MX2007004692A - Modulacion con arni de virus sincitial respiratorio, virus de la parainfluenza y otros virus respiratorios, y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se basa en la demostracion in vivo de que RSV y PIV pueden ser inhibidos a traves de la administracion intranasal de agentes de ARNi, asi como mediante la administracion parenteral de estos agentes. Ademas, se demuestra que una reduccion viral efectiva puede lograrse con mas de un virus que sea tratado concurrentemente. Con base en estos descubrimientos, la presente invencion proporciona composiciones y metodos generales y especificos que son utiles para reducir los niveles de ARNm de RSV o PIV, niveles de proteinas y titulos virales de RSV y PIV en un sujeto, por ejemplo, un mamifero, tal como un humano. Estos descubrimientos pueden aplicarse a otros virus respiratorios.

Description

MODULACIÓN CON ARNi DE VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO, VIRUS DE LA PARAINFLUENZA Y OTROS VIRUS RESPIRATORIOS, Y USOS DE LOS MISMOS Campo de la Invención La invención se refiere al campo de la terapia viral respiratoria y a composiciones y métodos para modular la replicación viral, y más particularmente a la sub-regulación de un gen o genes de un virus respiratorio mediante oligonucleótidos por medio de interferencia de ARN que se administra localmente a los pulmones y conducto nasal mediante inhalación/intranasalmente o sistémicamente por medio de inyección/intravenosamente .

Antecedentes de la invención En virtud de su función natural el tracto respiratorio está expuesto a una gran cantidad de patógenos originados en el aire que causan una variedad de enfermedades respiratorias . La infección viral del tracto respiratorio es la causa más común de hospitalización infantil en el mundo desarrollado con un cálculo de 91,000 admisiones anuales en Estados Unidos a un costo de 300 millones de dólares. El virus sincitial respiratorio (RSV) humano y virus de la parainfluenza (PIV) son dos agentes principales de enfermedad respiratoria; juntos, infectan los tractos respiratorios REF.: 181418 superior e inferior, llevando a crup, neumonía y bronquiolitis (Openshaw, P.J.M, Respir. Res. 3 (Suppl 1), S15-S20 (2002), Easton, A.J., et a., Clin . Microbiol . Rev. 17, 390-412 (2004)). RSV solo afecta hasta 65% de todos los bebés dentro del primer año de vida, y esencialmente a todos dentro de los primeros 2 años. Es una causa significativa de morbidez y mortalidad en los ancianos también. La inmunidad después de infección por RSV no es completa ni duradera, y por lo tanto, ocurren infecciones repetidas en todos los grupos de edades. Los infantes que experimentan bronquiolitis por RSV son más propensos a desarrollar respiración sibilante y asma más adelante en su vida. La investigación por tratamientos y vacunas efectivos contra RSV ha sido continua durante casi cuatro décadas con pocos éxitos (Openshaw, P.J.M Respir. Res. 3 (Suppl. 1), S15-S20 (2002), Magno, K. et al. Rev. Med. Virol . 14, 149-168 (2004)). Actualmente, no se ha aprobado clínicamente ninguna vacuna ni para RSV ni para PIV. Las cepas de ambos virus existen también para animales no humanos tales como el ganado, cabras, cerdos y borregos, causando pérdidas en la agricultura y en la industria láctea y cárnica (Easton, A. J., et al., Clin . Microbiol . Rev. 17 390-412 (2004)). Tanto RSV como PIV contienen genomas de ARN de hebra negativa no segmentados y pertenecen a la familia Paramyxoviridae . Un número de características de estos virus han contribuido a las dificultades de prevención y terapia. Los genomas virales mutan a una alta velocidad debido a la falta de un mecanismo de lectura a prueba de replicación de los genomas de ARN, presentando un reto significativo en el diseño de una vacuna o antiviral confiable (Sullender, W. M. Clin . Mi crobiol . Rev. 13, 1-15 (2000)). Inhibidores promisorios de la proteína de fusión (F) a RSV fueron abandonados parcialmente debido a que el virus desarrolló mutaciones resistentes que fueron mapeadas al gen F (Rzin ov, V., et al., Antivir . Res . 55, 189-200 (2002), Morton, C.J. et al . Virology 311, 275-288 (2003)). Ambos virus se asocian con proteínas celulares, sumándose a la dificultad de obtener material viral libre de células para vacunación (Burke, E., et al., Virology 252, 137-148 (1998), Burke, E., et al., J. Virol . 74, 669-675 (2000), Grupta, S., et al., J. Virol . 72, 2655-2662 (1998). Finalmente, la inmunología de ambos, y especialmente la de RSV, es exquisitamente compleja (Peebles, R.S., Jr., et al., Viral Immunol . 16, 25-34 (2003), Haynes, L.M., et al., J. Virol . 77, 9831-9844 (2003)). El uso de proteínas RSV desnaturalizadas como vacunas lleva a "inmunopotenciación" o enfermedad incrementada por vacuna (Polack, F. P. et al. J. Exp . Med. 196, 859-865 (2002), y este fenómeno no ha sido ni probado ni descartado para PIV. El problema general es exacerbado por el reciente cierre de un número de programas anti-RSV de la industria biofarmacéutica . El genoma de RSV comprende una sola hebra de ARN de sentido negativo que tiene 15,222 nucleótidos de longitud y produce once proteínas principales. (Falsey, A. R. , y E. E. Walsh, 2000, clinical Microbiological Reviews 13:371-84). Dos de estas proteínas, las glicoproteínas F (fusión) y G (fijación) , son las principales proteínas superficiales y las más importantes para inducir inmunidad protectora. La proteína SH (hidrofóbica pequeña) , la proteína M (matriz) y la proteína M2 (22 kDa) están asociadas con la envoltura o cápside viral pero no inducen una respuesta inmune protectora. Las proteínas ? (proteína asociada a nucleocápside principal) , P (fosfoproteína) y L (proteína polimerasa principal) se encuentran asociadas con ARN de virión. Las dos proteínas no estructurales, ?S1 y ?S2, presuntamente participan en la interacción huésped-virus pero no están presentes en viriones infecciosos. Cepas de RSV humano han sido clasificadas en dos grupos principales, A y B. La glicoproteína G ha demostrado ser la más divergente entre las proteínas RSV. La variabilidad de la glicoproteína G de RSV entre y dentro de los dos grupos de RSV se cree que es importante para la capacidad de RSV para causar brotes anuales de enfermedad. La glicoproteína G comprende 289-299 aminoácidos (dependiendo de la cepa de RSV) , y tiene una estructura de tallo altamente glicosilada, intracelular y transmembranar de 90 kDa, así como dominios de unión a heparina. La glicoproteína existe en formas unidas a membrana y secretada. Actualmente no están disponibles métodos exitosos para tratar infección por RSV (Maggon y Barik, 2004, Reviews in Medical Virology ^4:149-68). La infección del tracto respiratorio inferior con RSV es una condición auto-limitativa en la mayoría de los casos. No existen lineamientos o criterios definitivos sobre cómo tratar o cuándo admitir o descartar infantes y niños con la enfermedad. La hipoxia, la cual puede ocurrir en asociación con infección por RSV, puede ser dada con oxígeno mediante una cánula nasal . La ventilación mecánica para niños con insuficiencia respiratoria, choque o apnea recurrente puede reducir la mortalidad. Algunos médicos prescriben esteroides. Sin embargo, varios estudios han demostrado que la terapia con esteroides no afecta el curso clínico de los infantes y niños admitidos en el hospital con bronquiolitis. Así, los corticoesteroides, solos o en combinación con broncodilatadores, pueden ser inútiles en el manejo de la bronquiolitis en pacientes de otra manera no ventilados y saludables. En infantes y niños con enfermedades cardiopulmonares subyacentes, tales como disfasia broncopulmonar y asma, también se han usado esteroides. Ribavirin, un análogo de guanosina con actividad antiviral, ha sido usado para tratar infantes y niños con bronquiolitis por RSV desde mediados de 1980, pero muchos estudios que evalúan su uso han demostrado resultados conflictivos . En la mayoría de los centros, el uso de ribavirin está ahora restringido a pacientes inmunocomprometidos y a aquellos que están severamente enfermos . La severidad de bronquiolitis por RSV ha estado asociada con bajas concentraciones de retinol en suero, pero pruebas en niños hospitalizados con bronquiolitis por RSV han demostrado que la suplementación con vitamina A no proporciona efectos benéficos. Pruebas terapéuticas de 1,500 mg/kg intravenosos de globulina inmune a RSV o 100 mg/kg de globulina inmune inhalada para infección del tracto respiratorio inferior por RSV también ha fallado en demostrar efectos benéficos sustanciales. En países desarrollados, el tratamiento de infección del tracto respiratorio inferior por RSV está generalmente limitado a terapia sintomática. La terapia antiviral está normalmente limitada a situaciones que ponen en riesgo la vida debido a su alto costo y a la falta de consenso en eficacia. En países en desarrollo, el oxígeno es la principal terapia (cuando está disponible) , y la única forma de reducir la mortalidad es a través de la prevención. La interferencia de ARN o "ARNi " es un término inicialmente acuñado por Fire y colaboradores para describir la observación de que ARN de doble hebra (ARNds ) puede bloquear la expresión génica cuando se introduce en gusanos (Fire et al . Nature 391:806-811, 1998). El ARNds corto dirige silenciamiento específico de genes post-transcripcional en muchos organismos, incluyendo vertebrados, y ha proporcionado una nueva herramienta para estudiar la función génica. El AR?i se ha sugerido como un método para desarrollar una nueva clase de agentes terapéuticos. Sin embargo, hasta la fecha, éstos han permanecido principalmente como sugerencias sin una prueba real de que el ARNi pueda usarse terapéuticamente. Por lo tanto, existe la necesidad de vacunas seguras y efectivas contra RSV, especialmente para infantes y niños. Existe también la necesidad de agentes terapéuticos y métodos para tratar infección por RSV en todas las edades y en individuos inmuno-comprometidos. También existe la necesidad de métodos científicos para caracterizar la respuesta inmunológica protectora a RSV de tal forma que la patogénesis de la enfermedad pueda ser estudiada, y el tamizado para agentes terapéuticos y vacunas pueda ser facilitado. La presente invención supera desventajas anteriores en la técnica al proporcionar métodos y composiciones efectivas para modular y prevenir infección por RSV y PIV, los cuales pueden expandirse en otros virus respiratorios. Específicamente, la presente invención avanza en la técnica al proporcionar agentes de ARNi que han demostrado reducir los niveles de RSV y PIV in vivo y han demostrado tener actividad terapéutica de esta clase de moléculas. Se demuestra además que más de un virus puede tratarse concurrentemente.

Breve descripción de la invención La presente invención se basa en la demostración in vivo de que RSV y PIV in vivo pueden ser inhibidos a través de la administración intranasal de agentes de AR i , así como mediante la administración parenteral de estos agentes. Además, se demuestra que una reducción efectiva en títulos virales puede lograrse con más de un virus que sea tratado concurrentemente usando dos agentes de ARNi diferentes. Con base en estos descubrimientos, la presente invención proporciona composiciones y métodos generales y específicos que son útiles para reducir los niveles de ARNm de RSV o PIV, niveles de proteínas de RSV o PIV y títulos virales de RSV y PIV en un sujeto, por ejemplo, un mamífero, tal como un humano. Estos descubrimientos pueden aplicarse a otros virus respiratorios . La presente invención proporciona específicamente agentes de ARNi que consisten en o comprenden al menos 15 nucleótidos contiguos de uno de los genes de RSV, PIV u otro virus respiratorio, particularmente el gen P de RSV o PIV y los genes N G, F, SH M y L de RSV. El agente de ARNi comprende de preferencia menos de 30 nucleótidos por hebra, por ejemplo, 21-23 nucleótidos. El agente de ARNi de doble hebra puede tener ya sea extremos rasurados o muy preferiblemente puede tener salientes de 1-4 nucleótidos desde uno o ambos extremos 3' del agente. Además, el agente de AR?i puede ya sea contener sólo subunidades de ribonucleótidos que ocurran naturalmente, o puede ser sintetizado para que contenga una o más modificaciones en el azúcar o base de una o más de las subunidades de nucleótido que estén incluidas en el agente. El agente de AR?i puede modificarse más para ser unido a un ligando que se seleccione para mejorar la estabilidad, distribución o absorción celular del agente, por ejemplo colesterol. Los agentes de ARNi pueden además estar en forma aislada o pueden formar parte de una composición farmacéutica usada para los motivos descritos en la presente, regularmente como una composición farmacéutica formulada para el suministro a los pulmones o conducto nasal o formulada para administración parenteral. Las composiciones farmacéuticas pueden contener uno o más agentes de ARNi , y en algunas modalidades, contendrán dos o más agentes de ARNi , cada uno dirigido a diferentes virus respiratorios, tales como RSV y PIV.

La presente invención proporciona además métodos para reducir el nivel de RSV, PIV u otro ARNm viral respiratorio en una célula. Los presentes métodos utilizan los mecanismos celulares implicados en la interferencia de AR? para degradar selectivamente el AR?m viral en una célula y comprenden la etapa de poner en contacto la célula con uno de los agentes de AR?i antivirales de la presente invención. Estos métodos pueden llevarse a cabo directamente en una célula o pueden llevarse a cabo en un sujeto mamífero al administrar a un sujeto uno de los agentes de ARNi /composiciones farmacéuticas de la presente invención. La reducción del ARN viral en una célula da como resultado una reducción en la cantidad de proteína viral reducida, y en un organismo, da como resultado una reducción en el título viral de replicación. Los ejemplos demuestran esto con PIV y RSV, y esto se puede extender a otros virus respiratorios. La presente invención proporciona además métodos para reducir el nivel de dos o más moléculas de ARNm viral respiratorio en una célula, cada uno proveniente de un virus diferente. Los presentes métodos utilizan los mecanismos celulares implicados en la interferencia de AR? para degradar selectivamente el ARN viral de dos virus diferentes en una célula y comprenden la etapa de poner en contacto la célula con dos de los agentes de ARNi antivirales de la presente invención. Estos métodos pueden llevarse a cabo directamente en una célula o pueden llevarse a cabo en un sujeto mamífero al administrar a un sujeto dos de los agentes de ARNi de la presente invención. La reducción de ARNm viral de dos virus diferentes en una célula da como resultado una reducción en la cantidad tanto de la proteína viral producida, como en un organismo, da como resultado una reducción en el título viral de replicación de ambos virus. Los ejemplos demuestran esto con PIV y RSV y la administración concurrente de agentes de ARNi . Esta modalidad de la presente invención se puede aplicar a cualquiera de dos virus respiratorios. Los métodos y composiciones de la invención, por ejemplo, los métodos y composiciones de ARNi pueden usarse con cualquier dosis y/o formulación descrita en la presente, así como con cualquier ruta de administración descrita aquí . Es particularmente importante demostrar en la presente la administración intranasal de un agente de ARNi y su capacidad para inhibir la replicación viral en tejidos respiratorios. Este descubrimiento puede aplicarse a otros virus respiratorios, tales como PIV, como se muestra en los ejemplos, y a otras rutas de suministro local a los pulmones, por ejemplo mediante inhalación/nebulización. Los detalles de una o más modalidades de la invención se describen en las figuras anexas y en la siguiente descripción. Otras características, objetivos y ventajas de la invención serán aparentes a partir de esta descripción, las figuras y las reivindicaciones. Esta solicitud incorpora todas las referencias, patentes y solicitudes de patente citadas a manera de referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Breve descripción de las figuras Figuras la-Id. Titulación de moléculas de ARNsi antivirales ex vivo . Fig.l (a) Análisis de inmunoabsorción de proteínas totales de células A549 infectadas con RSV (ex vivo) con profilina como el control interno. Los números en el cuadro representan niveles de ARNm P objetivo luego de tratamiento con AR?si, expresado como porcentaje de niveles no tratados. En los siguientes tres paneles, los virus fueron administrados cuatro horas después de AR?si. Fig.l (b) Virus infeccioso pulmonar en ratones infectados con RSV (n = 8 para cada punto de dato) . Fig.l(c) Virus infeccioso pulmonar en ratones infectados con HPIV3 (n = 8 para cada punto de datos). Fig.l(d) Como en (b) excepto que ARNsi desnudo se administró sin algún reactivo de transfección. Los asteriscos indican inhibición significativa (P<0.05). Las moléculas de ARNsi se describen en la tabla 1. Figuras 2a-2d. Supresión de antígenos virales en pulmón de murino tratado con ARNsi sin activación de IF?. Fig.2 (a) Se administró virus 4 horas después de ARNsi , y los antígenos virales se detectaron mediante inmunohistología indirecta de los pulmones en 4 días p.i. (verde, RSV; rojo, HPIV3 ) . (1) infectado en falso, sondeado con anticuerpo RSV P; (2-6) infectado con RSV, sondeando con anticuerpo RSV P; (7,8) infectado con HPIV3 , sondeado con anticuerpo HPIV3. Las siguientes moléculas de APNsi (5 mmoles, -70 µg) fueron usadas: (1,2) ninguna; (3) RNAsi#l más reactivo TransIT-TKO; (4) ARNsi#l sin reactivo; (5) control negativo AR?si más TransIT-TKO (6) ARNluc-si más TransIT-TKO; (7) ninguno; (8) R?Asi#4 más Transít-TKO. Tejidos pulmonares representativos estuvieron en 5 días p.i. Barra = 400 um. Fig.2 (b) La hebra antisentido de AR?si#l se detectó mediante análisis Northern de cantidades variables de ARN pulmonar total 2 días después de la administración de ARNsi usando AD? de RSV P marcado como sonda. Una sonda contra RSV ?S1 no reaccionó, mostrando especificidad de detección. (c) ARNsi I? (10 mmoles o 140 ug por ratón) no activó IF? pulmonar ya sea tipo 1 (IF?-a) o tipo II (IF?-?) por arriba del umbral de detección (-10 pg/ml), mientras que en pulmones de control, la infección por RSV activó el tipo II y bajos niveles de tipo I. Líneas: 1, RNAsi#l ; 2 , APNSÍ#4 ; 3, ARNLuc si; 4, sin RNAsi pero infectado con RSV (con barra de error mostrada) . Los pulmones se obtuvieron dos días después de la administración de ARNsi y cuatro días después de la infección (n = 4 para cada gráfica). Fig.2(d) Inhibición mediada por ARNsi de infección doble por RSV y HPIV3 determinada por inmunohistologia indirecta (verde, SV; rojo, HPIV3). (1,5) Sin ARNsi ; (2,6) AR?si#l, 5 nanomoles (70 ug) ; (3,7) AR?si#4, 5 nanomoles (70 ug) ; (4, 8) AR?si#l y ARNsi#4 , 5 nanomoles cada uno (1-4) sondeado con anticuerpo RSV P, (5, 8) sondeado con anticuerpo HPIV3. El virus se administró 4 horas después de ARNsi , y los tejidos pulmonares se examinaron 4 días p.i. Barra = 400 um. Figuras 3a-3c . Inhibición viral competitiva a alta concentración de ARNsi en infección doble por RSV y HPIV3. Fig.3 (a) PCR en tiempo real (ex vivo) ; Fig.3(b) inmunoabsorción (ex vivo) ; Fig.3 (c) inmunoabsorción pulmonar con anticuerpos antivirales de cabra. La intensidad de banda de proteína ? viral respectiva se cuantificó y expresó como porcentaje de muestras de pulmón no tratadas con AR?si. El virus se administró 4 horas después ARNsi , y los tejidos pulmonares estuvieron 5 días p.i. (n = 4 para cada punto de datos) . Barra negra, RSV; barra blanca, HPIV3. Los errores estándares son como se muestra. Figuras 4a-4c. Alivio de patología pulmonar y reducción de un maracador de asma en ratones tratados con ARNsi# l . Fig.4 (a) Ritmo respiratorio; Fig.4(b) Histopatología pulmonar; Fig.4(c) Leucotrieno. P<0.002 en todos los ensayos; n = 4 para todos los puntos de datos; se muestran barras de error estándar. El virus se administró 4 horas después de AR?si (70 ug) . Los ratones tratados con ARNsi de control negativo fueron indistinguibles de los no tratados con ARNsi (datos no mostrados) . Figuras 5a-5b. Efecto terapéutico de ARNsi en enfermedad por RSV. Cambios en Fig.5 (a) peso corporal y Fig.5 (b) título viral pulmonar durante infección con RSV en ratones. Se muestran las barras de error estándar; n = 6 para cada punto de datos . Las flechas indican el día de administración de ARNsi (70 ug) .

