KR20230028719A - Sars-cov-2 항바이러스제로서의 지질-펩티드 융합 억제제 - Google Patents

Sars-cov-2 항바이러스제로서의 지질-펩티드 융합 억제제 Download PDF

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마테오 포로토
안느 모스코나
사무엘 겔만
빅터 아우트로
젠 유
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더 트러스티스 오브 콜롬비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕
위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
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Abstract

본원은 지질-펩티드 융합 항바이러스 요법으로 COVID-19를 치료하는 조성물 및 방법을 기재한다. 또한, 지질-펩티드 융합 항바이러스 요법으로 에볼라를 치료하는 조성물 및 방법을 기재한다.

Description

SARS-COV-2 항바이러스제로서의 지질-펩티드 융합 억제제
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에서 2020 년 4 월 24 일에 출원된 미국 가출원 제63/015,479호의 우선권의 이익을 주장하며, 이의 내용은 그 전체가 참조로 본원에 원용된다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공개물은 그 전체가 참조로 본원에 원용된다. 이들 공개물의 개시내용은 전체적으로 본 출원에 참조로 원용된다.
이 특허 공개공보는 저작권 보호의 대상이 되는 자료를 함유한다. 저작권 소유자는 미국 특허청 특허 파일 또는 기록에 나타나는 특허 문서 또는 특허 공개공보를 복제하는 데 이의가 없지만, 임의의 모든 저작권을 보유한다.
정부 지원
본 발명은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에서 수여한 AI1 14736 및 AI121349 보조금 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 발명에 대한 특정 권리를 가지고 있다.
중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-CoV-2 (COVID) 바이러스를 비롯한 코로나바이러스에 의한 감염은 바이러스 외피 및 폐 세포막 사이의 막 융합을 필요로 한다. 융합 과정은 스파이크 단백질 또는 S라고도 하는 바이러스의 외피 당단백질에 의해 매개된다. 현재 감염된 개체의 예방 또는 치료에 이용가능한 치료적 옵션은 없다. 새로 출현한 병원성 바이러스 SARS-CoV-2 (COVID-19 호흡기 질환의 원인)는 인류의 건강 및 사회 질서에 대한 세계적인 위협을 나타낸다. 따라서, 현재 COVID-19의 대유행을 감안할 때, 이러한 코로나바이러스, 특히 SARS-CoV-2에 대한 효과적인 항바이러스 요법의 개발은 국가적뿐만 아니라 전 세계적으로 최우선 과제이다.
발명의 요약
특정 양태에서, 본 발명은 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하거나 갖는 펩티드를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 그러나 100% 미만의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 갖는 펩티드를 제공한다.
특정 양태에서, SARS 지질-펩티드 융합은 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하거나 갖는 펩티드, 또는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 그러나 100% 미만의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 갖는 펩티드, 및 지질 태그를 포함한다.
일부 실시양태에서, 지질 태그는 콜레스테롤, 토코페롤 또는 팔미테이트이다.
특정 양태에서, SARS 지질-펩티드 융합 억제제는 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하거나 갖는 펩티드, 또는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 그러나 100% 미만의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 갖는 펩티드, 지질 태그 및 스페이서를 포함한다
일부 실시양태에서, 스페이서는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 PEG4이다. 일부 실시양태에서, 지질 태그는 콜레스테롤, 토코페롤 또는 팔미테이트이다.
일부 실시양태에서, SARS 지질-펩티드 융합 억제제는 세포 투과성 펩티드 서열 (CPP)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CPP는 HIV-TAT이다.
특정 양태에서, 약학 조성물은 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하거나 갖는 펩티드, 또는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 그러나 100% 미만의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 갖는 펩티드, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다.
특정 양태에서, 약학 조성물은 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하거나 갖는 펩티드, 또는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 그러나 100% 미만의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 갖는 펩티드, 지질 태그, 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 지질 태그는 콜레스테롤, 토코페롤 또는 팔미테이트이다.
특정 양태에서, 약학 조성물은 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하거나 갖는 펩티드, 또는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 그러나 100% 미만의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 갖는 펩티드, 지질 태그, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 스페이서는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 PEG4이다. 일부 실시양태에서, 지질 태그는 콜레스테롤, 토코페롤 또는 팔미테이트이다.
일부 실시양태에서, 코로나바이러스 지질-펩티드 융합 억제제는 세포 투과성 펩티드 서열 (CPP)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CPP는 HIV-TAT이다.
특정 양태에서, SARS-COV-2 (COVID-19) 항바이러스 조성물은 SARS-COV-2 (COVID-19) 지질-펩티드 융합 억제제 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. SARS-COV-2 (COVID-19) 지질-펩티드 융합 억제제는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로부터 선택된 펩티드, 지질 태그, 스페이서, 및 CPP를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 서열번호 2 또는 서열번호 3이다.
특정 양태에서, 본 발명은 항바이러스 약학 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, COVID-19의 치료 방법을 제공한다. 항바이러스 약학 조성물은 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하거나 갖는 펩티드, 또는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 그러나 100% 미만의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 갖는 펩티드, 지질 태그, 스페이서, CPP, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 지질 태그는 콜레스테롤, 토코페롤 또는 팔미테이트이다.
일부 실시양태에서, 항바이러스 약학 조성물은 기도 또는 피하 투여된다. 일부 실시양태에서, 항바이러스 약학 조성물은 비강내 투여된다. 일부 실시양태에서, 항바이러스 약학 조성물은 점비액 또는 스프레이로서 투여된다.
도 1: S (스파이크) 단백질. 양쪽 단부에서 절편 HRN 및 HRC를 반복하고, 서로를 인식하고, 함께 스냅하여, 접힌 구조를 형성한다. 융합 억제성 펩티드는 반복 절편에 결합하여 접힌 구조의 형성을 방지하여, 바이러스 융합 및 진입을 차단한다.
도 2: 코로나바이러스에 의한 감염 및 세포-진입.
도 3: 엔도좀 경로를 통한 에볼라 바이러스 진입. Falzarano D, Feldmann H.로부터의 Virology. Delineating Ebola entry. Science 2015.
도 4: 바이러스 외피 스파이크 (S) 단백질로부터 유래된 SARS-CoV-2 억제제의 모듈식 설계.
도 5: 지질 변형된 HRC 펩티드는 초기 및 잠복 코로나바이러스 바이러스 진입을 모두 차단한다. 이는 지질-컨쥬게이션된 MERS-유래된 펩티드를 사용하여 수득된 결과를 도식적으로 나타낸다. Park and Gallagher, Lipidation increases antiviral activities of coronavirus fusion-inhibiting peptides, Virology 2017; 511, 9-18로부터의 도면.
도 6: MERS-S 매개된 융합에 대한 MERS-CoV-S 펩티드의 융합 억제 검정.
도 7: 치료적 효험. 마우스 (N=5/그룹)를 10 개의 LD50 MERS-CoV (마우스 i.n.당 102 TCID50)의 감염 16 시간 후에 콜레스테롤 태깅된 또는 태깅되지 않은 (또는 미처리된) 펩티드 2 mg/Kg i.p의 단일 용량으로 치료하였다. 감염 전에 비강으로 주어지는 경우, 태깅되지 않은 펩티드라도 100% 보호적임을 주목한다.
도 8: TAT-EBOLA-dPEG4-Toc는 치사 (MA-)ZEBOV 감염으로부터 마우스를 보호한다. 5-6 주령 BALB/c 마우스는 제1 펩티드 처리 24 시간 후 (MA-)ZEBOV의 복강내 시험감염(challenge)을 받았고, 감염 후 5 주 동안 추적되었다. 펩티드 (등장수에 용해된 10 mg/kg)를 15 일 동안 매일 복강내 투여하였다.
도 9: TAT 및 지질-컨쥬게이션된 펩티드의 세포내 국소화. Vero 세포 단층을 표시된 펩티드의 10 μM과 함께 37oC에서 60 분 동안 항온처리하였다. 세포를 고정하고, PBS 중 0.02% Tween-20으로 투과화하고, 맞춤 제작된 비오틴-컨쥬게이션된 항펩티드 항체로 염색하였다. 항-펩티드 항체를 스트렙타비딘-피코에리트린 (PE)으로 검출하였다. 세포를 DAPI (핵 염색)로 대조염색하였다. PE (방출 580 nm) 및 DAPI (방출 460 nm) 형광을 획득하였다.
도 10: HRC 유래된 C-펩티드 및 서열의 설계. 소프트웨어 (http://www.uniprot.org/align/)는 MERS-CoV와 각각의 HRN 표적의 유사성을 나타낸다. C-펩티드와 상호작용하는 잔기는 볼드체로 강조되고, 비-상호작용하는 영역에 위치하는 잔기는 회색으로 음영 처리된다.
도 11: SARS-CoV-2 S로부터 태깅된 지질. SARS-CoV-2 S HRC 영역으로부터 유래된 C-펩티드가 합성될 것이다. 제3 행 (DISG... QEL)은 본 발명자들이 최근에 테스트하고 EK1 펩티드와 비교한 서열이다.
도 12: SARS-CoV-2 S 단백질 (PDB 6LXT)의 HRC 및 HRN 도메인에 의해 형성된 6HB 어셈블리의 결정 구조. HRC에서, 중앙 나선 및 양쪽 측면의 확장된 세그먼트에 주목한다.
도 13: SARS-CoV-2 S 단백질의 HRC 도메인의 서열 (상부), D-1에 나타낸 바와 같이 각각의 단부에 넘버링이 도시됨. 2 개의 "h" 기호는 나선형 세그먼트의 경계를 나타낸다. D-2는 이온 쌍 배열을 최적화하기 위해 2 개의 α-아미노산 잔기 변화 (적색)를 함유한다. D-3은 MERS의 HRC 도메인에 상응하고, D-4는 MERS HRC로부터 유래된 펩티드 EK1이다 (적색의 변화).
도 14: 융합 억제 검정은 MERS-CoV-S C-펩티드가 SARS-CoV-2-S 매개된 융합을 차단함을 보여준다. 펩티드 aa 서열이 도시된다. 대조군 펩티드 (파라인플루엔자 서열)는 흑색으로 도시된다.
도 15a-15b: 플라크 감소 검정. 도 15a: 세포 배양물에서 살아있는 바이러스 및 본 발명자들의 MERS 지질-펩티드를 사용하여 SARS-CoV-2 감염의 100% 감소를 관찰하였다. 도 15b. EBO-융합에 대한 플라크 억제 검정. 펩티드를 멸균수 (10 uM 내지 0.005 uM)에서 10-배 연속 희석하고, 각각의 펩티드 용량을 MEM에 희석된 500 PFU/mL를 함유하는 동일한 부피의 바이러스와 혼합하고, 펩티드/바이러스 혼합물을 37C에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 각각의 펩티드 용량/바이러스 혼합물을 6-웰 플레이트 중 Vero E6 세포의 삼중 웰에 접종하고 (웰당 0.2-mL), 37C에서 1 시간 동안 흡착되도록 하였다. 세포 단층을 MEM, 5% 소 태아 혈청, 항생제 및 ME 아가로스 (0.6%)를 함유하는 배지 오버레이를 첨가하기 전에 PBS로 2 회 헹구었다. 배양물을 37C에서 6 일 동안 항온처리하고, 염료로서 중성 적색을 함유하는 배지를 오버레이하고, 24-48 시간 후에 플라크를 계수하였다. 바이러스 대조군을 펩티드 대신 멸균수와 혼합하였다.
도 16: SARS 및 MERS 펩티드를 이용한 SARS CoV-2 당단백질 융합의 억제. SARS 펩티드는 ACE2가 있는 경우 약 6 nm의 IC50을 갖고, ACE2가 없는 경우 오직 0.09 nM의 IC50을 갖는다.
도 17: 표시된 펩티드를 이용한 SARS CoV-2 당단백질 융합의 억제.
도 18: 도 17에 사용된 표시된 펩티드의 서열.
도 19: 표시된 단백질을 이용한 SARS CoV-2 당단백질의 억제.
