CN115768521A - 预防和治疗2019新型冠状病毒(2019-nCoV)感染引起的严重急性呼吸道感染疾病的RNAi药物组合物及方法 - Google Patents

预防和治疗2019新型冠状病毒(2019-nCoV)感染引起的严重急性呼吸道感染疾病的RNAi药物组合物及方法 Download PDF

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Abstract

提供了开发有效预防和治疗冠状病毒(2019‑nCoV；COVID‑19)感染的siRNA治疗组合物及其方法。所述组合物包括一种由靶向病毒关键基因的siRNA鸡尾酒、药学上可接受的聚合物纳米颗粒载体和脂质体纳米颗粒载体构成的药学组分。提供了预防和治疗的给药方法，包括呼吸道灌输、皮下注射和雾化吸入。

Description

预防和治疗2019新型冠状病毒(2019-nCoV)感染引起的严重 急性呼吸道感染疾病的RNAi药物组合物及方法
本申请要求申请日为2020年1月23日，申请号为US62/965,063的美国发明专利的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
发明所属领域
本发明涉及一种能够治疗新型冠状病毒2019-nCoV感染的治疗制剂。具体的，所述siRNA分子靶向肺炎病毒(2019-nCoV)的保守基因序列或单链病毒RNA，以及一种包含化学修饰siRNA寡核苷酸的药学制剂，制剂还可选择性地包含其他成分：表面活性剂溶液、5％葡萄糖水溶液(D5W)、其它适合呼吸道的溶液；组氨酸-赖氨酸共聚物(HKP)，或精胺脂质体偶联物(SLiC)，或肺组织靶向的官能团如肽、核苷酸、小分子或抗体。制备和使用siRNA分子和药物组合物的方法，包括siRNA/纳米颗粒载体制剂、制剂制备方法、特定的给药途径和治疗方案。
发明背景
2019-nCoV病毒性疾病：生物学和病理学
对2019-nCoV遗传信息编码的最新研究证实，与SARS和MERS一样，蝙蝠也可能是2019-nCoV冠状病毒的起源(季伟，王伟，赵晓芳，宰俊杰，李星光。新发现的冠状病毒2019-nCoV的刺突糖蛋白内的同源重组可能会促进从蛇到人类的跨物种传播。医学病毒学杂志。2020年1月22日)。冠状病毒的基因组和亚基因组一般含有至少6个开放阅读框(ORF)。除了丙型冠状病毒缺乏nsp1外，第一个ORF(ORF1a/b)约占基因组的2/3，编码16个非结构蛋白(nsp1-16)。ORF1a和ORF1b有一个碱基的移位(ORF1b是通过ORF1a末端的翻译框移位而来)，形成两种重叠多蛋白：pp1a和pp1b，被木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(PLpro)和3C样丝氨酸蛋白酶(3CLpro)裂解，最终形成RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)、解旋酶(Helicase)以及其它一些参与RNA合成或调节宿主反应的总共16个非结构蛋白(泽布尔J，斯尼基德EJ，革巴伦亚AE.网巢病毒目中的病毒编码蛋白酶和蛋白水解过程。普通病毒学杂志。2000；81(Pt 4)：853-879。)。基因组的另外1/3则负责编码至少4种结构蛋白：刺突糖蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核衣壳蛋白(N)。
2020年1月7日，一株2019-nCoV从一名患者体内被快速分离出来，并进行基因组测序。一种2019-nCoV是2B组的乙型冠状病毒(βCoV)，与SARS-冠状病毒的基因序列相似性至少为70％，已被世卫组织命名为2019-nCoV(大卫·S·回，爱资·哈尔，塔里克·A·马达尼，弗朗辛·恩图米，理查德·科克，奥斯曼·达尔，朱塞佩·伊普波利托，蒂莫西·D·姆丘，轧德·A·梅米什，克里斯蒂安·德罗斯滕，阿利穆丁·祖姆拉，艾斯卡尔德·彼得森。序列分析显示2019-nCoV拥有典型的冠状病毒基因组结构，属于乙型冠状病毒属，该属还包括蝙蝠SARS样(SL)-ZC45、蝙蝠SL ZXC21和SARS-CoV等。根据冠状病毒进化树进行分析，2019-nCoV更接近于蝙蝠SARS样(SL)-ZC45毒株、蝙蝠SL ZXC21毒株，而与SARS-CoV的进化关系相对更远(陈宇，刘倩云，郭德银。冠状病毒：基因组结构、复制和发病机制。医学病毒学杂志。2020年1月22日)。
现有的预防和治疗策略
目前依然缺乏针对性的、疗效确切的预防或治疗药物，主要的治疗均以姑息治疗为主。重组干扰素和利巴韦林对冠状病毒感染效果有限(西纳特尔J，摩根斯坦B，鲍尔G，钱德拉P，拉贝纳H，杜尔HW。采用人干扰素治疗SARS。柳叶刀。2003；362(9380)：293-294。)。SARS和MERS大流行后，大量的抗冠状病毒药物立项研发，靶点包括蛋白酶、聚合酶、甲基转移酶、病毒入侵蛋白等，但这些都未能在临床研究中展现出足够的疗效(戴尔J，格罗斯R，金德拉楚克J，约翰逊射频，奥林格G，亨斯莱勒，弗里曼MB，贾林PB。中东呼吸系统综合征和严重急性呼吸系统综合征：当前新治疗方法和潜在的治疗新靶标。药物。2017年2月；77(18)：1935-1966；贾斯伯·F·W·陈，Kwok-Hung陈，理查德·Y·T·考，开尔文·K·W·屠，郑伯健，克拉拉·P·Y·李，帕特里克·T·W·李，戴军，佛罗伦萨·KY·默克，陈洪林，弗雷德里克·G·海登，袁国勇。新型中东呼吸道综合征冠状病毒的广谱抗病毒药物。感染杂志。2013；67(6)：606-616；刘强，袁宏，冯叶，詹秋阳。呼吸道病毒感染的抗病毒药物：问题和展望。呼吸重症监护医学研讨会。2016；37(4)：640-646。)。
迄今为止，已经提出了从康复期患者那里获得的血浆和抗体疗法作为主要疗法(迈尔-詹金斯，坎普，贝莉，卡斯，鲁尼，阮范丹，贝克CR；静止等离子体研究组。恢复期血浆和高免疫免疫球蛋白治疗病毒病因学严重急性呼吸道感染的有效性：系统综述和探索性荟萃分析。感染性疾病杂志。2015；211(1)：80-90。)。然而，目前与2019-nCoV感染有关的临床信息非常有限，特别是缺少人群范围、病毒动物来源、潜伏期、流行曲线、病毒动力学、传播路线、发病机制、解剖证据、重症病例对抗病毒药物的反应等信息未来，为了更有效地实现全球合作，需要更重要和更具目标性的投资，综合所有地理区域的经验(苏姆拉·A、达尔·O、科克·R、穆图里·M、恩图米·F、卡利布·P，等。采取‘一种健康”方法，扭转应对中东呼吸综合征冠状病毒和其他具有流行潜力的人畜共患病原体的潮流。感染性疾病国际杂志。2016；47：5–9。)。
不幸的是，目前没有针对冠状病毒的获批疫苗或抗病毒药物。为了阻止和治疗这一疾病，需要更好地理解2019-nCoV的生命周期，包括病毒来源、病毒如何传播和如何复制。由于缺乏有效的治疗药物或疫苗，对抗冠状病毒严重感染的方法是控制传染源，早诊断、早报告、早隔离，提供支持性治疗，及时发布流行病学信息以避免非必要的恐慌。同时，快速推动有效创新药物的开发是至关重要的。
发明概述
本发明所提供的药物组合物中含有至少两种siRNA分子，其针对2019年新型冠状病毒(2019-nCoV)的保守区域，该组合物含有药学上可接受的载体成分，其中载体包括聚合物纳米颗粒和/或脂质体纳米颗粒。siRNA分子包含长度为19-25个碱基对的寡核苷酸。该药物组合物所包含的siRNA分子成分可抑制病毒非结构(NS)RdRp酶，复制酶或解旋酶的基因表达，或病毒刺突蛋白基因的表达，以及除了病毒刺突蛋白之外的其他2019-nCoV基因的表达。这些siRNA分子的设计针对了NS基因的正义链序列和/或至少一个针对2019-nCoV刺突蛋白基因的正义链序列。除了刺突蛋白的基因序列外，这些siRNA分子可针对2019-nCoV全基因的正义链序列进行设计。
在一个实施例中，每种siRNA的正义链均从包含SEQ ID NO：1-101序列的siRNA中选择。在另一实施例中，每种siRNA的正义链均从包含表格E中序列的siRNA中选择。在一组特定实施例中，两个siRNA分子从以下组合中选择，这些组合包括：CoV3和Cov18；CoV3和CoV14；CoV4和CoV14；以及AoV4和CoV18，其中CoV3包含序列GGAAGGAAGTTCTGTTGAA或GGAAGGAAGTTCTGTTGAATTAAAA；CoV4包含序列GCCATTAGTGCAAAGAATA；CoV14包含序列GGCCGCAAATTGCACAATT；CoV18包含序列CCACCAACAGAGCCTAAAA或CCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACA。
该组合物含有聚合物纳米颗粒载体，如组氨酸-赖氨酸共聚合物(HKP)和/或含有脂质体纳米颗粒载体，如含胆固醇的精胺-脂质偶联物(SLiC)制剂。在这些组合物中，HKP和siRNA分子可自组装成纳米颗粒和/或含胆固醇的SLiC和siRNA可自组装纳米颗粒制剂。
同时本发明还提供了治疗受试者的方法，比如感染2019-nCoV的病人人类，可以给予如上所述的药效学上有效的组合物剂量。该药物组合物可通过气道灌注、腹腔和/或气道喷雾等方式和途径给药。
