CN111172195A - 一种新冠肺炎基因治疗制品的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新冠肺炎基因治疗制品的制备方法，根据nCoV2019基因组，筛选具有RNA干扰效应的siRNA序列并以核酸合成法合成，将合成的nCoV2019siRNA制成脂质纳米粒LHNPs，将LHNPs或nCoV2019siRNA与喷雾剂配成吸入给药的基因治疗制品，当siRNA到达靶细胞时，在固有和应激增生的解旋酶、内/外切酶的作用下生成的siRNA反义链与同源RNA和/或mRNA结合而使其降解。此外双链siRNA还能刺激产生I型干扰素、IL‑6、TNFa等并介导细胞免疫，已知I型干扰素具有抗病毒免疫，IL‑6可诱导免疫球蛋白和T细胞增生，TNFa能促进中性粒细胞抗感染、诱导病毒感染细胞凋亡而抑制病毒增殖，所以本发明除RNA干扰抗病毒外还能引发细胞因子、免疫细胞和免疫球蛋白参与的抗菌抗病毒免疫，且能高效快速合成，易于短期应用于治疗或预防。

Description

一种新冠肺炎基因治疗制品的制备方法
技术领域
本发明涉及一种新冠肺炎基因治疗制品的制备方法，属于生物制品制备领域。
背景技术
人类冠状病毒（HcoV 229E和HcoV OC43）可引起达30％的感冒。动物冠状病毒，如猪胃肠炎冠状病毒(TGEV)、小鼠肝炎冠状病毒(MHV)、鸟传染性气管炎冠状病毒(IBV)等可感染相应宿主的呼吸道、胃肠道、神经系统和肝脏，导致相应症状。冠状病毒的包膜呈花瓣形突起，使冠状病毒看起来像王冠(拉丁语，corona)，其核衣壳是可变的长螺旋形。冠状病毒的病毒粒子直径为60nm～140 nm，球形，病毒基因组是27kb～32kb的单链正义RNA，是所有RNA病毒基因组中最大的。2003年冠状病毒的一个变种引起了严重急性呼吸综合征即非典（SARS）的爆发，SARS-CoV基因组大小为27～3lkb，有14个开放读码框(open readingframe，ORF)和1个s2m模序(s2m motif)。
2020年1月12日，世界卫生组织将引起原因不明病毒性肺炎爆发的冠状病毒命名为新型冠状病毒，即“nCoV-2019”。石正丽等报道从5名病人体内获得了基本一致的nCoV-2019全基因组，其中有79.5%的序列与SARS-CoV一致，通过对其保守的7个非结构蛋白进行对比，发现nCoV-2019属于SARSr-CoV的包膜RNA病毒。nCoV-2019含有5'非翻译区(UTR)、复制酶复合体(orf1ab)、S基因、E基因、M基因、N基因、3'UTR以及几个未知的非结构性开放式阅读框架。对于nCoV-2019的基因诊断（PCR），目前中国疾病预防控制中心推荐了针对新冠肺炎（nCoV-2019）的开放读码框1ab（ORF1ab）、核壳蛋白（nucleoprotein，N）基因区域的引物和探针序列，其中：Target 1(ORF1ab)：正向引物(F)：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA；反向引物(R)：为ACGATTGTGCATCAGCTGA；探针(P)：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'。Target 2(N)：正向引物(F)：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；反向引物(R)：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG；荧光探针(P)：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ1-3'。nCoV-2019全基因组序列和功能的分析（A Novel Coronavirus from Patients with Pneumoniain China,2019. The New England Journal of Medicine, 2020,January 24）也为nCoV-2019的进一步研究奠定了良好的基础，但目前尚缺少有关nCoV-2019的更确切信息。
随着新型冠状病毒肺炎的爆发和蔓延，治疗药物和生物制品的研究已成为当务之急。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指某种小RNA可以与目的基因配对结合，特异性地剔除或关闭被结合基因的表达。即RNAi是指由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的同源mRNA的高效特异性降解。文献报道，1995年来自复旦大学的Guo Shu博士在美国康奈尔大学将反义RNA注入秀丽新小杆线虫(C·ele-gans)体内，试图阻断par-1基因的表达。同时她还将正义RNA注入对照组线虫，以期观察到par-1基因表达增强的效果。然而对照组的par-1基因表达不仅未增强，反而与实验组一样被阻断。这种结果无法用传统的反义RNA技术做出解释，但她们还是将研究结果如实地投寄给了Cell杂志，并被发表。这一悬疑引起了华盛顿卡内基研究院Fire A博士的注意，他采用凝胶电泳将正义RNA和反义RNA纯化，同时故意将纯化后的正、反义RNA混合在一起，制成dsRNA杂合体，分别注入线虫。结果发现纯化后的反义RNA基因阻抑作用显著减弱，而dsRNA杂合体却高效、特异地阻断了同源mRNA表达，其阻断作用超过反义RNA至少100倍以上。这一结果意外地证实了dsRNA在基因阻抑中发挥着重大作用。Hre A将dsRNA的这一作用称为RNA干扰(RNA interference，RNAi)。1998年，Hre A将研究结果发表于Nature杂志，以致迅速在全球掀起了RNA干扰研究的热潮，并证实RNA干扰是因dsRNA注入真核细胞后，激发真核细胞内防御反应，生成dsRNA诱导的沉默复合体，将与dsRNA具有同源序列的mRNA降解，导致基因在转录后水平沉默，丧失表达蛋白或多肽的能力。进一步的研究表明，病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶（Dicer）将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段siRNA（大约21～23 bp），siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶 (RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终靶mRNA被完全降解。RNAi作用类似于基因剔除，但远比基因剔除简单易行，安全性高，因不是真正剔除基因，可以避免基因误剔而带来的严重后果，这为研制新冠肺炎RNA干扰治疗制品提供了可行的机制。
