JP2018527882A - 脱免疫化された志賀毒素aサブユニット足場及びそれを含む細胞標的化分子 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、少なくとも1つの挿入された又は組み込まれた異種エピトープ(a)並びに少なくとも1つの破壊された内因性B細胞及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域(b)を含む、脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドであって、異種エピトープは、少なくとも1つの破壊された内因性B細胞及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域とオーバーラップしておらず、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも1つの志賀毒素エフェクター機能を示すことができる、志賀毒素エフェクターポリペプチドを提供する(例えば、志賀毒素エフェクター1、2、及び3と標識された、この実施形態セット番号1の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドの3つの例示的な実施形態の説明に役立つ例を表示する図1を参照)。ある特定のさらなる実施形態において、異種エピトープは、細胞のMHCクラスI分子によって提示されることが可能なCD8+T細胞エピトープである。ある特定のさらなる実施形態において、(a)における異種エピトープは、組み込まれており、志賀毒素エフェクターポリペプチドがその由来となる野生型志賀毒素ポリペプチド領域が有するのと同じアミノ酸残基総数を有するように、野生型志賀毒素ポリペプチド領域における同等の数のアミノ酸残基を置き換えている。上記したもののいずれかのある特定のさらなる実施形態において、脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ポリペプチドが存在する細胞のサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、及び細胞毒性から選択される少なくとも1つの志賀毒素エフェクター機能を示すことができる。
本発明は、それぞれ(i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、及び(ii)実施形態セット番号1の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子を提供する(例えば、この実施形態セット番号2の細胞標的化分子の4つの例示的な実施形態の説明に役立つ例を表示する図1を参照)。例えば、ある特定の実施形態のセット番号2は、(i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、並びに(ii)少なくとも1つの挿入された又は組み込まれた異種エピトープ(a)及び少なくとも1つの破壊された内因性B細胞及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域(b)を含む、脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドであって、異種エピトープは、組み込まれた又は挿入された異種T細胞エピトープとオーバーラップしない、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子である。ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも1つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び/又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び/又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、異種T細胞エピトープは、CD8+T細胞エピトープ、例えばヒト免疫系に関するものなどである。ある特定のさらなる実施形態に関して、異種T細胞エピトープは、細胞のMHCクラスI分子によって提示されることが可能である。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に入ること、リボソーム機能を阻害すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、細胞死を引き起こすこと、及び/又は細胞表面上での提示のために組み込まれた又は挿入された異種T細胞エピトープをMHCクラスI分子に送達することのうち1つ又は2つ以上が可能である。ある特定のさらなる実施形態に関して、細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、参照分子、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド要素の全てがそれぞれ野生型志賀毒素A1断片を含むことを除く細胞標的化分子からなる第2の細胞標的化分子などと同程度か又はそれより優れた細胞毒性を示すことができる。
本発明は、それぞれ(i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域;(ii)挿入された又は組み込まれた異種エピトープを含む志賀毒素エフェクターポリペプチド;及び(iii)カルボキシ末端の小胞体保留/回収シグナルモチーフを含む、細胞標的化分子を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、(a)少なくとも1つの細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域;(b)組み込まれた又は挿入された異種エピトープを含む志賀毒素エフェクターポリペプチド;及び(c)KDELファミリーのメンバーのカルボキシ末端の小胞体保留/回収シグナルモチーフを含む。ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも1つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び/又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び/又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、異種T細胞エピトープは、CD8+T細胞エピトープ、例えばヒト免疫系に関するものなどである。ある特定のさらなる実施形態に関して、異種T細胞エピトープは、細胞のMHCクラスI分子によって提示されることが可能である。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に入ること、リボソーム機能を阻害すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、細胞死を引き起こすこと、及び/又は細胞表面上での提示のために組み込まれた又は挿入された異種T細胞エピトープをMHCクラスI分子に送達することのうち1つ又は2つ以上が可能である。
本発明は、それぞれ(i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域;(ii)挿入された又は組み込まれた異種エピトープを含む志賀毒素エフェクターポリペプチド;及び(iii)破壊されたフーリン切断モチーフを含む、細胞標的化分子を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、(i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域;(ii)(a)挿入された又は組み込まれた異種エピトープ;(b)カルボキシ末端を有する志賀毒素A1断片由来の領域;及び(c)A1断片領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも1つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び/又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び/又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、異種T細胞エピトープは、CD8+T細胞エピトープ、例えばヒト免疫系に関するものなどである。ある特定のさらなる実施形態に関して、異種T細胞エピトープは、細胞のMHCクラスI分子によって提示されることが可能である。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に入ること、リボソーム機能を阻害すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、細胞死を引き起こすこと、及び/又は細胞表面上での提示のために組み込まれた又は挿入された異種T細胞エピトープをMHCクラスI分子に送達することのうち1つ又は2つ以上が可能である。ある特定のさらなる実施形態に関して、細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、参照分子、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド要素の全てが、そのA1断片領域のカルボキシ末端に野生型志賀毒素のフーリン切断部位を含むことを除く細胞標的化分子からなる第2の細胞標的化分子などと同程度か又はそれより優れた細胞毒性を示すことができる。
本発明は、(i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域;(ii)挿入された又は組み込まれた異種エピトープを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドをそれぞれ含む、細胞標的化分子であって、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ末端に又はその近位にある、細胞標的化分子を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、(i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、(ii)ポリペプチド要素、及び(iii)挿入された又は組み込まれた異種エピトープを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、細胞標的化分子のポリペプチド要素のアミノ末端に又はその近位にある。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドは、結合領域が志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の近位に位置しないように、細胞標的化分子内に物理的に配列又は配向されている。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、細胞標的化分子内において、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端より志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端の近位に位置する。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドに比べて、細胞標的化分子のアミノ末端の近位に位置していない。ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも1つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び/又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び/又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、異種T細胞エピトープは、CD8+T細胞エピトープ、例えばヒト免疫系に関するものなどである。ある特定のさらなる実施形態に関して、異種T細胞エピトープは、細胞のMHCクラスI分子によって提示されることが可能である。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に入ること、リボソーム機能を阻害すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、細胞死を引き起こすこと、及び/又は細胞表面上での提示のために組み込まれた又は挿入された異種T細胞エピトープをMHCクラスI分子に送達することのうち1つ又は2つ以上が可能である。
本発明は、(i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、及び(ii)破壊されたフーリン切断モチーフを含む脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドをそれぞれ含む細胞標的化分子を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、(i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、並びに(ii)(a)カルボキシ末端を有する志賀毒素A1断片由来の領域、(b)A1断片領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフ、及び(c)少なくとも1つの破壊された内因性B細胞及び/又はCD4+T細胞エピトープ及び/又はエピトープ領域を含む、脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも1つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び/又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び/又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に入ること、リボソーム機能を阻害すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び/又は細胞死をもたらすことの1つ又は2つ以上が可能である。ある特定のさらなる実施形態に関して、細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、参照分子、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド要素の全てが、そのA1断片領域のカルボキシ末端に野生型志賀毒素のフーリン切断部位を含むことを除く細胞標的化分子からなる第2の細胞標的化分子などと同程度か又はそれより優れた細胞毒性を示すことができる。
本発明は、(i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域;(ii)脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチド、及び(iii)カルボキシ末端の小胞体保留/回収シグナルモチーフをそれぞれ含む細胞標的化分子を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、(i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域;(ii)少なくとも1つの破壊された内因性B細胞及び/又はCD4+T細胞エピトープ及び/又はエピトープ領域を含む脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチド、並びに(iii)KDELファミリーのメンバーのカルボキシ末端の小胞体保留/回収シグナルモチーフを含む。ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも1つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び/又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び/又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に入ること、リボソーム機能を阻害すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び/又は細胞死をもたらすことの1つ又は2つ以上が可能である。
