ES2528010T5 - Métodos para detectar la presencia de patógenos intracelulares - Google Patents
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Description
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del método de la invención, pero debido a que el agente inhibe la reproducción de un segundo patógeno intracelular, el agente no sería adecuado cuando se busca dicho segundo patógeno.
Según los párrafos anteriores, la invención también comprende formas de realización en las que un segundo o sucesivo agente, inhibe la reproducción de un tercer o sucesivo patógeno intracelular.
El agente inhibidor puede seleccionarse en base al tipo de patógeno intracelular que va a inhibirse. Por ejemplo, si el segundo patógeno intracelular es un virus de la gripe, el agente inhibidor puede seleccionarse en base al tipo de virus, por ejemplo, virus de la gripe A o virus de la gripe B. En tal forma de realización, algunos agentes pueden actuar contra ambos virus A y B, mientras que otros son específicos.
El agente inhibidor puede ser un antifúngico. El agente inhibidor también puede ser un antiviral o un antibacteriano. El agente inhibidor puede ser un antibiótico.
Puede seleccionarse un agente inhibidor en base a características conocidas del ciclo vital del segundo patógeno intracelular. El segundo patógeno intracelular puede ser un patógeno lítico, es decir, puede provocar la lisis de las células. Cuando el segundo patógeno intracelular es lítico, el agente inhibidor inhibe preferentemente el ciclo vital del segundo patógeno intracelular de manera que se impida la lisis celular. Por ejemplo, en formas de realización preferentes, el agente inhibidor inhibe la replicación o la expresión génica en el segundo patógeno intracelular. Preferentemente, el agente inhibidor se dirige contra una o más especies de ARN del segundo patógeno intracelular de manera que se impida la reproducción y/o el ensamblaje del segundo patógeno intracelular. Por ejemplo, cuando el segundo patógeno intracelular es un virus de la gripe, oseltamivir es menos útil con la invención que otros agentes. Oseltamivir es activo contra el virus de la gripe in vivo, pero esta actividad se ejerce extracelularmente. Como el virus de la gripe es lítico, los cultivos celulares experimentarán un gran efecto citopático antes de que el compuesto antiviral pueda interferir con el ciclo vital del virus en las condiciones del proceso. En general, no resultan preferentes los agentes inhibidores que actúan extracelularmente (incluidos los inhibidores de la neuraminidasa para el virus de la gripe). Preferentemente, el agente inhibidor inhibe o impide la reproducción, el crecimiento, la multiplicación, la replicación, la expresión génica, la transcripción y/o la traducción intracelular del segundo patógeno intracelular. Por ejemplo, el agente inhibidor puede inhibir la expresión génica del segundo patógeno intracelular. Por ejemplo, el agente inhibidor puede inhibir post-transcripcionalmente la expresión génica del segundo patógeno intracelular, por ejemplo mediante la inhibición de la traducción del ARNm, en particular, mediante la degradación del ARNm.
Los agentes preferentes para utilizarse con la invención pueden, al menos parcialmente, inhibir la reproducción intracelular del segundo patógeno intracelular. Más preferentemente, dicha inhibición o impedimento es al menos sustancialmente completo, lo más preferentemente completo.
Los agentes preferentes para utilizarse con la invención pueden inhibir o impedir, al menos parcialmente, un efecto fenotípico o citopático del segundo patógeno intracelular, por ejemplo, efectos citopáticos virales, o puede inhibir o impedir, al menos parcialmente, la hemadsorción y/o hemaglutinación. Más preferentemente, los agentes para utilizarse con la invención inhiben o impiden la hemaglutinación, la hemadsorción y/o los efectos citopáticos virales, al menos sustancialmente completamente, lo más preferentemente completamente.
