CN110035771A - 抗呼吸道合胞病毒抗体及其产生和使用方法 - Google Patents

抗呼吸道合胞病毒抗体及其产生和使用方法 Download PDF

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Abstract

提供了具有针对RSV亚型A和RSV亚型B的中和效力的抗RSV抗体，以及提供了它们的鉴定、分离、产生方法和它们的制备和使用方法。

Description

抗呼吸道合胞病毒抗体及其产生和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年10月21日提交的美国临时专利申请号62/411,500的权益，其全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请含有已以ASCII格式电子版形式提交且特此以引用的方式整体并入的序列表。2017年10月20日创建的所述ASCII拷贝名为“2009186_0217_SL.TXT”且大小为860,021字节。
技术领域
本发明尤其涉及抗呼吸道合胞病毒(RSV)抗体及其功能片段，以及它们的制备和使用的方法和试剂。
背景技术
本文引用的所有参考文献，包括但不限于专利、专利申请以及通篇引用的非专利参考文献和出版物均出于所有目的通过全文引用方式明确地并入本文。
呼吸道合胞病毒(RSV)导致幼儿和老年人的大量发病率和死亡率，是美国婴儿住院的主要原因并且全世界每年估计有6400万例感染和160,000例死亡。然而，虽然进行了数十年的研究，但是开发针对RSV的安全并且有效的疫苗或治疗性和/或预防性抗体仍然难以实现，突出了对诱导或提供保护性免疫应答的新策略的需求。(1-3)。实际上，迄今为止目前还没有批准的RSV疫苗，并且用单克隆抗体帕利珠单抗(以销售)的被动预防部分由于其适度的功效而限于高风险婴儿。
某些儿童群体有发生RSV感染的风险，并且这些儿童群体包括早产儿(Hall等人,1979,New Engl.J.Med.300:393-396)、患有先天性气道畸形的儿童、患有支气管肺发育不良的儿童(Groothuis等人,1988,Pediatrics 82:199-203)、患有先天性心脏病的儿童(MacDonald等人,New Engl.J.Med.307:397-400)以及患有先天性或获得性免疫缺陷(Ogra等人,1988,Pediatr.Infect.Dis.J.7:246-249；和Pohl等人,1992,J.Infect.Dis.165:166-169)和囊性纤维化的儿童(Abman等人,1988,J.Pediatr.1 13:826-830)。
RSV也可以感染成年群体。在此群体中，RSV主要引起上呼吸道疾病，但老年患者可能患上严重感染和肺炎的风险更大(Evans,A.S.编,1989,Viral Infections ofHumans.Epidemiology and Control,第3版,Plenum Medical Book,New York,第525-544页)，以及免疫抑制的成年人，特别是骨髓移植患者(Hertz等人,1989,Medicine 68:269-281)。其他有风险的患者包括罹患充血性心力衰竭的患者和罹患慢性阻塞性肺病(即COPD)的患者。还有报告称疗养院患者和长期住院治疗的年轻人患有流行病(Falsey,A.R.,1991,Infect.Control Hosp.Epidemiol.12:602-608；和Garvie等人,1980,Br.Med.J.281:1253-1254)。
虽然确定的RSV疾病的治疗选择是有限的，但下呼吸道疾病的更严重形式通常需要相当大的支持疗法，包括施用加湿的氧气和呼吸辅助(Fields等人编,1990,FieldsVirology,第2版,第1卷,Raven Press,New York,第1045-1072页)。
与其他肺病毒相似，RSV表达两种主要的表面糖蛋白：融合蛋白(F)和附着蛋白(G)。尽管两者均显示出诱导保护性中和抗体应答，但F的遗传可变性小于G，是感染所必需的并且是人血清中大部分中和活性的靶标(4-8)。RSV F还是单克隆抗体帕利珠单抗的靶标，单克隆抗体帕利珠单抗用于被动地保护高风险婴儿免于严重疾病(9)。因此，RSV F蛋白被认为是疫苗和基于抗体的疗法的非常有吸引力的靶标。
成熟的RSV F糖蛋白最初存在于亚稳的融合前构象(10)中，之后经历构象变化，导致疏水性融合肽插入宿主细胞膜中。随后将F重折叠成稳定的、伸长的融合后构象(postF)(11，12)导致病毒和宿主细胞膜的融合。由于固有的不稳定性，preF蛋白具有在溶液中和在病毒表面上均过早触发成postF的倾向(13)。最近，通过蛋白质工程已经实现了preF的稳定化(14，15)，并且已显示在动物模型中稳定化的preF比postF诱导更高滴度的中和抗体(15)。
尽管中和抗体对于预防严重RSV疾病具有重要性，但我们对人抗体对RSV的应答的理解限于人血清和少量RSV特异性人单克隆抗体的研究(16-19)。由这些人抗体以及几种鼠抗体识别的表位已经在RSV F上限定了至少四个‘抗原位点’(1，10，16，18-20)(也参见例如表1)。这些位点中的三个，I、II和IV，存在于preF和postF上，而抗原位点仅存在于preF上。另外的preF特异性表位已由抗体MPE8(17)和AM14(21)定义。尽管血清作图研究显示，在大多数个体中，位点定向抗体是大部分中和抗体应答的原因(8)，但仍然还有其他有助于血清中和活性的抗体特异性有待解释。此外，迄今尚不清楚识别某些中和位点是否需要某些抗体序列特征，如对其他病毒靶标所观察到的那样(22-25)。因此，理解中和效力与表位特异性之间的关系将有利于疫苗抗原以及诱导对RSV的有效中和应答的治疗性和/或预防性抗体的选择和/或设计。
虽然确定的RSV疾病的治疗选择是有限的，但下呼吸道疾病的更严重形式通常需要相当大的支持疗法，包括施用加湿的氧气和呼吸辅助(Fields等人编,1990,FieldsVirology,第2版,第1卷,Raven Press,New York,第1045-1072页)。
利巴韦林是唯一被批准用于治疗感染的药物，已显示有效治疗与RSV感染相关的肺炎和毛细支气管炎，并且已显示可改变免疫功能正常儿童的严重RSV病程(Smith等人,1991,New Engl.J.Med.325:24-29)。由于考虑到当在医院环境施用时怀孕女性可能暴露于雾化药物的可能风险，利巴韦林的使用受到限制。
类似地，尽管疫苗可能是有用的，但迄今为止还没有开发出可商购获得的疫苗。已经放弃了几种候选疫苗，并且其他候选疫苗正在开发中(Murphy等人,1994,Virus Res.32:13-36)。疫苗的开发已被证明是有问题的。特别是，新生儿初期需要进行免疫接种，因为2-5个月龄发生呼吸道疾病的发病率高峰。然而，众所周知，那时新生儿免疫应答尚不成熟。此外，那个时间点的婴儿仍然具有高滴度的母体获得性RSV抗体，这可能降低疫苗免疫原性(Murphy等人,1988,J.Virol.62:3907-3910；和Murphy等人,1991,Vaccine 9:185-189)。
目前，唯一批准的预防RSV疾病的方法是被动免疫接种。例如，人源化抗体帕利珠单抗对F蛋白上的表位具有特异性，被批准在整个RSV季节(北半球11月至4月)内在15mg/kg体重的推荐每月剂量下肌内施用给儿科患者，以用于预防由RSV引起的严重下呼吸道疾病。是人(95％)和鼠(5％)抗体序列的复合物。(Johnson等人,(1997),J.Infect.Diseases 176:1215-1224和美国专利号5,824,307)。
尽管已成功用于预防儿科患者的RSV感染，但需要15mg/kg的多次肌内剂量的才能实现预防效果。对施用多次肌内剂量的抗体的需要需要反复去医生办公室就诊，这不仅对患者不方便，而且还可能导致遗漏剂量。
已做出努力以改进抗RSV-F抗体的治疗特性，并且这导致莫他珠单抗(还称为NUMAXTM)的鉴定和开发。然而，临床测试显示某些施用莫他珠单抗的患者具有严重的超敏反应。然后停止了这种人源化抗RSV-F抗体的进一步开发。
已经描述了RSV-F蛋白的其他抗体，并且可见于US6656467、US5824307、US7786273、US 7670600、US 7083784、US6818216、US7700735、US7553489、US7323172、US7229619、US7425618、US7740851、US7658921、US7704505、US7635568、US6855493、US6565849、US7582297、US7208162、US7700720、US6413771、US5811524、US6537809、US5762905、US7070786、US7364742、US7879329、US7488477、US7867497、US5534411、US6835372、US7482024、US7691603、US8562996、US8568726、US9447173、US20100015596、WO2009088159A1和WO2014159822。迄今为止，只有被监管机构批准用于预防RSV感染。
仍然需要提供高特异性、高亲和力并且高效的中和抗RSV抗体及其抗原结合片段，其中和亚型A和亚型B RSV病毒株中的至少一种，但优选两种，并且相对于F蛋白的PostF构象优先识别PreF。还需要提供抗RSV和抗HMPV交叉中和抗体及其抗原结合片段。
发明内容
申请人现已尤其发现、分离并表征了健康成人供体的记忆B细胞的广泛的RSV F特异性单克隆抗体组，并且使用这些抗体全面地绘制RSV F的抗原拓扑图。大多数RSV F特异性人抗体库有利地包含对F蛋白的PreF构象具有极大增强的特异性(相对于PostF形式)的抗体，其中许多(如果不是大多数)在针对RSV亚型A和RSV亚型B菌株中的一种或二种的中和测定中表现出显著的效力。实际上，大量的这些抗体显示出是以前抗RSV治疗性抗体(例如D25和帕利珠单抗)多倍大、约5到100倍大或更多的中和效力，因此用作用于治疗和/或预防RSV感染和疾病的有吸引力的治疗性和/或预防性候选物。
发现最有效的抗体靶向位于preF三聚体顶点附近的两个不同的抗原位点，为靶向这些抗原位点的治疗性和/或预防性抗体以及保留这些抗原位点的基于preF的疫苗候选物的开发提供强力支持。此外，本文描述和公开的中和抗体提供使用被动免疫预防来预防严重RSV疾病的新机会。
鉴于F蛋白在病毒与细胞的融合方面以及在病毒的细胞间传播方面所起的作用，本文所述的抗体和药物组合物提供了一种抑制此过程的方法，并且因此可用于预防暴露于RSV感染或有RSV感染风险的患者的感染，或用于治疗和/或改善暴露于RSV感染或有获得RSV感染或罹患RSV感染风险的患者的与RSV感染相关的一种或多种症状。本文所述的抗体还可用于预防或治疗由于潜在或预先存在的医学病状而可能经历更严重形式的RSV感染的患者的RSV感染。可以受益于本发明的抗体和/或药物组合物治疗的患者可以是早产婴儿、RSV季节期间(约晚秋(11月)至早春(4月))出生的因其他先前存在或潜在的医学病状包括先天性心脏病或慢性肺病而有风险的足月婴儿、年龄大于1岁且有或没有潜在的医学病状的儿童、长期住院治疗或住院的患者或者有或没有潜在的医学病状如充血性心力衰竭(CHF)或慢性阻塞性肺病(COPD)的老年人(>65岁)。可受益于此类治疗的患者可能罹患由肺、心血管、神经肌肉或免疫系统受损引起的医学病状。例如，患者可能罹患气道异常或气道功能障碍、慢性肺病、慢性或先天性心脏病、损害呼吸道分泌物处理的神经肌肉疾病，或者患者可能因严重的合并免疫缺陷病或严重的获得性免疫缺陷病或导致免疫抑制的任何其他潜在传染病或癌症病状而受到免疫抑制，或者患者可能因用免疫抑制药物(例如用于治疗移植患者的任何药物)治疗或放射治疗而受到免疫抑制。可受益于本发明的抗体和/或药物组合物的患者可以是罹患慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化(CF)、支气管肺发育不良、充血性心力衰竭(CHF)或先天性心脏病的患者。
因为与已知抗体相比，本发明的抗体及其抗原结合片段在中和RSV方面更有效，所以可以使用较低剂量的本发明的抗体或抗体片段或药物组合物来实现针对RSV感染的更高水平的保护以及与RSV感染相关的症状的更有效治疗和/或改善。因此，使用较低剂量的免疫特异性结合RSV-F抗原的抗体或其片段可导致较少或较不严重的不良事件。同样地，使用更有效的中和抗体可导致比先前针对预防感染、或针对病毒中和、或针对治疗或改善与RSV感染相关的一种或多种症状设想为必需的相比，对抗体或抗体片段或药物组合物的频繁施用的需求减少。RSV感染的症状可包括由于缺乏氧气(缺氧)、呼吸困难(快速呼吸或呼吸短促)、咳嗽、哮吼性咳嗽(“海豹叫”咳嗽)、发烧、鼻翼煽动、鼻充血(鼻塞)、呼吸暂停、食欲减退、脱水、喂养不良、精神状态改变或喘息而导致的皮肤颜色发蓝。
当预防性施用(在暴露于病毒和感染病毒之前)以减少RSV原发感染的严重程度或持续时间或改善至少一种与感染相关的症状时，此类抗体或药物组合物可以是有用的。抗体或药物组合物可以单独使用或与可用于治疗RSV感染的第二剂结合使用。在某些实施方案中，抗体或药物组合物可以治疗性地(在暴露于病毒并且感染病毒后)单独或与第二剂结合给予以减少原发感染的严重程度或持续时间，或改善至少一种与感染有关的症状。在某些实施方案中，抗体或药物组合物可以预防性地用作独立疗法以保护有获得RSV感染风险的患者，例如上述那些。当单独或与第二剂结合给予时，这些患者群体中的任一个均可受益于用本发明抗体进行的治疗，第二剂包括例如抗病毒疗法，例如利巴韦林，或其他抗病毒疫苗。
本发明的抗体可为全长(例如，IgG1或IgG4抗体)或可仅包含抗原结合部分(例如Fab、F(ab')2或scFv片段)，并且可被修饰以影响功能性，例如消除残余效应子功能(Reddy等人,(2000),J.Immunol.164:1925-1933)。
因此，在某些实施方案中，提供了与呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白(F)特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其中这些抗体或其抗原结合片段的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个与选自如表6中公开的抗体编号124至抗体编号244的抗体的如表6中公开的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、或至少六个具有至少70％同一性、至少75％同一性、80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％和/或其之间的所有百分比的同一性；并且其中所述抗体或其抗原结合片段还具有下列特征中的一个或多个：a)所述抗体或所述其抗原结合片段与所述抗体或其抗原结合片段交叉竞争结合RSV-F；b)所述抗体或其抗原结合片段相对于PostF形式对RSF-F的PreF形式表现出更好的结合亲和力；c)所述抗体或其抗原结合片段表现出无或低多反应性特性；d)所述抗体或其抗原结合片段表现出在体外对RSV亚型A和RSV亚型B的中和活性；e)所述抗体或其抗原结合片段表现出在位点位点I、位点II、位点III、位点IV或位点V处对RSV-F的抗原位点特异性；f)所述抗体或其抗原结合片段相对于RSV-F位点I、位点II或位点IV表现出对RSV-F位点位点V或位点III的抗原位点特异性；g)所述抗体或其抗原结合片段与之相互作用的表位的至少一部分包含PreF的α3螺旋和β3/β4发夹；h)所述抗体或其抗原结合片段表现出在约0.5微克/毫升(μg/ml)至约5μg/ml之间、在约0.05μg/ml至约0.5μg/ml之间、或小于约0.05mg/ml的体外中和效力(IC50)；i)相对于所述抗体或其抗原结合片段对RSV-F或RSV-F DS-Cav1的结合亲和力和/或表位特异性，所述抗体或其抗原结合片段对在图7A中指定为1、2、3、4、5、6、7、8、9和DG的任一种RSV-F变体的结合亲和力和/或表位特异性减小或消除；j)所述抗体或其抗原结合片段表现出对人偏肺病毒(HMPV)的交叉中和效力(IC50)；k)所述抗体或其抗原结合片段不与D25、MPE8、帕利珠单抗或莫他珠单抗一起完成；或l)所述抗体或其抗原结合片段表现出比D25和/或帕利珠单抗大至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约55倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、大于约100倍以及前述中的任一个之间的倍数的中和效力(IC50)。
在某些其他实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：上述特征a)至l)中的至少两个、至少三个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个或至少12个。
在某些其他实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRH3氨基酸序列；b)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRH2氨基酸序列；c)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRH1氨基酸序列；d)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRL3氨基酸序列；e)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRL2氨基酸序列；f)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRL1氨基酸序列；或g)a)、b)、c)、d)、e)和f)中的两个或更多个的任何组合。
在某些其他实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的重链(HC)氨基酸序列；和/或b)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的轻链(LC)氨基酸序列。
在某些其他实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段选自由与如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一抗体具有至少70％同一性、至少75％同一性、80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％和/或其之间的所有百分比的同一性的抗体组成的群组。
在某些其他实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段选自由如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的抗体组成的群组。
在其他实施方案中，提供了编码根据本文公开的任何其他实施方案的抗体、或其抗原结合片段、或其轻链和/或重链的分离的核酸序列。
在其他实施方案中，提供了包含根据本文公开的其他实施方案的分离的核酸序列的表达载体。
在其他实施方案中，提供了用根据本文公开的其他实施方案的核酸序列或表达载体转染、转化或转导的宿主细胞。
在其他实施方案中，提供了药物组合物，其包含：根据本文公开的其他实施方案的一种或多种分离的抗体或其抗原结合片段；和药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
在其他实施方案中，提供了药物组合物：根据本文公开的其他实施方案的一种或多种核酸序列；或根据本文公开的其他实施方案的一种或多种表达载体；和药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
在其他实施方案中，提供了转基因生物体，其包含根据本文公开的其他实施方案的核酸序列；或根据本文公开的其他实施方案的表达载体。
在其他实施方案中，提供了治疗或预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染或与RSV感染相关的至少一种症状的方法，其包括向有此需要或疑似有此需要的患者施用：a)根据本文公开的其他实施方案的一种或多种抗体或其抗原结合片段；b)根据本文公开的其他实施方案的核酸序列；根据本文公开的其他实施方案的表达载体；根据本文公开的其他实施方案的宿主细胞；或e)根据本文公开的其他实施方案的药物组合物；使得治疗或预防所述RSV感染，或者治疗、缓解所述至少一种与RSV感染相关的症状或减轻其严重程度。