本発明は、(i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、(ii)脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドをそれぞれ含む細胞標的化分子であって、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、アミノ末端に又はその近位にある、細胞標的化分子を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、(i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域;(ii)ポリペプチド要素;及び(iii)少なくとも1つの破壊された内因性B細胞及び/又はCD4+T細胞エピトープ及び/又はエピトープ領域を含む脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、細胞標的化分子のポリペプチド要素のアミノ末端に又はその近位にある。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドは、結合領域が志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の近位に位置しないように、細胞標的化分子内に物理的に配列又は配向されている。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、細胞標的化分子内において、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端より志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端の近位に位置する。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドに比べて、細胞標的化分子のアミノ末端の近位に位置していない。ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも1つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び/又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び/又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に入ること、リボソーム機能を阻害すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び/又は細胞死をもたらすことの1つ又は2つ以上が可能である。
本発明は、(i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域;(ii)破壊されたフーリン切断モチーフを含む志賀毒素エフェクターポリペプチド;及び(iii)カルボキシ末端の小胞体保留/回収シグナルモチーフをそれぞれ含む、細胞標的化分子を提供する。本発明は、(i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域;(ii)破壊されたフーリン切断モチーフを含む志賀毒素エフェクターポリペプチド;及び(iii)KDELファミリーのメンバーのカルボキシ末端の小胞体保留/回収シグナルモチーフをそれぞれ含む細胞標的化分子を提供する。ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも1つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び/又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び/又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に入ること、リボソーム機能を阻害すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び/又は細胞死をもたらすことの1つ又は2つ以上が可能である。ある特定のさらなる実施形態に関して、細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、参照分子、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド要素の全てが、そのA1断片領域のカルボキシ末端に野生型志賀毒素のフーリン切断部位を含むことを除く細胞標的化分子からなる第2の細胞標的化分子などと同程度か又はそれより優れた細胞毒性を示すことができる。
本発明は、(i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、及び(ii)その志賀毒素A1断片領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドをそれぞれ含む細胞標的化分子であって、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端は、細胞標的化分子のポリペプチド成分のアミノ末端にある、及び/又はその近位にある、細胞標的化分子を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、(i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、(ii)アミノ末端を有する志賀毒素エフェクターポリペプチド及びカルボキシ末端を有する志賀毒素A1断片由来の領域、並びに(iii)A1断片領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含み、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドと比べて、細胞標的化分子のアミノ末端の近位に配置されていない。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドは、結合領域が志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の近位に位置しないように、細胞標的化分子内に物理的に配列又は配向されている。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、細胞標的化分子内において、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端より志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端の近位に位置する。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドに比べて、細胞標的化分子のアミノ末端の近位に位置していない。ある特定のさらなる実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも1つの志賀毒素エフェクター機能、例えば、ポリペプチドが存在する細胞の小胞体及び/又はサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、リボソームを酵素的に不活性化すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び/又は細胞毒性を引き起こすことなどを示すことができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞に入ること、リボソーム機能を阻害すること、細胞性塞栓を引き起こすこと、及び/又は細胞死をもたらすことの1つ又は2つ以上が可能である。ある特定のさらなる実施形態に関して、細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、参照分子、例えば、その志賀毒素エフェクターポリペプチド要素の全てが、そのA1断片領域のカルボキシ末端に野生型志賀毒素のフーリン切断部位を含むことを除いた細胞標的化分子からなる第17の細胞標的化分子などと同程度か又はそれより優れた細胞毒性を示すことができる。
本発明は、(i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、(ii)カルボキシ末端の小胞体保持/回収シグナルモチーフ、及び(iii)志賀毒素エフェクターポリペプチドをそれぞれ含む細胞標的化分子であって、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端は、細胞標的化分子のポリペプチド成分のアミノ末端にある、及び/又はその近位にある、細胞標的化分子を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、(i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、(ii)KDELファミリーのメンバーのカルボキシ末端の小胞体保持/回収シグナルモチーフ、(iii)ポリペプチド成分、及び(iv)志賀毒素エフェクターポリペプチドを含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端は、細胞標的化分子のポリペプチド成分のアミノ末端にある、及び/又はその近位にある。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドは、結合領域が志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の近位に位置しないように、細胞標的化分子内に物理的に配列又は配向されている。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、細胞標的化分子内において、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端より志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端の近位に位置する。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドに比べて、細胞標的化分子のアミノ末端の近位に位置していない。
実施形態セット番号2〜番号11のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、直接的又は間接的のいずれかで、例えば熟練した作業者公知のリンカーを介して結合領域に融合されている。
本発明は、様々な組合せの、志賀毒素エフェクターポリペプチド及びそれを含む細胞標的化分子を提供する。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドのある特定の実施形態は、例えば、1)その特定のエレメントの組合せが欠失した分子バリアントと比較して低減した抗原性及び/又は免疫原性を示す能力、2)その特定のエレメントの組合せが欠失した分子バリアントと比較して低減したプロテアーゼ切断を示す能力、3)ある特定の投薬量で、その特定のエレメントの組合せが欠失した分子バリアントと比較して多細胞生物に対して低減した非特異的な毒性を示す能力、4)細胞表面提示のために、細胞のMHCクラスI系に、組み込まれた又は挿入されたT細胞エピトープを送達する能力、及び/又は5)強力な細胞毒性を示す能力などの2つ又は3つ以上の特性を、単一分子中にもたらす構造的なエレメントを組み合わせる。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、様々な細胞標的化分子、例えば、細胞を標的化する細胞毒性の治療的分子;細胞を標的化する非毒性の運搬手段;及び細胞を標的化する診断用分子などを作り出すための足場として役立つ可能性がある。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は、少なくとも1つの、野生型志賀毒素Aサブユニット由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドを含むが、1つ又は2つ以上の構造改変、例えば短縮化及び/又はアミノ酸残基の置換のような変異などを含む。ある特定の実施形態に関して、本発明は、以下の志賀毒素エフェクターポリペプチド部分領域:(1)脱免疫化された部分領域、(2)志賀毒素A1断片領域のカルボキシ末端に近いプロテアーゼ切断耐性の部分領域、及び(3)T細胞エピトープ−ペプチドの組み込まれた又は挿入された部分領域の2つ又は3つ以上の組合せを含む、改善された志賀毒素Aサブユニットエフェクターポリペプチドを改変することを含む。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば野生型志賀毒素、野生型志賀毒素ポリペプチド、及び/又は野生型ポリペプチド配列のみを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドなどと比較して、脱免疫化されている。本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドはそれぞれ、脊索動物にそのポリペプチドを投与した後に志賀毒素エフェクターポリペプチドの抗原性及び/又は免疫原性を低減するための、少なくとも1つの推定上の内因性エピトープ領域の破壊を含む。志賀毒素エフェクターポリペプチド及び/又は志賀毒素Aサブユニットポリペプチドは、天然に存在するか又はしないかにかかわらず、本明細書に記載される方法、国際公開第2015/113005号パンフレット及び/若しくは国際公開第2015/113007号パンフレットで説明される方法、並びに/又は熟練した作業者公知の方法によって脱免疫化することができ、得られた分子は、1つ又は2つ以上の志賀毒素Aサブユニット機能を保持する。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、(1)カルボキシ末端を有する志賀毒素A1断片由来の領域、及び(2)志賀毒素A1断片領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含む。志賀毒素成分と、細胞標的化分子の他の成分、例えば細胞を標的化する結合領域との間の接続の安定性の改善は、例えばタンパク質分解などの結果としての接続の破壊及び細胞標的化の損失によって引き起こされる非特異的な毒性を低減することによって、生物に投与した後のそれらの毒性プロファイルを改善することができる。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、組み込まれた又は挿入されたエピトープ−ペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態において、エピトープ−ペプチドは、異種T細胞エピトープ−ペプチド、例えば志賀毒素Aサブユニットにとって異種とみなされるエピトープである。ある特定のさらなる実施形態において、エピトープ−ペプチドは、CD8+T細胞エピトープである。ある特定のさらなる実施形態において、CD8+T細胞エピトープ−ペプチドは、10−4モーラー以下の解離定数(KD)を特徴とするMHCクラスI分子への結合親和性を有するか、及び/又は得られたMHCクラスI−エピトープ−ペプチド複合体は、10−4モーラー以下の解離定数(KD)を特徴とするT細胞受容体(TCR,T-cell receptor)への結合親和性を有する。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、新規の細胞標的化分子を改変するためのロバストで強い足場を提供する。細胞標的化結合領域と本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドとの会合は、例えば脱免疫化、強力な細胞毒性、効率的な細胞内経路決定、T細胞の過免疫化、分子の安定性、及び高い投薬量でのインビボ忍容性などの所望の特徴を有する治療用及び診断用分子の改変を可能にする。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子の結合領域は、標的生体分子の細胞外部分(例えば細胞外標的生体分子)に高親和性で特異的に結合することができる、ドメイン、分子部分、又は薬剤などの細胞標的化成分である。熟練した作業者に公知の、又は熟練した作業者により当業界において公知の技術を使用して発見され得る多数のタイプの結合領域がある。例えば、本明細書に記載される必要な結合特徴を示すあらゆる細胞標的化成分が、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態における結合領域として使用することができる。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子の結合領域は、標的生体分子の細胞外部分又は細胞外標的生体分子に特異的に結合することができ、好ましくは所望の細胞型、例えばがん細胞、腫瘍細胞、形質細胞、感染細胞、又は細胞内病原体を内包する宿主細胞などの表面と物理的に結合しているタンパク質領域を含む。本発明の細胞標的化分子の結合領域によって結合した標的生体分子としては、がん細胞、免疫細胞、及び/又は例えばウイルス、細菌、真菌、プリオン、若しくは原生動物などの細胞内病原体に感染した細胞に過剰な比率で又は独占的に存在するバイオマーカーを挙げることができる。
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、KDELファミリーのメンバーの1つ又は2つ以上のカルボキシ末端の小胞体保持/回収シグナルモチーフを含む。国際公開第2015/138435号パンフレットで説明されるあらゆる小胞体保持/回収シグナルモチーフが、本発明のある特定の細胞標的化分子の成分として使用するのに適している可能性がある。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、追加の外因性材料を含む。「追加の外因性物質」は、本明細書で使用される場合、志賀毒素及び天然の標的細胞のどちらにもしばしば一般的に存在しない1つ又は2つ以上の原子又は分子を指し、本発明の細胞標的化分子は、細胞内部にこのような材料を特異的に輸送するのに使用することができる。ある意味では、本発明の細胞標的化分子全体が細胞に入ると予想される外因性物質であることから、「追加の」外因性物質は、コア以外の細胞標的化分子それ自身に連結される異種材料である。追加の外因性物質の非限定的な例は、放射性核種、ペプチド、検出促進剤、タンパク質、低分子化学療法剤、及びポリヌクレオチドである。
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態に関して、例えば細胞毒性効力に対する成分の相対方向の作用;ある特定の投薬量におけるインビボ忍容性に対するフーリン切断感受性作用;インビトロでの安定性に対するフーリン切断感受性作用;インビボの半減期に対するフーリン切断感受性作用;及び多細胞生物におけるインビボの非特異的な毒性に対するフーリン切断感受性作用などの、特異的な構造と機能との関係がすでに観察されている。