Descripción detallada de la invención Para facilidad de exposición el término"nucleótido" o "ribonucleótido" algunas veces se usa en la presente en referencia a una o más subunidades monoméricas de un agente de ARN . Se entenderá que el uso del término "ribonucleótido" o "nucleótido" en la presente puede, en caso de un AR? modificado o sustituto de nucleótido, referirse también a un nucleótido modificado, o porción de reemplazo sustituta, como se describe más abajo, en una o más posiciones. Un "agente AR?" según se usa en la presente, es un AR? no modificado, ARN modificado o sustitutos de nucleósido, todos los cuales se describen en la presente o se conocen bien en la técnica sintética de AR?. Aunque se describen numerosas moléculas de ARN modificadas y sustitutos de nucleósido, los ejemplos preferidos incluyen aquellos que tienen una mayor resistencia a la degradación por nucleasa que las moléculas de ARN no modificadas. Ejemplos preferidos incluyen aquellos que tienen una modificación en el azúcar 2', una modificación en una sola saliente de la hebra, de preferencia una saliente de la hebra individual 3' o, particularmente si es de una sola hebra, una modificación 5' incluye uno o más grupos fosfato o uno o más análogos de un grupo fosfato. Un "agente de ARNi" algunas veces referido como un "agente de iARN" (abreviatura para "agente de ARN de interferencia) según se usa en la presente, es un agente de ARN, el cual puede subregular la expresión de un gen objetivo, por ejemplo RSV. Aunque no se desea ser limitados por teoría como un agente de ARNi puede actuar mediante uno o más de un número de mecanismos, incluyendo el corte post-transcripcional de un ARNm objetivo algunas veces referido en la técnica como AR?i, o mecanismos pre-transcripcionales o pre-traduccionales . Un agente de AR?i puede incluir una sola hebra o puede incluir más de una hebra, por ejemplo, puede ser un agente de ARNi de doble hebra (ds) . Si el agente de ARNi es de una sola hebra se prefiere particularmente que incluya una modificación 5' que incluya uno o más grupos fosfato o uno o más análogos de un grupo fosfato. Un "agente de ARNi de una sola hebra" según se usa en la presente, es un agente de AR?i que está constituido de una sola molécula. Puede incluir una región dúplex, formada mediante pares entre hebras, por ejemplo puede ser, o incluir, una estructura de pasador o de manija. Los agentes de ARNi de una sola hebra son de preferencia antisentido con respecto a la molécula objetivo. Un "agente de ARNi ds" (abreviatura para agente de ARNi de doble hebra"), según se usa en la presente, es un agente de AR?i que incluye más de una, y de preferencia dos, hebras en las cuales la hibridación entre cadenas puede formar una región de estructura dúplex. Los agentes de AR?i aislados descritos en la presente, incluyendo agentes de AR?i ds y agentes de ARNsi , también pueden mediar el silenciamiento de un gen objetivo, por ejemplo, mediante degradación de AR?. Por motivos de conveniencia, este ARN también es referido en la presente como el AR? que será silenciado. Tal gen también es referido como un gen objetivo. De preferencia, el AR? que será silenciado es un producto génico de un gen de RSV endógeno. Según se usa en la presente, la frase "media ARNi " se refiere a la capacidad de un agente para silenciar, de una manera específica de secuencia, un gen objetivo. "Silenciar un gen objetivo" significa el proceso mediante el cual una célula que contiene y/o secreta cierto producto del gen objetivo cuando no está en contacto con el agente, contendrá y/o secretará al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 705, 80% ó 90% menos de este producto génico cuando se ponga en contacto con un agente, en comparación con una célula similar que no ha sido puesta en contacto con el agente. Este producto de gen objetivo puede, por ejemplo, ser un ARN mensajero (ARNm) , una proteína o un elemento regulador. En los usos antivirales de la presente invención, el silenciamiento de un gen objetivo dará como resultado una reducción en el "título viral" en la célula. Según se usa en la presente, "reducción en el título viral" e refiere a una reducción en el número de virus viable producido por una célula o encontrado en un organismo que sufra el silenciamiento de un gen objetivo viral. La reducción en la cantidad celular de virus producido de preferencia llevará una reducción en la cantidad de virus medible producida en los tejidos de un sujeto que sufra tratamiento y a una reducción en la severidad de los síntomas de la infección viral. Los agentes de ARNi de la presente invención también son referidos como "agentes de AR?i antivirales" . Según se usa en la presente, un "gen RSV" se refiere a cualquiera de los genes identificados en el genoma del virus RSV (véase Falsey, A. R. y E. E. Walsh, 2000, Clinical Microbiological Reviews 13:371-84). Estos agentes se conocerán fácilmente en la técnica e incluyen los genes F, G, SH, M, ?, P y L. Según se usa en la presente, un "gen PIV" se refiere a cualquiera de los genes identificados en el genoma del virus PIV (véase GenBank No. de registro NC_001796) . Estos genes se conocen fácilmente en la técnica e incluyen los genes N, P, C, D, V, M, F, HN y L. Según se usa en la presente, "virus respiratorio" se refiere a virus que se replican en las células del sistema respiratorio. Estos virus incluyen, pero no están limitados a RSV, PIV, influenza, metapneumovirus, adenovirus y coronavirus (tales como SARS) . Según se usa en la presente, el término "complementario" se usa para indicar un grado suficiente de complementariedad de tal forma que una unión estable y específica ocurre entre un compuesto de la invención y una molécula de ARN objetivo, por ejemplo un RSV, PIV u otra molécula de APNm viral respiratorio. La unión específica requiere de un grado suficiente de complementariedad par lograr una unión no específica del compuesto oligomérico a secuencias no objetivo bajo condiciones en las cuales se desee una unión específica, es decir, bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, o en el caso de ensayos in vi tro, bajo condiciones en las cuales se lleven a cabo los ensayos. Las secuencias no objetivo típicamente difieren en al menos 4 nucleótidos . Según se usa en la presente, un agente de AR?i es "suficientemente complementario" a un AR? objetivo, por ejemplo, un ARNm objetivo (por ejemplo, un ARNm objetivo de RSV o PIV) si el agente de ARNi reduce la producción de una proteína codificada por el ARN objetivo en una célula. El agente de AR?i también puede ser "exactamente complementario" (excluyendo las subunidades que contienen SRMS) al AR? objetivo, por ejemplo, el ARN objetivo y el agente de ARNi se fijan, de preferencia para formar un híbrido hecho exclusivamente de pares de bases Watson-Crick en la región de complementariedad exacta. Un agente de ARNi "suficientemente complementario" puede incluir una región interna (por ejemplo, de al menos 10 nucleótidos) que sea exactamente complementaria a un AR? viral objetivo. Más aún, en algunas modalidades, el agente de ARNi discrimina específicamente una diferencia de un solo nucleótido. En este caso, el agente de ARNi sólo media AR?i si se encuentra una complementariedad exacta en la región (por ejemplo, dentro de 7 nucleótidos de) la diferencia de un solo nucleótido. Los agentes de ARNi que se prefieren se basarán en o consistirán o comprenderán las secuencias de sentido y antisentido provistas en los ejemplos. Según se usa en la presente, "esencialmente idéntico" cuando se usa en referencia a una primera secuencia de nucleótidos en comparación con una segunda secuencia de nucleótidos significa que la primera secuencia de nucleótidos es idéntica a la segunda secuencia de nucleótidos excepto por hasta 1, 2 ó 3 sustituciones de nucleótidos (por ejemplo, adenosina reemplazada por uracilo) . Según se usa en la presente, un "sujeto" se refiere a un organismo mamífero que sufre tratamiento por un trastorno mediado por infección y expresión viral, tal como infección por RSV o PIV o que sufra un tratamiento profilácticamente para evitar una infección viral. El sujeto puede ser cualquier mamífero, tal como un primate, vaca, caballo, ratón, rata, perro, cerdo, cabra. En la modalidad preferida, el sujeto es un humano. Según se usa en la presente, tratar una infección por RSV, infección por PIV u otra infección por virus respiratorio, se refiere a la reducción de cualquier punto final biológico patológico que 1) sea mediado en parte por la presencia del virus en el sujeto y 2) cuyo resultado puede ser afectado al reducir el nivel de proteína viral presente. Según se usa en la presente, "co-administración" se refiere a administrar a un sujeto dos o más agentes, y en particular dos o más agentes de ARNi . Los agentes pueden estar contenidos en una sola composición farmacéutica y ser administrados al mismo tiempo, o los agentes pueden estar contenidos en una formulación separada y administrarse en serie a un sujeto. Siempre y cuando los dos agentes puedan detectarse en el sujeto al mismo tiempo, se dice que los dos agentes son co-administrados.

Debido a que el agente de ARNi que medió el silenciamiento puede persistir durante varios días después de la administración de la composición del agente de AR?i, en muchos casos, es posible administrar la composición con una frecuencia de menos de una vez al día, o, por algunos casos, sólo una vez durante el régimen terapéutico completo.

Diseño y selección de agentes de ARNi La presente invención se basa en la demostración de el silenciamiento de genes objetivo de un gen viral respiratorio in vivo después de la administración local a los pulmones y conductos nasales de un agente de ARNi ya sea mediante administración intranasal/inhalación o sistémicamente/parenteralmente por medio de inyección y al tratamiento resultante de infección viral. La presente invención se extiende además al uso de agentes de ARNi a más de un virus respiratorio y a tratamiento de infecciones por virus con co-administración de dos o más agentes de ARNi . Con base en estos resultados, la invención proporciona específicamente un agente de AR?i que puede usarse para tratar infecciones virales, particularmente virus respiratorios y en particular infección por RSV o PIV, en forma aislada y como una composición farmacéutica descrita abajo. Estos agentes incluirán una hebra de sentido que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos que son complementarios a un gen viral y una hebra antisentido que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos que es complementaria a las secuencias de la hebra de sentido. Particularmente útiles son los agentes de ARNi que comprenden una secuencia de nucleótidos del gen de la proteína P de RSV o PIV. Otros genes objetivo en RSV incluyen, F, G, SH, M, ? y L. Otros genes en PIV incluyen los genes ?, P, C, D, V, M, F, H? y L. Los agentes ejemplificados se proporcionan en la tabla 1. Los agentes de AR?i candidatos pueden diseñarse al llevar a cabo, por ejemplo, un análisis de recorrido génico de los genes virales que servirán como el objetivo de AR?i. Pueden generarse y probarse agentes candidatos que se traslapen, sean adyacentes o estén estrechamente separados y que correspondan a toda o alguna parte de la región transcrita. Cada uno de los agentes de AR?i puede probarse y evaluarse para verificar su capacidad para subregular la expresión del gen objetivo (véase abajo, "Evaluación de agentes de AR?i Candidatos"). Un agente de ARNi puede diseñarse racionalmente con base en la información de secuencia y características deseadas. Por ejemplo, un agente de ARNi puede diseñarse de acuerdo con la temperatura de fusión relativa del dúplex candidato. Generalmente, el dúplex debe tener una temperatura de fusión más baja en el extremo 5' de la hebra antisentido que en el extremo 3' de la hebra antisentido.