Los agentes inhibidores adecuados incluyen, pero no se limitan a, compuestos orgánicos pequeños (por ejemplo, con peso molecular < 1.000 Da), compuestos oligoméricos, en particular, moléculas de ARN de interferencia y moléculas antisentido. Los agentes inhibidores adecuados incluyen fármacos antivirales de molécula pequeña, e inhibidores peptídicos.
Preferentemente, el agente comprende un resto o compuesto oligomérico, por ejemplo, un ácido nucleico, un oligonucleótido, un derivado de ácido nucleico o un derivado de oligonucleótido, incluido un ácido nucleico modificado o un oligonucleósido modificado. El agente puede inhibir la expresión de una secuencia (por ejemplo, un gen) en el genoma del segundo patógeno intracelular, es decir, el agente inhibidor puede dirigirse contra una secuencia diana.
Preferentemente, el agente comprende un resto o compuesto oligomérico que es capaz de apareamiento de bases complementarias con la secuencia diana. Preferentemente, el agente es sustancialmente complementario de una secuencia diana. La secuencia diana puede ser una secuencia nucleotídica presente en, complementaria de, codificada por y/o transcrita a partir del genoma del segundo patógeno intracelular. Preferentemente, el compuesto oligomérico es capaz de apareamiento de bases complementarias con una secuencia nucleotídica transcrita a partir del genoma del segundo patógeno intracelular, por ejemplo, con un ARNm, por ejemplo, un ARNm maduro. Si el segundo patógeno intracelular es un virus, dicha secuencia transcrita también puede estar dentro de un genoma de ARN o ADN complementario (ARNc o ADNc), es decir, una secuencia genómica complementaria en relación a un genoma viral de cadena positiva o de cadena negativa. Dicha secuencia transcrita también puede ser una molécula de ARN regulador.
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Preferentemente, el compuesto oligomérico es un 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o 100% complementario de la secuencia diana.
El agente que comprende un compuesto oligomérico puede ser monocatenario o bicatenario. Asimismo, el compuesto oligomérico puede ser monocatenario o bicatenario. Cuando el agente es un compuesto oligomérico bicatenario -es decir, un dúplex -una de las dos hebras de dicho agente es capaz de dicho apareamiento de bases complementarias con dicha secuencia nucleotídica presente en, y/o transcrita a partir del genoma del segundo patógeno intracelular.
Una porción o secuencia del agente que es capaz de apareamiento de bases complementarias con una secuencia diana se dice que es antisentido con respecto a dicha secuencia de dicha una secuencia diana. Por lo tanto, el agente puede ser un compuesto oligomérico antisentido. Un agente inhibidor que es un compuesto oligomérico antisentido puede actuar mediante cualquier mecanismo antisentido de inhibición génica, por ejemplo, una ARNasa H, un mecanismo de ARNi (ARN de interferencia), un mecanismo basado en RISC. En el presente documento, un mecanismo basado en RISC es un mecanismo que implica un complejo RISC, incluido el mecanismo de ARNi. Los agentes que actúan mediante un mecanismo antisentido de inhibición génica son bien conocidos en la técnica, y, por consiguiente, el experto en la materia puede adaptar la estructura del agente. Preferentemente, el compuesto oligomérico actúa mediante ARNi para inhibir la reproducción del segundo agente intracelular. Por lo tanto, el agente inhibidor puede ser un compuesto oligomérico de interferencia, incluida una molécula de ARN de interferencia, tal como un ARNip (una molécula de ARN de interferencia pequeño).