在其他实施方案中，提供了治疗或预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染和/或人偏肺病毒(HMPV)感染、或与所述RSV感染或所述HMPV感染相关的至少一种症状的方法，其包括向有此需要或疑似有此需要的患者施用：a)根据本文公开的其他实施方案的一种或多种抗体或其抗原结合片段；b)根据本文公开的其他实施方案的核酸序列；c)根据本文公开的其他实施方案的表达载体；d)根据本文公开的其他实施方案的宿主细胞；或e)根据本文公开的其他实施方案的药物组合物；使得治疗或预防所述RSV感染，或者治疗、缓解所述至少一种与RSV感染相关的症状或减轻其严重程度。在其他实施方案中，提供了根据其他实施方案的方法，其中a)的一种或多种抗体或其抗原结合片段选自由如表6中公开的指定为抗体编号179、188、211、221或229的抗体组成的群组。
在其他实施方案中，提供了根据其他实施方案的方法，其中所述方法还包括向患者施用第二治疗剂。
在其他实施方案中，提供了根据其他实施方案的方法，其中所述第二治疗剂选自由以下组成的群组：抗病毒剂；对RSV具有特异性的疫苗、对流感病毒具有特异性的疫苗或对偏肺病毒(MPV)具有特异性的疫苗；对RSV抗原或偏肺病毒(MPV)抗原具有特异性的siRNA；对RSV抗原或偏肺病毒(MPV)抗原具有特异性的第二抗体；抗IL4R抗体、对流感病毒抗原具有特异性的抗体、抗RSV-G抗体和NSAID。
在某些实施方案中，提供了药物组合物，其包含任一种或多种分离的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
在某些实施方案中，提供了根据其他实施方案的药物组合物，其用于预防有此需要或疑似有此需要的患者的呼吸道合胞病毒(RSV)感染，或用于治疗罹患RSV感染的患者，或用于改善与所述感染相关的至少一种症状或并发症，其中由于所述使用，预防所述感染，或者预防、改善至少一种与所述感染相关的症状或并发症或减少其严重程度和/或持续时间。
在某些实施方案中，提供了根据其他实施方案的药物组合物，其用于治疗或预防有此需要或疑似有此需要的患者的呼吸道合胞病毒(RSV)感染和/或人偏肺病毒(HMPV)感染，或与所述RSV感染或所述HMPV感染相关的至少一种症状，其中由于所述使用，预防所述感染，或者预防、改善至少一种与所述感染相关的症状或并发症或减少其严重程度和/或持续时间。
在某些其他实施方案中，提供了根据其他实施方案的药物组合物在药物制造中的用途，所述药物用于预防有此需要的患者的呼吸道合胞病毒(RSV)感染，或用于治疗罹患RSV感染的患者，或用于改善与所述感染相关的至少一种症状或并发症，其中预防所述感染，或者预防、改善至少一种与所述感染相关的症状或并发症或减少其严重程度和/或持续时间。
在某些其他实施方案中，提供了根据其他实施方案的药物组合物在药物制造中的用途，所述药物用于治疗或预防有此需要或疑似有此需要的患者的呼吸道合胞病毒(RSV)感染和/或人偏肺病毒(HMPV)感染，或与所述RSV感染和/或所述HMPV感染相关的至少一种症状，其中由于所述使用，预防所述感染，或者预防、改善至少一种与所述感染相关的症状或并发症或减少其严重程度和/或持续时间。
附图说明
图1A至图1F示出鉴定并分离的抗体的抗RSV库克隆和序列分析。图1A：RSV F特异性B细胞分选。FACS图显示健康成年人供体的IgG+和IgA+B细胞的RSV F反应性。象限2(Q2)中的B细胞进行单细胞分选。图1B：同种型分析。索引分选图示出表达IgG或IgA的RSV F特异性B细胞的百分比。图1C：克隆谱系分析。每个切片代表一个克隆谱系；切片的大小与谱系中的克隆数成比例。克隆的总数示出在饼图的中心。基于以下标准分配克隆谱系：1)可变和连接基因片段的匹配；2)相同的CDR3环长度；和3)CDR3核苷酸序列中>80％同源性。图1D：VH库分析。如果发现所富集的给定基因超过非RSV特异性库大于3倍，那么认为VH种系基因富集在RSV库中(33)。图1E：CDRH3长度分布。图1F：VH(不包括CDRH3)中的体细胞超突变。红色条表示核苷酸取代的平均数。每个克隆谱系在图1D和图1E中仅表示一次。非RSV反应性IgG的数据来源于通过对健康个体的重新排列的抗体可变基因库进行高通量测序所获得的公开序列(33)。
图2A至图2D示出对库中RSV F的构象状态和亚型观察到的类似抗体偏好。图2A：如图所示绘制对preF和postF的IgG亲和力。图2B：供体库中识别F的两种构象(绿色)或仅结合preF(蓝色)或postF(橙色)的抗体的百分比。图2C：供体库中特异性结合亚型A(绿色)、亚型B(蓝色)或亚型A和B两者(红色)的抗体的百分比。N.B.，非结合物。计算BLI应答>0.1nm的抗体的IgG KD。BLI应答<0.05nm的抗体被指定为N.B.。图2D：抗RSV抗体的多反应性分析。使用先前描述的测定测量分离的抗RSV F抗体的多反应性(42，43)。包括三组对照抗体用于比较：一组目前处于临床试验中的138种抗体，一组已被批准用于临床使用的39种抗体和一组14种广泛中和HIV的抗体。
图3A至图3G示出对跨越PreF和PostF表面的抗原位点的作图和抗RSV抗体对其的特异性。图3A：先前确定的preF结构，其具有一个显示为带状物的原体以及具有六个红色到紫色的彩虹色的抗原位点。图3B：示出了靶向每个抗原位点的抗体的百分比。图3C：靶向每个抗原位点的preF特异性抗体的百分比。图3D：对亚型A PreF抗原位点的表观抗体结合亲和力。图3E：对亚型A postF抗原位点的表观结合亲和力。图3F：对亚型B PreF抗原位点的表观抗体结合亲和力。图3G：对亚型B postF的表观结合亲和力。在此分析中仅包括表观结合亲和力大于2nM的抗体，因为不能可靠地标出具有较低亲和力的抗体。红色条示出中值，并且灰色虚线处于2nM。N.B.，非结合物。
图4A至图4G示出抗RSV抗体的中和效力以及效力与PreF相对于PostF对RSV亚型A和B中的每一种的特异性之间的相关性。图4A：从供体库分离的抗体的中和IC50。根据右边的图例，数据点基于中和效力被着色。红色和蓝色虚线分别示出莫他珠单抗和D25的IC50。图4B：供体库中针对RSV亚型A或亚型B的中和抗体的百分比，按效力进行分层，如图右侧部分中的图例所示。图4C：供体库内中和RSV亚型A和B(红色)或仅中和RSV亚型A(绿色)或亚型B(蓝色)的抗体的百分比。图4D：针对每种抗体绘制的对亚型A preF和postF的表观结合亲和力(计算BLI应答>0.1nm的抗体的IgG KD。BLI应答<0.05nm的抗体被指定为N.B.)图4E：针对RSV亚型A preF特异性、postF特异性和交叉反应抗体绘制的中和IC50。(红色和蓝色虚线分别示出莫他珠单抗和D25的IC50。红色条示出中值。N.B.，非结合物；N.N.，非中和)。图4F：对亚型B preF和postF的表观抗体结合亲和力。图4G：针对RSV亚型B preF特异性、postF特异性和交叉反应抗体绘制的IC50。(黑色条示出中值。N.B.，非结合物；N.N.，非中和。)
图5A至图5C示出最有效的中和抗体以高亲和力结合preF并识别抗原位点和V。图5A：针对中和IC50作图并根据抗原位点着色的表观preF KD，如图5C右侧的图例中所示。图5B：针对中和IC50作图并如图5A中所示着色的表观postF KD。图5C：根据中和效力分组并如右侧图例中所示按抗体位点进行着色的抗体。N.B.，非结合物；N.N.，非中和。计算BLI应答>0.1nm的抗体的IgG KD。将BLI应答<0.05nm的抗体指定为N.B.使用未配对双尾t检验确定统计学显著性。皮尔逊相关系数r使用Prism软件7.0版计算。无法结合或中和的抗体由于不能精确计算中点浓度而被排除在统计分析之外。
图6A至图6C示出preF和postF分选探针的性质和纯化。图6A：荧光预融合RSV F探针的示意图示出一个PE缀合的链霉抗生物素蛋白分子由四个avi标记的三聚体融合前F分子结合。图6B：考马斯染色的SDS-PAGE凝胶显示使用连续的Ni-NTA和Strep-Tactin纯化，用每个三聚体单个AviTag分离RSV F，如方法中所述。图6C：四聚体探针在Superose 6柱上的荧光尺寸排阻色谱(FSEC)迹线。分子量标准品的位置用箭头表示。
图7A至图7C示出preF补丁组突变体的产生和验证。图7A：用于表位作图的RSV F变体组。图7B：融合前RSV F显示为分子表面，其中一个原体为白色。根据图7A中的表格，九个变体(每个变体包含突变补丁)具有独特的颜色。图7C：使用PE缀合的抗人Fc抗体在FLEXMAP3D流式细胞仪(Luminex)上测量每种IgG与偶联于图7A中列出的每种变体的荧光标记的珠子的结合。D25和莫他珠单抗分别与补丁1和5结合的降低与其结构上定义的表位一致(10，11)。由于独特的跨原体表位，AM14对补丁3和补丁9的结合均降低(21)。此特征性结合特性用于辅助组中其他可能的四元特异性抗体的分类。
图8示出抗原位点V位于D25、MPE8和莫他珠单抗识别的表位之间。显示融合前F，其中一个原体根据抗原位点位置卡通着色，另两个原体为灰色。D25和莫他珠单抗Fab分别以蓝色和粉红色显示。MPE8结合位点用黑色圈出。抗原位点V位于一个原体内的D25和MPE8的结合位点之间，解释了位点V定向抗体与这些对照之间的竞争。根据这些位点V定向抗体的接近角，可以在两个相邻的原体(左)之间或在一个原体(右)内发生与莫他珠单抗的竞争。
图9显示了抗RSV抗体的百分比，表明了preF特异性、postF特异性和交叉反应性抗体的指示的中和活性。抗体根据中和效力分层和针对亚型A(左图)和亚型B(右图对各组中preF特异性(粉红色)、postF特异性(白色)或交叉反应性(橙色)抗体的百分比进行绘图。
图10A至图10C示出亚型B中和与抗RSV抗体的抗原位点特异性之间的关系。图10A：针对所有抗的中和IC50对亚型B preF亲和力进行绘图，并根据图10C右侧部分所示的颜色方案按抗原位点着色。图10B：针对IC50对postF亲和力进行绘图并如图10A所示着色。图10C：具有高于2nM的preF亲和力的抗体根据中和效力分组并按抗原位点着色(右侧部分)。
图11示出RSV A2的体外中和作用。使用Hep-2细胞在基于ELISA的中和测定中测量对RSV复制的抑制。将细胞、mAb和病毒在37℃共温育4天，然后使用多克隆抗RSV抗体定量感染细胞中的病毒蛋白。相对于在不存在中和抗体的情况下用病毒感染的对照细胞计算抑制％。数据表示为导致病毒复制减少50％的半数最大抑制浓度(IC50)并且表示两次独立实验的平均值+/-SEM。在每个实验中包括同种型匹配的对照mAb(*)，并且没有表现出病毒中和。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文所用的全部技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的意义具有相同的意义。如本文中所用，术语“大约”在用于提及特定引述的数值时，指的是所述值可从所引述值变化不大于1％。例如，如本文中所用，表述“约100”包括99和101以及介于之间的所有值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
定义
“呼吸道合胞病毒-F蛋白”也称为“RSV-F”或“RSV F”，是I型跨膜表面蛋白，其具有N末端切割的信号肽和C末端附近的膜锚(Collins,P.L.等人,(1984),PNAS(USA)81:7683-7687)。RSV-F蛋白被合成为无活性的67KDa前体，表示为F0(Calder,L.J.等人,Virology(2000),277,122-131。F0蛋白在高尔基复合体中通过弗林蛋白酶样蛋白酶在两个位点以蛋白水解方式被活化，产生分别来自N和C末端的两个二硫键连接的多肽F2和F1。释放出具有27个氨基酸的肽，称为“pep27”。在pep27的两侧均有弗林蛋白酶切割位点(FCS)(Collins,P.L.,Mottet,G.(1991),J.Gen.Virol.,72:3095-3101；Sugrue,R.J等人(2001),J..Gen.Virol.,82,1375-1386)。F2亚基由七肽重复序列C(HRC)组成，而F1包含融合多肽(FP)、七肽重复序列A(HRA)、结构域I、结构域II、七肽重复序列B(HRB)、跨膜(TM)和细胞质结构域(CP)(参见Sun,Z.等人Viruses(2013),5:21 1-225)。RSV-F蛋白在病毒颗粒与细胞膜的融合方面起作用，并在感染细胞的表面上表达，从而在病毒的细胞间传播和合胞体形成方面起作用。RSV-F蛋白的氨基酸序列在GenBank中以登录号AAX23994提供。
RSV-F的PreF三聚体构象的稳定化变体被称为“RSV-DS-Cav1”，或“DS-Cav1”，尤其公开于Stewart-Jones等人,PLos One,第10(6)卷e0128779和WO 2011/050168，被用于本文公开的抗体的鉴定、分离和表征。
如本文所用的术语“实验室菌株”是指已在体外细胞培养物中广泛传代的RSV(亚型A或B)菌株。“实验室菌株”可以获得可能影响其生物学特性的适应性突变。如本文所用的“临床菌株”是指RSV分离物(亚型A或B)，其获自感染的个体并且已被分离并在低传代下在组织培养物中生长。
术语“有效剂量99”或“ED99”是指相对于同种型(阴性)对照，产生99％病毒形成斑块减少的所需效果的剂的剂量。在本发明中，ED99是指将在体内中和病毒感染(即，减少99％的病毒载量)的抗RSV-F抗体的剂量，如实施例5中所述。
术语“IC50”是指“半数最大抑制浓度”，此值衡量化合物(例如抗RSV-F抗体)抑制对生物学或生物化学效用的有效性。此定量量度指出特定抑制剂抑制给定生物过程减半所需的量。在某些实施方案中，本文公开的抗RSV抗体和/或抗RSV/抗HMPV交叉中和抗体的RSV病毒中和效力表示为中和IC50值。
“帕利珠单抗”也称为是重链和轻链可变结构域具有US7,635,568和US 5,824,307中所述的氨基酸序列的人源化抗RSV-F抗体。这种免疫特异性结合RSV-F蛋白的抗体目前已获FDA批准用于高风险儿童的严重RSV疾病的被动免疫预防，并在整个RSV季节(北半球的11月到4月)中以推荐的15mg/kg体重的每月剂量进行肌内施用。由95％的人抗体序列和5％的鼠抗体序列构成。还参见Johnson等人,(1997),J.Infect.Diseases 176:1215-1224。
“莫他珠单抗”也称为“NUMAXTM”，是一种增强效力的RSV-F特异性人源化单克隆抗体，其通过帕利珠单抗的重链和轻链的互补决定区的体外亲和力成熟而衍生。出于参考目的，NUMAXTM抗体的氨基酸序列公开于美国专利公开2003/0091584和美国专利号6,818,216以及Wu等人,(2005)J.Mol.Bio.350(1):126-144和Wu等人(2007)J.Mol.Biol.368:652-665中。其在本文中还示出为针对抗体重链的SEQ ID NO:359和针对轻链的SEQ ID NO:360。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指由一种或多种疗法的施用(包括但不限于一种或多种预防性或治疗性剂的施用)引起的上呼吸道和/或下呼吸道RSV感染和/或人偏肺病毒(HMPV)、中耳炎或与其相关的症状或呼吸病状(例如哮喘、喘息或其组合)的进展、严重程度和/或持续时间的减少或改善。在某些实施方案中，此类术语是指RSV和/或HMPV的复制的减少或抑制、RSV和/或HMPV向其他组织或受试者蔓延的抑制或减少(例如，向下呼吸道蔓延)、细胞受RSV和/或HMPV感染的抑制或减少、或与上呼吸道和/或下呼吸道RSV感染或中耳炎相关的一种或多种症状的改善。
如本文所用，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指预防或抑制受试者的上呼吸道和/或下呼吸道RSV和/或HMPV感染、中耳炎或与其相关的呼吸病状的发展或发作；预防或抑制由施用疗法(例如，预防性或治疗性剂)引起的上呼吸道RSV和/或HMPV感染向下呼吸道RSV和/或HMPV感染、中耳炎或与其相关的呼吸病状的进展；预防上呼吸道和/或下呼吸道RSV和/或HMPV感染、中耳炎或与其相关的呼吸病状的症状；或施用疗法的组合(例如，预防性或治疗性剂的组合)。如本文所用，术语“改善”和“缓解”是指病状或其任何症状的严重程度的减轻或下降。
如本文所用，术语“抗体”意指包含四个多肽链，即通过二硫键互连的两个重(H)链和两个轻(L)链的免疫球蛋白分子(即，“全抗体分子”)，以及其多聚体(例如IgM)或其抗原结合片段。每个重链(HC)包含重链可变区(“HCVR”或“VH”)和重链恒定区(包含域CH1、CH2和CH3)。每个轻链(LC)包含轻链可变区(“LCVR”或“VL”)和轻链恒定区(CL)。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着较保守的区域，称为框架区(FR)。各VH和VL由三个CDR和四个FR组成，以下列顺序从氨基末端排列至羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明某些实施方案中，抗体(或其抗原结合片段)的FR可与人种系序列相同，或可为天然的或人工修饰的。氨基酸共有序列可基于两个或更多个CDR的并排(side-by-side)分析来定义。因此，重链中的CDR分别指定为“CHRH1”、“CDRH2”和“CDRH3”，轻链中的CDR指定为“CDRL1”、“CDRL2”和“CDRL3”。
取代一个或多个CDR残基或省略一个或多个CDR也是可能的。一个或两个CDR可对于结合被省去的抗体已经在科技文献中有所描述。Padlan等人(1995FASEB J.9:133-139)基于公开结晶结构来分析抗体与其抗原之间的接触区，并且得出的结论是仅约五分之一至三分之一的CDR残基实际上接触抗原。Padlan还发现其中一个或两个CDR不具有与抗原接触的氨基酸的许多抗体(也参见，Vajdos等人2002 J Mol Biol 320:415-428)。
不接触抗原的CDR残基可基于先前的研究(例如，通常不需要CDRH2中的残基H60-H65)，通过分子建模和/或凭经验，根据位于Chothia CDR外部的Kabat CDR区域来识别。如果省略CDR或其残基，那么它通常用占据另一个人抗体序列或这类序列的共有序列中的相应位置的氨基酸来取代。CDR和氨基酸内用于取代的取代位置也可凭经验来选择。
如与相应种系序列相比，本文公开的全人单克隆抗体可包含重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中的一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。通过将本文中所公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列相比较，可容易地确定这些突变。本发明包括来源于本文中所公开的任何氨基酸序列的抗体和其抗原结合片段，其中在一个或多个框架区和/或CDR区中的一个或多个氨基酸被突变成抗体所来自的种系序列的对应残基，或另一个人种系序列的对应残基，或对应种系残基的保守氨基酸取代(这些序列变化在本文中统称为“种系突变”)。由本文中所公开的重链可变区和轻链可变区序列开始，本领域的一般技术人员可容易地制造许多包含一个或多个独立种系突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施方案中，VH和/或VL结构域内的所有框架残基和/或CDR残基被突变回到抗体所来源的原始种系序列中所发现的残基。在其他实施方案中，仅某些残基突变回到原始的种系序列，例如仅在FR1的前8个氨基酸中或FR4的后8个氨基酸中发现突变的残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3内发现突变残基。在其他实施方案中，框架残基和/或CDR残基中的一个或多个被突变成具有不同种系序列的对应残基(即与抗体最初所来源的种系序列不同的种系序列)。此外，本发明的抗体在框架区和/或CDR区内可含有两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些独立残基被突变成特定种系序列的对应残基，而与原始种系序列不同的其他残基被维持或被突变成不同种系序列的对应残基。一旦获得，含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段可容易地测试一种或多种所需的性质，如提高的结合特异性、增加的结合亲和力、提高或增强(视情况而定)的拮抗或促效性生物学性质、降低的免疫原性等。以这种一般方式获得的抗体和抗原结合片段包括在本发明内。
