TW202229316A - 肽、sars脂質-肽融合體、sars脂質-肽融合抑制劑、藥物組成物、sars-cov-2(covid-19)抗病毒組成物及用途 - Google Patents
肽、sars脂質-肽融合體、sars脂質-肽融合抑制劑、藥物組成物、sars-cov-2(covid-19)抗病毒組成物及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本文闡述了一種組成物以及用脂質-肽融合抗病毒治療預防COVID-19(COVID-19)的方法。
Description
本申請案主張下列美國臨時申請案的優先權:於2020年10月14日提出申請的美國臨時申請案第63/091915號;於2020年10月29日提出申請的美國臨時申請案第63/107429號;於2021年1月19日提出申請的美國臨時申請案第63/139302號及第63/139306號;於2021年2月2日提出申請的美國臨時申請案第63/144606號;以及於2021年2月3日提出申請的美國臨時申請案第63/145453號,所有該些申請案的內容全文併入本案供參考。
本文引用的所有專利、專利申請案及出版物的內容全文併入本案供參考。該些出版物的揭露內容全文特此併入本申請案供參考。
本專利揭露包含受版權保護的材料。版權所有者不反對任何人摹真複製出現在美國專利商標局(U.S. Patent and Trademark Office)專利文件或記錄中的專利文件或專利揭露,但保留任何及所有版權。
政府支持
本發明是在政府的支持下,由美國國立衛生研究院(National Institutes of Health)授予的資助項目AI114736及AI121349完成的。政府對本發明有一定的權利。
包括SARS病毒SARS-CoV-2SARS-CoV-2(COVID)病毒在內的冠狀病毒造成的感染,需要病毒包膜與肺細胞膜之間的膜融合。融合過程由病毒的包膜糖蛋白(亦稱為刺突蛋白(spike protein)或S)介導。目前尚無預防或治療受感染個體的治療方案。新出現的致病性病毒SARS-CoV-2(COVID-19(COVID-19)呼吸道疾病的病因)對人類健康及社會秩序構成全球性威脅。因此,考慮到當前COVID-19的大流行,開發針對該些冠狀病毒(尤其是SARS-CoV-2)的有效抗病毒治療,不僅在國內,而且在全球都是重中之重。
在某些態樣中,本發明提供了一種肽;所述肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」,且所述肽的N-末端部分選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。在某些態樣中,本發明提供了一種肽;所述肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」,且所述肽的N-末端部分與選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的序列具有大於80%、85%、90%、95%但小於100%的同源性。
在某些態樣中,SARS脂質-肽融合體包括脂質標籤;其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的肽;或其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分與選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的序列具有大於80%、85%、90%、95%但小於100%的同源性的肽。
在一些實施例中,脂質標籤為膽固醇、生育酚或棕櫚酸酯。在一些實施例中,脂質標籤為膽固醇。
在某些態樣中,SARS脂質-肽融合抑制劑包括脂質標籤;間隔;其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的肽;或其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分與選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的序列具有大於80%、85%、90%、95%但小於100%的同源性的肽。
在一些實施例中,間隔為聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)。在一些實施例中,間隔為PEG