Una hebra de un agente que es un compuesto oligomérico, por ejemplo, un oligonucleótido, puede tener 19-80 monómeros de longitud, preferentemente 19-75, 19-70, 19-65, 19-60, 19-55, 19-50, 19-45, 19-40, 19-35 ó 19-30 monómeros de longitud, preferentemente 19-29, 19-28, 19-27 ó 19-26 monómeros de longitud, por ejemplo, 20-26, 21-26, 22-26, 23-26, 19-25, 20-25, 21-25, 22-25, 23-25, 19-24, 20-24, 21-24, 22-24, 23-24, 19-23, 20-23, 21-23, 22-23, 19-22, 20-22, 21-22, 19-21, 20-21 ó 19-20 nucleótidos de longitud. Dichos monómeros son preferentemente capaces de apareamiento de bases complementarias con ácidos nucleicos, y preferentemente comprenden bases de ácido nucleico, nucleósidos o nucleótidos, por ejemplo, ribonucleósidos o desoxirribonucleótidos o derivados de los mismos. Es decir, dichos monómeros son preferentemente capaces de apareamiento de bases complementarias con una secuencia diana de manera que sostenga un mecanismo antisentido (por ejemplo, ARNi) de inhibición de la expresión de la secuencia diana. El agente puede ser una sola hebra capaz de formar una estructura en horquilla, es decir, en virtud del apareamiento de bases complementarias interno, por ejemplo, el agente puede ser un ARN horquillado corto.
Por ejemplo, se conocen en la técnica agentes que inhiben los coronavirus, por ejemplo el coronavirus del SARS, o la replicación del virus de la gripe. Por ejemplo, en la referencia 24 se analizan y se hace referencia a moléculas de ARNip dirigidas a coronavirus. En la referencia 25 se describen aproximadamente 20 moléculas de ARNip diferentes dirigidas al virus de la gripe A. En las referencias 26 y 27 se describe un trabajo sobre ARNip adicional del mismo grupo. En la referencia 28 la diana es el virus de la gripe B. En las referencias 29 y 30 se describen ARN de interferencia adicionales activos contra el virus de la gripe.
Preferentemente, las regiones de un virus a las que se dirigen los compuestos oligoméricos están conservadas entre diferentes subtipos y cepas del virus, por ejemplo, entre la gripe del ser humano, pollo, pato, caballo y/o cerdo. Las secuencias de la gripe se encuentran disponibles en la base de datos de secuencias de la gripe: www.flu.lanl.gov. Preferentemente, un compuesto oligomérico no comparte identidad con un gen conocido en la población de células utilizadas en los métodos de la invención, o no interfiere con la capacidad de las células para permitir la reproducción de dicho primer patógeno intracelular. Por ejemplo, los compuestos oligoméricos dirigidos a virus de la gripe pueden inhibir la expresión de uno o más de los genes HA, NA, M, NP, NS, PA, PB1, PB2. Los genes NP, PA, PB1 y/o PB2 resultan preferentes para la selección de secuencias diana, en particular, los genes NP y/o PA son dianas preferentes.
También se conocen en la técnica ácidos nucleicos antisentido activos contra la replicación del virus de la gripe. Por ejemplo, en la referencia 31 se describen oligonucleótidos antisentido morfolino antivirales.
Mientras que los agentes inhibidores utilizados in vivo deben tener una toxicidad, perfiles farmacocinéticos, semivida, etc. aceptables, estas consideraciones no son tan importantes con los procesos de la invención. Por ejemplo, hay muchos compuestos antivirales potentes (por ejemplo, contra la gripe) que han sido rechazados para su uso rutinario en seres humanos debido a propiedades farmacéuticas sistémicas desfavorables, pero que pueden utilizarse con la invención. Del mismo modo, las cuestiones de administración que son pertinentes para las moléculas antisentido o de ARNip son menos importantes cuando se trata de cultivos celulares. En la referencia 25 ya se informa que sus moléculas de ARNip son activas contra el virus de la gripe que crece en un cultivo MDCK, y la referencia 28 también se centraba en células cultivadas. Aun así, todavía pueden utilizarse los sistemas de administración para el trabajo in vitro. Por ejemplo, en la referencia 32 se informó acerca de la administración de ARNip a células cultivadas para inhibir la replicación del virus de la gripe, utilizando virosomas. En la referencia 33 se informa adicionalmente del uso de sistemas basados en policatión para facilitar su administración a las células.
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