JP2023524911A - Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２抗ウイルス薬としての脂質－ペプチド融合物阻害剤 - Google Patents

Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２抗ウイルス薬としての脂質－ペプチド融合物阻害剤 Download PDF

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Abstract

脂質－ペプチド融合物を用いる抗ウイルス療法でＣＯＶＩＤ－１９を治療する組成物及び方法を記載する。また、脂質－ペプチド融合物を用いる抗ウイルス療法でエボラを治療する組成物及び方法を記載する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０１５４７９号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張する。
本明細書で引用される全ての特許、特許出願及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらの刊行物の開示は、その全体が参照により本出願に組み込まれる。
本特許開示は、著作権保護の対象となる資料を含む。著作権所有者は、米国特許商標庁の特許ファイル又は記録に記載されているように、特許文書又は特許開示のいずれかによるファクシミリ複製に異議を唱えないが、それ以外のあらゆる全ての著作権を留保する。
政府支援
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金ＡＩ１１４７３６及びＡＩ１２１３４９の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ）ウイルスを含むコロナウイルスによる感染は、ウイルスエンベロープと肺細胞膜との間の膜融合を必要とする。融合プロセスは、スパイクタンパク質又はＳとも呼ばれるウイルスのエンベロープ糖タンパク質によって媒介される。感染個体の予防又は治療のために現在利用可能な治療選択肢はない。新たに出現した病原性ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９呼吸器疾患の原因）は、ヒトの健康及び社会秩序に対する世界的な脅威である。したがって、ＣＯＶＩＤ－１９の現在のパンデミックを考えると、これらのコロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する有効な抗ウイルス療法の開発は、全国的にだけでなく世界的にも最優先事項である。
ある特定の態様では、本発明は、配列番号２若しくは配列番号３を含む又は有するペプチドを提供する。ある特定の態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２又は配列番号３と８０％超、８５％超、９０％超、９５％超であり且つ１００％未満である相同性を有する配列を含む又は有するペプチドを提供する。
ある特定の態様では、ＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合物が、配列番号２若しくは配列番号３を含む若しくは有するペプチド、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と８０％超、８５％超、９０％超、９５％超であり且つ１００％未満である相同性を有する配列を含む若しくは有するペプチド、及び脂質タグを含む。
いくつかの実施形態では、脂質タグがコレステロール、トコフェロール、又はパルミテートである。
ある特定の態様では、脂質－ペプチド融合物であるＳＡＲＳ阻害剤が、配列番号２若しくは配列番号３を含む若しくは有するペプチド、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と８０％超、８５％超、９０％超、９５％超であり且つ１００％未満である相同性を有する配列を含む若しくは有するペプチド、脂質タグ、及びスペーサーを含む。
いくつかの実施形態では、スペーサーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、スペーサーがＰＥＧ４である。いくつかの実施形態では、脂質タグがコレステロール、トコフェロール、又はパルミテートである。
いくつかの実施形態では、脂質－ペプチド融合物であるＳＡＲＳ阻害剤が、細胞膜透過性ペプチド配列（ＣＰＰ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＰＰがＨＩＶ－ＴＡＴである。
ある特定の態様では、医薬組成物が、配列番号２若しくは配列番号３を含む若しくは有するペプチド、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と８０％超、８５％超、９０％超、９５％超であり且つ１００％未満である相同性を有する配列を含む若しくは有するペプチド、及び医薬的に許容される添加剤（excipient）を含む。
ある特定の態様では、医薬組成物が、配列番号２若しくは配列番号３を含む若しくは有するペプチド、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と８０％超、８５％超、９０％超、９５％超であり且つ１００％未満である相同性を有する配列を含む若しくは有するペプチド、脂質タグ、医薬的に許容される添加剤を含む。
いくつかの実施形態では、脂質タグがコレステロール、トコフェロール、又はパルミテートである。
ある特定の態様では、医薬組成物が、配列番号２若しくは配列番号３を含む若しくは有するペプチド、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と８０％超、８５％超、９０％超、９５％超であり且つ１００％未満である相同性を有する配列を含む若しくは有するペプチド、脂質タグ、スペーサー、及び医薬的に許容される添加剤を含む。
いくつかの実施形態では、スペーサーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、スペーサーがＰＥＧ４である。いくつかの実施形態では、脂質タグがコレステロール、トコフェロール、又はパルミテートである。
いくつかの実施形態では、コロナウイルス脂質－ペプチド融合物阻害剤が、細胞膜透過性ペプチド配列（ＣＰＰ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＰＰがＨＩＶ－ＴＡＴである。
ある特定の態様では、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物が、脂質－ペプチド融合物であるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）阻害剤及び医薬的に許容される添加剤を含む。脂質－ペプチド融合物であるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）阻害剤は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３から選択されるペプチド、脂質タグ、スペーサー、並びにＣＰＰをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドが配列番号２又は配列番号３である。
ある特定の態様では、本発明は、抗ウイルス医薬組成物を患者に投与することを含む、ＣＯＶＩＤ－１９を治療する方法を提供する。抗ウイルス医薬組成物は、配列番号２若しくは配列番号３を含む若しくは有するペプチド、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と８０％超、８５％超、９０％超、９５％超であり且つ１００％未満である相同性を有する配列を含む若しくは有するペプチド、脂質タグ、スペーサー、ＣＰＰ、及び医薬的に許容される添加剤を含む。
いくつかの実施形態では、脂質タグがコレステロール、トコフェロール、又はパルミテートである。
いくつかの実施形態では、抗ウイルス医薬組成物が気道を通じて投与されるか又は皮下投与される。いくつかの実施形態では、抗ウイルス医薬組成物が鼻腔内投与される。いくつかの実施形態では、抗ウイルス医薬組成物が点鼻薬（nasal drops）又は噴霧薬（spray）として投与される。
Ｓ（スパイク）タンパク質を示した図である。反復セクションＨＲＮ及びＨＲＣは、いずれかの端部において互いに認識し、互いにかみ合って折り畳み構造を形成する。融合阻害ペプチドは、反復セクションに結合し、折り畳み構造の形成を妨げて、ウイルスの融合及び侵入を阻止する。
コロナウイルスによる感染及び細胞侵入を示した図である。
エンドソーム経路を介したエボラウイルス侵入を示した図である。Ｆａｌｚａｒａｎｏ Ｄ、Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｈ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｄｅｌｉｎｅａｔｉｎｇ Ｅｂｏｌａ ｅｎｔｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５から。
ウイルスエンベロープスパイク（Ｓ）タンパク質に由来するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害剤のモジュール設計を示した図である。
脂質修飾ＨＲＣペプチドが早期コロナウイルス侵入及び後期コロナウイルス侵入の両方を阻止することを示した図である。これは、本発明者らの脂質コンジュゲートＭＥＲＳ由来ペプチドを使用して得られた結果の概略図である。Ｐａｒｋ及びＧａｌｌａｇｈｅｒ、Ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｆｕｓｉｏｎ－ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１７；５１１、９～１８からの図。
ＭＥＲＳ－Ｓ媒介融合に対するＭＥＲＳ－ＣｏＶ－Ｓペプチドの融合阻害アッセイを示した図である。
治療有効性を示した図である。マウス（Ｎ＝５／群）を、１０ ＬＤ５０ ＭＥＲＳ－ＣｏＶ（１０２ ＴＣＩＤ５０／マウス当たりｉ．ｎ．）による感染の１６時間後に、２ｍｇ／Ｋｇ ｉ．ｐ．のコレステロールタグ付きペプチド又はタグ無しペプチドの単回投与で治療した（又は未治療とした）。感染前に鼻腔内投与された場合、タグ無しペプチドでさえ１００％防御性であることに留意されたい。
ＴＡＴ－ＥＢＯＬＡ－ｄＰＥＧ４－Ｔｏｃが、致死性（ＭＡ－）ＺＥＢＯＶ感染からマウスを防御することを示した図である。５～６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに、最初のペプチド治療の２４時間後に（ＭＡ－）ＺＥＢＯＶの腹腔内曝露を受けさせ、感染後５週間追跡した。ペプチド（等張水に溶解した１０ｍｇ／ｋｇ）を１５日間にわたって毎日腹腔内投与した。
ＴＡＴ及び脂質コンジュゲートペプチドの細胞内局在を示した図である。Ｖｅｒｏ細胞単層を、１０μＭの示されるペプチドと共に３７℃で６０分間インキュベートした。細胞を固定し、ＰＢＳ中０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０で透過処理し、カスタムメイドのビオチンコンジュゲート抗ペプチド抗体で染色した。抗ペプチド抗体をストレプトアビジン－フィコエリトリン（ＰＥ）で検出した。細胞をＤＡＰＩで対比染色した（核染色）。ＰＥ（発光５８０ｎｍ）及びＤＡＰＩ（発光４６０ｎｍ）蛍光を取得した。
ＨＲＣ由来Ｃペプチドの設計及び配列を示した図である。ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ａｌｉｇｎ／）は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶのものに対する各ＨＲＮ標的の類似度を示す。Ｃペプチドと相互作用する残基は太字フォントで強調されており、非相互作用領域に位置する残基は灰色で陰影が付けられている。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ由来のタグ付き脂質を示した図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＨＲＣ領域由来のＣペプチドを合成する。３行目（ＤＩＳＧ．．．ＱＥＬ）は、本発明者らが最近試験し、ＥＫ１ペプチドと比較した配列である。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質（ＰＤＢ ６ＬＸＴ）のＨＲＣドメイン及びＨＲＮドメインによって形成される６ＨＢ集合体の結晶構造を示した図である。ＨＲＣでは、両側の中心ヘリックス及び拡張セグメントに注目されたい。