도 20: SARS-CoV-2 펩티드를 이용한 바이러스 감염의 억제.
도 21: 인간 기도 상피 (HAE).
도 22: 시간 경과 (3 일)에 따른 HAE의 인간 파라인플루엔자-GFP.
도 23: EGFP를 보유하는 SARS-CoV-2를 이용한 인간 기도 상피 (HAE) 감염.
도 24: EGFP를 보유하는 파라인플루엔자 바이러스를 이용하여 감염된 인간 폐 오가노이드.
도 25: 골든 햄스터에서 니파 (치사 바이러스) 감염에 대한 인 비보 효험은 지질-펩티드의 2 mg/kg/d 피하 전달이 효과적임을 보여준다.
도 26: 골든 햄스터에서 니파 (치사 바이러스) 감염에 대한 인 비보 효험: 지질-펩티드를 비강 내로 투여하였다. 1 일 전, 당일, 1 일 후의 투여는 치사 감염으로부터 60% 보호를 제공할 수 있다.
도 27: 인플루엔자 감염에 대한 인 비보 효험. 3 회 비강내로 주어된 펩티드: 1 일 전, 당일, 1 일 후 면화 랫트에서 1000x 낮은 바이러스 역가.
도 28: 홍역 펩티드를 갖는 마우스에서 홍역 감염 (치사 뇌염)을 예방하기 위한 인 비보 효험. 피하 및 비강내 투여 둘 모두를 조사하였다.
도 29: Kim et al에서와 같이, 페럿 연구의 설계.
본 발명은 COVID-19의 예방 및 치료를 위한 지질-펩티드 분자를 포함한다. 본 발명은 세포로의 SARS-CoV-2의 진입을 차단하고, 인 비보 감염을 예방하고/하거나 폐기하고, 전파를 예방할 가능성이 있는 설계된 펩티드를 사용한다. 본 발명자들은 이러한 유형의 지질-펩티드 분자가 홍역, 치사 니파 바이러스 및 인플루엔자 등과 같은 다른 바이러스의 치사 감염을 예방하고 심지어 치료하는 데 매우 효과적이라는 것을 발견하였다. 설계된 펩티드는 배양된 세포 및 엑스 비보에서 살아있는 SARS-CoV-2 (COVID) 바이러스 감염을 억제하는 데 매우 효과적이다.
SARS-CoV-2 (COVID) 바이러스를 비롯한 코로나바이러스에 의한 감염은 바이러스 외피 및 폐 세포막 사이의 막 융합을 필요로 한다. 융합 과정은 스파이크 단백질 또는 S라고 또한 불리는 바이러스의 외피 당단백질에 의해 매개된다. 본 발명자들은 스파이크 단백질의 전이 단계에 결합하여, 이의 기능을 방지함으로써 바이러스 융합 및 감염을 억제하는, 지질에 연결된 특이적 펩티드를 설계하였다. 중요하게는, 본 발명자들이 표적화하는 다른 바이러스로부터의 증거에 기반하여, 이러한 항바이러스제는 기도로, 점비액에 의해 주어질 수 있고, 독성이 없으며, 폐에서 양호한 반감기를 갖는다. 이들이 코 및 흡입을 통해 주어질 수 있다는 사실은 이들을 광범위한 사용에 대해 실행가능하게 만든다.
본 발명자들은 BSL2 실험실 조건에서 효능 및 기전을 평가하기 위한 여러 검정을 설계하였으며, 이는 지금까지 세포 배양에서 살아있는 SARS-CoV-2에 대한 효험을 정확하게 예측하였다. 프로토타입 펩티드는 배양된 세포에서 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 융합 및 바이러스 진입 검정을 차단하고 인 비보 및 엑스 비보에서 살아있는 SARS-CoV-2 (COVID) 바이러스 감염을 억제하는 데 매우 효과적이다. 이러한 항바이러스제의 개선은 이들이 훨씬 더 효과적이고, 폐 또는 혈액에서 분해되는 것에 대해 더 저항성이 있으며, 스파이크 단백질과 더 잘 상호작용하여, 전이 상태를 차단하도록 할 것이다. 동물 모델에서 선두(lead) 항바이러스제를 테스트하는 것은 의료 종사자의 감염을 예방하기 위한 점비액 또는 스프레이로서의 치료를 포함하여, 감염을 예방 및 치료하고 감염된 동물에서 건강한 동물로의 전염을 예방하는 것에 대해 유용성을 보여줄 것이다.
특정 양태에서, 본 발명은 서열 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하거나 갖는 펩티드를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 그러나 100% 미만의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 갖는 펩티드를 제공한다.
특정 양태에서, SARS 지질-펩티드 융합은 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하거나 갖는 펩티드, 또는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 그러나 100% 미만의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 갖는 펩티드, 및 지질 태그를 포함한다.
일부 실시양태에서, 지질 태그는 콜레스테롤, 토코페롤 또는 팔미테이트이다.
특정 양태에서, SARS 지질-펩티드 융합 억제제는 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하거나 갖는 펩티드, 또는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 그러나 100% 미만의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 갖는 펩티드, 지질 태그, 및 스페이서를 포함한다.
일부 실시양태에서, 스페이서는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 PEG4이다. 일부 실시양태에서, 지질 태그는 콜레스테롤, 토코페롤 또는 팔미테이트이다.
일부 실시양태에서, SARS 지질-펩티드 융합 억제제는 세포 투과성 펩티드 서열 (CPP)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CPP는 HIV-TAT이다.
특정 양태에서, 약학 조성물은 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하거나 갖는 펩티드, 또는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 그러나 100% 미만의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 갖는 펩티드, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다.
특정 양태에서, 약학 조성물은 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하거나 갖는 펩티드, 또는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 그러나 100% 미만의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 갖는 펩티드, 지질 태그, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 지질 태그는 콜레스테롤, 토코페롤 또는 팔미테이트이다.
특정 양태에서, 약학 조성물은 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하거나 갖는 펩티드, 또는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 그러나 100% 미만의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 갖는 펩티드, 지질 태그, 스페이서, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 스페이서는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 PEG4이다. 일부 실시양태에서, 지질 태그는 콜레스테롤, 토코페롤 또는 팔미테이트이다.
일부 실시양태에서, 코로나바이러스 지질-펩티드 융합 억제제는 세포 투과성 펩티드 서열 (CPP)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CPP는 HIV-TAT이다.
특정 양태에서, SARS-COV-2 (COVID-19) 항바이러스 조성물은 SARS-COV-2 (COVID-19) 지질-펩티드 융합 억제제 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. SARS-COV-2 (COVID-19) 지질-펩티드 융합 억제제는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로부터 선택된 펩티드, 지질 태그, 스페이서, 및 CPP를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 서열번호 2 또는 서열번호 3이다.
특정 양태에서, 본 발명은 항바이러스 약학 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 COVID-19를 치료하는 방법을 제공한다. 항바이러스 약학 조성물은 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하거나 갖는 펩티드, 또는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 그러나 100% 미만의 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 갖는 펩티드, 지질 태그, 스페이서, CPP, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 지질 태그는 콜레스테롤, 토코페롤 또는 팔미테이트이다.
일부 실시양태에서, 항바이러스 약학 조성물은 기도 또는 피하 투여된다. 일부 실시양태에서, 항바이러스 약학 조성물은 비강내 투여된다. 일부 실시양태에서, 항바이러스 약학 조성물은 점비액 또는 스프레이로서 투여된다.
실시예
본 발명의 보다 완전한 이해를 용이하게 하기 위해 실시예가 아래에 제공된다. 다음의 실시예는 본 발명을 만들고 시행하는 예시적인 모드를 예시한다. 그러나, 대안적인 방법을 활용하여 유사한 결과를 수득할 수 있기 때문에, 본 발명의 범주는 단지 예시의 목적을 위한 것인 이러한 실시예에 개시된 특이적 실시양태로 제한되지 않는다.
실시예 1 일반 개념
코로나바이러스 감염
코로나바이러스 (CoV)는 생명을 위협하는 질환을 유발할 수 있다. 가장 최근의 질환은 최근에 세계 보건 기구에서 코로나바이러스 질환 2019 (약칭 "COVID-19")로 명명되었다. COVID-19는 코로나바이러스 균주 SARS-CoV-2에 의해 유발된다. 전구자(predecessor) SARS-CoV-1 및 중동 호흡기 증후군 바이러스 MERS-CoV와 마찬가지로, SARS-CoV-2는 베타코로나바이러스이다. COVID-19에 대한 백신 또는 치료제는 아직 이용가능하지 않다. 숙주 세포로의 바이러스 진입을 표적화하는 항바이러스제는 광범위한 바이러스 질환에 대해 효과적인 것으로 입증되었다.
표적 세포로의 코로나바이러스 진입 경로
코로나바이러스는 유형 I 융합 메커니즘을 사용하여, 숙주 세포의 세포질에 접근한다. 유형 I 융합 메커니즘을 사용하는 다른 병원성 바이러스는 HIV, 파라믹소바이러스 및 뉴모바이러스를 포함한다. 바이러스 외피 및 숙주 세포막의 병합은 삼합체 바이러스 융합 단백질의 충분한 구조적 재배열에 의해 구동되며; 재배열 과정을 억제함으로써 감염을 저지할 수 있다.
코로나바이러스에 의한 감염은 바이러스 외피 및 세포막 사이의 막 융합을 필요로 한다. 세포 유형 및 코로나바이러스 균주에 따라, 융합은 세포 표면 막 또는 엔도좀 막에서 발생할 수 있다. 융합 과정은 큰 동종삼합체로서 ~1200 개의 잔기가 아주 많이-글리코실화된 유형-I 통합 막 단백질인 바이러스 외피 당단백질 (S)에 의해 매개되며, 각각의 단량체는 여러 도메인을 갖는다 (도 1, 2). 수용체 결합 도메인 (RBD) -- 바이러스 막에 대해 원위부 -- 은 세포 표면 부착을 담당한다. 막 병합은 근위 세포 융합 도메인 (FD)에 의해 매개된다. 융합을 위해서는 RBD 및 FD의 합동된 작용이 필요하다. 바이러스 부착 (및 특정 경우 흡수) 시, 숙주 인자 (수용체 및 프로테아제)는, 단백질 재접힘을 막 융합에 직접 커플링하는 에너지적으로 안정한 6-나선 다발 (6HB)의 형성에 의해 구동된 FD에서의 대규모 입체형태적 재배열을 촉발한다. FD는 융합 억제성 펩티드 (C-말단 헵타드 반복, C-펩티드 또는 HRC 펩티드로서 지칭됨)에 의해 표적화될 수 있는 고도로 보존된 삼합체 코일링된-코일 코어로 구성된 일시적인 프리-헤어핀 중간체를 형성하는 것으로 생각된다.
인플루엔자 HA와 같이, 이 S는 비리온 표면에 삼합체로서 존재하고, 부착, 수용체 결합 및 막 융합을 매개한다. 지금까지 식별된 베타코로나바이러스 S 단백질의 숙주 세포 수용체는 SARS-CoV-1에 대한 안지오텐신-전환 효소 2 (ACE2) 및 MERS-CoV에 대한 디펩티딜 펩티다제-4 (DPP4)를 포함한다. SARS-CoV-2는 진입을 위해 인간 안지오텐신-전환 효소 2 (hACE2)를 사용하는 것으로 밝혀졌다 (그리고 아직 알려지지 않은 다른 수용체를 사용할 수 있음). S는 숙주 프로테아제에 의해 절단되어, S1 및 S2를 생성한다. 수용체를 사용한 프라이밍 및 절단 둘 모두가 막 병합에 필요하다.