En consecuencia, la presente invención proporciona agentes de ARNi que comprenden una hebra de sentido y una hebra antisentido que cada una comprenden una secuencia de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 23 nucleótidos que es esencialmente idéntica a, como se definió arriba, una porción de un gen proveniente de un virus respiratorio, particularmente los genes de proteína P de RSV o PIV. Los agentes de ARNi ejemplificados incluyen aquellos que comprenden 15 nucleótidos contiguos de uno de los agentes provistos en la tabla 1. La hebra antisentido de un agente de ARNi debe ser igual a o por lo menos 15, 16, 17, 18, 19, 25, 29, 40 ó 50 nucleótidos de largo. Debe ser igual a o tener menos de 50, 40 ó 30 nucleótidos de largo. Las escalas que se prefieren son 15-30, 17 a 25, 19 a 23 y 19 a 21 nucleótidos de largo. En varias modalidades, el agente comprenderá 15 nucleótidos de uno de los agentes en la tabla 1. La hebra de sentido de un agente de ARNi debe ser igual a o por lo menos 15, 16, 17, 18, 19, 25, 29, 40 ó 50 nucleótidos de largo. Debe ser igual a o tener menos de 50, 40 ó 30 nucleótidos de largo. Las escalas que se prefieren son 15-30, 17 a 25, 19 a 23, y 19 a 21 nucleótidos de largo. En varias modalidades, el agente comprenderá 15 nucleótidos de uno de los agentes en la tabla 1. La porción de doble hebra de un agente de ARNi debe ser igual a o por lo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 29, 40 ó 50 pares de nucleótidos de largo. Debe ser igual a o tener menos de 50, 40 ó 30 pares de nucleótidos de largo. Las escalas que se prefieren son de 15-30, 17 a 25, 19 a 23, y 19 a 21 pares de nucleótidos de largo. Los agentes provistos en la tabla 1 tienen 21 nucleótidos de largo por cada hebra. Los agentes de ARNi contienen una región de doble hebra de 19 nucleótidos con una saliente de dos nucleótidos sobre cada uno de los extremos 3 ' del agente. Estos agentes pueden ser modificados como se describe en la presente para obtener agentes equivalentes que comprendan al menos una porción de estas secuencias y/o modificaciones a las bases y enlaces de oligonucleótidos. Generalmente, los agentes de ARNi de la presente invención incluyen una región de complementariedad suficiente para el gen viral, por ejemplo, la proteína P de RSV o PIV, y tienen una longitud suficiente en términos de nucleótidos, como para que el agente de AR?i o un fragmento del mismo pueda mediar la subregulación del gen viral específico. Las hebras antisentido de los agentes de AR?i de la presente invención están de preferencia completamente complementarias a las secuencias de AR? del gen viral, como es en la presente para las proteínas P de RSV y PIV. Sin embargo, no es necesario que haya una complementariedad perfecta entre el agente de ARNi y el objetivo, sino que la correspondencia debe ser suficiente para hacer posible que el agente de ARNi , o un producto de corte del mismo, dirija silenciamiento específica de secuencia, por ejemplo, mediante el corte de AR?i o de una molécula de AR?m de RSV. Por lo tanto, los agentes de ARNi de la presente invención incluyen agentes que comprenden una hebra de sentido y una hebra antisentido que cada una comprenden una secuencia de por lo menos 16, 17 ó 18 nucleótidos que es esencialmente idéntica, como se define abajo, a una de las secuencias de un gen viral, particularmente la proteína P de RSV o PIV, excepto que no más de 1 , 2 ó 3 nucleótidos por hebra, respectivamente, han sido sustituidos por otros nucleótidos (por ejemplo, adenosina reemplazada por uracilo) , y esencialmente conservando la capacidad para inhibir la expresión de RSV en células humanas cultivadas, como se define abajo. Estos agentes por lo tanto poseerán al menos 15 nucleótidos idénticos a una de las secuencias de un gen viral, particularmente el gen de la proteína P de RSV o PIV, pero 1, 2 ó 3 no apareamientos de bases con respecto ya sea a la secuencia de AR?m viral objetivo o entre la hebra sentido y antisentido se introducen. Las no coincidencias con la secuencia de ARNm viral objetivo, particularmente la hebra antisentido, son principalmente toleradas en las regiones terminales y están de preferencia en una región o regiones terminales, por ejemplo, dentro de 6, 5, 4 ó 3 nucleótidos de un término 5' y/o 3', muy preferiblemente dentro de 6, 5, 4 ó 3 nucleótidos del término 5' de la hebra de sentido o el término 3' de la hebra antisentido. La hebra de sentido no sólo tiene que ser suficientemente complementaria con la hebra antisentido para mantener el carácter de doble hebra general de la molécula. Se prefiere que las hebras de sentido y antisentido se seleccionen de tal manera que el agente de ARNi incluya una sola hebra o una región no apareada en uno o ambos extremos de la molécula, tales como aquellos ejemplificados en la tabla 1. Así, un agente de ARNi contiene hebras de sentido y antisentido, de preferencia apareadas para contener una saliente, por ejemplo, 1 ó 2 salientes de 5' ó 3' pero de preferencia una saliente 3' de 2-3 nucléotidos. La mayoría de las modalidades tendrán una saliente 3'. Los agentes ARNsi que se prefieren tendrán salientes de una sola hebra, de preferencia salientes 3', de 1 a 4 , o de preferencia 2 ó 3 nucleótidos, de longitud uno o ambos extremos del agente de AR?i. Las salientes pueden ser el resultado de que una hebra sea más larga que la otra, o el resultado de que dos hebras del mismo largo sean escalonadas. Los extremos 5' son de preferencia fosforilados . Las longitudes preferidas para la región de dúplex son de entre 15 y 30, más preferiblemente 18, 19, 20, 21, 22 y 23 nucleótidos de largo, por ejemplo, en la escala de agente ARNsi descrita arriba. Las modalidades en las cuales las dos hebras del agente ARNsi son enlazadas, por ejemplo, enlazadas covalentemente también se incluyen. Estructuras de pasador u otras estructuras de una sola hebra que proporcionen la región de doble hebra requerida, y de preferencia una saliente 3 ' también están dentro de la invención .

Evaluación de agentes de ARNi candidatos Un agente de ARNi candidato puede evaluarse para verificar su capacidad para subregular la expresión de genes objetivo. Por ejemplo, un agente de ARNi candidato puede ser provisto, puesto en contacto con una célula, por ejemplo una célula humana, que será infectada con el virus de interés, por ejemplo, un virus que contenga el gen objetivo. Como alternativa, la célula puede ser transfectada con una construcción de la cual se exprese un gen viral objetivo, evitando así la necesidad de un modelo de infectividad viral. El nivel de la expresión del gen objetivo antes de y después del contacto con el agente de ARNi candidato puede ser comparado, por ejemplo en un nivel de ARNm, proteína o título viral. Si se determina que la cantidad de ARN, proteína o virus expresado del gen objetivo es más baja después del contacto con el agente de AR?i, entonces se puede concluir que el agente de AR?i subregula la expresión de gen objetivo.

El nivel de ARN viral objetivo o proteína viral en la célula o título viral en la célula o tejido puede determinarse mediante cualquier método deseado. Por ejemplo, el nivel de ARN objetivo puede determinarse mediante análisis Northern blot, transcripción inversa acoplada con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) , análisis de ADNb o ensayo de protección por RNAsa. El nivel de proteína puede determinarse, por ejemplo, mediante análisis Western blot o inmunofluorescencia . El título viral puede detectarse a través de un ensayo de formación de placa.

Pruebas de estabilidad, modificación y pruebas adicionales de agentes de ARNi Un agente de ARNi candidato puede ser evaluado con respecto a estabilidad, por ejemplo, su susceptibilidad a corte por una endonucleasa o exonucleasa, tal como cuando el agente de AR?i es introducido en el cuerpo de un sujeto. Pueden emplearse métodos para identificar sitios que sean susceptibles a modificación, particularmente corte, por ejemplo, el corte por un componente encontrado en el cuerpo de un sujeto. Cuando se identifiquen sitios susceptibles a corte, puede diseñarse y/o sintetizarse un agente de ARNi adicional en el que un sitio de corte potencial se haga resistente al corte, por ejemplo, mediante la introducción de una modificación 2' en el sitio de corte, por ejemplo un grupo 2 ' -0-metilo. Este agente de ARNi adicional puede volverse a probar para estabilidad, y este proceso puede repetirse hasta que se encuentre un agente de ARNi que exhiba la estabilidad deseada.

Pruebas in vivo Un agente de ARNi identificado como siendo capaz de inhibir la expresión del gen RSV puede probarse para funcionalidad in vivo en un modelo animal (por ejemplo, en un mamífero tal como un ratón o rata) como se muestra en los ejemplos. Por ejemplo, el agente de AR?i puede administrarse a un animal, y el agente de AR?i evaluarse con respecto a su biodistribución, estabilidad y su capacidad para inhibir la expresión de genes virales, por ejemplo, RSV o PIV, o reducir el título viral. El agente de AR?i puede administrarse directamente al tejido o cultivo, tal como mediante inyección, o el agente de AR?i puede administrarse al modelo animal de la misma manera que se administrará a un humano. Como se muestra en la presente, el agente puede ser de preferencia administrado mediante inhalación como un medio para tratar infección viral . El agente de ARNi también puede evaluarse para su distribución intracelular. La evaluación puede incluir determinar si el agente de ARNi fue absorbido en la célula. La evaluación también puede incluir determinar la estabilidad (por ejemplo, la vida media) del agente de ARNi . La evaluación de un agente de AR?i in vivo puede ser facilitada por el uso de un agente de ARNi conjugado a un marcador trazable (por ejemplo como un marcador fluorescente tal como fluoresceína; un marcador radioactivo, tal como 35P, 32P, 33P o 3H; partículas de oro o partículas de antígeno para inmunohistoquímica) . Un agente de ARNi útil para monitorear la biodistribución puede carecer de la actividad de silenciamiento génico in vivo . Por ejemplo, el agente de AR?i puede dirigirse a un gen que no esté presente en el animal (por ejemplo, un agente de AR?i inyectado en ratón puede dirigirse a luciferasa) , o un agente de ARNi puede tener una secuencia que no tenga sentido, la cual no se dirija a ningún gen, por ejemplo, a ningún gen endógeno) . La localización/biodistribución del ARNi puede monitorearse, por ejemplo por un marcador trazable unido al agente de AR?i, tal como un agente trazable descrito arriba. El agente de AR?i puede ser evaluado con respecto a su capacidad para subregular la expresión de genes virales. Los niveles de expresión de genes virales in vivo pueden medirse, por ejemplo, mediante hibridación in si tu , o mediante el aislamiento de ARN de tejido antes de y después de la exposición al agente de ARNi . Cuando el animal tiene que ser sacrificado para poder cosechar el tejido, un animal de control no tratado servirá para la comparación. El AR?m viral objetivo puede detectarse mediante cualquier método deseado, incluyendo pero no limitado a RT-PCR, Northern blot, ensayo de ADN ramificado o ensayo de protección por ARNasa. Como alternativa, o además, la expresión de genes virales puede monitorearse al llevar a cabo análisis Western blot sobre extractos de tejido tratados con el agente de ARNi . Los títulos virales pueden determinarse usando un ensayo pfu.

Química del AR?i En la presente se describen agentes de AR?i aislados, por ejemplo, moléculas de AR? (de doble hebra; una sola hebra) que median AR?i para inhibir la expresión de un gen viral, por ejemplo la proteína P de RSV o PIV. Los agentes de AR? descritos en la presente incluyen ARN de otra manera no modificado, así como AR? que ha sido modificado, por ejemplo, para mejorar la eficacia, y polímeros de sustitutos de nucleósidos. ARN no modificado se refiere a una molécula en la cual los componentes del ácido nucleico, llámese azúcar, bases y porciones de fosfato, son los mismos o esencialmente los mismos que los que ocurren en la naturaleza, de preferencia a los que ocurren naturalmente en el cuerpo humano. La técnica se ha referido a moléculas de ARN raras o inusuales, pero que ocurren naturalmente como moléculas de ARN modificadas, véase, por ejemplo, Limbach et al., (1994), Nucleic Acids Res . 22:2183-2196. Estas moléculas de AR?s raras o inusuales, comúnmente llamadas moléculas de AR? modificadas (aparentemente porque típicamente son el resultado de una modificación después de la transcripción) están dentro del término ARN no modificado como el usado en la presente. El ARN no modificado según se usa en la presente se refiere a una molécula en la cual uno o más de los componentes del ácido nucleico, en particular azúcares, bases y porciones de fosfato, son diferentes a aquellas que ocurren en la naturaleza, de preferencia diferentes de las que ocurren en el cuerpo humano. Aunque son mencionadas como "moléculas de AR? modificadas", por supuesto, debido a la modificación, incluirán moléculas que no sean moléculas de AR?. Los sustitutos de nucleósidos son moléculas en las cuales la estructura de base de ribofosfato es reemplazada con una construcción que no es ribofosfato que permite que las bases sean presentadas en la relación espacial correcta de tal manera que la hibridación sea sustancialmente similar a lo que se observa con la estructura de base de ribofosfato, por ejemplo mímicos no cargados de la estructura de base de ribofosfato. Ejemplos de cada uno de los anteriores se describen en la presente. Las modificaciones descritas en la presente pueden incorporarse en cualquier ARN de doble hebra y molécula tipo ARN descrita en la presente, por ejemplo, un agente de AR?i. Puede ser deseable modificar una o ambas de las cebras antisentido y de sentido de un agente de ARNi . Ya que los ácidos nucleicos son polímeros de subunidades o monómeros, muchas de las modificaciones descritas abajo ocurren en una posición que se repite dentro de un ácido nucleico, por ejemplo, una modificación de una base, o una porción fosfato, o la 0 no enlazadora de una porción fosfato. En algunos casos la modificación ocurrirá en todas las posiciones objetivo en el ácido nucleico pero en muchos, y de hecho en la mayoría, de los casos no ocurrirá. A manera de ejemplo, una modificación puede sólo ocurrir en una posición terminal 3' ó 5', puede sólo ocurrir en una región terminal, por ejemplo en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 ó 10 nucleótidos de una hebra. Una modificación puede ocurrir en una región de doble hebra, una región de una sola hebra o en ambas. Por ejemplo, una modificación de fósforotioato en una posición 0 no enlazadora puede sólo ocurrir en uno o ambos términos, puede sólo ocurrir en una región terminal, por ejemplo, en una posición sobre un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 ó 10 nucleótidos de una hebra, o puede ocurrir en regiones de doble hebra o de una sola hebra, particularmente en términos. De manera similar, una modificación puede ocurrir en la hebra de sentido, hebra antisentido o ambas. En algunos casos, la hebra de sentido y antisentido tendrá las mismas modificaciones o la misma clase de modificaciones, pero en otros casos la hebra de sentido y antisentido tendrá modificaciones diferentes, por ejemplo, en algunos casos puede ser deseable modificar sólo una hebra, por ejemplo la hebra de sentido. Dos objetivos principales para la introducción de modificaciones en agentes de ARNi es su estabilización hacia la degradación en ambientes biológicos y la mejora de las propiedades farmacológicas, por ejemplo, propiedades farmacodinámicas, las cuales se describen más abajo. Otras modificaciones adecuadas a una azúcar, base o estructura de base de un agente de ARNi se describen en la solicitud de PCT en co-propiedad ?o . PCT/US2004/01193 , presentada el 16 de enero de 2004. Un agente de AR?i puede incluir una base que no ocurra naturalmente, tal como las bases descritas en la solicitud de PCT en co-propiedad ?o . PCT/US2004/011822 , presentada el 16 de abril de 2004. Un agente de ARNi puede incluir una azúcar que no ocurra naturalmente, tal como una molécula portadora cíclica que no sea carbohidrato. Las características ejemplares de azúcares que no ocurran naturalmente para usarse en agentes de AR?i se describen en la solicitud de PCT en co-propiedad ?o . PCT/US2004/11829 presentada el 16 de abril de 2003.

Un agente de ARNi puede incluir un enlace entre nucleótidos (por ejemplo, el enlace de fósforotioato quiral) útil para incrementar la resistencia a nucleasa. Además, o como alternativa, un agente de ARNi puede incluir un mímico de ribosa para resistencia a nucleasa incrementada. Los enlaces entre nucleótidos ejemplares y los mímicos de ribosa para la resistencia a nucleasa incrementada se describen en la solicitud de PCT en co-propiedad No. PCT/US2004/07070 presentada el 8 de marzo de 2004. Un agente de ARNi puede incluir subunidades monoméricas conjugadas a ligando y monómeros para la síntesis de oligonucleótidos. Los monómeros ejemplares se describen en la solicitud de E.U.A. en co-propiedad ?o . 10/916,185, presentada el 10 de agosto de 2004. Un agente de ARNi puede tener una estructura ZXY, tal como la descrita en la solicitud de PCT en co-propiedad ?o. PCT/US2004/07070 presentada el 8 de marzo de 2004. Un agente de AR?i puede ser acomplejado con una porción anfifática. Las porciones anfifáticas ejemplares para usarse con agentes de AR?i se describen en la solicitud de PCT ?o. PCT/US2004/07070 presentada el 8 de marzo de 2004. En otra modalidad, el agente de ARNi puede ser acomplejado a un agente de suministro que incorpore un complejo modular. El complejo puede incluir un agente portador enlazado a uno o más (de preferencia dos o más, muy preferiblemente los tres de) : (a) un agente de condensación (por ejemplo, un agente capaz de atraer, es decir, unirse, a un ácido nucleico, por ejemplo a través de interacciones iónicas o electrostáticas) ; (b) un agente fusogénico (por ejemplo, un agente de fusionar y/o ser transportado a través de una membrana celular) y (c) un grupo de dirección, por ejemplo, un agente de dirección de células o tejidos, por ejemplo, una lectina, glicoproteína, lípido o proteína, por ejemplo, un anticuerpo que se una a un tipo de célula especificado. Los agentes de ARNi acomplejados son agentes de suministro se describen en la solicitud de PCT en copropiedad ?o. PCT/US2004/07070 presentada el 8 de marzo de 2004. Un agente de ARNi puede tener apareamientos no canónicos, tales como entre las secuencias de sentido y antisentido del dúplex de AR?i. Las características ejemplares de los agentes de AR?i no canónicos se describen en la solicitud de PCT en co-propiedd ?o . PCT/US2004/07070 presentada el 8 de marzo de 2004.