Ｄ－１に表されるように、各末端にナンバリングが示されている、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＨＲＣドメインの配列（上）を示した図である。２つの「ｈ」記号は、螺旋セグメントの境界を示す。Ｄ－２は、イオンペアリングアレイを最適化するための、２つのα－アミノ酸残基変更（赤色）を含む。Ｄ－３はＭＥＲＳのＨＲＣドメインに対応し、Ｄ－４はＭＥＲＳ ＨＲＣに由来するペプチドＥＫ１である（変更を赤色で表示）。
ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－Ｓ ＣペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ媒介融合を阻止することを、融合阻害アッセイによって示した図である。ペプチドａａ配列を示す。対照ペプチド（パラインフルエンザ配列）を黒色で示す。
プラーク減少アッセイを示した図である。図１５Ａ：細胞培養物において、生ウイルス及び本発明者らのＭＥＲＳ脂質－ペプチドを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の１００％の減少が観察された。図１５Ｂ．ＥＢＯ融合についてのプラーク阻害アッセイ。ペプチドを滅菌水に１０倍段階希釈し（１０μＭ～０．００５μＭ）、各ペプチド用量を、ＭＥＭに希釈した５００ＰＦＵ／ｍＬを含有する等量のウイルスと混合し、ペプチド／ウイルス混合物を３７℃で１時間インキュベートした。各ペプチド用量／ウイルス混合物を６ウェルプレート中、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞の３連ウェルに接種し（０．２ｍＬ／ウェル）、３７℃で１時間吸着させた。細胞単層をＰＢＳで２回すすいだ後、ＭＥＭ、５％ウシ胎児血清、抗生物質、及びＭＥアガロース（０．６％）を含有する培地オーバーレイを添加した。培養物を３７℃で６日間インキュベートし、染色剤としてニュートラルレッドを含有する培地を積層し、２４～４８時間後にプラークを計数した。ウイルス対照をペプチドの代わりに滅菌水と混合した。
ＳＡＲＳペプチド及びＭＥＲＳペプチドによるＳＡＲＳ ＣｏＶ－２糖タンパク質融合の阻害を示した図である。ＳＡＲＳペプチドは、ＡＣＥ２ありだとＩＣ５０が約６ｎｍであり、ＡＣＥ２なしだとＩＣ５０がわずか０．０９ｎＭである。
示されるペプチドによるＳＡＲＳ ＣｏＶ－２糖タンパク質融合の阻害を示した図である。
図１７で使用される示されるペプチドの配列を示した図である。
示されるタンパク質によるＳＡＲＳ ＣｏＶ－２糖タンパク質の阻害を示した図である。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドによるウイルス感染の阻害を示した図である。
ヒト気道上皮（ＨＡＥ）を示した図である。
経時的な（３日間）ＨＡＥ中のヒトパラインフルエンザ－ＧＦＰを示した図である。
ＥＧＦＰを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるヒト気道上皮（ＨＡＥ）感染を示した図である。
ＥＧＦＰを有するパラインフルエンザウイルスに感染したヒト肺オルガノイドを示した図である。
ゴールデンハムスターにおけるニパ（致死性ウイルス）感染に対するインビボ有効性が、脂質－ペプチドの２ｍｇ／ｋｇ／日の皮下送達が有効であったことを実証していることを示した図である。
ゴールデンハムスターにおけるニパ（致死性ウイルス）感染に対するインビボ有効性を示した図である。脂質－ペプチドを鼻腔内投与した。１日前、その日、１日後の投与は、致死的な感染からの６０％防御を提供することができる。
インフルエンザ感染に対するインビボ有効性を示した図である。ペプチドを、コットンラットにおいて１０００倍低いウイルス力価で１日前、その日、１日後の３回鼻腔内投与した。
マウスの麻疹感染（致死性脳炎）を麻疹ペプチドを用いて予防することの、インビボ有効性を示した図である。皮下投与及び鼻腔内投与の両方を調査した。
Ｋｉｍらのようなフェレット試験の設計を示した図である。
本発明は、ＣＯＶＩＤ－１９を予防及び治療するための脂質－ペプチド分子を網羅する。本発明は、細胞内へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入を阻止し、インビボで感染を予防及び／又は抑止し、伝染を予防する可能性が高い設計ペプチドを使用する。本発明者らは、このタイプの脂質－ペプチド分子が、麻疹、致死性ニパウイルス、インフルエンザなどの他のウイルスの致死的な感染を予防し、さらには治療するのに極めて有効であることを発見した。設計ペプチドは、培養細胞及びエキソビボでの生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ）ウイルス感染の阻害に極めて有効である。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ）ウイルスを含むコロナウイルスによる感染は、ウイルスエンベロープと肺細胞膜との間の膜融合を必要とする。融合プロセスは、スパイクタンパク質又はＳとも呼ばれるウイルスのエンベロープ糖タンパク質によって媒介される。本発明者らは、スパイクタンパク質の移行段階に結合し、その機能を妨げることによってウイルス融合及び感染を阻害する、脂質に連結された特異的ペプチドを設計した。重要なことに、本発明者らが標的とした他のウイルスからの証拠に基づいて、これら抗ウイルス薬は、気道を通じて、点鼻薬によって投与することができ、毒性がなく、肺において良好な半減期を有する。これらの抗ウイルス薬を鼻及び吸入を介して投与することができるということは、これらを広範な使用において適用することを可能にする。
本発明者らは、細胞培養物中の生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する有効性をはるかに正確に予測する、ＢＳＬ２実験室条件において効力及び機序を評価するためのいくつかのアッセイを設計した。プロトタイプペプチドは、培養細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質融合及びウイルス侵入阻止アッセイ、並びにインビトロ及びエキソビボでの生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ）ウイルス感染の阻害に極めて有効である。これらの抗ウイルス薬に対する改善は、これらの抗ウイルス薬を一層有効にし、肺又は血液中における分解に対する耐性を高め、より良好にスパイクタンパク質と相互作用してその移行状態を阻止することを可能とするであろう。動物モデルにおけるリード抗ウイルス薬の試験は、医療従事者の感染を予防するための点鼻薬又は噴霧薬としての治療を含む、感染の予防及び治療、並びに感染動物から健康な動物への接触感染の予防についての有用性を示す。
ある特定の態様では、本発明は、配列番号２若しくは配列番号３を含む又は有するペプチドを提供する。ある特定の態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２又は配列番号３と８０％超、８５％超、９０％超、９５％超であり且つ１００％未満である相同性を有する配列を含む又は有するペプチドを提供する。
ある特定の態様では、ＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合物が、配列番号２若しくは配列番号３を含む若しくは有するペプチド、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と８０％超、８５％超、９０％超、９５％超であり且つ１００％未満である相同性を有する配列を含む若しくは有するペプチド、及び脂質タグを含む。
いくつかの実施形態では、脂質タグがコレステロール、トコフェロール、又はパルミテートである。
ある特定の態様では、脂質－ペプチド融合物であるＳＡＲＳ阻害剤が、配列番号２若しくは配列番号３を含む若しくは有するペプチド、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と８０％超、８５％超、９０％超、９５％超であり且つ１００％未満である相同性を有する配列を含む若しくは有するペプチド、脂質タグ、及びスペーサーを含む。
いくつかの実施形態では、スペーサーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、スペーサーがＰＥＧ４である。いくつかの実施形態では、脂質タグがコレステロール、トコフェロール、又はパルミテートである。
いくつかの実施形態では、脂質－ペプチド融合物であるＳＡＲＳ阻害剤が、細胞膜透過性ペプチド配列（ＣＰＰ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＰＰがＨＩＶ－ＴＡＴである。
ある特定の態様では、医薬組成物が、配列番号２若しくは配列番号３を含む若しくは有するペプチド、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と８０％超、８５％超、９０％超、９５％超であり且つ１００％未満である相同性を有する配列を含む若しくは有するペプチド、及び医薬的に許容される添加剤を含む。
ある特定の態様では、医薬組成物が、配列番号２若しくは配列番号３を含む若しくは有するペプチド、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と８０％超、８５％超、９０％超、９５％超であり且つ１００％未満である相同性を有する配列を含む若しくは有するペプチド、脂質タグ、医薬的に許容される添加剤を含む。
いくつかの実施形態では、脂質タグがコレステロール、トコフェロール、又はパルミテートである。
ある特定の態様では、医薬組成物が、配列番号２若しくは配列番号３を含む若しくは有するペプチド、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と８０％超、８５％超、９０％超、９５％超であり且つ１００％未満である相同性を有する配列を含む若しくは有するペプチド、脂質タグ、スペーサー、及び医薬的に許容される添加剤を含む。
いくつかの実施形態では、スペーサーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、スペーサーがＰＥＧ４である。いくつかの実施形態では、脂質タグがコレステロール、トコフェロール、又はパルミテートである。
いくつかの実施形態では、コロナウイルス脂質－ペプチド融合物阻害剤が、細胞膜透過性ペプチド配列（ＣＰＰ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＰＰがＨＩＶ－ＴＡＴである。
ある特定の態様では、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物が、脂質－ペプチド融合物であるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）阻害剤及び医薬的に許容される添加剤を含む。脂質－ペプチド融合物であるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）阻害剤は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３から選択されるペプチド、脂質タグ、スペーサー、並びにＣＰＰをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドが配列番号２又は配列番号３である。
ある特定の態様では、本発明は、抗ウイルス医薬組成物を患者に投与することを含む、ＣＯＶＩＤ－１９を治療する方法を提供する。抗ウイルス医薬組成物は、配列番号２若しくは配列番号３を含む若しくは有するペプチド、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と８０％超、８５％超、９０％超、９５％超であり且つ１００％未満である相同性を有する配列を含む若しくは有するペプチド、脂質タグ、スペーサー、ＣＰＰ、及び医薬的に許容される添加剤を含む。
いくつかの実施形態では、脂質タグがコレステロール、トコフェロール、又はパルミテートである。