4、PEG
11或PEG
24。在一些實施例中,脂質標籤為膽固醇、生育酚或棕櫚酸酯。在一些實施例中,脂質標籤為膽固醇。
在一些實施例中,SARS脂質-肽融合抑制劑具有一個肽部分、一個間隔部分及一個脂質標籤。在一些實施例中,抑制劑具有二個肽部分、二個間隔部分及一個脂質標籤。術語「連接體(linker)」與「間隔(spacer)」在本申請案中可互換使用。
在某些態樣中,藥物組成物包括其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的肽;或其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分與選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的序列具有大於80%、85%、90%、95%但小於100%的同源性的肽;及藥學上可接受的賦形劑。
在某些態樣中,藥物組成物包括其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的肽;或其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分與選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的序列具有大於80%、85%、90%、95%但小於100%的同源性的肽;脂質標籤;及藥學上可接受的賦形劑。
在一些實施例中,脂質標籤為膽固醇、生育酚或棕櫚酸酯。
在某些態樣中,藥物組成物包括其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的肽;或其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分與選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的序列具有大於80%、85%、90%、95%但小於100%的同源性的肽;脂質標籤;間隔;及藥學上可接受的賦形劑。
在一些實施例中,間隔為聚乙二醇(PEG)。在一些實施例中,間隔為PEG
4、PEG
11或PEG
24。在一些實施例中,脂質標籤為膽固醇、生育酚或棕櫚酸酯。
在一些實施例中,藥物組成物中的SARS脂質-肽融合抑制劑具有一個肽部分、一個間隔部分及一個脂質標籤。在一些實施例中,抑制劑具有二個肽部分、二個間隔部分及一個脂質標籤。
在某些態樣中,SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑。所述抑制劑更包括二個SEQ ID NO:1部分、二個PEG
4部分、一個膽固醇標籤及藥學上可接受的賦形劑。在一些實施例中,每個PEG
4在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接所述膽固醇標籤。
在某些態樣中,SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑。所述抑制劑更包括一個SEQ ID NO:1部分、一個PEG
4部分、一個膽固醇標籤及藥學上可接受的賦形劑。在一些實施例中,PEG
4在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接所述膽固醇標籤。
在某些態樣中,本發明提供了一種預防COVID-19的方法,所述方法包括給需要的受試者施用抗病毒藥物組成物。所述藥物組成物包括其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的肽;或其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分與選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的序列具有大於80%、85%、90%、95%但小於100%的同源性的肽;脂質標籤;間隔;及藥學上可接受的賦形劑。
在一些實施例中,脂質標籤為膽固醇、生育酚或棕櫚酸酯。
在某些態樣中,本發明提供了一種預防COVID-19的方法,所述方法包括給需要的受試者施用抗病毒藥物組成物。所述藥物組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑更包括二個SEQ ID NO:1部分、二個PEG
4部分、一個膽固醇標籤,其中每個PEG