個々の細胞標的化結合領域、志賀毒素エフェクターポリペプチド、及び/又は本発明の細胞標的化分子の成分は、好適には、当業界において周知の及び/又は本明細書に記載される1つ又は2つ以上のリンカーを介して互いに連結されていてもよい。結合領域の個々のポリペプチド下位成分、例えば重鎖可変領域(VH)、軽鎖可変領域(VL)、CDR、及び/又はABR領域が、好適には、当業界において周知の及び/又は本明細書に記載される1つ又は2つ以上のリンカーを介して互いに連結されていてもよい。本発明のタンパク質性成分、例えば多連鎖の結合領域は、好適には、当業界において周知の1つ又は2つ以上のリンカーを介して、互いに又は本発明の他のポリペプチド成分に連結されていてもよい。本発明のペプチド成分、例えば、KDELファミリーの小胞体保持/回収シグナルモチーフは、好適には、1つ又は2つ以上のリンカー、例えば当業界において周知のタンパク質性リンカーなどを介して、本発明の別の成分に連結されていてもよい。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、短縮型志賀毒素Aサブユニットを含むか又はそれから本質的になり得る。志賀毒素Aサブユニットの短縮化は、例えば、触媒活性及び細胞毒性などの志賀毒素エフェクター機能に影響することなく、エピトープ全体及び/若しくはエピトープ領域、B細胞エピトープ、CD4+T細胞エピトープ、並びに/又はフーリン切断部位の欠失を生じ得る。完全な酵素活性を示すことが示された最小の志賀毒素Aサブユニット断片は、Slt1Aの残基1〜239で構成されるポリペプチドであった(LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005))。有意な酵素活性を示すことが示された最小の志賀毒素Aサブユニット断片は、StxAの残基75〜247で構成されるポリペプチドであった(Al-Jaufy A et al., Infect Immun 62: 956-60 (1994))。
ある特定の実施形態において、本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、2つ又は3つ以上の変異を有する短縮型志賀毒素Aサブユニットから本質的になり得る。志賀毒素Aサブユニットの短縮化は、例えば、触媒活性及び細胞毒性などの志賀毒素エフェクター機能に影響することなく、エピトープ全体及び/若しくはエピトープ領域、B細胞エピトープ、CD4+T細胞エピトープ、並びに/又はフーリン切断部位の欠失を生じ得る。SLT−1A、StxA、又はSLT−2Aのカルボキシ末端をアミノ酸1〜251へ短縮化することは、2つの予測されたB細胞エピトープ領域、2つの予測されたCD4陽性(CD4+)T細胞エピトープ、及び予測された非連続性B細胞エピトープを取り除く。SLT−1A、StxA、又はSLT−2Aのアミノ末端を75〜293へ短縮化することは、少なくとも3つの予測されたB細胞エピトープ領域及び3つの予測されたCD4+T細胞エピトープを取り除く。SLT−1A、StxA、又はSLT−2Aのアミノ末端とカルボキシ末端の両方を75〜251へ短縮化することは、少なくとも5つの予測されたB細胞エピトープ領域、4つの推定CD4+T細胞エピトープ、及び1つの予測された非連続性B細胞エピトープを欠失させる。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素A1断片由来領域のカルボキシ末端に、破壊されたフーリン切断モチーフ及び/又はフーリン切断部位を含み得る。ある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素A1断片由来領域のカルボキシ末端の近位に、フーリン切断を与え得るいかなる知られた代償構造も含まない。本発明における使用に適した、破壊されたフーリン切断モチーフ及びフーリン切断部位の非限定的例は、国際公開第2015/191764号パンフレットに記載されている。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、脱免疫化、及び/又は標的細胞のMHCクラスI提示経路への送達のために、1つ又は2つ以上の組み込まれた又は挿入された異種T細胞エピトープを含み得る。ある特定の実施形態及び/又はある特定の志賀毒素エフェクターポリペプチド部分領域について、T細胞エピトープを組み込むこと、又は部分的に組み込むことは、T細胞エピトープを挿入することより好ましくあり得、例えば、組み込み型改変は、志賀毒素エフェクターポリペプチドの多様な部分領域において成功する可能性がより高く、一方、成功した挿入は、志賀毒素エフェクターポリペプチド部分領域のより小さいサブセットに、より限定され得るからである。用語「成功した」とは、志賀毒素エフェクターポリペプチドへの改変(例えば、異種T細胞エピトープの導入)が、結果として、1つ又は2つ以上の志賀毒素エフェクター機能を単独で、又は細胞標的化分子の成分としてのいずれかで、必要なレベルの活性で保持する改変型志賀毒素エフェクターポリペプチドを生じることを意味するように本明細書で使用される。
本発明の組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドは、2つ又は3つ以上の部分領域(すなわち、オーバーラップしていない部分領域)を含み、各部分領域が、以下の少なくとも1つを含む:(1)内因性エピトープ又はエピトープ領域における破壊;(2)組み込まれた異種T細胞エピトープ−ペプチド;(3)挿入された異種T細胞エピトープ−ペプチド;及び(4)A1断片由来領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフ。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、様々な細胞外標的生体分子を標的にする細胞標的化分子の成分として使用され得る。以下の例は、例えば、CD19、CD20、CD22、CD30、CD38、CD45、HER2、PD−L1、及びTYRP1などの細胞外標的生体分子を発現する細胞を標的にする、本発明の例示的な細胞標的化分子のある特定の構造をより詳細に記載する。
B4としても当技術分野において認識されているCD19は、発達中のB細胞の表面上に存在する95kDa、B系列特異的、I型膜貫通糖タンパク質であるが、最終分化したプラズマ細胞によって発現しない。CD19という名前は、様々な種由来の関連した構造及びポリペプチド配列を有する複数のタンパク質を指し得るが、このセクションの構造例を示すことを目的として、用語「CD19」は、正確な配列がアイソフォームに基づいて、及び個体間でわずかに異なり得る、ヒトに存在するBリンパ球抗原CD19タンパク質を指す。ヒトに関しては、CD19は、主なポリペプチド配列UniProt P15391及び(National Center Biotechnology Institute, U.S.)(NCBI)アクセッションAAA69966.1又はAAB60697.1によって表されるタンパク質を指す;しかしながら、スプライシング、多型性、及び/又は変異により異なるアイソフォーム及びバリアントが存在する(例えば、Kuroki K et al., Genes Immun Suppl 1: S21-30 (2002);Tsuchiya N et al., Arthritis Rheum 50: 4002-7 (2004);Dawidowicz K et al., Clin Exp Rheumatol 29: 839-42 (2011)参照)。熟練した作業者は、たとえ参照された配列とは異なる場合でさえも、ヒトにおいて他のCD19タンパク質を同定することができるだろう。
CD20(Bリンパ球抗原CD20)CD20という名前は、様々な種由来の関連した構造及びポリペプチド配列を有する複数のタンパク質を指し得るが、このセクションの構造例を示すことを目的として、用語「CD20」は、正確な配列がアイソフォームに基づいて、及び個体間でわずかに異なり得る、ヒトに存在するBリンパ球抗原CD20タンパク質を指す。ヒトに関しては、CD20は、主なポリペプチド配列UnitProt P11836及びNCBIアクセッションNP 690605.1によって表されるタンパク質を指す;しかしながら、スプライシング、多型性、及び/又は変異により異なるアイソフォーム及びバリアントが存在する(例えば、Dawidowicz K et al., Clin Exp Rheumatol 29: 839-42 (2011);Fang C et al., Int J Clin Exp Med 8: 11235-43 (2015)参照)。熟練した作業者は、たとえ参照された配列とは異なる場合でさえも、ヒトにおいて他のCD20タンパク質を同定することができるだろう。
当技術分野においてSiglec−2、SIGLEC2、BL−CAM、B3、Leu−14、及びLyb−8としても認識されているCD22は、シアル酸リガンドと結合する、(スプライスフォーム(spliceoform)に依存して)約120〜140kDaの膜貫通糖タンパク質である。CD22は、発達中のB細胞、及び成熟B細胞の特定のサブセットによって特異的に発現する。CD22という名前は、様々な種由来の関連した構造及びポリペプチド配列を有する複数のタンパク質を指し得るが、このセクションの構造例を示すことを目的として、用語「CD22」は、正確な配列がアイソフォームに基づいて、及び個体間でわずかに異なり得る、ヒトに存在するシアル酸結合性レクチンタンパク質を指す。ヒトに関しては、CD22は、主なポリペプチド配列UniProt P20273及びNCBIアクセッションNP_001265346.1によって表されるタンパク質を指す;しかしながら、スプライシング、多型性、及び/又は変異により異なるアイソフォーム及びバリアントが存在する(例えば、Hitomi Y et al., Tissue Antigens 69: 242-9 (2007);Dawidowicz K et al., Clin Exp Rheumatol 29: 839-42 (2011)参照)。熟練した作業者は、たとえ参照された配列とは異なる場合でさえも、ヒトにおいて他のCD22タンパク質を同定することができるだろう。
当技術分野において腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー8(TNFRSF8,tumor necrosis factor receptor superfamily 8)又はKi−1/120としても認識されている、CD30は、約90〜120kDaのサイズのI型膜貫通糖タンパク質である。CD30は、腫瘍壊死因子受容体ファミリーの細胞表面受容体(又は共受容体)として機能し、リガンドCD30Lと結合する。CD30抗原は、ホジキン病を有する患者に存在する古典的ホジキンリンパ腫及びリード・シュテルンベルク細胞のマーカーとして最初、記載され(Schwab U et al., Nature 299: 65-7 (1982);Stein H et al., Int J Cancer 30: 445-459 (1982))、CD30抗原は、後で、非ホジキンリンパ腫細胞上に観察された(例えば、Stein H et al., Blood 66: 848-58 (1985)参照)。CD30という名前は、様々な種由来の関連した構造及びポリペプチド配列を有する複数のタンパク質を指し得るが、このセクションの構造例を示すことを目的として、用語「CD30」は、正確な配列がアイソフォームに基づいて、及び個体間でわずかに異なり得る、ヒトに存在する腫瘍壊死因子受容体タンパク質を指す。ヒトに関しては、CD30は、主なポリペプチド配列UniProt P28908及びNCBIアクセッションAAA51947.1によって表されるタンパク質を指す;しかしながら、スプライシング、多型性、及び/又は変異により異なるアイソフォーム及びバリアントが存在し得る。熟練した作業者は、たとえ参照された配列とは異なる場合でさえも、ヒトにおいて他のCD30タンパク質を同定することができるだろう。
CD38は、細胞表面受容体と、細胞外サイクリックADPリボースヒドロラーゼ(ADPリボシラーゼ)の両方として特徴づけられる膜貫通タンパク質である。CD38という名前は、様々な種由来の関連した構造及びポリペプチド配列を有する複数のタンパク質を指し得るが、このセクションの構造例を示すことを目的として、用語「CD38」は、正確な配列がアイソフォームに基づいて、及び個体間でわずかに異なり得る、ヒトに存在するサイクリックADPリボースヒドロラーゼタンパク質を指す。ヒトに関しては、CD38は、主なポリペプチド配列UniProt P28907及びNCBIアクセッションBAA18964によって表されるタンパク質を指す;しかしながら、スプライシング、多型性、及び/又は変異により異なるアイソフォーム及びバリアントが存在し得る(例えば、Ferrero E et al., Immunogenetics 49: 597-604 (1999);Gonzalez-Escribano M et al., Hum Immunol 65: 660-664 (2004);Drummond F et al., J Bone Miner Metab 24: 28-35 (2006);Aydin S et al., Blood 111: 5646-53 (2008);国際公開第2006/099875号パンフレット参照)。熟練した作業者は、たとえ参照された配列とは異なる場合でさえも、ヒトにおいて他のCD38タンパク質を同定することができるだろう。
当技術分野においてPTPRC(タンパク質チロシンホスファターゼ,受容体型,C,protein tyrosine phosphatase, receptor type, C)及び白血球共通抗原(LCA,leukocyte common antigen)としても認識されているCD45は、多くの分化型造血系細胞、特に、悪性血液学的細胞、例えば、リンパ腫、B細胞慢性リンパ球性白血病(B−CLL,B-cell chronic lymphocytic leukemia)、有毛細胞性白血病、及び急性非リンパ球性白血病(AML,acute nonlymphocytic leukemia)細胞の細胞表面上に発現するI型膜貫通タンパク質チロシンホスファターゼである。CD45という名前は、様々な種由来の関連した構造及びポリペプチド配列を有する複数のタンパク質を指し得るが、このセクションの構造例を示すことを目的として、用語「CD45」は、正確な配列がアイソフォームに基づいて、及び個体間でわずかに異なり得る、ヒトに存在するタンパク質チロシンホスファターゼタンパク質を指す。ヒトに関しては、CD45は、主なポリペプチド配列UniProt Q6QIQ5、及び、例えば、NCBIアクセッションNP_563578.2又はNP_002829.3によって表されるタンパク質を指す;しかしながら、スプライシング、多型性、及び/又は変異により異なるアイソフォーム及びバリアントが存在する(例えば、Motta-Mena L et al., J Biol Chem 286: 20043-53 (2011);Marme F et al., Breast Cancer Res Treat 132: 819-31 (2012);Pokoyski C et al., Genes Immun 16: 519-27 (2015)参照)。熟練した作業者は、たとえ参照された配列とは異なる場合でさえも、ヒトにおいて他のCD45タンパク質を同定することができるだろう。
当技術分野において受容体型チロシンタンパク質キナーゼerbB−2としても認識されている、HER2は、細胞増殖及びアポトーシスの細胞内制御因子へ細胞膜を通してシグナルを伝達するための細胞表面受容体として機能する膜貫通タンパク質である。HER2はまた、当技術分野において、Neu、erbB−2、p185、CD340、NGL、及びHER2/neuとして認識されている(Coussens L et al., Science 230: 1132-39 (1985);King C et al., Science 229: 974-6 (1985);Semba K et al., Proc Natl Acad Sci USA 82: 6497-501 (1985);Yamamoto T et al., Nature 319:230-234 (1986);Kokai Y et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5389-93 (1988);Disis M et al., Cancer Res 54: 16-20 (1994);Yoshino I et al., J Immunol 152: 2393-400 (1994)、例えば、GenBankアクセッション番号X03363;M17730;NM_004448;SEG_HUMHER20参照)。HER2という名前は、様々な種由来の関連した構造及びポリペプチド配列を有する複数のタンパク質を指し得るが、このセクションの構造例を示すことを目的として、用語「HER2」は、正確な配列がアイソフォームに基づいて、及び個体間でわずかに異なり得る、ヒトに存在する上皮増殖因子受容体タンパク質を指す。例えば、HER2は、例示的なポリペプチド配列UniProt P04626、並びにNCBIアクセッションNP_004439.2、NP_001005862.1、NP_001276865.1、NP_001276866.1、及びNP_001276867.1によって表されるヒトタンパク質を指す;しかしながら、スプライシング、多型性、及び/又は変異により異なるアイソフォーム及びバリアントが存在する(例えば、Siddig A et al., Ann N Y Acad Sci 1138: 84-94 (2008);Poole E et al., Int J Mol Epidemiol Genet 2: 300-15 (2011);国際公開第2000/020579号パンフレット参照)。熟練した作業者は、たとえ参照された配列とは異なる場合でさえも、ヒトにおいて他のHER2タンパク質を同定することができるだろう。