本发明还包括全单克隆抗体，其包含具有一个或多个保守取代的本文公开的任何CDR氨基酸序列的变体。例如，本发明包括相对于本文公开的任何CDR氨基酸序列，具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等保守氨基酸取代的CDR氨基酸序列的抗体。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人mAb可包括未由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机或位点特异性诱变或通过在体内体细胞突变来引入的突变)，例如在CDR中并且尤其在CDR3中。
然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括来源于另一个哺乳动物物种(例如，小鼠)的种系的CDR序列枝接至人FR序列上的mAb。
术语“人源化抗体”是指抗体的一个或多个CDR已经被获自非人源(例如，小鼠、大鼠、兔、灵长类)抗体的一个或多个相应的CDR替换的人抗体。人源化抗体还可以包括来源于此类非人抗体的某些非CDR序列或残基以及一种或多种非人CDR序列。此类抗体也可被称为“嵌合”抗体。
术语“重组”通常是指通过基因工程方法产生的表达感兴趣的基因的任何蛋白质、多肽或细胞。关于蛋白质或多肽使用的术语“重组”意指通过重组多核苷酸的表达所产生的多肽。用于本发明免疫原性组合物的蛋白质可以从天然来源分离或通过基因工程方法产生。
在一些实施方案中，本发明的抗体可为重组人抗体。如本文中所用的术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方法所制备、表达、产生或分离的所有抗体(包括人抗体或人源化抗体)，如使用转染至宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(以下进一步详述)，由重组组合人抗体文库分离的抗体(以下进一步详述)，由针对人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见，例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列拼接的任何其他方法所制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，这些重组人抗体经受体外诱变(或，当使用针对人Ig序列转基因的动物时，经受体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是尽管来源于人种系VH和VL序列或与其有关但可能不是在体内天然存在于人抗体种系库中的序列。
术语“特异性地结合”或“与…特异性地结合”等意指抗体或其抗原结合片段与在生理条件下相对稳定的抗原形成复合物。特异性结合可特征在于平衡解离常数为至少约1×10-6M或更小(例如，较小KD表示较紧密结合)。用于确定两个分子是否特异性结合的方法在本领域中是熟知的，并且包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。如本文所述，已经通过表面等离子体共振(例如BIACORETM)、使用例如ForteBio Octet HTX仪器(Pall LifeSciences)的生物层干涉测量鉴定了特异性结合RSV-F的抗体。此外，结合RSV-F蛋白和一种或多种其他抗原(例如由HMPV表达的抗原)的多特异性抗体或结合RSV-F的两个不同区的双特异性抗体仍被认为是“特异性地结合”的抗体，如本文所用。在某些实施方案中，本文公开的抗体显示平衡解离常数(并因此显示特异性)为约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-6M与约1×10-7M之间、约1×10-7M与约1×10-8M之间、约1×10-8M与约1×10-9M之间或约1×10-9M与约1×10-10M之间。
术语“高亲和力”抗体指是指如通过表面等离子体共振(例如BIACORETM)、使用例如ForteBio Octet HTX仪器(Pall Life Sciences)的生物层干涉测量或溶液亲和ELISA所测量，对RSV-F和/或HMPV的结合亲和力(表示为KD)为至少10-9M、更优选地10-10M、更优选地10-11M、更优选地10-12M的那些mAb。
术语“慢解离速率”、“Koff”或“kd”意指从RSV-F解离的抗体，其速率常数为1×10- 3s"1或更小、优选地1×10-4s"1或更小，如通过表面等离子体共振(例如BIACORETM)或ForteBio Octet HTX仪器(Pall Life Sciences)所测量的。
如本文中所用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等等包括特异性地结合抗原以形成复合物的任何天然存在、可以酶促方法获得、合成或基因工程改造的多肽或糖蛋白。在某些实施方案中，如文中所用，术语抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”是指保持与RSV-F和/或HMPV结合的能力的抗体的一个或多个片段。
抗体片段可包括Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、dAb片段、含有CDR的片段或分离CDR。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术例如从例如全抗体分子获得，所述标准技术如蛋白质水解消化作用或涉及操作和表达编码抗体可变区和(任选地)恒定区的DNA的重组基因工程改造技术。这种DNA为已知的和/或可容易地从例如商业来源、DNA文库(包括，例如噬菌体-抗体文库)获得，或可进行合成。DNA可用化学方法或通过使用分子生物学技术来定序和操作，例如将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成适合构型，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、增添或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小鉴别单位(例如，分离的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)或限制性FR3-CDR3-FR4肽。如本文中所用的表述“抗原结合片段”内还涵盖其他工程改造分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR-接枝抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、双价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIP)和鲨可变IgNAR结构域。
抗体的抗原结合片段通常包含至少一个可变结构域。可变结构域可为具有任何大小或氨基酸组成的结构域，并且一般应包含与一个或多个框架序列相邻或同框的至少一个CDR。在具有与VL结构域缔合的VH结构域的抗原结合片段中，VH结构域和VL结构域可以任何适合的排列相对彼此定位。例如，可变区可为二聚的并含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。替代地，抗体的抗原结合片段可含有单体VH或VL结构域。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可以在本发明的抗体的抗原结合片段中发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-Ch1-Ch2；(v)VH-Ch1-Ch2-Ch3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在任何可变结构域和恒定结构域的构型(包括上列任何的示例性构形)中，可变结构域和恒定结构域可直接彼此连接或可通过完整或部分铰链区或接头区连接。铰链区可由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸组成，从而在单一多肽分子中相邻的可变结构域和/或恒定结构域之间产生柔性和半柔性键联。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可包含相互和/或与一个或多个单体VH或VL结构域(例如，通过双硫键)呈非共价缔合的任何上列可变结构域和恒定结构域构型的同源二聚体或异源二聚体(或其他多聚体)。
就全抗体分子来说，抗原结合片段可为单特异性或多特异性(例如双特异性)。抗体的多特异性抗原结合片段将典型地包含至少两个不同的可变结构域，其中各可变结构域能够特异性地与单独抗原结合或与相同抗原上不同的表位结合。任何多特异性抗体型式，包括本文中所公开的示例性双特异性抗体型式，可使用本领域中可利用的常规技术来改编，使其适用于本发明抗体的抗原结合片段情形。
本发明的具体实施方案、抗体或抗体片段可以与治疗性部分(“免疫缀合物”)例如抗生素、第二抗RSV-F抗体、抗HMPV抗体、疫苗或类毒素或者用于治疗RSV感染和/或HMPV感染的任何其他治疗性部分缀合。
如本文所用，“分离抗体”意指实质上不含具有不同抗原特异性的其他抗体(Ab)的抗体(例如，分离抗体特异性地结合RSV-F和/或HMPV，实质上不含特异性地结合除RSV-F和/或HMPV以外的抗原的Ab)。
如本文所用，“阻断抗体”或“中和抗体”(或“中和RSV-F和/或HMPV活性的抗体”)意指如本文所公开的情况，与RSV-F或HMPV抗原的结合导致抑制RSV-F和/或HMPV的至少一种生物活性的抗体。例如，本发明的抗体可以帮助阻断RSV和/或HMPV与宿主细胞的融合，或防止合胞体形成，或预防由RSV和/或HMPV引起的原发性疾病。替代地，本发明的抗体可以显示改善RSV感染和/或HMPV感染的至少一种症状的能力。RSV-F和/或HMPV的生物活性的这种抑制可以通过几种标准体外测定(如中和测定，如本文描述)或本领域已知的体内测定(例如，在施用本文所述的一种或多种抗体后防止RSV和/或HMPV攻击进行观察的动物模型)中的一种或多种测量RSV-F和/或HMPV生物活性的一个或多个指标来评估。
如本文所用，术语“表面等离子体共振”指的是允许通过例如使用BIACORETM系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden和Piscataway,N.J.)检测生物传感器矩阵内的蛋白浓度的变化来分析实时生物分子相互作用的光学现象。
如本文所用，术语“KD”意指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
术语“表位”指的是与抗体分子可变区中称为互补位(paratope)的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定子。单一抗原可具有一个以上表位。因此，不同抗体可与抗原上的不同区域结合并且可具有不同生物效应。术语“表位”还指抗原上的B和/或T细胞对其作出应答的位点。它还指由抗体结合的抗原区。表位可定义为结构或功能表位。功能表位总体上为结构表位的子集并且具有直接促成相互作用的亲和力的那些残基。表位还可为构型表位，也就是说，由非线性氨基酸构成。在某些实施方案中，表位可包括作为分子的化学活性表面分组的决定子，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可具有具体的三维结构特性和/或具体的电荷特性。
在提及核酸或其片段时，术语“实质同一性”或“实质上相同”指示当与插入或缺失另一核酸(或其互补链)的适当核苷酸进行最佳比对时，如通过序列同一性的任何熟知算法(如FASTA、BLAST或GAP，如以下所论述)所测量，至少约90％，并且更优选地至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基存在核苷酸序列同一性。因此，显示一定百分比“同一性”的核酸序列共有那个百分比同一性，和/或是彼此有那个百分比的“相同”。在某些情况下，具有与参考核酸分子实质同一性的核酸分子可编码与由参考核酸分子所编码的多肽具有相同或实质上类似氨基酸序列的多肽。
在某些实施方案中，所公开的抗体核酸序列与其他序列具有例如至少70％同一性、至少75％同一性、80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％和/或其之间的所有百分比的同一性；并且/或者彼此(或与本文公开的抗体序列的某些子集)共有这些百分比同一性。
在应用于多肽时，术语“实质同一性”或“实质上相同”意指当例如通过使用默认间隙权重的程序GAP或BESTFIT进行最佳化比对时，两个肽序列共有至少90％序列同一性，甚至更优选地至少95％、98％或99％序列同一性。因此，显示一定百分比“同一性”的氨基酸序列共有那个百分比同一性，并且/或者是彼此有那个百分比的“相同”。因此，显示一定百分比“同一性”的氨基酸序列共有那个百分比同一性，并且/或者是彼此有那个百分比的“相同”。
在某些实施方案中，所公开的抗体胺基酸序列与其他序列具有例如至少70％同一性、至少75％同一性、80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％和/或其之间的所有百分比的同一性；并且/或者彼此(或与本文公开的抗体序列的某些子集)共有这些百分比同一性。
优选地，不相同的残基位置相差了保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”为一种氨基酸残基被具有带类似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基)的另一氨基酸残基取代的取代。一般来说，保守氨基酸取代实质上将不会改变蛋白的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列彼此相差保守取代的情况中，可向上调整序列类似性百分比或类似性程度以修正取代作用的保守性质。用于进行这种调整的手段是本领域技术人员公知的。(参见，例如，Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331)。具有类似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，和(7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。替代地，保守替换为PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化，公开在Gonnet等人(1992)Science 256：1443 45中。“中度保守”替换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
多肽的序列类似性通常使用序列分析软件来测量。蛋白分析软件使用分配至各种取代、缺失和其他修饰作用(包括保守氨基酸取代)的类似性度量来配出类似的序列。例如，GCG软件含有如GAP和BESTFIT的程序，所述程序可使用默认参数来测定密切相关多肽之间(如来自不同生物物种的同源多肽)，或野生型蛋白与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如GCG 6.1版。多肽序列还可使用利用默认或推荐参数的FASTA(其为GCG6.1版内的程序)进行比较。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列和检索序列之间的最佳重叠区的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)，如上)。当将本发明序列与含有大量来自不同生物体的序列的数据库进行比较时，另一优选的算法为使用默认参数的计算机程序BLAST，特别是BLASTP或TBLASTN。(参见，例如，Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403 410和(1997)Nucleic Acids Res.25:3389 402)。
在某些实施方案中，用于本发明方法的抗体或抗体片段可为单特异性、双特异性或多特异性。多特异性抗体可对于一个靶多肽的不同表位具有特异性，或可含有对于一个以上靶多肽的表位具有特异性的抗原结合结构域。可用于本发明上下文中的示例性双特异性抗体形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中第一和第二Ig CH3结构域彼此相差至少一个氨基酸，并且其中在与没有氨基酸差异的双特异性抗体相比时，至少一个氨基酸差异减少了双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施方案中，第一Ig CH3结构域结合蛋白A并且第二Ig CH3结构域含有减少或消除蛋白A结合的突变，如H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。第二CH3可还包括Y96F修饰(根据IMGT；根据EU为Y436F)。可在第二CH3内发现的其他修饰包括：在IgG1 mAb情况下的D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT；根据EU为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2 mAb情况下的N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU为N384S、K392N和V422I)；和在IgG4mAb情况下的Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT；根据EU为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述双特异性抗体形式的变异涵盖在本发明的范围内。
短语“治疗有效量”意指产生施用此量产生所需效果的量。精确量取决于治疗目的，并且可由本领域技术人员使用已知技术(参见，例如，Lloyd(1999)The Art,Scienceand Technology of Pharmaceutical Compounding)来确定。
“免疫原性组合物”涉及含有抗原/免疫原例如微生物，例如病毒或细菌、或其组分、蛋白质、多肽、蛋白质或多肽的片段、灭活的全细胞、亚单位或减毒病毒、或多糖、或其组合的组合物，其被施用以刺激接受者对免疫原性组合物中存在的一种或多种抗原/免疫原的体液和/或细胞免疫系统。通过经由全身途径施用免疫原性组合物，本发明的免疫原性组合物可用于治疗易患RSV和/或HMPV感染或者疑似患有或易患RSV和/或HMPV感染的人。这些施用可包括通过肌内(i.m.)、皮内(i.d.)、鼻内或吸入途径或皮下(s.c.)途径注射；通过贴剂或其他透皮递送装置应用。在一个实施方案中，免疫原性组合物可用于制造疫苗或引发可用于被动保护或治疗哺乳动物的多克隆或单克隆抗体。
可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”是指包含至少一种在动物中诱导免疫应答的免疫原性组合物的组合物。
在某些实施方案中，感兴趣的蛋白质包括抗原。当提及分子时，术语“抗原”、“免疫原”、“抗原性”、“免疫原性”、“抗原活性”和“免疫学活性”是指能够诱导具体体液和/或细胞介导的免疫应答的任何物质。在一个实施方案中，抗原包括表位，如上定义。
如本文所用，“免疫学保护量”是有效诱导接受者的免疫原性应答的抗原的量，其足以预防或改善疾病的征象或症状，包括其对健康的不利影响或并发症。可以诱导体液免疫或细胞介导的免疫或两者。可以评估动物对组合物的免疫原性应答，例如，通过测量抗体滴度、淋巴细胞增殖测定来间接评估，或通过微生物攻击后监测征象和症状来直接评估。免疫原性组合物或疫苗赋予的保护性免疫可以通过测量例如攻击生物体脱落减少量、临床征象如死亡率减少量、发病率、体温以及受试者的整体身体状况、健康和表现来评估。免疫应答可包括但不限于诱导细胞和/或体液免疫。治疗有效的组合物或疫苗的量可以根据使用的特定生物体或被治疗或接种疫苗的动物的状况而变化。