바이러스 진입의 경로 및 억제에 대한 전략
막 병합을 야기하는 융합 단백질의 일련의 입체형태적 변화를 개시하는 활성화 단계는 바이러스가 세포에 진입하기 위해 사용하는 경로에 따라 상이하다. 많은 파라믹소바이러스의 경우, 수용체 결합 시, 부착 당단백질은 융합 단백질 (F)을 활성화하여, 중성 pH에서 세포 표면에서 융합 준비된 입체형태를 취한다. 본 발명자들 및 다른 사람들은 (세포 막에서 융합하는) 이러한 바이러스에 대해, 융합 단백질 엑토도메인의 HRC 영역으로부터 유래된 C-펩티드가 다양한 활성으로 바이러스 진입을 억제하고, 지질 컨쥬게이션이 항바이러스 효능을 현저하게 향상시키고 동시에 이들의 인 비보 반감기를 증가시킨다는 것을 보여주었다. 지질-컨쥬게이션된 융합 억제성 펩티드를 원형질막에 표적화하고, 증가된 HRN-펩티드 결합 친화도를 조작함으로써, 본 발명자들은 항바이러스 효능을 몇 로그만큼 증가시켰다. 세포 표면 상의 지질-컨쥬게이션된 억제성 펩티드는 바이러스 융합의 막 부위를 직접적으로 표적화한다. 지질 모이어티 및 펩티드 사이의 화합물에 폴리-에틸렌 글리콜 (PEG) 링커 (예컨대, PEG4)를 첨가함으로써, 본 발명자들은 컨쥬게이트의 넓은 스펙트럼의 활성 및 효능을 더욱 증가시켰다. 본 출원의 목적상, 단어 "링커" 및 "스페이서"는 상호교환적으로 사용된다. 본 발명자들은 골든 햄스터 및 비-인간 영장류의 치사 니파 바이러스 감염, 마우스 및 코튼 랫트의 홍역 바이러스 감염, 및 코튼 랫트의 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3 감염에 대한 지질-컨쥬게이션된 융합 억제성 펩티드의 인 비보 효험을 입증하였다.
세포 막에서 융합하지 않는 바이러스의 경우, C-펩티드에 대한 표적은 일반적으로 접근할 수 없는 것으로 생각된다. 이러한 바이러스의 예는 인플루엔자 및 에볼라 바이러스가 있다. 인플루엔자 (헤마글루티닌 단백질; HA) 및 에볼라 (GP)의 융합 단백질은 세포 내재화 후에만 융합되도록 활성화된다. 본 발명자들은 인플루엔자 HA로부터 유래된 지질-컨쥬게이션된 펩티드가 인플루엔자에 의한 감염을 억제한다는 것을 보여주었으며, 이는 지질-컨쥬게이션-기반 전략이 세포 내부에서 융합하는 바이러스에 대한 융합-억제성 펩티드의 사용을 허용함을 시사한다. 본 발명자들이 인플루엔자에 대해 채택한 제2 전략은 세포내 표적의 억제를 향상시키기 위해 HIV-TAT (잘 알려진 세포-투과성 펩티드, CPP)를 첨가하는 것이다. 이 두 가지 전략의 조합으로, HA 유래된 펩티드는 인플루엔자 바이러스의 인간 균주에 대해 인 비보에서 효과적이다.
유사한 전략은 에볼라 감염에 대한 효과적인 항바이러스 C-펩티드로 이어졌다. 도 3에서, 에볼라 바이러스 진입 과정이 묘사되어 있다. 에볼라 GP2 융합으로 이어지는 활성화 단계는 후기 엔도좀 및 리소좀 사이에서 발생한다. 에볼라 GP2에서, HRN 및 HRC 영역은 CX6CC 모티브 및 내부 융합 루프를 함유하는 25 개의 잔기 링커로 연접된다. 에볼라 GP2의 융합 코어에 대한 구조적 연구는 항바이러스제로서 GP2 C-펩티드의 제안된 용도로 이어졌다. 그러나, 에볼라 (EBOV) C-펩티드는 표적이 세포 표면이 아닌 엔도좀에서만 접근가능하다는 개념과 일치하여, 낮은 효능을 보였다. CPP HIV TAT를 에볼라 융합 억제제와 컨쥬게이션하면 (국소화를 향상시키기 위한 노력으로) 항바이러스 활성을 개선시켜, 약 ~50 μM의 IC50 값을 초래하였다. 이 정보에 기반하여, 지질-컨쥬게이션된 인플루엔자 HA-유래된 펩티드라는 발견과 조합하여, 본 발명자들은 표 1에 기재된 Zaire (Z) EBOV GP2-유래된 C-펩티드를 합성하였다. 본 발명자들은 지질 모이어티 및 펩티드 사이에 삽입된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 스페이서가 향상된 넓은 스펙트럼의 활성 및 효능을 야기함을 보여주었다. 지질 모이어티 및 PEG4 스페이서는 C-펩티드의 C-말단에 위치한다. 본 발명자들의 인플루엔자 연구에서, 본 발명자들은 항바이러스 펩티드에 대한 토코페롤 모이어티의 첨가가 펩티드의 인 비보 효능을 증가시킨다는 것을 발견하여, 항-에볼라 C-펩티드의 설계에 토코페롤 (Toc)을 사용하였다.
원리의 증명: 융합 지질-펩티드
코로나바이러스에 대한 C-펩티드 융합 억제제 개발의 주요 도전과제는 코로나바이러스 바이러스 진입이 여러 진입 경로를 따를 수 있다는 것일 수 있다 (도 2). 일부 코로나바이러스 균주는 세포 표면에서 융합할 수 있지만, 여러 다른 균주는 초기에 엔도사이토시스를 하고, 융합이 엔도좀에서 촉발된다. 일부 경우에서, S 절단 부위 및 표적 숙주 세포 프로테아제에 따라 동일한 균주가 상이한 경로를 통해 진입할 수 있다. 바이러스는 세포 표면 또는 세포 내부에서 융합할 수 있다.
이러한 이유로, 코로나바이러스에 대한 진입 억제제의 설계는 도전과제이다. 본 발명자들은 엔도좀 국소화를 촉진하는 세포 투과성 펩티드 및 지질 모이어티를 첨가하는 것이 항바이러스 효능을 증가시킬 것인지 여부를 조사하였다.
HRC 펩티드는 프리-헤어핀 중간체에 결합하여 6HB의 형성을 방지함으로써 우성-음성 방식으로 바이러스 융합 및 진입을 억제한다. 세포 막에서 융합하는 균주 (초기 진입)의 경우, 추가적인 구성요소가 없는 HRC 펩티드는 바이러스 진입을 방지할 수 있지만, 이러한 펩티드는 엔도좀에서 융합하는 균주 (후기 진입)에는 효과가 없다. S의 세포내 격리는 엔도좀 융합 코로나바이러스 균주에 대한 HRC 펩티드 융합 억제제를 개발하는 것을 어렵게 만들 수 있다. SARS-CoV-2를 포함한 엔도좀 융합 코로나바이러스를 표적화하기 위해, 입증된 지질화 및 페길화 전략 외에도, 세포 투과성 펩티드 서열 (도 4의 CPP)을 통합하여 엔도사이토시스를 더욱 촉진하였다.
지질-컨쥬게이션된 억제성 펩티드에 대한 초기 연구는 지질이 펩티드를 세포 막으로 지시하고 항바이러스 효험을 증가시킨다는 것을 입증하였다. 이러한 컨쥬게이션된 펩티드는 공개된 연구에서 코로나바이러스의 초기 및 후기 진입 균주 둘 모두를 억제하는 것으로 나타났다 (도 5).
표적 세포 막에서 융합하는 바이러스의 경우, HRC 펩티드에 대한 지질 컨쥬게이션은 항바이러스 효능 및 인 비보 반감기를 현저하게 증가시킨다. 지질 컨쥬게이션은 또한 엔도사이토시스를 통해 흡수될 때까지 융합되지 않은 바이러스에 대한 활성을 가능하게 한다. 예를 들어, 본 발명자들은 지질-컨쥬게이션된 MERS로부터 유래된 HRC 펩티드 (아래 참고)가 MERS 감염을 억제한다는 것을 보여주었으며, 이는 지질-컨쥬게이션-기반 전략이 엔도좀 막과의 융합의 억제제를 생성함을 시사한다. 유사한 전략은 후기 엔도좀과 리소좀 사이를 융합하는, 에볼라 감염에 대해 효과적인 항바이러스 펩티드를 야기하였다. 이러한 지질-펩티드는 바이러스를 "따라" 세포내 구획으로 뒤따른다.
본 발명자들은 폐-내 투여 후 인 비보에서 효과적인 것으로 나타난 펩티드 서열에 기반하여 MERS-CoV-특이적 지질-컨쥬게이션된 펩티드를 설계 및 생산하였다. 2014 년에, 본 발명자들의 설계에 의해 만들어진 이들 펩티드를 인 비트로에서 (도 6) 및 인 비보에서 (도 7) MERS-CoV에 대해 테스트하였다. 지질 모이어티는 융합 검정에서 펩티드의 효능을 증가시켰고 (도 6), 이들의 인 비보 활성을 증가시켰다 (도 7). 보다 최근에, Gallagher 그룹은 지질-컨쥬게이션 (본 발명자들의 펩티드를 사용함)이 MERS-CoV-유래된 펩티드의 항바이러스 효능을 최대 1000-배까지 증가시켜, 원형질 막 및 엔도좀 구획 둘 모두에서 CoV 진입 억제를 야기한다는 것을 발견하였다.
원리의 증명: 인 비트로에서 살아있는 에볼라 감염의 억제.
본 발명자들은 UTMB의 BSL4 시설과 협력하여 인 비트로에서 살아있는 ZEBOV 감염에 대한 위의 C-펩티드의 효험을 비교하였다 (표 1). 동일한 HR 도메인으로부터 유래되었지만 TAT (CPP 모티브) 서열이 없는 대조군 에볼라 C-펩티드는 지질이 컨쥬게이션된 경우에도 효과가 없었다 (100 μM이 테스트된 최고 농도임). 따라서, 특히 에볼라 바이러스에 대한 억제 활성은 TAT 서열 및 지질 컨쥬게이션 둘 모두를 필요로 한다.
Figure pct00001
원리의 증명: 인 비보에서 마우스 적응형 (MA)-ZEBOV의 억제:
표 1의 3 가지 C-펩티드 억제제 (강조 표시됨)를 임의의 내약성 문제 없이 복강내 (i.p.) 전달에 의해 14 일 동안 20 mg/ml로 마우스의 급성 독성에 대해 먼저 테스트하였다. 마우스 약동학 연구는 24 시간 이상 동안 혈장에서 지질 컨쥬게이션된 C-펩티드 억제제의 존재를 확인하였다. 도 8에 제시된 인 비보 연구를 위해, 동물을 1OOLD5O의 바이러스로 감염시켰다. 본 발명자들은 그룹당 5 마리의 5-6 주령의 BALB/c 마우스의 동물을 감염-후 -1 일차부터 15 일차까지 10 mg/kg i.p.로 치료하였다 (동물당 ~100 μl의 등장성 수용액). 모든 감염된 동물은 유의한 중량 손실을 나타내었지만, TAT-EBOLA-dPEG4-Toc 펩티드로 예방적으로 치료된 동물 5 마리 중 4 마리가 감염에서 생존하였다 (미처리된 그룹에서는 아무도 없음). 지질이 없는 TAT-EBOLAdPEG4는 5 마리 동물 중 2 마리를 부분적으로 보호하였다. 콜레스테롤 컨쥬게이션된 C-펩티드로 치료된 동물은 한 마리도 생존하지 못하였다. 동물의 대조군을 동일한 TAT 서열, 지질 모이어티 및 PEG 링커를 보유하는 HPIV3 C-유래 펩티드로 치료하였다. 살아남은 동물을 재-시험감염(re-challenged)하였고, 모든 동물은 제2 시험감염에서 생존하였는데, 이는 C-펩티드 융합 억제제를 사용한 치료가 보호 면역의 발달을 허용하였음을 나타낸다.
원리의 증명: 지질-컨쥬게이션된 억제성 펩티드는 세포 내재화를 겪음.