实验对象也可以是老鼠、雪貂或猴子。
图表的简要说明
图1表明组氨酸-赖氨酸共聚物增强了体内局部和皮下siRNA的递送。(a)自组装的HKP/siRNA纳米颗粒(平均直径150nm)可溶解在水溶液中、可冻干成干粉、可再复溶，并可与甲基纤维素或与RNAse-free(无RNA酶)的水混合。HKP/siRNA纳米颗粒可被递送到小鼠呼吸道：上呼吸道、支气管、肺泡。
图2经口插管给予siRNA后，比较经HKP、DOTAP和D5W介导的3种不同递送载体给药方案对肺内源性靶基因敲除的影响。在20μg剂量下，HKP表现出siRNA介导的靶基因有效敲除。
图3表明在病毒攻毒后的小鼠中，腹腔注射HKP-siRNA纳米颗粒制剂对H1N1具有预防作用(n＝10)。在第1、2、3、4和5天腹腔给予HKP-siRNA组合物(siRNA103-siRNA105，1:1)，其浓度为40μg/2ml，剂量为2.5mg/kg/天(紫色箭头)。第2天(红色箭头)通过2倍LD50的H1N1(A/波多黎各/1934)病毒对病毒组，利巴韦林和siRNA治疗组分别攻毒。利巴韦林作为阳性对照，在第1-5天，每天灌胃200μl，剂量为75mg/kg/天(橙色箭头)。HKP-siRNA制剂的预防效果明显优于利巴韦林。
图4表明腹腔注射PAA-siRNA制剂对经H1N1病毒攻毒小鼠的疗效(n＝15)。在第1天，分别针对病毒组、达菲和siRNA治疗组，通过鼻内滴注1倍LD50的H1N1(A/加利福尼亚/04/2009)的病毒进行攻毒(红色箭头)。从第2天到第6天，每天H1N1攻毒小鼠通过腹腔注射接受不同剂量的PAA-siRNA组合(siRNA89-siRNA103，1:1)、1mg/kg、5mg/kg和10mg/kg(黑色箭头)。根据相同的途径和给药方案，每天也给予H1N1攻毒小鼠25mg/kg的达菲。10mg/kg/天的PAA-siRNA组合的治疗效果与25mg/kg/天的达菲抗流感活性几乎相同。
图5展示了精胺-脂质偶联物(SLiC)的结构。
图6展示了SLiC介导的siRNA递送后靶基因表达的一个实例。
图7显示了经组氨酸-赖氨酸聚合物介导siRNA传递后，IFN-α在肺中的表达。图7A.展示用于测量IFN-α浓度的标准曲线(Lowry法)和图7B.中显示经总蛋白归一化后，每个样品的IFN-α浓度。
图8展示了2种细胞被用于筛选靶向SARS-CoV-2的S蛋白的siRNA(第一部分)。利用293T(上)和A549细胞(下)检测SCO31-38、guagnzhou1、guagnzhou2等14种siRNA，发现对S蛋白基因表达抑制作用更好的siRNA。阴性对照siRNA分别为SCO29和SCO30，不抑制任何基因的表达。
图9展示了2种细胞被用于筛选靶向SARS-CoV-2的S蛋白的siRNA(第二部分)。利用293T和A549细胞检测SCO39-69等31种siRNA，鉴定出对S蛋白基因表达有更好抑制作用的siRNA。
图10展示了2种细胞被用于筛选靶向SARS-CoV-2的S蛋白的siRNA(第三部分)。利用293T和A549细胞系对guagnzhou3-5、guagnzhou广州12-20等26种siRNA进行检测，鉴定出对S蛋白基因表达抑制作用最强的siRNA。
图11展示了通过2种细胞对针对SARS-CoV-2ORF1AB的siRNA进行了筛选(第一部分)。利用293T(左上、右上)和A549细胞系(下)检测SCO1、SCO2、SCO22、SCO23等4种siRNA，鉴定对ORF1Ab基因表达有效抑制作用的siRNA。
图12展示了通过2种细胞对针对SARS-CoV-2ORF1AB的siRNA进行了筛选(第二部分)。利用293T(左上、右上)和A549细胞系(左下、右下)检测15种siRNA，包括SCO8-17、SCO20、SCO24、SCO25、SCO26、SCO28，识别对ORF1Ab基因表达有效抑制作用的siRNA。
图13展示了通过2种细胞对针对SARS-CoV-2ORF1AB的siRNA进行了筛选(第三部分)。利用293T(上)和A549(下)细胞系检测3种siRNA：SCo18、SCo19、SCo21，鉴定对ORF1AB基因表达有较强抑制作用的siRNA。
图14显示了针对293T和A549细胞中的靶基因表达，一些siRNA的抑制作用和EC50。这些siRNA的EC50通常小于10pg/L。
图15显示了在不同浓度下，分别检测siRNAs对病毒的抑制作用。大多数siRNA(SCo1、SCo2、SCo34、SCo36)在检测的最低浓度下，即3.125nM，显示出对感染的完全阻断。
图16显示了多肽核酸纳米药物的制备和表征。siRNA与HKP自组装，通过静电相互作用形成纳米颗粒。平均直径为150-200nm，Zeta电位大于30mV。
图17显示了雾化前后siRNA的浓度和稳定性分析。siRNA通过手持式喷雾器雾化后，喷雾或停留在喷雾器中的siRNA浓度变化不大，分子结构保持稳定。
图18显示了雾化前后HKP之间的比较。用手持纳米喷雾器将多肽纳米传递载体雾化后，用HPLC(2种模型)进行分析，表明其分子结构保持稳定。
图19(表1)显示了siRNA序列，25mer钝端寡核苷酸和21mer粘性端寡核苷酸，针对各种病毒RNA(非结构蛋白)。
图20(表2)显示了siRNA序列，25mer钝端寡核苷酸和21mer粘性端寡核苷酸，针对各种病毒RNA(刺突蛋白)，
图21(表3)显示了最有效的siRNA寡核苷酸、25mer钝端寡核苷酸和21mer粘性端寡核苷酸，针对各种病毒蛋白和基因。
图22A和22B显示了不同浓度下的单独siRNA抑制病毒的测试。
图23显示了4种最有效的siRNA的剂量效应。
图24显示了比较Cov#4和Cov#18及其混合物对病毒抑制的影响。
图25显示了比较Cov#3和Cov#18及其组合物对病毒的影响。
发明详细描述
本发明提供一种抑制严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染和/或复制的小干扰RNA(siRNA)分子组合物。siRNA靶向SARS-CoV-2保守序列，siRNA的正义链序列与SARS-CoV-2病毒基因序列完全一致。这些保守基因序列包括与SARS-CoV-2的侵入、复制、组装、释放紧密相关的多个蛋白和/或酶。当SARS-CoV-2病毒缺乏这些蛋白和/或酶时，它们无法完成整个生命周期。优选的，siRNA能同时抑制SARS-CoV和SARS-CoV-2的序列，或同时抑制MERS-CoV和SARS-CoV-2的序列。所述的组合物也包括用作导入载体的药学材料，如多肽聚合物载体。优选的，这一载体是一种由组氨酸和赖氨酸构成的多肽。将siRNA与导入载体联合形成纳米颗粒，为有效抑制SARS-CoV-2在体内外感染宿主细胞提供了一种组合物，同时还可以抑制病毒的复制、组装以及从细胞中释放。
RNA干扰(RNAi)是一种自然发生的、高度特异性的转录后基因沉默作用，RNAi的机制是精确而又高度特异性的。起始阶段，短的(19-25bp)双链RNA序列(名为短干扰RNA，siRNA)与细胞质内的RNA干扰沉默复合物(RISC)结合(基内科·M，都德纳·JA。RNA干扰分子机制的三维展示。自然。2009；457(7228)：405-412。)。接着，复合物搜寻与其序列完全互补的信使RNA(mRNA)，最终导致这些转录本的降解(和/或翻译减弱)。科学家选择这一内源性RNAi机制来推进siRNA的广泛用途，包括作为治疗药物。
有许多生物屏障和因素保护肺脏免受外来颗粒的影响，如厚的弹性粘液层，可能通过粘液清除机制清除颗粒，分化良好的气管表皮细胞顶端表面的低水平刺激内吞作用，细胞外和细胞内广泛存在的RNA酶，以及靶细胞中存在内吞体降解系统，等等。克服呼吸道递送的困难，有效将分子输送到细胞内部并发挥功能，将为siRNA作为一种系统性的抗2019-nCoV冠状病毒治疗药物铺平道路。
此外，必须选择合适的导入载体和给药方式，并根据病毒感染的阶段，在所需的时间点最快地实现对病毒基因的沉默。例如，在早期上皮/内皮细胞感染阶段抑制病毒基因表达可以达到预防目的，而通过全身给药可以实现对晚期疾病的治疗。其中，通过吸入进行局部/全身导入已被证明是治疗呼吸系统疾病最有效的方法。在疾病大流行情况下，这种导入方法非常便于患者使用。
抗病毒策略
冠状病毒为一种包膜病毒，基因组为单股正链RNA，是所有RNA病毒中基因组最大的病毒，编码多达16个非结构蛋白(nsp)、4个主要的结构蛋白和至少8个辅助蛋白。这些蛋白经常作为酶，在病毒生命周期中发挥重要功能，因此也是抗病毒治疗药物的关键靶标。抗病毒策略一般是靶向冠状病毒进入细胞的关键因子或抑制关键酶的功能，例如冠状病毒蛋白酶或RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)。例如，刺突糖蛋白(S)介导各种冠状病毒与其特异性细胞受体结合，这一过程与气管表皮的纤毛细胞或非纤毛细胞的优先病毒倾向性有关。S蛋白还介导病毒包膜的脂质与宿主细胞质膜或内吞囊泡膜之间的融合，以促进病毒基因组RNA输送到细胞质中。