いくつかの実施形態では、抗ウイルス医薬組成物が気道を通じて投与されるか又は皮下投与される。いくつかの実施形態では、抗ウイルス医薬組成物が鼻腔内投与される。いくつかの実施形態では、抗ウイルス医薬組成物が点鼻薬又は噴霧薬として投与される。
本発明のより完全な理解を容易にするために、実施例を以下に提供する。以下の実施例は、本発明を作製及び実施する例示的な様式を示す。しかしながら、代替の方法を利用して同様の結果を得ることができるので、本発明の範囲は、例示のみを目的とするこれらの実施例に開示される特定の実施形態に限定されない。
実施例１ 一般概念
コロナウイルス感染
コロナウイルス（ＣｏＶ）は、生命を脅かす疾患を引き起こす可能性がある。この新型疾患は、最近、世界保健機関によってコロナウイルス感染症２０１９（「ＣＯＶＩＤ－１９」と略される）と命名された。ＣＯＶＩＤ－１９は、コロナウイルス株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる。その前身であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び中東呼吸器症候群ウイルスＭＥＲＳ－ＣｏＶと同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はベータコロナウイルスである。ＣＯＶＩＤ－１９に対しては利用可能なワクチンも治療もまだない。宿主細胞へのウイルス侵入を標的とする抗ウイルス薬は、広範囲のウイルス性疾患に対して有効であることが証明されている。
標的細胞へのコロナウイルス侵入経路
コロナウイルスは、宿主細胞の細胞質へのアクセスを得るためにＩ型融合機序（type I fusion mechanism）を使用する。Ｉ型融合機序を使用する他の病原性ウイルスとしては、ＨＩＶ、パラミクソウイルス及びニューモウイルスが挙げられる。ウイルスエンベロープと宿主細胞膜との融合が、三量体ウイルス融合タンパク質の重大な構造再編成によって駆動され；再編成プロセスを阻害することによって感染を抑止することができる。
コロナウイルスによる感染は、ウイルスエンベロープと細胞膜との間の膜融合を必要とする。細胞型及びコロナウイルス株に応じて、融合は、細胞表面膜又はエンドソーム膜のいずれかで起こり得る。融合プロセスは、各単量体がいくつかのドメインを有する、大型ホモ三量体としての約１２００残基の重グリコシル化Ｉ型内在性膜タンパク質である、ウイルスエンベロープ糖タンパク質（Ｓ）によって媒介される（図１、図２）。ウイルス膜の遠位にある受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）が、細胞表面付着を担う。膜融合は、近位細胞融合ドメイン（ＦＤ）によって媒介される。融合には、ＲＢＤ及びＦＤによる協調作用が必要である。ウイルスが付着（及びある特定の場合には取り込み）すると、タンパク質リフォールディングを直接的に膜融合に結び付けるエネルギー的に安定な６ヘリックスバンドル（６ＨＢ）の形成によって駆動される、ＦＤにおける大規模な立体構造再編成を、宿主因子（受容体及びプロテアーゼ）が誘起する。ＦＤは、融合阻害ペプチドによって標的とされ得る高度に保存された三量体コイルドコイルコアで構成されるトランジェントなプレヘアピン中間体を形成すると考えられている（Ｃ末端ヘプタッドリピート、Ｃペプチド、又はＨＲＣペプチドと呼ばれる）。
インフルエンザＨＡと同様に、このＳはビリオン表面上に三量体として存在し、付着、受容体結合及び膜融合を媒介する。これまでに識別されたベータコロナウイルスＳタンパク質の宿主細胞受容体には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対するアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）及びＭＥＲＳ－ＣｏＶに対するジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）が含まれる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、侵入のためにヒトアンジオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）を使用することが分かった（そしてまだ知られていない他の受容体も使用し得る）。Ｓは、宿主プロテアーゼによって切断され、Ｓ１及びＳ２を生成する。受容体によるプライミング及び切断が共に膜融合に必要である。
ウイルス侵入経路及び阻害戦略
膜融合をもたらす融合タンパク質の一連の立体構造変化を開始させる活性化工程は、ウイルスが細胞に侵入するために使用する経路に応じて異なる。多くのパラミクソウイルスでは、受容体結合時に、付着糖タンパク質が融合タンパク質（Ｆ）を活性化して、中性ｐＨにおいて細胞表面でその融合準備のできた立体構造（fusion-ready conformation）をとる。本発明者ら及びその他は、（細胞膜で融合する）これらのウイルスについて、融合タンパク質エクトドメインのＨＲＣ領域に由来するＣペプチドが様々な活性でウイルス侵入を阻害し、脂質コンジュゲーションがそれらの抗ウイルス効力を顕著に増強し、同時にそれらのインビボ半減期を増加させることを示してきた。脂質コンジュゲート融合阻害ペプチドに原形質膜を標的とさせることによって（By targeting lipid-conjugated fusion inhibitory peptides to the plasma membrane）、また増加したＨＲＮ－ペプチド結合親和性を設計することによって、本発明者らは抗ウイルス効力を数ｌｏｇ増加させた。細胞表面上の脂質コンジュゲート阻害ペプチドは、ウイルス融合の膜部位を直接標的とする。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー（ＰＥＧ４など）を脂質部分とペプチドとの間で化合物に付加することによって、本発明者らはコンジュゲートの広域スペクトル活性及び効力をさらに増加させた。本出願の目的のために、「リンカー」及び「スペーサー」という用語は互換的に使用される。本発明者らは、ゴールデンハムスター及び非ヒト霊長類における致死性ニパウイルス感染、マウス及びコットンラットにおける麻疹ウイルス感染、並びにコットンラットにおけるヒトパラインフルエンザウイルス３型感染に対する脂質コンジュゲート融合阻害ペプチドのインビボ有効性を実証した。
細胞膜で融合しないウイルスの場合、Ｃペプチドの標的にはアクセスできないと一般的に考えられている。これらのウイルスの例は、インフルエンザウイルス及びエボラウイルスである。インフルエンザの融合タンパク質（ヘマグルチニンタンパク質；ＨＡ）及びエボラの融合タンパク質（ＧＰ）は、細胞内内部移行後にのみ融合するように活性化される。本発明者らは、インフルエンザＨＡに由来する本発明者らの脂質コンジュゲートペプチドがインフルエンザによる感染を阻害することを示し、脂質コンジュゲーションに基づく戦略が、細胞内部で融合するウイルスに対する融合阻害ペプチドの使用を可能にすることを示唆した。本発明者らがインフルエンザに採用した第２の戦略は、細胞内標的の阻害を増強するためのＨＩＶ－ＴＡＴ（周知の細胞膜透過性ペプチド、ＣＰＰ）の付加である。これらの２つの戦略の組み合わせにより、ＨＡ由来ペプチドは、インフルエンザウイルスのヒト株に対してインビボで有効となる。
同様の戦略により、エボラ感染に対して有効な抗ウイルスＣペプチドが得られた。図３に、エボラウイルス侵入のプロセスを示す。エボラＧＰ２融合をもたらす活性化工程は、後期エンドソームとリソソームとの間で起こる。エボラＧＰ２では、ＨＲＮ領域及びＨＲＣ領域は、ＣＸ６ＣＣモチーフ及び内部融合ループを含む２５残基リンカーによって接続されている。エボラＧＰ２の融合コアの構造研究により、抗ウイルス薬としてのＧＰ２ Ｃペプチドの提案された使用が導かれた。しかしながら、エボラ（ＥＢＯＶ）Ｃペプチドは、その標的がエンドソーム内でのみアクセス可能であり、細胞表面ではアクセス可能でないという考えと一致して、低い効力を示した。エボラ融合阻害剤へのＣＰＰ ＨＩＶ ＴＡＴのコンジュゲーション（局在を増強しようとした試みにおける）が、その抗ウイルス活性を改善し、約５０μＭのＩＣ５０値をもたらした。この情報に基づいて、脂質コンジュゲートインフルエンザＨＡ由来ペプチドという本発明者らの発見と組み合わせて、本発明者らは表１に記載されるザイール（Ｚ）ＥＢＯＶ ＧＰ２由来Ｃペプチドを合成した。本発明者らは、脂質部分とペプチドとの間に挿入されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーが、増強された広域スペクトル活性及び効力をもたらすことを示した。脂質部分及びＰＥＧ４スペーサーは、ＣペプチドのＣ末端に位置する。本発明者らのインフルエンザ研究で、本発明者らは、抗ウイルスペプチドへのトコフェロール部分の付加がペプチドのインビボ効力を増加させることを見出したので、本発明者らは抗エボラＣペプチドの設計にトコフェロール（Ｔｏｃ）を使用した。
原理の証明：融合脂質－ペプチド
コロナウイルスに対するＣペプチド融合阻害剤の開発における主要な課題は、コロナウイルスのウイルス侵入がいくつかの侵入経路をたどりうることであろう（図２）。一部のコロナウイルス株は細胞表面で融合することができるが、いくつかの他の株は最初にエンドサイトーシスを起こし、エンドソームで融合が誘起される。場合によっては、Ｓ切断部位及び標的宿主細胞プロテアーゼに応じて、同じ株が異なる経路を介して侵入することができる。ウイルスは、細胞表面又は細胞内部で融合することができる。
このため、コロナウイルスに対する侵入阻害剤の設計は難題である。本発明者らは、エンドソーム局在を促進する細胞膜透過性ペプチド及び脂質部分を付加することで抗ウイルス効力が増加するかどうかを調査した。
ＨＲＣペプチドは、プレヘアピン中間体に結合することによってウイルス融合及び侵入をドミナントネガティブ様式で阻害し、６ＨＢの形成を妨げる。細胞膜で融合（早期侵入）する株の場合、追加の成分なしのＨＲＣペプチドがウイルス侵入を妨げることができるが、これらのペプチドは、エンドソームで融合（後期侵入）する株には無効である。Ｓの細胞内隔離は、エンドソーム融合コロナウイルス株に対するＨＲＣペプチド融合阻害剤の開発を困難にする可能性がある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むエンドソーム融合コロナウイルスを標的とするために、証明されている脂質修飾及びペグ化戦略に加えて、本発明者らは、細胞膜透過性ペプチド配列（図４のＣＰＰ）を組み込んで、それらのエンドサイトーシスをさらに促進した。
脂質コンジュゲート阻害ペプチドに関する以前の研究で、脂質がペプチドを細胞膜に向かわせ、抗ウイルス有効性を高めることが実証されている。これらのコンジュゲートペプチドは、公開された研究において、コロナウイルスの早期侵入株及び後期侵入株の両方を阻害することが示されている（図５）。
標的細胞膜で融合するウイルスの場合、ＨＲＣペプチドへの脂質コンジュゲーションは、抗ウイルス効力及びインビボ半減期を著しく増加させる。脂質コンジュゲーションはまた、エンドサイトーシスを介して取り込まれるまで融合しないウイルスに対する活性を可能にする。例えば、本発明者らは、ＭＥＲＳに由来する脂質コンジュゲートＨＲＣペプチド（以下参照）がＭＥＲＳ感染を阻害することを示し、脂質コンジュゲーションに基づく戦略がエンドソーム膜との融合の阻害剤をもたらすことを示唆した。同様の戦略が、後期エンドソームとリソソームとの間で融合する、エボラ感染のための有効な抗ウイルスペプチドをもたらした。これらの脂質－ペプチドは、ウイルス「の後について」細胞内区画に入る。
本発明者らは、肺内投与後にインビボで有効であることが示されたペプチド配列に基づいて、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ特異的脂質コンジュゲートペプチドを設計及び作製した。２０１４年に、本発明者らの設計によって作製されたこれらのペプチドを、インビトロ（図６）及びインビボ（図７）でＭＥＲＳ－ＣｏＶに対して試験した。脂質部分は、融合アッセイにおいてペプチドの効力を増加させ（図６）、それらのインビボ活性を増加させた（図７）。より最近、Ｇａｌｌａｇｈｅｒのグループが、脂質コンジュゲーション（本発明者らのペプチドを使用）がＭＥＲＳ－ＣｏＶ由来ペプチドの抗ウイルス効力を最大１０００倍増加させ、原形質膜及びエンドソーム区画の両方でＣｏＶ侵入阻害をもたらすことを見出した。
原理の証明：インビトロでの生エボラ感染力の阻害