TATEBOLA-dPEG4-Toc 펩티드는 인 비보에서 효과적이기 때문에 (도 8), 본 발명자들은 세포내 국소화가 TAT-EBOLA-dPEG4-Chol (또는 다른 펩티드)과 상이한지 여부를 묻고, 공초점 현미경을 사용하여 세포 국소화를 분석하였다. 펩티드 (DMSO에 1000 μM로 용해됨)를 PBS에 10 μM으로 희석하고, 37℃에서 살아있는 Vero 세포에 첨가하였다. 대조군은 지질이 없는 펩티드 및 DMSO 단독을 포함하였고, 펩티드를 비오틴-컨쥬게이션된 항-펩티드 항체로 검출하였다. TAT-EBOLA-dPEG4-Toc 처리된 세포는 강렬한 세포내 형광 반점을 나타낸다. EBOLA-dPEG4-Chol (TAT 없음)은 주로 최소한의 세포 내재화로 세포 막에 국소화되며; TAT를 첨가하면 막 국소화가 증가되고, 부분적인 세포내 국소화를 야기한다. TAT-EBOLA-dPEG4는 지질 태깅된 펩티드와 비교하여 세포 막 및 세포 내부에서 매우 낮은 수준으로만 검출되었다. 도 9는 TAT-EBOLA-dPEG4-Toc 펩티드가 세포내로 국소화됨을 보여주며, 이는 GP2-유래된 펩티드가 인 비보에서 효과적이기 위해서는 세포내 국소화가 필요하다는 본 발명자들의 가설을 지지한다. 유사한 결과가 인플루엔자 HA 유래된 펩티드 11에서 수득되었는데, 이는 지질 모이어티 및 TAT가 이들 두 바이러스에 대한 세포이하(subcellular) 국소화의 주요 동인임을 나타냈다.
요약하면, 본 발명자들은 TAT 서열 및 지질 모이어티 둘 모두가 세포내 융합 바이러스에 대한 효율적인 세포내 국소화 및 인 비보 효험을 촉진하고, 둘 모두가 다양한 조합으로 코로나바이러스에 유용할 수 있음을 보여주었다. 과학적 전제: 코로나바이러스가 표적 세포로 진입하는 경로는 무질서하다.
실시예 2 SARS-CoV HRC 항바이러스 펩티드의 설계
개선된 억제성 SARS-CoV-2 S 특이적 C-펩티드의 설계, 생성 및 특성화
본 발명자들은 MERS를 효과적으로 차단하는 지질-유도체화된 MERS-CoV-S-유래된 진입 억제제를 식별하였다 (도 6 및 7 참고). C-펩티드 억제제를 설계하고, SARS-CoV-2에 대한 효험에 대해 최적화하였다. 엔도좀에서 융합 차단이 발생한다는 점을 감안할 때, 펩티드가 최적의 세포내 국소화 및 인 비보 효험을 달성하기 위해서는 CPP 서열 및 지질 컨쥬게이션 둘 모두가 필요하다. 본 발명자들은 인플루엔자 및 에볼라에 대한 이 가설에 대한 실험적 증거를 제공한다. 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 코로나바이러스 융합은 세포 막에서 또는 세포내 국소화 후에 발생할 수 있다. 본 발명자들은 CPP를 첨가하고 지질 모이어티를 변형함으로써 엔도좀 국소화를 개선하면 SARS-CoV-2에 대한 항바이러스 효능이 증가하는지 여부를 테스트하였다.
SARSCoV-2 S 단백질의 HRC 도메인의 서열
SARS-CoV-2 6HB 어셈블리 (도 12)은 SARS-CoV-2 막 융합의 백본-변형된 억제제의 설계를 위한 우수한 기초를 제공한다. HRC 도메인은 중심의 5-회전 α-나선 및 양쪽 측면 상의 나선에 플랭킹하는 확장된 영역을 특징으로 한다. 천연 HRC 도메인은 SARS-CoV-2 S 단백질의 잔기 1168-1203에 상응한다.
펩티드 D-1 (도 13)은 SARS-CoV-2 HRC 도메인 (SARS-CoV-1 HRC 도메인과 동일함)에 상응하고; Xia et al.은 최근에 D-1이 슈도바이러스-기반 세포 검정 (IC50 ~ 1 μM)에서 SARS-CoV-2 감염의 적당한 억제제라고 보고하였다. 중심 α-나선을 형성하는 잔기를 나타냈다. 제안된 펩티드 D-2는 D-1과 관련하여 다음의 2 개의 변화를 함유하며: Lys118에서Glu로 및 Asp1184에서Lys로, 이는 나선의 용매-대향 측면을 따라 양이온 및 음이온 측쇄의 교대를 야기한다. 따라서, D-2는 나선23을 안정화시키는 이온 쌍의 어레이를 특징으로 해야 하며, 본 발명자들은 D-2가 SARS-CoV-2 감염의 억제제로서 D-1보다 우수할 것으로 예측한다. D-3은 MERS S HRC 도메인에 상응하고, D-4는 SARS-CoV-2 감염의 억제제로서 D-1에 필적하는 D-3의 유도체이다.
이 프로그램에서 생성된 HRC-기반 펩티드를 평가하기 위해 일반적인 접근법을 사용할 것이다. 원편광 이색성 (CD) 측정은 HRC 유도체가 HRN 펩티드와 공동조립되는지 여부를 나타내며, 그렇다면 조립 안정성을 평가할 것이다. 유망한 HRC 유도체의 경우, HRN 펩티드를 사용한 공결정화는 도 12와 유사한 구조를 제공할 것이다. 항바이러스 활성은 초기에 세포 검정에서 평가되며; 유망한 후보는 인간 엑스 비보 및 설치류 인 비보 검정에서 평가될 것이다.
구조-가이드된 돌연변이유발 사용
Figure pct00002
본원에서 논의하는 SARS-CoV-2에 대한 연구를 지지하기 위한 예로서 EBOV C-펩티드 융합 억제제의 항바이러스 효능 및 생체이용률을 최적화하기 위해 구조-가이드된 돌연변이유발 및 단백질 조작을 사용하였다. 본 발명자들은 지질 모이어티 (C 또는 N 말단에서) 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 스페이서 (크기 및 기원)에 변형이 있는 여러 펩티드의 IC50을 평가하였다. 결과는 위의 표 2에 도시되어 있다.
본 발명자들은 또한 에볼라 바이러스의 여러 균주를 사용하여 표 3의 데이터를 확장하였다. 예비 데이터는 여러 에볼라 바이러스 균주에 대해 나노몰 범위의 효능을 보여준다 (표 3 참고).
Figure pct00003
본 발명자들이 설계한 새로 식별된 서열을 살아있는 바이러스에 대해 테스트하였다 (아래 표 4 참고). 생물물리학적 데이터에 기반하여 서열 IEP (표 2에서 강조 표시로 도시됨)를 IAAILP (표 4에서 강조 표시됨)로 변형하였다. 본 발명자들의 가설과 달리, TAT-EBO-IAAILP-PEG4-Chol (표 4 참고)은, 유사한 구조 (PEG4 및 콜레스테롤)를 갖는 TAT-EBO-PEG4-Chol 및 TAT-EBO-dPEG4-Chol 둘 모두 (표 2 참고)보다 약 10 배 높은 0.6 uM의 IC50을 가졌다. 본 발명자들은 서열 변형이 항바이러스 활성에 해롭다고 결론지었다. 그러나, 본 발명자들은 PEG4 링커가 없는 TAT-EBO-IAAILP-Chol이 지금까지 식별된 가장 강력한 펩티드보다 약 20 배 우수한 3 nM의 IC50을 갖는다는 것을 발견하였다. 추가적으로, IC90은 27 nM으로, 지금까지 본 발명자들의 최선의 펩티드의 IC50의 절반 정도였다.
Figure pct00004
본 발명자들은 TAT-EBO-Chol (표 2의 원래 서열이지만 PEG가 없음)을 준비하였다. 본 발명자들은 원래 서열을 테스트하고, 이를 도 15b의 새로 변형된 서열과 비교하였다. PEG4가 없는 TAT-EBO-Chol은 TAT-EBO-PEG4-Chol보다 유의하게 더 강력하지만 (표 2 참고), PEG4 링커가 없는 TAT-EBO-IAAILP-Chol은 본 발명자들이 지금까지 설계한 가장 강력한 펩티드이다. 데이터는 서열 변형 및 PEG 제거 둘 모두가 효능 증가에 기여하고 있음을 도시한다.
실시예 3 SARS-CoV HRC 펩티드의 추가 변형
효험 및 세포내 표적화를 개선시키기 위한 지질 및 세포-투과성 펩티드 서열의 첨가
본 발명자들은 SARS-CoV-2 S 특이적 C-펩티드를 설계하였다 (도 11 참고). (SARS-CoV-2 S HRC 도메인으로부터의) 총 5 개의 중첩 C-펩티드를 (세포 투과성 펩티드 유무에 관계없이) 합성할 것이다. 넓은 스펙트럼의 활성 1을 갖는 위에 도시된 MERS 서열 (TAT 유무에 관계없이)을 포함할 것이다. SARS-CoV-2 융합을 억제하는 다른 넓은 스펙트럼의 HRC 유래된 서열 (TAT 유무에 관계없이 EK1)을 또한 포함할 것이다 (이 서열은 MERS 서열로부터 5 개의 aa의 상이함을 가짐). 이들 14 개의 펩티드 (7 개의 일반 및 7 개의 TAT 포함)를 초기에 2 개의 지질과 컨쥬게이션할 것이다. 2 개의 지질은 (i) 콜레스테롤 (가장 강력한 MERS 펩티드가 콜레스테롤 컨쥬게이트이기 때문에, 도 6 참고) 및 (ii) 토코페롤 (TAT 서열과 조합될 때, 토코페롤 컨쥬게이션은 인 비보에서 에볼라 및 인플루엔자에 대해 가장 강력한 펩티드를 야기하기 때문에, 표 1)일 것이다. (위의 도 8 및 11에 도시된 펩티드에서와 같이) PEG4 링커를 사용할 것이다. 이 28 개의 펩티드 (14 개의 펩티드 X 2 개의 지질)의 세트를 (본 발명자들의 연구 및 위의 융합 검정에서와 같이) VSV 슈도유형의 바이러스 기반 시스템을 사용하여 CUIMC에서 테스트하였다. 가장 효과적인 10 개의 펩티드는 살아있는 SARS-CoV-2 테스트 (Vero 세포의 플라크 감소 검정 및 Calu-3 세포의 확인)를 위해 UTMB로 보내질 것이다. 이 예비 스크리닝의 결과는 기계론적 연구 및 넓은 스펙트럼의 평가를 발전시키기 위해 가장 강력한 5 개의 펩티드의 선택을 가이드할 것이다. 이들 5 개의 펩티드는 또한 엔도좀 국소화 및 엑스 비보 효험으로 발전할 것이다.
이들 데이터는 7 개의 서열 (위의 도 11의 5 개 및 넓은 스펙트럼의 활성을 나타낸 2 개의 MERS 기반 펩티드) 중에서 가장 효과적인 HRC S 유래된 aa 서열에 관한 정보를 제공할 것이다.
단층 세포 배양물에서 펩티드 독성의 평가: 이전 연구5에서와 같이 5 개의 펩티드를 독성에 대해 평가할 것이다. 독성을 Vybrant® MTT 세포 증식 검정 (Invitrogen)에 의해 평가할 것이다.