Resistencia a nucleasa incrementada Un agente de AR?i, por ejemplo un agente de ARNi que se diriga a RSV puede tener resistencia incrementada a nucleasas. Una forma de incrementar la resistencia es la de identificar sitios de corte y modificar estos sitios para inhibir el corte. Por ejemplo, los dinucleótidos 5'-UA-3', 5'-UG-3', 5'-CA-3', 5'-U-3', o 5'-CC-3 pueden servir como sitios de corte. Para resistencia a nucleasa y/o afinidad de unión al objetivo incrementadas, un agente de ARNi, por ejemplo, las hebras de sentido y/o antisentido del agente de ARNi , puede incluir, por ejemplo, unidades de ribosa 2 ' -modificadas y/o enlaces de fosforotioato. Por ejemplo, el grupo 2' hidroxilo (OH) puede ser modificado o reemplazado con un número de diferentes sustituyentes "oxi" o "desoxi". Ejemplos de modificaciones a grupos 2 '-hidroxilo "oxi" pueden incluir alcoxi o arioxi (OR, por ejemplo, R=H, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azúcar); polietilenglicoles (PEG), 0 (CH2CH2o) nCH2CH2OR; ácidos nucleicos "trabados" (L?A) en los cuales el 2' hidroxilo es conectado, por ejemplo, con un puente de metileno, al carbono 4' del mismo azúcar de ribosa; 0-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino o dieteroarilamino, etilendiamina, poliamino) y aminoalcoxi, 0 (CH2) nAMINA, (por ejemplo, AMINA - NH ; aquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino o diheteroarilamino, etilendiamina, poliamino) . Cabe mencionar que los oligonucleótidos que contienen sólo el grupo metoxietilo (MOE) , (OCH2CH2OCH3, un derivado de PEG) , exhiben estabilidades de nucleasa comparables con aquellas modificadas con la modificación robusta de fosforotioato. Las modificaciones "desoxi" incluyen hidrógeno (es decir, azúcares de desoxirribosa, las cuales son de particular relevancia para las porciones salientes de ARN parcialmente ds) ; halo (por ejemplo fluoro) ; amino (por ejemplo, NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino, dieteroarilamino, o aminoácido); NH (CH2CH2NH) nCH2CH2-AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino o diheteroarilamino) , -NHC(0)R (R = alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azúcar); ciano; mercapto; alquil-tio-alquilo; tioalcoxi; y alquilo, cicloalquilo, arilo, alquenilo y alquinilo, los cuales pueden ser sustituidos opcionalmente con por ejemplo una funcionalidad amino. Los sustituyentes preferidos son 2'-metoxietilo, 2 ' -0CH3 , 2'-0-alilo, 2'-C-alilo, y 2'-fluoro. Para maximizar la resistencia a nucleasa, las modificaciones 2' pueden usarse en combinación con una o más modificaciones enlazadoras de fosfato (por ejemplo, fosforotioato) . Los llamados oligonucleótods "quiméricos" son aquellos que contienen dos o más modificaciones diferentes . En ciertas modalidades, todas las piridinas de un agente de ARNi portan una modificación 2', y el agente de ARNi por lo tanto tiene resistencia incrementada a endonucleasas. Una resistencia a nucleasa incrementada también puede lograrse al modificar el nucleótido 5', dando como resultado, por ejemplo, al menos un dinucleótido de 5'-uridina-adenina-3 ' (5'-UA-3') en el que la uridina es un nucleótido 2 ' -modificado; al menos un dinucleótido de 5'-uridina-guanina-3 ' (5-UG-3')/ en el que la 5 ' -uridina es un nucleótido 2 ' -modificado; al menos un dinucleótido de 5'-citidina-adenina-3 ' (5'-CA-3'), en el que la 5'-citidina es un nucleótido 2 ' -modificado; al menos un dinucleótido de 5'-uridina-uridina-3 ' (5'-UU-3'), en donde el 5 '-uridina es un nucleótido 2 ' -modificado o al menos un dinucleótido de 5'-citidina-citidina-3 ' (5'-CC-3), en el que la 5'-citidina es un nucleótido 2 ' -modificado . El agente de ARNi puede incluir al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 de estos dinucleótidos . La inclusión de azúcares de furanosa en la estructura de base del oligonucleótido también puede reducir el corte endonucleolítico . Un agente de AR?i puede modificarse más al incluir un grupo catiónico 3', o al invertir el nucleósido en el término 3' con un enlace 3 '-3'. En otra alternativa, el término 3' puede ser bloqueado con un grupo aminoalquilo, por ejemplo, 3 ' -C5-aminoalquilo dT. Otros conjugados 3' pueden inhibir el porte 3 '-5' hexonucleolítico . Aunque no se desea ser limitados por teoría, un conjugado 3', tal como naproxeno o ibuprofeno, puede inhibir el corte exonucleolítico al bloquear estrictamente la exonucleasa de unirse al extremo 3 ' del oligonucleótido. Cadenas alquilo aún pequeñas, grupos alilo o conjugados heterocíclicos o azúcares modificados (D-ribosa, desoxiribosa, glucosa, etc.) pueden bloquear las 3 '-5'-exonucleasas . En forma similar, los conjugados 5' pueden inhibir el corte exonucleolítico 5 '-3'. Aunque no se desea ser limitado por teoría, un conjugado 5', tal como naproxeno o ibuprofeno, puede inhibir el corte exonucleolítico al bloquear estéricamente la exonucleasa de unirse al extremo 5' del oligonucleótido. Incluso cadenas alquilo pequeñas, grupos arilo o conjugados heterocíclicos o azúcares modificados (D-ribosa, desoxirribosa, glucosa, etc.) pueden bloquear las 3 ' -5 ' -exonucleasas . Un agente de ARNi puede tener resistencia incrementada a nucleasas cuando un agente de ARNi duplexado incluya una saliente de nucleótidos de una sola hebra en al menos un extremo. En modalidades preferidas, la saliente de nucleótidos incluye 1 a 4, de preferencia 2 a 3 nucleótidos no apareados. En una modalidad preferida, el nucleótido no apareado de la saliente de una sola hebra que está directamente adyacente al par de nucleótidos terminal contiene una base de purina, y el par de nucleótidos terminal es un par G-C, o al menos dos de los últimos pares de nucleótidos complementarios son pares G-C. En modalidades adicionales, la saliente de nucleótidos puede tener 1 ó 2 nucleótidos no apareados, y en una modalidad ejemplar la saliente de nucleótido es 5'-GC-3'. En modalidades preferidas, la saliente de nucleótidos está en el extremo 3' de la hebra antisentido. En una modalidad, el agente de ARNi incluye el motivo 5'CGC-3' en el extremo 3' de la hebra antisentido, de tal manera que una saliente de 2 nucleótidos 5'-GC-3' se forme. Así, un agente de ARNi puede incluir monómeros que hayan sido modificados para inhibir así la degradación, por ejemplo, por nucleasas, por ejemplo endonucleasas o exonucleasas, encontradas en el cuerpo de un sujeto. estos monómeros son referidos en la presente como MRNs , o monómeros promotores de resistencia a nucleasa o modificaciones. En muchos casos estas modificaciones modularán otras propiedades del agente de AR?i también, por ejemplo, la capacidad para interactuar con una proteína, por ejemplo, una proteína de transporte, por ejemplo, alúmina de suero, un miembro de RISC, o la capacidad de las primera y segunda secuencias para formar un dúplex unas con otras o para formar un dúplex con otra secuencia, por ejemplo una molécula objetivo. Las modificaciones que pueden ser útiles para producir agentes de ARNi que satisfagan los criterios de resistencia a nucleasa preferidos delineados arriba puede incluir una o más de las modificaciones químicas y/o esteroquí icas siguientes del azúcar, base y/o estructura de base de fosfato: (i) tioatos (SP) quirales. Así, los NRMs que se prefieren incluyen dímeros de nucleótidos con una forma enriquecida o pura para una forma quiral particular de un grupo fosfato modificado que contenga un heteroátomo en la posición de no puenteo, por ejemplo Sp o Rp, en la posición X, en donde esta es la posición ocupada normalmente por el oxígeno. El átomo en X también puede ser S, Se, Nr2 o Br3. Cuando X es S, se prefiere un enlace Sp enriquecido quiralmente puro. Enriquecido significa al menos 70, 80, 90, 95 ó 99% de la forma preferida. Estos NRMs se describen en más detalle abajo; (ii) fijación de uno o más grupos catiónicos al azúcar, base y/o el átomo de fósforo de un fosfato o porción de estructura de base de fosfato modificada. Así, los NRMs que se prefieren incluyen monómeros en la posición terminal derivados en un grupo catiónico. Como el extremo 5' de una secuencia antisentido debe tener un grupo -OH o fosfato terminal este NRM es de preferencia no usado en el extremo 5' de una secuencia antisentido. El grupo debe ser unido en una posición sobre la base que minimice la interferencia con la formación de enlaces de hidrógeno e hibridación, por ejemplo, lejos de la cara que interactúa con la base complementaria por la otra hebra, por ejemplo, en la posición 5' de una pirimidina o una posición 7 de una purina. Esto se describe en más detalle abajo; (iii) enlaces no fosfato en los términos. Así, los NRMs que se prefieren incluyen enlaces no fosfato, por ejemplo, un enlace de 4 átomos que confiere mayor resistencia a corte que un enlace de fosfato. Ejemplos incluyen 3' CH2-NHC3-0-CH2-5' y 3' CH2-NH- (0=) -CH2-5 ' ; (iv) tiofosfatos de puenteo 3' y tiofosfatos de puenteo 5'. Así, los NRMs que se prefieren pueden incluir estas estructuras; (v) L-ARN, enlaces 2 '-5', enlaces invertidos, a-nucleósidos. De esta manera, otros NRMs que se prefieren incluyen: L nucleósidos y nucleósidos diméricos derivados de L-nucleósidos ; 2 '-5' fosfato, enlaces no fosfato y de fosfato modificados (por ejemplo, tiofosfatos, fosforamidatos y boronofosfatos) ; dímeros que tengan enlaces invertidos, por ejemplo, enlaces 3'-3' o 5'-5'; monómeros que tengan un enlace alfa en el sitio 1' en el azúcar, por ejemplo las estructuras descritas en la presente que tienen un enlace alfa; (vi) grupos conjugados. De esta manera, los NRMs que se prefieren pueden incluir, por ejemplo, una porción de dirección o un ligando conjugado descrito en la presente conjugado con el monómero, por ejemplo, a través del azúcar, base o estructura de base; vi) enlaces abásicos . Así, los NRMs que se prefieren pueden incluir un monómero abásico, por ejemplo, un monómero abásico como el descrito en la presente (por ejemplo, un monómero sin nucleobases) ; un monómero aromático o aromático heterocíclico o poliheterocíclico como el descrito en la presente y (vii) 5 ' -fosfonatos y profármacos de 5 '-fosfato. Así, los NRMs que se prefieren incluyen monómeros, de preferencia en la posición terminal, por ejemplo, la posición 5', en los cuales uno o más átomos del grupo fosfato es derivado con un grupo protector, grupo o grupos protectores que son removidos como resultado de la acción de un componente en el cuerpo del sujeto, por ejemplo, una carboxiesterasa o una enzima presente en el cuerpo de un sujeto. Por ejemplo, un profármaco del fosfato en el cual una carboxiesterasa corte la molécula protegida dando como resultado la producción de un anión de tioato que ataque un carbono adyacente a la 0 de un fosfato y que resulte en la producción de un fosfato no protegido. Una o más modificaciones de NRM diferentes pueden introducirse en un agente de ARNi o en una secuencia de un agente de ARNi . Una modificación ?RM puede usarse más de una vez en una secuencia o en un agente de AR?i . Ya que algunos NRMs interfieren con hibridación, el número total incorporado debe ser tal que niveles aceptables de formación de dúplex de agente de ARNi se mantengan. En algunas modalidades las modificaciones de NRM se introducen en el sitio de corte terminal o en la región de corte de una secuencia (una hebra o secuencia de sentido) que no dirija una secuencia o gen deseado en el sujeto. esto puede reducir el silenciamiento fuera del objetivo. Las modificaciones resistentes a nucleasa incluyen algunas que pueden ser puestas sólo en el término y otras que pueden ir en cualquier posición. Generalmente, las modificaciones que pueden inhibir la hibridación se usan sólo en regiones terminales, y de preferencia no en el sitio de corte o en la región de corte de una secuencia que se dirija a una secuencia o gen objetivo. Pueden usarse en cualquier lugar en una secuencia de sentido, siempre y cuando se mantenga una hibridación suficiente entre las dos secuencias del agente de ARNi . En algunas modalidades es deseable poner el ?RM en el sitio de corte o en la región de corte de una secuencia que no se dirija a una secuencia o gen objetivo, ya que puede minimizar el silenciamiento fuera de objetivo. En la mayoría de los casos, las modificaciones promotoras de resistencia a nucleasa serán distribuidas diferentemente dependiendo de si la secuencia se dirigirá a una secuencia en el sujeto (comúnmente referida como una secuencia antisentido) o no se dirigirá a una secuencia en el sujeto (comúnmente referida como una secuencia de sentido) . Si una secuencia va a dirigirse a una secuencia en el sujeto, las modificaciones que interfieren con o inhiben el corte por endonucleasa no deben ser centradas en la región que sea sujeta al corte mediado por RISC, por ejemplo, el corte y el sitio de corte o la región de corte (como se describe en Elbashir et al . , 2001, Genes and Dev. 15:188, incorporada en la presente a manera de referencia) . El corte del objetivo ocurre aproximadamente en la parte media de una ARN de guía de 20 ó 21 nucleótidos, o aproximadamente 10 u 11 nucleótidos hacia el extremo cinco prima del primer nucleótido que sea complementario a la secuencia de guía. Según se usa en la presente el sitio de corte se refiere a nucleótidos sobre cada lado del sitio de corte, en el objetivo o en la hebra del agente de AR?i a la que hibride. Región de corte significa un nucleótido con 1, 2 ó 3 nucléotidos del sitio de corte, en cualquier dirección) . Estas modificaciones pueden introducirse en las regiones terminales, por ejemplo, en la posición terminal con 2, 3, 4 ó 5 posiciones del término, de una secuencia que se dirija o una secuencia que no se dirija a una secuencia en el suj eto .

Ligandos atados Las propiedades de un agente de ARNi , incluyendo sus propiedades farmacológicas, pueden influenciarse y diseñarse, por ejemplo, mediante la introducción de ligandos, por ejemplo, ligandos amarrados. Una amplia variedad de entidades, por ejemplo, ligandos, pueden ser atados a un agente de ARNi , por ejemplo, al portador de una subunidad monomérica conjugada a ligando. Ejemplos se describen abajo en el contexto de una subunidad monomérica conjugada a ligando pero que sólo se prefiere, entidades pueden acoplarse en otros puntos a un agente de AR?i. Las porciones que se prefieren son ligandos, los cuales son acoplados, de preferencia covalentemente, ya sea directa o indirectamente por medio de un atado de intervención, al vehículo. En modalidades preferidas, el ligando es unido al vehículo por medio de un atado de intervención. El ligando o ligando atado puede estar presente en el monómero conjugado a ligando cuando el monómero conjugado a ligando sea incorporado en una hebra creciente. En algunas modalidades, el ligando puede ser incorporado en una subunidad monomérica conjugada a ligando "precursora" después de que una subunidad monomérica conjugada a ligando precursora haya sido incorporada en la hebra en crecimiento. Por ejemplo, un monómero que tenga, por ejemplo, un atado terminado en amino, por ejemplo, TAP- (CH2)nNH2 puede ser incorporado en una hebra de sentido o antisentido en crecimiento. En una operación subsecuente, es decir, después de la incorporación de la subunidad monomérica precursora en la hebra, un ligando que tenga un grupo electrofílico, por ejemplo, un éster pentafluorofenílico o un grupo aldehido, puede ser subsecuentemente unido al monómero conjugado a ligando precursor al acoplar el grupo electrofílico del ligando con el grupo nucleofílico terminal del atado de la subunidad monomérica conjugada a ligando precursor. En modalidades preferidas, un ligando altera la distribución, dirección o tiempo de vida de un agente de ARNi en el cual está incorporado. En modalidades preferidas, un ligando proporciona una afinidad incrementada para un objetivo seleccionado, por ejemplo, molécula, célula o tipo de célula, compartimiento, por ejemplo, un compartimiento celular u orgánico, tejido, órgano o región del cuerpo, como, por ejemplo, comparado con una especie ausente en este ligando. Los ligandos que se prefieren pueden mejorar las propiedades de transporte, hibridación y especificidad, y también pueden mejorar la resistencia a nucleasa del oligorribonucleótido natural o modificado resultante, o una molécula polimérica que comprenda cualquier combinación de monómeros descritos en la presente y/o ribonucleótidos naturales o modificados. Los ligandos en general pueden incluir modificadores terapéuticos, por ejemplo, para incrementar la absorción; compuestos de diagnóstico o grupos reporteros, por ejemplo, para monitorear la distribución; agentes de entrelazamiento; porciones que confieran resistencia a nucleasa y nucleobases naturales o inusuales. Ejemplos generales incluyen lipófilos, lípidos, esteroides (por ejemplo, uvaol, hecigenina, diosgenina) , terpenos (por ejemplo, triterpenos, por ejemplo, sarsapogenina, Friedelina, epifriedelanol derivado con ácido litocólico) , vitaminas (por ejemplo, ácido fólico, vitamina A, biotina, piridoxal), carbohidratos, proteínas, agentes de unión a proteínas, moléculas de dirección a integrina, policatiónicos, péptidos, poliaminas y peptidomiméticos . Los ligandos pueden incluir cualquier sustancia que ocurra naturalmente (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA) , lipoproteína de baja densidad (LDL) , o globulina) ; carbohidratos (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosan, inulina, ciclodextrina y ácido hialurónico) ; aminoácido o un lípido. El ligando también puede ser una molécula recombinante o sintética, tal como n polímero sintético, por ejemplo, un poliaminoácido sintético. Ejemplos de poliaminoácidos incluyen el poliaminoácido que es una polilisina (PLL), ácido poli-L-aspártico, ácido poli L-glutámico, copolímero de anhídrido de ácido estiren-maleico, copolímero de poli (L-lacturo-co-glicol) , copolímero de éter divinílico-anhídrido maleico, copolimero de N-(2-hidroxipropil) etacrilamida (HMPA) , polietilenglicol (PEG) , alcohol polivinílico (PVA), poliuretano, ácido poli (2-etilacrílico) , polímeros de N-isopropilacrilamida o polifosfazina. Ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL) , spermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina dendrímera, arginina, amidina, protamina, porciones catiónicas, por ejemplo, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina o un péptido alfa helicoidal. Los ligandos también pueden incluir grupos de dirección, por ejemplo, un agente de dirección a células o tejidos, por ejemplo, una lectina, glucoproteína, lípido o proteína, por ejemplo un anticuerpo, que se una a un tipo de célula especificado tal como una célula hepática o una célula de yeyuno. Un grupo de dirección puede ser una tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína A tensioactiva, carbohidrato de mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-gulucosamina mañosa multivalente, fucosa multivalente, poliaminoácidos glicosilados, galactosa multivalente, transferrina, bifosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lípido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, biotina o péptido RGD o peptidomimético RGD. Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo, glicoproteínas, o péptidos, por ejemplo moléculas que tengan una afinidad específica para un co-ligando, o anticuerpos, por ejemplo un anticuerpo que se una a un tipo de célula específico tal como una célula de cáncer, célula endotelial o célula ósea. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-gulucosamina mañosa multivalente o fucosa multivalente. El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido, un activador de p38 MAP cinasa o un activador de NF-KB. El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo, un fármaco que pueda incrementar la función del agente de ARNi en la célula, por ejemplo, al romper el citoesqueleto de la célula, por ejemplo, al romper los microtúbulos, microfilamentos y/o filamentos intermedios de la célula. El fármaco puede ser, por ejemplo, taxón, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, japlakinolida, ltrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina o mioservina.

