胞毒性を呈さなかったことを示す。細胞標的化分子の代わりに標的化されていない野生型志賀毒素Ａ１断片を用いたこのアッセイの細胞毒性結果も、同様に示されている。 本発明の例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：ｓｃＦｖ−（ｎ）が、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分が志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に破壊されたフーリン切断部位を含むこと以外は野生型の志賀毒素Ａサブユニット断片（ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ（配列番号５））からなる「対照」細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−（ｎ）と同程度の細胞標的化細胞毒性を呈したことを示す図である。各細胞型について標的陽性細胞の生存率パーセントを、底を１０として、それぞれの細胞に投与した細胞標的化分子の濃度の対数でプロットした。図７は、例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ２：：ｓｃＦｖ−２（配列番号５８）が、細胞株Ｂ及びＧに対して、「対照」細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−２（配列番号３５）と同程度の細胞毒性を呈したが、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ２：：ｓｃＦｖ−２（配列番号５８）は、細胞株Ａに対しては、対照と比較して減弱化した細胞毒性を呈したことを図示する。図７は、細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１３：：ｓｃＦｖ−２（配列番号６２）が、試験した３つの細胞型に対して、対照と比較して大幅に減弱化した細胞毒性を呈したことを示す。 本発明の例示的な細胞標的化分子ｓｃＦｖ−３：：ＳＬＴ−１Ａ−コンボ５（配列番号６４）及びｓｃＦｖ−３：：ＳＬＴ−１Ａ−コンボ６（配列番号６５）が、２つの異なる標的陽性細胞型に対して、志賀毒素Ａサブユニット成分が野生型志賀毒素Ａサブユニット断片であった「対照」細胞標的化分子ｓｃＦｖ−３：：ＳＬＴ−１Ａ−ＷＴ（配列番号３３）と同程度の細胞標的化細胞毒性を呈したことを示す図である。２つの異なる細胞型について標的陽性細胞の生存率パーセントを、底を１０として、細胞に投与した細胞標的化分子の濃度の対数でプロットした。細胞株Ｂについては、ｓｃＦｖ−３：：ＳＬＴ−１Ａ−コンボ５（配列番号６４）及びｓｃＦｖ−３：：ＳＬＴ−１Ａ−コンボ６（配列番号６５）の両方が、ＣＤ５０値で測定した場合に、同等レベルの対照よりも低い細胞毒性力を呈した。細胞標的化の特異性を、ｓｃＦｖ−３の標的生体分子の細胞表面発現が陰性の細胞株を用いた同じアッセイを使用して示した。図８では、細胞株Ａについて、標的陰性細胞の生存率パーセントを、底を１０として、細胞に投与した細胞標的化分子の濃度の対数でプロットした。図８は、細胞標的化分子ｓｃＦｖ−３：：ＳＬＴ−１Ａ−コンボ５（配列番号６４）及びｓｃＦｖ−３：：ＳＬＴ−１Ａ−コンボ６（配列番号６５）が、標的陰性細胞型に対して、対照と同程度の標的化されない細胞毒性を呈したことを示す。 本発明の例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：ｓｃＦｖ−（ｎ）が、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分が志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に破壊されたフーリン切断部位を含むこと以外は野生型の志賀毒素Ａサブユニット断片（ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ（配列番号５））からなる「対照」細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−（ｎ）と同程度の細胞標的化細胞毒性を呈したことを示す図である。各細胞型について標的陽性細胞の生存率パーセントを、底を１０として、それぞれの細胞に投与した細胞標的化分子の濃度の対数でプロットした。図９は、例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−４（配列番号６６）及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１４：：ｓｃＦｖ−４（配列番号６７）が、標的陽性細胞型に対して、「対照」細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−４（配列番号３６）と同程度の細胞標的化細胞毒性を呈したことを図示する。細胞標的化の特異性を、ｓｃＦｖ−４の標的生体分子の細胞表面発現が陰性の細胞株を用いた同じアッセイを使用して示した。図９では、細胞株Ｅについて、標的陰性細胞の生存率パーセントを、底を１０として、細胞に投与した細胞標的化分子の濃度の対数でプロットした。図９は、細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−４（配列番号６６）及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１４：：ｓｃＦｖ−４（配列番号６７）が、標的陰性細胞型に対して、対照と同程度の標的化されない細胞毒性を呈したことを示す。 本発明の例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：ｓｃＦｖ−（ｎ）が、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分が志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に破壊されたフーリン切断部位を含むこと以外は野生型の志賀毒素Ａサブユニット断片（ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ（配列番号５））からなる「対照」細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−（ｎ）と同程度の細胞標的化細胞毒性を呈したことを示す図である。各細胞型について標的陽性細胞の生存率パーセントを、底を１０として、それぞれの細胞に投与した細胞標的化分子の濃度の対数でプロットした。図１０は、例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ８：：ｓｃＦｖ−５（配列番号６９）が、標的陽性細胞型に対して、「対照」細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−５（配列番号３７）と同程度の細胞標的化細胞毒性を呈したことを図示する。細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ９：：ｓｃＦｖ−５（配列番号７０）は、この細胞株に対して、対照と比較して減弱化した細胞毒性を呈し、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１１：：ｓｃＦｖ−５（配列番号７１）は、対照と比較して非常に低い細胞毒性力を呈した。 図１１〜１２は、本発明の例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：ｓｃＦｖ−１によって誘導されるカスパーゼ活性を、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分が志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に破壊されたフーリン切断部位を含むこと以外は野生型の志賀毒素Ａサブユニット断片（ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ（配列番号５））からなる「対照」細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−（ｎ）と比較して図示する。カスパーゼ活性パーセントを、底を１０として、細胞に投与した細胞標的化分子の濃度の対数でプロットした。図１１〜１２は、例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４４）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１４：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５０）、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−７（配列番号８１）が、試験した少なくとも１つの細胞株に関して、対照細胞標的化分子と同程度のカスパーゼ活性を誘導したことを示す。 図１１〜１２は、本発明の例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：ｓｃＦｖ−１によって誘導されるカスパーゼ活性を、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分が志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に破壊されたフーリン切断部位を含むこと以外は野生型の志賀毒素Ａサブユニット断片（ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ（配列番号５））からなる「対照」細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−（ｎ）と比較して図示する。カスパーゼ活性パーセントを、底を１０として、細胞に投与した細胞標的化分子の濃度の対数でプロットした。図１１〜１２は、例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４４）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１４：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５０）、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−７（配列番号８１）が、試験した少なくとも１つの細胞株に関して、対照細胞標的化分子と同程度のカスパーゼ活性を誘導したことを示す。 志賀毒素Ａ１断片を認識する３つの異なる抗体を使用した変性条件下でのウエスタンブロット分析による、本発明の例示的な細胞標的化分子及び対照細胞標的化分子の相対的な抗原性を示す図である。図１３は、複数の複製ゲル及び膜の写真を示す。「分子量マーカー」と記された第１のレーンは、タンパク質の分子量ラダーの移動パターンを示し、各ラダータンパク質バンドのおよそのサイズは、キロダルトン（ｋＤａ，kiloDalton）で示される。１〜４に番号付けしたレーンにロードし、泳動させた試料を、図の凡例に示す：＃１）ＳＬＴ−１Ａ：：コンボ７：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４４）、＃２）ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１（配列番号３４）、＃３ ＳＬＴ−１Ａ：：コンボ１４：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５０）、及びＳＬＴ−１Ａ：：コンボ１０：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４７）。上のパネルは、クーマシー染色した複製ゲルの写真を示し、２番目のパネル（上から）は、α−ＳＬＴ−１Ａ ｐＡｂ１でプローブした複製膜の写真を示し、３番目のパネル（上から）は、α−ＳＬＴ−１Ａ ｐＡｂ２でプローブした複製膜の写真を示し、最後のパネル（上から）は、α−ＳｔｘＡ ｍＡｂ１でプローブした複製膜の写真を示す。図１３は、例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４４）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４７）、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１４：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５０）が、それぞれ、このアッセイにおいて、参照分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１（配列番号３４）と比較して低減した抗原性を有することを示す。 志賀毒素Ａ１断片を認識する２つの異なる抗体を使用したＥＬＩＳＡ分析による、本発明の例示的な細胞標的化分子及び対照細胞標的化分子の相対的な抗原性を示す図である。正規化したＥＬＩＳＡ吸光シグナルを、対照分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１（配列番号３４）に対する割合としてグラフにする。図１４は、例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４４）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４７）、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１４：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５０）が、それぞれ、このアッセイにおいて、対照と比較して低減した抗原性を有することを示す。 図１５〜１６は、哺乳動物モデルから採取した血清から、溶液中でのＥＬＩＳＡアッセイを使用して各動物の血清中における投与した志賀毒素Ａサブユニット由来の分子を認識する抗体の量を検出することにより測定した、本発明の例示的な細胞標的化分子の相対的な免疫原性を図示する。相対比較に使用した基準細胞標的化分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分がフーリン切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ（配列番号５）からなるＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−（ｎ）であった。本発明の細胞標的化分子を投与した各動物の処置群について、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−（ｎ）参照分子処置群に対する割合の値を、所与の時点における細胞標的化分子処置群の全ての対象の平均ＥＬＩＳＡシグナルをＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−（ｎ）基準処置群の対象の平均ＥＬＩＳＡシグナルで除すことによって、計算した。各実験処置群の基準に対する割合をＹ軸に描き、血清採取日をＸ軸に描いた。図１５〜１６の記号は、示される群内の個々の対象の平均シグナルを表し、エラーバーは、示される時点における群内の対象の平均の標準誤差を示す。図１５〜１６は、例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４３）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４４）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４７）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１２：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４９）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１５：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５１）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１６：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５２）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１９：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５５）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：：ｓｃＦｖ−２（配列番号６１）、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ２２：：ｓｃＦｖ−２（配列番号６３）が、このアッセイにおいて、適切な参照分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−（ｎ）（配列番号３４又は３５）と比べて低減した免疫原性を呈したことを示す。 図１５〜１６は、哺乳動物モデルから採取した血清から、溶液中でのＥＬＩＳＡアッセイを使用して各動物の血清中における投与した志賀毒素Ａサブユニット由来の分子を認識する抗体の量を検出することにより測定した、本発明の例示的な細胞標的化分子の相対的な免疫原性を図示する。相対比較に使用した基準細胞標的化分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分がフーリン切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ（配列番号５）からなるＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−（ｎ）であった。本発明の細胞標的化分子を投与した各動物の処置群について、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−（ｎ）参照分子処置群に対する割合の値を、所与の時点における細胞標的化分子処置群の全ての対象の平均ＥＬＩＳＡシグナルをＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−（ｎ）基準処置群の対象の平均ＥＬＩＳＡシグナルで除すことによって、計算した。各実験処置群の基準に対する割合をＹ軸に描き、血清採取日をＸ軸に描いた。図１５〜１６の記号は、示される群内の個々の対象の平均シグナルを表し、エラーバーは、示される時点における群内の対象の平均の標準誤差を示す。図１５〜１６は、例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４３）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４４）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４７）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１２：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４９）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１５：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５１）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１６：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５２）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１９：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５５）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：：ｓｃＦｖ−２（配列番号６１）、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ２２：：ｓｃＦｖ−２（配列番号６３）が、このアッセイにおいて、適切な参照分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−（ｎ）（配列番号３４又は３５）と比べて低減した免疫原性を呈したことを示す。 破壊されたフーリン切断モチーフを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む、細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−９のフーリン切断耐性を、野生型フーリン切断部位を有する野生型志賀毒素Ａ１断片を含むほぼ同一の細胞毒性細胞標的化分子（ＳＬＴ−１Ａ−ＷＴ：：ｓｃＦｖ−９）と比較して示す図である。図１７は、精製した組換えヒトフーリン又は様々な陰性対象条件で処置したタンパク質試料の電気泳動後のクーマシー染色したポリアクリルアミドゲルを示す。ゲルのレーンに番号を付け、図の凡例は、試料をゲルにロードする前の各細胞標的化分子試料の処置前条件を示す：摂氏での温度（℃）、１時間単位での処置前の時間、及びいくらかのフーリンが添加されたかどうかを、細胞標的化分子１マイクログラム（μｇ）当たりの添加されたフーリン活性単位（Ｕ）の量（「Ｕ／μｇフーリン」として表記）又は添加したフーリンがゼロＵ／μｇの場合には「フーリンなし」で示す。「分子量マーカー」と記された第１のレーンは、タンパク質の分子量ラダーの移動パターンを示し、各ラダータンパク質バンドのおよそのサイズは、キロダルトン（ｋＤａ）で示される。図の凡例は、１）野生型フーリン部位（ＷＴ）又は２）破壊されたフーリンモチーフ（ＦＲ）のいずれの志賀毒素エフェクター領域が各細胞標的化分子試料中に存在していたかを、レーン毎に示す。処置試料を、３０℃で３０時間、細胞標的化分子１マイクログラム当たり０．５フーリン活性単位（Ｕ／μｇフーリン）に供した。図１７は、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−９が、３０℃で、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−９ １マイクログラム当たり０．５フーリン活性単位に耐性であったことを示す。 標的陽性細胞に対する本発明の例示的な細胞標的化分子（配列番号８２）の特異的な結合を、標的陰性細胞と比較して示す図である。細胞に結合する細胞標的化分子の量を、統合した平均蛍光強度（ｉＭＦＩ，integrated, mean fluorescence intensity）として計算し、細胞標的化分子の濃度に対してグラフにした。データの曲線当てはめを使用して、試験した２つの標的陽性細胞型の線を生成した。 本発明の例示的な細胞標的化分子又はビヒクルのみの対照試料のいずれかを与えた後のマウス異種移植片モデル対象の群について、ヒト腫瘍量の経時的な変化を示す図である。全身生物発光として光子／秒単位で測定した腫瘍量を、時間（腫瘍インプラント後の日数）に対するグラフにした。細胞標的化分子ＳＬＴ１−Ａ−コンボ７：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１（配列番号８２）投与により、ビヒクルのみの対照群で観察された腫瘍量の増加が予防された。
本発明は、例示的な非限定的な実施形態、及び添付の図面への参照を使用して、下記でより詳細に説明される。しかしながらこの発明は、多くの様々な形態を具体化することができ、以下に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。そうではなく、この開示が十分であり、当業者に本発明の範囲を伝えられるように、これらの実施形態は提供される。
本発明をより容易に理解できるように、以下である特定の用語を定義する。追加の定義が本発明の詳細な説明中に見出される場合もある。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、用語「１つの（a）」、「１つ
の（an）」及び「その（the）」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、単数形及び
複数形の指示対象の両方を含む。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、用語「及び／又は」は、２つの種、Ａ及びＢを指す場合、Ａ及びＢの少なくとも１つを意味する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、用語「及び／又は」は、２つより多くの種、例えばＡ、Ｂ、及びＣを指す場合、Ａ、Ｂ、若しくはＣの少なくとも１つ、又はＡ、Ｂ、若しくはＣのあらゆる組合せの少なくとも１つを意味する（それぞれの種は単数又は複数の可能性がある）。
本明細書にわたり、言葉「含む（comprise）」又は「含む（comprises）」若しくは「
含む（comprising）」などの変化形は、必然的に述べられている整数（又は要素）又は整数（又は要素）の群を含むが、他のあらゆる整数（又は要素）又は整数（又は要素）の群も排除されないことと理解されるものとする。
本明細書にわたり、用語「含む（including）」は、「限定されないが、〜が挙げられ
る」を意味するのに使用される。「含む（including）」及び「限定されないが、〜が挙
げられる」は、同義的に使用される。
用語「アミノ酸残基」又は「アミノ酸」は、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに取り込まれているアミノ酸への言及を含む。用語「ポリペプチド」は、アミノ酸又はアミノ酸残基のあらゆるポリマーを含む。用語「ポリペプチド配列」は、物理的にポリペプチドを構成する一連のアミノ酸又はアミノ酸残基を指す。「タンパク質」は、１つ又は２つ以上のポリペプチド又はポリペプチド「鎖」を含む高分子である。「ペプチド」は、合計およそ１５〜２０アミノ酸残基未満のサイズを有する小さいポリペプチドである。用語「アミノ酸配列」は、長さに応じてペプチド又はポリペプチドを物理的に構成する一連のアミノ酸又はアミノ酸残基を指す。別段の指定がない限り、本明細書で開示されたポリペプチド及びタンパク質配列は、アミノ末端からカルボキシ末端にそれらの順番を表示するのに、左から右へ記載される。
用語「アミノ酸」、「アミノ酸残基」、「アミノ酸配列」、又はポリペプチド配列は、天然に存在するアミノ酸（Ｌ及びＤイソステレオマーを含む）を含み、別段の限定がない限り、天然に存在するアミノ酸と類似の方式で機能できる天然アミノ酸の公知のアナログ、例えばセレノシステイン、ピロリシン、Ｎ−ホルミルメチオニン、ガンマ−カルボキシグルタメート、ヒドロキシプロリンヒプシン、ピログルタミン酸、及びセレノメチオニンも含む。本明細書で述べられるアミノ酸は、表Ａで示されるような簡略名によって記載される。