当技術分野においてPDL1、プログラム細胞死1リガンド1、PDCD1リガンド1、PDCD1L1、PDCD1LG1、B7ホモログ1(B7−H1)、及びCD274としても認識されているPD−L1は、T細胞及びB細胞のプログラム細胞死1受容体(Dong H et al., Nat Med 5: 1365-9 (1999);Freeman G et al., J Exp Med 192: 1027-34 (2000);Latchman Y et al., Nat Immunol 2: 261-8 (2001))並びにT細胞上に見出されるB7−1受容体及びCD80受容体(Butte M et al., Immunity 27:111-22 (2007);Park J et al., Blood 116: 1291-8 (2010))についてのリガンドである。PD−L1という名前は、様々な種由来の関連した構造及びポリペプチド配列を有する複数のタンパク質を指し得るが、このセクションの構造例を示すことを目的として、用語「PD−L1」は、正確な配列がアイソフォームに基づいて、及び個体間でわずかに異なり得る、ヒトに存在するPD−1リガンドを指す。ヒトに関しては、PD−L1は、主なポリペプチド配列UniProt Q9NZQ7又はQ9EP73、及びNCBIアクセッションAAI13735.1によって表されるタンパク質を指す;しかしながら、スプライシング、多型性、及び/又は変異により異なるアイソフォーム及びバリアントが存在する(例えば、Abelson A et al., Genes Immun 8: 69-74 (2007);Wang S et al., J Clin Immunol 27: 563-7 (2007);Hayashi M et al., Eur J Endocrinol 158: 817-22 (2008);Mitchell A et al., J Clin Endocrinol Metab 94: 5139-45 (2009);Yang Q et al., Clin Exp Rheumatol 29: 13-8 (2011);Ma Y et al., Int J Clin Exp Med 15: 16585-91 (2015)参照)。熟練した作業者は、たとえ参照された配列とは異なる場合でさえも、ヒトにおいて他のPD−L1タンパク質を同定することができるだろう。
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、結合領域は、例えば、国際公開第2005/092917号パンフレット、国際公開第2007/033497号パンフレット、米国特許出願公開第2009/0156417号明細書、日本特許第4339511号明細書、欧州特許公告第1727827号明細書、独国特許公告第602004027168号明細書、欧州特許公告第1945660号明細書、日本特許第4934761号明細書、欧州特許公告第2228383号明細書、米国特許出願公開第2013/0196928号明細書、国際公開第2014/164680号パンフレット、国際公開第2014/164693号パンフレット、国際公開第2015/138435号パンフレット、国際公開第2015/138452号パンフレット、国際公開第2015/113005号パンフレット、国際公開第2015/113007号パンフレット、国際公開第2015/191764号パンフレット、米国特許出願公開第20150259428号明細書、米国特許出願第62/168,758号明細書、第62/168,759号明細書、第62/168,760号明細書、第62/168,761号明細書、第62/168,762号明細書、第62/168,763号明細書、及び国際特許出願第PCT/US2016/016580号明細書に、以前、記載されている。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドと細胞標的化結合領域との機能的会合は、特定の細胞型を選択的に殺滅し、それの増殖を阻害し、それに外因性材料を送達し、及び/又はそれを検出する細胞標的化分子の作製を可能にする。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドの性質は、前の志賀毒素エフェクターポリペプチドと比較して、脊索動物において治療濃度域が向上した細胞標的化分子の作製を可能にする。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドの脱免疫化は、変異及び/若しくは短縮化による、又は共有結合した化学的構造のコンジュゲーションによることを含む、志賀毒素Aサブユニット又は志賀毒素エフェクターポリペプチドの1つ又は2つ以上の内因性B細胞及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域の破壊を設計することにより、達成される。B細胞エピトープは成熟CD4+T細胞のエピトープと一致し、又はオーバーラップする場合が多いため、内因性B細胞エピトープ領域の破壊は、内因性CD4+T細胞エピトープを同時に破壊する場合が多く、又はその逆もまた同様である。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子のある特定の実施形態は、野生型志賀毒素A1断片領域を含む関連分子と比較してプロテアーゼ切断感受性の低減を示す。ある特定のさらなる実施形態は、このプロテアーゼ切断感受性の低減及び中毒性細胞内の標準的なフーリン切断事象の欠損にも関わらず、最適ではないにしても、強力な志賀毒素Aサブユニット触媒ドメイン依存性細胞毒性を示す。
ある特定の実施形態において、本発明の分子(例えば、本発明の細胞標的化分子)は、フーリン切断感受性がより高いアナログ及び/又は脱免疫化がより低いアナログ(アナログは、本発明の1つ又は2つ以上の構造的特徴を欠く、密接に関係した分子である)と比較して、安定性の増加及び/又はインビボ忍容性の改善を示す。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子のある特定の実施形態は、細胞毒性である。本発明の細胞標的化分子のある特定のさらなる実施形態は、1つ又は2つ以上の志賀毒素エフェクターポリペプチド成分の存在によってのみ細胞毒性である。志賀毒素ファミリーのメンバーのAサブユニットそれぞれは、いったん細胞のサイトゾル内にあれば、真核細胞を死滅させる能力がある酵素活性のあるポリペプチド領域を含む。志賀毒素ファミリーのメンバーは、真核細胞を死滅させることに適応しているため、志賀毒素由来の分子、例えば、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドのある特定の実施形態を含む分子などは、強力な細胞殺滅活性を示し得る。
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は、T細胞エピトープを含み、そのエピトープは、有核脊索動物細胞による送達及び細胞表面提示のためのエピトープ−ペプチドカーゴの選択が事実上、無制限である、「T細胞エピトープを送達する」分子の改変を可能にする。ある特定の実施形態について、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子はそれぞれ、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び/又は細胞標的化分子と会合した1つ又は2つ以上のT細胞エピトープを細胞のプロテアソームへ送達する能力がある。その後、送達されたT細胞エピトープは、タンパク質分解性プロセシングを受け、細胞の表面上のMHCクラスI経路により提示される。MHCクラスIエピトープを細胞標的化分子中へ操作することにより、脊索動物免疫系の有益な機能を利用し、かつ指揮するために免疫刺激抗原の標的化送達及び提示が達成され得る。
ある特定の実施形態について、本発明の細胞標的化分子は、1)標的細胞によるMHCクラスI提示のためのT細胞エピトープの送達、及び/又は2)強力な細胞毒性を提供することができる。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態について、細胞標的化結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞を接触させることにより、本発明の細胞標的化分子は、その細胞の死を引き起こす能力がある。細胞殺滅の機構は、例えば毒素エフェクターポリペプチド領域の酵素活性により直接的で、又はCTL媒介性細胞溶解により間接的であり得る。
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、それらが、標的細胞のMHCクラスI提示経路へ送達され、かつ標的細胞の細胞表面上で提示される能力があるCD8+T細胞エピトープを含むため、細胞毒性である。例えば、本発明の、T細胞エピトープを送達する、CD8+T細胞で過免疫された、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、内因性エピトープ脱免疫化があろうとなかろうと、間接的細胞殺滅に関わる適用のための細胞標的化分子の成分として使用され得る。
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、それらが、分子中での免疫原性CD8+T細胞エピトープの存在の有無を問わず、触媒活性のある志賀毒素エフェクターポリペプチドを含むため、細胞毒性である。例えば、内因性エピトープ脱免疫化の有無に関わらず、本発明の、CD8+T細胞で過免疫された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、例えば、志賀毒素エフェクターポリペプチドのリボ毒性の酵素活性、又は非触媒機構によるリボソーム結合及びリボソーム機能への干渉を介してなどの、直接的細胞殺滅に関わる適用のための細胞標的化分子の成分として使用され得る。
本発明のある特定の細胞標的化分子は、非標的化バイスタンダー細胞の存在下での特異的標的細胞の選択的殺滅に使用される。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドの送達を、細胞標的化結合領域を介して特異的細胞へ向けることにより、本発明の細胞標的化分子は、非標的化細胞の存在下で、選択された細胞型の排他的又は優先的殺滅を生じる、細胞型特異的な限定的細胞殺滅活性を示し得る。同様に、免疫原性T細胞エピトープの送達を標的細胞のMHCクラスI経路へ向けることにより、本発明の細胞標的化分子により誘導された標的細胞のその後のT細胞エピトープの提示及びCTL媒介性細胞溶解は、非標的化細胞の存在下で、選択された細胞型を排他的に、又は優先的に死滅させることに限定され得る。加えて、細胞毒性志賀毒素エフェクターポリペプチド領域と免疫原性T細胞エピトープの両方の細胞標的化送達は、両方の潜在的細胞毒性成分の送達が、非標的化細胞の存在下で標的細胞へ排他的又は優先的に限定されるような本発明の単一の細胞標的化分子によって達成することができる。
本発明の細胞毒性、細胞分裂阻害性、及び免疫刺激適応に加えて、本発明の細胞標的化分子は、標的化細胞内送達機能として、例えば、情報収集及び診断機能に関わる適用において、使用されてもよい。
本発明のある特定の細胞標的化分子は、特異的な細胞、細胞型、及び/又は細胞集団、加えて、前述のいずれかの特異的な細胞内区画のインビトロ及び/又はインビボ検出に使用される。検出促進剤にコンジュゲートされている本発明の細胞毒性細胞標的化分子の低減細胞毒性及び/又は無細胞毒性型は、それ、又は関連した結合領域、例えば、その同じ標的生体分子、オーバーラップエピトープ、及び/若しくは同じエピトープと高親和性で結合する結合領域などを含む治療レジメンと併せて使用されるコンパニオン診断としてなど診断機能として使用されてもよい。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及びある特定の細胞標的化分子は、当業者周知の技術を使用して産生することができる。例えば、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は、標準的な合成方法によって、組換え発現系の使用によって、又は他のあらゆる好適な方法によって製造することができる。したがって、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子は、例えば、(1)標準的な固相又は液相手法を使用して、段階的に又は断片のアセンブリのいずれかによって、細胞標的化分子のポリペプチド又はポリペプチド成分を合成し、最終的なポリペプチド化合物産物を単離及び精製すること;(2)宿主細胞中で本発明の細胞標的化分子のタンパク質又はタンパク質成分をコードするポリヌクレオチドを発現させ、宿主細胞又は宿主細胞培養物から発現産物を回収すること;又は(3)本発明の細胞標的化分子のポリペプチド又はポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを無細胞で、インビトロで発現させ、発現産物を回収することを含む方法によって、又は(1)、(2)若しくは(3)の方法のあらゆる組合せを含む、多数の方法によって合成し、タンパク質成分の断片を得て、それに続きペプチド又はポリペプチド断片を合体させて(例えばライゲートして)ポリペプチド成分を得て、ポリペプチド成分を回収することができる。
本発明は、以下のさらなる詳細で説明される状態、疾患、障害、又は症状(例えばがん、悪性腫瘍、非悪性腫瘍、増殖異常、免疫障害、及び微生物感染)を治療又は予防するための、単独で、又は医薬組成物中で1つ若しくは2つ以上の追加の治療剤と組み合わせて使用するための、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子を提供する。本発明はさらに、本発明の志賀毒素ポリペプチド若しくは細胞標的化分子、又は薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物を、本発明に従って、少なくとも1つの薬学的に許容される担体、賦形剤、又はビヒクルと一緒字含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド又は細胞標的化分子のホモ多量体及び/又はヘテロ多量体の形態を含んでいてもよい。本発明の医薬組成物は、以下のさらなる詳細で説明される疾患、状態、障害、又は症状を治療する、緩和する、又は予防する方法において有用である。このような疾患、状態、障害、又は症状のそれぞれは、本発明に係る医薬組成物の使用に関して別個の実施形態であることが想定される。本発明はさらに、以下でより詳細に説明される本発明に係る少なくとも1つの治療方法で使用するための医薬組成物を提供する。
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子のいずれかの薬学的に許容される塩又は溶媒和物は、本発明の範囲内である。
本発明のポリペプチド及び細胞標的化分子の他にも、本発明のポリペプチド及び細胞標的化分子、又はそれらの機能的部分をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内に包含される。用語「ポリヌクレオチド」は、用語「核酸」と同等であり、これらのそれぞれは、デオキシリボ核酸(DNA)のポリマー、リボ核酸(RNA)のポリマー、ヌクレオチドアナログを使用して生成されたこれらのDNA又はRNAのアナログ、並びにそれらの派生物、断片及びホモログの1つ又は2つ以上を含む。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖であり得る。このようなポリヌクレオチドは、例えば、RNAコドンの3番目の位置で許容されることがわかっているゆらぎを考慮に入れた、それでもなお異なるRNAコドンと同じアミノ酸をコードする例示的なタンパク質をコードすることができる全てのポリヌクレオチドを含むことが具体的に開示されている(Stothard P, Biotechniques 28:1102-4 (2000)を参照)。
本発明のある特定の実施形態は、固体基板に固定された、本発明の分子(例えば本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、細胞標的化分子、融合タンパク質、又はポリヌクレオチド)、又はそれらのあらゆるエフェクター断片を含む。本明細書において予期される固体基板としては、これらに限定されないが、マイクロビーズ、ナノ粒子、ポリマー、マトリックス材料、マイクロアレイ、マイクロタイタープレート、又は当業界において公知のあらゆる固体表面が挙げられる(例えば米国特許第7,771,955号明細書を参照)。これらの実施形態によれば、本発明の分子は、熟練した作業者公知の技術を使用して、例えばビーズ、粒子、又はプレートなどの固体基板に共有結合で又は非共有結合で連結されていてもよい(例えばJung Y et al., Analyst 133:697-701 (2008)を参照)。本発明の固定された分子は、当業界において公知の技術を使用するスクリーニング用途に使用することができる(例えばBradbury A et al., Nat Biotechnol 29:245-54 (2011);Sutton C, Br J Pharmacol 166:457-75 (2012);Diamante L et al., Protein Eng Des Sel 26:713-24 (2013);Houlihan G et al., J Immunol Methods 405:47-56 (2014)を参照)。
ある特定の実施形態において、本発明は、それらを必要とする対象に送達するための、本発明の物質、例えば医薬組成物又は診断用組成物などの1つ又は2つ以上の組成物を含むデバイスに関する。したがって、本発明の1つ又は2つ以上の組成物を含む送達デバイスは、静脈内、皮下、筋肉内又は腹膜内注射;経口投与;経皮投与;経肺又は経粘膜投与;インプラント、浸透圧ポンプ、カートリッジ又はマイクロポンプによる投与を含む様々な送達方法によって、又は当業者によって認識されている他の手段によって、本発明の物質の組成物を患者に投与するのに使用することができる。
一般的に、本発明の目的は、例えばある特定のがん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、又は本明細書で述べられるさらなる病態などの疾患、障害、及び状態の予防及び/又は治療に使用することができる、薬理活性薬剤、加えてそれを含む組成物を提供することである。したがって、本発明は、標的化された細胞殺滅のための、標的化された細胞に追加の外因性物質を送達するための、標的化された細胞内部を標識付けするための、診断情報を収集するための、標的細胞のMHCクラスI提示経路にT細胞エピトープを送達するための、及び本明細書に記載される疾患、障害、及び状態を治療するための、本発明のポリペプチド、細胞標的化分子、及び医薬組成物を使用する方法を提供する。例えば、本発明の方法は、がん、がんの発生、腫瘍の発生、転移、及び/又は疾患の再発を予防又は治療するのに使用することができる。