4在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇。
在某些態樣中,本發明提供了一種預防COVID-19的方法,所述方法包括給需要的受試者施用抗病毒藥物組成物。所述藥物組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑更包括一個SEQ ID NO:1部分、一個PEG
24部分、一個膽固醇標籤,其中PEG
24在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇。
在一些實施例中,抗病毒藥物組成物經氣道或皮下施用。在一些實施例中,抗病毒藥物組成物經鼻內施用。在一些實施例中,抗病毒藥物組成物以滴鼻劑或噴霧劑的形式施用。在一些實施例中,抗病毒藥物組成物以鼻用粉末形式施用。
在一些實施例中,抗病毒藥物組成物施用於受試者至少二次。在一些實施例中,在受試者暴露於SARS-CoV-2之前進行至少一次施用。在一些實施例中,所有施用皆在受試者暴露於SARS-CoV-2之前進行。在一些實施例中,抗病毒藥物組成物每天施用。
在一些實施例中,抗病毒藥物組成物施用於受試者一次。在一些實施例中,施用發生在受試者暴露於SARS-CoV-2之前。
在一些實施例中,抗病毒藥物組成物與一或多種另外的抗病毒物質一起施用於有此需要的受試者。在一些實施例中,至少一種另外的抗病毒物質靶向SARS-CoV-2生命週期的不同於SARS
HRC肽的態樣。
在一些實施例中,肽在受試者的上呼吸道及下呼吸道二者中皆達到生物有效濃度。在一些實施例中,肽在受試者的肺中達到生物有效濃度。在一些實施例中,肽在受試者血液中達到生物有效濃度。
在一些實施例中,所述方法防止將由包含刺突蛋白的SARS-CoV-2病毒體引起的COVID-19,其中所述刺突蛋白的序列不同於SEQ ID No:3。在一些實施例中,SARS-CoV-2選自SARS-CoV-2 S247R、SARS-CoV-2 D614G、SARS-CoV-2 S943P及SARS-CoV-2 D839Y組成的群組。在一些其他實施例中,SARS-CoV-2選自SARS-CoV-2 α變體、β變體、γ變體、δ變體及λ變體組成的群組。
在某些態樣中,本發明提供了一種降低SARS-CoV-2感染受試者細胞的風險的方法。所述方法包括施用有效量的SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物以抑制細胞的SARS-CoV-2感染。SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑包括二個SEQ ID NO:1部分、二個PEG
4部分、一個膽固醇標籤。每個PEG
4可在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇標籤。作為另外一種選擇,SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑包括一個SEQ ID NO:1部分、一個PEG
24部分、一個膽固醇標籤。PEG
24可在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇。
在某些態樣中,其中SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑包括二個SEQ ID NO:1部分、二個PEG
4部分、一個膽固醇標籤,鼻內施用所述抗病毒組成物在施用後1小時在受試者的鼻甲中及肺中產生等效水準的SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑。若二個水準(例如,脂質-肽融合抑制劑的濃度水準)具有相同的數量級,或者其中一個水準在另一個水準的25%以內,或者其中一個水準在另一個水準的50%以內,則二個水準是等效的。在一些實施例中,鼻內施藥後在受試者的肺及鼻甲二者中維持等效水準的SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑達8小時。在一些實施例中,鼻內施藥後在受試者的肺及鼻甲二者中維持等效水準的SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑達24小時。在一些實施例中,鼻內施藥後在受試者的肺及鼻甲二者中維持等效水準的SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑達48小時。