成句「保存的置換」は、ペプチド、ペプチド領域、ポリペプチド領域、タンパク質、又は分子のアミノ酸残基に関して、全体的なペプチド、ペプチド領域、ポリペプチド領域、タンパク質、又は分子の機能及び構造を実質的に変更しない、ペプチド、ペプチド領域、ポリペプチド領域、タンパク質、又は分子のアミノ酸組成における変化を指す（Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H.Freeman and Company, New
York (2nd ed., 1992))を参照）。
本発明の目的に関して、成句「由来の」は、ポリペプチド又はポリペプチド領域を指す場合、ポリペプチド又はポリペプチド領域が、「親の」タンパク質に元々見出されるアミノ酸配列を含み、「親の」分子のある特定の機能及び構造が実質的に保存される限り、現時点で元のポリペプチド又はポリペプチド領域に対するある特定のアミノ酸残基の付加、欠失、短縮化、再配列、又は他の変更含む可能性があることを意味する。熟練した作業者であれば、当業界において公知の技術、例えば、タンパク質配列アライメントソフトウェアを使用してポリペプチド又はポリペプチド領域の由来となる親の分子を同定できると予想される。
特許請求された発明の目的に関して、さらに志賀毒素ポリペプチド配列又は志賀毒素由来のポリペプチドに関して、用語「野生型」は、一般的に、例えば病原菌などの生きた種に見出される天然に存在する志賀毒素タンパク質配列を指し、その志賀毒素タンパク質配列は、最も高頻度で生じるバリアントの１つである。これは、統計学的に有効な数の少なくとも１つの志賀毒素タンパク質バリアントを含む所与の種の天然に存在する個々の生物
をサンプリングした場合、天然に存在するもののその種の個々の生物の１パーセント未満で見出されるまれにしか生じない志賀毒素タンパク質配列とは対照的である。その天然環境を除去した天然分離株のクローン性の拡張（分離株が、生物学的な配列情報を含む生物であるか又は分子であるかに関係なく）は、クローン性の拡張が、その種の天然に存在する集団に存在しない新しい配列多様性を導入したり及び／又は配列バリアントの相対的比率を互いに変化させたりしない限り、天然に存在する必要条件を変更しない。
特許請求された発明に関する用語「会合する」、「会合すること」、「連結された」、又は「連結すること」は、２つ又は３つ以上の分子の要素が合体、結合、接続、若しくはそれ以外の方法で結合して単一分子を形成している状況、又は２つの分子間の会合、連結、結合、及び／若しくは他のあらゆる接続を作り出すことによって互いに会合した２つの分子を作製し、単一分子を形成する作用を指す。例えば、用語「連結された」は、単一分子が形成されるように１つ又は２つ以上の原子の相互作用によって会合した２つ又は３つ以上の要素を指す場合もあり、原子の相互作用は、共有結合及び／又は非共有結合によるものであってもよい。２つの要素間の共有結合による会合の非限定的な例としては、ペプチド結合及びシステイン間のジスルフィド結合が挙げられる。２つの分子要素間の非共有結合による会合の非限定的な例としては、イオン結合が挙げられる。
本発明の目的に関して、用語「連結された」は、単一分子が形成されるように１つ又は２つ以上の原子の相互作用によって会合した２つ又は３つ以上の分子の要素を指し、原子の相互作用は、少なくとも１つの共有結合を含む。本発明の目的に関して、用語「連結すること」は、上述したような連結された分子を作り出す作用を指す。
本発明の目的に関して、用語「融合した」は、少なくとも１つの共有結合によって会合した２つ又は３つ以上のタンパク質要素を指し、少なくとも１つの共有結合は、ペプチド結合がカルボキシル酸基の炭素原子の参加を含むか又は例えばα−炭素、β−炭素、γ−炭素、σ−炭素などの別の炭素原子を含むかどうかに関係なくペプチド結合である。一緒に融合した２つのタンパク質要素の非限定的な例としては、例えば、得られた分子が単一の連続的なポリペプチドになるようにペプチド結合を介してポリペプチドに融合したアミノ酸、ペプチド、又はポリペプチドが挙げられる。本発明の目的に関して、用語「融合すること」は、上述したような融合した分子、例えば、翻訳されたときに単一のタンパク質性分子を産生する遺伝学的領域の組換え融合から生成した融合タンパク質などを作り出す作用を指す。
記号「：：」は、その前及びその後のポリペプチド領域が物理的に一緒に連結されて連続的なポリペプチドを形成していることを意味する。
用語「発現される」、「発現すること」、又は「発現する」、及びそれらの文法上の変化形は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド又は核酸のタンパク質への翻訳を指す。発現されたタンパク質は、細胞内に留まって細胞表面の膜の要素になる場合もあるし、又は細胞外空間に分泌される場合もある。
本明細書で使用される場合、少なくとも１つの細胞表面で有意な量の細胞外標的生体分子を発現する細胞は、「標的陽性細胞」又は「標的＋細胞」であり、特定された細胞外標的生体分子に物理的に結合している細胞である。
記号「α」は、本明細書で使用される場合、記号の後に続く生体分子に結合することができる免疫グロブリン型の結合領域の略記である。記号「α」は、記号の後に続く生体分子に結合するその能力に基づく免疫グロブリン型の結合領域の機能的な特徴を指すのに使用され、解離定数（ＫＤ）によって記載される結合親和性は１０−５又はそれ未満である
。
本明細書で使用される場合、用語「重鎖可変（ＶＨ）ドメイン」又は「軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン」はそれぞれ、あらゆる抗体ＶＨ又はＶＬドメイン（例えばヒトＶＨ又はＶＬドメイン）、加えて対応する天然の抗体（例えば天然のマウスＶＨ又はＶＬドメイン由来のヒト化ＶＨ又はＶＬドメイン）の少なくとも定性的な抗原結合能力を保持するあらゆるそれらの派生物を指す。ＶＨ又はＶＬドメインは、３つのＣＤＲ又はＡＢＲを途中に有する「フレームワーク」領域からなる。フレームワーク領域は、抗原のエピトープへの特異的結合のためにＣＤＲ又はＡＢＲを並べるのに役立つ。アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＶＨ及びＶＬドメインの両方は、以下のフレームワーク（ＦＲ）及びＣＤＲ領域又はＡＢＲ領域：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４；又は同様にＦＲ１、ＡＢＲ１、ＦＲ２、ＡＢＲ２、ＦＲ３、ＡＢＲ３、及びＦＲ４を含む。用語「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、又は「ＨＣＤＲ３」は、本明細書で使用される場合、それぞれＶＨドメイン中のＣＤＲ１、２、又は３を指すのに使用され、用語「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」は、それぞれＶＬドメイン中のＣＤＲ１、２、又は３を指すのに使用される。本明細書で使用される場合、用語「ＨＡＢＲ１」、「ＨＡＢＲ２」、又は「ＨＡＢＲ３」は、それぞれＶＨドメイン中のＡＢＲ１、２、又は３を指すのに使用され、用語「ＬＡＢＲ１」、「ＬＡＢＲ２」、又は「ＬＡＢＲ３」は、それぞれＶＬドメイン中のＣＤＲ１、２、又は３を指すのに使用される。ラクダ科動物のＶＨＨ断片、軟骨魚類のＩｇＮＡＲ、ＶＮＡＲ断片、ある特定の単一ドメイン抗体、及びそれらの派生物に関して、同じベースの配列：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む単一の重鎖可変ドメインが存在する。用語「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、又は「ＨＣＤＲ３」は、本明細書で使用される場合、それぞれ単一の重鎖可変ドメイン中のＣＤＲ１、２、又は３を指すのに使用される場合もある。
本発明の目的に関して、用語「エフェクター」は、細胞毒性、生物学的なシグナル伝達、酵素による触媒作用、細胞内経路決定、並びに／又はアロステリック作用及び／若しくは１つ又は２つ以上の因子の動員をもたらす分子間結合などの生物活性を提供することを意味する。
本発明の目的に関して、成句「志賀毒素エフェクターポリペプチド」、「志賀毒素エフェクターポリペプチド領域」、及び「志賀毒素エフェクター領域」は、志賀毒素ファミリーのメンバーの少なくとも１つの志賀毒素Ａサブユニット由来のポリペプチド又はポリペプチド領域を指し、ポリペプチド又はポリペプチド領域は、少なくとも１つの志賀毒素の機能を表すことができる。例えば、配列番号８、１１〜２７、２９〜３２、３４８、３５６〜３５８、３６３、３７０〜３７１、３７３、３７８〜４３８は、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａに由来する。
本発明の目的に関して、志賀毒素エフェクター機能は、志賀毒素Ａサブユニット由来のポリペプチド領域によって付与された生物活性である。志賀毒素エフェクター機能の非限定的な例としては、細胞の侵入を促進すること；脂質膜の変形；細胞内在化を促進すること；クラスリン媒介エンドサイトーシスを刺激すること；例えばゴルジ、小胞体、及びサイトゾルなどの様々な細胞内区画への細胞内経路決定を指示すること；カーゴを用いて細胞内経路決定を指示すること；リボソーム機能を阻害すること；触媒活性、例えばＮ−グリコシダーゼ活性、及びリボソームを触媒的に阻害することなど；タンパク質合成を低減すること、カスパーゼ活性を誘導すること、エフェクターカスパーゼを活性化すること、細胞増殖抑制作用を実現すること、並びに細胞毒性が挙げられる。志賀毒素の触媒活性としては、例えば、リボソーム不活性化、タンパク質合成阻害、Ｎ−グリコシダーゼ活性、ポリヌクレオチド：アデノシングリコシダーゼ活性、ＲＮアーゼ活性、及びＤＮＡアーゼ活性が挙げられる。志賀毒素は、リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）である。ＲＩ
Ｐは、核酸、ポリヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ｒＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｍＲＮＡ（及びポリＡ）、及びウイルス核酸を脱プリン化することができる（例えば、Barbieri L et al., Biochem J 286: 1-4(1992)；Barbieri L et al., Nature 372: 624
(1994)；Ling J et al., FEBS Lett 345: 143-6 (1994)；Barbieri L et al., Biochem J 319: 507-13(1996)；Roncuzzi L, Gasperi-Campani A, FEBS Lett 392:16-20 (1996)；Stirpe F et al., FEBS Lett 382: 309-12 (1996)；BarbieriL et al., Nucleic Acids Res 25: 518-22 (1997)；Wang P, Tumer N, Nucleic Acids Res 27: 1900-5 (1999)；Barbieri L et al., Biochim Biophys Acta 1480: 258-66 (2000)；BarbieriL et al., J
Biochem 128: 883-9 (2000)；Brigotti M et al., Toxicon 39: 341-8(2001)；Brigotti M et al., FASEB J 16: 365-72 (2002)；Bagga S et al., J Biol Chem 278:4813-20 (2003)；Picard D et al., J Biol Chem 280:20069-75 (2005)を参照）。いくつかのＲ
ＩＰは、抗ウイルス活性及びスーパーオキシドジスムターゼ活性を示す（Erice A et al., Antimicrob Agents Chemother 37:835-8 (1993)；Au T et al., FEBS Lett 471: 169-72 (2000)；Parikh B, Tumer N, Mini Rev Med Chem 4:523-43 (2004)；Sharma N et al., Plant Physiol 134: 171-81 (2004)）。志賀毒素の触媒活性は、インビトロとインビ
ボの両方で観察されている。志賀毒素エフェクター活性のためのアッセイの非限定的な例は、例えば、タンパク質合成阻害活性、脱プリン活性、細胞増殖の阻害、細胞毒性、スーパーコイルＤＮＡの緩和活性、及びヌクレアーゼ活性などの様々な活性を測定する。
志賀毒素エフェクター機能の保持は、本明細書で使用される場合、同じ条件下における野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド対照（例えば志賀毒素Ａ１断片）又は野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド（例えば志賀毒素Ａ１断片）を含む細胞標的化分子と同程度の、適切な定量的アッセイによって測定された再現性のある志賀毒素の機能的な活性のレベルを示すことができることを指す。リボソーム不活性化又はリボソーム阻害の志賀毒素エフェクター機能に関して、保持された志賀毒素エフェクター機能は、例えば熟練した作業者公知の及び／又は本明細書に記載されるアッセイを使用することなどによるインビトロの環境で、１０，０００ｐＭ以下のＩＣ５０を表すことである。標的陽性細胞殺滅アッセイにおける細胞毒性の志賀毒素エフェクター機能に関して、保持された志賀毒素エフェクター機能は、例えば熟練した作業者公知の及び／又は本明細書に記載されるアッセイを使用することによって示されるような、適切な細胞外標的生体分子の細胞型及びその発現に応じて、１，０００ｎＭ以下のＣＤ５０を表すことである。
特許請求された発明の目的に関して、用語「同等な（equivalent）」は、リボソーム阻害に関して、同じ条件下における参照分子（例えば、第２の細胞標的化分子又は第３の細胞標的化分子）の活性の１０％以内又はそれ未満を再現性よく示す、適切な定量的アッセイによって測定された再現性のあるリボソーム阻害活性の実験的に測定されたレベルを意味する。
特許請求された発明の目的に関して、用語「同等な（equivalent）」は、細胞毒性に関して、同じ条件下における参照分子（例えば、第２の細胞標的化分子又は第３の細胞標的化分子）の活性の１０％以内又はそれ未満を再現性よく示す、適切な定量的アッセイによって測定された再現性のある細胞毒性の実験的に測定されたレベルを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「弱化した」は、細胞毒性に関して、分子が、同じ条件下において参照分子によって表されるＣＤ５０の１０倍〜１００倍のＣＤ５０を表すか又は表したことを意味する。
不正確なＩＣ５０及びＣＤ５０値は、志賀毒素エフェクター機能活性のレベルを決定する場合に考慮すべきではない。いくつかの試料について、ＩＣ５０又はＣＤ５０のいずれかの正確な値は、正確な曲線のあてはめに必要なデータポイントを収集することができな
いために入手が難しい場合がある。例えば、理論上、所与の試料の一連の濃度で５０％より大きいリボソーム阻害又は細胞死がそれぞれ起こらない場合、ＩＣ５０もＣＤ５０も決定することができない。例示的な志賀毒素エフェクター機能アッセイ、例えば以下の実施例で説明されるアッセイなどからのデータの分析で説明されるような正確に曲線をあてはめるには不十分なデータは、実際の志賀毒素エフェクター機能を代表するものとして考慮すべきではない。
志賀毒素エフェクター機能における活性を検出できないことは、細胞の侵入、細胞内経路決定、及び／又は酵素活性の欠如というより、不適切な発現、ポリペプチドフォールディング、及び／又はタンパク質安定性による可能性がある。志賀毒素エフェクター機能のためのアッセイは、有意な量の志賀毒素エフェクター機能活性を測定するのに本発明のポリペプチドをそれほど多く必要としない場合がある。エフェクター機能が低いか又はない根本的な原因がタンパク質発現又は安定性に関連することが実験的に決定される程度に、当業者は、志賀毒素の機能的なエフェクター活性を回復させ測定が可能になるように、当業界において公知のタンパク質化学及び分子工学技術を使用してこのような要因を相殺することができる。例として、不適切な細胞ベースの発現は、異なる発現制御配列を使用することによって相殺される場合もあるし、不適切なポリペプチドフォールディング及び／又は安定性は、末端配列を安定化すること、又は分子の３次元構造を安定化させる非エフェクター領域中の補償的な変異によって利益を得る場合もある。
ある特定の志賀毒素エフェクター機能、例えば細胞内経路決定機能は、容易に測定可能ではない。例えば、志賀毒素エフェクターポリペプチドが細胞毒性にならないこと及び／又は異種エピトープを送達できないことが不適切な細胞内経路決定に起因するかどうかを区別する慣例的な定量的アッセイはないが、試験が利用可能である場合に、適切な野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドと比較してあらゆる有意なレベルの細胞内経路決定について志賀毒素エフェクターポリペプチドを分析することができる。しかしながら、本発明の細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターのポリペプチド成分が、野生型志賀毒素Ａサブユニットコンストラクトと同程度又は同等な細胞毒性を表す場合、細胞内経路決定活性レベルは、それぞれ少なくとも試験された条件下で野生型志賀毒素Ａサブユニットコンストラクトの細胞内経路決定活性レベルと同程度又は同等であると推論される。
個々の志賀毒素の機能のための新しいアッセイが利用可能になる場合、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子は、それらの志賀毒素エフェクター機能のあらゆるレベルに関して、例えば野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドの活性の１０００倍若しくは１００倍以内又はそれ未満であること、又は機能的にノックアウトされた志賀毒素エフェクターポリペプチドと比較して３倍から３０倍又はそれより大きい活性を示すことに関して分析することができる。
十分な細胞内経路決定は、細胞毒性アッセイ、例えばＴ細胞エピトープ提示に基づく又はサイトゾル及び／又は小胞体に局在化した標的基質に関与する毒素エフェクター機能に基づく細胞毒性アッセイなどで分子の細胞毒性活性レベルを観察することによって単に推測することができる。
「有意な」志賀毒素エフェクター機能の保持は、本明細書で使用される場合、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド対照（例えば志賀毒素Ａ１断片）と同程度の、適切な定量的アッセイによって測定された再現性のある志賀毒素の機能的な活性のレベルを指す。インビトロでのリボソーム阻害の場合、有意な志賀毒素エフェクター機能は、アッセイで使用されるリボソーム源（例えば細菌、古細菌、又は真核（藻類、真菌、植物、又は動物）源）に応じて３００ｐＭ以下のＩＣ５０を示すことである。これは、触媒的に破壊されたＳＬＴ−１Ａ１−２５１二重変異体（Ｙ７７Ｓ／Ｅ１６７Ｄ）の１００，０００ｐＭの
およそのＩＣ５０と比較して有意に大きい阻害である。実験細胞培養における標的陽性細胞殺滅アッセイにおける細胞毒性の場合、有意な志賀毒素エフェクター機能は、結合領域及び細胞型の標的生体分子、特に、評価される分子によって標的化された適切な細胞外標的生体分子及び／又は細胞外のエピトープのその細胞型の発現及び／又は細胞表面表示に応じて、１００、５０、３０ｎＭ、又はそれ未満のＣＤ５０を示すことである。これは、細胞株に応じて１００〜１０，０００ｎＭのＣＤ５０を有する細胞標的化結合領域を含まない志賀毒素Ａサブユニット単独（又は野生型志賀毒素Ａ１断片）と比較して有意により大きい適切な標的陽性細胞集団に対する細胞毒性である。
本発明の目的に関して、さらに本発明の分子の志賀毒素エフェクター機能に関して、用語「適度な活性」は、天然に存在する志賀毒素を含む分子に関して本明細書において定義されるような少なくとも中程度のレベル（例えば１１倍〜１，０００倍以内）の志賀毒素エフェクター活性を示すことを指し、志賀毒素エフェクター活性は、内在化効率、サイトゾルへの細胞内経路決定効率、標的細胞による送達されたエピトープの提示、リボソーム阻害、及び細胞毒性からなる群から選択される。細胞毒性に関して、志賀毒素エフェクター活性の適度なレベルは、野生型志賀毒素コンストラクトの１，０００倍以内であること、例えば、野生型志賀毒素コンストラクト（例えば野生型志賀毒素Ａ１断片を含む細胞標的化分子）が０．５ｎＭのＣＤ５０を表す場合、５００ｎＭ以下のＣＤ５０を示すことを含む。
本発明の目的に関して、及び本発明の分子の細胞毒性に関して、用語「最適な」は、野生型志賀毒素Ａ１断片（例えば志賀毒素Ａサブユニット又はある特定のそれらの短縮型バリアント）及び／又は天然に存在する志賀毒素を含む分子の細胞毒性の２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０倍以内の志賀毒素触媒ドメインが媒介する細胞毒性のレベルを指す。
注目すべきことに、志賀毒素エフェクターポリペプチドの細胞毒性が、野生型志賀毒素Ａサブユニット又はそれらの断片と比較して低減される場合であっても、実際には、弱化した志賀毒素エフェクターポリペプチドを使用する適用は、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドを使用するのと等しく又はそれより高く有効であり得るが、これは、最も高い効力のバリアントは望ましくない作用を表す可能性があるが、そのような作用は細胞毒性効力が低減されたバリアントにおいて最小化されるか又は低減されるためである。野生型志賀毒素は非常に強力であり、毒素が与えられた細胞のサイトゾルにわずか１つの毒素分子が到達した後、又は場合により毒素が与えられた細胞にわずか４０個の毒素分子が内在化した後に、毒素が与えられた細胞を死滅させることができる。例えば細胞内経路決定又は細胞毒性などの志賀毒素エフェクター機能が野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドと比較して顕著に低減した志賀毒素エフェクターポリペプチドは、それでもなお、例えば標的化された細胞を死滅させること、異種エピトープ送達、並びに／又は特異的な細胞及びそれらの細胞内区画の検出を含む適用などの実際の適用に十分に強力であり得る。加えて、ある特定の活性が低減した志賀毒素エフェクターポリペプチドは、標的細胞のある特定の細胞内配置又は細胞内区画にカーゴ（例えば追加の外因性物質又はＴ細胞エピトープ）を送達するのに特に有用な場合もある。
用語「選択的な細胞毒性」は、分子の細胞毒性活性に関して、生体分子標的陽性細胞集団（例えば標的化された細胞型）と非標的化バイスタンダー細胞集団（例えば生体分子標的陰性細胞型）との間の細胞毒性の相対レベルを指し、これは、細胞毒性の選択性の測定基準、又は標的化された細胞と非標的化細胞との殺滅の優先性の指標を提供するための、非標的化細胞型のＣＤ５０に対する標的化された細胞型の半数細胞毒性濃度（ＣＤ５０）の比率として表すことができる。
所与の細胞外標的生体分子（又は所与の標的生体分子の細胞外エピトープ）の細胞表面表示及び／又は密度は、本発明のある特定の細胞標的化分子を最も好適に使用することができる適用に影響を与えることができる。所与の標的生体分子の細胞表面表示及び／又は密度における細胞間の差は、本発明の所与の細胞標的化分子の細胞内在化の効率及び／又は細胞毒性効力を、定量的及び定性的の両方で変更することができる。細胞周期又は細胞分化における異なるポイントにおいて、標的生体分子陽性細胞間で、又は同じ細胞においてでも、所与の標的生体分子の細胞表面表示及び／又は密度を大幅に変更することができる。特定の細胞又は細胞集団における所与の標的生体分子及び／又は所与の標的生体分子のある特定の細胞外エピトープの合計の細胞表面表示は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）フローサイトメトリーを含む方法などの熟練した作業者公知の方法を使用して決定することができる。
本明細書で使用される場合、用語「破壊された」、「破壊」、又は「破壊すること」、及び文法上のその変化形は、ポリペプチド領域又はポリペプチド内の機構に関して、領域内の又は破壊された機構を構成する少なくとも１つのアミノ酸の変更を指す。アミノ酸の変更は、例えばポリペプチドのアミノ酸配列を変更する欠失、逆位、挿入、又は置換などの様々な変異を含む。アミノ酸の変更はまた、例えばアミノ酸官能基における１つ又は２つ以上の原子の変更、又はアミノ酸官能基への１つ又は２つ以上の原子の付加などの化学的変化も含む。
「脱免疫化された」は、本明細書で使用される場合、脊索動物への投与後、例えば野生型ペプチド領域、ポリペプチド領域、又はポリペプチドなどの参照分子と比較して低減した抗原性及び／又は免疫原性を意味する。これは、参照分子と比較して１つ又は２つ以上のデノボ、抗原性及び／又は免疫原性エピトープが導入されているにもかかわらず、全体的な抗原性及び／又は免疫原性が低減していることを含む。ある特定の実施形態に関して、「脱免疫化された」は、分子が、哺乳動物への投与後に、例えば野生型志賀毒素Ａ１断片などのその由来となった「親の」分子と比較して低減した抗原性及び／又は免疫原性を表することを意味する。ある特定の実施形態において、本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、参照分子と比較して相対的な抗原性を示すことが可能であり、例えば定量的ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロット分析のような熟練した作業者公知の及び／又は本明細書に記載されるアッセイなどの同じアッセイによって測定された同じ条件下における参照分子の抗原性より、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれより大きく低減された抗原性を示すことができる。ある特定の実施形態において、本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、参照分子と比較して相対的な免疫原性を表すことが可能であり、例えば所与のタイムポイントで分子の非経口投与を受けた後の哺乳動物中で産生された抗分子抗体の定量的な測定のような熟練した作業者公知の及び／又は本明細書に記載されるアッセイなどの同じアッセイによって測定された同じ条件下における参照分子の免疫原性より、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、又はそれより大きく低減された免疫原性を示すことができる。
例示的な細胞標的化分子の相対的な免疫原性は、長期間にわたる（over periods of many）繰り返しの非経口投与の後にインビボにおける細胞標的化分子に対する抗体応答のためのアッセイを使用して決定された。
本発明の目的に関して、成句「Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞で脱免疫化された」は、Ｂ細胞の抗原性若しくは免疫原性及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原性若しくは免疫原性のいずれかに関して哺乳動物に投与した後に、分子が低減した抗原性及び／又は免疫原性を有することを意味する。ある特定の実施形態に関して、「Ｂ細胞で脱免疫化された」は、分子が、哺乳動物への投与後に、例えば野生型志賀毒素Ａ１断片などのその由来となっ
た「親の」分子と比較して低減したＢ細胞の抗原性及び／又は免疫原性を表することを意味する。ある特定の実施形態に関して、「ＣＤ４＋Ｔ細胞で脱免疫化された」は、分子が、哺乳動物への投与後に、例えば野生型志賀毒素Ａ１断片などのその由来となった「親の」分子と比較して低減したＣＤ４Ｔ細胞の抗原性及び／又は免疫原性を表することを意味する。
用語「内因性」は、志賀毒素エフェクターポリペプチドにおけるＢ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ領域、又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域に関して、エピトープが野生型志賀毒素Ａサブユニット中に存在することを指す。
本発明の目的に関して、成句「ＣＤ８＋Ｔ細胞で過免疫された」は、分子が、生きた脊索動物中の有核の脊索動物細胞の内部に存在する場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原性又は免疫原性に関して増加した抗原性及び／又は免疫原性を有することを意味する。一般的に、ＣＤ８＋Ｔ細胞で免疫化された分子は、固有の機構又は細胞標的化分子の成分のいずれかによる、有核の脊索動物の初期エンドソーム区画への細胞内在化が可能である。
本発明の目的に関して、用語「異種」は、天然に存在する志賀毒素のＡサブユニットとは異なる源に由来することを意味し、例えば異種ポリペプチドは、天然の志賀毒素のいずれのＡサブユニットの一部としても天然に見出されない。用語「異種」は、本発明のＴ細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープ−ポリペプチドのペプチド成分に関して、改変しようとするポリペプチド中に最初に存在していなかったが、本明細書に記載される組み込み、融合、挿入、及び／若しくはアミノ酸置換のプロセスにより付加されたか、又は他のあらゆる改変手段によって付加されたにかかわらずポリペプチドに付加されたエピトープ又はペプチド配列を指す。その結果物は、元の改変されていないポリペプチドにとって外来のＴ細胞エピトープを含む改変されたポリペプチドであり、すなわちＴ細胞エピトープは元のポリペプチドに存在していなかった。
用語「組み込まれた」及び文法上のその変化形は、本発明のＴ細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープ−ポリペプチドのペプチド成分に関して、開始のポリペプチド領域と同じアミノ酸残基総数を共有する新しいポリペプチド配列を生成するための、ポリペプチド領域内における異なるアミノ酸での１つ又は２つ以上のアミノ酸の内部の置き換えを指す。したがって、用語「組み込まれた」は、いかなる追加のアミノ酸、ペプチド、又はポリペプチド成分の開始のポリペプチドへのいかなる外部からの末端融合も、いかなる追加のアミノ酸残基のいかなる追加の内部挿入も含まないが、既存のアミノ酸の置換のみを含む。内部の置き換えは、単にアミノ酸残基の置換によって、又は一連の置換、欠失、挿入、及び／若しくは逆位によって達成することができる。１つ又は２つ以上のアミノ酸の挿入が使用される場合、組み込まれたＴ細胞エピトープをもたらすためには、挿入とは別に同数の近位のアミノ酸を欠失させなければならない。これは、本発明のポリペプチド内に含有されるＴ細胞エピトープに関する用語「挿入された」の使用とは対照的であり、この用語は、ポリペプチド内部への１つ又は２つ以上のアミノ酸の挿入を指し、その結果として開始のポリペプチドと比較してアミノ酸残基数が増加した新しいポリペプチドが生じる。
用語「挿入された」及び文法上のその変化形は、本発明のポリペプチド内に含有されるＴ細胞エピトープに関して、ポリペプチド内への１つ又は２つ以上のアミノ酸の挿入を指し、その結果として開始のポリペプチドと比較してアミノ酸残基数が増加した新しいポリペプチド配列が生じる。Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの「純粋な」挿入は、得られたポリペプチドの長さが、全体の挿入されたＴ細胞エピトープ−ペプチドにおけるアミノ酸残基数と同等のアミノ酸残基数分増加する場合である。成句「部分的に挿入された」、「組み込まれ及び挿入された」、並びに文法上のその変化形は、本発明のポリペプチド内に含有されるＴ細胞エピトープに関して、得られたポリペプチドの長さが増加するが、全体の挿
入されたＴ細胞エピトープ−ペプチドの長さと同等のアミノ酸残基数より少ない場合を指す。挿入は、「純粋な」挿入でも「部分的な」挿入でも、ポリペプチド内の挿入部位の近位ではないポリペプチドの他の領域が欠失して最終的なポリペプチドの合計長さの減少が起こる場合であっても、最終的なポリペプチドがそれでもなおポリペプチド領域内にＴ細胞エピトープ−ペプチドの１つ又は２つ以上のアミノ酸の内部挿入を含むために、これまでに述べられた挿入のいずれかを含む。
本明細書で使用される場合、用語「Ｔ細胞エピトープを送達する」は、分子の機能的な活性を説明する場合、分子が、細胞内においてＴ細胞エピトープ−ペプチドを含む分子のタンパク質部分のプロテアソームによる切断を引き起こす能力がある細胞内区画に局在化する生物活性を提供することを意味する。分子の「Ｔ細胞エピトープを送達する」機能は、分子が外部から投与された細胞の細胞表面上における分子のＴ細胞エピトープ−ペプチドカーゴのＭＨＣ提示を観察することによってアッセイすることができ、又はこのアッセイは、そのエンドソーム区画の１つ又は２つ以上に分子を含有する細胞を用いて開始された。一般的に、Ｔ細胞エピトープをプロテアソームに送達する分子の能力は、「Ｔ細胞エピトープを送達する」分子の最初の位置が細胞の初期エンドソーム区画であり、次いで分子がエピトープ−ペプチドを細胞のプロテアソームに送達することが実験的に示される場合に決定することができる。しかしながら、「Ｔ細胞エピトープを送達する」能力はまた、分子の最初の位置が細胞外であり、エピトープを細胞及び細胞のプロテアソームに送達することが直接的又は間接的のいずれかで実験的に示される場合でも決定することもできる。例えば、ある特定の「Ｔ細胞エピトープを送達する」分子は、例えば細胞へのエンドサイトーシスによる侵入の後に、その細胞のエンドソーム区画を通過する。代替として、「Ｔ細胞エピトープを送達する」活性は、「Ｔ細胞エピトープを送達する」分子が細胞に入りＴ細胞エピトープ−ペプチドを細胞のプロテアソームに送達するのではなく、分子の最初の位置が細胞外であり、そのため分子が細胞のいずれのエンドソーム区画にも入らない場合にも観察することができ、これはなぜなら「Ｔ細胞エピトープを送達する」分子が、そのＴ細胞エピトープ−ペプチド成分のプロテアソームによる切断が起こるように細胞内区画への経路決定能にそれ自身を方向付けたためと予想される。
本発明の目的に関して、成句「アミノ末端の近位」は、本発明の細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチド領域の位置を参照した場合、細胞標的化分子が本明細書で言及される適切なレベルの志賀毒素エフェクター機能活性（例えば、ある特定のレベルの細胞毒性効力）を示すことができる限り、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域の少なくとも１つのアミノ酸残基が、細胞標的化分子のアミノ末端の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又はそれより多くのアミノ酸残基以内、例えば１８〜２０アミノ酸残基までである距離を指す。したがって本発明のある特定の実施形態に関して、アミノ末端を志賀毒素エフェクターポリペプチドに融合させたいずれのアミノ酸残基も、志賀毒素エフェクターポリペプチドの機能的な活性が本明細書で必要な適切な活性レベルより低く低減されるようにいずれの志賀毒素エフェクター機能を低減させないと予想される（例えば、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域のアミノ末端の近くで構造に立体的に干渉することによって）。
本発明の目的に関して、成句「アミノ末端のより近位」は、本発明の細胞標的化分子内の志賀毒素エフェクターポリペプチド領域の配置を別の成分（例えば、細胞を標的化する、結合領域、分子部分、及び／又は追加の外因性物質）と比較して参照した場合、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の少なくとも１つのアミノ酸残基が、他の参照された成分と比較して、本発明の細胞標的化分子の直鎖状のポリペプチド成分のアミノ末端により近い配置を指す。
本発明の目的に関して、成句「志賀毒素ファミリーのメンバーの１つのＡサブユニット
由来の活性な酵素ドメイン」は、触媒性のリボソーム不活性化メカニズムを介してタンパク質合成を阻害する能力を有することを指す。天然に存在する志賀毒素の酵素活性は、例えば生きた細胞の非存在下におけるＲＮＡ翻訳を含むインビトロでのアッセイ、又は生きた細胞におけるＲＮＡ翻訳を含むインビボでのアッセイなどの熟練した作業者公知のアッセイを使用して、タンパク質の翻訳を阻害する能力と定義される場合がある。熟練した作業者公知の及び／又は本明細書に記載されるアッセイを使用して、志賀毒素の酵素活性の効力は、例えばリボソームニッキングアッセイなどによりリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に対するＮ−グリコシダーゼ活性を観察することによって直接的にアセスメントしてもよいし、及び／又はリボソーム機能及び／又はタンパク質合成の阻害を観察することによって間接的にアセスメントしてもよい。
本発明の目的に関して、用語「志賀毒素Ａ１断片領域」は、志賀毒素Ａ１断片から本質的になるか及び／又は志賀毒素の志賀毒素Ａ１断片由来のポリペプチド領域を指す。
本発明の目的に関して、用語「末端」、「アミノ末端」、又は「カルボキシ末端」は、細胞標的化分子に関して、細胞標的化分子のポリペプチド鎖（例えば、単一の連続的なポリペプチド鎖）の最後のアミノ酸残基を一般的に指す。細胞標的化分子は１つより多くのポリペプチド又はタンパク質を含む可能性があることから、本発明の細胞標的化分子は、複数のアミノ末端及びカルボキシ末端を含む可能性がある。例えば、細胞標的化分子の「アミノ末端」は、ポリペプチドのアミノ末端の終わりの部分を示すポリペプチド鎖の第１のアミノ酸残基と定義される場合があり、これは、一般的に、開始のアミノ酸残基がいずれのアミノ酸残基とのペプチド結合も有さず、開始のアミノ酸残基の主鎖のアミノ基を含むか、又はＮ−アルキル化されたアルファアミノ酸残基のクラスのメンバーである開始のアミノ酸残基にとって等価な窒素を含むことを特徴とする。同様に、細胞標的化分子の「カルボキシ末端」は、ポリペプチドのカルボキシル末端の終わりの部分を示すポリペプチド鎖の最後のアミノ酸残基と定義される場合があり、これは、一般的に、最後のアミノ酸残基が、その主鎖のカルボキシル基のアルファ−炭素にペプチド結合によって連結されたいずれのアミノ酸残基も有さないことを特徴とする。
本発明の目的に関して、用語「末端」、「アミノ末端」、又は「カルボキシ末端」は、ポリペプチド領域に関して、その領域の外側に追加のアミノ酸残基がペプチド結合によって連結されているかどうかに関係なく、その領域の局所的な境界を指す。言い換えれば、ポリペプチド領域の末端は、その領域が他のペプチド又はポリペプチドに融合されているかどうかを問わない。例えば、２つのタンパク質領域、例えばペプチド又はポリペプチドを含む結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む融合タンパク質は、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域のアミノ酸残基２５１で終わるカルボキシ末端を有する志賀毒素エフェクターポリペプチド領域を有していてもよいが、別のタンパク質領域、例えば結合領域の始まりを示す２５２位のアミノ酸残基へのペプチド結合が残基２５１を含む。この例において、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域のカルボキシ末端は、融合タンパク質の末端ではなく内部領域の境界を示す残基２５１を指す。したがって、ポリペプチド領域の場合、用語「末端」、「アミノ末端」、及び「カルボキシ末端」は、境界が物理的な末端であるか、又はより大きいポリペプチド鎖内に組み込まれた内部位置であるかにかかわらず、ポリペプチド領域の境界を指すのに使用される。
本発明の目的に関して、成句「志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端領域」は、天然に存在する志賀毒素Ａ１断片由来のポリペプチド領域を指し、この領域は、疎水性残基（例えば、ＳｔｘＡ−Ａ１及びＳＬＴ−１Ａ１のＶ２３６、並びにＳＬＴ−２Ａ１のＶ２３５）で始まり、それに続いて疎水性残基があり、さらにこの領域は、志賀毒素Ａ１断片ポリペプチド間で保存されたフーリン切断部位で終わり、天然の志賀毒素ＡサブユニットにおけるＡ１断片とＡ２断片との間のジャンクションで終わる。本発明の目的に関して、志賀毒
素Ａ１断片のカルボキシ末端領域は、志賀毒素Ａ１断片ポリペプチドのカルボキシ末端由来のペプチド領域、例えば、志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端を含むか又はそれから本質的になるペプチド領域などを含む。志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端由来のペプチド領域の非限定的な例としては、Ｓｔｘ１Ａ（配列番号２）又はＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）における、２３６位から、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、又は２５１位まで；及びＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）における、２３５位から、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、又は２５０位までの天然に位置するアミノ酸残基配列が挙げられる。
本発明の目的に関して、成句「Ａ１断片ポリペプチドのカルボキシ末端の近位」は、連結された分子部分及び／又は結合領域に関して、志賀毒素Ａ１断片ポリペプチドの最後の残基を定義するアミノ酸残基から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２アミノ酸残基以内であることを指す。
本発明の目的に関して、成句「Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする」は、Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端中のアミノ酸残基、例えば、Ｓｔｘ１Ａ（配列番号２）若しくはＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）における２３６〜２５１位又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）における２３５〜２５０位のいずれか１つにおける天然に位置するアミノ酸残基由来のアミノ酸残基などに連結及び／又は融合した、サイズが４．５ｋＤａであるか又はそれより大きいあらゆる分子部分（例えば、免疫グロブリン型の結合領域）を含む。本発明の目的に関して、成句「Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする」はまた、Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端中のアミノ酸残基、例えば、Ａ１断片由来の領域の最後のアミノ酸及び／又は志賀毒素エフェクターポリペプチドに対するカルボキシ末端のアミノ酸残基などに連結及び／又は融合した、サイズが４．５ｋＤａであるか又はそれより大きいあらゆる分子部分（例えば、免疫グロブリン型の結合領域）も含む。本発明の目的に関して、成句「Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする」はまた、Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端の細胞による認識、例えば真核細胞のＥＲＡＤ機構による認識などを物理的に防ぐ、サイズが４．５ｋＤａであるか又はそれより大きいあらゆる分子部分（例えば、免疫グロブリン型の結合領域）も含む。
本発明の目的に関して、結合領域、例えば、少なくとも４０アミノ酸を含むポリペプチドを含む、及びＡ１断片由来の領域を含む志賀毒素エフェクターポリペプチド領域のカルボキシ末端に連結されている（例えば、融合されている）免疫グロブリン型の結合領域などは、「Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする」分子部分である。
本発明の目的に関して、結合領域、例えば、少なくとも４０アミノ酸を含むポリペプチドを含む、及びＡ１断片由来の領域を含む志賀毒素エフェクターポリペプチド領域のカルボキシ末端に連結されている（例えば、融合されている）免疫グロブリン型の結合領域などは、「Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端を妨害する」分子部分である。
本発明の目的に関して、用語「志賀毒素ファミリーのメンバーのＡ１断片」は、志賀毒素Ａサブユニット間で保存されており、野生型志賀毒素Ａサブユニット中でＡ１断片とＡ２断片との間に配置されたフーリン切断部位でフーリンによりタンパク質分解された後の志賀毒素Ａサブユニットの残存したアミノ末端断片を指す。
特許請求された発明の目的に関して、成句「Ａ１断片領域のカルボキシ末端におけるフーリン切断モチーフ」は、志賀毒素Ａサブユニット間で保存されており、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニット中のＡ１断片とＡ２断片との間でジャンクションを架橋する特異
的なフーリン切断モチーフを指す。
本発明の目的に関して、成句「Ａ１断片領域のカルボキシ末端の近位におけるフーリン切断部位」は、Ａ１断片領域又はＡ１断片由来の領域中の最後のアミノ酸残基を定義するアミノ酸残基から、１、２、３、４、５、６、７未満の、又はそれより多くのアミノ酸残基の距離内のアミノ酸残基を有するあらゆる同定可能なフーリン切断部位を指し、例えば、Ａ１断片領域又はＡ１断片由来の領域のカルボキシ末端に配置されている、例えば、例えば本発明の細胞標的化分子の分子部分などの分子の別の成分へのＡ１断片由来の領域の連結部の近位に配置されているフーリン切断モチーフを含む。
本発明の目的に関して、成句「破壊されたフーリン切断モチーフ」は、（ｉ）本明細書のＩ−Ｂ章で説明される特定のフーリン切断モチーフ、及び（ii）参照分子と比較してフーリン切断が低減した分子、例えば、同じ条件下における同じアッセイで観察された参照分子のフーリン切断より３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はそれ未満（切断なしの場合の１００％を含む）の、再現性よく観察されるフーリン切断の低減を示す分子を付与することができる、変異及び／又は短縮化を含む、フーリン切断モチーフを指す。参照分子と比較したフーリン切断のパーセンテージは、参照分子の切断された材料：切断されていない材料で割った所望の分子の切断された材料：切断されていない材料の比率として表すことができる（上記の実施例を参照）。好適な参照分子の非限定的な例としては、野生型志賀毒素フーリン切断モチーフ並びに／又は本明細書のＩ−Ｂ章、IV−Ｂ章及び／若しくは実施例で説明されるフーリン切断部位を含むある特定の分子、並びに／又は以下の実施例で参照分子として使用される分子が挙げられる。
本発明の目的に関して、成句「フーリン切断耐性」は、分子又はそれらの特定のポリペプチド領域が、本明細書に記載される方法を使用することなどによる熟練した作業者にとって利用可能ないずれかの手段によってアッセイした場合、（ｉ）野生型志賀毒素Ａサブユニットにおける志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端、又は（ii）Ａ１断片とＡ２断片との間のジャンクションに天然に位置する、天然に存在するフーリン切断部位が破壊されていないコンストラクトの志賀毒素Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端より少ないフーリン切断を再現性よく示すことを意味する。
本発明の目的に関して、成句「志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニット由来の活性な酵素ドメイン」は、志賀毒素の酵素活性に基づき触媒によるリボソームの不活性化を介してタンパク質合成を阻害する能力を有するポリペプチド構造を指す。タンパク質合成の阻害活性及び／又は触媒によるリボソームの不活性化を示す分子構造の能力は、様々な熟練した作業者公知のアッセイ、例えば、生きた細胞の非存在下におけるＲＮＡ翻訳アッセイを含むインビトロでのアッセイ、又はインビボでの生きた細胞のリボソームを含むアッセイを使用して観察することができる。例えば、熟練した作業者公知のアッセイを使用して、志賀毒素の酵素活性に基づく分子の酵素活性は、例えばリボソームニッキングアッセイなどのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に対するＮ−グリコシダーゼ活性を観察することによって直接的に、並びに／又はリボソーム機能、ＲＮＡ翻訳、及び／若しくはタンパク質合成の阻害を観察することによって間接的にアセスメントすることができる。
「組合せ」は、本明細書で志賀毒素エフェクターポリペプチドに関して使用される場合、各部分領域が（１）内因性エピトープ又はエピトープ領域における破壊；（２）組み込まれた異種Ｔ細胞エピトープ−ペプチド；（３）挿入された異種Ｔ細胞エピトープ−ペプチド；及び（４）Ａ１断片領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフの少なくとも１つを含む、２つ又は３つ以上の部分領域を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを説明する。
導入
本発明は、様々な組合せの、志賀毒素エフェクターポリペプチド及びそれを含む細胞標的化分子を提供する。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドのある特定の実施形態は、例えば、１）その特定のエレメントの組合せが欠失した分子バリアントと比較して低減した抗原性及び／又は免疫原性を示す能力、２）その特定のエレメントの組合せが欠失した分子バリアントと比較して低減したプロテアーゼ切断を示す能力、３）ある特定の投薬量で、その特定のエレメントの組合せが欠失した分子バリアントと比較して多細胞生物に対して低減した非特異的な毒性を示す能力、４）細胞表面提示のために、細胞のＭＨＣクラスＩ系に、組み込まれた又は挿入されたＴ細胞エピトープを送達する能力、及び／又は５）強力な細胞毒性を示す能力などの２つ又は３つ以上の特性を、単一分子中にもたらす構造的なエレメントを組み合わせる。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、様々な細胞標的化分子、例えば、細胞を標的化する細胞毒性の治療的分子；細胞を標的化する非毒性の運搬手段；及び細胞を標的化する診断用分子などを作り出すための足場として役立つ可能性がある。
Ｉ．本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドの一般的な構造
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は、少なくとも１つの、野生型志賀毒素Ａサブユニット由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドを含むが、１つ又は２つ以上の構造改変、例えば短縮化及び／又はアミノ酸残基の置換のような変異などを含む。ある特定の実施形態に関して、本発明は、以下の志賀毒素エフェクターポリペプチド部分領域：（１）脱免疫化された部分領域、（２）志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に近いプロテアーゼ切断耐性の部分領域、及び（３）Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの組み込まれた又は挿入された部分領域の２つ又は３つ以上の組合せを含む、改善された志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドを改変することを含む。
志賀毒素エフェクターポリペプチドは、１つ又は２つ以上の志賀毒素の機能を示すことができる志賀毒素ファミリーのメンバーの志賀毒素Ａサブユニット由来のポリペプチドである（例えば、Cheung M et al., Mol Cancer 9:28 (2010)；国際公開第２０１４／１６
４６９３号パンフレット；国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット；国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット；国際公開第２０１５／１３８４５２号パンフレット；国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）。志賀毒素の機能としては、例えば、細胞内在化を増加させること、エンドソーム区画からサイトゾルへの細胞内経路決定を指示すること、細胞内分解を回避すること、リボソームを触媒的に不活性化すること、及び細胞増殖抑制性及び／又は細胞毒性作用を実現することが挙げられる。
タンパク質毒素の志賀毒素ファミリーは、構造的及び機能的に関連する様々な天然に存在する毒素、例えば、志賀毒素、志賀様毒素１、及び志賀様毒素２で構成される（Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8:105-16 (2010)）。志賀毒素ファミリーのホロトキシンメンバーは、いくつかの宿主細胞の表面上に存在する特異的なスフィンゴ糖脂質に優先的に結合するドメイン、及び細胞の内部に入ればリボソームを永久に不活性化することが可能な酵素ドメインを標的化することを含有する（Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8:105-16 (2010)）。志賀毒素ファミリーのメンバーは、同じ全体構造及び作用機序を共有する（Engedal N et al.,Microbial Biotech 4：32-46 (2011)）。例えば、Ｓ
ｔｘ、ＳＬＴ−１及びＳＬＴ−２は、無細胞系において区別できない酵素活性を提示する（Head S et al.,J Biol Chem 266: 3617-21 (1991)；Tesh V et al., Infect Immun 61: 3392-402(1993)；Brigotti M et al., Toxicon 35:1431-1437 (1997)）。
志賀毒素ファミリーは、志賀赤痢菌（S. dysenteriae）血清型１から単離した真の志賀毒素（Ｓｔｘ）、腸管出血性大腸菌（E. coli）の血清型から単離した志賀様毒素１バリ
アント（ＳＬＴ１又はＳｔｘ１又はＳＬＴ−１又はＳｌｔ−Ｉ）、及び腸管出血性大腸菌の血清型から単離した志賀様毒素２バリアント（ＳＬＴ２又はＳｔｘ２又はＳＬＴ−２）を含む。ＳＬＴ１は、１つのアミノ酸残基だけＳｔｘと異なっており、両方ともベロ細胞毒素又はベロ毒素（ＶＴ）と称されてきた（O'Brien A, Curr Top Microbiol Immunol 180:65-94 (1992)）。ＳＬＴ１及びＳＬＴ２バリアントは一次アミノ酸配列レベルで互い
に約５３〜６０％しか類似していないにもかかわらず、それらは、志賀毒素ファミリーのメンバーに共通する酵素活性及び細胞毒性のメカニズムを共有する（Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8:105-16 (2010)）。例えば規定のサブタイプＳｔｘ１ａ、Ｓｔｘ１ｃ、Ｓｔｘ１ｄ、及びＳｔｘ２ａ−ｇなどの３９種を超える異なる志賀毒素が説明されている（Scheutz F et al.,J Clin Microbiol 50:2951-63 (2012)）。志賀毒素をコードする遺伝子は遺伝子水平伝播を介して細菌種間で伝播することができることから、志賀毒素ファミリーのメンバーは通常、どの細菌種にも制限されない（Strauch E et al., Infect Immun 69:7588-95(2001)；Bielaszewska M et al., Appl Environ Micrbiol73:3144-50 (2007)；Zhaxybayeva O, Doolittle W, Curr Biol 21:R242-6(2011)）。種間の伝播の例として、志賀毒素は、患者から単離されたＡ．ヘモリチカス（A. haemolyticus）の
株で発見された（Grotiuz G et al., J Clin Microbiol 44:3838-41 (2006)）。志賀毒素をコードするポリヌクレオチドが新しい亜種又は種に入ると、志賀毒素のアミノ酸配列は、遺伝的浮動及び／又は選択圧力によりわずかな配列の変動を発生させる可能性があるが、それでもなお志賀毒素ファミリーのメンバーに共通する細胞毒性のメカニズムを維持すると推測される（Scheutz F et al.,J Clin Microbiol 50:2951-63 (2012)を参照）。
Ａ．脱免疫化された志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば野生型志賀毒素、野生型志賀毒素ポリペプチド、及び／又は野生型ポリペプチド配列のみを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドなどと比較して、脱免疫化されている。本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドはそれぞれ、脊索動物にそのポリペプチドを投与した後に志賀毒素エフェクターポリペプチドの抗原性及び／又は免疫原性を低減するための、少なくとも１つの推定上の内因性エピトープ領域の破壊を含む。志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は志賀毒素Ａサブユニットポリペプチドは、天然に存在するか又はしないかにかかわらず、本明細書に記載される方法、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット及び／若しくは国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレットで説明される方法、並びに／又は熟練した作業者公知の方法によって脱免疫化することができ、得られた分子は、１つ又は２つ以上の志賀毒素Ａサブユニット機能を保持する。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、内因性エピトープ又はエピトープ領域、例えばＢ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープなどの破壊を含む。ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、本明細書に記載される少なくとも１つの内因性エピトープ領域の破壊を含み、この破壊は、脊索動物にそのポリペプチドを投与した後、志賀毒素エフェクターポリペプチドの抗原性及び／又は免疫原性を低減し、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、１つ又は２つ以上の志賀毒素Ａサブユニット機能、例えば有意なレベルの志賀毒素の細胞毒性などを示すことができる。
用語「破壊された」又は「破壊」は、本明細書でエピトープ領域に関して使用される場合、エピトープ領域における少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、逆転したアミノ酸残基の少なくとも１つがエピトープ領域中である２つ又は３つ以上のアミノ酸残基の逆位、エピトープ領域への少なくとも１つのアミノ酸の挿入、及びエピトープ領域中の少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を指す。変異によるエピトープ領域の破壊は、非標準アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸でのアミノ酸置換を含む。代替として、エピトープ領域は、
エピトープ領域中の少なくとも１つのアミノ酸をマスクする共有結合で連結された化学構造の付加によるアミノ酸の改変を含む変異によって破壊されてもよく、例えばペグ化（Zhang C et al., BioDrugs 26: 209-15 (2012)を参照）、低分子アジュバント（Flower D, Expert Opin Drug Discov 7: 807-17 (2012)）、及び部位特異的なアルブミン化（albumination）（LimS et al., J Control Release 207-93 (2015)）を参照されたい。
ある特定のエピトープ領域及び破壊は、本明細書において、配列表に記載された天然の志賀毒素Ａサブユニットの具体的なアミノ酸位置を参照することによって示されるが、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニットは、それらのアミノ末端に、除去されると成熟志賀毒素Ａサブユニットを産生して熟練した作業者に認識可能になる約２２アミノ酸のシグナル配列を含有する前駆体型を含み得ることに留意されたい。さらに、ある特定のエピトープ領域の破壊は、本明細書において、具体的なアミノ酸（例えばセリン残基の場合はＳ）、それが天然に存在する天然の志賀毒素Ａサブユニット内の具体的な位置（例えばアミノ末端から３３位のセリン残基の場合はＳ３３）、続いて議論中の特定の変異においてその残基を置換しているアミノ酸を参照することによって示される（例えばＳ３３Ｉは、アミノ末端からのアミノ酸残基３３におけるイソロイシンによるセリンのアミノ酸置換を表示する）。
ある特定の実施形態において、本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、本明細書で提供される少なくとも１つのエピトープ領域の破壊を含む（例えば表１〜７及び／又は１２を参照）。ある特定の実施形態において、本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット又は国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレットで説明される少なくとも１つのエピトープ領域の破壊を含む。
ある特定の実施形態において、本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２の１〜１５；配列番号３の３〜１４；配列番号３の２６〜３７；配列番号１又は配列番号２の２７〜３７；配列番号１又は配列番号２の３９〜４８；配列番号３の４２〜４８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５３〜６６；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４〜１１５；配列番号１又は配列番号２の１４１〜１５３；配列番号３の１４０〜１５６；配列番号１又は配列番号２の１７９〜１９０；配列番号３の１７９〜１９１；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；配列番号３の２１０〜２１８；配列番号３の２４０〜２５８；配列番号１又は配列番号２の２４３〜２５７；配列番号１又は配列番号２の２５４〜２６８；配列番号３の２６２〜２７８；配列番号３の２８１〜２９７；及び配列番号１又は配列番号２の２８５〜２９３からなる天然に位置するアミノ酸の群から選択されるアミノ酸配列、又は志賀毒素Ａサブユニットポリペプチド、保存された志賀毒素エフェクターポリペプチド部分領域、及び／若しくは非天然の志賀毒素エフェクターポリペプチド配列において相当する位置の少なくとも１つの破壊を含む完全長志賀毒素Ａサブユニット（例えばＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３））を含むか又はそれから本質的になる。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、短縮型志賀毒素Ａサブユニットを含むか又はそれから本質的になる。志賀毒素Ａサブユニットの短縮化は、志賀毒素エフェクター機能に影響を及ぼすことなく、エピトープ領域全体の欠失をもたらす可能性がある。有意な酵素活性を表すことが示された最小の志賀毒素Ａサブユニット断片は、ＳｔｘＡの残基７５〜２４７で構成されるポリペプチドであった（Al-Jaufy A et al., Infect Immun 62：956-60 (1994)）。ＳＬＴ−１Ａ、ＳｔｘＡ、又はＳ
ＬＴ−２Ａのカルボキシ末端のアミノ酸１〜２５１への短縮は、２つの予測されたＢ細胞エピトープ領域、２つの予測されたＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）Ｔ細胞エピトープ、及び予測
された不連続のＢ細胞エピトープを除去する。ＳＬＴ−１Ａ、ＳｔｘＡ、又はＳＬＴ−２Ａのアミノ末端の７５〜２９３への短縮は、少なくとも３つの予測されたＢ細胞エピトープ領域、及び３つの予測されたＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを除去する。ＳＬＴ−１Ａ、ＳｔｘＡ、又はＳＬＴ−２Ａのアミノ及びカルボキシ末端の両方の７５〜２５１への短縮は、少なくとも５つの予測されたＢ細胞エピトープ領域；４つの推定上のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ；及び１つの予測された不連続のＢ細胞エピトープを欠失させる。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、提供されたエピトープ領域中に、少なくとも１つの変異、例えば欠失、挿入、逆位、又は置換を有する完全長又は短縮型志賀毒素Ａサブユニットを含んでいてもよいし、又はそれらから本質的になっていてもよい。ある特定のさらなる実施形態において、ポリペプチドは、エピトープ領域内の少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含む破壊を含む。ある特定のさらなる実施形態において、ポリペプチドは、エピトープ領域内の少なくとも１つのアミノ酸の挿入を含む破壊を含む。ある特定のさらなる実施形態において、ポリペプチドは、アミノ酸の逆位を含む破壊を含み、少なくとも１つの逆転したアミノ酸は、エピトープ領域内である。ある特定のさらなる実施形態において、ポリペプチドは、例えば非標準アミノ酸又は化学修飾された側鎖を有するアミノ酸へのアミノ酸置換などの変異を含む破壊を含む。以下の実施例に、単一のアミノ酸置換の多数の例を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、及びＫからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、天然の配列と比較して１つ又は２つ以上の変異を有する完全長又は短縮型志賀毒素Ａサブユニットを含んでいてもよいし、又はそれらから本質的になっていてもよい。ある特定のさらなる実施形態において、ポリペプチドは、天然の配列と比較して単一の変異を有する完全長又は短縮型志賀毒素Ａサブユニットを含んでいてもよいし、又はそれらから本質的になっていてもよく、置換は、ＤからＡ、ＤからＧ、ＤからＶ、ＤからＬ、ＤからＩ、ＤからＦ、ＤからＳ、ＤからＱ、ＥからＡ、ＥからＧ、ＥからＶ、ＥからＬ、ＥからＩ、ＥからＦ、ＥからＳ、ＥからＱ、ＥからＮ、ＥからＤ、ＥからＭ、ＥからＲ、ＧからＡ、ＨからＡ、ＨからＧ、ＨからＶ、ＨからＬ、ＨからＩ、ＨからＦ、ＨからＭ、ＫからＡ、ＫからＧ、ＫからＶ、ＫからＬ、ＫからＩ、ＫからＭ、ＫからＨ、ＬからＡ、ＬからＧ、ＮからＡ、ＮからＧ、ＮからＶ、ＮからＬ、ＮからＩ、ＮからＦ、ＰからＡ、ＰからＧ、ＰからＦ、ＲからＡ、ＲからＧ、ＲからＶ、ＲからＬ、ＲからＩ、ＲからＦ、ＲからＭ、ＲからＱ、ＲからＳ、ＲからＫ、ＲからＨ、ＳからＡ、ＳからＧ、ＳからＶ、ＳからＬ、ＳからＩ、ＳからＦ、ＳからＭ、ＴからＡ、ＴからＧ、ＴからＶ、ＴからＬ、ＴからＩ、ＴからＦ、ＴからＭ、ＴからＳ、ＹからＡ、ＹからＧ、ＹからＶ、ＹからＬ、ＹからＩ、ＹからＦ、及びＹからＭからなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、免疫原性残基の少なくとも１つのアミノ酸置換及び／又はエピトープ領域内の少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、天然のアミノ酸残基配列と比較して１つ又は２つ以上の変異を有する完全長又は短縮型志賀毒素Ａサブユニットを含むか又はそれから本質的になり、少なくとも１つの置換は、配列番号１又は配列番号２の１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１；配列番号１又は配列番号２の３３；配列番号１又は配列番号２の４３；配列番号１又は配列番号２の４４；配列番号１又は配列番号２の４５；配列番号１又は配列番号２の４６；配列番号１又は配列番号２の４７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４８；配列番号１又は配列番号２の４９；配列番号１又は配列番号２の５０；配列番号１又は配列番号２の５１；配列番号１又は配列番号２の５３；配列番号１又は配列番号２の５４；配列番号１又は配
列番号２の５５；配列番号１又は配列番号２の５６；配列番号１又は配列番号２の５７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５９；配列番号１又は配列番号２の６０；配列番号１又は配列番号２の６１；配列番号１又は配列番号２の６２；配列番号１又は配列番号２の８４；配列番号１又は配列番号２の８８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９６；配列番号１又は配列番号２の１０４；配列番号１又は配列番号２の１０５；配列番号１又は配列番号２の１０７；配列番号１又は配列番号２の１０８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１０９；配列番号１又は配列番号２の１１０；配列番号１又は配列番号２の１１１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１２；配列番号１又は配列番号２の１４１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１４７；配列番号１又は配列番号２の１５４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１７９；配列番号１又は配列番号２の１８０；配列番号１又は配列番号２の１８１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８３；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８４；配列番号１又は配列番号２の１８５；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８６；配列番号１又は配列番号２の１８７；配列番号１又は配列番号２の１８８；配列番号１又は配列番号２の１８９；配列番号１又は配列番号２の１９８；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；配列番号３の２４１；配列番号１又は配列番号２の２４２；配列番号１又は配列番号２の２４７；配列番号３の２４７；配列番号１又は配列番号２の２４８；配列番号３の２５０；配列番号１又は配列番号２の２５１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の２６４；配列番号１又は配列番号２の２６５；及び配列番号１又は配列番号２の２８６からなる群から選択されるアミノ酸の天然に位置する群で生じる。
ある特定のさらなる実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、免疫原性残基の少なくとも１つの置換及び／又はエピトープ領域内の少なくとも１つの置換を有する完全長又は短縮型志賀毒素Ａサブユニットを含むか又はそれから本質的になり、少なくとも１つのアミノ酸置換は、以下の天然の位置：配列番号１又は配列番号２の１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１；配列番号１又は配列番号２の３３；配列番号１又は配列番号２の４３；配列番号１又は配列番号２の４４；配列番号１又は配列番号２の４５；配列番号１又は配列番号２の４６；配列番号１又は配列番号２の４７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４８；配列番号１又は配列番号２の４９；配列番号１又は配列番号２の５０；配列番号１又は配列番号２の５１；配列番号１又は配列番号２の５３；配列番号１又は配列番号２の５４；配列番号１又は配列番号２の５５；配列番号１又は配列番号２の５６；配列番号１又は配列番号２の５７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５９；配列番号１又は配列番号２の６０；配列番号１又は配列番号２の６１；配列番号１又は配列番号２の６２；配列番号１又は配列番号２の８４；配列番号１又は配列番号２の８８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９６；配列番号１又は配列番号２の１０４；配列番号１又は配列番号２の１０５；配列番号１又は配列番号２の１０７；配列番号１又は配列番号２の１０８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１０９；配列番号１又は配列番号２の１１０；配列番号１又は配列番号２の１１１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１２；配列番号１又は配列番号２の１４１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１４７；配列番号１又は配列番号２の１５４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１７９；配列番号１又は配列番号２の１８０；配列番号１又は配列番号２の１８１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８３；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８４；配列番号１又は配列番号２の１８５；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８６；配列番号１又は配列番号２の１８７；配列番号１又は配列番号２の１８８；配列番号１又は配列番号２の１８９；配列番号
１又は配列番号２の１９８；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；配列番号３の２４１；配列番号１又は配列番号２の２４２；配列番号１又は配列番号２の２４７；配列番号３の２４７；配列番号１又は配列番号２の２４８；配列番号３の２５０；配列番号１又は配列番号２の２５１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の２６４；配列番号１又は配列番号２の２６５；及び配列番号１又は配列番号２の２８６の１つに位置する天然に存在するアミノ酸に対する非保存的アミノ酸へ置換である（例えば下記の表Ｃを参照）。
ある特定のさらなる実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、Ｋ１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ及びＨ；Ｔ４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｓ８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｔ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｋ１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ及びＨ；Ｔ１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ３３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｓ４３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４４からＡ及びＬ；Ｓ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｔ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４６からＡ及びＰ；Ｄ４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｎ４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、及びＭ；Ｌ４９からＡ又はＧ；Ｆ５０；Ａ５１からＶ；Ｄ５３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｖ５４からＡ、Ｇ、及びＬ；Ｒ５５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｇ５６からＡ及びＰ；Ｉ５７からＡ、Ｇ、Ｍ、及びＦ；Ｌ５７からＡ、Ｇ、Ｍ、及びＦ；Ｄ５８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｐ５９からＡ、Ｇ、及びＦ；Ｅ６０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、及びＲ；Ｅ６１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、及びＲ；Ｇ６２からＡ；Ｄ９４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｒ８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｖ８８からＡ及びＧ；Ｉ８８からＡ、Ｇ、及びＶ；Ｄ９４；Ｓ９６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ａ１０５からＬ；Ｔ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｌ１０８からＡ、Ｇ、及びＭ；Ｓ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｇ１１０からＡ；Ｄ１１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１４１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ１４７からＡ；Ｖ１５４からＡ及びＧ；Ｒ１７９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｔ１８０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｔ１８１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ１８３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｌ１８５からＡ、Ｇ、及びＶ；Ｓ１８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｇ１８７からＡ；Ｒ１８８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｓ１８９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１９７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１９８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｒ２０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２０５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ及びＨ；Ｃ２４２からＡ、Ｇ、Ｖ、及びＳ；Ｓ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｙ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｒ２４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｃ２６２からＡ、Ｇ、Ｖ、及びＳ；Ｄ２６４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ２６４からＡ；及びＴ２８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する完全長又は短縮型志賀毒素Ａサブユニットを含むか又はそれから本質的になる。
ある特定のさらなる実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは
、以下のアミノ酸置換Ｋ１Ａ、Ｋ１Ｍ、Ｔ４Ｉ、Ｄ６Ｒ、Ｓ８Ｉ、Ｔ８Ｖ、Ｔ９Ｉ、Ｓ９Ｉ、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｈ、Ｔ１２Ｋ、Ｓ３３Ｉ、Ｓ３３Ｃ、Ｓ４３Ｎ、Ｇ４４Ｌ、Ｓ４５Ｖ、Ｓ４５Ｉ、Ｔ４５Ｖ、Ｔ４５Ｉ、Ｇ４６Ｐ、Ｄ４７Ｍ、Ｄ４７Ｇ、Ｎ４８Ｖ、Ｎ４８Ｆ、Ｌ４９Ａ、Ｆ５０Ｔ、Ａ５１Ｖ、Ｄ５３Ａ、Ｄ５３Ｎ、Ｄ５３Ｇ、Ｖ５４Ｌ、Ｖ５４Ｉ、Ｒ５５Ａ、Ｒ５５Ｖ、Ｒ５５Ｌ、Ｇ５６Ｐ、Ｉ５７Ｆ、Ｉ５７Ｍ、Ｄ５８Ａ、Ｄ５８Ｖ、Ｄ５８Ｆ、Ｐ５９Ａ、Ｐ５９Ｆ、Ｅ６０Ｉ、Ｅ６０Ｔ、Ｅ６０Ｒ、Ｅ６１Ａ、Ｅ６１Ｖ、Ｅ６１Ｌ、Ｇ６２Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｖ８８Ａ、Ｄ９４Ａ、Ｓ９６Ｉ、Ｔ１０４Ｎ、Ａ１０５Ｌ、Ｔ１０７Ｐ、Ｌ１０８Ｍ、Ｓ１０９Ｖ、Ｔ１０９Ｖ、Ｇ１１０Ａ、Ｄ１１１Ｔ、Ｓ１１２Ｖ、Ｄ１４１Ａ、Ｇ１４７Ａ、Ｖ１５４Ａ、Ｒ１７９Ａ、Ｔ１８０Ｇ、Ｔ１８１Ｉ、Ｄ１８３Ａ、Ｄ１８３Ｇ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ｆ、Ｌ１８５Ｖ、Ｌ１８５Ｄ、Ｓ１８６Ａ、Ｓ１８６Ｆ、Ｇ１８７Ａ、Ｇ１８７Ｔ、Ｒ１８８Ａ、Ｒ１８８Ｌ、Ｓ１８９Ａ、Ｄ１９８Ａ、Ｒ２０４Ａ、Ｒ２０５Ａ、Ｃ２４２Ｓ、Ｓ２４７Ｉ、Ｙ２４７Ａ、Ｒ２４８Ａ、Ｒ２５０Ａ、Ｒ２５１Ａ、又はＤ２６４Ａ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２８６Ａ、及び／又はＴ２８６Ｉの少なくとも１つを有する完全長又は短縮型志賀毒素Ａサブユニットを含むか又はそれから本質的になる。これらのエピトープを破壊する置換を組み合わせて、脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを形成してもよく、その場合、志賀毒素エフェクター機能を保持しながら、エピトープ領域１つ当たり複数の置換があってもよいし、及び／又は複数のエピトープ領域が破壊されていてもよい。例えば、天然に位置するＫ１Ａ、Ｋ１Ｍ、Ｔ４Ｉ、Ｄ６Ｒ、Ｓ８Ｉ、Ｔ８Ｖ、Ｔ９Ｉ、Ｓ９Ｉ、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｈ、Ｔ１２Ｋ、Ｓ３３Ｉ、Ｓ３３Ｃ、Ｓ４３Ｎ、Ｇ４４Ｌ、Ｓ４５Ｖ、Ｓ４５Ｉ、Ｔ４５Ｖ、Ｔ４５Ｉ、Ｇ４６Ｐ、Ｄ４７Ｍ、Ｄ４７Ｇ、Ｎ４８Ｖ、Ｎ４８Ｆ、Ｌ４９Ａ、Ｆ５０Ｔ、Ａ５１Ｖ、Ｄ５３Ａ、Ｄ５３Ｎ、Ｄ５３Ｇ、Ｖ５４Ｌ、Ｖ５４Ｉ、Ｒ５５Ａ、Ｒ５５Ｖ、Ｒ５５Ｌ、Ｇ５６Ｐ、Ｉ５７Ｆ、Ｉ５７Ｍ、Ｄ５８Ａ、Ｄ５８Ｖ、Ｄ５８Ｆ、Ｐ５９Ａ、Ｐ５９Ｆ、Ｅ６０Ｉ、Ｅ６０Ｔ、Ｅ６０Ｒ、Ｅ６１Ａ、Ｅ６１Ｖ、Ｅ６１Ｌ、Ｇ６２Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｖ８８Ａ、Ｄ９４Ａ、Ｓ９６Ｉ、Ｔ１０４Ｎ、Ａ１０５Ｌ、Ｔ１０７Ｐ、Ｌ１０８Ｍ、Ｓ１０９Ｖ、Ｔ１０９Ｖ、Ｇ１１０Ａ、Ｄ１１１Ｔ、Ｓ１１２Ｖ、Ｄ１４１Ａ、Ｇ１４７Ａ、Ｖ１５４Ａ、Ｒ１７９Ａ、Ｔ１８０Ｇ、Ｔ１８１Ｉ、Ｄ１８３Ａ、Ｄ１８３Ｇ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ｆ、Ｌ１８５Ｖ、Ｌ１８５Ｄ、Ｓ１８６Ａ、Ｓ１８６Ｆ、Ｇ１８７Ａ、Ｇ１８７Ｔ、Ｒ１８８Ａ、Ｒ１８８Ｌ、Ｓ１８９Ａ、Ｄ１９８Ａ、Ｒ２０４Ａ、Ｒ２０５Ａ、Ｃ２４２Ｓ、Ｓ２４７Ｉ、Ｙ２４７Ａ、Ｒ２４８Ａ、Ｒ２５０Ａ、Ｒ２５１Ａ、又はＤ２６４Ａ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２８６Ａ、及び／又はＴ２８６Ｉにおける置換を、可能であれば、天然に位置する残基Ｋ１Ａ、Ｋ１Ｍ、Ｔ４Ｉ、Ｄ６Ｒ、Ｓ８Ｉ、Ｔ８Ｖ、Ｔ９Ｉ、Ｓ９Ｉ、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｈ、Ｔ１２Ｋ、Ｓ３３Ｉ、Ｓ３３Ｃ、Ｓ４３Ｎ、Ｇ４４Ｌ、Ｓ４５Ｖ、Ｓ４５Ｉ、Ｔ４５Ｖ、Ｔ４５Ｉ、Ｇ４６Ｐ、Ｄ４７Ｍ、Ｄ４７Ｇ、Ｎ４８Ｖ、Ｎ４８Ｆ、Ｌ４９Ａ、Ｆ５０Ｔ、Ａ５１Ｖ、Ｄ５３Ａ、Ｄ５３Ｎ、Ｄ５３Ｇ、Ｖ５４Ｌ、Ｖ５４Ｉ、Ｒ５５Ａ、Ｒ５５Ｖ、Ｒ５５Ｌ、Ｇ５６Ｐ、Ｉ５７Ｆ、Ｉ５７Ｍ、Ｄ５８Ａ、Ｄ５８Ｖ、Ｄ５８Ｆ、Ｐ５９Ａ、Ｐ５９Ｆ、Ｅ６０Ｉ、Ｅ６０Ｔ、Ｅ６０Ｒ、Ｅ６１Ａ、Ｅ６１Ｖ、Ｅ６１Ｌ、Ｇ６２Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｖ８８Ａ、Ｄ９４Ａ、Ｓ９６Ｉ、Ｔ１０４Ｎ、Ａ１０５Ｌ、Ｔ１０７Ｐ、Ｌ１０８Ｍ、Ｓ１０９Ｖ、Ｔ１０９Ｖ、Ｇ１１０Ａ、Ｄ１１１Ｔ、Ｓ１１２Ｖ、Ｄ１４１Ａ、Ｇ１４７Ａ、Ｖ１５４Ａ、Ｒ１７９Ａ、Ｔ１８０Ｇ、Ｔ１８１Ｉ、Ｄ１８３Ａ、Ｄ１８３Ｇ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ｆ、Ｌ１８５Ｖ、Ｌ１８５Ｄ、Ｓ１８６Ａ、Ｓ１８６Ｆ、Ｇ１８７Ａ、Ｇ１８７Ｔ、Ｒ１８８Ａ、Ｒ１８８Ｌ、Ｓ１８９Ａ、Ｄ１９８Ａ、Ｒ２０４Ａ、Ｒ２０５Ａ、Ｃ２４２Ｓ、Ｓ２４７Ｉ、Ｙ２４７Ａ、Ｒ２４８Ａ、Ｒ２５０Ａ、Ｒ２５１Ａ、又はＤ２６４Ａ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２８６Ａ、及び／又はＴ２８６Ｉにおける置換と組み合わせて、本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを作り出してもよい。
本明細書に記載される脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチド部分領域及び／又はエピトープを破壊する変異のいずれも、単独で使用してもよいし、又は本発明の方法を含む本発明のそれぞれ個々の実施形態と組み合わせて使用してもよい。
Ｂ．プロテアーゼ切断耐性志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（１）カルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片由来の領域、及び（２）志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含む。志賀毒素成分と、細胞標的化分子の他の成分、例えば細胞を標的化する結合領域との間の接続の安定性の改善は、例えばタンパク質分解などの結果としての接続の破壊及び細胞標的化の損失によって引き起こされる非特異的な毒性を低減することによって、生物に投与した後のそれらの毒性プロファイルを改善することができる。
志賀毒素ファミリーのメンバーの志賀毒素Ａサブユニットは、志賀毒素の機能にとって重要なそれらのＡ１断片領域のカルボキシ末端に保存されたフーリン切断部位を含む。フーリン切断部位モチーフ及びフーリン切断部位は、熟練した作業者により、標準的な技術を使用して、及び／又は本明細書に記載の情報を使用することによって同定することができる。
志賀毒素の細胞毒性のモデルは、毒素が与えられた細胞におけるフーリンによる志賀毒素Ａサブユニットの細胞内タンパク質分解性プロセシングは、１）志賀ホロトキシンの残部からのＡ１断片の解放、２）Ａ１断片のカルボキシ末端における疎水性ドメインを露出させることによる、小胞体からのＡ１断片の離脱、及び３）Ａ１断片の酵素による活性化に必須であるモデルである（Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8：105-16(2010)を参照）。毒素が与えられた細胞の小胞体におけるＡ２断片及び志賀ホロトキシンの成
分の残部からの志賀毒素Ａ１断片の効率的な解放は、サイトゾルへの効率的な細胞内経路決定、最大の酵素活性、効率的なリボソーム不活性化、及び最適な細胞毒性、すなわち野生型志賀毒素と同程度の細胞毒性の達成に必須である（例えば国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット及びそこに記載の参考文献を参照）。
志賀毒素による中毒の間、Ａサブユニットは、保存されたアルギニン残基（例えばＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａにおける２５１位のアルギニン残基、並びにＳｔｘ２Ａ及びＳＬＴ−２Ａにおける２５０位のアルギニン残基）のカルボキシ結合でのフーリンによるタンパク質分解によって切断される。志賀毒素Ａサブユニットのフーリン切断は、エンドソーム及び／又はゴルジ区画で起こる。フーリンは、検査された全てのヒト組織における多種多様の細胞型によって、及びほとんどの動物細胞によって発現される特殊化したセリンエンドプロテアーゼである。フーリンは、最小の二塩基性コンセンサスモチーフＲ−ｘ−（Ｒ／Ｋ／ｘ）−Ｒにおいて中心にあることが多い利用可能なモチーフを含むポリペプチドを切断する。志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットは、保存された、表面に露出した伸長したループ構造（例えばＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａでは２４２〜２６１、及びＳＬＴ−２では２４１〜２６０）を含み、保存されたＳ−Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒモチーフがフーリンによって切断される。ＳｔｘＡにおけるアミノ酸残基２４２〜２６１に位置する表面に露出した伸長したループ構造は、最小のフーリン切断モチーフＲ−ｘ−ｘ−Ｒの端にある機構を含む、フーリンによって誘導されるＳｔｘＡの切断に必要である。
志賀毒素Ａサブユニット及び志賀毒素エフェクターポリペプチドにおけるフーリン切断モチーフ及びフーリン切断部位は、熟練した作業者により、標準的な方法を使用して、及び／又は本明細書に記載の情報を使用することによって同定することができる。フーリンは、最小のコンセンサスモチーフＲ−ｘ−ｘ−Ｒを切断する（Schalken J et al.,J Clin Invest 80：1545-9 (1987)；BresnahanP et al., J Cell Biol 111：2851-9 (1990)；Hatsuzawa K etal., J Biol Chem 265：22075-8 (1990)；Wise R et al., Proc Natl Acad Sci USA 87：9378-82 (1990)；Molloy S et al., J Biol Chem267：16396-402 (1992)）。これと一致して、多くのフーリン阻害剤は、モチーフＲ−ｘ−ｘ−Ｒを含むペプチ
ドを含む。フーリンの合成阻害剤の例は、ペプチドＲ−Ｖ−Ｋ−Ｒを含む分子（配列番号５３７）である（HenrichS et al., Nat Struct Biol 10：520-6 (2003)）。一般的に、２つのアミノ酸残基によって分離した２つの正電荷を有するアミノ酸を有する利用可能な二塩基性アミノ酸モチーフの表面を含むペプチド又はタンパク質は、モチーフ中の最後の塩基性アミノ酸のカルボキシ結合で切断が起こるフーリン切断に対して感受性を有することが予測され得る。
フーリンによって切断される基質中のコンセンサスモチーフは、ある程度の特異性で同定されている。フーリン切断部位モチーフは、２０個の連続的なアミノ酸残基の領域を含み、その領域は、Schechter I, Berger, A, Biochem Biophys Res Commun 32：898-902 (1968)で説明される命名法を使用して標識されたＰ１４〜Ｐ６’（TianS et al., Int J Mol Sci 12：1060-5 (2011)）であり得ることが説明されている。この命名法によれば、
フーリン切断部位は、Ｐ１と称されるアミノ酸残基のカルボキシ結合にあり、フーリン切断モチーフのアミノ酸残基は、この基準のＰ１残基からアミノ末端に向かう方向で、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４などと番号付けされる。基準のＰ１残基からカルボキシ末端に向かうモチーフのアミノ酸残基は、Ｐ２’、Ｐ３’、Ｐ４’などのようにプライム記号と共に番号付けされる。この命名法を使用すれば、Ｐ６〜Ｐ２’領域は、フーリンの酵素ドメインによって結合したフーリン切断モチーフのコア基質を表す。２つのフランキング領域Ｐ１４〜Ｐ７及びＰ３’〜Ｐ６’は、それらの間に位置されたコアのフーリン切断部位への利用しやすさを増加するために極性アミノ酸残基リッチになっていることが多い。
一般的なフーリン切断部位は、Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１に相当するコンセンサスモチーフＲ−ｘ−ｘ−Ｒによって記載されることが多く、式中「Ｒ」は、アルギニン残基を表示し（上記の表Ａを参照）、ダッシュ「−」はペプチド結合を表示し、小文字の「ｘ」は、任意のアミノ酸残基を表示する。しかしながら、他の残基及び位置が、フーリン切断モチーフをさらに定義するのを助ける場合がある。それよりわずかに洗練されたフーリン切断部位であるコンセンサスモチーフは、Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１に相当するコンセンサスモチーフＲ−ｘ−［Ｋ／Ｒ］−Ｒ（式中、フォワードスラッシュ「／」は、「又は」を意味し、同じ位置で二者択一のアミノ酸残基を分割する）として報告されることが多く、これはなぜなら、フーリンは、このモチーフを含有する基質の切断に対して強い優先性を有することが観察されたためである。
最小のフーリン切断部位Ｒ−ｘ−ｘ−Ｒに加えて、ある特定の位置においてある特定のアミノ酸残基への優先性を有するそれより大きいフーリン切断モチーフが説明されている。様々な公知のフーリン基質を比較することによって、長さが２０アミノ酸残基のフーリン切断部位モチーフにおけるアミノ酸残基についてある特定の物理化学的な特性が特徴付けられている。フーリン切断モチーフのＰ６〜Ｐ２’領域は、フーリンの酵素ドメインと物理的に相互作用するコアのフーリン切断部位を表す。２つのフランキング領域Ｐ１４〜Ｐ７及びＰ３’〜Ｐ６’は、親水性であることが多く、それらの間に配置されたコアのフーリン切断部位の表面への利用しやすさを増加するために極性アミノ酸残基リッチになっている。
一般的に、Ｐ５位〜Ｐ１位のフーリン切断モチーフ領域は、正電荷及び／又は高い等電点を有するアミノ酸残基を含む傾向がある。特定には、Ｐ１位は、フーリンのタンパク質分解の位置の指標であり、一般的にアルギニンによって占められているが、この位置に他の正電荷を有するアミノ酸残基が存在する場合もある。Ｐ２位及びＰ３位は、フレキシブルなアミノ酸残基によって占められる傾向があり、特定にはＰ２は、アルギニン、リシン、又は時にはグリシンのような極めて小さくフレキシブルなアミノ酸残基によって占められる傾向がある。Ｐ４位は、フーリン基質中で正電荷を有するアミノ酸残基によって占められる傾向がある。しかしながら、Ｐ４位が脂肪族アミノ酸残基によって占められている
場合、正電荷を有する官能基の欠失は、Ｐ５位及び／又はＰ６位に配置された正電荷を有する残基によって補うことができる。Ｐ１’位及びＰ２’位は、一般的に脂肪族及び／又は疎水性アミノ酸残基によって占められており、Ｐ１’位は、最も一般的にはセリンによって占められている。
２つの親水性フランキング領域は、極性、親水性であり、より小さいアミノ酸官能基を有するアミノ酸残基によって占められる傾向があるが、ある特定の検証されたフーリン基質において、フランキング領域は、どのような親水性アミノ酸残基も含有しない（Tian S, Biochem Insights 2：9-20 (2009)を参照）。
志賀毒素Ａ１断片とＡ２断片との間のジャンクションにおける、天然の志賀毒素Ａサブユニットに見出される２０アミノ酸残基のフーリン切断モチーフ及びフーリン切断部位は、ある特定の志賀毒素においてよく特徴付けられている。例えばＳｔｘＡ（配列番号２）及びＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）において、このフーリン切断モチーフは、Ｌ２３８〜Ｆ２５７に天然に位置しており、ＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）において、このフーリン切断モチーフは、Ｖ２３７〜Ｑ２５６に天然に位置する。本明細書に記載されるアミノ酸相同性、実験、及び／又はフーリン切断アッセイに基づいて、熟練した作業者は、他の天然の志賀毒素Ａサブユニット又は志賀毒素エフェクターポリペプチドでフーリン切断モチーフを同定することができ、この場合、モチーフは、実際のフーリン切断モチーフであるか、又は真核細胞中でその分子がフーリンで切断された後にＡ１及びＡ２断片の産生が生じると予測される。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（１）カルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片由来のポリペプチド、及び（２）志賀毒素Ａ１断片由来のポリペプチドのカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含む。志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端由来のポリペプチドは、熟練した作業者により、当業界において公知の技術を使用することによって同定することができ、例えば、タンパク質配列アライメントソフトウェアなどを使用することによって、（ｉ）天然に存在する志賀毒素と共に保存されたフーリン切断モチーフ、（ii）天然に存在する志賀毒素と共に保存された表面に露出した伸長したループ、及び／又は（iii）ＥＲＡＤシステムによっ
て認識することが可能な主として疎水性のアミノ酸残基のストレッチ（すなわち疎水性「パッチ」）を同定することができる。
本発明のプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（１）その志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端において全てのフーリン切断モチーフが完全に欠失していてもよいし、及び／又は（２）その志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端及び／又は志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端由来の領域に、破壊されたフーリン切断モチーフを含んでいてもよい。フーリン切断モチーフの破壊としては、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基への様々な変更、例えば、翻訳後修飾、アミノ酸官能基中の１つ又は２つ以上の原子の変更、アミノ酸官能基への１つ又は２つ以上の原子の付加、非タンパク質性部分への会合、及び／又は例えば結果として分岐したタンパク質性構造が生じるアミノ酸残基、ペプチド、ポリペプチドへの連結などが挙げられる。
プロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドは、本明細書に記載される方法、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットで説明された方法、及び／又は熟練した作業者公知の方法を使用して、天然に存在するか又はしないかにかかわらず、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は志賀毒素Ａサブユニットポリペプチドから作り出すことができ、得られた分子は、それでもなお１つ又は２つ以上の志賀毒素Ａサブユニット機能を保持する。
フーリン切断部位又はフーリン切断モチーフに関する本発明の目的に関して、用語「破壊」又は「破壊された」は、天然に存在するフーリン切断部位及び／又はフーリン切断モチーフからの変更、例えば、野生型志賀毒素Ａサブユニット又は野生型ポリペプチド配列のみを含む野生型志賀毒素Ａサブユニット由来のポリペプチドのフーリン切断と比較して、志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端、又はそれらに由来する同定可能な領域の近位のフーリン切断の低減を引き起こす変異などを指す。フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基への変更としては、例えばフーリン切断モチーフのカルボキシ末端の欠失、挿入、逆位、置換、及び／又は短縮化などのフーリン切断モチーフ中の変異、加えて、例えば、アミノ酸残基の官能基に分子をコンジュゲート又は連結することを含む糖付加、アルブミン化などの結果としての翻訳後修飾が挙げられる。フーリン切断モチーフは理論上約２０アミノ酸残基で構成されることから、これらの２０個の位置のいずれか１つの１つ又は２つ以上のアミノ酸残基に関与する変更、改変、変異、欠失、挿入、及び／又は短縮化が、フーリン切断の感受性の低減を引き起こす可能性がある（Tian S et al., Sci Rep 2：261 (2012)）。フーリン切断部位及び／又はフーリン切断モチーフの破壊は、例えばトリプシンなどの他のプロテアーゼ、及び哺乳動物の血管系に共通する細胞外プロテアーゼによって、切断に対する耐性を増加させる可能性もあるし、又は増加させない可能性もある。所与のプロテアーゼの切断の感受性に対する所与の破壊の作用は、熟練した作業者により、当業界において公知の技術を使用して試験することができる。
本発明の目的に関して、「破壊されたフーリン切断モチーフ」は、志賀毒素Ａ１断片とＡ２断片領域との間のジャンクションにおいて天然の志賀毒素Ａサブユニットで見出される保存されたフーリン切断モチーフを表示し、志賀毒素Ａサブユニットのフーリン切断によりＡ１及びＡ２断片の産生が生じるように配置された２０アミノ酸残基の領域に由来する１つ又は２つ以上のアミノ酸残基への変更を含むフーリン切断モチーフであり、熟練した作業者公知の及び／又は本明細書に記載される適切なアッセイを使用してフーリン切断をモニターできる程度に十分に大きいサイズを有するカルボキシ末端のポリペプチドに融合した野生型志賀毒素Ａ１断片領域を含む参照分子と比較して、破壊されたフーリン切断モチーフは、実験的に再現可能な方式で低減したフーリン切断を示す。
フーリン切断部位及びフーリン切断モチーフを破壊させることができる変異のタイプの例は、アミノ酸残基の欠失、挿入、短縮化、逆位、並びに／又は、非標準アミノ酸及び／若しくは非天然アミノ酸での置換を含む、置換である。加えて、例えばペグ化、低分子アジュバントの結合、及び／又は部位特異的なアルブミン化などの結果として、部位又はモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸をマスクする共有結合で連結された構造の付加によるアミノ酸改変を含む変異によって、フーリン切断部位及びフーリン切断モチーフを破壊することができる。
フーリン切断モチーフが、変異及び／又は非天然アミノ酸残基の存在によって破壊されている場合、ある特定の破壊されたフーリン切断モチーフは、いずれかのフーリン切断モチーフに関すると容易に認識できない可能性がある。しかしながら、志賀毒素Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端は、認識可能であると予想され、破壊されていなければそのフーリン切断モチーフがどこに配置されるかを定義すると予想される。例えば、破壊されたフーリン切断モチーフは、志賀毒素Ａサブユニット及び／又は志賀毒素Ａ１断片と比較して、カルボキシ末端の短縮化により、２０個未満のフーリン切断モチーフのアミノ酸残基を含んでいてもよい。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（１）カルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片由来のポリペプチド、及び（２）志賀毒素Ａ１断片のポリペプチド領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含み、志賀毒素エフェクターポリペプチド（及びそれを含むあらゆる細胞標的化分子）は、
例えばＡ１断片とＡ２断片との間にＡ１断片及び／又は保存されたフーリン切断モチーフのカルボキシ末端を含む野生型志賀毒素ポリペプチドなどの参照分子と比較して、より高いフーリン切断耐性を有する。例えば、参照分子と比較した１つの分子のフーリン切断の低減は、以下の実施例で説明される同じ条件を使用して遂行されたインビトロのフーリン切断アッセイを使用し、次いで切断の結果生じるあらゆる断片のバンド密度の定量を実行してフーリン切断の変化を定量的に測定することにより決定することができる。
ある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、インビトロ及び／又はインビボでのフーリン切断により高い耐性を有する。
一般的に、本発明の細胞標的化分子のプロテアーゼ切断感受性は、それを、志賀毒素Ａ１断片を含む野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドでそのフーリン切断耐性の志賀毒素エフェクターポリペプチドが置き換えられている同じ分子と比較することによって試験される。ある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフを含む本発明の分子は、そのカルボキシ末端においてペプチド又はポリペプチドに融合した野生型志賀毒素Ａ１断片を含む参照分子、例えば、以下の実施例２で説明される参照分子ＳＬＴ−１Ａ−ＷＴ：：ｓｃＦｖ−１などと比較して、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％又はそれより大きいインビトロにおけるフーリン切断の低減を示す。
数々のフーリン切断モチーフの破壊が説明されている。例えば、最小のＲ−ｘ−ｘ−Ｒモチーフ中で２つの保存されたアルギニンをアラニンに変異させることにより、フーリン及び／又はフーリン様プロテアーゼによるプロセシングが完全にブロックされた（例えばDuda A et al., JVirology 78：13865-70 (2004)を参照）。フーリン切断部位モチーフ
は理論上約２０アミノ酸残基で構成されることから、これらの２０個のアミノ酸残基位置のいずれか１つの１つ又は２つ以上に関与するある特定の変異が、フーリン切断を無効にするか又はフーリン切断効率を低減する可能性がある（例えばTian S et al., Sci Rep 2：261 (2012)を参照）。
ある特定の実施形態において、本発明の分子は、志賀毒素ファミリーのメンバーの少なくとも１つのＡサブユニット由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドを含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素Ａサブユニットの保存された高度に利用可能なプロテアーゼ切断感受性ループ由来の１つ又は２つ以上のアミノ酸における破壊を含む。例えば、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａにおいて、この高度に利用可能なプロテアーゼ感受性ループは、アミノ酸残基２４２〜２６１に天然に位置しており、ＳＬＴ−２Ａにおいて、この保存されたループは、アミノ酸残基２４１〜２６０に天然に位置する。ポリペプチド配列の相同性に基づいて、熟練した作業者は、他の志賀毒素Ａサブユニット中のこの保存された高度に利用可能なループ構造を同定することができる。このループにおけるアミノ酸残基へのある特定の変異は、ループ内のある特定のアミノ酸残基のタンパク質分解による切断に対する利用しやすさを低減することができ、これは、フーリン切断感受性を低減する可能性がある。
ある特定の実施形態において、本発明の分子は、志賀毒素Ａサブユニット間で保存された表面に露出したプロテアーゼ感受性ループにおいて変異を含む破壊されたフーリン切断モチーフを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の分子は、志賀毒素Ａサブユニットのこのプロテアーゼ感受性ループに変異を含む破壊されたフーリン切断モチーフを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含み、この変異は、フーリン切断感受性が低減するようにループ内のある特定のアミノ酸残基の表面における利用しやすさを低減する。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドの破壊されたフーリン切断モチーフは、例えば、最小のフーリン切断モチーフＲ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒの１位及び４位におけるアミノ酸残基などの、コンセンサスアミノ酸残基Ｐ１及びＰ４の一方又は両方の存在、位置、又は官能基に関する破壊を含む。例えば、最小のフーリンコンセンサス部位Ｒ−ｘ−ｘ−Ｒにおける２つのアルギニン残基の一方又は両方をアラニンに変異させることは、フーリン切断モチーフを破壊させて、その部位でのフーリン切断を防ぐと予想される。同様に、最小のフーリン切断モチーフＲ−ｘ−ｘ−Ｒにおけるアルギニン残基の一方又は両方のアミノ酸残基を熟練した作業者公知のいずれかの非保存的アミノ酸残基に置換することは、モチーフのフーリン切断感受性を低減させると予想される。特に、破壊されたフーリン切断モチーフにおいて、アルギニンから、例えばＡ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、及びＹなどの正電荷を欠失しているいずれかの非塩基性アミノ酸残基へのアミノ酸残基の置換が起こると予想される。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドの破壊されたフーリン切断モチーフは、コンセンサスアミノ酸残基Ｐ４からＰ１の間隔において、２以外の介在するアミノ酸残基の数に関する破壊を含み、それにより、Ｐ４及び／又はＰ１のいずれかが異なる位置に変化し、Ｐ４及び／又はＰ１の記号が除去される。例えば、最小のフーリン切断部位のフーリン切断モチーフ又はコアのフーリン切断モチーフ内の欠失は、フーリン切断モチーフのフーリン切断感受性を低減すると予想される。
ある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の置換を含む。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小のフーリン切断部位Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ中に１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の置換を含み、例えば、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドの場合、いずれかの正電荷を有さないアミノ酸残基で置換された天然に位置するアミノ酸残基Ｒ２４８及び／又はいずれかの正電荷を有さないアミノ酸残基で置換されたＲ２５１；並びにＳＬＴ−２Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドの場合、いずれかの正電荷を有さないアミノ酸残基で置換された天然に位置するアミノ酸残基Ｙ２４７及び／又はいずれかの正電荷を有さないアミノ酸残基で置換されたＲ２５０を含む。
ある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、破壊されていない最小のフーリン切断部位Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒを含むが、その代わりに破壊されたフランキング領域を含み、例えば、フーリン切断モチーフのフランキング領域中の１つ又は２つ以上のアミノ酸残基におけるアミノ酸残基の置換は、例えば、２４１〜２４７及び／又は２５２〜２５９に天然に位置する。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断モチーフのＰ１〜Ｐ６領域に配置されたアミノ酸残基の１つ又は２つ以上を置換すること；Ｐ１’を、例えばＲ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、及びＨなどの嵩高なアミノ酸に変異させること；及びＰ２’を、極性及び親水性アミノ酸残基に変異させること；及びフーリン切断モチーフのＰ１’〜Ｐ６’領域に配置されたアミノ酸残基の１つ又は２つ以上を、１つ又は２つ以上の嵩高な及び疎水性アミノ酸残基で置換することを含む。
ある特定の実施形態において、フーリン切断モチーフの破壊は、フーリン切断モチーフ内に少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、逆位、及び／又は変異を含む。ある特定の実施形態において、本発明のプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀様毒素１のＡサブユニット（配列番号１）若しくは志賀毒素のＡサブユニット（配列番号２）の２４９〜２５１、又は志賀様毒素２のＡサブユニット（配列番号３）の２４７〜２５０、又は保存された志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／若しくは非天
然の志賀毒素エフェクターポリペプチド配列において相当する位置に天然に位置するアミノ酸配列の破壊を含んでいてもよい。ある特定のさらなる実施形態において、プロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドは、フーリン切断モチーフ内に少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含む破壊を含む。ある特定のさらなる実施形態において、プロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドは、プロテアーゼ切断モチーフ領域内に少なくとも１つのアミノ酸の挿入を含む破壊を含む。ある特定のさらなる実施形態において、プロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドは、アミノ酸の逆位を含む破壊を含み、少なくとも１つの逆転したアミノ酸はプロテアーゼモチーフ領域内である。ある特定のさらなる実施形態において、プロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば非標準アミノ酸又は化学修飾された側鎖を有するアミノ酸へのアミノ酸置換などの変異を含む破壊を含む。単一のアミノ酸置換の例は、以下の実施例で提供される。
本発明の分子のある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断モチーフ内のカルボキシ末端のアミノ酸残基の９、１０、１１、又はそれより多くの欠失を含む。これらの実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断部位又は最小のフーリン切断モチーフを含まないと予想される。言い換えれば、ある特定の実施形態は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端においてフーリン切断部位を欠失している。
ある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較したアミノ酸残基の欠失及びアミノ酸残基の置換の両方を含む。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小のフーリン切断部位Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ中に１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の欠失及び置換を含み、例えば、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドの場合、いずれかの正電荷を有さないアミノ酸残基で置換された天然に位置するアミノ酸残基Ｒ２４８及び／又はいずれかの正電荷を有さないアミノ酸残基で置換されたＲ２５１；並びにＳＬＴ−２Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドの場合、いずれかの正電荷を有さないアミノ酸残基で置換された天然に位置するアミノ酸残基Ｙ２４７及び／又はいずれかの正電荷を有さないアミノ酸残基で置換されたＲ２５０を含む。
天然に位置するアミノ酸残基Ｒ２４８及び／又はいずれかの正電荷を有さないアミノ酸残基で置換されたＲ２５１；並びにＳＬＴ−２Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドの場合、いずれかの正電荷を有さないアミノ酸残基で置換された天然に位置するアミノ酸残基Ｙ２４７及び／又はいずれかの正電荷を有さないアミノ酸残基で置換されたＲ２５０を含む。
ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小のフーリン切断部位Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ中のアミノ酸置換と、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較したカルボキシ末端の短縮化との両方を含み、例えば、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドの場合、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、又はそれより大きい天然のアミノ酸位置で終わり、必要に応じていずれかの正電荷を有さないアミノ酸残基で置換された天然に位置するアミノ酸残基Ｒ２４８及び／又はＲ２５１を含む短縮化；及びＳＬＴ−２Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドの場合、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９
、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、又はそれより大きい天然のアミノ酸位置で終わり、必要に応じていずれかの正電荷を有さないアミノ酸残基で置換された天然に位置するアミノ酸残基Ｙ２４７及び／又はＲ２５０を含む短縮化を含む。
ある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、挿入されたアミノ残基がデノボのフーリン切断部位を作り出さない限り、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の挿入を含む。ある特定の実施形態において、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の挿入は、最小のフーリン切断部位Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ中のアルギニン残基間の天然の間隔を破壊し、例えば、２４９又は２５０に、したがってＲ２４８とＲ２５１との間に１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の挿入を含むＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａ由来のポリペプチド；又は２４８又は２４９に、したがってＹ２４７とＲ２５０との間に１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の挿入を含むＳＬＴ−２Ａ由来のポリペプチドである。
ある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、アミノ酸残基の挿入及びカルボキシ末端の短縮化の両方を含む。ある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、アミノ酸残基の挿入及びアミノ酸残基の置換の両方を含む。ある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、アミノ酸残基の挿入及びアミノ酸残基の欠失の両方を含む。
ある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、アミノ酸残基の欠失、アミノ酸残基の挿入、及びアミノ酸残基の置換を含む。
ある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、アミノ酸残基の欠失、挿入、置換、及びカルボキシ末端の短縮化を含む。
ある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドは、アミノ酸、ペプチド、及び／又はポリペプチドを含む分子部分にペプチド結合によって直接融合されており、融合した構造は、単一の連続的なポリペプチドを含む。これらの融合の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフに続くアミノ酸配列は、融合のジャンクションにおいてデノボのフーリン切断部位を作り出さないと予想される。
上記したプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチド部分領域及び／又は破壊されたフーリン切断モチーフのいずれも、単独で使用してもよいし、又は本発明の方法を含むそれぞれ個々の本発明の実施形態と組み合わせて使用してもよい。
Ｃ．Ｔ細胞で過免疫された志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、組み込まれた又は挿入されたエピトープ−ペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態において、エピトープ−ペプチドは、異種Ｔ細胞エピトープ−ペプチド、例えば志賀毒素Ａサブユニットにとって異種とみなされるエピトープである。ある特定のさらなる実施形態において、エピトープ−ペプチドは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである。ある特定のさらなる実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、１０−４モーラー以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とするＭＨＣクラスＩ分子への結合親和性を有するか、及び／又は
得られたＭＨＣクラスＩ−エピトープ−ペプチド複合体は、１０−４モーラー以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とするＴ細胞受容体（ＴＣＲ，T-cell receptor）への結合親和性を
有する。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープ、例えばヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープなどを含む。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドの由来となる天然に存在する志賀毒素ポリペプチド又は親の志賀毒素エフェクターポリペプチドにおいて同定可能な内因性エピトープ又はエピトープ領域（例えばＢ細胞エピトープ及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ）を破壊するように、異種Ｔ細胞エピトープが組み込まれるか又は挿入される。
本発明のある特定の実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチド（及びそれを含むあらゆる細胞標的化分子）は、例えば野生型志賀毒素ポリペプチドと比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞で過免疫されている。本発明のＣＤ８＋Ｔ細胞で過免疫された志賀毒素エフェクターポリペプチドはそれぞれ、組み込まれた又は挿入されたＴ細胞エピトープ−ペプチドを含む。過免疫された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、本明細書に記載される方法、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレットで説明される方法、及び／又は熟練した作業者公知の方法を使用して、天然に存在するか又はしないかにかかわらず、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は志賀毒素Ａサブユニットポリペプチドから作り出すことができ、結果得られた分子は、それでもなお１つ又は２つ以上の志賀毒素Ａサブユニット機能を保持する。
特許請求された発明の目的に関して、Ｔ細胞エピトープは、抗原性ペプチドで構成される分子構造であり、直鎖状のアミノ酸配列によって表示することができる。一般的に、Ｔ細胞エピトープは、８〜１１アミノ酸残基のサイズを有するペプチドである（Townsend A, Bodmer H, AnnuRev Immunol 7：601-24 (1989)）。しかしながら、ある特定のＴ細胞
エピトープ−ペプチドは、アミノ酸長さが８よりより小さいか又は１１より大きい長さを有する（例えばLivingstone A, Fathman C, AnnuRev Immunol 5：477-501 (1987)；GreenK et al., Eur J Immunol 34：2510-9 (2004)を参照）。ある特定の実施形態において、組み込まれた又は挿入されたエピトープは、少なくとも７アミノ酸残基の長さである。ある特定の実施形態において、組み込まれた又は挿入されたエピトープは、Stone J et al., Immunology 126：165-76 (2009)に記載の式を使用して計算した場合、１０ｍＭ未満
（例えば１〜１００μＭ）のＫＤを特徴とする結合親和性でＴＣＲと結合する。しかしながら、注目すべきことに、ＭＨＣ−エピトープとＴＣＲとの間の所与の範囲内の結合親和性は、例えばＭＨＣ−ペプチド−ＴＣＲ複合体安定性、ＭＨＣ−ペプチド密度、及びＣＤ８などのＴＣＲ補因子のＭＨＣ非依存性の機能のような要因による抗原性及び／又は免疫原性（例えばAl-Ramadi B et al., J Immunol 155：662-73(1995)を参照）と関係ない場合がある（Baker B et al., Immunity 13：475-84 (2000)；Hornell T et al., J Immunol170：4506-14 (2003)；Woolridge Let al., J Immunol 171：6650-60 (2003)）。
異種Ｔ細胞エピトープは、野生型志賀毒素Ａサブユニット；天然に存在する志賀毒素Ａサブユニット；及び／又は本明細書に記載される方法、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレットで説明される方法、及び／又は熟練した作業者公知の方法による改変のための源のポリペプチド（source polypeptide）として使用される親の志賀毒素エフェクターポリペプチド中にすでに存在しないエピトープである。
例えば、源のポリペプチド内に１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を作り出すプロセス、源のポリペプチドに１つ又は２つ以上のアミノ酸を融合させるプロセス、源のポリペプチドに１つ又は２つ以上のアミノ酸を挿入するプロセス、源のポリペプチドにペプチドを連
結するプロセス、及び／又は上述のプロセスの組合せを含む熟練した作業者公知の多数の方法を介して、異種Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを源のポリペプチドに取り込ませることができる。このような方法の結果は、１つ又は２つ以上の組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む源のポリペプチドの改変されたバリアントの生成である。
Ｔ細胞エピトープは、本発明で使用するための多数の源の分子（source molecules）から選択されてもよいし、又はそれらに由来していてもよい。Ｔ細胞エピトープは、様々な天然に存在するタンパク質から作り出されてもよいし、又はそれらに由来していてもよい。Ｔ細胞エピトープは、哺乳動物にとって外来の様々な天然に存在するタンパク質、例えば微生物のタンパク質などから作り出されてもよいし、又はそれらに由来していてもよい。Ｔ細胞エピトープは、変異したヒトタンパク質及び／又は悪性ヒト細胞によって異常に発現されるヒトタンパク質から作り出されてもよいし、又はそれらに由来していてもよい。Ｔ細胞エピトープは、合成的に作り出されてもよいし、又は合成分子に由来していてもよい（例えば、Carbone F et al., J Exp Med 167：1767-9(1988)；Del Val M et al., J Virol65：3641-6 (1991)；Appella E et al., Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1：177-84(1995)；Perez S et al., Cancer 116：2071-80 (2010)を参照）。