如本文所用的受试者的“免疫应答”或“免疫学应答”是指对抗原/免疫原的体液免疫应答、细胞免疫应答或体液和细胞免疫应答的发展。“体液免疫应答”是指至少部分由抗体介导的应答。“细胞免疫应答”是由T淋巴细胞或其他白细胞或两者介导的应答，并且包括由活化的T细胞、白细胞或两者产生的细胞因子、趋化因子和类似分子的产生。可以使用本领域已知的标准免疫测定和中和测定来确定免疫应答。
如本文所用，“免疫原性”是指蛋白质或多肽引发特异性针对引起所鉴定疾病的细菌或病毒的免疫应答的能力。
除非另外特别指示，如本文所用，术语“抗体”应理解为涵盖包含两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链的抗体分子(即，“全抗体分子”)以及其抗原结合片段。如本文中所用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等等包括特异性地结合抗原以形成复合物的任何天然存在、可以酶促方法获得、合成或基因工程改造的多肽或糖蛋白。
人抗体的制备
如本文所公开的，抗RSV和/或抗RSV/抗HMPF交叉中和抗体可通过可供技术人员使用并且例如如以下实施例中所述的B细胞分选技术获得。用于在转基因小鼠中产生人抗体的方法也是本领域已知的，并且可以用于衍生根据本公开的抗体。可以在本发明的上下文中使用任何这样的已知方法来制备特异性结合RSV-F的人抗体(参见，例如，美国专利号6,596,541)。
在某些实施方案中，当通过与固定在固相上或溶液相中的抗原结合进行测量时，本发明的抗体具有在约1.0×10-7M至约1.0×10-12M的范围内的亲和力(KD)。在某些实施方案中，当通过与固定在固相上或溶液相中的抗原结合进行测量时，本发明的抗体具有在约1×10-7M至约6×10-10M的范围内的亲和力(KD)。在某些实施方案中，当通过与固定在固相上或溶液相中的抗原结合进行测量时，本发明的抗体具有在约1×10-7M至约9×10-10M的范围内的亲和力(KD)。
本文公开的抗RSV-F和/或抗HMPV抗体和抗体片段涵盖具有与所述抗体的氨基酸序列不同的氨基酸序列但保留结合RSV-F的能力的蛋白质。此类变体抗体和抗体片段包含当与亲本序列比较时的一个或多个氨基酸添加、缺失或取代，但展现与所述抗体的生物学活性基本上等效的生物学活性。同样地，本发明的抗体编码的DNA序列涵盖以下序列，所述序列包括当与所公开序列相比时的一个或多个核苷酸添加、缺失或取代，但是编码与本发明的抗体或抗体片段基本上生物等效的抗体或抗体片段。
如果例如两种抗原结合蛋白或抗体为药学等效物或药学替代品，即当在类似的实验条件下以相同摩尔剂量、以单次给药或多次给药来施用时，它们的吸收速率和程度并不显示显著差异，那么所述两种抗原结合蛋白或抗体被视为生物等效。如果一些抗体在其吸收程度上等效但是不在其吸收速率上等效，那么这些抗体被认为是等效物或药物替代物，并且仍可被认为是生物等效的，因为吸收速率的这些差异是有意的并且反映在标签中，对于例如在长期使用时达到有效体内药物浓度不是必需的，并且被认为对于所研究的具体药物产品在医学上是无关紧要的。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在它们的安全性、纯度和效力上不具有临床上的有意义差异，那么所述两种抗原结合蛋白为生物等效的。
在一个实施方案中，如果患者可在参考产品与生物产品之间作一次或多次切换，而与没有这种切换的持续治疗相比无预期的不利效应风险的增加，那么两种抗原结合蛋白为生物等效的，所述不利效应包括免疫原性的临床上显著改变或减低的有效性。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白通过针对一种或多种使用条件的共同的机制或作用机制来起作用，以达到这些机制已知的程度，那么所述两种抗原结合蛋白为生物等效的。
生物等效性可通过体内和/或体外方法来证明。生物等效性测量包括例如(a)人或其他哺乳动物的体内试验，其中测量血液、血浆、血清或其他生物体液中随着时间变化的抗体或其代谢物浓度；(b)与人体内生物可利用性数据关联并且可合理预测所述数据的体外试验；(c)人或其他哺乳动物的体内试验，其中测量随时间变化的抗体(或其靶)的适当急性药学效果；以及(d)建立抗体的安全性、功效或生物可利用性或生物等效性的良好控制临床试验。
本发明的抗体的生物等效变体可通过例如产生残基或序列的各种取代或缺失对于生物活性并非必需的末端或内部残基或序列来构建。例如，对生物活性来说非必需的半胱氨酸残基可被缺失或以其他氨基酸替换，以防止变性之后形成不必要或不正确的分子内双硫键联。在其他情形中，生物等效抗体可包括抗体变体，其包含修饰抗体的糖基化特性的氨基酸改变，例如消除或移除糖基化的突变。
抗体的生物学和生物物理学特征
在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段特异性结合呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白(F)，其中此抗体或其抗原结合片段的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和/或CDRL3氨基酸序列中的至少一个与选自如表6中公开的抗体编号124至抗体编号244的抗体的如表6中公开的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和/或CDRL3氨基酸序列中的至少一个具有至少70％同一性、至少75％同一性、80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性和/或其之间的所有百分比的同一性。在某些实施方案中，此类抗体还具有在紧接在后面十一段中公开的至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种特征。
不希望受任何理论的束缚，据信本发明抗体及其抗原结合片段可通过与RSV-F结合起作用，优选以PreF构象，并且这样一来起阻断病毒膜与宿主细胞膜融合的作用。本发明的抗体还可以通过与RSV-F结合起作用，并且这样一来阻断病毒的细胞间蔓延并阻断与细胞的RSV感染相关的合胞体形成。有利地，RSV亚型A和RSV亚型B均被本文公开的大多数抗RSV抗体有效阻断或中和。
在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段相对于RSV-F的PostF形式对RSF-F的PreF形式表现出更好的结合亲和力。
在某些其他实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段有利地表现出无或低多反应性特性(参见，例如，WO 2014/179363和Xu等人,Protein Eng Des Sel,10月；26(10):663-70)，且因此特别适合于发展为安全、有效并且可发展的治疗性和/或预防性抗RSV和/或HMPV治疗。
在某些实施方案中，不希望受任何理论束缚，本发明抗体及其抗原结合片段可通过与例如F蛋白的PreF构象的抗原位点I、II、III、IV或位点V中的任一个或多个结合而阻断或抑制RSV与细胞膜的融合来起作用。在某些实施方案中，本发明抗体相对于RSV-F位点I、位点II或位点IV表现出对PreF的位点位点V或位点III的抗原位点特异性。
在某些实施方案中，与本发明抗体及其抗原结合片段相互作用的表位的至少一部分包含PreF的α3螺旋和β3/β4发夹的一部分。在某些实施方案中，此类抗体的基本上所有表位包含PreF的α3螺旋和β3/β4发夹。在更进一步的实施方案中，本发明抗体与识别PreF的α3螺旋和β3/β4发夹的一部分或基本上全部的抗体交叉竞争。
在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段表现出在约0.5微克/毫升(μg/ml)至约5μg/ml之间、在约0.05μg/ml至约0.5μg/ml之间、或小于约0.05mg/ml的体外中和效力(IC50)。
在某些实施方案中，相对于所述抗体或其抗原结合片段对RSV-F或RSV-F DS-Cav1的结合亲和力和/或表位特异性，本发明抗体及其抗原结合片段对在图7A中指定为1、2、3、4、5、6、7、8、9和DG的任一种RSV-F变体的结合亲和力和/或表位特异性减小或消除。
在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段表现出对人偏肺病毒(HMPV)以及RSV的交叉中和效力(IC50)。在某些这样的实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和/或CDRL3氨基酸序列中的至少一个与选自如表6中公开的抗体编号179、188、211、221和229组成的群组的抗体的如表6中公开的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和/或CDRL3氨基酸序列中的至少一个具有至少70％同一性、至少75％同一性、80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性和/或其之间的所有百分比的同一性。
在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段不与D25、MPE8、帕利珠单抗、莫他珠单抗或AM-14一起完成。在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段不与D25、MPE8、帕利珠单抗或莫他珠单抗一起完成。在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段不与MPE8、帕利珠单抗或莫他珠单抗一起完成。在某些实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段不与D25、帕利珠单抗或莫他珠单抗一起完成。在某些实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段不与D25一起完成。在某些实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段不与MPE8一起完成。在某些实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段不与帕利珠单抗一起完成。在某些实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段不与莫他珠单抗一起完成。
在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段与D25、MPE8、帕利珠单抗、莫他珠单抗和/或AM-14中的一种或多种一起完成。
在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段表现出比D25和/或帕利珠单抗大至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约55倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、大于约100倍以及前述中的任一个之间的倍数的中和效力(IC50)。
在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段包含如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRH3氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段包含如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRH2氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段包含如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRH1氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段包含如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRL3氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段包含如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRL2氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段包含如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRL1氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段包含在紧接前面六段中公开的两种、三种、四种、五种或六种特征的任何组合。
在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段包含如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的重链(HC)氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段包含如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的轻链(LC)氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段包含如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的重链(HC)氨基酸序列和轻链(LC)氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段各自选自由与如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一抗体具有至少70％同一性、至少75％同一性、80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、100％同一性和/或其之间的所有百分比的同一性的抗体组成的群组。
在某些实施方案中，本发明抗体及其抗原结合片段各自选自由如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的抗体组成的群组。
在某些实施方案中，提供了分离的核酸序列，其编码特异性结合呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白及其抗原结合片段的抗体或其抗原结合片段，其中此抗体或其抗原结合片段的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和/或CDRL3氨基酸序列中的至少一个与选自如表6中公开的抗体编号124至抗体编号244的抗体的如表6中公开的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和/或CDRL3氨基酸序列中的至少一个具有至少70％同一性、至少75％同一性、80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、100％同一性和/或其之间的所有百分比的同一性。在某些实施方案中，此类核酸序列选自如表6中公开的那些核酸序列及其补体。
在某些实施方案中，提供了分离的核酸序列，其编码本发明抗体及其抗原结合片段，其中此类核酸序列包含编码如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的抗体的CDRH3氨基酸序列的序列。在某些实施方案中，此类核酸序列选自如表6中公开的那些核酸序列及其补体。
在某些实施方案中，提供了分离的核酸序列，其编码本发明抗体及其抗原结合片段，其中此类核酸序列包含编码如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的抗体的CDRH2氨基酸序列的序列。在某些实施方案中，此类核酸序列选自如表6中公开的那些核酸序列及其补体。
在某些实施方案中，提供了分离的核酸序列，其编码本发明抗体及其抗原结合片段，其中此类核酸序列包含编码如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的抗体的CDRH1氨基酸序列的序列。在某些实施方案中，此类核酸序列选自如表6中公开的那些核酸序列及其补体。
在某些实施方案中，提供了分离的核酸序列，其编码本发明抗体及其抗原结合片段，其中此类核酸序列包含编码如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的抗体的CDRL3氨基酸序列的序列。在某些实施方案中，此类核酸序列选自如表6中公开的那些核酸序列及其补体。
在某些实施方案中，提供了分离的核酸序列，其编码本发明抗体及其抗原结合片段，其中此类核酸序列包含编码如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的抗体的CDRL2氨基酸序列的序列。在某些实施方案中，此类核酸序列选自如表6中公开的那些核酸序列及其补体。
在某些实施方案中，提供了分离的核酸序列，其编码本发明抗体及其抗原结合片段，其中此类核酸序列包含编码如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的抗体的CDRL1氨基酸序列的序列。在某些实施方案中，此类核酸序列选自如表6中公开的那些核酸序列及其补体。
在某些实施方案中，提供了分离的核酸序列，其编码本发明抗体及其抗原结合片段，其中此类核酸序列包含编码如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的抗体的重链(HC)氨基酸序列的序列。在某些实施方案中，此类核酸序列选自如表6中公开的那些核酸序列及其补体。
在某些实施方案中，提供了分离的核酸序列，其编码本发明抗体及其抗原结合片段，其中此类核酸序列包含编码如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的抗体的轻链(LC)氨基酸序列的序列。在某些实施方案中，此类核酸序列选自如表6中公开的那些核酸序列及其补体。
在某些实施方案中，提供了分离的核酸序列，其编码本发明抗体及其抗原结合片段，其中所述核酸序列包含各自选自由与如表6中公开的任一核酸序列具有至少70％同一性、至少75％同一性、80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、100％同一性和/或其之间的所有百分比的同一性的序列组成的组的序列及其补体。
在某些实施方案中，提供了表达载体，其包含本文和通篇并且特别是在紧接前面的十段中公开的分离的核酸序列。
在某些实施方案中，提供了用紧接上文公开的核酸序列和/或表达载体转染、转化或转导的宿主细胞。
表位作图和相关技术
如上所述并如实施例中所说明，申请人已经表征了本发明抗体及其抗原结合片段的表位特异性、箱分配和抗原位点分配。除了进行这种表征的方法之外，技术人员可获得各种其他技术，这些技术可用于进行这种表征或以其他方式确定抗体是否与多肽或蛋白质内的“一个或多个氨基酸相互作用”。示例性技术包括，例如，常规交叉阻断测定，如可进行在Antibodies,Harlow和Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)中描述的测定。其他方法包括丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke(2004)Methods MolBiol 248:443-63)、肽裂解分析晶体学研究和NMR分析。另外，可使用方法例如表位切除、表位提取和抗原的化学修饰(Tomer(2000)Protein Science 9:487-496)。可用于识别与抗体相互作用的多肽内的氨基酸的另一种方法是通过质谱法检测的氢/氘交换。一般地说，氢/氘交换方法涉及氘标记目的蛋白质，随后使抗体与氘标记蛋白结合。随后，将蛋白质/抗体复合物转移至水中，并且与并非界面一部分的氨基酸内的可交换质子相比，由抗体复合物保护的氨基酸内的可交换质子以较慢速率经历氘至氢反向交换。因此，形成蛋白质/抗体界面一部分的氨基酸可保持氘并且因此与不包含于界面中的氨基酸相比，展现相对较高质量。在解离抗体后，对靶蛋白进行蛋白酶切割和质谱分析，从而揭示对应于与抗体相互作用的特定氨基酸的氘标记的残基。参见，例如，Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。