[実施例]
志賀毒素ファミリーの複数の志賀毒素に由来するAサブユニットのポリペプチド配列を分析して、推定上の抗原性エピトープ及び/又は免疫原性エピトープを特定した。この実施例は、抗原性エピトープ及び免疫原性エピトープを、どのようにして志賀毒素Aサブユニット及び関連するポリペプチドにおいて特定することができるかを示す(国際公開第WO2015/113005号パンフレット、同第WO2015/113007号パンフレットも参照されたい)。計算法を使用して、様々な志賀毒素Aサブユニットにおける抗原性エピトープ及び/又は免疫原性エピトープを予測したが、これには、タンパク質構造に関する公的に入手可能なデータの利用が含まれた。免疫応答を誘起する可能性のあるB細胞エピトープ及びCD4+T細胞エピトープの両方を、コンピュータで予測した。エピトープ予測は、経験的に検証した(後述の実施例2、国際公開第WO2015/113005号パンフレット、同第WO2015/113007号パンフレットを参照されたい)。
この実施例では、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む様々な足場の作製及び試験について説明するが、これらのポリペプチドは、例えば、他の志賀毒素エフェクターポリペプチドと比べて抗原性及び/又は免疫原性の低減によって示されるように、脱免疫化されている。加えて、この実施例の志賀毒素エフェクターポリペプチドのうちの一部は、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドよりもプロテアーゼ切断耐性が高い、及び/又は組み込まれた若しくは挿入されたCD8+T細胞エピトープを含む。この実施例の志賀毒素エフェクターポリペプチドを、本発明の様々な細胞標的化分子の構成成分として試験した。
それぞれが、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域に連結された細胞標的化免疫グロブリン型結合領域を含む、脱免疫化された志賀毒素Aサブユニットエフェクターポリペプチドを作製し、細胞標的化分子の状況において試験した。
様々な脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドの酵素活性を、熟練した作業者に公知のインビトロリボソーム阻害アッセイ(TNT(登録商標)Quick Coupled Transcription/Translation Kit、Promega社、Madison、WI、U.S.)を使用して、細胞標的化分子の状況において試験した。この無細胞のインビトロタンパク質翻訳アッセイを使用して、SLT−1A−コンボ10:scFv−1(配列番号47)、SLT−1A−コンボ16::scFv−1(配列番号52)、SLT−1A−コンボ19::scFv−1(配列番号55)、SLT−1A−コンボ0::scFv−2(配列番号57)、SLT−1A−コンボ2::scFv−2(配列番号58)、SLT−1A−コンボ3::scFv−2(配列番号59)、SLT−1A−コンボ4::scFv−2(配列番号60)、及びSLT−1A−コンボ13::scFv−2(配列番号62)のリボソーム不活性化能力を判定した。
細胞毒性の効力及び特異性を、様々な細胞標的化分子を構成する足場としての本発明の脱免疫化された組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドSLT−1A−コンボ(n)に関して試験した。脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドSLT−1A−コンボ(n)を含む例示的な細胞標的化分子の細胞毒性活性を、熟練した作業者に公知の標的生体分子陽性細胞殺滅アッセイを使用して判定した。この標的陽性細胞殺滅アッセイを使用して、それぞれが、配列番号43〜81の細胞標的化分子を形成するように組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドSLTA−1A−コンボ(n)(配列番号6〜32)のうちの1つに遺伝子融合させた細胞標的化結合領域scFv−(n)を含む、様々な細胞標的化分子の細胞毒性活性を判定した(そのような分子の代表的なサブセットについては表8を参照されたい)。
アポトーシスは、カスパーゼによる細胞成分の分解を伴うプログラム細胞死である。アポトーシスは、エフェクターカスパーゼ3及び7の活性、例えば、カスパーゼ3又はカスパーゼ7のいずれかの活性状態などを監視することによって、検出することができる。本発明の脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドSLT−1A−コンボ(n)を含む例示的な細胞標的化分子のカスパーゼ活性化を、熟練した作業者に公知の標的生体分子陽性細胞のカスパーゼ活性アッセイを使用して、判定した。標的陽性細胞のカスパーゼ活性アッセイの方法は、上述の標的陽性細胞殺滅アッセイに類似している。
この実施例では、志賀毒素Aサブユニットエフェクターポリペプチドを、ある特定の短縮化及びアミノ酸残基置換の組合せにより脱免疫化することができることを示す。欠失及び/又はアミノ酸置換を、表12に列挙した志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来する志賀毒素エフェクターポリペプチドの推定上のB細胞エピトープ及び/又はT細胞エピトープに行った。この実施例及び国際公開第WO2015/113005号パンフレットでは、多数の変異が、様々な志賀毒素エフェクターポリペプチド及び細胞標的化分子の志賀毒素エフェクター機能に対する効果に関して、経験的に試験されている。表12に、この実施例及び国際公開第WO2015/113005号パンフレットに記載の結果を要約するが、この結果では、アミノ酸置換又はアミノ酸置換の組合せは、強力なレベルの志賀毒素エフェクター機能を呈することを防止しなかった。表12は、実施例1に記載されているエピトープ領域番号付けスキームを使用し(上記の表7を参照されたい)、BcePredソフトウェアによって予測されたB細胞エピトープにおける任意の変化を列挙する。
慣例的な方法を使用して、細胞標的化分子の状況において、志賀毒素エフェクターポリペプチドの相対的な抗原性を評価することができる(例えば、国際公開第WO2015/113005号パンフレット、同第WO2015/113007号パンフレットを参照されたい)。ある特定の脱免疫化されたプロテアーゼ切断耐性組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドSLT−1A−コンボ(n)を含む例示的な細胞標的化分子の抗原性を、野生型志賀様毒素A1断片(SLT−1A1)に高親和性で結合するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を使用して、ウエスタンブロット及びELISAによって評価した。細胞標的化分子SLT−1A−FR::scFv−1(配列番号34)を、参照分子として使用した。
予測されたCD4+T細胞エピトープ領域における破壊を、外部から投与したポリペプチドの存在下におけるヒトCD4+T細胞増殖のアッセイ、及び投与したポリペプチドにより処置したヒト単球の存在下におけるヒトCD4+樹状T細胞刺激のアッセイを使用して、CD4+T細胞免疫原性の低減に関して試験する。
本発明の分子の相対的なCD4+T細胞免疫原性を、以下の樹状細胞(DC、dendritic cell)T細胞増殖アッセイを使用して判定する。このDC T細胞アッセイは、外部から投与したポリペプチド又はタンパク質に対するCD4+T細胞の応答を測定する。ProImmune社のDC−Tアッセイサービスを使用してDC T細胞アッセイを行って、タンパク質と本発明の細胞標的化分子との間でCD4+T細胞による免疫原性の相対レベルを、参照分子と比較して判定する。この実施例のDC T細胞アッセイは、投与したポリペプチド、タンパク質、又は細胞標的化分子試料に由来するペプチドの抗原提示に関して、ヒト樹状細胞を試験することを伴う。
マウスを使用して、本発明のある特定の例示的な分子の免疫原性能を調査した。何週間もの期間にわたる反復的な非経口投与後に、細胞標的化分子に対するインビボでの抗体応答に関するアッセイを使用して、例示的な細胞標的化分子の相対的な免疫原性を判定した(例えば、国際公開第WO2015/113005号パンフレットを参照されたい)。溶液中でのELISAを使用して、異なる細胞標的化分子に特異的であった血清マウス抗体の相対量を判定した。この免疫原性アッセイは、一般的に哺乳動物における分子の相対的な免疫原性を示すマウスの使用を伴う。
MHCクラスI系によるT細胞エピトープの提示は、CTL媒介性溶解による殺滅の標的を提示細胞に定め、局所領域において免疫刺激を引き起こす。異種免疫原性エピトープを含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子を改変することにより、免疫刺激性抗原の標的化された送達及び提示を達成することができる。標的細胞による免疫刺激性非自己抗原、例えば、高い免疫原性を有する既知のウイルス抗原などの提示により、標的細胞を破壊するように、並びに生体内のその領域により多くの免疫細胞を動員するように、他の免疫細胞へシグナル伝達が行われる。
当該技術分野で公知の慣例的なアッセイを使用して、本発明の例示的な分子がT細胞エピトープをMHCクラスI分子に送達する能力を調査する(例えば、国際公開第WO2015/113007号パンフレットを参照されたい)。具体的には、フローサイトメトリー法を使用して、標的細胞の表面上でMHCクラスI分子と複合体を形成するT細胞エピトープ−ペプチド(志賀毒素エフェクターポリペプチドに挿入されている又は組み込まれている)の送達及び細胞外提示を実証する。このフローサイトメトリー法は、それぞれが異なるエピトープ−ヒトHLA複合体に高親和性で結合する可溶性ヒトT細胞受容体(TCR、T-cell receptor)多量体試薬(Soluble T-Cell Antigen Receptor STAR(商標)Multimer、Altor Bioscience社、Miramar、FL、U.S.)を利用する。
当該技術分野で公知の慣例的なアッセイを使用して、本発明の例示的な細胞標的化分子によって送達されたT細胞エピトープの標的細胞のMHCクラスIによる提示の機能的結果を調査する(例えば、国際公開第WO2015/113007号パンフレットを参照されたい)。調査する機能的結果には、CTL活性化、CTL媒介性標的細胞殺滅、及びCTLによるサイトカイン放出が含まれる。
複数のB細胞エピトープ領域破壊を有する組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む例示的な細胞標的化分子は、参照分子と比較して、抗原性及び免疫原性の両方の低減によって示されるように、脱免疫化されていた。加えて、この実施例は、複数のB細胞エピトープ領域破壊、フーリン切断モチーフ破壊、及び/又は組み込まれたT細胞エピトープを含む組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチドを含むある特定の脱免疫化された細胞標的化分子が、1又は2以上の志賀毒素エフェクター機能、例えば、触媒性リボソーム阻害、細胞内経路決定、及び細胞毒性などを有意なレベルで保持することを示す。
フーリン切断耐性志賀毒素Aサブユニットエフェクターポリペプチドを作製し、細胞標的化分子の成分として試験したが、ここで、各細胞標的化分子は、細胞標的化免疫グロブリン型結合領域を含んでいた。改変により志賀毒素エフェクターポリペプチドにプロテアーゼ耐性をもたらすために、実施例2に記載のように、R248A及びR251Aの2つのアミノ酸残基置換を志賀毒素エフェクターポリペプチドに導入した。志賀毒素エフェクターポリペプチドSLT−1A−FR(配列番号5)を使用して、細胞標的化分子SLT−1A−FR::scFv−9(配列番号41)を作製した。
細胞標的化分子SLT−1A−FR::scFv−9(配列番号41)を、インビトロフーリン切断アッセイを使用して試験して、フーリン切断を、熟練した作業者に公知の方法を使用して野生型対照と比較して定量化した(例えば、国際公開第WO2015/191764号パンフレットを参照されたい)。フーリンがSLT−1A−FR::scFv−9を切断する能力を評価するために、リン酸緩衝食塩水(PBS)中の精製したタンパク質試料を、フーリン(New England Biolabs社、Ipswich、MA、U.S.)とともに、フーリン切断緩衝液(100ミリモル(mM、millimolar)のHEPES(4−(2−ヒドロキシメチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸)、pH7、1mM CaCl2)中において試料タンパク質1マイクログラム(μg、microgram)当たり0.5フーリン活性単位(U)で、30℃で30時間インキュベートした。対照試料は、フーリンなしで、同じ緩衝液中において4℃又は30℃でインキュベートした。様々な細胞標的化分子試料を、変性条件下においてSDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動させ、クーマシーで染色した(図17)。
様々な投薬量の細胞標的化分子試料で顕著な副作用が検出された程度を判定するために、マウスを使用して、本発明の例示的な細胞標的化分子のインビボ忍容性を試験する。忍容性研究は、熟練した作業者に公知の及び/又は本明細書に記載される方法を使用して行う(例えば、国際公開第WO2015/191764号パンフレットを参照されたい)。例えば、マウスに、細胞標的化分子試料又はビヒクル対照を、1回の注射につき体重1キログラム当たり0.25〜5.00ミリグラム(mg/kg/注射)の用量で、数週間にわたって週3回注射する。インビボ忍容性を評価するために、注射したマウスを、健康状態及び臨床徴候、例えば、罹患状態、瀕死状態(morbundity)、体重、身体的な見た目、測定可能な臨床徴候、理由のない行動(unprovoked behavior)、及び外部刺激に対する応答などの変化を監視する(例えば、Morton D, Griffiths P, Vet Rec 116: 431-43 (1985)、Montgomery C, Cancer Bull 42: 230-7 (1990)、Ullman-Cullere M, Foltz C, Lab Anim Sc 49: 319-23 (1999)、Clingerman K, Summers L, J Am Assoc Lab Anim Sci 51: 31-6 (2012)を参照されたい)。罹患状態及び/又は瀕死状態の兆候に応じて、安楽死を使用してもよく、その場合、死亡時点が作成され得る。例えば、2〜3日以内に15〜20%の体重の減少は、げっ歯類における罹患の兆候、及び安楽死の正当な理由として使用することができる(例えば、Institute of Laboratory Animal Research 2011. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed., Washington, DC, U.S.: National Academies Pressを参照されたい)。
動物モデルを使用して、例示的な志賀毒素エフェクターポリペプチドコンボ(n)及び前述のものを含む細胞標的化分子の標的陽性新生物細胞に対するインビボでの効果を判定する。様々なマウス株を使用して、マウスにおける異種移植片腫瘍に対する細胞標的化分子の効果を、これらのマウスに各分子を静脈内投与した後に、試験する。ある特定の実験では、ヒト腫瘍の播種性異種移植片モデルを使用して、ヒト腫瘍保持マウスにおける本発明の例示的な細胞標的化分子のインビボでの効果を判定する。ルシフェラーゼを構成的に発現し、適切なscFv−(n)の標的の細胞表面発現を示す、ヒト腫瘍細胞を、この異種移植片モデルにおいて使用する。熟練した作業者に公知の方法を使用して、本発明の分子の標的化細胞毒性を試験する(例えば、国際公開第WO2014/164680号パンフレット、同第WO2014/164693号パンフレット、同第WO2015/191764号パンフレットを参照されたい)。本発明のある特定の細胞標的化分子は、ヒト腫瘍細胞でチャレンジしたマウスにおいて、ヒト腫瘍量を有意に低減させることができる。
「SLT−1A−コンボ7::αCD38−scFv−1」タンパク質(配列番号82)の細胞外ヒトCD38標的への結合の特徴を、蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイによって判定した。CD38陽性(CD38+)細胞(細胞株A又はFのいずれかの)を含む試料を、1パーセントのウシ血清アルブミン(BSA、bovine serum albumin)(Calbiochem社、San Diego、CA、U.S.)を含有する1倍PBS(以降、「1倍PBS+1%BSA」と称する)中に懸濁させ、SLT−1A−コンボ7::αCD38−scFv−1の様々な希釈物100μLとともに、4℃で1時間インキュベートした。結合の可能性をすべて飽和させるために、このアッセイで試験した最も高い濃度のSLT−1A−コンボ7::αCD38−scFv−1を選択した。CD38陰性(CD38−)細胞(細胞株H及びIの)を、このアッセイにおいて標的陽性細胞に対して試験した最も高い濃度のSLT−1A−コンボ7::αCD38−scFv−1で処置した。1時間のインキュベーションの後、細胞試料を、1倍PBS+1%BSAで2回洗浄した。細胞試料を、α−SLT−1A pAb1を含有する1倍PBS+1%BSA100μLとともに4℃で1時間インキュベートした後、再び洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート(FITC、fluorescein isothiocyanate)にコンジュゲートした抗ウサギ二次抗体を含有する1倍PBS+1%BSA溶液100μLとともに4℃で1時間インキュベートした。