自1998年RNA干扰现象被发现以来，人们致力于将RNA干扰技术用于制药方面的努力就从来没有停止过。RNA干扰的特殊机制使得RNA干扰技术在理论上具有可以治疗任何疾病的可能。随着基因测序技术的发展，确定一个疾病的靶标已越来越快速、准确，这使RNA干扰技术发展为药物治疗成为可能。目前已有多个siRNA 药物进入临床实验，如应用于黄斑病变 (AMD)和呼吸道合胞病毒 (RSV)感染等疾病的治疗。虽然siRNA（dsRNA）在特定的环境中十分稳定的，但在血液中很不稳定，半衰期不到15min，所以静脉注射给药后易被血清中存在的多种酶降解而失去作用，并大量积蓄在肝脏，在较短时间内被肾脏清除。所以虽然RNA干扰技术在制药领域具有巨大的潜力，但尚需解决siRNA的稳定性、递送和脱靶等问题。为了增加siRNA的稳定性，需对合成siRNA的单核苷酸进行化学修饰，用经化学修饰的碱基（AUCG）合成siRNA。文献报道常用的修饰方法包括硫代磷酸酯修饰、烷磷酸酯修饰、键连接核酸修饰以及糖环修饰。其中糖环修饰包括如2'-Ome、2'-F、2'-MOE、2'-OCE和2'-EA的2'-OH修饰、4'-S修饰、2'-OMe修饰、2'-MOE修饰、Me-SRNA修饰和F-SRNA修饰。
但如果通过呼吸道给药，由于肺部的表面积大、血管丰富、肺泡上皮细胞层薄，所以肺部给药起效快、有利于药物的沉积和各类载体的递送吸收，而且由于肺部的酶活性较低，可以防止药物的活性成分降解失效，还能避免药物在胃肠道的降解和避开肝脏的首过效应，所以肺部吸入给药刺激性小，使用方便，患者顺应性好。因此，如果通过呼吸系统给药进行新冠肺炎的RNA干扰治疗，在无特效药可用的当下应该是一种理论上可行的方案。但nCoV2019siRNA的靶向递送也是需要解决的关键问题。由于基因分子带大量负电荷而缺乏穿透细胞膜的能力，随着纳米技术的发展，各种纳米粒已被广泛应用于基因递送，纳米粒不仅能为包封在内的基因分子提供保护作用，更能提高靶细胞对其的摄取率，用于基因递送的纳米粒可分为固体纳米粒（多糖、脂质、蛋白、可降解生物聚合物等）和脂质纳米粒（脂质体、胶束、乳剂等）。人工合成的阳离子脂质纳米粒是常用的非病毒类基因载体，可通过静电作用与带负电的 siRNA 形成复合物，并易与细胞膜结合，产生较高的转染效率。文献报道，肺部吸入给药常用吸入粉雾剂（DPI），当DPI粒子进入肺部后，将以不同的空气动力学直径发生惯性碰撞、沉降和扩散，直径1.0-5.0μm 的粒子，以重力沉积形式分别沉积在10-17 级支气管壁；直径0.5-1.0μm的粒子，沉积于呼吸性支气管及肺泡壁；直径小于0.2μm 的粒子，以布朗运动形式沉积于肺泡；直径小于0.1μm的粒子大部分随呼吸气流排出。故直径在0.1-3.0 μm的粒子在细支气管和肺泡内的沉降率最高。通常将微粉化药物单独或与载体混合后，通过患者的主动吸入，使药物分散成雾状进入呼吸道，发挥局部或全身作用。
总之，至今未见制备可用于新型冠状病毒（nCoV2019）肺炎治疗的siRNA制品的报道以及将RNA干扰技术应用于新型冠状病毒肺炎治疗的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种易实施、见效快的新冠肺炎基因治疗制品的制备方法，以解决现有技术未能将RNA干扰技术应用于治疗新冠肺炎的问题。
本发明的目的是这样实现的：根据nCoV2019全基因组序列，用shRNA设计软件预测其RNA干扰靶基因序列，筛选具有高沉默效率的nCoV2019siRNA序列，利用核酸合成方法合成nCoV2019siRNA，将合成的nCoV2019siRNA制成脂质纳米粒LHNPs，将LHNPs或nCoV2019siRNA与喷雾剂配制成经呼吸道给药的新冠肺炎基因治疗制品，以通过降解nCoV2019的同源RNA和/或其表达的mRNA来沉默靶基因的表达，实现新冠肺炎的RNA干扰治疗。
进一步的，所述RNA干扰靶基因序列指nCoV2019基因组中能被用来设计、筛选和合成siRNA并能被所合成的siRNA结合而发生RNA干扰效应的保守基因和/或功能基因，包括ORF1ab、3'UTR、S、E、M、N等基因。
进一步的，所述高沉默效率的nCoV2019siRNA序列包括能被合成的siRNA结合而产生显著的RNA干扰效应的nCoV2019基因序列和/或表达的mRNA能被合成的siRNA结合而产生显著的RNA干扰效应的nCoV2019基因序列，所述nCoV2019基因序列指nCoV2019基因组中最保守的功能基因。
进一步的，所述nCoV2019siRNA 由A、U、C、G这四种单核苷酸制备而成，所述单核苷酸包括未经化学修饰的单核苷酸和/或经化学修饰的单核苷酸，所述化学修饰包括4'-C-甲基修饰、硫代磷酸酯修饰、烷磷酸酯修饰、键连接核酸修饰和/或糖环修饰，所述糖环修饰包括2'-Ome修饰、2'-F修饰、2'-MOE修饰、2'-OCE修饰、2'-EA修饰、2'-OH修饰、4'-S修饰、2'-OMe修饰、2'-MOE修饰、Me-SRNA修饰和/或F-SRNA修饰，所述制备而成指采用核酸固相合成法在体外合成nCoV2019siRNA。
进一步的，所述基因治疗制品由具有RNA干扰效应的nCoV2019siRNA与喷雾剂按比例配制而成，所述按比例配制包括LHNPs：甘露醇的质量比=1：1～2、nCoV2019siRNA：H2O的摩尔或质量/体积=1：5～50或nCoV2019siRNA：现有喷雾剂的摩尔或质量/体积=1：5～50。