실시예 4 세포 배양물에서 HRC-유래된 펩티드의 효험을 평가함
SARS-CoV-2 감염은 Calu-3 세포에서 확인된 Vero 세포에서 먼저 수행될 것이며, 이들 세포에서 살아있는 바이러스에 대한 효험을 나타내는 펩티드는 HAE (상업적으로 획득됨)에서의 실험으로 이동할 것이다. 펩티드 억제제의 연속 희석물을 감염 전후에 첨가하여, 펩티드가 바이러스 진입을 방지하는 효과 및 펩티드가 감염 후 조직 내 바이러스 확산을 차단하는지 여부를 평가할 것이다. 또한, 본 발명자들은 확립된 프로토콜을 사용하여 펩티드의 독성의 증거에 대해 HAE 조직을 연구할 것이다. 본 발명자들은 엑스 비보 활성을 연구하기 위해 ~ 5 개 이하의 펩티드 억제제를 사용할 것이다. 본 발명자들은 HAE가 융합 억제성 펩티드 활성을 평가하는 이상적인 모델임을 보여주었다. 본 발명자들은 또한 최근에 인간 발달 폐 오가노이드 모델이 발달 중인 폐를 나타내고 호흡기 감염의 여러 양태를 모델링할 수 있음을 보여주었으며, 향후 이 모델을 SARS-CoV-2에 사용할 수 있다. 이들 두 모델을 SARS-CoV-2에 대한 펩티드 유효성을 평가하기 위해 본 발명자들의 공개된 연구에서와 같이 사용할 것이다. HAE (또는 향후 연구에서 오가노이드)의 성장으로부터 출현하는 바이러스는 이전에 수행한 것처럼 진화를 평가하고 출현하는 임의의 펩티드-저항성 변이체를 평가하기 위해 시퀀싱될 것이다.
중동 호흡기 증후군 (MERS, MERS-CoV에 의해 유발됨)은 2012 년에 처음 보고되었을 당시 인간에게 생소한 호흡기 질병이다. 본 발명자들은 폐-내 투여 후 인 비보에서 효과적인 것으로 보여진 펩티드 서열에 기반하여 몇 가지 MERS-CoV 특이적 지질 컨쥬게이션된 펩티드를 설계하고 생산하였다.
2014 년에, 본 발명자들이 설계한 이들 펩티드를 융합 검정 (도 6) 및 인 비보 (도 7)에서 MERS-CoV에 대해 테스트하였다. 이러한 연구결과는 진입하는 바이러스가 CoV 스파이크-지시된 막 융합을 활성화하는 것으로 알려진 세포 프로테아제에 의해 표적화된 후에도 MERS C-지질-펩티드가 효과적임을 입증하였다. 연구결과는 C-지질-펩티드가 CoV 진입을 차단하기 위해 엔도좀에 축적되어야 하는지 여부, 및 항-CoV 활성의 스펙트럼이 CoV 막 융합의 단백질분해 활성화에 대한 요구사항과 관련되는지 여부와 같은 질문을 제기한다. 특히, 세린 프로테아제 억제제, 예컨대, 카모스타트 및 나파모스타트가 SARS-CoV-2의 유용한 억제제일 수 있음을 시사하는 새로운 보고가 있다. 이러한 세린 프로테아제 억제제는 CoV 융합 활성화를 저지하거나 지연시키기 때문에, 동일한 반응에 영향을 미치지만 기계적으로는 별개의 방식으로 C-지질-펩티드와 상승작용할 수 있다.
본 발명자들은 최근에 SARS-CoV-2 S 단백질을 사용하여 융합 검정에서 이러한 MERS-S 유래된 펩티드를 테스트하였다. 세포 투과 서열이 없어도, 지질 모이어티의 첨가는 융합 검정에서 펩티드의 효능을 증가시켰다 (도 14). 해당 실험에서, 본 발명자들은 (콜레스테롤 컨쥬게이션된) 최선의 펩티드가 약 ~33 nM의 IC50 및 200 nM의 IC90을 갖는다는 것을 발견하였다. IC50 및 IC90은 유사한 검정에서 본 발명자들의 홍역 펩티드보다 우수하다. 이러한 홍역 펩티드는 비강내 투여시 예방적으로 주어질 수 있고 인 비보에서 감염을 차단할 수 있다.
SARS-CoV-2 감염의 100% 감소를 세포 배양물에서 살아있는 바이러스 및 본 발명자들의 MERS 지질-펩티드를 사용하여 관찰하였다 (도 15a). Vero-E6 세포의 플라크 감소 중화 테스트에서, 세포를 펩티드의 유무에 관계없이 감염시키고, 플라크를 감염 3 일 후에 카운팅하였다. 결과를 펩티드와 함께 항온처리되지 않은 바이러스와 비교한 감소 퍼센트로서 표현하였다. 값은 삼중 웰로부터의 표준 편차가 있는 평균이다. 위에 논의된 TAT-EBO-Chol 융합을 테스트하기 위해 유사한 설정을 활용하였으며 (표 2-4), 그 결과는 도 15b에 도시되어 있다.
SARS-COV-2에 기반한 지질-펩티드는 MERS 지질-펩티드보다 훨씬 더 효과적이었다.
표시된 펩티드를 이용한 SARS CoV-2 당단백질 융합의 억제. 표시된 돌연변이 및 β-갈락토시다제의 α-서브유닛을 보유하는 SARS-CoV-2 당단백질을 발현하는 293T 세포와, β-갈락토시다제의 ω-서브유닛이 형질주입되고 A) hACE2 수용체가 형질주입되거나 B) 형질주입된 hACE2 수용체가 없는 293T 세포의 세포-간 융합을 표시된 펩티드의 증가하는 농도의 존재 하에 β-Gal 상보성 검정에 의해 평가하였다. Tecan Infinite M1000 Pro를 사용하여 β-갈락토시다제로부터의 생성된 발광을 정량화하였다. 융합의 억제 퍼센트 (펩티드로 처리되지 않은 대조군 세포에 대한 결과와 비교함)는 펩티드 농도의 함수로서 도시된다. 값은 하나의 실험으로부터의 결과의 평균 (± SD)이다. 펩티드의 서열은 아래 다이어그램과 같다 (도 18).
SARS 지질-펩티드는 살아있는 SARS 바이러스에 대해 효과적이었다. IC50은 약 5-10 nM로 추정되며, 이는 필요한 수준이 사람에게 도달할 수 있음을 나타낸다. 특히, 도 20은 MERS 및 SARS 바이러스 둘 모두가 프로토타입 SARS 펩티드에 의해 억제됨을 도시한다.
실시예 5 항바이러스 활성 및 C-펩티드 융합 억제제에 대한 저항성에 대한 분자적 기초를 연구하기 위한 엑스 비보 항바이러스 활성 및 바이러스 진화 실험.
자연 숙주에서 감염의 결정자를 이해하기 위해, 극성 및 세포 특이성을 특성화하는 데 사용된 HAE 모델을 사용할 것이다. 본 발명자들은 파라인플루엔자 감염에 이 모델을 사용하여, 이것이 인간 폐에서의 바이러스-HAE 상호작용을 반영한다는 것을 확인하였다. 본 발명자들 및 다른 사람들은 불멸화된 단층 세포의 결과가 인 비보에서 번역될 때 적용가능하지 않을 수 있음을 문서화하였으며, 따라서 자연 숙주를 보다 밀접하게 나타내는 모델에서 본 발명자들의 가설을 테스트하는 것이 중요하다. HAE는 임상 시나리오를 복제하는 실험에서 현장 단리물을 평가하는 데 이상적이다.
인간 기도 상피 (HAE)는 대부분 공기-액체 계면에서 성장된 큰 기도 조직으로 이루어진다 (도 21). 본 발명자들은 파라인플루엔자 바이러스를 포함한 다른 바이러스에 대한 진정한 바이러스 성장 및 항바이러스 평가를 위해 인간 폐 모델을 검증하였다 (도 22). SARS-CoV-2 실험을 위해, HAE를 EGFP를 보유하는 SARS-CoV-2로 감염시켜, 감염을 시각화하였다 (도 23). 대조군 조직은 처리하지 않고, 요법 조직은 감염 발병 뒤 200 nm에서 SARS-CoV-2 HRC로 처리하였다. HRC 처리는 감염을 효과적으로 제거하였다.
본 발명자들은 또한 인간 폐 오가노이드를 모델로서 활용할 수 있다 (도 24). 인간 폐 엑스-비보 모델 둘 모두를 진정한 바이러스 성장 및 항바이러스 평가에 대해 검증하였다. (HAE를 이미 SARS-CoV-2에 대해 검증하였으며, 오가노이드를 도면에서와 같이 RSV, 인플루엔자, 파라인플루엔자에 대해 검증되었고 SARS-CoV-2로 테스트할 것이다.)
HIV-1에 대한 Fuzeonⓒ의 임상적 사용은 약물 저항성 HIV-1 변이체의 출현을 초래하였다. 탈출 변이체 바이러스는 또한 Fuzeonⓒ의 존재 하에 HIV-1의 인 비트로 계대배양시 출현하였다. 저항성 바이러스 집단은 3 개의 HRN 아미노산인 글리신-이소류신발린 (GIV)의 고도로 보존된 스트레치 내에서 돌연변이를 획득하였다. 이 GIV 모티프의 저항성 돌연변이는 Fuzeonⓒ 요법 중인 환자의 바이러스 유사-종(quasi-species) 내에 또한 존재한다. 저항성은 바이러스 HRN 및 Fuzeonⓒ 사이의 감소된 상호작용 또는 바이러스 HRN 및 HRC 사이의 증가된 상호작용에 기인하였다. 증가된 융합 역학은 저항성을 야기하였으나, 또한 바이러스의 성장이 약물에 의존하게 되었다. 항-SARS CoV-2 요법은 HIV (급성 대 만성 치료)보다 지속기간이 짧지만, 인플루엔자와 마찬가지로 저항성이 임상적으로 중요할 수 있다. HIV 및 인플루엔자의 결과에 기반하여, 저항성의 출현에 대한 인 비트로 데이터는 치료의 선택적 압력 하에서 바이러스의 인 비보 거동에 직접 적용될 것이며, 저항성을 예측하고 C-펩티드 융합 억제제 설계를 선제적으로 개선하는 데 사용될 수 있다.
전략: SARS-CoV-2 감염을 HAE에서 수행할 것이다. 최근에 EGFP 유전자를 보유하는 재조합 SARS-CoV-2 바이러스 (EGFP-SARS-CoV-2)를 생산하였다. 이 바이러스는 실시간으로 C-펩티드의 선택적 압력 하에서 바이러스 진화를 모니터링하는 데 사용될 것이다. 펩티드 억제제의 연속 희석물을 (i) 바이러스 진입을 방지하는 펩티드의 효과; (ii) 펩티드가 감염 후 조직 내 바이러스 확산을 차단하는지 여부를 평가하기 위해 감염 전후에 첨가할 것이다. 또한, 본 발명자들은 확립된 프로토콜을 사용하여 펩티드의 독성의 증거에 대해 HAE 및 오가노이드 조직을 연구할 것이다. HAE에서 항바이러스 활성의 평가 후, 최적화된 C-펩티드 융합 억제제의 선택적 압력 하에서 감염을 수행하여, 잠재적 저항성의 분자적 기초를 분석하고; C-펩티드-저항성 바이러스의 진화의 가능성을 예측하고; 저항성에 대해 선택될 최소한의 가능성이 있는 C-펩티드 융합 억제제를 식별하는 데 사용할 정보를 제공할 것이다.
엑스 비보 항바이러스 활성: 본 발명자들은 HAE가 융합 억제성 펩티드 활성을 평가하기 위한 이상적인 모델임을 보여주었다. 이 모델을 도 23에서와 같이 SARSCoV-2에 대한 C-펩티드 유효을 평가하는 데 사용하였다. 이러한 모델의 평가를 통해, 유효한 인간 엑스 비보 모델 (HAE)에서 엔도좀 국소화가 SARS-CoV-2 항바이러스 활성에 유익한지 여부를 결정할 수 있다. HAE로부터의 상층액을 2 개의 분취량으로 나누고, qPCR/게놈 서열 분석 및 바이러스 역가를 위해 가공하였다.