どのようなＴ細胞エピトープ−ペプチドも、本発明の異種Ｔ細胞エピトープとして使用されるものとして予期されるが、所望の特性に基づきある特定のエピトープを選択することができる。本発明の１つの目的は、脊椎動物に投与するためのＣＤ８＋Ｔ細胞で過免疫された志賀毒素エフェクターポリペプチドを作り出すことであり、これは、異種Ｔ細胞エピトープが高度に免疫原性であり、細胞表面上でＭＨＣクラスＩ分子と複合体化したことが提示されたときにインビボでロバストな免疫応答を惹起することができることを意味する。ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである１つ又は２つ以上の組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含む。本発明の、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ＣＤ８＋Ｔ細胞で過免疫された志賀毒素エフェクターポリペプチドとみなされる。
本発明のＴ細胞エピトープ成分は、脊椎動物の免疫応答を惹起できることがすでに公知の多数の源の分子から選択されてもよいし、又はそれらに由来していてもよい。Ｔ細胞エピトープは、脊椎動物にとって外来の様々な天然に存在するタンパク質、例えば病原微生物のタンパク質及び非自己がん抗原などに由来していてもよい。特定には、感染性微生物は、公知の抗原性及び／又は免疫原性特性を有する多数のタンパク質を含有し得る。さらに、感染性微生物は、公知の抗原性及び／若しくは免疫原性の部分領域又はエピトープを有する多数のタンパク質を含有し得る。
例えば、哺乳類宿主を伴う細胞内病原体のタンパク質は、Ｔ細胞エピトープの源である。よく研究された抗原性のタンパク質又はペプチドを有する、多数の細胞内病原体、例えばウイルス、細菌、真菌、及び単細胞真核生物などがある。Ｔ細胞エピトープは、ヒトウイルス又は他の細胞内病原体、例えばマイコバクテリウム属（mycobacterium）のような
細菌、トキソプラズマ属（toxoplasmae）のような真菌、及びトリパノソーマ属（trypanosomes）のような原生生物などから選択又は同定することができる。
例えば、ヒトに対する感染性があるウイルス由来のウイルスタンパク質の多くの免疫原性ウイルスペプチド成分がある。多数のヒトＴ細胞エピトープが、Ａ型インフルエンザウイルス由来のタンパク質中のペプチド、例えばタンパク質ＨＡ糖タンパク質ＦＥ１７、Ｓ１３９／１、ＣＨ６５、Ｃ０５、ヘマグルチン１（ＨＡ１）、血球凝着素２（ＨＡ２）、非構造タンパク質１及び２（ＮＳ１及びＮＳ２）、マトリックスタンパク質１及び２（Ｍ
１及びＭ２）、核タンパク質（ＮＰ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ））中のペプチドなどにマッピングされており、これらのペプチドの多くが、例えばエクスビボのアッセイを使用することによって、ヒト免疫応答を惹起することが示されている。同様に、多数のヒトＴ細胞エピトープが、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来のタンパク質のペプチド成分、例えばタンパク質ｐｐ６５（ＵＬ８３）、ＵＬ１２８〜１３１、前初期１（ＩＥ−１；ＵＬ１２３）、糖タンパク質Ｂ、外被タンパク質中のペプチドなどにマッピングされており、これらのペプチドの多くが、例えばエクスビボのアッセイを使用することによって、ヒト免疫応答を惹起することが示されている。
別の例として、ヒトにおける多くの免疫原性がん抗原がある。がんのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ及び／又は腫瘍細胞抗原は、熟練した作業者により、例えば差次的なゲノミクス、差次的なプロテオミクス、イムノプロテオミクス、予測とそれに次ぐ検証、及び逆の遺伝学的トランスフェクションのような遺伝学的アプローチなどの当業界において公知の技術を使用して同定することができる（例えば、Admon A et al.,Mol Cell Proteomics 2
：388-98 (2003)；Purcell A,Gorman J, Mol Cell Proteomics 3：193-208 (2004)；Comber J, Philip R, Ther Adv Vaccines 2：77-89 (2014)を参照）。ヒトがん及び／又は腫瘍細胞において生じることがすでに同定又は予測された多くの抗原性及び／又は免疫原性のＴ細胞エピトープがある。例えば、Ｔ細胞エピトープは、一般的に変異されるか又は新生細胞中で過剰発現されるヒトタンパク質、例えばＡＬＫ、ＣＥＡ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＧｎＴ−Ｖ）、ＨＣＡ５８７、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ−１、ｐ５３、及びＴＲＡＧ−３などにおいて予測されている（van der Bruggen P et al., Science 254：1643-7 (1991)；Kawakami
Y et al., J Exp Med 180：347-52 (1994)；Fisk B et al., J Exp Med 181：2109-17 (1995)；Guilloux Y et al.,J Exp Med 183：1173 (1996)；SkipperJ et al., J Exp Med 183：527 (1996)；Brossart P et al.,93：4309-17 (1999)；Kawashima Iet al., Cancer Res 59：431-5 (1999)；Papadopoulos K et al., Clin Cancer Res 5：2089-93(1999)；Zhu B et al., Clin Cancer Res 9：1850-7 (2003)；Li B et al., Clin Exp Immunol140：310-9 (2005)；Ait-Tahar K et al., Int J Cancer 118：688-95 (2006)；Akiyama Y et al., CancerImmunol Immunother 61：2311-9(2012)を参照）。加えて、ヒトがん細胞由来のＴ細胞エピトープの合成バリアントが作り出されている（例えば、Lazoura E, Apostolopoulos V, Curr Med Chem12：629-39 (2005)；Douat-Casassus C et al., J
Med Chem 50：1598-609 (2007)を参照）。
本発明のポリペプチド及び分子にあらゆるＴ細胞エピトープを使用することができるが、ある特定のＴ細胞エピトープが、それらの公知の及び／又は実験的に決定された特徴に基づいて好ましい場合がある。例えば、多くの種において、そのゲノム中のＭＨＣ対立遺伝子は、複数のＭＨＣ−Ｉ分子バリアントをコードする。ＭＨＣクラスＩタンパク質多型は、ＣＤ８＋Ｔ細胞による抗原−ＭＨＣクラスＩ複合体の認識に影響を与える可能性があることから、ある特定のＭＨＣクラスＩ多型、及び／又は異なる遺伝子型を有するＴ細胞によって認識される、ある特定の抗原−ＭＨＣクラスＩ複合体の能力に関する知見に基づき、Ｔ細胞エピトープを本発明で使用するために選択することができる。
免疫原性ＭＨＣクラスＩにより制限される及び／又は特異的なヒト白血球抗原（ＨＬＡ，humanleukocyte antigen）バリアントと適合することが公知の明確に定義されたペプ
チド−エピトープがある。ヒトにおける適用又はヒト標的細胞の関与のために、熟練した作業者により、当業界において公知の標準的な技術を使用して、ＨＬＡクラスＩ制限エピトープを選択又は同定することができる。ペプチドのヒトＭＨＣクラスＩ分子に結合する能力は、推定上のＴ細胞エピトープの免疫原性を予測するのに使用することができる。ペプチドのヒトＭＨＣクラスＩ分子に結合する能力は、ソフトウェアツールを使用してスコア付けすることができる。ある特定のヒト集団においてより優勢な対立遺伝子によってコ
ードされたＨＬＡバリアントのペプチド選択性に基づいて、Ｔ細胞エピトープは、本発明の異種のＴ細胞エピトープ成分として使用するために選択されてもよい。例えば、個体ごとにＨＬＡ遺伝子の対立遺伝子が多様であることから、ヒト集団はＭＨＣクラスＩ分子のアルファ鎖に関して多形性である。ある特定のＴ細胞エピトープは、特異的なＨＬＡ分子、例えばＨＬＡ−Ａ対立遺伝子グループのＨＬＡ−Ａ２及びＨＬＡ−Ａ３によってコードされた一般的に存在するＨＬＡバリアントなどによってより効率的に提示される可能性がある。
本発明の異種Ｔ細胞エピトープ成分として使用するためにＴ細胞エピトープを選択する場合、例えば標的細胞中の以下の因子：プロテアソーム、ＥＲＡＡＰ／ＥＲＡＰ１、タパシン、及びＴＡＰの存在及びエピトープ特異性など、エピトープの生成及び受け入れ可能なＭＨＣクラスＩ分子への輸送に影響を与える可能性がある複数の要因が考慮される場合がある。
本発明の異種Ｔ細胞エピトープ成分として使用するためにＴ細胞エピトープを選ぶ場合、標的化しようとする細胞型又は細胞集団中に存在するＭＨＣクラスＩ分子に最もよく適合するエピトープが選択され得る。異なるＭＨＣクラスＩ分子は、特定のペプチド配列への優先的な結合を示し、特定のペプチド−ＭＨＣクラスＩバリアント複合体は、エフェクターＴ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって特異的に認識される。熟練した作業者は、本発明で使用される異種Ｔ細胞エピトープの選択を最適化するために、ＭＨＣクラスＩ分子の特異性及びＴＣＲ特異性に関する知見を使用することができる。
加えて、ＭＨＣクラスＩ提示のための複数の免疫原性Ｔ細胞エピトープは、例えば複数のＴ細胞エピトープを同時に標的化送達で使用するために、同じ本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドに組み込まれていてもよい。本発明の、複数のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む細胞標的化分子の例は、配列番号２６である。
本明細書に記載されるプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチド部分領域及び／又は破壊されたフーリン切断モチーフのいずれも、単独で使用してもよいし、又は本発明の方法を含むそれぞれ個々の本発明の実施形態と組み合わせて使用してもよい。
II．本発明の細胞標的化分子の一般的な構造
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、新規の細胞標的化分子を改変するためのロバストで強い足場を提供する。細胞標的化結合領域と本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドとの会合は、例えば脱免疫化、強力な細胞毒性、効率的な細胞内経路決定、Ｔ細胞の過免疫化、分子の安定性、及び高い投薬量でのインビボ忍容性などの所望の特徴を有する治療用及び診断用分子の改変を可能にする。
本発明は、（１）細胞標的化結合領域及び（２）本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドをそれぞれ含む様々な細胞標的化分子を提供する。本発明の細胞標的化分子を作り出すために、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、様々な多様な細胞標的化成分（例えば分子部分及び／又は薬剤）と会合及び／又は結合していてもよい。本発明の細胞標的化分子は、（１）標的生体分子の細胞外部分に特異的に結合することができる結合領域、及び（２）本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む志賀毒素エフェクターポリペプチド領域を含む。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、標的生体分子の細胞外部分、例えば細胞の細胞表面に物理的に結合している標的生体分子などへの結合特異性を介した細胞標的化を媒介する１つ又は２つ以上の細胞標的化結合領域に連結されていてもよい。本発明の細胞標的化分子の１つの非限定的な例は、タンパク質性の細胞標的化結合領域、例えば免
疫グロブリン型の結合領域などに融合した本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドである。
Ａ．結合領域
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子の結合領域は、標的生体分子の細胞外部分（例えば細胞外標的生体分子）に高親和性で特異的に結合することができる、ドメイン、分子部分、又は薬剤などの細胞標的化成分である。熟練した作業者に公知の、又は熟練した作業者により当業界において公知の技術を使用して発見され得る多数のタイプの結合領域がある。例えば、本明細書に記載される必要な結合特徴を示すあらゆる細胞標的化成分が、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態における結合領域として使用することができる。
標的生体分子の細胞外部分は、分子が細胞と物理的に結合している場合、例えば標的生体分子が細胞によって細胞表面に発現されている場合に細胞外環境に露出したその構造の一部を指す。この状況において、細胞外環境に露出したとは、標的生体分子の一部が、例えば、抗体又は抗体より小さい少なくとも結合部分、例えば単一ドメイン抗体ドメイン、ナノボディ、ラクダ科動物又は軟骨魚類由来の重鎖抗体ドメイン、一本鎖可変断片、又は多数の免疫グロブリンへの改変された代替足場などによって利用可能であることを意味する（以下を参照）。細胞に物理的に結合している標的生体分子の一部の細胞外環境への露出又はその利用しやすさは、熟練した作業者により、当業界において周知の方法を使用して実験的に決定することができる。
本発明の細胞標的化分子の結合領域は、例えばリガンド、ペプチド、免疫グロブリン型の結合領域、モノクローナル抗体、改変された抗体派生物、又は抗体の改変された代替物であり得る。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子の結合領域は、標的生体分子の細胞外部分に高親和性で特異的に結合することができるタンパク質性の部分である。本発明の細胞標的化分子の結合領域は、１つ又は２つ以上の様々なペプチド性部分又はポリペプチド部分、例えば無作為に生成したペプチド配列、天然に存在するリガンド又はそれらの派生物、免疫グロブリン由来のドメイン、免疫グロブリンドメインの代替物として合成的に改変された足場などを含んでいてもよい（例えば、国際公開第２００５／０９２９１７号パンフレット；国際公開第２００７／０３３４９７号パンフレット；Cheung M et al., Mol Cancer 9：28 (2010)；米国特許出願公開第２０１３／０１９６９２８号；国際公開第２０１４／１６４６９３号パンフレット；国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット；国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット；国際公開第２０１５／１３８４５２号パンフレット；国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞外標的生体分子を選択的及び特異的に結合することができる１つ又は２つ以上のポリペプチドを含む結合領域を含む。
特異的な細胞型に、それらの結合特徴、例えばある特定のリガンド、モノクローナル抗体、改変された抗体派生物、及び改変された抗体代替物などを介して分子を標的化するのに有用な、当業界において公知の多数の結合領域がある。
１つの特異的な、ただし非限定的な態様によれば、本発明の細胞標的化分子の結合領域は、細胞外標的生体分子、一般的には細胞表面受容体への結合機能を保持する天然に存在するリガンド又はそれらの派生物を含む。例えば、当業界において公知の様々なサイトカイン、増殖因子、及びホルモンを使用して、同起源のサイトカイン受容体、増殖因子受容体、又はホルモン受容体を発現する特異的な細胞型の細胞表面に、本発明の細胞標的化分子を標的化することができる。リガンドのある特定の非限定的な例（括弧内に代替の名称を示す）としては、アンギオゲニン（angiogenin）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ，B-cell activatingfactor，ＡＰＲＩＬ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ，colony stimulating factor）、上皮増殖因子（ＥＧＦ，epidermal growth factor）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ，fibroblastgrowth factor）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ，vascular endothelialgrowth factor）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ，insulin-like growthfactor）、インターフェロン、インターロイキン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−６、及びＩＬ−２３）、神経増殖因子（ＮＧＦ，nerve growth factor）、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ，transforming growth factor）、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ，tumornecrosis factor）が挙げられる。
本発明の細胞標的化分子のある特定の他の実施形態によれば、結合領域は、細胞外標的生体分子と結合することができる合成リガンドを含む（例えばLiang S et al., J Mol Med 84：764-73 (2006)；Ahmed S et al., Anal Chem 82：7533-41 (2010)；Kaur K et al., Methods Mol Biol 1248：239-47(2015)を参照）。
ある特定の実施形態において、結合領域は、ペプチドミメティクス、例えばＡＡペプチド、ガンマ−ＡＡペプチド、及び／又はスルホノ−γ−ＡＡペプチドなどを含む（例えば、Pilsl L、Reiser O、Amino Acids 41：709-18 (2011)；Akram O et al., Mol Cancer Res 12：967-78 (2014)；Wu H et al., Chemistry 21：2501-7 (2015)；Teng P et al., Chemistry 2016 Mar 4を参照）。
１つの具体的な、ただし非限定的な態様によれば、結合領域は、免疫グロブリン型の結合領域を含んでいてもよい。用語「免疫グロブリン型の結合領域」は、本明細書で使用される場合、例えば抗原又はエピトープなどの１つ又は２つ以上の標的生体分子と結合することが可能なポリペプチド領域を指す。結合領域は、標的分子に結合するそれらの能力によって機能的に定義される場合がある。免疫グロブリン型の結合領域は、一般的に抗体又は抗体様構造に由来するが、他の源由来の代替足場もこれらの用語の範囲内であると予期される。
免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質は、Ｉｇドメインとして公知の構造ドメインを有する。Ｉｇドメインは、長さが約７０〜１１０アミノ酸残基の範囲であり、２つのベータシートに典型的に７〜９個の逆平行ベータ鎖が配列されてサンドイッチ様構造を形成する特徴的なＩｇ−フォールドを有する。Ｉｇフォールドは、サンドイッチの内部表面と鎖中のシステイン残基間の高度に保存されたジスルフィド結合とにおける疎水性アミノ酸相互作用によって安定化されている。Ｉｇドメインは、可変（ＩｇＶ又はＶ−セット）、定常（ＩｇＣ又はＣ−セット）又は中間（ＩｇＩ又はＩ−セット）であり得る。いくつかのＩｇドメインは、それらのエピトープに結合する抗体の特異性にとって重要な、「相補性決定領域（complementary determining region）」とも称される相補性決定領域（ＣＤＲ，complementarity determining region）と会合していてもよい。Ｉｇ様ドメインはまた、非免疫グロブリンタンパク質にも見出され、それに基づきタンパク質のＩｇスーパーファミリーのメンバーとして分類される。ＨＵＧＯ遺伝子命名法委員会（ＨＧＮＣ，HUGO Gene Nomenclature Committee）は、Ｉｇ様ドメインを含有するファミリーのメンバーのリストを提供している。
免疫グロブリン型の結合領域は、抗体又はそれらの抗原結合断片のポリペプチド配列であってもよく、そのアミノ酸配列は、例えば分子工学又はライブラリースクリーニングによる選択によって天然の抗体又は非免疫グロブリンタンパク質のＩｇ様ドメインのアミノ酸配列から変更されている。免疫グロブリン型の結合領域の生成における組換えＤＮＡ技術及びインビトロのライブラリースクリーニングの適切性のために、抗体を再設計して、
例えばより小さいサイズ、細胞の侵入、又はインビボの用途及び／若しくは治療用途に関する他の改善などの所望の特徴を得ることができる。多くの可能なバリエーションがあり、たった１つのアミノ酸の変化から例えば可変領域の完全なデザイン変化まで多岐にわたっていてもよい。典型的には、抗原結合特徴を改善する、可変領域の安定性を改善する、又は免疫原性応答の可能性を低減するためには、可変領域における変化がなされると予想される。
本発明の成分として予期される多数の免疫グロブリン型の結合領域がある。ある特定の実施形態において、免疫グロブリン型の結合領域は、免疫グロブリンの結合領域、例えば細胞外標的生体分子と結合することが可能な抗体パラトープなどに由来する。ある特定の他の実施形態において、免疫グロブリン型の結合領域は、いずれの免疫グロブリンドメインにも由来しないが、細胞外標的生体分子への高親和性結合を提供することによって免疫グロブリンの結合領域のように機能する改変されたポリペプチドを含む。この改変されたポリペプチドは、本明細書に記載される免疫グロブリン由来の相補性決定領域を含むか又はそれから本質的になるポリペプチド足場を含む場合がある。
また、ポリペプチドをそれらの高親和性結合特徴を介して特異的な細胞型に標的化するのに有用な、従来技術における多数の結合領域もある。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子の結合領域は、自律的なＶＨドメイン、単一ドメイン抗体ドメイン（ｓｄＡｂ）、ラクダ科動物由来の重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ断片又はＶＨドメイン断片）、ラクダ科動物ＶＨＨ断片又はＶＨドメイン断片由来の重鎖抗体ドメイン、軟骨魚類由来の重鎖抗体ドメイン、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、ＶＮＡＲ断片、一本鎖可変（ｓｃＦｖ）断片、ナノボディ、重鎖及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、一本鎖Ｆｖ−ＣＨ３ミニボディ、二量体ＣＨ２ドメイン断片（ＣＨ２Ｄ）、Ｆｃ抗原結合ドメイン（Ｆｃａｂ）、単離された相補性決定領域３（ＣＤＲ３）断片、拘束フレームワーク領域３、ＣＤＲ３、フレームワーク領域４（ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）ポリペプチド、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ，small modular immunopharmaceutical）ドメイン、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体、多量体ｓｃＦｖ断片（二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体）、ジスルフィド安定化抗体の可変（Ｆｖ）断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるジスルフィド安定化抗原結合（Ｆａｂ）断片、２価ナノボディ、２価ミニボディ、２価Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｆａｂ二量体）、二重特異性タンデムＶＨＨ断片、二重特異性タンデムｓｃＦｖ断片、二重特異性のナノボディ、二重特異性のミニボディ、並びにそのパラトープ及び結合機能を保持する前述のもののあらゆる遺伝子操作された対応物を含む群から選択される（Ward E et al., Nature 341：544-6 (1989)；Davies J,
Riechmann L, Biotechnology (NY) 13：475-9 (1995)；Reiter Y et al., Mol Biol 290：685-98 (1999)；Riechmann L, Muyldermans S, J Immunol Methods 231：25-38 (1999)；Tanha J et al., J ImmunolMethods 263：97-109 (2002)；Vranken W et al., Biochemistry 41：8570-9 (2002)；Jespers L et al., J Mol Biol 337：893-903 (2004)；Jespers L et al.,Nat Biotechnol 22：1161-5(2004)；To R et al., J Biol Chem 280：41395-403 (2005)；Saerens D et al., Curr OpinPharmacol 8：600-8 (2008)；Dimitrov D, MAbs 1：26-8 (2009)；Weiner L, Cell 148：1081-4 (2012)；Ahmad Z et al., Clin DevImmunol 2012：980250 (2012)を参照）。
免疫グロブリンの定常領域由来のポリペプチド、例えば、改変された二量体Ｆｃドメイン、単量体Ｆｃ（ｍＦｃ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ＶＨＨ−Ｆｃ、ＣＨ２ドメイン、単量体ＣＨ３ｓドメイン（ｍＣＨ３）、合成的にリプログラミングされた免疫グロブリンドメイン、及び／又は免疫グロブリンドメインとリガンドとのハイブリッド融合体などを含む様々な結合領域がある（Hofer T et al., Proc Natl Acad Sci U. S.A. 105：12451-6 (2008)；Xiao J etal., J Am Chem Soc 131：13616-13618 (2009)；Xiao X et al., Biochem BiophysRes Commun 387：387-92 (2009)；Wozniak-Knopp G et al., Protein Eng Des S
el 23 289-97 (2010)；Gong R et al., PLoSONE 7：e42288 (2012)；Wozniak-Knopp G et al., PLoS ONE 7：e30083 (2012)；Ying T et al., J Biol Chem 287：19399-408 (2012)；Ying T et al., J Biol Chem288：25154-64 (2013)；Chiang M etal., J Am Chem Soc 136：3370-3 (2014)；Rader C, Trends Biotechnol 32：186-97 (2014)；Ying T et al., Biochimica Biophys Acta 1844：1977-82 (2014)）。
ある特定の他の実施形態によれば、結合領域は、免疫グロブリンドメインへの改変された代替足場を含む。例えば標的生体分子の高親和性の及び特異的な結合などの免疫グロブリン由来の構造に対して類似の機能的な特徴を示す改変された代替足場が当業界において公知であり、ある特定の免疫グロブリンドメインに、例えばより大きい安定性又は低減した免疫原性などの改善された特徴を提供することができる。一般的に、免疫グロブリンへの代替足場は、２０キロダルトン未満であり、単一のポリペプチド鎖からなり、システイン残基を欠失しており、相対的に高い熱力学的な安定性を示す。
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態に関して、結合領域は、自律的なＶＨドメイン、単一ドメイン抗体ドメイン（ｓｄＡｂ）、ラクダ科動物由来の重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ断片又はＶＨドメイン断片）、ラクダ科動物ＶＨＨ断片又はＶＨドメイン断片由来の重鎖抗体ドメイン、軟骨魚類由来の重鎖抗体ドメイン、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、ＶＮＡＲ断片、一本鎖可変（ｓｃＦｖ）断片、ナノボディ、重鎖及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、並べ替えられたＦｖ（ｐＦｖ）、一本鎖Ｆｖ−ＣＨ３ミニボディ、二量体ＣＨ２ドメイン断片（ＣＨ２Ｄ）、Ｆｃ抗原結合ドメイン（Ｆｃａｂ）、単離された相補性決定領域３（ＣＤＲ３）断片、拘束フレームワーク領域３、ＣＤＲ３、フレームワーク領域４（ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）ポリペプチド、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）ドメイン、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体、多量体ｓｃＦｖ断片（二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体）、ジスルフィド安定化抗体の可変（Ｆｖ）断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるジスルフィド安定化抗原結合（Ｆａｂ）断片、２価ナノボディ、２価ミニボディ、２価Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｆａｂ二量体）、二重特異性タンデムＶＨＨ断片、二重特異性タンデムｓｃＦｖ断片、二重特異性のナノボディ、二重特異性のミニボディ、並びにその結合機能性を保持する前述のもののあらゆる遺伝子操作された対応物を含む群から選択される代替足場を含む（Worn A, Pluckthun A, J
Mol Biol 305：989-1010 (2001)；XuL et al., Chem Biol 9：933-42 (2002)；Wikman M et al.,Protein Eng Des Sel 17：455-62 (2004)；Binz H et al., Nat Biotechnol 23：1257-68 (2005)；Hey T et al., Trends Biotechnol 23 ：514-522 (2005)；Holliger
P, Hudson P, Nat Biotechnol 23：1126-36 (2005)；Gill D, DamleN, Curr Opin Biotech 17：653-8 (2006)；Koide A, Koide S, Methods MolBiol 352：95-109 (2007)；Byla P et al., J Biol Chem 285：12096 (2010)；Zoller F et al., Molecules 16：2467-85 (2011)；Alfarano P et al., Protein Sci 21：1298-314 (2012)；Madhurantakam C et
al., Protein Sci 21：1015-28 (2012)；Varadamsetty G etal., J Mol Biol 424：68-87 (2012)；Reichen C et al.,J Struct Biol 185：147-62 (2014)）。
例えば、細胞外受容体ＨＥＲ２に結合する多数の代替足場が同定されている（例えば、Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17：455-62 (2004)；Orlova A et al. Cancer Res 66：4339-8 (2006)；Ahlgren S et al., Bioconjug Chem 19：235-43 (2008)；Feldwisch J etal., J Mol Biol 398：232-47 (2010)；米国特許第５，５７８，４８２号明細
書；５，８５６，１１０号明細書；５，８６９，４４５号明細書；５，９８５，５５３号明細書；６，３３３，１６９号明細書；６，９８７，０８８号明細書；７，０１９，０１７号明細書；７，２８２，３６５号明細書；７，３０６，８０１号明細書；７，４３５，７９７号明細書；７，４４６，１８５号明細書；７，４４９，４８０号明細書；７，５６０，１１１号明細書；７，６７４，４６０号明細書；７，８１５，９０６号明細書；７，８７９，３２５号明細書；７，８８４，１９４号明細書；７，９９３，６５０号明細書；
８，２４１，６３０号明細書；８，３４９，５８５号明細書；８，３８９，２２７号明細書；８，５０１，９０９号明細書；８，５１２，９６７号明細書；８，６５２，４７４号明細書；及び米国特許出願公開第２０１１／００５９０９０号明細書を参照）。代替の抗体様式に加えて、抗体様の結合能力は、非タンパク質性化合物、例えばオリゴマー、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、炭水化物、及びグリコカリックスカリックスアレーン（例えばSansone F, Casnati A, Chem Soc Rev 42：4623-39 (2013)を参照）又は部分的にタンパク質
性の化合物、例えばペプチドと結合したフェノール−ホルムアルデヒド環状オリゴマー及びカリックスアレーン−ペプチド組成物など（例えば米国特許第５，７７０，３８０号明細書を参照）によって付与することができる。
上記した結合領域構造はいずれも、結合領域成分が細胞外標的生体分子に対して１０−５〜１０−１２モル／リットル、好ましくは２００ナノモーラー（ｎＭ）未満の解離定数を有する限り、本発明の分子の成分として使用してもよい。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、標的生体分子の細胞外部分又は細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域に連結及び／又は融合した、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。細胞外標的生体分子は、例えば本明細書に記載される基準などの多数の基準に基づき選択してもよい。
Ｂ．結合領域によって結合した細胞外標的生体分子
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子の結合領域は、標的生体分子の細胞外部分又は細胞外標的生体分子に特異的に結合することができ、好ましくは所望の細胞型、例えばがん細胞、腫瘍細胞、形質細胞、感染細胞、又は細胞内病原体を内包する宿主細胞などの表面と物理的に結合しているタンパク質領域を含む。本発明の細胞標的化分子の結合領域によって結合した標的生体分子としては、がん細胞、免疫細胞、及び／又は例えばウイルス、細菌、真菌、プリオン、若しくは原生動物などの細胞内病原体に感染した細胞に過剰な比率で又は独占的に存在するバイオマーカーを挙げることができる。
用語「標的生体分子」は、本発明の細胞標的化分子の結合領域と結合して、その結果として特異的な細胞、細胞型、及び／又は多細胞生物内の位置への細胞標的化分子の標的化が生じる生体分子、一般的には、例えば糖付加などの翻訳後修飾によって改変されたタンパク質性分子又はタンパク質を指す。
本発明の目的に関して、用語「細胞外」は、標的生体分子に関して、その構造の少なくとも一部が細胞外環境に露出した生体分子を指す。細胞外環境への露出又は標的生体分子の細胞に結合した部分への利用しやすさは、熟練した作業者により当業界において周知の方法を使用して実験的に決定することができる。細胞外標的生体分子の非限定的な例としては、細胞膜成分、膜貫通タンパク質、細胞膜に固定された生体分子、細胞表面に結合した生体分子、及び分泌された生体分子が挙げられる。
本発明に関して、成句「物理的に結合している」は、標的生体分子を説明するのに使用される場合、共有結合及び／又は非共有結合による分子間相互作用により標的生体分子又はそれらの一部を細胞の外側に結合させることを意味し、例えば、単一の相互作用それぞれのエネルギーが概して少なくとも約１〜５キロカロリーの、標的生体分子と細胞との間の複数の非共有結合による相互作用（例えば、静電結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性力など）である。全ての内在性膜タンパク質が、細胞膜に物理的に結合していることを見出すことができ、表在性膜タンパク質も同様である。例えば、細胞外標的生体分子は、膜貫通領域、脂質アンカー、グリコリピドアンカーを含む場合もあるし、及び／又は前述のもののいずれか１つを含む因子と非共有結合によって（例えば非特異的な疎水性相互作用及び／又は脂質結合相互作用を介して）会合している場合
もある。
標的生体分子の細胞外部分としては、改変されていないポリペプチド、生化学的な官能基及びグリコリピドの付加によって改変されたポリペプチドを含む、様々なエピトープを挙げることができる（例えば米国特許第５，０９１，１７８号明細書；欧州特許第２４３１７４３号明細書を参照）。
本発明の細胞標的化分子の結合領域は、例えばそれらの標的生体分子の細胞型特異的な発現、それらの標的生体分子の特異的な細胞型に関する物理的な局在化、及び／又はそれらの標的生体分子の特性などの多数の基準に基づき設計又は選択することができる。例えば、本発明のある特定の細胞標的化分子は、１つの種の１つのみの細胞型又は多細胞生物中の１つのみの細胞型によって細胞表面で独占的に発現される細胞表面の標的生体分子と結合することが可能な結合領域を含む。細胞外標的生体分子は、本質的に内在化されているか又は本発明の細胞標的化分子と相互作用したときに容易に内在化されることが望ましいが、必須ではない。
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態のなかでも、結合領域は、がん又は腫瘍細胞の細胞表面上における表面抗原への特異的な高親和性の結合に関して選択される免疫グロブリン型ポリペプチドに由来し、この場合、抗原は、がん又は腫瘍細胞への発現に制限される（Glokler J et al.,Molecules 15：2478-90 (2010)；LiuY et al., Lab Chip
9：1033-6 (2009)を参照）。他の実施形態によれば、結合領域は、がん細胞の細胞表面
上における表面抗原への特異的な高親和性の結合に関して選択され、この場合、抗原は、非がん細胞と比較して、がん細胞によって過剰発現されるか又は優先的に発現される。いくつかの代表的な標的生体分子としては、これらに限定されないが、以下に列挙した、がん及び／又は特異的な免疫細胞型に関連する標的が挙げられる。
がん細胞に関連する細胞外エピトープに高親和性で結合する多くの免疫グロブリン型の結合領域が熟練した作業者に公知であり、例えば、以下の標的生体分子：アネキシンＡＩ、Ｂ３黒色腫抗原、Ｂ４黒色腫抗原、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０（Ｂリンパ球抗原タンパク質ＣＤ２０）、ＣＤ２２、ＣＤ２５（インターロイキン−２受容体ＩＬ２Ｒ）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３７、ＣＤ３８（環状ＡＤＰリボースヒドロラーゼ）、ＣＤ４０、ＣＤ４４（ヒアルロナン受容体）、ＩＴＧＡＶ（ＣＤ５１）、ＣＤ５６、ＣＤ６６、ＣＤ７０、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）、ＣＤ７３、ＣＤ７４（ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連の不変鎖）、ＣＤ７９、ＣＤ９８、エンドグリン（ＥＮＤ、ＣＤ１０５）、ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）、ＣＤ１３８、ケモカイン受容体タイプ４（ＣＤＣＲ−４、フーシン、ＣＤ１８４）、ＣＤ２００、インスリン様増殖因子１受容体（ＣＤ２２１）、ムチン１（ＭＵＣ１、ＣＤ２２７、ＣＡ６、ＣａｎＡｇ）、基底細胞接着分子（Ｂ−ＣＡＭ、ＣＤ２３９）、ＣＤ２４８（エンドシアリン、ＴＥＭ１）、腫瘍壊死因子受容体１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＣＤ２６２）、腫瘍壊死因子受容体１３Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＡＣＩ、ＣＤ２７６）、血管内皮増殖因子受容体２（ＫＤＲ、ＣＤ３０９）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３２６）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２、Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ２、ＣＤ３４０）、がん抗原１５−３（ＣＡ１５−３）、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６）、ＣＡ２４２、癌胎児性抗原関連細胞接着分子（例えばＣＥＡＣＡＭ３（ＣＤ６６ｄ）及びＣＥＡＣＡＭ５）、癌胎児性抗原タンパク質（ＣＥＡ）、コリン輸送体様タンパク質４（ＳＬＣ４４Ａ４）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰ４、ＭＣＳＰ、ＮＧ２）、ＣＴＬＡ４、デルタ様タンパク質（例えばＤＬＬ３、ＤＬＬ４）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼタンパク質（例えばＥＮＰＰ３）、エンドセリン受容体（ＥＴＢＲ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１）、葉酸受容体（ＦＯＬＲ、例えばＦＲα）、Ｇ−２８、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、Ｈ
ＬＡ−Ｄｒ１０、ＨＬＡ−ＤＲＢ、ヒト上皮増殖因子受容体１（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ−３、エフリンタイプＢ受容体２（ＥｐｈＢ２）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ／セプラーゼ）、グアニリルシクラーゼｃ（ＧＣＣ）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、インターロイキン２受容体（ＩＬ−２Ｒ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ−６Ｒ）、インテグリンアルファ−Ｖベータ−３（αＶβ３）、インテグリンアルファ−Ｖベータ−５（αｖβ５）、インテグリンアルファ−５ベータ−１（α５β１）、Ｌ６、亜鉛輸送体（ＬＩＶ−１）、ＭＰＧ、黒色腫関連抗原１タンパク質（ＭＡＧＥ−１）、黒色腫関連抗原３（ＭＡＧＥ−３）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、メタロレダクターゼＳＴＥＡＰ１、ＭＰＧ、ＭＳ４Ａ、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン（例えばネクチン−４）、ｐ２１、ｐ９７、ポリオウイルス受容体様４（ＰＶＲＬ４）、プロテアーゼ活性化受容体（例えばＰＡＲ１）、前立腺特異的膜抗原タンパク質（ＰＳＭＡ）、ＳＬＩＴ及びＮＴＲＫ様タンパク質（例えばＳＬＩＴＲＫ６）、トーマス−フリーデンライヒ（Thomas-Friedenreich）抗原、膜貫通糖タンパク質（ＧＰＮＭ
Ｂ）、栄養膜糖タンパク質（ＴＰＧＢ、５Ｔ４、ＷＡＩＦ１）、及び腫瘍関連のカルシウムシグナルトランスデューサー（ＴＡＣＳＴＤ、例えばＴｒｏｐ−２、ＥＧＰ−１など）のいずれか１つと結合する結合領域などがある（例えばLui B et al., Cancer Res 64：704-10 (2004)；Novellino L et al., Cancer Immunol Immunother54：187-207 (2005)；Bagley R etal., Int J Oncol 34：619-27 (2009)；Gerber H et al., mAbs 1：247-53 (2009)；Beck A et al., Nat Rev Immunol10：345-52 (2010)；Andersen J etal., J Biol Chem 287：22927-37 (2012)；Nolan-Stevaux O et al., PLoS One 7：e50920 (2012)；Rust S et al., Mol Cancer 12：11 (2013)を参照）。この標的生体分子のリストは、
非限定的であることが意図される。熟練した作業者であれば、本発明の細胞標的化分子の成分として使用するのに適している可能性がある結合領域を設計又は選択するのに、がん細胞又は他の所望の細胞型と関連するあらゆる所望の標的生体分子を使用できることを認識していよう。
がん細胞と強く関連し、公知の免疫グロブリン型の結合領域によって高親和性で結合する他の標的生体分子の例としては、ＢＡＧＥタンパク質（Ｂ黒色腫抗原）、基底細胞接着分子（ＢＣＡＭ又はルセラン式血液型糖タンパク質）、膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ）、がん精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、がん精巣抗原ＬＡＧＥタンパク質、ＣＤ１９（Ｂリンパ球抗原タンパク質ＣＤ１９）、ＣＤ２１（補体受容体−２又は補体３ｄ受容体）、ＣＤ２６（ジペプチジルペプチダーゼ−４、ＤＰＰ４、又はアデノシンデアミナーゼ複合タンパク質２）、ＣＤ３３（シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン−３）、ＣＤ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原）、ＣＤ５６、ＣＳ１（ＳＬＡＭファミリー７番又はＳＬＡＭＦ７）、細胞表面Ａ３３抗原タンパク質（ｇｐＡ３３）、エプスタイン−バーウイルス抗原タンパク質、ＧＡＧＥ／ＰＡＧＥタンパク質（黒色腫関連がん／精巣抗原）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ）、ＭＡＧＥタンパク質、Ｔ細胞１タンパク質によって認識される黒色腫抗原（ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ＭＡＲＴＩ）、ムチン、優先的に発現される黒色腫抗原（ＰＲＡＭＥ）タンパク質、前立腺特異的抗原タンパク質（ＰＳＡ）、前立腺幹細胞抗原タンパク質（ＰＳＣＡ）、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、及びウィルムス腫瘍抗原が挙げられる。
がん細胞と強く関連する他の標的生体分子の例は、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ９／ＣＡＩＸ）、クローディンタンパク質（ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４）、エフリンタイプＡ受容体３（ＥｐｈＡ３）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、ガングリオシドＧＭ２、インスリン様増殖因子受容体、インテグリン（例えばＣＤ１１ａ−ｃ）、核因子カッパＢの受容体活性化剤（ＲＡＮＫ）、受容体チロシン−プロテインキナーゼｅｒＢ−３、腫瘍壊死因子受容体１０Ａ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１／ＤＲ４）、腫瘍壊死因子受容体１０Ｂ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、テネイシンＣ、及びＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）である（Hough C et al., Cancer Res 6
0：6281-7 (2000)；Thepen T et al., Nat Biotechnol 18：48-51 (2000)；Pastan I et al.,Nat Rev Cancer 6：559-65 (2006)；Pastan, Annu Rev Med 58：221-37 (2007)；Fitzgerald D et al., Cancer Res 71：6300-9(2011)；Scott A et al., Cancer Immun12：14-22 (2012)を参照）。この標的生体分子のリストは、非限定的であることが意図される。
加えて、予期される標的生体分子の多数の他の例があり、例えば、標的生体分子に関して、ＡＤＡＭメタロプロテイナーゼ（例えばＡＤＡＭ−９、ＡＤＡＭ−１０、ＡＤＡＭ−１２、ＡＤＡＭ−１５、ＡＤＡＭ−１７）、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ（ＡＲＴ１、ＡＲＴ４）、抗原Ｆ４／８０、骨髄間質抗原（ＢＳＴ１、ＢＳＴ２）、ブレイクポイントクラスター領域−ｃ−ａｂｌ腫瘍遺伝子（ＢＣＲ−ＡＢＬ）タンパク質、Ｃ３ａＲ（補体成分３ａ受容体）、ＣＤ７、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５（ルイスＸ又はステージ特異的胎児抗原１）、ＣＤ２３（ＦＣイプシロンＲＩＩ）、ＣＤ４５（タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｃ型）、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５３、ＣＤ５４（細胞間接着分子１）、ＣＤ６３（テトラスパニン）、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８８（補体成分５ａ受容体１）、ＣＤ１１５（コロニー刺激因子１受容体）、ＩＬ−１Ｒ（インターロイキン−１受容体）、ＣＤ１２３（インターロイキン−３受容体）、ＣＤ１２９（インターロイキン９受容体）、ＣＤ１８３（ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３）、ＣＤ１９１（ＣＣＲ１）、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）、ＣＤ１９５（ケモカイン受容体ＣＣＲ５）、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２２５（インターフェロン誘導膜貫通タンパク質１）、ＣＤ２４４（ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４）、ＣＤ２８２（Ｔｏｌｌ様受容体２）、ＣＤ２８４（Ｔｏｌｌ様受容体４）、ＣＤ２９４（ＧＰＲ４４）、ＣＤ３０５（白血球関連免疫グロブリン様受容体１）、エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）、ＦｃｅＲＩａ、ガレクチン−９、アルファ−フェトプロテイン抗原１７−Ａ１タンパク質、ヒトアスパルチル（アスパラギニル）ベータ−ヒドロキシラーゼ（ＨＡＡＨ）、免疫グロブリン様転写ＩＬＴ−３、リゾホスファチジルグリセロール（lysophosphatidlglycerol）アシルトランスフェラーゼ１（Ｌ
ＰＧＡＴ１／ＩＡＡ０２０５）、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ、例えばＣＤ１０７）、メラニン細胞タンパク質ＰＭＥＬ（ｇｐ１００）、骨髄関連タンパク質−１４（ｍｒｐ−１４）、ＮＫＧ２Ｄリガンド（例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬ−１６結合タンパク質、Ｈ−６０、Ｒａｅ−１、及びそれらのホモログ）、受容体チロシン−プロテインキナーゼｅｒｂＢ−３、ＳＡＲＴタンパク質、スカベンジャー受容体（例えばＣＤ６４及びＣＤ６８）、シグレック（シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン）、シンデカン（例えばＳＤＣ１又はＣＤ１３８）、チロシナーゼ、チロシナーゼ（tyrosinease）関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）、チロシナーゼ関連タンパク質２（
ＴＲＰ−２）、チロシナーゼ関連抗原（ＴＡＡ）、ＡＰＯ−３、ＢＣＭＡ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４９、ＣＤ９０、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ケモカイン受容体、補体タンパク質、サイトカイン受容体、組織適合性タンパク質、ＩＣＯＳ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、ｃ−ｍｙｃ、オステオプロテゲリン、ＰＤ−１、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー（ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦＲ−２）、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、及びＴＲＡＩＬ−Ｒ４などであり（Scott A et al., Cancer Immunity 12：14 (2012)；Cheever M et al., Clin Cancer Res 15：5323-37(2009)を参照）、ここに記載した標的生体分子は
非限定的な例であることに留意されたい。
ある特定の実施形態において、結合領域は、免疫系の細胞型の細胞表面に特異的に高親和性で結合することが可能な免疫グロブリン型の結合領域を含むか又はそれから本質的になる。例えば、免疫細胞表面の因子に結合する免疫グロブリン型の結合ドメインが公知であり、例えば、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、Ｃ
Ｄ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１、ＣＤ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ６６、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ２３５、ＣＤ１４６、ＣＤ３２６、インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）、インターロイキン−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）、核因子カッパＢの受容体活性化剤（ＲＡＮＫＬ）、ＳＬＡＭ関連タンパク質（ＳＡＰ）、及びＴＮＦＳＦ１８（腫瘍壊死因子リガンド１８又はＧＩＴＲＬ）などである。
本発明の分子における使用に想定される標的生体分子及び結合領域のさらなる例については、国際公開第２００５／０９２９１７号パンフレット、国際公開第２００７／０３３４９７号パンフレット、米国特許出願公開第２００９／０１５６４１７号明細書、日本国特許第４３３９５１１号明細書、欧州特許第１７２７８２７号明細書、独国特許第６０２００４０２７１６８号明細書、欧州特許第１９４５６６０号明細書、日本国特許第４９３４７６１号明細書、欧州特許第２２２８３８３号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０１９６９２８号明細書、国際公開第２０１４／１６４６８０号パンフレット、国際公開第２０１４／１６４６９３号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８４３５号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８４５２号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット、米国特許第２０１５０２５９４２８号明細書、６２／１６８，７５８号明細書、６２／１６８，７５９号明細書、６２／１６８，７６０号明細書、６２／１６８，７６１号明細書、６２／１６８，７６２号明細書、６２／１６８，７６３号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１６５８０号明細書を参照されたい。
熟練した作業者であれば、志賀毒素エフェクターポリペプチドと会合及び／又は結合させて、本発明の細胞標的化分子を産生するのに好適な結合領域を設計又は選択するのに、あらゆる所望の標的生体分子を使用できることを認識しているものと予想される。
本明細書に記載した上記の結合領域のいずれかは、単独で使用してもよいし、又は本発明の方法を含むそれぞれ個々の本発明の実施形態と組み合わせて使用してもよい。
多種多様な細胞標的化結合領域が様々な本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドと会合して、それらの結合領域の差によりそれらの細胞標的化活性における差を示す本発明の異なる細胞標的化分子を作り出すことができるという点で、本発明の細胞標的化分子の一般的な構造はモジュール式である。これは、異なる実施形態が、例えば細胞性塞栓、細胞毒性、及び外因性物質の細胞内の送達などの志賀毒素エフェクター機能を有する異なるタイプの細胞を標的化するように、様々な細胞を標的化する活性を本発明の細胞標的化分子の異なる実施形態によって表することを可能にする。さらに、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、それらそれぞれの志賀毒素エフェクターポリペプチド領域における差に起因するある特定の特徴、例えば、脊索動物に投与した場合の低い抗原性及び／又は免疫原性、ある特定のプロテアーゼによるタンパク質分解による切断に対する耐性、多細胞生物に投与した場合の高い安定性、高い投薬量におけるインビボ忍容性、カーゴを細胞内配置に送達する能力、及び／又は細胞表面上での提示のためにＴ細胞エピトープをＭＨＣクラスＩ分子に送達する能力などを示す。
本発明の目的に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域及び細胞標的化結合領域の具体的な順番又は方向は、明確に述べられていない限り、本発明の細胞標的化分子と互いに関連して又は本発明の細胞標的化分子内で、固定されていない。例えば、本発明の
細胞標的化分子がアミノ末端及びカルボキシ末端を有する融合タンパク質である場合、本発明の成分の様々な配列が好適であり得る（例えば図１を参照）。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、細胞標的化分子と互いに関連する又は細胞標的化分子内のそれらの成分の配列は、本明細書に記載されている通りに限定される。例えば、ある特定の小胞体保持／回収シグナルモチーフは、一般的に、本発明の細胞標的化分子のカルボキシ末端及び／又は本発明の細胞標的化分子のタンパク質成分のカルボキシ末端に位置する。
Ｃ．ＫＤＥＬファミリーのメンバーの小胞体保持／回収シグナルモチーフ
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、ＫＤＥＬファミリーのメンバーの１つ又は２つ以上のカルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフを含む。国際公開第２０１５／１３８４３５号パンフレットで説明されるあらゆる小胞体保持／回収シグナルモチーフが、本発明のある特定の細胞標的化分子の成分として使用するのに適している可能性がある。
本発明の目的に関して、成句「小胞体保持／回収シグナルモチーフ」、ＫＤＥＬタイプのシグナルモチーフ、又はシグナルモチーフは、本発明の細胞標的化分子又はそれらの成分をＫＤＥＬ受容体を介して小胞体に細胞内局在させることを促進するように真核細胞内で機能化することが可能なあらゆるＫＤＥＬファミリーのメンバーを指す。
カルボキシ末端のリシン−アスパラギン−グルタミン酸−ロイシン（ＫＤＥＬ）配列（配列番号５１４）は、真核細胞における可溶性タンパク質のための標準的な小胞体保持及び回収シグナルモチーフであり、ＫＤＥＬ受容体によって認識される（総論に関して、Capitani M, Sallese M, FEBS Lett 583：3863-71(2009)を参照）。シグナルモチーフのＫＤＥＬファミリーとしては、多くのＫＤＥＬ様モチーフ、例えばＨＤＥＬ（配列番号５１５）、ＲＤＥＬ（配列番号５１６）、ＷＤＥＬ（配列番号５１７）、ＹＤＥＬ（配列番号５１８）、ＨＥＥＬ（配列番号５１９）、ＫＥＥＬ（配列番号５２０）、ＲＥＥＬ（配列番号５２１）、ＫＦＥＬ（配列番号５２２）、ＫＩＥＬ（配列番号５２３）、ＤＫＥＬ（配列番号５２４）、ＫＫＥＬ（配列番号５２５）、ＨＮＥＬ（配列番号５２６）、ＨＴＥＬ（配列番号５２７）、ＫＴＥＬ（配列番号５２８）、及びＨＶＥＬ（配列番号５２９）などが挙げられ、これらの全ては、複数の系統発生学的な界全体にわたり小胞体の内腔に存在することが公知のタンパク質のカルボキシ末端で見出されている（Munro S, Pelham H, Cell 48：899-907 (1987)；Raykhel I et al.,J Cell Biol 179：1193-204 (2007)）。ＫＤＥＬシグナルモチーフファミリーとしては、合成コンストラクトを使用して示される少なくとも４６種のポリペプチドバリアントが挙げられる（Raykhel, J CellBiol 179：1193-204 (2007)）。追加のＫＤＥＬシグナルモチーフとしては、ＡＬＥＤＥＬ（配列
番号５３０）、ＨＡＥＤＥＬ（配列番号５３１）、ＨＬＥＤＥＬ（配列番号５３２）、ＫＬＥＤＥＬ（配列番号５３３）、ＩＲＳＤＥＬ（配列番号５３４）、ＥＲＳＴＥＬ（配列番号５３５）、及びＲＰＳＴＥＬ（配列番号５３６）が挙げられる（Alanen H et al., J
Mol Biol 409：291-7 (2011)）。ＫＤＥＬシグナルモチーフの大部分を代表する汎用の
コンセンサスモチーフは、［ＫＲＨＱＳＡ］−［ＤＥＮＱ］−Ｅ−Ｌとして説明されている（Hulo N et al., Nucleic Acids Res 34：D227-30 (2006)）。
ＫＤＥＬファミリーシグナルモチーフを含有するタンパク質は、ゴルジ複合体全体に分布するＫＤＥＬ受容体と結合し、小胞体の内腔への放出のための微小管依存性メカニズムによって小胞体に輸送される（Griffiths G et al., J Cell Biol 127：1557-74(1994)
；Miesenbock G, Rothman J, J Cell Biol 129：309-19 (1995)）。ＫＤＥＬ受容体はゴ
ルジ複合体と小胞体との間を動的に循環する（Jackson M et al., EMBO J. 9：3153-62 (1990)；Schutze M et al., EMBO J. 13：1696-1705 (1994)）。
本発明の目的に関して、ＫＤＥＬファミリーのメンバーとしては、タンパク質をＫＤＥＬ受容体を介して小胞体に細胞内局在することを促進するように真核細胞内で機能することができる合成シグナルモチーフが挙げられる。言い換えれば、いくつかのＫＤＥＬファミリーのメンバーは、自然に生じない可能性もあるし、又はまだ自然で観察されていないが、熟練した作業者により当業界において公知の方法を使用して構築し、実験的に検証されたか又はそのようにすることが可能である；例えば、Raykhel I et al.,J Cell Biol 179：1193-204 (2007)を参照されたい。
本発明のある特定の細胞標的化分子の成分として、ＫＤＥＬタイプのシグナルモチーフは、それが本発明の細胞標的化分子のポリペプチド成分のカルボキシ末端上になるように、細胞標的化分子内に物理的に配置される、配向される、又は配列される。
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチド領域、並びに／又は小胞体保持／回収シグナルモチーフは、互いに直接連結されていてもよいし、及び／又は好適には、１つ又は２つ以上の介在成分を介して、例えば熟練した作業者周知の及び／又は本明細書に記載される１つ又は２つ以上のリンカーなどと互いに連結されていてもよい。
Ｄ．追加の外因性物質
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、追加の外因性材料を含む。「追加の外因性物質」は、本明細書で使用される場合、志賀毒素及び天然の標的細胞のどちらにもしばしば一般的に存在しない１つ又は２つ以上の原子又は分子を指し、本発明の細胞標的化分子は、細胞内部にこのような材料を特異的に輸送するのに使用することができる。ある意味では、本発明の細胞標的化分子全体が細胞に入ると予想される外因性物質であることから、「追加の」外因性物質は、コア以外の細胞標的化分子それ自身に連結される異種材料である。追加の外因性物質の非限定的な例は、放射性核種、ペプチド、検出促進剤、タンパク質、低分子化学療法剤、及びポリヌクレオチドである。
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、追加の外因性物質は、１つ又は２つ以上の放射性核種、例えば２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、６０Ｃ、及び／又はルテチウムの放射性同位体などである。
ある特定の実施形態において、追加の外因性物質は、アポトーシス促進性ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、例えばＢＣＬ−２、カスパーゼ（例えばカスパーゼ−３又はカスパーゼ−６の断片）、シトクロム、グランザイムＢ、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ，apoptosis-inducing factor）、ＢＡＸ、ｔＢｉｄ（短縮型Ｂｉｄ）、及びアポトー
シス促進性断片又はそれらの派生物などを含む（例えば、Ellerby H et al., Nat Med 5
：1032-8 (1999)；Mai J et al.,Cancer Res 61：7709-12 (2001)；JiaL et al., Cancer Res 63：3257-62 (2003)；Liu Y et al., Mol Cancer Ther 2：1341-50 (2003)；Perea S et al., Cancer Res 64：7127-9 (2004)；Xu Y et al., J Immunol 173：61-7 (2004)；Dalken B et al.,Cell Death Differ 13：576-85 (2006)；Wang T et al., Cancer Res 67：11830-9 (2007)；Kwon M et al., Mol Cancer Ther 7：1514-22 (2008)；Qiu X et al., Mol Cancer Ther 7：1890-9 (2008)；Shan L et al., Cancer Biol Ther 11：1717-22 (2008)；Wang F et al., Clin Cancer Res 16：2284-94(2010)；Kim J et al., J Virol85：1507-16 (2011)を参照）。
ある特定の実施形態において、追加の外因性物質は、酵素を含むタンパク質又はポリペプチドを含む。ある特定の他の実施形態において、追加の外因性物質は、例えば低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ，small inhibiting RNA）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とし
て機能するリボ核酸などの核酸である。ある特定の実施形態において、追加の外因性物質は、例えば病原体、細菌タンパク質、ウイルスタンパク質、がんにおいて変異したタンパク質、がんにおいて異常に発現されるタンパク質、又はＴ細胞相補性決定領域由来の抗原などの抗原である。例えば、外因性物質としては、例えば細菌に感染した抗原提示細胞に特徴的な抗原などの抗原、及び外因性抗原として機能することが可能なＴ細胞相補性決定領域が挙げられる。ポリペプチド又はタンパク質を含む外因性物質は、熟練した作業者に公知か又は未知かにかかわらず１つ又は２つ以上の抗原を含んでいてもよい。
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドと会合した全ての異種抗原及び／又はエピトープは、細胞標的化分子のアミノ末端から志賀毒素エフェクターポリペプチドの志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に向かって配列される。ある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドと会合した全ての異種抗原及び／又はエピトープは、直接的又は間接的のいずれかで、アミノ末端から志賀毒素エフェクターポリペプチドの志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端までの位置で、志賀毒素エフェクターポリペプチドと会合する。ある特定のさらなる実施形態において、抗原である全ての追加の外因性物質は、例えば志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端に直接的又は間接的に融合した、志賀毒素エフェクターポリペプチドに対する配列されたアミノ末端である。
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、追加の外因性物質は、細胞毒性剤、例えば、低分子化学療法剤、抗新生物剤、細胞毒性抗生物質、アルキル化剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、及び／又はチューブリン阻害剤などである。本発明との使用に好適な細胞毒性剤の非限定的な例としては、アジリジン、シスプラチン、テトラジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ビンカアルカロイド、タキサン、カンプトテシン、エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、ノボビオシン、アクラルビシン、アントラサイクリン、アクチノマイシン、アマニチン、アマトキシン、ブレオマイシン、センタナマイシン（centanamycin）（インドールカルボキサミド）、プリカマイシン、マイトマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ドラスタチン、メイタンシン、マイタンシノイド（maytansionoid）、デュロマイシン（duromycin）、ドセタキセル、デュオカルマイシン、アドリアマイシン、カリケアマイシン、オーリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン、ピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ）、カルボプラチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン、マイトマイシンＣ、パクリタキセル、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア（ＢＣＮＵ）、リファンピシン、シスプラチン、メトトレキセート、ゲムシタビン、アセグラトン、アセトゲニン（例えばブラタシン及びブラタシノン）、アクラシノマイシン、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１、アルドホスファミド配糖体、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン）、アルキル化剤（例えばチオテパ及びシクロホスファミド（cyclosphosphamide））、アミノレブリン酸、アミノプテリン、ア
ムサクリン、アンシタビン、アンスラマイシン、アラビノシド、アザシチジン、アザセリン、アジリジン（例えば、ベンゾドパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドパ（meturedopa）、及びウレドパ（uredopa））、アザウリジン、ベストラブシル（bestrabucil）、
ビスアントレン、ビスホスホネート（例えばクロドロネート）、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン、カクチノマイシン、カリスタチン、カラビシン（carabicin）
、カルミノマイシン、カルモフール、カルムスチン、カルチノフィリン、ＣＣ−１０６５、クロラムブシル、クロラムブシル（chloranbucil）、クロルナファジン、クロロゾトシン、クロモマイシニス（chromomycinis）、色素タンパク質のエンジイン抗生物質発色団
、ＣＰＴ−１１、クリプトフィシン（例えばクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノマイシン、デフォファミン、デメコルシン、デトルビシン、ジアジクオン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ジデオキシウリジン、ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ
）、ドキシフルリジン、ドキソルビシン（例えば、モルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシン）、ダイネミシン、エダトラキセート、エダトレキセート、エロイテロビン、エルフォルミチン（elformithine）、酢酸エリプチニウム、エンジイン抗生物質（例えばカリケアマイシン）、エニルウラシル、エノシタビン、エピルビシン、エポチロン、エソルビシン、エスペラミシン、エストラムスチン、エチレンイミン、２−エチルヒドラジド、エトグルシド、フルダラビン、葉酸アナログ（例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、及びトリメトレキセート）、葉酸補充液（例えばフォリン酸（frolinic acid
））、フォテムスチン、フルベストラント、ガシトシン（gacytosine）、硝酸ガリウム、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イバンドロネート、イフォスファミド、メシル酸イマチニブ、エルロチニブ、フルベストラント、レトロゾール、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４（Novartis社、Basel、CH）、オキサリプラチン、ロイコボリン、ラパ
マイシン、ラパチニブ、ロナファルニブ、ソラフェニブ、メチルメラミン（methylamelamine）（例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド
、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチロメラミン）、パンクラチスタチン、サルコジクチン、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド、メクロレタミン、酸化メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プ
レドニムスチン、トロホスファミド、及びウラシルマスタード）、ニトロソウレア（nitrosurea）（例えば、カルムスチン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン（ranimnustine））、ダイネミシン、ネオカルチノスタチン発色団、アンスラマイシン、デトルビシン、エピルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン（例えばマイトマイシンＣ）、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン（potfiromycins）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicins）、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン、
プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（thiamiprine）、及びチオグアニン）、ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチ
ジン、６−アザウリジン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、及びフロクシウリジン）、アセグラトン、レンチナン、ロニダニン（lonidainine）、メイタ
ンシノイド（例えばメイタンシン及びアンサマイトシン）、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール（mopidanmol）、ニトラエリン（nitraerine）、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、リゾキシン、シゾフィラン（sizofuran）、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジコン、２，２’
，２”トリクロロトリエチルアミン、トリコテセン（例えば、Ｔ−２毒素、ベラクリン（verracurin）Ａ、ロリジンＡ、及びアングイジン）、ウレタン、ビンデシン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、アラビノシド、シクロホスファミド、トキソイド（例えばパクリタキセル及びドセタキセル（doxetaxel））、６−チ
オグアニン、メルカプトプリン、白金、白金アナログ（例えばシスプラチン及びカルボプラチン）、エトポシド（ＶＰ−１６）、ミトキサントロン、ビノレルビン、ノバントロン、ダウノマイシン、ゼローダ、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００、レチノイド（例えばレチノイン酸）、カペシタビン、ロムスチン、ロソキサントロン、メルカプトプリン、ニムスチン、ニトラクリン（nitraerine）、ラパマイシン、ラゾキサン、ロリジンＡ、スポンジスタチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スーテント、Ｔ−２毒素、チアミプリン、チオテパ、トキソイド（例えばパクリタキセル及びドセタキセル）、ツベルシジン、ベラクリンＡ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、並びに上述のもののいずれかの構造的なアナログ（例えば合成アナログ）、並びに／又は上述のもののいずれかの派生物が挙げられる（例えば、Lindell T et al., Science 170：447-9 (1970)；Remillard
S et al., Science 189：1002-5 (1975)；Ravry M et al., AmJ Clin Oncol 8：148-50
(1985)；Ravry M et al., Cancer Treat Rep 69：1457-8 (1985)；Sternberg C et al.,
Cancer 64：2448-58 (1989)；Bai Ret al., Biochem Pharmacol39：1941-9 (1990)；B
oger D, Johnson D, Proc Natl AcadSci USA 92：3642-9 (1995)；Beck Jet al., Leuk
Lymphoma 41：117-24 (2001)；CassadyJ et al., Chem Pharm Bull (Tokyo) 52：1-26 (2004)；Sapra P et al.,Clin Cancer Res 11：5257-64 (2005)；Okeley N et al., Clinc Cancer Res 16：888-97 (2010)；Oroudjev E et al.,Mol Cancer Ther 9：2700-13(2010)；Ellestad G, Chirality 23：660-71 (2011)；Kantarjian H etal., Lancet Oncol 13：403-11 (2012)；Moldenhauer G et al., J Natl Cancer Inst 104：622-34 (2012)；Meulendijks D et al., Invest New Drugs 34：119-28 (2016)を参照）。
Ｅ．本発明の細胞標的化分子の構造と機能との関係
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態に関して、例えば細胞毒性効力に対する成分の相対方向の作用；ある特定の投薬量におけるインビボ忍容性に対するフーリン切断感受性作用；インビトロでの安定性に対するフーリン切断感受性作用；インビボの半減期に対するフーリン切断感受性作用；及び多細胞生物におけるインビボの非特異的な毒性に対するフーリン切断感受性作用などの、特異的な構造と機能との関係がすでに観察されている。
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、結合領域が、細胞標的化分子内において、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域のアミノ末端より志賀毒素エフェクターポリペプチド領域のカルボキシ末端の近位に位置されるように、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域及び結合領域の具体的な順番又は方向が固定される。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、細胞標的化分子内の志賀毒素エフェクターポリペプチド領域の配列は、細胞標的化分子のポリペプチド成分のアミノ末端にあるか、及び／又はその近位にあるように制限される（図１を参照）。例えば、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、１）カルボキシ末端から志賀毒素エフェクターポリペプチド領域までの位置で、細胞標的化分子内に配向された結合領域、２）志賀毒素エフェクターポリペプチド領域のアミノ末端から遠位の位置で（例えば５０、１００、２００、又は２５０アミノ酸残基又はより大きい距離で）、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域と会合した結合領域、３）志賀毒素エフェクターポリペプチド領域のアミノ末端を立体的にカバーしていない結合領域、及び／又は４）志賀毒素エフェクターポリペプチド領域のアミノ末端に近い構造に立体的に干渉しない結合領域を含む（例えば図１；国際公開第２０１５１３８４５２号パンフレットを参照）。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、より最適な細胞毒性効力を示すことができ、例えば、同じ志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド領域及び結合領域を含む関連する細胞標的化参照分子と比べて３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、又はそれより高いＣＤ５０値を示すことができ、この場合、結合領域は、１）アミノ末端から志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド領域であるか、２）志賀毒素エフェクターポリペプチド領域のアミノ末端の近位の位置に（例えば５０、４０、３０、２０、又は１０アミノ酸残基又はそれより少ないアミノ酸残基未満の距離で）志賀毒素エフェクターポリペプチド領域と会合しているか、３）志賀毒素エフェクターポリペプチド領域のアミノ末端を立体的にカバーしていないか、及び／又は４）志賀毒素エフェクターポリペプチド領域のアミノ末端に近い構造に立体的に干渉しない（例えば図１；国際公開第２０１５／１３８４５２号パンフレットを参照）。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドは、志賀毒素Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフ（例えば志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に配置されている破壊されたフーリン切断部位）を含む志賀毒素Ａ１断片由来の領域を含む（例えば図１；国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）。ある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば野生型志賀毒素Ａサブユニット又は志賀毒素Ａ１断片を含む分子などの関連する参照分子と比較してより高いフーリン切断耐性を有
する（例えば国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、同じ条件下における同じアッセイで観察された参照分子のフーリン切断より３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はそれ未満（切断なしの場合の１００％を含む）の、再現性よく観察されるフーリン切断の低減を示す。ある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、フーリン以外のプロテアーゼに対して、例えば野生型志賀毒素Ａサブユニット又は志賀毒素Ａ１断片を含む分子などの関連する参照分子と比較してより高い切断耐性を有する。
本発明のある特定の細胞標的化分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチド中に破壊されたフーリン切断モチーフの代償となる構造的機構がまったくないにもかかわらず、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド領域を含む参照分子の１００倍、２０倍、１０倍、５倍以内、又はそれ未満の細胞毒性効力を示す。フーリン切断事象を維持していない志賀毒素Ａサブユニット由来の領域を含む細胞標的化分子、すなわち標的細胞内部のフーリンによって切断されない志賀毒素Ａサブユニット由来の成分を含む分子の場合、最大の細胞毒性を保存するための１つの代替案は、補償である。細胞毒性分子における志賀毒素Ａサブユニット領域のフーリン切断の欠失に対する補償は、志賀毒素Ａサブユニット領域を「予備加工した」形態で提供することによって達成される可能性がある。例えば、志賀毒素Ａサブユニット領域を含む細胞標的化分子は、志賀毒素Ａサブユニット由来のポリペプチドのカルボキシ末端が、１）その分子のカルボキシ末端の近位になり、２）フーリンによって切断された後、天然の志賀毒素Ａ１断片と一致するか又はそれと類似するように、構築されてもよい（国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）。このような補償は本発明のある特定の細胞標的化分子では必須ではなく、それよりもむしろ、例えばある特定の投薬量でのインビボ忍容性の改善；インビトロ安定性の増加；インビボ半減期の増加；及び／又は多細胞生物におけるインビボでの非特異的な毒性の低減などの１つ又は２つ以上の機能を提供するために意図的に回避される。ある特定の実施形態に関して、これらの有益な機能は、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む参照分子と比較して本発明の細胞標的化分子の細胞毒性効力におけるいかなる有意な低減も起こすことなく存在する。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、志賀毒素Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフ（例えば志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に配置されている破壊されたフーリン切断部位）を含む志賀毒素Ａ１断片由来の領域を含む志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドを含むが（例えば図１；国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）、志賀毒素Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端の近位にあり、及び／又は志賀毒素エフェクターポリペプチドと相対的に大きい分子部分（例えば４．５ｋＤａ、６ｋＤａ、９ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２８ｋＤａ、３０ｋＤａ、４１ｋＤａ、又は５０ｋＤａより大きいサイズの結合領域）との間に配向されたいかなる補償的なプロテアーゼ切断部位含まない。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、例えば野生型志賀毒素Ａサブユニット又は志賀毒素Ａ１断片を含む分子などの関連する参照分子と比較してより高いフーリン切断耐性を有する志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む（例えば国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、同じ条件下における同じアッセイで観察された参照分子のフーリン切断より３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％未満のフーリン切断の低減を示し、一方で細胞標的化分子は、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド領域を含む参照分子の１００倍、２０倍、１０倍、５倍以内、又はそれ未満の細胞毒性効力を示す。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、その志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端に野生型フーリン切断モチーフ及び／又は野生型フーリン
切断部位を有する志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む関連する参照分子と比較して、インビボ忍容性の改善を示す（例えば国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）。例えば、インビボ忍容性の増加は、異なる分子が同じ投薬量で投与された実験動物のグループにおける死亡率、罹患の徴候、及び／又はある特定の臨床徴候の測定値を比較することによって決定することができる（例えば下記の実施例；国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、志賀毒素Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフ（例えば志賀毒素Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端に配置された破壊されたフーリン切断部位）を含む志賀毒素Ａ１断片由来の領域を含む志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドを含む（例えば図１；国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）。ある特定のさらなる実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、細胞毒性成分を含み、細胞標的化分子は、より高いプロテアーゼ切断感受性を有するバリアントと比較して低減した非特異的な毒性を示し、特に例えば細胞集団、組織、及び／又は生物などの生きた材料に投与した場合、細胞毒性成分を結合領域から切り離すことによってそれを放出させるより強い性質を有する。さらに、本発明のある特定のプロテアーゼ切断耐性を有する細胞標的化分子は、志賀毒素Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフによって細胞標的化分子に付与されたプロテアーゼ切断耐性に基づき、より高いプロテアーゼ切断感受性を有するバリアントと比較して、生きた材料（例えば、ある特定の脊索動物）に投与した後にインビボでの半減期の増加を表す可能性がある。
III．本発明の成分及び／又はそれらの下位成分を接続する連結
個々の細胞標的化結合領域、志賀毒素エフェクターポリペプチド、及び／又は本発明の細胞標的化分子の成分は、好適には、当業界において周知の及び／又は本明細書に記載される１つ又は２つ以上のリンカーを介して互いに連結されていてもよい。結合領域の個々のポリペプチド下位成分、例えば重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、ＣＤＲ、及び／又はＡＢＲ領域が、好適には、当業界において周知の及び／又は本明細書に記載される１つ又は２つ以上のリンカーを介して互いに連結されていてもよい。本発明のタンパク質性成分、例えば多連鎖の結合領域は、好適には、当業界において周知の１つ又は２つ以上のリンカーを介して、互いに又は本発明の他のポリペプチド成分に連結されていてもよい。本発明のペプチド成分、例えば、ＫＤＥＬファミリーの小胞体保持／回収シグナルモチーフは、好適には、１つ又は２つ以上のリンカー、例えば当業界において周知のタンパク質性リンカーなどを介して、本発明の別の成分に連結されていてもよい。
好適なリンカーは、一般的に、本発明の各ポリペプチド成分を、いかなるリンカー又は他の成分も用いずに個別に産生されたポリペプチド成分に非常に類似した３次元構造にフォールディングさせることができるリンカーである。好適なリンカーとしては、単一のアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、及び上述のもののいずれも含まないリンカー、例えば様々な非タンパク質性炭素鎖などが挙げられ、分岐状か又は環状かは問わない。
好適なリンカーは、タンパク質性であってもよく、１つ又は２つ以上のアミノ酸、ペプチド、及び／又はポリペプチドを含んでいてもよい。タンパク質性のリンカーは、組換え融合タンパク質及び化学的に連結されたコンジュゲートの両方にとって好適である。タンパク質性のリンカーは、典型的には約２〜約５０アミノ酸残基、例えば約５〜約３０又は約６〜約２５アミノ酸残基を有する。選択されるリンカーの長さは、例えばリンカーが選択される理由となる所望の１つ又は複数の特性などの様々な要因に依存すると予想される。ある特定の実施形態において、リンカーは、タンパク質性であり、本発明のタンパク質成分の末端の近くに、典型的には末端から約２０アミノ酸以内に連結されている。
好適なリンカーは、例えば化学的リンカーなどの非タンパク質性であり得る。当業界において公知の様々な非タンパク質性リンカーは、細胞標的化結合領域を本発明の細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターのポリペプチド成分に連結するのに使用することができ、例えば免疫グロブリンのポリペプチドを異種ポリペプチドにコンジュゲートするのに一般的に使用されるリンカーなどである。例えば、ポリペプチド領域は、それらのアミノ酸残基及び炭水化物部分の機能的な側鎖、例えばカルボキシ、アミン、スルフヒドリル、カルボン酸、カルボニル、ヒドロキシル、及び／又は環状の環基などを使用して連結されてもよい。例えば、２つ又は３つ以上のポリペプチドを連結するのに、ジスルフィド結合及びチオエーテル結合を使用することができる。加えて、非天然アミノ酸残基は、例えばケトン基などの他の機能的な側鎖と共に使用することができる。非タンパク質性の化学的リンカーの例としては、これらに限定されないが、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）−アミノベンゾエート、Ｓ−（Ｎ−スクシンイミジル）チオアセテート（ＳＡＴＡ）、Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−ｃｕ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−ペンタノエート（ＳＰＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ又はＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）−アミノベンゾエート、４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン、スルホスクシンイミジル−６−（α−メチル−α−（ピリジルジチオール）−トルアミド）ヘキサノエート、Ｎ−スクシンイミジル−３−（−２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（proprionate）（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６（３（−（
−２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド（proprionamido））ヘキサノエート、スル
ホスクシンイミジル６（３（−（−２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド）ヘキサノエート、マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ）、３−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、アルファ−アルキル誘導体、スルホＮＨＳ−ＡＴＭＢＡ（スルホスクシンイミジルＮ−［３−（アセチルチオ）−３−メチルブチリル−ベータ−アラニン］）、スルホジクロロフェノール、２−イミノチオラン、３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロトリアジン酸（dichlorotriazinicacid）、及びＳ−（２−チオピリジル）−Ｌ−システインが挙げられる。
好適なリンカーとしては、タンパク質性又は非タンパク質性かどうかにかかわらず、例えば、プロテアーゼ感受性の、環境の酸化還元電位感受性の、ｐＨ感受性の、酸で切断可能な、光で切断可能な、及び／又は熱感受性のリンカーを挙げることができる。
タンパク質性のリンカーは、本発明の細胞標的化分子の組換え融合体への取り込みのために選択されてもよい。本発明の細胞標的化タンパク質の組換え融合体の場合、リンカーは、典型的には約２〜５０アミノ酸残基、好ましくは約５〜３０アミノ酸残基を含む。一般的に、タンパク質性のリンカーは、アミノ酸残基の大部分を、極性の、非荷電性の、及び／又は電荷を有する残基、例えばスレオニン、プロリン、グルタミン、グリシン、及びアラニンなどで構成している。タンパク質性のリンカーの非限定的な例としては、アラニン−セリン−グリシン−グリシン−プロリン−グルタミン酸（ＡＳＧＧＰＥ）（配列番号５３８）、バリン−メチオニン（ＶＭ）、アラニン−メチオニン（ＡＭ）、ＡＭ（Ｇ２〜４Ｓ）ｘＡＭ（配列番号５３９）が挙げられ、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンであり、ｘは１〜１０の整数である。
タンパク質性のリンカーは、所望の特性に基づき選択されてもよい。タンパク質性のリンカーは、具体的な特色を考慮して、例えば、同じドメインそれ自身の活性と比較して、融合コンストラクトの状況における融合分子のフォールディング、安定性、発現、溶解性、薬物動態学的特性、薬力学的な特性、及び／又は融合したドメインの活性の１つ又は２つ以上を最適化するように、熟練した作業者によって選択されてもよい。例えば、タンパク質性のリンカーは、フレキシビリティー、剛性、及び／又は切断可能性に基づき選択されてもよい。熟練した作業者は、リンカーを選ぶときに、データベース及びリンカー設計ソフトウェアツールを使用することができる。本発明の特定の態様において、リンカーは、発現を最適化するように選択されてもよい。ある特定の態様において、リンカーは、同一なポリペプチド又はタンパク質間の分子間相互作用を促進してホモ多量体を形成するように、又は異なるポリペプチド又はタンパク質間の分子間相互作用を促進してヘテロ多量体を形成するように選択されてもよい。例えば、本発明の細胞標的化分子のポリペプチド成分間の所望の非共有結合相互作用、例えば二量体及び他のより高次の多量体の形成に関する相互作用などを可能にするタンパク質性のリンカーが選択されてもよい。
フレキシブルなタンパク質性のリンカーは、しばしば長さが１２アミノ酸残基より大きく、小さい非極性アミノ酸残基、極性アミノ酸残基、及び／又は親水性アミノ酸残基、例えばグリシン、セリン、及びスレオニンなどがリッチである。フレキシブルなタンパク質性のリンカーは、成分間の空間的な分離を増加させるように、及び／又は成分間の分子内相互作用を可能にするように選択されてもよい。例えば、様々な「ＧＳ」リンカーが熟練した作業者に公知であり、これらは、複数のグリシン及び／又は１つ又は２つ以上のセリンで、時には例えば（ＧｘＳ）ｎ（配列番号５４０）、（ＳｘＧ）ｎ（配列番号５４１）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５４２）、及び（Ｇ）ｎ（配列番号５４３）（式中ｘは１〜６であり、ｎは１〜３０である）などの反復単位で構成されている。フレキシブルなタンパク質性のリンカーの非限定的な例としては、GKSSGSGSESKS（配列番号５４４）、EGKSSGSGSESKEF（配列番号５４５）、GSTSGSGKSSEGKG（配列番号５４６）、GSTSGSGKSSEGSGSTKG（配列番号５４７）、GSTSGSGKPGSGEGSTKG（配列番号５４８）、SRSSG（配列番号５４
９）、及びSGSSC（配列番号５５０）が挙げられる。
リジッドのタンパク質性のリンカーは、しばしば硬いアルファらせん構造であり、プロリン残基リッチであるか、及び／又は１つ又は２つ以上のプロリンが戦略的に配置されている。リジッドなリンカーは、連結された成分間の分子内の相互作用を防ぐように選択されてもよい。
好適なリンカーは、例えば切断及び／又は環境特異的な不安定などによるインビボでの成分の分離を可能にするように選択されてもよい。インビボで切断可能なタンパク質性のリンカーは、タンパク質分解性プロセシングによって、及び／又はしばしば生物中の特異的な部位若しくはある特定の細胞型の内部の還元性の環境によって連結をはずすことができる。インビボで切断可能なタンパク質性のリンカーは、プロテアーゼ感受性モチーフ及び／又は１つ又は２つ以上のシステイン対によって形成されたジスルフィド結合を含むことが多い。インビボで切断可能なタンパク質性のリンカーは、生物中のある特定の配置、細胞中の区画にのみ存在するか、及び／又はある特定の生理学的又は病態でのみ活性になるプロテアーゼ（例えば、異常に高いレベルの関与するプロテアーゼ、ある特定の疾患部位で過剰発現しているプロテアーゼ、及び病原性微生物によって特異的に発現されているプロテアーゼなど）に対して感受性になるように設計することもできる。例えば、細胞内にのみ存在するプロテアーゼ、特異的な細胞型内にのみ存在するプロテアーゼ、及びがん又は炎症のような病態でのみ存在するプロテアーゼによって切断される当業界において公知のタンパク質性のリンカーがあり、例えばＲ−ｘ−ｘ−Ｒモチーフ及びＡＭＧＲＳＧＧＧＣＡＧＮＲＶＧＳＳＬＳＣＧＧＬＮＬＱＡＭ（配列番号５５１）などがある。
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、標的細胞内に存在するプロテアーゼによる切断をもたらすための１つ又は２つ以上のプロテアーゼ感受性部位を含むリンカーを使用してもよい。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、脊椎生物への投与後に不要な毒性を低減するために切断可能ではないリンカーを使用してもよ
い。
好適なリンカーとしては、タンパク質性か又は非タンパク質性かにかかわらず、例えば、プロテアーゼ感受性の、環境の酸化還元電位感受性の、ｐＨ感受性の、酸で切断可能な、光で切断可能な、及び／又は熱感受性のリンカーを挙げることができる（例えば、Doronina S et al.,Bioconjug Chem 17：114-24(2003)；Saito G et al., Adv Drug DelivRev 55：199-215 (2003)；Jeffrey Set al., J Med Chem 48：1344-58 (2005)；Sanderson R et al., Clin Cancer Res 11：843-52(2005)；Erickson H et al., Cancer Res 66：4426-33 (2006)；Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65：1357-69 (2013)を参照）。好適な切断可能なリンカーとしては、当業界において公知の切断可能な基を含むリンカーを挙げることができる。
好適なリンカーとしては、ｐＨ感受性リンカーを挙げることができる。例えば、ある特定の好適なリンカーは、標的細胞の細胞内区画の内部における解離をもたらすためのより低いｐＨ環境におけるそれらの不安定のために選択されてもよい（例えば、van Der Velden V et al., Blood 97：3197-204(2001)；Ulbrich K, Subr V, Adv Drug DelivRev 56：1023-50 (2004)を参照）。例えば、１つ又は２つ以上のトリチル基、誘導体化されたトリチル基、ビスマレイミドエトキシ（bismaleimideothoxy）プロパン基、アジピン酸ジヒドラジド基、及び／又は酸不安定性のトランスフェリン基を含むリンカーは、特異的なｐＨ範囲を有する環境において、本発明の細胞標的化分子の成分、例えばポリペプチド成分の放出をもたらす可能性がある。例えば腫瘍組織のｐＨが健康な組織のｐＨより低い場合など、組織間の生理学的なｐＨ差に対応するｐＨ範囲で切断されるある特定のリンカーが選択されてもよい。
光で切断可能なリンカーは、例えば可視域の光などのある特定の波長範囲の電磁放射線に曝露されると切断されるリンカーである。光で切断可能なリンカーは、ある特定の波長の光に曝露されたときに、本発明の細胞標的化分子の成分、例えばポリペプチド成分を放出させるのに使用されてもよい。光で切断可能なリンカーの非限定的な例としては、システインの場合の光で切断可能な保護基としてのニトロベンジル基、塩化ニトロベンジルオキシカルボニル架橋剤、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドコポリマー、グリシンコポリマー、フルオレセインコポリマー、及びメチルローダミンコポリマーが挙げられる。光で切断可能なリンカーは、成分を連結して、光ファイバーを使用して光に曝露することができる疾患、障害、及び状態を治療するために設計された本発明の細胞標的化分子を形成することに特に利用することができる。
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、細胞標的化結合領域は、共有結合による連結と非共有結合による連結の両方を含む熟練した作業者公知の多数の手段を使用して、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドに連結される。
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、分子は、重鎖可変（ＶＨ）ドメインと軽鎖可変（ＶＬ）ドメインとを接続するリンカーを有する、ｓｃＦｖである結合領域を含む。この目的に好適な当業界において公知の多数のリンカーがあり、例えば１５残基の（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチド（配列番号５５２）などである。非共有結合による多価構造を形成するのに使用できる好適なｓｃＦｖリンカーとしては、GGS（配列番号５
５３）、GGGS（配列番号５５４）、GGGGS（配列番号５５５）、GGGGSGGG（配列番号５５
６）、GGSGGGG（配列番号５５７）、GSTSGGGSGGGSGGGGSS（配列番号５５８）、及びGSTSGSGKPGSSEGSTKG（配列番号５５９）が挙げられる。
本発明の細胞標的化分子の成分の連結に好適な方法は、その結合が、細胞標的化結合領域の結合能力、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分の細胞内在化、及び／又は適切な
場合は所望の志賀毒素エフェクター機能を実質的に妨害しない限り、本明細書に記載されるアッセイを含む適切なアッセイによって測定された場合にそのような連結を達成するための目下当業界において公知のあらゆる方法によってなされ得る。
本発明の細胞標的化分子の目的に関して、成分：志賀毒素エフェクターポリペプチド、結合領域、及びあらゆる任意選択のリンカーの具体的な順番又は方向は、具体的に述べられていない限り、互いに関連して又は細胞標的化分子全体で固定されない（例えば図１を参照）。本発明の細胞標的化分子の成分は、結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドの所望の活性が除去されないのであれば、どのような順番で配列されてもよい。
IV．本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子の構造バリエーションの例
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、短縮型志賀毒素Ａサブユニットを含むか又はそれから本質的になり得る。志賀毒素Ａサブユニットの短縮化は、例えば、触媒活性及び細胞毒性などの志賀毒素エフェクター機能に影響することなく、エピトープ全体及び／若しくはエピトープ領域、Ｂ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ、並びに／又はフーリン切断部位の欠失を生じ得る。完全な酵素活性を示すことが示された最小の志賀毒素Ａサブユニット断片は、Ｓｌｔ１Ａの残基１〜２３９で構成されるポリペプチドであった（LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18
(2005））。有意な酵素活性を示すことが示された最小の志賀毒素Ａサブユニット断片は、ＳｔｘＡの残基７５〜２４７で構成されるポリペプチドであった（Al-Jaufy A et al.,
Infect Immun 62: 956-60 (1994)）。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、一般的に、完全長志賀毒素Ａサブユニットより小さくあり得るが、本発明の細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、（ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）又はＳｔｘＡ（配列番号２）の）アミノ酸位置７７〜２３９のポリペプチド領域、又は志賀毒素ファミリーのメンバーの他のＡサブユニットにおけるその等価物（例えば、（配列番号３）の７７〜２３８）を維持する。例えば、本発明の分子のある特定の実施形態において、ＳＬＴ−１Ａに由来する本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸７５〜２５１、配列番号１の１〜２４１、配列番号１の１〜２５１、又は配列番号１のアミノ酸１〜２６１を含むか又はそれから本質的になり得、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対して、少なくとも１つのアミノ酸残基が内因性エピトープ及び／若しくはエピトープ領域において変異し、若しくは欠失しており、並びに／又は志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端において、破壊されたフーリン切断モチーフ領域がある。同様に、ＳｔｘＡに由来する志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、配列番号２のアミノ酸７５〜２５１、配列番号２の１〜２４１、配列番号２の１〜２５１、又は配列番号２のアミノ酸１〜２６１を含むか又はそれから本質的になり得、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対して、少なくとも１つのアミノ酸残基が内因性エピトープ及び／若しくはエピトープ領域において変異し、若しくは欠失しており、並びに／又は志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端において、破壊されたフーリン切断モチーフ領域がある。追加として、ＳＬＴ−２に由来する志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、配列番号３のアミノ酸７５〜２５１、配列番号３の１〜２４１、配列番号３の１〜２５１、又はアミノ酸１〜２６１を含むか又はそれから本質的になり得、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対して、少なくとも１つのアミノ酸残基が内因性エピトープ及び／若しくはエピトープ領域において変異し、若しくは欠失しており、並びに／又は志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端において、破壊されたフーリン切断モチーフ領域がある。
本発明は、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子のバリアントであって、前記志賀毒素エフェクターポリペプチドが、天然に存在する志賀毒素Ａサブ
ユニットと、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、又は４１個以上のアミノ酸残基だけ、又は最高それまでのアミノ酸残基（ただし、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を保持するバリアントにおける異なるアミノ酸残基の数より多くないアミノ酸残基）が異なる、バリアントをさらに提供する。したがって、志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットに由来する、本発明の分子は、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上のアミノ酸配列同一性が、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニットに対して維持される限り、最初の配列からの付加、欠失、短縮化、又は他の変更を含み得、かつ野生型志賀毒素Ａサブユニットに対して、少なくとも１つのアミノ酸残基が、内因性エピトープ及び／若しくはエピトープ領域において変異し、若しくは欠失しており、並びに／又は志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端において、破壊されたフーリン切断モチーフ領域がある。
したがって、ある特定の実施形態において、本発明の分子の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、及び／又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）などの天然に存在する志賀毒素Ａサブユニットに対する少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．７％の全配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になり、かつ野生型志賀毒素Ａサブユニットに対して、少なくとも１つのアミノ酸残基が、内因性エピトープ及び／若しくはエピトープ領域において変異し、若しくは欠失しており、並びに／又は志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端において、破壊されたフーリン切断モチーフ領域がある。
志賀毒素Ａサブユニットの完全長又は短縮型のいずれも、本発明の分子の志賀毒素エフェクターポリペプチド領域を含んでもよく、その志賀毒素由来ポリペプチドが、天然に存在する志賀毒素と比較して、１つ又は２つ以上の変異（例えば、置換、欠失、挿入、又は反転）を含む。志賀毒素エフェクターポリペプチドが、宿主細胞形質転換、トランスフェクション、感染、若しくは導入の周知の方法によるか、又は志賀毒素エフェクターポリペプチドと連結した細胞標的化結合領域により媒介される内在化によるかのいずれかにより、細胞への侵入後に細胞毒性を保持するのに十分な、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニットとの配列同一性を有することが、本発明のある特定の実施形態において好ましい。志賀毒素Ａサブユニットにおける酵素活性及び／又は細胞毒性にとって最も重要な残基は、とりわけ、以下の残基位置にマッピングされている：アスパラギン−７５、チロシン−７７、グルタミン酸−１６７、アルギニン−１７０、及びアルギニン−１７６（Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)）。本発明の実施形態のいずれか１つにおいて、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ＳｔｘＡ、ＳＬＴ−１Ａにおける位置７７、１６７、１７０、及び１７６、又は典型的には細胞毒性活性に必要とされる志賀毒素ファミリーの他のメンバーにおける等価の保存された位置に見出されるものなどの位置に、１つ又は２つ以上の保存されたアミノ酸を維持することが、必ずしもではないが、好ましくあり得る。細胞死を引き起こす本発明の細胞毒性分子の能力、例えば、それの細動毒性は、当技術分野においてよく知られたいくつかのアッセイのいずれか１つ又は２つ以上を使用して測定され得る。
Ａ．脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドの例
ある特定の実施形態において、本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、２つ又は３つ以上の変異を有する短縮型志賀毒素Ａサブユニットから本質的になり得る。志賀毒素Ａサブユニットの短縮化は、例えば、触媒活性及び細胞毒性などの志賀毒素エフェクター機能に影響することなく、エピトープ全体及び／若しくはエピトープ領域、Ｂ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ、並びに／又はフーリン切断部位の欠失を生じ得る。ＳＬＴ−１Ａ、ＳｔｘＡ、又はＳＬＴ−２Ａのカルボキシ末端をアミノ酸
１〜２５１へ短縮化することは、２つの予測されたＢ細胞エピトープ領域、２つの予測されたＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）Ｔ細胞エピトープ、及び予測された非連続性Ｂ細胞エピトープを取り除く。ＳＬＴ−１Ａ、ＳｔｘＡ、又はＳＬＴ−２Ａのアミノ末端を７５〜２９３へ短縮化することは、少なくとも３つの予測されたＢ細胞エピトープ領域及び３つの予測されたＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを取り除く。ＳＬＴ−１Ａ、ＳｔｘＡ、又はＳＬＴ−２Ａのアミノ末端とカルボキシ末端の両方を７５〜２５１へ短縮化することは、少なくとも５つの予測されたＢ細胞エピトープ領域、４つの推定ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ、及び１つの予測された非連続性Ｂ細胞エピトープを欠失させる。
ある特定の実施形態において、本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、提供された内因性のＢ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域において（野生型志賀毒素ポリペプチドに対する）少なくとも１つの変異、例えば、欠失、挿入、反転、又は置換を有する、完全長又は短縮型志賀毒素Ａサブユニットを含むか又はそれから本質的になり得る。ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域内に少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を含む、（野生型志賀毒素ポリペプチドに対する）変異を含む破壊を含む。ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域内に少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を含む破壊を含む。ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、アミノ酸残基の反転を含む破壊を含み、少なくとも１つの反転したアミノ酸残基が内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域内にある。ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、アミノ酸置換、非標準アミノ酸及び／又は化学修飾された側鎖を有するアミノ酸残基へのアミノ酸置換などの（野生型志賀毒素ポリペプチドに対する）変異を含む破壊を含む。本発明における使用に適した、脱免疫化された志賀毒素エフェクター部分領域の非限定的例は、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット、及び国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットに記載されている。アミノ酸置換を含む、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドの多数の非限定的例は実施例に提供されている。
他の実施形態において、本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、実施例（例えば、表１〜７及び／又は表Ｂ）で提供された、天然に位置するＢ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域において少なくとも１つのアミノ酸残基が破壊されている、完全長志賀毒素Ａサブユニットより短い短縮型志賀毒素Ａサブユニットを含む。
脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを作製するために、原理的には、提供されたエピトープ領域における任意のアミノ酸残基を様々な手段により改変すること、例えば、野生型志賀毒素ポリペプチドに対する、欠失、挿入、反転、転位、置換、及び側鎖の化学修飾を表す改変が、結果として、エピトープの破壊を生じ得る。しかしながら、ある特定のアミノ酸残基を改変すること、及びある特定のアミノ酸修飾を使用することは、ある程度の志賀毒素エフェクター機能を維持しながら、抗原性及び／又は免疫原性を低減するのに成功する可能性がより高い。例えば、末端の短縮化及び内部のアミノ酸置換は、これらの型の改変が、志賀毒素エフェクターポリペプチドにおいてアミノ酸残基の全体的なスペーシングを維持し、それゆえに、志賀毒素エフェクターポリペプチド構造及び機能を維持する可能性がより高いため、好ましい。
本発明のある特定の実施形態の中で、脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、実施例（例えば、表１〜７及び／又は１２参照）で提供された天然に位置するエピトープ領域において少なくとも１つのアミノ酸残基が破壊されている、ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、及び／又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）のアミノ
酸７５〜２５１を含むか又はそれから本質的になり得る。ある特定の他の実施形態の中には、実施例（例えば、表１〜７及び／又は１２参照）で提供された天然に位置するエピトープ領域において少なくとも１つのアミノ酸残基が破壊されている、ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、及び／又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）のアミノ酸１〜２４１を含むか又はそれから本質的になる脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドがある。さらなる実施形態は、実施例（例えば、表１〜７及び／又は１２参照）で提供された天然に位置するエピトープ領域において少なくとも１つのアミノ酸残基が破壊されている、ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、及び／又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）のアミノ酸１〜２５１を含むか又はそれから本質的になる脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドである。さらなる実施形態は、実施例（例えば、表１〜７及び／又は１２参照）で提供された天然に位置するエピトープ領域において少なくとも１つのアミノ酸残基が破壊されている、ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、及び／又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）のアミノ酸１〜２６１を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドである。
本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを作製するために使用することができる多数の多様な内部アミノ酸置換がある。エピトープ領域内で使用するための可能な代用のアミノ酸のうち、以下の代用のアミノ酸残基が、エピトープの抗原性及び／又は免疫原性を低減する可能性が最も高いと予測される：Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｋ、及びＨ。グリシンを除いて、これらのアミノ酸残基は全て、極性及び／又は荷電残基として分類され得る。代わりに用いるための可能なアミノ酸のうち、以下のアミノ酸Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、及びＫは、取って代わられるアミノ酸に依存して、有意なレベルの志賀毒素エフェクター機能の保持を提供しながら、抗原性及び／免疫原性を低減する可能性が最も高いと予測される。一般的に、置換は、極性及び／又は荷電アミノ酸残基を無極性及び非荷電残基へ変化させるべきである（例えば、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット参照）。加えて、アミノ酸残基のＲ基機能性側鎖の全体的なサイズ及び／又は長さを縮小することが、エピトープ破壊に有益であり得る（例えば、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット参照）。しかしながら、エピトープ破壊を与える可能性が最も高いこれらの置換の一般論にも関わらず、目的が有意な志賀毒素エフェクター機能を保存することであるため、代用アミノ酸は、それが、取って代わられるアミノ酸と似ている場合には、志賀毒素エフェクター機能を保存する可能性がより高くあり得、例えば、類似したサイズの無極性及び／又は非荷電残基が、極性及び／又は荷電残基の代わりに用いられる。
下記の実施例及び国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレットにおいて、多くの変異が、様々な志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子の志賀毒素エフェクター機能への効果について実験的に試験されている。単独で、又は１つ若しくは２つ以上の他の置換と組み合わせてのアミノ酸置換が、強力なレベルの志賀毒素エフェクター機能の発揮を妨げなかったという、実施例及び国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレットに記載された結果を表Ｂは要約する。表Ｂは、下記の実施例に記載されたエピトープ領域ナンバリングスキームを使用する（以下の実施例１−表７参照）。