病毒结合并进入细胞的过程可以被针对S蛋白的抗体、干扰病毒受体的抗体或小分子、或来自S蛋白融合触发七肽重复区的合成肽所抑制。病毒进入细胞后，单链正链的冠状病毒基因组，会对RNA链进行加帽和聚腺苷化，然后被直接翻译，产生冠状病毒复制酶基因编码的nsp。冠状病毒NSP被翻译为两种具有蛋白水解酶的大蛋白，即木瓜蛋白酶样和胰凝乳蛋白酶样蛋白酶，它们广泛加工冠状病毒多蛋白以释放高达16种NSP(NSP 1-16)。这些蛋白水解的功能对病毒的复制是至关重要的，因此，有许多候选抗病毒药物致力于抑制冠状病毒多蛋白的加工过程。同样，冠状病毒nsp8和nsp12具有的RdRp活性，被认为是冠状病毒复制和极具吸引力的抗病毒干预靶标。除了这些经典的药物靶标外，冠状病毒还编码代表其它候选靶标的一系列RNA处理酶。这些包括与nsp13中的甲基转移酶(NTPase)活性相关的解旋酶活性，与nsp14中的N7-甲基转移酶活性相关的3'-5'-核酸外切酶活性，nsp15的内切核酸酶活性以及nsp16的2'-O-甲基转移酶活性。
像所有正链RNA病毒一样，冠状病毒会在细胞器样结构上合成病毒RNA，以便将病毒生命周期的这一关键步骤进入到一个专门的环境中，该环境富含复制性病毒和宿主细胞因子，并同时受到保护免遭来自抗病毒宿主防御机制的攻击。目前，有关各种正链RNA病毒(包括冠状病毒)的RNA合成中关于宿主细胞膜的参与、重排和需求的知识越来越多。三种冠状病毒nsp，即nsp3、nsp4和nsp6被认为与用于病毒RNA合成的位点的形成有关。特别地，这些蛋白质包含多个跨膜结构域，这些结构域被认为可以通过募集细胞内膜，形成修饰的、经常成对的膜网状小体网络(RVN)，包括复杂卷曲的膜和双膜囊泡(DVN)，并通过外膜与粗糙的内质网(ER)相连接。
病毒能够利用不同策略逃避RNAi机制。病毒进化过程中，突变时有发生。当siRNA启动RNAi机制时，病毒有可能通过靶标序列的突变而使siRNA失去作用效果。因此，如何解决病毒频繁突变与RNAi作用的高度特异性之间的矛盾，是siRNA分子设计的关键。以新型冠状病毒SARS-CoV-2为例，病毒无时无刻不在发生突变。近期，研究人员发现SARS-CoV-2基因组中的一种突变提高了这种病毒感染人体细胞的能力，这种突变被命名为―D614G”，使得从这种病毒表面突出的S蛋白发生了微小但有效的变化，其中这种病毒利用S蛋白进入并感染人体细胞，并帮助它成为在当今世界上传播的主导毒株。为应对病毒突变可能引起的逃避RNAi机制的问题，本发明采用两种策略：(1)针对病毒的保守基因序列设计siRNA，这些基因对病毒复制和组装是最为关键的，因此经过实际验证为高度保守的序列；(2)采用两种以上的siRNA分子，同时抑制病毒两个以上关键基因的表达。
靶标选择
2019-nCoV是一种包膜单链正链RNA病毒，属于贝塔冠状病毒属。该基因组的长度约为3万碱基。基因组包含14个预测的开放阅读框(ORF)：ORF1a、ORF1b、刺突糖(S)蛋白、3、4a、4b、5辅助蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白，5‘端三分之二的基因组(ORF1a、ORF1b)编码16个非结构蛋白(非结构蛋白1-16)，其余3‘端三分之一的基因组编码4个结构蛋白(S、E、M和N蛋白)。
2019-nCoV的刺突蛋白(S)是一种含有1282个氨基酸的糖蛋白，分子量超过150kDa，是决定病毒毒力和宿主范围的重要因素。S蛋白三聚体在2019-nCoV包膜上形成刺突，负责与受体结合和膜融合。与HIV包膜(env)和流感血凝素(HA)类似，2019-nCoV的S蛋白是I类病毒融合蛋白，它需要蛋白酶裂解S1和S2之间的结构域，以促使S2的构象变化，并启动病毒的进入和合胞体的形成。S蛋白对病毒进入和病毒-宿主膜融合的重要性，使其成为抗2019-nCoV siRNA开发的绝佳靶点。
进入细胞后，2019-nCoV表达的pp1a和pp1ab两个多聚体蛋白，进行共翻译蛋白水解加工成为病毒复制复合物的蛋白。在加工过程中，非结构蛋白3、木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)和非结构蛋白5、3C样蛋白酶(3CLpro)的活性，对从多聚体蛋白中产生16个非结构蛋白至关重要。
2019-nCoV的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)，即非结构蛋白12，是病毒复制复合物中最重要的组成部分。该复合物负责嵌套的亚基因组mRNA的转录和基因组正链RNA的复制。这两个过程都发生在细胞质中。在病毒mRNA转录中，负链RNA首先由基因组RNA产生，然后由复制复合物和一条基因组5‘末端衍生出来的共同的5‘端先导序列(67个碱基)，转录一组3‘-共终端嵌套的亚基因组mRNA。以负链RNA为模板，产生新合成的基因组RNA。非结构蛋白-12在病毒mRNA转录和基因组复制中的关键作用，表明该基因是设计抗2019-nCoV siRNA的重要靶点。
基于上述信息，我们选择2019-nCoV的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)、复制酶、解旋酶、刺突蛋白(S)等其它结构基因(如M和N蛋白)和非结构基因(如非结构蛋白-2、非结构蛋白-10和非结构蛋白-15)作为siRNA介导的鸡尾酒治疗方法的靶点。本发明提供了包含长度为21或25个碱基对的双链序列的siRNA分子，其中该siRNA分子可抑制2019-nCoV靶基因的表达。siRNA分子有钝端，或在双链区域的两侧有一个或多个核苷酸的3‘端悬垂。本发明的siRNA混合物包含针对这些2019-nCoV基因的两个、三个、四个或更多的序列。最好是siRNA的混合物可针对病毒的不同片段，即确保病毒可被至少一个siRNA抑制，除非两个片段同时在siRNA靶向位点发生突变，但这种情况极少发生。
本发明设计了一系列的含25个碱基对的钝端siRNA和19个碱基对的粘性末端siRNA，以干扰对SARS-CoV-2复制周期至关重要的关键基因或部分基因序列。这些关键基因包括但不限于S基因、E基因、M基因、N基因、RdRP基因等。SARS-CoV-2毒株的每个基因都可以包含在这个列表中。
特别是，本文描述的siRNA组合物包括了抑制刺突糖蛋白基因(S)的siRNA，它可以有效地抑制S蛋白的表达。S蛋白通过与宿主受体(ACE2)相互作用而感染宿主细胞，该受体决定了病毒的感染靶点和感染能力。
siRNA的分子组合还包括了抑制SARS-CoV-2ORF1AB基因的siRNA，可有效抑制Mpro(非结构蛋白5)、PLpro、3CLPro(3CL水解酶)、RdRp(非结构蛋白12)、解旋酶(非结构蛋白13)等蛋白/酶的表达。ORF1AB基因位于病毒基因组的5‘端，编码了参与病毒RNA转录和复制的多功能蛋白，其中包含一种负责切割多聚体蛋白的蛋白酶。
siRNA的分子组合还包括有效抑制ORF3A蛋白表达的siRNA。ORF3a编码的蛋白是一种辅助蛋白，具有诱导细胞凋亡的功能，帮助改变被感染细胞内的环境，使病毒更容易复制。ORF3a蛋白在受感染细胞的细胞膜上留下孔洞，使病毒更容易逃脱。
siRNA的分子组合还包括抑制包膜蛋白基因(E)的siRNA，它可以有效地抑制E蛋白的表达。E蛋白在病毒的形态发生和组装中起着关键作用，并通过在宿主细胞膜上自组装形成五聚体蛋白-脂质孔，允许离子运输，并在诱导细胞凋亡中发挥作用。
siRNA的分子组合还包括抑制膜蛋白基因(M)的siRNA，它可以有效地抑制M蛋白的表达。M蛋白是病毒包膜的重要组成部分，通过与其他病毒蛋白的相互作用，在病毒的形态发生和组装中起着核心作用。
siRNA的分子组合还包括抑制核衣壳蛋白基因(N)的siRNA，它可以有效地抑制N蛋白的表达。在病毒组装过程中，N蛋白通过与病毒基因组和M蛋白的相互作用而发挥功能，尤其在提高病毒基因组的转录效率和病毒复制方面起到重要作用。
本文所描述的siRNA组合包括抑制ORF10基因的siRNA，它可以有效地抑制ORF10蛋白的表达。ORF10蛋白是SARS-CoV-2所特有的一种小附属蛋白，其功能尚未完全明确。
siRNA的分子组合还包括抑制3‘端非翻译区序列(3‘-UTR)的siRNA。这些分子可以与病毒mRNA的3‘-UTR结合，降解病毒mRNA。
本发明描述的siRNA通常具有短的双链RNA结构，长度为19个碱基对或25个碱基对。19个碱基对的siRNA是一个双链RNA，在每个RNA链的3‘端有两个脱氧胸腺嘧啶(dTdT)突起。25碱基对siRNA是一种钝端的双链RNA。
有两种方法可以用来预测靶向病毒基因保守区域的siRNA。一种方法是对多个病毒株的所有基因进行排列，确定这些基因的重叠区域，然后决定是否有可能设计具有相关药理活性的siRNA来靶向和抑制这些特定的基因结构域。这种方法通常可以取得良好的结果，但当某些病毒株变异较大时，它会严重限制可预测的siRNA数量，且该方法设计的siRNA会显示出较低的基因沉默有效性。