在某些態樣中,本發明提供了一種降低受試者COVID-19風險的方法。所述方法包括施用有效量的SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物以抑制細胞的SARS-CoV-2感染。SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑包括二個SEQ ID NO:1部分、二個PEG
4部分、一個膽固醇標籤。每個PEG
4可在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇標籤。作為另外一種選擇,SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑包括一個SEQ ID NO:1部分、一個PEG
24部分、一個膽固醇標籤。PEG
24可在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇。
在某些態樣中,本發明提供了一種降低受試者死於COVID-19的風險的方法。所述方法包括施用有效量的SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物以抑制細胞的SARS-CoV-2感染。SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑包括二個SEQ ID NO:1部分、二個PEG
4部分、一個膽固醇標籤。每個PEG
4可在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇標籤。作為另外一種選擇,SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑包括一個SEQ ID NO:1部分、一個PEG
24部分、一個膽固醇標籤。PEG
24可在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇。
在一些實施例中,所述方法預防可能由包含刺突蛋白的SARS-CoV-2病毒體引起的COVID-19,其中所述刺突蛋白的序列不同於SEQ ID NO:3。在一些實施例中,SARS-CoV-2選自SARS-CoV-2 S247R、SARS-CoV-2 D614G、SARS-CoV-2 S943P及SARS-CoV-2 D839Y組成的群組。在一些其他實施例中,SARS-CoV-2選自SARS-CoV-2B α變體、β變體、γ變體、δ變體及λ變體組成的群組。
圖 1 : SARS-CoV-2 刺突( S ) 糖蛋白結構域的架構及結構。示出了SARS-CoV-2 S的簡化示意圖。繪示了N-末端結構域(N-terminal domain,NTD)、受體結合結構域(receptor-binding domain,RBD)、融合肽(fusion peptide,FP)、N-末端七肽重複區(N-terminal heptad repeat,HRN)、C-末端七肽重複區(C-terminal heptad repeat,HRC)、跨膜(transmembrane,TM)結構域及胞質尾區(cytoplasmic tail,CP)結構域。重複區HRN及HRC在兩端互相識別,並咬扣在一起,形成折疊結構。融合抑制肽與重複區結合並阻止折疊結構的形成,從而阻斷病毒融合及進入。
圖
2
:冠狀病毒感染及細胞進入。
圖 3 :脂質修飾的 HRC 肽阻斷早期及潛伏性二者的冠狀病毒進入。這是使用我們的脂質共軛的MERS衍生肽獲得的結果的示意圖。圖來自帕克(Park)及加拉格爾(Gallagher),脂質化增加冠狀病毒融合抑制肽的抗病毒活性(Lipidation increases antiviral activities of coronavirus fusion-inhibiting peptides),病毒學(Virology)2017;511,9-18,圖文摘要(Graphic Abstract)處。
圖 4 : SARS-CoV-2 S 蛋白( PDB 6LXT ) HRC (紅色)結構域及 HRN (藍色)結構域形成的 6HB 組裝( assembly )的晶體結構。在HRC中,注意中心螺旋及兩側的延伸段。
圖 5 : SARS-CoV-2 S 蛋白 HRC 結構域序列(頂部),兩端示出編號,如肽SARS所示。二個「h」符號表示螺旋段的邊界。相較於肽SARS,肽SARSMod含有七個α-胺基酸殘基變化。