本発明者らは、ＵＴＭＢのＢＳＬ４施設と協力して、インビトロでの生ＺＥＢＯＶ感染に対する上記Ｃペプチドの有効性を比較した（表１）。同じＨＲドメインに由来するがＴＡＴ（ＣＰＰモチーフ）配列を有さない対照エボラＣペプチドは、脂質コンジュゲートした場合であっても効果がなかった（１００μＭが試験された最高濃度であった）。したがって、エボラウイルスに対する阻害活性は、特に、ＴＡＴ配列及び脂質コンジュゲーションの両方を必要とする。
Figure 2023524911000002
原理の証明：インビボでのマウス適応（ＭＡ）－ＺＥＢＯＶの阻害：
表１の３種のＣペプチド阻害剤（強調表示）を、最初に、忍容性の問題なしに、腹腔内（ｉ．ｐ．）送達によって１４日間、２０ｍｇ／ｍｌでマウスにおける急性毒性について試験した。マウス薬物動態試験により、血漿中の脂質コンジュゲートＣペプチド阻害剤の存在が少なくとも２４時間確認された。図８に示されるインビボ試験のために、動物に１００ＬＤ５０のウイルスを感染させた。本発明者らは、５～６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス、１群当たり５匹を、感染後－１日目から１５日目まで１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．（１匹当たり約１００μｌの等張水溶液）で処置した。全ての感染動物が有意な体重減少を示したが、ＴＡＴ－ＥＢＯＬＡ－ｄＰＥＧ４－Ｔｏｃペプチドで予防的に処置された５匹のうちの４匹が感染を生き延びた（未処置群のなしと比較して）。脂質を含まないＴＡＴ－ＥＢＯＬＡｄＰＥＧ４は、５匹のうちの２匹を部分的に防御した。コレステロールコンジュゲートＣペプチドで処置した動物は、いずれも生存しなかった。動物の対照群を、同じＴＡＴ配列、脂質部分、及びＰＥＧリンカーを有するＨＰＩＶ３ Ｃ由来ペプチドで処置した。生存している動物を再曝露したところ、全ての動物が２回目の曝露を生き延びたことから、Ｃペプチド融合阻害剤による処置が防御免疫の発達を可能にしたことが示された。
原理の証明：脂質コンジュゲート阻害ペプチドは細胞内部移行を受ける
ＴＡＴＥＢＯＬＡ－ｄＰＥＧ４－Ｔｏｃペプチドはインビボで有効であるので（図８）、本発明者らは、その細胞内局在がＴＡＴ－ＥＢＯＬＡ－ｄＰＥＧ４－Ｃｈｏｌ（又は他のペプチド）と異なるかどうかを求め、共焦点顕微鏡法を使用して細胞局在を分析した。ペプチド（ＤＭＳＯに１０００μＭまで溶解）をＰＢＳに１０μＭまで希釈し、３７℃で生Ｖｅｒｏ細胞に添加した。対照は、脂質を含まないペプチド、及びＤＭＳＯのみを含んでおり、ペプチドはビオチンコンジュゲート抗ペプチド抗体で検出した。ＴＡＴ－ＥＢＯＬＡ－ｄＰＥＧ４－Ｔｏｃ処理細胞は、強い細胞内蛍光スポットを示す。ＥＢＯＬＡ－ｄＰＥＧ４－Ｃｈｏｌ（ＴＡＴなし）は、最小限の細胞内部移行で細胞膜上に主に局在する；ＴＡＴの付加によって、膜局在が増加し、部分的な細胞内局在がもたらされる。ＴＡＴ－ＥＢＯＬＡ－ｄＰＥＧ４は、脂質タグ付きペプチドと比較して、細胞膜及び細胞内部で非常に低いレベルでしか検出されなかった。図９は、ＴＡＴ－ＥＢＯＬＡ－ｄＰＥＧ４－Ｔｏｃペプチドが細胞内に局在することを示しており、ＧＰ２由来ペプチドがインビボで有効であるために細胞内局在を必要とするという本発明者らの仮説を裏付けている。インフルエンザＨＡ由来ペプチド１１でも同様の結果が得られ、脂質部分及びＴＡＴがこれら２つのウイルスの細胞内局在の主要な駆動因子であることが示された。
要約すると、本発明者らは、ＴＡＴ配列及び脂質部分の両方が、細胞内融合ウイルスの効率的な細胞内局在及びインビボ有効性を促進し、両方が様々な組み合わせでコロナウイルスに有用となり得ることを示した。科学的前提：標的細胞へのコロナウイルス侵入経路は乱雑（promiscuous）である。
実施例２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＨＲＣ抗ウイルスペプチドの設計
改善された阻害性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ特異的Ｃペプチドの設計、作製及び特徴解析
本発明者らは、ＭＥＲＳを有効に阻止する脂質派生体化ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－Ｓ由来侵入阻害剤を識別した（図６及び図７参照）。Ｃペプチド阻害剤を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する有効性のために設計及び最適化する。融合遮断がエンドソームにおいて起こることを考えると、ペプチドが最適な細胞内局在及びインビボ有効性を達成するためには、ＣＰＰ配列及び脂質コンジュゲーションの両方が必要である。本発明者らは、インフルエンザ及びエボラについてこの仮説の実験的証拠を提供する。他の箇所で論じられるように、コロナウイルスについては、融合が細胞膜又は細胞内局在後のいずれかで起こり得る。ＣＰＰの付加及び脂質部分の修飾によるエンドソーム局在の改善がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗ウイルス効力を増加させるかどうかを試験する。
ＳＡＲＳＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＨＲＣドメインの配列
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ６ＨＢ集合体（図１２）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜融合の骨格修飾阻害剤を設計するための優れた基礎を提供する。ＨＲＣドメインは、中心の５ターンα－ヘリックス及び両側のヘリックスに隣接する拡張領域を特徴とする。天然ＨＲＣドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の残基１１６８～１２０３に対応する。
ペプチドＤ－１（図１３）はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＨＲＣドメイン（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＨＲＣドメインと同一）に対応し；Ｘｉａらは最近、Ｄ－１がシュードウイルスに基づく細胞アッセイにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の弱力な（modest）阻害剤であることを報告した（ＩＣ５０約１μＭ）。中心αヘリックスを形成する残基が示される。提案されるペプチドＤ－２は、Ｄ－１に対して２つの変更：ヘリックスの溶媒に面する側に沿った、交互のカチオン性側鎖及びアニオン性側鎖（alternation of cationic and anionic side chains）をもたらす、Ｌｙｓ１１８からＧｌｕへの変更及びＡｓｐ１１８４からＬｙｓへの変更、を含む。したがって、Ｄ－２は、ヘリックス２３を安定化する一連のイオン対を特徴とするはずであり、本発明者らは、Ｄ－２がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の阻害剤としてＤ－１よりも優れていると予測する。Ｄ－３はＭＥＲＳ Ｓ ＨＲＣドメインに対応し、Ｄ－４はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の阻害剤としてＤ－１に匹敵するＤ－３の派生体（derivative）である。
一般的なアプローチを使用してこのプログラムで作製されたＨＲＣベースのペプチドを評価する。円偏光二色性（ＣＤ）測定は、ＨＲＣ派生体がＨＲＮペプチドと共集合するかどうかを示し、そうである場合、集合安定性を評価する。有望なＨＲＣ派生体の場合、ＨＲＮペプチドとの共結晶化が、図１２の構造と類似の構造を提供する。抗ウイルス活性を、最初に細胞アッセイで評価し；有望な候補をヒトエキソビボアッセイ及びげっ歯類インビボアッセイで評価する。
Figure 2023524911000003
ここで論じるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の研究を支持する一例としての、ＥＢＯＶ Ｃペプチド融合阻害剤の抗ウイルス効力及びバイオアベイラビリティを最適化するための構造誘導突然変異誘発及びタンパク質工学の使用。本発明者らは、脂質部分（Ｃ末端又はＮ末端のいずれか）及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサー（サイズ及び起源）に修飾を有するいくつかのペプチドのＩＣ５０を評価した。結果を上記の表２に示す。
本発明者らはまた、エボラウイルスのいくつかの株を使用して表３のデータを拡げた。予備データは、いくつかのエボラウイルス株に対してナノモル範囲内で効力があることを示す（表３参照）。
Figure 2023524911000004
本発明者らが設計した新たに識別された配列を生ウイルスに対して試験した（以下の表４参照）。生物物理学的データに基づいて、配列ＩＥＰ（表２で強調表示）をＩＡＡＩＬＰ（表４で強調表示）に改変した。本発明者らの仮説に反して、ＴＡＴ－ＥＢＯ－ＩＡＡＩＬＰ－ＰＥＧ４－Ｃｈｏｌ（表４参照）は、同様の構造（ＰＥＧ４及びコレステロール）を有するＴＡＴ－ＥＢＯ－ＰＥＧ４－Ｃｈｏｌ及びＴＡＴ－ＥＢＯ－ｄＰＥＧ４－Ｃｈｏｌ（表２参照）の両方よりも約１０倍高い、０．６μＭのＩＣ５０を有していた。本発明者らは、配列改変が抗ウイルス活性に有害であると結論付けた。しかしながら、本発明者らは、ＰＥＧ４リンカーなしのＴＡＴ－ＥＢＯ－ＩＡＡＩＬＰ－Ｃｈｏｌが、これまでに識別された最も強力なペプチドよりも約２０倍優れた、３ｎＭのＩＣ５０を有することを見出した。さらに、ＩＣ９０は２７ｎＭ－この時点までの本発明者らの最良のペプチドのＩＣ５０のおよそ半分であった。
Figure 2023524911000005
本発明者らは、ＴＡＴ－ＥＢＯ－Ｃｈｏｌ（表２の元の配列であるがＰＥＧがない）を調製した。本発明者らは元の配列を試験し、それを図１５Ｂの新たな修飾配列と比較した。ＰＥＧ４なしのＴＡＴ－ＥＢＯ－Ｃｈｏｌは、ＴＡＴ－ＥＢＯ－ＰＥＧ４－Ｃｈｏｌよりも有意に強力である（表２参照）が、ＰＥＧ４リンカーなしのＴＡＴ－ＥＢＯ－ＩＡＡＩＬＰ－Ｃｈｏｌは、本発明者らがこれまでに設計した最も強力なペプチドである。データは、配列改変及びＰＥＧ除去の両方が効力の増加に寄与していることを示している。
実施例３ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＨＲＣペプチドのさらなる修飾
有効性と細胞内標的化とを改善するための、脂質及び細胞膜透過性ペプチド配列の付加
本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ特異的Ｃペプチドを設計した（図１１参照）。合計５つの重複Ｃペプチド（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＨＲＣドメインから）を合成する（細胞膜透過性ペプチドあり及びなし）。広域スペクトル活性１を有することが上で示されたＭＥＲＳ配列（ＴＡＴをあり及びなし）を含める。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２融合を阻害する別の広域スペクトルＨＲＣ由来配列（ＥＫ１、ＴＡＴあり及びなし）も含める（この配列は本発明者らのＭＥＲＳ配列との５ａａの相違を有する）。これらの１４個のペプチド（レギュラー７つ及びＴＡＴあり７つ）を最初に２つの脂質とコンジュゲートする。２つの脂質は、（ｉ）コレステロール（最も強力なＭＥＲＳペプチドはコレステロールコンジュゲートであるので、図６参照）及び（ｉｉ）トコフェロール（トコフェロールコンジュゲーションは、ＴＡＴ配列と組み合わせると、エボラ及びインフルエンザについてインビボで最も強力なペプチドをもたらしたので、表１）とする。ＰＥＧ４リンカーを使用する（図８及び図１１において上に示されるペプチドのように）。この２８個のペプチドのセット（１４個のペプチド×２つの脂質）を、（上記の発明者らの研究及び融合アッセイのように）ＶＳＶシュードタイプウイルスに基づく系を使用してＣＵＩＭＣで試験する。最も有効な１０個のペプチドを、生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験（Ｖｅｒｏ細胞におけるプラーク減少アッセイ及びＣａｌｕ－３細胞における確認）のためにＵＴＭＢに送る。この予備スクリーニングの結果は、機序試験及び広域スペクトル評価に進む５つの最も強力なペプチドの選択を導く。これらの５つのペプチドはまた、エンドソーム局在及びエキソビボ有効性にも進む。
これらのデータは、７つの配列（上記の図１１の５つ及び広域スペクトル活性を示した２つのＭＥＲＳ系ペプチド）の中で最も有効なＨＲＣ Ｓ由来ａａ配列に関する情報を提供する。