更具优势的是，本发明中siRNA的设计考虑了病毒基因中siRNA序列和靶基因序列的一致性。19个碱基对的siRNA已被证明在体内和体外都能有效地沉默相关基因。因为siRNA混合物也包括有25个碱基对的siRNA，这些siRNA可能有一些序列冗余。去除这些冗余序列后，仍然可以完全沉默靶基因。已建立检测可能与siRNA序列中所有碱基非100％相同的基因结构域的方法，但该基因结构域应该至少有19个与siRNA一致的连续碱基。对与所有25个碱基对siRNA不相同的基因的识别能力会增加siRNA可靶向的病毒株数量。
联合使用多种siRNA的协同效应
通过扩大针对所有冠状病毒基因的siRNA检索和所有已知序列的致病性冠状病毒SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2的比较，我们可以确定以下两种siRNA：a)展现出显著病毒株特异性的siRNA；b)选择用于特殊病毒株中特定基因的siRNA。通过结合列表中具有广泛病毒株活性(如抗S蛋白)的一种siRNA和SARS-CoV-2中另一个基因(如RdRP或解旋酶)的特异性siRNA，连同针对SARS-CoV-2另一个基因靶标的第三种siRNA，我们可以得到一种广泛有效的针对多个病毒株的siNRA组合物，这种组合物以抑制病毒多个靶标的方式，可以抑制病毒突变的能力，防止病毒逃脱治疗。
本发明所述的siRNA分子药物组合物，包括一种、两种或两种以上的siRNA分子。所述siRNA分子与SARS-CoV-2的基因序列匹配。当siRNA分子进入宿主细胞后，与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合，其中的引导链RNA会与病毒mRNA结合，引导链携带RISC与病毒mRNA靠近后，RISC中的蛋白酶会将病毒mRNA降解，从而抑制病毒基因表达。所述病毒mRNA可以是病毒的正链基因组RNA，也可以是在病毒基因组RNA基础上复制而来的、作为下一代病毒基因组的正链RNA。
所述组合物，当包含两种或两种以上的siRNA分子时，优选的，这些siRNA分子分别针对SARS-CoV-2的不同基因，即可以同时抑制SARS-CoV-2两个或两个以上的基因的表达。更进一步优选的，两种或两种以上的siRNA分子，其中有一种针对结构蛋白基因，另有一种针对非结构蛋白基因，即所述组合物至少可以同时抑制一种结构蛋白基因和一种非结构蛋白基因的表达。
一种抑制S蛋白的siRNA分子与一种抑制ORF1AB中RdRp的siRNA分子的组合物，将这两种siRNA转入宿主细胞后，可以抑制RdRp酶的表达，使病毒不能复制自己的RNA；同时还可以抑制S蛋白的表达，使病毒无法包装成完整的病毒粒子，从而缺乏感染新的宿主细胞的能力。
一种抑制ORF1AB蛋白的siRNA分子与一种抑制N蛋白的siRNA分子的组合物，采用这两种siRNA可以抑制病毒复制，使病毒无法包装成完整的病毒粒子，每种siRNA浓度为41pM的组合可以抑制病毒超过80％。
一种抑制E蛋白的siRNA分子与一种抑制ORF1AB中RdRp的siRNA分子的组合物，将这两种siRNA转入宿主细胞后，可以抑制RdRp酶的表达，使病毒不能复制自己的RNA；同时还可以抑制E蛋白的表达，使病毒无法包装成完整的病毒粒子，从而使病毒的形态发生和组装无法完成，病毒不能从细胞中释放出去。
一种抑制S蛋白的siRNA分子与一种抑制ORF1AB中解旋酶(Helicase)的siRNA分子的组合物，将这两种siRNA转入宿主细胞后，可以抑制解旋酶的表达，抑制病毒复制过程中所必需的核酸双链的解链，以及病毒复制/转录复合物的形成；同时还可以抑制S蛋白的表达，使病毒无法包装成完整的病毒粒子，从而缺乏感染新的宿主细胞的能力。
一种抑制E蛋白的siRNA分子与一种抑制ORF1AB中RdRp的siRNA分子的组合物，将这两种siRNA转入宿主细胞后，可以抑制RdRp酶的表达，使病毒不能复制自己的RNA；同时还可以抑制E蛋白的表达，使病毒无法包装成完整的病毒粒子并释放出细胞。
一种抑制S蛋白的siRNA分子、一种抑制E蛋白的siRNA分子与一种抑制ORF1AB中RdRp的siRNA分子的组合物，将这三种siRNA转入宿主细胞后，可以抑制RdRp酶的表达，使病毒不能复制自己的RNA；同时还可以抑制S蛋白和E蛋白的表达，使病毒无法包装成完整的病毒粒子并释放出细胞，也不能感染新的细胞。
一种抑制ORF1AB蛋白的siRNA分子与一种抑制N蛋白的siRNA分子的组合物，采用这两种siRNA可以抑制病毒复制，使病毒无法包装成完整的病毒粒子，每种siRNA浓度为41pM的组合可以抑制病毒超过80％。
含有两种或更多siRNA的组合物可以单独或混合在一起被包裹成纳米颗粒。也就是说，两种或多种siRNA可以是混合在一起提供，或者在给药前进行混合，或者分开给药。
基于HKP的聚合物纳米颗粒siRNA递送系统
本发明所述的包含siRNA的药物制剂，优选的，是一种特定大小的、球形或椭球形为主的纳米颗粒制剂。所述制剂中，多肽/脂质阳离子聚合载体分子与siRNA分子通过静电作用力相互作用。在聚合物载体分子过量的情形下，大部分siRNA分子被置于纳米颗粒制剂的内部，整个纳米药物颗粒携带正电荷。所述纳米药物制剂颗粒直径为50-300nm，优选的，直径为100-200nm。所述纳米药物制剂颗粒的电势(zeta电位)为5-50mV，优选的，电势为10-40mV，进一步优选的，电势为30-45mV。
本发明提供了一种基于纳米颗粒的治疗制剂，即HKP-siRNA纳米颗粒，包含siRNA分子和一个药用载体。组氨酸-赖氨酸多肽聚合物(HKP)用于siRNA的体外和体内导入。所述纳米载体包含两种HK聚合物，H3K4b和H3K(+H)4b，具有一个含四个分支的赖氨酸骨架，每个分支都含有多个重复的组氨酸、赖氨酸。当HKP水溶液和siRNA以4:1或3:1或5:1的N/P质量比混合时，会自组装成纳米颗粒，平均直径为100-200nm(图1)。最优的分支组氨酸-赖氨酸聚合物HKP，由Ranin Voyager合成器(PTI，Tucson，AZ)合成。用于研究的两种HKP为H3K4b，结构为(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK；K＝赖氨酸，H＝组氨酸。用Brookhaven particle Sizer 90Plus测量了颗粒大小和ζ电位。HKP-siRNA水溶液呈半透明，没有明显的沉淀聚集，并且4℃下至少可以保存三个月。我们已经开发了将这种HKP-siRNA溶液冻干为干粉的工艺。用PBS或D5W(5％的葡萄糖溶液)溶解这些干粉后，这种治疗制剂可以通过静脉注射(iv)、腹腔注射(ip)输液进入血液，或者用于表皮局部给药，也可以通过雾化吸入(inhalaiton)给药方式将药物导入到呼吸系统特定病灶部位。
基于SLiC的脂质纳米颗粒siRNA递送系统
本发明还开发了一种新型的药物导入载体，这种载体由一种新的阳离子脂质和胆固醇组成(图2)。阳离子脂质，由一个精胺头部和一个油醇尾部组成，和胆固醇结合，形成一种新颖而独特的siRNA导入系统(精胺-脂质-胆固醇，SLiC)。精胺的CAS编号为71-44-3。当SLiC和siRNA双链在水溶液中混合时，siRNA/SLiC纳米颗粒可通过自组装过程形成。因为所有组成都是天然分子，这种新型脂质纳米颗粒很容易生物降解。在各种具有精胺作为阳离子头部和油醇作为尾部的新型脂质结构，都是头部和尾部通过各种化学键和中部的两个叔胺基团结合在一起。我们将这种载体用于Hela细胞和293细胞的siRNA转染，证明这种导入载体可以将siRNA导入到细胞内，抑制靶标基因的表达，我们还利用小鼠模型检测了该载体在siRNA体内导入中的应用。
药物对病毒靶标基因的沉默效果及对病毒抑制的效果
为了鉴别对靶标基因有显著抑制效果并可以有效阻断病毒的感染和复制的siRNA分子，可以采用双荧光素酶假病毒报告系统或真实的SARS-CoV-2病毒感染模型，其中一种合适的报告系统是psiCHECK系统(Promega,Inc.Madison WI)。
采用雾化器进行吸入给药治疗
新冠肺炎(COVID-19)是一种呼吸系统感染性疾病，通过呼吸道和肺部表皮细胞上的ACE2受体进入细胞，开始复制生命周期。因此，理论上通过呼吸道给药将是一种最有效的给药方式，通过特定的吸入装置将药物输送到呼吸系统、特别是下呼吸道和肺部，可以有效达到病毒感染和复制的病灶部位，实现对病毒的高效抑制。
本发明针对新冠病毒感染进行预防和治疗的给药方式之一是雾化吸入给药。具体的，采用一种手持式雾化装置对配制好的纳米药物制剂进行雾化，通过呼吸道吸入药物雾化的液滴，将药物输送到下呼吸道和肺部。所述的雾化吸入装置，优选超声雾化装置，进一步优选的，采用微网式超声雾化吸入装置。
进一步的，本发明对雾化吸入给药的效果进行了体外的生物学检测。具体的，收集雾化后喷出的药液，以及雾化后留在雾化杯内未喷出的药液，测定雾化后的药液中纳米药物颗粒的性质，以及对siRNA特异性靶标基因表达的抑制效果。
具体实施例
实施例1.2019-nCoV病毒结构和蛋白质功能