この実施例では、上述の志賀毒素エフェクターポリペプチドSLT−1A−コンボ0〜26のうちのいずれか1つを、ヒトHER2上の細胞外抗原に特異的かつ高親和性で結合する、米国特許出願公開第2011/59,090号パンフレットに記載されるラクダ抗体5F7の単一ドメイン可変領域(αHER2−VHH)などの免疫グロブリン結合領域抗HER2に作動可能に連結させて、本発明の例示的な細胞標的化分子を形成する。
ある特定の実施形態については、免疫グロブリン由来の結合領域αHER2−VHH及び志賀毒素エフェクターポリペプチドを、一緒に融合して、単一の連続的なポリペプチド「SLT−1A−コンボ(n)::αHER2−VHH」を形成する。この実施例では、免疫グロブリン5F7に由来するVHH可変ドメインを含む結合領域であるαHER2−VHHをコードするポリヌクレオチドを、当該技術分野で公知のリンカーをコードするポリヌクレオチドとインフレームでクローニングし、志賀毒素エフェクターポリペプチドSLT−1A−コンボ(n)をコードするポリヌクレオチドとインフレームでクローニングする。熟練した作業者に公知の及び/又は前述の実施例に記載される細菌及び/又は無細胞のタンパク質翻訳系を使用して、細胞標的化分子SLT−1A−コンボ(n)::αHER2−VHHの発現を達成する。
この実施例の細胞標的化分子のHER2+細胞及びHER2−細胞に対する結合特徴を、蛍光に基づくフローサイトメトリーによって判定する。HER2+細胞に対するSLT−1A−コンボ(n)::αHER2−VHHのBmaxを測定すると、およそ50,000〜200,000MFIであり、KDは0.01〜100nMの範囲内であるが、このアッセイにおいてHER2−細胞に対する有意な結合は存在しない。
SLT−1A−コンボ(n)::αHER2−VHHの細胞毒性の特徴を、前述の実施例に記載のように、HER2+細胞を使用して、一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。加えて、SLT−1A−コンボ(n)::αHER2−VHHの選択的細胞毒性の特徴を、HER2−細胞を使用して、HER2+細胞との比較として、同じ一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。この実施例の細胞標的化分子のCD50は、細胞株に応じて、HER2+ではおよそ0.01〜100nMである。SLT−1A−コンボ(n)::αHER2−VHHのCD50は、細胞表面上にHER2を発現する細胞と比較して、細胞表面上にHER2を発現しない細胞では、およそ10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。加えて、SLT−1A−コンボ(n)::αHER2−VHHの細胞毒性を、熟練した作業者に公知の及び/又は本明細書に記載されるアッセイを使用して、直接的な細胞毒性、並びにT細胞エピトープ送達及びCTL媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性の両方に関して調査する。
動物モデルを使用して、新生物細胞に対する細胞標的化分子SLT−1A−コンボ(n)::αHER2−VHHのインビボでの効果を判定する。様々なマウス株を使用して、HER2を細胞表面上に発現するヒト新生物細胞をマウスに注射することにより得られるマウスの異種移植片腫瘍への静脈内投与後の、SLT−1A−コンボ(n)::αHER2−VHHの効果を試験する。細胞殺滅を、熟練した作業者に公知の及び/又は本明細書に記載されるアッセイを使用して、直接的な細胞毒性、並びにT細胞エピトープ送達及びCTL媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性の両方に関して調査する。
この実施例では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、上述のように、フーリン切断耐性を付与するアミノ酸残基置換、例えば、R248A/R251Aなどを有していてもよい志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来する(上述の実施例3を参照されたい)。ヒトCD8+T細胞エピトープ−ペプチドを、MHC I分子結合予測、HLA型、既に特徴付けられている免疫原性、及び上述のような容易に入手可能な試薬、例えば、エピトープGVMTRGRLK(配列番号560)に基づいて選択する。結合領域は、ヒトインターロイキン2受容体(IL−2R)のリガンド(サイトカインインターロイキン2又はIL−2)に由来し、これは、ヒトIL−2Rの細胞外部分に特異的に結合することができる。IL−2Rは、T細胞及びナチュラルキラー細胞などの様々な免疫細胞型によって発現される細胞表面受容体である。
リガンド型結合領域αIL−2R、志賀毒素エフェクターポリペプチド、及びT細胞エピトープを、一緒に連結させて、単一の連続的なポリペプチド、例えば「Tエピトープ::SLT−1A::IL−2」又は「IL−2::Tエピトープ::SLT−1A」を形成し、KDELを、得られたポリペプチドのカルボキシ末端に付加してもよい。例えば、融合タンパク質は、Tエピトープ::SLT−1A::IL−2及びIL−2::Tエピトープ::SLT−1Aをコードするポリヌクレオチドから発現させることにより産生される。Tエピトープ::SLT−1A::IL−2又はIL−2::Tエピトープ::SLT−1A細胞標的化分子の発現は、前述の実施例に記載のように、細菌及び/又は無細胞のタンパク質翻訳系のいずれかを使用して達成される。
IL−2R陽性細胞及びIL−2R陰性細胞に対するこの実施例の細胞標的化分子の結合特徴を、蛍光に基づくフローサイトメトリーによって判定する。IL−2R陽性細胞に対するTエピトープ::SLT−1A::IL−2及びIL−2::Tエピトープ::SLT−1Aの両方のBmaxを測定すると、およそ50,000〜200,000MFIであり、KDは、0.01〜100nMの範囲内であるが、このアッセイにおいてIL−2R陰性細胞に対する有意な結合は存在しない。
Tエピトープ::SLT−1A::IL−2又はIL−2::Tエピトープ::SLT−1Aの細胞毒性の特徴を、前述の実施例に記載のように、IL−2R陽性細胞を使用して、一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。加えて、Tエピトープ::SLT−1A::IL−2又はIL−2::Tエピトープ::SLT−1Aの選択的細胞毒性の特徴を、IL−2R陰性細胞を使用して、IL−2R陽性細胞との比較として、同じ一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。この実施例の細胞標的化分子のCD50は、細胞株に応じて、IL−2R陽性細胞ではおよそ0.01〜100nMである。Tエピトープ::SLT−1A::IL−2又はIL−2::Tエピトープ::SLT−1AのCD50は、細胞表面上にIL−2Rを発現する細胞と比較して、細胞表面上にIL−2Rを発現しない細胞では、およそ10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。加えて、Tエピトープ::SLT−1A::IL−2又はIL−2::Tエピトープ::SLT−1Aの細胞毒性を、熟練した作業者に公知の及び/又は本明細書に記載されるアッセイを使用して、直接的な細胞毒性、並びにT細胞エピトープ送達及びCTL媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性の両方に関して調査する。
動物モデルを使用して、新生物細胞に対する細胞標的化分子Tエピトープ::SLT−1A::IL−2及びIL−2::Tエピトープ::SLT−1Aのインビボでの効果を判定する。様々なマウス株を使用して、IL−2Rを細胞表面上に発現するヒト新生物細胞をマウスに注射することにより得られるマウスの異種移植片腫瘍への静脈内投与後の、Tエピトープ::SLT−1A::IL−2及びIL−2::Tエピトープ::SLT−1Aの効果を試験する。細胞殺滅を、熟練した作業者に公知の及び/又は本明細書に記載されるアッセイを使用して、直接的な細胞毒性、並びにT細胞エピトープ送達及びCTL媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性の両方に関して調査する。
この実施例では、志賀毒素エフェクターポリペプチドSLT−1A−コンボ(n)を、上述のように、ヒト癌胎児性抗原(CEA、carcinoembryonic antigen)上の細胞外抗原に特異的かつ高親和性で結合する、免疫グロブリン型結合領域抗CEA(Fn3)結合領域、例えば、Pirie C et al., J Biol Chem 286: 4165-72 (2011)に記載されるような第10ヒトフィブロネクチンIII型ドメインに由来する結合領域C743に作動可能に連結させて、本発明の例示的な細胞標的化分子を形成する。加えて、免疫原性性CD8+T細胞エピトープを、この実施例の志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端に融合させて、エピトープ−SLT−1A−コンボ(n)を形成する。
ある特定の実施形態については、免疫グロブリン型結合領域αCEA−(Fn3)及び志賀毒素エフェクターポリペプチドを一緒に融合して、単一の連続的なポリペプチド「エピトープ−SLT−1A−コンボ(n)と融合したαCEA−(Fn3)」を形成する。この実施例では、融合タンパク質「エピトープ−SLT−1A−コンボ(n)と融合したαCEA−(Fn3)」を設計し、前述の実施例に記載のように産生した。
CEA+細胞及びCEA−細胞に対するこの実施例の細胞標的化分子の結合特徴を、蛍光に基づくフローサイトメトリーによって判定する。CEA+細胞に対するエピトープ−SLT−1A−コンボ(n)と融合したαCEA−(Fn3)のBmaxを測定すると、およそ50,000〜200,000MFIであり、KDは、0.01〜100nMの範囲内であるが、このアッセイにおいてCEA−細胞に対する有意な結合は存在しない。
エピトープ−SLT−1A−コンボ(n)と融合したαCEA−(Fn3)の細胞毒性の特徴を、前述の実施例に記載のように、一般的な細胞殺滅アッセイによって、CEA+細胞を使用して判定する。加えて、エピトープ−SLT−1A−コンボ(n)と融合したαCEA−(Fn3)の選択的細胞毒性の特徴を、CEA−細胞を使用して、CEA+細胞との比較として、同じ一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。この実施例の細胞標的化分子のCD50は、細胞株に応じて、CEA+細胞ではおよそ0.01〜100nMである。エピトープ−SLT−1A−コンボ(n)と融合したαCEA−(Fn3)のCD50は、細胞表面上にCEAを発現する細胞と比較して、細胞表面上にCEAを発現しない細胞では、およそ10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。加えて、エピトープ−SLT−1A−コンボ(n)と融合したαCEA−(Fn3)の細胞毒性を、熟練した作業者に公知の及び/又は本明細書に記載されるアッセイを使用して、直接的な細胞毒性、並びにT細胞エピトープ送達及びCTL媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性の両方に関して調査する。
動物モデルを使用して、新生物細胞に対する、エピトープ−SLT−1A−コンボ(n)と融合した細胞標的化分子αCEA−(Fn3)のインビボでの効果を判定する。様々なマウス株を使用して、CEAを細胞表面上に発現するヒト新生物細胞をマウスに注射することにより得られるマウスの異種移植片腫瘍への静脈内投与後の、エピトープ−SLT−1A−コンボ(n)と融合したαCEA−(Fn3)の効果を試験する。細胞殺滅を、熟練した作業者に公知の及び/又は本明細書に記載されるアッセイを使用して、直接的な細胞毒性、並びにT細胞エピトープ送達及びCTL媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性の両方に関して調査する。
この実施例では、志賀毒素エフェクターポリペプチドSLT−1A−コンボ0〜26のうちのいずれかを、上述のように、蠕虫抗原を標的とする免疫グロブリン型結合領域に作動可能に連結させる。免疫グロブリン型結合領域α腸蠕虫抗原は、当該技術分野で公知の技法を使用して生成された、ヒトトランスフェリン受容体の蠕虫オルソログに対する抗体に由来する(例えば、線虫遺伝子gcp−2.1 UniProt G8JYE4_CAEEL、Rosa B et al., Mol Cell Proteomics M114.046227 (2015)を参照されたい)。
免疫グロブリン型結合領域α腸蠕虫抗原、及びプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクター領域であってもよい志賀毒素エフェクター領域を、一緒に連結して、免疫グロブリン型結合領域が、志賀毒素エフェクター領域と比較して、タンパク質のアミノ末端に対して近位に位置していない、タンパク質を形成する。例えば、融合タンパク質は、アミノ末端のSLT−1A−コンボ0〜26に融合したα腸蠕虫抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。SLT−1A−コンボ(n)::α腸蠕虫抗原結合タンパク質の発現は、前述の実施例に記載のように、細菌及び/又は無細胞のタンパク質翻訳系のいずれかを使用して達成する。
この実施例の細胞毒性細胞標的化分子の結合特徴を、精製した組換え標的タンパク質を使用して、当該技術分野で公知の分子結合アッセイによって判定する。標的タンパク質に対するSLT−1A::α腸蠕虫抗原及び/又はSLT−1A−FR::α腸蠕虫抗原のKDを測定すると、およそ100nMであるが、このアッセイにおいて、陰性対照タンパク質(例えば、精製された組換えのヒトトランスフェリン受容体の蠕虫オルソログ)に対する有意な結合は存在しない。
蠕虫に対するSLT−1A::α腸蠕虫抗原の毒性を、蠕虫モデルを使用して判定する(例えば、Iatsenko I et al., Toxins 2050-63 (2014)を参照されたい)。蠕虫を、浸漬によって、精製したSLT−1A::α腸蠕虫抗原に投与してもよく、又は代替として、SLT−1A::α腸蠕虫抗原融合タンパク質を発現する細菌を蠕虫に与えることによって投与してもよい。
この実施例では、志賀毒素エフェクターポリペプチドSLT−1A−コンボ0〜26のいずれか1つを、上述のように、HIVキャプシドタンパク質HIV−1 Gagポリタンパク質を認識する免疫グロブリン型ドメインに由来し(例えば、Nagola S et al., Retrovirology 9: 17 (2012)を参照されたい)、Gagの細胞外部分に結合することができる人工的なアンキリンドメイン反復ポリペプチドを含む、免疫グロブリン型結合領域αGag抗原に作動可能に連結させる。Gagは、HIVウイルスのアセンブリに関与する主要な構造タンパク質であり、オリゴマー化して、1ビリオン当たり700〜5000個のコピーの格子となり、円錐形のCAコアを形成する(例えば、Chen Y et al., Biophys J 96: 1961-9 (2009)、Pornillos O et al., Nature 469: 424-7 (2011)を参照されたい)。
免疫グロブリン型結合領域αGag及び志賀毒素エフェクターポリペプチドSLT−1A−コンボ(n)を融合して、細胞毒性タンパク質を形成する。例えば、融合タンパク質は、αGag−抗原結合タンパク質SLT−1A−コンボ(n)::αGagをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生する。SLT−1A−コンボ(n)::αGag細胞毒性タンパク質の発現は、前述の実施例に記載のように、細菌及び/又は無細胞のタンパク質翻訳系のいずれかを使用して達成する。
精製した組換えHIV−1 Gagに対するこの実施例の細胞毒性タンパク質の結合特徴を、酵素結合免疫吸着アッセイなどの当該技術分野で公知のアッセイによって判定する。Gagに対するSLT−1A−コンボ(n)::αGagの結合のKDを測定すると、およそ0.01〜100ナノモル(nM)の範囲内である。
SLT−1A−コンボ(n)::αGagの細胞毒性特徴を、前述の実施例に記載のように、HIV感染ヒトT細胞を使用して、上述の一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。加えて、SLT−1A−コンボ(n)::αGagの選択的細胞毒性の特徴を、未感染のT細胞を使用して、感染したT細胞との比較として、同じ一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。この実施例の細胞毒性タンパク質のCD50は、活発に複製しているウイルスを有する感染したT細胞ではおよそ0.01〜100nMである。細胞毒性タンパク質のCD50は、未感染のT細胞ではおよそ10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。
HIV感染の進行を阻害するためのSLT−1A−コンボ(n)::αGagの使用を、SLT−1A−コンボ(n)::αGagをサル免疫不全ウイルス(SIV)に感染した非ヒト霊長動物に投与することにより試験する(Sellier P et al., PLoS One 5: e10570 (2010)を参照されたい)。
この実施例では、志賀毒素エフェクターポリペプチドSLT−1A−コンボ0〜26のうちのいずれか1つを、上述のように、免疫グロブリン型結合領域αヒストプラズマ抗原に作動可能に連結させるが、これは、ヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)表面抗原に対する既知の抗体又は当該技術分野で公知の技法を使用して生成した抗体に由来する(例えば、ヒストプラズマ・カプスラーツムH抗原(Deepe G, Durose G, Infect Immun 63: 3151-7 (1995))及びmAb H1C(Lopes L et al., Clin Vaccine Immunol 17: 1155-8 (2010)、ヒストプラズマ・カプスラーツム細胞表面ヒストン様タンパク質H2B(Nosanchuk J et al., J Clin Invest 112: 1164-1175 (2003))を参照されたい)。