圖 6 的 A 至 B :抑制 SARS-CoV-2 刺突( S )介導的融合的肽 - 脂質共軛物。(A)顯示了SARS-CoV-2 S蛋白的功能結構域:受體結合結構域(RBD)及七肽重複區(HRN及HRC)。(B)源自SARS-CoV-2 S的HRC結構域的肽序列。(C)在細胞-細胞融合分析中評估的脂質標記SARS-CoV-2抑制肽的單體及二聚體形式。
圖 7 的 A 至 E :藉由 MALDI-TOF MS 驗證共軛物的特性。(A)SARS
HRC-PEG
4-chol的MALDI。理論值:5170.8 Da;觀測值5170.1 Da。(B)[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol的MALDI。理論m/z:10,335.4 Da,觀測值10,339.10 Da。(C)[SARS
HRC]
2-PEG
11的MALDI。理論m/z:9841.0 Da;觀測m/z: 9,839.40 Da。(D)SARS
HRC-chol的MALDI。理論m/z:4923.64 Da;觀測值4923.74 Da。(E)SARS
HRC-PEG
24-chol的MALDI。理論m/z:6051.31 Da;觀測值6053.48 Da。
圖 8 的 A 至 C :不同 SARS 脂質 - 肽融合體的體外效力。(A)使用不同抑制肽的細胞-細胞融合分析。顯示了六種不同的SARS-CoV-2專一性肽及對照HPIV3專一性肽在濃度增加時的抑制百分比。抑制百分比計算為存在特定濃度抑制劑時的相對發光單位與不存在抑制劑時的相對發光單位之比,針對背景發光進行了校正。%抑制 = 100 x [1 -(在X下的發光 - 背景)/(在抑制劑不存在下的發光 - 背景)]。[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol脂肽與SARS
HRC-PEG
4-chol脂肽的結果之間的差異具有統計學意義(二因子變異數分析(Two-way ANOVA),p<0.0001)。(B)[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol肽對SARS-CoV-2變體(SARS-CoV-2 S247R、SARS-CoV-2 D614G、SARS-CoV-2 S943P及SARS-CoV-2 D839Y)、MERS-CoV-2及SARS-CoV的融合抑制活性。(C)[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol肽對另外最近出現的SARS-CoV-2變體(SARS-CoV-2 D614G、SARS-CoV-2 α(B 1.1.7)及SARS-CoV-2 β(B 1.351))、MERS-CoV-2及SARS-CoV的融合抑制活性。(A、B及C)中的資料為三個獨立實驗的平均值±平均值標準誤差(standard error of the mean,SEM),曲線代表四參數劑量-反應模型。
圖 9 的 A 至 B :添加細胞穿透肽序列不會增加 [SARS
HRC-PEG
4]
2-chol
的抗病毒活性。(A)TAT-SARS比較 - 在VeroE6細胞中進行的肽療效比較。(B)TAT-SARS比較 - 在VeroE6-TMPRSS2細胞中進行的肽療效比較。在二個圖中,VeroE6細胞及VeroE6-TMPRSS2細胞的感染抑制百分比隨著[SARSHRC-PEG
4]
2-chol(淺藍色線)及[TAT-SARSHRC-PEG
4]
2-chol(深藍色線)濃度的增加而增加。
圖 10 的 A 至 B :病毒 - 宿主細胞膜融合機制的模型。(A)所提出的病毒包膜上的S與宿主細胞膜上的Ace2之間相互作用導致膜融合的模型。(B)所提出的二聚體脂肽錨定在宿主細胞膜中,並與病毒S蛋白相互作用,從而抑制S介導的融合。
圖 11 的 A 至 C : [SARS
HRC- PEG
4]
2-chol
對 SARS-CoV-2 抑制的設計及專一性。(A)[SARS
HRC- PEG
4]
2-chol的化學結構。(B)證實[SARS
HRC- PEG
4]