进一步的，所述LHNPs指以纳米沉淀法制备的脂质复合纳米粒，所述脂质复合纳米粒的内层包含类脂质环氧烷基胺衍生物EAAD、nCoV2019siRNA和聚乳酸羟基乙酸PLGA，中层为能提高载体生物相容性的脂质体，外层为能提高载体结构稳定性的PEG。
进一步的，所述基因治疗制品的RNA干扰治疗指当nCoV2019siRNA经喷雾进入呼吸道细胞内时，siRNA在RNA解旋酶的作用下生成正义链和反义链，反义链与胞质的内切酶、外切酶和解旋酶结合生成基因沉默复合物RISC，RISC与nCoV2019的同源RNA或其表达的mRNA特异性结合，在结合处切割、降解nCoV2019的RNA或mRNA，产生基因沉默/RNA干扰，而且siRNA还可作为引物与nCoV2019靶基因结合并在RNA聚合酶和Dicer的作用下生成更多的siRNA，从而进一步放大RNA干扰作用，最终使nCoV2019靶基因被完全降解。
本发明的有益效果在于：本发明的机制正确、方法原创、技术方案新颖、易实施、易产业化、见效快、临床使用方便。本发明不但发现了RNA干扰技术在新型冠状病毒肺炎治疗中的新用途，而且推断出RNA干扰效应还可发生在呼吸道细胞表面的新理论。更重要的是，本发明的治疗制品不但具有其本身的RNA干扰效果，而且还能产生相当于使用I型干扰素和细胞因子从而提高免疫力、抗菌力尤其是抗病毒力的额外效果。
进一步的，本发明首次建立新冠肺炎基因治疗制品的制备和应用方法，设计了基于nCoV2019基因序列合成具有靶向干扰效应的nCoV2019siRNA的方法，发现RNA干扰技术在新冠肺炎治疗中的新用途。已知RNA干扰的活性较好的siRNA的IC50浓度可达10-6～10-8摩尔级别，远高于小分子药物的10-3～10-5级别，这也是RNA干扰被认为高效的原因。
进一步的，本发明还发现RNA干扰也可发生在细胞外，因进入呼吸道的nCoV2019siRNA粘附在细胞表面，细胞受刺激并改变了细胞膜的通透性，所以细胞产生细胞因子、内切酶、外切酶和解旋酶，并渗透到胞外，以及在细胞内产生的siRNA反义链也渗透到细胞外，在细胞表面产生抗病毒的RNA干扰作用，使nCoV2019靶基因被降解。
进一步的，更重要的是，本发明发现当nCoV2019siRNA附着在细胞表面时，这种双链RNA可引起由I型干扰素或促炎症细胞因子(IL-6，TNFa)介导的先天性细胞免疫应答（RNASilencing: The Genome's Immune System. Science, 2002, 296: 1263-5），并且siRNA引发的先天免疫应答具有序列依赖和长度依赖性（Sequence-specific Potent Inductionof IFN-alpha by Short Interfering RNA in Plasmacytoid Dendritic Cills ThoughTLR7.Nat Med,2005,11:263-70），而已知I型干扰素是参与抗病毒免疫的重要效应分子；IL-6 可诱导B细胞产生免疫球蛋白、促进T细胞和造血干细胞的增殖；TNFa能促进中性粒细胞募集而发挥抗感染作用以及诱导病毒感染细胞凋亡而抑制病毒增殖，所以在新冠肺炎的治疗中，本发明的基因治疗制品不但具有其本身的RNA干扰效果，而且还能产生相当于使用I型干扰素和细胞因子从而提高免疫力、抗菌力尤其是抗病毒力的额外效果。
进一步的，随着基因测序技术的日趋成熟，找到一个能沉默同源靶基因的siRNA序列也已日益容易，而且基因序列的合成如固相合成法也是常用而成熟的方法，所以很容易委托生物公司进行产业化合成本发明的nCoV2019siRNA，边合成边验证边配制成呼吸道给药的基因治疗制品，以解决在急性传染病防控中因药物欠缺和疫苗制备周期长等所致的问题。
具体实施方式
下面对本发明的nCoV2019siRNA制品的制备及应用作详细的描述。
一、实施例1
针对nCoV2019全基因组筛选具有高沉默效率的nCoV2019siRNA序列，用经4'-C-甲基修饰的单核苷酸（AUCG）合成nCoV2019siRNA，用开环反应合成类脂质环氧烷基胺衍生物EAAD，用纳米沉淀法制备由EAAD负载nCoV2019siRNA的脂质复合纳米粒载体LHNPs，其内层为含有EAAD和nCoV2019siRNA结合物的聚乳酸羟基乙酸PLGA，外层包裏能提高载体生物相容性的脂质体，最外层是能提高载体结构稳定性的PEG，最后将载体LHNPs与喷雾剂配制成经肺部吸入给药治疗新冠肺炎的剂型，用来沉默同源的nCoV2019基因，从而产生抗nCoV2019的作用。
1、亚磷酰胺碱基单体（AUCG）的制备
在现有的siRNA合成技术中，最成熟的方法是固相亚磷酰胺法。因此，本发明以4'-C-甲基修饰为实施例描述4'-C-甲基修饰的亚磷酰胺单体的制备方法。
以D-核糖为原料，将其5'羟基氧化为醛基，再通过羟醛缩合反应在4'-C位置引入一个羟甲基，继之经过还原反应得到4'-C-甲基的核糖结构，然后以糖苷化反应引入A、U、C、G四种碱基，进而选择性地脱出糖环上的保护基，保留碱基上的保护基可以得到亚磷酰胺单体的前体，最后通过在糖环上引入固相合成法所需要的各种羟基保护基和亚磷酰胺基团就可以得到4'-C-甲基修饰的四种碱基的亚磷酰胺单体。具体方法参照有关文献进行，这些单体可以通过固相合成仪得到所需要的siRNA序列。
类似地，可以参照有关文献，进行其他化学修饰碱基单体的合成，如硫代磷酸酯修饰、烷磷酸酯修饰、键连接核酸修饰以及糖环修饰的碱基单体。其中糖环修饰包括如2'-Ome、2'-F、2'-MOE、2'-OCE和2'-EA的2'-OH修饰、4'-S修饰、2'-OMe修饰、2'-MOE修饰、Me-SRNA修饰和F-SRNA修饰。
2、nCoV2019siRNA的合成
（1）nCoV2019siRNA引物设计
根据已得知的新型冠状病毒ORF1ab、3'UTR、S、E、M、N等基因序列，利用Ambion公司的shRNA设计软件(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNAtools.html)，获得长度为19nt的多个siRNA备选序列，再根据RNA结合的Tm值及特异性比对结果，优选siRNA序列，与其互补的序列被选为干扰的靶位点。