En un aspecto, el ligando es un lípido o molécula a base de lípidos. Este lípido o molécula a base de lípidos de preferencia se une a una proteína de suero, por ejemplo albúmina de suero humana (HSA) . Un ligando de unión a HSA permite la distribución del conjugado a un tejido objetivo, por ejemplo, tejido hepático, incluyendo células parenquimáticas del hígado. Otras moléculas que pueden unirse a HSA también pueden usarse como ligandos . Por ejemplo, neproxina o aspirina pueden usarse. Un lípido o ligando a base de lípidos puede (a) incrementar la resistencia a la degradación del conjugado, (b) incrementar la dirección o transporte al interior de una célula objetivo o membrana de célula y/o (c) puede usarse para ajustar la unión a una proteína de suero, por ejemplo HSA. Un ligando a base de lípidos puede usarse para modular, por ejemplo controlar la unión del conjugado o tejido objetivo. Por ejemplo, un lípido o ligando a base de lípidos que se una a un HSA más fuertemente será menos propenso a ser dirigido al riñon y por lo tanto menos propenso a ser eliminado del cuerpo. Un lípido o ligando a base de lípidos que se una a HSA menos fuertemente puede usarse para dirigir el conjugado al riñon. En una modalidad preferida, el ligando a base de lípidos se une a HSA, . De preferencia, se une a HSA con una afinidad suficiente de tal forma que el conjugado sea de preferencia distribuido a un tejido no renal. Sin embargo, se prefiere que la afinidad no sea tan fuete como para que la unión del ligando HSA no pueda invertirse. En otro aspecto, el ligando es una porción, por ejemplo, una vitamina, que es absorbida por una célula objetivo, por ejemplo, una célula proliferativa. Estos son particularmente útiles para tratar trastornos caracterizados por proliferación celular no deseada, es decir, del tipo maligno o no maligno, por ejemplo células de cáncer. Las vitaminas ejemplares incluyen vitamina A, E y K. Otras vitaminas ejemplares incluidas son vitamina B, por ejemplo ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, pridoxal u otras vitaminas y nutrientes absorbidos por células cancerosas. También se incluyen HSA y lipoproteína de baja densidad (LDL) . En otro aspecto, el ligando es un agente de permeación de células, de preferencia un agente de permeación de células helicoidal. De preferencia, el agente es anfifático. Un agente ejemplar es un péptido tal como Tat o antenopedia. Si el agente es un péptido, puede ser modificado, incluyendo un peptidilmimético, invertómeros, enlaces no peptídicos o seudopeptídicos y el uso de D-aminoácidos. El agente helicoidal es de preferencia un agente alfa helicoidal, el cual tiene de preferencia una fase lipofílica y una lipofóbica.

Modificaciones con 5 '-fosfato En modalidades preferidas, los agentes de ARNi son 5 ' -fosforilados o incluyen un análogo de fosforilo en el término 5'. Las modificaciones con 5-fosfato de la hebra antisentido incluyen aquellas que son compatibles con el silenciamiento génico mediado por RISC. Las modificaciones adecuadas incluyen: 5 ' -monofosfato (HO) 2 (0) P-0-5 ' ) ; 5-difosfato ( (H0)2 (O)P-O-P(HO) (0)-0-5' ) ; 5 ' -trifosfato ( (H0)2 (O)P-O-(HO) (O)P-O-P(HO) (0)-0-5' ) ; tapa de 5 ' -guanosina (7-metilada o no metilada) (7m-G-0-5 ' - (HO) (0) P-0- (HO) (0) P-0-P(H0) (0)-0-5'); bloqueo de 5 '-adenosina (Appp) y cualquier estructura de tapa o bloqueo de extremos de nucleótidos modificada o no modificada (N-0-5 ' - (HO) (0) P-O- (HO) (0) P-0-P(H0) (0) -0-5' ; 5'-monotiofosfato (fosforotioato; (H0)2(S)P-0-5'); 5'-monoditiofosfato (fosforoditioato; (HO) (HS) (S) P-0-5'), 5'-fosforotiolato (HO) 2 (0) P-S-5 ' ) ; y cualquier combinación adicional de monofosfato reemplazado con oxígeno/azufre, difosfato y trifosfatos (por ejemplo, 5'-alfa-tiotrifosfato, 5 ' -gama-tiotrifosfato, etc.), 5'-fosforamidatos (H0) 2 (0) P-NH-5 ' , (H0) NH2 ) (0) P-0-5 ' ) , 5'-alquilfosfonatos (R = alquilo = metió, etilo, isopropilo, propilo, etc., por ejemplo RP (OH) (0) -0-5 ' - , (OH) 2 (0) P-5 ' -CH2- ), 5 ' -alquiléterfosfonatos (R =éter alquílico = metoximetilo (MeOCH2-), etoximetilo, etc., por ejemplo, RP (OH) (0) -0-5 ' - ) . La hebra de sentido puede ser modificada para inactivar la hebra de sentido y evitar la formación de un RISC activo, de esta manera reduciendo potencialmente los efectos fuera del blanco. Esto se puede lograr mediante una modificación que evite la 5 ' -fosforilación de la hebra de sentido, por ejemplo, mediante la modificación con un ribonucleótido de 5'-0-metilo (véase Nykánen et al., (2001) ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 107, 309-321) . Otras modificaciones que evitan la fosforilación también pueden usarse, por ejemplo, simplemente sustituyendo el 5 ' -OH por H en lugar de O-Me. Como alternativa, un grupo voluminoso grande puede añadirse al 5 '-fosfato volviéndolo un enlace de fosfodiéster .

Suministro de agentes de ARNi a tejidos y células Formulación Los agentes de ARNi descritos en la presente pueden formularse para su administración a un sujeto, de preferencia para su administración localmente a los pulmones y conductos nasales (tejido respiratorio) mediante inhalación o administración intranasal, o parenteralmente, por ejemplo, mediante inyección. Para facilidad de exposición, las formulaciones, composiciones y métodos en esta sección se describen ampliamente con respecto a agentes de AR?i no modificados.

Sin embargo, se debe entender que estas formulaciones, composiciones y métodos pueden llevarse a la práctica con otros agentes de ARNi , por ejemplo agentes de ARNi modificados, y esta práctica está dentro de la invención. Una composición ARNi formulada puede asumir una variedad de estados. En algunos ejemplos, la composición es al menos parcialmente cristalina, uniformemente cristalina y/o anhidra (por ejemplo, menos de 80, 50, 30, 20 ó 10% de agua) . En otro ejemplo, 'el AR?i está en una fase acuosa, por ejemplo, en una solución que incluye agua, esta forma ha sido la forma preferida para administración mediante inhalación. La fase acuosa o las composiciones cristalinas pueden incorporarse en un vehículo de suministro, por ejemplo, un liposoma (particularmente para la fase acuosa), o una partícula (por ejemplo, una micropartícula como sea adecuado para una composición cristalina) . Generalmente, la composición de AR?i se formula de una manera que sea compatible con el método de administración deseado. Una preparación de ARNi puede formularse en combinación con otro agente, por ejemplo, otro agente terapéutico o un agente que estabilice un ARNi , por ejemplo, una proteína que se acompleje con ARNi para formar un iR P .

Aún otros agentes incluyen quelatadores, por ejemplo, EDTA (por ejemplo, para remover cationes divalentes tales como Mg2+) , sales, inhibidores de AR sa (por ejemplo, un inhibidor de ARNsa de amplia especificidad tal como ARNsin) y demás. En una modalidad, la preparación de ARNi incluye otro agente de AR?i, por ejemplo, un segundo agente de ARNi que puede mediar ARNi con respecto a un segundo gen. Aún otras preparaciones pueden incluir al menos tres, cinco, diez, veinte, cincuenta o cien o más especies de ARNi diferentes. En algunas modalidades, los agentes son dirigidos al mismo virus pero a diferentes secuencias objetivo. En otra modalidad, cada agente de AR?i es dirigido a un virus diferente. Como se demuestra en el ejemplo, más de un virus puede ser inhibido al coadministrar dos agentes de AR?i simultáneamente, por intervalos de tiempo estrechos, cada uno dirigido a uno de los virus que se esté tratando.

Método de tratamiento y rutas de suministro Una composición que incluye un agente de ARNi de la presente invención, por ejemplo, un agente de ARNi que se dirige a RSV o IV, puede ser suministrado a un sujeto mediante una variedad de rutas. Las rutas ejemplares incluyen inhalación, intratecal, parenquimática, intravenosa, nasal, oral y suministro ocular. El medio que se prefiere para administrar los agentes de ARNi de la presente invención es a través de administración directa a los pulmones y en los conductos nasales o sistémicamente a través de la administración parenteral.

Un agente de ARNi puede incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración. Por ejemplo, las composiciones pueden incluir uno o más agentes de ARNi y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Según se usa en la presente la frase "vehículo farmacéuticamente aceptable" está destinado a incluir cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y de retraso de absorción y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de estos medios agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conocen bien en la técnica. Excepto en cuanto a cualquier medio u objeto convencional sea incompatible con el compuesto activo, el uso del mismo en las composiciones se contempla. Los compuestos activos complementarios también pueden incorporarse en las composiciones. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de un número de formas dependiendo de si se desea tratamiento local o sistémico y del área que será tratada. La administración puede ser tópica (incluyendo oftálmica, intranasal, transdérmica, intrapulmonar) oral o parenteral. La administración parenteral incluye goteo intravenoso, inyección subcutánea, intraperitoneal e intramuscular, o administración intratecal o intraventricular.