本明細書における実施例及び国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレットにおける実験的証拠に基づいて、志賀毒素のＡサブユニットにおけるある特定のアミノ酸位置は、有意な志賀毒素エフェクター機能をなお保持しながら、エピトープ破壊を許容することが予想される。例えば、以下の天然に存在する位置は、細胞毒性などの志賀毒素エフェクター機能を保持しながら、単独か又は組合せかのいずれかでのアミノ酸置換を許容する：配列番号１又は配列番号２の１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１；配列番号１又は配列番号２の３３；配列番号１又は配列番号２の４３；配列番号１又は配列番号２の４４；配列番号１又は配列番号２の４５；配列番号１又は配列番号２の４６；配列番号１又は配列番号２の４７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４８；配列番号１又は配列番号２の４９；配列番号１又は配列番号２の５０；配列番号１又は配列番号２の５１；配列番号１又は配列番号２の５３；配列番号１又は配列番号２の５４；配列番号１又は配列番号２の５５；配列番号１又は配列番号２の５６；配列番号１又は配列番号２の５７；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５９；配列番号１又は配列番号２の６０；配列番号１又は配列番号２の６１；配列番号１又は配列番号２の６２；配列番号１又は配列番号２の８４；配列番号１又は配列番号２の８８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９６；配列番号１又は配列番号２の１０４；配列番号１又は配列番号２の１０５；配列番号１又は配列番号２の１０７；配列番号１又は配列番号２の１０８；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１０９；配列番号１又は配列番号２の１１０；配列番号１又は配列番号２の１１１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１２；配列番号１又は配列番号２の１４１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１４７；配列番号１又は配列番号２の１５４；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１７９；配列番号１又は配列番号２の１８０；配列番号１又は配列番号２の１８１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８３；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８４；配列番号１又は配列番号２の１８５；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８６；配列番号１又は配列番号２の１８７；配列番号１又は配列番号２の１８８；配列番号１又は配列番号２の１８９；配列番号１又は配列番号２の１９８；配列番号３の２０４；配列番号１又は配列番号２の２０５；配列番号３の２４１；配列番号１又は配列番号２の２４２；
配列番号１又は配列番号２の２４７；配列番号３の２４７；配列番号１又は配列番号２の２４８；配列番号３の２５０；配列番号１又は配列番号２の２５１；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の２６４；配列番号１又は配列番号２の２６５；及び配列番号１又は配列番号２の２８６。
実施例及び国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレットにおける実験的データは、前述の短縮化、及び置換を許容する位置の新しい組合せ、加えて関連した志賀毒素Ａサブユニットにおける同一の位置又は保存された位置における新しい置換など、有意な志賀毒素エフェクター機能を示す志賀毒素エフェクターポリペプチドの能力を保持しながら、志賀毒素エフェクターポリペプチドの抗原性及び／又は免疫原性を低減することができる、他のエピトープ破壊性置換及びエピトープ破壊性置換の組合せを指し示している。
本明細書で試験された置換の保存的官能基のアミノ酸残基への他のアミノ酸置換が、有意な志賀毒素エフェクター機能を保存しながら、抗原性及び／又は免疫原性を低減し得ることは予想できる。例えば、Ｋ１Ａ、Ｋ１Ｍ、Ｔ４Ｉ、Ｄ６Ｒ、Ｓ８Ｉ、Ｔ８Ｖ、Ｔ９Ｉ、Ｓ９Ｉ、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｈ、Ｔ１２Ｋ、Ｓ３３Ｉ、Ｓ３３Ｃ、Ｓ４３Ｎ、Ｇ４４Ｌ、Ｓ４５Ｖ、Ｓ４５Ｉ、Ｔ４５Ｖ、Ｔ４５Ｉ、Ｇ４６Ｐ、Ｄ４７Ｍ、Ｄ４７Ｇ、Ｎ４８Ｖ、Ｎ４８Ｆ、Ｌ４９Ａ、Ｆ５０Ｔ、Ａ５１Ｖ、Ｄ５３Ａ、Ｄ５３Ｎ、Ｄ５３Ｇ、Ｖ５４Ｌ、Ｖ５４Ｉ、Ｒ５５Ａ、Ｒ５５Ｖ、Ｒ５５Ｌ、Ｇ５６Ｐ、Ｉ５７Ｆ、Ｉ５７Ｍ、Ｄ５８Ａ、Ｄ５８Ｖ、Ｄ５８Ｆ、Ｐ５９Ａ、Ｐ５９Ｆ、Ｅ６０Ｉ、Ｅ６０Ｔ、Ｅ６０Ｒ、Ｅ６１Ａ、Ｅ６１Ｖ、Ｅ６１Ｌ、Ｇ６２Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｖ８８Ａ、Ｄ９４Ａ、Ｓ９６Ｉ、Ｔ１０４Ｎ、Ａ１０５Ｌ、Ｔ１０７Ｐ、Ｌ１０８Ｍ、Ｓ１０９Ｖ、Ｔ１０９Ｖ、Ｇ１１０Ａ、Ｄ１１１Ｔ、Ｓ１１２Ｖ、Ｄ１４１Ａ、Ｇ１４７Ａ、Ｖ１５４Ａ、Ｒ１７９Ａ、Ｔ１８０Ｇ、Ｔ１８１Ｉ、Ｄ１８３Ａ、Ｄ１８３Ｇ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ｆ、Ｌ１８５Ｖ、Ｌ１８５Ｄ、Ｓ１８６Ａ、Ｓ１８６Ｆ、Ｇ１８７Ａ、Ｇ１８７Ｔ、Ｒ１８８Ａ、Ｒ１８８Ｌ、Ｓ１８９Ａ、Ｄ１９８Ａ、Ｒ２０４Ａ、Ｒ２０５Ａ、Ｃ２４２Ｓ、Ｓ２４７Ｉ、Ｙ２４７Ａ、Ｒ２４８Ａ、Ｒ２５０Ａ、Ｒ２５１Ａ、又はＤ２６４Ａ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２８６Ａ、及び／若しくはＴ２８６Ｉのいずれかに類似している、熟練した作業者に公知の他の置換は、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能を維持しながら内因性エピトープを破壊し得る。特に、Ｋ１Ａ、Ｋ１Ｍ、Ｔ４Ｉ、Ｓ８Ｉ、Ｔ８Ｖ、Ｔ９Ｉ、Ｓ９Ｉ、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｈ、Ｓ３３Ｉ、Ｓ３３Ｃ、Ｓ４３Ｎ、Ｇ４４Ｌ、Ｓ４５Ｖ、Ｓ４５Ｉ、Ｔ４５Ｖ、Ｔ４５Ｉ、Ｇ４６Ｐ、Ｄ４７Ｍ、Ｎ４８Ｖ、Ｎ４８Ｆ、Ｌ４９Ａ、Ａ５１Ｖ、Ｄ５３Ａ、Ｄ５３Ｎ、Ｖ５４Ｌ、Ｖ５４Ｉ、Ｒ５５Ａ、Ｒ５５Ｖ、Ｒ５５Ｌ、Ｇ５６Ｐ、Ｉ５７Ｆ、Ｉ５７Ｍ、Ｄ５８Ａ、Ｄ５８Ｖ、Ｄ５８Ｆ、Ｐ５９Ａ、Ｅ６０Ｉ、Ｅ６０Ｔ、Ｅ６１Ａ、Ｅ６１Ｖ、Ｅ６１Ｌ、Ｇ６２Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｖ８８Ａ、Ｄ９４Ａ、Ｓ９６Ｉ、Ｔ１０４Ｎ、Ｔ１０７Ｐ、Ｌ１０８Ｍ、Ｓ１０９Ｖ、Ｔ１０９Ｖ、Ｇ１１０Ａ、Ｄ１１１Ｔ、Ｓ１１２Ｖ、Ｄ１４１Ａ、Ｇ１４７Ａ、Ｖ１５４Ａ、Ｒ１７９Ａ、Ｔ１８０Ｇ、Ｔ１８１Ｉ、Ｄ１８３Ａ、Ｄ１８３Ｇ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ｆ、Ｌ１８５Ｖ、Ｓ１８６Ａ、Ｓ１８６Ｆ、Ｇ１８７Ａ、Ｒ１８８Ａ、Ｒ１８８Ｌ、Ｓ１８９Ａ、Ｄ１９８Ａ、Ｒ２０４Ａ、Ｒ２０５Ａ、Ｃ２４２Ｓ、Ｓ２４７Ｉ、Ｙ２４７Ａ、Ｒ２４８Ａ、Ｒ２５０Ａ、Ｒ２５１Ａ、Ｄ２６４Ａ、Ｇ２６４Ａ、Ｔ２８６Ａ、及びＴ２８６Ｉに類似した保存的アミノ酸残基へのアミノ酸置換は、同じ、又は類似した効果を生じ得る。ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば、Ｋ１からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＨ；Ｔ４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ９からＡ、Ｇ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ９からＡ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｋ１１からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｓ３３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｓ４３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｓ４５からＡ、Ｇ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ４５からＡ、Ｇ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｄ４７からＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｎ４８からＡ、Ｇ、Ｌ、及びＭ；Ｌ４９からＧ；Ｙ４９からＡ；Ｄ５３からＶ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｒ５５からＧ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｄ５８からＧ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、及び
Ｑ；Ｐ５９からＧ；Ｅ６０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、及びＭ；Ｅ６１からＧ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、及びＲ；Ｒ８４からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｖ８８からＧ；Ｉ８８からＧ；Ｄ９４からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｓ９６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｓ１０９からＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０９からＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１４１からＶ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｖ１５４からＧ；Ｒ１７９からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｔ１８０からＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｔ１８１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ１８３からＶ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１８４からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、及びＱ；Ｓ１８６からＧ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、及びＭ；Ｒ１８８からＧ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｓ１８９からＧ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１９７からＶ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１９８からＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｒ２０４からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２０５からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ及びＨ；Ｓ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｙ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｒ２４８からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５０からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５１からＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｄ２６４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；及びＴ２８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳなどの実験的に試験されたものと類似した保存的アミノ酸置換を含み得る。
同様に、電荷、極性を取り除き、及び／又は側鎖長を縮小するアミノ酸置換は、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能を維持しながら、エピトープを破壊することができる。ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば、配列番号１又は配列番号２の１位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４位；配列番号１又は配列番号２の６位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の８位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１２位；配列番号１又は配列番号２の３３位；配列番号１又は配列番号２の４３位；配列番号１又は配列番号２の４４位；配列番号１又は配列番号２の４５位；配列番号１又は配列番号２の４６位；配列番号１又は配列番号２の４７位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の４８位；配列番号１又は配列番号２の４９位；配列番号１又は配列番号２の５０位；配列番号１又は配列番号２の５１位；配列番号１又は配列番号２の５３位；配列番号１又は配列番号２の５４位；配列番号１又は配列番号２の５５位；配列番号１又は配列番号２の５６位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５７位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５８位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の５９位；配列番号１又は配列番号２の６０位；配列番号１又は配列番号２の６１位；配列番号１又は配列番号２の６２位；配列番号１又は配列番号２の８４位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の８８位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９４位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の９６位；配列番号１又は配列番号２の１０４位；配列番号１又は配列番号２の１０５位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１０７位；配列番号１又は配列番号２の１０８位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１０９位；配列番号１又は配列番号２の１１０位；配列番号１又は配列番号２の１１１位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１１２位；配列番号１又は配列番号２の１４１位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１４７位；配列番号１又は配列番号２の１５４位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１７９位；配列番号１又は配列番号２の１８０位；配列番号１又は配列番号２の１８１位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８３位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８４位；配列番号１又は配列番号２の１８５位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の１８６位；配列番号１又は配列番号２の１８７位；配列番号１又は配列番号２の１８８位；配列番号１又は配列番号２の１８９
位；配列番号３の１９７位；配列番号１又は配列番号２の１９８位；配列番号３の２０４位；配列番号１又は配列番号２の２０５位；配列番号３の２４１位；配列番号１又は配列番号２の２４２位；配列番号１又は配列番号２の２４７位；配列番号３の２４７位；配列番号１又は配列番号２の２４８位；配列番号３の２５０位；配列番号１又は配列番号２の２５１位；配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の２６４位；配列番号１又は配列番号２の２６５位；及び配列番号１又は配列番号２の２８６位におけるアミノ酸残基の代わりに、以下の群Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、又はＫから選択される適切なアミノ酸を用いることなどの、側鎖電荷が取り除かれ、極性が取り除かれ、及び／又は側鎖長が縮小されるような置換によって破壊された１つ又は２つ以上のエピトープを含み得る。ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、以下のアミノ酸置換の１つ又は２つ以上を含み得る：Ｋ１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ及びＨ；Ｔ４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｓ８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｔ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｋ１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ及びＨ；Ｔ１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ３３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｓ４３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４４からＡ及びＬ；Ｓ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｔ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４６からＡ及びＰ；Ｄ４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｎ４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、及びＭ；Ｌ４９からＡ又はＧ；Ｆ５０；Ａ５１からＶ；Ｄ５３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｖ５４からＡ、Ｇ、及びＬ；Ｒ５５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｇ５６からＡ及びＰ；Ｉ５７からＡ、Ｇ、Ｍ、及びＦ；Ｌ５７からＡ、Ｇ、Ｍ、及びＦ；Ｄ５８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｐ５９からＡ、Ｇ、及びＦ；Ｅ６０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、及びＲ；Ｅ６１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、及びＲ；Ｇ６２からＡ；Ｄ９４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｒ８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｖ８８からＡ及びＧ；Ｉ８８からＡ、Ｇ、及びＶ；Ｄ９４；Ｓ９６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ａ１０５からＬ；Ｔ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｌ１０８からＡ、Ｇ、及びＭ；Ｓ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｇ１１０からＡ；Ｄ１１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１４１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ１４７からＡ；Ｖ１５４からＡ及びＧ；Ｒ１７９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｔ１８０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｔ１８１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ１８３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｌ１８５からＡ、Ｇ、及びＶ；Ｓ１８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｇ１８７からＡ；Ｒ１８８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｓ１８９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１９７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１９８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｒ２０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２０５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ及びＨ；Ｃ２４２からＡ、Ｇ、Ｖ、及びＳ；Ｓ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｙ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｒ２４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｃ２６２からＡ、Ｇ、Ｖ、及びＳ；Ｄ２６４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ２６４からＡ；及びＴ２８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ。
さらに、有意な志賀毒素エフェクター機能を保持しながら、エピトープを破壊する志賀
毒素エフェクターポリペプチドの１つのエピトープ領域における任意のアミノ酸置換は、有意なレベルの志賀毒素エフェクター機能をなお保持しながら、破壊された複数のエピトープ領域を有する脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを形成するために、有意な志賀毒素エフェクター機能を保持しながらエピトープを破壊する、同じ、又は異なるエピトープ領域における任意の他のアミノ酸置換と組合せ可能である。ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、前述の置換の２つ若しくは３つ以上の組合せ、及び／又は国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレットに記載された置換の組合せを含み得る。
実施例及び国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレットにおける実験的証拠に基づいて、志賀毒素のＡサブユニットにおけるある特定のアミノ酸領域は、有意な志賀毒素エフェクター機能をなお保持しながら、エピトープ破壊を許容することが予想される。例えば、１〜１５、３９〜４８、５３〜６６、５５〜６６、９４〜１１５、１８０〜１９０、１７９〜１９０、及び２４３〜２５７で天然に位置するエピトープ領域は、志賀毒素酵素活性及び細胞毒性を損なうことなく、同時に複数のアミノ酸置換組合せを許容した。
Ｂ．フーリン切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドの例
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端に、破壊されたフーリン切断モチーフ及び／又はフーリン切断部位を含み得る。ある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端の近位に、フーリン切断を与え得るいかなる知られた代償構造も含まない。本発明における使用に適した、破壊されたフーリン切断モチーフ及びフーリン切断部位の非限定的例は、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットに記載されている。
ある特定のフーリン切断モチーフ破壊は、配列表に提供される天然の志賀毒素Ａサブユニットの特定のアミノ酸位置を参照して本明細書に示され、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニットが、取り除かれて成熟志賀毒素Ａサブユニットを生じ、かつ熟練した作業者に認識できる約２２個のアミノ酸のシグナル配列をそれらのアミノ末端に含有する前駆体を含むことに留意されたい。さらに、変異を含むある特定のフーリン切断モチーフ破壊は、天然の志賀毒素Ａサブユニット内の特定の位置（例えば、アミノ末端から２５１位におけるアルギニン残基についてのＲ２５１）に天然で存在する特定のアミノ酸（例えば、アルギニン残基についてのＲ）、続いて、検討中の特定の変異においてその残基の代わりに用いられているアミノ酸を参照することにより本明細書に示される（例えば、Ｒ２５１Ａは、アミノ末端からアミノ酸残基２５１においてアルギニンの代わりにアラニンのアミノ酸置換を表す）。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端において、破壊されたフーリン切断モチーフを含み、そのような実施形態は、本明細書において、野生型志賀毒素Ａサブユニット及び／又は野生型志賀毒素Ａ１断片融合タンパク質に対してそれらの性質を記載するために、「フーリン切断耐性」又は「プロテアーゼ切断耐性」志賀毒素エフェクターポリペプチドと呼ばれる。
ある特定の実施形態において、本発明のプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドは、２つ又は３つ以上の変異を有する短縮型志賀毒素Ａサブユニットから本質的になる。
ある特定の実施形態において、本発明のプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドは、Ａ、Ｇ、又はＨを有する最小のフーリン切断部位共通モチーフにおいてア
ルギニン残基の１つ又は両方の（野生型志賀毒素ポリペプチドに対する）アミノ酸残基置換を含む、破壊されたフーリン切断モチーフを含む。ある特定の実施形態において、本発明のプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドは、フーリン切断モチーフ領域内にアミノ酸置換を含む破壊であって、前記置換が、配列番号３の２４７、配列番号１の２４８、配列番号２の２４８、配列番号３の２５０、配列番号１の２５１、配列番号２の２５１、並びに保存的志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は非天然の志賀毒素エフェクターポリペプチド配列における等価の位置からなる群から選択される、天然に位置するアミノ酸に存在する、破壊を含む。ある特定のさらなる実施形態において、置換は、任意の非保存的アミノ酸への置換であり、置換は、天然に位置するアミノ酸残基位置に生じる。ある特定のさらなる実施形態において、変異は、Ｒ２４７Ａ、Ｒ２４８Ａ、Ｒ２５０Ａ、Ｒ２５１Ａ、並びに保存的志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は非天然の志賀毒素エフェクターポリペプチド配列における等価の位置からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。
ある特定の実施形態において、本発明のプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドは、欠失である変異を含む、破壊されたフーリン切断モチーフを含む。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、ＳｔｘＡ（配列番号２）及びＳＬＴ−１Ａ（配列番号３）における２４７〜２５２において天然に位置する領域、又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）における２４６〜２５１において天然に位置する領域の欠失；ＳｔｘＡ（配列番号２）及びＳＬＴ−１Ａ（配列番号３）における２４４〜２４６において天然に位置する領域、又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）における２４３〜２４５において天然に位置する領域の欠失；又はＳｔｘＡ（配列番号２）及びＳＬＴ−１Ａ（配列番号３）における２５３〜２５９において天然に位置する領域、又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）における２５２〜２５８において天然に位置する領域の欠失である変異を含む。
本発明のプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドのある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較してカルボキシ末端の短縮化（結果として、フーリン切断モチーフ内の１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の欠失を生じる短縮化）である変異を含む。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小の切断部位Ｙ／Ｒ−ｘ−ｘ−Ｒ内の１つ又は２つ以上のアミノ酸残基を欠失するカルボキシ末端の短縮化、例えば、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａ由来志賀毒素エフェクターポリペプチドについて、天然でのアミノ酸残基位置２５０、２４９、２４８、２４７、２４６、２４５、２４４、２４３、２４２、２４１、２４０、又は２３９以下で終わる短縮化、ＳＬＴ−２Ａ由来志賀毒素エフェクターポリペプチドについて、天然でのアミノ酸残基位置２４９、２４８、２４７、２４６、２４５、２４４、２４３、２４２、２４１、又は２４０以下で終わる短縮化を含む。ある特定のさらなる実施形態は、可能な場合、前述の変異のいずれかの組合せを含む、破壊されたフーリン切断モチーフを含む。
ある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断モチーフの部分的なカルボキシ末端の短縮化である変異を含むが、本発明のある特定の分子は、２０個のアミノ酸残基のフーリン切断モチーフ全体の完全なカルボキシ末端の短縮化である破壊されたフーリン切断モチーフを含まない。例えば、本発明のある特定の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ＳｔｘＡ（配列番号２）又はＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）において、天然の位置２４０までの志賀毒素Ａ１断片領域の部分的なカルボキシ末端の短縮化を含むが、位置２３９又は２３８以下におけるカルボキシ末端の短縮化を含まない、破壊されたフーリン切断モチーフを含む。同様に、本発明のある特定の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）において、天然の位置２３９までの志賀毒素Ａ１断片領域の部分的カルボキシ末端の短縮化を含むが、位置２３８又は２３７以
下におけるカルボキシ末端の短縮化を含まない、破壊されたフーリン切断モチーフを含む。本発明のフーリン切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドの最大のカルボキシ末端の短縮化である、破壊されたフーリン切断モチーフを含む変異において、フーリン切断モチーフの位置Ｐ１４及びＰ１３がなお存在する。
ある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、フーリン切断モチーフ内のアミノ酸残基置換とカルボキシ末端の短縮化の両方を含む。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、最小のフーリン切断部位Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ内のアミノ酸残基置換とカルボキシ末端の短縮化の両方、例えば、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａ由来志賀毒素エフェクターポリペプチドについて、天然でのアミノ酸残基位置２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、又は２９２以上で終わる短縮化、並びに、適切な場合には、任意の正電荷を有さないアミノ酸残基で置換された、天然に位置するアミノ酸残基Ｒ２４８及び／又はＲ２５１を含むこと；ＳＬＴ−２Ａ由来志賀毒素エフェクターポリペプチドについて、天然でのアミノ酸残基位置２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、又は２９２以上で終わる短縮化、並びに、適切な場合には、任意の正電荷を有さないアミノ酸残基で置換された、天然に位置するアミノ酸残基Ｙ２４７及び／又はＲ２５０を含むことを含む。ある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフを含む短縮型志賀毒素エフェクターポリペプチドはまた、最適な細胞毒性を維持するために、フーリン切断モチーフの、位置Ｐ９、Ｐ８、及び／又はＰ７におけるアミノ酸残基を含む。
ある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、１つ又は２つ以上の内部のアミノ酸残基欠失である変異を含む。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小のフーリン切断部位Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ内に１つ又は２つ以上のアミノ酸残基欠失を有する変異を含む。例えば、周囲残基、例えば、２４９、２５０、２４７、２５２などの欠失と組み合わせられ得る、天然に位置するアミノ酸残基Ｒ２４８及び／又はＲ２５１の内部欠失を含むＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａ由来志賀毒素エフェクターポリペプチド；並びに周囲残基、例えば、２４８、２４９、２４６、２５１などの欠失と組み合わせられ得る、天然に位置するアミノ酸残基Ｙ２４７及び／又はＲ２５０の内部欠失を含むＳＬＴ−２Ａ由来志賀毒素エフェクターポリペプチド。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小のフーリン切断部位Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒを欠失する、４個の連続したアミノ酸残基の欠失である変異を含み、例えば、Ｒ２４８〜Ｒ２５１を欠くＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａ由来志賀毒素エフェクターポリペプチド、並びにＹ２４７〜Ｒ２５０を欠くＳＬＴ−２Ａ由来志賀毒素エフェクターポリペプチドである。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、コアのフーリン切断モチーフに隣接するアミノ酸残基において１つ又は２つ以上のアミノ酸残基欠失、例えば、ＳＬＴ−１Ａ又はＳｔｘＡにおける２４４〜２４７及び／又は２５２〜２５５の欠失を有する変異を含む。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、表面露出したプロテアーゼ切断感受性ループ全体の内部欠失、例えば、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａ由来志賀毒素エフェクターポリペプチドについて、天然に位置するアミノ酸残基２４１〜２６２の欠失、並びにＳＬＴ−２Ａ
由来志賀毒素エフェクターポリペプチドについて、天然に位置するアミノ酸残基２４０〜２６１の欠失である変異を含む。
ある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、フーリン切断モチーフ内の内部のアミノ酸残基欠失である変異と、カルボキシ末端の短縮化である変異の両方を含む。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、最小のフーリン切断部位Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ内のアミノ酸残基欠失である変異と、カルボキシ末端の短縮化である変異の両方を含む。例えば、プロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドは、アミノ酸残基２４７及び／若しくは２５２をなお有する短縮型ＳｔｘＡ若しくはＳＬＴ−１Ａポリペプチドにおける天然に位置するアミノ酸残基２４８〜２４９及び／若しくは２５０〜２５１、又はアミノ酸残基２４６及び／若しくは２５１をなお有する短縮型ＳＬＴ−２Ａにおけるアミノ酸残基２４７〜２４８及び／若しくは２４９〜２５０の欠失である変異を含む、破壊されたフーリン切断モチーフを含み得る。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、最小のフーリン切断部位Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒを欠失する４つの連続したアミノ酸残基の欠失、及びカルボキシ末端の短縮化を有する変異、例えば、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａ由来志賀毒素エフェクターポリペプチドについて、天然でのアミノ酸残基位置２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、又は２９２以上で終わる短縮化、及びＲ２４８〜Ｒ２５１の欠損；並びにＳＬＴ−２Ａ由来志賀毒素エフェクターポリペプチドについて、天然でのアミノ酸残基位置２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、又は２９２以上で終わる短縮化、及びＹ２４７〜Ｒ２５０の欠損を有する変異を含む。
Ｃ．組み込まれたエピトープを有する志賀毒素エフェクターポリペプチドの例
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、脱免疫化、及び／又は標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路への送達のために、１つ又は２つ以上の組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含み得る。ある特定の実施形態及び／又はある特定の志賀毒素エフェクターポリペプチド部分領域について、Ｔ細胞エピトープを組み込むこと、又は部分的に組み込むことは、Ｔ細胞エピトープを挿入することより好ましくあり得、例えば、組み込み型改変は、志賀毒素エフェクターポリペプチドの多様な部分領域において成功する可能性がより高く、一方、成功した挿入は、志賀毒素エフェクターポリペプチド部分領域のより小さいサブセットに、より限定され得るからである。用語「成功した」とは、志賀毒素エフェクターポリペプチドへの改変（例えば、異種Ｔ細胞エピトープの導入）が、結果として、１つ又は２つ以上の志賀毒素エフェクター機能を単独で、又は細胞標的化分子の成分としてのいずれかで、必要なレベルの活性で保持する改変型志賀毒素エフェクターポリペプチドを生じることを意味するように本明細書で使用される。
国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレットに記載された志賀毒素エフェクターポリペプチド部分領域のいずれも、本発明のある特定の実施形態に適し得、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレットに記載された志賀毒素エフェクターポリペプチドのいずれも、例えば、脱免疫化のための１つ若しくは２つ以上の新しいエピトープ領域破壊
（例えば、本明細書に記載される破壊）及び／又はフーリン切断モチーフ破壊（例えば、本明細書に記載される破壊）の追加により、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドへ改変され得る。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープ、及び１つ又は２つ以上の他の変異を含む短縮型志賀毒素Ａサブユニットから本質的になる。ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含み、かつＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）若しくはＳｔｘＡ（配列番号２）のアミノ酸７７〜２３９、又は、例えば、志賀毒素ファミリーのメンバーの他のＡサブユニットにおける等価物（例えば、ＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）のアミノ酸７７〜２３８）により表されるポリペプチドからなるなど、完全長の志賀毒素Ａサブユニットより小さい。例えば、本発明のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸７５〜２５１、配列番号１のアミノ酸１〜２４１、配列番号１のアミノ酸１〜２５１、又は配列番号１のアミノ酸１〜２６１に由来し、その志賀毒素エフェクターポリペプチドが、少なくとも１つの組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含み、実施例（例えば、表１〜７及び／又は１２参照）に提供された内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域において少なくとも１つのアミノ酸が破壊されており、かつその破壊されたアミノ酸が、組み込まれた又は挿入されたエピトープとオーバーラップしていない。同様に、他の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸７５〜２５１、配列番号２のアミノ酸１〜２４１、配列番号２のアミノ酸１〜２５１、又は配列番号２のアミノ酸１〜２６１に由来し、その志賀毒素エフェクターポリペプチドが、少なくとも１つの組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含み、実施例（例えば、表１〜７及び／又は１２参照）に提供された内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域において少なくとも１つのアミノ酸が破壊されており、かつその破壊されたアミノ酸が、組み込まれた又は挿入されたエピトープとオーバーラップしていない。さらに、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸７５〜２５１、配列番号３のアミノ酸１〜２４１、配列番号３のアミノ酸１〜２５１、又は配列番号３のアミノ酸１〜２６１に由来し得、その志賀毒素エフェクターポリペプチドが、少なくとも１つの組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含み、実施例（例えば、表１〜７及び／又は１２参照）に提供された内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域において少なくとも１つのアミノ酸が破壊されており、かつその破壊されたアミノ酸が、組み込まれた又は挿入されたエピトープとオーバーラップしていない。本発明のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープ、及び志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含む。例えば、ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸７５〜２５１、配列番号１のアミノ酸１〜２４１、配列番号１のアミノ酸１〜２５１、又は配列番号１のアミノ酸１〜２６１に由来し、その志賀毒素エフェクターポリペプチドが、少なくとも１つの組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープ、及び志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含む。同様に、他の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸７５〜２５１、配列番号２のアミノ酸１〜２４１、配列番号２のアミノ酸１〜２５１、又は配列番号２のアミノ酸１〜２６１に由来し、その志賀毒素エフェクターポリペプチドが、少なくとも１つの組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープ、及び志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含む。さらに、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸７５〜２５１、配列番号３のアミノ酸１〜２４１、配列番号３のアミノ酸１〜２５１、又は配列番号３のアミノ酸１〜２６１に由来し得、その志賀毒素エフェクターポリペプチドが、少なくとも１つの組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープ、及び志賀毒素Ａ
１断片由来領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含む。
Ｄ．組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドの例
本発明の組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドは、２つ又は３つ以上の部分領域（すなわち、オーバーラップしていない部分領域）を含み、各部分領域が、以下の少なくとも１つを含む：（１）内因性エピトープ又はエピトープ領域における破壊；（２）組み込まれた異種Ｔ細胞エピトープ−ペプチド；（３）挿入された異種Ｔ細胞エピトープ−ペプチド；及び（４）Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフ。
本発明の組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドの、ある特定の実施形態は、（１）内因性エピトープ又はエピトープ領域における破壊と、（２）Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフの両方を含む。下記の実施例に記載され、又は国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレットに記載された、個々の脱免疫化された志賀毒素エフェクター部分領域（例えば、上記の表Ｂ参照）は、一般的に、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドを作製するために、本明細書に記載され、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットに記載され、及び／又は当技術分野において知られた、破壊されたフーリン切断モチーフを含む任意の志賀毒素エフェクター部分領域と組み合わせられ得ると予想される。
本発明の特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、組み込まれた又は挿入された異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープとオーバーラップしない少なくとも１つの内因性Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープ領域の破壊をさらに含む、配列番号３５５〜４３８のいずれか１つに示されたポリペプチドから本質的になり、その破壊が、野生型志賀毒素に対する１つ又は２つ以上のアミノ酸残基置換を含む。ある特定のさらなる実施形態において、置換は、以下からなる群から選択される：Ｋ１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ及びＨ；Ｔ４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ及びＲ；Ｓ８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｋ１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ及びＨ；Ｔ１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、Ｓ、及びＫ；Ｓ１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｓ３３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＣ；Ｓ４３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４４からＡ又はＬ；Ｓ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｔ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４６からＡ及びＰ；Ｄ４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｍ、及びＱ；Ｎ４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｍ及びＦ；Ｌ４９からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｙ４９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＴ；Ｆ５０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、及びＴ；Ａ５１；Ｄ５３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｖ５４からＡ、Ｇ、Ｉ、及びＬ；Ｒ５５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｇ５６からＡ及びＰ；Ｉ５７からＡ、Ｇ、Ｖ、及びＭ；Ｌ５７からＡ、Ｖ、Ｃ、Ｇ、Ｍ、及びＦ；Ｄ５８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｐ５９からＡ、Ｇ、及びＦ；Ｅ６０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、Ｔ、及びＲ；Ｅ６１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、及びＲ；Ｇ６２からＡ；Ｒ８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｖ８８からＡ及びＧ；Ｉ８８からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｄ９４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｓ９６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ；及びＮ；Ａ１０５からＬ；Ｔ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＰ；Ｓ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＰ；Ｌ１０８からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｓ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｇ１１０からＡ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、及びＴ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１４１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ１４７からＡ；Ｖ
１５４からＡ及びＧ。Ｒ１７９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｔ１８０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｔ１８１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ１８３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｌ１８５からＡ、Ｇ、Ｖ及びＣ；Ｓ１８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｇ１８７からＡ；Ｒ１８８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｓ１８９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１９８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｒ２０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２０５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ及びＨ；Ｓ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｙ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｒ２４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｄ２６４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ２６４からＡ；並びにＴ２８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ。ある特定のさらなる実施形態において、複数の内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ領域の複数の破壊があり、各破壊が、Ｋ１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ及びＨ；Ｔ４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ及びＲ；Ｓ８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｓ９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｋ１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ及びＨ；Ｔ１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、Ｓ、及びＫ；Ｓ１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｓ３３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＣ；Ｓ４３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４４からＡ又はＬ；Ｓ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｔ４５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｇ４６からＡ及びＰ；Ｄ４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｍ、及びＱ；Ｎ４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｍ及びＦ；Ｌ４９からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｙ４９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＴ；Ｆ５０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、及びＴ；Ａ５１；Ｄ５３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｖ５４からＡ、Ｇ、Ｉ、及びＬ；Ｒ５５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｇ５６からＡ及びＰ；Ｉ５７からＡ、Ｇ、Ｖ、及びＭ；Ｌ５７からＡ、Ｖ、Ｃ、Ｇ、Ｍ、及びＦ；Ｄ５８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｐ５９からＡ、Ｇ、及びＦ；Ｅ６０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、Ｔ、及びＲ；Ｅ６１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、及びＲ；Ｇ６２からＡ；Ｒ８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｖ８８からＡ及びＧ；Ｉ８８からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｄ９４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｓ９６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ；及びＮ；Ａ１０５からＬ；Ｔ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＰ；Ｓ１０７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＰ；Ｌ１０８からＡ、Ｖ、Ｃ、及びＧ；Ｓ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｔ１０９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｇ１１０からＡ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１１１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、及びＴ；Ｓ１１２からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１４１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ１４７からＡ；Ｖ１５４からＡ及びＧ。Ｒ１７９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｔ１８０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｔ１８１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳ；Ｄ１８３からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｄ１８４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｌ１８５からＡ、Ｇ、Ｖ及びＣ；Ｓ１８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｇ１８７からＡ；Ｒ１８８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｓ１８９からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｄ１９８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｒ２０４からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２０５からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ及びＨ；Ｓ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、及びＭ；Ｙ２４７からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、及びＭ；Ｒ２４８からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５０からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｒ２５１からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｋ、及びＨ；Ｄ２６４か
らＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、及びＱ；Ｇ２６４からＡ；並びにＴ２８６からＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、及びＳからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基置換を含む。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドのある特定の実施形態は、（１）組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープ−ペプチドと、（２）Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフの両方を含む。下記の実施例又は国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレットに記載された、組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含む志賀毒素エフェクターポリペプチド部分領域のいずれも一般的に、細胞標的化分子の成分として、プロテアーゼ切断耐性であることと、異種Ｔ細胞エピトープを標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路へ送達する能力があることの両方である組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドを作製するために、任意のプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチド部分領域（例えば、本明細書に記載され、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットに記載され、及び／又は当技術分野において知られた改変型志賀毒素Ａサブユニット部分領域）と組み合わせられ得る。この型の組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドの非限定的例は、配列番号６〜２７、２９〜３２、３４０〜３５５、及び３７０〜４３８に示される。
本発明の組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドのある特定の実施形態は、（１）内因性エピトープ又はエピトープ領域における破壊と、（２）組み込まれた異種Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの両方を含む。しかしながら、本明細書に記載され、又は国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットに記載された、挿入された又は組み込まれた異種Ｔ細胞エピトープを含む志賀毒素エフェクター部分領域は、一般的に、成功裏に組み合わせられ、その結果として生じた組合せ分子が十分なレベルの志賀毒素エフェクター機能を保持したことが実験的に示された場合を除き、本明細書に記載されるあらゆる脱免疫化された志賀毒素エフェクター部分領域と組合せ可能であるとは限らない。本明細書における開示は、成功を実験的に実証するために、どのようにそのような実施形態が作製され、試験され得るかを示している。
用語「成功した」は、志賀毒素エフェクターポリペプチドにおける２つ又は３つ以上のアミノ酸残基置換が、結果として、その改変された志賀毒素エフェクターポリペプチドが１つ又は２つ以上の志賀毒素エフェクター機能を保持しながら、機能的特徴、例えば、脱免疫化、フーリン切断の低減、及び／又は組み込まれた若しくは挿入されたエピトープを送達する能力を生じることを意味するように本明細書で使用される。本明細書に記載されるアプローチ及びアッセイは、組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチド及びそれを含む細胞標的化分子を表す本発明の実施形態を設計し、作製し、及び実験的に試験する方法を示している。
本発明の組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドは、それらのそれぞれの部分領域の特徴、例えば、フーリン切断モチーフ破壊、個々のエピトープ破壊、及び／又は異種Ｔ細胞エピトープカーゴを兼ね備え、これらの組合せが、結果として、それらの部分的に脱免疫化された部分領域の合計と比較して、免疫原性の相乗的低減を有する志賀毒素エフェクターポリペプチドを生じることがある。特に、配列番号１３、１６、及び２１に示された例示的な志賀毒素エフェクターポリペプチドは、２つ又は３つ以上の部分領域の組合せにより相乗的に脱免疫化されており、その部分領域の１つが、組み込まれた異種Ｔ細胞エピトープを含み、もう１つが、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基置換により破壊された内因性エピトープを含む。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号６〜３２、３４０〜３５４、及び３７０〜４３８のいずれか１つにおいて示されたポリ
ペプチドを含むか又はそれから本質的になる。ある特定の実施形態において、本発明の、組み込まれたＴ細胞エピトープを含む、脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号６〜１０、１３〜３２、３４０〜３５４、及び３７０〜４３８によって表されたポリペプチドの１つを含むか又はそれから本質的になる。
ある特定の濃度で無細胞毒性又は低減細胞毒性を示す、本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチド、例えば、Ｒ１７９Ａを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドは、外因性材料を細胞へ送達するための脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドとしてなお有用であり得る。同様に、ある特定の濃度で無細胞毒性又は低減細胞毒性を示す、本発明のＣＤ８＋Ｔ細胞で過免疫された志賀毒素エフェクターポリペプチド、例えば、触媒ドメインへ組み込まれたエピトープを含む志賀毒素エフェクターポリペプチド（例えば、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット、実施例１−Ｆ参照）は、Ｔ細胞エピトープを、その志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞の所望の細胞内区画へ送達するのに、又はＴ細胞エピトープの標的細胞への送達のための細胞標的化分子の成分として、なお有用であり得る。
Ｅ．本発明の細胞標的化分子の例
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、様々な細胞外標的生体分子を標的にする細胞標的化分子の成分として使用され得る。以下の例は、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＨＥＲ２、ＰＤ−Ｌ１、及びＴＹＲＰ１などの細胞外標的生体分子を発現する細胞を標的にする、本発明の例示的な細胞標的化分子のある特定の構造をより詳細に記載する。
１．ヒトＣＤ１９を標的にする細胞標的化分子
Ｂ４としても当技術分野において認識されているＣＤ１９は、発達中のＢ細胞の表面上に存在する９５ｋＤａ、Ｂ系列特異的、Ｉ型膜貫通糖タンパク質であるが、最終分化したプラズマ細胞によって発現しない。ＣＤ１９という名前は、様々な種由来の関連した構造及びポリペプチド配列を有する複数のタンパク質を指し得るが、このセクションの構造例を示すことを目的として、用語「ＣＤ１９」は、正確な配列がアイソフォームに基づいて、及び個体間でわずかに異なり得る、ヒトに存在するＢリンパ球抗原ＣＤ１９タンパク質を指す。ヒトに関しては、ＣＤ１９は、主なポリペプチド配列ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１５３９１及び（National Center Biotechnology Institute, U.S.）（ＮＣＢＩ）アクセッシ
ョンＡＡＡ６９９６６．１又はＡＡＢ６０６９７．１によって表されるタンパク質を指す；しかしながら、スプライシング、多型性、及び／又は変異により異なるアイソフォーム及びバリアントが存在する（例えば、Kuroki K et al., Genes Immun Suppl 1:S21-30 (2002)；Tsuchiya N et al., Arthritis Rheum 50:4002-7 (2004)；Dawidowicz K et al., Clin Exp Rheumatol 29: 839-42(2011)参照）。熟練した作業者は、たとえ参照された配列とは異なる場合でさえも、ヒトにおいて他のＣＤ１９タンパク質を同定することができるだろう。
ＣＤ１９は、例えば、Ｂ細胞系列の新生細胞及び腫瘍によるＣＤ１９の遍在性細胞表面発現のため、標的化がん治療のための魅力的な標的である。例えば、ほとんどの悪性Ｂ細胞は、ＣＤ１９を発現することが見出された（例えば、Anderson K et al., Blood 63: 1424 (1984)；Uckun F et al., Blood 71: 13 (1988)；Bradbury L et al., J Immunol 149: 2841-50 (1992)；Haas K, Tedder T, Adv Exp Med Biol 560: 125-39 (2005)；Tedder
T, Nat Rev Rheumatol 5: 572-7 (2009)参照）。ＣＤ１９は、Ｂ細胞発達の間中、発現
する、汎Ｂ細胞マーカーと考えられているが、成熟Ｂ細胞及びＢ細胞系列の腫瘍細胞は、未成熟Ｂ細胞と比較して、３倍多いＣＤ１９を発現することが観察されている。特に、ＣＤ１９発現は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ，non-Hodgkin lymphoma）の低悪性度及び高
悪性度のサブタイプ、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ，B-cell chronic lympocytic leukemia）、並びに急性リンパ芽球性白血病の型に観察された。さらに、ＣＤ２０発現と比較したＣＤ１９発現の違いにより、ＣＤ１９標的化治療は、ＣＤ２０標的化治療より初期に、Ｂ細胞新生物を標的にすることが可能であり得る。
本発明の細胞標的化分子を作製するために本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドと会合し得る、熟練した作業者に公知の多数のＣＤ１９結合領域がある。本発明を目的として、用語「ＣＤ１９結合領域」は、例えば、１０−５〜１０−１２モル／リットルのＣＤ２０に関する解離定数を有するなどの高親和性でＣＤ１９分子の細胞外部分と特異的に結合する能力がある分子部分（例えば、タンパク質性分子）又は作用物質を指す。本明細書で用いられる場合、ＣＤ１９結合は、ヒトＣＤ１９のアイソフォーム又はバリアントの細胞外部分と結合する能力を指す。
ある特定の実施形態において、ＣＤ１９結合領域は、免疫グロブリン型結合領域である。ある特定の実施形態において、免疫グロブリン型ＣＤ１９結合領域は、ＣＤ１９の細胞外部分と結合する能力がある抗体パラトープなどの、免疫グロブリンＣＤ１９結合領域に由来する。ある特定の他の実施形態において、免疫グロブリン型ＣＤ１９結合領域は、いかなる免疫グロブリンドメインにも由来しないが、ＣＤ１９の細胞外部分との高親和性結合を提供することにより免疫グロブリンＣＤ１９結合領域のように機能する改変されたポリペプチドを含む。この改変されたポリペプチドは、本明細書に記載されているような免疫グロブリン由来の相補性決定領域及び／又は抗原結合領域を含むか又はそれらから本質的になるポリペプチドスキャフォールドを含んでもよい。
本発明の成分として企図される、多数のＣＤ１９結合領域がある。免疫グロブリン型ＣＤ１９結合領域の非限定的例には、ＣＤ１９結合性モノクローナル抗体、及びヒト化バリアント及び組換え免疫グロブリンドメインなどの、それらの派生物、例えば、Ｂ４（例えば、クローンｅＢｉｏ１Ｄ３）、Ｌｅｕ−１２（Ｌｅｕ１２）、ＨＤ３７、Ｂ４３、ＣＬＢ−ＣＤ１９、ＭＯＰＣ ２１成分、ＦＭＣ６３、ＭＢ１９−１、ｃＣＤ１９、Ｂ４ ８９Ｂ、ＳＪ２５−Ｃ１、ｈＡ１９、ｈｕＢ４、ｈＢＵ１２、ＸｍＡｂ５５７４、ＭＯＲ２０８、ＭＥＤＩ−５５１、ＳＡＲ３４１９、ＡＦＭ１１、ＧＢＲ ４０１、ＸｍＡｂ ５８７１、Ｈｍ２Ｅ８ｂ、Ｂ−１、５Ｆ３、２Ｅ２、１Ｇ９、Ｃ−２０、Ｆ−３、ＨＤ２３７、Ｈ−３００、Ｍ−２０、Ｒ−２０、ＰＤＲ１３４、ＢＣＥ１９、ＨＩＢ１９、ＬＥ−ＣＤ１９、ＬＴ１９、ＣＢ１９、６Ｄ５、４Ｇ７、ＡＢ−１、Ｆ９７４Ａ２、Ｊ３−１１９、ＭＤＸ−１３４２、ＭＡＢ７４８９（クローン７７１４０４）、及びＭＡＢ４８６７（クローン４Ｇ７−２Ｅ３）が挙げられる（例えば、Caligaris-Cappio Fet al., J Clin Invest 76: 1243-51 (1985)；Chen Z et al.,Leuk Res 10: 1411-7 (1986)；Pezzutto
A et al., J Immunol 138: 2793-9 (1987)；De Rie M et al., Leuk Res 12: 135-41(1988)；Uckun F et al., Blood 71: 13-29 (1988)；Vuist W et al., Cancer Res 49: 3783-8(1989)；Carter R et al., J Immunol 147: 3663-71 (1991)；Zola H et al., Immunol Cell Biol 69: 411-22 (1991)；Holder M et al., Eur J Immunol 22: 2725-8 (1992)；Engel P et al., Immunity 3: 39-50 (1995)；Pietersz G et al., Cancer Immunol Immunother 41: 53-60 (1995)；Tisone J et al., Am J Clin Pathol 107: 283-91 (1997)
；国際公開第２００５／０１２４９３号パンフレット；Lutz R et al., Proc Am AssocCancer Res 47: 3731 (2006)；Horton H et al., Cancer Res68: 8049-57 (2008)；Gerber H et al., Blood 113: 4352-61(2009)；Awan F et al., Blood 115: 1204-13 (2010)
；Herbst R et al., J PharmacolExp Ther 335: 213-22 (2010)；Coiffier B et al.,J
Clin Oncol 29: 1182-9 (2011)；Reusch U et al., Blood 122: 4405 (2013)；Breton C
et al., J Hematol Oncol 7: 33 (2014)；Horton H et al., J Immunol 186: 4223-33 (2014)；Shen D et al., Monoclon Antib Immunodiagn Immunother 33: 215-20 (2014)).
Non-limiting examples of CD19 binding regions include scFvs,such as, e.g., FVS
191, FVS192, scFv-HD37, scFv-FMC63, HD37-C, HD37-CCH, FMC63-28Z, 4G7mut,4G7-graft (例えば、Bejeck B et al., Cancer Res 55: 2346-51 (1995)；Kipriyanov et al., J
Immunol Meth 196: 51-62 (1996)；Nicholson I et al., MolImmunol 34: 1157-65 (1997)参照)；国際公開第２００２／０５０１１８号パンフレット；Peipp M et al., JImmunol Methods 285: 265-80 (2004)；Cheng W et al., Biochim Biophys Acta 1768: 21-9(2007)；Kochenderfer J et al., J Immunother 32: 689-702 (2009)；Kugler M et al.,
Protein Eng Des Sel 22:135-47 (2009)；国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレット；Kneissi S et al., PLoSOne 8: e79047 (2013)参照）。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、ヒトＣＤ１９及び／又はＣＤ１９＋細胞の細胞表面との特異的かつ高親和性結合について選択された免疫グロブリン型ポリペプチドを含む結合領域を含む。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、結合領域は、ａ）（ｉ）配列番号８３、配列番号８９、又は配列番号９６に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ１；（ii）配列番号８４、配列番号９０、配列番号９５、又は配列番号９７に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ２；及び（iii）配列番号８５、配列番号９１
、又は配列番号９８に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ，heavy chain variable）ドメイン；並びにｂ）（ｉ）配列番号８６、配列番号９２、又は配列番号９９に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＡＢＲ１；（ii）配列番号９７、配列番号９３、又は配列番号１００に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＡＢＲ２；及び（iii）配列番号８８、配列番号９４、又は配列番号１０１に示されるアミノ酸配列の
１つを含むか又はそれから本質的になるＬＡＢＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ，lightchain variable）ドメインからなる群から選択されるポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、配列番号４７〜１１９及び１７６〜２４８のいずれか１つのアミノ酸１〜２３２、１〜２３３、１〜２３４、１〜２３５、１〜２３６、１〜２４２、１〜２４３、１〜２４４、１〜２４５、１〜２４６、１〜２５２、１〜２５３、１〜２５４、１〜２５５、又は１〜２５６を含むか又はそれから本質的になる結合領域を含む。
１つの特定の、しかし、非限定的な態様によれば、本発明の細胞標的化分子の結合領域は、ＣＤ１９の細胞外部分との結合機能性を保持する（天然に存在するか、合成であるかに関わらず）リガンド又はその派生物を含む。天然ＣＤ１９は、少なくとも１つのリガンド、ＣＤ１９−Ｌ（高移動度群（ＨＭＧ，high mobility group）ボックスタンパク質）
と結合することが知られている（例えば、Uckun F et al., Br J Haematol 153: 15-23 (2011)；米国特許出願公開第２０１２０１４１５０５号明細書参照）。
前述のＣＤ１９結合分子のいずれも、ＣＤ１９結合領域としての使用に適し、又は本発明の細胞標的化分子に使用される１つ若しくは２つ以上のＣＤ１９結合領域を作製するために改変され得る。
２．ヒトＣＤ２０を標的にする細胞標的化分子
ＣＤ２０（Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０）ＣＤ２０という名前は、様々な種由来の関連した構造及びポリペプチド配列を有する複数のタンパク質を指し得るが、このセクションの構造例を示すことを目的として、用語「ＣＤ２０」は、正確な配列がアイソフォームに基づいて、及び個体間でわずかに異なり得る、ヒトに存在するＢリンパ球抗原ＣＤ２０タンパク質を指す。ヒトに関しては、ＣＤ２０は、主なポリペプチド配列ＵｎｉｔＰｒｏｔ Ｐ１１８３６及びＮＣＢＩアクセッションＮＰ ６９０６０５．１によって表されるタンパク質を指す；しかしながら、スプライシング、多型性、及び／又は変異により異なるアイソフォーム及びバリアントが存在する（例えば、Dawidowicz K etal., Clin Exp Rheuma
tol 29: 839-42 (2011)；Fang Cet al., Int J Clin Exp Med 8: 11235-43 (2015)参照
）。熟練した作業者は、たとえ参照された配列とは異なる場合でさえも、ヒトにおいて他のＣＤ２０タンパク質を同定することができるだろう。
ＣＤ２０は、ある特定の細胞発達段階内の正常なＢ細胞系列細胞、加えて、ＮＨＬ及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ，chroniclymphocytic leukemia）細胞などの多数の成熟Ｂ細胞新生物によって発現する細胞表面糖タンパク質である。加えて、ＣＤ２０は、成熟Ｔ細胞及びＮＫ細胞新生物によって発現する。ＣＤ２０は、正常なＴ細胞のサブセット、並びに悪性Ｔ細胞、例えば、菌状息肉腫（ＭＦ，mycosis fungoides）、ナチュラルキラ
ー細胞リンパ腫（ＮＫ細胞リンパ腫，natural killer cell lymphoma）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ，peripheral T-cell lymphoma）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、及びＴ細胞大顆粒リンパ球性白血病（Ｔ−ＬＧＬＬ，T-cell large granular lymphocyte leukemia）
を含むＴ細胞リンパ腫（ＴＣＬ，T-cell lymphoma）によって発現する。細胞表面ＣＤ２
０の悪性細胞との関連により、ＣＤ２０が細胞標的化治療のための魅力的な標的となっている。
本発明の細胞標的化分子を作製するために本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドと会合し得る、熟練した作業者に公知の多数のＣＤ２０結合領域がある。本発明を目的として、用語「ＣＤ２０結合領域」は、例えば、１０−５〜１０−１２モル／リットルのＣＤ２０に関する解離定数を有するなどの高親和性でＣＤ２０分子の細胞外部分と特異的に結合する能力がある分子部分（例えば、タンパク質性分子）又は作用物質を指す。本明細書で用いられる場合、ＣＤ２０結合は、ヒトＣＤ２０のアイソフォーム又はバリアントの細胞外部分と結合する能力を指す。
ある特定の実施形態において、ＣＤ２０結合領域は、免疫グロブリン型結合領域である。ある特定の実施形態において、免疫グロブリン型ＣＤ２０結合領域は、ＣＤ２０の細胞外部分と結合する能力がある抗体パラトープなどの、免疫グロブリンＣＤ２０結合領域に由来する。ある特定の他の実施形態において、免疫グロブリン型ＣＤ２０結合領域は、いかなる免疫グロブリンドメインにも由来しないが、ＣＤ２０の細胞外部分との高親和性結合を提供することにより免疫グロブリンＣＤ２０結合領域のように機能する改変されたポリペプチドを含む。この改変されたポリペプチドは、本明細書に記載されているような免疫グロブリン由来の相補性決定領域及び／又は抗原結合領域を含むか又はそれらから本質的になるポリペプチドスキャフォールドを含んでもよい。
本発明の成分として企図される、多数のＣＤ２０結合領域、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１６５８０号明細書に記載されたＣＤ２０結合領域がある。免疫グロブリン型ＣＤ２０結合領域の非限定的例には、モノクローナル抗体及び派生物（例えば、ヒト化バリアント及びｓｃＦｖ）、例えば、１Ｆ５、１Ｈ４、１Ｋ１７９１、２Ｂ８、Ｌｅｕ１６、Ｌｅｕδ、２Ｆ２、２Ｈ７、７Ｄ８、８Ｅ４、１１Ｂ８、ＡＭＥ−１３３ｖ、ＬＹ２４６９２９８、Ｂ９Ｅ９、ＢＭ−ｃａ、Ｃ２Ｂ８、ＣＫＩ、ＧＡ１０１、ＲＯ５０７２７５９、ＬＴ２０、イブリツモマブ、ＨＢ２０−１−２５、ＭＢ２０−１−１８、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、ＰＲＯ７０７６９、オファツムマブ、ＯＵＢＭ１−ＯＵＢＭ８、ＰＲＯ１３１９２１、リツキシマブ、ＴＧＬＡ、トシツモマブ、ＴＲＵ−０１５、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ＩＭＭＵ−１０６、ｈＡ２０、ＣＤ２０結合性フィブロネクチンドメインＦＮ３ＣＤ２０、並びにＨＬ２３−ｓｃＦｖ：ｓｃＦｖ−１、ｓｃＦｖ−３、ｓｃＦｖ−５、及びｓｃＦｖ−８が挙げられる（例えば、Golay J et al., JImmunol 135: 3795-801 (1985)；Tedder T et al., Eur JImmunol
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９５，７２１号明細書；第５，６７７，１８０号明細書；第５，７２１，１０８号明細書；第５，７３６，１３７号明細書；第５，７７６，４５６号明細書；第５，８４３，３９８号明細書；第５，８４９，８９８号明細書；第６，０１５，５４２号明細書；第６，０９０，３６５号明細書；第６，１２０，７６７号明細書；第６，１７１，５８６号明細書；第６，１９４，５５１号明細書；第６，２２４，８６６号明細書；第６，２４２，１９５号明細書；第６，２８７，５３７号明細書；第６，３０６，３９３号明細書；第６，３６８，５９６号明細書；第６，３９９，０６１号明細書；第６，４１０，３９１号明細書；第６，４５５，０４３号明細書；第６，５２８，６２４号明細書；第６，５３８，１２４号明細書；第６，５６５，８２７号明細書；第６，６５２，８５２号明細書；第６，６８２，７３４号明細書；第７，８７９，９８４号明細書；第８，１０１，１７９号明細書；第８，１５３，１２５号明細書；第８，３３７，８４４号明細書；及び特許出願公開 国際公開第１９９５／０３７７０号パンフレット；国際公開第１９９８／５８９６４号パンフレット；国際公開第１９９９／２２７６４号パンフレット；国際公開第２０００／０９１６０号パンフレット；国際公開第２０００／２７４２８号パンフレット；国際公開第２０００／２７４３３号パンフレット；国際公開第２０００／４２０７２号パンフレット；国際公開第２０００／４４７８８号パンフレット；国際公開第２０００／６７７９５号パンフレット；国際公開第２０００／６７７９６号パンフレット；国際公開第２０００／７６５４２号パンフレット；国際公開第２００１／０３７３４号パンフレット；国際公開第２００１／１０４６０号パンフレット；国際公開第２００１／１０４６１号パンフレット；国際公開第２００１／１０４６２号パンフレット；国際公開第２００１／１３９４５号パンフレット；国際公開第２００１／７２３３３号パンフレット；国際公開第２００１／８０８８４号パンフレット；国際公開第２００１／９７８５８号パンフレット；国際公開第２００２／０６０９５５号パンフレット；国際公開第２００２／０７９２５５号パンフレット；国際公開第２００２／０９６９４８号パンフレット；国際公開第２００２／１０２３１２号パンフレット；国際公開第２００３／００２６０７号パンフレット；国際公
開第２００３／０６１６９４号パンフレット；国際公開第２００４／０３２８２８号パンフレット；国際公開第２００５／０００９０１号パンフレット；国際公開第２００５０１６９６９号パンフレット；国際公開第２００６／１０６９５９号パンフレット；国際公開第２００９／０３１２３０号パンフレット；国際公開第２０１４／０７６２９２号パンフレット；米国特許出願公開第２０１１／００９１４８３号明細書；米国特許出願第１２／０９４１，５８３号明細書；国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５８２６号明細書；欧州特許出願第２０１４０１５１９３２号明細書；国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５３２号明細書；米国特許出願第１３／０４８，１３５号明細書；欧州特許出願第２０１４０１５１９３２号明細書；国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５３２号明細書；米国特許出願第１３／０４８，１３５号明細書；国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４６０３４号明細書参照）。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、ヒトＣＤ２０及び／又はＣＤ２０＋細胞の細胞表面との特異的かつ高親和性結合について選択された免疫グロブリン型ポリペプチドを含む結合領域を含む。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、結合領域は、ａ）（ｉ）配列番号１０２、配列番号１０８、配列番号１１４、配列番号１２０、又は配列番号１２４に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＣＤＲ１；（ii）配列番号１０３、配列番号１１５、又は配列番号１２５に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＣＤＲ２；及び（iii）配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１６、配列番号１２
１、又は配列番号１２６に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；並びにｂ）（ｉ）配列番号１０５、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１７、又は配列番号１２７に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＣＤＲ１；（ii）配列番号１０６、配列番号１１８、配列番号１２２、又は配列番号１２８に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＣＤＲ２；及び（iii）配列番号１０７、配列番号１１３
、配列番号１１９、配列番号１２３、又は配列番号１２９に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインからなる群から選択されるポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、配列番号３３、６４、及び６５のいずれか１つのアミノ酸１〜２４５を含むか又はそれから本質的になる。
前述のＣＤ２０結合分子のいずれも、ＣＤ２０結合領域としての使用に適し、又は本発明の細胞標的化分子において使用される１つ若しくは２つ以上のＣＤ２０結合領域を作製するために改変され得る。
３．ヒトＣＤ２２を標的にする細胞標的化分子
当技術分野においてＳｉｇｌｅｃ−２、ＳＩＧＬＥＣ２、ＢＬ−ＣＡＭ、Ｂ３、Ｌｅｕ−１４、及びＬｙｂ−８としても認識されているＣＤ２２は、シアル酸リガンドと結合する、（スプライスフォーム（spliceoform）に依存して）約１２０〜１４０ｋＤａの膜貫
通糖タンパク質である。ＣＤ２２は、発達中のＢ細胞、及び成熟Ｂ細胞の特定のサブセットによって特異的に発現する。ＣＤ２２という名前は、様々な種由来の関連した構造及びポリペプチド配列を有する複数のタンパク質を指し得るが、このセクションの構造例を示すことを目的として、用語「ＣＤ２２」は、正確な配列がアイソフォームに基づいて、及び個体間でわずかに異なり得る、ヒトに存在するシアル酸結合性レクチンタンパク質を指す。ヒトに関しては、ＣＤ２２は、主なポリペプチド配列ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ２０２７３及びＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００１２６５３４６．１によって表されるタンパク質を指す；しかしながら、スプライシング、多型性、及び／又は変異により異なるアイソフォーム及びバリアントが存在する（例えば、Hitomi Y et al.,Tissue Antigens 69: 242-9 (2007)；Dawidowicz K et al., Clin Exp Rheumatol 29: 839-42(2011)参照）。熟練
した作業者は、たとえ参照された配列とは異なる場合でさえも、ヒトにおいて他のＣＤ２２タンパク質を同定することができるだろう。
Ｂ細胞特異的マーカーとして、ＣＤ２２は、Ｂ細胞に関わる疾患及び状態、例えば、過敏性Ｂ細胞を含む状態、Ｂ細胞集団の上昇、Ｂ細胞媒介性自己免疫疾患、白血病、及びリンパ腫を含む状態についての細胞標的化治療のための魅力的な標的である（例えば、Nitschke L,Glycobiology 24: 807-17 (2014)参照）。さらに、ＣＤ２２は、様々な悪性Ｂ細胞、例えば、Ｂ細胞新生物（それについて、分析されている大部分が細胞表面ＣＤ２２を発現した）によって過剰発現し得る。
本発明の細胞標的化分子を作製するために本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドと会合し得る、熟練した作業者に公知の多数のＣＤ２２結合領域がある。本発明を目的として、用語「ＣＤ２２結合領域」は、例えば、１０−５〜１０−１２モル／リットルのＣＤ２２に関する解離定数を有するなどの高親和性でＣＤ２２分子の細胞外部分と特異的に結合する能力がある分子部分（例えば、タンパク質性分子）又は作用物質を指す。本明細書で用いられる場合、ＣＤ２結合は、ヒトＣＤ２２のアイソフォーム又はバリアントの細胞外部分と結合する能力を指す。
ある特定の実施形態において、ＣＤ２２結合領域は、免疫グロブリン型結合領域である。ある特定の実施形態において、免疫グロブリン型ＣＤ２２結合領域は、ＣＤ２２の細胞外部分と結合する能力がある抗体パラトープなどの、免疫グロブリンＣＤ２２結合領域に由来する。ある特定の他の実施形態において、免疫グロブリン型ＣＤ２２結合領域は、いかなる免疫グロブリンドメインにも由来しないが、ＣＤ２２の細胞外部分との高親和性結合を提供することにより免疫グロブリンＣＤ２２結合領域のように機能する改変されたポリペプチドを含む。この改変されたポリペプチドは、本明細書に記載されているような免疫グロブリン由来の相補性決定領域及び／又は抗原結合領域を含むか又はそれらから本質的になるポリペプチドスキャフォールドを含んでもよい。
本発明の成分として企図される、多数のＣＤ２２結合領域がある。免疫グロブリン型ＣＤ２２結合領域の非限定的例には、ＣＤ２２結合性モノクローナル抗体、及びヒト化バリアント及び組換え免疫グロブリンドメインなどの、それらの派生物、例えば、ＲＦＢ４、アルファＳ−ＨＣＬ−１（アルファＬｅｕ−１４）、ＨＤ３９、Ｔｏ１５、４ＫＢ１２８、ＨＤ３７、ＥＰＢ、ＨＤ６、ＬＬ２、ＨＡ２２−ＬＲ、ＨＢ２２．７、Ｈｕ１０Ｆ４（ＭＣＤＴ２２１９Ａ又はピナツズマブ）、エプラツズマブ、イノツズマブ、ＣＡＴ−３８８８（ＢＬ２２）、ＣＡＴ−８０１５（モキセツモマブ）、及びｓｃＦｖ−４ＫＢ１２８が挙げられる（例えば、Campana D et al., J Immunol 134: 1524-30 (1985)；Schwarting R etal., Blood 65: 974-83 (1985)；Dorken B et al., J Immunol 136: 4470-9 (1986)；MasonD et al., Blood 69: 836-40 (1987)；Ghetie M et al., Cancer Res 48: 2610-7 (1988)；Pawlak-Byczkowska E et al., Cancer Res 49: 4568-77 (1989)；Press O et al., Cancer Res 49: 4906-12 (1989)；Stein R et al., Cancer Immunol Immunother37: 293-8 (1993)；Leung S et al., Hybridoma 13: 469-76(1994)；国際公開第１９９
４／０２７６３８号パンフレット；Leung S et al., Mol Immunol 32: 1413-27(1995)；国際公開第１９９８／０４１６４１号パンフレット；国際公開第２０００／０７４７１８号パンフレット；ColemanM et al., Clin Cancer Res 9: 3991S-4S (2003)；国際公開第２００３／０２７１３５号パンフレット；国際公開第２００３／０７２０３６号パンフレット；Arndt M et al., FEBS Lett 578: 257-61 (2004)；Furman et al., Curr Treat Options Oncol 5:283-8 (2004)；国際公開第２００５／０１２４９３号パンフレット；Ho M et al., ProcNatl Acad Sci USA 103: 9637-42 (2006)；米国特許第７，０７４，４０３号明細書；国際公開第２００８／０７０５６９号パンフレット；O'Donnell et al., Caner Immunol Immunother58: 1715-22 (2009)；Mussai Et al., Br J Haematol 150: 352
-8 (2010)；Polson A et al., Leukemia 24: 1566-73 (2010)；Wayne et al., Clin Cancer Res 16: 1894-903 (2010)；Wong et al., Expert Opin Biol Ther 10: 1251-8 (2010)；米国特許出願公開第２０１４０２４８２７８号明細書；ＪＰ２０１５１８４０４参照）。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、ヒトＣＤ２２及び／又はＣＤ２２＋細胞の細胞表面との特異的かつ高親和性結合について選択された免疫グロブリン型ポリペプチドを含む結合領域を含む。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、結合領域は、ａ）（ｉ）配列番号１３０、配列番号１３６、配列番号１４２、又は配列番号１４８に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ１；（ii）配列番号１３１、配列番号１３７、配列番号１４３、又は配列番号１４９に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ２；及び（iii）配列番号１３２、配列番号１３８、配列番号１４４、又は配列番号１５０に示される
アミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；並びにｂ）（ｉ）配列番号１３３、配列番号１３９、配列番号１４５、又は配列番号１５１に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＡＢＲ１；（ii）配列番号１３４、配列番号１４０、配列番号１４６、又は配列番号１５２に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＡＢＲ２；及び（iii
）配列番号１３５、配列番号１４１、配列番号１４７、又は配列番号１５３に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＡＢＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインからなる群から選択されるポリペプチドを含む。或いは、結合領域は、ＣＤＲによって記載され得、そのＣＤＲは、ＡＢＲと大部分、オーバーラップし、配列番号１５４〜１６５に記載されている。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、配列番号４０又は８０のアミノ酸２６９〜５１３を含むか又はそれらから本質的になる。
１つの特定の、しかし、非限定的な態様によれば、本発明の細胞標的化分子の結合領域は、ＣＤ２２との結合機能性を保持する（天然に存在するか、合成であるかに関わらず）リガンド又はその派生物、例えば、シアル酸、シアル酸含有複合糖質、及び可溶性Ｍ型免疫グロブリン（ＩｇＭ，type-M immunoglobulin）のドメインを含む（例えば、Bakker Tet al., Eur J Immunol 32: 1924-32 (2002)；Chen W et al.,Blood 115: 4778-86 (2010)；Chen W et al., Leuk Lymphoma 53: 208-10 (2012)；SchweizerA et al., Eur J Immunol 42: 2792-802 (2012)参照）。高結合親和性を有する合成ＣＤ２２リガンドが設計
されており、細胞標的化に用いることができる（例えば、Razi N, Varki A et al., Proc
Natl Acad Sci USA 95: 7469-74 (1998)；Sliedregt L etal., Bioorg Med Chem 9: 85-97 (2001)；van Rossenberg S et al., J Biol Chem 276:12967-73 (2001)；Kelm S et
al., J Exp Med 195: 1207-13 (2002)；Collins B et al., JImmunol 177: 2994-3003 (2006)；Yu J et al., Biochem Biophys Res Commun 360: 759-64 (2007)；Abdu-AllahH
et al., J Med Chem 51: 6665-81 (2008)；O’Reilly M et al., J Am Chem Soc 130: 7736-45 (2008)；Abdu-Allah H et al., Bioorg Med Chem Lett19: 5573-5 (2009)；Chen
W et al., Blood 115: 4778-86 (2010)；Lepenies B et al., Curr OpinChem Biol 14:
404-11 (2010)；Abdu-Allah H et al., BioorgMed Chem 19: 1966-71 (2011)；Chen W et al., Leuk Lymphoma 53: 208-10 (2012)；Mesch S et al., ChemMedChem7: 134-43 (2012)；Kelm S et al., Angew Chem Int Ed Engl 52: 3616-20 (2013)；Macauley Met al., J Clin Invest 123: 3074-83 (2013)；Preshcer H et al., ACS Chem Biol 9:1444-50 (2014)参照）。
前述のＣＤ２２結合分子のいずれも、ＣＤ２２結合領域としての使用に適し、又は本発明の細胞標的化分子において使用される１つ若しくは２つ以上のＣＤ２２結合領域を作製するために改変され得る。
４．ヒトＣＤ３０を標的にする細胞標的化分子
当技術分野において腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー８（ＴＮＦＲＳＦ８，tumor necrosisfactor receptor superfamily 8）又はＫｉ−１／１２０としても認識されている、ＣＤ３０は、約９０〜１２０ｋＤａのサイズのＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ３０は、腫瘍壊死因子受容体ファミリーの細胞表面受容体（又は共受容体）として機能し、リガンドＣＤ３０Ｌと結合する。ＣＤ３０抗原は、ホジキン病を有する患者に存在する古典的ホジキンリンパ腫及びリード・シュテルンベルク細胞のマーカーとして最初、記載され（Schwab U et al., Nature 299: 65-7 (1982)；SteinH et al., Int J Cancer 30: 445-459 (1982)）、ＣＤ３０抗原は、後で、非ホジキンリンパ腫細胞上に観察された
（例えば、Stein H et al., Blood 66: 848-58 (1985)参照）。ＣＤ３０という名前は、
様々な種由来の関連した構造及びポリペプチド配列を有する複数のタンパク質を指し得るが、このセクションの構造例を示すことを目的として、用語「ＣＤ３０」は、正確な配列がアイソフォームに基づいて、及び個体間でわずかに異なり得る、ヒトに存在する腫瘍壊死因子受容体タンパク質を指す。ヒトに関しては、ＣＤ３０は、主なポリペプチド配列ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ２８９０８及びＮＣＢＩアクセッションＡＡＡ５１９４７．１によって表されるタンパク質を指す；しかしながら、スプライシング、多型性、及び／又は変異により異なるアイソフォーム及びバリアントが存在し得る。熟練した作業者は、たとえ参照された配列とは異なる場合でさえも、ヒトにおいて他のＣＤ３０タンパク質を同定することができるだろう。
ＣＤ３０は、例えば、それの発現が、活性化された及び／又は増殖性のリンパ球、並びに悪性細胞に大部分、制限されるため、細胞標的化治療のための魅力的な標的である。正常又は炎症性組織において、ＣＤ３０発現は、中型／大型の活性化Ｂ細胞及び／又は、Ｔｈ２型サイトカインを産生する活性化Ｔ細胞に大部分、制限される（Chiarle R et al.,Clin Immunol 90: 157-64 (1990)；Werner B et al., J Cutan Pathol 35: 1100-7 (2008)；Buchan S, Al-Shamkhani A, PLoS One 7:e45244 (2012)）。ＣＤ３０は、ある特定の細胞型、例えば、ある特定のリンパ腫細胞、他の悪性リンパ系細胞、及び非リンパ系腫瘍細胞により高度に発現するが、健康な細胞の限られたサブセットのみが、より低いレベルでＣＤ３０を発現する（Deutsch Y et al., Leuk Lymphoma 52:1641-54 (2011)）。ＣＤ３０は、リンパ球増殖性障害、リンパ系新生物、及び骨髄系新生物に関与する細胞によって発現する。例えば、ＣＤ３０は、バーキットの未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ，anaplastic large-cell lymphoma）細胞、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫細胞7、結節
性小切れ込み核細胞型リンパ腫細胞、リンパ球性リンパ腫細胞、末梢性Ｔ細胞性リンパ腫細胞、レンネルトリンパ腫細胞、免疫芽球性リンパ腫細胞、成人Ｔ細胞性白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ，adult T-cell leukemia/lymphoma）細胞、成人Ｔ細胞性白血病（ＡＴＬ，adult T-cell leukemia）、中心芽細胞性中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ，centroblastic/centrocytic）濾胞性リンパ腫細胞、及びリンパ腫様丘疹症細胞を含む非ホジキンリンパ腫のサブセット上に発現する（例えば、Stein H et al., Blood 66: 848-58 (1985)；Steinet al., Neoplastic Hematophathology, pg 675, (Baltimore, Williams & Wilkins, Knowles D, ed.)(1985)；Stein H et al., Pathology of Cells Receptors andTumor Markers, pg 121 (Stuttgart, Gustav FischerVerlag, Sefert G, Hubner K(eds) (1987)；Suchi T et al., J Clin Pathol 40: 995 (1987)；Eckert F et al., Am J Dermatopathol 11:345-52 (1989)；Moller P et al., Am J Clin Pathol 91: 18-23 (1989)；Burns B, Dardick I, Am J Clin Pathol 93:327-32 (1990)；Piris M et al., Histopathology 17:
211-8 (1990)；Miettinen M, Arch PatholLab Med 116: 1197-201 (1992)；Norduyn L et al., J Clin Pathol 47: 33-7 (1994)；Sabattini E etal., Haematologica 98: e8 1-2 (2013)参照）。ＣＤ３０発現は、胚性癌腫、非胚性癌腫、悪性黒色腫、間葉系腫瘍、並びに分化の後期における骨髄系細胞株及びマクロファージにおいて観察されている（例えば、Andreesen R et al., Blood 63: 1299-1302 (1984)；Schaadt M et al.,Int Rev Exp Pathol 27: 185-202 (1985)；Stein H et al., Haematol Blood Transfus 29: 441-4
(1985)；Froese P et al., J Immunol 139: 2081-7 (1987)；Pallesen G,Hamilton-Dutoit S, Am J Pathol133: 446-50 (1988)；Andreesen R et al., Am J Pathol 134: 187-92 (1989)；Hansen Het al., Biol Chem Hoppe-Seyler 370: 409-16 (1989)；Schwarting R etal., Blood 74: 1678-89 (1989)；Mechtersheimer G, Moller P, Cancer 66: 1732-7 (1990)；Pallesen G, Histopathology 16: 409-13(1990)；Durkop H et al., Cell 68: 421-7 (1992)；Latza U et al., Am J Pathol 146: 463-71 (1995)参照）。ＣＤ３０発現は、進行性新生物、例えば、肥満細胞症及び全身性肥満細胞症に関与する新生物の腫瘍性肥満細胞によって上方制御されるように思われる（例えば、Soltar K et al.,Mod Pathol 24: 585-95 (2011)；ValentP et al., Leuk Lymphoma 52: 740-4 (2011)参照）。ＣＤ３０発現はまた、様々な自己免疫疾患及び炎症性疾患、例えば、リンパ系新生物、骨髄系新生物、アトピー性アレルギー（アトピー性皮膚炎、アトピー性喘息、鼻結膜炎、アレルギー性鼻炎）、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症（強皮症）、移植片対宿主病、ＨＩＶ感染症、エプスタイン・バーウイルス感染症、麻疹、伝染性単核球症、オーメン症候群、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、橋本甲状腺炎、原発性胆汁性肝硬変、シェーグレン症候群、トキソプラズマ症、ウェゲナー肉芽腫症、及び結核において増加することが報告されている（例えば、Ralfkiaer E etal., Arch Dermatol Res 279: 28-292 (1987)；Romagnani S et al., J Leukocyte Biol57: 726-30 (1995)；Gruss H et al., Immunol Today 18: 156-63 (1997)；Horie R, Watababe T, Semin Immunol 10: 457-70 (1998)；Bengtsson A, Allergy 561: 593-603 (2001)；Gerli R et al., Trends Immunol 22:72-7 (2001)参照）。ＣＤ３０発現は、肥満細胞症についてのマーカー
である（例えば、Maric J, Calvo K, Leuk Lymphoma 52: 732-3(2011)参照）。
本発明の細胞標的化分子を作製するために本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドと会合し得る、熟練した作業者に公知の多数のＣＤ３０結合領域がある。本発明を目的として、用語「ＣＤ３０結合領域」は、例えば、１０−５〜１０−１２モル／リットルのＣＤ３０に関する解離定数を有するなどの高親和性でＣＤ３０分子の細胞外部分と特異的に結合する能力がある分子部分（例えば、タンパク質性分子）又は作用物質を指す。本明細書で用いられる場合、ＣＤ３０結合は、ヒトＣＤ３０のアイソフォーム又はバリアントの細胞外部分と結合する能力を指す。
ある特定の実施形態において、ＣＤ３０結合領域は、免疫グロブリン型結合領域である。ある特定の実施形態において、免疫グロブリン型ＣＤ３０結合領域は、ＣＤ３０の細胞外部分と結合する能力がある抗体パラトープなどの、免疫グロブリンＣＤ３０結合領域に由来する。ある特定の他の実施形態において、免疫グロブリン型ＣＤ３０結合領域は、いかなる免疫グロブリンドメインにも由来しないが、ＣＤ３０の細胞外部分との高親和性結合を提供することにより免疫グロブリンＣＤ３０結合領域のように機能する改変されたポリペプチドを含む。この改変されたポリペプチドは、本明細書に記載されているような免疫グロブリン由来の相補性決定領域及び／又は抗原結合領域を含むか又はそれらから本質的になるポリペプチドスキャフォールドを含んでもよい。
本発明の成分として企図される、多数のＣＤ３０結合領域がある。免疫グロブリン型ＣＤ３０結合領域の非限定的例には、ＣＤ３０結合性モノクローナル抗体、及びヒト化バリアント及び組換え免疫グロブリンドメインなどの、それらの派生物、例えば、Ｋｉ−１、ＨｅＦｉ−１、Ｂｅｒ−Ｈ２、Ｂｅｒ−Ｈ４、Ｂｅｒ−Ｈ６、Ｂｅｒ−Ｈ８、Ｂｅｒ−Ｈ１０、ＨＲＳ−１、ＨＲＳ−３、ＨＲＳ−４、ＡＣ１０、Ｃ１０、Ｋｉ−２、Ｋｉ−３、Ｋｉ−４、Ｋｉ−５、Ｋｉ−６、Ｋｉ−７、Ｍ４４、Ｍ６７、ｓｃＦｖ−Ｋｉ−４、ｓｃＦｖ ４Ｅ３、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ１３、Ｔ１４、Ｔ２１、Ｔ２４、Ｔ２５、Ｔ１０４、Ｔ１０５、Ｔ１０７、Ｔ１１２、Ｔ２０１、Ｔ２１４、Ｔ２１５、Ｔ４０５、Ｔ４０６、Ｔ４０８、Ｔ４１１、Ｔ４２０、Ｔ４２６、Ｔ４２７が挙げられる（例えば、Schwab U et al., Nature 299: 65-7 (1982)；HechtT et al., J Immunol 134: 4231-6 (1985)；Schwar
ting R et al., Issue Sections. In: J. A. McMichael (ed.). Leucocyte Typing 3:574-75. Oxford: Oxford University Press, (1987)；Schwarting R et al., Leucocyte TypingIV: 419-22. Oxford, UK, Oxford University (1989)；BowenM et al., J Immunol 151: 5896-906 (1993)；Gruss H et al., Blood 83: 2045-56(1994)；Horn-Lohrens
O et al., Int J Cancer 60: 539-44 (1995)；国際公開第１９９６／０２２３８４号パ
ンフレット；Barth S et al., Blood 95: 3909-14 (2000)；Klimka A et al.,Br J Cancer 83: 252-60 (2000)；国際公開第２００２／０４３６６１号パンフレット；国際公開第２００３／０５９２８２号パンフレット；米国特許出願公開第２００４／０１８１９４号明細書；国際公開第２００５／００１０３８号パンフレット；国際公開第２００７／０４０６５３号パンフレット；国際公開第２００８／０２５０２０号パンフレット；国際公開第２０１５／０２８４４４号パンフレット参照）。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、ヒトＣＤ３０及び／又はＣＤ３０＋細胞の細胞表面との特異的かつ高親和性結合について選択された免疫グロブリン型ポリペプチドを含む結合領域を含む。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、結合領域は、ａ）（ｉ）配列番号１６６、配列番号１７２、配列番号１７８、又は配列番号１８４に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ１；（ii）配列番号１６７、配列番号１７３、配列番号１７９、又は配列番号１８５に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ２；及び（iii）配列番号１６８、配列番号１７４、又は配列番号１８０に示されるアミノ酸配列の１
つを含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；並びにｂ）（ｉ）配列番号１６９、配列番号１７５、配列番号１８１、又は配列番号１８６に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＡＢＲ１；（ii）配列番号１７０、配列番号１７６、配列番号１８２、又は配列番号１８７に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＡＢＲ２；及び（iii）配列番号１７１
、配列番号１７７、配列番号１８３、又は配列番号１８８に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＡＢＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインからなる群から選択されるポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、配列番号４５２、４７２、４８７、及び５０３のいずれか１つのアミノ酸２６８〜５００を含むか又はそれらから本質的になる結合領域を含む。
１つの特定の、しかし、非限定的な態様によれば、本発明の細胞標的化分子の結合領域は、ＣＤ３０の細胞外部分との結合機能性を保持する（天然に存在するか、合成であるかに関わらず）リガンド又はその派生物を含む（例えば、Powell I et al., J Leukoc Biol
63: 752-7 (1998)；Gruss H et al., Eur J Immunol 25: 2083 (1995)；Gattei V et al., LeukLymphoma 35: 21-35 (1999)；Zhang P et al., Lab Invest89: 1423-32 (2009)；Parekh P et al., Biomaterials 34:8909-17 (2013)；Shinoda K et al., J Autoimmun57: 14-23 (2015)；国際公開第１９９３／０２４１３５号パンフレット参照）。
前述のＣＤ３０結合分子のいずれも、ＣＤ３０結合領域としての使用に適し、又は本発明の細胞標的化分子において使用される１つ若しくは２つ以上のＣＤ３０結合領域を作製するために改変され得る。
５．ヒトＣＤ３８を標的にする細胞標的化分子
ＣＤ３８は、細胞表面受容体と、細胞外サイクリックＡＤＰリボースヒドロラーゼ（ＡＤＰリボシラーゼ）の両方として特徴づけられる膜貫通タンパク質である。ＣＤ３８という名前は、様々な種由来の関連した構造及びポリペプチド配列を有する複数のタンパク質を指し得るが、このセクションの構造例を示すことを目的として、用語「ＣＤ３８」は、正確な配列がアイソフォームに基づいて、及び個体間でわずかに異なり得る、ヒトに存在するサイクリックＡＤＰリボースヒドロラーゼタンパク質を指す。ヒトに関しては、ＣＤ
３８は、主なポリペプチド配列ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ２８９０７及びＮＣＢＩアクセッションＢＡＡ１８９６４によって表されるタンパク質を指す；しかしながら、スプライシング、多型性、及び／又は変異により異なるアイソフォーム及びバリアントが存在し得る（例えば、Ferrero E et al., Immunogenetics 49: 597-604 (1999)；Gonzalez-Escribano M et al., Hum Immunol65: 660-664 (2004)；Drummond F et al., J Bone Miner Metab 24: 28-35 (2006)；Aydin S etal., Blood 111: 5646-53 (2008)；国際公開第２００６／
０９９８７５号パンフレット参照）。熟練した作業者は、たとえ参照された配列とは異なる場合でさえも、ヒトにおいて他のＣＤ３８タンパク質を同定することができるだろう。
本発明の細胞標的化分子を作製するために本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドと会合し得る、熟練した作業者に公知の多数のＣＤ３８結合領域がある。本発明を目的として、用語「ＣＤ３８結合領域」は、例えば、１０−５〜１０−１２モル／リットルのＣＤ３８に関する解離定数を有するなどの高親和性でＣＤ３８分子の細胞外部分と特異的に結合する能力がある分子部分（例えば、タンパク質性分子）又は作用物質を指す。本明細書で用いられる場合、ＣＤ３８結合は、ヒトＣＤ３８のアイソフォーム又はバリアントの細胞外部分と結合する能力を指す。
ある特定の実施形態において、ＣＤ３８結合領域は、免疫グロブリン型結合領域である。ある特定の実施形態において、免疫グロブリン型ＣＤ３８結合領域は、ＣＤ３８の細胞外部分と結合する能力がある抗体パラトープなどの、免疫グロブリンＣＤ３８結合領域に由来する。ある特定の他の実施形態において、免疫グロブリン型ＣＤ３８結合領域は、いかなる免疫グロブリンドメインにも由来しないが、ＣＤ３８の細胞外部分との高親和性結合を提供することにより免疫グロブリンＣＤ３８結合領域のように機能する改変されたポリペプチドを含む。この改変されたポリペプチドは、本明細書に記載されているような免疫グロブリン由来の相補性決定領域及び／又は抗原結合領域を含むか又はそれらから本質的になるポリペプチドスキャフォールドを含んでもよい。
本発明の成分として企図される、多数のＣＤ３８結合領域がある。免疫グロブリン型ＣＤ３８結合領域の非限定的例には、ＣＤ３８結合性モノクローナル抗体、並びにｓｃＦｖ、例えば、ダラツムマブ、イサツキシマブ、及びＭＯＲ２０２が挙げられる（例えば、Deaglio S et al.,Trends Mol Med 14: 210-8 (2008)；van de Donk N et al., Immunol Rev 270: 95-112 (2016)；国際公開第１９９６／０１６９９０号パンフレット；国際公開
第２００２／００６３４７号パンフレット；国際公開第２００５／１０３０８３号パンフレット；国際公開第２００８／０４７２４２号パンフレット；国際公開第２０１２／０９２６１２号パンフレット；国際公開第２０１２／０９２６１６号パンフレット；米国特許出願公開第２００２０１６４７８８号明細書；米国特許出願公開第２０１００２８５００４号明細書；米国特許出願公開第２０１５０１１８２５１号明細書参照）。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、ヒトＣＤ３８及び／又はＣＤ３８＋細胞の細胞表面との特異的かつ高親和性結合について選択された免疫グロブリン型ポリペプチドを含む結合領域を含む。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、結合領域は、ａ）（ｉ）配列番号１８９、配列番号１９５、配列番号２０１、配列番号２０７、配列番号２１３、又は配列番号２１９に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ１；（ii）配列番号１９０、配列番号１９６、配列番号２０２、配列番号２０８、配列番号２１４、又は配列番号２２０に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ２；及び（iii）配列番号１９
１、配列番号１９７、配列番号２０３、配列番号２０９、配列番号２１５、又は配列番号２２１に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；並びにｂ）（ｉ）配列番号１９２、配列番号１９８、配列番号２０４、配列番号２１０、配列番号２１６、又は配列番号２２２に示されるアミノ酸
配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＡＢＲ１；（ii）配列番号１９３、配列番号１９９、配列番号２０５、配列番号２１１、配列番号２１７、又は配列番号２２３に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＡＢＲ２；及び（iii
）配列番号１９４、配列番号２００、配列番号２０６、配列番号２１２、配列番号２１８、又は配列番号２２４に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＡＢＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインからなる群から選択されるポリペプチドを含む。或いは、結合領域は、ＣＤＲによって記載され得、そのＣＤＲは、ＡＢＲと大部分、オーバーラップし、配列番号２２５〜２４２に記載されている。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、配列番号３４、３５、４１〜５６、及び８２のいずれか１つのアミノ酸２６９〜４９９、２６９〜５１２、２６９〜５１３、又は２８０〜５１０を含むか又はそれらから本質的になる。
天然のＣＤ３８リガンド又はその派生物が、本発明の細胞標的化分子の結合領域として利用され得る。天然ＣＤ３８は、少なくとも１つのリガンドＣＤ３８Ｌ（血小板内皮細胞接着分子１（ＰＥＣＡＭ１，platelet endothelial cell adhesion molecule 1）又はＣ
Ｄ３１としても知られたＩｇタンパク質）と結合することが知られている（Cesano A et al., J Immunol 160: 1106-15 (1998)；Deaglio S et al., J Immunol 160:395-402 (1998)）。ＣＤ３８又はその派生物と相互作用するＣＤ３１又はＣＤ３１の部分を、本発明
の志賀毒素エフェクターポリペプチドと融合させて、ＣＤ３８の細胞外部分と結合するＣＤ３８標的化の細胞標的化分子を構築し得る。
前述のＣＤ３８結合分子のいずれも、ＣＤ３８結合領域としての使用に適し、又は本発明の細胞標的化分子において使用される１つ若しくは２つ以上のＣＤ３８結合領域を作製するために改変され得る。
６．ヒトＣＤ４５を標的にする細胞標的化分子
当技術分野においてＰＴＰＲＣ（タンパク質チロシンホスファターゼ，受容体型，Ｃ，proteintyrosine phosphatase, receptor type, C）及び白血球共通抗原（ＬＣＡ，leukocytecommon antigen）としても認識されているＣＤ４５は、多くの分化型造血系細胞、特に、悪性血液学的細胞、例えば、リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ，B-cell chronic lymphocytic leukemia）、有毛細胞性白血病、及び急性非リンパ球性
白血病（ＡＭＬ，acute nonlymphocytic leukemia）細胞の細胞表面上に発現するＩ型膜
貫通タンパク質チロシンホスファターゼである。ＣＤ４５という名前は、様々な種由来の関連した構造及びポリペプチド配列を有する複数のタンパク質を指し得るが、このセクションの構造例を示すことを目的として、用語「ＣＤ４５」は、正確な配列がアイソフォームに基づいて、及び個体間でわずかに異なり得る、ヒトに存在するタンパク質チロシンホスファターゼタンパク質を指す。ヒトに関しては、ＣＤ４５は、主なポリペプチド配列ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ６ＱＩＱ５、及び、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿５６３５７８．２又はＮＰ＿００２８２９．３によって表されるタンパク質を指す；しかしながら、スプライシング、多型性、及び／又は変異により異なるアイソフォーム及びバリアントが存在する（例えば、Motta-Mena L et al., J Biol Chem 286: 20043-53 (2011)；Marme F
et al., Breast Cancer Res Treat 132: 819-31 (2012)；Pokoyski C et al., Genes Immun 16: 519-27 (2015)参照）。熟練した作業者は、たとえ参照された配列とは異なる場
合でさえも、ヒトにおいて他のＣＤ４５タンパク質を同定することができるだろう。
本発明の細胞標的化分子を作製するために本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドと会合し得る、熟練した作業者に公知の多数のＣＤ４５結合領域がある。本発明を目的として、用語「ＣＤ４５結合領域」は、例えば、１０−５〜１０−１２モル／リットルのＣＤ４５に関する解離定数を有するなどの高親和性でＣＤ４５分子の細胞外部分と特異的に結合する能力がある分子部分（例えば、タンパク質性分子）又は作用物質を指す。本明細
書で用いられる場合、ＣＤ４５結合は、ヒトＣＤ４５のアイソフォーム又はバリアントの細胞外部分と結合する能力を指す。
ある特定の実施形態において、ＣＤ４５結合領域は、免疫グロブリン型結合領域である。ある特定の実施形態において、免疫グロブリン型ＣＤ４５結合領域は、ＣＤ４５の細胞外部分と結合する能力がある抗体パラトープなどの、免疫グロブリンＣＤ４５結合領域に由来する。ある特定の他の実施形態において、免疫グロブリン型ＣＤ４５結合領域は、いかなる免疫グロブリンドメインにも由来しないが、ＣＤ４５の細胞外部分との高親和性結合を提供することにより免疫グロブリンＣＤ４５結合領域のように機能する改変されたポリペプチドを含む。この改変されたポリペプチドは、本明細書に記載される免疫グロブリン由来の相補性決定領域及び／又は抗原結合領域を含むか又はそれらから本質的になるポリペプチドスキャフォールドを含んでもよい。
本発明の成分として企図される、多数のＣＤ４５結合領域がある。免疫グロブリン型ＣＤ４５結合領域の非限定的例には、ＣＤ４５結合性モノクローナル抗体及びｓｃＦｖ、例えば、抗ＣＤ４５ＲＢが挙げられる（例えば、Luke P et al., Curr Mol Med 1: 533-43(2001)；Lin Y et al., Cancer Res 66: 3884-92 (2006)参照）。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、ヒトＣＤ４５及び／又はＣＤ４５＋細胞の細胞表面との特異的かつ高親和性結合について選択された免疫グロブリン型ポリペプチドを含む結合領域を含む。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、結合領域は、ａ）（ｉ）配列番号２４３、配列番号２４９、又は配列番号２５５に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ１；（ii）配列番号２４４、配列番号２５０、又は配列番号２５６に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ２；及び（iii）配列番号２４５、配列番号２５
１、又は配列番号２５７に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；並びにｂ）（ｉ）配列番号２４６、配列番号２５２、又は配列番号２５８に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＡＢＲ１；（ii）配列番号２４７、配列番号２５３、又は配列番号２５９に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＡＢＲ２；及び（iii
）配列番号２４８、配列番号２５４、又は配列番号２６０に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＡＢＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインからなる群から選択されるポリペプチドを含む。
前述のＣＤ４５結合分子のいずれも、ＣＤ４５結合領域としての使用に適し、又は本発明の細胞標的化分子において使用される１つ若しくは２つ以上のＣＤ４５結合領域を作製するために改変され得る。
７．ヒトＨＥＲ２を標的にする細胞標的化分子
当技術分野において受容体型チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ−２としても認識されている、ＨＥＲ２は、細胞増殖及びアポトーシスの細胞内制御因子へ細胞膜を通してシグナルを伝達するための細胞表面受容体として機能する膜貫通タンパク質である。ＨＥＲ２はまた、当技術分野において、Ｎｅｕ、ｅｒｂＢ−２、ｐ１８５、ＣＤ３４０、ＮＧＬ、及びＨＥＲ２／ｎｅｕとして認識されている（Coussens L et al.,Science 230: 1132-39 (1985)；King C et al., Science 229:974-6 (1985)；Semba K et al., Proc Natl Acad Sci USA 82: 6497-501 (1985)；YamamotoT et al., Nature 319:230-234 (1986)；Kokai Y et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:5389-93 (1988)；Disis M et al., Cancer Res 54: 16-20 (1994)；YoshinoI et al., J Immunol 152: 2393-400 (1994)、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０３３６３；Ｍ１７７３０；ＮＭ＿００４４４８；ＳＥＧ＿ＨＵＭＨＥＲ２０参照）。ＨＥＲ２という名前は、様々な種由来の関連した構
造及びポリペプチド配列を有する複数のタンパク質を指し得るが、このセクションの構造例を示すことを目的として、用語「ＨＥＲ２」は、正確な配列がアイソフォームに基づいて、及び個体間でわずかに異なり得る、ヒトに存在する上皮増殖因子受容体タンパク質を指す。例えば、ＨＥＲ２は、例示的なポリペプチド配列ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０４６２６、並びにＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００４４３９．２、ＮＰ＿００１００５８６２．１、ＮＰ＿００１２７６８６５．１、ＮＰ＿００１２７６８６６．１、及びＮＰ＿００１２７６８６７．１によって表されるヒトタンパク質を指す；しかしながら、スプライシング、多型性、及び／又は変異により異なるアイソフォーム及びバリアントが存在する（例えば、Siddig A et al.,Ann N Y Acad Sci 1138: 84-94 (2008)；Poole E et al., Int J Mol Epidemiol Genet 2: 300-15 (2011)；国際公開第２０００／０２０５７９号パンフレット参照）。熟練した作業者は、たとえ参照された配列とは異なる場合でさえも、ヒトにおいて他のＨＥＲ２タンパク質を同定することができるだろう。
ＨＥＲ２は、多くのがん細胞、著しくは、乳がん細胞によって過剰発現し、それの過剰発現は、転移の増加、疾患再発の増加、及び予後不良と強く関連づけられる（例えば、Slamon D et al.,Science 235: 177-82 (1987)参照）。
本発明の細胞標的化分子を作製するために本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドと会合し得る、熟練した作業者に公知の多数のＨＥＲ２結合領域がある。本発明を目的として、用語「ＨＥＲ２結合領域」は、例えば、１０−５〜１０−１２モル／リットルのＣＤ２０に関する解離定数を有するなどの高親和性でＨＥＲ２分子の細胞外部分と特異的に結合する能力がある分子部分（例えば、タンパク質性分子）又は作用物質を指す。本明細書で用いられる場合、ＨＥＲ２結合は、ヒトＨＥＲ２のアイソフォーム又はバリアントの細胞外部分と結合する能力を指す。
ある特定の実施形態において、ＨＥＲ２結合領域は、免疫グロブリン型結合領域である。ある特定の実施形態において、免疫グロブリン型ＨＥＲ２結合領域は、ＨＥＲ２の細胞外部分と結合する能力がある抗体パラトープなどの、免疫グロブリンＨＥＲ２結合領域に由来する。ある特定の他の実施形態において、免疫グロブリン型ＨＥＲ２結合領域は、いかなる免疫グロブリンドメインにも由来しないが、ＨＥＲ２の細胞外部分との高親和性結合を提供することにより免疫グロブリンＨＥＲ２結合領域のように機能する改変されたポリペプチドを含む。この改変されたポリペプチドは、本明細書に記載される免疫グロブリン由来の相補性決定領域及び／又は抗原結合領域を含むか又はそれらから本質的になるポリペプチドスキャフォールドを含んでもよい。
本発明の成分として企図される、多数のＨＥＲ２結合領域がある。免疫グロブリン型ＨＥＲ２結合領域の非限定的例には、ＨＥＲ２結合性モノクローナル抗体並びにその派生物、例えば、抗ＥｒｂＢ２、４Ｄ５、２Ｃ４、７Ｆ３、７Ｃ２、ｍｕｍＡｂ ４Ｄ５、ｃｈｍＡｂ ４Ｄ５、（ｒｈｕ）ｍＡｂ ４Ｄ５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、トラスツズマブ、ヒト化５２０Ｃ９、４Ｄ５Ｆｃ８、ヒンジなしｒｈｕ４Ｄ５、変異型システイン残基を有する非グリコシル化ｒｈｕ４Ｄ５、ペルツズマブ、及びヒト化２Ｃ４が挙げられる（Hudziak R et al.,Mol Cell Biol 9: 1165-72 (1989)；McKenzie S et al.,Oncogene 4:543-8 (1989)；Bacus S et al., Molecular Carcinogenesis 3: 350-62 (1990)；Hancock M et al., Cancer Res 51: 4575-80 (1991)；Maier L et al., Cancer Res 51: 5361-5369 (1991)；Stancovski I etal., Proc Natl Acad Sci USA 88: 8691-5 (1991)；Tagliabue E et al., Int J Cancer 47: 933-937 (1991)；Bacus S et al.,Cancer Res 52: 2580-9 (1992)；Carter P et al., Proc NatlAcad Sci USA 89: 4285-89 (1992)；Harwerth I et al.J Biol Chem 267: 15160-7 (1992)；Kasprzyk P et al., Cancer Res 52: 2771-6 (199
2)；Lewis G et al., Cancer Immunol Immunother37: 255-63 (1993)；Xu F et al., Int J Cancer 53: 401-8(1993)；Arteaga C et al., Cancer Res 54: 3758-65 (1994)；Shawver L et al.,Cancer Res 54: 1367-73 (1994)；Klapper L et al. Oncogene 14: 2099-109 (1997)；国際公開第１９９３／２１３１９号パンフレット；国際公開第１９９４／００１３６号パンフレット；国際公開第１９９７／００２７１号パンフレット；国際公開第１９９８／７７７９７号パンフレット；米国特許第５，７７２，９９７号明細書；米国特許第５，７８３，１８６号明細書；米国特許第５，８２１，３３７号明細書；米国特許第５，８４０，５２５号明細書；米国特許第６，９４９，２４５号明細書；及び米国特許第７，６２５，８５９号明細書）。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、ヒトＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ２＋細胞の細胞表面との特異的かつ高親和性結合について選択された免疫グロブリン型ポリペプチドを含む結合領域を含む。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、結合領域は、ａ）（ｉ）配列番号２６１、配列番号２６８、又は配列番号２７４に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ１；（ii）配列番号２６２、配列番号２６９、又は配列番号２７５に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ２；及び（iii）配列番号２６３、配列番号２６
７、配列番号２７０、又は配列番号２７６に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；並びにｂ）（ｉ）配列番号２６４、配列番号２７１、又は配列番号２７７に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＡＢＲ１；（ii）配列番号２６５、配列番号２７２、又は配列番号２７８に示されているようなアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＡＢＲ２；及び（iii）配列番号２６６、配列番号２７３、又は配列番号２７９に
示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＡＢＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインからなる群から選択されるポリペプチドを含む。或いは、結合領域は、ＣＤＲによって記載され得、そのＣＤＲは、ＡＢＲと大部分、オーバーラップし、配列番号２８３〜３０３に記載されている。本発明の細胞標的化分子の他の実施形態において、結合領域は、ａ）（ｉ）配列番号２８０に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ１；（ii）配列番号２８１に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ２；及び（iii）配列番号２８２に示されるアミノ酸配列を
含むか又はそれから本質的になるＨＡＢＲ３を含む重鎖のみの可変（ＶＨＨ）ドメインからなる群から選択されるポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、配列番号３６、６６、及び６７のいずれか１つのアミノ酸２６９〜５２０又は２６９〜５２１を含むか又はそれらから本質的になる。
天然のリガンド又はその派生物は、本発明の細胞標的化分子についてのＨＥＲ２結合領域として利用され得る。天然ＨＥＲ２は、エピレグリン及びヘレグリンのような上皮増殖因子などのリガンドと結合すると、ＥｒｂＢファミリーの他のメンバーとヘテロ二量体化することが知られている（Moasser M,Oncogene 26: 6469-87 (2007)；Riese D, Cullum R, Semin Cell Dev Biol 28: 49-56 (2014)；Sollome J et al.,Cell Signal 26: 70-82
(2014)）。ＥｒｂＢファミリーのメンバーと結合するＥｒｂＢリガンドには、ＥＧＦ、
ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ベータセルリン、ＨＢ−ＥＧＦ、エピレグリン、ＨＥＲ２−６８及びＨＥＲ２−１００、ヘレグリン、ハースタチン、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３、並びにＮＲＧ−４が挙げられる（Justman Q et al.,J Biol Chem 277: 20618-24 (2002)；Jhabvala-Romero F., etal., Oncogene 22: 8178-86 (2003)）。ＥｒｂＢリガンドの
例には、米国特許第５，６４１，８６９号明細書及びMarchionni M et al., Nature362:
312-8 (1993)に開示された原型ヘレグリンなどのヘレグリン（ＨＲＧ，heregulin）が挙げられる。ヘレグリンの例には、ヘレグリン−α、ヘレグリン−β１、ヘレグリン−β２、及びヘレグリン−β３（Holmes W et al., Science 256: 1205-10 (1992)；米国特許第５，６４１，８６９号明細書）；ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ，neu differentiation factor
）（Peles et al., Cell 69: 205-16 (1992)）；アセチルコリン受容体誘導因子（ＡＲＩＡ，acetylcholine receptor-inducing activity）（FallsD et al., Cell 72: 801-15 (1993)）；グリア増殖因子（ＧＧＦ，glialgrowth factor）（Marchionni M et al., Nature 362: 312-8(1993)）；感覚運動性ニューロン由来因子（ＳＭＤＦ，sensory and motor neuronderived factor）（Ho W et al., J Biol Chem 270: 14523-32(1995))；γ
−ヘレグリン（Schaefer G et al., Oncogene 15: 1385-94 (1997)）が挙げられる。
本発明によるＥｒｂＢリガンドはまた、合成ＥｒｂＢリガンドでもよい。合成リガンドは、特定のＥｒｂＢ受容体に特異的であり得、又は特定のＥｒｂＢ受容体複合体を認識し得る。合成リガンドの例は、合成ヘレグリン／ＥＧＦキメラのビレグリン（biregulin）
（Jones J et al., FEBS Lett, 447: 227-31 (1999)）及びＥＧＦ様ドメイン断片ＨＲＧ
β１１７７−２４４である。ＨＥＲ２又はその派生物と相互作用するＥｒｂＢリガンド又はＥｒｂＢリガンドの部分は、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドに融合して、ＨＥＲ２の細胞外部分と結合する、本発明のＨＥＲ２を標的にする細胞標的化分子を構築し得る。
ＨＥＲ２の細胞外部分と結合する合成ペプチドは、標的化のための結合領域として利用され得る。ＨＥＲ２と結合する能力がある多くのペプチドが記載されている（例えば、米国特許第５，５７８，４８２号明細書；第５，８５６，１１０号明細書；第５，８６９，４４５号明細書；第５，９８５，５５３号明細書；第６，３３３，１６９号明細書；第６，９８７，０８８号明細書；第７，０１９，０１７号明細書；第７，２８２，３６５号明細書；第７，３０６，８０１号明細書；第７，４３５，７９７号明細書；第７，４４６，１８５号明細書；第７，４４９，４８０号明細書；第７，５６０，１１１号明細書；第７，６７４，４６０号明細書；第７，８１５，９０６号明細書、第７，８７９，３２５号明細書；第７，８８４，１９４号明細書；第７，９９３，６５０号明細書；第８，２４１，６３０号明細書；第８，３４９，５８５号明細書；第８，３８９，２２７号明細書；第８，５０１，９０９号明細書；第８，５１２，９６７号明細書；第８，６５２，４７４号明細書；及び米国特許出願公開第２０１１／００５９０９０号明細書参照）。
ある特定の実施形態において、ＨＥＲ２の細胞外部分と結合する小分子が、標的化のための結合領域として利用され得る。ＨＥＲ２と結合する能力がある多くの小分子が記載されており、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤、ＡＺＤ８９３１、ラパチニブ、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、ダコミチニブ（ＰＦ−００２９９８０４）、アファチニブ（ＢＩＢＷ ２９９２）（Barlaam B et al., ACS Med Chem Lett 4: 742-6 (2013)；Yu H, Riley
G, J Natl Compr Canc Netw 11: 161-9 (2013)；Roskoski R, PharmacolRes 87C: 42-59 (2014)）である。ＨＥＲ２の細胞外部分と結合する他の小分子は、当業者に周知の方法を使用して、例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ＡＥＥ７８８、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ−５２７１）、ＡＰ２６１１３、ＣＯ−１６８６、ＸＬ６４７、バンデタニブ、及びＢＭＳ−６９０５１４のような既知のＥＧＦＲ結合物質を誘導体化することにより、同定され得る（Kurokawa H,Arteaga C, Clin Cancer Res 7: 4436s-4442s (2001)；Yigitbasi O et al., Cancer Res 64:7977-84 (2004)；Yu H, Riley G, J Natl Compr
Canc Netw 11: 161-9 (2013)；Roskoski R, Pharmacol Res 87C: 42-59 (2014)）。
前述のＨＥＲ２結合分子のいずれも、ＨＥＲ２結合領域としての使用に適し、又は本発明の細胞標的化分子において使用される１つ若しくは２つ以上のＨＥＲ２結合領域を作製するために改変され得る。
８．ヒトＰＤ−Ｌ１を標的にする細胞標的化分子
当技術分野においてＰＤＬ１、プログラム細胞死１リガンド１、ＰＤＣＤ１リガンド１、ＰＤＣＤ１Ｌ１、ＰＤＣＤ１ＬＧ１、Ｂ７ホモログ１（Ｂ７−Ｈ１）、及びＣＤ２７４
としても認識されているＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞及びＢ細胞のプログラム細胞死１受容体（Dong H et al.,Nat Med 5: 1365-9 (1999)；Freeman G et al., J Exp Med192: 1027-34 (2000)；Latchman Y et al., Nat Immunol 2: 261-8 (2001)）並びにＴ細胞上に見出されるＢ７−１受容体及びＣＤ８０受容体（Butte M et al., Immunity 27:111-22 (2007)
；Park J et al., Blood 116: 1291-8 (2010)）についてのリガンドである。ＰＤ−Ｌ１
という名前は、様々な種由来の関連した構造及びポリペプチド配列を有する複数のタンパク質を指し得るが、このセクションの構造例を示すことを目的として、用語「ＰＤ−Ｌ１」は、正確な配列がアイソフォームに基づいて、及び個体間でわずかに異なり得る、ヒトに存在するＰＤ−１リガンドを指す。ヒトに関しては、ＰＤ−Ｌ１は、主なポリペプチド配列ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９ＮＺＱ７又はＱ９ＥＰ７３、及びＮＣＢＩアクセッションＡＡＩ１３７３５．１によって表されるタンパク質を指す；しかしながら、スプライシング、多型性、及び／又は変異により異なるアイソフォーム及びバリアントが存在する（例えば、Abelson A et al., Genes Immun 8: 69-74(2007)；Wang S et al., J Clin Immunol 27: 563-7 (2007)；Hayashi M et al., Eur J Endocrinol 158: 817-22 (2008)；Mitchell
A et al., J Clin Endocrinol Metab 94: 5139-45 (2009)；Yang Q et al., Clin Exp Rheumatol 29: 13-8(2011)；Ma Y et al., Int J Clin Exp Med 15: 16585-91(2015)参
照）。熟練した作業者は、たとえ参照された配列とは異なる場合でさえも、ヒトにおいて他のＰＤ−Ｌ１タンパク質を同定することができるだろう。
ＰＤ−Ｌ１は、正常な状態下のたいていの健康な組織には存在しない；しかしながら、ＰＤ−Ｌ１発現は、たいていの有核哺乳類細胞のインターフェロンへの曝露により誘導され得る（例えば、Dong H et al., Nat Med 8: 793-800 (2002)；ChenL, Nat Rev Immunol 4: 336-47 (2004)；Hirano F et al.,Cancer Res 65: 1089-96 (2005)；Zou W, Chen L, Nat RevImmunol 8: 467-7 (2008)；Flies D et al., Yale J Biol Med84: 409-21 (2011)；Chen J et al., Immunobiology 217:385-93 (2012)；Spranger S et al. Sci Transl Med 5: 200ra116(2013)参照）。ある特定の悪性度の間、腫瘍微小環境におけるＰ
Ｄ−Ｌ１上方制御は、腫瘍細胞に対する免疫応答の過剰抑制をもたらし得、それは、腫瘍細胞の宿主の免疫系への適応免疫耐性におけるＰＤ−Ｌ１の関与についての一般的概念と一致する（例えば、Zou W, Chen L, Nat Rev Immunol 8: 467-7 (2008)；Zheng P, Zho Z, Biomark Cancer 7: 15-8(2015)参照）。
ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−Ｌ１が、ある特定の腫瘍細胞及び腫瘍浸潤リンパ球によって強く発現するが、健康なヒト組織及び細胞は細胞表面で高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現することはほとんどないことから、治療のための魅力的な標的である（例えば、Dong H et al., Nat Med 8: 793-800 (2002)；ChenL, Nat Rev Immunol 4: 336-47 (2004)；Hirano F et al.,Cancer Res 65: 1089-96 (2005)；Chen L, Han X, J ClinInvest 125: 3384-91 (2015)参照）。ヒトにおいて、腫瘍細胞による細胞表面ＰＤ−Ｌ１の発現は、免疫組織化学法により評価された、いくつかの原発性腫瘍生検及び腫瘍細胞の培養細胞において観察されており、それらには、例えば、癌腫、神経膠腫、Ｂ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ，angioimmunoblastic
T-cell lymphoma）、膀胱がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、上皮悪性腫瘍、口腔扁平上皮癌、食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ，esophageal squamous cell carcinoma）、肺がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ，non-Hodgkin lymphoma）、膵臓がん、腎細胞癌（ＲＣＣ，renalcell carcinoma）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ，small lymphocyticlymphoma）、頭頚部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ，squamous cell carcinoma of thehead and neck）、及びウイルス関連悪性腫瘍に関連した細胞及び組織が挙げられる（例えば、BrownJ et al., Immunol 170: 1257-66 (2003)；Strome S et al.,Cancer Res 63: 6501-5 (2003)；Wintterle et al., Cancer Res 63: 7462-7 (2003)；ThompsonR et al., Cancer Res 66: 3381-5 (2006)；Nomi T et al.,Clin Cancer Res 13: 2151-7 (2007)；Thompson et al., ClinCancer Res 13: 1757-61 (2007)；Andorsky D et al., Clin Cancer Res
17: 4232-44 (2011)；Chen B et al., Clin Cancer Res 19:3462-73 (2013)；Chen M et al., Oncotarget7: 7913-24 (2016)；Wu C et al., Sci Rep 6: 19740 (2016)参照）
。
本発明の細胞標的化分子を作製するために本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドと会合し得る、熟練した作業者に公知の多数のＰＤ−Ｌ１結合領域がある。本発明を目的として、用語「ＰＤ−Ｌ１結合領域」は、例えば、１０−５〜１０−１２モル／リットルのＰＤ−Ｌ１に関する解離定数を有するなどの高親和性でＰＤ−Ｌ１分子の細胞外部分と特異的に結合する能力がある分子部分（例えば、タンパク質性分子）又は作用物質を指す。本明細書で用いられる場合、ＰＤ−Ｌ１結合は、ヒトＰＤ−Ｌ１のアイソフォーム又はバリアントの細胞外部分と結合する能力を指す。
ある特定の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１結合領域は、免疫グロブリン型結合領域である。ある特定の実施形態において、免疫グロブリン型ＰＤ−Ｌ１結合領域は、ＰＤ−Ｌ１の細胞外部分と結合する能力がある抗体パラトープなどの、免疫グロブリンＰＤ−Ｌ１結合領域に由来する。ある特定の他の実施形態において、免疫グロブリン型ＰＤ−Ｌ１結合領域は、いかなる免疫グロブリンドメインにも由来しないが、ＰＤ−Ｌ１の細胞外部分との高親和性結合を提供することにより免疫グロブリンＰＤ−Ｌ１結合領域のように機能する改変されたポリペプチドを含む。この改変されたポリペプチドは、本明細書に記載される免疫グロブリン由来の相補性決定領域及び／又は抗原結合領域を含むか又はそれらから本質的になるポリペプチドスキャフォールドを含んでもよい。
本発明の成分として企図される、多数のＰＤ−Ｌ１結合領域がある。免疫グロブリン型ＰＤ−Ｌ１結合領域の非限定的例には、細胞表面に存在するＰＤ−Ｌ１の細胞外部分と結合することがすでに知られた、多数の抗体及び免疫グロブリンドメインが挙げられ、それらには、ＭＤＸ−１１０５、ＭＯＭ−１８５３４−Ｓ（Ｐ）、及び様々なｓｃＦｖが挙げられる（例えば、Latchman Y et al.,Nat Immunol 2: 261-8 (2001)；Xerri L et al., Human Pathol 39: 1050-8 (2008)；Chen B et al., Clin Cancer Res 19: 3462-73 (2013)；Drees J et al., Protein Expr Purif 94:60-6 (2014)；国際公開第２００７／００
５８７４号パンフレット；国際公開第２０１０／０３６９５９号パンフレット；国際公開第２０１３／０１９９０６号パンフレット；米国特許第７，９４３，７４３号明細書；米国特許第８，５５２，１５４号明細書；米国特許第９，１０２，７２７号明細書；米国特許第９，２７３，１３５号明細書、並びに米国特許出願公開第２０１１０２７１３５８号明細書及び第２０１６００７５７８２号明細書参照）。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、ヒトＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ１＋細胞の細胞表面との特異的かつ高親和性結合について選択された免疫グロブリン型ポリペプチドを含む結合領域を含む。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、結合領域は、ａ）（ｉ）配列番号３０４、配列番号３１０、配列番号３１６、配列番号３２２、又は配列番号３２８に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＣＤＲ１；（ii）配列番号３０５、配列番号３１１、配列番号３１７、配列番号３２３、又は配列番号３２９に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＣＤＲ２；及び（iii）配列番号３０６、配列番号３１２、配列番号
３１８、配列番号３２４、又は配列番号３３０に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；並びにｂ）（ｉ）配列番号３０７、配列番号３１３、配列番号３１９、配列番号３２５、又は配列番号３３１に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＣＤＲ１；（ii）配列番号３０８、配列番号３１４、配列番号３２０、配列番号３２６、又は配列番号３３２に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＣＤＲ２；及び（iii）配列番号３０９、配列番号３１５、配列番号３２１、配列番号３２７、又は配列番
号３３３に示されるアミノ酸配列の１つを含むか又はそれから本質的になるＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインからなる群から選択されるポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、配列番号３７〜３９、６８〜７９、及び８１のいずれか１つのアミノ酸２６９〜４９８又は２６９〜４９９を含むか又はそれから本質的になる。
前述のＰＤ−Ｌ１結合分子のいずれも、ＰＤ−Ｌ１結合領域としての使用に適し、又は本発明の細胞標的化分子において使用される１つ若しくは２つ以上のＰＤ−Ｌ１結合領域を作製するために改変され得る。
他の構造バリエーション
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、結合領域は、例えば、国際公開第２００５／０９２９１７号パンフレット、国際公開第２００７／０３３４９７号パンフレット、米国特許出願公開第２００９／０１５６４１７号明細書、日本特許第４３３９５１１号明細書、欧州特許公告第１７２７８２７号明細書、独国特許公告第６０２００４０２７１６８号明細書、欧州特許公告第１９４５６６０号明細書、日本特許第４９３４７６１号明細書、欧州特許公告第２２２８３８３号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０１９６９２８号明細書、国際公開第２０１４／１６４６８０号パンフレット、国際公開第２０１４／１６４６９３号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８４３５号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８４５２号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５０２５９４２８号明細書、米国特許出願第６２／１６８，７５８号明細書、第６２／１６８，７５９号明細書、第６２／１６８，７６０号明細書、第６２／１６８，７６１号明細書、第６２／１６８，７６２号明細書、第６２／１６８，７６３号明細書、及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１６５８０号明細書に、以前、記載されている。
本発明の細胞標的化分子のある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、（ａ）配列番号３３４に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるＨＣＤＲ２、及び配列番号３３６に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、並びに（ｂ）配列番号３３７に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるＬＣＤＲ１、配列番号３３８に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるＬＣＤＲ２、及び配列番号３３９に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインからなる群から選択されるポリペプチドを含む。
標的生体分子の任意の細胞外部分に対する機能性結合部位を含有し、さらにより好ましくは、（例えば、ＫＤによって示される）高親和性で標的生体分子と結合する能力がある、本発明の細胞標的化分子の断片、バリアント、及び／又は派生物を使用することは、本発明の範囲内である。例えば、１０−５〜１０−１２モル／リットル、好ましくは２００ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で、標的生体分子の細胞外部分と結合する任意の結合領域が、本発明の細胞標的化分子の作製、及び本発明の方法における使用に、代用され得る。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子、並びに前者のいずれかをコードするポリヌクレオチドに、それらの生物学的活性を減弱させることなく、例えば、１つ又は２つ以上の、１）抗原性及び／若しくは免疫原性潜在能力を低減する内因性エピトープの破壊、２）タンパク質分解性切断を低減するフーリン切断モチーフの破壊、並びに／又は３）抗原性及び／若しくは免疫原性潜在能力を低減し、若しくは細胞表面上での提示のためにＭＨＣ Ｉ分子へ送達され得る、組み込まれた若しくは挿入されたエピ
トープと共に、志賀毒素エフェクターポリペプチドの全体的な構造及び機能を維持することにより、バリエーションが加えられ得ることは、熟練した作業者は認識しているだろう。例えば、いくつかの改変は、発現を促進し、精製を容易にし、薬物動態学的性質を改善し、及び／又は免疫原性を改善し得る。そのような改変は、熟練した作業者によく知られており、それらには、例えば、開始部位を提供するためのアミノ末端に付加されるメチオニン、都合良く位置した制限部位又は終止コドンを生じるためのいずれかの末端に配置される追加のアミノ酸、並びに便利な検出及び／又は精製を提供するためのいずれか末端に融合した生化学的アフィニティタグが挙げられる。非脊索動物系（例えば、原核細胞）を使用して産生されたポリペプチドの免疫原性を改善するための一般的な改変は、例えば、細菌宿主系においてなどの、産生中にホルミル化され得る開始メチオニン残基を、ポリペプチドの産生後に取り除くことであり、例えば、Ｎ−ホルミルメチオニン（ｆＭｅｔ，N-formylmethionine）の存在が脊索動物において望ましくない免疫応答を誘導する可能性があるからである。
エピトープタグ又は他の部分についての配列など、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、本発明の細胞標的化分子、又は本発明の細胞標的化分子のタンパク質性成分のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端における追加のアミノ酸残基の包含もまた、本明細書で企図される。その追加のアミノ酸残基は、例えば、クローニングを促進すること、発現、翻訳後修飾を促進すること、合成、精製を容易にすること、検出及び投与を容易にすることを含む、様々な目的のために使用され得る。エピトープタグ及び部分の非限定的例は、キチン結合タンパク質ドメイン、エンテロペプチダーゼ切断部位、第Ｘ因子切断部位、ＦＩＡｓＨタグ、ＦＬＡＧタグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ，green fluorescent protein）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ部分、ＨＡタグ、マルトース結合タン
パク質ドメイン、ｍｙｃタグ、ポリヒスチジンタグ、ＲｅＡｓＨタグ、ｓｔｒｅｐ−タグ、ｓｔｒｅｐ−タグII、ＴＥＶプロテアーゼ部位、チオレドキシンドメイン、トロンビン切断部位、及びＶ５エピトープタグである。
ある特定の上記の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は細胞標的化分子のポリペプチド配列は、全ての必要とされる構造的特徴がなお存在し、かつ志賀毒素エフェクターポリペプチドが、単独か又は細胞標的化分子の成分としてかのいずれかでいかなる必要とされる機能も示す能力がある限り、そのポリペプチド領域へ導入される１つ又は２つ以上の保存的アミノ酸置換によって変化する。本明細書で用いられる場合、用語「保存的置換」は、１つ又は２つ以上のアミノ酸が、別の生物学的に類似したアミノ酸残基によって置き換えられることを意味する。例には、類似した特性を有するアミノ酸残基、例えば、小型アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸、及び芳香族アミノ酸の置換が挙げられる（例えば、表Ｃ参照）。内因性哺乳類ペプチド及びタンパク質に正常には見出されない残基での保存的置換の例は、アルギニン又はリジン残基の、例えば、オルニチン、カナバニン、アミノエチルシステイン、又は別の塩基性アミノ酸での保存的置換である。ペプチド及びタンパク質における表現型的にサイレントな置換に関するさらなる情報について、例えば、Bowie J et al., Science 247: 1306-10 (1990)を参照されたい。