저항성 변이체의 생성: 본 발명자들은 실험실에서 일상적으로 수행되는 프로토콜을 사용하여 소분자의 억제 효과에 저항성인 SARS-CoV-2 바이러스를 이끌어 내려고 시도할 것이다. 간단히 말해서, SARSCoV-2의 여러 희석물을 HAE에서 3 내지 4 일 동안 여러 농도 (IC50의 5 배 내지 40 배의 범위)의 C-펩티드의 존재 하에 HAE에서 계대배양할 것이다. 선택을 위해 바이러스 중합효소 복합체가 표현형 변이체를 복제하고 생산하는 것을 허용하는 초기 감염 후에 C-펩티드를 첨가할 것임을 주목한다. 저항성 바이러스는 C-펩티드의 존재 시에도 확산될 것이다. 바이러스 수율을 플라크 검정 및/또는 qRTPCR에 의해 결정할 것이다. 바이러스가 억제제의 존재 및 부재 하에 확산됨에 따라, 억제제의 농도가 점진적으로 증가하여 저항성 바이러스 집단을 수득할 것이다. 계대배양된 바이러스를 시퀀싱할 뿐만 아니라 플라크 감소 검정에서 억제제 민감도에 대해 테스트할 것이다. 바이러스 진화에 선택적인 압력을 적용하는 이 전략은 본 발명자들의 연구실에서 뉴라미니다제-저항성 변이체 및 소분자 억제제-저항성 변이체에 대해 수행한 유익한 실험과 유사하다.
인 비트로에서 저항성 변이체의 분석: (HAE에서의 성장에 의한) 확장 전 및 확장 돌연변이체 저항성 바이러스를 시퀀싱할 것이다. 본 발명자들은 높은 깊이의 전체 바이러스 게놈 시퀀싱에 의해 저항성 바이러스 돌연변이체를 분석할 것이다. HAE-성장된 바이러스의 서열을 바이러스 진화의 종단적 분석을 위해 특별히 제작된 맞춤형 생물정보학 소프트웨어를 사용하여 선택 실험의 지속기간 동안 생성된 집단-유래된 서열과 비교할 것이다. 이 접근법은 선택 과정 동안에 또는 후에 공존할 수 있는 게놈에 걸쳐 존재하는 대립유전자 또는 잠재적으로 중요한 바이러스 서브집단을 무시하는 것을 방지한다. 본 발명자들은 각각의 변이체의 적합성이 모 바이러스의 적합성과 유사한지 여부 또는 변이체가 생존을 위해 억제제의 존재를 필요로 하는지 여부를 결정할 것이다. 본 발명자들은 광범위한 경험을 가지고 있고 이전에 두 접근법 모두를 검증하였으며, 이는 대립유전자 빈도가 파라믹소비리다에, 예컨대, 개 홍역 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 3 (HPIV3) 및 호흡기 세포융합 바이러스를 이용한 2 개의 접근법과 매칭함을 보여준다. 샷건 시퀀싱은 모든 RNA 바이러스에 대해 간단한 1 개의-워크플로우 프로토콜을 가능하게 하는 반면, 타일링 RT-PCR은 복잡한 샘플 유형으로부터의 바이러스 서열의 특이적 선택을 가능하게 한다. 본 발명자들은 이들 바이러스를 최소 평균값 깊이 200X로 시퀀싱하고, >4%의 대립유전자 빈도를 갖는 모든 변이체를 호출할 것이다. 서열 판독물을 각각의 샘플에 대한 판독물을 당일/계대배양 0 바이러스 게놈의 드 노보 어셈블리 컨센서스 참조에 대해 정렬하는 바이러스 대립유전자의 종단 분석을 위한 맞춤형 생물정보학 파이프라인을 사용하여 분석할 것이다.
S가 돌연변이를 함유한다면, 본 발명자들은 돌연변이된 유전자를 본 발명자들의 발현 벡터에 도입하고, 본 발명자들의 기능적 검정에서 당단백질 기능을 평가할 것이다. 다중 돌연변이가 발견되면, 부위-특이적 돌연변이유발을 사용하여, 돌연변이를 S 배경에 도입할 것이고, 단일-돌연변이된 유전자를 동일한 인 비트로 검정을 사용하여 표현형에 대해 분석할 것이다. 돌연변이의 위치 및 보존은 상이한 펩티드에 대한 저항성 메커니즘(들)이 유사한 정도를 알려줄 것이다. 상이한 펩티드로부터 유래된 돌연변이체가 현저하게 상이한 경우, 특이적 돌연변이의 기여도를 분석하여 각각의 기여도를 상세히 분석할 것이다.
인 비보에서 저항성 변이체의 분석: 인 비트로 및 엑스 비보에서 잘 성장하는 저항성 변이체를 식별하는 경우, 이들의 인 비보 적합성을 평가할 것이다. 저항성 변이체의 병원성을 인 비보에서 모 바이러스와 비교할 것이다. 동물의 총 수는 저항성 변이체의 수에 따라 달라질 것이다. 본 발명자들이 본원에서 저항성 변이체 및 펩티드의 효험을 평가하는 데 사용할 하나의 마우스 모델은 인간 안지오텐신-전환 효소 2 (ACE2) 트랜스제닉 마우스 (hACE2 마우스)이다. 이 모델은 SARS-CoV-1에 대한 치사 모델인 것으로 나타났다. 최근 보고서는 SARS-CoV-2에 대해 모델은 치명적이지는 않지만, 중량 손실 및 병리학적 징후가 관찰됨을 나타낸다. 육안적 병리학 및 조직병리학 둘 모두를 감염 후 3 일차 및 5 일차 둘 모두에서 쉽게 관찰할 수 있다. 106-107 pfu/ml의 바이러스 역가를 감염 후 1-3 일 후에 수득하였다. 본 발명자들은 Jax laboratory로부터 이러한 마우스를 사전-주문하였으며, 2020 년 6 월에 마우스를 얻을 것으로 예상하였다. 이 감염의 동물 모델을 사용하여, 펩티드-저항성 변이체가 wt에 관하여 변경된 병리학을 유발하는지 여부, 및 저항성 돌연변이의 결과로서 이들의 적합성이 감소 또는 증가하는지를 평가할 것이다. hACE2 마우스를 항바이러스 효험의 평가에 사용할 것이다. 본 발명자들은 총 5 개의 바이러스에 대해 ~4 개의 변이체 바이러스에 더하여 1 개의 wt를 테스트할 것으로 예상한다 (10 마리의 동물; 그룹당 수컷 5 마리, 암컷 5 마리, 총 n=50 마리의 마우스).
샘플 수집 및 분석: 조직병리학 평가 및 바이러스 부하 (qRT-PCR에 의함)를 위해 모든 주요 장기의 조직 샘플을 각각의 마우스로부터 수집할 것이다. 바이러스 단리를 qRT-PCR에 의해 EGFP-SARS-CoV-2에 대해 양성인 표본에서만 수행할 것이다. 바이러스 적정을 플라크 검정에 의해 수행할 것이다. 샘플을 또한 시퀀싱하여, 인 비보에서 바이러스 진화를 평가할 것이다.
S의 서열 변경은 기능적 변경과 연결될 것이고, 이 정보는 저항성 메커니즘을 이해하는 데 사용될 것이다. 파라인플루엔자의 경우, 향상된 융합 역학은 인 비트로에서 펩티드 억제제에 대한 부분적인 저항성을 야기하였지만, 본 발명자들은 융합 역학을 증가시키는 돌연변이가 자연 숙주 조직의 성장에 부정적인 영향을 미치며; 이러한 저항성 돌연변이가 인 비보에서 적합성을 유의하게 감소시킬 가능성이 있다는 것을 보여주었다. 본 발명자들은 저항성 CoV 변이체가 인 비보에서 덜 병원성일 것으로 기대한다. 본 발명자들은 항바이러스 개발 초기에 이러한 메커니즘을 평가함으로써 더 많은 병원성 바이러스를 야기할 수 있는 항바이러스 전략의 발전을 피할 것을 제안한다. 변이체의 생성의 용이성 및 저항성 돌연변이를 함유하는 SARS-CoV-2의 적합성의 결정은 임상적으로 관련된 저항성 변이체의 진화 가능성을 예측하도록 허용할 것이다. 4 내지 5 회의 계대배양 내에 저항성이 획득된다면, 본 발명자들은 C-펩티드를 다른 곳에서 논의된 프로테아제 억제제와 조합하여, 병용 치료가 저항성에 대한 더 높은 장벽을 제공할 것이라는 가설을 테스트하는 것을 고려할 것이다. 본 발명자들은 또한 -- 그럴 가능성이 거의 없지만 -- 저항성을 이끌어 내지 않을 가능성을 고려하며, 이는 특이적 C-펩티드에 저항성을 갖는 생존가능한 변이체를 생성하기에 적합성 비용이 너무 높다는 것을 시사할 것이다. 이러한 C-펩티드는 앞으로 나아가기에 이상적인 후보가 될 것이다. 본원에서 얻은 정보는 저항성을 이끌어 낼 가능성이 가장 낮은 C-펩티드를 선택하는 데 사용될 것이다. 엑스 비보에서 효과적이고 인 비보에서 저항성을 이끌어 낼 최소한의 가능성이 있는 C-펩티드를 인 비보 효험에 대해 테스트할 것이다.
논의: 주요 초점은 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 효과적인 C-펩티드를 수득하는 것이지만, 동시에 이러한 실험으로부터 본 발명자들은 코로나바이러스 패밀리가 하나의 C-펩티드에 의해 억제될 수 있는지 여부를 알게 될 것이다. 본 발명자들은 이미 하나의 펩티드가 SARS-CoV-2 및 MERS 둘 모두를 억제한다는 것을 보여주었다 (도 20). SARS-CoV-1의 HRC는 SARS-CoV-2와 동일하기 때문에, 본 발명자들은 펩티드가 SARS-CoV-1에도 작용할 것으로 예상한다. 본 발명자들은 이것이 본 발명자들이 넓은 스펙트럼의 코로나바이러스 억제제를 수득할 것임을 시사한다고 주장한다. 본 발명자들은 발발(outbreak) 및 비축(stockpiling)에 사용하기 위한 매우 효과적인 항-코로나바이러스 펩티드를 식별할 것이다. 본 발명자들은 C-펩티드의 억제 활성에 대한 분자적 기초의 상세한 이해를 수득하고 최적의 억제의 기초를 다룰 것이다. 이러한 결과는 구조적 및 안정성 특성 및 억제 효능 간의 상관관계를 밝힐 것이고, 펩티드 설계를 가이드하는 데 사용될 것이다. 세포 내부의 펩티드 국소화의 결정자는 펩티드의 엔도좀 국소화를 향상시키기 위해 식별되고 활용될 것이다. 본 발명자들의 적용의 강점은 개선된 융합 억제제의 특이적 특성이 인 비보 효험을 평가함으로써 테스트될 것이라는 것이다. 결과를 통해 본 발명자들은 이상적인 항바이러스 화합물을 설계하기 위해 효험, 엔도좀 표적화 및 독성 부재를 지지하는 생화학적 및 구조적 인자 및 최적의 제형의 이해를 사용할 수 있을 것이다. 본 발명자들은 저항성의 분자적 기초에 대한 정보를 수득할 것으로 기대한다. 저항성 돌연변이체의 서열 변경은 기능적 변경과 연결되며, 이 정보는 저항성 메커니즘을 이해하는 데 사용될 것이다. 저항성 연구, 특히 저항성 메커니즘의 이해는 기본적인 코로나바이러스 융합 생물학에 대한 통찰력을 제공할 것이다.
실시예 6 SARS-CoV-2 감염의 마우스 모델에서 펩티드 융합 억제제의 인 비보 효능의 평가
본 발명자들은 마우스에서 약동학 및 안전성 연구를 실시할 것이다. 본 발명자들은 식별된 인 비트로 개선된 펩티드가 원하는 혈청 반감기 및 조직 생체분포 프로파일을 가지고 있는지 여부, 및 인 비보에서 안전하고 내약성이 좋은지 여부를 결정할 것이다. 본 발명자들은 인간 안지오텐-전환 효소 2 (ACE2) 트랜스제닉 마우스50-52 (hACE2 마우스)를 사용하여, 인 비보 항-SARS-CoV-2 효험을 평가할 것이다. 최근 보고서에 따르면 SARS-CoV-2에 대해 모델이 치명적이지는 않지만 중량 손실 및 병리학적 징후가 관찰되었다. (https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.07.939389v3). 육안적 병리학 및 조직병리학 둘 모두는 감염 후 3 일차 및 5 일차 둘 모두에서 쉽게 관찰할 수 있다. 106-107 pfu/ml의 바이러스 역가를 감염 후 1-3 일 후에 수득하였다.