En general, el suministro de los agentes de ARNi de la presente invención se lleva a cabo para lograr el suministro al interior del sujeto en el sitio de infección. El medio que se prefiere para lograr esto es a través de ya sea administración local a los pulmones o conducto nasal, por ejemplo, dentro de unos tejidos respiratorios mediante administración por inhalación o intranasal, o mediante administración sistémica, por ejemplo, administración parenteral . Las formulaciones para inhalación o administración parenteral se conocen bien en la técnica. Esta formulación puede incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener reguladores de pH, diluyentes y otros aditivos adecuados. Para uso intravenoso, la concentración total de solutos debe controlarse para hacer a la preparación isotónica . Los compuestos activos descritos en la presente se administran de preferencia a los pulmones o conducto nasal de un sujeto mediante cualquier medio adecuado. Los compuestos activos pueden administrarse al administrar una suspensión en aerosol de partículas respirables que comprenden el compuesto activo o compuestos activos, que el sujeto inhale. El compuesto activo puede aerosolizarse en una variedad de formas, tales como, pero no limitadas a, inhalantes de polvo seco, inhalantes de dosis medida o suspensiones líquidas/líquidas . Las partículas respirables pueden ser líquidas o sólidas. Las partículas pueden contener opcionalmente otros ingredientes terapéuticos tales como amilorida, benzamilo o fenamilo; con el compuesto seleccionado incluido en una cantidad efectiva para inhibir la reabsorción de agua de las secreciones mucosas de la vía aérea, como se describe en la patente de E.U.A. No. 4,501,729. La composición farmacéutica en partículas puede ser opcionalmente mezclada y combinada con un vehículo para ayudar a la dispersión o transporte. Un vehículo adecuado tal como un azúcar (es decir, lactosa, sucrosa, trehalosa, manitol) puede ser mezclado con el compuesto o compuestos activos en cualquier relación adecuada (por ejemplo, una relación de 1 a 1 en peso) . Las partículas que comprenden el compuesto activo para llevar a la práctica la presente invención deben incluir partículas de tamaño respirable, es decir, partículas de un tamaño suficientemente pequeño como para pasar a través de la boca o nariz y laringe luego de su inhalación y al interior de los bronquios y alveolos de los pulmones. En general, las partículas que varían de aproximadamente 1 a 10 mieras en tamaño (más particularmente) , menos de alrededor de 5 mieras en tamaño) son respirables. Las partículas de tamaño no respirable que están incluidas en el aerosol tienden a depositarse en la garganta y ser tragadas, y la cantidad de partículas no respirables en el aerosol se reduce al mínimo de preferencia. Para administración nasal, un tamaño de partícula en la escala de 10-500 uM se prefiere para asegurar la retención en la cavidad nasal . Las composiciones farmacéuticas líquidas del compuesto activo para producir un aerosol pueden prepararse al combinar el compuesto activo con un vehículo adecuado, tal como agua estéril libre de pirógenos. Soluciones salinas hipertónicas usadas para llevar a cabo la presente invención son de preferencia soluciones estériles y libres de pirógenos, que comprenden de uno a quince por ciento (en peso) de la sal fisiológicamente aceptable, y muy preferiblemente de tres a siete por ciento en peso de la sal fisiológicamente aceptable. Los aerosoles de partículas líquidas que comprenden el compuesto activo pueden producirse mediante cualquier medio adecuado, tal como un nebulizador de chorro activado por presión o un nebulizador ultrasónico. Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,501,729. Los nebulizadores son dispositivos disponibles comercialmente que transforman soluciones o suspensiones del ingrediente activo en una niebla de aerosol terapéutica ya sea por medio de aceleración de gas comprimido, típicamente aire u oxígeno, a través de un orificio de venturi angosto o por medio de agitación ultrasónica. Las formulaciones adecuadas para usarse en nebulizadores consisten en el ingrediente activo en un vehículo líquido, el ingrediente activo que comprende hasta 40% p/p de la formulación, pero de preferencia menos de 20% p/p. El vehículo es típicamente agua (y muy preferiblemente agua estéril libre de pirógenos) o una solución alcohólica acuosa diluida, de preferencia hecha isotónica, pero puede ser hipertónica con fluidos corporales mediante la adición de, por ejemplo, cloruro de sodio. Los aditivos opcionales incluyen conservadores si la formulación no se ha hecho estéril, por ejemplo, hidroxibenzoato de metilo, antioxidante, agentes saborizantes, agentes volátiles, agentes reguladores de pH y agentes tensioactivos. Los aerosoles de partículas sólidas que comprenden el compuesto activo pueden asimismo producirse con cualquier generador de aerosol terapéutico en partículas sólido. Los generadores de aerosol terapéuticos en partículas sólidas a un sujeto producen partículas que son respirables y generan un volumen de aerosol que contiene una dosis en medida predeterminada de un producto terapéutico a una velocidad adecuada para administración a humanos. Un tipo ilustrativo de generador en aerosol de partículas sólidas es un insuflador. Las formulaciones adecuadas para su administración por insuflación incluyen polvos finamente pulverizados que pueden ser suministrados por medio de un insuflador o tomados en la cavidad nasal de la manera de una aspiración. En el insuflador, el polvo (por ejemplo, una dosis medida del mismo efectiva para llevar a cabo los tratamientos descritos en la presente) está contenido en cápsulas o cartuchos, hechos típicamente de gelatina o plástico, los cuales son ya sea perforados o abiertos in si tu y el polvo suministrado por el aire extraído a través del dispositivo luego de la inhalación o por medio de una bomba operada manualmente. El polvo empleado en el insuflador consiste ya sea únicamente en el ingrediente activo o en una mezcla de polvos que comprende el ingrediente activo, un diluyente en polvo adecuado, tal como lactosa, y un agente tensioactivo opcional. El ingrediente activo típicamente comprende de 0.1 a 100 p/v de la formulación. Un segundo tipo de generador de aerosol ilustrativo comprende un inhalador de dosis medida. Los inhaladores de dosis medida son despachadores en aerosol presurizados, que contienen típicamente una suspensión o formulación en solución del ingrediente activo en un propelente licuado. Durante el uso estos dispositivos descargan la formulación a través de una válvula adaptada para suministrar un volumen medido, típicamente de 10 a 200 ul, para producir un rocío de partículas finas y que contiene el ingrediente activo. Los propelentes adecuados incluyen ciertos compuestos de cloroflurocarburo, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano y mezclas de los mismos. La formulación puede contener además uno o más co-solventes, por ejemplo, etanol, agentes tensioactivos, tales como ácido oleico o triolato de sorbitán, antioxidantes y agentes saborizantes adecuados. La administración puede proporcionarse por el sujeto o por otra persona, por ejemplo, un cuidador. Un cuidador puede ser cualquier entidad implicada que proporcione cuidado al humano: por ejemplo, un hospital, hospicio, consultorio de doctor, clínica ambulante; un trabajador del cuidado de la salud tal como un doctor, enfermera u otro practicante, o una esposa o guardián, tal como un padre. El medicamento puede ser provisto en dosis medidas o en un despachador que suministra una dosis medida. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" es la cantidad presente en la composición que se requiere para proporcionar el nivel deseado del fármaco en el sujeto que será tratado para dar la respuesta fisiológica anticipada. En una modalidad, cantidades terapéuticamente efectivas de dos o más agentes de ARNi , cada uno dirigido a un virus respiratorio diferente, por ejemplo RSV y PIV, se administran concurrentemente a un sujeto. El término "cantidad fisiológicamente efectiva" es aquella que es suministrada a un sujeto para dar el efecto paliativo o curativo deseado. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa que el vehículo puede ser tomado en los pulmones sin efectos toxicológicos adversos significativos en los pulmones. Los tipos de excipientes farmacéuticos que son útiles como vehículo incluyen estabilizadores tales como albúmina de suero humana (HSA) , agentes de volumen tales como carbohidratos, aminoácidos y polipéptidos; ajustadores o reguladores de pH; sales tales como cloruro de sodio y similares. Estos vehículos pueden estar en forma cristalina o amorfa o pueden ser una mezcla de las dos. Los agentes de volumen que son particularmente valiosos incluyen carbohidratos compatibles, polipéptidos, aminoácidos o combinaciones de los mismos. Los carbohidratos adecuados incluyen monosacáridos tales como galactosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos, tales como lactosa, trihalosa y similares; ciclodextrinas, tales como 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina y polisacáridos, tales como rafinosa, maltodextrinas, dextranos y similares; alditoles, tales como manitol, xilitoles y similares. Un grupo preferido de carbohidratos incluye lactosa, trihalosa, rafinosa, maltodextrinas y manitol. Los polipéptidos adecuados incluyen aspartame. Los aminoácidos incluyen alanina y glicina, prefiriéndose glicina. Los ajustadores o reguladores de pH adecuados incluyen sales orgánicas preparadas a partir de ácidos orgánicos y bases, tales como citrato de sodio, ascorbato de sodio y similares; se prefiere citrato de sodio. Dosis . Un agente de ARNi puede administrarse en una unidad de dosis de menos de aproximadamente 75 mg por kg de peso corporal, o menos de alrededor de 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 ó 0.005 mg por kg de peso corporal, y menos de 200 mmoles de agente AR? (por ejemplo, alrededor de 4.4 x 1016 copias) por kg de peso corporal, o menos de 1,500, 750, 300, 150, 75, 15, 7.5, 1.5, 0.75, 0.15, 0.075, 0.015, 0.0075, 0.0015, 0.00075, 0.00015 mmoles de agente ARN por kg de peso corporal. La dosis única, por ejemplo, puede administrarse mediante inyección (por ejemplo, intravenosa o intramuscular, intratecalmente o directamente en un órgano) , una dosis inhalada o una aplicación tópica. El suministro de un agente de ARNi directamente a un órgano (por ejemplo, directamente al hígado) puede ser una dosis en el orden de aproximadamente 0.00001 mg a alrededor de 3 mg por órgano, o de preferencia alrededor de 0.0001-0.001 mg por órgano, aproximadamente 0.03-3.0 mg por órgano, alrededor de 0.1-3.0 mg por ojo o aproximadamente 0.3-3.0 mg por órgano . La dosis puede ser una cantidad efectiva para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno.

En una modalidad, la dosis única se administra menos frecuentemente que una vez al día, por ejemplo, menos de cada 2, 4, 8 ó 30 días. En otra modalidad, la dosis única no se administra con una frecuencia (por ejemplo, no una frecuencia regular) . Por ejemplo, la dosis única puede administrarse en una sola vez. En una modalidad, la dosis efectiva se administra con otras modalidades terapéuticas tradicionales. En una modalidad, a un sujeto se le administra una dosis inicial, y una o más dosis de mantenimiento de un agente de ARNi, por ejemplo, un agente de ARNi de doble hebra, o agente de ARNsi (por ejemplo, un precursor, por ejemplo, un agente de ARNi más grande que pueda ser procesado en un agente ARNsi , o un ADN que codifique para un agente de ARNi , por ejemplo, un agente de AR?i de doble hebra, o agente ARNsi , o precursor del mismo) . La o las dosis de mantenimiento son generalmente más bajas que la dosis inicial, por ejemplo, la mitad o menos de la dosis inicial. Un régimen de mantenimiento puede incluir tratar al sujeto con una dosis o dosis que varíen de 0.1 µg a 75 mg/kg, por ejemplo, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 ó 0.005 mg por kg de peso corporal al día. Las dosis de mantenimiento se administran de preferencia a no más de una vez cada 5, 10 ó 30 días. Además, el régimen de tratamiento puede durar un periodo de tiempo que variará dependiendo de la naturaleza de la enfermedad particular, su severidad y la condición general del paciente. En modalidades preferidas la dosis puede ser suministrada no más de una vez al día, por ejemplo no más de una vez cada 24, 36, 48 o más horas, por ejemplo, no más de una vez cada 5 u 8 días. Después del tratamiento, el paciente puede ser monitoreado para cambio en su condición y para el alivio de los síntomas del estado de enfermedad. La dosis del compuesto puede ser ya sea incrementada en caso de que el paciente corresponda significativamente a los niveles de dosis actuales, o la dosis puede ser reducida si un alivio de los síntomas del estado de enfermedad se observa, si el estado de enfermedad ha sido destruido, o si se observan efectos secundarios no deseados . La dosis efectiva puede administrarse en una sola dosis o en dos o más dosis, según se desee o considere adecuado bajo las circunstancias específicas. Si se desea facilitar infusiones repetidas o frecuentes, la implantación de un dispositivo de suministro, por ejemplo, puede ser aconsejable una bomba, stent semipermanente (por ejemplo, intravenoso, intraperitoneal, intracisternal o intracapsular) o depósito. En una modalidad, la composición farmacéutica del agente de ARNi incluye una pluralidad de especies de agente de AR?i . Las especies de agente de AR?i pueden tener secuencias que no se traslapen y no sean adyacentes con respecto a una secuencia objetivo que ocurre naturalmente, por ejemplo, una secuencia objetivo del gen de RSV. En otra modalidad, la pluralidad de especies de agentes de ARNi son específicas para diferentes genes objetivo que ocurren naturalmente. Por ejemplo, un agente de ARNi que se dirija al gen de proteína P de RSV puede estar presente en la misma composición farmacéutica que un agente de ARNi que se dirija a un gen diferente, por ejemplo el gen de proteína ?. En otra modalidad, los agentes de AR?i son específicos para diferentes virus, por ejemplo RSV y PIV. Después de un tratamiento exitoso, puede ser deseable hacer que el paciente sufra terapia de mantenimiento para evitar la recurrencia del estado de enfermedad, en donde el compuesto de la invención se administre en dosis de mantenimiento, que varíen de 0.01 µg a 100 g por kg de peso corporal (véase US 6,107,094). La concentración de la composición de agente de AR?i es una cantidad suficiente como para ser efectiva para tratar o prevenir un trastorno o para regular una condición fisiológica en humanos. La concentración o cantidad de agente de ARNi administrada dependerá de los parámetros determinados para el agente y del método de administración, por ejemplo, nasal, bucal o pulmonar. Por ejemplo, las formulaciones nasales tienden a requerir concentraciones mucho más bajas de algunos ingredientes para de esta manera evitar la irritación o quemazón de los conductos nasales. Algunas veces es deseable diluir una formulación oral hasta 10-100 veces para proporcionar una formulación nasal adecuada . Ciertos factores pueden influenciar la dosis requerida para tratar efectivamente un sujeto, incluyendo pero no limitados a la severidad del trastorno o enfermedad, en tratamientos anteriores, el estado de salud general y/o edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Más aún, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de ARNi, por ejemplo un agente de ARNi de doble hebra, o agente de AR?si (por ejemplo, un precursor, por ejemplo un agente de AR?i más grande que puede ser procesado en un agente AR?si o un AD? que codifique para un agente de ARNi , por ejemplo un agente de ARNi de doble hebra, o agente ARNsi o precursor del mismo) puede incluir un solo tratamiento o, de preferencia, puede incluir una serie de tratamientos. También será apreciado que la dosis efectiva de un agente de ARNi tal como un agente ARNsi usado para el tratamiento puede incrementar o reducir con el curso de un tratamiento particular. Los cambios en la dosis pueden resultar y ser aparentes a parir de los resultados de ensayos de diagnóstico como los descritos en la presente. Por ejemplo, el sujeto puede ser monitoreado después de administrar una composición de agente de ARNi . Con base en la información del monitoreo, una cantidad adicional del agente de AR?i y la composición de agente de AR?i puede ser administrada. La dosis depende de la severidad y capacidad de respuesta a la condición de enfermedad que sea tratada, con el curso de tratamiento durando de varios días a varios meses, o hasta que se lleve a cabo una cura o una reducción del estado de enfermedad. Programas de dosificación óptimos pueden calcularse a partir de mediciones de acumulación del fármaco en el cuerpo del paciente. Las personas de capacidad ordinaria fácilmente pueden determinar las dosis óptimas, metodologías de dosificación y velocidades de repetición. Las dosis óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los compuestos individuales, y generalmente pueden calcularse con base en las EC50 que se encuentran sean efectivas en modelos animales in vi tro e in vivo . En algunas modalidades, los modelos animales incluyen animales transgénicos que expresan un gen humano, por ejemplo, un gen que produce un ARN de RSV objetivo. El animal transgénico puede ser deficiente para el AR? endógeno correspondiente. En otra modalidad, la composición para pruebas incluye un agente de ARNi que es complementario, al menos en una región interna, a una secuencia que se conserva entre el ARN de RSV objetivo en el modelo animal y el ARN de RSV objetivo en un humano . La invención se ilustra más por los siguientes ejemplos, los cuales no deben ser considerados como limitantes .

Ejemplos Diseño de moléculas de ARNsi antivirales contra ARNm de fosfoproteína de RSV y HPIV3 ARNsi contra RSV P y moléculas de ARNsi contra ARNm de HPIV3 P se sintetizaron químicamente (Bitko, V. & Barik, S. BMC Microbiol. 1, 34 (2001)) y su IC50 (concentración de ARNsi que produce 50% de reducción de objetivo) ex vivo fue determinada (figura la) . Las secuencias y valores IC50 del AR?si se listan (tabla 1) . Dos moléculas de ARNsi contra RSV-P (#lm #2) y una contra HPIV3 (#4) mostraron actividades inhibitorias apreciables, y fueron seleccionadas para estudios adicionales. La correlación de ARNm objetivo con proteína, como se ejemplifica para ARNsi #1 (figura la) , concordó con un mecanismo de ARNi , y como se muestra abajo, la actividad de supresión de un ARNsi ex vivo también coincidió con su actividad en el animal ( in vivo) . Así, el ensayo ex vivo proporciona un tamizado inicial confiable, económico, rápido y conveniente para un fármaco antiviral de ARNsi .

Las moléculas de ARNsi intranasales (IN) inhiben la replicación de RSV y HPIV3 en pulmón de ratón Para determinar si las moléculas de ARNsi que son activas ex vivo podrían ser efectivas durante una infección real, se usó un modelo animal. El ratón BALB/c es un modelo de laboratorio bien establecido para infección por RSV para estudiar la progresión, patología e inmunología de la enfermedad (Graham, B.S., et al., J. Med. Virol . 26, 153-162 (1988), van Schaik, S. M. , et al., J. Infect . Dis . 177, 269-276 (1998), Haeberle, H.A. et al . J. Virol . 75, 878-890 (2001) ) . Los ratones fueron tratados con AR?si acomplejado con reactivo TransIT-TKO® intranasalmente y 4 horas más tarde se atacó a cada animal con 107 pfu de RSV o HPIV3 , también intranasalmente. El crecimiento de RSV máximo en pulmón de murino pudo observarse alrededor de 5-6 días p.i. y este punto de tiempo se usó en estudios adicionales. Las moléculas de AR?si que fueron efectivas ex vivo (figura la) fueron altamente antivirales en el animal (figura lb,c). A una dosis de 5 mmoles de ARNsi I? (promediando alrededor de 70 ug para moléculas de ARNsi de doble hebra) por ratón, AR?si#l y AR?si#4 redujeron respectivamente los títulos de RSV y HPIV3 pulmonares en aproximadamente 5,000 y 100 veces en infecciones individuales (figura lb,c). De manera importante, las moléculas de AR?si, libres de reactivo de transfección, también inhibieron significativamente los títulos virales pulmonares (figura ld) . Esto demuestra que la terapia antiviral a base de inhalación es posible con composiciones farmacéuticas simples que comprenden un agente de ARNi . Se debe notar que HPIV3 no infecta al ratón tan fácil como RSV (Durbin, A.P., Elkins, W.R. & Murphy, B.R. Vaccine 18, 2462-2469 (2000)), lo cual es la razón para la replicación de HPIV3 relativamente más baja en el pulmón de ratón (figura le). El uso de HPIV3 de alto título purificado con sucrosa como inoculo hizo posible que el modelo lograra infecciones mesurables en el pulmón de ratón. Varias características adicionales de los ejemplos son aplicables a las modalidades de la presente invención. Primero, los resultados demuestran el efecto específico de virus de las moléculas de AR?si (figura 1) . Incluso el más potente ARNsi anti-RSV (#1) sólo inhibió RSV pero no HPIV3 , y viceversa, lo cual solo argumenta contra un efecto antiviral no específico del ARNsi I?. Segundo, ARNsi anti-luciferasa (Elbashir, S.M. et al . Nature 411, 494-498 (2001)), incluso a la dosis más alta probada (50 mmoles o 700 ug/ratón) no inhibió ningún virus (figura lb-d) . Finalmente, moléculas de ARNsi I? con o sin el reactivo Transit-TKO en ratones no infectados no causaron incomodidad obvia (juzgada por recubrimiento, actividad, apetito y ganancia de peso normales, falta de cualquier insuficiencia respiratoria) sugiriendo una farmacología favorable para el desarrollo de fármacos potenciales. Se debe notar que en todos los experimentos descritos en la presente, los resultados de la inmunoabsorción de proteínas virales siempre coincidieron con los títulos virales, y por lo tanto, para un experimento dado cada uno puede servir como marcador redundante del otro y todos los datos complementarios no son presentados .