表Ｃにおける保存的置換スキームにおいて、アミノ酸の例示的な保存的置換は、物理化学的性質により以下のようにグループ化される：Ｉ：中性、親水性；II：酸及びアミド；III：塩基性；IV：疎水性；Ｖ：芳香族、かさ高いアミノ酸、VI親水性非荷電、VII脂肪族非荷電、VIII無極性非荷電、IXシクロアルケニル結合型、Ｘ疎水性、XI極性、XII小型、XIII回転可能、及びXIV可動性。例えば、保存的アミノ酸置換には以下が挙げられる：１）ＳがＣの代わりに用いられ得る；２）Ｍ又はＬがＦの代わりに用いられ得る；３）ＹがＭの代わりに用いられ得る；４）Ｑ又はＥがＫの代わりに用いられ得る；５）Ｎ又はＱがＨの代わりに用いられ得る；及び６）ＨがＮの代わりに用いられ得る。
追加の保存的アミノ酸置換には以下が挙げられる：１）ＳがＣの代わりに用いられ得る；２）Ｍ又はＬがＦの代わりに用いられ得る；３）ＹがＭの代わりに用いられ得る；４）Ｑ又はＥがＫの代わりに用いられ得る；５）Ｎ又はＱがＨの代わりに用いられ得る；及び６）ＨがＮの代わりに用いられ得る。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は、（１）少なくとも１つの組み込まれた若しくは挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含み、かつ少なくとも１つのアミノ酸が、実施例（例えば、表１〜７及び／又は１２参照）に提供された、内因性Ｂ細胞及び／若しくはＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域において破壊されており、前記破壊されたアミノ酸が、前記組み込まれた若しくは挿入されたエピトープとオーバーラップしていない；（２）少なくとも１つの組み込まれた若しくは挿入された異種Ｔ細胞エピトープ、及び志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含む；又は（３）志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含み、かつ少なくとも１つのアミノ酸が、実施例（例えば、表１〜７及び／又は１２参照）に提供された、内因性Ｂ細胞及び／若しくはＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域において破壊されており、前記破壊されたアミノ酸が、前記破壊されたフーリン切断モチーフとオーバーラップしない限り、本明細書に列挙されたポリペプチド配列と比較して、多くとも２０個、１５個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸置換を有する、本明細書に記載される本発明のポリペプチド領域の機能性断片又はバリアントを含み得る。本発
明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子のバリアントは、変化した細胞毒性、変化した細胞分裂停止効果、変化した免疫原性、及び／又は変化した血清中半減期などの所望の性質を達成するために、結合領域又は志賀毒素エフェクターポリペプチド領域内などの、１つ若しくは２つ以上のアミノ酸残基を変更し、又は１つ若しくは２つ以上のアミノ酸残基を欠失させ若しくは挿入することにより、本明細書に記載されるポリペプチドを変化させた結果として、本発明の範囲内である。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子はさらに、シグナル配列を含んでも含まなくてもよい。
したがって、ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニット又はその断片、例えば、ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、及び／又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）などの志賀毒素Ａサブユニットと、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の全体的な配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になり、前記志賀毒素エフェクターポリペプチドが、（１）少なくとも１つの組み込まれた若しくは挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含み、かつ少なくとも１つのアミノ酸が、実施例（例えば、表１〜７及び／又は１２参照）に提供された、内因性Ｂ細胞及び／若しくはＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域において破壊されており、前記破壊されたアミノ酸が、前記組み込まれた若しくは挿入されたエピトープとオーバーラップせず；（２）少なくとも１つの組み込まれた若しくは挿入された異種Ｔ細胞エピトープ、及び志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含み；又は（３）志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含み、かつ少なくとも１つのアミノ酸が、実施例（例えば、表１〜７及び／又は１２参照）に提供された、内因性Ｂ細胞及び／若しくはＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域において破壊されており、前記破壊されたアミノ酸が、前記破壊されたフーリン切断モチーフとオーバーラップしない。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドのある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドの酵素活性を増加させるために、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基が、変異され、挿入され、又は欠失され得る。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドのある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドの触媒活性及び／又は細胞毒活性を低減又は除去するために、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基が変異され、又は欠失され得る。例えば、志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットの触媒活性及び／又は細胞毒活性は、変異又は短縮化により減弱又は除去され得る。
志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットの細胞毒性は、変異及び／又は短縮化により変更され、低減され、又は除去され得る。標識された位置、チロシン−７７、グルタミン酸−１６７、アルギニン−１７０、チロシン−１１４、及びトリプトファン−２０３は、Ｓｔｘ、Ｓｔｘ１、及びＳｔｘ２の触媒活性にとって重要であることが示されている（Hovde C et al.,Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988)；Deresiewicz R et al., Biochemistry 31: 3272-80 (1992)；Deresiewicz R et al., Mol Gen Genet 241: 467-73 (1993)；Ohmura M et al., Microb Pathog 15: 169-76 (1993)；Cao C etal., Microbiol Immunol 38: 441-7 (1994)；Suhan M, HovdeC, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)）。グルタミン酸−１６７とアルギニン−１７０の両方を変異させることは、無細胞リボソーム不活性化アッセイにおいて、Ｓｌｔ−Ｉ Ａ１の酵素活性を除去した（LaPointe
P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。小胞体におけるＳｌｔ−Ｉ Ａ１の
新規の発現を使用する別のアプローチにおいて、グルタミン酸−１６７とアルギニン−１７０の両方を変異させることは、Ｓｌｔ−Ｉ Ａ１断片細胞毒性をその発現レベルで、除去した（LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。短縮化分析により
、残基７５〜２６８のＳｔｘＡの断片はインビトロで有意な酵素活性をなお保持することが実証された（Haddad Jet al., J Bacteriol 175: 4970-8 (1993））。残基１〜２３９
を含有するＳｌｔ−Ｉ Ａ１の短縮型断片は、サイトゾルにおける新規の発現により、インビトロでの有意な酵素活性及び細胞毒性を示した（LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。残基１〜２３９へ短縮化されたＳｌｔ−Ｉ Ａ１断片の小胞体
における発現は、それが、サイトゾルへ逆行輸送する（retrotranslocate）ことができなかったため、細胞毒性ではなかった（LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。
志賀毒素Ａサブユニットにおける酵素活性及び／又は細胞毒性について最も重要な残基は、とりわけ以下の残基位置：アスパラギン−７５、チロシン−７７、チロシン−１１４、グルタミン酸−１６７、アルギニン−１７０、アルギニン−１７６、及びトリプトファン−２０３にマッピングされた（Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)）。特に、グルタミン酸−Ｅ１６７からリジンへ、及びアルギニン−１７６からリジンへの変異を含有するＳｔｘ２Ａの二重ミュータント構築物は、完全に不活性化され、一方、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２における多くの単一変異は、細胞毒性の１０分の１への低減を示した。さらに、Ｓｔｘ１Ａの１〜２３９又は１〜２４０への短縮化は、それの細胞毒性を低減し、同様に、Ｓｔｘ２Ａの保存的疎水性残基への短縮化は、それの細胞毒性を低減した。志賀毒素Ａサブユニットにおける真核生物リボソームへの結合及び／又は真核生物リボソーム阻害について最も重要な残基はとりわけ以下の残基位置：アルギニン−１７２、アルギニン−１７６、アルギニン−１７９、アルギニン−１８８、チロシン−１８９、バリン−１９１、及びロイシン−２３３にマッピングされた（McCluskey A et al., PLoS One 7: e31191(2012）。しかしながら、ある特定の改変は、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドにより示される志賀毒素機能活性を増加させ得る。例えば、Ｓｔｘ１Ａにおける残基位置アラニン−２３１をグルタミン酸へ変異させることは、インビトロでＳｔｘ１Ａの酵素活性を増加させた（Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9(1998)）。
ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）又はＳｔｘＡ（配列番号２）に由来した、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドのある特定の実施形態において、変異したその１つ又は２つ以上のアミノ酸残基には、位置７５におけるアスパラギン、位置７７におけるチロシン、位置１１４におけるチロシン、位置１６７におけるグルタミン酸、位置１７０におけるアルギニン、位置１７６におけるアルギニンの置換、及び／又は位置２０３におけるトリプトファンの置換が挙げられる。そのような置換の例は、先行技術に基づいて熟練した作業者に知られており、例えば、位置７５におけるアスパラギンからアラニンへの置換、位置７７におけるチロシンからセリンへの置換、位置１１４におけるチロシンからセリンへの置換、位置１６７におけるグルタミン酸からグルタミン酸への置換、位置１７０におけるアルギニンからアラニンへの置換、位置１７６におけるアルギニンからリジンへの置換、位置２０３におけるトリプトファンからアラニンへの置換、及び／又は２３１におけるアラニンのグルタミン酸での置換である。志賀毒素酵素活性及び／又は細胞毒性を増強するか又は低減するかのいずれかである他の変異は本発明の範囲内であり、本明細書に開示された周知の技術及びアッセイを使用して決定され得る。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子を、１つ又は２つ以上の追加の作用物質にコンジュゲートさせてもよく、その作用物質には、本明細書に記載される作用物質を含む、当技術分野において公知の、治療剤、診断剤、及び／又は他の追加の外因性材料が挙げられ得る。ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド又は細胞標的化分子は、例えば、脱免疫化を与え、志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における伸長ループ及び／若しくはフーリン切断モチーフをマスクすることによりフーリン切断を破壊し、薬物動態学的性質を改善し、並びに／又は免疫原性を改善するために、ＰＥＧ化され、又はアルブミン付加される（例えば、Wang Q et al., Cancer Res 53: 4588-94 (1993)；Tsutsumi Y et al.,Proc Natl Acad Sci USA 97: 8548-53 (2000)；Buse J, El-Aneed A, Nanomed5: 1237-60 (2010)；Lim S et al., J
Control Release 207-93 (2015)参照）。
Ｖ．本発明の細胞標的化分子の一般的な機能
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドと細胞標的化結合領域との機能的会合は、特定の細胞型を選択的に殺滅し、それの増殖を阻害し、それに外因性材料を送達し、及び／又はそれを検出する細胞標的化分子の作製を可能にする。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドの性質は、前の志賀毒素エフェクターポリペプチドと比較して、脊索動物において治療濃度域が向上した細胞標的化分子の作製を可能にする。
ある特定の実施形態について、本発明の細胞標的化分子は、脊索動物への投与後、以下のうちの１つ又は２つ以上を提供する：１）低投与用量での標的細胞、例えば、感染細胞又は悪性細胞の強力かつ選択的殺滅、２）細胞標的化分子が細胞外スペースに存在する間での、細胞標的化結合領域と志賀毒素エフェクターポリペプチド領域との連結安定性、３）低レベルのオフターゲット細胞死及び／又は望まれない組織損傷、並びに４）望ましいＴ細胞媒介性免疫応答、例えば、組織部位におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の動員及びサイトカインの局在的放出を惹起するための標的細胞による提示についての、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの細胞標的化送達。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は、例えば、細胞殺滅、細胞増殖阻害、細胞内カーゴ送達、生物学的情報収集、免疫応答刺激、及び／又は健康な状態の矯正に関わる多様な適用において有用である。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、様々な治療用及び／又は診断用分子、例えば、リガンド−毒素融合体、免疫毒素、及び／又は免疫複合体などの成分として有用である。本発明の細胞標的化分子は、例えば、がん、免疫障害、及び微生物感染を含む様々な疾患の診断又は治療のために特定の細胞型のインビボ標的化に関わる適用において、治療用及び／又は診断用分子、例えば、細胞標的化細胞毒性治療用分子、細胞標的化無毒性送達媒体、及び／又は細胞標的化診断用分子として有用である。
実施形態によって、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド又は細胞標的化分子は、以下の特性又は機能性の１つ又は２つ以上を有し、又は提供する：（１）脱免疫化、（２）プロテアーゼ切断耐性、（３）ある特定の濃度における強力な細胞毒性、（４）追加の材料（例えば、異種Ｔ細胞エピトープ）からなるカーゴの細胞内送達、（４）選択的細胞毒性、（６）ある特定の用量若しくは投与量における多細胞生物における低いオフターゲット毒性、（７）標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路への異種Ｔ細胞エピトープの送達、及び／又は（８）ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答の刺激。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子のある特定の実施形態は、その分子が、本明細書に記載される特性又は機能性の２つ又は３つ以上を有するため、多機能性である。本発明の細胞標的化分子のある特定のさらなる実施形態は、単一分子において、前述の特性及び機能性の全部を提供する。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドと細胞標的化結合領域との会合、結合、及び／又は連結は、哺乳類などの多細胞生物へのある特定の用量又は投与量での投与後に、より小さい有害作用を生じ得る志賀毒素機能を有する細胞標的化分子の改変を可能にする。有害作用の非限定的例には、オフターゲット毒性、標的化されない細胞毒性、及び／又は望まれない免疫応答が挙げられる。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子のある特定の実施形態は、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は細胞標的化分子の脊索動物への投与に関わる適用に特に有用であり、機能的性質、例えば、脱免疫化、オフターゲット毒性の低減、及び／又は細胞標的化分子に送達されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの細胞表面提示を介してなどの望ましい免疫応答の標的化刺激などを有するからである。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、特定の細胞型の細胞表面に会合した細胞外標的生体分子と結合し、かつそれらの細胞に侵入する能力がある。いったん標的細胞型内に内在化したならば、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、酵素活性のある細胞毒性志賀毒素エフェクターポリペプチド断片を標的細胞のサイトゾルへ送り、最終的にその細胞を死滅させる能力がある。或いは、本発明の細胞標的化分子の、無毒性又は低減毒性のバリアントを使用して、エピトープ、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、及び検出促進剤などの追加の外因性材料を標的細胞へ送達するために使用され得る。この系は、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドを様々な多様な細胞型へ向けるために多様な結合領域をいくつでも使用することができる点において、モジュール方式である。
Ａ．脊索動物への投与に関わる適用のための脱免疫化
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドの脱免疫化は、変異及び／若しくは短縮化による、又は共有結合した化学的構造のコンジュゲーションによることを含む、志賀毒素Ａサブユニット又は志賀毒素エフェクターポリペプチドの１つ又は２つ以上の内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域の破壊を設計することにより、達成される。Ｂ細胞エピトープは成熟ＣＤ４＋Ｔ細胞のエピトープと一致し、又はオーバーラップする場合が多いため、内因性Ｂ細胞エピトープ領域の破壊は、内因性ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを同時に破壊する場合が多く、又はその逆もまた同様である。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子のある特定の実施形態は、１つ又は２つ以上のＢ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープに関して脱免疫化され、つまり、これらの分子が、その同じＢ細胞及び／若しくはＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ若しくはエピトープ領域への同一の破壊を欠き、並びに／又はその同じＢ細胞及び／若しくはＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ若しくはエピトープ領域へのいかなる破壊をも欠く前の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子と比較して、低下した抗原性及び／又は免疫原性潜在能力を示すということである。ある特定のさらなる実施形態は、脱免疫化性を与える複数の変異の存在にも関わらず、野生型レベルとまではいかなくても、強力な志賀毒素Ａサブユニット触媒ドメイン依存性細胞毒性を示す。本発明の脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は、脊索動物、例えば、哺乳類、両生類、鳥類、魚、爬虫類、又はサメなどへの志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は細胞標的化分子の非経口投与に関わる適用のために有用であり、その投与された分子により引き起こされる望ましくない免疫応答を生じる可能性が低減するからである。
本発明の様々な脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、様々な脊索動物種へ投与された場合、それらの抗原性プロファイルが異なり得るが、本発明の脱免疫化されたポリペプチドの全ては、少なくとも１つの定量的アッセイによって測定される場合、少なくとも１つの生物体において抗原性及び／又は免疫原性の低減を示す。特に、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、哺乳類レシピエントに関して脱免疫化されており、例えば、その分子は、参照分子（例えば、野生型志賀毒素Ａ１断片を含む関連した細胞標的化分子）と比較して、その哺乳類に投与された場合、より低い量及び／又は頻度の「抗細胞標的化分子」抗体を引き起こす。加えて、複数の内因性エピトープ領域の破壊を有する本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、そのようなポリペプチドの脊索動物レシピエントにおいて望ましくない免疫応答の発生の可能性をより大きく低減することが予想される。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子のある特定の実施形態について、脱免疫化性は、志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含む構造変化の結果である。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子のある特定の実施形態について、脱免疫化性は、内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域を破壊するＴ細胞エピトープの組み込み及び／又は挿入を含む構造変化の結果である。
ある特定の実施形態について、脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドが由来した親の志賀毒素ポリペプチドの望ましい生物学的機能、例えば、細胞内在化を促進すること、細胞内経路決定を方向づけること、及び強力な細胞毒性の志賀毒素Ａサブユニット機能は、保存されている。保存とは、本明細書に記載される活性の最小レベルの保持を指す。
Ｂ．プロテアーゼ切断感受性の低減
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子のある特定の実施形態は、野生型志賀毒素Ａ１断片領域を含む関連分子と比較してプロテアーゼ切断感受性の低減を示す。ある特定のさらなる実施形態は、このプロテアーゼ切断感受性の低減及び中毒性細胞内の標準的なフーリン切断事象の欠損にも関わらず、最適ではないにしても、強力な志賀毒素Ａサブユニット触媒ドメイン依存性細胞毒性を示す。
本発明のプロテアーゼ切断耐性細胞標的化分子（すなわち、志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端において破壊されたフーリン切断モチーフを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子）のある特定の実施形態は、野生型志賀毒素Ａ１断片領域を含む関連分子と比較してインビボ忍容性の改善を示す。ある特定のさらなる実施形態は、このプロテアーゼ切断感受性の低減及び中毒性細胞内の標準的なフーリン切断事象の欠損にも関わらず、最適ではないにしても、強力な志賀毒素Ａサブユニット触媒ドメイン依存性細胞毒性を示す。
以前には、志賀毒素Ａ１断片触媒領域を含む細胞毒性志賀毒素Ａサブユニット構築物は、効率的かつ強力な細胞毒性に対する志賀毒素の天然の適応を保存するために、中毒性細胞内のフーリンによる自然発生のタンパク質分解性プロセシングを維持し、又はいくらか代償しなければならないと考えられていた。野生型志賀毒素対照構築物のレベルでの強力な志賀毒素細胞毒性が、カルボキシ末端部分の存在にも関わらず、志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端におけるいかなるフーリン切断事象もの非存在下で達成されたため、フーリン切断事象が強力な細胞毒性に必要とされないことが予想外にも発見された（下記の実施例及び国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット参照）。中毒性細胞内のフーリン切断事象の欠損は、志賀毒素Ａ１断片様領域の効率的な遊離を防ぎ、したがって、志賀毒素Ａ１断片領域への相対的に大きい（例えば、サイズが２８ｋＤａより大きい）部分の継続した連結を生じ得る。しかしながら、この可能性にも関わらず、強力な志賀毒素細胞毒性は、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域を含み、かつ、例えば、志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端に近位での細胞内切断を提供することなどのいかなる既知の代償特徴をも欠く、フーリン切断欠損構築物で達成された（下記の実施例及び国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット参照）。
これは、Ａ１断片領域に連結した相対的に大きい分子部分の残存及び／又は非効率的遊離が、必ずしも志賀毒素細胞毒性の効力を低減するわけではなかったことを示唆している。最適な志賀毒素中毒過程が、志賀毒素Ａ１断片を全ての他の大きな分子部分から遊離させて、遊離したＡ１断片を小胞体からサイトゾル（そのサイトゾルにおいて、Ａ１断片は、中毒性細胞のリボソームを触媒的に不活性化する、酵素活性のある構造を形成することができる）へ効率的に逆行輸送することを必要とすると考えられていたため、これは驚くべきことであった。特に、志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端を覆う相対的に大きい分子部分の残存及び／又は非効率的遊離は、Ａ１断片の疎水性カルボキシ末端ドメインの露出
及びこのドメインのＥＲＡＤ系による認識を含むサイトゾルへのアクセスを効率的に獲得することの志賀毒素Ａ１断片の自然機構に干渉することが予想された（Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)； Li Set al., PLoS One 7: e41119 (2012)参照）。
志賀毒素Ａサブユニット派生物を含む分子についての中毒性細胞媒介性フーリン切断事象の欠損は、仮定的には、代償され得る。可能な代償アプローチの非限定的例には、１）その構築物の１つのカルボキシ末端を、志賀毒素Ａ１断片様ポリペプチド領域のカルボキシ末端で終結させること、２）志賀毒素Ａサブユニットポリペプチドがそれの志賀毒素Ａ１断片様ポリペプチドのカルボキシ末端の近くですでにニッキングされているように、志賀毒素由来構築物を作製すること、３）天然の志賀毒素フーリン切断事象の欠損を機能的に代用することができる異種性及び／又は異所性プロテアーゼを改変すること、並びに４）アプローチ３及び４の組合せが挙げられる。
第１のアプローチにおいて、志賀毒素Ａ１断片様ポリペプチドのカルボキシ末端は、いかなるカルボキシ末端部分によっても覆われず、したがって、志賀毒素Ａ１断片様ポリペプチドのカルボキシ末端は、小胞体におけるＥＲＡＤ機構による認識のために永久的に露出されている。最後の３つのアプローチにおいて、志賀毒素Ａ１断片様ポリペプチドは、小胞体において、志賀毒素Ａ１断片様ポリペプチドのカルボキシ末端がＥＲＡＤ機構による認識のために露出するように、その分子が中毒性細胞の小胞体に達する時までに、その構築物の１つ又は２つ以上の他の成分から細胞内で解離するように設計することができる。例えば、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドを含む細胞毒性分子は、標的細胞に接触する前に、Ａ１断片様領域のカルボキシ末端の近くでそのポリペプチド領域にニックを入れるように、プロテアーゼで前処理され得る。或いは、細胞毒性分子は、標的細胞の細胞内プロテアーゼにより切断されるプロテアーゼ部位を含むように改変することができる。
中毒性細胞媒介性フーリン切断事象の欠損を代償する志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドを設計するためのこれらの仮定上のアプローチは、野生型志賀ホロ毒素、又は最適な天然に存在するフーリン切断部位を含む野生型配列のみを含む志賀毒素Ａサブユニット構築物と比較して、細胞毒性の効率及び効力を有意に変更し得る。例えば、現在、フーリン切断と等価の完全に代償的な細胞毒性を提供することができる、フーリン以外の標的細胞エンドプロテアーゼに頼る代償アプローチは知られておらず、カルパインのようなフーリンの代替の細胞プロテアーゼは、志賀毒素細胞毒性を促進することにおいて効率がより低いことが示されている（Garred O et al.,Exp Cell Res 218: 39-49 (1995)；Garred O et al., J Biol Chem 270: 10817-21 (1995)；Kurmanova A etal., Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007)）。
本発明は、中毒性細胞内のフーリン切断事象の欠損の代償によるか、又はいくつかの解明されていない理由によるかに関わらず、強い細胞毒性であるフーリン切断耐性志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドを提供する。本発明のある特定の細胞標的化分子は、少なくとも、プロテアーゼ切断感受性の野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド領域を含む細胞標的化分子と同じくらい効率的かつ強い細胞毒性である（下記の実施例参照）。
Ｃ．安定性及びインビボ忍容性の改善
ある特定の実施形態において、本発明の分子（例えば、本発明の細胞標的化分子）は、フーリン切断感受性がより高いアナログ及び／又は脱免疫化がより低いアナログ（アナログは、本発明の１つ又は２つ以上の構造的特徴を欠く、密接に関係した分子である）と比較して、安定性の増加及び／又はインビボ忍容性の改善を示す。
参照分子と比較しての細胞標的化分子の安定性の増加は、インビトロ及び／又はインビボで示され得る。時間経過における治療用又は診断用分子の安定性は、重要な特徴であり、どの適用についてその分子が実際に利用され得るかに影響を与え得る。分子安定性には、インビトロ及びインビボ、例えば、投与後の生物体内での、並びに一連の温度及び濃度にわたっての保管中の安定性などが挙げられる。ある特定の免疫毒素又はリガンド−毒素融合体について、毒素と他の成分の連結の安定性は、生物体内での時間経過における非標的化毒素の存在及び／又は量によって引き起こされる非特異的毒性の量に影響し得る。
本発明のある特定の細胞標的化分子は、プロテアーゼ切断感受性がより高いバリアントと比較して増加したインビボ忍容性として顕在化される、インビボでの非特異的毒性の低減を示す。インビボ忍容性は、当技術分野において公知の、及び／又は本明細書に記載される技術を使用して熟練した作業者によって決定され得る。死亡率を使用してインビボ忍容性を評価することに加えて、罹患の徴候、例えば、体重、身体的外観、測定可能な臨床徴候、非挑発性行動、及び外部刺激に対する応答の側面などがインビボ忍容性を評価するために使用され得る（例えば、Morton D, Griffiths P, Vet Rec 116: 431-43 (1985)；Montgomery C, Cancer Bull 42: 230-7 (1990)；Ullman-Cullere M, Foltz C, Lab Anim Sci49: 319-23 (1999)；Clingerman K, Summers L, J Am Assoc Lab Anim Sci 51:31-6 (2012)参照）。罹患及び／又は瀕死の徴候に応えて、安楽死が使用され、したがって、死亡時点を生じる場合がある。例えば、２〜３日間に１５〜２０％の体重の減少が、げっ歯類における罹患の徴候として、及び安楽死を正当とする理由として使用することができる（例えば、Institute of Laboratory Animal Research 2011. Guide for the care anduse of laboratory animals, 8th ed., Washington, DC, U.S.: National AcademiesPress参照）。
フーリン切断感受性がより高いアナログと比較しての本発明の例示的な細胞標的化分子について観察されたインビボ忍容性の改善は、フーリン切断感受性志賀毒素エフェクターポリペプチド領域を含む関連分子の用量と比較して、本発明のこれらの細胞標的化分子のはるかに多い用量が、哺乳類へ安全に投与され得る。本発明のある特定の細胞標的化分子は、プロテアーゼ感受性がより高いバリアントと比較して、低下した非特異的毒性を示し得、プロテアーゼ耐性が、志賀毒素エフェクター成分と細胞標的化部分成分の連結を保護し、かつ保存する働きをするからである。
加えて、本発明の細胞標的化分子についてのインビボ忍容性は、所定の細胞標的化分子の脱免疫化性と関係し得る。したがって、本発明のそのような脱免疫化された細胞標的化分子のより高い用量が、「脱免疫化されていない」又は脱免疫化の程度がより低い志賀毒素エフェクターポリペプチド（例えば、野生型志賀毒素Ａ１断片）を含む関連分子の用量と比較して哺乳類へ安全に投与され得る。
加えて、本発明のある特定の分子は、プロテアーゼ切断感受性がより高いバリアントと比較して、インビトロ及び／又はインビボの両方で半減期の増加を示す。分子安定性は、所望の分子の半減期をそれの成分の会合に関して決定することによりアッセイすることができる。本発明の分子のある特定の実施形態は、フーリン切断感受性バリアントと比較して、特に、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分と１つ又は２つ以上の他の成分の会合の継続に関して、より長い半減期を有するだろう。例えば、本発明の分子のある特定の実施形態は、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分と別の成分、例えば、細胞標的化結合領域の会合の継続に関して、フーリン切断感受性部位がそれらの２つの成分の間にあるフーリン切断感受性バリアントと比較して、より長い半減期を有するだろう。
Ｄ．志賀毒素Ａサブユニット細胞毒性による細胞殺滅
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子のある特定の実施形態
は、細胞毒性である。本発明の細胞標的化分子のある特定のさらなる実施形態は、１つ又は２つ以上の志賀毒素エフェクターポリペプチド成分の存在によってのみ細胞毒性である。志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットそれぞれは、いったん細胞のサイトゾル内にあれば、真核細胞を死滅させる能力がある酵素活性のあるポリペプチド領域を含む。志賀毒素ファミリーのメンバーは、真核細胞を死滅させることに適応しているため、志賀毒素由来の分子、例えば、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドのある特定の実施形態を含む分子などは、強力な細胞殺滅活性を示し得る。
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態について、細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞（例えば、標的陽性細胞）を接触させることにより、細胞標的化分子は、その細胞の死を引き起こす能力がある。ある特定のさらなる実施形態について、細胞標的化分子のＣＤ５０値は、非標的化の野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド（例えば、配列番号４）より非常に強力である、５ｎＭ未満、２．５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、又は０．２５ｎＭ未満である。
細胞殺滅は、本発明の分子を使用して、標的細胞の様々な条件下、例えば、エクスビボで操作された標的細胞、インビトロで培養された標的細胞、インビトロで培養された組織試料内の標的細胞、又は多細胞生物体内のようなインビボ設定における標的細胞などにおいて、達成され得る。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は、（１）脱免疫化された志賀毒素エフェクター部分領域、（２）志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端近くのプロテアーゼ切断耐性領域、（３）カルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフ、及び／又は（４）異種Ｔ細胞エピトープを組み込まれた若しくは挿入された領域を含むが、ある特定のさらなる実施形態について、これらの構造改変は、例えば野生型志賀毒素Ａ１断片などの野生型志賀毒素Ａサブユニットポリペプチドを含む参照分子と比較して、志賀毒素細胞毒性の効力を有意には変化させない。したがって、脱免疫化され、プロテアーゼ切断耐性であり、及び／又は組み込まれた若しくは挿入された異種エピトープを有する、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は、１つ又は２つ以上の様々な他の機能又は性質を提供しながら、強力な細胞毒性を維持することができる。
志賀毒素エフェクターポリペプチドを含むすでに細胞毒性の細胞標的化分子は、細胞毒性がより高く、及び／又は完全に異なる機構を介して作動する重複性のバックアップ細胞毒性を有するように、本明細書に提供された情報及び方法を使用して熟練した作業者により改変され得る。これらの複数の細胞毒性機構は、それらの機能多様性により（例えば、直接的及び間接的な細胞殺滅の２つの機構、並びに局所的区域への免疫刺激の機構を介して、強力な殺滅を提供することにより）、互いに補完し、（例えば、（標的細胞が、以前活性のあった機構の一部に対して耐性であり、又はそれに対するいくらかの免疫を獲得している場合のような）他の機構の非存在下で、１つの細胞殺滅機構を提供することにより）重複して互いにバックアップし、及び／又は（悪性又は感染細胞が複数の異なる細胞殺滅機構を同時にブロックするという可能性が低い状況へ耐性を限定することにより）発生した耐性に対して保護し得る。
Ｅ．細胞表面上のＭＨＣクラスＩ提示のためのＴ細胞エピトープの送達
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は、Ｔ細胞エピトープを含み、そのエピトープは、有核脊索動物細胞による送達及び細胞表面提示のためのエピトープ−ペプチドカーゴの選択が事実上、無制限である、「Ｔ細胞エピトープを送達する」分子の改変を可能にする。ある特定の実施形態について、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子はそれぞれ、志賀毒素
エフェクターポリペプチド及び／又は細胞標的化分子と会合した１つ又は２つ以上のＴ細胞エピトープを細胞のプロテアソームへ送達する能力がある。その後、送達されたＴ細胞エピトープは、タンパク質分解性プロセシングを受け、細胞の表面上のＭＨＣクラスＩ経路により提示される。ＭＨＣクラスＩエピトープを細胞標的化分子中へ操作することにより、脊索動物免疫系の有益な機能を利用し、かつ指揮するために免疫刺激抗原の標的化送達及び提示が達成され得る。
ある特定の実施形態について、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド又は細胞標的化分子は、細胞表面提示のために、細胞のＭＨＣクラスＩ分子へＴ細胞エピトープを送達する能力がある。ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド又は細胞標的化分子は、追加の外因性材料としてか、又は志賀毒素エフェクターポリペプチド内に組み込まれ若しくは挿入されているかに関わらず、異種Ｔ細胞エピトープを含む。ある特定のさらなる実施形態について、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド又は細胞標的化分子は、細胞表面提示のために、組み込まれた又は挿入されたＴ細胞エピトープをＭＨＣクラスＩ分子へ送達する能力がある。
ある特定の実施形態について、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチド中に組み込まれ又は挿入されているＴ細胞エピトープを、細胞のＭＨＣクラスＩ分子へ送達する能力があり、その細胞において、志賀毒素エフェクターポリペプチドが、その細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子によるＴ細胞エピトープの提示のために存在する。ある特定のさらなる実施形態について、Ｔ細胞エピトープは、異種Ｔ細胞エピトープである。ある特定のさらなる実施形態について、Ｔ細胞エピトープは、すでに知られていようが、又は熟練した作業者にとって今や日常的である方法を使用して将来、同定されようが、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープとして機能する。
ある特定の実施形態について、本発明の細胞標的化分子は、細胞標的化分子と会合しているＴ細胞エピトープを、細胞の表面上のＭＨＣクラスＩ分子によるＴ細胞エピトープの提示のために、細胞のＭＨＣクラスＩ分子へ送達する能力がある。ある特定のさらなる実施形態について、Ｔ細胞エピトープは、志賀毒素エフェクターポリペプチド中に組み込まれ、又は挿入されている異種Ｔ細胞エピトープである。ある特定のさらなる実施形態について、Ｔ細胞エピトープは、すでに知られていようが、又は熟練した作業者にとって今や日常的である方法を使用して将来、同定されようが、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープとして機能する。
ある特定の実施形態について、細胞を本発明の細胞標的化分子と接触させることにより、細胞標的化分子は、細胞標的化分子と会合しているＴ細胞エピトープ−ペプチドを、細胞の表面上のＭＨＣクラスＩ分子によるＴ細胞エピトープ−ペプチドの提示のために、細胞のＭＨＣクラスＩ分子へ送達する能力がある。ある特定のさらなる実施形態について、Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチド中に組み込まれ、又は挿入されている異種エピトープである。ある特定のさらなる実施形態について、Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、すでに知られていようが、又は熟練した作業者にとって今や日常的である方法を使用して将来、同定されようが、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープとして機能する。
本発明の細胞標的化分子への異種エピトープの付加、又は細胞標的化分子内の異種エピトープの存在は、追加の異種材料としてか、又は志賀毒素エフェクターポリペプチド内に組み込まれ、若しくは挿入されているかに関わらず、脊索動物内の有核標的細胞による細胞表面提示のための選択されたエピトープの細胞標的化送達のためにそのような細胞標的化分子を使用する方法を可能にする。
本発明のある特定のＣＤ８＋Ｔ細胞で過免疫された志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子の１つの機能は、細胞によるＭＨＣクラスＩ提示のための、１つ又は２つ以上のＴ細胞エピトープ−ペプチドのＭＨＣクラスＩ分子への送達である。異種Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの標的細胞のＭＨＣクラスＩ系への送達は、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子と会合したＴ細胞エピトープ−ペプチドを提示するように標的細胞を誘導するために使用することができ、その後、標的細胞を攻撃する、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の活性化をもたらす。
熟練した作業者は、当技術分野において公知の技術を用いて、本発明のある特定の志賀毒素エフェクターポリペプチドを様々な他の細胞標的化結合領域に会合させ、結合させ、及び／又は連結させて、細胞へ物理的に結合している特定の細胞外の標的生体分子を標的にし、これらの細胞標的分子の標的細胞内在化を促進する本発明の細胞標的化分子を作製することができる。全ての有核脊椎動物細胞は、ＭＨＣクラスＩ系を使用して細胞内エピトープを提示する能力があると考えられている。したがって、本発明の細胞標的化分子の細胞外標的生体分子は、原理的には、そのような細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路へのＴ細胞エピトープ送達のために、いかなる有核脊椎動物細胞をも標的にし得る。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子のエピトープ送達機能は、当技術分野において熟練した作業者に公知の及び／又は本明細書に記載される様々な標準方法により検出し、かつモニターすることができる。例えば、本発明の細胞標的化分子の、Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを送達し、かつ標的細胞のＭＨＣクラスＩ系によるエピトープ−ペプチドの提示を駆動させる能力は、様々なインビトロ及びインビボのアッセイを使用して調べることができ、そのアッセイには、例えば、ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体の直接的検出／可視化、異種Ｔ細胞エピトープ−ペプチドのＭＨＣクラスＩ分子に対する結合親和性の測定、及び／又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ，cytotoxic T-lymphocyte）応答をモニターすることによる標的細胞上のＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体提示の機能的影響の測定が挙げられる（例えば、下記の実施例参照）。
本発明のポリペプチド及び分子のこの機能をモニターする、ある特定のアッセイは、インビトロ又はエクスビボでの特定のＭＨＣクラスＩ／ペプチド抗原複合体の直接的検出を含む。ペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体の直接的可視化及び定量化のための一般的な方法は、熟練した作業者に公知の様々な免疫検出試薬を含む。例えば、特異的なモノクローナル抗体は、特定のＭＨＣクラスＩ／ペプチド抗原複合体を認識するように発生させることができる。同様に、TCR-STAR試薬（Altor Bioscience Corp.社, Miramar, FL, U.S.）などの可溶性多量体Ｔ細胞受容体は、特異的なＭＨＣ Ｉ／抗原複合体を直接的に可視化し、又は定量化するために使用することができる（Zhu X et al., J Immunol 176: 3223-32 (2006)）。これらの特異的ｍＡｂ又は可溶性多量体Ｔ細胞受容体は、例えば、免疫組織化学法、フローサイトメトリー、及び酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ，enzyme-linked immuno assay）を含む、様々な検出方法と共に使用され得る。
ＭＨＣ Ｉ／ペプチド複合体の直接的同定及び定量化のための代替方法は、マススペクトル法分析、例えば、ProPresent Antigen Presentation Assay（ProImmune, Inc.社, Sarasota, FL, U.S.）（そのアッセイにおいて、ペプチド−ＭＣＨクラスＩ複合体が細胞の表面から抽出され、その後、そのペプチドが、精製され、シーケンシングマススペクトル法により同定される）を含む（Falk K et al., Nature 351: 290-6 (1991)）。
本発明のポリペプチド及び分子のＴ細胞エピトープ送達及びＭＨＣクラスＩ提示機能をモニターするためのある特定のアッセイは、ＭＨＣクラスＩとペプチドの結合及び安定性をモニターするためのコンピュータ的及び／又は実験的方法を含む。ペプチドのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に対する結合応答を予測するために熟練した作業者が用いるのに、いく
つかのソフトウェアプログラムが利用可能であり、例えば、The Immune Epitope Databaseand Analysis Resource（ＩＥＤＢ）分析リソースＭＨＣ−Ｉ結合予測コンセンサスツ
ール（Analysis Resource MHC-I binding prediction Consensustool）（Kim Y et al.,
Nucleic Acid Res 40: W525-30 (2012)）である。いくつかの実験的アッセイが日常的に適用されており、例えば、結合動態を定量化及び／又は比較する細胞表面結合アッセイ及び／又は表面プラズモン共鳴アッセイである（Miles K et al., Mol Immunol 48: 728-32
(2011)）。追加として、既知の対照と比較した、所定のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子につ
いての三元ＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化させるペプチドの能力の測定に基づいた他のＭＨＣ−ペプチド結合アッセイが開発されている（例えば、ProImmmune, Inc社製のＭＨ
Ｃ−ペプチド結合アッセイ）。
或いは、細胞表面上でのＭＨＣクラスＩ／ペプチド抗原複合体提示の結果の測定は、その特異的な複合体に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答をモニターすることにより実施することができる。これらの測定は、ＣＴＬのＭＨＣクラスＩ四量体又は五量体試薬での直接的標識を含む。四量体又は五量体は、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ，Major Histocompatibility Complex）対立遺伝子とペプチドの複合体によって決定される特定の特異性のＴ細胞受容体と直接的に結合する。追加として、インターフェロンガンマ又はインターロイキンなどの放出されたサイトカインのＥＬＩＳＡ又は酵素結合免疫スポット（ELIspot，enzyme-linkedimmunospot）による定量化は、一般的に、特異的ＣＴＬ応答を同
定するためにアッセイされる。ＣＴＬの細胞傷害性能力は、いくつかのアッセイを使用して測定することができ、そのアッセイには、古典的５１クロム（Ｃｒ）遊離アッセイ又は代替の非放射性細胞傷害性アッセイ（例えば、Promega Corp社., Madison, WI, U.S.から入手可能なCytoTox96（登録商標）非放射性キット及びCellTox（商標）CellTiter-GLO（
登録商標）キット）、Granzyme B ELISpot、カスパーゼ活性アッセイ、又はＬＡＭＰ−１転位置フローサイトメトリーアッセイが挙げられる。標的細胞の殺滅を特異的にモニターするために、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ，carboxyfluoresceindiacetate succinimidyl ester）を用いて、インビトロ又はイ
ンビボ調査のために所望の細胞集団を容易かつ迅速に標識し、エピトープ特異的ＣＳＦＥ標識標的細胞の殺滅をモニターすることができる（Durward M et al., J Vis Exp 45 pii
2250 (2010)）。
ＭＨＣクラスＩ提示に対するインビボ応答は、ＭＨＣクラスＩ／抗原促進物質（例えば、ペプチド、タンパク質、又は不活性化／弱毒化ウイルスワクチン）を投与し、続いて、活性物質（例えば、ウイルス）での誘発、及びその物質に対する応答を、典型的にはワクチン接種をしていない対照と比較して、モニターすることにより追跡することができる。エクスビボでの試料は、前に記載された方法（例えば、ＣＴＬ細胞傷害性アッセイ及びサイトカイン放出の定量化）と類似した方法でＣＴＬ活性をモニターすることができる。
ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子は、中毒性細胞から、溶解後、免疫親和性を使用して単離され（例えば、抗ＭＨＣ抗体「プルダウン」精製）、会合したペプチド（すなわち、単離されたＭＨＣ分子により提示されたペプチド）は、その精製された複合体から回収される。回収されたペプチドは、シーケンシングマススペクトル法により分析される。マススペクトル法データは、外因性（非自己）ペプチド（Ｔ細胞エピトープＸ）の配列及び（「自己」又は非免疫原性ペプチドを表す）ヒトについてのinternational protein indexからなるタンパク質データベースライブラリーに対して比較される。
そのペプチドは、確率データベースによる有意性によりランク付けされる。全ての検出された抗原性（非自己）ペプチド配列が列挙される。データは、誤ったヒットを減らすためにスクランブル化デコイデータベースに対して検索することにより検証される（例えば、Ma B, Johnson R, Mol Cell Proteomics 11: O111.014902 (2012)参照）。結果は、Ｔ細
胞エピトープＸ由来のペプチドが、中毒性標的細胞の表面上でＭＨＣ複合体として提示さ
れることを示すだろう。
提示されるペプチド−抗原−ＭＨＣ複合体のセットは、発現した抗原特異性ＨＬＡ分子により細胞間で異なり得る。その後、Ｔ細胞は、異なる抗原特異性を有する異なるＴＣＲ分子を使用して、細胞表面上にディスプレイされた特異的ペプチド−抗原−ＭＨＣ複合体を認識することができる。
複数のＴ細胞エピトープは、本発明の細胞標的化分子により、例えば、単一のプロテアソーム送達性エフェクターポリペプチド内に２つ又は３つ以上の異なるＴ細胞エピトープを組み込むことにより、送達され得るため、本発明の単一の細胞標的化分子は、異なるＭＨＣクラスバリアントを有する同じ種の脊索動物において、例えば、異なるＨＬＡ対立遺伝子を有するヒトにおいて、有効であり得る。これは、ＭＨＣ複合体タンパク質多様性及び多型に基づいた対象の異なる亜集団において異なる有効性を有する異なるＴ細胞エピトープの、単一分子内での組合せを可能にし得る。例えば、ヒトＭＨＣ複合体タンパク質、ＨＬＡタンパク質は、遺伝学的祖先、例えば、アフリカ人（サハラ以南）、アメリカンインディアン、コーカソイド、モンゴロイド、ニューギニア及びオーストラリア人、又は太平洋諸島系に基づいて、ヒトの間で異なる。
本発明のＴ細胞エピトープを送達するポリペプチド及び分子に関わる適用は、幅広い。哺乳類生物におけるあらゆる有核細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体化した、それらの細胞外表面上での免疫原性Ｔ細胞エピトープ−ペプチドのＭＨＣクラスＩ経路提示の能力があり得る。加えて、Ｔ細胞エピトープ認識の感受性は、ごく少数のＭＨＣ−Ｉペプチド複合体だけが、免疫応答を生じるのに提示されることが必要とされるように精巧であり、例えば、単一の複合体の提示だけでも、エフェクターＴ細胞による認識にとって十分であり得る（Sykulev Y et al.,Immunity 4: 565-71 (1996)）。
Ｔ細胞応答の活性化は、標的細胞に対する患者自身の免疫系を刺激するある特定の抗がん性、抗新生物性、抗腫瘍性、及び／又は抗菌性生物学的製剤の望ましい特性である。ロバストかつ強いＴ細胞応答の活性化はまた、多くのワクチンの望ましい特性でもある。生物体内における標的細胞によるＴ細胞エピトープの提示は、生物体内における標的細胞及び／又はそれの全般的な場所へのロバストな免疫応答の活性化をもたらし得る。したがって、提示のためのＴ細胞エピトープの標的化送達は、治療レジメ中にＴ細胞応答を活性化するための機構として利用され得る。
ＭＨＣクラスＩ系によるＴ細胞免疫原性エピトープ−ペプチドの提示は、ＣＴＬ媒介性溶解による殺滅のために提示細胞を標的にし、また、局所的微小環境においても免疫刺激を誘発する。標的細胞内在化型治療用分子の志賀毒素エフェクターポリペプチド成分内の免疫原性エピトープ配列を改変することにより、免疫刺激性抗原の標的化送達及び提示が達成され得る。免疫刺激性非自己抗原、例えば、高い免疫原性を有する既知のウイルス抗原などの標的細胞による提示は、他の免疫細胞へシグナルを送って、標的細胞を破壊することに加えて、より多くの免疫細胞をその区域へ動員する。
ＭＨＣクラスＩ複合体による免疫原性Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの提示は、ＣＴＬ媒介性細胞溶解による殺滅のために提示細胞を標的にする。免疫刺激性非自己抗原、例えば、高い免疫原性を有する既知のウイルスエピトープ−ペプチドなどの標的細胞による提示は、他の免疫細胞へシグナルを送って、標的細胞を破壊し、かつより多くの免疫細胞を脊索動物内の標的細胞部位へ動員することができる。
したがって、すでに細胞毒性の分子、例えば、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む治療用、又は潜在的治療用分子は、本発明の方法を使用して、細胞毒性のより高い分子
へと、並びに／又はＴ細胞エピトープの送達、エフェクターＴ細胞の提示、及び刺激を介して作動する追加の細胞毒性機構を有するように、改変され得る。これらの複数の細胞毒性機構は、（例えば、直接的標的細胞殺滅と間接的（ＣＴＬ媒介性）細胞殺滅の両方を提供することにより）互いに補完し、（例えば、１つの細胞殺滅機構を他の機構の非存在下で提供することにより）重複して互いにバックアップし、及び／又は（悪性又は感染細胞が２つの異なる細胞殺滅機構を同時にブロックするように進化するという起こりそうにない状況へ耐性を限定することにより）治療耐性の発生から保護し得る。
加えて、触媒作用に基づいた細胞毒性を示す志賀毒素エフェクターポリペプチド領域を含む細胞毒性分子は、熟練した作業者により、日常的方法を使用して、酵素不活性なバリアントへ改変され得る。例えば、細胞毒性分子の細胞毒性志賀毒素エフェクターポリペプチド成分は、生じた分子が、Ｔ細胞エピトープを標的細胞のＭＨＣクラスＩ系へ送達し、その後、標的細胞の表面へ提示するそれの能力により、なお細胞毒性であり得るように、１つ又は２つ以上の変異及び／又は短縮の導入により、活性の低減をもたらされ、及び／又は不活性にされ得る。別の例において、Ｔ細胞エピトープは、志賀毒素エフェクターポリペプチドへ挿入され又は組み込まれ得、その結果、志賀毒素エフェクターポリペプチドが、その加えられたエピトープにより不活性化される（例えば、国際公開第２０１５／１１３００７号参照）。このアプローチは、１つの細胞毒性機構を取り除き、同時に別の機構を保持又は加え、また、送達されたＴ細胞エピトープ提示又は「抗原接種（seeding）
」によって生物体内の標的細胞の局所的区域へ免疫刺激を示す能力のある分子を与え得る。さらに、組み込まれた又は挿入された異種Ｔ細胞エピトープを含む本発明の細胞標的化分子の無細胞毒性バリアントは、脊索動物内の免疫刺激、及び／又は脊索動物内の標的細胞の、ＭＨＣクラスＩ分子にディスプレイされたエピトープでの標識に関わる適用において有用であり得る。
本発明のある特定の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子のＴ細胞エピトープを送達する能力は、様々な条件下、及び非標的化バイスタンダー細胞の存在下、例えば、エクスビボで操作された標的細胞、インビトロで培養された標的細胞、インビトロで培養された組織試料内の標的細胞、又は多細胞生物体内のようなインビボ設定における標的細胞などにおいて、達成され得る。
Ｆ．標的化細胞毒性及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞の関与による細胞殺滅
ある特定の実施形態について、本発明の細胞標的化分子は、１）標的細胞によるＭＨＣクラスＩ提示のためのＴ細胞エピトープの送達、及び／又は２）強力な細胞毒性を提供することができる。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態について、細胞標的化結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞を接触させることにより、本発明の細胞標的化分子は、その細胞の死を引き起こす能力がある。細胞殺滅の機構は、例えば毒素エフェクターポリペプチド領域の酵素活性により直接的で、又はＣＴＬ媒介性細胞溶解により間接的であり得る。
Ｉ．Ｔ細胞エピトープの送達及びＭＨＣクラスＩ提示による間接的細胞殺滅
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、それらが、標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路へ送達され、かつ標的細胞の細胞表面上で提示される能力があるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むため、細胞毒性である。例えば、本発明の、Ｔ細胞エピトープを送達する、ＣＤ８＋Ｔ細胞で過免疫された、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、内因性エピトープ脱免疫化があろうとなかろうと、間接的細胞殺滅に関わる適用のための細胞標的化分子の成分として使用され得る。
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、細胞標的化結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞を接触させることにより、本発明の細胞標的化
分子は、例えば、標的細胞による１つ又は２つ以上のＴ細胞エピトープの提示、及びその後の、標的細胞を死滅させるＣＴＬの動員により、その細胞の死を間接的に引き起こす能力がある。
細胞によるＭＨＣクラスＩ分子と複合体化した抗原性ペプチドの提示は、アポトーシスの誘導、溶解、及び／又は壊死を介する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による標的化殺滅に対して提示細胞を感作させる。加えて、標的細胞を認識するＣＴＬは、免疫刺激性サイトカイン、例えば、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ，interferon gamma）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ，tumornecrosis factor）、マクロファージ炎症性タンパク
質−１ベータ（ＭＩＰ−１ベータ，macrophage inflammatory protein-1 beta）、並びにＩＬ−１７、ＩＬ−４、及びＩＬ−２２などのインターロイキンなどを放出し得る。さらに、提示されたエピトープの認識により活性化されたＣＴＬは、提示細胞の近位にある他の細胞を、それらの近位細胞により提示されるペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体レパートリーを問わず、無差別に死滅させ得る（Wiedemann A et al., Proc Natl Acad Sci USA103: 10985-90 (2006)）。
異なる種内でのＭＨＣ対立遺伝子多様性のため、たった１つのエピトープを含む本発明の細胞標的化分子は、同じ種の異なる患者又は対象へ様々な有効性を示し得る。しかしながら、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態はそれぞれ、標的細胞のＭＨＣクラスＩ系へ同時に送達され得る複数のＴ細胞エピトープを含み得る。したがって、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態について、細胞標的化分子は、ＭＨＣ分子のエピトープ−ペプチド結合親和性にかなりの違い（すなわち、ＭＨＣ対立遺伝子及び／又はＭＨＣ遺伝子型におけるかなりの違い）がある異なる対象を治療するために使用される。加えて、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、複数の細胞殺滅機構を同時に使用すること（例えば、複数の異なるＴ細胞エピトープによる同時での直接的殺滅及び間接的殺滅）により、殺滅をエスケープし得る標的細胞適応（例えば、治療有効性をエスケープし得る標的がん細胞変異、又は「ミュータントエスケープ」）を低減又は防止する。
２．細胞標的化志賀毒素細胞毒性による直接的細胞殺滅
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、それらが、分子中での免疫原性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの存在の有無を問わず、触媒活性のある志賀毒素エフェクターポリペプチドを含むため、細胞毒性である。例えば、内因性エピトープ脱免疫化の有無に関わらず、本発明の、ＣＤ８＋Ｔ細胞で過免疫された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば、志賀毒素エフェクターポリペプチドのリボ毒性の酵素活性、又は非触媒機構によるリボソーム結合及びリボソーム機能への干渉を介してなどの、直接的細胞殺滅に関わる適用のための細胞標的化分子の成分として使用され得る。
本発明のＣＤ８＋Ｔ細胞で過免疫された細胞標的化分子のある特定の実施形態について、細胞標的化結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞を接触させることにより、本発明の細胞標的化分子は、例えば、非標的化細胞傷害性Ｔ細胞の関与なしに、その細胞の死を直接的に引き起こす能力がある（上記セクションＶ〜Ｄ参照）。
Ｇ．細胞型の間での選択的細胞毒性
本発明のある特定の細胞標的化分子は、非標的化バイスタンダー細胞の存在下での特異的標的細胞の選択的殺滅に使用される。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドの送達を、細胞標的化結合領域を介して特異的細胞へ向けることにより、本発明の細胞標的化分子は、非標的化細胞の存在下で、選択された細胞型の排他的又は優先的殺滅を生じる、細胞型特異的な限定的細胞殺滅活性を示し得る。同様に、免疫原性Ｔ細胞エピトープの送達を標的細胞のＭＨＣクラスＩ経路へ向けることにより、本発明の細胞標的化分子により誘導された標的細胞のその後のＴ細胞エピトープの提示及びＣＴＬ媒介性細胞溶解は、非
標的化細胞の存在下で、選択された細胞型を排他的に、又は優先的に死滅させることに限定され得る。加えて、細胞毒性志賀毒素エフェクターポリペプチド領域と免疫原性Ｔ細胞エピトープの両方の細胞標的化送達は、両方の潜在的細胞毒性成分の送達が、非標的化細胞の存在下で標的細胞へ排他的又は優先的に限定されるような本発明の単一の細胞標的化分子によって達成することができる。
ある特定の実施形態について、本発明の細胞標的化分子は、ある特定の濃度において細胞毒性である。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子を細胞型の混合物へ投与することにより、その細胞毒性細胞標的化分子は、細胞外標的生体分子と物理的に結合していない細胞型と比較して、細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞を選択的に死滅させる能力がある。ある特定の実施形態について、本発明の細胞毒性細胞標的化分子は、２つ又は３つ以上の異なる細胞型の混合物内で特異的細胞型の死を選択的又は優先的に引き起こす能力がある。これは、標的生体分子を発現しない「バイスタンダー」細胞型と比べて３倍大きい細胞毒性効果など、高い優先性で特異的細胞型へ細胞毒性活性を向けることを可能にする。或いは、結合領域の標的生体分子の発現は、標的生体分子が、標的にされることになっていない細胞型に関して十分低い量で発現し、及び／又は低量で物理的に結合している場合には、１つの細胞型へ非排他的であってもよい。これは、標的生体分子の有意な量を発現せず、又は標的生体分子の有意な量と物理的に結合していない「バイスタンダー」細胞型と比べて３倍大きい細胞毒性効果など、高い優先性での特異的細胞型の標的化細胞殺滅を可能にする。
ある特定のさらなる実施形態について、細胞毒性細胞標的化分子を２つの異なる細胞型集団へ投与することにより、細胞毒性細胞標的化分子は、最大半量細胞毒性濃度（ＣＤ５０）により定義されるような細胞死を、メンバーが細胞毒性細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子を発現する標的細胞集団に、メンバーが細胞毒性細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子を発現しない細胞集団への同じ細胞毒性細胞標的化分子のＣＤ５０用量の少なくとも３分の１の用量で、引き起こす能力がある。
ある特定の実施形態について、細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞型集団への本発明の細胞標的化分子の細胞毒性活性は、結合領域のいかなる細胞外標的生体分子とも物理的に結合していない細胞型集団への細胞毒性活性の少なくとも３倍高い。本発明によれば、選択的細胞毒性は、（ａ）結合領域の標的生体分子と物理的に結合している特異的細胞型の細胞集団への細胞毒性の、（ｂ）結合領域の標的生体分子と物理的に結合していない細胞型の細胞集団への細胞毒性に対する比率（ａ／ｂ）によって定量化され得る。ある特定の実施形態において、細胞毒性比率は、結合領域の標的生体分子と物理的に結合していない細胞又は細胞型の集団と比較して、結合領域の標的生体分子と物理的に結合している細胞又は細胞型の集団について、少なくとも３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、２５０倍、５００倍、７５０倍、又は１０００倍大きい選択的細胞毒性を示す。
特定の実施形態について、本発明の細胞標的化分子の優先的細胞殺滅機能又は選択的細胞毒性は、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドに存在する追加の外因性材料（例えば、細胞毒性材料）及び／又は異種Ｔ細胞エピトープによるものであり、必ずしも、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域の触媒活性の結果とは限らない。
この優先的細胞殺滅機能は、様々な条件下、及び非標的化バイスタンダー細胞の存在下、例えば、エクスビボで操作された細胞型の混合物、細胞型の混合物を含むインビトロで培養された組織において、又は複数の細胞型の存在下でのインビボで（例えば、多細胞生物体内のインサイツ又は天然の位置で）、標的細胞が本発明のある特定の細胞毒性細胞標的化分子により殺滅されるのを可能にする。
Ｈ．追加の外因性材料の標的細胞の内部への送達
本発明の細胞毒性、細胞分裂阻害性、及び免疫刺激適応に加えて、本発明の細胞標的化分子は、標的化細胞内送達機能として、例えば、情報収集及び診断機能に関わる適用において、使用されてもよい。
低減細胞毒性型及び／又はその無毒型を含む本発明の細胞標的化分子は、細胞標的化分子の結合領域により認識される細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞に侵入する能力があるため、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、追加の外因性材料を標的細胞型の内部へ送達するために使用され得る。例えば、本発明の細胞毒性細胞標的化分子の無毒性バリアント、又は任意で、細胞毒性バリアントは、細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞の内部へ追加の外因性材料を送達し、及び／又はその細胞の内部を標識するために使用され得る。標的生体分子を少なくとも１つの細胞表面に発現する様々な型の細胞及び／又は細胞集団は、外因性材料を受けるために、本発明の細胞標的化分子によって標的にされ得る。本発明の機能成分は、様々な志賀毒素エフェクターポリペプチド、追加の外因性材料、及び結合領域が、カーゴ送達に関わる多様な適用、例えば、腫瘍細胞の非侵襲性インビボ画像化などに適した細胞標的化分子を提供するように、互いに会合され得る点において、モジュール方式である。
本発明のある特定の細胞標的化分子の外因性材料機能のこの送達は、様々な条件下、及び非標的化バイスタンダー細胞の存在下、例えば、エクスビボで操作された標的細胞、インビトロで培養された標的細胞、インビトロで培養された組織試料内の標的細胞、又は多細胞生物体内のようなインビボ設定における標的細胞などにおいて、達成され得る。さらに、本発明のある特定の細胞標的化分子による外因性材料のある特定の細胞への選択的送達は、様々な条件下、及び非標的化バイスタンダー細胞の存在下、例えば、エクスビボで操作された細胞型の混合物、細胞型の混合物を含むインビトロで培養された組織において、又は複数の細胞型の存在下でのインビボで（例えば、多細胞生物体内のインサイツ又は天然の位置で）、達成され得る。
標的細胞を殺滅し、及び／又は標的細胞のＭＨＣ分子による細胞表面提示のために組み込まれた又は挿入されたエピトープを送達することが、例えば、ある特定の濃度範囲において、できない志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は、それでもなお、外因性材料、例えば、検出促進剤などを細胞へ送達するのに有用であり得る。
ある特定の実施形態について、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、低〜ゼロの細胞毒性を示し、それゆえに、「無細胞毒性」及び／又は「低減細胞毒性」と本明細書で呼ばれる。ある特定の実施形態について、本発明の細胞標的化分子は、低〜ゼロの細胞毒性を示し、「無細胞毒性」及び／又は「低減細胞毒性バリアント」と呼ばれ得る。例えば、本発明の分子のある特定の実施形態は、志賀毒素に基づいた細胞毒性の有意なレベルを示さず、１０００ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満の用量において、例えば熟練した作業者に公知の及び／又は本明細書に記載されるアッセイによって測定される場合、適切な参照分子と比較して、有意な量の細胞死がない。ある特定のさらなる実施形態について、本発明の分子は、哺乳類レシピエントの１ｋｇあたり１〜１００μｇの投与量において少しの毒性も示さない。低減細胞毒性バリアントは、ある特定の濃度又は投与量において、なお細胞毒性であり得るが、低下した細胞毒性を示し、例えば、ある特定の状況において、有意なレベルの志賀毒素細胞毒性を示す能力はない。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及びそれを含むある特定の細胞標的化分子は、例えば、本明細書に記載される例示的な置換を含む、志賀毒素Ａサブユニット及び／
又は志賀毒素エフェクターポリペプチドを不活性化するために熟練した作業者に公知の１つ又は２つ以上のアミノ酸置換の追加などにより、無細胞毒性にすることができる。本発明の細胞標的化分子の無細胞毒性及び低減細胞毒性バリアントは、ある特定の状況において、より高い細胞毒性バリアントより、追加の外因性材料の送達により適し得る。
診断機能のための情報収集
本発明のある特定の細胞標的化分子は、特異的な細胞、細胞型、及び／又は細胞集団、加えて、前述のいずれかの特異的な細胞内区画のインビトロ及び／又はインビボ検出に使用される。検出促進剤にコンジュゲートされている本発明の細胞毒性細胞標的化分子の低減細胞毒性及び／又は無細胞毒性型は、それ、又は関連した結合領域、例えば、その同じ標的生体分子、オーバーラップエピトープ、及び／若しくは同じエピトープと高親和性で結合する結合領域などを含む治療レジメンと併せて使用されるコンパニオン診断としてなど診断機能として使用されてもよい。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される細胞標的化分子は、診断と治療の両方、又は診断のみに使用される。同じ細胞毒性細胞標的化分子が診断と治療の両方に使用される場合、本発明のある特定の実施形態について、診断用に検出促進剤を組み入れる細胞標的化分子バリアントは、本明細書に記載される例示的な置換を含む１つ又は２つ以上のアミノ酸置換によるそれの志賀毒素エフェクターポリペプチド領域の触媒作用の不活性化により、それの細胞毒性が低減され、又は無毒性にされ得る。例えば、本発明の細胞標的化分子のある特定の無毒性バリアントは、１ｍｇ／ｋｇ未満の用量の投与後、標的細胞の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満の死を示す。低減細胞毒性バリアントは、ある特定の濃度又は投与量においてまだ細胞毒性であり得るが、低下した細胞毒性を示し、例えば、本明細書に記載される有意なレベルの志賀毒素細胞毒性を示す能力がない。
当技術分野において公知の検出促進剤を本発明の様々な細胞標的化分子にコンジュゲートする能力は、ある特定の細胞、例えば、がん細胞、腫瘍細胞、免疫細胞、及び／又は感染細胞の検出のための有用な組成物を提供する。本発明の細胞標的化分子のこれらの診断用実施形態は、当技術分野において公知の様々な画像化技術及びアッセイによる情報収集に使用され得る。例えば、本発明の細胞標的化分子の診断用実施形態は、患者又は生検試料における個々のがん細胞、免疫細胞、及び／又は感染細胞の細胞内小器官（例えば、エンドサイトーシス、ゴルジ、小胞体、及びサイトゾルの区画）の画像化による情報収集に使用され得る。
様々な型の情報は、診断用か他の用途かに関わらず、本発明の細胞標的化分子の診断用実施形態を使用して収集され得る。この情報は、例えば、新生物細胞型を診断すること、患者の疾患の治療感受性を決定すること、時間経過において抗新生物治療の進行をアッセイすること、時間経過において免疫調節治療の進行をアッセイすること、時間経過において抗菌治療の進行をアッセイすること、移植材料において感染細胞の存在を評価すること、移植材料において望ましくない細胞型の存在を評価すること、及び／又は腫瘤の外科的切除後の残存腫瘍細胞の存在を評価することにおいて有用であり得る。
例えば、患者の亜集団は、本発明の細胞標的化分子の診断用バリアントを使用して収集された情報を用いて確認され得、その後、個々の患者は、それらの診断用実施形態を使用して明らかにされたそれらの固有の特性に基づいて亜集団へさらに分類することができる。例えば、特定の医薬又は治療の有効性は、患者亜集団を定義するために使用される判断基準であり得る。例えば、本発明の特定の細胞毒性細胞標的化分子の無毒性診断用バリアントは、どの患者が、本発明の細胞標的化分子の細胞毒性バリアントに対して陽性に応答すると予測される患者のクラス又は亜集団に入るかを識別するために使用され得る。した
がって、本発明の細胞毒性細胞標的化分子の無毒性バリアントを含む本発明の細胞標的化分子を使用する患者同定、患者層別化、及び診断のための関連した方法は、本発明の範囲内であるとみなされる。
細胞による標的生体分子の発現は、本発明の細胞標的化分子による細胞標的化のために、例えば、直接的細胞殺滅、間接的細胞殺滅、Ｔ細胞エピトープのような外因性材料の送達、及び／又は情報収集のために、天然である必要はない。標的生体分子の細胞表面発現は、感染の結果、病原体の存在、及び／又は細胞内微生物病原体の存在であり得る。標的生体分子の発現は、例えば、ウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス系、アデノ随伴ウイルス系、及びレトロウイルス系参照）での感染後の強制又は誘導された発現によるなど、人工的であり得る。標的生体分子の誘導された発現の例は、オールトランスレチノイン酸及び様々な合成レチノイド、又は任意のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ，retinoic
acid receptor）アゴニストのようなレチノイドへ曝された細胞のＣＤ３８発現の上方制御である（Drach J et al., Cancer Res 54:1746-52 (1994)；Uruno A et al., J Leukoc Biol 90: 235-47 (2011)）。ＣＤ３０の発現は、分裂促進因子、植物性血球凝集素（ＰＨＡ，phytohemagglutinin）、ブドウ球菌プロテインＡ、ＥＢＶウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１又は２（ＨＴＬＶ−１，human T-cell leukemia virus 1又はＨＴＬＶ−
２，human T-cell leukemia virus 2）への曝露によりＢ細胞とＴ細胞の両方において誘
導することができる（例えば、Stein H et al., Blood 66: 848-58 (1985)参照）。別の
例において、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、及びＥＧＦＲ発現は、細胞を電離放射線に曝すことにより、誘導され得る（WattenbergM et al., Br J Cancer 110: 1472-80 (2014)）。さらに、ＰＳＭＡ発現は、アンドロゲン欠乏に応答して上方制御される（例えば、Chang S et
al., Cancer 88: 407-15 (2000)；Meller B et al., EJNMMI Res 5: 66 (2015)参照）。
VI．本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及びそれを含む細胞標的化分子の産生、製造、及び精製
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及びある特定の細胞標的化分子は、当業者周知の技術を使用して産生することができる。例えば、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は、標準的な合成方法によって、組換え発現系の使用によって、又は他のあらゆる好適な方法によって製造することができる。したがって、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は、例えば、（１）標準的な固相又は液相手法を使用して、段階的に又は断片のアセンブリのいずれかによって、細胞標的化分子のポリペプチド又はポリペプチド成分を合成し、最終的なポリペプチド化合物産物を単離及び精製すること；（２）宿主細胞中で本発明の細胞標的化分子のタンパク質又はタンパク質成分をコードするポリヌクレオチドを発現させ、宿主細胞又は宿主細胞培養物から発現産物を回収すること；又は（３）本発明の細胞標的化分子のポリペプチド又はポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを無細胞で、インビトロで発現させ、発現産物を回収することを含む方法によって、又は（１）、（２）若しくは（３）の方法のあらゆる組合せを含む、多数の方法によって合成し、タンパク質成分の断片を得て、それに続きペプチド又はポリペプチド断片を合体させて（例えばライゲートして）ポリペプチド成分を得て、ポリペプチド成分を回収することができる。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、本発明の細胞標的化分子、又は本発明の細胞標的化分子のタンパク質成分を、固相又は液相ペプチド合成を用いて合成することが好ましい場合もある。本発明のポリペプチド及び細胞標的化分子は、標準的な合成方法によって好適に製造することができる。したがって、ペプチドは、例えば、標準的な固相又は液相手法によって、段階的に又は断片のアセンブリのいずれかによってペプチドを合成すること、及び最終的なペプチド産物を単離及び精製することを含む方法によって合成することができる。この文脈において、国際公開第１９９８／０１１１２５号パンフレット、又はとりわけ、Fields G et al., Principles and Practice of Solid-Phase Peptide
Synthesis（Synthetic Peptides, Grant G, ed., OxfordUniversity Press, U.K., 2nd ed., 2002）及びそこに記載された合成例を参照することができる。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は、当業界において周知の組換え技術を使用して調製することができる（産生及び精製することができる）。一般的に、コード化されたポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞を培養して、細胞培養物からタンパク質を精製又は回収することによってタンパク質を調製するための方法は、例えば、Sambrook J et al., Molecular Cloning： ALaboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, U.S., 1989)； Dieffenbach C et al., PCR Primer： ALaboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., U.S., 1995)に記載されている。本発明のポリペプチド及び／