본 발명자들은 지질 변형이 선두 SARS-Cov-2 융합-억제성 펩티드의 항바이러스 효험을 증가시킬 뿐만 아니라 펩티드 약물의 전형적으로 불량한 약동학을 극복하여, 펩티드의 순환 반감기를 임상적으로 유용한 수준으로 연장한다는 것을 보여주었다. 본 발명자들은 항-SARS-Cov-2 효능 및 프로테아제 저항성을 증가시키도록 설계된 돌연변이 및 백본 변형이 선택된 개선된 SARS-Cov-2 펩티드의 약동학적 특성에 어느 정도 영향을 미치는지를 결정할 것이다. 본 발명자들의 목표는 개선된 펩티드가 인 비보에서 효과적인 농도에 도달하도록 하고, (i) 최소 투여량 및 (ii) 이를 유지하는 데 필요한 투여 빈도를 평가하는 것이다. 본원에서 본 발명자들은 또한 잠재적인 부작용 및 약물 클리어런스의 역학을 평가한다. 본 발명자들의 인 비보 파라믹소바이러스 실험 및 예비 약동학 연구에서 20 mg/kg으로 최대 21 일 동안 치료된 마우스 및 햄스터에서 독성 효과가 관찰되지 않았다는 것은 고무적이다.
유사한 펩티드 억제제에 대해 이전에 수행한 바와 같이 마우스 (또는 하기에 논의되는 바와 같이 유리한 것으로 밝혀진 임의의 다른 동물 모델)에서 선택된 개선된 펩티드의 약동학 (PK)을 평가할 것이다. 본 발명자들은 4 개의 펩티드를 평가할 것이다. 마우스 (그룹당 6 마리, 성별을 변수로서 포착하기 위한 수컷 3 마리 + 암컷 3 마리)에 피하 (s.q.), 복강내 (i.p.), 비강내 (i.n) 및 (i.t)로 주사할 것이다 (초기 4 가지 경로 모두를 테스트할 것임). 본 발명자들의 예비 데이터는 i.p. 전달이 MERS 치료에 효과적임을 나타낸다 (도 7 참고). 이제 본 발명자들은 i.p.를 s.q., i.n. 및 i.t.와 비교할 것이며, 왜냐하면 후자의 세 가지 전달 경로가 임상 적용에 더 바람직할 것이기 때문이다 (i.n은 의료 환경 외부에서의 예방에 바람직하지만, s.q./i.t. 투여는 질병의 환자 또는 i.n. 의약에 내약성일 수 없는 사람들에게 사용될 수 있음). 동물에 융합 억제성 펩티드 (6 mg/kg)를 접종하고, 12, 24, 36 및 48 시간 후에 희생시킬 것이다. 본 발명자들은 생체분포 연구 및 면역형광을 위한 ELISA를 수행할 것이다. 마우스에서 SARS-CoV-2 HRC 펩티드 독성의 평가: 급성, 15-일 및 만성 독성.
본 발명자들의 공개된 데이터는 니파 바이러스, 홍역 바이러스 (MV) 및 인플루엔자에 대한 인 비보 지질화된 펩티드의 예방적 및 치료적 효험 둘 모두를 보여주고, 에볼라 (본원에 도시되지 않음) 및 MERS (도 7)에 대한 예비 데이터는 또한 인 비보 지질화된 펩티드의 효험을 보여준다. 제안된 시험감염 실험은 예방적 효험에 필요한 최소 용량 및 펩티드 억제제 효험에 대한 치료적 시간 윈도우를 결정할 것이다. 효험을 평가하는 데 사용할 마우스 모델은 다른 곳에서 기재된 hACE2 마우스50-52이다 (https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.07.939389v3). 이 감염 동물 모델은 바이러스 복제 및 확산에 대한 펩티드 효험의 평가에 이상적이다. 필요에 따라 다른 동물 모델이 포함되거나 대체될 것이다.
골든 햄스터에서 니파 (치사 바이러스) 감염에 대한 인 비보 효험: 2 mg/kg/d 지질-펩티드의 피하 전달이 효과적이었다 (도 25).
골든 햄스터에서 니파 (치사 바이러스) 감염에 대한 인 비보 효험: 지질-펩티드를 비강내 투여하였다. 1 일 전, 당일, 1 일 후의 투여는 치사 감염으로부터 60%의 보호를 제공할 수 있다 (도 26).
인플루엔자 감염에 대한 인 비보 효험. 3 회 비강내 주어진 펩티드: 코튼 랫트에서 1000 배 더 낮은 바이러스 역가 1 일 전, 당일, 1 일 후 (도 27).
홍역 펩티드를 이용한 마우스에서 홍역 감염 (치명적 뇌염)을 예방하기 위한 인 비보 효험. 피하 및 비강내 투여 둘 모두를 조사하였다 (도 28).
hACE2 수용체의 상이한 발현 수준에 따른 정량적 융합 검정의 비교. 이들 데이터 (위의 도 16에 도시됨)는 펩티드가 ACE2가 더 적은 비강/상기도에서 매우 효과적일 것임을 나타낸다.
유리한 독성/생체분포 프로파일을 갖는 인 비트로에서 가장 효과적인 2 개의 펩티드 융합 억제제를 hACE2 마우스의 SARS-CoV-2 감염에서 테스트할 것이고/이거나, 이들이 필요하고 유리해지면 다른 관련 동물 모델에서 테스트할 것이다. 본 발명자들은 먼저 감염 전, 감염과 동시에, 또는 감염 후 최대 10 일 동안 i.n. 펩티드 투여에 의해 보호가 제공되는지 여부를 결정할 것이고, 최적의 투여량을 확립할 것이다. 이러한 데이터에 기반하여, 본 발명자들은 대체 전달 경로 (s.q.)를 사용하여 예방적 및 치료적 연구를 수행할 것이다.
투약: 2 개의 최적화된 펩티드 억제제의 초기 스크리닝을 위해, 및 최적의 용량을 결정하기 위해, 10 마리의 동물의 그룹을 시험감염 1 일 전에 3 가지 상이한 용량의 펩티드로 i.n. 및 s.q. 치료한 다음, 최대 2 일 동안 매일 치료할 것이다. 감염을 SARS-CoV-2 i.n.의 105 TCID50으로 수행할 것이다.
효험: 일단 유효 용량을 결정하면, 노출 후 치료를 위한 치료적 윈도우를 결정하는 데 집중할 것이다. 이는 발발을 관리하기 위해 생성물을 사용할 가능성이 높기 때문에 중요하다. 감염 후 며칠 동안 펩티드 치료가 보호를 제공할 수 있는지 결정할 것이다. VA 섹션을 참고한다.
동물 수: 투약용: (2 개의 펩티드 + 스크램블된 + 모의 처리됨) X 10 마리의 마우스 X 2 개의 접종 경로 X 3 개의 용량 = 240 마리의 마우스. 효험: 2 개의 펩티드 X 10 마리의 마우스 X 1 개의 접종 경로 X 4 개의 시점 = 80 + 10 마리의 미치료된 마우스.
폐로부터의 바이러스 부하는 플라크 검정 및 qRT-PCR에 의해 결정될 것이다. 치료된 동물 및 미치료된 동물로부터의 샘플 조직은 또한 치료 동안에 바이러스 진화가 발생했는지 여부를 결정하기 위해 시퀀싱을 위해 보내질 것이다.
모델의 판독은 명확하고 통계적으로 유의한 그룹을 형성할 것이다. 두 성별의 동물을 성별을 변수로서 포착하는 데 사용할 것이다. 본 발명자들은 펩티드의 예방적 투여가 감염에 대해 보호할 것으로 기대한다. 펩티드가 노출-후 양생법에서 또한 효과적인지 여부를 결정할 것이다. 비강내 전달은 예방에 잘 작용할 수 있지만, 초기 감염 후에 s.q.가 우수하게 작용할 가능성이 있으며, 결과에 따라 s.q. 주사를 통한 노출-후 치료를 결정할 수 있다.
HPLC-MS가 특정 장기의 펩티드 평가에 너무 높은 검출 한계를 갖는다는 것을 발견했기 때문에, 펩티드 농도의 정량은 ELISA에 의해 수행된다 (데이터는 도시되지 않음). 본 발명자들의 펩티드와 같은 블록 양친매성 물질은 계면활성제 특성을 가질 수 있어, 상피 자극을 야기할 수 있으며; 따라서, 독성 테스트가 중요하다. 독성 효과를 나타내지 않는 펩티드만을 효험 연구로 진행할 것이다. 코로나바이러스에 대한 요법은 짧은 지속기간에 이루어질 것으로 예상되나; 치료에 영향을 미칠 수 있는 치료 동안에 펩티드에 대한 항체를 생성할 수 있다. 본 발명자들은 니파-감염된 햄스터, 홍역 감염된 마우스 및 코튼 랫트를 연구하는 동안 이러한 효과를 관찰하지 못하였다. 치료에 대한 항체 길항작용의 가능성을 테스트하기 위해, 위에 개략된 독성 연구에 사용된 동물로부터의 혈청을 수집하고, 펩티드의 억제 활성을 이용한 방해를 평가할 것이다. 본 발명자들은 hACE 마우스에서 SARS-CoV-2를 이용한 인 비보 감염의 비-치사성에 대한 설명이 동물의 노령화 (6-11 개월) 때문일 수 있다는 가능성을 고려한다. 본 발명자들은 어린 마우스가 치사 감염 모델을 허용할 수 있는지 여부를 결정할 것이다. 생존 곡선은 효험에 대해 통계적으로 유의한 판독값이 될 것이다.
이러한 실험으로부터, 본 발명자들은 현재 순환하는 CoV에 대한 SARS-CoV-2에 대한 효과적인 억제제가 있는지 여부 (및 코로나바이러스 패밀리 바이러스가 하나의 펩티드에 의해 억제될 수 있는지 여부)를 알 수 있을 것이다. 본 발명자들은 펩티드의 억제 활성에 대한 분자적 기초 및 펩티드 설계를 가이드하는 데 유용한 구조적 및 안정성 특성 및 억제 효능 사이의 상관관계에 대한 양호한 이해를 수득할 것이다. 제안된 연구의 결과로서, 본 발명자들은 본원에 제시된 데이터 및 공개된 데이터를 기반으로 효과적인 예방적 양생법이 달성될 것이라고 확신한다. 감염-후 치료법을 개발하는 것은 더 어렵지만; 그러나, 예방 자체가 매우 중요할 것이다. 의료 종사자는 쉽게 투여 (예컨대, 1 일 1 회 i.n.)할 수 있고 (장기 백신 전략 대비) 즉시 24-시간 이상 동안 효과가 있기 때문에, 예방적 접근법으로부터의 직접적인 이익을 얻을 것이다. 위험에 처한 사람들은 또한 이러한 예방적 치료로부터 이익을 얻을 것이다. 이 프로젝트의 종결 시, (1) SARS-CoV-2 펩티드 융합 억제제를 식별하고; (2) 인 비트로 및 엑스 비보에서 항바이러스 활성을 최적화하고; (3) 관련 동물 모델에서 이러한 신규 융합 억제제의 효험을 테스트할 것이다.
실시예 7 SARS-CoV-2 HRC 펩티드 융합 억제제의 인 비보 생체분포 및 독성의 분석.
본 발명자들은 SARS-CoV-2 C-펩티드의 항-SARS-CoV-2 효능, 프로테아제 저항성, 및 약동학적 특성을 결정할 것이다. 본 발명자들의 목표는 HRC 펩티드가 인 비보에서 효과적인 농도에 도달하도록 하고, (i) 최소 투여량 및 (ii) 이를 유지하는 데 필요한 투여 빈도를 평가하는 것이다. 본원에서 본 발명자들은 또한 잠재적인 부작용 및 약물 클리어런스의 역학을 평가하였다.