2019-nCoV是一种有包膜的单链正义RNA病毒，基因组含有29903个核苷酸。2019-nCoV的基因组结构与其它冠状病毒例如2019-nCoV相似，5'端三分之二的基因组编码病毒基因组复制所需的非结构蛋白(NSP)，剩下的3'端基因组编码构成病毒体的结构基因(刺突、包膜、膜和核衣壳蛋白)，以及夹杂在结构基因区域内的四个辅助基因。在基因组的5'端有一个前导序列(67个核苷酸)，其后是一个非翻译区(UTR)。在RNA基因组的3'端有另一个UTR，后面是可变长度的poly(A)序列。转录调控序列(TRS 5'AACGAA 3')位于前导序列的3'端和2019-nCoV基因组3'-近端结构域中基因上游的不同位置。2019-nCoV基因组包含至少14个预测的开放阅读框(ORF)：ORF1a、ORF1b、S、3、4a、4b、5、E、M和N，其中有16个预测的非结构蛋白由ORF1a/b编码。2019-nCoV编码了几个非病毒复制所必需的独特的基团特异性ORF。尚未清楚这些基团特异性ORF的功能，与其它冠状病毒类似，它们可能编码结构蛋白或干扰素拮抗剂基因。开放阅读框ORF2、-6、-7和-8a是从预测编码四种公认的结构基因的亚基因组mRNA翻译而来的，分别为：>150-kDa的刺突糖蛋白(S)；～23-kDa的膜糖蛋白(M)；小包膜蛋白(E)和～50-kDa的核衣壳蛋白(N)。
实施例2.设计靶向2019-nCoV关键基因的siRNA
设计了多个siRNA序列，包括25个碱基对(mer)和21个碱基对的寡核苷酸。表1显示了针对各种病毒RNA(非结构蛋白)的siRNA序列，25mer平末端寡核苷酸和21mer粘性末端寡核苷酸。这些序列的特点包括但不限于：靶向保守基因序列、合适的热力学稳定性和低毒副作用。表2显示了靶向各种病毒RNA(刺突蛋白)的siRNA序列，25mer平端寡核苷酸和21mer粘端寡核苷酸，其中以粗体表示的siRNA是最有效的siRNA抑制剂，以下划线表示的siRNA类型是第二有效的siRNA抑制剂。表3显示了靶向各种其他病毒蛋白和基因的最有效的siRNA寡核苷酸，25mer平端寡核苷酸和21-mer粘端寡核苷酸。
实施例3.通过细胞培养筛选有效的抗2019-nCoV siRNA寡核苷酸
为了在Vero细胞培养实验中找出最有效的沉默2019-nCoV基因的siRNA，先使用携带2019-nCoV基因序列的psiCheck质粒。然后使用感染真实2019-nCoV的Vero细胞，测试所选siRNA的抗2019-nCoV感染活性。A.亚克隆2019-nCoV病毒基因片段作为Vero细胞中siRNA活性测试的替代物
为了考察siRNA候选物对靶向2019-nCoV基因的降解作用，使用双荧光素酶报告载体psiCHECK-2，结合以下的基因片段：木瓜蛋白酶样病毒蛋白(nsp5)、冠状病毒内肽酶C30(nsp6)、RNA合成蛋白(nsp10)、RNA依赖性RNA聚合酶(nsp12)和结构蛋白S、E、M和N。psiCHECK-2载体可以为RNA干扰(RNAi)的初始优化提供定量和快速的方法。这种载体能够监测与报告基因融合的目标基因表达水平的变化。nsp5、nsp6、nsp10、nsp12和结构蛋白S、E、M和N的DNA片段用这些基因的特异性引物通过PCR扩增，然后克隆到psiCHECK-2载体的多个克隆位点。在该载体中，海肾荧光素酶作为主要报告基因，siRNA靶向基因位于海肾荧光素酶翻译终止密码子的下游。
Vero细胞接种于96孔板中孵育12小时。使用不含PBS的DMEM中的Lipofectamine2000，将报告质粒(重组载体)psi-nsp5、psi-nsp6、psi-nsp10、psi-nsp12、psi-S、psi-E、psi-M和psi-N，与siRNA候选物共转染到Vero细胞中。空白psi载体作为阴性对照。转染六小时后，将培养基更换为含10％ FBS的DMEM。转染18、24、36和48小时后，使用双荧光素酶试剂盒检测每个孔中萤火虫发光和海肾荧光素酶的活性。siRNA候选物显著降低荧光素酶活性，表明siRNA在体外能很好地抑制2019-nCoV靶基因的表达。
B.Vero细胞的2019-nCoV感染
为了研究nsp5、nsp6、nsp10、nsp12和结构蛋白S、E、M和N的2019-nCoV mRNA是否可以通过RNA干扰(RNAi)的特定机制直接降解，将Vero细胞接种在24孔板中，当细胞单层汇合到80％时，用不含FBS的DMEM中的Lipofectamine 2000转染选定的有疗效的单一siRNA或siRNA组合候选物。Cy3标记的siRNA作为转染率阳性对照。PBS作为阴性对照。序列与2019-nCoV无关的siRNA作为另一个阴性对照。转染24小时后，将含有转染试剂的培养基更换为含2％ FBS的新鲜培养基，并用2019-nCoV感染细胞。感染一小时后，将接种液替换为含10％FBS的DMEM。感染24小时后，收集细胞用于RNA分离和5'-cDNA末端快速扩增(5'-RACE)。在平行实验中，在感染24、48和72小时后，收集细胞上清液用于病毒滴度测定。所有实验均在生物安全等级为2级的条件下进行。
从细胞上清液提取病毒RNA，使用正向和反向引物以及特异于2019-nCoV分离株FRA/UAE刺突蛋白的TaqMan探针进行一步定量实时PCR。从收集细胞中提取总RNA，并使用针对nsp5、nsp6、nsp10、nsp12和结构蛋白S、E、M和N的cDNA产物的基因特异性引物进行5'-RACE测定。筛选具有高保护活性的单一siRNA或siRNA组合用于体内研究。
在不含PBS的DMEM培养基(细胞培养基)中，利用Lipofectamine 2000将这些报告质粒(包含不同的病毒基因片段)和siRNA(针对这些基因片段)共转染到Vero E6细胞中。不靶向任何病毒基因的siRNA作为阴性对照。转染6小时后，使用双荧光素酶试剂盒检测每孔中海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶催化各自底物发出荧光的能力。当系统中荧光表达降低时，表明siRNA抑制了荧光素酶的表达。该酶催化底物发出荧光的能力下降意味着siRNA候选药物分子可以有效抑制SARS-CoV-2靶基因的表达。使用该方法筛选出多个有效的siRNA(图3-5)。在293T和A549细胞中，筛选出的8种siRNA对靶基因的抑制作用超过80％(其中有三种siRNA，即G32、R03和R24，在这两种细胞中抑制作用超过85％)。特别是在A549细胞系中，有5种siRNA对靶基因的抑制作用达到90％以上。我们进一步测定了这些siRNA对两种细胞抑制率的EC50。其中抑制效果最好的Rec#3，在293T细胞和A549细胞的EC50分别为0.3pg/L和5.8pg/L。
实施例4.体外细胞实验验证siRNA对SARS-CoV-2的抑制作用
Vero E6细胞培养过夜，然后转染不同浓度的siRNA(从3.125nM到100nM)，细胞以特定的MOI(感染复数)感染SARS-CoV-2。培养几天后，病毒感染率由致细胞病变效果决定。感染率的计算方法为：被感染细胞数(表达病毒N蛋白，使用特异性抗体染色)除以细胞总数(通过被Hoechst 33342染料染色的细胞核计算得到)。大多数siRNA(SCo1、SCo2、SCo34、SCo36)在最低测试浓度下显示了对病毒感染的完全阻断——即3.125nM。
实施例5.HKP/siRNA纳米颗粒和肺部递送
组氨酸-赖氨酸共聚物(HKP)siRNA纳米颗粒制剂可通过将HKP和siRNA的水溶液以4:1的分子量比例(N/P)混合制备。典型的HKP/siRNA制剂是平均粒径为150nm的纳米颗粒。将自组装的HKP/siRNA纳米颗粒重新悬浮于水溶液中，冻干成粉，然后重新悬浮在无RNase的水中。在将HKP/siRNA(红色标记)纳米颗粒经口-气管给药至小鼠呼吸道后，在上呼吸道(支气管)和下呼吸道(肺泡)中可观察到荧光siRNA。比较了三种不同剂量的以HKP、DOTAP和D5W为载体的siRNA，经口-气管递送后亲环素B在肺中的RNAi效果。HKP介导的递送在20μg剂量下表现出有效的靶基因RNAi效果(图8)。
实施例6.纳米颗粒制剂的制备和鉴别
将组氨酸-赖氨酸共聚物(HKP)和siRNA水溶液以4:1的分子量比(N/P混合制备HKP/siRNA纳米颗粒制剂(图16A)。标准HKP/siRNA纳米颗粒的平均粒径一般在150-200nm之间。自组装HKP/siRNA纳米颗粒可以悬浮在水溶液中。冻干成粉后，可将其重新悬浮在无核糖核酸酶的水中(图16B)。用Malvern粒度分析仪分析和检测制备的纳米颗粒制剂。结果表明，纳米颗粒的平均粒径为193.4nm(图16C)，Zeta电位为32.7mV(图16D)，符合预期要求。
实施例7：雾化吸入给药试验
为了测试由HKP和siRNA组成的纳米药物制剂在雾化吸入治疗呼吸/肺部疾病方面的开发潜力，进一步对活性药物成分(API：siRNA)、递送载体多肽(HKP)和纳米制剂(siRNA和HKP)进行了雾化试验。并在体外分析了雾化前后API、辅料和药物制剂的理化性质和生物活性。