2-chol具有專一性,因為基於來自其他幾種人類病原體的HRC結構域的脂肽在任何測試濃度下皆不抑制S介導的融合(人類間質肺炎病毒 = HMPV;西尼羅病毒 = WNV;人副流感病毒3型 = HPIV3)。融合抑制百分比計算為存在特定濃度抑制劑時的相對發光單位與不存在抑制劑時的相對發光單位之比,並針對背景發光進行了校正。資料為平均值±標準差(standard deviation,SD)。(C)圖11的B中評估的相應肽的序列。
圖 12 的 A 至 E :體內生物分佈評定。(A,B)小鼠皮下(subcutaneously,SQ)注射[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol及SARS
HRC-PEG
24;在施藥後1、8及24小時採集肺及血液。使用ELISA法量測肺勻漿及血漿樣本(肽處理的n=3或4)中的脂肽濃度(y軸)。n=1模擬處理的小鼠被包括作為陰性對照。對於每個ELISA點,實驗進行三次。中間值由水平條表示。(C,D)鼻內施藥後進行的類似實驗。(E)hACE2轉基因小鼠生物分佈實驗的實驗設計。向小鼠鼻內(intranasally,IN)接種[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol及SARS
HRC-PEG
24,並在施藥後1、8及24小時採集肺及血。
圖 13 :用抗 SARS-HRC 抗體(紅色)對 [SARS
HRC-PEG
4]
2-chol
處理(或媒液處理)小鼠的肺分佈進行染色,並用DAPI(藍色)複染細胞核。相較於該些媒液處理的動物,在接種後(HPI)1、8、24小時,影像證實[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol在經處理動物的肺切片中廣泛分佈。(A)肺切片掃描,比例尺 = 500微米;(B)40X影像,比例尺 = 50微米;(C)抗體專一性測試。僅用二級抗體染色的[SARS
HRC-PEG
4]2-chol處理小鼠的肺切片未顯示任何交叉反應性訊號。
圖 14 的 A 至 B :體內生物分佈評定。向小鼠鼻內注射(IN)了(A)[SARS
HRCPEG
4]
2-chol或(B)SARS
HRC-PEG24。在給藥後1、8、24及48小時採集器官及血液(n = 2至6只小鼠)。採用ELISA法量測肺勻漿、鼻甲、血漿、腦、脾、腎及肝樣本中脂肽的濃度(y軸)。中位值用水平條表示,檢出限用虛線表示。從圖中可看出,二聚體脂質-肽融合抑制劑在鼻甲中及肺中的生物分佈相當,在鼻內施藥後1、8、24及48小時保持等效濃度。單體脂質-肽融合抑制劑的生物分佈與二聚體顯著不同,施藥後1、8、24及48小時在鼻甲中觀察到的單體水準低於肺。
圖 15 :離體細胞毒性評定。使用MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)分析來測定人氣道上皮(human airway epithelial,HAE)細胞中[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol、SARS
HRC-PEG
4-chol及SARS
HRC-PEG
24-chol的毒性。即使在所測試的最高濃度(100 μM),所觀測到的所有脂肽的毒性皆小於30%。基於缺乏劑量反應及此離體模型固有的可變性,我們認為30%為此毒性分析的可變性範圍。使用環己醯亞胺(cycloheximide,CHE,在二級x軸上0.1、1及10毫克/毫升,紫色)作為陽性對照。
圖 16 的 A 至 C : [SARS
HRC-PEG
4]
2-chol
及 [HPIV3
HRC- PEG
4]
2-chol
肽對感染性 SARS-CoV-2 進入的抑制。(A,B)在[SARS
HRC-
PEG
4]
2-chol(紅線)及[HPIV3
HRC-PEG
4]
2-chol(灰線)濃度增加下,在VeroE6及VeroE6-TMPRSS2細胞上顯示感染抑制百分比。並行測試了DMSO調配的母液(A)及蔗糖調配的母液(B)。顯示了三次測試的平均值±SEM,虛線顯示50%及90%抑制。此外,藉由抑制傳染性HPIV3進入證實了[HPIV3
HRC- PEG
4]
2-chol的效力(Vero細胞上的綠色虛線)。(C)藉由對A及B中顯示的資料執行具有可變斜率的四參數非線性回歸來計算[SARS
HRC- PEG
4]
2-chol及[HPIV3
HRC- PEG
4]
2-chol對SARS-CoV-2的抑制濃度50%及90%。括號間顯示的是95%置信區間。