単層細胞培養物におけるペプチド毒性の評価：以前の研究５と同様に、５つのペプチドを毒性について評価する。毒性をＶｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＭＴＴ細胞増殖アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって評価する。
実施例４ 細胞培養物におけるＨＲＣ由来ペプチドの有効性の評価
Ｃａｌｕ－３細胞で確認して、最初にＶｅｒｏ細胞でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を実施し、これらの細胞で生ウイルスに対する有効性を示すペプチドをＨＡＥ（商業的に入手）での実験に移す。ペプチド阻害剤の段階希釈物を感染前又は感染後のいずれかに添加して、ウイルス侵入防止におけるペプチドの効果、及びペプチドが感染後に組織内のウイルス拡散を阻止するかどうかを評価する。さらに、本発明者らは、確立されたプロトコルを使用して、ペプチドの毒性の証拠についてＨＡＥ組織を試験する。本発明者らは、約５個以下のペプチド阻害剤を使用してエキソビボ活性を試験する。本発明者らは、ＨＡＥが融合阻害ペプチド活性を評価するための理想的なモデルであることを示した。本発明者らはまた、最近、ヒト発達肺オルガノイドモデルが発達中の肺を表し、呼吸器感染症のいくつかの態様をモデル化することができ、将来このモデルをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に使用することができることを示した。これら２つのモデルを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するペプチド有効性を評価するための本発明者らの公開された研究と同様に使用する。ＨＡＥ（又は将来の研究ではオルガノイド）における増殖から出現するウイルスを配列決定して、本発明者らが以前に行ったように進化を評価し、出現するペプチド耐性変異株を評価する。
中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ－ＣｏＶによって引き起こされるＭＥＲＳ）は、２０１２年に初めて報告された際、ヒトにとって新規な呼吸器疾患である。本発明者らは、肺内投与後にインビボで有効であることが示されたペプチド配列に基づいて、いくつかのＭＥＲＳ－ＣｏＶ特異的脂質コンジュゲートペプチドを設計及び作製した。
２０１４年に、本発明者らによって設計されたこれらのペプチドを、融合アッセイ（図６）及びインビボ（図７）でＭＥＲＳ－ＣｏＶに対して試験した。これらの所見は、侵入ウイルスがＣｏＶスパイク指向性膜融合を活性化することが知られている細胞プロテアーゼによって標的とされた後であってもＭＥＲＳ Ｃ脂質－ペプチドが有効であることを実証した。これらの所見は、Ｃ脂質ペプチドがＣｏＶ侵入を阻止するためにエンドソームに蓄積しなければならないかどうか、及び抗ＣｏＶ活性のスペクトルがＣｏＶ膜融合のタンパク質分解活性化のための要件に関連するかどうかに関して疑問を提起する。注目すべきことに、カモスタット及びナファモスタットなどのセリンプロテアーゼ阻害剤がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の有用な阻害剤となり得ることを示唆する新たな報告がある。これらのセリンプロテアーゼ阻害剤はＣｏＶ融合活性化を抑止する又は遅延させるので、同じ応答をもたらすが機序的に異なる様式でＣ脂質－ペプチドと相乗作用し得る。
本発明者らは最近、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を使用した融合アッセイにおいてこれらのＭＥＲＳ－Ｓ由来ペプチドを試験した。細胞膜透過性配列がなくても、脂質部分の付加によって、融合アッセイにおけるペプチドの効力が増加した（図１４）。この実験において、本発明者らは、最良のペプチド（コレステロールコンジュゲート）が約３３ｎＭのＩＣ５０及び２００ｎＭのＩＣ９０を有することを見出した。ＩＣ５０及びＩＣ９０は、同様のアッセイにおいて本発明者らの麻疹ペプチドよりも優れている。これらの麻疹ペプチドは、予防的に与えることができ、鼻腔内投与された場合、インビボで感染を阻止することができる。
細胞培養物において、生ウイルス及び本発明者らのＭＥＲＳ脂質－ペプチドを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の１００％の減少が観察された（図１５Ａ）。Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞におけるプラーク減少中和試験では、細胞を、ペプチドを用いて又は用いないで感染させ、感染３日後にプラークを計数した。結果を、ペプチドとインキュベートしなかったウイルスと比較した減少パーセントとして表す。値は３連ウェルからの平均＋標準偏差である。同様の設定を利用して、上に論じられるＴＡＴ－ＥＢＯ－Ｃｈｏｌ融合物を試験し（表２～表４）、結果を図１５Ｂに示す。
ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に基づく脂質－ペプチドは、ＭＥＲＳ脂質－ペプチドよりもさらに有効であった。
示されるペプチドによるＳＡＲＳ ＣｏＶ－２糖タンパク質融合の阻害
示される突然変異及びβ－ガラクトシダーゼのα－サブユニットを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質を発現する２９３Ｔ細胞と、β－ガラクトシダーゼのω－サブユニットでトランスフェクトされており、且つＡ）トランスフェクトされたｈＡＣＥ２受容体を有する、又はＢ）トランスフェクトされたｈＡＣＥ２受容体を有さない、２９３Ｔ細胞と、の細胞間融合を、濃度が上昇する、示されるペプチドの存在下で、β－Ｇａｌ相補アッセイによって評価した。β－ガラクトシダーゼから得られた発光を、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ Ｐｒｏを使用して定量した。融合の阻害パーセント（ペプチドで処理していない対照細胞についての結果と比較）を、ペプチドの濃度の関数として示す。値は１つの実験からの結果の平均（±ＳＤ）である。ペプチドの配列を以下の図に示す（図１８）。
ＳＡＲＳ脂質－ペプチドは、ＳＡＲＳ生ウイルスに対して有効であった。ＩＣ５０は約５～１０ｎＭと推定され、必要なレベルが人において達成可能であることを示している。注目すべきことに、図２０は、ＭＥＲＳウイルス及びＳＡＲＳウイルスの両方がプロトタイプＳＡＲＳペプチドによって阻害されることを示している。
実施例５ 抗ウイルス活性及びＣペプチド融合阻害剤に対する耐性の分子基盤を試験するためのエキソビボ抗ウイルス活性及びウイルス進化実験
自然宿主における感染の決定因子を理解するために、本発明者らは、極性及び細胞特異性を特徴解析するために使用されているＨＡＥモデルを使用する。本発明者らは、パラインフルエンザ感染についてこのモデルを使用し、これがヒト肺におけるウイルス－ＨＡＥ相互作用を反映することを確認した。本発明者ら及びその他は、不死化単層細胞の結果がインビボに移行された場合に適用可能でない可能性があることを実証しており、したがって、天然宿主をより厳密に表すモデルにおいて本発明者らの仮説を試験することが重要である。ＨＡＥは、臨床シナリオを再現する実験において野外分離株を評価するのに理想的である。
ヒト気道上皮（ＨＡＥ）は、大部分が気液界面で成長した大きな気道組織からなる（図２１）。本発明者らは、パラインフルエンザウイルスを含む他のウイルスについての信頼すべきウイルス増殖及び抗ウイルス評価のためにヒト肺モデルを検証した（図２２）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２実験のために、ＨＡＥを、ＥＧＦＰを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させて感染を可視化した（図２３）。対照組織は処置せず、治療組織は、感染の開始後、２００ｎｍにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＨＲＣで処置した。ＨＲＣ処置は感染を有効に除去した。
本発明者らはまた、ヒト肺オルガノイドをモデルとして利用することができる（図２４）。両方のヒト肺エキソビボモデルを、信頼すべきウイルス増殖及び抗ウイルス評価について検証した。（ＨＡＥは既にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で検証されており、オルガノイドは図のようにＲＳＶ、インフルエンザ、パラインフルエンザで検証されており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で試験する）。
ＨＩＶ－１に対するＦｕｚｅｏｎ（著作権）の臨床使用は、薬剤耐性ＨＩＶ－１変異株の出現をもたらした。エスケープ変異ウイルスはまた、Ｆｕｚｅｏｎ（著作権）の存在下でのＨＩＶ－１のインビトロ継代の際にも出現した。耐性ウイルス集団は、３つのＨＲＮアミノ酸の高度に保存された伸長、グリシン－イソロイシン－バリン（ＧＩＶ）内で突然変異を獲得した。このＧＩＶモチーフの耐性突然変異は、Ｆｕｚｅｏｎ（著作権）療法の患者のウイルス準種内にも存在する。耐性は、ウイルスＨＲＮとＦｕｚｅｏｎ（著作権）との間の相互作用の減少、又はウイルスＨＲＮとＨＲＣとの間の相互作用の増加のいずれかによるものであった。融合のキネティクスの増加は、耐性をもたらしたのみならず、増殖が薬物に依存するウイルスももたらした。抗ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２療法はＨＩＶよりも短期間である（急性疾患治療ｖｓ．慢性疾患治療）が、インフルエンザの場合と同様に、耐性が臨床的に重要となり得る。ＨＩＶ及びインフルエンザにおける結果に基づいて、耐性の出現に関するインビトロデータは、治療の選択圧下でのウイルスのインビボ挙動に直接適用され、耐性を予測し、Ｃペプチド融合阻害剤設計を先制的に改善するために使用することができる。
戦略：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染をＨＡＥで実施する。近年、ＥＧＦＰ遺伝子を有する組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（ＥＧＦＰ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が作製されている。このウイルスを使用して、Ｃペプチドの選択圧下でリアルタイムでウイルス進化を監視する。ペプチド阻害剤の段階希釈物を感染前又は感染後のいずれかに添加して、（ｉ）ウイルス侵入防止におけるペプチドの効果；（ｉｉ）ペプチドが感染後に組織内のウイルス拡散を阻止するかどうかを評価する。さらに、本発明者らは、確立されたプロトコルを使用して、ペプチドの毒性の証拠についてＨＡＥ及びオルガノイド組織を試験する。ＨＡＥにおける抗ウイルス活性の評価後、最適化されたＣペプチド融合阻害剤の選択圧下で感染を実施して、潜在的な耐性の分子基盤の分析；Ｃペプチド耐性ウイルスの進化の可能性の予測；及び耐性について選択する可能性が最も低いＣペプチド融合阻害剤の識別、のために使用される情報を提供する。
エキソビボ抗ウイルス活性：本発明者らは、ＨＡＥが融合阻害ペプチド活性を評価するための理想的なモデルであることを示した。このモデルを使用して、図２３のように、ＳＡＲＳＣｏＶ－２に対してのＣペプチドの有効性を評価する。これらのモデルにおける評価は、有効なヒトエキソビボモデル（ＨＡＥ）において、エンドソーム局在がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗ウイルス活性に有益であるかどうかを決定することを可能にする。ＨＡＥからの上清流体を２つのアリコートに分け、ｑＰＣＲ／ゲノム配列分析及びウイルス力価のために処理する。
耐性変異株の生成：本発明者らは、本発明者らの実験室で日常的に実施されるプロトコルを使用して、低分子の阻害効果に対する耐性のあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを誘発することを試みる。手短に述べると、３～４日間、いくつかの濃度のＣペプチド（ＩＣ５０の５倍～４０倍の範囲）の存在下、ＨＡＥ中でＳＡＲＳＣｏＶ－２のいくつかの希釈物を継代する。最初の感染後にＣペプチドを添加して、ウイルスポリメラーゼ複合体が複製され、選択のための表現型変異株を産生することを可能にすることに留意されたい。耐性ウイルスは、Ｃペプチドの存在下であっても拡散するであろう。ウイルスの収量をプラークアッセイ及び／又はｑＲＴＰＣＲによって決定する。ウイルスが阻害剤の存在下及び非存在下で拡散するにつれて、阻害剤の濃度を徐々に増加させて耐性ウイルスの集団を得る。継代されたウイルスを配列決定すると同時に、プラーク減少アッセイにおいて阻害剤感受性について試験する。ウイルス進化のために選択圧を適用するこの戦略は、ノイラミニダーゼ耐性変異株及び低分子阻害剤耐性変異株について本発明者らの実験室で実施された有益な実験と同様である。