如技术人员将理解的，表位可以由连续氨基酸或由蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时得以保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时失去。表位通常包括以独特空间构象的至少3个并且更通常至少5个或8-10个氨基酸。
修饰辅助分析(MAP)也称为基于抗原结构的抗体分析(ASAP)，是根据每一种抗体与化学或酶促修饰抗原表面的结合概况的相似性来将针对相同抗原的大量单克隆抗体(mAb)分类的方法(美国公开号2004/0101920)。每个类别可反映与另一个类别表示的表位明显不同或与其部分重叠的独特表位。这种技术允许快速过滤遗传相同抗体，以使得表征可集中于遗传有差别的抗体。当应用于杂交瘤筛选时，MAP可促进产生具有所需特征的mAb的罕见杂交瘤克隆的鉴定。MAP可用于将本发明抗体分选成结合不同表位的抗体群组。
在某些实施方案中，本发明抗体和/或其抗原结合片段与包含以下氨基酸残基的氨基酸序列相互作用，所述氨基酸残基在例如实施例中公开并在例如图7A中描绘并且指定为RSV F变体1、2、3、4、5、6、7、8、9和DG的一种或多种F蛋白补丁变体方面改变。在某些实施方案中，此类本发明抗体及其抗原结合片段与包含在RSV F变体2方面改变的氨基酸残基的氨基酸序列相互作用。在某些实施方案中，本发明抗体和/或其抗原结合片段与朝RSV-F蛋白的氨基末端或羧基末端延伸超出上文鉴定的一个或多个区域约5至10个氨基酸残基、或约10至15个氨基酸残基、或约15至20个氨基酸残基的氨基酸残基相互作用。
在某些实施方案中，本发明的抗体不与RSV-F蛋白上与帕利珠单抗、莫他珠单抗、MPE8或AM-14相同的表位结合。
如技术人员所理解的，通过使用本领域可获得的常规方法，可以容易地确定抗体是否结合与参考抗RSV-F抗体相同的表位或是否与其竞争结合。例如，为了确定测试抗体是否结合与本发明的参考RSV-F抗体相同的表位，使参考抗体与RSV-F蛋白或肽在饱和条件下结合。接下来，评估测试抗体结合RSV-F分子的能力。如果测试抗体在与参考抗RSV-F抗体的饱和结合后能够结合RSV-F，那么可以断定，测试抗体结合与参考抗RSV-F抗体不同的表位。另一方面，如果测试抗体在与参考抗RSV-F抗体饱和结合后不能结合RSV-F分子，那么测试抗体可结合与本发明的参考抗RSV-F抗体所结合表位相同的表位。
为了确定抗体是否与参考抗RSV-F抗体竞争结合，上述结合方法以两个取向进行：在第一取向上，使参考抗体在饱和条件下与RSV-F分子结合，然后评估测试抗体与RSV-F分子的结合。在第二取向上，使测试抗体在饱和条件下与RSV-F分子结合，接着评估参考抗体与RSV-F分子的结合。如果在两个取向上，仅第一(饱和)抗体能够结合RSV-F分子，那么推断测试抗体和参考抗体竞争结合RSV-F。如本领域普通技术人员所理解的，与参考抗体竞争结合的抗体可能不一定结合与参考抗体相同的表位，但可通过结合重叠或相邻的表位来空间上阻断参考抗体的结合。
如果两种抗体各自竞争性抑制(阻断)另一种抗体与抗原的结合，那么这两种抗体结合相同或重叠表位。也就是说，1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量的一种抗体抑制另一种抗体的结合达至少50％但是优选地75％、90％或甚至99％，如竞争结合测定中所测量(参见，例如，Junghans等人Cancer Res.(1990)50:1495-1502)。可替代地，如果抗原中的减少或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，那么两种抗体具有相同表位。如果减少或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，那么两种抗体具有重叠表位。
然后可进行另外的常规实验(例如，肽突变和结合测定)，以确认所观察到的缺乏试验抗体结合是否事实上由于与参考抗体结合相同表位所致，或是否因立体阻断(或另一现象)造成缺乏观察到的结合。这类实验可使用ELISA、RIA、表面等离子体共振、流式细胞术或本领域中可利用的任何其他定量或定性抗体结合测定来进行。
免疫缀合物
本发明涵盖与治疗部分缀合的人RSV-F单克隆抗体(“免疫缀合物”)，所述治疗部分例如能够降低RSV和/或HMPV原发感染的严重程度，或改善至少一种与RSV感染和/或HMPV感染相关的症状包括咳嗽、发烧、肺炎或其严重程度的剂。这种剂可以是针对RSV-F和/或HMPV的第二种不同抗体，或疫苗。可以与抗RSV-F抗体和/或抗HMPV抗体缀合的治疗部分的类型将考虑待治疗的病状和要实现的所需治疗效果。替代地，如果所需治疗效果是治疗与RSV和/或HMPV感染相关联的后遗症或症状，或由这种感染引起的任何其他病状例如但不限于肺炎，那么缀合适合于治疗病状的后遗症或症状或减轻本发明抗体的任何副作用的剂是有利的。形成免疫缀合物的适合剂的实例在本领域中为已知的，参见例如WO 05/103081。
多特异性抗体
本发明的抗体可为单特异性、双特异性或多特异性。多特异性抗体可对一个靶多肽的不同表位具有特异性或可含有对一个以上靶多肽具有特异性的抗原结合结构域。参见，例如，Tutt等人,1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等人,2004,TrendsBiotechnol.22:238-244。本发明的抗体可与另一种功能分子连接或共表达，例如另一种肽或蛋白。例如，抗体或其片段可与一个或多个其他分子实体功能性连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)，例如用于产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体的另一种抗体或抗体片段。
可用于本发明上下文中的示例性双特异性抗体形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中第一和第二Ig CH3结构域彼此相差至少一个氨基酸，并且其中在与没有氨基酸差异的双特异性抗体相比时，至少一个氨基酸差异减少了双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施方案中，第一Ig CH3结构域结合蛋白A并且第二IgCH3结构域含有减少或消除蛋白A结合的突变，如H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。第二CH3可还包括Y96F修饰(根据IMGT；根据EU为Y436F)。可在第二CH3内发现的其他修饰包括：在IgG1抗体情况下的D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT；根据EU为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗体情况下的N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU为N384S、K392N和V422I)；和在IgG4抗体情况下的Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT；根据EU为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述双特异性抗体形式的变异涵盖在本发明的范围内。
治疗施用和制剂
本发明提供包含本发明抗RSV-F抗体或其抗原结合片段的治疗组合物。根据本发明的治疗组合物的施用将与适合载剂、赋形剂和并入制剂中以提供改进传递、递送、耐受性等的其他剂一起施用。许多适合的制剂可参见所有药物化学家已知的处方集：Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。这些制剂包括例如粉剂、糊膏、软膏、软冻、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(例如LIPOFECTINTM)、DNA缀合物、无水吸收糊膏、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(具有各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含碳蜡(carbowax)的半固体混合物。也参见Powell等人“Compendium ofexcipients for parenteral formulations”PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。
本发明各抗体的剂量可根据待施用的受试者的年龄和体型、目标疾病、病状、施用途径等而变化。当本发明的抗体用于治疗患者的RSV感染和/或HMPV感染，或用于治疗患者的与RSV感染和/或HMPV感染相关的一种或多种症状例如与RSV感染和/或HMPV感染相关的咳嗽或肺炎，或用于减轻疾病的严重程度时，通常以约0.01至约30mg/kg体重、更优选地约0.1至约20mg/kg体重、或约0.1至约15mg/kg体重、或约0.02至约7mg/kg体重、约0.03至约5mg/kg体重、或约0.05至约3mg/kg体重、或约1mg/kg体重、或约3.0mg/kg体重、或约10mg/kg体重、或约20mg/kg体重的单剂量静脉内或皮下施用本发明的各抗体是有利的。可按需要施用多个剂量。根椐病状的严重程度，可调整治疗的频率和持续时间。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以以至少约0.1mg至约800mg、约1至约600mg、约5至约300mg、或约10至约150mg、至约100mg、或至约50mg的初始剂量施用。在某些实施方案中，初始剂量之后可以施用第二或多个后续剂量的抗体或其抗原结合片段，其量可以与初始剂量的量大致相同或更小，其中后续剂量间隔至少1天至3天、至少一周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少12周或至少14周。
各种递送系统是已知的并可用于施用本发明的药物组合物，例如在脂质体包封、微粒、微胶囊、能表达突变病毒的重组细胞、受体介导内吞作用(参见，例如Wu等人(1987)J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入的方法包括但不限于皮内、透皮、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或皮肤粘膜内层(例如，口腔粘膜、鼻粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并可与其他生物活性剂共同施用。施用可为全身性或局部的。其可以作为雾化制剂递送(参见美国公开号2011/031 1515和美国公开号2012/0128669)。用于通过吸入治疗呼吸系统疾病的药剂的递送正变得越来越被广泛接受(参见A.J.Bitonti和J.A.Dumont,(2006),Adv.DrugDeliv.Rev,58:1 106-118)。除了有效治疗局部肺病外，这种递送机制也可用于全身递送抗体(参见Maillet等人(2008),Pharmaceutical Research,第25卷,第6期,2008)。
药物组合物也可在囊泡，尤其脂质体中递送(参见，例如，Langer(1990)Science249:1527-1533)。
在某些情况下，药物组合物可在受控释放系统中递送。在一个实施方案中，可使用泵。在另一个实施方案中，可使用聚合物材料。在又另一个实施方案中，受控释放系统可被放置成接近组合物的靶，因此只需要全身剂量的一部分。
可注射制剂可包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、滴注等的剂型。这些可注射制剂可通过公知的方法制备。例如，可注射制备物可例如通过将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备。用于注射的水性介质例如生理盐水、含葡萄糖的等张溶液和其它辅剂等，其可与下列组合使用：适合的增溶剂，如醇(例如乙醇)；多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)；非离子表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等。可使的用油性介质为例如芝麻油、大豆油等，其可与如苯甲酸苄酯、苄醇等的增溶剂组合使用。由此所制备的注射剂优选地填充于适当的安瓿中。
本发明的药物组合物可由标准针或注射器进行皮下或静脉内递送。此外，就皮下递送来说，笔型递送装置可容易地用于递送本发明的药物组合物。这种笔型递送装置可重复使用或为一次性的。可重复使用的笔型递送装置一般利用含有药物组合物的可更换药筒。一旦药筒内的所有药物组合物施用后并且药筒腾空，那么空药筒可容易丢弃并更换新的含药物组合物的药筒。然后，笔型递送装置便可重复使用。在一次性笔型递送装置中，没有可替换的药筒。取而代之，一次性笔型递送装置预先填充有药物组合物，所述药物组合物被保持在装置内的贮存器中。一旦药物组合物的贮存器腾空，就将整个装置丢弃。
许多可重复使用的笔型和自动注射器递送装置可应用于皮下递送本发明的药物组合物。实例包括但确定不限于AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems,Burgdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX75/25TM笔、HUMALOGTM笔,HUMALIN 70/30TM笔、(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I、II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(NovoNordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(Sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，仅举几例。用于皮下递送本发明药物组合物的一次性笔型递送装置包括但当然不限于SOLOSTARTM笔(Sanofi-Aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(EliLilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM笔(Abbott Labs,Abbott Park IL)，仅举几例。
有利地，上述的用于口服或肠胃外用途的药物组合物被制备成呈适于配合活性成分剂量的单位剂量的剂型。单位剂量的这些剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。所含的前述抗体的量通常为每个以单位剂量的剂型、特别是以注射剂的形式约5至约500mg，优选的是，前述抗体以约5至约100mg并且对于其他剂型来说以约10至约250mg被包含在内。
施用方案
根据某些实施方案，可以在限定的时程内向受试者施用多个剂量的RSV-F和/或HMPV抗体。根据本发明此方面的方法包括向受试者依次施用多个剂量的RSV-F和/或HMPV抗体。如本文所用，“依次施用”意指各剂量的RSV-F和/或HMPV抗体在不同时间点施用给受试者，例如在以预定间隔分开的不同天(例如小时、天、周或月)。本发明包括以下方法，所述方法包括依次向患者施用单次初始剂量的RSV-F和/或HMPV抗体，然后施用一个或多个第二剂量的RSV-F和/或HMPV抗体，并任选地随后施用一个或多个第三剂量的RSV-F和/或HMPV抗体。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指施用RSV-F和/或HMPV抗体的时间顺序。因此，“初始剂量”为治疗方案开始时所施用的剂量(也称为“基线剂量”)；“第二剂量”为在初始剂量之后所施用的剂量；而“第三剂量”为在第二剂量之后所施用的剂量。初始剂量、第二剂量和第三剂量都可含有相同量的RSV-F和/或HMPV抗体，但就施用频率来说，一般可彼此不同。然而，在某些实施方案中，包含在初始剂量、第二剂量和/或第三剂量中的RSV-F和/或HMPV抗体的量在治疗过程期间彼此不同(例如，在适当时上调或下调)。在某些实施方案中，在治疗方案开始时施用的两个或更多个(例如2、3、4或5个)剂量为“负荷剂量”，接着以较低频率为基础施用后续剂量(例如“维持剂量”)。
在本发明的一个示例性实施方案中，各第二和/或第三剂量是紧接前一剂量之后的1至26周(例如1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更久)来施用。如本文中所用的短语“紧接前一剂量”意指在多次施用顺序中，以没有间断剂量的顺序在施用下一剂量之前向患者施用RSV-F和/或HMPV抗体的剂量。
根据本发明的这个方面的方法可包括将任何数量的第二和/或第三剂量的RSV-F和/或HMPV抗体施用给患者。例如，在某些实施方案中，仅将单一第二剂量施用于患者。在其他实施方案中，将两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多个)第二剂量施用于患者。同样的，在某些实施方案中，仅将单一第三剂量施用于患者。在其他实施方案中，将两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多个)第三剂量施用于患者。
在涉及多个第二剂量的实施方案中，各第二剂量可以与其他第二剂量相同的频率来施用。例如，各第二剂量可在紧接前面剂量后1至2周施用于患者。同样的，在涉及多个第三剂量的实施方案中，各第三剂量可以与其他第三剂量相同的频率来施用。例如，各第三剂量可在紧接前面剂量后2至4周施用于患者。或者，施用于患者的第二和/或第三剂量的频率在治疗方案过程内可有所不同。在治疗过程期间，施用频率还可取决于个别患者的需求在临床检查后由医师做出调整。
因此，在某些实施方案中提供了药物组合物，其包含：一种或多种本文和通篇公开的本发明抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载剂和/或一种或多种赋形剂。在某些其他实施方案中提供了药物组合物，其包含：一种或多种编码一种或多种本发明抗体或其抗原结合片段的核酸序列；或一个或多个携带这种核酸序列的表达载体；和药学上可接受的载剂和/或一种或多种赋形剂。
抗体的治疗用途
由于与RSV融合蛋白(RSV-F)的结合和相互作用，据信不希望受任何理论束缚，本发明抗体及其抗原结合片段用于防止病毒与宿主细胞膜的融合，用于防止细胞间病毒蔓延，以及抑制合胞体形成。另外，如申请人在本文中已说明，令人惊讶地是，本发明抗RSV抗体及其抗原结合片段的子集表现出对HMPV的交叉中和效力，本发明抗体及其抗原结合片段当预防性施用时有利于预防受试者感染RSV和/或HMPV。替代地，本发明的抗体可用于改善至少一种与感染相关的症状例如咳嗽、发烧、肺炎，或用于减轻感染的严重程度、持续时间和/或频率。还预期本发明的抗体用于有发展或获得RSV感染和/或HMPV感染风险的患者的预防性用途。这些患者包括早产儿、在RSV季节(晚秋至早春)出生的足月婴儿、老年人(例如，65岁或以上的任何人)和/或HMPV季节、或由于疾病或免疫抑制治疗的治疗而免疫功能低下的患者、或可能具有使其易患RSV感染(例如，囊性纤维化患者、患有充血性心力衰竭或其他心脏病状的患者、气道损伤患者、COPD患者)和/或HMPV感染的潜在医学病症的患者。预期本发明的抗体可单独使用，或与第二剂或第三剂结合使用，所述第二剂或第三剂用于治疗RSV感染和/或HMPV感染，或用于缓解至少一种与RSV感染和/或HMPV感染相关的症状或并发症，例如与这种感染相关或由这种感染引起的发烧、咳嗽、毛细支气管炎或肺炎。第二或第三剂可与本发明抗体同时递送，或其可在本发明抗体之前或之后单独地施用。第二或第三剂可以是抗病毒剂如利巴韦林、NSAID或其他减轻发烧或疼痛的剂，特异性结合RSV-F的另一种第二但不同的抗体，结合另一RSV抗原(如RSV-G)的剂(如抗体)，针对RSV的疫苗，对RSV抗原具有特异性的siRNA。