在超净工作台里，提前对正元YS31E雾化器清洗消毒，将喷雾口(含喷嘴)插入50mL无菌离心管中，将离心管插入冰盒中，使离心管和雾化器成直角，并将它们分别倾斜45°；配制一定浓度的siRNA、HKP或STP705水溶液，取大部分溶液置于雾化器中，开始雾化，10-20分钟(雾化2mL，约6-8分钟)。待雾化结束，收集50mL离心管中的冷凝液(B溶液)，雾化器内剩余溶液为C溶液，原来配置未加入雾化器的为A溶液。然后进行如下操作，1)用分光光度计测量雾化前后A、B、C三种溶液中的蛋白质(HKP))和/或核酸(siRNA)的浓度，2)通过电泳法确认siRNA和STP705的完整性，3)通过细胞转染实验分析siRNA对靶基因的抑制作用。
首先，对雾化后siRNA溶液的稳定性进行了测试(图17A)。结果表明，0.2mg/mLsiRNA雾化后，分光光度计测试显示浓度下降约4％(从227.85ug/mL降至218.69ug/mL)，雾化装置内剩余siRNA溶液浓度不受影响。此外，电泳结果也证实了上述结果(图17B)，经雾化后的siRNA溶液除了浓度略有下降外，siRNA片段得到了完整保留。
为了分析雾化对HKP多肽递送系统的影响，本发明采用YS31E雾化器对HKP溶液进行雾化(浓度约为0.8mg/mL)。收集上述HKP溶液的三种不同溶液，即A、B和C，然后用HPLC进行测试。结果证实了HKP在喷雾溶液中浓度降低，但经雾化后的HKP保持了完整结构，说明雾化对HKP结构无显著影响(图18)。
实施例8.用于腹腹腔内递送的HKP/siRNA制剂
在评估siRNA抑制剂对流感感染的预防和治疗获益的实验中，通过使用不同剂量和疗法的腹膜内给药对HKP/siRNA制剂进行了测试。基于对这些治疗结果的观察，发现HKP/siRNA(两种针对流感基因的siRNA)的预防效果超过了利巴韦林(图3)。HKP/siRNA(两种针对流感基因的siRNA)的治疗效果也比达菲要好(图4)。
实施例9.SLiC/siRNA纳米颗粒
SLiC脂质体制备
首先，尝试采用常规工艺来制备新合成SLiC分子的脂质体，如薄膜法、溶剂注入法等，但收效甚微。Maurer等人报道了一种脂质体制备方法，将siRNA或寡核苷酸溶液在涡旋下缓慢加入到脂质体的50％乙醇溶液(v/v)中，然后通过透析去除乙醇，得到尺寸小而均一的纳米颗粒。该方法中的siRNA是在脂质体形成过程中直接被阳离子脂质包裹，而在大多数其它方法中，siRNA或核酸分子被加载(或包埋)到预制成的脂质体中，例如Lipofectamine2000。
溶解在乙醇中的脂质处于亚稳态，得到的脂质体不是很稳定且易于聚集。然后，使用了改进的Maurer方法制备未加载或预制成的脂质体，发现通过将乙醇稀释到12.5％(v/v)的终浓度可以很容易地制得稳定的脂质体溶液。通过将溶解在乙醇中的脂质(阳离子SLiC/胆固醇，50:50，mol％)加入到无菌dd-H2O中来制备脂质体。乙醇脂质溶液在快速混合下缓慢加入。
要制备出SLiC脂质体需要乙醇的缓慢加入和快速混合，因为该过程可以形成更小且更均匀的脂质体(图5)。与在脂质体形成过程中加载siRNA并在制备结束时除去乙醇或其他溶剂的常规方法不同，SLiC脂质体在配制过程中，乙醇保留在溶液体系，因此脂质体被认为处于亚稳态中。当siRNA溶液与脂质体溶液混合/加载时，脂质的阳离子基团与阴离子siRNA相互作用并凝聚成核。SLiC脂质体的亚稳态有助于或促进脂质体结构转化，从而更有效地包埋住siRNA或核酸。siRNA的包埋使SLiC脂质体变得更加紧凑和均匀。
SLiC脂质体的理化特性和生物学表征
在脂质体形成后，一系列分析方法被开发和用于表征SLiC脂质体的理化性质，包括粒径、表面电位、形态研究、siRNA包封率和生物活性等。采用Nano ZS Zeta Sizer(英国马尔文仪器公司)测定SLiC脂质体的粒径和zeta电位。考察研究了乙醇含量从50％变为25％和12.5％时，对SLiC脂质体的粒度和zeta电位影响。数据来自不同乙醇含量的处方。所有SLiC脂质体均以1mg/mL的浓度制备并加载siRNA(2:1，w/w)。每种SLiC脂质体由阳离子SLiC和溶于12.5％乙醇溶液的胆固醇组成，例如TM2(12.5)。
对SLiC脂质体的理化参数进一步分析表明，乙醇浓度与粒径成正比(乙醇浓度越低，粒径越小)，但与zeta电位成反比(乙醇浓度越低，zeta电位越大)。更高的表面电位使粒子在溶液中更稳定。除了溶液稳定性外，后面的数据进一步表明，乙醇浓度越低毒性也越低。综上所述，在用于制备脂质体制剂前，选择浓度为12.5％(v/v)的乙醇作为胆固醇和SLiC在主工作储备液的悬浮溶剂。
与裸SLiC脂质体制剂相比，当脂质体以2:1(w/w)加载siRNA时，得到的脂质体粒径更小，范围在110至190nm，PDI值也低很多。从脂质体的结构分析，siRNA通过静电力加载或与阳离子脂质相互作用，脂质体包埋siRNA形成球形颗粒以降低表面张力。因此加载siRN后脂质体粒径变得更小。siRNA的中和作用使加载siRNA的脂质体也具有更低的表面电荷。通过抗亲环蛋白-B siRNA对亲环蛋白-B的表达证实了由SLiC介导的siRNA递送的抑制作用。
实施例10：呼吸道给药小鼠模型的建立
人类宿主细胞二肽基肽酶4(hDPP4)、ACE2和NRP1已被证明是2019-nCoV的受体，但小鼠没有被2019-nCoV识别和结合的受体。因此，小鼠不适合作为2019-nCoV的动物模型。在这项研究中，通过在呼吸道中表达hDPP4的腺病毒或慢病毒载体，转导到小鼠中，使小鼠对2019-nCoV感染致敏，并利用该小鼠模型研究siRNA在体内抑制2019-nCoV感染的有效性。siRNA组合候选基因通过HKP-SLiC纳米颗粒包裹传递，所有小鼠实验研究在3级生物安全条件下进行。
在本研究开始时，所有BALB/c小鼠均为18周龄，且被检测为特异性无病原体。将表达hDPP4的腺病毒载体和慢病毒载体，分别转导于腺病毒载体组的30只小鼠和慢病毒载体组的30只小鼠中，以研究其对2019-nCoV的易感性。另外20只小鼠用空腺病毒或慢病毒载体转导作为对照。在腺病毒载体组中，将hDDP4基因克隆到Ad5中。然后，用20mol的Ad5-hDDP4转导于MLE-15细胞中。在感染48h后收集上清液。将108个pfu的Ad5-hDDP4导入小鼠鼻内。在慢病毒载体组中，将hDDP4基因克隆到质粒pWPXLd中，再通过磷酸钙法，将pWPXLd-hDPP4连同包装载体psPAX2和包膜载体pMD2.G共转染到包装细胞系HEK 293T中。转染48小时后，获得所构建的病毒载体并纯化，转染到CHO细胞中。收集并浓缩慢病毒。将表达hDPP4的慢病毒经鼻内转导小鼠，滴度为108个转导单位/ml(TU/ml)。
通过蛋白质印迹证实，hDPP4在小鼠呼吸道中表达后，腺病毒组和慢病毒载体组进一步分为预防、治疗和对照组，每组10只小鼠。Ad5-hDDP4或psPAX2-hDDP4的预防性组的10只小鼠，接种前24小时在小鼠鼻内接种了用HKP-SLiC纳米粒子包裹的siRNA组合基因。24小时后，所有80只小鼠(包括用空载体转导的小鼠)均用105个pfu的2019-nCoV进行静脉感染。预防、治疗和对照组在感染后0、24、48、72和96小时，在鼻内接种siRNA或PBS。
每天对所有小鼠称重并统计各组的存活率。在感染后1、3、5、7、9和14天收集洗鼻液进行病毒滴度测定。分别于感染后第3天和第5天处死每组2只感染小鼠。采集肺、气管、脾、肝、心、脑、肾等组织进行病理和病毒学研究。
为了测定病毒滴度，将组织样品在DMEM中匀质并离心澄清。组织悬浮液和鼻洗液均连续稀释10倍。将稀释液添加到在96孔板生长的单层Vero细胞中。在感染后第3天观察细胞病变效应(CPE)，并通过Reed-Muench方法计算TCID50。
为了研究siRNA候选基因对病毒基因表达的抑制作用，从组织中提取总RNA，利用正向引物、反向引物和TaqMan探针对2019-nCoV nsp12(依赖性RNA聚合酶)保守区进行定量实时PCR测试。
实施例11：siRNA纳米药物颗粒溶液腹腔内给药
siRNA体内给药
采用6-8周龄雌性小鼠进行体内实验，接种时使用含流感病毒的尿囊液，剂量为5×104EID50/mL。用致死滴定法在体内测定病毒在尿囊液中的感染活性，用Reed和Muench法计算病毒滴度(17a)。将未感染的小鼠与感染的小鼠经相同条件处理作为阴性对照。在轻度乙醚麻醉下，将病毒传导到动物鼻腔内，每组15只小鼠。siRNA(抗流感siRNA89与siRNA103比例为1：1)与前述的PAA复合，在体重1-10mg/kg的剂量下给小鼠注射，siRNA腹腔注射(每次200μL)。对照组动物注射不含siRNA的PAA。
动物接种后观察14天，每天记录对照组和实验组动物的死亡率。每组动物死亡率(M)为：M＝N/Nt，其中N为感染后14天内动物死亡数，Nt为组动物总数。保护指数(IP)的计算为：IP＝((Mc-Me)/Mc)×100％，其中对照组和实验组的死亡率分别为Mc和Me。14天内的中位死亡日(MDD)的计算为：MDD＝(ΣND)/Nt，其中：N为存活D天的动物数目，Nt为组动物总数。达菲(奥司他韦磷酸盐，罗氏，瑞士)用作参考化合物，按照同样的方案，给予25毫克/千克的剂量注射。