在成功合成4'-C-甲基修饰的A、U、C、G四种核苷的亚磷酰胺单体后，通过固相亚磷酰胺法将修饰的单体引入一个siRNA序列的特定位点，对已在siRNA序列引入了修饰单体的A链进行单位点的逐个修饰，随后得到单位点修饰的siRNA，我们需要测试4'-C-甲基修饰对siRNA性质的影响。通过测试解链温度(Tm)，圆二色谱以及干扰活性来分别表征4'-C-甲基修饰对siRNA的热力学稳定性，空间构型以及生物活性的影响。通过分析不同位点的修饰对siRNA性质所造成的不同影响，可以筛选出效果较明显的位点。
（2）nCoV2019siRNA序列合成
按照前文的设计思路，利用4'-C-甲基修饰的亚磷酰胺单体，通过固相合成法合成nCoV2019siRNA单链序列，这些序列可以委托生物公司进行合成（苏州瑞博公司订购合成）。
3、nCoV2019siRNA序列表征和性质的测定
（1）nCoV2019siRNA序列表征测定
Figure DEST_PATH_IMAGE002
HPLC和质谱表征：对上述固相合成法合成的各条siRNA单链均进行HPLC纯度鉴定以及MALDI-TOF质谱测试，比较天然单链和修饰后单链纯度以及质谱表征是否和理论值相符。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
聚丙烯酰胺凝胶电泳表征：用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定这些单链siRNA，包括各条单链的纯度，8％变性PAGE结果是否显示每条单链均为单一条带，并且每条链的迁移速率是否彼此相同，然后用8％的非变性PAGE对各条A链和B链的退火效果进行验证。观察天然的B+A和4'-C-甲基修饰的B+Ax在退火后是否形成双链siRNA，如果两者都形成双链siRNA，说明明4'-C-甲基单位点修饰的引入不会影响互补配对。
（2）nCoV2019siRNA性质测定
Figure 860745DEST_PATH_IMAGE002
解链温度(Tm)测定:参照文献测试解链温度，利用Varian Cary bio 100的Thermal程序收集双链的熔解曲线(260nm处吸光度随温度的改变曲线)，光程1.0厘米,在测量之前，需要将两条siRNA单链进行退火，退火条件为，等量的两条单链RNA(0.3 OD)加入到终体积为200uL的ddH20中，加热到90℃下孵育5分钟，然后缓慢冷却至4℃。随后将退火的siRNA双链加入到1.5mL无RNA酶的缓冲液中(10 mM磷酸盐缓冲液，100 mM的NaCl和0.1 mMEDTA，pH 7.0)，在260nm处测定吸光度，从30-90℃，加热速率为0.5℃每分钟。解链温度(％)的值由Caryl00自带的WinUV软件给出。
Figure 777885DEST_PATH_IMAGE004
圆二色谱（CD）测定：圆二色性(CD)的测量范围为320nm至200nm，使用仪器为JASCOJ-715 spcctropolarimeter(AVⅣ，USA)。用前文中的退火条件得到0.3 OD siRNA双链，然后将其溶于无RNase的缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，100 mM NaCl和0.1mM EDTA，pH7.0)中，使用0.1 cm光程的比色皿在25℃下对每个siRNA进行三次独立的测量最后取平均。
Figure DEST_PATH_IMAGE006
RNA干扰活性(RNAi efficiency)测试: 为了逐一验证不同位点修饰的siRNA双链各自干扰效果，可使用Promega公司的双荧光素酶报告检测系统。这是一种结合萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶检测的先进辅助报告基因技术(PromegaDual luciferasereport system)。在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时，通常采用第二个报告基因来减少实验误差。Promega公司提供的这种技术，将萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)检测和海肾荧光素酶(Renilla Luciferase)检测进行组合，满足在单管中进行双荧光素酶报告基因的检测，快速、灵敏和简便。两个报告基因用在一个实验系统中，是为了进行相互测量，或称为比率测量。通常一个报告基因作为内对照，使另一个报告基因的测量结果正态化。将siRNA转染进入细胞后，分别读取Firefly Luciferase(FL)和Renilla Luciferase(RL)的荧光强度。计算荧光强度比值(FL/RL)之后，用检测组的荧光强度比值(FL/RL)除以空白组(未加入siRNA只加入水)的荧光强度比值(FL/RL)得到归一化的荧光强度比值(NormalizedFL/RL signal)。这一比值的大小代表的是检测组中加入的siRNA的干扰效果。值越大干扰效果越差，值越小干扰效果越好。
具体实验步骤：
A. HEK293A细胞的复苏与传代：取出冻存的HEK293A细胞进行复苏，于37℃水浴中快速摇动融化后，加入10 mL DMEM培养基冲洗一次，1000 rpm离心5 min，细胞积聚于离心管底部。去除培养液，再加入5 mL DMEM培养基将细胞悬起，混匀后转入含10 mL DMEM培养液的10 cm平皿中，水平轻摇使细胞分散均匀，置于细胞培养箱中37℃，5％C02条件下复苏培养。24 h后观察细胞生长状态，更换新的DMEM培养基。观察复苏5天的细胞，贴壁良好，形态饱满。丰度达到80％～90％以上，符合传代条件，即可传代。