インビトロでの耐性変異株の分析：（ＨＡＥによる）増殖の前及び増殖後の突然変異耐性ウイルスを配列決定する。本発明者らは、高深度の全ウイルスゲノムシーケンシングによって耐性ウイルス突然変異株を分析する。ＨＡＥ増殖ウイルスの配列を、ウイルス進化の縦断的分析のために特別に作成されたカスタムバイオインフォマティクスソフトウェアを使用して、選択実験の期間中に生成された集団由来配列と比較する。このアプローチは、選択プロセス中又は後に共存し得る、ゲノムにわたって存在する潜在的に重要なウイルス亜集団又は対立遺伝子を無視することを防ぐだろう。本発明者らは、各変異株の適応度が親ウイルスの適合度と類似しているかどうか、又は変異株が生存能力のために阻害剤の存在を必要とするかどうか、を決定する。本発明者らは、広範な経験及び以前に検証された両方のアプローチを有し、対立遺伝子頻度が、イヌジステンパーウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス３（ＨＰＩＶ３）、及び呼吸器合胞体ウイルスなどのパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）による２つのアプローチに適合することを示している。ショットガンシーケンシングは、全てのＲＮＡウイルスについて単純な一ワークフロープロトコルを可能にし、タイリングＲＴ－ＰＣＲは、複雑な試料型からのウイルス配列の特異的選択を可能にする。本発明者らは、これらのウイルスを最小平均深度２００Ｘまで配列決定し、対立遺伝子頻度４％超を有する全ての変異株を呼び出す。配列リードを、各試料のリードを０日／継代０ウイルスゲノム（day/passage 0 viral genome）のデノボアセンブリーコンセンサス参照に整列させる、ウイルス対立遺伝子の縦断的分析のための本発明者らのカスタム生物情報パイプラインを使用して分析する。
Ｓが突然変異を含む場合、本発明者らは突然変異遺伝子を本発明者らの発現ベクターに導入し、本発明者らの機能アッセイにおいて糖タンパク質機能を評価する。複数の突然変異が見出された場合、部位特異的突然変異誘発を使用して、突然変異をＳバックグラウンドに導入し、同じインビトロアッセイを使用して、単一突然変異遺伝子をそれらの表現型について分析する。突然変異の位置及び保存は、異なるペプチドに対する耐性機序が類似している程度を明らかにするだろう。異なるペプチドに由来する突然変異株が著しく異なる場合、本発明者らは各寄与を精査するために特定の突然変異の寄与を分析する。
インビボでの耐性変異株の分析：本発明者らは、インビトロ及びエキソビボで良好に増殖する耐性変異株を識別した場合、それらのインビボ適応度を評価する。耐性変異株の病原性を親ウイルスとインビボで比較する。動物の総数は、耐性変異株の数に依存する。ここで耐性変異株及びペプチドの有効性を評価するために使用する１つのマウスモデルは、ヒトアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）トランスジェニックマウス（ｈＡＣＥ２マウス）である。このモデルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１の致死的モデルであることが示されている。最近の報告は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２については、モデルが致死的ではないが、体重減少及び病理学的徴候が観察されることを示している。肉眼病理学及び組織病理学の両方を、感染後３日目及び５日目の両方で容易に観察することができる。１０６～１０７ｐｆｕ／ｍｌのウイルス力価が感染後１～３日後に得られた。本発明者らは、Ｊａｘ実験室からこれらのマウスを事前注文しており、２０２０年６月にマウスが得られると予想している。この感染の動物モデルを使用して、ペプチド耐性変異株がｗｔに対して変化した病理学を引き起こすかどうか、及び耐性突然変異の結果としてそれらの適応度が減少又は増加するかどうかを評価する。ｈＡＣＥ２マウスを抗ウイルス有効性の評価に使用する。本発明者らは、合計５つのウイルスに対して約４つの変異株ウイルス＋１つのｗｔを試験することを予測する（１群当たり１０匹；雄５匹及び雌５匹、合計ｎ＝５０匹のマウス）。
試料採取及び分析：組織病理学評価及びウイルス負荷（ｑＲＴ－ＰＣＲによる）のために、全ての主要器官の組織試料を各マウスから採取する。ウイルス分離を、ｑＲＴ－ＰＣＲによってＥＧＦＰ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について陽性の標本からのみ行う。ウイルス滴定をプラークアッセイによって実施する。試料を配列決定してインビボでのウイルス進化も評価する。
Ｓにおける配列変化は、機能的変化に関連付けられ、この情報を使用して耐性機序を理解する。パラインフルエンザの場合、融合キネティクスの増強はインビトロでペプチド阻害剤に対する部分的耐性をもたらしたが、本発明者らは、融合キネティクスを増加させる突然変異が天然の宿主組織における増殖に悪影響を及ぼすことを示した；これらの耐性突然変異はインビボでの適応度を有意に低下させる可能性がある。本発明者らは、耐性ＣｏＶ変異株がインビボで病原性が低いと予想している。本発明者らは、抗ウイルス薬開発の早期にこれらの機序を評価することによって、より病原性の高いウイルスをもたらし得る抗ウイルス薬戦略の前進を回避することを提案する。変異株の生成の容易さ及び耐性突然変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の適応度を決定することによって、臨床的に関連する耐性変異株の進化の可能性を予測することが可能になる。耐性が４～５継代以内に獲得される場合、本発明者らは、併用治療が耐性に対するより高い障壁を提供するという仮説を試験するために、Ｃペプチドを他の箇所で論じられるプロテアーゼ阻害剤と組み合わせることを検討する。本発明者らはまた、耐性が誘発されない可能性も考慮する－これはありそうもないが－、これは、適応度コストが高すぎて、その特定のＣペプチドに耐性のある生存可能な変異株が生成されないことを示唆するだろう。このようなＣペプチドは、前進するための理想的な候補であろう。ここで得られた情報を使用して、耐性を誘発する可能性が最も低いＣペプチドを選択する。エキソビボで有効であり、インビボで耐性を誘発する可能性が最も低いＣペプチドをインビボ有効性について試験する。
考察：主な焦点は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対して有効なＣペプチドを得ることであるが、同時にこれらの実験から、コロナウイルス科が１つのＣペプチドによって阻害され得るかどうかが分かる。本発明者らは、１つのペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＭＥＲＳの両方を阻害することを既に示している（図２０）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のＨＲＣはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と同じであるので、本発明者らはペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１にも作用すると予想している。本発明者らは、これが広域スペクトルコロナウイルス阻害剤が得られることを示唆すると主張する。本発明者らは、大流行での使用及び備蓄のための極めて有効な抗コロナウイルスペプチドを識別する。本発明者らは、Ｃペプチドの阻害活性の分子基盤の詳細な理解を得て、最適な阻害の基礎に対処する。これらの結果は、構造特性及び安定性特性と阻害効力との間の相関を明らかにし、ペプチド設計を導くために使用される。細胞内部のペプチド局在の決定因子を識別し、ペプチドのエンドソーム局在を増強するために活用する。本発明者らの出願の強みは、改善された融合阻害剤の特定の特性が、インビボ有効性を評価することによって試験されることである。その結果は、有効性、エンドソーム標的化及び毒性の欠如を支持する生化学的因子及び構造的因子並びに最適な製剤に対する我々の理解を、理想的な抗ウイルス化合物の設計のために使用することを可能にする。本発明者らは、耐性の分子基盤についての情報が得られると予想している。耐性突然変異株における配列変化は、機能的変化に関連付けられ、この情報を使用して耐性機序を理解する。耐性試験、特に耐性機序の理解は、基本的なコロナウイルス融合生物学への洞察を提供する。
実施例６ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のマウスモデルにおけるペプチド融合阻害剤のインビボ効力の評価
本発明者らは、マウスにおける薬物動態試験及び安全性試験を行う。本発明者らは、識別されたインビトロ改善ペプチドが所望の血清半減期及び組織体内分布プロファイルを有するかどうか、並びにこれらがインビボで安全で忍容性が高いかどうかを決定する。本発明者らは、ヒトアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）トランスジェニックマウス５０－５２（ｈＡＣＥ２マウス）を使用して、インビボ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２有効性を評価する。最近の報告は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２については、モデルが致死的ではないが、体重減少及び病理学的徴候が観察されることを示している（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／２０２０．０２．０７．９３９３８９ｖ３）。肉眼病理学及び組織病理学の両方を、感染後３日目及び５日目の両方で容易に観察することができる。１０６～１０７ｐｆｕ／ｍｌのウイルス力価が感染後１～３日後に得られる。
本発明者らは、脂質修飾がリードＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２融合阻害ペプチドの抗ウイルス有効性を増加させるだけでなく、ペプチド薬物の典型的に不十分な薬物動態も克服し、ペプチドの循環半減期を臨床的に有用なレベルまで延長することを示した。本発明者らは、抗ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２効力及びプロテアーゼ耐性を増加させるように設計された突然変異及び骨格修飾が、選択された改善されたＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ペプチドの薬物動態特性に影響を及ぼす程度を決定する。本発明者らの目標は、改善されたペプチドがインビボで有効濃度に達することを確実にし、（ｉ）最小投与量及び（ｉｉ）それを維持するのに必要な投与頻度を評価することである。ここで、本発明者らはまた、潜在的な副作用及び薬物クリアランスのキネティクスを評価する。本発明者らのインビボパラミクソウイルス実験及び予備的薬物動態試験において、２０ｍｇ／ｋｇで最大２１日間治療したマウス及びハムスターで毒性効果が観察されなかったことは励みになる。
本発明者らが同様のペプチド阻害剤について以前行ったように、マウスにおいて（又は以下に論じられる、本発明者らが有利であると考える他の動物モデルにおいて）選択された改善されたペプチドの薬物動態（ＰＫ）を評価する。本発明者らは４つのペプチドを評価する。マウス（１群当たり６匹、性別を変数として捕捉するために雄３匹＋雌３匹）に皮下（ｓ．ｑ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、鼻腔内（ｉ．ｎ．）、及び（ｉ．ｔ．）注射する（最初に４つの経路全てを試験する）。本発明者らの予備データは、ｉ．ｐ．送達がＭＥＲＳ治療に有効であることを示している（図７参照）。ここで、本発明者らはｉ．ｐ．をｓ．ｑ．、ｉ．ｎ．及びｉ．ｔ．と比較するが、これは後者の３つの送達経路が臨床用途に好ましいためである（ｉ．ｎ．は医療現場以外での予防に好ましいが、ｓ．ｑ．／ｉ．ｔ．投与は、病気の患者又はｉ．ｎ．投薬に耐えられない患者に使用することができる）。動物に融合阻害ペプチド（６ｍｇ／ｋｇ）を接種し、１２時間後、２４時間後、３６時間後及び４８時間後に屠殺する。本発明者らは、体内分布試験のためのＥＬＩＳＡ及び免疫蛍光を実施する。マウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＨＲＣペプチド毒性の評価：急性、１５日目及び慢性毒性。