유사한 펩티드 억제제에 대해 이전에 수행한 바와 같이 마우스에서 HRC 펩티드의 약동학 (PK)을 평가할 것이다. 마우스에서 기관내 (i.t.) 전달은 i.n. 전달에 비해 일관된 결과를 제공하며, 이는 생체분포 연구를 돕고 필요한 경우 기도를 통한 전달을 나타내는 예방적 연구에 사용될 것이다. 본 발명자들은 4 개의 펩티드를 평가할 것이다. 마우스 (그룹당 6 마리, 성별을 변수로서 포착하기 위한 수컷 3 마리 + 암컷 3 마리)에 피하 (s.q.), 복강내 (i.p.), 비강내 (i.n) 및 (i.t)로 주사할 것이다 (초기 4 가지 경로 모두를 테스트할 것임). 본 발명자들의 예비 데이터는 i.p. 전달이 MERS 치료에 효과적임을 나타낸다 (도 7 참고). 이제 본 발명자들은 i.p.를 s.q., i.n. 및 i.t와 비교할 것이다. 동물에 융합 억제성 펩티드 (6 mg/kg)를 접종하고, 12, 24, 36 및 48 시간 후에 희생시킬 것이다. 혈청 및 장기 (폐, 간, 비장 및 뇌)를 수집할 것이다. 장기를 분할하여, 면역형광을 위해 드라이아이스에서 차가운 이소펜탄으로 동결하거나 반-정량적 ELISA 분석을 위해 균질화할 것이다.
면역형광: 저온-절편을 특이적 토끼 항-SARS-Cov-2 HRC 항체 (본 발명자들이 정기적으로 수행한 것처럼 계약 회사를 사용하여 생성할 것임)로 염색할 것이다. 조직 절편을 공초점 현미경을 사용하여 분석할 것이다.
생체분포 연구를 위한 ELISA: 장기를 "BeadBug" 균질화기를 사용하여 균질화할 것이다. 조직 샘플 및 혈청의 펩티드 농도를 이전에 수행된 바와 같이 결정할 것이다5,7,8. 표준 곡선을 테스트 샘플과 동일한 ELISA 조건을 사용하여 선두 펩티드에 대해 확립할 것이다 (이는 이전에 사용한 LC/MS/MS보다 더 민감한 것임을 주목한다).
마우스에서 SARS-CoV-2 C-펩티드 독성의 평가: 개선된 SARS-CoV-2 펩티드의 독성 및 용량 내약성을 평가하기 위해 (최선의 생체분포 프로파일을 갖는 펩티드에 대한) 마우스에서의 급성 전신 독성 테스트를 수행할 것이다. 목적-사육 비근교계(outbred) 마우스 (n= 그룹당 6 마리, 수컷 3 마리 및 암컷 3 마리)는 5, 20 또는 200 mg/kg의 융합 억제성 C-펩티드의 단일 s.q. 주사를 받을 것이다. Harlan 등용적 식염수가 대조군으로서 역할을 할 것이다. 동물을 생존 및/또는 고통의 징후에 대해 면밀히 모니터링할 것이다. 15-일 독성 연구의 경우, 동물에 연속 15 일 동안 펩티드 (20 mg/kg)를 s.q. 접종하고, 매일 모니터링할 것이다. 만성 독성의 경우, 펩티드를 30 일 (즉, 8 회 접종) 또는 60 일 (즉, 16 회 접종) 동안 20 mg/kg의 용량으로 매주 2 회 마우스 (n = 그룹당 6 마리)에 s.q. 및 i.n. 투여할 것이다. 30 일차 및 60 일차에, 동물을 신체 및 장기 중량의 측정 및 육안적 병리학적 검사 (기재된 바와 같음; 5,7,52-54)뿐만 아니라 조직병리학을 위해 희생할 것이다. 대조군과 비교하여 처리군의 평균의 통계적 유의성을 일원 분산 분석에 의해 분석한 다음, Prism 프로그램 (Graphpad, San Diego)을 사용한 Dunnett의 다중 비교 테스트에 의해 분석할 것이다. 상이함은 p < 0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주된다.
이들 실험은 마우스에서 SARS-CoV-2 펩티드 억제제의 치료적 용량 및 총 생체분포에 대한 유효 반감기, 및 (본 발명자들이 예상하는 바와 같이) SARS-CoV-2 펩티드 융합 억제제가 가능한 치료적 용량에서 비-독성인지 여부를 결정할 것이다. 더 강력한 억제제는 더 낮은 투여량을 허용할 것이다. 독성을 나타내지 않은 펩티드만을 효험 연구로 진행할 것이다. 본 발명자들은 상이한 전달 경로 (s.q., i.p., i.t. 및 i.n.)의 조합이 생체분포 프로파일 및 최소한의 유해 부작용을 갖는 사용 용이성 간에 유리한 균형을 산출할 수 있다는 가능성을 고려한다. 점막 표면으로의 전달 (예컨대, i.n./i.t.)은 예방적으로 치료하는 쉽고 효과적인 방법이 될 것이며, 이 전략은 (예컨대, 의료 제공자를 보호하기 위해) 현장 또는 병원에서 적용가능할 것이다. 중환자 또는 i.n. 의약에 내약성일 수 없는 기타 환자의 경우, 비경구 투여가 바람직할 것이다. 본 발명자들은 큰 부피 (즉, 50 ul)를 이용한 i.n.이 일관된 폐 전달을 초래할 것임을 보여줄 것으로 예상하며10, 이는 i.t.가 기도를 통한 전달을 모방하는 것으로 나타났기 때문에 i.t.와 비교하여 평가될 것이다. 이는 (특히 예방을 위해) 모든 동물이 i.n을 통해 일관된 투여량을 받아야 하기 때문에, 인 비보 시험감염이 중요할 것이다. i.n이 일관되게 i.t.와 유사한 분포를 초래하지 않는 경우, 본 발명자들은 적어도 단일 예방적 용량에 대해 i.t.를 고려할 것이다. 이로부터 본 발명자들은 폐에서 가장 긴 생체분포를 기반으로 하는 펩티드를 선택할 것이다.
펩티드 면역원성 연구: 반복된 용량 독성 연구를 실시할 때 펩티드 투여와 연관된 항체의 측정을 수행할 것이다. 항-펩티드 항혈청은 위에 기재된 만성 독성 연구 동안 생성된 항체를 검정하는 데 사용할 것이다. 본 발명자들은 약동학, 유해 효과의 발생률 및/또는 중증도, 보체 활성화 또는 면역 복합체 형성 및 침착과 관련된 병리학적 변화에 대한 항체 반응의 효과를 평가하려고 시도할 것이다.
실시예 8 페럿 모델.
마우스 외에도, 본 발명자들은 상이한 동물 모델이 설명되고 이용가능하게 됨에 따라 이들을 또한 사용할 것이다 (www.sciencemag.org/news/2020/04/mice-hamsters-ferrets-monkeys-which-lab-animals-can-help-defeat-new-coronavirus).
본 발명자들이 사용할 제1 동물 모델은 본 발명자들의 프로토타입 펩티드가 감염된 동물에서 감염되지 않은 직접 접촉자로의 SARS-CoV-2의 직접 전파를 예방하는지 여부를 평가하기 위한 페럿 (Kim et ah, Infection and Rapid Transmission of SARS-CoV-2 in Ferrets, Cell Host & Microbe (2020))이다. 페럿은 예방 및 전파 연구에 이상적인 모델이다. 이 동물은 SARS-CoV-2를 감염되지 않은 페럿에게 직접 접촉에 의해 또는 케이지에서 케이지로 매우 용이하게 전파시킨다. (Kim et al.) 페럿을 점비액으로 처리하고, SARS-CoV-2 감염된 접촉 동물과 접촉하는 동안 감염으로부터의 보호에 대해 평가할 것이다. 모든 직접 접촉자는 2 일 이내에 감염된다. 페럿을 점비액으로 처리하고, SARS-CoV-2 감염된 접촉 동물과 접촉하는 동안 감염으로부터의 보호에 대해 평가할 것이다 (도 29).
실시예 9 인간 시험
본 발명자들은 동물 테스트로부터 허용가능한 결과를 얻은 후, 먼저 의료 종사자 및 기타 최초 대응자에 대한 인간의 안전/효험을 확인한다.
서열 목록
서열번호 1 (야생형 SARS-CoV-2-HRC)
Figure pct00005
서열번호 2 (펩티드 1, 변형된 SARS-CoV-2-HRC)
Figure pct00006
서열번호 3 (펩티드 2, 변형된 SARS-CoV-2-HRC)
Figure pct00007
서열번호 4 (펩티드 4, 에볼라 바이러스 GP 2 로부터 유래됨)
Figure pct00008
서열번호 4 (펩티드 5, 에볼라 바이러스 GP 2 로부터 유래됨)
Figure pct00009

Claims (32)

  1. 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 펩티드.
  2. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 그러나 100% 미만의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항의 펩티드 및 지질 태그를 포함하는, 지질-펩티드 융합체.
  4. 제3항에 있어서,
    지질 태그는 콜레스테롤, 토코페롤 또는 팔미테이트인, 지질-펩티드 융합체.
  5. 제1항 또는 제2항의 펩티드, 지질 태그 및 스페이서를 포함하는, 지질-펩티드 융합 억제제.
  6. 제5항에 있어서,
    스페이서는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는, 지질-펩티드 융합 억제제.
  7. 제6항에 있어서,
    스페이서는 PEG4를 포함하는, 지질-펩티드 융합 억제제.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    지질 태그는 콜레스테롤, 토코페롤 또는 팔미테이트인, 지질-펩티드 융합 억제제.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 투과성 펩티드 서열(CPP)을 추가로 포함하는, 지질-펩티드 융합 억제제.
  10. 제9항에 있어서,
    CPP는 HIV-TAT인, 지질-펩티드 융합 억제제.
  11. 제1항 또는 제2항의 펩티드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약학 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항의 펩티드, 지질 태그 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    지질 태그는 콜레스테롤, 토코페롤 또는 팔미테이트인, 약학 조성물.
  14. 제1항 또는 제2항의 펩티드, 지질 태그, 스페이서 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    스페이서는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는, 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    스페이서는 PEG4를 포함하는, 약학 조성물.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    지질 태그는 콜레스테롤, 토코페롤 또는 팔미테이트인, 약학 조성물.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 투과성 펩티드 서열(CPP)을 추가로 포함하는, 약학 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    CPP는 HIV-TAT인, 약학 조성물.
  20. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드, 지질 태그, 스페이서 및 CPP를 포함하는 SARS-COV-2(COVID-19) 지질-펩티드 융합 억제제, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, SARS-COV-2(COVID-19) 항바이러스 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    펩티드는 서열번호 2 및 서열번호 3으로부터 선택되는, SARS-COV-2(COVID-19) 항바이러스 조성물.
  22. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 80% 초과의 상동성을 갖는 펩티드, 지질 태그, 스페이서, CPP 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 항바이러스 약학 조성물을 COVID-19의 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, COVID-19의 치료 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    지질 태그는 콜레스테롤, 토코페롤 또는 팔미테이트인, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서,
    항바이러스 약학 조성물은 기도 또는 피하로 투여되는 것인, 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    항바이러스 약학 조성물은 비강내 투여되는 것인, 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    항바이러스성 약학 조성물은 점비액 또는 스프레이로서 투여되는 것인, 방법.
  27. 서열번호 4 및 서열번호 5로부터 선택된 펩티드, 지질 태그 및 CPP를 포함하는 에볼라 지질-펩티드 융합 억제제, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 에볼라 항바이러스 조성물.
  28. 제27항에 있어서,
    스페이서를 추가로 포함하는, 에볼라 항바이러스 조성물.
  29. 서열번호 4 및 서열번호 5로부터 선택된 서열과 80% 초과의 상동성을 갖는 펩티드, 지질 태그, CPP 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 항바이러스 약학 조성물을 에볼라의 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 에볼라의 치료 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    펩티드는 스페이서를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서,
    지질 태그는 콜레스테롤, 토코페롤 또는 팔미테이트인, 방법.
  32. 제22항 또는 제23항에 있어서,
    항바이러스 약학 조성물은 기도 또는 피하로 투여되는 것인, 방법.
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