免疫グロブリン型結合領域α腸蠕虫抗原、及びプロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクター領域であってもよい志賀毒素エフェクターポリペプチドを一緒に連結して、免疫グロブリン型結合領域が、志賀毒素エフェクターポリペプチドと比較して、タンパク質のアミノ末端に対して近位に位置していない、タンパク質を形成する。例えば、融合タンパク質は、アミノ末端のSLT−1A−コンボ(n)に融合したヒストプラズマ表面抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。SLT−1A−コンボ(n)::αヒストプラズマ抗原結合タンパク質の発現は、前述の実施例に記載のように、細菌及び/又は無細胞のタンパク質翻訳系のいずれかを使用して達成する。
この実施例の細胞毒性細胞標的化分子の結合特徴を、精製した組換え標的タンパク質を使用して、当該技術分野で公知の分子結合アッセイによって判定する。標的タンパク質(例えば、精製した組換えヒストプラズマ・カプスラーツム表面抗原)に対するSLT−1A−コンボ(n)::αヒストプラズマ抗原のKDを測定すると、およそ100nMであるが、このアッセイにおいて、陰性対照タンパク質への有意な結合は存在しない。
真菌細胞に対するSLT−1A−コンボ(n)::αヒストプラズマ抗原の殺真菌活性を判定する。殺真菌活性を測定するために、精製したStxA::αヒストプラズマ抗原及び/又はStxA−FR::αヒストプラズマ抗原を、真菌培養物に直接投与する(例えば、 Li R et al., Antimicrob Agents Chemother 44: 1734-6 (2000)を参照されたい)。加えて、真菌(例えば、ヒストプラズマ・カプスラーツム)に感染した実験室動物並びに/又はヒストプラズマ症、全身性心筋症、及び/若しくは他のヒストプラズマ・カプスラーツム関連疾患を呈する実験室動物に、SLT−1A−コンボ(n)::αヒストプラズマ抗原を投与し、真菌病原体及び/又は真菌感染の関連症状の低減又は除去に関して監視する(例えば、Kobayashi G et al., Antimicrob Agents Chemother 34: 524-8 (1990)を参照されたい)。
この実施例では、志賀毒素エフェクター領域は、次の:1)脱免疫化、2)プロテアーゼ切断耐性、及び/又は3)組み込まれた若しくは挿入された異種T細胞エピトープのうちの2又は3以上を提供するような本明細書に記載される部分領域の組合せを含むような、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)、志賀毒素のAサブユニット(StxA)、及び/又は志賀様毒素2のAサブユニット(SLT−2A)に由来する。結合領域は、表21の列1から選択される分子に由来し、これは、表21の列2に示される細胞外標的生体分子に結合する。得られた組合せ型志賀毒素エフェクターポリペプチド及び結合領域を一緒に融合して、様々な一本鎖ポリペプチドを形成する。この実施例の例示的なタンパク質は、当該技術分野で公知の技法を使用してカルボキシ末端KDEL型シグナルモチーフを有して作製されていてもよく、検出促進剤などの追加の外来性材料に連結されていてもよい。この実施例の例示的なタンパク質を、前述の実施例に記載のように、適切な細胞外標的生体分子を発現する細胞を使用して試験する。この実施例の例示的なタンパク質は、例えば、標的細胞の細胞内区画を標識し、表21の列3に示される疾患、状態、及び/又は障害を診断及び治療するために使用され得る。
この実施例では、志賀毒素エフェクターポリペプチドSLT−1A−コンボ0〜26のうちのいずれか1つを、上述のように、蠕虫抗原を標的とする免疫グロブリン型結合領域に作動可能に連結させる。免疫グロブリン型結合領域α腸蠕虫抗原は、当該技術分野で公知の技法を使用して生成された、ヒトトランスフェリン受容体の蠕虫オルソログに対する抗体に由来する(例えば、線虫遺伝子gcp−2.1 UniProt G8JYE4_CAEEL、Rosa B et al., Mol Cell Proteomics M114.046227 (2015)を参照されたい)。
Claims (51)
- i)組み込まれた又は挿入された異種CD8+T細胞エピトープ、並びに
ii)前記組み込まれた又は挿入された異種CD8+T細胞エピトープとオーバーラップしない少なくとも1つの内因性B細胞及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域の破壊
を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドであって、
志賀毒素エフェクター機能を示すことができる、前記志賀毒素エフェクターポリペプチド。 - 破壊が、配列番号1又は配列番号2の1〜15;配列番号3の3〜14;配列番号3の26〜37;配列番号1又は配列番号2の27〜37;配列番号1又は配列番号2の39〜48;配列番号3の42〜48;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の53〜66;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の94〜115;配列番号1又は配列番号2の141〜153;配列番号3の140〜156;配列番号1又は配列番号2の179〜190;配列番号3の179〜191;配列番号3の204;配列番号1又は配列番号2の205、及び配列番号3の210〜218;配列番号3の240〜260;配列番号1又は配列番号2の243〜257;配列番号1又は配列番号2の254〜268;配列番号3の262〜278;配列番号3の281〜297;配列番号1又は配列番号2の285〜293;配列番号1又は配列番号2の4〜33;配列番号1又は配列番号2の34〜78;配列番号1又は配列番号2の77〜103;配列番号1又は配列番号2の128〜168;配列番号1又は配列番号2の160〜183;配列番号1又は配列番号2の236〜258;及び配列番号1又は配列番号2の274〜293からなる天然に位置する志賀毒素Aサブユニット領域の群から選択されるB細胞及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域中の、野生型志賀毒素Aサブユニットに対する変異を含む、請求項1に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
- 組み込まれた又は挿入された異種CD8+T細胞エピトープが、配列番号1又は配列番号2の1〜15;配列番号3の3〜14;配列番号3の26〜37;配列番号1又は配列番号2の27〜37;配列番号1又は配列番号2の39〜48;配列番号3の42〜48;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の53〜66;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の94〜115;配列番号1又は配列番号2の141〜153;配列番号3の140〜156;配列番号1又は配列番号2の179〜190;配列番号3の179〜191;配列番号3の204;配列番号1又は配列番号2の205、及び配列番号3の210〜218;配列番号3の240〜260;配列番号1又は配列番号2の243〜257;配列番号1又は配列番号2の254〜268;配列番号3の262〜278;配列番号3の281〜297;配列番号1又は配列番号2の285〜293;配列番号1又は配列番号2の4〜33;配列番号1又は配列番号2の34〜78;配列番号1又は配列番号2の77〜103;配列番号1又は配列番号2の128〜168;配列番号1又は配列番号2の160〜183;配列番号1又は配列番号2の236〜258;及び配列番号1又は配列番号2の274〜293からなる天然に位置する志賀毒素Aサブユニット領域の群から選択される内因性B細胞エピトープ及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域を破壊する、請求項1又は2に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
- 少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ以上の内因性B細胞及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域の破壊を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
- 少なくとも1つの破壊が、野生型志賀毒素Aサブユニットに対するアミノ酸残基の置換を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
- 少なくとも1つの破壊が、エピトープ領域中の、野生型志賀毒素Aサブユニットに対する複数のアミノ酸残基の置換を含む、請求項1〜5のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
- 少なくとも1つの破壊が、野生型志賀毒素Aサブユニットに対する、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ以上のアミノ酸残基の置換を含み、少なくとも1つの置換が、配列番号1又は配列番号2の1;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の4;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の6;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の8;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の9;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の11;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の12;配列番号1又は配列番号2の33;配列番号1又は配列番号2の43;配列番号1又は配列番号2の44;配列番号1又は配列番号2の45;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の46;配列番号1又は配列番号2の47;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の48;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の49;配列番号1又は配列番号2の50;配列番号1又は配列番号2の51;配列番号1又は配列番号2の53;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の54;配列番号1又は配列番号2の55;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の56;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の57;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の58;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の59;配列番号1又は配列番号2の60;配列番号1又は配列番号2の61;配列番号1又は配列番号2の62;配列番号1又は配列番号2の84;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の88;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の94;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の96;配列番号1又は配列番号2の104;配列番号1又は配列番号2の105;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の107;配列番号1又は配列番号2の108;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の109;配列番号1又は配列番号2の110;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の111;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の112;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の141;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の147;配列番号1又は配列番号2の154;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の179;配列番号1又は配列番号2の180;配列番号1又は配列番号2の181;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の183;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の184;配列番号1又は配列番号2の185;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の186;配列番号1又は配列番号2の187;配列番号1又は配列番号2の188;配列番号1又は配列番号2の189;配列番号3の197;配列番号1又は配列番号2の198;配列番号3の204;配列番号1又は配列番号2の205;配列番号1又は配列番号2の247;配列番号3の247;配列番号1又は配列番号2の248;配列番号3の250;配列番号1又は配列番号2の251;配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の264;配列番号1又は配列番号2の265;及び配列番号1又は配列番号2の286からなる群から選択される、天然に位置する志賀毒素Aサブユニットのアミノ酸残基で生じていてもよい、請求項1〜6のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
- 置換の少なくとも1つが、DからA、DからG、DからV、DからL、DからI、DからF、DからS、DからQ、DからM、DからR、EからA、EからG、EからV、EからL、EからI、EからF、EからS、EからQ、EからN、EからD、EからM、EからR、FからA、FからG、FからV、FからL、FからI、GからA、GからP、HからA、HからG、HからV、HからL、HからI、HからF、HからM、IからA、IからV、IからG、IからC、KからA、KからG、KからV、KからL、KからI、KからM、KからH、LからA、LからV、LからG、LからC、NからA、NからG、NからV、NからL、NからI、NからF、PからA、PからG、PからF、RからA、RからG、RからV、RからL、RからI、RからF、RからM、RからQ、RからS、RからK、RからH、SからA、SからG、SからV、SからL、SからI、SからF、SからM、TからA、TからG、TからV、TからL、TからI、TからF、TからM、TからS、VからA、VからG、YからA、YからG、YからV、YからL、YからI、YからF、YからM、及びYからTからなる群から選択される、請求項5〜7のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
- 1つ又は2つ以上の置換が、K1からA、G、V、L、I、F、M及びH;T4からA、G、V、L、I、F、M、及びS;D6からA、G、V、L、I、F、S、Q及びR;S8からA、G、V、I、L、F、及びM;T9からA、G、V、I、L、F、M、及びS;S9からA、G、V、L、I、F、及びM;K11からA、G、V、L、I、F、M及びH;T12からA、G、V、I、L、F、M、S、及びK;S12からA、G、V、I、L、F、及びM;S33からA、G、V、L、I、F、M、及びC;S43からA、G、V、L、I、F、及びM;G44からA又はL;S45からA、G、V、L、I、F、及びM;T45からA、G、V、L、I、F、及びM;G46からA及びP;D47からA、G、V、L、I、F、S、M、及びQ;N48からA、G、V、L、M及びF;L49からA、V、C、及びG;Y49からA、G、V、L、I、F、M、及びT;F50からA、G、V、L、I、及びT;A51;D53からA、G、V、L、I、F、S、及びQ;V54からA、G、I、及びL;R55からA、G、V、L、I、F、M、Q、S、K、及びH;G56からA及びP;I57からA、G、V、及びM;L57からA、V、C、G、M、及びF;D58からA、G、V、L、I、F、S、及びQ;P59からA、G、及びF;E60からA、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M、T、及びR;E61からA、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M、及びR;G62からA;R84からA、G、V、L、I、F、M、Q、S、K、及びH;V88からA及びG;I88からA、V、C、及びG;D94からA、G、V、L、I、F、S、及びQ;S96からA、G、V、I、L、F、及びM;T104からA、G、V、L、I、F、M;及びN;A105からL;T107からA、G、V、L、I、F、M、及びP;S107からA、G、V、L、I、F、M、及びP;L108からA、V、C、及びG;S109からA、G、V、I、L、F、及びM;T109からA、G、V、I、L、F、M、及びS;G110からA;S112からA、G、V、L、I、F、及びM;D111からA、G、V、L、I、F、S、Q、及びT;S112からA、G、V、L、I、F、及びM;D141からA、G、V、L、I、F、S、及びQ;G147からA;V154からA及びG;R179からA、G、V、L、I、F、M、Q、S、K、及びH;T180からA、G、V、L、I、F、M、及びS;T181からA、G、V、L、I、F、M、及びS;D183からA、G、V、L、I、F、S、及びQ;D184からA、G、V、L、I、F、S、及びQ;L185からA、G、V及びC;S186からA、G、V、I、L、F、及びM;G187からA;R188からA、G、V、L、I、F、M、Q、S、K、及びH;S189からA、G、V、I、L、F、及びM;D198からA、G、V、L、I、F、S、及びQ;R204からA、G、V、L、I、F、M、Q、S、K、及びH;R205からA、G、V、L、I、F、M、Q、S、K及びH;S247からA、G、V、I、L、F、及びM;Y247からA、G、V、L、I、F、及びM;R248からA、G、V、L、I、F、M、Q、S、K、及びH;R250からA、G、V、L、I、F、M、Q、S、K、及びH;R251からA、G、V、L、I、F、M、Q、S、K、及びH;D264からA、G、V、L、I、F、S、及びQ;G264からA;並びにT286からA、G、V、L、I、F、M、及びSからなる、志賀毒素Aサブユニット中の天然位置の置換の群から選択される、請求項8に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