本発明者らの公開データは、ニパウイルス、麻疹ウイルス（ＭＶ）、及びインフルエンザに対するインビボでの脂質修飾ペプチドの予防有効性及び治療有効性の両方を示しており、エボラ（ここには示さず）及びＭＥＲＳ（図７）についての予備データもインビボでの脂質修飾ペプチドの有効性を示す。提案される曝露実験は、予防有効性のための最小必要用量及びペプチド阻害剤有効性のための治療時間枠を決定する。有効性を評価するために使用するマウスモデルは、他の箇所に記載されているｈＡＣＥ２マウス５０－５２である（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／２０２０．０２．０７．９３９３８９ｖ３）。この感染の動物モデルは、ウイルス複製及び拡散に対するペプチド有効性の評価に理想的である。必要に応じて、他の動物モデルを含める、又は置換する。
ゴールデンハムスターにおけるニパ（致死性ウイルス）感染に対するインビボ有効性：脂質－ペプチドの２ｍｇ／ｋｇ／日の皮下送達が有効であった（図２５）。
ゴールデンハムスターにおけるニパ（致死性ウイルス）感染に対するインビボ有効性：脂質－ペプチドを鼻腔内投与した。１日前、その日、１日後の投与は、致死的な感染からの６０％防御を提供することができる（図２６）。
インフルエンザ感染に対するインビボ有効性。ペプチドを、コットンラットにおいて１０００倍低いウイルス力価で１日前、その日、１日後の３回鼻腔内投与した（図２７）。
マウスの麻疹感染（致死性脳炎）を麻疹ペプチドを用いて予防することの、インビボ有効性。皮下投与及び鼻腔内投与の両方を調査した（図２８）。
ｈＡＣＥ２受容体の異なる発現レベルでの定量的融合アッセイの比較。これらのデータ（図１６の上側に示される）は、ＡＣＥ２が少ない鼻／上気道においてペプチドが非常に有効であることを示している。
好ましい毒性／体内分布プロファイルを有するインビトロで最も有効な２つのペプチド融合阻害剤を、ｈＡＣＥ２マウスにおける、及び／又は他の関連する動物モデルが必要かつ有利になるのでこれらにおける、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染において試験する。本発明者らは、最初に、感染前、感染と同時、又は感染最大１０日後のｉ．ｎ．ペプチド投与によって防御がもたらされるかどうかを決定し、最適な投与量を確立する。本発明者らは、これらのデータに基づいて、代替的送達経路（ｓ．ｑ．）を使用して予防試験及び治療試験に着手する。
投与：２つの最適化されたペプチド阻害剤の最初のスクリーニングのため、及び最適用量を決定するために、１０匹の動物の群を、３つの異なる用量のペプチドで、曝露の１日前、次いで、最大２日間にわたって毎日ｉ．ｎ．及びｓ．ｑ．で治療する。感染を、１０５ ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によりｉ．ｎ．で実施する。
有効性：本発明者らは、有効用量を決定したら、曝露後治療のための治療域を決定することに焦点をあてる。これは、大流行を管理するために重要であり可能性が高いであろう本製品の使用であるため、重要である。本発明者らは、感染の何日後にペプチド治療が防御を提供することができるかを決定する。ＶＡの節を参照されたい。
動物数：投与について：（２ペプチド＋スクランブル＋モック治療）×１０匹のマウス×２接種経路×３用量＝２４０匹のマウス。有効性：２ペプチド×１０匹のマウス×１接種経路×４時点＝８０匹＋１０匹の未治療マウス。
肺からのウイルス負荷をプラークアッセイ及びｑＲＴ－ＰＣＲによって決定する。治療された動物及び未治療動物からの試料組織も配列決定のために送って、治療中にウイルス進化が起こったかどうかを決定する。
モデルの読み取りは明確であり、統計学的に有意な群が形成される。両性別の動物を使用して、性別を変数として捕捉することを確実にする。本発明者らは、ペプチドの予防的投与が感染から防御すると予想している。ペプチドが曝露後レジメンにおいても有効であるかどうかを決定する。鼻腔内送達は、予防のためにうまく働く可能性が高いが、初期感染後にはｓ．ｑ．がより良く働くことが可能であり、結果に応じて、本発明者らはｓ．ｑ．注射を介して曝露後に治療することを決定することができる。
本発明者らは、ある特定の器官におけるペプチドの評価にはＨＰＬＣ－ＭＳでは検出限界が高すぎることを見出したので（データは示さず）、ペプチド濃度の定量はＥＬＩＳＡによって行う。本発明者らのペプチドなどのブロック両親媒性物質は界面活性剤特性を有し、上皮刺激をもたらす可能性がある；したがって、毒性を試験することが重要である。毒性効果を示さないペプチドのみが有効性試験に進む。コロナウイルスの治療は短期間であると予想される；しかしながら、治療中に、治療に影響を及ぼし得る、ペプチドに対する抗体が産生され得る可能性がある。本発明者らは、ニパ感染ハムスター、麻疹感染マウス及びコットンラットを試験している間、このような効果を観察しなかった。治療に対する抗体拮抗作用の可能性を試験するために、本発明者らは、上に概説される毒性試験に使用した動物から血清を採取し、ペプチドの阻害活性との干渉を評価する。本発明者らは、ｈＡＣＥマウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のインビボ感染の非致死性の説明が動物の老齢（６～１１月齢）に起因し得る可能性を考慮する。本発明者らは、若齢マウスが致死的感染モデルを可能にし得るかどうかを決定する。生存曲線は、有効性についてのより統計学的に有意な読み取りとなるだろう。
これらの実験から、本発明者らは、現在循環しているＣｏＶに対する有効なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害剤を有するかどうか（及びコロナウイルス科ウイルスが１つのペプチドによって阻害され得るかどうか）を知るであろう。本発明者らは、ペプチド設計を導くのに有用な、ペプチドの阻害活性の分子基盤、並びに構造特性及び安定性特性と阻害効力との間の相関についての良好な理解を得る。提案された研究の結果として、本発明者らは、ここに提示されるデータ及び本発明者らの公開データに基づいて、有効な予防レジメンが達成されると確信している。感染後治療の開発はより困難である；しかしながら、予防自体が極めて重要である。医療従事者は、本発明者らの予防的アプローチが、容易に投与することができ（例えば、１日１回ｉ．ｎ．）、即時に及び少なくとも２４時間有効である（長期ワクチン戦略に対して）から、この予防的アプローチから直接利益を得るであろう。リスクのある人々も、このような予防的治療から利益を得る。このプロジェクトの終わりに、本発明者らは、（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチド融合阻害剤を識別しており、（２）インビトロ及びエキソビボでのこれらの抗ウイルス活性を最適化しており、（３）関連する動物モデルにおけるこれらの新規な融合阻害剤の有効性を試験しているだろう。
実施例７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＨＲＣペプチド融合阻害剤のインビボ体内分布及び毒性の分析
本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｃペプチドの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２効力、プロテアーゼ耐性、及び薬物動態特性を決定する。本発明者らの目標は、ＨＲＣペプチドがインビボで有効濃度に達することを確実にし、（ｉ）最小投与量及び（ｉｉ）それを維持するのに必要な投与頻度を評価することである。ここで、本発明者らはまた、潜在的な副作用及び薬物クリアランスのキネティクスを評価する。
本発明者らが同様のペプチド阻害剤について以前行ったように、マウスにおけるＨＲＣペプチドの薬物動態（ＰＫ）を評価する。マウスにおける気管内（ｉ．ｔ．）送達は、ｉ．ｎ．送達と比較して一貫した結果を提供し、これは体内分布試験に役立ち、必要に応じて気道を介した送達を表す予防試験に使用される。本発明者らは４つのペプチドを評価する。マウス（１群当たり６匹、性別を変数として捕捉するために雄３匹＋雌３匹）に皮下（ｓ．ｑ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、鼻腔内（ｉ．ｎ．）、及び（ｉ．ｔ．）注射する（最初に４つの経路全てを試験する）。本発明者らの予備データは、ｉ．ｐ．送達がＭＥＲＳ治療に有効であることを示している（図７参照）。本発明者らはここで、ｉ．ｐ．とｓ．ｑ．、ｉ．ｎ．及びｉ．ｔ．を比較する。動物に融合阻害ペプチド（６ｍｇ／ｋｇ）を接種し、１２時間後、２４時間後、３６時間後及び４８時間後に屠殺する。血清及び器官（肺、肝臓、脾臓、及び脳）を採取する。器官を分割し、免疫蛍光のためにドライアイス上で冷イソペンタンにより凍結するか、又は半定量的ＥＬＩＳＡ分析のためにホモジナイズする。
免疫蛍光：凍結切片を特定のウサギ抗ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ＨＲＣ抗体（本発明者らが定期的に行っているように、契約会社を使用して作製する）で染色する。組織切片を、共焦点顕微鏡法を使用して分析する。
体内分布試験のためのＥＬＩＳＡ：「ＢｅａｄＢｕｇ」ホモジナイザーを使用して器官をホモジナイズする。組織試料及び血清中のペプチド濃度を、本発明者らが５、７、８以前に行ったように決定する。試験試料と同じＥＬＩＳＡ条件を使用して、リードペプチドの標準曲線を確立する（これは本発明者らが以前使用したＬＣ／ＭＳ／ＭＳよりも感度が高いことに留意されたい）。
マウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｃペプチド毒性の評価：本発明者らは、マウスにおける急性全身毒性試験（最良の体内分布プロファイルを有するペプチドについて）を行って、改善されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドの毒性及び用量耐性を評価する。研究用に繁殖された（ｐｕｒｐｏｓｅ－ｂｒｅｄ）非近交系マウス（ｎ＝６／群、雄３匹及び雌３匹）に、５、２０又は２００ｍｇ／ｋｇの融合阻害Ｃペプチドの単回ｓ．ｑ．注射を受けさせる。Ｈａｒｌａｎ等容生理食塩水が対照として働く。生存及び／又は苦痛の徴候について動物を綿密に監視する。１５日間の毒性試験のために、動物にペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ）を１５連続日間ｓ．ｑ．接種し、毎日監視する。慢性毒性のために、ペプチドを、３０日間（すなわち、８回の接種）又は６０日間（すなわち、１６回の接種）、２０ｍｇ／ｋｇの用量で１週間に２回、マウス（ｎ＝６／群）にｓ．ｑ．及びｉ．ｎ．投与する。３０日目及び６０日目に、体重及び器官重量の測定及び肉眼的病理検査（記載通り；５、７、５２～５４）並びに組織病理学のために動物を屠殺する。対照群の平均と比較した治療群の平均の統計学的有意性を、一元配置分散分析、引き続いてＰｒｉｓｍプログラム（Ｇｒａｐｈｐａｄ、サンディエゴ）を使用したＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定によって分析する。ｐ＜０．０５の場合、差は統計学的に有意であると考えられる。
これらの実験は、マウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチド阻害剤の治療用量及び全体的な体内分布についての有効半減期、並びに（本発明者らが予想するように）ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ペプチド融合阻害剤が可能性の高い治療用量で非毒性であるかどうかを決定する。より強力な阻害剤は、より低い投与量を可能にする。毒性を示さないペプチドのみが有効性試験に進む。本発明者らは、異なる送達経路（ｓ．ｑ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｔ．、及びｉ．ｎ．）の組み合わせが、最小限の有害な副作用で、体内分布プロファイルと使用の容易さとの間の好ましいバランスをもたらし得る可能性を考慮する。粘膜表面への送達（例えば、ｉ．ｎ．／ｉ．ｔ．）は、予防的に治療する簡単で有効な方法となり、この戦略は、現場又は病院で適用可能となるだろう（例えば、医療従事者を防御するために）。重症患者又はｉ．ｎ．投薬に耐えられない他の患者には、非経口投与が好ましいだろう。本発明者らは、大量（すなわち、５０μｌ）のｉ．ｎ．が一貫した肺送達をもたらすことを示すと予想し１０、ｉ．ｔ．が気道を介した送達を模倣することが示されているため、ｉ．ｎ．をｉ．ｔ．との比較によって評価する。（特に予防の場合）全ての動物がｉ．ｎ．を介して一貫した投与量を受けるべきであるため、これはインビボ負荷にとって重要である。ｉ．ｎがｉ．ｔ．と同様の分布を一貫してもたらさない場合、本発明者らは少なくとも単回予防投与についてｉ．ｔ．を検討する。このことから、本発明者らは、肺における最も長い体内分布に基づいてペプチドを選択する。