B.报告质粒pGL3.Rosa与pRL.TK的扩增：报告质粒pGL3-Rosa和pRL-TK为氨苄青霉素抗性，是分别编码萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的真核表达质粒。分别将两种测序正确的质粒转化大肠杆菌TOPl0感受态细胞，挑取单菌落扩大培养。收集10-50 mL菌液，使用Qiagen高纯度质粒中提试剂盒提取质粒。Nanodrop定量，分别以DEPC-H20稀释至200ng/uL和100ng/uL，分装-20℃保存待用。
C.核酸序列转染至HEK293A细胞：在传代的过程中，将细胞悬液铺入24孔板：将传代过程中的细胞悬液，吸取1 mL于12 mL DMEM培养基中制备铺板细胞悬液(约106/mL)。反复吹打使细胞分散均匀，以500 uL/孔的体积(约4 x104个/孔)铺入24孔板中。每次吸取细胞悬液之前都要反复吹打，以保证吸取相同的细胞数量。显微镜下观察铺板效果，若出现细胞聚集现象应轻轻摇动细胞板使其分散均匀。记录铺板时间，于37℃，5％C02条件下培养24小时，待转染使用。作为制备一个24孔板细胞的数量。
每孔细胞的汇合度达到60％-70％左右时，可以开始进行转染操作。pGL3-Rosa(0.17ug/pL)和pRL-TK对照vector(0.017ug/孔)共同转染。检测组中加入siRNA双链(16.7uM，1.67uM，0.167uM，16.7pM，1.67pM)，空白组中加入无RNA酶液。
D.荧光数据处理以及RNA干扰活性计算：对于每一孔的细胞裂解液，存在两个荧光数值，即萤火虫荧光素酶分解底物的荧光值和海肾荧光素酶分解底物的荧光值。由于siRNA及其修饰序列均为靶向萤火虫荧光素酶，不会影响海肾荧光素酶的表达。所以，各孔的萤火虫荧光素酶分解底物荧光值/荧光素酶分解底物荧光值，再与未转染核酸样品的空白组进行比较，能够得出内参化的萤火虫荧光素酶的相对表达量。继之得出各个核酸样品在不同浓度下对于靶标的沉默效果，即RNA干扰活性。
P/N(ratio)=[D(firefly)/D(renilla)+C(firefly)/C(renilla)]/[B(firefly)/B(renilla)+A(firefly)/A(renilla)]
其中C与D为两个平行的核酸样品转染孔，A和B为空白样品转染孔(仅转染了两个报告基因质粒)。1-P/N即为该样品在该浓度下的RNA干扰百分比。浓度依赖的RNA干扰活性数据根据Origin8.0软件中Boltzman回归分析进行拟合并求取对于靶标沉默的IC50值。
4、负载nCoV2019siRNA的脂质复合纳米粒（LHNPs）的制备
（1）类脂质环氧烷基胺衍生物EAAD的制备
Figure 495305DEST_PATH_IMAGE002
EAAD的合成：根据开环反应合成 EAAD：将 6 mmol 1,2-环氧十六烷（C16）和 2mmol 3-甲氨基丙胺（N96）加入到密封的圆底烧瓶中，85℃油浴条件下，磁力搅拌 72 h，得到产物 EAAD（C16-N96），反应产物利用非极性的烃链尾部的数量的不同通过柱层析（硅胶填料200～300目）分离，然后参照文献进行表征（带正电荷的EAAD 用于传递带负电荷的siRNA）。
Figure 317944DEST_PATH_IMAGE004
EAAD的表征
A.红外光谱分析：在化学位移750-840、810-950、1250 cm-1处有3个吸收峰，是环氧烷C16 中-C-O-C-的伸缩振动峰，3250-3300、3330-3400 cm-1处的两个裂峰，代表N96的-NH2基团，纯化产物 EAAD 在 3406 cm-1处有-OH的特征吸收，且在1066 cm-1处有C-O的特征吸收，与产物特征相符，表明成功合成阳离子类脂质材料EAAD。
B.氢谱（1H-NMR）分析：利用氢谱对分离纯化后的 EAAD 进行表征，估算EAAD的纯度。
（2）DSPE-PEG2000-Mal的合成
Figure 132316DEST_PATH_IMAGE002
合成：称取 DSPE（瑞士Cordenpharma公司）20 mg于舒伦克瓶中，加入少量无水氯仿，超声使其溶解，然后加入NHS-PEG 2000 -Mal约 34 mg，超声溶解，在反应体系中加入10μL催化剂无水三乙胺，氮气保护条件下，40℃磁力搅拌5 h。通过 TLC板观察反应是否完全。待反应完全后，旋转蒸发除去有机溶剂，然后加入20 mL的冷乙腈，超声溶解，4℃冰箱中过夜以沉淀过量的DSPE，6000 g离心10 min，吸取上清，旋转蒸发除去乙腈，再用适量蒸馏水超声溶解产物，置于 MWCO=8,000-14,000 的透析袋中透析48h，冷冻干燥 48h 后得到产物（DSPE-PEG2000-Mal可增加载体在体内的循环时间）。
Figure 892462DEST_PATH_IMAGE004
表征：参照文献，采用核磁共振谱法（1H-NMR）计算产物纯度。
（3）LHNPs的具体制备方法
Figure 34861DEST_PATH_IMAGE002
精密称取5mg的聚乳酸-羟基乙酸（PLGA,50:50，15000 Da）和1mg的阳离子材料EAAD于1mL丙酮中，超声使其溶解，混合均匀，其中PLGA的浓度为5mg.mL-1。
Figure 233761DEST_PATH_IMAGE004
分别量取0.3mg的大豆磷脂S100（30mg.mL-1大豆磷脂的乙醇溶液，取10μL）和1.2mg的DSPE-PEG2000-Mal（20 mg.mL-1DSPE-PEG2000-Mal的乙醇溶液，取60μL），加入20 mL的去离子水中，作为外水相(其中S100和DSPE-PEG2000-Mal的摩尔比为7：3，总质量占PLGA 质量比的30%)，溶液预热到35℃。
Figure 276541DEST_PATH_IMAGE006
将3nmolsiRNA溶解于50μL的DEPC水中，然后加入到步骤
Figure 207588DEST_PATH_IMAGE002
中的丙酮溶液中，混合均匀，作为油相。
Figure DEST_PATH_IMAGE008
将PLGA丙酮溶液按照1mL.min-1的速度缓慢滴加到预热的处于快速搅拌状态下的水相中，然后在35℃条件下缓慢搅拌6h，挥发有机溶剂。