腹腔给药(i.p.)可能是一种可行的替代方案，特别是在严重的流感或COVID-19感染伴有低气体交换量和/或机械肺通气症状的患者。由于同一长度的siRNA具有相似的性质(电荷、疏水性、分子量等)，而且siRNA可以快速设计和制造，因此，在疫苗开发的同时，纳米粒子介导的siRNA可作为一种有效的治疗策略，用于治疗对现有治疗不起作用的、死亡率高的流感病毒或冠状病毒毒株。本研究提及的siRNA组合可为具有广泛抗COVID-19毒株覆盖范围的预防/治疗提供重要价值，并且这种覆盖范围很可能扩展到未来可能出现的尚未确定的COVID-19毒株。
我们在这项研究中证明，通过腹腔注射给药，聚合纳米颗粒介导的两种siRNA组合可以在病毒感染的动物中产生有效的抗病毒效果。组氨酸赖氨酸共聚物(HKP)纳米颗粒介导的siRNA递送已通过多种途径在各种动物模型中得到充分验证。我们最近通过对小鼠和猴子模型进行皮下给药，完成了HKP-siRNA纳米粒子制剂的全面安全性研究(数据未显示)。当HKP-siRNA 103/105制剂i.p.给药(每天10mg/kg)时，在保护小鼠免受2×LD50剂量病毒感染方面，获得了比利巴韦林(75mg/kg/天)更好的预防和治疗效果。实验数据表明，腹腔注射含有siRNA的多肽纳米粒子或者携带siRNA的聚阳离子载体后，均可以降低由流感感染引起的小鼠死亡率。本文研究了两亲性聚烯丙胺(PAA)形成的聚合物胶束(PM)，通过胃肠道传递siRNA，从而实现了siRNA的有效传递和内膜体/溶酶体的释放。PAA和siRNA可自组装成具有纳米级直径(150-300nm)和阳离子表面电荷(+20至30mV)的复合物。当IP给药PAA-siRNA89/103制剂(10mg/kg)时，观察到的抗病毒治疗活性与达菲(25mg/kg)相当。这些结果清楚地表明，siRNA纳米颗粒给药可作为针对新出现的流感病毒株的预防/治疗策略。
实施例12：非人类灵长动物研究
目前，没有有效的疫苗或药物可用于针对2019-nCoV的预防或治疗策略。最近，猕猴已经成为气管内接种2019-nCoV的动物模型。与人类相似，受感染的猴子表现出疾病的临床症状、病毒复制和组织学损伤，这表明猕猴是评估疫苗和抗2019-nCoV感染策略的一个很好的模型。为了研究siRNA在预防和治愈2019-nCoV感染方面的效果，我们在猕猴中进行非人类灵长类动物研究。siRNA组合候选物用HKP-SLiC纳米颗粒包裹，并在气管内给药。这项猴子研究是在生物安全级别3条件下进行的。
该研究开始时，所有猕猴都是2-3岁，并且所有猕猴SARS-CoV-2检测都为阴性。12只猴子随机分成3组：预防组、治疗组和对照组，每组4只猴子。预防组的4只猴子利用手持式雾化喷雾装置，通过气道接种多肽或脂质体类纳米载体包裹的siRNA组合物。24小时后，所有12只猴子都通过气道接种6.5×107TCID50的SARS-CoV-2(1mL)。感染后的0、24、48、72和96小时，预防组和治疗组的猴子继续通过雾化喷雾装置接种siRNA组合物。对照组则在相应的时间点接种PBS(磷酸缓冲液)。
所有猴子每天观察两次，记录症状和死亡率。感染前1天以及感染后3天和5天，照射胸部X光片。感染1、3、5、7、9、14、21和28天后，收集口咽、鼻和泄殖腔拭子(cloacalswabs)，用于病毒滴度的测定。感染后不同时间死亡的猴子，收集组织用于病理学和病毒学研究，包括肺、气管、脾、肝、心脏、大脑、肾和结肠组织。
组织和拭子样本中的病毒滴度测定如实施例2所述。为了研究siRNA候选药物抑制病毒基因表达的有效性，我们将对呼吸道中病毒滴度进行测定。同时，从细胞上清液中提取病毒RNA，并利用MERS-CoV分离出来的FRA/UAE刺突蛋白特异性的正向、反向引物和TaqMan探针，进行一步定量实时PCR。
为了研究候选siRNA抑制病毒蛋白表达的效率，从组织中提取总RNA并进行一步实时定量PCR，方法如实施例8所述。
实施例13：动物药效学试验
非人类灵长类动物实验(中国猕猴)可以用于研究siRNA抗SARS-CoV-2感染的疗效。该研究在生物安全级别为3(BSL-3)的实验室中进行。
在研究开始前，所有猕猴都是2-3岁，并且所有猕猴SARS-CoV-2检测都为阴性。12只猴子随机分成3组，为预防组、治疗组和对照组，每组4只猴子。预防组的4只猴子利用手持式雾化喷雾装置，通过气道接种由多肽或者脂质体类纳米载体包裹的siRNA组合物。24小时后，所有12只猴子都通过气道接种6.5×107TCID50的SARS-CoV-2(1mL)。感染后的0、24、48、72和96小时，预防组和治疗组的猴子继续通过雾化喷雾装置给予siRNA组合物。对照组则在相应的时间点接种PBS(磷酸缓冲液)。
所有猴子每天观察两次，记录它们的症状和死亡率。在感染前1天以及感染后3天和5天对猕猴进行胸部X光检查。分别于感染的1、3、5、7、9、14、21和28天后，收集口咽、鼻和泄殖腔拭子，用于病毒滴度的测定。对感染后不同时间死亡的猴子，收集组织用于病理学和病毒学研究，包括肺、气管、脾、肝、心脏、大脑、肾和结肠组织。
为了研究siRNA候选药物抑制病毒基因表达的有效性，我们将对呼吸道内的病毒滴度进行测定。同时，从细胞上清液中提取病毒RNA，并利用MERS-CoV分离出来的FRA/UAE刺突蛋白特异性的正向、反向引物和TaqMan探针，进行一步实时定量PCR。然后从收获的细胞中提取总RNA，并利用非结构蛋白ORF1AB和结构蛋白S、E、M和N的cDNA产物的基因特异性的引物进行5‘-RACE试验，验证siRNA分子的作用机制。
实施例14：针对活SARS-Cov2的siRNA的设计和筛选
针对各种CoV(冠状)病毒和SARS病毒共同存在的部分，序列分析确定了25种双链siRNA分子。这25条序列在psiCheck2质粒系统中对病毒感染的293T和A549细胞进行了检测(见图21，表3)。结果如下表A-C所示:
表A
Figure SMS_1
Figure SMS_2
表B：候选siRNA序列的EC50数据汇总
Figure SMS_3
表C
Figure SMS_4
Figure SMS_5
这些数据表明，表D中的siRNA序列是最有效的序列。
表D
靶标 293T细胞中的EC<sub>50</sub> pg/ul A549细胞中EC<sub>50</sub> pg/ul
Guangzhou32 Spike基因片段#2 ～8 ND
25seqs CoV#3 ORF1ab基因片段#4 5.8 0.3
25seqs CoV#6 ORF3A 17.9 0.9
25seqs CoV#13 N 3.1 ND
25seqs CoV#24 3’UTR 2.4 ND
siRNA的特征、在基因上的位置及其GC含量如下表E所示:
表E
正义链 靶标 SEQ ID NO
CoV 1,, GGTTCACCATCTGGTGTTT ORF1AB
CoV 2,, GGTGACATGGTACCACATA ORF1AB
CoV 3,, GGAAGGAAGTTCTGTTGAA,, ORF1AB
CoV 4,, GCCATTAGTGCAAAGAATA, ORF1AB
CoV 5,, CCTTTGAAAAAGGTGACTA, ORF1AB
CoV 6,, CGACTACTAGCGTGCCTTT, ORF3A
CoV 7,, CGTGCCTTTGTAAGCACAA,, ORF3A
CoV 8,, GGTACGTTAATAGTTAATA,, E
CoV 9,, CGCTTCGATTGTGTGCGTA,, E
CoV 10,, GCTACATCACGAACGCTTT, M
CoV 11,, CGCTTTCTTATTACAAATT,, M
CoV 12,, CGTGCTACAACTTCCTCAA, N
CoV 13,, CCAGAACAAACCCAAGGAA, N
CoV 14,, GGCCGCAAATTGCACAATT, N
CoV 15,, GCCGCAAATTGCACAATTT, N
CoV 16,, GGCATGGAAGTCACACCTT, N
CoV 17,, CCCACCAACAGAGCCTAAA, N
CoV 18,, CCACCAACAGAGCCTAAAA, N
CoV 19,, GCAGAATGAATTCTCGTAA, ORF10
CoV 20,, CCTATATGGAAGAGCCCTA,
CoV 21,, GGAAGAGCCCTAATGTGTA,
CoV 22,, GCCCTAATGTGTAAAATTA,
CoV 23,, CCCTAATGTGTAAAATTAA,
CoV 24,, CCTAATGTGTAAAATTAAT,
CoV 25,, GCTATCCCCATGTGATTTT,
在使用活病毒的初级筛选试验中，序列3、4、14和18具有最佳活性。从这些试验中获得的数据如下所示。
分析显示为总细胞感染的百分比(左列)，基于非沉默对照组的平均感染率的抑制百分比(右下一列)，然后对下一个重复以及重复的平均值进行相同的分析。感染百分数计算为感染细胞数(表达病毒N蛋白，用特异性抗体染色)除以Hoechst 33342染料染色计数为细胞核的细胞总数。设定了50％的阈值(约为非沉默对照组的3个标准偏差)。在COV3或COV4中抑制率有70％，并显示了良好的成药前景。
Figure SMS_6
第二轮筛选的siRNA(浓度曲线)如下；初步结果以粗体和下划线显示
1.CoV3
2.CoV4