Los efectos antivirales especificos de ARNsi IN previenen infección pulmonar Aunque los resultados presentados arriba documentaron la inhibición de replicación viral, no probaron directamente la abrogación de infección de tejido pulmonar. Por lo tanto, se sondearon varias secciones de ambos pulmones a 5 días p.i. usando anticuerpos específicos contra el virus adecuado. Con 107 pfu instilados por ratón, ambos virus produjeron una robusta infección pulmonar. En resultados representativos (figura 2a), la infección fue fuertemente abolida en ratones pre-tratados con 5 mmoles (70 ug) de anti-RSV ARNsi#l acomplejado con TransIT-TKO. Una reducción similar de la infección por HPIV3 se observó también con 5 mmoles de anti-HPIV3 ARNsi#4 . Al igual que con el título viral, ARNsi sin reactivo de transfección mostró una reducción significativa de infección, como se representa para RSV. Para la misma cantidad de AR?si, se calcula que el ARNsi libre de reactivo fue casi 70-80% tan efectivo como el ARNsi acomplejado con TransIT-TKO. Aunque sólo se han presentado datos para TransIT-TKO acomplejado con AR?si, en el resto del documento, estos resultados apuntan al excitante prospecto de que el suministro ARNsi I? desnudo puro, libre de otros químicos, podría ofrecer una protección sustancial contra patógenos respiratorios . Esto es particularmente importante toda vez que los propios reactivos de transfección pueden tener efectos secundarios . Se nota aquí que la polietilenimina (PEÍ) ha sido exitosamente usada como un vehículo para suministro intravenoso (IV) así como intratecal (IT) de ARNsi y AD? contra virus de la influenza (Ge, Q., et al., Proc . Nati . Acad. Sci . USA 101, 8676-86-81 (2004). Sin embargo, en nuestra experiencia, la administración I? directa de PEÍ, con o sin ARNsi , comúnmente dio como resultado enfermedad evidente y/o muerte del ratón.

Las moléculas de AR?si I? se dirigen al pulmón y no activan interferón Para proporcionar evidencia adicional de que la inhibición viral observada en el pulmón fue un efecto directo y específico del ARNsi aplicado nasalmente, se llevaron a cabo dos tipos de experimentos: primero, se pudo detectar una hebra antisentido del AR?si en tejido pulmonar (figura 2b) mediante análisis Northern específicos. Segundo, la posibilidad de que el efecto antiviral de las moléculas de ARNsi se debiera a la activación de interferones (IF?s) se descartó por lo siguiente. Los paramixovirus en general codifican para diversos mecanismos para contrarrestar IF?s; RSV, en particular, es ampliamente resistente a IF?s tipo I (IF?-a/ß) aunque es sensible a IF? tipo II (IF?-?) (Schlender, J., et al., J". Virol . 74, 8234-8242 (2000), Ramaswamy, M. , et al., Am J. Respir . Cell . Mol . Biol . 30, 893-900 (2004)). Estudios anteriores por los inventores mostraron que las moléculas de AR?si eran activas contra RSV y HPIV3 en células Vero que contenían supresiones de genes de IF? tipo I (datos no mostrados) . ?o obstante, se midieron los niveles de IF?-OC e IF?-? en tejidos pulmonares de murino en diferentes días después de tratamiento con varias moléculas de ARNsi , y no se encontró activación de ningún tipo de IF? (figura 2c) .

Las moléculas de AR?si protegen competitivamente contra RSV y HPIV3 en infección mixta. La coinfección del tracto respiratorio por varios agentes siempre es una posibilidad, y en algunos estudios la infección conjunta por RSV y HPIV3 ha sido diagnosticada. De hecho, virus y métodos y vacunas recombinantes que incorporan RSV así como antígenos HPIV3 han sido construidos con la esperanza de que pudieran ofrecer una protección simultánea contra ambos virus (Schmidt, A.C., et al., J. Virol . 75, 4594-4603 (2001), Bernhard, W. et al . Am . J. Respir . Cell . Mol . Biol , 25, 725-731 (2001)). El efecto antiviral específico de ARNsittl y ARNsi#4 contra RSV y HPIV3 , respectivamente, incitó a probarlos juntos (5 mmoles o 70 ug de cada uno) en infecciones mixtas de los ratones por ambos virus . Los ratones de control se trataron con un solo tipo de AR?si (ya sea #1 o #4) . Ya que no hay una forma fácil de determinar la pfu de cada virus en una mezcla de los dos, se recurrió a microscopía por inmunofluorescencia como la descrita arriba, y se sometieron las secciones de tejido pulmonar a tinción doble usando una mezcla de anticuerpos anti-RSV y anti-HPIV3. La infección mixta del tejido pulmonar fue de hecho lograda por este criterio (figura 2d) . En ratones pre-tratados ya sea con ARNsi #1 o sIARN#4 , la infección por SRSV y HP-3 se previno respectivamente, como se observa por la pérdida de fluorescencia ya sea verde o roja, pero no ambas (figura 2d) . Usando una combinación de las dos moléculas de AR?si (5 mmoles, es decir, 70 µg con los modelos) , ambos tipos de fluorescencia desaparecieron, documentando la inhibición de ambos virus (figura 2d) . Como arriba, la misma mezcla de AR?si sin ningún reactivo de transfección también fue altamente activa (datos no mostrados) . En forma interesante, cuando se usaron cantidades excesivamente altas de un ARNsi , la actividad de los demás ARNsi se inhibió en un ensayo de infección doble (figura 3). Mediante RT-PCR en tiempo real cuantitativa, la IC50 de ARNsi#4 (contra HPIV3 P) ex vivo se incrementó a través de 15, 35 y 100 nM al igual que la concentración de ARNsi#l (contra RSV P) se elevó de 0 a 20 a 200 nM (figura 3a) . Estos resultados fueron validados mediante la medición de proteína P de HPTV3 en inmunoabsorción (figura 3b) . En la infección doble de ratones, la cuantificación por inmunoabsorción de proteína ? de cada virus produjo una conclusión esencialmente idéntica: mientras que 5 mmoles (70ug) de cada AR?si efectivamente inhibieron ambos virus, 5 mmoles de un AR?si redujeron el efecto de 5 mmoles del otro de una manera mutua (figura 3) .

Las moléculas de AR?si I? previenen patología pulmonar Ya que las moléculas ARNsi previnieron la infección, una duda lógica era si evitaban el desarrollo de características patológicas también. Después de una infección visual las ratones expuestos a RSV tratados con AR?si actuaron y parecieron esencialmente como ratones no infectados con actividad normal, pelaje brilloso y de salud general buena. Después se midió el ritmo respiratorio, la inducción de leucotrieno, y la inflamación pulmonar. Se sabe que el ritmo respiratorio de ratones se incrementa en respuesta a la reacción por RSV (Haeberle, H.A. et al. J. Virol . 75, 878-890 (2001), Volovitz, B., et al., Pediatr . Res . 24, 504-507 (1988)). Leucotrienos, un producto de la vía de lipooxigenasa, se unen a los receptores de leucotrienos presentes en músculo liso bronqueal y se elevan en las secreciones respiratorias en pacientes asmáticos, infantes y humanos con infección por RSV y ratones infectados con RSV (Volovitz, B., et al., Pediatr. Res . 24, 504-507 (1988), Welliver, R.C., 2a e . Al., J. Infect . Dis . 187, 1773-1779 (2003)). Estos compuestos provocan secreción de moco de la vía aérea, broncoconstricción e infección de la vía aérea por células inflamatorias, las cuales son características importantes de una severa enfermedad por RSV. Cuando se administró ARNsi #1 anti-RSV al mismo tiempo que (o antes de) RSV, una reducción significativa en el ritmo respiratorio, histopatología pulmonar y acumulación de leucotrieno en fluido bronquialbeolar (BALF) fue observada (figura 4). Estos valores permanecieron cerca de la línea de base y fueron esencialmente comparables con aquellos en ratones infectados en falso. Todos los parámetros permanecieron bajos al menos 14 días después de la infección, demostrando que el AR?si verdaderamente previno la enfermedad y no sólo la pospuso. De hecho, los ratones tratados con ARNsi no mostraron signos visibles de alteración respiratoria hasta seis semanas después de observación. ARM de control negativo o luc-ARNsi (tabla 1) no ofreció algún alivio en todos los experimentos (datos no mostrados) .

Las moléculas de AR?si I? son antivirales efectivos después de infección Habiendo demostrado que las moléculas de AR?si pueden prevenir una enfermedad viral respiratoria si se administran antes de la infección, nos preguntamos si pudieran tener un efecto curativo una vez que la infección se ha establecido, y esto es sumamente importante en la medicina pediátrica. En esta serie de experimentos, se administró ARNsi #1 varios días después de la infección por RSV y los ratones se pesaron diariamente. Se sabe que los ratones pierden peso hasta aproximadamente 8-10 días después de la infección por RSV, después de lo cual o se mueren o vuelven lentamente a ganar peso dependiendo de si el inoculo de inicio es demasiado alto o moderado a bajo (Haeberle, H.A. et al . J. Virol 75, 878-890 (2001)). En una cohorte similar de ratones, los pulmones fueron muestreados en días predeterminados para evaluar el virus infeccioso. Como se esperaba, los ratones no tratados con AR?si mantuvieron su peso corporal durante aproximadamente 4 días p.i., seguidos por una pérdida gradual que continuó al menos hasta 9 días (figura 5a) . Los ratones tratados con ARNsi antes de (datos no mostrados) o al mismo tiempo que RSV (día 0) parecieron esencialmente no infectados y continuaron ganando peso sin interrupción. La mayoría de los ratones que recibieron ARNsi el día 1 también fueron bastante difíciles de distinguir de los controles infectados con placebo. Aquellos que recibían ARNsi en fechas subsecuentes (día 1-4) mostraron gradualmente menos y menos protección, aunque una mejora significativa de peso se observó todos los días para todos los tratamientos. Una imagen similar emergió cuando el título de RSV pulmonar se determinó en estos ratones en el día 2, 4, 6, 8, 10 y 16 (figura 5b) . En los ratones no tratados con ARNsi, el título se llevó hasta el día 4-5, y luego cambió lentamente a niveles indetectables por el día 16. El tratamiento con ARNsi antes o concomitante a la infección por RSV mantuvo el título 5,000 veces abajo en todos los días probados. La administración de AR?si en tiempos posteriores en la infección fue progresivamente menos efectiva, pero el título viral siempre fue más bajo que el de los controles no tratados en cualquier día probado. Pareció que el ARNsi , no obstante de cuándo fuera administrado, redujo la velocidad de replicación del virus, dando como resultado un título pico más bajo. Subsecuentemente, el título cayó por debajo de niveles detectables en tiempos cada vez más tempranos tan pronto como el ARNsi era administrado. Por ejemplo, mientras que en los ratones infectados no tratados el RSV pulmonar pudo detectarse hasta aproximadamente 16 días p.i., no pudo detectarse el día 1 en ratones tratados con ARNsi después de 10 p.i. Como antes, ARNsi de control negativo o ARNsi de luciferasa (tabla 1) no tuvo efecto en todos los experimentos (datos no mostrados). Juntos, estos resultados demostraron que en ARNsi de P RSV tuvo un efecto curativo incluso cuando se administró después de la infección y que los ratones siempre estuvieron menos enfermos y se recuperaron más rápidamente que sus cohortes no tratadas .

Discusión El principal descubrimiento de este documento es que las moléculas de ARNsi diseñadas adecuadamente y aplicadas intranasalmente, ofrecen protección contra infecciones respiratorias así como proporcionan también una terapia significativa cuando se aplican después de la infección. Las moléculas de ARNsi , suministradas por aerosoles de partícula pequeña en un inhalador manual simple, pueden usarse para prevenir o tratar infecciones pulmonares. Aunque este manuscrito fue en preparación, aparecieron dos reportes en los cuales moléculas de ARNsi inhibieron virus de la influenza, otro principal patógeno respiratorio, en un modelo de murino (Ge, Q., et al., Proc . Nati . Acad. Sci . USA 101, 8676-8681 (2004), Tompkins, S. M. et al. Proc . Nati . Acad. Sci . USA 101 8682-8686 (2004)). En un estudio (Ge, Q, et al., Proc . Nati . Acad. Sci . USA 101 8676-8681 (2004)), ARNsi sintético o AD? plasmídico que expresaba ARNsi se administró por medio de una combinación de rutas IV e IT. En otro estudio (Tompkins, S.M., et al. Proc . Nati . Acad . Sci . US 101, 8682-8686 (2004)), ARNsi se suministró primero mediante suministro IV hidrodinámico; 16-24 horas más tarde los ratones fueron infectados con virus de la influenza y se les dio una segunda dosis de AR?si en un portador lípido, ambos por ruta I?. La presencia de virus pulmonar se probó 2 días más tarde y una inhibición de 10-50 veces se observó con diferentes cepas de virus de la influenza. Nuestros estudios contra RSV y PIV ofrecen la siguiente mejora en significación sobre los anteriores: (i) el suministro es únicamente intranasal y por lo tanto, relativamente no invasivo e indoloro, haciéndolo viable a un inhalador o terapia a base de niebla; (ii) ARNsi sin ningún vehículo es significativamente efectivo, reduciendo así el riesgo potencial de efectos secundarios el vehículo, (iii) una sola dosis de aproximadamente 5 nanomoles de ARNsi (70 ug de ARN de doble hebra) parece proporcionar beneficios sobre la liberación completa de la infección. Un tamiz más comprensivo de la secuencia objetivo (por ejemplo RSV P) y el uso de químicas más nuevas puede llevar a moléculas AR?si con IC50 significativamente más bajas y mejor farmacocinética, dando como resultado una dosis más baja. Las moléculas de ARNsi exhiben varios grados de efectos no específicos fuera del blanco, especialmente a altas concentraciones (Jackson, A. L. et al. Nat . Biotechnol . 21, 635-637 (2003), Sledz, C.A., et al., at. Cell Biol, 5, 834-839 (2003 ) , Persengiev, S. P. et al . RNA 10, 12-18 (2004), Bridge, A.J. et al., Na t . Genet . 34 263-264 (2003)). Esto es una preocupación obvia en terapia, y la administración IV de ARNsi puede dar como resultado efectos secundarios sistémicos. En contraste, el ARNsi suministrado intranasalmente es más probable que sea concentrado - si es que no exclusivamente localizado - en los tejidos respiratorios, minimizando así los efectos secundarios. La falta de activación de IF? por AR?si sintético suministrado intranasalmente soporta y extiende previos descubrimientos de que las moléculas de AR?si sintetizadas químicamente, libres de 5 '-fosfatos, no activan la vía IF? en cultivo de células (Kim, D. H. et al . Nat . Biotechnol . 2 321-325 (2004)). Juntos, la correlación de la actividad antirival con supresión de ARNm específica (figura 1) detección del AR?si en el tejido objetivo (pulmón) (figura 2b), falta de activación de IF? (figura 2c) y efecto específico de virus de las moléculas de ARNsi (figuras 1-3) -proporcionan todos evidencia de que el efecto antiviral es específico, dirigido y es mediado por AR?i. (iii) Virus respiratorios, tales como RSV y PIV, exhiben alta selectividad en tropismo de tejido al infectar los tejidos respiratorios. Así, el suministro IN asegura que el ARNsi sea dirigido al sitio de infección - una condición ideal para la farmacología. Aunque RSV y PIB algunas veces se co-infectan, sus interacciones han permanecido ampliamente ignoradas. La razón exacta detrás de la inhibición observada de un AR?si por otro requiere de estudios adicionales. El hecho de que también ocurra ex vivo (cultivo de célula) argumenta en contra, aunque no descarta, factores humorales y citocinas en el animal, tales como interferón. RSV en realidad inhibe la activación de interferón (Schlender, J., et al., J. Virol . 74, 8234-8242 (2000), Ramaswamy, M. , et al., Am . J. Resp . Cell Mol . Biol . 30, 893-900 (200)), y así, debe facilitar más que inhibir el crecimiento de PIV. Otra posibilidad es que el crecimiento de un virus inhiba al otro a través de otros mecanismos, tales como la competencia por recursos intracelulares. Por otro lado, se sabe que la máquina aérea de AR?i es saturable y así dos ARNsi podrían competir potencialmente por un fondo fijo de esta maquinaria (Barik, S. Virus Res . 102, 27-35 (2004), (Hutvagner G, et al., PloS Biol . 2, E98 (2004)). Se debe notar que esta competencia sólo fue apreciable a dosis relativamente altas de las moléculas de ARNsi , es decir, con cientos de nanomoles (figura 3). En contraste, sólo pocas nanomoles de nuestras moléculas ARNsi ofrecieron una protección casi completa en ratones. Así, la competencia observada no es un asunto de preocupación práctica con las moléculas de ARNsi con una IC50 en la escala nanomolar baja. Cuando se usó como un profiláctico, el ARNsi no sólo previno la infección sino también inhibió la aparición de diferentes aspectos del proceso de la enfermedad como se mide por peso corporal, patología pulmonar, parámetros respiratorios y marcadores de alergias (figura 4) . La cinética del proceso de enfermedad en ratones y hombres son relativamente similares y en ambas especies cambios inmunopatológicos ocurren rápidamente después de la infección por RSV. Cuando se usen como un fármaco de tratamiento después de que la infección se hace evidente, no se espera que las moléculas de ARNsi corrijan la patología que ya ha ocurrido. Incluso entonces, sin embargo, la inhibición de un crecimiento adicional del virus dio como resultado una cura y recuperación más rápidas (figura 5). Así, parece que la "ventana de oportunidades" de tratamiento existe en todo momento en el paciente infectado por RSV aunque, como en cualquier enfermedad, los tratamientos anteriores deben producir mejor prognosis. La efectividad del ARNsi en desnudo permanece por ser explicada. Es posible que el tejido respiratorio, especialmente el pulmón, sea naturalmente más receptor al intercambio de moléculas pequeñas, o tal vez se vuelva así cuando se infecte.