圖 17 的 A 至 B :抑制性脂肽( FIP )、單株抗體( mAb )或接種後血清對野生型 SARS-CoV-2 及引發關注的變體( VOC )進入的效力。在8小時傳染性病毒進入分析中,在VeroE6-TMPRSS2細胞(A)及Calu3細胞(B)中測試了2種FIP、11種mAb及8種接種後血清的效力。使用四參數劑量反應模型計算IC50值,對數轉換為0至9的範圍內(反映稀釋系列),並將每種抑制劑按其類別(FIP、mAb、血清)分類為相對不同的效能。抑制劑按效力排序,並顯示了每種抑制劑及病毒組合的IC50值。FIP(橙色)的IC50值以奈莫耳(nM)顯示,mAb(黑色)的IC50值以微克/毫升顯示,且接種後血清(紫色)的IC50值以稀釋度顯示。對每一類而言皆包括一個陰性對照,如線下所示。
圖 18 的 A 至 B :抑制性脂肽( FIP )、單株抗體( mAb )或接種後血清對抗野生型 SARS-CoV-2 及引發關注的變體( VOC )進入的效力。在8小時傳染性病毒進入分析中,在VeroE6-TMPRSS2細胞(A)及Calu3細胞(B)中測試了2種FIP、11種mAb及8種接種後血清的效力。IC
50值採用四參數劑量反應模型計算;符號大小表示相對反應等級。簡言之,按樣本類型(FIP、mAb、血清)及細胞類型(VeroE6-TMPRSS2或Calu3)計算經對數轉換反應範圍(最強反應至最弱反應)。所述範圍被細分為十個等級,具有相等的距離,且每個樣本被分配到該些等級其中的一個。FIP(橙色)的IC
50值以奈莫耳(nM)顯示,mAb(黑色)的IC
50值以微克/毫升表示,且接種後血清(紫色)的IC
50值以稀釋度表示。對每一類而言皆包括一個陰性對照,如線下所示。
圖 19 的 A 至 G :融合抑制肽( FIP )、單株抗體( mAb )或接種後血清對野生型 SARS-CoV-2 及 VOC 進入的抑制。在8小時傳染性病毒進入分析中,測試了2種FIP、11種mAb及8種接種後血清的效力。對於FIP(A)、mAb(B至D)濃度增加或接種後血清(E至G)稀釋度增加,顯示了VeroE6-TMPRSS2細胞中的進入抑制百分比。紅線示出野生型SARS-CoV-2,綠線示出α(B.1.1.7)變體,且藍線示出β(B. 1.351)變體。並行測試所有FIP、mAb及血清三次,並繪製平均值;曲線表示四參數劑量-反應模型。A)在0.0005 nM至5000 nM的10倍稀釋系列中測試FIP。[HPIV3
HRC-PEG
4]
2-chol(HPIV-3專一性脂肽)用作陰性對照。(B至D)在0.0003微克/毫升至20微克/毫升的5倍稀釋系列中測試mAb。使用MAb C28-10-8(麻疹病毒專一性單株抗體)作為陰性對照。根據對不同VOC的活性MAb分類為(B)對所有三種測試病毒具有活性,(C)對野生型SARS-CoV-2及α(B.1.1.7)病毒具有活性,(D)無活性。(E至G)血清以1:32至1:4096的2倍稀釋系列進行測試。使用BNT162b2 mRNA疫苗進行2次接種後三周,採集血清。使用匹配的接種前樣本作為陰性對照。
圖 20 的 A 至 B : [SARS
HRC-PEG
4]
2-chol
肽對新出現的 SARS-CoV-2 S 變體的融合抑制活性。( A )在存在不同稀釋度的肽[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol下,藉由β-半乳糖苷酶互補分析使用轉染有hACE2受體及β-半乳糖苷酶的⍵-亞單位的293T細胞評估SARS-CoV-2糖蛋白及β-半乳糖苷酶的⍺-亞單位。使用Tecan infinite M1000 pro對β-半乳糖苷酶產生的發光進行了定量。所述值為三個實驗結果的平均值(±SEM)。
( B )抑制百分比計算為存在特定濃度抑制劑時的相對發光單位與不存在抑制劑時的相對發光單位之比,並如下針對背景發光進行校正:抑制百分比 = 100 × [1 -(X下的發光 - 背景)/(不存在抑制劑時的發光 - 背景)]。資料為三個獨立實驗的平均值 ± 標準誤差(SE)(誤差線(error bar)),曲線代表三參數劑量反應模型。
圖 21 的 A 至 J : [SARS
HRC-PEG
4]
2-chol