在本发明的又另一个实施方案中，本发明的抗体用于制备用于治疗罹患RSV感染和/或HMPV感染的患者的药物组合物。在本发明的又另一个实施方案中，本发明的抗体用于制备药物组合物，所述药物组合物用于降低RSV和/或HMPV原发感染的严重程度，或用于减少感染的持续时间，或用于减轻至少一种与RSV感染和/或HMPV感染相关的症状。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体作为辅助疗法与任何其他可用于治疗RSV感染和/或HMPV感染的剂包括抗病毒素、类毒素、疫苗、第二RSV-F抗体或任何其他对RSV抗原具有特异性的抗体包括RSV-G抗体或者本领域技术人员已知的任何其他姑息疗法一起使用。
因此，在某些实施方案中提供了治疗或预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染或至少一种与RSV感染相关的症状的方法，其包括向有此需要或疑似有此需要的患者施用一种或多种本文及通篇公开的本发明抗体或其抗原结合片段，例如表6中公开的一种或多种抗RSV抗体，以使得治疗或预防所述RSV感染，或者治疗、缓解至少一种与RSV感染相关的症状或减轻其严重程度。
在某些其他实施方案中，提供了治疗或预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染或至少一种与RSV感染相关的症状的方法，其包括向有此需要或疑似有此需要的患者施用编码一种或多种本发明抗体或其抗原结合片段的核酸序列，例如表6中公开的核酸序列及其补体，以使得治疗或预防所述RSV感染，或者治疗、缓解至少一种与RSV感染相关的症状或减轻其严重程度。
在另外的实施方案中提供了治疗或预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染或至少一种与RSV感染相关的症状的方法，其包括向有此需要或疑似有此需要的患者施用携带核酸序列的宿主细胞或包含这种核酸序列的表达载体，其中此类核酸序列选自由表6中公开的序列及其补体组成的群组，以使得治疗或预防所述RSV感染，或者治疗、缓解至少一种与RSV感染相关的症状或减轻其严重程度。
在另外的实施方案中提供了治疗或预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染或至少一种与RSV感染相关的症状的方法，其包括向有此需要或疑似有此需要的患者施用包含以下任一种的药物组合物：一种或多种如表6中公开的本发明抗体或其抗原结合片段；一种或多种核酸序列或包含这种核酸序列的表达载体，其中此类核酸序列选自由表6中公开的序列及其补体组成的群组；一种或多种携带一个或多个核酸序列的宿主细胞或包含此类一个或多个核酸序列的表达载体，其中此类核酸序列选自由表6中公开的序列及其补体组成的群组；和药学上可接受的载剂和/或一种或多种赋形剂，以使得治疗或预防所述RSV感染，或者治疗、缓解至少一种与RSV感染相关的症状或减轻其严重程度。
在某些实施方案中提供了治疗或预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染或人偏肺病毒(HMPV)感染或至少一种与所述RSV感染或所述HMPV感染相关的症状的方法，其包括向有此需要或疑似有此需要的患者施用一种或多种本文及通篇公开的本发明抗体或其抗原结合片段，例如表6中公开的一种或多种抗RSV抗体，以使得治疗或预防所述RSV感染，或者治疗、缓解至少一种与RSV感染相关的症状或减轻其严重程度。在某些实施方案中，a)的一种或多种抗体或其抗原结合片段选自由如表6中公开的指定为抗体编号179、188、211、221或229的抗体组成的群组。
在某些其他实施方案中，提供了治疗或预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染或人偏肺病毒(HMPV)感染或至少一种与所述RSV感染或所述HMPV感染相关的症状的方法，其包括向有此需要或疑似有此需要的患者施用编码一种或多种本发明抗体或其抗原结合片段的核酸序列，例如表6中公开的核酸序列及其补体，以使得治疗或预防所述RSV感染，或者治疗、缓解至少一种与RSV感染相关的症状或减轻其严重程度。在某些实施方案中，a)的一种或多种抗体或其抗原结合片段选自由如表6中公开的指定为抗体编号179、188、211、221或229的抗体组成的群组。
在另外的实施方案中提供了治疗或预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染或人偏肺病毒(HMPV)感染或至少一种与所述RSV感染或所述HMPV感染相关的症状的方法，其包括向有此需要或疑似有此需要的患者施用携带核酸序列的宿主细胞或包含这种核酸序列的表达载体，其中此类核酸序列选自由表6中公开的序列及其补体组成的群组，以使得治疗或预防所述RSV感染，或者治疗、缓解至少一种与RSV感染相关的症状或减轻其严重程度。在某些实施方案中，a)的一种或多种抗体或其抗原结合片段选自由如表6中公开的指定为抗体编号179、188、211、221或229的抗体组成的群组。
在另外的实施方案中提供了治疗或预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染或人偏肺病毒(HMPV)感染或至少一种与所述RSV感染或所述HMPV感染相关的症状的方法，其包括向有此需要或疑似有此需要的患者施用包含以下任一种的药物组合物：一种或多种如表6中公开的本发明抗体或其抗原结合片段；一种或多种核酸序列或包含这种核酸序列的表达载体，其中此类核酸序列选自由表6中公开的序列及其补体组成的群组；一种或多种携带一个或多个核酸序列的宿主细胞或包含此类一个或多个核酸序列的表达载体，其中此类核酸序列选自由表6中公开的序列及其补体组成的群组；和药学上可接受的载剂和/或一种或多种赋形剂，以使得治疗或预防所述RSV感染，或者治疗、缓解至少一种与RSV感染相关的症状或减轻其严重程度。在某些实施方案中，a)的一种或多种抗体或其抗原结合片段选自由如表6中公开的指定为抗体编号179、188、211、221或229的抗体组成的群组。
组合疗法
如上所述，根据某些实施方案，所公开的方法包括向受试者施用一种或多种与本发明的RSV-F和/或HMPV抗体或药物组合物组合的另外的治疗剂。如本文所用，表述“与......组合”意指在包括抗RSV-F抗体的抗体或包含抗RSV-F抗体的药物组合物之前、之后或同时施用另外的治疗剂。术语“与......组合”还包括依次或共同施用抗RSV-F抗体和第二治疗剂。
例如，当在包含抗RSV-F抗体的药物组合物“之前”施用时，另外的治疗剂可以在施用包含抗RSV-F抗体的药物组合物之前约72小时、约60小时、约48小时、约36小时、约24小时、约12小时、约10小时、约8小时、约6小时、约4小时、约2小时、约1小时、约30分钟、约15分钟或约10分钟施用。当在包含抗RSV-F抗体的药物组合物“之后”施用时，另外的治疗剂可以在施用包含抗RSV-F抗体的药物组合物之后约10分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时或约72小时施用。“同时”施用或与包含抗RSV-F抗体的药物组合物一起施用意指另外的治疗剂在施用包含抗RSV-F抗体的药物组合物的不到5分钟内(之前、之后或同时)以单独剂型施用给受试者，或以包含另外的治疗剂和抗RSV-F抗体的单一组合剂量制剂施用给受试者。
组合疗法可包括本发明的抗RSV-F抗体和可有利地与本发明抗体，或与本发明抗体的生物活性片段组合的任何另外的治疗剂。
例如，可以使用第二或第三治疗剂来帮助减少肺中的病毒载量，例如抗病毒素，例如利巴韦林。如上所述，抗体还可以与其他疗法结合使用，包括类毒素、对RSV具有特异性的疫苗、对RSV-F具有特异性的第二抗体或对另一RSV抗原(例如RSV-G)具有特异性的抗体。
抗体的诊断用途
本发明抗RSV抗体及其抗原结合片段也可用于检测和/或测量样品中的RSV和/或HMPV，例如达到诊断目的。设想通过使用本发明的任一种或多种抗体测量病毒的存在，可以确认认为由RSV和/或HMPV引起的感染。RSV和/或HMPV的示例性诊断测定可以包括，例如，将得自患者的样品与本发明的抗RSV-F和/或HMPV抗体接触，其中抗RSV-F和/或HMPV抗体用可检测的标记或报告分子标记或用作捕获配体以从患者样品中选择性分离含有F蛋白的病毒。替代地，未标记的抗RSV-F和/或HMPV抗体可与本身被可检测地标记的第二抗体组合用于诊断应用。可检测标记或报告分子可为放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S或125l；荧光或化学荧光部分，例如荧光素异硫氰酸酯或罗丹明；或酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化酶或荧光素酶。可用于检测或测量样品中含有F蛋白的RSV和/或HMPV的具体示例性测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。
可用于根据本发明的RSV和/或HMPV诊断测定的样品包括可在正常或病理学条件下从患者获得的任何组织或流体样品，其含有可检测量的RSV-F蛋白和/或HMPV、或其片段。一般来说，测量得自健康患者(例如未患有与RSV-F和/或HMPV的存在相关的疾病或病状的患者)的特定样品中RSV-F和/或HMPV的水平以初始地建立RSV的F蛋白和/或HMPV的基线或标准水平。然后可以将RSV-F和/或HMPV的此基线水平与得自疑似患有RSV和/或HMPV感染或与此类感染相关的症状的个体的样品中所测量的RSV-F和/或HMPV的水平进行比较。
实施例
申请人通过从健康成年供体的记忆B细胞中分离并表征108种RSV F特异性单克隆抗体，全面描述了对RSV融合蛋白(F)的人抗体应答，并使用这些抗体对RSV F的抗原拓扑图进行全面地作图。确定对RSV F的抗体应答包含靶向几个抗原位点的多种多样的克隆。近一半的最有效抗体靶向RSV F的融合前构象(preF)顶点附近的先前未定义的易感位点，为靶向此区域的RSV抗体以及保留preF蛋白的膜远侧半球的疫苗候选物的发展提供强有力的支持。另外，这类抗体表现出会聚的序列特征，因此提供了快速检测人样品中这些类型抗体的未来手段。此供体的许多结合preF特异性表面的抗体比帕利珠单抗的效力高超过100倍并且有几种交叉中和人偏肺病毒(HMPV)。总之，这些结果对基于RSV疫苗和抗体的治疗候选物的设计和评估具有意义，并为被动预防提供了新的选择。
从健康成年人供体大规模分离RSV F特异性单克隆抗体
为了全面描述对RSV F的人抗体应答，申请人从健康成年供体(“供体003”)的记忆B细胞中分离并表征了约108种单克隆抗体。虽然此供体未记录有RSV感染史，但预计健康成年人终生会有多次RSV感染(26)。
通过用荧光标记的融合前和融合后RSV F分选探针的混合物染色外周B细胞来评估此供体中对RSV F的记忆B细胞应答的量值(图6A至6B)(11，15)。两种蛋白质都经过双重标记，以消除由于非特异性荧光染料结合导致的背景(27)。流式细胞术分析显示，0.04-0.18％的类别转换(IgG+和IgA+)的外周B细胞对RSV F具有特异性(图1A和图B)，这明显低于在实验性RSV感染后观察到的RSV F特异性细胞的百分比，并表明此供体可能最近未暴露于RSV(28)。值得注意的是，指数分选显示17-38％的循环RSV F特异性B细胞表达IgA，表明针对RSV F的IgA记忆B细胞存在于外周血中(图1B)。
将约200个RSV F特异性B细胞从供体样品中单细胞分选出，并通过单细胞PCR拯救抗体可变重链(VH)和可变轻链(VL)基因(29)。随后对超过100个同源重链和轻链对进行克隆，并在工程化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中表达为全长IgG，用于进一步表征(30)。初步结合研究显示，约80％的从RSV F糖蛋白(F)特异性B细胞克隆的抗体与重组RSV F蛋白结合。
RSV F特异性抗体库的序列分析
分离的单克隆抗体的序列分析显示RSV-F特异性库具有高度多样性，包含超过70种独特谱系(图1C和表2)。这结果与在HIV感染患者(31)中或在流感疫苗接种后的健康供体(32)中观察到的相对受限库形成鲜明对比。与非RSV反应性抗体相比(33)，RSV F特异性库一般倾向于某些VH种系基因(VH1-18、VH1-2、VH1-69、VH2-70、VH4-304和VH5-51)(图1D和表2)和较长的重链第三互补决定区(CDRH3)长度(通常，长度约14-18个氨基酸；图1E和表2)。有趣的是，在抗HIV-1、抗流感和抗HCV库中也观察到对VH1-69的倾向(34-36)，并且最近的研究表明，在急性登革热感染期间VH1-18、VH1-2和VH1-69的相对使用量显著增加(37)。因此，看起来这些特定的种系基因区段可能具有促进病毒包膜蛋白识别的固有特性。
体细胞超突变(SHM)的平均水平在每个VH基因(不包括CDRH3)16与30之间个核苷酸取代的范围内(图1F和表2)，其与在抗流感抗体库中观察到的SHM的平均水平相当(32，38)并且与RSV感染的复发性质一致(26)。有趣的是，几种抗体含有40或更多个的VH基因核苷酸取代，这表明多轮RSV感染可导致具有非常高水平的体细胞超突变(SHM)的抗体。
大多数抗体仅与preF结合
我们接下来使用生物层干涉测量法测量了IgG与在融合前(DS-Cav1)或融合后(FΔFP)构象中稳定的弗林蛋白酶切割的RSV F胞外域的表观结合亲和力(11,15)。相对大多数抗体(36-67％)仅与preF结合(图2A和图B；表3)。绝大多数的剩余抗体与preF和postF都结合，只有5-7％的抗体显示出独有的postF特异性(图2A和图B；表3)。在这些供体库中postF特异性抗体的低流行率与观察到低于10％的抗RSV F血清结合活性特异性地靶向postF一致(8)。然而，有趣的是，大多数交叉反应性抗体与postF以较高表观亲和力结合(图2A；表3)，表明这些抗体可能在体内由postF引发和/或是针对postF亲和力成熟的。因此，preF特异性抗体相对于postF特异性抗体的比例显著较高可能是由于preF上独特表面的免疫原性高于postF，而不是由于体内preF丰度增加。最后，如基于RSV亚型之间相对高程度的序列保守性所预期的，大多数抗体示出与衍生自亚型A和B的F蛋白的结合反应性(图2C；表3)。
由于某些抗病毒抗体特异性与多反应性和自身反应性相关(39-41)，我们还使用先前描述的高通量测定测试RSV抗体的多反应性，这种高通量测定与下游行为如血清清除相关(42，43)。还包括177种临床抗体以及几种广泛中和HIV抗体用于比较。有趣的是，与许多先前描述的HIV广泛中和抗体相反，绝大多数RSV F特异性抗体在此测定中缺乏显著的多反应性(图2D)。
RSV F特异性抗体靶向六个主要抗原位点
为了对RSV F特异性抗体的抗原特异性进行作图，申请人首先使用先前描述的基于酵母的测定进行竞争性结合实验(44)。最初测试抗体与D25、AM14和MPE8(三种先前描述的preF特异性抗体(10，17，21))以及莫他珠单抗(结合preF和postF的帕利珠单抗的亲和力成熟变体(10,11,45))的竞争。然后测试非竞争性抗体与位点IV定向mAb(101F)(46)、位点I定向抗体(位点I Ab)和彼此或与任何对照抗体没有强烈竞争的两种高亲和力抗体(分别为高亲和力Ab I和高亲和力Ab 2)的竞争。基于此竞争测定的结果为每种抗体分配箱(参见例如表4)。
为了确认和增加我们的表位分配的分辨率，使用基于luminex的测定测量每种抗体与一组preF变体的结合。每个变体包含2-4个聚集在一起以在preF的表面上形成补丁的突变。产生均匀覆盖preF表面的总共九个补丁(图7A至图7C)。还包括去糖基化的preF以鉴定靶向聚糖依赖性表位的抗体。将每种抗体与10种preF变体的结合与其与野生型preF的结合进行比较，并用于分配补丁(参见例如表4)。使用先前表征的抗体D25、AM14和莫他珠单抗来验证测定(参见例如图7C和表4)。然后使用组合的箱和补丁数据以将每种抗体分配到单个抗原位点(图3A至图3G)，其基于先前确定的结构、抗性突变和F蛋白的二级结构元件来定义。总体而言，这些数据显示绝大多数分离的抗体靶向融合前RSV F上的六个显性抗原位点(I、II、III、IV和V)。有趣的是，只有一小部分分离的抗体具有与AM14类似的结合特性，表明在自然感染期间通常不会引发靶向此四元表位的抗体。没有一种抗体对F的去糖基化敏感，表明天然RSV感染也很少引发聚糖依赖性抗体。
对靶向每个抗原位点的抗体的preF和postF结合活性的分析(参见，例如，图3C至图3G；表4)显示三个位点主要在preF上发现(III和V)。先前已经描述了靶向位点和位点III的抗体(10，17)，并且这些位点分别位于preF纤突的顶部和侧面。此供体的大于20％的抗体识别位点并且约22％的抗体识别位点III。此供体的相对大多数抗体(约14％)识别第三preF特异性位点，其先前未被描述并且因此在本文中被指定为区域位点V(参见例如图3C至图3G；表4)。大多数位点V抗体与D25、MPE8和莫他珠单抗竞争，考虑到这三种抗体识别的表位之间的距离，这是出乎意料的。补丁突变体分析显示这些抗体与preF的α3螺旋和β3/β4发夹相互作用。此区域位于D25、MPE8和莫他珠单抗所识别的表位之间，解释了对这类抗体观察到的不寻常的竞争特性(参见例如图8)。除了三个主要的preF特异性位点之外，大量识别抗原位点IV的抗体具有preF特异性，可能是由于与β22的接触，β22在从preF过渡到postF期间显著重排。总之，表位作图数据显示大多数分离的抗体靶向六个显性抗原位点，其中约一半仅在preF上表达。
高效中和抗体靶向preF特异性表位
接着使用先前描述的高通量中和测定测试抗体针对RSV亚型A和B的中和活性(15)。大于60％的分离的抗体显示出中和活性，并且约20％以高效力中和(IC50≤0.05μg/ml)(参见例如图4A和图4B；表3)。值得注意的是，几种克隆不相关的抗体比D25的效力大≥5.0倍，并且比帕利珠单抗的效力大≥100倍(参见例如图4A；表3)。有趣的是，中和效力与SHM水平之间没有相关性，这表明广泛的SHM不是RSV强效中和所必需的。与结合交叉反应性数据一致，大多数中和抗体显示出对亚型A和B的活性(图4A至图4C；表3)。
接下来研究了preF结合亲和力和postF结合亲和力与中和效力之间的关系，其清楚地证明大多数高效抗体优先或仅结合preF(参见例如图4D至图4G；表3)。量化这种差异表明，超过80％的高效抗体(IC50<0.05μg/ml)对preF具有特异性(参见，例如图9；表3)，并且preF特异性抗体的中值IC50比preF和postF交叉反应抗体低超过8倍，并且比特异性识别postF的抗体低80倍(参见例如图4E；表3)。重要的是，preF结合与中和之间存在正相关性(P<0.001，r＝0.24)，并且表观preF KD一般与中和IC50完全对应(参见，例如图5A；表3)。相反，中和效力与postF亲和力之间没有相关性(P＝0.44，r＝-0.07)(参见，例如图5B；表3)。这个结果与抗体介导的中和的占有模型相当(47)，并且表明DS-Cav1是天然preF三聚体的可靠抗原模拟物。值得注意的是，非常少的抗体以低于100pM的IC50中和，这与以前提出的升限到亲和力成熟一致(48，49)。
接下来分析中和效力与抗原位点之间的关系。在例如图5C、表3和表4中提供的结果共同指出，超过60％的高效中和抗体靶向抗原位点和V，抗原位点和V是三个融合前F特异性位点中的两个。相反，靶向位点III和IV的抗体显示出广泛的中和效力，并且靶向位点I和II的抗体通常是中度至非中和的。使用针对亚型B测量的结合亲和力和中和效力获得了类似的结果(参见，例如，图10A至图10C；表3和表4)。有趣的是，位点IV定向抗体的子集以基于preF结合亲和力预期的效力显著更低的效力中和(参见，例如，图5A；表3)。这个结果可能表明，在病毒粒子的拥挤表面上表达的天然包膜纤突的情况下，位点IV内的某些表位与在重组preF上的情况相比暴露较少。
几种抗体交叉中和RSV和HMPV
鉴于RSV和人偏肺病毒(HMPV)F蛋白共有33％的氨基酸同一性，并且某些RSV F特异性抗体交叉中和HMPV(17，50)，测试此供体的抗体对HMPV的中和活性。在测试的108种抗体中，5种中和HMPV，并且2种显示出对HMPV和RSV两者的高效活性(参见例如表5)。序列分析显示，五种抗体代表两种不同的克隆家族，其利用不同的VH种系基因并具有不同的CDRH3长度和体细胞超突变水平(参见，例如，表2和序列表)。所有交叉中和抗体仅与preF结合并与MPE8竞争(参见，例如，表5)，与之前的研究一致，这指示MPE8交叉中和四种肺病毒，包括RSV和HMPV(17)。此结果尤其表明，高度保守的表位在天然RSV和/或HMPV感染的情况下具有相对免疫原性。