Finalmente, dependiendo de la severidad del apareo ARNsi-obj etivo , la exposición a AR?si puede causar la selección de virus resistentes a ARNsi , y esto ha sido demostrado en VIH (Ds, A. T. et al J. Virol . 78, 2601-2605 (2004)). ?o hemos enfrentado este problema hasta el momento con las moléculas de AR?si probadas aquí. Los virus que podrían ser recuperados del pulmón de murino tratado con ARNsi fueron cultivados en un cultivo de células a 5-9 y se encontró que exhibían la misma IC50 para el ARNsi que el inoculo original (datos no mostrados) . Más aún, la determinación de secuencia del ARNsi de RSV en seis de estos aislados de RSV purificados por placa independientes reveló la secuencia progenitora tipo silvestre (datos no mostrados) . Incluso si resistencia ocasional se encuentra en el futuro, un segundo AR?si con una baja IC50 y dirección a una región diferente del ARNm de P o un AR?m viral diferente puede usarse en un régimen de varios fármacos, reduciendo de esta manera las probabilidades de resistencia viral.

Métodos Virus, AR?si y otros reactivos. RSV de cepa grande y PIV humano tipo 3 (HPIV3) cepa JS fueron cultivados en monocapas HEp-2 como las descritas para RSV (Burke, E., et al., virology 252 137-148 (1998), Burke, E, et al., J. Virol . 74, 669-675 (2000), Grupta, S., et al., J. Virol . 72, 2655- 2662 (1998) ) . Los medios extracelulares contenían virus de progenie liberado se recogió aproximadamente 70 horas para RSV y 50 horas para HIPIV3. Los virus fueron concentrados y purificados mediante precipitación con polietilenglicol (PM 8,000) y centrifugación con ingrediente de sucrosa esencialmente como se describió para RSV (Ueba, O . Acta . Med. Okayama 32, 265-272 (1978)). Las preparaciones finales tuvieron títulos infecciosos en la escala de 108-109/ml y se almacenaron congeladas a -802C en porciones pequeñas. Todos los títulos virales infecciosos (pfu) se determinaron mediante ensayo de placa de agarosa en monocapas de Hep-2 con tinción rojo neutro (Burke, E., et al., Virology 252, 137-148 (1998), Burke, E., et al., J". Virol . 74, 669-675 (2000), Gupta, S., et al., J. Virol . 72, 2655-26662 (1998)). Moléculas de ARNsi se compraron de Dharmacon y se procesaron como se recomendó por el fabricante (Bitko, V. & Barik, S. BMC Microbiol . 1, 34 (2001). El reactivo TransIT-TKO® fue de Mrus Bio Corp (Madison, Wisconsin) . Anticuerpo RSV-P, desarrollado en conejo, se usó en toda la tinción inmunohistológica (Bitko, V. & Barik, S, BMC Microbiol . 1, 34 (2001) . Anticuerpos RSV y HPIV3 polclonales se criaron contra viriones purificados en cabra y comprados de Chemicon (Temecutla, California) y BiosPacific (Emeryville, California) , respectivamente; la proteína de nucleocápside (?) es la principal banda viral detectada por estos anticuerpos en inmunabsorción. El anticuerpo profilina ha sido descrito (Burke, E., et al . , J. Virol . 74, 669-675 (2000), Gupta, S., et al., J. Virol . 2 , 2655-2662 (1998)).

Infección por virus y tratamiento con ARNsi . La infección y tratamiento con ARNsi de células A549 cultivadas en monocapas se llevaron a cabo como se describió (Bitko, V. & Barik, S. BMC Microbiol . 1, 34 (2001)). La aplicación intranasal del RSV en ratones es un procedimiento establecido y causa bronquiolitis. Ratones BALB/c hembra de 8-10 semanas de edad libres de patógenos, que pesaban entre 16 y 20 gramos se compraron de Charles River Laboratories. La anestesia para la infección o administración de AR?si se logró con inyección intraperitoneal de 0.2 ml de nembutal (5 mg/ml). Se llevó a cabo la eutanasia mediante dislocación cervical después de anestesia con 0.3 ml de nembutal. El AR?si se diluyó adecuadamente en el regulador de pH de dilución proporcionado por el fabricante de tal manera que la cantidad deseada estuviera contenida en 1 ul . Esto se mezcló con 5 ul del reactivo TransIT-TKO® y 35 ul de Opti-MEM (Gibco Life Technologies, Invitrogen, Carlsbad, CA) inmediatamente antes del experimento para producir un volumen total de 41 ul . Cuando siARn se usó sin vehículo, 5 ul del reactivo de transfección se sustituyeron con 5 ul de Opti-MEM. El virus purificado con sucrosa fue diluido adecuadamente en solución salina de pH regulado con fosfato fría (PBS) inmediatamente antes de la infección de tal manera que 107 Pfu de virus estuvieron contenidos en 30 ul . Una infección placebo se llevó a cabo con el mismo volumen de PBS libre de virus. Tanto la mezcla de ARNsi como el virus se dividieron igualmente en las dos fosas nasales y se aplicaron con una micropipeta (es decir, cada fosa nasal recibió 35 ug de ARNsi en 20.5 ul yO .5 x 107 pfu de virus en 15 ul) . No se requirió equipo especial porque los ratones inhalaron todo el fluido a través de respiración natural. Para infección doble, grupos de RSV y HPIV3 se dividieron de tal manera que cada ratón se midió en una mezcla de 107 de pfu de cada virus y una mezcla de 5 nmoles (70 ug) cada una de ARNsi#l y ARNsi#4 en los mismos volúmenes que antes. Los experimentos con animales obedecieron todos los lineamientos prescritos y fueron aprobados por la IACUC .

Ensayo viral pulmonar y mediciones clínicas. Los animales fueron revisados y pesados diariamente. Se notaron los síntomas clásicos de RSV, incluyendo moco nasal, ritmo respiratorio incrementado debido a la congestión y bronquiolitis, un pelaje opaco, vello rizado y pérdida de pelaje, y un letargo y malestar generales. Los ritmos respiratorios (respiraciones por minuto) se determinaron mediante grabación por video (Volovitz, B., et al., Pediatr.

Res . 24, 504-507 (1988)). Estornudos, inhalaciones y suspiros se excluyeron del conteo. Varios días después de la infección (p.i.), los pulmones fueron removidos para la detección de RSV mediante ensayo de virus infecciosos, análisis de inmunoabsorción o inmunotinción, como se describe abajo . Para determinar el título viral, el pulmón se homogeneizó en DMEM complementado con 2% de FBS (2 ml de DMEM por 100 mg de tejido) en frío. El extracto se centrifugó a 2,000 x g durante 10 min., y diluciones en serie de sobrenadante se ensayaron para pfu. Para la inmunoabsorción de proteínas virales (Burke, E., et al., Virology 252 137-148 (1998)), 10 ul de la muestra homogeneizada (antes de la centrifugación) se añadieron a 10 ul de regulador de pH de muestra 2x SDS-PAGE, la muestra se calentó a 98 aC durante 5 minutos, se aclaró mediante centrifugación en una microcentrífuga a temperatura ambiente y 10 ul del sobrenadante transparente se analizaron mediante inmunoabsorción usando anticuerpos anti-RSV y anti-HPIV3 de cabra. Para medir IFN, los pulmones se homogeneizaron en PBS, se procesaron igual que arriba y se ensayaron diluciones en serie mediante equipos ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN) que tenían límites de detección de 10 pg/ml. Para histopatología pulmonar, los pulmones fueron perfundidos y fijados en 10% de formalina regulada en pH e incrustados en parafina. Varias secciones de 4 ml de grosor se tiñeron con hematoxicilina y eocina y se calificaron para inflamación celular bajo microscopía de luz por dos investigadores independientes. Los infiltrados inflamatorios se calificaron al enumerar las capas de células inflamatorias que rodeaban los vasos y bronquíolos. Cero a tres capas de células inflamatorias se consideraron normales, mientras que más de tres capas de células inflamatorias que rodeaban 50% o más de la circunferencia del vaso o bronquíolos se consideraron anormales. El número de espacios perivasculares y peribronquiales anormales dividido entre un total de estos espacios fue el porcentaje reportado como la puntuación de patología. Un total de aproximadamente 20 espacios por pulmón se contaron por cada animal. Con 107 RSV (y sin ARNsi) (Haeberle, H.A. et al . J. Virol 75, 878-890 (2001)), alrededor de 30-35% de los espacios perivasculares y peribronquiales pudieron encontrarse normales tan temprano como el día 1 y formaron un pico alrededor del día 5. Para inmunohistología (Haeberle, H. A., et al . , J. virol , 75, 878-890 (2001)), el tejido pulmonar se incrustó en 100% de compuesto OCT, y se congeló a -80 aC. Las secciones se cortaron sobre portaobjetos, se secaron al aire, se fijaron en acetona, se lavaron en PBS y se permeabilizaron con 0.2% de Tritón X-100 en PBS, se bloquearon durante 20 minutos con 10% de suero de cabra en PBS a temperatura ambiente. Después de varios lavados en PBS el tejido se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente ya sea con anticuerpo anti-RSV-P o anti-HPIV3 diluido en PBS que contenía 1.5% de suero de cabra. Los portaobjetos se lavaron nuevamente varias veces en PBS, y los dos anticuerpos se detectaron con anticuerpo anti-conejo conjugado FITC y inmunoglobulina G anti-cabra conjugado a TRITC . Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, los portaobjetos se les dio un lavado final en PBS, se montaron en el medio de montaje DABCO-DAPI y se vieron mediante microscopía por fluorescencia (Bitko, V & Barik, S. BMC Microbiol . 1, 34 (2001)). El fluido del lavado bronquialveolar (BALF) se recogió al perfundir los bronquios y los pulmones con 5 x 1.0 ml de solución salina normal (que contenía 10 ug de indometacina por ml) (Bernhard, W. et al . , Am . J. Respir . Cell Mol . Biol . . 25, 725-731 (2001)), recuperación total de BALF por ratón fue de 4.2-4.4 ml . Las muestras que contenían signos visibles de contaminación de sangre fueron descartadas. Las células se removieron de BALF mediante centrifugación a 5,000 x g durante 15 minutos a 4aC y las muestras se almacenaron a -802C hasta análisis adicionales. La concentración de conjugados de leucotrienos de cisteinilo en el BALF se determinó mediante un equipo ELISA siguiendo el protocolo del fabricante (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) . De acuerdo con el inserto de producto, la reactividad cruzada del equipo a los diferentes leucotrienos fue: LTC4 100%, LTD4 115%, LTE4 63% y LTB4 1.2%. Para experimentos de PCR en Tiempo Real, el ARN se aisló de células infectadas con HPIV3 y del AD?c de la primera hebra se hizo usando el equipo GeneAmp R?A PCR Core (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, California) .

Los cebadores se diseñan por el software Beacon Designer v 2.13 de Premier Biosoft. Se usaron los siguientes cebadores para amplificar el APNm de HPIV3 : 5 ' -GGTCATCACACGAATGTACAC-3 ' (SEQ ID ?O: 1) y 5 ' -CTTGGAACATCTGCAGATTGTC-3 ' (SEQ ID ?O : 2). Se llevó a cabo una PCR en tiempo real en el sistema iCycler iQ Quantitative PCR de BioRad Laboratories (Hercules, California) usando la iQ Sybr Green SuperMix. Las mediciones de expresión génica se calcularon usando el software del fabricante y GAPDH como el control interno. La hebra antisentido de AR?si en el pulmón se extrajo y se detectó por hibridación Northern esencialmente como se describió (Reinhart, B.J., et al., Genes & Dev. 16, 1616-1626 (2002)) usando desoxinucleótidos sintéticos complementarios marcados terminalmente con 32P.

Análisis estadístico. Los cambios entre grupos de tratamiento o entre conjuntos de experimentos in vi tro se analizaron mediante ANOVA de una vía y después por la prueba t del estudiante con corrección de Bonferroni . Los incrementos en concentraciones de leucotrieno se determinan por la prueba de Mann-Whitney. Todos los datos numéricos se recabaron a partir de al menos tres experimentos separados. Los resultados se expresaron como media ± SEM (barras de error en gráficas) . Se consideró que las diferencias eran significativas a P < 0.05.

Tabla 1 Secuencias de ARNsi Nombre Objetivo SEQ ID NO: Secuencia de ARNsi IC50 (Nm) ARNsi#l RSV-P 5 '-CGAUAAUAUAACUGC AAGAdTdT-3 ' 3'dTdTGCUAUUAUAUUGACGUUCU-5' ARNsi#2 RSV-P 5'CCCUACACCAAGUGAUAAUdTdT-3' 80 3'dTdTGGGAUGUGGUUCACUAUUA-5' ARNs¡#3 RSV-P 5'-GAUGCCAUGAUUGGUUUAAdTdT-3' >300 3 '-dTdTCUACGGUACUAACCAAAUU-5 ' ARNsi#4 HPIV3-P 5 '-CGAGUUGUAUGUGUAGCAAdTdT-3 ' 15 3'-dTdTGCUCAACAUACACAUCGUU-5' ARNsi#5 HPIV3-P 1 1 5'-GAUAGACUUCCUAGCAGGAdTdT-3' >300 12 3 '-dTdTCUAUCUGAAGGAUCGUCCU-5 ' Luc- ARNsi Luciferasa 13 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3' 14 3 '-dTdTGCAUGCGCCUUAUGAAGCU-5' Negativo 15 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3 ' 16 3'-dTdTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5' - Los números de registro de GenBank para las secuencias de RSV-P, HPIV3-P y luciferasa son M22644, Z11575 y X65324 respectivamente. Nótese que las secuencias de ARNsi se basaron en secuenciación real de las cepas virales en nuestro laboratorio; así, ARNsi#2 difiere por un nucleótido de la secuencia en GenBank (la C subrayada es U en M22644) . La secuencia de ARNsi de control negativo fue de Qiagen (Valencia, California) . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un método para reducir los niveles de una proteína viral, ARNm viral o un título viral en una célula de un sujeto, caracterizado porque comprende la etapa de administrar un agente de AR?i al sujeto, en donde el agente de ARNi comprende una hebra en sentido que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos complementarios a un gen de un primer virus respiratorio de mamífero y una hebra en antisentido que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos complementarios a la hebra en sentido. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el virus respiratorio de mamíferos se selecciona del grupo que consiste en PIV y RSV.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el gen del RSV es el gen de proteína P.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el agente comprende 15 nucleótidos seleccionados de uno de los agentes de la tabla 1.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente de ARNi se administra intranasalmente a un sujeto.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente de ARNi se administra mediante inhalación o nebulización a un sujeto.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente de AR?i reduce el título viral en el sujeto.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además co-administrar un segundo agente de ARNi al sujeto, en donde el segundo agente de ARNi comprende una hebra en sentido que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos complementarios a un gen de un segundo virus respiratorio de mamífero y una hebra en antisentido que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos complementarios a la hebra en sentido.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sujeto es diagnosticado como teniendo una infección viral.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer virus respiratorio de mamíferos es RSV y el segundo virus respiratorio de mamíferos es PIV.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el sujeto es diagnosticado como teniendo una infección viral con el primer virus respiratorio de mamíferos y el segundo virus respiratorio de mamíferos.
12. 12. Un método para reducir los niveles de una proteína viral de un primero y un segundo virus respiratorio de mamíferos en una célula de un sujeto, caracterizado porque comprende la etapa de co-administrar un primero y un segundo agentes de ARNi al sujeto, en donde el primer agente de ARNi comprende una hebra en sentido que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos complementarios a un gen de un primer virus respiratorio de mamífero y una hebra en antisentido que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos complementarios a la hebra en sentido, y el segundo agente de ARNi comprende una hebra en sentido que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos complementarios a un gen de un segundo virus respiratorio de mamífero y una hebra en antisentido que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos complementarios a la hebra en sentido.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer virus respiratorio de mamíferos es RSV y el segundo virus respiratorio de mamíferos es PIV.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque los agentes de AR?i se administran intranasalmente .
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque los agentes de ARNi se administran mediante inhalación o nebulización.