Figure DEST_PATH_IMAGE010
用超滤管将制得的脂质复合纳米粒超滤浓缩，冷的PBS洗三遍，最后保存于1mL的PBS中。
（4）LHNPs的相关测试
Figure 338749DEST_PATH_IMAGE002
包封率和载药量的测定：参照文献，通过超速离心法测定游离的Cy3-siRNA浓度，来考察脂质复合纳米粒中siRNA的包封率以及载药量。制备负载Cy3-siRNA的脂质复合纳米粒，在25000g，4℃条件下，超速离心45min，收集上清中未被包封的游离的Cy3-siRNA，用全波长酶标仪测定总荧光强度和未被包封的游离药物的荧光强度。根据以下公式计算脂质复合纳米粒的包封率（Entrapment Efficiency, EE%）及其载药量。包封率=[（总的siRNA-游离的siRNA）/总的siRNA]×100%，载药量=[（总的siRNA-游离的siRNA）/PLGA质量]×100%。
Figure 75761DEST_PATH_IMAGE004
血清稳定性试验：精密量取100μL裸siRNA、负载等量siRNA的LHNPs 100μL（0.03 nmol siRNA），分别将裸siRNA和LHNPs与血清孵育0，6，12，24h后，超速离心12000 g，用氯仿充分溶解LHNPs，用0.1% SDS/0.5M NaCl水溶液萃取LHNPs中的siRNA，然后用琼脂糖凝胶（4%）观察 siRNA-LHNPs抗血清降解的能力，裸siRNA的操作相同。
Figure 536829DEST_PATH_IMAGE006
安全性测试：采用MTT 法检测载体LHNPs对293T的毒性，设空白组和LHNPs，具体方法：收集对数生长的293T细胞，调整细胞浓度为5×104个/mL，接种于96孔培养板中，每孔100μL，于5% CO2、37℃培养箱中培养24h后，吸出原培养基，加入100μL浓度分别为10、50、100、500、1000μg.mL-1的含药培养基，对照组加入等体积的无药培养基，每组设6个复孔。培养箱中继续孵育72 h后，吸出原含药培养基，用PBS洗一遍，每孔加入90μL新鲜培养基和10μL MTT工作液，37℃培养箱中避光孵育4h后，轻轻弃上清，每孔加入100μL DMSO，置于微型振荡器上震荡10 min，酶联免疫检测仪在490nm 波长下测定其吸光度值OD490nm。根据公式计算细胞存活率，考察载体安全性：细胞成活率=[（含药组平均OD-空白组平均OD）/（对照组平均OD-空白组平均OD）]×100%，细胞成活率应达80%以上。
Figure 966673DEST_PATH_IMAGE008
细胞摄取LHNPs试验：收集对数生长期的293T细胞，调整细胞密度为1×10 5个/mL，接种在玻底培养皿中，继续培养24h。弃去原培养基，加入含有Cy3-siRNA-LHNPs的Opti-MEM 培养基（每孔含Cy3-siRNA 0.1nmol），继续培养2，6，12，24h后，收集细胞，用PBS 洗 3次，加入300μL Hoechst 33342（10μg·mL-1）染细胞核，37℃孵育30 min，PBS洗3次，加入 4%多聚甲醛室温固定15min，PBS洗3次，通过CLSM观察Cy3-siRNA-LHNPs在细胞中的摄取分布情况。
Figure 145982DEST_PATH_IMAGE010
RNA干扰效果试验：本发明针对nCoV2019基因序列设计、筛选和合成具有高沉默效率的nCoV2019siRNA，通过沉默同源的nCoV2019基因而产生抗病毒作用。体外测试RNA干扰效果的具体方法是：按上述安全性试验培养感染了nCoV2019的细胞株，设计试验组和空白组，加LHNPs，并继续培养。然后提取细胞株的mRNA或蛋白，进行Western Blot、RT-PCR等分析，观察试验组细胞株中nCoV2019在mRNA水平或蛋白水平的表达是否下调。
5、制备LHNPs的干粉吸入剂
（1）LHNPs干粉吸入剂的制备：采用喷雾冷冻干燥法制备LHNPs干粉吸入剂，选用甘露醇为支撑剂，将上述制备好的LHNPs溶液和相同质量的甘露醇混合均匀（LHNPs：甘露醇的质量比=1：1～2），将装有液氮的烧杯置于喷雾干燥机下方5-8 cm处接受喷出的液滴，液滴在接触烧杯里的液氮后迅速被冷冻，其中喷雾冷冻干燥的条件为：进料速率 2 mL.min-1，雾化气流压力1.8 MPa，喷雾冷冻干燥后将样品和剩余的液氮倒入离心管中，置于-80℃的冰箱中预冻，然后冻干48 h即得干粉。制备的干粉呈圆形，略有引湿性，空气动力学粒径为 2.8μm左右，排空率大于90%，且具有较好的稳定性。
（2）LHNPs干粉吸入剂的使用：利用药用撞击器（NGI）将LHNPs干粉喷入患者呼吸道。
6、LHNPs的基因治疗效应
（1）先天性细胞免疫应答：当LHNPs干粉吸入剂进入患者呼吸道时，nCoV2019siRNA附着在细胞表面，这种双链RNA可引起由I型干扰素或促炎症细胞因子(IL-6，TNFa)介导的先天性细胞免疫应答（RNA Silencing:The Genome's Immune System.Science,2002,296:1263-5），并且siRNA引发的先天免疫应答具有序列依赖和长度依赖性（Sequence-specificPotent Induction of IFN-alpha by Short Interfering RNA in PlasmacytoidDendritic Cills Though TLR7.Nat Med,2005,11:263-70）。而已知I型干扰素是参与抗病毒免疫的重要效应分子；IL-6 可诱导B细胞产生免疫球蛋白、促进T细胞和造血干细胞的增殖；TNFa能促进中性粒细胞募集而发挥抗感染作用以及诱导病毒感染细胞凋亡而抑制病毒增殖。所以在新冠肺炎的治疗中，本发明发现的基因治疗制品不但具有本身的RNA干扰效果，而且还能产生相当于使用I型干扰素和细胞因子从而提高免疫力、抗菌尤其是抗病毒的额外效果。