RSV F特异性抗体的亲和力成熟：
一些实施方案涉及表6中列出的任何抗体的亲和力成熟抗体(各自被理解为用于产生亲和力成熟变体的“亲本抗体”)。可以通过诱变亲本抗体的任一个或多个CDR来产生亲和力成熟抗体。根据具体实施方案，本发明提供亲和力成熟变体，其在表6中列出的任一抗体的每个CDR序列中或在包含表6中列出的任一抗体的六个CDR序列的抗体的每个CDR序列中包含一个或多个点突变例如0、1、2或3个点突变。亲和力成熟变体可以通过采用例如用于优化结合特征例如增加结合的亲和力、或增加Kon、或降低Koff的标准诱变技术的任何亲和力成熟方法产生并且可以特征为与亲本抗体相比KD相差至少2倍、5倍、1个对数、或2个对数、或3个对数。这种亲和力成熟抗体仍然具有与亲本抗体相同的结合特异性以及例如结合靶表位的最佳亲和力。
鉴定了选择的抗RSV抗体的亲和力成熟。订购寡核苷酸，其包含经由NNK多样性来多样化的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。如前所述，通过DNA改组将NNK寡核苷酸掺入亲本HC或LC中(Stemmer WP等人,DNA shuffling by random fragmentationand reassembly:In vitro recombination for molecular evolution.Proc Natl AcadSci USA.1994年10月25日；91(22):10747-51)。然后通过将VH和VL PCR产物转化到已经含有亲本的轻链或重链质粒的酵母中来产生文库。然后使用流式细胞术选择多样化的文库。对于每轮FACS，使用递减量的抗原对文库进行亲和力加压，并且对具有改善的结合亲和力的克隆进行分选和繁殖。一旦通过流式细胞术(通常两轮选择)观察到改善的结合群体，就挑选单个酵母克隆用于测序和表征(表6)。
具体实施方案是指表6中抗体128、133和227的亲和力成熟变体。值得注意的是，编号为232和233的抗体是表6中编号为128的抗体的亲和力成熟变体，编号为234-236的抗体是表6中编号为133的抗体的亲和力成熟变体，并且编号为237-244的抗体是表6中编号为227的抗体的亲和力成熟变体。
亲和力成熟抗体的抗体产生和纯化
使酵母克隆生长至饱和，然后在30℃下振荡诱导48小时。在诱导之后，将酵母细胞沉淀并且收获上清液以用于纯化。将IgG使用蛋白质A柱纯化并且用乙酸，pH 2.0洗脱。通过木瓜蛋白酶消化产生Fab片段并且经KappaSelect(GE Healthcare LifeSciences)纯化。
基于ELISA的微中和测定中的RSV体外中和
使用RSV-A菌株A2(ATCC，VR1540P)在基于ELISA的微中和测定中测试体外RSV中和。将病毒(最终感染复数为约0.25)加入96孔板中，所述96孔板含有在无血清MEM中连续稀释的mAb，并在4℃下预温育30分钟。将新鲜胰蛋白酶消化Hep-2细胞(1.5×10E4个细胞/孔)加入到每孔中的补充有5％FCS的MEM中。在37℃和5％CO2下温育4天后，吸出培养基并用200μl PBS/孔洗涤细胞两次，空气干燥并用100μl丙酮(80％)固定。通过ELISA量化表达的病毒蛋白来测量RSV复制。出于此目的，将固定的细胞用PBS-0.1％Tween-20洗涤2次，用含1％脱脂乳的PBS在室温下封闭1小时，然后在室温下在封闭缓冲液中用多克隆山羊抗RSV抗体制剂(BioRad，编号7950-0004)染色1小时。使用驴抗山羊IgG HRP缀合物作为检测试剂并且将1step-Ultra TMB(Thermo Fisher Scientific，编号34209)作为底物。相对于在不存在中和抗体的情况下用病毒感染的对照细胞计算病毒复制的抑制％。在所有实验中包括同种型匹配的对照mAb。mAb效力表述为导致病毒复制减少50％的半数最大抑制浓度(IC50)。结果如图11所示，并且证明所有mAb均能在此设定中中和RSV-A2，其中IC50值范围广，范围为8.5ng/ml(ADI-31674)至495.5ng/ml(ADI-31379)。
论述
深入理解人抗体对RSV感染的应答将有助于用于治疗和/或预防RSV感染的RSV疫苗和治疗性和/或预防性抗体候选物的开发和评估。尽管先前的研究已经对人血清中RSV特异性中和抗体所靶向的表位进行了粗略作图(4，8)，但天然RSV感染诱导的抗体的特异性和功能性仍然很大程度上未定义。如本文所公开的，使用preF和postF稳定蛋白质(11，15)、高通量抗体分离平台和结构引导的融合前F突变体集合以在天然感染的成年供体中在克隆上剖析人记忆B细胞对RSV F的应答，并且分离和表征了高效且选择性RSV中和，以及高效抗RSV/抗HMPV交叉选择性和交叉中和。
在所分析的库中，preF特异性抗体与识别preF和postF的抗体的比率略大于1:1(参见例如图2B)。这些值略低于针对人血清所报告的值，其显示约70％的抗F血清结合对preF具有特异性(8)。这种差异可能是血清中单个抗体水平之间的差异、对于特定特异性实现的B细胞表型的差异或供体之间的差异的结果。尽管存在这些微小差异，但两项研究的结果表明，preF特异性表位以及preF和postF共有的表位在自然RSV感染期间具有免疫原性，而postF上的独特表面的免疫原性显著较小。
本文公开的库分析显示，绝大多数RSV F特异性抗体靶向融合前RSV F上的六个显性抗原位点：I、II、III、IV和V。这些位点是基于先前确定的结构、表位分箱/竞争测定、抗性突变和preF蛋白的二级结构元件来定义的。重要的是，要注意，描述RSV F抗原位点的命名法随着时间的推移而发展(6，51-57)，并且先前的作图工作是基于F的融合后构象，并且不包括仅存在于preF上的表面。preF的晶体结构提供了关于F结构和功能的关键信息，以及用于对在preF的独特表面和与postF共有的表面上的抗体结合位点进行作图的新试剂。大致上，可以将每个抗体主要分配给这些位点中的一个。然而有可能的是，抗体表位可能覆盖F的整个表面，并且存在结合原体内的两个或更多个相邻抗原位点的抗体和在原体上结合的四元抗体。
重要的是，本文公开的结果显示最有效中和抗体靶向抗原位点和V，两者都位于preF三聚体的顶点附近。这些发现与从人血清作图获得的结果一致，其确定大多数中和活性可以通过与preF预温育而除去(4，8)，并且除了位点之外的preF特异性位点构成了preF特异性中和抗体的相当大的一部分(8)。虽然抗原位点已显示是有效中和抗体的靶标(8，10)，但抗体与位点V的相互作用尚不清楚。有趣的是，发现大多数位点V定向抗体共有几个会聚序列特征，表明有可能使用高通量测序技术快速检测人类样品中的这些类型的抗体(58)。申请人预期这项发现特别有利于分析对RSV疫苗候选物的抗体应答，RSV疫苗候选物旨在保留preF三聚体的顶点。
这里描述的广泛的抗体组为被动预防以及RSV感染的治疗提供了新的机会。大量的这些抗体比D25更有效地中和RSV，D25充当MEDI8897的基础，MEDI8897是一种单克隆抗体，目前正在临床试验中用于预防年轻、有风险的儿童的RSV(59)。另外，这些抗体的子集被证明交叉中和HMPV。
有效的RSV疫苗的开发带来了许多独特的挑战，并且最佳疫苗接种策略的选择将是至关重要的。本文提供的对人抗体对天然RSV感染的应答的深入分析为这种疫苗的开发提供了启示。重要的是，结果表明，使免疫前供体免疫接种preF免疫原预期可以加强中和响应，而使用postF免疫原可能会扩增具有中度或弱中和活性的B细胞克隆。类似地，与postF免疫原相比，使RSV原初婴儿免疫接种preF免疫原预期将活化靶向与明显更强效中和活性相关的表位的原初B细胞。此外，理想的RSV疫苗应保留抗原位点和V，因为这些位点是响应于天然RSV感染引起的最高效抗体所靶向的。
因此，本文公开了高选择性并且高效的抗RSV抗体、以及高效的交叉中和抗RSV和抗HMPV抗体、以及候选疫苗，其用于治疗和/或预防RSV和/或HMPV感染。另外，文中公开的试剂提供了一组用于评估临床试验的有用工具，这对于从目前正在研究的许多项中选择最佳的基于RSV疫苗接种或抗体的治疗策略是至关重要的(60)。
表1：原型RSV抗体靶向的抗原位点
表2：抗RSV抗体的种系使用和序列信息
表3：抗RSV抗体的亲和力和中和数据
*NN，非中和；NB，非结合；ND，未确定。计算BLI结合应答>0.1nm的抗体的IgG KD。将BLI结合应答<0.05nm的抗体指定为NB。
表4：抗RSV抗体的箱、补丁和抗原位点分配
**两种位点III抗体显示对补丁1和/或2的弱破坏结合。这种破坏比对D25竞争物所观察到的要弱得多。
表5：抗RSV F抗体的子集交叉中和人偏肺病毒。
NB，非结合物；N/A，不适用
*结合位点分配仅基于竞争。
材料和方法
研究设计
为了分析抗体对RSV F的应答，从约20-35岁之间的成年供体获得外周血单核细胞，并从中分离RSV F反应性B细胞的单克隆抗体。通过测序、结合、表位作图和中和测定来表征抗体。在志愿者知情同意下收集此研究的所有样品。这项研究是非盲的并且不是随机的。对每个测定进行至少两次独立实验。
生成RSV F分选探针
可溶性融合前和融合后探针是基于我们先前进行结晶并确定分别处于融合前和融合后构象的RSV FΔFP和DS-Cav1构建体(11，15)。为了增加探针的亲合力并均匀地定向RSV F蛋白，通过C末端AviTag的生物素化将三聚体RSV F蛋白与四聚体链霉抗生物素蛋白偶联。对于每个探针，将C末端His-Avi标记型式和C末端StrepTagII型式共转染到FreeStyle 293-F细胞中。首先在Ni-NTA树脂上纯化分泌的蛋白质以除去缺少His-Avi标记的三聚体。然后在Strep-Tactin树脂上纯化Ni-NTA纯化的洗脱液。由于单个StrepTagII对Strep-Tactin树脂的亲合力低，因此额外的洗涤步骤能够除去单个StrepTagged三聚体。这导致纯化含有两个StrepTagII标记的单体和因此仅一个His-Avi标记的单体的三聚体。此纯化方案产生每个三聚体单个AviTag，其极大地减少了当含有三个AviTag的三聚体蛋白质与四聚体链霉抗生物素蛋白一起温育时发生的聚集或‘菊花链接’。根据制造商的说明书(Avidity，LLC)，使用生物素连接酶BirA对RSV F三聚体进行生物素化。通过在Superdex200柱(GE Healthcare)上进行尺寸排阻色谱法将生物素化蛋白质与过量的生物素分离。使用Quant*Tag生物素试剂盒按照制造商的说明书(Vector Laboratories)进行每个RSV F三聚体的生物素部分数量的定量。
单B细胞分选
使用抗人IgG(BV605)、IgA(FITC)、CD27(BV421)、CD8(PerCP-Cy5.5)、CD14(PerCP-Cy5.5)、CD19(PECy7)、CD20(PECy7)和双标记的DS-Cav1和FΔFP四聚体的混合物(各50nM)染色外周血单核细胞。通过将单独的AviTagged RSV F蛋白与优级藻红蛋白标记的链霉抗生物素蛋白(Molecular Probes)或优级别藻蓝蛋白标记的链霉抗生物素蛋白在冰上以4:1的摩尔比温育至少20分钟来产生双标记的RSV F四聚体。为每个实验制备新鲜的四聚体。将单细胞在BD荧光激活细胞分选仪Aria II上分选到含有20μL/孔裂解缓冲液[5μL 5X第一链cDNA缓冲液(Invitrogen)、0.25μL RNaseOUT(Invitrogen)、1.25μL二硫苏糖醇(Invitrogen)、0.625μL NP-40(New England Biolabs)和12.6μL dH2O]的96孔PCR板(BioRad)中。将板立即在干冰上冷冻，然后在-80℃下储存。
抗体可变基因的扩增和克隆
如前所述(22)进行单B细胞PCR。简言之，通过RT-PCR和使用IgG和IgA特异性引物的混合物的巢式PCR反应扩增IgH、Igλ和Igκ可变基因(22)。在第二轮PCR中使用的引物含有40个与切割表达载体的5'和3'同源的碱基对，以允许通过同源重组克隆到酿酒酵母中(40)。使用乙酸锂法将PCR产物克隆到酿酒酵母中进行化学转化(41)。每个转化反应含有20μL未纯化的重链和轻链PCR产物和200ng切割的重链和轻链质粒。转化后，挑选单个酵母菌落用于测序和表征。
IgG和Fab片段的表达和纯化
如前所述(23)，在24孔板中生长的酿酒酵母培养物中表达抗RSV F IgG。通过在30℃下用木瓜蛋白酶消化IgG 2小时产生用于竞争测定的Fab片段。通过加入碘乙酰胺终止消化，并使Fab和Fc混合物通过蛋白A琼脂糖以除去Fc片段和未消化的IgG。然后将蛋白A树脂的流过物通过CaptureSelectTM IgG-CH1亲和树脂(ThermoFischer Scientific)，并用200mM乙酸/50mM NaCl pH 3.5洗脱到1/8体积2M Hepes pH 8.0中。然后将Fab片段缓冲液交换到pH7.0的PBS中。
生物层干涉测量结合分析
使用FortéBioOctetHTX仪器(Pall Life Sciences)通过BLI测量确定IgG与DS-Cav1和FΔFP的结合。对于高通量KD筛选，将IgG固定在AHQ传感器(Pall Life Sciences)上并暴露于含有0.1％BSA(PBSF)的PBS中的100nM抗原进行缔合步骤，然后在PBSF缓冲液中进行解离步骤。使用FortéBio数据分析软件7分析数据。将数据拟合至1:1结合模型以计算缔合和解离速率，并使用比率kd/ka计算KD。
抗体竞争测定
如前所述(23)进行抗体竞争测定。通过对照抗RSV F Fab抑制酵母表面表达的抗RSV F IgG与DS-Cav1或FΔFP的结合的能力来测量抗体竞争。将50nM生物素化的DS-Cav1或FΔFP与1μM竞争物Fab在室温下预温育30分钟，然后加入到表达抗RSV F IgG的酵母的悬浮液中。通过用含有0.1％BSA(PBSF)的PBS洗涤除去未结合的抗原。洗涤后，使用以1:500稀释的链霉抗生物素蛋白Alexa Fluor 633(Life Technologies)检测结合的抗原，并使用FACSCanto II(BD Biosciences)通过流式细胞术分析。通过测量在竞争物Fab存在下的抗原结合相对于仅抗原对照的倍数降低来评估竞争水平。相对于仅抗原对照，在对照Fab存在下观察到大于5倍的降低时，抗体被认为是竞争物。
preF补丁变体的表达、纯化和生物素化
基于融合前RSV F的结构设计了一组均匀覆盖preF分子表面的9个具有2-4个突变的补丁(10)。对于已知的抗原位点，包括由莫他珠单抗、101F、D25、AM14和MPE8识别的那些，补丁掺入了与病毒逃逸相关的残基或已知对抗体结合是关键的残基。在可能的情况下避免了跨184个亚型A、亚型B和牛RSV F序列的具有高保守性的残基，以最小化破坏蛋白质结构的可能性。每个补丁变体中存在的突变显示在图7A中。将每个补丁变体的突变克隆到具有C末端AviTag的融合前稳定的RSV F(DS-Cav1)构建体中，用于位点特异性生物素化。蛋白质从FreeStyle 293-F细胞分泌，在Ni-NTA树脂上纯化并根据制造商的说明书(Avidity，LLC)使用生物素连接酶BirA进行生物素化。通过在Superdex 200柱(GE Healthcare)上进行尺寸排阻色谱法将生物素化蛋白质与过量的生物素分离。通过在1μM几夫碱存在下表达DS-Cav1并在生物素化之前用10％(wt/wt)EndoH消化来产生去糖基化型式的DS-Cav1。
用于补丁变体结合的Luminex测定
使用高通量Luminex测定法测定分离的抗体与补丁变体的结合。将每种生物素化的变体和DS-Cav1对照与抗生物素蛋白包被的MagPlex珠子(Bio-Rad)偶联，每个珠子具有珠子识别号，其反映嵌入珠子内的红色和红外染料的独特比率。然后将偶联的珠子与每种抗体的六倍连续稀释液(在400nM至1.4pM的范围内)在384孔板中混合。在与PE缀合的小鼠抗人IgG Fc二抗(Southern Biotech)温育之前，使用磁性微量板洗涤器(BioTek)洗涤珠子。将珠子分类并使用FLEXMAP 3D流式细胞仪(Luminex)测量PE的结合。
RSV中和测定
如前所述(61)制备和维持病毒原液。如Hotard等人(62)报道的，构建表达原型亚型A(菌株A2)和亚型B(18537)F基因的重组mKate-RSV和Katushka荧光蛋白。将HEp-2细胞维持在伊格尔氏最低必需培养基中，所述培养基含有补充有谷氨酰胺、青霉素和链霉素的10％胎牛血清。通过荧光板读数器中和测定来测量抗体中和(15)。将含有2.4×104个HEp-2细胞的30μL培养基溶液接种在384孔黑色光学底板(Nunc，Thermo Scientific)中。将IgG样品从1:10连续稀释4倍至1:163840，并加入等体积的重组mKate-RSV A2。将样品混合并在37℃下温育1小时。温育后，将50μL样品和病毒的混合物加入384孔板中的细胞中，并在37℃下温育22-24小时。然后在Ex 588nm和Em 635nm(SpectraMax Paradigm，分子装置)下在微板读数仪中测量测定板的荧光强度。使用Prism(GraphPad Software Inc.)通过曲线拟合计算每个样品的中和IC50。
人偏肺病毒中和测定
将预定量的表达GFP的hMPV重组病毒(NL/1/00，A1亚谱系，Bernadette van denHoogen和Ron Fouchier,Rotterdam,the Netherlands惠赠)与单克隆抗体的连续稀释液混合，然后加入在具有补充10％胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基的96孔板中生长的Vero-118细胞培养物中。36小时后，除去培养基，加入PBS，并且用Tecan微板读数仪M200测量每孔GFP的量。荧光值表示为没有抗体的病毒对照的百分比。
多反应性测定
使用先前描述的测量与溶解的CHO细胞膜制剂(SMP)结合的高通量测定(43)来评估抗体多反应性。简而言之，将200万个IgG呈递酵母转移到96孔测定板中并沉淀以除去上清液。将沉淀再悬浮于50μL 1:10稀释的原液b-SMP中，并在冰上温育20分钟。然后用冰冷的PBSF洗涤细胞两次，并将细胞沉淀再悬浮于50μL次级标记混合物(Extravidin-R-PE，抗人LCFITC和碘化丙锭)中。将混合物在冰上温育20分钟，然后用冰冷的PBSF洗涤两次。然后将细胞再悬浮于100μL冰冷的PBSF中，并使用HTS样品注射器在FACSCanto II(BDBiosciences)上运行板。分析流式细胞术数据用以R-PE信道中的平均荧光强度，并归一化至适当的对照以评估非特异性结合。
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下表6中提供了非正式的序列表。抗体124-231的非正式序列表提供包含在108个抗体中的每一个中的以下十六(16)个序列元件，抗体如上所述鉴定并指定为抗体编号(Ab#)124至231，序列元件顺序如下：
·重链可变区(“HC”)核酸序列
·重链可变区(“HC”)氨基酸序列
·重链可变区CDR H1(“H1”)氨基酸序列
·重链可变区CDR H1(“H1”)核酸序列
·重链可变区CDR H2(“H2”)氨基酸序列
·重链可变区CDR H2(“H2”)核酸序列
·重链可变区CDR H3(“H3”)氨基酸序列
·重链可变区CDR H3(“H3”)核酸序列
·轻链可变区(“LC”)核酸序列
·轻链可变区(“LC”)氨基酸序列
·轻链可变区CDR L1(“L1”)氨基酸序列
·轻链可变区CDR L1(“L1”)核酸序列
·轻链可变区CDR L2(“L2”)氨基酸序列
·轻链可变区CDR L2(“L2”)核酸序列
·轻链可变区CDR L3(“L3”)氨基酸序列
·轻链可变区CDR L3(“L3”)核酸序列
抗体232-244的非正式序列表提供包含在13个抗体中的每一个中的以下十(10)个序列元件，抗体如上所述鉴定并指定为抗体编号(Ab#)232至244，序列元件顺序如下：
·重链可变区(“HC”)核酸序列
·重链可变区(“HC”)氨基酸序列
·重链可变区CDR H1(“H1”)氨基酸序列
·重链可变区CDR H2(“H2”)氨基酸序列
·重链可变区CDR H3(“H3”)氨基酸序列
·轻链可变区(“LC”)核酸序列
·轻链可变区(“LC”)氨基酸序列
·轻链可变区CDR L1(“L1”)氨基酸序列