又は細胞標的化タンパク質を産生するのに、あらゆる好適な宿主細胞を使用することができる。宿主細胞は、本発明のポリペプチドの発現を駆動させる１つ又は２つ以上の発現ベクターで安定して若しくは一時的にトランスフェクトされた、形質転換された、形質導入された、又は感染させた細胞であり得る。加えて、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は細胞標的化分子は、例えば変化した細胞毒性、変化した細胞増殖抑制作用、及び／又は変化した血清中半減期などの所望の特性を達成するために、１つ若しくは２つ以上のアミノ酸の変更又は１つ若しくは２つ以上のアミノ酸の欠失又は挿入を引き起こす本発明のポリペプチド又は細胞標的化タンパク質をコードするポリヌクレオチドの改変によって産生することもできる。
本発明のポリペプチド又は細胞標的化タンパク質を産生するように選択することができる多種多様の発現系がある。例えば、本発明の細胞標的化タンパク質の発現のための宿主生物としては、原核生物、例えば大腸菌及び枯草菌（B. subtilis）、真核細胞、例えば
酵母及び糸状菌（filamentous fungi）（Ｓ．セレビジエ（S. cerevisiae）、Ｐ．パストリス（P. pastoris）、アワモリコウジカビ（A. awamori）、及びＫ．ラクティス（K. lactis）など）、藻類（コナミドリムシ（C. reinhardtii）など）、昆虫細胞株、哺乳類細胞（ＣＨＯ細胞など）、植物細胞株、及び真核生物、例えばトランスジェニック植物（シロイヌナズナ（A. thaliana）及びベンサミアナタバコ（N. benthamiana）など）が挙げ
られる。
したがって、本発明はまた、上記で列挙された方法に従って、さらに、本発明のポリペプチド又は本発明の細胞標的化タンパク質のタンパク質成分の一部又は全てをコードするポリヌクレオチド、宿主細胞に導入される場合、本発明のポリペプチド又は細胞標的化タンパク質の一部又は全てをコードすることができる本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び／又は本発明のポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞を使用して、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は細胞標的化分子を産生するための方法も提供する。
組換え技術を使用して宿主細胞又は無細胞系中でタンパク質が発現される場合、高い純度を有するか又は実質的に均一な調製物を得るために、例えば宿主細胞成分などの他の成分から所望のタンパク質を分離すること（又は精製すること）が有利である。精製は、例えば遠心分離技術、抽出技術、クロマトグラフ及び分画技術（例えばゲルろ過によるサイズ分離、汚染物質を除去するための、イオン交換カラム、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、シリカ又は例えばＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、及びプロテインＡセファロースクロマトグラフィーによる電荷分離）、及び沈殿技術（例えばエタノール沈殿又は硫酸アンモニウム沈殿）などの当業界において周知の方法によって達成することができる。本発明のポリペプチド及び／又は細胞標的化分子の純度を増加させるために、多数の生化学精製技術を使用することができる。ある特定の実施形態において、本発明のポリペプチド及び細胞標
的化分子は、ホモ多量体の形態（例えば２つ又は３つ以上の本発明のポリペプチド又は細胞標的化分子を含む分子複合体）で精製されてもよい。
以下の実施例は、例示的な本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子を産生するための方法の非限定的な例、加えて産生方法の具体的な、ただし非限定的な形態の説明である。
VII．本発明の細胞標的化分子を含む医薬品及び診断用組成物
本発明は、以下のさらなる詳細で説明される状態、疾患、障害、又は症状（例えばがん、悪性腫瘍、非悪性腫瘍、増殖異常、免疫障害、及び微生物感染）を治療又は予防するための、単独で、又は医薬組成物中で１つ若しくは２つ以上の追加の治療剤と組み合わせて使用するための、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子を提供する。本発明はさらに、本発明の志賀毒素ポリペプチド若しくは細胞標的化分子、又は薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物を、本発明に従って、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤、又はビヒクルと一緒字含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド又は細胞標的化分子のホモ多量体及び／又はヘテロ多量体の形態を含んでいてもよい。本発明の医薬組成物は、以下のさらなる詳細で説明される疾患、状態、障害、又は症状を治療する、緩和する、又は予防する方法において有用である。このような疾患、状態、障害、又は症状のそれぞれは、本発明に係る医薬組成物の使用に関して別個の実施形態であることが想定される。本発明はさらに、以下でより詳細に説明される本発明に係る少なくとも１つの治療方法で使用するための医薬組成物を提供する。
用語「患者」及び「対象」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用され、少なくとも１つの疾患、障害、又は状態の症状、徴候、及び／又は兆しを呈する、あらゆる生物、一般的には脊椎動物、例えばヒト及び動物などを指す。これらの用語は、哺乳動物、例えば非限定的な例として霊長類、家畜動物（例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、コンパニオンアニマル（例えばネコ、イヌなど）及び実験動物（例えばマウス、ウサギ、ラットなど）を含む。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、又は「治療」及びその文法上の変化形は、有益な又は所望の臨床結果を得るためのアプローチを指す。この用語は、状態、障害若しくは疾患の発症若しくは進行速度を遅延させること、それに関連する症状を低減若しくは軽減すること、状態の完全若しくは部分寛解をもたらすこと、又は上記したもののいずれかのいくつかの組合せを指す場合もある。本発明の目的に関して、有益な又は所望の臨床結果としては、これらに限定されないが、検出可能か又は検出不可能かにかかわらず、症状の低減又は軽減、疾患の程度の減縮、疾患の状態の安定化（例えば悪化させないこと）、疾患の進行の遅延又は減速、病状の緩和又は一時的緩和、及び緩解（部分的か又は総合的かにかかわらず）が挙げられる。「治療する」、「治療すること」、又は「治療」はまた、治療を受けない場合に予測される生存期間に対して生存を延長することを意味する場合もある。したがって治療が必要な対象（例えばヒト）は、すでに問題の疾患又は障害に罹患している対象であってもよい。用語「治療する」、「治療すること」、又は「治療」は、治療がなされない場合と比較した、病理学的な状態又は症状の重症度の増加の阻害又は低減を含み、関連する疾患、障害、又は状態の完全な停止を伴うことを必ずしも意味しない。腫瘍及び／又はがんに関して、治療は、全体的な腫瘍負荷量及び／又は個々の腫瘍サイズの低減を含む。
本明細書で使用される場合、用語「予防する」、「予防すること」、「予防」及びその文法上の変化形は、状態、疾患、障害の発症を予防するための、又は状態、疾患、若しくは障害の病状を変更するためのアプローチを指す。したがって、「予防」は、防止措置又
は予防措置を指す場合もある。本発明の目的に関して、有益な又は所望の臨床結果としては、これらに限定されないが、検出可能か又は検出不可能かにかかわらず、疾患の症状、進行又は発症の予防又は減速が挙げられる。したがって予防が必要な対象（例えばヒト）は、まだ問題の疾患又は障害に罹患していない対象であってもよい。用語「予防」は、治療がなされない場合と比較して疾患の発症を減速することを含み、関連する疾患、障害又は状態の永続的な予防を伴うことを必ずしも意味しない。したがって状態を「予防すること」又はその「予防」は、ある特定の文脈において、その状態を発症するリスクを低減すること、又はその状態に関連する症状の発症を予防すること若しくは遅延させることを指す場合がある。
「有効量」又は「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、対象において少なくとも１つの所望の治療作用、例えば標的とする状態の予防若しくは治療、又は有利には状態に関連する症状の軽減をもたらす組成物（例えば治療用組成物、化合物、又は薬剤）の量又は用量である。最も望ましい治療有効量は、それらを必要とする所与の対象ごとの、当業者によって選択される特定の治療の望ましい効能をもたらすと予想される量である。この量は、熟練した作業者によって理解される様々な要因に応じて様々であると予想され、このような要因としては、これらに限定されないが、治療用組成物（活性、薬物動態学、薬力学、及び生物学的利用率など）の特徴、対象の生理学的な状態（年齢、性別、疾患のタイプ、疾患の段階、全身の状態、与えられた投薬量に対する応答性、及び薬物療法のタイプなど）、調合物中の薬学的に許容される１つ又は複数の担体の性質、及び投与経路が挙げられる。臨床及び薬理学分野における熟練者は、慣例的な実験を介して、すなわち組成物の投与に対する対象の応答をモニターすること、及びそれに応じて投薬量を調整することによって、治療有効量を決定することができよう（例えばRemington：The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro A, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, U.S., 19th ed., 1995)を参照）。
本発明の診断用組成物は、本発明の細胞標的化分子及び１つ又は２つ以上の検出促進剤を含む。本発明の診断用組成物を生産又は製造する場合、本発明の細胞標的化分子は、直接的又は間接的に１つ又は２つ以上の検出促進剤に連結されていてもよい。分子のタンパク質又はタンパク質性成分に、特に免疫グロブリン及び免疫グロブリン由来のドメインに、様々な検出促進剤を取り込む、付加する、及び／又はコンジュゲートするための、熟練した作業者公知の多数の標準的な技術がある。
情報収集方法のための、例えば生物の疾患、障害、又は状態に対する診断及び／又は予後予測用途などのための、本発明のポリペプチド又は細胞標的化分子に機能するように連結できる、例えば同位体、色素、比色剤、コントラスト増強剤、蛍光剤、生物発光剤、及び磁気性の物質などの熟練した作業者公知の多数の検出促進剤がある（例えばCai W et al., J Nucl Med 48：304-10 (2007)；Nayak T, BrechbielM, Bioconjug Chem 20：825-41(2009)；Paudyal P et al., Oncol Rep 22：115-9 (2009)；Qiao J et al., PLoS ONE 6：e18103 (2011)；Sano K et al., Breast Cancer Res 14：R61(2012)を参照）。これ
らの薬剤は、あらゆる好適な位置で本発明のポリペプチド又は細胞標的化分子に会合していてもよいし、それに連結されていてもよいし、及び／又はその中に取り込まれていてもよい。例えば、検出促進剤の連結又は取り込みは、本発明の分子のアミノ酸残基を介して、又は当業界において公知のいくつかのタイプの連結を介して、例えばリンカー及び／又はキレート化剤などを介してなされてもよい。薬剤の取り込みは、スクリーニング、アッセイ、診断手順、及び／又はイメージング技術で診断用組成物の存在を検出できるような方法でなされる。
同様に、熟練した作業者公知の多数のイメージングアプローチ、例えば、医療の場で一般的に使用される非侵襲的なインビボのイメージング技術、例えばコンピュータ断層撮影
イメージング（ＣＴスキャニング）、光学的イメージング（直接、蛍光、及び生物発光イメージングを含む）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ，magnetic resonance imaging）、ポジトロンエミッショントモグラフィー（ＰＥＴ，positron emission tomography）、単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ，single-photon emission computed tomography）、超音波、及びＸ線コンピュータ断層撮影イメージングなどがある。
VIII．本発明の細胞標的化分子を含む医薬品及び／又は診断用組成物の産生又は製造
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子のいずれかの薬学的に許容される塩又は溶媒和物は、本発明の範囲内である。
用語「溶媒和物」は、本発明の文脈において、溶質（この場合、本発明に係るタンパク質性化合物又はそれらの薬学的に許容される塩）と溶媒とで形成される規定の化学量論の複合体を指す。この文脈において溶媒は、例えば、水、エタノール、又は別の薬学的に許容される、典型的には低分子の有機化学種、例えば、これらに限定されないが、酢酸又は乳酸であってもよい。問題の溶媒が水である場合、このような溶媒和物は通常、水和物と称される。
本発明のポリペプチド及びタンパク質、又はそれらの塩は、保管又は投与のために調製された医薬組成物として製剤化してもよく、医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体中に本発明の分子又はそれらの塩の治療有効量を含む。用語「薬学的に許容される担体」は、標準的な製剤用担体のいずれかを含む。治療的分子用途のための薬学的に許容される担体は薬学分野において周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. (A.Gennaro, ed., 1985)で説明されている。「薬学的に許容される担体」は、本明細書で使用される場合、ありとあらゆる生理学的に許容できる、すなわち適合性の、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗微生物剤、等張剤、及び吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される担体又は希釈剤としては、経口、直腸、経鼻又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、及び経皮を含む）投与に好適な調合物で使用されるものが挙げられる。例示的な薬学的に許容される担体としては、滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製のための、滅菌水溶液又は分散液及び滅菌粉末が挙げられる。本発明の医薬組成物で採用される可能性がある好適な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物、植物油、例えばオリーブ油、並びに注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。適した流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液のケースでは必要な粒度の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。ある特定の実施形態において、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば注射又は注入による）に好適である。選択される投与経路に応じて、低いｐＨや特定の投与経路で患者に投与した場合に活性なタンパク質が遭遇する可能性がある他の自然の不活性化条件の作用から化合物を保護することを意図した材料で、タンパク質又は他の医薬品成分をコーティングしてもよい。
本発明の医薬組成物の調合物は、都合のよい形態として単位剤形で提供してもよいし、薬学分野において周知の方法のいずれかによって調製してもよい。このような形態において、組成物は、適切な量の活性成分を含有する単位用量に分割される。単位剤形は、パッケージ化された調製物であってもよく、パッケージは、個別の量の調製物、例えば、バイアル又はアンプル中に個包装された錠剤、カプセル剤、及び粉末剤を含有する。単位剤形はまた、カプセル剤、カシェ剤、又は錠剤それ自身であってもよいし、又は適切な数のこれらのパッケージ化された形態のいずれかであってもよい。単位剤形は、単回用量の注射可能な形態で、例えばペンの形態で提供されてもよい。組成物は、あらゆる好適な投与の経路及び手段のために製剤化されていてもよい。本明細書に記載される治療用タンパク質
にとって、皮下又は経皮の投与様式が特に好適であり得る。
本発明の医薬組成物はまた、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントを含有していてもよい。微生物の存在の予防は、滅菌手順と、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの包含の両方によって確実にすることができる。また、組成物への例えば糖、塩化ナトリウムなどなどの等張剤も望ましい場合がある。加えて、注射用医薬形態の持続吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の包含によってもたらされる可能性がある。
本発明の医薬組成物はまた、薬学的に許容される抗酸化剤を含んでいてもよい。例示的な薬学的に許容される抗酸化剤は、水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ，butylated hydroxyanisole）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ，butylated hydroxytoluene）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど；及び金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ，ethylenediamine tetraacetic acid）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などである。
別の態様において、本発明は、本発明の異なるポリペプチド及び／若しくは細胞標的化分子、又は前述の物質のいずれかのエステル、塩若しくはアミドの１つ又は組合せ、及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
治療用組成物は、典型的には滅菌されており、製造及び保管条件下で安定である。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高い薬物濃度に好適な他の秩序だった構造として製剤化されてもよい。担体は、例えば、水、アルコール、例えばエタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、又はあらゆる好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適した流動性は、例えば、当業界において周知の製剤化学に従い、例えばレシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液のケースでは必要な粒度の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。ある特定の実施形態において、等張剤、例えば、糖及び多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトールなど、又は塩化ナトリウムが組成物において望ましい場合がある。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に包含させることによってもたらされる可能性がある。
皮内又は皮下適用に使用される溶液又は懸濁液は、典型的には、滅菌希釈剤、例えば注射用水、塩類溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒など；抗細菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベンなど；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムなど；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸など；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩など；及び張度調節剤、例えば、塩化ナトリウム又はデキストロースなどの１つ又は２つ以上を含む。ｐＨは、例えば塩酸若しくは水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基、又はクエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩などを含む緩衝剤で調整することができる。このような調製物は、ガラス又はプラスチックで作製された、アンプル、使い捨てのシリンジ又は複数回投与用のバイアル中に封入されていてもよい。
滅菌注射用溶液は、上述した成分の１つ又は組合せを含む適切な溶媒中に本発明のポリペプチド又は細胞標的化分子を必要な量で取り込むこと、必要に応じて、それに続き滅菌精密ろ過することによって調製することができる。分散液は、分散媒及び例えば上述した
ものなどの他の成分を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を取り込むことによって調製することができる。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末のケースにおいて、調製方法は、それらの滅菌ろ過した溶液からあらゆる追加の所望の成分に加えて活性成分の粉末を生じさせる真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）である。
本発明のポリペプチド及び／又は細胞標的化分子の治療有効量を、例えば静脈内、皮膚又は皮下注射によって投与されるように設計する場合、結合剤は、パイロジェンフリーの非経口的に許容できる水溶液の形態であろう。適切なｐＨ、等張性、安定性などを考慮した、非経口的に許容できるタンパク質溶液を調製するための方法は、当業界における能力の範囲内である。静脈内、皮膚、又は皮下注射にとって好ましい医薬組成物は、結合剤に加えて、等張ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、デキストロース注射、デキストロース及び塩化ナトリウム注射、乳酸リンゲル注射用のビヒクル、又は当業界で公知の他のビヒクルを含有するであろう。本発明の医薬組成物はまた、当業者周知の安定剤、保存剤、緩衝剤、抗酸化剤、又は他の添加剤を含有していてもよい。
本明細書の他所で説明されるように、本発明のポリペプチド及び／又は細胞標的化分子は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化した送達系を含む放出制御製剤など、急速な放出から活性な治療剤を保護する担体を用いて調製してもよい。生分解性生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などが使用されてもよい。このような調合物を調製するための多くの方法は、特許化されているか又は一般的に当業者公知である（例えばSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (Robinson J,ed., Marcel Dekker, Inc., NY, U.S., 1978)を参照）。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物（例えば医薬及び／又は診断用組成物）は、本発明の細胞標的化分子の所望のインビボにおける分配を確実にするように製剤化することができる。例えば、血液脳関門は、多くの大きい及び／又は親水性化合物を排除する。特定のインビボにおける位置に本発明の治療的分子又は組成物を標的化するために、それらは、例えば、特定の細胞又は臓器に選択的に輸送される１つ又は２つ以上の部分を含み得るリポソーム中に製剤化されてもよく、そのようにして標的化された薬物送達が強化される。例示的な標的部分としては、葉酸塩又はビオチン；マンノシド；抗体；サーファクタントプロテインＡ受容体；ｐ１２０カテニンなどが挙げられる。
医薬組成物は、インプラント又は微粒子系として使用されるように設計された非経口調合物を含む。インプラントの例は、例えばエマルジョン、イオン交換樹脂、及び可溶性塩溶液などの高分子又は疎水性成分で構成されるデポ製剤である。微粒子系の例は、マイクロスフェア、微粒子、ナノカプセル、ナノスフェア、及びナノ粒子である（例えばHonda M et al., Int J Nanomedicine 8：495-503(2013)；Sharma A et al., Biomed Res Int 2013：960821 (2013)；Ramishetti S, Huang L, Ther Deliv3：1429-45 (2012)を参照）。放出制御製剤は、イオンに感受性を有するポリマー、例えばリポソーム、ポロキサマー（polaxamer）４０７、及びヒドロキシアパタイトなどを使用して調製されてもよい。
IX．本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、及び宿主細胞
本発明のポリペプチド及び細胞標的化分子の他にも、本発明のポリペプチド及び細胞標的化分子、又はそれらの機能的部分をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内に包含される。用語「ポリヌクレオチド」は、用語「核酸」と同等であり、これらのそれぞれは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のポリマー、リボ核酸（ＲＮＡ）のポリマー、ヌクレオチドアナログを使用して生成されたこれらのＤＮＡ又はＲＮＡのアナログ、並びにそれらの派生物、断片及びホモログの１つ又は２つ以上を含む。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖であり得る。このようなポリヌクレオチドは、例えば、ＲＮ
Ａコドンの３番目の位置で許容されることがわかっているゆらぎを考慮に入れた、それでもなお異なるＲＮＡコドンと同じアミノ酸をコードする例示的なタンパク質をコードすることができる全てのポリヌクレオチドを含むことが具体的に開示されている（Stothard P,Biotechniques 28：1102-4 (2000)を参照）。
一態様において、本発明は、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は細胞標的化分子、又はそれらの断片若しくは派生物をコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドとしては、例えば、本発明のポリペプチド又は細胞標的化分子のアミノ酸配列の１つを含むポリペプチドに、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又はそれより高い％で同一なポリペプチドをコードする核酸配列を挙げることができる。本発明はまた、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は細胞標的化分子、又はそれらの断片若しくは派生物、又はあらゆるこのような配列のアンチセンス若しくは相補物をコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも含む。
本発明の分子（例えば、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及びそれを含む細胞標的化分子）の派生物又はアナログは、とりわけ、例えば同じサイズのポリヌクレオチド（又はポリペプチド）配列に対して少なくとも約４５％、５０％、７０％、８０％、９５％、９８％、又は９９％もの同一性で（好ましい同一性は８０〜９９％）、又は当業界において公知のコンピュータ相同性プログラムによってアライメントが行われる並べられた配列と比較した場合、本ポリヌクレオチド（又は本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子）に実質的に相同な領域を有するポリヌクレオチド（又はポリペプチド）分子を含む。例示的なプログラムは、Smith T, Waterman M, Adv Appl Math 2：482-9(1981)のアルゴリズムを使用するデフォルト設定を使用した、ＧＡＰプログラム（WisconsinSequence Analysis Package、UNIX用バージョン８、Genetics Computer Group、University ResearchPark、Madison、WI、U.S.）である。また、本発明の細胞標的
化タンパク質をコードする配列の相補物を、ストリンジェントな条件下（例えばAusubel F et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley &Sons, New York, NY, U.S., 1993)を参照）及びそれより低い条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドも包含される。ストリンジェントな条件は当業者公知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology（JohnWiley & Sons, NY, U.S., Ch. Sec. 6.3.1-6.3.6 (1989)）で見出すことができる。
本発明はさらに、本発明の範囲内のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は細胞標的化分子をコードすることができるポリヌクレオチドは、発現ベクターを産生するための当業界において周知の材料及び方法を使用して、細菌プラスミド、ウイルスベクター及びファージベクターを含む公知のベクターに挿入されてもよい。このような発現ベクターは、あらゆる最適な宿主細胞又は無細胞発現系（例えばｐＴｘｂ１及びｐＩＶＥＸ２．３）中で予期される本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は細胞標的化分子の産生を維持するのに必要なポリヌクレオチドを含むであろう。具体的なタイプの宿主細胞又は無細胞発現系と共に使用するための発現ベクターを含む具体的なポリヌクレオチドは、当業者周知であり、慣例的な実験を使用して決定してもよいし、及び／又は購入してもよい。
用語「発現ベクター」は、本明細書で使用される場合、直鎖状又は環状の、１つ又は２つ以上の発現単位を含むポリヌクレオチドを指す。用語「発現単位」は、所望のポリペプチドをコードし、宿主細胞における核酸セグメントの発現をもたらすことができるポリヌクレオチドセグメントを示す。発現単位は、典型的には、転写プロモーター、所望のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、及び転写ターミネーターを全て機
能するような立体位置で含む。発現ベクターは、１つ又は２つ以上の発現単位を含有する。したがって、本発明の文脈において、単一のポリペプチド鎖を含む本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は細胞標的化分子をコードする発現ベクターは、単一のポリペプチド鎖につき少なくとも１つの発現単位を含むが、それに対して、例えば２つ又は３つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質（例えば１つの鎖がＶＬドメインを含み、第２の鎖が毒素エフェクターポリペプチドに連結されたＶＨドメインを含む）は、少なくとも２つの発現単位を含み、すなわちタンパク質の２つのポリペプチド鎖のそれぞれにつき１つの発現単位を含む。本発明の多連鎖の細胞標的化タンパク質の発現のために、各ポリペプチド鎖の発現単位は、異なる発現ベクターに別々に含有されていてもよい（例えば発現は、各ポリペプチド鎖の発現ベクターが導入された単一の宿主細胞で達成することができる）。
ポリペプチド及びタンパク質の一過性の又は安定な発現を指示することが可能な発現ベクターは当業界において周知である。発現ベクターとしては、一般的に、これらに限定されないが、異種シグナル配列又はペプチド、複製起点、１つ又は２つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列の１つ又は２つ以上が挙げられ、これらのそれぞれは当業界において周知である。採用可能な任意選択の調節制御配列、統合配列、及び有用なマーカーが当業界において公知である。
用語「宿主細胞」は、発現ベクターの複製又は発現を維持することができる細胞を指す。宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌又は真核細胞（例えば酵母、昆虫、両生類、鳥類、又は哺乳動物細胞）であり得る。本発明のポリヌクレオチドを含む、又は本発明のポリペプチド及び／又は細胞標的化分子を産生することが可能な宿主細胞株の生成及び単離は、当業界において公知の標準的な技術を使用して達成することができる。
本発明の範囲内の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又はタンパク質は、本明細書に記載されるポリペプチド及び分子のバリアント又は派生物であってもよく、これらは、例えば宿主細胞によるより最適な発現などの所望の特性を達成するのにそれをより好適にすることができる１つ又は２つ以上のアミノ酸の変更、又は１つ又は２つ以上のアミノ酸の欠失若しくは挿入によって、細胞標的化分子のポリペプチド及び／又はタンパク質性成分をコードするポリヌクレオチドを改変することによって産生される。
Ｘ．固体基板に固定された本発明の分子
本発明のある特定の実施形態は、固体基板に固定された、本発明の分子（例えば本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、細胞標的化分子、融合タンパク質、又はポリヌクレオチド）、又はそれらのあらゆるエフェクター断片を含む。本明細書において予期される固体基板としては、これらに限定されないが、マイクロビーズ、ナノ粒子、ポリマー、マトリックス材料、マイクロアレイ、マイクロタイタープレート、又は当業界において公知のあらゆる固体表面が挙げられる（例えば米国特許第７，７７１，９５５号明細書を参照）。これらの実施形態によれば、本発明の分子は、熟練した作業者公知の技術を使用して、例えばビーズ、粒子、又はプレートなどの固体基板に共有結合で又は非共有結合で連結されていてもよい（例えばJung Y et al., Analyst 133：697-701 (2008)を参照）。本発明の固定された分子は、当業界において公知の技術を使用するスクリーニング用途に使用することができる（例えばBradbury A et al., Nat Biotechnol 29：245-54 (2011)；Sutton C, Br J Pharmacol 166：457-75 (2012)；Diamante L et al., Protein Eng Des Sel 26：713-24 (2013)；Houlihan G et al., J Immunol Methods 405：47-56(2014)を参照）。
本発明の分子をその上に固定することができる固体基板の非限定的な例としては、マイクロビーズ、ナノ粒子、ポリマー、ナノポリマー、ナノチューブ、磁気ビーズ、常磁性ビ
ーズ、超常磁性ビーズ、ストレプトアビジンでコーティングしたビーズ、逆相磁気ビーズ、カルボキシ末端を有するビーズ、ヒドラジン末端を有するビーズ、シリカ（ナトリウムシリカ）ビーズ及びイミノ二酢酸（ＩＤＡ）修飾ビーズ、アルデヒド修飾ビーズ、エポキシ活性化ビーズ、ジアミノジプロピルアミン（ＤＡＤＰＡ）修飾ビーズ（第一級アミン表面基を有するビーズ）、生分解性ポリマービーズ、ポリスチレン基板、アミノ−ポリスチレン粒子、カルボキシル−ポリスチレン粒子、エポキシ−ポリスチレン粒子、ジメチルアミノ−ポリスチレン粒子、ヒドロキシ−ポリスチレン粒子、色付きの粒子、フローサイトメトリー粒子、スルホン酸−ポリスチレン粒子、ニトロセルロース表面、補強されたニトロセルロース膜、ナイロン膜、ガラス表面、活性化ガラス表面、活性化石英表面、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜、ポリアクリルアミドベースの基板、ポリ塩化ビニル基板、ポリメタクリル酸メチル基板、ポリ（ジメチルシロキサン）基板、並びに共有結合による連結を形成することが可能な光反応性種（例えばニトレン、カルベン、及びケチルラジカル）を含有するフォトポリマーが挙げられる。本発明の分子をその上に固定することができる固体基板の他の例は、分子ディスプレイシステムで一般的に使用されるものであり、例えば細胞表面、ファージ、及びウイルス粒子などである。
XI．送達デバイス及びキット
ある特定の実施形態において、本発明は、それらを必要とする対象に送達するための、本発明の物質、例えば医薬組成物又は診断用組成物などの１つ又は２つ以上の組成物を含むデバイスに関する。したがって、本発明の１つ又は２つ以上の組成物を含む送達デバイスは、静脈内、皮下、筋肉内又は腹膜内注射；経口投与；経皮投与；経肺又は経粘膜投与；インプラント、浸透圧ポンプ、カートリッジ又はマイクロポンプによる投与を含む様々な送達方法によって、又は当業者によって認識されている他の手段によって、本発明の物質の組成物を患者に投与するのに使用することができる。
また、少なくとも１つの本発明の物質の組成物、並びに任意選択でパッケージ及び使用説明書を含むキットも本発明の範囲内である。キットは、薬物投与及び／又は診断情報収集に有用であり得る。本発明のキットは、少なくとも１つの追加の試薬（例えば、標準、マーカーなど）を含んでいてもよい。キットは、典型的には、キット内容物の意図される使用を示すラベルを含む。キットは、試料又は対象中で細胞型（例えば腫瘍細胞）を検出するための、又は患者が、本発明の化合物、組成物、又は関連する方法、例えば本明細書に記載される方法などを利用する治療戦略に応答するグループに属するかどうかを診断するための試薬及び他のツールをさらに含んでいてもよい。
XII．本発明の細胞標的化分子並びに／又はそれらの医薬及び／若しくは診断用組成物を
使用するための方法
一般的に、本発明の目的は、例えばある特定のがん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、又は本明細書で述べられるさらなる病態などの疾患、障害、及び状態の予防及び／又は治療に使用することができる、薬理活性薬剤、加えてそれを含む組成物を提供することである。したがって、本発明は、標的化された細胞殺滅のための、標的化された細胞に追加の外因性物質を送達するための、標的化された細胞内部を標識付けするための、診断情報を収集するための、標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路にＴ細胞エピトープを送達するための、及び本明細書に記載される疾患、障害、及び状態を治療するための、本発明のポリペプチド、細胞標的化分子、及び医薬組成物を使用する方法を提供する。例えば、本発明の方法は、がん、がんの発生、腫瘍の発生、転移、及び／又は疾患の再発を予防又は治療するのに使用することができる。
特定には、本発明の目的は、現在のところ当業界において公知の薬剤、組成物、及び／又は方法と比較して一定の利点を有する、このような薬理学的に活性な薬剤、組成物、及び／又は方法を提供することである。したがって、本発明は、特定されたタンパク質配列
を有する志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子並びにそれらの医薬組成物を使用する方法を提供する。例えば、配列番号６〜３５４及び３７０〜５１３に記載のアミノ酸配列のいずれかは、以下の方法又は熟練した作業者公知の細胞標的化分子を使用するためのあらゆる方法で、例えば国際公開第２０１４／１６４６８０号パンフレット、国際公開第２０１４／１６４６９３号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８４３５号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８４５２号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット、米国特許第２０１５０２５９４２８号明細書、同第６２／１６８，７５８号明細書、同６２／１６８，７５９号明細書、同６２／１６８，７６０号明細書、同６２／１６８，７６１号明細書、同６２／１６８，７６２号明細書、同６２／１６８，７６３号明細書、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１６５８０号で説明される様々な方法などで使用される細胞標的化分子の成分としてとりわけ利用される場合がある。
本発明は、インビトロ又はインビボのいずれかで、細胞を、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、細胞標的化分子、又は医薬組成物と接触させるステップを含む、細胞を死滅させる方法を提供する。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、細胞標的化分子、及び医薬組成物は、１つ又は複数の細胞を特許請求された物質の組成物の１つと接触させたときに特異的な細胞型を死滅させるのに使用することができる。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物は、異なる細胞型の混合物、例えばがん細胞、感染細胞、及び／又は血液系細胞を含む混合物などにおいて、特異的な細胞型を死滅させるのに使用することができる。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子、又は医薬組成物は、異なる細胞型の混合物中のがん細胞を死滅させるのに使用することができる。ある特定の実施形態において、細胞毒性の志賀細胞標的化分子、又は本発明の医薬組成物は、例えば移植前組織などの異なる細胞型の混合物中の特異的な細胞型を死滅させるのに使用することができる。ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、細胞標的化分子、又は医薬組成物は、例えば治療目的の投与前の組織材料などの細胞型の混合物中の特異的な細胞型を死滅させるのに使用することができる。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物は、ウイルス又は微生物に感染した細胞を選択的に死滅させる、又はそれ以外の方法で特定の細胞外標的生体分子、例えば細胞表面生体分子などを発現する細胞を選択的に死滅させるのに使用することができる。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、細胞標的化分子、及び医薬組成物は、様々な用途を有し、このような用途としては、例えば、インビトロ又はインビボのいずれかで組織から不要な細胞型を枯渇させることにおける使用、移植片対宿主反応を治療するために免疫応答をモジュレートすることにおける使用、抗ウイルス剤としての使用、抗寄生虫剤としての使用、及び移植組織から不要な細胞型を取り除くことにおける使用などが挙げられる。
ある特定の実施形態において、本発明のある特定の志賀毒素エフェクターポリペプチド、細胞標的化分子、及び医薬組成物は、単独で、又は他の化合物又は医薬組成物と組み合わせて、例えば治療が必要な患者などの対象において、インビトロ又はインビボで細胞集団に投与した場合に強力な細胞殺滅活性を示すことができる。特異的な細胞型に対して高親和性の結合領域を使用して、酵素的に活性な志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド及び／又はＴ細胞エピトープの送達を標的化することによって、生物中のある特定の細胞型、例えばある特定のがん細胞、新生細胞、悪性細胞、非悪性腫瘍細胞、及び／又は感染細胞などを特異的及び選択的に死滅させることに、細胞殺滅活性を限定することができる。
本発明は、それを必要とする患者において細胞を死滅させる方法であって、患者に、少なくとも１つの本発明の細胞標的化分子又はそれらの医薬組成物を投与するステップを含
む、方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子又はそれらの医薬組成物は、がん又は腫瘍細胞と物理的に結合していることが見出された細胞外の生体分子を標的化することによって、患者においてがん細胞を死滅させるのに使用することができる。用語「がん細胞（cancer cell）」又は「がん細胞（cancerous cell）」は、異常に促進された及
び／又は無秩序な様式で増殖及び分裂する様々な新生細胞を指し、当業者には明らかであろう。用語「腫瘍細胞」は、悪性細胞と非悪性細胞の両方を含む。一般的に、がん及び／又は腫瘍は、治療及び／又は予防を受ける余地のある疾患、障害、又は状態と定義することができる。本発明の方法及び組成物によって利益を得る可能性があるがん細胞及び／又は腫瘍細胞で構成されるがん及び腫瘍（悪性又は良性のいずれか）は、当業者には明らかであろう。新生細胞は、無秩序な増殖、分化の欠如、局所的な組織浸潤、血管新生、及び転移の１つ又は２つ以上に関連することが多い。ある特定のがん細胞及び／又は腫瘍細胞を標的化する本発明の方法及び組成物によって利益を得る可能性があるがん及び／又は腫瘍（悪性又は良性のいずれか）の結果生じる疾患、障害、及び状態は、当業者には明らかであろう。
本発明の細胞標的化分子及び組成物のある特定の実施形態は、一般的に分裂が遅く、化学療法及び放射線のようながん療法に対する耐性を有する、がん幹細胞、腫瘍幹細胞、前がん状態の発がん性細胞、及び腫瘍始原細胞を死滅させるのに使用することができる。例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、本発明を用いて、ＡＭＬ幹細胞及び／又は休眠中のＡＭＬ前駆細胞を死滅させることにより治療することができる（例えばShlush L et al.,Blood 120：603-12 (2012)を参照）。がん幹細胞はしばしば、細胞表面の標的、例え
ば、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態のある特定の結合領域の標的となり得るＣＤ４４、ＣＤ２００、及び他の本明細書で列挙したものなどを過剰発現する（例えばKawasaki B et al., Biochem Biophys Res Commun 364：778-82 (2007)；Reim F et al.,
CancerRes 69：8058-66 (2009)を参照）。
志賀毒素Ａサブユニットベースの作用機序のために、本発明の物質の組成物は、例えば化学療法、免疫療法、放射線、幹細胞移植、及び免疫チェックポイント阻害剤などの他の療法とそれらとの組合せを含む方法で、又は他の療法との補足的な様式で、並びに／又は化学療法抵抗性／放射線抵抗性及び／若しくは静止腫瘍細胞／腫瘍始原細胞／幹細胞に対して有効な方法で、より効果的に使用することができる。同様に、本発明の物質の組成物は、他の細胞標的療法と組み合わせて、同じエピトープ以外の、同じ疾患、障害又は状態のオーバーラップしない又は異なる標的に標的化することを含む方法でより効果的に使用することができる。
本発明の細胞標的化分子、又はそれらの医薬組成物のある特定の実施形態は、免疫細胞と物理的に結合していることが見出された細胞外の生体分子を標的化することによって、患者において免疫細胞（健康であるか又は悪性であるかにかかわらず）を死滅させるのに使用することができる。
悪性の、新生物の、又はそれ以外の不要なＴ細胞及び／又はＢ細胞の患者の細胞集団（例えば骨髄）を取り除き、次いでＴ細胞及び／又はＢ細胞を枯渇させた材料を患者に再注入する目的のために、本発明の細胞標的化分子、又はそれらの医薬組成物を利用することは、本発明の範囲内である（例えばvan Heeckeren W et al., Br J Haematol 132：42-55
(2006)を参照；例えばAlpdogan O, van den Brink M, Semin Oncol 39：629-42(2012)
を参照）。
患者から取り出された単離された細胞集団からエクスビボでＴ細胞及び／又はＢ細胞を
枯渇させる目的のために、本発明の細胞標的化分子、又はそれらの医薬組成物を利用することは、本発明の範囲内である。１つの非限定的な例において、本発明の細胞標的化分子は、臓器及び／又は組織の移植による拒絶反応を予防するための方法で使用されてもよく、この場合、臓器からドナーのＴ細胞及び／又はＢ細胞を取り除くために、本発明の細胞毒性の細胞標的化分子又はそれらの医薬組成物を移植する前にドナーの臓器又は組織は潅流される（例えばAlpdogan O, vanden Brink M, Semin Oncol 39：629-42 (2012)を参照）。
また、骨髄及び又は幹細胞移植を受ける患者における移植片対宿主病、及び寛容の誘発に対する予防として、ドナーの細胞集団からＴ細胞及び／又はＢ細胞を枯渇させる目的のために、本発明の細胞標的化分子、又はそれらの医薬組成物を利用することも本発明の範囲内である（例えばvan Heeckeren W et al., Br J Haematol 132：42-55 (2006)を参照
；例えばAlpdogan O, van den Brink M, Semin Oncol 39：629-42(2012)を参照）。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド又は細胞標的化分子、又はそれらの医薬組成物のある特定の実施形態は、感染細胞と物理的に結合していることが見出された細胞外の生体分子を標的化することによって、患者において感染細胞を死滅させるのに使用することができる。
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、又はそれらの医薬組成物は、免疫系を活性化してその場所での規制を強化するために、脊索動物内の場所を非自己Ｔ細胞エピトープ−ペプチド提示細胞で「シーディング」するのに使用されてもよい。この本発明の「シーディング」方法のある特定のさらなる実施形態において、場所は、腫瘤又は感染した組織部位である。本発明のこの「シーディング」方法の好ましい実施形態において、非自己Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、細胞標的化分子の標的細胞によってまだ提示されていないペプチド、標的細胞によって発現されるあらゆるタンパク質中に存在しないペプチド、標的細胞のプロテオーム又はトランスクリプトーム中に存在しないペプチド、シーディングしようとする部位の細胞外の微環境中に存在しないペプチド、及び標的化しようとする腫瘤又は感染した組織部位中に存在しないペプチドからなる群から選択される。
この「シーディング」方法は、エフェクターＴ細胞による認識及び下流の免疫応答の活性化のために、１つ又は２つ以上のＭＨＣクラスＩ提示Ｔ細胞エピトープで脊索動物内の１つ又は２つ以上の標的細胞を標識するように機能する。本発明の細胞標的化分子の、細胞内在化、細胞内経路決定、及びＴ細胞エピトープを送達する機能を利用することによって、送達されたＴ細胞エピトープを提示する標的細胞は、宿主Ｔ細胞による提示標的細胞の認識の誘導及びＣＴＬによる標的細胞殺滅を含むさらなる免疫応答の誘導に利用される。本発明の細胞標的化分子を使用する、この「シーディング」方法は、適応免疫応答を誘導して、細胞標的化分子が送達されたＴ細胞エピトープを提示するか又は提示しないかにかかわらず、シーディングした微環境中の細胞、例えば腫瘤又は感染した組織部位などを攻撃することによって一時的なワクチン接種作用を提供することができる。この「シーディング」方法はまた、脊索動物内の標的細胞集団、腫瘤、及び／又は感染した組織部位への免疫寛容の破壊を誘導することもできる。
１つ又は２つ以上の抗原性及び／又は免疫原性エピトープで脊索動物内の場所をシーディングするステップを含む本発明のある特定の方法は、局所的に又は全身に投与されるかどうかにかかわらず、ある特定の抗原に対する免疫応答を刺激するために免疫学的なアジュバントの投与と組み合わせてもよく、例えば本発明の組成物と、サイトカイン、細菌産物、又は植物のサポニンのような１つ又は２つ以上の免疫学的なアジュバントとの共投与などである。本発明の方法で使用するのに適している可能性がある免疫学的なアジュバン
トの他の例としては、アルミニウム塩及び油、例えばミョウバン、水酸化アルミニウム、鉱油、スクアレン、パラフィン油、落花生油、及びチメロサールなどが挙げられる。
加えて、本発明は、患者における疾患、障害、又は状態を治療する方法であって、それを必要とする患者に、本発明の細胞標的化分子、又はそれらの医薬組成物の少なくとも１つの治療有効量を投与するステップを含む、方法を提供する。この方法を使用して治療され得る予期される疾患、障害、及び状態としては、がん、悪性腫瘍、非悪性腫瘍、増殖異常、免疫障害、及び微生物感染が挙げられる。「治療上有効な投薬量」の本発明の組成物の投与は、疾患の症状の重症度における減少、疾患の無症状期間の頻度及び持続時間における増加、又は疾患の苦痛による欠陥又は能力障害の予防をもたらすことができる。
本発明の組成物の治療有効量は、投与経路、治療する生物のタイプ、及び検討中の具体的な患者の身体的特徴に依存すると予想される。この量を決定するためのこれらの要因及びそれらの関係は、医療分野における熟練した技術者に周知である。この量及び投与方法は、最適な効能を達成するために調整することができ、体重、食事、並行する薬物療法のような要因、及び医療分野における当業者に周知の他の要因に依存する可能性がある。ヒトでの使用に最も適切な投薬の程度及び用量レジメンは、本発明により得られた結果によって導かれてもよいし、適切に設計された臨床試験で確認されてもよい。有効な投薬量及び治療プロトコールは、実験動物で低い用量から開始して、次いで作用をモニターしながら投薬量を増加させ、同様に投薬レジメンを系統的に変化させる従来の手段によって決定することができる。所与の対象にとって最適な投薬量を決定するときに、臨床医は多数の要因を考慮に入れることができる。このような考慮は、当業者公知である。
剤、ゲル剤若しくは軟膏剤の局所投与、又は経皮パッチ剤による）を含む、当業界において公知のあらゆる投与経路を指す場合もある。「非経口投与」は、典型的には意図される作用部位への、又はそれと連通する部位への注射に関連し、眼窩下、注入、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹膜内、肺内、脊髄内、胸骨内、髄腔内、子宮内、静脈内、クモ膜下、被膜下、皮下、経粘膜、又は経気管投与が挙げられる。
本発明の医薬組成物を投与するために、投薬量範囲は、一般的に、対象の体重１キログラム当たり約０．００１〜１０ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）及びそれより多く、通常は０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇである。例示的な投薬量は、体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ、体重１ｋｇ当たり０．０３ｍｇ、体重１ｋｇ当たり０．０７ｍｇ、体重１ｋｇ当たり０．９ｍｇ若しくは体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ、又は０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。例示的な治療計画は、１日１回若しくは２回の投与、又は週１回若しくは２回の投与、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、月１回、２若しくは３ヶ月ごとに１回、又は３〜６ヶ月ごとに１回である。特定の患者ごとに治療上の利益を最大化するために、必要に応じて、投薬量は、熟練した健康管理の専門家により選択され再調整されてもよい。
本発明の医薬組成物は、典型的には同じ患者に複数回投与されると予想される。単回投薬間のインターバルは、例えば２〜５日おき、１週間おき、１ヶ月おき、２若しくは３ヶ月おき、６ヶ月おき、又は１年おきであってもよい。また投与間のインターバルは、対象又は患者中の血中レベル又は他のマーカーの調節に基づき不規則であってもよい。本発明の組成物のための投薬レジメンは、体重１ｋｇ当たり１ｍｇ又は体重１ｋｇ当たり３ｍｇの静脈内投与で、２〜４週間ごとに６回の投薬で組成物を投与すること、次いで３ヶ月ごとに体重１ｋｇ当たり３ｍｇ又は体重１ｋｇ当たり１ｍｇ投与することを含む。
本発明の医薬組成物は、１つ又は２つ以上の投与経路を介して、当業界において公知の様々な方法の１つ又は２つ以上を使用して投与してもよい。熟練した作業者であれば理解
されるように、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に応じて様々であろう。本発明の細胞標的化分子及び医薬組成物のための投与経路としては、例えば静脈内、筋肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊髄、又は他の非経口投与経路が挙げられ、例えば注射又は注入による投与経路である。他の実施形態について、本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物は、非経口以外の経路によって投与されてもよく、例えば局所、表皮又は粘膜の投与経路、例えば鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下、又は局所などによって投与されてもよい。
本発明の治療用細胞標的化分子又は医薬組成物は、当業界において公知の様々な医療用デバイスの１つ又は２つ以上を用いて投与されてもよい。例えば、一実施形態において、本発明の医薬組成物は、無針の皮下注射デバイスを用いて投与されてもよい。本発明において有用な周知のインプラント及びモジュールの例は、当業界において、例えば、制御された速度での送達のための移植可能なマイクロ注入ポンプ；経皮投与するためのデバイス；正確な注入速度で送達するための注入ポンプ；連続的な薬物送達のための可変流量の移植可能な注入デバイス；及び浸透性薬物送達システムなどが挙げられる。これらの及び他のこのようなインプラント、送達系、及びモジュールは、当業者公知である。
本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物は、単独で、又は１つ又は２つ以上の他の治療剤又は診断剤と組み合わせて投与されてもよい。併用療法は、治療しようとする特定の患者、疾患又は状態に基づき選択される少なくとも１つの他の治療剤と組み合わせた、本発明の細胞標的化分子、又はそれらの医薬組成物を含んでいてもよい。他のこのような薬剤の例としては、とりわけ、細胞毒性剤、抗がん剤又は化学療法剤、抗炎症剤又は増殖抑制剤、抗微生物剤又は抗ウイルス剤、増殖因子、サイトカイン、鎮痛薬、治療活性を有する小分子又はポリペプチド、一本鎖抗体、古典的な抗体又はそれらの断片、又は１つ又は２つ以上のシグナル伝達経路をモジュレートする核酸分子、及び治療的又は防止的処置レジメンを補うか又はそれ以外の方法で有益な可能性がある類似のモジュレートする治療的分子が挙げられる。
本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物での患者の治療は、好ましくは、標的化された細胞の細胞死及び／又は標的化された細胞の増殖の阻害を引き起こす。そのようなものとして、本発明の細胞毒性細胞標的化分子、及びそれらを含む医薬組成物は、とりわけ、がん、腫瘍、他の増殖異常、免疫障害、及び感染細胞などの、標的細胞を死滅させること又は枯渇させることが有益であり得る様々な病理学的障害を治療するための方法において有用であろう。本発明は、細胞増殖を抑制して、新形成、過活動のＢ細胞、及び過活動のＴ細胞を含む細胞障害を治療するための方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子及び医薬組成物を使用して、がん、腫瘍（悪性及び良性）、増殖異常、免疫障害、及び微生物感染を治療又は予防することができる。さらなる態様において、上記したエクスビボの方法を上記したインビボの方法と組み合わせて、骨髄移植レシピエントにおける拒絶を治療又は予防する、及び免疫寛容を達成するための方法を提供することができる。
ある特定の実施形態において、本発明は、例えばヒトなどの哺乳動物対象における悪性腫瘍又は新生物及び他の血液細胞関連のがんを治療するための方法であって、それらを必要とする対象に、本発明の細胞毒性細胞標的化分子又は医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、方法を提供する。
本発明の細胞標的化分子及び医薬組成物は、例えば、不要なＴ細胞を除去することにおける使用、免疫応答をモジュレートして移植片対宿主反応を治療することにおける使用、抗ウイルス剤としての使用、抗微生物剤としての使用、及び移植組織から不要な細胞型を取り除くことにおける使用を含む様々な用途を有する。本発明の細胞標的化分子及び医薬
組成物は、一般的には抗新生物剤であり、それらが、増殖を阻害すること及び／又はがん若しくは腫瘍細胞の死滅を引き起こすことによって新生物又は悪性細胞の発症、成熟、又は蔓延を治療及び／又は予防することができることを意味する。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物は、Ｂ細胞、形質細胞又は抗体が媒介する疾患又は障害、例えば白血病、リンパ腫、骨髄腫、ヒト免疫不全ウイルス関連の疾患、アミロイド症、溶血尿毒症症候群、多発性動脈炎、敗血症性ショック、クローン病、リウマチ様関節炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎、乾癬、喘息、シェーグレン症候群、移植片対宿主病、移植片拒絶反応、糖尿病、脈管炎、強皮症、及び全身性エリテマトーデスなどを治療するのに使用される。
別の態様において、本発明の細胞標的化分子及び医薬組成物のある特定の実施形態は、抗微生物剤であり、それらが、微生物学的な病原性感染、例えばウイルス、細菌、真菌、プリオン、又は原生動物によって引き起こされる感染などの獲得、発症、又は結果を治療及び／又は予防することができることを意味する。
患者におけるＴ細胞又はＢ細胞を死滅させる目的で、本発明の細胞標的化分子、又はそれらの医薬組成物を患者に投与することによる、Ｔ細胞又はＢ細胞が媒介する疾患又は状態の予防又は治療を提供することは、本発明の範囲内である。この使用は、移植される材料の源、例えばヒト又はヒト以外の源であるかにかかわらず、骨髄移植、幹細胞移植、組織移植、又は臓器移植のために患者を準備又は調整することと両立し得る。
本発明の細胞毒性細胞標的化分子又は医薬組成物を使用した宿主Ｔ細胞の標的化された細胞殺滅を介して宿主対移植片病を予防又は治療するために、骨髄レシピエントを提供することは、本発明の範囲内である。
本発明の細胞標的化分子及び医薬組成物のある特定の実施形態は、本発明の細胞標的化分子及び／又は医薬組成物の治療有効量をそれらを必要とする患者に投与することを含む、がんを治療する方法に利用することができる。本発明の方法のある特定の実施形態において、治療されるがんは、骨がん（例えば多発性骨髄腫又はユーイング肉腫）、乳がん、中枢／末梢神経系がん（例えば脳腫瘍、神経線維腫症、又は膠芽腫）、消化器がん（例えば胃がん又は結腸直腸がん）、生殖細胞がん（例えば卵巣がん及び睾丸がん）、腺がん（例えば膵臓がん、副甲状腺がん、褐色細胞腫、唾液腺がん、又は甲状腺がん）、頭頸部がん（例えば鼻咽頭がん、口腔がん、又は咽頭がん）、血液がん（例えば白血病、リンパ腫、又は骨髄腫）、腎臓から尿道のがん（例えば腎臓がん及び膀胱がん）、肝臓がん、肺／胸膜がん（例えば中皮腫、小細胞肺癌、又は非小細胞肺癌）、前立腺がん、肉腫（例えば血管肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、又は滑膜肉腫）、皮膚がん（例えば基底細胞癌、扁平上皮癌、又は黒色腫）、及び子宮がんからなる群から選択される。
本発明の細胞標的化分子及び医薬組成物のある特定の実施形態は、本発明の細胞標的化分子及び／又は医薬組成物の治療有効量を、それらを必要とする患者に投与することを含む、免疫障害を治療する方法に利用することができる。本発明の方法のある特定の実施形態において、免疫障害は、アミロイド症、強直性脊椎炎、喘息、クローン病、糖尿病、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、橋本甲状腺炎、溶血尿毒症症候群、ＨＩＶ関連の疾患、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、多発性動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、強皮症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、及び脈管炎からなる群から選択される疾患に関連する炎症に関する。
本発明のある特定の実施形態のなかでも、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド又は細胞標的化分子を、がん、腫瘍、他の増殖異常、免疫障害、及び／又は微生物感染を
治療又は予防するための医薬組成物又は医薬品の成分として使用することが挙げられる。例えば、患者の皮膚上に現れる免疫障害は、炎症を低減させるために、このような医薬品で治療されてもよい。別の例において、皮膚腫瘍は、腫瘍サイズを低減する又は腫瘍を完全に除去するために、このような医薬品で治療されてもよい。
本発明のある特定の細胞毒性細胞標的化分子、及びそれらの組成物は、例えば免疫損傷（immunolesioning）及びニューロントレーシングなどの分子レベルの神経外科用途に使
用されてもよい（総論に関して、Wiley R, LappiD, Adv Drug Deliv Rev 55：1043-54(2003)を参照）。例えば、標的化ドメインは、様々なリガンド、例えば、神経回路特異的
なＧタンパク質共役受容体などのニューロンの表面受容体と結合することによって特異的なニューロン性細胞型を標的化する神経伝達物質及び神経ペプチドなどから選択されてもよいし、又はそれら由来であってもよい。同様に、標的化ドメインは、ニューロンの表面受容体と結合する抗体から選択されてもよいし、又はそれら由来であってもよい。ある特定の志賀毒素エフェクターポリペプチドはロバストにそれら自身の逆行性軸索輸送を指示することから、本発明のある特定の細胞標的化分子は、細胞体から遠位の細胞毒性タンパク質の注射部位で細胞外の標的を発現するニューロンを死滅させるのに使用することができる（Llewellyn-Smith I et al., J NeurosciMethods 103：83-90 (2000)を参照）。これらのニューロン性細胞型を特異的に標的化する標的化された本発明の細胞毒性分子は、例えば感覚のメカニズムを解明するための（例えばMishra S, Hoon M, Science 340：968-71 (2013)を参照）、並びに例えばパーキンソン及びアルツハイマー病などの神経変性疾患のモデル系を作り出すための（例えばHamlin A et al., PLoS One e53472 (2013)を参
照）神経科学的調査において用途を有する。
本発明のある特定の実施形態のなかでも、新生細胞及び／又は免疫細胞型の内部を標識又は検出するために、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、細胞標的化分子、医薬組成物、及び／又は診断用組成物を使用する方法が挙げられる。この方法は、特異的な細胞型に入り、逆行性細胞内輸送を介して、検出のために標識される特異的な細胞型の内部区画に細胞内の経路を決定するある特定の本発明の細胞標的化分子の能力に基づいていてもよい。これは、インサイチュで患者中の細胞に実行してもよいし、又は生物から取り出された細胞及び組織、例えば生検材料に実行してもよい。
本発明のある特定の実施形態のなかでも、疾患、状態及び／又は障害に関する情報収集の目的で細胞型の存在を検出するために、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、細胞標的化分子、医薬組成物、及び／又は診断用組成物を使用する方法が挙げられる。本方法は、アッセイ又は診断技術によって分子を検出するために、細胞を、診断上十分な量の本発明の細胞標的化分子と接触させることを含む。成句「診断上十分な量」は、利用される特定のアッセイ又は診断技術による情報収集目的にとって十分な検出及び正確な測定をもたらす量を指す。一般的に、生物全体のインビボの診断的使用にとって診断上十分な量は、対象ごとに対象１ｋｇ当たり０．００１〜１０ミリグラムの検出促進剤が連結された本発明の細胞標的化分子の非累積な用量であろう。典型的には、これらの情報収集方法で使用される本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド又は細胞標的化分子の量は、それでもなお診断上十分な量であるという条件で、できる限り低いであろう。例えば、インビボにおける生物中での検出の場合、対象に投与される本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、細胞標的化分子、又は医薬組成物の量は、実現可能な限り低いであろう。
検出促進剤と組み合わせた本発明の細胞標的化分子の細胞型特異的な標的化は、本発明の分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞を検出及びイメージングする方法を提供する。本発明の細胞標的化分子を使用して細胞をイメージングすることは、当業界において公知のあらゆる好適な技術によってインビトロ又はインビボで実行することができる。診断情報は、生物の全身イメージングを含む当業界において公知の様
々な方法を使用して、又は生物から採取したエクスビボの試料を使用して収集することができる。本明細書において使用される用語「試料」は、これらに限定されないが、例えば血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門分泌物、膣分泌物、及び精液などの流体、並びに生検手順により得られた組織などの多数の物を指す。例えば、様々な検出促進剤は、例えば磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、光学的方法（例えば直接、蛍光、及び生物発光イメージング）、ポジトロンエミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）、単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、超音波、Ｘ線コンピュータ断層撮影、及び上述のものの組合せなどの技術による、非侵襲的なインビボでの腫瘍イメージングに利用することができる（総論に関して、Kaur S et al., Cancer Lett 315：97-111 (2012)を参照）。
本発明のある特定の実施形態のなかでも、血液系細胞、がん細胞、腫瘍細胞、感染細胞、及び／又は免疫細胞の内部を標識又は検出するための診断用組成物において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、細胞標的化分子、又は医薬組成物を使用する方法が挙げられる（例えば、Koyama Y et al., Clin Cancer Res 13：2936-45(2007)；Ogawa M
et al., Cancer Res 69：1268-72 (2009)；Yang L et al., Small 5：235-43 (2009)を
参照）。特異的な細胞型に入り、逆行性細胞内輸送を介して、細胞内の経路を決定する本発明のある特定の細胞標的化分子の能力に基づき、特異的な細胞型の内部区画は、検出のために標識される。これは、インサイチュで患者中の細胞に実行してもよいし、又は生物から取り出された細胞及び組織、例えば生検材料に実行してもよい。
本発明の診断用組成物を使用して、本発明の関連する医薬組成物によって治療できる可能性があるとして疾患、障害、又は状態を特徴付けることができる。本発明の物質のある特定の組成物を使用して、患者が、本明細書に記載される本発明の化合物、組成物又は関連する方法を利用する治療戦略に応答するグループに属するかどうか、又は本発明の送達デバイスを使用するのによく適しているかどうかを決定することができる。
本発明の診断用組成物は、疾患、例えばがんをよりよく特徴付けるために、例えば遠隔転移、不均質性、及びがん進行のステージをモニターするために、それが検出された後に使用してもよい。疾患、障害又は感染の表現型の評価は、治療の意思決定中の予後及び予測を助けることができる。疾患再発において、ある特定の本発明の方法を使用して、それが局所か又は全身の問題かを決定することができる。
本発明の診断用組成物は、例えば低分子薬物、生物学的な薬物、又は細胞ベースの療法などの療法のタイプを問わず、療法に対する応答をアセスメントするのに使用することができる。例えば、本発明の診断剤のある特定の実施形態は、腫瘍サイズの変化、抗原陽性細胞集団の数及び分布などの変化を測定すること、又はすでに患者に施された療法によって標的化された抗原とは異なるマーカーをモニターすることに使用することができる（Smith-Jones P et al., Nat. Biotechnol 22：701-6 (2004)；Evans M et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 108：9578-82 (2011)を参照）。
細胞型の存在を検出するのに使用される方法のある特定の実施形態は、例えば、骨がん（例えば多発性骨髄腫又はユーイング肉腫）、乳がん、中枢／末梢神経系がん（例えば脳腫瘍、神経線維腫症、又は膠芽腫）、消化器がん（例えば胃がん又は結腸直腸がん）、生殖細胞がん（例えば卵巣がん及び睾丸がん、腺がん（例えば膵臓がん、副甲状腺がん、褐色細胞腫、唾液腺がん、又は甲状腺がん）、頭頸部がん（例えば鼻咽頭がん、口腔がん、又は咽頭がん）、血液がん（例えば白血病、リンパ腫、又は骨髄腫）、腎臓から尿道のがん（例えば腎臓がん及び膀胱がん）、肝臓がん、肺／胸膜がん（例えば中皮腫、小細胞肺癌、又は非小細胞肺癌）、前立腺がん、肉腫（例えば血管肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、又は滑膜肉腫）、皮膚がん（例えば基底細胞癌、扁平上皮癌、又は黒色腫）、子宮がん、ＡＩＤＳ、アミロイド症、強直性脊椎炎、喘息、自閉症、心臓発生、クローン病、糖尿病
、エリテマトーデス、胃炎、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、溶血尿毒症症候群、ＨＩＶ関連の疾患、紅斑性狼瘡、リンパ増殖性障害（移植後リンパ増殖性障害を含む）、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎症、多発性動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、強皮症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、脈管炎、細胞増殖、炎症、白血球活性化、白血球接着、白血球走化性、白血球成熟、白血球遊走、ニューロンの分化、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ，acute lymphoblastic leukemia）、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病／リンパ腫（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ，acute myeloid leukemia）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ，B-cellchronic lymphocytic leukemia）、Ｂ細胞性前リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫（ＢＬ，Burkitt's lymphoma
）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ，chronic lymphocytic leukemia）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ−ＢＰ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ，chronic myeloid leukemia）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ，hairy cell
leukemia）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ，Hodgkin's Lymphoma）、血管内大細胞型Ｂ細胞
リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、リンパ形質細胞性リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫（ＭＭ，multiple myeloma）、ナチュラルキラー細胞白血病、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ，Non-Hodgkin's lymphoma）、プラズマ細胞性白血病、形質細胞腫、原発性滲出液リンパ腫、前リンパ球性白血病、前骨髄球性白血病、小リンパ球性リンパ腫、脾性辺縁帯リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ，T-cell lymphoma）、重鎖病、単クローン性免疫グロブリン血症、単クローン性免疫
グロブリン沈着症、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ，myelodusplastic syndromes）、くすぶ
り型多発性骨髄腫、及びワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症などの疾患、障害、及び状態に関する情報を収集するのに使用することができる。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子、又はそれらの医薬組成物は、診断及び治療の両方に、又は診断単独に使用される。いくつかの状況において、治療で使用するための本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド又は細胞標的化分子を選択する前に、対象及び／又は例えば治療が必要な患者などの対象からの罹患した組織で発現されるＨＬＡバリアント及び／又はＨＬＡ対立遺伝子を決定又は検証することが望ましい。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び本発明の細胞標的化分子（例えば要約における実施形態セット番号１〜１１の実施形態）のあらゆる実施形態は、本発明の方法のそれぞれ個々の実施形態と共に使用することができる。
本発明は、以下の、１）本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、２）本発明の細胞標的化分子、及び３）上述のポリペプチドを含み、ある特定の細胞型を特異的に標的化することが可能な本発明の細胞毒性細胞標的化分子の非限定的な例によってさらに例示される。
［実施例］
以下の実施例は、本発明のある特定の実施形態を示す。しかしながら、これらの実施例は、例示目的のものに過ぎず、本発明の条件及び範囲に関して完全に決定的であることを意図するものでもそのように見なすものでもないことを理解されたい。以下の実施例における実験は、別途記載されている場合を除き、当業者にとって周知であり、慣例的である、標準的な技法を使用して実行した。
以下の実施例は、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む複数の例示的な細胞毒性志賀毒素Ａサブユニット由来のポリペプチド足場について説明する。これらの実施例では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、脱免疫化されているが、触媒活性及び／
又は細胞毒性活性は保持している。
以下の実施例はまた、複数の細胞毒性細胞標的化分子についても説明し、それぞれの分子は、ある細胞の細胞表面に物理的に結合した標的生体分子の細胞外部分に結合することができる細胞標的化結合領域に直接的に又は間接的にのいずれかで連結された志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。以下に説明される例示的な細胞毒性細胞標的化分子は、標的とされる腫瘍細胞型によって発現される、細胞表面の標的生体分子に結合し、これらの標的とされる細胞に進入した。内在化された細胞標的化分子は、志賀毒素エフェクターポリペプチドを、効果的に標的細胞の細胞質へと送り、ここで、志賀毒素エフェクターポリペプチドが、リボソームを不活性化させ、続いて、標的とされる細胞のアポトーシスによる死滅をもたらした。本発明の例示的な細胞標的化分子は、免疫原性のＴ細胞エピトープを、標的細胞のＭＨＣクラスＩ経路に効果的に送達することができる。
加えて、例示的な細胞標的化分子の一部は、プロテアーゼ切断耐性の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを含み、このポリペプチドは、追加の内因性エピトープ領域の破壊によりさらなる脱免疫化が行われていないフーリン切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む親細胞毒性分子と比較してインビボ免疫原性プロファイルの改善（抗体応答の低減）を示した。さらに、これらの例示的なプロテアーゼ切断耐性の脱免疫化された細胞標的化分子は、プロテアーゼ切断感受性志賀毒素エフェクターポリペプチド領域をより多く含む関連する細胞標的化分子と比較してインビボ忍容性の改善を示す。
以下の実施例は、本発明のある特定の志賀毒素エフェクターポリペプチド及びそれらの特性について説明する。ある特定の実施例では、組み込まれた異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む、本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドについて説明する。ある特定の実施例では、フーリン切断耐性である、本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドについて説明する。ある特定の実施例では、組み込まれた異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む、本発明のフーリン切断耐性の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドについて説明する。ある特定の実施例では、組み込まれた異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含み、脱免疫化が最小限である、本発明のフーリン切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドについて説明する。さらに、以下の実施例は、本発明のある特定の細胞標的化分子及びそれらの特性について説明する。ある特定の実施例では、本発明の細胞標的化分子であって、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分が、（１）脱免疫化されている、（２）細胞標的化分子のポリペプチド成分のアミノ末端にあるか若しくはその近傍にある、（３）フーリン切断耐性である、及び／又は（４）組み込まれた若しくは挿入されたＴ細胞エピトープを含む、細胞標的化分子について説明する。ある特定の実施例では、細胞標的化分子のポリペプチド成分が、カルボキシ末端の小胞体保留／回収シグナルモチーフを含む、細胞標的化分子について説明する。
志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドにおける内因性エピトープ領域の特定
志賀毒素ファミリーの複数の志賀毒素に由来するＡサブユニットのポリペプチド配列を分析して、推定上の抗原性エピトープ及び／又は免疫原性エピトープを特定した。この実施例は、抗原性エピトープ及び免疫原性エピトープを、どのようにして志賀毒素Ａサブユニット及び関連するポリペプチドにおいて特定することができるかを示す（国際公開第ＷＯ２０１５／１１３００５号パンフレット、同第ＷＯ２０１５／１１３００７号パンフレットも参照されたい）。計算法を使用して、様々な志賀毒素Ａサブユニットにおける抗原性エピトープ及び／又は免疫原性エピトープを予測したが、これには、タンパク質構造に関する公的に入手可能なデータの利用が含まれた。免疫応答を誘起する可能性のあるＢ細胞エピトープ及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの両方を、コンピュータで予測した。エピトープ予測は、経験的に検証した（後述の実施例２、国際公開第ＷＯ２０１５／１１３００
５号パンフレット、同第ＷＯ２０１５／１１３００７号パンフレットを参照されたい）。
ProImmune社（Sarasota、FL、U.S.）のREVEAL（登録商標）システムを使用して、志賀
様毒素Ａ鎖（ＰＤＢ番号：１ＤＭ０＿Ａ）のポリペプチド配列及び３Ｄ構造データから、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（ＳＬＴ−１Ａ、配列番号１）の直鎖状Ｂ細胞エピトープを予測した。
加えて、志賀毒素のＡサブユニット（ＳｔｘＡ、配列番号２）、志賀様毒素１のＡサブユニット（ＳＬＴ−１Ａ、配列番号１）、及び志賀様毒素２のＡサブユニット（Ｓｔｘ２Ａ、配列番号３）のポリペプチド配列において、BcePredウェブサーバー（Saha S, Raghava G, Lecture Notes in Comput Sci 3239: 197-204 (2004)）、Bepipred直鎖状エピトープ予測（Larsen J et al.,Immunome Res 2: 2 (2006)）、及びElliPro抗体エピトープ予測（Haste Andersen P et al., Protein Sci 15: 2558-67 (2006)、Ponomarenko J, Bourne P, BMC Struct Biol 7: 64 (2007)）を使用して、Ｂ細胞エピトープを予測した。様々な計算法により、３つの典型的な志賀毒素Ａサブユニットにおいて、Ｂ細胞エピトープ領域に関して同様の予測が明らかとなった（表１〜３）。