ペプチド免疫原性試験：反復投与毒性試験を行う場合に、ペプチドの投与に関連する抗体の測定を実施する。抗ペプチド抗血清を使用して、上記の慢性毒性試験中に産生された抗体をアッセイする。本発明者らは、薬物動態、有害効果の発生率及び／若しくは重症度、補体活性化、又は免疫複合体の形成及び沈着に関連する病理学的変化に対する抗体応答の効果を評価することを試みる。
実施例８ フェレットモデル
マウス以外にも、様々な動物モデルが解明され、利用可能になっているので、本発明者らはこれらも使用する（ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｎｅｗｓ／２０２０／０４／ｍｉｃｅ－ｈａｍｓｔｅｒｓ－ｆｅｒｒｅｔｓ－ｍｏｎｋｅｙｓ－ｗｈｉｃｈ－ｌａｂ－ａｎｉｍａｌｓ－ｃａｎ－ｈｅｌｐ－ｄｅｆｅａｔ－ｎｅｗ－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）。
本発明者らのプロトタイプペプチドが感染動物から非感染直接接触動物へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の直接伝染を妨げるかどうかを評価するために、本発明者らが使用する最初の動物モデルは、フェレットである（Ｋｉｍら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎ Ｆｅｒｒｅｔｓ、Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅ（２０２０））。フェレットは、予防及び伝染を試験するための理想的なモデルである。この動物は、直接接触、又はケージからケージへのいずれかによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を非感染フェレットに非常に容易に伝染させる（Ｋｉｍら）。フェレットを点鼻薬で治療し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染接触動物との接触中の感染からの防御について評価する。全ての直接接触動物は２日以内に感染する。フェレットを点鼻薬で治療し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染接触動物との接触中の感染からの防御について評価する（図２９）。
実施例９ ヒト試験
本発明者らは、動物試験から許容可能な結果を得ることができた後、最初に医療従事者及び他の初期対応者におけるヒト安全性／有効性に目を向ける。
配列表
配列番号１（野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＨＲＣ）
DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL
配列番号２（ペプチド１、修飾ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＨＲＣ）
DISQINASVVNIEYEIKKLEEVAKKLEESLIDLQEL
配列番号３（ペプチド２、修飾ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＨＲＣ）
SIDQINATFVDIEYEIKKLEEVAKKLEESYIDLKEL
配列番号４（ペプチド４、エボラウイルスＧＰ２由来）
IEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDK
配列番号４（ペプチド５、エボラウイルスＧＰ２由来）
IAALPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDK

Claims (32)

  1. 配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５からなる群より選択される配列を含むペプチド。
  2. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５からなる群より選択される配列と８０％超、８５％超、９０％超、９５％超であり且つ１００％未満である相同性を有する配列を含むペプチド。
  3. 請求項１又は請求項２に記載のペプチド及び脂質タグを含む脂質－ペプチド融合物。
  4. 前記脂質タグがコレステロール、トコフェロール、又はパルミテートである、請求項３に記載の脂質－ペプチド融合物。
  5. 請求項１又は請求項２に記載のペプチド、脂質タグ、及びスペーサーを含む脂質－ペプチド融合物阻害剤。
  6. 前記スペーサーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項５に記載の脂質－ペプチド融合物阻害剤。
  7. 前記スペーサーがＰＥＧ４を含む、請求項６に記載の脂質－ペプチド融合物阻害剤。
  8. 前記脂質タグがコレステロール、トコフェロール、又はパルミテートである、請求項５～請求項７のいずれか一項に記載の脂質－ペプチド融合物阻害剤。
  9. 細胞膜透過性ペプチド配列（ＣＰＰ）をさらに含む、請求項５～請求項８のいずれか一項に記載の脂質－ペプチド融合物阻害剤。
  10. 前記ＣＰＰがＨＩＶ－ＴＡＴである、請求項９に記載の脂質－ペプチド融合物阻害剤。
  11. 請求項１又は請求項２に記載のペプチド及び医薬的に許容される添加剤を含む医薬組成物。
  12. 請求項１又は請求項２に記載のペプチド、脂質タグ、及び医薬的に許容される添加剤を含む医薬組成物。
  13. 前記脂質タグがコレステロール、トコフェロール、又はパルミテートである、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 請求項１又は請求項２に記載のペプチド、脂質タグ、スペーサー、及び医薬的に許容される添加剤を含む医薬組成物。
  15. 前記スペーサーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 前記スペーサーがＰＥＧ４を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 前記脂質タグがコレステロール、トコフェロール、又はパルミテートである、請求項１４～請求項１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  18. 細胞膜透過性ペプチド配列（ＣＰＰ）をさらに含む、請求項１４～請求項１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  19. 前記ＣＰＰがＨＩＶ－ＴＡＴである、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群より選択されるペプチド、脂質タグ、スペーサー、ＣＰＰ、並びに医薬的に許容される添加剤を含む、脂質－ペプチド融合物であるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）阻害剤
    を含む、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物。
  21. 前記ペプチドが配列番号２及び配列番号３から選択される、請求項２０に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物。
  22. 配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群より選択される配列と８０％超の相同性を有する配列を含むペプチド、脂質タグ、スペーサー、ＣＰＰ、並びに医薬的に許容される添加剤を含む、抗ウイルス医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＣＯＶＩＤ－１９を治療する方法。
  23. 前記脂質タグがコレステロール、トコフェロール、又はパルミテートである、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記抗ウイルス医薬組成物が、気道を通じて、又は皮下に、投与される、請求項２２又は請求項２３に記載の方法。
  25. 前記抗ウイルス医薬組成物が鼻腔内投与される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記抗ウイルス医薬組成物が、点鼻薬又は噴霧薬として投与される、請求項２５に記載の方法。
  27. 配列番号４及び配列番号５からなる群より選択されるペプチド、脂質タグ、ＣＰＰ、並びに医薬的に許容される添加剤を含む、脂質－ペプチド融合物であるエボラ阻害剤
    を含む、エボラ抗ウイルス組成物。
  28. スペーサーをさらに含む、請求項２７に記載のエボラ抗ウイルス組成物。
  29. 配列番号４及び配列番号５から選択される配列と８０％超の相同性を有する配列を含むペプチド、脂質タグ、ＣＰＰ、並びに医薬的に許容される添加剤を含む、抗ウイルス医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、エボラを治療する方法。
  30. 前記ペプチドがスペーサーをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記脂質タグがコレステロール、トコフェロール、又はパルミテートである、請求項２９又は請求項３０に記載の方法。
  32. 前記抗ウイルス医薬組成物が、気道を通じて、又は皮下に、投与される、請求項２２又は請求項２３に記載の方法。

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WO2024016011A2 (en) * 2022-07-15 2024-01-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Broad spectrum inhibition of human coronaviruses by lipopeptides derived from the c-terminal heptad repeat of betacoronaviruses

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080027006A1 (en) * 2004-02-12 2008-01-31 The Regents Of The University Of Colorado Compositions And Methods For Modification And Prevention Of Sars Coronavirus Infectivity
WO2010089129A1 (en) * 2009-02-06 2010-08-12 Cormus Srl Inhibitors of viral fusion and uses thereof
US20130196903A1 (en) * 2010-08-11 2013-08-01 Jv Bio Srl Multimeric Inhibitors of Viral Fusion and Uses Thereof
US10172961B2 (en) * 2014-05-07 2019-01-08 Cornell University Inhibitors of fusion between viral and cell membranes as well as compositions and methods of using them
WO2017015457A1 (en) * 2015-07-21 2017-01-26 Modernatx, Inc. Ebola vaccine
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