3.CoV5
4.CoV6
5.CoV9
6.CoV13
7.CoV14
8.CoV15
9.CoV18
10.CoV19
11.CoV20
12.CoV21
13.CoV23
14.CoV24
15.SCO1
16.SCO2
17.SCO8
18.SCO34
19.SCO36
siRNA分别在不同浓度下对病毒的抑制作用。
数据绘制如图22A和22B所示。
细胞核的丢失表明了细胞中siRNA的毒性，因此这些siRNA不再进一步进行筛选测试。
在siRNA筛选测试中，大多数与之前的评估结果一致。对于所有siRNA，无法计算EC50值，因为siRNA的性能是持平的，siRNA没有显示出与siRNA使用量的关系。根据感染的一般抑制程度对siRNA进行排序，与NS对照相比，COV6、COV9和SC08的抑制效果最弱，抑制效果约为50％。其次是COV5、COV13、COV19，控制感染水平可达70％。
其余的siRNA在最低浓度(3nM)下表现完全阻断感染。分别是COV3、COV4、COV14、COV15、COV17、COV18、COV21、COV23、COV24、SC01、SC02、SC034、SC036。
一些siRNA处理会导致孔中的大量细胞核丢失。这可能表明病毒正在杀死细胞(细胞病变效应)或者是siRNA在与病毒感染结合时具有毒性。对于非特异性对照siRNA处理，可以看到细胞丢失，但两组对照组至少进行重复检测，以验证结果的准确性。这可能对数据造成影响，导致会低估了治疗的效力。在第二张图中，第2组数据重复2次或2次以上，证明siRNA处理会导细胞丢失。在第1组的数据中观察到的细胞核丢失，但3次重复中至少有2次实验的未处理对照细胞具有＞50％细胞核，因此数据应该是准确的。与未接受病毒的细胞相比，感染但未接受治疗的对照组细胞数量下降了40％，但这是与预期一致的，因为病毒抑制细胞生长，在本试验中是细胞分裂一次，导致了细胞数量的变化。
在接下来的一系列实验中，我们检测了4种最有效的siRNA的剂量效应，以确定最有效的序列。我们选择了siRNA#3、4、14和18进行评估。
每个siRNA通过剂量反应试验进行评估，以确定对抗病毒的效力。数据如图23所示。
从实验结果来看，Cov3和Cov4序列以及Cov18序列在浓度高于0.123nM时对病毒有100％的抑制作用。
由于Cov#3和Cov#4是针对ORF1ab片段，而Cov#18是针对N-蛋白的，我们决定比较#3和#18的组合以及#4和#18的组合，以确定组合2个siRNA针对不同的片段是否会影响疗效。图24为Cov#4和Cov#18对病毒抑制作用的比较。
Cov#4的浓度在0.041nM和0.005nM之间变化，而Cov#18在与Cov#4联合使用的两种浓度(0.041nM和0.013nm)下进行测试。
在0.041nM Cov#4和0.041nM Cov#18条件下，两种siRNA联合抑制效果最好。在这些浓度下，组合的最大抑制率为55％。
在相似的条件下，我们还比较了Cov#3和Cov#18的组合，如图25所示。
Cov#3的浓度在0.041nM和0.005nM之间变化，而Cov#18与Cov#3联合使用在两种浓度(0.041nM和0.013nm)下进行检测。
在0.041nM Cov#3和0.041nM Cov#18条件下，两种siRNA联合抑制效果最大。在这些浓度下组合的最大抑制率为75％。单独在这个浓度下的Cov3只有～48％的抑制作用，这表明当2个siRNA结合时，具有一定的协同效应。
Cov#3和Cov#18联合可以提供避免病毒逃脱治疗压力的能力，除非它在ORF1ab片段区域和由siRNA序列特异性靶向的N-蛋白段区域都发生了突变。
CoV3：GGAAGGAAGTTCTGTTGAA
CoV18：CCACCAACAGAGCCTAAAA
CoV3和CoV18的25mer版本也已经设计完成，可以用于抑制病毒复制：
CoV3 25mer：GGAAGGAAGTTCTGTTGAATTAAAA
CoV18 25mer：CCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACA
这2种siRNA可以通过使用纳米颗粒配方来传递，以确保它们同时被传递到同一个细胞中。
NRP1(神经磷脂受体)被假定为帮助肺内皮细胞摄取SARS-COV2(肯图提-卡斯特尔维特利，等。科学。10.1126/Science.abd2985(2020))。此前已有研究表明，选定比例的组氨酸和赖氨酸组成的多肽纳米颗粒的制剂可以通过NRP1受体提供结合。(冷，米克森。美国基因医学杂志。2016；18：134-144。)，使多肽纳米颗粒介导的siRNA被递送到SARS-Cov2感染的细胞中。siRNA沉默病毒生存所需的基因，从而降低病毒滴度。
多肽纳米颗粒制剂含有两种或多种siRNA，例如：CoV3和Cov18；CoV3和CoV14；CoV4和CoV14；以及CoV4和CoV18的组合，可以通过腹腔给药、静脉给药或直接吸入肺部来实现。可以单独使用H2K或与H3K组合，以及上述siRNA的组合来制备具有适当给定尺寸的纳米颗粒。制备H2K和H3K4b(HKP)的不同比率组合的制剂，例如HK:siRNA的比例为3:1。先前的实验表明，单独的H2K与siRNA混合时可以形成直径约124nm的纳米颗粒。高于1:1比例的H2K:HKP也可以与siRNA形成纳米粒子。在1:2和1:5的比例下观察到最佳尺寸(<200nm)。单独的HKP与siRNA形成121nm的纳米颗粒。
此外，还使用其他线性肽来测试了纳米颗粒的形成，如H3K(+H)-C(在C端含有半胱氨酸)或使用支链HKP(HKP(+H))。H2K:H3K(+H)-C的比例为1:0.2时，产生161nm的纳米颗粒。H2K:HKP(+H)在1:0.2的比例下得到146nm的纳米颗粒，而单独的HKP(+H)得到129nm的颗粒，单独的HKP得到121nm的纳米颗粒。这些结果表明，单独使用H2K，或采用其他肽序列结合siRNA，会产生具有不同程度的NRP1靶向的纳米颗粒。H2K含量较高的纳米颗粒可能比含量较低的纳米颗粒更能与NRP1结合。

Claims (20)

1.一种包含至少两种靶向新冠肺炎(2019-nCoV)基因保守区域的siRNA分子的药物组合物，所述组合物包含一种药学上可接受的载体，所述载体包括聚合物类纳米颗粒和/或脂质体类纳米颗粒载体。
2.权利要求1所述的组合物，其siRNA分子为抑制非结构蛋白(NS)RdRp、复制酶或解旋酶等病毒基因表达的分子。
3.权利要求1所述的组合物，其siRNA序列靶向病毒刺突糖蛋白(S)基因表达。
4.权利要求1所述的组合物，其siRNA序列靶向2019-nCoV除了病毒刺突糖蛋白(S)以外的其它基因表达。
5.上述权利要求中任意一条所述的组合物，其siRNA分子包含19-25个碱基对长度的寡核苷酸。
6.上述权利要求中任意一条所述的组合物，其siRNA分子靶向NS基因的正义链序列。
7.权利要求1所述的组合物，其siRNA分子靶向2019-nCoV刺突糖蛋白(S)基因的至少一条正义链序列。
8.权利要求1所述的组合物，其siRNA分子靶向2019-nCoV刺突糖蛋白(S)基因之外其他基因的正义链序列。
9.权利要求1所述的组合物，每条siRNA分子的正义链选自SEQ ID NO:1-101中的siRNA。
10.权利要求1所述的组合物，每条siRNA分子的正义链选自表E中的siRNA。
11.权利要求10所述的组合物，其中两条siRNA分子选自如下的组合：
CoV3和Cov18
CoV3和CoV14
AoV4和CoV14，以及
CoV4和CoV18，
其中，CoV3序列为GGAAGGAAGTTCTGTTGAA或GGAAGGAAGTTCTGTTGAATTAAAA，CoV4序列为GCCATTAGTGCAAAGAATA，CoV 14序列为GGCCGCAAATTGCACAATT，CoV18序列为CCACCAACAGAGCCTAAAA或CCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACA。
12.上述权利要求中任意一条权利要求所述的组合物，其聚合物类纳米颗粒载体包含一种组氨酸-赖氨酸共聚物(HKP)。
13.上述权利要求中任意一条所述的组合物，其脂质体类纳米颗粒载体包含一种含胆固醇的精氨-脂质偶联物(SLiC)剂型。
14.权利要求12所述的组合物，所述HKP和所述siRNA分子可以自组装形成纳米颗粒。
15.权利要求12所述的组合物，所述SLiC和所述siRNA分子可以自组装形成含胆固醇的纳米颗粒制剂。
16.一种治疗2019新型冠状病毒感染病患的方法，包含给予病患药学有效剂量的权利要求1-15中任意一条权利要求所述组合物。
17.权利要求16所述的方法，其组合物通过呼吸道灌输实现给药。
18.权利要求16所述的方法，其组合物通过腹腔注射实现给药。
19.权利要求16所述的方法，其组合物通过呼吸道雾化吸入实现给药。
20.权利要求16-19中任意一条权利要求所述的组合物，所述的病患包括人、小鼠、雪貂或猴子。
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