ＳＬＴ−１Ａでは予測Ｂ細胞エピトープ領域が９個あったが、これらは、１を上回る方法によりオーバーラップする領域として特定された（表４）。

加えて、Ｂ細胞エピトープ及び免疫原性残基を予測するために、Epitopiaウェブサーバーを使用して、志賀毒素Ａサブユニットを分析した（Rubinstein N et al., BMC Bioinformatics 10: 287 (2009)）。Epitopiaを使用して、ＳＬＴ−１Ａにおいて、直鎖状のアミノ酸残基領域内の大部分のアミノ酸残基に関して、４又は５の（「高い」）Epitopiaスコアに基づいて、免疫原性であることが予測される直鎖状のアミノ酸残基領域を特定した。
Epitopia分析により、免疫原性領域はＳＬＴ−１Ａにおいてアミノ酸残基１〜１５に生じることが予測された（「エピトープ領域１」として表記、表５を参照されたい）。Epitopia分析に基づくと、ＳＬＴ−１Ａにおける免疫原性エピトープ領域３９〜４８（表４を参照されたい）には、４９位が含まれる場合がある（「エピトープ領域３」として表記、表５を参照されたい）。Epitopia分析に基づくと、ＳＬＴ−１Ａにおける免疫原性エピトープ領域５５〜６６（表４を参照されたい）には、５３位を含み、６２位〜６６位付近まで伸びる場合があり（「エピトープ領域４」として表記、表５を参照されたい）、ＳＬＴ−１Ａにおけるエピトープ領域９６〜１１５（表４を参照されたい）には、９４位が含まれる場合があり（「エピトープ領域５」として表記、表５を参照されたい）、ＳＬＴ−１Ａにおけるエピトープ領域１８０〜１９０（表４を参照されたい）は、１７９位から始まり、１８８位〜１９０位付近まで伸びる場合がある（「エピトープ領域７」として表記、表５を参照されたい）。

志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）について、ProImmune社（Sarasota
、FL、U.S.）によって行われるREVEAL（商標）免疫原性システム（ＩＳ，Immunogenicity
System）Ｔ細胞アッセイによって、Ｔ細胞エピトープを予測した。このアッセイは、目
的のタンパク質由来の複数のオーバーラップするペプチドを使用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた健常ドナーの細胞試料に由来する哺乳動物ＣＤ４＋Ｔ細胞による任意の免疫応答の誘起に関して、試験する。ProImmune社のREVEAL（商標）アッセイでは、ＳＬＴ−１
Ａにおいて７個のＴ細胞エピトープが予測された（表６）。

１０個の予測Ｂ細胞エピトープ領域（表５）のすべてが、REVEAL（商標）アッセイによって予測された少なくとも１つのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープとオーバーラップしていた（表７）。

脊索動物における治療用途及び診断用途のための志賀毒素由来のポリペプチドを改善するために、異なる志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドを、脱免疫化されておりフーリン切断耐性となるように構築し、同様に、一部の事例では、組み込まれた異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むように構築した（本明細書において、「ＣＤ８＋Ｔ細胞で過免疫化された」と称される）。異種Ｔ細胞エピトープを含むように志賀毒素エフェクターポリペプチド内の部分領域を改変することによって、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを、志賀毒素エフェクターポリペプチドに組み込んだか又は挿入した（例えば、国際公開第ＷＯ２０１５／１１３００７号パンフレットを参照されたい）。志賀毒素Ａサブユニット由来の足場をさらに脱免疫化するために、異種Ｔ細胞エピトープの埋込み又は挿入を使用して、内因性Ｂ細胞エピトープ領域及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域を破壊してもよい（国際公開第ＷＯ２０１５／１１３００７号パンフレット）。表７における予測されたＢ細胞エピトープ領域及びＴ細胞エピトープのすべてを、以下の実施例において、個別又は組み合わせて、破壊及び／又は欠失させた。
本発明の例示的な志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子の構築及び試験
この実施例では、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む様々な足場の作製及び試験について説明するが、これらのポリペプチドは、例えば、他の志賀毒素エフェクターポリペプチドと比べて抗原性及び／又は免疫原性の低減によって示されるように、脱免疫化されている。加えて、この実施例の志賀毒素エフェクターポリペプチドのうちの一部は、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドよりもプロテアーゼ切断耐性が高い、及び／又は組み込まれた若しくは挿入されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む。この実施例の志賀毒素エフェクターポリペプチドを、本発明の様々な細胞標的化分子の構成成分として試験した。
例示的な志賀毒素エフェクターポリペプチド（ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ））及びそれを含む細胞標的化分子（ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：ｓｃＦｖ−（ｎ））の構築
それぞれが、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域に連結された細胞標的化免疫グロブリン型結合領域を含む、脱免疫化された志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプ
チドを作製し、細胞標的化分子の状況において試験した。
改変により志賀毒素Ａサブユニット由来のポリペプチドにプロテアーゼ切断耐性をもたらすために、アミノ酸残基置換Ｒ２４８Ａ及び／又はＲ２５１Ａを、志賀毒素エフェクターポリペプチドに導入した（例えば、国際公開第ＷＯ２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照されたい）。Ｒ２４８Ａ及びＲ２５１Ａ置換は、個別か又は組合せのいずれかで、志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端でフーリン切断モチーフを破壊し、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べると最小限のフーリン切断モチーフにおける１又は２以上の変異を示す（国際公開第ＷＯ２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照されたい）。
この実施例では、Ｒ２４８Ａ及びＲ２５１Ａを、志賀様毒素１のＡサブユニット（ＳＬＴ−１Ａ）に由来しＳＬＴ−１Ａのアミノ酸１〜２５１を含む志賀毒素エフェクターポリペプチド（配列番号４）に導入した。ＳＬＴ−１Ａ １〜２５１ Ｒ２４８Ａ／Ｒ２５１Ａ二重変異体（配列番号５）は、本明細書において、フーリン切断耐性ＳＬＴ−１Ａ又はより簡略的には「ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ」と称される。Ｒ２４８Ａ及びＲ２５１Ａによる、志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端でのフーリン切断モチーフにおける最小限のフーリン切断部位Ｒ−ｘ−ｘ−Ｒの破壊は、フーリンによる切断の減少をもたらす（後述の実施例３、国際公開第ＷＯ２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照されたい）。ＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａにおいてアミノ酸残基２３８〜２５７に天然に位置するフーリン切断モチーフにおける最小限のフーリン切断部位Ｒ−ｘ−ｘ−Ｒの破壊は、他のプロテアーゼ、例えば、プロタンパク質変換酵素及び高度に雑多なプロテアーゼなどによるタンパク質分解に対するこの領域の感受性を減少させることが予測された。加えて、Ｒ２４８Ａ及び／又はＲ２５１Ａ変異は、（１）ＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａにおいてアミノ酸残基２４３〜２５９に天然に位置するＢ細胞エピトープ領域＃８、並びに（２）ＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａにおいてアミノ酸残基２３６〜２５８に天然に位置するＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを破壊する。
組み込まれた異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープをもたらす修飾を含む、複数のアミノ酸残基置換を付加して、予測されたＢ細胞エピトープ領域及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域を破壊することによって、脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを作製した（表８、国際公開第ＷＯ２０１５／１１３００５号パンフレット、同第ＷＯ２０１５／１１３００７号パンフレットを参照されたい）。さらに脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを作製するために、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ（配列番号５）を、組み込まれた異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープをもたらす修飾を含め、予測されたＢ細胞エピトープ領域及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域を破壊するための複数のアミノ酸残基置換を含むように、修飾した（表８、国際公開第ＷＯ２０１５／１１３００５号パンフレット、同第ＷＯ２０１５／１１３００７号パンフレットを参照されたい）。表８は、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）と命名した２０個の異なる脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドを示し、ここで、ｎは、０、１、２、３などの整数であり、異なる変異形を表す。表８に記載される内因性エピトープ領域の番号付けは、表６〜７における番号付けスキームに従う。表８の志賀毒素エフェクターポリペプチドを、後述の節に記載されるように試験した。









脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）（配列番号６〜２１、２３〜２７、及び２９〜３２）のそれぞれは、１又は２以上の脱免疫化された部分領域と組み込まれた異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む１又は２以上の部分領域との組合せを含む。これらのポリペプチドの大半はまた、志賀毒素Ａ１断片部分領域（配列番号６〜１０、１３〜２１、２３〜２７、及び２９〜３２）のカルボキシ末端において最小限のフーリン切断モチーフが破壊されている。コンピュータによる計算分析により、（１）野生型志賀毒素ＳｔｘＡ又はＳＬＴ−１Ａに存在する少なくとも２つのＢ細胞エピトープが、表８に言及されている志賀毒素エフェクターポリペプチドコンボ（ｎ）ではすべて除去されていたこと、及び（２）表８に列挙されている志賀毒素エフェクターポリペプチドコンボ（ｎ）のいずれにおいても新しいＢ細胞エピトープが作製されなかったことが予測された。志賀毒素エフェクターポリペプチドコンボ（ｎ）における個々の部分領域に対する修飾の多くに関する特性及び機能的結果は、実施例３、国際公開第ＷＯ２０１５／１１３００５号パンフレット、同第ＷＯ２０１５／１１３００７号パンフレット、及び同第ＷＯ２０１５／１９１７６４号パンフレットに記載されている。
熟練した作業者に公知の技法を使用して、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドの組合せ構築物をコードするポリヌクレオチドを作製し、細胞標的化免疫グロブリン型結合領域をコードする構築物に融合した。結果として得られたポリヌクレオチドは、細胞標的化分子をコードし、ここで、それぞれのポリペプチドは、（１）志賀毒素エフェクターポリペプチド領域の組合せＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）、（２）細胞標的化領域「ｓｃＦｖ−（ｎ）」であって、ｎは、１、２、３などの整数を表し、異なるｓｃＦｖを示す、細胞標的化領域、並びに（３）志賀毒素エフェクターポリペプチド領域と結合領域との間に配置される当該技術分野で公知のリンカーを含む。
当該技術分野で公知の細菌発現系を使用し、これらのポリヌクレオチドを使用して、脱免疫化された組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチド（表８、配列番号６〜２１、２３〜２７、及び２９〜３２）を、１又は２以上の細胞標的化分子の状況で少なくとも２７個産生した。細胞標的化結合領域に連結させた後、２７個の足場ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）中２６個が、安定した完全長の触媒的に活性な細胞標的化分子を産生した。しかしながら、細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１８：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５４）は、不安定さの兆候を示したが、これは、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１８：：ｓｃＦｖ−１では、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１８：：ｓｃＦｖ−１の調製物及び分子量ラダーを参照としてゲルとともにロードし泳動させたポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析によって、分解が観察されたためであった。
Ａ．志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）を含む例示的な細胞標的化分子のリボソーム阻害活性の試験
様々な脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチ
ドの酵素活性を、熟練した作業者に公知のインビトロリボソーム阻害アッセイ（TNT（登
録商標）Quick Coupled Transcription/Translation Kit、Promega社、Madison、WI、U.S.）を使用して、細胞標的化分子の状況において試験した。この無細胞のインビトロタン
パク質翻訳アッセイを使用して、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：ｓｃＦｖ−１（配列番号４７）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１６：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５２）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１９：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５５）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ０：：ｓｃＦｖ−２（配列番号５７）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ２：：ｓｃＦｖ−２（配列番号５８）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ３：：ｓｃＦｖ−２（配列番号５９）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ４：：ｓｃＦｖ−２（配列番号６０）、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１３：：ｓｃＦｖ−２（配列番号６２）のリボソーム不活性化能力を判定した。
リボソーム活性反応物を、製造業者の指示書に従って調製した。試験する細胞標的化分子の１０倍希釈系列を、適切な緩衝液中に調製し、各希釈物に対して、同一のTNT（登録
商標）反応混合成分系列を作製した。希釈系列中の各試料を、Luciferase T7 Control DNA（Promega社、Madison、WI、U.S.）とともにTNT（登録商標）反応混合物のそれぞれと合わせた。被験試料を、摂氏３０度（℃）で１．５時間インキュベートした。インキュベーションの後、Luciferase Assay Reagent（(Promega社、Madison、WI、U.S.）をすべての
被験試料に添加し、ルシフェラーゼタンパク質翻訳量を、製造業者の指示書に従って発光により測定した。３つの陽性対照を使用した：野生型のＳＬＴ−１Ａ１断片（ＳＬＴ−１Ａ１−ＷＴ）（配列番号４）並びにプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ（配列番号５）を含む２つの細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１（配列番号３４）及びＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−２（配列番号３５）（国際公開第ＷＯ２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照されたい）。
タンパク質合成の阻害レベルを、相対発光単位に対する総細胞標的化分子の対数変換した濃度の非線形回帰分析によって判定した。統計ソフトウェア（GraphPad Prism、San Diego、CA、U.S.）を使用して、半数阻害濃度（ＩＣ５０）値を、用量応答阻害の項目でPrismソフトウェアのｌｏｇ（阻害剤）対応答（３パラメーター）の関数［Ｙ＝最低値＋（（最高値−最低値）／（１＋１０＾（Ｘ−Ｌｏｇ ＩＣ５０）））］を使用して、各試料に関して計算した。各試料についてＩＣ５０を計算し、これを表９に示す。このアッセイにおいて、タンパク質合成の阻害に関する測定値は、試料分子のリボソーム不活性化活性を表し、これは、志賀毒素エフェクターポリペプチド又は志賀毒素Ａサブユニットの触媒活性の計量法の１つである。実施例において報告されるように、参照分子が呈したＩＣ５０の１０倍以内のＩＣ５０を呈する分子は、その参照分子のものと同程度のリボソーム阻害活性を呈すると見なす。実施例において報告されるように、参照分子が呈したＩＣ５０よりも低いか又は１０パーセント以内のＩＣ５０を呈する分子は、その参照分子のものと同等のリボソーム阻害活性を呈すると見なす。

試験したすべての志賀毒素エフェクターポリペプチドコンボ（ｎ）のリボソーム不活性化活性は、細胞標的化分子の構成成分として、野生型志賀毒素Ａ１断片（配列番号４）及び／又はＳＬＴ−１Ａ−ＦＲポリペプチド（配列番号５）の触媒活性と同程度であった（表９、図２）。ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：：ｓｃＦｖ−１、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１６：：ｓｃＦｖ−１、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１９：：ｓｃＦｖ−１、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ０：：ｓｃＦｖ−２、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ２：：ｓｃＦｖ−２、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ４：：ｓｃＦｖ−１、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１３：：ｓｃＦｖ２のリボソーム不活性化活性は、細胞標的化分子の構成成分として、野生型志賀毒素Ａ１断片（配列番号４）及び／又はＳＬＴ−１Ａ−ＦＲポリペプチド（配列番号５）の触媒活性と同等であった（表９、図２）。
これらの結果は、ある特定の例示的な脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドのリボソーム阻害活性が、細胞標的化分子の状況において、野生型志賀毒素Ａ１断片（配列番号４）単独又は細胞標的化分子の状況において志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ（配列番号５）の触媒活性と同程度であったことを示す（表９、図２）。したがって、ある特定の例示的な脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドの触媒活性は、細胞標的化分子の状況において、このアッセイでは、野生型志賀毒素Ａサブユニットの触媒活性と同程度であると見られた（表９、図２）。
Ｂ．志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）を含む例示的な細胞標的化分子の標的化細胞毒性の試験
細胞毒性の効力及び特異性を、様々な細胞標的化分子を構成する足場としての本発明の脱免疫化された組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）に関して試験した。脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）を含む例示的な細胞標的化分子の細胞毒性活性を、熟練した作業者に公知の標的生体分子陽性細胞殺滅アッセイを使用して判定した。こ
の標的陽性細胞殺滅アッセイを使用して、それぞれが、配列番号４３〜８１の細胞標的化分子を形成するように組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴＡ−１Ａ−コンボ（ｎ）（配列番号６〜３２）のうちの１つに遺伝子融合させた細胞標的化結合領域ｓｃＦｖ−（ｎ）を含む、様々な細胞標的化分子の細胞毒性活性を判定した（そのような分子の代表的なサブセットについては表８を参照されたい）。
脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子の細胞毒性を、細胞表面に有意な量の適切な細胞外標的生体分子、例えば、結合領域ｓｃＦｖ−１〜８の標的を発現する細胞を使用して、判定した。免疫グロブリン由来の結合領域ｓｃＦｖ−１、ｓｃＦｖ−２、ｓｃＦｖ−３、ｓｃＦｖ−４、ｓｃＦｖ−５、ｓｃＦｖ−６、ｓｃＦｖ−７、ｓｃＦｖ−８、及びｓｃＦｖ−９は、それぞれ、ある特定のヒト細胞の細胞表面に物理的に結合したヒト標的生体分子に高親和性で結合する。この実施例で使用した細胞は、ATCC（Manassas VA、U.S.）、National Cancer Institute of the U.S.（Frederick、MD、U.S.）、及び／又はDSZM（Braunschweig、DE）から入手可能
な不死化ヒト腫瘍細胞であった。以下に言及される細胞は、Ｈ９２９、Ｄａｕｄｉ、ＮＣＩ−ＡＤＲ／ＲＥＳ（トランスフェクトしたベクターからＨＥＲ−２を発現する）、ＨＣＣ１４１９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＯＬＰ−８、ＳＴ４８６、ＨＤＬＭ−２、及びＬ１２３６、又はより簡略的に、それぞれ細胞株Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、及びＩであった。熟練した作業者に公知の方法を使用して、この実施例で使用した細胞株Ｃ由来の細胞に、発現ベクターをトランスフェクトし、有意な量の細胞表面ＨＥＲ−２を発現するようにした。
細胞殺滅アッセイは、次のように行った。ある特定のヒト腫瘍細胞株細胞を、３８４ウェルプレートにおいて、２０マイクロリットル（μＬ、microliter）の細胞培養培地に播種した（１ウェル当たり約２〜８×１０３個の細胞で）。試験する細胞標的化分子の１０倍希釈系列を、適切な緩衝液中に調製し、５μＬの希釈物又は緩衝液対照を、播種した細胞に添加した。細胞培養培地のみを含む対照ウェルを、ベースライン補正として使用した。細胞試料を、細胞標的化分子又は緩衝液のみとともに、３７℃で３日間又は５日間、５パーセント二酸化炭素（ＣＯ２）雰囲気下においてインキュベートした。全細胞生存又は生存率パーセントを、CellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（G7573、Promega社、Madison、WI、U.S.）を製造業者の指示書に従って使用し、発光読取り値を使用して判定した。
実験ウェルの生存率パーセントを、以下の等式を使用して計算した：（試験ＲＬＵ−平均培地ＲＬＵ）／（平均細胞のみＲＬＵ−平均培地ＲＬＵ）×１００。生存率パーセントに対する細胞標的化分子の濃度の対数を、Prism（GraphPad Prism、San Diego、CA、U.S.）においてプロットし、ｌｏｇ（阻害剤）対応答（３パラメーター）の分析を使用して、試験した細胞標的化分子の半数細胞毒性濃度（ＣＤ５０）値を判定した。各試料についてＣＤ５０を計算し、これを表１０に示す。試験した濃度にわたって曲線の形状に基づいてＣＤ５０値を計算することができなかった場合、最大ＣＤ５０値は、最大試験値を上回るとして記入し、例えば、試験した最も高い試料濃度、例えば、１００．０００ｎＭ又は２００．０００ｎＭで細胞の５０％を殺滅しなかった試料について、１００ｎＭを上回る（「＞１００．０００ｎＭ」）又は２００ｎＭを上回る（「＞２００．０００ｎＭ」）として記入した。このアッセイにおける細胞生存率が、試験した最も高い試料濃度でおよそ５０％であった場合、その分子のＣＤ５０値は、試験した最大濃度での細胞生存率がおよそ５０％であった、例えば、「約１００．０００ｎＭ」として、表１０に記入した。実施例において報告されるように、参照分子が呈したＣＤ５０の１０倍以内のＣＤ５０を呈する分子は、その参照分子のものと同程度の細胞毒性活性を呈すると見なす。






例示的なＳＬＴ−１Ａ−コンボ足場に基づく細胞標的化分子のＣＤ５０値を表１０に示し、関連する細胞殺滅アッセイデータを、図３〜１０に示す。これらの結果は、それぞれが、少なくとも２６個の志賀毒素エフェクターポリペプチド（配列番号６〜２７及び２９〜３２）から選択される脱免疫化された組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）を含む、少なくとも３４個の固有な細胞標的化分子についての細胞殺滅アッセイの結果を示す。３４個の脱免疫化された組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（０〜１２、１４〜１７、１９〜２１、２３〜２７、及び２９〜３２）のうちの３２個は、細胞標的化分子の状況において、１００ｎＭ以下のＣＤ５０値を特徴とする細胞毒性を生じたが、一方でＳＬＴ−１Ａ−コンボ１３（配列番号１９）及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１８（配列番号２４）のいずれかを含む２つの細胞標的化分子は、試験した２つの細胞株に対して１００ｎＭを上回るＣＤ５０値を特徴とする細胞毒性を呈した（表１０、図６〜７）。
表１０に報告した結果は、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ０、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ４、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ８、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ９、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１１、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１２、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１４、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１５、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１６、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１７、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１９、又はＳＬＴ−１Ａ−コンボ２５を含む細胞標的化分子が、試験した細胞株に応じて、０．２ｎＭ以下のＣＤ５０値を特徴とする強力な細胞毒性を示したことを示す（表１０、図３〜１０）。細胞標的化分子の構成成分として、試験した志賀毒素エフェクターポリペプチドコンボ（ｎ）のほとんどの細胞毒性は、関連する細胞標的化分子の構成成分としてのＳＬＴ−１Ａ−ＦＲポリペプチド（配列番号５）の細胞毒性と同程度であった（表１０、図３〜７、図９〜１０）。例えば、志賀毒素エフェクターポリペプチドコンボ（０〜２、４、７〜８、１０、１２、１４〜１９、又は２３〜２６）のうちの１つを含む少なくとも１つの細胞標的化分子に関して試験した少なくとも１つの細胞型に対する細胞毒性は、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲポリペプチド（配列番号５）を含む関連する細胞標的化分子の細胞毒性と同程度であった（表１０、図３〜７、図９〜１０）。
ある特定の脱免疫化された組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−
コンボ（ｎ）を含む例示的な細胞標的化分子の細胞毒性の特異性を、熟練した作業者に公知の標的陰性細胞殺滅アッセイを使用して判定した。標的生体分子陰性細胞殺滅アッセイは、使用した細胞型を除いて標的陽性細胞殺滅アッセイと同一である。標的陰性細胞殺滅アッセイは、試験した細胞標的化分子のそれぞれの結合領域ｓｃＦｖ−（ｎ）が高親和性で結合する細胞外標的生体分子を有意な量で発現しない細胞を使用して行った。ある特定の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチド足場の組合せＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）を含む例示的な細胞標的化分子の細胞毒性特異性を、標的陽性細胞殺滅アッセイの結果と標的陰性細胞殺滅アッセイの結果とを比較することによって判定した（例えば、表１０、図８〜９を参照されたい）。脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ１−Ａ−コンボ（５〜７、１４、若しくは２１）又はＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ（配列番号５）を含む細胞毒性細胞標的化分子は、同じ細胞標的化分子濃度では、標的陰性細胞を、標的陽性細胞と比較して同程度の割合で殺滅しなかった（表１０、図８〜９）。
Ｃ．志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）を含む例示的な細胞標的化分子によって誘導されるカスパーゼ活性化の試験
アポトーシスは、カスパーゼによる細胞成分の分解を伴うプログラム細胞死である。アポトーシスは、エフェクターカスパーゼ３及び７の活性、例えば、カスパーゼ３又はカスパーゼ７のいずれかの活性状態などを監視することによって、検出することができる。本発明の脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）を含む例示的な細胞標的化分子のカスパーゼ活性化を、熟練した作業者に公知の標的生体分子陽性細胞のカスパーゼ活性アッセイを使用して、判定した。標的陽性細胞のカスパーゼ活性アッセイの方法は、上述の標的陽性細胞殺滅アッセイに類似している。
志賀毒素触媒活性は、固有の経路を介して、志賀毒素中毒の哺乳動物細胞のアポトーシスを誘導することができる（例えば、Inward C et al., J Infect 30: 213-8 (1995)、Fujii J et al.,Infect Immun 71: 2724-35 (2003)、Jandhyala D etal., Curr Top Microbiol Immunol 357: 41-65 (2012)、Tesh V, Curr Top Microbiol Immunol 357: 137-78 (2012)を参照されたい）。カスパーゼ活性化は、細胞死をもたらすアポトーシス機構の活性化に関する読取り値として使用することができる（Pop C, Salvesen G, J Biol Chem 284: 21777-81 (2009)、Nicholls S, Hyman B, Methods Enzymol 544:251-69 (2014)を参照されたい）。細胞標的化分子の状況において、脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ７及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１４によって誘導されるカスパーゼ活性化の効力及び特異性を、次のように判定した。
脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチド足場を含む細胞標的化分子のカスパーゼ活性化を、細胞表面に結合領域ｓｃＦｖ−１又はｓｃＦｖ−６の細胞外標的生体分子を有意な量で発現する細胞を使用して、判定した。
カスパーゼ活性化アッセイは、次のように行った。ある特定のヒト腫瘍細胞株を、３８４ウェルプレートにおいて、２０マイクロリットル（μＬ）の細胞培養培地に播種した（１ウェル当たり約２〜８×１０３個の細胞で）。試験する細胞標的化分子の１０倍希釈系列を、適切な緩衝液中に調製し、５μＬの希釈物又は緩衝液対照を、播種した細胞に添加した。細胞培養培地のみを含む対照ウェルを、ベースライン補正として使用した。細胞試料を、細胞標的化分子又は緩衝液のみとともに、３７℃で１８〜２０時間、５パーセントＣＯ２雰囲気下においてインキュベートした。カスパーゼ活性化を、Caspase-Glo 3/7（
登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（Promega社、Madison、WI、U.S.）を製造業者の指示書に従って使用し、発光読取り値を使用して判定した。
実験ウェルにおけるカスパーゼ活性化の量を、以下の等式を使用して計算した：（（試験ＲＬＵ−平均培地ＲＬＵ）／（平均細胞ＲＬＵ−平均培地ＲＬＵ））×１００。カスパーゼ活性化に対する細胞標的化分子の濃度の対数を、Prism（GraphPad Prism、San Diego、CA、U.S.）においてプロットし、ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３パラメーター）の分析をそれぞれの試験した細胞標的化分子に使用して、このアッセイにおけるカスパーゼ活性化の半数効果濃度（ＥＣ５０）値を計算した（図１１〜１２、表１１）。各実験の最大カスパーゼ活性の割合（「細胞のみ」の対照の測定値に対する活性化パーセント）（最大活性）を、「細胞のみ」の試料からのカスパーゼ活性化測定値をベースラインとして使用して計算した（表１１）。例示的な細胞標的化分子のカスパーゼ活性化のＥＣ５０及び最大活性を、表１１に示す。

細胞標的化分子の構成成分としてそれぞれ試験した志賀毒素エフェクターポリペプチドコンボ７及び１４によって誘導された標的細胞におけるカスパーゼ活性は、試験した細胞株のほとんどに関して、関連する細胞標的化分子（それぞれ、配列番号３４及び配列番号３９）の構成成分としてのＳＬＴ−１Ａ−ＦＲポリペプチド（配列番号５）によって誘導されるカスパーゼ活性と同程度であった（表１１、図１１〜１２）。
Ｄ．志賀毒素エフェクターポリペプチドにおける内因性エピトープ破壊の変異
この実施例では、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドを、ある特定の短縮化及びアミノ酸残基置換の組合せにより脱免疫化することができることを示す。欠失及び／又はアミノ酸置換を、表１２に列挙した志賀様毒素１のＡサブユニット（ＳＬＴ−１Ａ）に由来する志賀毒素エフェクターポリペプチドの推定上のＢ細胞エピトープ及び／又はＴ細胞エピトープに行った。この実施例及び国際公開第ＷＯ２０１５／１１３００５号パンフレットでは、多数の変異が、様々な志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子の志賀毒素エフェクター機能に対する効果に関して、経験的に試験されている。表１２に、この実施例及び国際公開第ＷＯ２０１５／１１３００５号パンフレットに記載の結果を要約するが、この結果では、アミノ酸置換又はアミノ酸置換の組合せは、強力なレベルの志賀毒素エフェクター機能を呈することを防止しなかった。表１２は、実施例１
に記載されているエピトープ領域番号付けスキームを使用し（上記の表７を参照されたい）、BcePredソフトウェアによって予測されたＢ細胞エピトープにおける任意の変化を列
挙する。








エピトープ領域１〜５及び７〜８において、異なるアミノ酸置換を行い、試験した（表１２を参照されたい）。エピトープ領域＃１（表７を参照されたい）において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１位に天然に位置するリシンを、アラニン（Ｋ１Ａ）及びメチオニン（Ｋ１Ｍ））に変異させた。エピトープ領域＃１において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の４位に天然に位置するスレオニンを、イソロイシン（Ｔ４Ｉ）に変異させた。エピトープ領域＃１において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の６位に天然に位置するアスパラギン酸を、アルギニン（Ｄ６Ｒ）に変異させた。エピトープ領域＃１において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の８位に天然に位置するセリンを、イソロイシン（Ｓ８Ｉ）に変異させた。エピトープ領域＃１において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の９位に天然に位置するスレオニンを、イソロイシン（Ｔ９Ｉ）及びバリン（Ｔ９Ｖ）に変異させた。エピトープ領域＃１において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１１位に天然に位置するリシンを、アラニン（Ｋ１１Ａ）及びヒスチジン（Ｋ１１Ｈ）に変異させた。エピトープ領域＃１において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１２位に天然に位置するスレオニンを、リシン（Ｔ１２Ｋ）に変異させた。
エピトープ領域＃２（表７を参照されたい）において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の３３位に天然に位置するセリンを、イソロイシン（Ｓ３３Ｉ）に変異させた。
エピトープ領域＃３（表７を参照されたい）において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）の４３位に天然に位置するセリンを、アスパラギン（Ｓ４３Ｎ）に変異させた。エピトープ領域＃３において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）の４４位に天然に位置するグリシンを、ロイシン（Ｇ４４Ｌ）に変異させた。エピトープ領域＃３において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）の４５位に天然に位置するセリンを、バリン（Ｓ４５Ｖ）及びイソロイシン（Ｓ４５Ｉ）に変異させた。エピトープ領域＃３において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の４５位に天然に位置するスレオニンを、バリン（Ｔ４５Ｖ）及びイソロイシン（Ｔ４５Ｉ）に変異させた。エピトープ領域＃３において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）の４６位に天然に位置するグリシンを、プロリン（Ｇ４６Ｐ）に変異させた。エピトープ領域＃３において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）の４７位に天然に位置するアスパラギン酸を、グリシン（Ｄ４７Ｇ）及びメチオニン（Ｄ４７Ｍ）に変異させた。エピトープ領域＃３において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）の４８位に天然に位置するアスパラギンを、バリン（Ｎ４８Ｖ）及びフェニルアラニン（Ｎ４８Ｆ）に変異させた。
エピトープ領域＃４（表７を参照されたい）において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の５３位に天然に位置するアスパラギン酸を、アラニン（Ｄ５３Ａ）、グリシン（Ｄ５３Ｇ）、及びアスパラギン（Ｄ５３Ｎ）に変異させた。Epitopiaウェブサーバーにより、Ｄ５３残基は、溶媒に露出されており、免疫原性スケール値５又は「高」を有することが予測された。エピトープ領域＃４において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の５４位に天然に位置するバリンを、イソロイシン（Ｖ５４Ｉ）に変異させた。エピトープ領域＃４において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の５５位に天然に位置するアルギニンを、アラニン（Ｒ５５Ａ）、バリン（Ｒ５５Ｖ）、及びロイシン（Ｒ５５Ｌ）に変異させた。エピトープ領域＃４において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の５６位に天然に位置するグリシンを、プロリン（Ｇ５６Ｐ）に変異させた。エピトープ領域＃４において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の５７位に天然に位置するイソロイシンを、メチオニン（Ｄ５７Ｍ）及びフェニルアラニン（Ｄ５７Ｆ）に変異させた。エピトープ領域＃４において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の５８位に天然に位置するアスパラギン酸を、アラニン（Ｄ５８Ａ）、バリン（Ｄ５８Ｖ）、及びフェニルアラニン（Ｄ５８Ｆ）に変異させた。エピトープ領域＃４において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の５９位に天然に位置するプロリンを、アラニン（Ｐ５９Ａ）に変異させた。エピトープ領域＃４において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の６０位に天然に位置するグルタミン酸を、イソロイシン（Ｅ６０Ｉ）、スレオニン（Ｅ６０Ｔ）、及びアルギニン（Ｅ６０Ｒ）に変異させた。エピトープ領域＃４において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の６１位に天然に位置するグルタミン酸を、アラニン（Ｅ６１Ａ）、バリン（Ｅ６１Ｖ）、及びロイシン（Ｅ６１Ｌ）に変異させた。エピトープ領域＃４において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の６２位に天然に位置するグリシンを、アラニン（Ｇ６２Ａ）に変異させた。
エピトープ領域＃５（表７を参照されたい）において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の９４位に天然に位置するアスパラギン酸を、アラニン（Ｄ９４Ａ）に変異させた。エピトープ領域＃５において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の９６位に天然に位置するセリンを、イソロイシン（Ｓ９６Ｉ）に変異させた。エピトープ領域＃５において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１０４位に天然に位置するスレオニンを、アスパラギン（Ｔ１０４Ｎ）に変異させた。エピトープ領域＃５において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１０５位に天然に位置するアラニンを、ロイシン（Ａ１０５Ｌ）に変異させた。エピトープ領域＃５において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１０７位に天然に位置するスレオニンを、プロリン（Ｔ１０７Ｐ）に変異させた。エピトープ領域＃５において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１０８位に天然に位置するロイシンを、メチオニン（Ｌ１０８Ｍ）に変異させた。エピトープ領域＃５において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１０９位に天然に位置するセリンを、バリン（Ｓ１０９Ｖ）に変異させた。エピトープ領域＃５において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１１０位に
天然に位置するグリシンを、アラニン（Ｇ１１０Ａ）に変異させた。エピトープ領域＃５において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１１１位に天然に位置するアスパラギン酸を、スレオニン（Ｄ１１１Ｔ）に変異させた。エピトープ領域＃５において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１１２位に天然に位置するセリンを、バリン（Ｓ１１２Ｖ）に変異させた。
エピトープ領域＃６（表７を参照されたい）において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１４１位に天然に位置するアスパラギン酸を、アラニン（Ｄ１４１Ａ）に変異させた。エピトープ領域＃６において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１４７位に天然に位置するグリシンを、アラニン（Ｇ１４７Ａ）に変異させた。
エピトープ領域＃７（表７を参照されたい）において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１７９位に天然に位置するアルギニンを、アラニン（Ｒ１７９Ａ）に変異させた。Epitopiaウェブサーバーにより、このＲ１７９残基は、露出されており、免疫原性値５又は「高」を有することが予測された。エピトープ領域＃７（表７を参照されたい）において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１８０位に天然に位置するスレオニンを、グリシン（Ｔ１８０Ｇ）に変異させた。エピトープ領域＃７（表７を参照されたい）において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１８１位に天然に位置するスレオニンを、イソロイシン（Ｔ１８１Ｉ）に変異させた。エピトープ領域＃７（表７を参照されたい）において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１８３位に天然に位置するアスパラギン酸を、アラニン（Ｄ１８３Ａ）及びグリシン（Ｄ１８３Ｇ）に変異させた。エピトープ領域＃７において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１８４位に天然に位置するアスパラギン酸を、アラニン（Ｄ１８４Ａ）又はフェニルアラニン（Ｄ１８４Ｆ）に変異させた。エピトープ領域＃７（表７を参照されたい）において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１８５位に天然に位置するロイシンを、バリン（Ｌ１８５Ｖ）又はアスパラギン酸（Ｌ１８５Ｄ）に変異させた。エピトープ領域＃７において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１８６位に天然に位置するセリンを、アラニン（Ｓ１８６Ａ）及びフェニルアラニン（Ｓ１８６Ｆ）に変異させた。エピトープ領域＃７において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１８７位に天然に位置するグリシンを、アラニン（Ｇ１８７Ａ）及びスレオニン（Ｇ１８７Ｔ）に変異させた。エピトープ領域＃７において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１８８位に天然に位置するアルギニンを、アラニン（Ｒ１８８Ａ）及びロイシン（Ｒ１８８Ｌ）に変異させた。エピトープ領域＃７において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１８９位に天然に位置するセリンを、アラニン（Ｓ１８９Ａ）に変異させた。
エピトープ領域＃８（表７を参照されたい）において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の２４８位に天然に位置するアルギニンを、アラニン（Ｒ２４８Ａ）に変異させた。エピトープ領域＃８において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の２５１位に天然に位置するアルギニンを、アラニン（Ｒ２５１Ａ
）に変異させた。
志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の４９位に天然に位置するロイシンを、アラニン（Ｌ４９Ａ）に変異させた。Epitopiaウェブサーバーにより、このＬ４９残基は、溶媒に露出されており、免疫原性値４を有し、Ｔ細胞エピトープ＃２（表７を参照されたい）に存在することが予測された。志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１９８位に天然に位置するグルタミン酸を、アラニン（Ｄ１９８Ａ）に変異させた。Epitopiaウェブサーバーにより、このＤ１９８残基は、溶媒に露出されており、免疫原性値５又は「高」を有することが予測された。志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の２０５位に天然に位置するアルギニンを、アラニン（Ｒ２０５Ａ）に変異させた。Epitopiaウェブサーバーにより、このＲ２０５残基は、溶媒に露出されており、免疫原性値５又は「高」を有することが予測された。
Ｔ細胞エピトープ領域＃１〜＃６において、異なるアミノ酸置換を行い、試験した（表１２を参照されたい）。
Ｔ細胞エピトープ＃１（表７を参照されたい）において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の４位に天然に位置するスレオニンを、イソロイシン（Ｔ４Ｉ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の６位に天然に位置するアスパラギン酸を、アルギニン（Ｄ６Ｒ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の８位に天然に位置するセリンを、イソロイシン（Ｓ８Ｉ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の９位に天然に位置するスレオニンを、イソロイシン（Ｔ９Ｉ）及びバリン（Ｔ９Ｖ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１１位に天然に位置するリシンを、アラニン（Ｋ１１Ａ）及びヒスチジン（Ｋ１１Ｈ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１２位に天然に位置するスレオニンを、リシン（Ｔ１２Ｋ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の３３位に天然に位置するセリンを、イソロイシン（Ｓ３３Ｉ）に変異させた。
Ｔ細胞エピトープ＃２（表７を参照されたい）において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）の４３位に天然に位置するセリンを、アスパラギン（Ｓ４３Ｎ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）の４４位に天然に位置するグリシンを、ロイシン（Ｇ４４Ｌ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）の４５位に天然に位置するセリンを、バリン（Ｓ４５Ｖ）及びイソロイシン（Ｓ４５Ｉ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）の４６位に天然に位置するグリシンを、プロリン（Ｇ４６Ｐ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）の４７位に天然に位置するアスパラギン酸を、グリシン（Ｄ４７Ｇ）及びメチオニン（Ｄ４７Ｍ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）の４８位に天然に位置するアスパラギンを、バリン（Ｎ４８Ｖ）及びフェニルアラニン（Ｎ４８Ｆ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の５０位に天然に位置するフェニルアラニンを、アラニン（Ｆ５０Ｔ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の５１位に天然に位置するアラニンを、バリン（Ａ５１Ｖ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１
）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の５３位に天然に位置するアスパラギン酸を、アラニン（Ｄ５３Ａ）、グリシン（Ｄ５３Ｇ）、及びアスパラギン（Ｄ５３Ｎ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の５６位に天然に位置するバリンを、ロイシン（Ｖ５４Ｌ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の５５位に天然に位置するアルギニンを、アラニン（Ｒ５５Ａ）、バリン（Ｒ５５Ｖ）、及びロイシン（Ｒ５５Ｌ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の５６位に天然に位置するグリシンを、プロリン（Ｇ５６Ｐ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の５７位に天然に位置するイソロイシンを、メチオニン（Ｄ５７Ｍ）及びフェニルアラニン（Ｄ５７Ｆ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の５８位に天然に位置するアスパラギン酸を、アラニン（Ｄ５８Ａ）、バリン（Ｄ５８Ｖ）、及びフェニルアラニン（Ｄ５８Ｆ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の５９位に天然に位置するプロリンを、アラニン（Ｐ５９Ａ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の６０位に天然に位置するグルタミン酸を、イソロイシン（Ｅ６０Ｉ）、スレオニン（Ｅ６０Ｔ）、及びアルギニン（Ｅ６０Ｒ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の６１位に天然に位置するグルタミン酸を、アラニン（Ｅ６１Ａ）、バリン（Ｅ６１Ｖ）、及びロイシン（Ｅ６１Ｌ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の６２位に天然に位置するグリシンを、アラニン（Ｇ６２Ａ）に変異させた。
Ｔ細胞エピトープ＃３（表７を参照されたい）において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の９４位に天然に位置するアスパラギン酸を、アラニン（Ｄ９４Ａ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の９６位に天然に位置するセリンを、イソロイシン（Ｓ９６Ｉ）に変異させた。
Ｔ細胞エピトープ＃４（表７を参照されたい）において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１４７位に天然に位置するグリシンを、アラニン（Ｇ１４７Ａ）に変異させた。
Ｔ細胞エピトープ＃５（表７を参照されたい）において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１７９位に天然に位置するアルギニンを、アラニン（Ｒ１７９Ａ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１８０位に天然に位置するスレオニンを、グリシン（Ｔ１８０Ｇ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１８１位に天然に位置するスレオニンを、イソロイシン（Ｔ１８１Ｉ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の１８３位に天然に位置するアスパラギン酸を、アラニン（Ｄ１８３Ａ）及びグリシン（Ｄ１８３Ｇ）に変異させた。
Ｔ細胞エピトープ＃６（表７を参照されたい）において、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の２４２位に天然に位置するシステインを、セリン（Ｃ２４２Ｓ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の２４８位
に天然に位置するアルギニンを、アラニン（Ｒ２４８Ａ）に変異させ、志賀様毒素１の成熟Ａサブユニット（配列番号１）及び志賀毒素の成熟Ａサブユニット（配列番号２）の２５１位に天然に位置するアルギニンを、アラニン（Ｒ２５１Ａ）に変異させた。
さらに、ＳＬＴ−１Ａのカルボキシ末端を、配列番号１のアミノ酸１〜２５１に短縮化することにより、最後の２つのエピトープ領域（表７、＃９及び＃１０）、最後のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（表６、＃７）、及びElliProによって予測された最も高いスコアの
非連続的なＢ細胞エピトープ（２８９〜２９３）を除去した。加えて、２５１位での短縮化により、Ｔ細胞エピトープ＃６及びエピトープ領域＃８（表７）を破壊する。
この実施例の例示的な脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ２２（配列番号２８）であり、これは、野生型志賀様毒素１のＡサブユニット（配列番号１）に対して７個のアミノ酸残基置換を有し、これらの置換のすべてが、内因性エピトープを破壊することが予測された。表８の分類によると、志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ２２は、エピトープ領域４を破壊する置換、エピトープ領域５を破壊する置換、エピトープ領域６を破壊する置換、エピトープ領域７を破壊する置換、エピトープ領域８を破壊する置換、短縮化によって破壊されるエピトープ領域８、９、及び１０、並びにＡ１断片に由来する領域のカルボキシ末端におけるフーリン切断部位を破壊する置換を含む。加えて、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ２２は、Ｔ細胞エピトープ＃２を破壊する置換、Ｔ細胞エピトープ＃４を破壊する置換、エピトープ＃６を破壊する置換、並びに短縮化によって破壊されるＴ細胞エピトープ＃６及び＃７を含む。
Ｅ．ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットアッセイを使用した例示的な志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）の抗原性の低減に関する試験
慣例的な方法を使用して、細胞標的化分子の状況において、志賀毒素エフェクターポリペプチドの相対的な抗原性を評価することができる（例えば、国際公開第ＷＯ２０１５／１１３００５号パンフレット、同第ＷＯ２０１５／１１３００７号パンフレットを参照されたい）。ある特定の脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）を含む例示的な細胞標的化分子の抗原性を、野生型志賀様毒素Ａ１断片（ＳＬＴ−１Ａ１）に高親和性で結合するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を使用して、ウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡによって評価した。細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１（配列番号３４）を、参照分子として使用した。
本明細書に使用されるウエスタン分析では、変性条件下における相対的な抗原性を判定し、一方で本明細書に使用されるＥＬＩＳＡ分析では、天然のタンパク質折り畳み条件下における相対的な抗原性を測定した。
ウエスタン分析については、志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ７、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１４を含む例示的な細胞標的化分子を試験し、参照分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１の結果と比較した。前述の分子の試料を、同量で、複製の４〜２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Lonza社、Basel、CH）にロードし、変性条件下において電気泳動した。得られたゲルは、クーマシー染色によって分析したか、又はポリビニルジフルオライド（ＰＶＤＦ、polyvinyl difluoride）膜に、iBlot（登録商標）（Life Technologies社、Carlsbad、CA、U.S.）のシステムを製造業者の指示書に従って使用して移した。得られた膜を、以下の抗体を使用して標準的な条件下においてプローブした：マウスモノクローナルα−Ｓｔｘ（ｍＡｂ１）（BEI NR-867、BEI Resources社、Manassas、VA、U.S.、志賀様毒素1のＡサブユニットと交差反応性を有する）、ウサギポリクローナル抗体α−ＳＬＴ−１Ａ（ｐＡｂ１）（Harlan Laboratories社、Indianapolis、IN、U.S.、野生型ＳＬＴ−１Ａ１に対して特注で産生さ
れた抗体、及び野生型志賀毒素のＡ１断片に由来するペプチドRGIDPEEGRFNN及びHGQDSVRVGRに対するウサギポリクローナル抗体α−ＳＬＴ−１Ａ（ｐＡｂ２）（Genscript社、Piscataway、NJ、U.S.、特注で産生された抗体）。ＳＬＴ−１Ａ及びＳｔｘＡにおいて、ペ
プチド配列RGIDPEEGRFNNは、アミノ酸５５〜６６に位置し、ペプチド配列HGQDSVRVGRは、２１４〜２２３に位置する。膜に結合した抗体は、標準的な条件を使用して検出し、適切な場合には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、horseradish peroxidase）コンジュゲート二次抗体（ヤギ抗ウサギＨＲＰ又はヤギ抗マウスＨＲＰ、Thermo Scientific社、Rockford、IL、U.S.）を使用して検出した。図１３は、ゲルのレーン及び／又は膜に番号
を付けてウエスタンブロットを示しており、図の凡例は、各レーンにロードした細胞標的化分子にはどの志賀毒素エフェクターポリペプチド領域が存在していたかをそれぞれ同じ番号で示している。クーマシー染色したレーンは、試料ローディング対照として示す。
図１３は、このアッセイでは、変性条件下において、例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−１、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：：ｓｃＦｖ−１、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１４：：ｓｃＦｖ−１が、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１と比較して減少した抗原性を呈することを示す。これらの結果は、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１４が、同じ様式で同じリンカーを使用して同じ標的化ドメイン（ｓｃＦｖ−１）に連結している場合、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲと比較して、又は推論ではＳＬＴ−１Ａ−ＷＴと比較して、減少した抗原性を有することを示す。加えて、図１３に示される結果は、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７が、このアッセイでは、試験した条件下において、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１４と比較して、低減した相対的な抗原性を有することを示唆する。
標準的なＥＬＩＳＡを使用して、α−ＳＬＴ−１Ａ ｍＡｂ１が、細胞標的化分子の状況において、それぞれ複数のエピトープ領域が破壊されている様々な脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを認識する能力を測定した。試験したそれぞれの細胞標的化分子がそのｓｃＦｖ結合領域の標的生体分子に結合する能力を、このアッセイで利用した。リン酸緩衝食塩水（１倍ＰＢＳ、phosphate buffered saline）（Hyclone Brand、Fisher Scientific社、Waltham、MA、U.S.）中のNunc MaxiSorp（登録商標）プレートのウ
ェルに、結合領域（ｓｃＦｖ−１）の組換えヒト標的生体分子をコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。ウェルを１倍ＰＢＳ、０．０５％Tween-20（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄し、ウェルを室温で１時間ＰＢＳ−Ｔ中３％ミルクとともにインキュベートすることによって、非特異的結合をブロッキングした。例示的な細胞標的化分子をウェルに添加し、ある特定のウェルに、脱免疫化された組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）を１種類だけ含む細胞標的化分子：ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−１、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：：ｓｃＦｖ−１、又はＳＬＴ−１Ａ−コンボ１４：：ｓｃＦｖ−１を１種類のみ入れた。加えて、細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１を、参照分子としてある特定のウェルに添加した。すべての細胞標的化分子を、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１を検出するためにＨＲＰにコンジュゲートしたプロテインＬを使用したＥＬＩＳＡによって最大結合（Ｂｍａｘ、maximum binding）を上回ることが既に判定されている濃度でウェルに添加し、これによって、
利用可能な標的生体分子が、過剰に存在する細胞標的化分子試料によって１００％結合されるようにした。プレートを室温で１時間インキュベートして、細胞標的化分子が、非変性条件下において標的生体分子に結合するようにした。ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いで、室温で１時間、ＨＲＰにコンジュゲートした抗ＳｘｔＡマウスモノクローナル抗体（抗ＳＬＴ−１Ａ ｍＡｂ１−ＨＲＰ）又はＨＲＰにコンジュゲートしたウサギポリクローナル抗体α−ＳＬＴ−１Ａ（抗ＳＬＴ−１Ａ ｐＡｂ２−ＨＲＰ）又はプロテインＬ−ＨＲＰ（これは、ｓｃＦｖ−１に結合するものであり、ローディング対照として使用した）とともにインキュベートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔ中で洗浄し、次いで、Pierce TMB Ultra（Thermo Scientific社、Rockford、IL、U.S.）とともにインキュベートした。反応
を、２５０ｍＭ塩酸（ＨＣｌ）により停止させた。ＨＲＰ活性は、発色性ＨＲＰ基質を添加し、次いで化学発光により生じる発光を、４５０ナノメートル（ｎｍ）の波長に設定した吸光（Ａｂｓ、absorbance）を測定するプレート読取りデバイスを使用して検出することによって、ウェルにおいて検出した。
測定した吸光値は、任意の細胞標的化分子試料の代わりにＰＢＳのみとともにインキュベートした、コーティングしてブロッキングしたウェルの吸光値を差し引くことによって、バックグラウンドに対して補正した。３つの異なる検出抗体からのシグナルを正規化するために、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ１からのシグナルを１００％に設定し、この対照に対する割合として、試験したそれぞれの細胞標的化分子試料の相対シグナルを、計算（試料のＡｂｓシグナル／対照の平均Ａｂｓシグナル）×１００により判定した。ＥＬＩＳＡの結果を、図１４に示す。
図１４は、天然の条件下において、例示的な細胞標的化分子、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４４）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４７）、又はＳＬＴ−１Ａ−コンボ１４：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５０）が、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１（配列番号３４）と比較して減少した抗原性を呈することを示す。これらの結果は、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１４が、同じ様式で同じリンカーを使用して同じ標的化ドメイン（ｓｃＦｖ−１）に連結している場合、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ（配列番号５）と比較して、又は推論ではＳＬＴ−１Ａ１−ＷＴ（配列番号４）と比較して減少した抗原性を呈することを示す。加えて、図１４に示される結果は、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１４が、このＥＬＩＳＡアッセイの天然の条件下において、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０と比較して低減した相対的な抗原性を有することを示唆する。
Ｆ．例示的な志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）のＣＤ４＋Ｔ細胞脱免疫化の試験
予測されたＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域における破壊を、外部から投与したポリペプチドの存在下におけるヒトＣＤ４＋Ｔ細胞増殖のアッセイ、及び投与したポリペプチドにより処置したヒト単球の存在下におけるヒトＣＤ４＋樹状Ｔ細胞刺激のアッセイを使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫原性の低減に関して試験する。
熟練した作業者に公知のＴ細胞増殖アッセイを使用して、志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ脱免疫化の有効性を試験する。この実施例のＴ細胞増殖アッセイは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を標識し、次いで、志賀毒素エフェクターポリペプチドコンボ（ｎ）又は参照分子、例えば、野生型志賀毒素Ａ１断片、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ、及び／又は前述のものを含む関連細胞標的化分子などのいずれかに由来する様々なペプチドの投与に応答した増殖の変化を、フローサイトメトリー法を使用して測定することを伴う。
選択した分子に由来するオーバーラップするペプチド系列を合成し、ＣＦＳＥ ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖アッセイ（ProImmune社、Sarasota、FL、U.S）において試験する。ＣＦＳＥで標識した、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、peripheral blood mononuclear cell）を、６つの複製ウェルにおいて７日間、目的のペプチドそれぞ
れ５μＭとともに培養する。各アッセイプレートには、未処置対照ウェルのセットが含まれる。このアッセイにはまた、既知のＭＨＣクラスＩＩ抗原又はアグレトープに対する合成ペプチドを含む基準抗原対照も組み込まれる。
投与したペプチドに応答して増殖するＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣは、フローサイトメトリーによって直接測定した場合に、ＣＦＳＥ蛍光強度の低減を示すであろう。ナイーブ
Ｔ細胞分析については、バックグラウンドを上回る刺激の割合を、刺激したそれぞれの試料について、蛍光シグナルに関して陰性、微弱、又は高いとランク付けを行うなど、未刺激の試料からの結果との比較により判定する。各試料におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＦＳＥが微弱の集団の計数を、全ＣＤ４＋Ｔ細胞集団に対する比率として表す。再現値を使用して、バックグラウンドを上回る刺激の割合を計算する（抗原刺激によるＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＦＳＥが微弱な細胞の比率から、抗原刺激なしのＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＦＳＥが微弱な細胞の比率を差し引く）。平均及び平均の標準誤差を、再現値から計算する。結果は、バックグラウンドを上回る刺激の割合が０．５％を上回り、またバックグラウンドを上回る標準誤差の２倍を上回った場合に、「陽性」と見なす。ペプチドの比較を可能にするため、応答指数（Response Index）を計算する。この指数は、各ペプチドに対する応答の大きさ（バックグラウンドを上回る刺激の割合）に、各ペプチドに対して応答するドナーの数（抗原性の割合）を乗じることに基づく。
Ｇ．例示的な志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）の相対的なＣＤ４＋Ｔ細胞免疫原性の判定
本発明の分子の相対的なＣＤ４＋Ｔ細胞免疫原性を、以下の樹状細胞（ＤＣ、dendritic cell）Ｔ細胞増殖アッセイを使用して判定する。このＤＣ Ｔ細胞アッセイは、外部から投与したポリペプチド又はタンパク質に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の応答を測定する。ProImmune社のＤＣ−Ｔアッセイサービスを使用してＤＣ Ｔ細胞アッセイを行って、タンパ
ク質と本発明の細胞標的化分子との間でＣＤ４＋Ｔ細胞による免疫原性の相対レベルを、参照分子と比較して判定する。この実施例のＤＣ Ｔ細胞アッセイは、投与したポリペプチド、タンパク質、又は細胞標的化分子試料に由来するペプチドの抗原提示に関して、ヒト樹状細胞を試験することを伴う。
簡単に述べると、健康なヒトドナーの組織を使用して、高分解能（high-resolution）
ＭＨＣクラスＩＩ組織分類に基づいて、分類された試料を単離する。２０人、４０人、又は５０人のドナーのコホートを使用する。まず、ヒトドナーＰＢＭＣから得た単球を、規定の培地で培養して、未成熟樹状細胞を生成する。次いで、未成熟樹状細胞を、明確に定義された対照抗原で刺激し、規定の培地でさらに培養することによって、より成熟した表現型に誘導する。次に、同じヒトドナー試料由来のＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇ドナーＰＢＭＣを、ＣＦＳＥで標識する。ＣＦＳＥで標識したＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣを、次いで、抗原感作した樹状細胞とともに７日間培養して、ＣＤ４＋樹状細胞刺激を行わせ、その後、各試料に対して８個の複製物を試験する。陰性対照として、各樹状細胞培養系列には、未処置樹状細胞のセットも含まれる。陽性対照について、このアッセイには、それぞれが完全長タンパク質を含む２つの明確に定義された基準抗原が組み込まれている。
樹状細胞に基づく免疫原性を評価するために、ドナー細胞応答の頻度を、研究コホート全体で分析する。このアッセイにおける陽性応答は、インビボでのＣＤ４＋Ｔ細胞応答の可能性の指標と見なす。バックグラウンドを上回る刺激の割合として測定される陽性応答は、２又は３以上の独立したドナー試料における０．５パーセント（％）を上回る割合として定義される。陽性ドナー細胞応答の強度は、各試料の許容ドナー全体で得られたバックグラウンドを上回る刺激割合の平均を取ることによって、判定される。応答の強度の値にドナーが応答した頻度を乗じることによって応答指数を計算して、各試料のＣＤ４＋Ｔ細胞免疫原性のレベルを判定する。加えて、相対的なＣＤ４＋Ｔ細胞免疫原性を表す応答指数を、２つの試料からの結果、すなわち、志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）を伴うもの、並びに参照分子としてＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及び／又はエピトープ領域の１又は２以上の予測された破壊を欠く関連分子である第２のバリアントの結果を比較することによって判定する。
Ｈ．志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）を含む例示的な細胞
標的化分子の免疫原性の低減に関する試験
マウスを使用して、本発明のある特定の例示的な分子の免疫原性能を調査した。何週間もの期間にわたる反復的な非経口投与後に、細胞標的化分子に対するインビボでの抗体応答に関するアッセイを使用して、例示的な細胞標的化分子の相対的な免疫原性を判定した（例えば、国際公開第ＷＯ２０１５／１１３００５号パンフレットを参照されたい）。溶液中でのＥＬＩＳＡを使用して、異なる細胞標的化分子に特異的であった血清マウス抗体の相対量を判定した。この免疫原性アッセイは、一般的に哺乳動物における分子の相対的な免疫原性を示すマウスの使用を伴う。
このアッセイを使用して、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：ｓｃＦｖ−（ｎ）を含む例示的な細胞標的化分子の相対的な免疫原性を、あまり脱免疫化されていない細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ（ｎ）又は参照分子ｓｃＦｖ−３：：ＳＬＴ−１Ａ−ＷＴ（配列番号３３）と比較して判定した。参照分子ｓｃＦｖ−３：：ＳＬＴ−１Ａ−ＷＴを、相対的な免疫原性アッセイにおいて試験した本発明の例示的な細胞標的化分子の逆のアミノ−カルボキシ融合配向で構築し、ｓｃＦｖ−３：：ＳＬＴ−１Ａ−ＷＴの志賀毒素エフェクターポリペプチド成分は、野生型志賀毒素Ａ１断片（配列番号４）からなっており、これは「脱免疫化されていない」志賀毒素エフェクターポリペプチドを表す。
４回の異なるマウス研究を行ったが、ここでは、ＢＡＬＢ／ｃマウス又はＣ５７ＢＬ／６マウスを、１群当たり６匹のマウスからなる処置群にランダムに割り当て、異なる処置群のマウスには、異なる細胞標的化分子を投与した。まず、細胞標的化分子に曝露する前に、各マウスから血清試料を採取した。次に、処置群の各マウスに、試料細胞標的化分子の１回の投与につき体重１キログラム当たり０．２５ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）の試料分子を、２週間にわたり週３回の腹腔内注射によって投与した。いずれの試料の投与も受けずに１週間経った後、試料細胞標的化分子の１回の投与につき０．２５ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射を、さらに２週間にわたり週３回投与し、結果、５週間の期間にわたって合計１２回の細胞標的化分子の投与となった。すべての研究について、投与した分子であるＳＬＴ−１Ａ−コンボ１：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４３）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４４）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４７）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：：ｓｃＦｖ−２（配列番号６１）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１２：：ｓｃＦｖ−１（配列番号４９）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１５：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５１）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１６：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５２）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１９：：ｓｃＦｖ−１（配列番号５５）、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ２２：：ｓｃＦｖ−２（配列番号６３）、並びに参照分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１（配列番号３４）及びＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−２（配列番号３５）は、忍容性が良好であり、結果として、体重に対する影響がなかったか又は最小限であり、臨床徴候はなかった。５週間の投与期間の最中及びその後に、すべてのマウスから血清を採取して、溶液中でのＥＬＩＳＡを使用して、投与した細胞標的化分子を標的とする抗体を観察した。マウス研究は、Charles River Laboratories社、Piedmont、NC、U.S.において行った。これらの研究の結果を、表１３〜１６及び図１５〜１６に示す。
投与した細胞標的化分子を認識する抗体を検出するための溶液中でのＥＬＩＳＡは、試験している細胞標的化分子の結合領域ｓｃＦｖ−（ｎ）に特異的なものであり、以下のように行った。各細胞標的化分子及びそのそれぞれのマウス処置群について、異なるＥＬＩＳＡアッセイを行ったが、同じ一般的な溶液中でのＥＬＩＳＡアッセイの設定を使用した。各細胞標的化分子及びそのそれぞれのマウス処置群について、溶液中でのＥＬＩＳＡアッセイの設定には、その群の細胞標的化分子のｓｃＦｖ−（ｎ）の適切な標的生体分子のみが含まれた。すべての溶液中でのＥＬＩＳＡアッセイに関して、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに、細胞標的化結合領域ｓｃＦｖ−（ｎ）の標的生体分子をコーティングした。マウス処置群において注射に使用される同じ細胞標的化分子を、その群の１匹のマウスから
採取した血清とともに、溶液中において４℃で一晩インキュベートした後、形成された任意の複合体（例えば、細胞標的化分子及び血清中に存在する抗体を含む複合体）を、コーティングされたＥＬＩＳＡプレートのウェルを使用して捕捉した。捕捉した、マウス免疫グロブリンＧ分子（ＩｇＧ）を含む免疫複合体を、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。発色性ＨＲＰ基質を添加し、化学発光の結果として発光を検出することによって、ウェルにおいてＨＲＰ活性を検出した。ＨＣｌの添加によって反応を停止させ、ＨＲＰ活性又は「ＥＬＩＳＡシグナル」を、プレートリーダーを使用して４５０ｎＭで測定した。ＥＬＩＳＡシグナルの値は、「血清不含」の陰性対照ウェルから測定したバックグラウンドシグナルを差し引いた後に、吸光値（Ａｂｓ ４５０ｎＭ）として計算した。このアッセイの飽和レベルよりも下の吸光値の読取りを可能にするために、血清を希釈したが、希釈比は、所与の日に測定したすべての処置群のすべてのマウスで同じであった。これらの溶液中でのＥＬＩＳＡアッセイの一般的な設定として、より高いＥＬＩＳＡシグナル値は、投与した細胞標的化分子を認識するマウスＩｇＧ抗体がより多く存在すること、又は換言すると、免疫原性が高いことを示す。
これらの溶液中でのＥＬＩＳＡアッセイに基づいて、４回の研究のいずれの処置群のマウスにも、注射による曝露の前に試験した細胞標的化分子を認識する事前形成された血清抗体を有することが観察されたものはなかった。したがって、溶液中でのＥＬＩＳＡアッセイを使用したこれらの研究のマウスの血清において、投与後における抗「細胞標的化分子」ＩｇＧ抗体の検出はすべて、細胞標的化分子の投与後に誘導されたデノボ抗体産生を表す。
投与した細胞標的化分子に対するマウスＩｇＧ抗体応答は、適切な溶液中でのＥＬＩＳＡアッセイを使用して、異なる時点における４回の研究で測定しており、この結果を、表１３〜１６及び図１５〜１６に報告する。それぞれの時点において、血清試料を、ＥＬＩＳＡシグナルの値がアッセイのダイナミックレンジ内にとどまるように希釈した。個々の研究の単一の時点において、すべての血清試料を同一に希釈した。個々の血清採取時点におけるそれぞれのマウス処置群の平均ＥＬＩＳＡ吸光値（「平均ＥＬＩＳＡシグナル」）を計算した。これらの相対的な免疫原性の研究を行う際、特定の処置群のマウスに注射した同じ細胞標的化分子を、その同じ群のマウスのみから採取した血清から血清抗体を捕捉するためのＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用した。換言すると、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１を投与したマウス（ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１基準群）に由来する血清中に存在する抗「細胞標的化分子」ＩｇＧ抗体は、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１だけのために特別に設計したＥＬＩＳＡアッセイにおいて捕捉及び検出し、同様に、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−１を投与したマウス（例えば、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−１群）に由来する血清中に存在する抗「細胞標的化分子」ＩｇＧ抗体は、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−１だけのために特別に設計した溶液中でのＥＬＩＳＡアッセイを使用して捕捉及び検出した。
個々の血清採取時点における各マウス処置群の平均ＥＬＩＳＡシグナル値を計算し、次いで、相対的な免疫原性を、それぞれの時点において各群について、上述の基準細胞標的化分子で処置した基準群の同じそれぞれの時点における平均ＥＬＩＳＡ吸光値と比較して計算した。所与の研究においてある特定の時点で試験したそれぞれの例示的な細胞標的化分子（ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：ｓｃＦｖ−（ｎ））の相対的な免疫原性を、参照分子（例えば、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−（ｎ）又はｓｃＦｖ−３：：ＳＬＴ−１Ａ−ＷＴ）の免疫原性と比較して、次の式を使用して計算した：（細胞標的化分子のＥＬＩＳＡシグナル−「血清不含」対照の平均ＥＬＩＳＡシグナル）／（参照分子の平均ＥＬＩＳＡシグナル−「血清不含」対照の平均ＥＬＩＳＡシグナル）×１００。図１５〜１６を作成するために、各マウス処置群について参照分子のＥＬＩＳＡシグナルに対する割
合をＹ軸に描き、血清採取日をＸ軸に描いた。各細胞標的化分子に対する哺乳動物のＩｇＧ応答を測定するために、平均ＥＬＩＳＡシグナル（「平均シグナル」）及び参照分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−（ｎ）の平均シグナルに対するパーセント（「基準に対するパーセント」）を、各マウス処置群について計算した（表１３〜１６）。
第１のマウス研究からの相対的な免疫原性アッセイの結果を、図１５のパネルＡ及び表１３に示す。「該当なし」という用語は、１日目の計算が、処置前血清を含み、ＥＬＩＳＡシグナルの値がゼロであるため、「該当しない」ことを示すために使用した。