- 組み込まれた又は挿入された異種CD8+T細胞エピトープとオーバーラップしない少なくとも1つの内因性B細胞及び/又はCD4+T細胞エピトープの破壊をさらに含む配列番号355〜369のいずれか1つに示されるポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる、請求項1〜9のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
- 配列番号6〜32、340〜354、及び370〜438のいずれか1つに示されるポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる、請求項1〜10のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
- 半数阻害濃度(IC50)値が10,000ピコモーラー以下のリボソーム阻害活性を示すことができる、請求項1〜11のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
- 志賀毒素エフェクターポリペプチドの酵素活性を変化させる、志賀毒素ファミリーのメンバーの天然に存在するAサブユニットに対する1つ又は2つ以上の変異を含み、前記変異が、少なくとも1つのアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換から選択される、請求項1〜12のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
- 志賀毒素エフェクターポリペプチドの酵素活性を変化させる、天然に存在するAサブユニットに対する変異が、前記志賀毒素エフェクターポリペプチドの細胞毒性を低減又は除去する、請求項13に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
- 請求項1〜14のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチドであって、前記志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞の初期エンドソーム区画から前記細胞のMHCクラスI分子への組み込まれた又は挿入された異種CD8+T細胞エピトープの細胞内の送達が可能である、前記志賀毒素エフェクターポリペプチド。
- 請求項15に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチドであって、前記志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞の初期エンドソーム区画から前記細胞のMHCクラスI分子への組み込まれた異種CD8+T細胞エピトープの細胞内の送達に加えて、1つ又は2つ以上の志賀毒素エフェクター機能を示すことができる、前記志賀毒素エフェクターポリペプチド。
- カルボキシ末端を有する志賀毒素A1断片領域、及び
前記A1断片領域の前記カルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフ
を含む、請求項1〜16のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。 - 破壊されたフーリン切断モチーフが、野生型志賀毒素Aサブユニットに対する1つ又は2つ以上の変異を含み、前記変異が、
志賀様毒素1の前記Aサブユニット(配列番号1)若しくは志賀毒素の前記Aサブユニット(配列番号2)の248〜251に、又は
志賀様毒素2の前記Aサブユニット(配列番号3)の247〜250に
天然に位置する領域内の少なくとも1つのアミノ酸残基を変更する、請求項17に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。 - 破壊されたフーリン切断モチーフが、前記フーリン切断モチーフ中の、野生型志賀毒素Aサブユニットに対するアミノ酸残基の置換を含む、請求項17又は18に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
- フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換が、アラニン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンからなる群から選択される正電荷を有さないアミノ酸残基でのアルギニン残基の置換である、請求項19に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
- i)細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、及び
ii)請求項1〜20のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド
を含む、細胞標的化分子。 - 結合領域が、免疫グロブリン型の結合領域を含む、請求項21に記載の細胞標的化分子。
- 免疫グロブリン型の結合領域が、単一ドメイン抗体断片、一本鎖可変断片、抗体可変断片、相補性決定領域3断片、拘束FR3−CDR3−FR4ポリペプチド、Fd断片、抗原結合断片、アルマジロ反復ポリペプチド、フィブロネクチン由来第10フィブロネクチンIII型ドメイン、テネイシンIII型ドメイン、アンキリン反復モチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Aドメイン、リポカリン、クニッツドメイン、プロテインA由来Zドメイン、ガンマ−B結晶由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Sac7d由来ポリペプチド、Fyn由来SH2ドメイン、ミニタンパク質、C型レクチン様ドメイン足場、改変抗体模倣物、及び結合機能を保持する前述のもののいずれかのあらゆる遺伝子操作された対応物からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項22に記載の細胞標的化分子。
- 請求項22又は23に記載の細胞標的化分子であって、メンバーが結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している第1の細胞集団、及びメンバーが結合領域のいずれの細胞外標的生体分子とも物理的に結合していない第2の細胞集団に前記細胞標的化分子を投与することにより、前記第1の細胞集団のメンバーに対する前記細胞標的化分子の細胞毒性作用が、前記第2の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果と比較して少なくとも3倍大きい、前記細胞標的化分子。
- 志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端と会合した分子部分を含む、請求項24に記載の細胞標的化分子。
- 分子部分が、結合領域を含むか又はそれからなる、請求項25に記載の細胞標的化分子。
- 分子部分が、細胞毒性である、請求項26に記載の細胞標的化分子。
- 分子部分が、少なくとも1つのアミノ酸を含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドが、前記分子部分の少なくとも1つのアミノ酸残基に連結されている、請求項26又は27に記載の細胞標的化分子。
- 分子部分及び志賀毒素エフェクターポリペプチドが融合されて、連続的なポリペプチドを形成している、請求項28に記載の細胞標的化分子。
- 結合領域が、CD20、CD22、CD40、CD74、CD79、CD25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前立腺特異的膜抗原、Cripto、CDCP1、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、ルイス−Y、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、CD133、CEA、gpA33、ムチン、TAG−72、チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通型受容体、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合タンパク質、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、ガングリオシドルイス−Y2、VEGFR、アルファVベータ3、アルファ5ベータ1、ErbB1/EGFR、Erb3、c−MET、IGF1R、EphA3、TRAIL−R1、TRAIL−R2、RANK、FAP、テネイシン、CD64、メソテリン、BRCA1、MART−1/メランA、gp100、チロシナーゼ、TRP−1、TRP−2、MAGE−1、MAGE−3、GAGE−1/2、BAGE、RAGE、NY−ESO−1、CDK−4、ベータ−カテニン、MUM−1、カスパーゼ−8、KIAA0205、HPVE6、SART−1、PRAME、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパルチル(アスパラギニル)ベータ−ヒドロキシラーゼ、EphA2、HER3/ErbB−3、MUC1、MART−1/メランA、gp100、チロシナーゼ関連抗原、HPV−E7、エプスタイン−バーウイルス抗原、Bcr−Abl、アルファ−フェトプロテイン抗原、17−A1、膀胱腫瘍抗原、CD38、CD15、CD23、CD45、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305、C3AR、FceRIa、IL−1R、ガレクチン−9、mrp−14、NKG2D、PD−L1、シグレック−8、シグレック−10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT−3、ガレクチン−3、CD11a−c、GITRL、MHCクラスI分子、MHCクラスII分子、CD284、CD107−Mac3、CD195、HLA−DR、CD16/32、CD282、CD11c、及び前述のもののいずれかのあらゆる免疫原性断片からなる群から選択される細胞外標的生体分子に結合することができる、請求項21〜29のいずれかに記載の細胞標的化分子。
- 請求項21〜30のいずれかに記載の細胞標的化分子であって、野生型志賀毒素A1ポリペプチドからなる志賀毒素エフェクターポリペプチドを除いた前記細胞標的化分子からなる第2の細胞標的化分子の細胞毒性と同程度の細胞毒性を示すことができる、前記細胞標的化分子。
- 結合領域が、配列番号33、64、及び65のいずれか1つのアミノ酸1〜245;配列番号40又は配列番号80の269〜513;配列番号36、66、及び67のいずれか1つのアミノ酸269〜520又は269〜521;配列番号47〜119及び176〜248のいずれか1つのアミノ酸1〜232、1〜233、1〜234、1〜235、1〜236、1〜242、1〜243、1〜244、1〜245、1〜246、1〜252、1〜253、1〜254、1〜255、又は1〜256;配列番号37〜39、68〜79、及び81のいずれか1つのアミノ酸269〜498又は269〜499;配列番号34、35、41〜56、及び82のいずれか1つのアミノ酸269〜499、269〜512、269〜513、又は280〜510のいずれかによって表されるポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる、請求項21〜31のいずれかに記載の細胞標的化分子。
- 配列番号43〜62、64〜82、及び439〜513のいずれか1つに示されるポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる、請求項21〜32のいずれかに記載の細胞標的化分子。
- 請求項21〜33のいずれかに記載の細胞標的化分子であって、野生型志賀毒素A1ポリペプチドからなる志賀毒素エフェクターポリペプチドを除いた前記細胞標的化分子からなる第3の細胞標的化分子と比較してインビボ忍容性の改善を示すことができる、前記細胞標的化分子。
- 志賀毒素エフェクターポリペプチドが細胞毒性ではなく、分子部分が細胞毒性である、請求項34に記載の細胞標的化分子。
- 請求項1〜20のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド又は請求項21〜35のいずれかに記載の細胞標的化分子、及び少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む医薬組成物。
- 請求項21〜35のいずれかに記載の細胞標的化分子、及び
検出促進剤
を含む診断用組成物。 - 請求項1〜20のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド及び/若しくは請求項21〜35のいずれかに記載の細胞標的化分子、若しくはそれらの相補物、又は前述のもののいずれかの断片をコードすることができるポリヌクレオチド。
- 請求項38に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項38又は39に記載のポリヌクレオチド又は発現ベクターのいずれか1つを含む、宿主細胞。
- 細胞を死滅させる方法であって、
前記細胞を、請求項1〜20のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド、請求項21〜35のいずれかに記載の細胞標的化分子、又は請求項36に記載の医薬組成物と接触させるステップ
を含む、前記方法。 - T細胞エピトープを細胞のMHCクラスI分子に送達する方法であって、
前記細胞を、前記T細胞エピトープと会合する請求項1〜20のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド、前記T細胞エピトープと会合する請求項21〜35のいずれかに記載の細胞標的化分子、及び/又は上述のものを含む医薬組成物と接触させるステップ
を含む、前記方法。 - 接触させるステップがインビトロで行われる、請求項41又は42に記載の方法。
- 接触させるステップがインビボで行われる、請求項41又は42に記載の方法。
- 患者における疾患、障害、又は状態を治療する方法であって、
それを必要とする患者に、請求項1〜20のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド、請求項21〜35のいずれかに記載の細胞標的化分子、又は請求項36に記載の医薬組成物の治療有効量を投与するステップ
を含む、前記方法。 - 疾患、障害、又は状態が、がん、腫瘍、免疫障害、及び微生物感染からなる群から選択される、請求項45に記載の方法。
- 疾患、障害、又は状態が、骨がん、乳がん、中枢/末梢神経系がん、消化器がん、生殖細胞がん、腺がん、頭頸部がん、血液がん、腎臓から尿道のがん、肝臓がん、肺/胸膜がん、前立腺がん、肉腫、皮膚がん、子宮がん、アミロイド症、強直性脊椎炎、喘息、クローン病、糖尿病、移植片拒絶反応、移植片対宿主疾患、橋本甲状腺炎、溶血尿毒症症候群、HIV関連の疾患、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、多発性動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、強皮症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、及び脈管炎からなる群から選択される、請求項46に記載の方法。
- がん、腫瘍、免疫障害、又は微生物感染を治療又は予防するための、請求項1〜20のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド、及び/又は請求項21〜35のいずれかに記載の細胞標的化分子を含む組成物。
- がん、腫瘍、免疫障害、又は微生物感染を治療又は予防するための医薬品の製造における、請求項1〜40のいずれかに記載の物質の組成物の使用。
- 疾患、障害、又は状態の診断、予後予測、又は特徴付けにおける、請求項1〜40のいずれかに記載の物質の組成物の使用。
- 請求項1〜40のいずれかに記載の物質の組成物並びに追加の試薬及び/又は医薬送達デバイスを含む、キット。
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