（2）细胞内RNA干扰作用：当LHNPs干粉吸入剂进入患者呼吸道时，nCoV2019siRNA随LHNPs进入细胞内， nCoV2019siRNA在RNA解旋酶的作用下生成正义链和反义链，反义链与胞质的内切酶、外切酶和解旋酶结合生成基因沉默复合物RISC，RISC与nCoV2019的同源RNA或mRNA特异性结合，在结合处切割、降解nCoV2019RNA或mRNA，产生RNA干扰，进而nCoV2019siRNA还可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶和Dicer作用下生成更多的nCoV2019siRNA，从而进一步放大RNA干扰作用，最终使nCoV2019靶基因被完全降解。
（3）细胞外RNA干扰作用：根据现有技术可知，当LHNPs干粉吸入剂进入患者呼吸道时，粘附在细胞表面的nCoV2019siRNA改变了细胞膜的通透性，细胞内的内切酶、外切酶、解旋酶及在细胞内产生的nCoV2019siRNA反义链能渗透到细胞外，在细胞外也能产生抗病毒的RNA干扰作用，使细胞外的nCoV2019靶基因被降解。
二、实施例2
1、按实施例1中的第“1”、“2”和“3”步骤委托生物公司产业化合成nCoV2019siRNA。
2、参照实施例1中第“4”步骤的“（4）”进行nCoV2019siRNA测试。
3、按实施例1中的第“5”步骤制备nCoV2019siRNA干粉吸入剂，用于新型冠状病毒肺炎的治疗，本实施例2能比实施例1更为快速地制备新型冠状病毒肺炎的基因治疗制品。
三、实施例3
1、按实施例1中的第“2”步骤设计引物，筛选基因沉默效果显著的1个或几个nCoV2019靶向序列，委托生物公司产业化合成nCoV2019siRNA。
2、参照实施例1中第“4”步骤的“（4）”进行nCoV2019siRNA测试。
3、将生物公司产业化合成的nCoV2019siRNA制成以下几种喷雾剂，用于新冠肺炎的治疗。
Figure 421105DEST_PATH_IMAGE002
按实施例1中的第“5”步骤制备nCoV2019siRNA干粉吸入剂。
Figure 376161DEST_PATH_IMAGE004
将合成的nCoV2019siRNA与水按siRNA：H2O=1：5～50（摩尔或质量/体积）配制成呼吸道或口腔给药的喷雾剂。
Figure 649010DEST_PATH_IMAGE006
将合成的nCoV2019siRNA与合适的现有医用喷雾剂按siRNA：现有医用喷雾剂=1：5～50（摩尔或质量/体积）配制成呼吸道或口腔给药的喷雾剂。
因为基因或氨基酸序列的合成是较为成熟的方法，可以委托生物公司进行产业化合成，边合成边验证边使用，以应急解决药物和疫苗都欠缺的传染病防控问题。

Claims (10)

1.一种新冠肺炎基因治疗制品的制备方法，其特征在于，根据nCoV2019的全基因组序列，用shRNA软件预测其RNA干扰靶基因序列，筛选具有高沉默效率的nCoV2019siRNA序列，利用核酸合成法合成nCoV2019siRNA，将合成的nCoV2019siRNA制成脂质复合纳米粒LHNPs，然后将脂质复合纳米粒LHNPs或nCoV2019siRNA与喷雾剂配制成经呼吸道给药的新冠肺炎基因治疗制品，以通过降解nCoV2019的同源RNA和/或其表达的mRNA沉默靶基因的表达，实现新冠肺炎的RNA干扰治疗。
2.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎基因治疗制品的制备方法，其特征在于，所述RNA干扰靶基因序列指nCoV2019基因组中能被用来设计、筛选和合成siRNA并能被所合成的siRNA结合而发生RNA干扰效应的保守基因和/或功能基因，包括ORF1ab、3'UTR、S、E、M、N等基因。
3.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎基因治疗制品的制备方法，其特征在于，所述高沉默效率的nCoV2019siRNA序列包括能被合成的siRNA结合而产生显著的RNA干扰效应的nCoV2019基因序列和/或表达的mRNA能被合成的siRNA结合而产生显著的RNA干扰效应的nCoV2019基因序列，所述nCoV2019基因序列指nCoV2019基因组中最保守的功能基因。
4.根据权利要求1、3所述的一种新冠肺炎基因治疗制品的制备方法，其特征在于，所述nCoV2019siRNA 由A、U、C、G这四种单核苷酸制备而成，所述单核苷酸包括未经化学修饰的单核苷酸和/或经化学修饰的单核苷酸，所述化学修饰包括4'-C-甲基修饰、硫代磷酸酯修饰、烷磷酸酯修饰、键连接核酸修饰和/或糖环修饰，所述糖环修饰包括2'-Ome修饰、2'-F修饰、2'-MOE修饰、2'-OCE修饰、2'-EA修饰、2'-OH修饰、4'-S修饰、2'-OMe修饰、2'-MOE修饰、Me-SRNA修饰和/或F-SRNA修饰，所述制备而成指采用核酸固相合成法在体外合成nCoV2019siRNA。
5.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎基因治疗制品的制备方法，其特征在于，所述基因治疗制品由具有RNA干扰效应的nCoV2019siRNA与喷雾剂按比例配制而成，所述按比例配制包括LHNPs：甘露醇的质量比=1：1～2、nCoV2019siRNA：H2O的摩尔或质量/体积=1：5～50或nCoV2019siRNA：现有喷雾剂的摩尔或质量/体积=1：5～50。
6.根据权利要求1、5所述的一种新冠肺炎基因治疗制品的制备方法，其特征在于，所述LHNPs指以纳米沉淀法制备的脂质复合纳米粒，所述脂质复合纳米粒的内层包含类脂质环氧烷基胺衍生物EAAD、nCoV2019siRNA和聚乳酸羟基乙酸PLGA，中层为能提高载体生物相容性的脂质体，外层为能提高载体结构稳定性的PEG。
7.根据权利要求1、5所述的一种新冠肺炎基因治疗制品的制备方法，其特征在于，所述基因治疗制品的RNA干扰治疗指当nCoV2019siRNA经喷雾进入呼吸道细胞内时，siRNA在RNA解旋酶的作用下生成正义链和反义链，反义链与胞质的内切酶、外切酶和解旋酶结合生成基因沉默复合物RISC，RISC与nCoV2019的同源RNA或其表达的mRNA特异性结合，在结合处切割、降解nCoV2019的RNA或mRNA，产生基因沉默/RNA干扰，而且siRNA还可作为引物与nCoV2019靶基因结合并在RNA聚合酶和Dicer的作用下生成更多的siRNA，从而进一步放大RNA干扰作用，最终使nCoV2019靶基因被完全降解。