·轻链可变区CDR L2(“L2”)氨基酸序列
·轻链可变区CDR L3(“L3”)氨基酸序列
表6：非正式序列表
另外的实施方案
实施方案1.一种与呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白(F)特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或所述其抗原结合片段的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列中的至少一个与选自如表6中公开的抗体编号124至抗体编号244的抗体的如表6中公开的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和/或CDRL3氨基酸序列中的至少一个具有至少70％同一性、至少75％同一性、80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％和/或其之间的所有百分比的同一性；并且其中所述抗体或所述其抗原结合片段还具有下列特征中的一个或多个：
a)所述抗体或所述其抗原结合片段与所述抗体或其抗原结合片段交叉竞争结合RSV-F；
b)所述抗体或其抗原结合片段相对于PostF形式对RSF-F的PreF形式表现出更好的结合亲和力；
c)所述抗体或其抗原结合片段表现出无或低多反应性特性；
d)所述抗体或其抗原结合片段表现出在体外对RSV亚型A和RSV亚型B的中和活性；
e)所述抗体或其抗原结合片段表现出在位点位点I、位点II、位点III、位点IV或位点V处对RSV-F的抗原位点特异性；
f)所述抗体或其抗原结合片段相对于RSV-F位点I、位点II或位点IV表现出对RSV-F位点位点V或位点III的抗原位点特异性；
g)所述抗体或其抗原结合片段与之相互作用的表位的至少一部分包含PreF的α3螺旋和β3/β4发夹；
h)所述抗体或其抗原结合片段表现出在约0.5微克/毫升(μg/ml)至约5μg/ml之间、在约0.05μg/ml至约0.5μg/ml之间、或小于约0.05mg/ml的体外中和效力(IC50)；
i)相对于所述抗体或其抗原结合片段对RSV-F或RSV-F DS-Cav1的结合亲和力和/或表位特异性，所述抗体或其抗原结合片段对在图7A中指定为1、2、3、4、5、6、7、8、9和DG的任一种RSV-F变体的结合亲和力和/或表位特异性减小或消除；
j)所述抗体或其抗原结合片段表现出对人偏肺病毒(HMPV)的交叉中和效力(IC50)；
k)所述抗体或其抗原结合片段不与D25、MPE8、帕利珠单抗或莫他珠单抗一起完成；或
l)所述抗体或其抗原结合片段表现出比D25和/或帕利珠单抗大至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约55倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、大于约100倍以及前述中的任一个之间的倍数的中和效力(IC50)。
实施方案2.根据实施方案1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：特征a)至l)中的至少两个、至少三个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个或至少12个。
实施方案3.根据实施方案1或2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRH3氨基酸序列；
b)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRH2氨基酸序列；
c)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRH1氨基酸序列；
d)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRL3氨基酸序列；
e)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRL2氨基酸序列；
f)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRL1氨基酸序列；或
g)a)、b)、c)、d)、e)和f)中的两个或更多个的任何组合。
实施方案4.根据实施方案1至3中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的重链(HC)氨基酸序列；和/或
b)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的轻链(LC)氨基酸序列。
实施方案5.根据实施方案1至4中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自由与如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体具有至少70％同一性、至少75％同一性、80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％和/或其之间的所有百分比的同一性的抗体组成的群组。
实施方案6.根据实施方案1至5中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自由如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的所述抗体组成的群组。
实施方案7.一种分离的核酸序列，其编码根据实施方案1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
实施方案8.一种表达载体，其包含根据实施方案7所述的分离的核酸序列。
实施方案9.一种用根据实施方案7所述的核酸序列或根据实施方案8所述的表达载体转染、转化或转导的宿主细胞。
实施方案10.一种药物组合物，其包含：根据实施方案1至6中任一项所述的一种或多种分离的抗体或其抗原结合片段；和药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
实施方案11.一种药物组合物，其包含：根据实施方案7所述的一种或多种核酸序列；或根据实施方案8所述的一种或多种表达载体；和药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
实施方案12.一种转基因生物体，其包含根据实施方案7所述的核酸序列；或根据实施方案8所述的表达载体。
实施方案13.一种治疗或预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染或与RSV感染相关的至少一种症状的方法，其包括向有此需要或疑似有此需要的患者施用：
a)根据实施方案1至6中任一项所述的一种或多种抗体或其抗原结合片段；
b)根据实施方案7所述的核酸序列；
c)根据实施方案8所述的表达载体；
d)根据实施方案9所述的宿主细胞；或
e)根据实施方案10或实施方案11所述的药物组合物；
使得治疗或预防所述RSV感染，或者治疗、缓解所述至少一种与RSV感染相关的症状或减轻其严重程度。
实施方案14.一种治疗或预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染或人偏肺病毒(HMPV)感染，或至少一种与所述RSV感染或所述HMPV感染相关的症状的方法，其包括向有此需要或疑似有此需要的患者施用：
a)根据实施方案1至6中任一项所述的一种或多种抗体或其抗原结合片段；
b)根据实施方案7所述的核酸序列；
c)根据实施方案8所述的表达载体；
d)根据实施方案9所述的宿主细胞；或
e)根据实施方案10或实施方案11所述的药物组合物；
使得治疗或预防所述RSV感染，或者治疗、缓解所述至少一种与RSV感染相关的症状或减轻其严重程度。
实施方案15.根据实施方案14所述的方法，其中a)的所述一种或多种抗体或其抗原结合片段选自由如表6中公开的指定为抗体编号179、188、211、221或229的抗体组成的群组。
实施方案16.根据实施方案13至15中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述患者施用第二治疗剂。
实施方案17.根据实施方案16所述的方法，其中所述第二治疗剂选自由以下组成的群组：抗病毒剂；对RSV具有特异性的疫苗、对流感病毒具有特异性的疫苗或对偏肺病毒(MPV)具有特异性的疫苗；对RSV抗原或偏肺病毒(MPV)抗原具有特异性的siRNA；对RSV抗原或偏肺病毒(MPV)抗原具有特异性的第二抗体；抗IL4R抗体、对流感病毒抗原具有特异性的抗体、抗RSV-G抗体和NSAID。
实施方案18.一种药物组合物，其包含根据实施方案1至7中任一项所述的任一种或多种分离的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
实施方案19.根据实施方案18所述的药物组合物，其用于预防有此需要或疑似有此需要的患者的呼吸道合胞病毒(RSV)感染，或用于治疗罹患RSV感染的患者，或用于改善与所述感染相关的至少一种症状或并发症，其中由于所述使用，预防所述感染，或者预防、改善至少一种与所述感染相关的症状或并发症或减少其严重程度和/或持续时间。
实施方案20.根据实施方案18所述的药物组合物，其用于治疗或预防有此需要或疑似有此需要的患者的呼吸道合胞病毒(RSV)感染或人偏肺病毒(HMPV)感染，或与所述RSV感染或所述HMPV感染相关的至少一种症状，其中由于所述使用，预防所述感染，或者预防、改善至少一种与所述感染相关的症状或并发症或减少其严重程度和/或持续时间。
实施方案21.根据实施方案18的药物组合物在药物制造中的用途，所述药物用于预防有此需要的患者的呼吸道合胞病毒(RSV)感染，或用于治疗罹患RSV感染的患者，或用于改善与所述感染相关的至少一种症状或并发症，其中预防所述感染，或者预防、改善至少一种与所述感染相关的症状或并发症或减少其严重程度和/或持续时间。
实施方案22.根据实施方案18所述的药物组合物在药物制造中的用途，所述药物用于治疗或预防有此需要或疑似有此需要的患者的呼吸道合胞病毒(RSV)感染或人偏肺病毒(HMPV)感染，或与所述RSV感染或所述HMPV感染相关的至少一种症状，其中由于所述使用，预防所述感染，或者预防、改善至少一种与所述感染相关的症状或并发症或减少其严重程度和/或持续时间。

Claims (22)

1.一种与呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白(F)特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或所述其抗原结合片段的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列中的至少一个与选自如表6中公开的抗体编号124至抗体编号244的抗体的如表6中公开的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和/或CDRL3氨基酸序列中的至少一个具有至少70％同一性、至少75％同一性、80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％和/或其之间的所有百分比的同一性；并且其中所述抗体或所述其抗原结合片段还具有下列特征中的一个或多个：
a)所述抗体或所述其抗原结合片段与所述抗体或其抗原结合片段交叉竞争结合RSV-F；
b)所述抗体或其抗原结合片段相对于PostF形式对RSF-F的PreF形式表现出更好的结合亲和力；
c)所述抗体或其抗原结合片段表现出无或低多反应性特性；
d)所述抗体或其抗原结合片段表现出在体外对RSV亚型A和RSV亚型B的中和活性；
e)所述抗体或其抗原结合片段表现出在位点位点I、位点II、位点III、位点IV或位点V处对RSV-F的抗原位点特异性；
f)所述抗体或其抗原结合片段相对于RSV-F位点I、位点II或位点IV表现出对RSV-F位点位点V或位点III的抗原位点特异性；
g)所述抗体或其抗原结合片段与之相互作用的表位的至少一部分包含PreF的α3螺旋和β3/β4发夹；
h)所述抗体或其抗原结合片段表现出在约0.5微克/毫升(ug/ml)至约5ug/ml之间、在约0.05ug/ml至约0.5ug/ml之间、或小于约0.05mg/ml的体外中和效力(IC50)；
i)相对于所述抗体或其抗原结合片段对RSV-F或RSV-F DS-Cav1的结合亲和力和/或表位特异性，所述抗体或其抗原结合片段对在图7A中指定为1、2、3、4、5、6、7、8、9和DG的任一种RSV-F变体的结合亲和力和/或表位特异性减小或消除；
j)所述抗体或其抗原结合片段表现出对人偏肺病毒(HMPV)的交叉中和效力(IC50)；
k)所述抗体或其抗原结合片段不与D25、MPE8、帕利珠单抗、莫他珠单抗或AM-14一起完成；或
l)所述抗体或其抗原结合片段表现出比D25和/或帕利珠单抗大至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约55倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、大于约100倍以及前述中的任一个之间的倍数的中和效力(IC50)。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：特征a)至l)中的至少两个、至少三个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个或至少12个。
3.根据权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRH3氨基酸序列；
b)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRH2氨基酸序列；
c)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRH1氨基酸序列；
d)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRL3氨基酸序列；
e)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRL2氨基酸序列；
f)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的CDRL1氨基酸序列；或
g)a)、b)、c)、d)、e)和f)中的两个或更多个的任何组合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的重链(HC)氨基酸序列；和/或
b)如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体的轻链(LC)氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自由与如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的任一所述抗体具有至少70％同一性、至少75％同一性、80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％和/或其之间的所有百分比的同一性的抗体组成的群组。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自由如表6中公开的指定为抗体编号124至抗体编号244的所述抗体组成的群组。
7.一种分离的核酸序列，其编码根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
8.一种表达载体，其包含根据权利要求7所述的分离的核酸序列。
9.一种用根据权利要求7所述的核酸序列或根据权利要求8所述的表达载体转染、转化或转导的宿主细胞。
10.一种药物组合物，其包含：根据权利要求1至6中任一项所述的一种或多种分离的抗体或其抗原结合片段；和药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
11.一种药物组合物，其包含：根据权利要求7所述的一种或多种核酸序列；或根据权利要求8所述的一种或多种表达载体；和药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
12.一种转基因生物体，其包含根据权利要求7所述的核酸序列；或根据权利要求8所述的表达载体。
13.一种治疗或预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染或至少一种与RSV感染相关的症状的方法，其包括向有此需要或疑似有此需要的患者施用：
a)根据权利要求1至6中任一项所述的一种或多种抗体或其抗原结合片段；
b)根据权利要求7所述的核酸序列；
c)根据权利要求8所述的表达载体；
d)根据权利要求9所述的宿主细胞；或
e)根据权利要求10或权利要求11所述的药物组合物；
使得治疗或预防所述RSV感染，或者治疗、缓解所述至少一种与RSV感染相关的症状或减轻其严重程度。
14.一种治疗或预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染或人偏肺病毒(HMPV)感染，或至少一种与所述RSV感染或所述HMPV感染相关的症状的方法，其包括向有此需要或疑似有此需要的患者施用：
a)根据权利要求1至6中任一项所述的一种或多种抗体或其抗原结合片段；
b)根据权利要求7所述的核酸序列；
c)根据权利要求8所述的表达载体；
d)根据权利要求9所述的宿主细胞；或
e)根据权利要求10或权利要求11所述的药物组合物；
使得治疗或预防所述RSV感染，或者治疗、缓解所述至少一种与RSV感染相关的症状或减轻其严重程度。
15.根据权利要求14所述的方法，其中a)的所述一种或多种抗体或其抗原结合片段选自由如表6中公开的指定为抗体编号179、188、211、221或229的抗体组成的群组。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述患者施用第二治疗剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第二治疗剂选自由以下组成的群组：抗病毒剂；对RSV具有特异性的疫苗、对流感病毒具有特异性的疫苗或对偏肺病毒(MPV)具有特异性的疫苗；对RSV抗原或偏肺病毒(MPV)抗原具有特异性的siRNA；对RSV抗原或偏肺病毒(MPV)抗原具有特异性的第二抗体；抗IL4R抗体、对流感病毒抗原具有特异性的抗体、抗RSV-G抗体和NSAID。
18.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的任一种或多种分离的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其用于预防有此需要或疑似有此需要的患者的呼吸道合胞病毒(RSV)感染，或用于治疗罹患RSV感染的患者，或用于改善与所述感染相关的至少一种症状或并发症，其中由于所述使用，预防所述感染，或者预防、改善至少一种与所述感染相关的症状或并发症或减少其严重程度和/或持续时间。
20.根据权利要求18所述的药物组合物，其用于治疗或预防有此需要或疑似有此需要的患者的呼吸道合胞病毒(RSV)感染或人偏肺病毒(HMPV)感染，或与所述RSV感染或所述HMPV感染相关的至少一种症状，其中由于所述使用，预防所述感染，或者预防、改善至少一种与所述感染相关的症状或并发症或减少其严重程度和/或持续时间。
21.根据权利要求18所述的药物组合物在药物制造中的用途，所述药物用于预防有此需要的患者的呼吸道合胞病毒(RSV)感染，或用于治疗罹患RSV感染的患者，或用于改善与所述感染相关的至少一种症状或并发症，其中预防所述感染，或者预防、改善至少一种与所述感染相关的症状或并发症或减少其严重程度和/或持续时间。
22.根据权利要求18所述的药物组合物在药物制造中的用途，所述药物用于治疗或预防有此需要或疑似有此需要的患者的呼吸道合胞病毒(RSV)感染或人偏肺病毒(HMPV)感染，或与所述RSV感染或所述HMPV感染相关的至少一种症状，其中由于所述使用，预防所述感染，或者预防、改善至少一种与所述感染相关的症状或并发症或减少其严重程度和/或持续时间。
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