第１の相対的な免疫原性に関するマウス研究の結果として、例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−１は、すべての時点において、基準の細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１と比較して、低減した免疫原性を呈した。ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−１処置群の平均ＥＬＩＳＡ吸光値は、１日目以降すべての時点において、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１処置群よりも低かった（血清は、１日目の処置前に採取した）。試験した細胞標的化分子について、抗「細胞標的化分子」ＩｇＧ応答は、１５日目（６回目の用量を投与した３日後）に初めて観察され、次いで、マウスＩｇＧ応答が、後続のすべての時点において観察された：２２日目（６回目の用量を投与した１０日後で７回目の用量を投与する前）、２９日目（９回目の用量を投与した３日後で１０回目の用量を投与する前）、３６日目（最後の用量を投与した３日後）、４３日目（１１回目の用量を投与した１０日後）、及び５０日目（最後の用量を投与した１７日後）（図１５のパネルＡ、表１３）。表１３のデータは、脱免疫化されたフーリン切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドコンボ７を含む細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：ｓｃＦｖ−１が、野生型志賀毒素Ａ１断片を含む細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１と比較して、低減した免疫原性を有していたことを示した。これらの結果は、脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチド足場の組合せであるコンボ７からなる志賀毒素エフェクターポリペプチドのみを含む分子が、（１）野生型志賀様毒素Ａ１断片又は（２）フーリン切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−ＦＲを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む分子と
比較して、低減した免疫原性を呈することを示唆する。
第２のマウス研究からの相対的な免疫原性アッセイの結果を、図１５のパネルＢ及び表１４に示す。

第２の相対的な免疫原性に関するマウス研究の結果として、試験した例示的な細胞標的化分子（ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：：ｓｃＦｖ−１、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１６：：ｓｃＦｖ−１、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１９：：ｓｃＦｖ−１）は、３６日目までのすべての時点において、基準の細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１と比較して、低減した免疫原性を呈した（図１５のパネルＢ、表１４）。試験した細胞標的化分子について、抗「細胞標的化分子」ＩｇＧ応答は、１５日目（６回目の用量を投与した３日後）に初めて観察され、次いで、マウスＩｇＧ応答が、後続のすべての時点において観察された：２２日目（６回目の用量を投与した１０日後で７回目の用量を投与する前）、２９日目（９回目の用量を投与した３日後で１０回目の用量を投与する前）、３６日目（最後の用量を投与した３日後）、及び４０日目（最後の用量を投与した７日後）（図１５のパネルＢ、表１４）。１５日目及び２２日目の両方において、基準の細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１を投与した群のマウスは、ＥＬＩＳＡシグナルによって示されるように、全ＩｇＧ抗体応答の規模が、脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクター足場を含む例示的な細胞標的化分子（ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１６、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１９）を投与した群のマウスよりも高かった（図１５、表１４）。２９日目、３６日目、及び４０日目において、平均基準ＥＬＩＳＡシグナルに対するＳＬＴ−１Ａ−コンボ１６：：ｓｃＦｖ−１及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１９：：ｓｃＦｖ−１を投与した群の平均ＥＬＩＳＡシグナル値の割合は、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１：：ｓｃＦｖ−１を投与した群よりも高かった。すべての時点において、平均基準ＥＬＩＳＡシグナルに対するＳＬＴ−１Ａ−コンボ１９：：ｓｃＦｖ−１群の平均ＥＬＩＳＡシグナル値の割合は、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：：ｓｃＦｖ−１又はＳＬＴ−１Ａ−コンボ１６：：ｓｃＦｖ−１を投与した群の平均ＥＬＩＳＡシグナル値の割合よりも高かった。
第３のマウス研究からの相対的な免疫原性アッセイの結果を、表１５及び図１５のパネルＣに示す。

ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：：ｓｃＦｖ−２及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ２２：：ｓｃＦ
ｖ−２処置群の平均ＥＬＩＳＡ吸光値は、１日目の後２９日目まで、すべての時点において、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−２及びｓｃＦｖ−３：：ＳＬＴ−１Ａ−ＷＴ処置群のものよりも低かった。表１５のデータは、それぞれ脱免疫化されたフーリン切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む、細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：：ｓｃＦｖ−２及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ２２：：ｓｃＦｖ−２が、細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ２及び逆のカルボキシ−アミノ融合配向の別のｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ−３）の状況での野生型ＳＬＴ−１のＡ１断片と比較して、低減した免疫原性を呈したことを示す。これらの結果は、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域が脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチド足場の組合せ、コンボ１０又はコンボ２２からなる細胞標的化分子が、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域が（１）野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド又は（２）フーリン切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−ＦＲからなる細胞標的化分子と比較して、低減した免疫原性を示すことを示唆する。
第４のマウス研究からの相対的な免疫原性アッセイの結果を、図１６及び表１６に示す。

第４の免疫原性研究の結果として、試験した例示的な細胞標的化分子は、少なくとも早い時点においては、基準の細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１と比較して低減した免疫原性を呈した（図１４のパネルＡ、表１６）。血清は、１日目の処置前に採取した。試験した細胞標的化分子について、抗「細胞標的化分子」ＩｇＧ応答は、１５日目（６回目の用量を投与した３日後）に初めて観察され、次いで、マウスＩｇＧ応答が、後続のすべての時点において観察された：２２日目（６回目の用量を投与した１０日後で７回目の用量を投与する前）、２９日目（９回目の用量を投与した３日後で１０回目の用量を投与する前）、３６日目（最後の用量を投与した３日後）、及び４０日目（最後の用量を投与した７日後）（図１４、表１６）。１５日目、２２日目、及び２９日目のすべてにおいて、基準の細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−１を投与した群のマウスは、ＥＬＩＳＡシグナルによって示されるように、全ＩｇＧ抗体応答の規模が、脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクター足場を含む例示的な細胞標的化
分子（ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１２、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１５）を投与した群のマウスよりも高かった（図１６、表１６）。すべての時点において、平均基準ＥＬＩＳＡシグナルに対するＳＬＴ−１Ａ−コンボ１：：ｓｃＦｖ−１処置群の平均ＥＬＩＳＡシグナル値の割合は、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：：ｓｃＦｖ−１、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１２：：ｓｃＦｖ−１、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１５：：ｓｃＦｖ−１を投与した処置群の平均ＥＬＩＳＡシグナル値の割合よりも高かった。３６日目及び４０日目において、平均基準ＥＬＩＳＡシグナルに対するＳＬＴ−１Ａ−コンボ１２：：ｓｃＦｖ−１を投与した処置群の平均ＥＬＩＳＡシグナル値の割合は、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０：：ｓｃＦｖ−１及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１５：：ｓｃＦｖ−１を投与した処置群のものよりも高かった。これらの結果は、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域が脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチド足場の組合せＳＬＴ−１Ａ−コンボ１、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１２、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１５からなる細胞標的化分子が、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域が（１）野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド又は（２）フーリン切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−ＦＲからなる細胞標的化分子と比較して、低減した免疫原性を示すことを示唆する。
第２、第３、及び第４のマウス研究において試験した細胞標的化分子の中でも、脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクター足場の組合せＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０が、この相対的な免疫原性アッセイでは、試験した条件下において、最も脱免疫されていると見られた（図１５〜１６、表１４〜１６を参照されたい）。この志賀毒素エフェクター足場は、（１）５つの破壊されたエピトープ領域、うち２つが複数のアミノ酸残基置換を伴うもの、及び（２）組み込まれた異種Ｔ細胞エピトープによって破壊される内因性エピトープ領域を含んでいた。第２の研究において、脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクター足場の組合せＳＬＴ−１Ａ−コンボ１６は、特に、早い時点において、脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクター足場の組合せＳＬＴ−１Ａ−コンボ１９よりも脱免疫化されていると見られた（図１５のパネルＢ、表１４を参照されたい）。第４の研究において、脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクター足場の組合せＳＬＴ−１Ａ−コンボ１が、試験した志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（１、１０、１２、及び１５）のうちで最も脱免疫化されていないと見られた（図１６のパネルＡ、表１６を参照されたい）。第４の研究において、脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクター足場の組合せＳＬＴ−１Ａ−コンボ１５は、特に、遅い時点において、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１２よりも脱免疫化されていると見られた（図１６のパネルＡ、表１６を参照されたい）。
これらの免疫原性研究の結果は、エピトープ領域破壊、アミノ酸残基置換、及び組み込まれた異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのうちの２つが、志賀毒素エフェクターポリペプチドの脱免疫化に寄与し得ることを示す。さらに、同じ志賀毒素エフェクターポリペプチドにおいて両方の種類の破壊を組み合わせることにより、より脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドをもたらすことができる。これらの脱免疫化されたＣＤ８＋Ｔ細胞で過免疫化されたプロテアーゼ切断耐性組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む例示的な細胞毒性細胞標的化分子を投与した群のマウスにおける抗体誘導の全体的な規模は、プロテアーゼ切断耐性であるがそれ以外は野生型の志賀毒素エフェクターポリペプチド領域を含む細胞標的化分子を投与した群のマウスにおける抗体誘導の規模と比較して、低減された。ある特定の脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクター足場の組合せを含む細胞標的化分子のＥＬＩＳＡシグナル値の減少は、これらの特定の足場の脱免疫化が成功した（すなわち、哺乳動物における免疫原性能が低減している）ことを示す。したがって、志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ１、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１２、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１５、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１６、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１９は、哺乳動
物における免疫原性能の低減を呈しており、これらのポリペプチドを含むいずれの例示的な細胞標的化分子も、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａのアミノ酸残基２３８〜２５７に天然に位置する領域におけるフーリン切断モチーフの変異に起因して、野生型のみ又は単にプロテアーゼ切断耐性の志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む類似の分子と比較して、脱免疫化されているはずである。
試験した異なる脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドの免疫原性能において観察された相違は、脱免疫化された部分領域及び／又は組み込まれたＴ細胞エピトープ部分領域のある特定の組合せが、異なる規模で免疫原性を低減させることを示す。例えば、研究２では、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０は、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１６及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１９が野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較してＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０よりも多くの破壊されたエピトープ領域を含み、より多くの合計アミノ酸残基置換を含んでいたにもかかわらず（表８）、特に、遅い時点において、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１６及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１９よりも脱免疫化されていた（表１４、図１５のパネルＢ）。研究４では、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０は、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１２及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１５の両方が、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０よりも多くの破壊されたエピトープ領域を含み、より多くの合計アミノ酸残基置換を含んでいたにもかかわらず（表８）特に、遅い時点において、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１２よりも脱免疫化されていた（表１６、図１６のパネルＡ）。したがって、追加のＢ細胞エピトープ領域破壊の累積的な組合せは、必ずしも免疫原性のさらなる減少につながるわけではなく、むしろ、例えば、遅い時点などにおいて、望ましくない免疫原性の増加をもたらし得る（図１５のパネルＢを参照し、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０の結果をＳＬＴ−１Ａ−コンボ１６及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１９の結果と比較されたい）。
Ｉ．例示的な細胞標的化分子がＴ細胞エピトープ−ペプチドを提示のために細胞のＭＨＣクラスＩ経路に送達する能力の試験
ＭＨＣクラスＩ系によるＴ細胞エピトープの提示は、ＣＴＬ媒介性溶解による殺滅の標的を提示細胞に定め、局所領域において免疫刺激を引き起こす。異種免疫原性エピトープを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子を改変することにより、免疫刺激性抗原の標的化された送達及び提示を達成することができる。標的細胞による免疫刺激性非自己抗原、例えば、高い免疫原性を有する既知のウイルス抗原などの提示により、標的細胞を破壊するように、並びに生体内のその領域により多くの免疫細胞を動員するように、他の免疫細胞へシグナル伝達が行われる。
同じ志賀毒素エフェクターポリペプチド領域において、脱免疫化と、標的細胞表面上へのＴ細胞エピトープ提示の提供とを同時に行うために、予測されたＢ細胞エピトープ領域を、その中のアミノ酸残基をヒトＭＨＣクラスＩ分子に結合することが予測される免疫原性Ｔ細胞エピトープ領域と置き換えることによって破壊された。
この実施例では、本発明の例示的な細胞標的化分子が標的細胞表面への提示のためにＴ細胞エピトープを標的細胞のＭＨＣクラスＩ経路に送達する能力を調査する。加えて、本発明の例示的な細胞標的化分子によって送達されたＴ細胞エピトープの標的細胞のＭＨＣクラスＩによる提示の機能的結果を、ＭＨＣ Ｉ分子による送達されたエピトープ−ペプチドの提示によって誘導される様々な免疫応答を観察することによって調査する。
１．分子がＴ細胞エピトープ−ペプチドを細胞表面上での提示のためにＭＨＣクラスＩ経路に送達する能力の試験
当該技術分野で公知の慣例的なアッセイを使用して、本発明の例示的な分子がＴ細胞エピトープをＭＨＣクラスＩ分子に送達する能力を調査する（例えば、国際公開第ＷＯ２０
１５／１１３００７号パンフレットを参照されたい）。具体的には、フローサイトメトリー法を使用して、標的細胞の表面上でＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成するＴ細胞エピトープ−ペプチド（志賀毒素エフェクターポリペプチドに挿入されている又は組み込まれている）の送達及び細胞外提示を実証する。このフローサイトメトリー法は、それぞれが異なるエピトープ−ヒトＨＬＡ複合体に高親和性で結合する可溶性ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ、T-cell receptor）多量体試薬（Soluble T-Cell AntigenReceptor STAR（商標）Multimer、AltorBioscience社、Miramar、FL、U.S.）を利用する。
それぞれのSTAR（商標）ＴＣＲ多量体試薬は、特定のＴ細胞受容体に由来し、選択されたＴＣＲが特定のＭＨＣクラスＩ分子に関連して提示される特定のペプチドを認識する能力に基づいた特定のペプチド−ＭＨＣ複合体の検出を可能にする。これらのＴＣＲ多量体は、ビオチニル化されており、ストレプトアビジンと多量体化している、組換えヒトＴＣＲから構成されている。ＴＣＲ多量体は、フィコエリトリン（ＰＥ、phycoerythrin）で
標識する。これらのＴＣＲ多量体試薬は、ヒト細胞の表面上に提示される特定のペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体の検出を可能にするが、これは、それぞれの可溶性ＴＣＲ多量体型が、様々な条件下において特定のペプチド−ＭＨＣ複合体を認識し、安定に結合するためである（Zhu X et al., J Immunol 176: 3223-32 (2006)）。これらのＴＣＲ多量体試
薬は、細胞の表面上に提示されるペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体のフローサイトメトリーによる特定及び定量化を可能にする。
この実施例で使用した標的細胞は、ATCC（ManassasVA, U.S.）、National Cancer Institute of the U.S.（Frederick、MD、U.S.）、及び／又はDSZM（Braunschweig、DE）か
ら入手可能である。当該技術で公知の標準的なフローサイトメトリー法を使用して、標的細胞が、適切なＭＨＣクラスＩ分子及びこの実施例で使用した細胞標的化分子の細胞標的化部分の細胞外標的生体分子の両方を細胞表面に発現することを確認する。
標的細胞を、それぞれが組み込まれた又は挿入されたＴ細胞エピトープを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む本発明の例示的な細胞標的化分子で処置する。この実施例において試験する本発明のある特定の例示的な分子は、次の変異：Ｙ７７Ｓ及びＥ１６７Ｄのうちの一方又は両方を付加することによって、触媒的に損傷又は不活性化されている。標的細胞のセットは、本発明の異なる例示的な細胞標的化分子を、志賀毒素に対する細胞型特異的感受性を考慮して他で使用されるものと類似の濃度で外部から投与することによって処置する（例えば、Noakes K et al., FEBS Lett 453: 95-9 (1999)を参照され
たい）。処置した細胞を、次いで、３７℃及び５％二酸化炭素の雰囲気を含む標準的な条件下において６時間インキュベートして、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域によって媒介される中毒を起こさせる。次いで、細胞を細胞培養培地で洗浄し、新しい細胞培養培地中に再懸濁させ、２０時間インキュベートした後、適切なSTAR（商標）多量体試薬で染色する。追加の時点及び設定条件もまた試験する。
対照として、標的細胞のセットを、３つの条件で処置する：１）処置なし（「未処置」）、外来分子も添加されていないことを意味する、２）対照抗原−ペプチドを外部から投与、及び３）対照抗原−ペプチドを、ペプチドローディング増強剤（「ＰＬＥ」、Peptide Loading Enhancer、Altor Bioscience社、Miramar、FL、U.S.）と組み合わせて外部か
ら投与。対照の抗原−ペプチドペプチドとＰＬＥとの組合せ処置は、外来ペプチドローディングを可能にし、陽性対照として機能した。適切なＭＨＣクラスＩハプロタイプを呈する細胞は、細胞外空間から（すなわち、適用されたペプチドの細胞内在化の非存在下で）又はＢ２−ミクログロブリン及び他の成分の混合物であるＰＬＥの存在下において、適切な外部から適用されるペプチドを強制的にロードすることができる。
処置後に、すべての細胞セットを洗浄し、適切なSTAR多量体試薬とともに氷上で１時間
インキュベートする。細胞を洗浄し、試料の蛍光を、Accuri（商標）Ｃ６フローサイトメーター（BD Biosciences社、San Jose、CA、U.S.）を使用してフローサイトメトリーによって測定して、集団中の細胞に結合した任意のSTAR（商標）多量体の存在を検出し、定量化する（本明細書において「染色」と称される場合がある）。
未処置対照を使用して、未処置対照から「陽性」ゲートに入る細胞が１％未満であるゲートを用いて陽性細胞集団及び陰性細胞集団を特定する（バックグラウンドシグナルを表す）。次いで、同じゲートを他の試料に適用して、各試料の陽性集団を特徴付ける。
中毒化された標的細胞の細胞表面上でヒトＭＨＣクラスＩ分子と複合体形成した、外部から投与した組み込まれた又は挿入されたＴ細胞エピトープの検出は、組み込まれた又は挿入されたＴ細胞エピトープ−ペプチドを含む細胞標的化分子が、標的細胞に進入し、十分な細胞内経路決定を行い、標的細胞表面に提示するのに十分なＴ細胞エピトープをＭＨＣクラスＩ経路に送達することができることを示す。
２．分子が標的細胞の細胞毒性Ｔ細胞媒介性細胞溶解及び他の免疫応答を誘導する能力の試験
当該技術分野で公知の慣例的なアッセイを使用して、本発明の例示的な細胞標的化分子によって送達されたＴ細胞エピトープの標的細胞のＭＨＣクラスＩによる提示の機能的結果を調査する（例えば、国際公開第ＷＯ２０１５／１１３００７号パンフレットを参照されたい）。調査する機能的結果には、ＣＴＬ活性化、ＣＴＬ媒介性標的細胞殺滅、及びＣＴＬによるサイトカイン放出が含まれる。
ＣＴＬに基づく細胞毒性アッセイを使用して、エピトープ提示の結果を評価する。このアッセイは、組織培養した標的細胞及びＴ細胞を含む。標的細胞は、国際公開第ＷＯ２０１５／１１３００７号パンフレットに記載されているように中毒化する。簡単に述べると、標的細胞を、標準的な条件下において、異なる外来的に投与した細胞標的化分子とともに６時間インキュベートするが、ここで、ある特定の細胞標的化分子は、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。次に、中毒化した標的細胞にＣＴＬを添加し、インキュベートして、Ｔ細胞が、エピトープ−ペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体を提示する任意の標的細胞を認識し、それに結合できるようにする。次いで、標的細胞へのＣＴＬの結合、ＣＴＬ媒介性細胞溶解による標的細胞殺滅、及びＥＬＩＳＡ又はＥＬＩｓｐｏｔによるインターフェロンガンマ若しくはインターロイキンなどのサイトカインの放出を含む、ある特定の機能的結果を、熟練した作業者に公知の標準的な方法を使用して調査する。
エピトープ−ペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体を提示する標的細胞によるＣＴＬの活性化は、市販入手可能なＣＴＬ応答アッセイ、例えば、CytoTox96（登録商標）非放射性ア
ッセイ（Promega社、Madison、WI、U.S.）、グランザイムBELISpotアッセイ（Mabtech社、Cincinnati、OH、U.S.）、カスパーゼ活性アッセイ、及びLAMP-1転移フローサイトメトリーアッセイを使用して、定量化する。標的細胞のＣＴＬ媒介性殺滅を特に監視するために、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、carboxyfluoresceinsuccinimidyl ester）を、当該技術分野で説明されているように、インビトロ及びイ
ンビボでの調査で標的細胞に使用する（例えば、Durward M et al., J Vis Exp 45 pii 2250 (2010)を参照されたい）。
実施例２の概要
複数のＢ細胞エピトープ領域破壊を有する組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む例示的な細胞標的化分子は、参照分子と比較して、抗原性及び免疫原性の両方の低減によって示されるように、脱免疫化されていた。加えて、この実施例は、複数のＢ細胞エピトープ領域破壊、フーリン切断モチーフ破壊、及び／又は組み込まれたＴ細胞エピト
ープを含む組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドを含むある特定の脱免疫化された細胞標的化分子が、１又は２以上の志賀毒素エフェクター機能、例えば、触媒性リボソーム阻害、細胞内経路決定、及び細胞毒性などを有意なレベルで保持することを示す。
表１７は、志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ１、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１２、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１５、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１６、又はＳＬＴ−１Ａ−コンボ１９を含む、本発明の例示的なプロテアーゼ切断耐性の脱免疫化された細胞標的化分子に関する、実施例２の結果を要約する。

表１７に示される本発明の例示的なプロテアーゼ切断耐性の脱免疫化された細胞標的化分子は、すべてが、相当なレベルの細胞毒性を示したが、これは、野生型志賀毒素Ａ１断片を含む細胞標的化分子と同程度であった。本発明のこれらの例示的なプロテアーゼ切断耐性の脱免疫化された細胞標的化分子は、リボソームによる翻訳の触媒阻害、野生型志賀毒素Ａサブユニット及び／又はＡ１断片と同程度の細胞内経路決定、並びに野生型志賀毒素Ａ１断片及び／又はＡサブユニットを含む細胞標的化分子と同程度の細胞毒性を示す。本発明のこれらの例示的なプロテアーゼ切断耐性の脱免疫化された細胞標的化分子は、野生型志賀毒素Ａサブユニット及び／又はＡ１断片と同程度の触媒活性レベルを示す。本発明のこれらの例示的なプロテアーゼ切断耐性の脱免疫化された細胞標的化分子は、野生型志賀毒素Ａサブユニット及び／又はＡ１断片と同程度の細胞毒性レベルを示す。本発明のこれらの細胞標的化分子は、すべてが、（１）野生型志賀毒素Ａ１断片、及び／又は（２）フーリン切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−ＦＲからなる志賀
毒素エフェクターポリペプチド領域を含む細胞標的化分子と比較して、哺乳動物における免疫原性の低減を示した。さらに、本発明のある特定の細胞標的化分子は、安定性の増加、インビボ忍容性の改善、及び／又は標的細胞によるＭＨＣクラスＩ提示のための異種Ｔ細胞エピトープの送達能力を示す。
実施例２に示される結果は、様々な例示的なエピトープ領域の破壊を単一の分子において一緒に組み合わせることで、抗原性及び／又は免疫原性の大幅な低減をもたらし、同時に１又は２以上の志賀毒素エフェクター機能の有意なレベルを保持し（例えば、国際公開第ＷＯ２０１５／１１３００５号パンフレットを参照されたい）、ときには、野生型志賀毒素Ａサブユニットには存在していない別の機能的特徴、例えば、フーリン切断耐性及び／又は異種Ｔ細胞エピトープを標的細胞に送達する能力などを提供することができるという考えを裏付ける。本発明のある特定の脱免疫化された志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドの組合せは、部分的に脱免疫化された部分領域、例えば、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ１０、及びＳＬＴ−１Ａ−コンボ１５などを合わせたものと比較して、相乗的な免疫原性の低減を示す。
インビトロで有意なレベルのリボソーム阻害及び／又は細胞毒性を保持していた少なくとも１つの志賀毒素エフェクターポリペプチドにおいて、以下の置換を行い、試験した。Ｋ１Ａ、Ｋ１Ｍ、Ｔ４Ｉ、Ｓ８Ｉ、Ｔ９Ｉ、Ｋ１１Ａ、Ｓ３３Ｉ、Ｓ３３Ｃ、Ｓ４３Ｎ、Ｇ４４Ｌ、Ｓ４５Ｖ、Ｔ４５Ｖ、Ｓ４５Ｉ、Ｔ４５Ｉ、Ｇ４６Ｐ、Ｄ４７Ｍ、Ｎ４８Ｖ、Ｌ４９Ａ、Ｆ５０Ｔ、Ａ５１Ｖ、Ｄ５３Ａ、Ｄ５３Ｎ、Ｖ５４Ｌ、Ｖ５４Ｉ、Ｒ５５Ａ、Ｒ５５Ｖ、Ｒ５５Ｌ、Ｇ５６Ｐ、Ｉ５７Ｆ、Ｉ５７Ｍ、Ｄ５８Ａ、Ｄ５８Ｖ、Ｄ５８Ｆ、Ｐ５９Ａ、Ｐ５９Ｆ、Ｅ６０Ｉ、Ｅ６０Ｔ、Ｅ６０Ｒ、Ｅ６１Ａ、Ｅ６１Ｖ、Ｅ６１Ｌ、Ｇ６２Ａ、Ｄ９４Ａ、Ｓ９６Ｉ、Ｔ１０４Ｎ、Ａ１０５Ｌ、Ｔ１０７Ｐ、Ｌ１０８Ｍ、Ｓ１０９Ｖ、Ｇ１１０Ａ、Ｄ１１１Ｔ、Ｄ１４１Ａ、Ｖ１５４Ａ、Ｇ１４７Ａ、Ｔ１８０Ｇ、Ｔ１８１Ｉ、Ｄ１８３Ａ、Ｄ１８３Ｇ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ｆ、Ｌ１８５Ｄ、Ｓ１８６Ａ、Ｓ１８６Ｆ、Ｇ１８７Ａ、Ｇ１８７Ｔ、Ｒ１８８Ａ、Ｓ１８９Ａ、Ｄ１９８Ａ、Ｒ２０５Ａ、Ｃ２４２Ｓ、Ｒ２４８Ａ、及びＲ２５１Ａ。
事前に置換の成功を予測することが難しいとはいえ、本明細書の実施例に示されるデータは、ある特定のアミノ酸置換により、抗原性及び／又は免疫原性を低減すると同時に、有意な志賀毒素エフェクター機能の維持が成功する可能性が高いと考えられる根拠を提供する。「成功」という用語は、ここでは、予測されたエピトープ領域における１又は２以上のアミノ酸残基の置換により、１又は２以上の志賀毒素エフェクター機能を保持した志賀毒素エフェクターポリペプチドが得られたことを意味して使用する。例えば、成功した忍容性の置換として本明細書に示される特定のアミノ酸位置における置換は、ある特定の他のアミノ酸と置換されたときに、少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能を保持することに成功する可能性が高い。成功した単一のアミノ酸置換は、一般に、異なるエピトープ領域における他の成功したアミノ酸置換と組み合わせて、有意な志賀毒素エフェクター機能を保持する脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを生成することができる。同様に、同じエピトープ領域内に複数の単一アミノ酸置換を有する志賀毒素エフェクターポリペプチド領域を含む細胞標的化分子が酵素活性を保持したことの証明により、同じエピトープ領域における成功した単一のアミノ酸置換を、一般に、同じエピトープ領域における他の単一のアミノ酸置換と組み合わせて、有意な志賀毒素エフェクター機能を保持する脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを生成することができることが示唆される。
ある特定の置換（Ｋ１Ａ、Ｋ１Ｍ、Ｔ４Ｉ、Ｓ８Ｉ、Ｔ９Ｉ、Ｋ１１Ａ、Ｓ３３Ｉ、Ｓ３３Ｃ、Ｓ４３Ｎ、Ｇ４４Ｌ、Ｓ４５Ｖ、Ｔ４５Ｖ、Ｓ４５Ｉ、Ｔ４５Ｉ、Ｇ４６Ｐ、Ｄ４７Ｍ、Ｎ４８Ｖ、Ｌ４９Ａ、Ｆ５０Ｔ、Ａ５１Ｖ、Ｄ５３Ａ、Ｄ５３Ｎ、Ｖ５４Ｌ、Ｖ
５４Ｉ、Ｒ５５Ａ、Ｒ５５Ｖ、Ｒ５５Ｌ、Ｇ５６Ｐ、Ｉ５７Ｆ、Ｉ５７Ｍ、Ｄ５８Ａ、Ｄ５８Ｖ、Ｄ５８Ｆ、Ｐ５９Ａ、Ｐ５９Ｆ、Ｅ６０Ｉ、Ｅ６０Ｔ、Ｅ６０Ｒ、Ｅ６１Ａ、Ｅ６１Ｖ、Ｅ６１Ｌ、Ｇ６２Ａ、Ｄ９４Ａ、Ｓ９６Ｉ、Ｔ１０４Ｎ、Ａ１０５Ｌ、Ｔ１０７Ｐ、Ｌ１０８Ｍ、Ｓ１０９Ｖ、Ｇ１１０Ａ、Ｄ１１１Ｔ、Ｄ１４１Ａ、Ｇ１４７Ａ、Ｖ１５４Ａ、Ｇ１４７Ａ、Ｔ１８０Ｇ、Ｔ１８１Ｉ、Ｄ１８３Ａ、Ｄ１８３Ｇ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ｆ、Ｌ１８５Ｄ、Ｓ１８６Ａ、Ｓ１８６Ｆ、Ｇ１８７Ａ、Ｇ１８７Ｔ、Ｒ１８８Ａ、Ｓ１８９Ａ、Ｄ１９８Ａ、Ｒ２０５Ａ、Ｃ２４２Ｓ、Ｒ２４８Ａ、Ｒ２５１Ａ、及び／又はこれらの組合せ）並びにある特定の位置は、置換（１、４、８、９、１１、３３、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、９４、９６、１０４、１０５、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１４１、１４７、１５４、１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９８、２０５、２４２、２４８、及び２５１）を忍容し、同時に少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能の有意なレベルの活性を保持することが、経験的に実証されている。この経験上のデータは、有意な志賀毒素エフェクター機能を保持する脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを生成するために使用することができる、ある特定の他のエピトープ破壊置換及びエピトープ破壊置換の組合せを示唆する。保存的官能基のアミノ酸残基に対する他のアミノ酸置換もまた忍容されるであろうことが予測できる。例えば、Ｋ１Ａ、Ｋ１Ｍ、Ｔ４Ｉ、Ｓ８Ｉ、Ｔ９Ｉ、Ｋ１１Ａ、Ｓ３３Ｉ、Ｓ３３Ｃ、Ｓ４３Ｎ、Ｇ４４Ｌ、Ｓ４５Ｖ、Ｔ４５Ｖ、Ｓ４５Ｉ、Ｔ４５Ｉ、Ｇ４６Ｐ、Ｄ４７Ｍ、Ｎ４８Ｖ、Ｌ４９Ａ、Ｆ５０Ｔ、Ａ５１Ｖ、Ｄ５３Ａ、Ｄ５３Ｎ、Ｖ５４Ｌ、Ｖ５４Ｉ、Ｒ５５Ａ、Ｒ５５Ｖ、Ｒ５５Ｌ、Ｇ５６Ｐ、Ｉ５７Ｆ、Ｉ５７Ｍ、Ｄ５８Ａ、Ｄ５８Ｖ、Ｄ５８Ｆ、Ｐ５９Ａ、Ｐ５９Ｆ、Ｅ６０Ｉ、Ｅ６０Ｔ、Ｅ６０Ｒ、Ｅ６１Ａ、Ｅ６１Ｖ、Ｅ６１Ｌ、Ｇ６２Ａ、Ｄ９４Ａ、Ｓ９６Ｉ、Ｔ１０４Ｎ、Ａ１０５Ｌ、Ｔ１０７Ｐ、Ｌ１０８Ｍ、Ｓ１０９Ｖ、Ｇ１１０Ａ、Ｄ１１１Ｔ、Ｄ１４１Ａ、Ｇ１４７Ａ、Ｖ１５４Ａ、Ｇ１４７Ａ、Ｔ１８０Ｇ、Ｔ１８１Ｉ、Ｄ１８３Ａ、Ｄ１８３Ｇ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８４Ｆ、Ｌ１８５Ｄ、Ｓ１８６Ａ、Ｓ１８６Ｆ、Ｇ１８７Ａ、Ｇ１８７Ｔ、Ｒ１８８Ａ、Ｓ１８９Ａ、Ｄ１９８Ａ、Ｒ２０５Ａ、Ｃ２４２Ｓ、Ｒ２４８Ａ、又はＲ２５１Ａのうちのいずれかに類似であることが熟練した作業者に公知の他の置換もまた、エピトープを破壊し、同時に少なくとも１つの志賀毒素エフェクター機能を維持することができるであろう。
フーリン切断耐性志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド及びそれを含む細胞標的化分子
フーリン切断耐性志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドを作製し、細胞標的化分子の成分として試験したが、ここで、各細胞標的化分子は、細胞標的化免疫グロブリン型結合領域を含んでいた。改変により志賀毒素エフェクターポリペプチドにプロテアーゼ耐性をもたらすために、実施例２に記載のように、Ｒ２４８Ａ及びＲ２５１Ａの２つのアミノ酸残基置換を志賀毒素エフェクターポリペプチドに導入した。志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ（配列番号５）を使用して、細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−９（配列番号４１）を作製した。
Ａ．参照分子と比較した本発明の分子のフーリン切断の定量化
細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−９（配列番号４１）を、インビトロフーリン切断アッセイを使用して試験して、フーリン切断を、熟練した作業者に公知の方法を使用して野生型対照と比較して定量化した（例えば、国際公開第ＷＯ２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照されたい）。フーリンがＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−９を切断する能力を評価するために、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の精製したタンパク質試料を、フーリン（New England Biolabs社、Ipswich、MA、U.S.）とともに、フーリン切断緩衝液（１００ミリモル（ｍＭ、millimolar）のＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキ
シメチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ｐＨ７、１ｍＭ ＣａＣｌ２）中において試料タンパク質１マイクログラム（μｇ、microgram）当たり０．５フーリン活性単
位（Ｕ）で、３０℃で３０時間インキュベートした。対照試料は、フーリンなしで、同じ緩衝液中において４℃又は３０℃でインキュベートした。様々な細胞標的化分子試料を、変性条件下においてＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動させ、クーマシーで染色した（図１７）。
図１７は、番号付けしたレーンとともにゲルの写真を示し、図の凡例は、どのレーンに、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド領域（ＳＬＴ−１Ａ−ＷＴ）を含む細胞標的化分子又はフーリン切断部位破壊型志賀毒素エフェクターポリペプチド（ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ）を含む細胞標的化分子のいずれの試料をロードしたかを示す。「分子量マーカー」と記されたレーンは、個々のラダータンパク質バンドのおおよそのサイズとともに、タンパク質の分子量ラダーの移動パターンをキロダルトン（ｋＤａ）単位で示し、これは、番号付けしたレーンにおけるタンパク質のサイズの推測を可能にする、内部分子量基準として使用する。図の凡例は、細胞標的化分子試料の処置前条件を示し、摂氏での温度（℃）、期間、及びフーリンを添加したかどうかはその量を１マイクログラム当たりのフーリン活性単位で（「Ｕ／μｇフーリン」と表記）又はゼロ単位については「フーリンなし」で示す。
図１７は、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−９（配列番号４１）が、ヒトフーリンによるタンパク質分解切断に耐性であったことを示す。このアッセイで試験した細胞標的化分子は、いずれもサイズが約５６ｋＤａであり、合わせたサイズが約２８ｋＤａであるカルボキシ末端リンカー及び結合領域に連結された、約２８ｋＤａの志賀毒素エフェクターポリペプチド（ＳＬＴ−１Ａ−ＷＴ又はＳＬＴ−１Ａ−ＦＲの両方で同一のサイズ）を含んでいた。ＳＬＴ−１Ａの表面の露出した伸長ループ２４２〜２５１にフーリン切断が生じていた場合、結果としては、それぞれおよそ２８ｋＤａ付近の分子量に２つのタンパク質バンドが生じることが予測される。フーリン切断が、ＳＬＴ−１Ａ−ＷＴ：：ｓｃＦｖ−９においてＷＴ足場の２５１位でアルギニンのカルボキシペプチド結合で正確に生じる場合、得られる２つのタンパク質バンドは、ＳＬＴ−１Ａ（ＷＴ又はＦＲ）では２７．５ｋＤａ及びｓｃＦｖ−９では２８．３ｋＤａの分子量を有するはずである。
ゲルを、GelAnalyzer 2010ソフトウェアを使用して分析した。このソフトウェアにより、図１７に示されるゲルのレーン及び各レーン内のバンドを検出した。バックグラウンド減算法を使用して、バックグラウンドを自動で定義し、ローリングボールバックグラウンド減算をボール半径は２５に設定して使用して、分析したすべてのバンドのボリュームから差し引いた。図１７に示されるゲルのこの定量的バンド分析の結果を、表１８に要約する。表１８は、図１７の写真のゲルにおいてレーン１〜６の５６ｋＤａ付近を移動しているある特定のバンドの相対的な移動度及び未加工のボリューム値を示す。レーン＃２の野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む「フーリンなし」の４℃で処置した細胞標的化分子（ＳＬＴ−１Ａ−ＷＴ：：ｓｃＦｖ−９）（配列番号４２）の結果を対照として使用して、フーリンの非存在下又は存在下における３０℃での未切断材料（それぞれレーン＃２及び＃３）の割合を判定した。ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−９試料については、「フーリンなし」の４℃のレーン（レーン＃４）を使用して、フーリンの非存在下又は存在下における３０℃での未切断材料（それぞれ、レーン＃５及び＃６）の割合を判定した。それぞれの分子について、それぞれのフーリン処置試料の約５６ｋＤａのバンドに対する「未切断の割合」を、次の式によって計算した：（約５６ｋＤａの試料のバンドの未加工ボリューム）／（約５６ｋＤａのバンドの「フーリンなし」の４℃で処置からの未加工ボリューム）×１００（表１８を参照されたい）。

野生型フーリン部位試料については、フーリンとともにインキュベートした試料の約５６ｋＤａのバンド内のタンパク質の量が、「フーリンなし」の試料の約５６ｋＤａのバンド内のタンパク質の量と比較して低減されていた（表１８、図１７、レーン＃３をレーン＃１及び＃２と比較）。ＳＬＴ−１Ａ−ＷＴ：：ｓｃＦｖ−９のフーリン処置は、約２８ｋＤａの２つの新しいバンドの生成をもたらしたが（図１７、レーン＃３）、これは、ＳＬＴ−１Ａ−ＷＴ：：ｓｃＦｖ−９の志賀毒素（Shia toxin）Ａ１断片領域のカルボキシ末端における切断により生じるフーリン切断産物の予測サイズと一致する。ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−９試料については、フーリンとともにインキュベートした試料のレーンにおける約５５ｋＤａのバンド内のタンパク質の量は、「フーリンなし」の試料の約５５ｋＤａのバンド内のタンパク質の量から変化していないと見られた（表１８、図１７、レーン＃６をレーン＃４及び＃５と比較）。
この定量化分析により、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−ＷＴ及びカルボキシ末端結合領域を有して設計された細胞標的化分子が、約６７．３％の切断を呈し、約３２．７％のＳＬＴ−１Ａ−ＷＴ：：ｓｃＦｖ−９が切断されないままであったことが示された。参照分子と比較したフーリン切断の割合は、参照分子の［（利用可能な材料−未切断）／利用可能な材料］に対する目的の分子の［（利用可能な材料−未切断）／利用可能な材料］の比として表すことができる。このアッセイでは、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：ｓｃＦｖ−９は、［（９８５−１０００）／１０００］／［（７６６−２４６）／７６６］＝−１．５％の基準に対する切断又はおよそゼロの切断を呈した。
このアッセイにより、志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−ＦＲを有して設計された細胞標的化分子が、０％切断を呈し、細胞標的化分子は１００％が未切断のままであったことが示された。したがって、ＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ足場は、このアッセイでは、試験した条件下において、フーリン切断に耐性であると見られる。
Ｂ．実験室動物を使用した本発明の細胞標的化分子のインビボ忍容性の試験
様々な投薬量の細胞標的化分子試料で顕著な副作用が検出された程度を判定するために、マウスを使用して、本発明の例示的な細胞標的化分子のインビボ忍容性を試験する。忍容性研究は、熟練した作業者に公知の及び／又は本明細書に記載される方法を使用して行う（例えば、国際公開第ＷＯ２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照されたい）。例えば、マウスに、細胞標的化分子試料又はビヒクル対照を、１回の注射につき体重１キログラム当たり０．２５〜５．００ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ／注射）の用量で、数週間にわたって週３回注射する。インビボ忍容性を評価するために、注射したマウスを、健康状態及び臨床徴候、例えば、罹患状態、瀕死状態（morbundity）、体重、身体的な見た目、測定可能な臨床徴候、理由のない行動（unprovoked behavior）、及び外部刺激に対する
応答などの変化を監視する（例えば、Morton D, Griffiths P, Vet Rec 116:431-43 (1985)、Montgomery C, Cancer Bull 42: 230-7(1990)、Ullman-Cullere M,Foltz C, Lab Anim Sc 49: 319-23 (1999)、Clingerman K, SummersL, J Am Assoc Lab Anim Sci 51: 31-6 (2012)を参照されたい）。罹患状態及び／又は瀕死状態の兆候に応じて、安楽死を
使用してもよく、その場合、死亡時点が作成され得る。例えば、２〜３日以内に１５〜２０％の体重の減少は、げっ歯類における罹患の兆候、及び安楽死の正当な理由として使用することができる（例えば、Institute of Laboratory Animal Research 2011. Guide for the care anduse of laboratory animals, 8th ed., Washington, DC, U.S.: National AcademiesPressを参照されたい）。
フーリン切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む本発明の細胞標的化分子は、野生型志賀毒素Ａ１断片を含む関連する参照分子と比較して、忍容性の改善（例えば、非特異的毒性プロファイルの改善）を呈する（例えば、国際公開第ＷＯ２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照されたい）。このようなインビボ忍容性の改善は、志賀毒素エフェクターポリペプチドと、細胞標的化分子の結合領域及び／又は毒性成分との間の連結部の安定性の増加によるものであり得る。
Ｃ．動物モデルを使用した、インビボでの本発明の例示的な細胞標的化分子の標的化細胞毒性及び効果の試験
動物モデルを使用して、例示的な志賀毒素エフェクターポリペプチドコンボ（ｎ）及び前述のものを含む細胞標的化分子の標的陽性新生物細胞に対するインビボでの効果を判定する。様々なマウス株を使用して、マウスにおける異種移植片腫瘍に対する細胞標的化分子の効果を、これらのマウスに各分子を静脈内投与した後に、試験する。ある特定の実験では、ヒト腫瘍の播種性異種移植片モデルを使用して、ヒト腫瘍保持マウスにおける本発明の例示的な細胞標的化分子のインビボでの効果を判定する。ルシフェラーゼを構成的に発現し、適切なｓｃＦｖ−（ｎ）の標的の細胞表面発現を示す、ヒト腫瘍細胞を、この異種移植片モデルにおいて使用する。熟練した作業者に公知の方法を使用して、本発明の分子の標的化細胞毒性を試験する（例えば、国際公開第ＷＯ２０１４／１６４６８０号パンフレット、同第ＷＯ２０１４／１６４６９３号パンフレット、同第ＷＯ２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照されたい）。本発明のある特定の細胞標的化分子は、ヒト腫瘍細胞でチャレンジしたマウスにおいて、ヒト腫瘍量を有意に低減させることができる。
実施例１〜４に示されるように、本発明の志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドの組合せは、１）安定性の増加、２）脊索動物におけるインビボ忍容性の改善、２）脊索動物への投与後の免疫原性能の低減、及び／又は脊索動物の有核細胞によるＭＨＣクラスＩ提示のために組み込まれた若しくは挿入されたＴ細胞エピトープを送達する能力を呈する細胞標的化分子を作製するための足場として使用することができる。ある特定の組合せでは、得られる脱免疫化レベルは、一緒に組み合わせた、個別に脱免疫化された部分領域の相乗作用を表す。
ＣＤ３８＋細胞を標的とする例示的な細胞標的化分子
「ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１」タンパク質（配列番号８２）の細胞外ヒトＣＤ３８標的への結合の特徴を、蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイによって判定した。ＣＤ３８陽性（ＣＤ３８＋）細胞（細胞株Ａ又はＦのいずれかの）を含む試料を、１パーセントのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、bovine serum albumin）（Calbiochem社、San Diego、CA、U.S.）を含有する１倍ＰＢＳ（以降、「１倍ＰＢＳ＋
１％ＢＳＡ」と称する）中に懸濁させ、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１の様々な希釈物１００μＬとともに、４℃で１時間インキュベートした。結合の可能性をすべて飽和させるために、このアッセイで試験した最も高い濃度のＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１を選択した。ＣＤ３８陰性（ＣＤ３８−）細胞（細胞株Ｈ及びＩの）を、このアッセイにおいて標的陽性細胞に対して試験した最も高い濃度のＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１で処置した。１時間のインキュベーションの後、細胞試料を、１倍ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで２回洗浄した。細胞試料を、α−ＳＬＴ−１Ａ ｐＡｂ１を含有する１倍ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ１００μＬとともに４℃で１時間インキュベートした後、再び洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、fluorescein isothiocyanate）にコンジュゲートした抗ウサギ二次抗体を含有する１倍ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ溶液１００μＬとともに４℃で１時間インキュベートした。
細胞試料を、１倍ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで２回洗浄し、２００μＬの１倍ＰＢＳ中に再懸濁させ、蛍光に基づくフローサイトメトリーに供して、十分な二次抗体が結合した細胞の割合をアッセイしたが、これにより、各試料中の細胞に対するＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１の結合レベルを示す。平均蛍光強度（ＭＦＩ、mean fluorescence intensity）単位、相対蛍光単位でのすべての試料のデータを、いずれの細胞標的
化分子でも処置されていないが、上述のようにα−ＳＬＴ−１Ａ ｐＡｂ１一次抗体及び抗ウサギ二次抗体とともにインキュベートした細胞の陰性対照試料を使用して、データをゲーティングすることによって得た。陽性細胞の割合にＭＦＩを乗じることによって、統合ＭＦＩ（ｉＭＦＩ）を計算した。Prismソフトウェア（GraphPad Software社、San Diego、CA、U.S.）を使用して、ｉＭＦＩに対するナノモル単位の「タンパク質濃度」のグラ
フをプロットした。Ｐｒｉｓｍソフトウェアの結合飽和の項目で一部位結合の関数［Ｙ＝Ｂｍａｘ×Ｘ／（ＫＤ＋Ｘ）］を使用して、Ｂｍａｘ及びＫＤを、ベースライン補正データを使用して計算した。Ｂｍａｘは、ｉＭＦＩ単位で報告される最大の特異的結合である。ＫＤは、ナノモル単位で報告される平衡結合定数である。
ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１（配列番号８２）が２つの異なるＣＤ３８＋細胞型に結合するＢｍａｘを測定すると、およそ１００，０００ｉＭＦＩであり、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１がこれらのＣＤ３８＋細胞に結合するＫＤを測定すると、およそ２〜７ｎＭであった（表１９、図１８）。ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１は、このアッセイにおいて、記載される条件下で、ＣＤ３８−細胞に対する特異的な結合もＣＤ３８−細胞に対する高親和性結合も呈さなかった（図１８）。

例示的なＣＤ３８を標的とする細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１を、実施例２に記載されるように、触媒活性に関して試験した。ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１（配列番号８２）は、野生型と同程度のリボソーム不活性化活性を呈した。
例示的なＣＤ３８を標的とする細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１を、実施例２に記載されるように、細胞毒性に関して試験した。ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１（配列番号８２）は、ＣＤ３８＋細胞に対して強力に細胞毒性があった。
例示的なＣＤ３８を標的とする細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１を、実施例２に記載されるように、免疫原性の低減に関して試験した。ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１（配列番号８２）は、対照のＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１と比較して、低減した免疫原性を呈した。
例示的なＣＤ３８を標的とする細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１を、ＣＤ３８を発現するヒト細胞及び熟練した作業者に公知のアッセイを使用して、ヒトがんの異種移植片モデルにおいて試験した（例えば、国際公開第ＷＯ２０１４／１６４６９３号パンフレットを参照されたい）。ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１（配列番号８２）は、対照のビヒクル処置群と比較して、ＣＤ３８陽性のヒト新生物細胞が注射されたマウスにおいて、腫瘍量を低減させる能力を呈した。この研究では、マウスに、２．５×１０６個のＤａｕｄｉ−Ｌｕｃ細胞（ルシフェラーゼ遺伝子を発現するように改変されているヒトＣＤ３８陽性腫瘍細胞株）を注射した。腫瘍注射の４日後に、マウスを、１群当たり８匹のマウスの群にランダムに分け、処置を開始した。対照群及び細胞標的化分子処置群のマウスに、それぞれ、ビヒクルのみ又は細胞標的化分子を、５週間にわたって１２回の用量を与えた（１週間に３回を２週間、１週間は投与なし、その後、再び１週間に３回を２週間）。研究の異なる日において、全身生物発光（ＢＬＩ、bioluminescence）を１秒当たりの光子数で測定して、Ｄａｕｄｉ細胞を発
現するルシフェラーゼを検出することによって、腫瘍量を経時的に監視した。処置の前に、類似の平均ＢＬＩ値及び中央ＢＬＩ値を有するマウス群を作製するために、マウスを、ＢＬＩの読取り値を使用してランダムに分けた。この研究の結果を、表２０及び図１９に報告する。表２０は、細胞標的化分子処置群及びビヒクルのみの対照群のＢＬＩシグナル中央値を挙げ、「対照に対する処置」パーセント（％Ｔ／Ｃ）は、次の式によって定義した：（処置群のＢＬＩシグナル中央値）／（ビヒクルのみの対照群のＢＬＩシグナル中央値）×１００。４日目は、処置前の測定値を含む。

研究の７日目、１４日目、２２日目、３６日目、及び４０日目に取得したＢＬＩ測定値により、対照のビヒクルのみの群が、１回の用量につき体重１ｋｇ当たり０．５ミリグラムのＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１で処置した群よりも多い腫瘍量を有していたことが示された。最後の時点（４０日目）で、ビヒクルのみの対照に対する処置のＢＬＩの割合（Ｔ／Ｃ）は、１１％であり、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ７：：αＣＤ３８−ｓｃＦｖ−１（配列番号８２）で処置した群には腫瘍量中央値の８９％の低減が存在したことを示す。
ＨＥＲ２結合領域に連結した本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子（ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）と融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ）
この実施例では、上述の志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ０〜２６のうちのいずれか１つを、ヒトＨＥＲ２上の細胞外抗原に特異的かつ高親和性で結合する、米国特許出願公開第２０１１／５９，０９０号パンフレットに記載されるラクダ抗体５Ｆ７の単一ドメイン可変領域（αＨＥＲ２−ＶＨＨ）などの免疫グロブリン結合領域抗ＨＥＲ２に作動可能に連結させて、本発明の例示的な細胞標的化分子を形成する。
細胞毒性ＨＥＲ２結合融合タンパク質「ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＨＥＲ２−ＶＨＨ」の構築、産生、及び精製
ある特定の実施形態については、免疫グロブリン由来の結合領域αＨＥＲ２−ＶＨＨ及び志賀毒素エフェクターポリペプチドを、一緒に融合して、単一の連続的なポリペプチド「ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＨＥＲ２−ＶＨＨ」を形成する。この実施例では、免疫グロブリン５Ｆ７に由来するＶＨＨ可変ドメインを含む結合領域であるαＨＥＲ２−ＶＨＨをコードするポリヌクレオチドを、当該技術分野で公知のリンカーをコードするポリヌクレオチドとインフレームでクローニングし、志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）をコードするポリヌクレオチドとインフレームでクローニングする。熟練した作業者に公知の及び／又は前述の実施例に記載される細菌及び／又は無細胞のタンパク質翻訳系を使用して、細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＨＥＲ２−ＶＨＨの発現を達成する。
ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＨＥＲ２−ＶＨＨのインビトロ特徴を判定する。
この実施例の細胞標的化分子のＨＥＲ２＋細胞及びＨＥＲ２−細胞に対する結合特徴を、蛍光に基づくフローサイトメトリーによって判定する。ＨＥＲ２＋細胞に対するＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＨＥＲ２−ＶＨＨのＢｍａｘを測定すると、およそ５０，０００〜２００，０００ＭＦＩであり、ＫＤは０．０１〜１００ｎＭの範囲内であるが、このアッセイにおいてＨＥＲ２−細胞に対する有意な結合は存在しない。
ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＨＥＲ２−ＶＨＨ細胞標的化分子のリボソーム不活性化能力を、前述の実施例に記載のように、無細胞のインビトロタンパク質翻訳において判定する。この実施例の細胞標的化分子の、無細胞タンパク質合成に対する阻害効果は、有意である。この無細胞アッセイにおけるタンパク質合成に対するＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＨＥＲ２−ＶＨＨのＩＣ５０は、およそ０．１〜１００ｐＭである。
ＨＥＲ２＋細胞殺滅アッセイを使用したＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＨＥＲ２−ＶＨＨの細胞毒性の判定
ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＨＥＲ２−ＶＨＨの細胞毒性の特徴を、前述の実施例に記載のように、ＨＥＲ２＋細胞を使用して、一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。加えて、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＨＥＲ２−ＶＨＨの選択的細胞毒性の特徴を、ＨＥＲ２−細胞を使用して、ＨＥＲ２＋細胞との比較として、同じ一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。この実施例の細胞標的化分子のＣＤ５０は、細胞株に応じて、ＨＥＲ２＋ではおよそ０．０１〜１００ｎＭである。ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＨＥＲ２−ＶＨＨのＣＤ５０は、細胞表面上にＨＥＲ２を発現する細胞と比較して、細胞表面上にＨＥＲ２を発現しない細胞では、およそ１０〜１０，０００倍高い（細胞毒性が低い）。加えて、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＨＥＲ２−ＶＨＨの細胞毒性を、熟練した作業者に公知の及び／又は本明細書に記載されるアッセイを使用して、直接的な細胞毒性、並びにＴ細胞エピトープ送達及びＣＴＬ媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性の両方に関して調査する。
動物モデルを使用した、例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＨＥＲ２−ＶＨＨのインビボでの効果の判定
動物モデルを使用して、新生物細胞に対する細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＨＥＲ２−ＶＨＨのインビボでの効果を判定する。様々なマウス株を使用して、ＨＥＲ２を細胞表面上に発現するヒト新生物細胞をマウスに注射することにより得られるマウスの異種移植片腫瘍への静脈内投与後の、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＨＥＲ２−ＶＨＨの効果を試験する。細胞殺滅を、熟練した作業者に公知の及び／又は本明細書に記載されるアッセイを使用して、直接的な細胞毒性、並びにＴ細胞エピトープ送達及びＣＴＬ媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性の両方に関して調査する。
本発明の志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド、融合されたＴ細胞エピトープ−ペプチド、及びＩＬ−２Ｒに特異的なリガンド結合領域を含む細胞標的化分子
この実施例では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、上述のように、フーリン切断耐性を付与するアミノ酸残基置換、例えば、Ｒ２４８Ａ／Ｒ２５１Ａなどを有していてもよい志賀様毒素１のＡサブユニット（ＳＬＴ−１Ａ）に由来する（上述の実施例３を参照されたい）。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを、ＭＨＣ Ｉ分子結合予測、ＨＬＡ型、既に特徴付けられている免疫原性、及び上述のような容易に入手可能な試薬、例えば、エピトープGVMTRGRLK（配列番号５６０）に基づいて選択する。結合領域は、ヒト
インターロイキン２受容体（ＩＬ−２Ｒ）のリガンド（サイトカインインターロイキン２又はＩＬ−２）に由来し、これは、ヒトＩＬ−２Ｒの細胞外部分に特異的に結合すること
ができる。ＩＬ−２Ｒは、Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞などの様々な免疫細胞型によって発現される細胞表面受容体である。
細胞標的化融合タンパク質Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａ：：ＩＬ−２及びＩＬ−２：：Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａの構築、産生、及び精製
リガンド型結合領域αＩＬ−２Ｒ、志賀毒素エフェクターポリペプチド、及びＴ細胞エピトープを、一緒に連結させて、単一の連続的なポリペプチド、例えば「Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａ：：ＩＬ−２」又は「ＩＬ−２：：Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａ」を形成し、ＫＤＥＬを、得られたポリペプチドのカルボキシ末端に付加してもよい。例えば、融合タンパク質は、Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａ：：ＩＬ−２及びＩＬ−２：：Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａをコードするポリヌクレオチドから発現させることにより産生される。Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａ：：ＩＬ−２又はＩＬ−２：：Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａ細胞標的化分子の発現は、前述の実施例に記載のように、細菌及び／又は無細胞のタンパク質翻訳系のいずれかを使用して達成される。
細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ：：Ｔエピトープ：：ＩＬ−２及びＩＬ−２：：ＳＬＴ−１Ａ：：Ｔエピトープのインビトロ特徴の判定
ＩＬ−２Ｒ陽性細胞及びＩＬ−２Ｒ陰性細胞に対するこの実施例の細胞標的化分子の結合特徴を、蛍光に基づくフローサイトメトリーによって判定する。ＩＬ−２Ｒ陽性細胞に対するＴエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａ：：ＩＬ−２及びＩＬ−２：：Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａの両方のＢｍａｘを測定すると、およそ５０，０００〜２００，０００ＭＦＩであり、ＫＤは、０．０１〜１００ｎＭの範囲内であるが、このアッセイにおいてＩＬ−２Ｒ陰性細胞に対する有意な結合は存在しない。
Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａ：：ＩＬ−２及びＩＬ−２：：Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａのリボソーム不活性化能力を、前述の実施例に記載のように、無細胞のインビトロタンパク質翻訳において判定する。無細胞のタンパク質合成に対するこの実施例の細胞標的化分子の阻害効果は、有意である。Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａ：：ＩＬ−２及びＩＬ−２：：Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａの両方について、この無細胞アッセイにおけるタンパク質合成に対するＩＣ５０は、およそ０．１〜１００ｐＭである。
細胞殺滅アッセイを使用した細胞標的化分子Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａ：：ＩＬ−２又はＩＬ−２：：Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａの細胞毒性の判定
Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａ：：ＩＬ−２又はＩＬ−２：：Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａの細胞毒性の特徴を、前述の実施例に記載のように、ＩＬ−２Ｒ陽性細胞を使用して、一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。加えて、Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａ：：ＩＬ−２又はＩＬ−２：：Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａの選択的細胞毒性の特徴を、ＩＬ−２Ｒ陰性細胞を使用して、ＩＬ−２Ｒ陽性細胞との比較として、同じ一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。この実施例の細胞標的化分子のＣＤ５０は、細胞株に応じて、ＩＬ−２Ｒ陽性細胞ではおよそ０．０１〜１００ｎＭである。Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａ：：ＩＬ−２又はＩＬ−２：：Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１ＡのＣＤ５０は、細胞表面上にＩＬ−２Ｒを発現する細胞と比較して、細胞表面上にＩＬ−２Ｒを発現しない細胞では、およそ１０〜１０，０００倍高い（細胞毒性が低い）。加えて、Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａ：：ＩＬ−２又はＩＬ−２：：Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａの細胞毒性を、熟練した作業者に公知の及び／又は本明細書に記載されるアッセイを使用して、直接的な細胞毒性、並びにＴ細胞エピトープ送達及びＣＴＬ媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性の両方に関して調査する。
動物モデルを使用した細胞標的化分子Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａ：：ＩＬ−２又はＩＬ−２：：Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａのインビボでの効果の判定
動物モデルを使用して、新生物細胞に対する細胞標的化分子Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａ：：ＩＬ−２及びＩＬ−２：：Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａのインビボでの効果を判定する。様々なマウス株を使用して、ＩＬ−２Ｒを細胞表面上に発現するヒト新生物細胞をマウスに注射することにより得られるマウスの異種移植片腫瘍への静脈内投与後の、Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａ：：ＩＬ−２及びＩＬ−２：：Ｔエピトープ：：ＳＬＴ−１Ａの効果を試験する。細胞殺滅を、熟練した作業者に公知の及び／又は本明細書に記載されるアッセイを使用して、直接的な細胞毒性、並びにＴ細胞エピトープ送達及びＣＴＬ媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性の両方に関して調査する。
ＣＥＡ結合領域（ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）に融合したαＣＥＡ−（Ｆｎ３）結合領域）に連結した本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子
この実施例では、志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）を、上述のように、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ、carcinoembryonic antigen）上の細胞外抗原に特異的かつ高親和性で結合する、免疫グロブリン型結合領域抗CEA(Fn3)結合領域、例えば、Pirie C et al., J Biol Chem286: 4165-72 (2011)に記載されるような第１０ヒト
フィブロネクチンIII型ドメインに由来する結合領域Ｃ７４３に作動可能に連結させて、
本発明の例示的な細胞標的化分子を形成する。加えて、免疫原性性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを、この実施例の志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端に融合させて、エピトープ−ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）を形成する。
細胞毒性ＣＥＡ結合融合タンパク質「エピトープ−ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）と融合したαＣＥＡ−（Ｆｎ３）」の構築、産生、及び精製
ある特定の実施形態については、免疫グロブリン型結合領域αＣＥＡ−（Ｆｎ３）及び志賀毒素エフェクターポリペプチドを一緒に融合して、単一の連続的なポリペプチド「エピトープ−ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）と融合したαＣＥＡ−（Ｆｎ３）」を形成する。この実施例では、融合タンパク質「エピトープ−ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）と融合したαＣＥＡ−（Ｆｎ３）」を設計し、前述の実施例に記載のように産生した。
「エピトープ−ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）と融合したαＣＥＡ−（Ｆｎ３）」のインビトロ特徴の判定
ＣＥＡ＋細胞及びＣＥＡ−細胞に対するこの実施例の細胞標的化分子の結合特徴を、蛍光に基づくフローサイトメトリーによって判定する。ＣＥＡ＋細胞に対するエピトープ−ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）と融合したαＣＥＡ−（Ｆｎ３）のＢｍａｘを測定すると、およそ５０，０００〜２００，０００ＭＦＩであり、ＫＤは、０．０１〜１００ｎＭの範囲内であるが、このアッセイにおいてＣＥＡ−細胞に対する有意な結合は存在しない。
エピトープ−ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）と融合したαＣＥＡ−（Ｆｎ３）細胞標的化分子のリボソーム不活性化能力を、前述の実施例に記載のように、無細胞のインビトロタンパク質翻訳において判定する。この実施例の細胞標的化分子の、無細胞タンパク質合成に対する阻害効果は、有意である。この無細胞アッセイにおけるタンパク質合成に対するエピトープ−ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）と融合したαＣＥＡ−（Ｆｎ３）のＩＣ５０は、およそ０．１〜１００ｐＭである。
ＣＥＡ＋細胞殺滅アッセイを使用した「エピトープ−ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）と融合したαＣＥＡ−（Ｆｎ３）」の細胞毒性の判定
エピトープ−ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）と融合したαＣＥＡ−（Ｆｎ３）の細胞毒性の特徴を、前述の実施例に記載のように、一般的な細胞殺滅アッセイによって、ＣＥＡ＋細胞を使用して判定する。加えて、エピトープ−ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）と融合したαＣＥＡ−（Ｆｎ３）の選択的細胞毒性の特徴を、ＣＥＡ−細胞を使用して、ＣＥＡ＋細
胞との比較として、同じ一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。この実施例の細胞標的化分子のＣＤ５０は、細胞株に応じて、ＣＥＡ＋細胞ではおよそ０．０１〜１００ｎＭである。エピトープ−ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）と融合したαＣＥＡ−（Ｆｎ３）のＣＤ５０は、細胞表面上にＣＥＡを発現する細胞と比較して、細胞表面上にＣＥＡを発現しない細胞では、およそ１０〜１０，０００倍高い（細胞毒性が低い）。加えて、エピトープ−ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）と融合したαＣＥＡ−（Ｆｎ３）の細胞毒性を、熟練した作業者に公知の及び／又は本明細書に記載されるアッセイを使用して、直接的な細胞毒性、並びにＴ細胞エピトープ送達及びＣＴＬ媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性の両方に関して調査する。
動物モデルを使用した例示的な細胞標的化分子「エピトープ−ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）と融合したαＣＥＡ−（Ｆｎ３）」のインビボでの効果の判定
動物モデルを使用して、新生物細胞に対する、エピトープ−ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）と融合した細胞標的化分子αＣＥＡ−（Ｆｎ３）のインビボでの効果を判定する。様々なマウス株を使用して、ＣＥＡを細胞表面上に発現するヒト新生物細胞をマウスに注射することにより得られるマウスの異種移植片腫瘍への静脈内投与後の、エピトープ−ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）と融合したαＣＥＡ−（Ｆｎ３）の効果を試験する。細胞殺滅を、熟練した作業者に公知の及び／又は本明細書に記載されるアッセイを使用して、直接的な細胞毒性、並びにＴ細胞エピトープ送達及びＣＴＬ媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性の両方に関して調査する。
志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）及び抗体α腸蠕虫（helminth-intestinal）抗原を含む細動毒性細胞標的化分子
この実施例では、志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ０〜２６のうちのいずれか１つを、上述のように、蠕虫抗原を標的とする免疫グロブリン型結合領域に作動可能に連結させる。免疫グロブリン型結合領域α腸蠕虫抗原は、当該技術分野で公知の技法を使用して生成された、ヒトトランスフェリン受容体の蠕虫オルソログに対する抗体に由来する（例えば、線虫遺伝子ｇｃｐ−２．１ ＵｎｉＰｒｏｔ Ｇ８ＪＹＥ４＿ＣＡＥＥＬ、Rosa B et al., Mol Cell Proteomics M114.046227 (2015)を参照されたい）。
細胞毒性細胞標的化分子「ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：α腸蠕虫抗原」の構築、産生、及び精製
免疫グロブリン型結合領域α腸蠕虫抗原、及びプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクター領域であってもよい志賀毒素エフェクター領域を、一緒に連結して、免疫グロブリン型結合領域が、志賀毒素エフェクター領域と比較して、タンパク質のアミノ末端に対して近位に位置していない、タンパク質を形成する。例えば、融合タンパク質は、アミノ末端のＳＬＴ−１Ａ−コンボ０〜２６に融合したα腸蠕虫抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：α腸蠕虫抗原結合タンパク質の発現は、前述の実施例に記載のように、細菌及び／又は無細胞のタンパク質翻訳系のいずれかを使用して達成する。
細胞毒性細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：α腸蠕虫抗原のインビトロ特徴の判定
この実施例の細胞毒性細胞標的化分子の結合特徴を、精製した組換え標的タンパク質を使用して、当該技術分野で公知の分子結合アッセイによって判定する。標的タンパク質に対するＳＬＴ−１Ａ：：α腸蠕虫抗原及び／又はＳＬＴ−１Ａ−ＦＲ：：α腸蠕虫抗原のＫＤを測定すると、およそ１００ｎＭであるが、このアッセイにおいて、陰性対照タンパク質（例えば、精製された組換えのヒトトランスフェリン受容体の蠕虫オルソログ）に対する有意な結合は存在しない。
ＳＬＴ−１Ａ：：α腸蠕虫抗原のリボソーム不活性化能力を、前述の実施例に記載のように、無細胞のインビトロタンパク質翻訳において判定する。この実施例の細胞毒性細胞標的化分子の、無細胞タンパク質合成に対する阻害効果は、有意である。この無細胞アッセイにおけるタンパク質合成に対するＳＬＴ−１Ａ：：α腸蠕虫抗原のＩＣ５０は、およそ０．１〜１００ｐＭである。
細胞毒性細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：α腸蠕虫抗原の毒性の判定
蠕虫に対するＳＬＴ−１Ａ：：α腸蠕虫抗原の毒性を、蠕虫モデルを使用して判定する（例えば、Iatsenko I et al., Toxins 2050-63(2014)を参照されたい）。蠕虫を、浸漬によって、精製したＳＬＴ−１Ａ：：α腸蠕虫抗原に投与してもよく、又は代替として、ＳＬＴ−１Ａ：：α腸蠕虫抗原融合タンパク質を発現する細菌を蠕虫に与えることによって投与してもよい。
加えて、蠕虫保持動物及び／又は蠕虫関連疾患を呈する実験室動物に、ＳＬＴ−１Ａ：：α腸蠕虫抗原を投与し、蠕虫及び／又は寄生虫性蠕虫の関連症状の低減又は除去に関して監視する。
ＨＩＶ−１ Ｇａｇに特異的な免疫グロブリン型結合領域に融合した志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）を含む細胞標的化分子
この実施例では、志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ０〜２６のいずれか１つを、上述のように、ＨＩＶキャプシドタンパク質ＨＩＶ−１ Ｇａｇポリタンパク質を認識する免疫グロブリン型ドメインに由来し（例えば、Nagola S et al.,Retrovirology 9: 17 (2012)を参照されたい）、Ｇａｇの細胞外部分に結合することができ
る人工的なアンキリンドメイン反復ポリペプチドを含む、免疫グロブリン型結合領域αＧａｇ抗原に作動可能に連結させる。Ｇａｇは、ＨＩＶウイルスのアセンブリに関与する主要な構造タンパク質であり、オリゴマー化して、１ビリオン当たり７００〜５０００個のコピーの格子となり、円錐形のＣＡコアを形成する（例えば、Chen Y et al., Biophys J
96: 1961-9 (2009)、Pornillos O et al., Nature 469: 424-7 (2011)を参照されたい）。
細胞標的化分子「αＧａｇに連結したＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）」の構築、産生、及び精製
免疫グロブリン型結合領域αＧａｇ及び志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）を融合して、細胞毒性タンパク質を形成する。例えば、融合タンパク質は、αＧａｇ−抗原結合タンパク質ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＧａｇをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生する。ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＧａｇ細胞毒性タンパク質の発現は、前述の実施例に記載のように、細菌及び／又は無細胞のタンパク質翻訳系のいずれかを使用して達成する。
細胞標的化分子「ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＧａｇ」のインビトロ特徴の判定
精製した組換えＨＩＶ−１ Ｇａｇに対するこの実施例の細胞毒性タンパク質の結合特徴を、酵素結合免疫吸着アッセイなどの当該技術分野で公知のアッセイによって判定する。Ｇａｇに対するＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＧａｇの結合のＫＤを測定すると、およそ０．０１〜１００ナノモル（ｎＭ）の範囲内である。
ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＧａｇ細胞毒性タンパク質のリボソーム不活性化能力を、前述の実施例に記載のように無細胞のインビトロタンパク質翻訳において判定する。この実施例の細胞毒性タンパク質の、無細胞タンパク質合成に対する阻害効果は、有意
である。この無細胞アッセイにおけるタンパク質合成に対するＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＧａｇのＩＣ５０は、およそ０．１〜１００ｐＭである。
細胞殺滅アッセイを使用した細胞標的化分子「ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＧａｇ」の細胞毒性の判定
ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＧａｇの細胞毒性特徴を、前述の実施例に記載のように、ＨＩＶ感染ヒトＴ細胞を使用して、上述の一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。加えて、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＧａｇの選択的細胞毒性の特徴を、未感染のＴ細胞を使用して、感染したＴ細胞との比較として、同じ一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。この実施例の細胞毒性タンパク質のＣＤ５０は、活発に複製しているウイルスを有する感染したＴ細胞ではおよそ０．０１〜１００ｎＭである。細胞毒性タンパク質のＣＤ５０は、未感染のＴ細胞ではおよそ１０〜１０，０００倍高い（細胞毒性が低い）。
動物モデルを使用した細胞毒性細胞標的化分子「ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＧａｇ」のインビボでの効果の判定
ＨＩＶ感染の進行を阻害するためのＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＧａｇの使用を、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αＧａｇをサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に感染した非ヒト霊長動物に投与することにより試験する（Sellier P et al., PLoS One 5: e10570(2010)を参照されたい）。
志賀毒素のＡサブユニット及び抗体αヒストプラズマ抗原に由来する細胞毒性細胞標的化分子
この実施例では、志賀毒素エフェクターポリペプチドＳＬＴ−１Ａ−コンボ０〜２６のうちのいずれか１つを、上述のように、免疫グロブリン型結合領域αヒストプラズマ抗原に作動可能に連結させるが、これは、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）表面抗原に対する既知の抗体又は当該技術分野で公知の技法を使用して生成した抗体に由来する（例えば、ヒストプラズマ・カプスラーツムＨ抗原（Deepe G, Durose G,Infect Immun 63: 3151-7 (1995)）及びｍＡｂ Ｈ１Ｃ（Lopes L et al., Clin Vaccine Immunol 17: 1155-8 (2010)、ヒストプラズマ・カプスラーツム細胞表面ヒストン様
タンパク質Ｈ２Ｂ（Nosanchuk J et al., J Clin Invest 112: 1164-1175 (2003)）を参
照されたい）。
細胞毒性細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αヒストプラズマ抗原の構築、産生、及び精製
免疫グロブリン型結合領域α腸蠕虫抗原、及びプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクター領域であってもよい志賀毒素エフェクターポリペプチドを一緒に連結して、免疫グロブリン型結合領域が、志賀毒素エフェクターポリペプチドと比較して、タンパク質のアミノ末端に対して近位に位置していない、タンパク質を形成する。例えば、融合タンパク質は、アミノ末端のＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）に融合したヒストプラズマ表面抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αヒストプラズマ抗原結合タンパク質の発現は、前述の実施例に記載のように、細菌及び／又は無細胞のタンパク質翻訳系のいずれかを使用して達成する。
細胞毒性細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αヒストプラズマ抗原のインビトロ特徴の判定
この実施例の細胞毒性細胞標的化分子の結合特徴を、精製した組換え標的タンパク質を使用して、当該技術分野で公知の分子結合アッセイによって判定する。標的タンパク質（
例えば、精製した組換えヒストプラズマ・カプスラーツム表面抗原）に対するＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αヒストプラズマ抗原のＫＤを測定すると、およそ１００ｎＭであるが、このアッセイにおいて、陰性対照タンパク質への有意な結合は存在しない。
ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αヒストプラズマ抗原細胞毒性タンパク質のリボソーム不活性化能力を、前述の実施例に記載のように、無細胞のインビトロタンパク質翻訳において判定する。この実施例の細胞毒性細胞標的化分子の、無細胞タンパク質合成に対する阻害効果は、有意である。この無細胞アッセイにおけるタンパク質合成に対するＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αヒストプラズマ抗原のＩＣ５０は、およそ０．１〜１００ｐＭである。
真菌を使用した細胞毒性細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αヒストプラズマ抗原の抗真菌活性の判定
真菌細胞に対するＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αヒストプラズマ抗原の殺真菌活性を判定する。殺真菌活性を測定するために、精製したＳｔｘＡ：：αヒストプラズマ抗原及び／又はＳｔｘＡ−ＦＲ：：αヒストプラズマ抗原を、真菌培養物に直接投与する（例えば、 Li R et al., Antimicrob Agents Chemother44: 1734-6 (2000)を参照されたい
）。加えて、真菌（例えば、ヒストプラズマ・カプスラーツム）に感染した実験室動物並びに／又はヒストプラズマ症、全身性心筋症、及び／若しくは他のヒストプラズマ・カプスラーツム関連疾患を呈する実験室動物に、ＳＬＴ−１Ａ−コンボ（ｎ）：：αヒストプラズマ抗原を投与し、真菌病原体及び／又は真菌感染の関連症状の低減又は除去に関して監視する（例えば、Kobayashi G et al., Antimicrob AgentsChemother 34: 524-8 (1990)を参照されたい）。
様々な細胞型を標的とする細胞毒性細胞標的化分子
この実施例では、志賀毒素エフェクター領域は、次の：１）脱免疫化、２）プロテアーゼ切断耐性、及び／又は３）組み込まれた若しくは挿入された異種Ｔ細胞エピトープのうちの２又は３以上を提供するような本明細書に記載される部分領域の組合せを含むような、志賀様毒素１のＡサブユニット（ＳＬＴ−１Ａ）、志賀毒素のＡサブユニット（ＳｔｘＡ）、及び／又は志賀様毒素２のＡサブユニット（ＳＬＴ−２Ａ）に由来する。結合領域は、表２１の列１から選択される分子に由来し、これは、表２１の列２に示される細胞外標的生体分子に結合する。得られた組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチド及び結合領域を一緒に融合して、様々な一本鎖ポリペプチドを形成する。この実施例の例示的なタンパク質は、当該技術分野で公知の技法を使用してカルボキシ末端ＫＤＥＬ型シグナルモチーフを有して作製されていてもよく、検出促進剤などの追加の外来性材料に連結されていてもよい。この実施例の例示的なタンパク質を、前述の実施例に記載のように、適切な細胞外標的生体分子を発現する細胞を使用して試験する。この実施例の例示的なタンパク質は、例えば、標的細胞の細胞内区画を標識し、表２１の列３に示される疾患、状態、及び／又は障害を診断及び治療するために使用され得る。







本発明の一部の実施形態を、例示の目的で記載しているが、本発明が、本発明の趣旨から逸脱すること又は特許請求の範囲を逸脱することなく、多数の修正、変更、及び適合を伴って、並びに当業者の技能の範囲内である多数の等価物又は代替的な解決策の使用を伴って、実施され得ることは明らかであろう。
すべての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれ個別の刊行物、特許、又は特許出願が具体的かつ個別に参照によりその全体が組み込まれると示されるのと同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／１６４６８０号パンフレット、同第ＷＯ２０１４／１６４６９３号パンフレット、同第ＷＯ２０１５／１３８４３５号パンフレット、同第ＷＯ２０１５／１３８４５２号パンフレット、同第ＷＯ２０１５／１１３００５号パンフレット、同第ＷＯ２０１５／１１３００７号パンフレット、及び同第ＷＯ２０１５／１９１７６４号パンフレットは、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。米国特許出願第ＵＳ２０１５０２５９４２８号、同第６２／１６８，７５８号、同第６２／１６８，７５９号、同第６２／１６８，７６０号、同第６２／１６８，７６１号、同第６２／１６８，７６２号、及び同第６２／１６８，７６３号の開示は、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＷＯ２０１６／１２６９５０号の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に引用されるGenBank（National Center for BiotechnologyInformation、U.S.）より電子的に利用可能なアミノ酸配列及びヌクレオチド配列のすべての生物学的配列情報の完全な開示は、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

























































Claims (1)

  1. ｉ）組み込まれた又は挿入された異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、並びに
    ii）前記組み込まれた又は挿入された異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープとオーバーラップしない少なくとも１つの内因性Ｂ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域の破壊
    を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドであって、
    志賀毒素エフェクター機能を示すことができる、前記志賀毒素エフェクターポリペプチド。

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