8.根据权利要求1、5所述的一种新冠肺炎基因治疗制品的制备方法，其特征在于，所述基因治疗制品的RNA干扰治疗指当nCoV2019siRNA经喷雾到达呼吸道细胞表面时，细胞因受刺激而改变了细胞膜的通透性，使细胞固有和增生的细胞因子、内切酶、外切酶和解旋酶渗透到细胞外，以及在细胞内产生的siRNA反义链也渗透到细胞外，在细胞表面产生抗病毒的RNA干扰作用，使nCoV2019靶基因被降解。
9.根据权利要求1、5所述的一种新冠肺炎基因治疗制品的制备方法，其特征在于，所述基因治疗制品的RNA干扰治疗指当nCoV2019siRNA经喷雾到达呼吸道细胞表面或进入细胞内时，这种双链RNA引起由I型干扰素、促炎症细胞因子IL-6和/或TNFa介导的先天性细胞免疫应答。
10.根据权利要求1、9所述的一种新冠肺炎基因治疗制品的制备方法，其特征在于，I型干扰素起抗病毒免疫作用，IL-6 诱导免疫球蛋白和T细胞产生，TNFa促进中性粒细胞抗感染、诱导病毒感染细胞凋亡和抑制病毒增殖，本发明的基因治疗制品除了RNA干扰抗病毒外还引发细胞因子、免疫细胞和免疫球蛋白参与的抗菌抗病毒免疫。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111500789A (zh) * 2020-06-09 2020-08-07 深圳海普洛斯医学检验实验室 检测新冠病毒的试剂盒及方法
CN113249380A (zh) * 2021-03-01 2021-08-13 北京大学 靶向covid-19新冠病毒的反义寡核苷酸、natac嵌合分子及其应用
WO2021259244A1 (zh) * 2020-06-23 2021-12-30 深圳霁因生物医药转化研究院 抑制SARS-COV-2病毒复制的shRNA及其应用
WO2023248128A1 (en) * 2022-06-23 2023-12-28 Pfizer Inc. Use of a spray freeze-drying process for the lyophilization of a mrna-encapsulating lipid nanoparticles formulation

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180156807A1 (en) * 2015-04-29 2018-06-07 New York University Method for treating high-grade gliomas
EP3294276A4 (en) * 2015-05-12 2018-10-31 Apse, Llc In vivo production of long double stranded rna utilizing vlps
CN110035771A (zh) * 2016-10-21 2019-07-19 阿迪马布有限责任公司 抗呼吸道合胞病毒抗体及其产生和使用方法
CN110542754A (zh) * 2009-05-19 2019-12-06 迈阿密大学 用于体外抗原呈递、评估疫苗功效及生物制剂和药物的免疫毒性的组合物、试剂盒和方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110542754A (zh) * 2009-05-19 2019-12-06 迈阿密大学 用于体外抗原呈递、评估疫苗功效及生物制剂和药物的免疫毒性的组合物、试剂盒和方法
US20180156807A1 (en) * 2015-04-29 2018-06-07 New York University Method for treating high-grade gliomas
EP3294276A4 (en) * 2015-05-12 2018-10-31 Apse, Llc In vivo production of long double stranded rna utilizing vlps
CN110035771A (zh) * 2016-10-21 2019-07-19 阿迪马布有限责任公司 抗呼吸道合胞病毒抗体及其产生和使用方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李燕: "《精编分子生物学实验技术》", 30 September 2017 *
林金水: "《微生物功能基因组学及病原细菌的致病机制研究》", 31 March 2019 *
贺婉红等: "siRNA药物研究进展", 《中国药学杂志》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111500789A (zh) * 2020-06-09 2020-08-07 深圳海普洛斯医学检验实验室 检测新冠病毒的试剂盒及方法
WO2021259244A1 (zh) * 2020-06-23 2021-12-30 深圳霁因生物医药转化研究院 抑制SARS-COV-2病毒复制的shRNA及其应用
CN113249380A (zh) * 2021-03-01 2021-08-13 北京大学 靶向covid-19新冠病毒的反义寡核苷酸、natac嵌合分子及其应用
WO2023248128A1 (en) * 2022-06-23 2023-12-28 Pfizer Inc. Use of a spray freeze-drying process for the lyophilization of a mrna-encapsulating lipid nanoparticles formulation

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