防止體內 SARS-CoV-2 傳播。(A)實驗設計。(B,C)藉由RT-qPCR在咽喉(B)及鼻(C)拭子中檢測到的病毒負荷量。(D)來自B中報告的模擬處理警哨動物及肽處理警哨動物的基因組負荷的曲線下面積(AUC)的比較。(E)在VeroE6上藉由活病毒分離在咽拭子中檢測到的病毒負荷量。(F)藉由RT-qPCR與活病毒分離檢測到的咽喉中病毒負荷量之間的相關性。藉由IgG ELISA法測定抗S(G)抗體或抗N(H)抗體的存在。在活病毒中和測定中確定了中和抗體的存在。(I)病毒中和抗體顯示為阻斷SARS-CoV-2複製的終點血清稀釋因子。(J)在不存在S專一性抗體、N專一性抗體及中和性抗體下,用SARS-CoV-2直接接種經肽處理的動物或經模擬處理的動物僅在先前接受過肽處理的動物中導致有效感染。供體動物以灰色顯示,模擬處理動物以紅色顯示,肽處理動物以綠色顯示。符號對應於各別動物(在A中定義),並且在所有圖中一致。圖B、圖C、圖E及圖H至圖J中的折線圖連接了每個時間點的各別動物的中位值。藉由二因子變異數分析重複量測法(圖B、圖C、圖H至圖J)或曼-惠特尼(Mann-Whitney)檢定(圖D)比較模擬處理組與肽處理組。
圖 22 的 A 至 D :在雪貂中使用的肽母液的體外效力。(A,B)使用活病毒感染測定確認了SARS-CoV-2接種後1至4天(DPI,見
圖 16 的 A)用於雪貂鼻內接種的DMSO調配肽稀釋液的效力。在[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol(紅色)或模擬(藍色)濃度增加下的感染事件百分比顯示於(A)VeroE6及(B)VeroE6-TMPRSS上。模擬製劑為去離子水及等莫耳量的DMSO。藉由執行具有可變斜率的四參數非線性回歸來計算對SARS-CoV-2的50%及90%抑制濃度,所有製劑的抑制濃度皆等效。資料為來自三份肽給藥母液的平均值±平均標準誤差(SEM),模擬給藥母液以單份進行測試。(C,D)用活病毒感染測試檢測接種後1天(DPI,見
圖 19 的 A)用於雪貂鼻內接種的蔗糖調配肽稀釋液的效力。在[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol(紅色)或[HPIV3
HRC-PEG
4]
2-chol(藍色)的濃度增加下,感染事件百分比顯示在(C)VeroE6及(D)VeroE6- TMPRSS上。藉由實現具有可變斜率的四參數非線性回歸來計算對SARS-CoV-2的50%及90%抑制濃度。資料為一式三份樣本的平均值±平均標準誤差(SEM)。相較於DMSO調配的脂肽,以10毫克規模產生的蔗糖調配的脂肽獲得10至100倍高的IC50及IC90(將圖C/D與圖A/B進行比較),隨後使用體外融合分析進行確認(資料未示出)。
圖 23 的 A 至圖 23 的 B :先前進行過肽處理的動物及模擬處理的動物用 SARS-CoV-2 的激發感染。為了確認不存在抗體作為無菌保護的準確量測,對先前模擬處理或[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol處理的雪貂進行了感染性SARS-CoV-2激發(見
圖 16j)。將相同處理方案的雪貂成對重新安置在六個隔離籠中,採用5 x 10
5、5 x 10
4或5 x 10
3TCID
50/毫升(於450微升中)的SARS-CoV-2激發。對於每個劑量,對2只模擬處理的雪貂及2只肽處理的雪貂進行鼻內接種。每天藉由RT-qPCR測定咽拭子中的病毒負荷量,直至接種後7天(當實驗結束時)(A)。折線圖表示各別動物,符號對應於
圖 16 的 A中所述的符號:紅色為模擬處理的,綠色為肽處理的。(B)曲線下面積(AUC)表明,與激發劑量相對應,總基因組負荷量略有下降。由於每組僅包括2只動物,因此未進行統計。
圖 24 的 A 至 F :單劑量 [SARS
HRC-PEG
4]
2-chol
可在體內提供抗 SARS-CoV-2 傳播的保護。(A)我們使用HPIV3專一性肽作為模擬對照,評估了在合飼前2小時單次使用蔗糖調配的脂肽預防或延遲感染的可能性。(B,C)藉由RT-qPCR在咽(B)拭子及鼻(C)拭子中檢測到的病毒負荷量。(D)B中報告的[HPIV3
HRC-PEG
4]
2-chol處理警哨動物及[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol處理警哨動物的基因組負荷量曲線下面積(AUC)比較。(E)在VeroE6上藉由活病毒分離在咽拭子中檢測到的病毒負荷量。(F)藉由RT-qPCR或傳染性病毒分離測定的喉部病毒負荷量之間的相關性。傳染性病毒只能在咽拭子中分離,40-Ct > 15。供體動物以灰色顯示,模擬處理動物以紅色顯示,肽處理動物以綠色顯示。符號對應於各別動物(定義見A),並且在所有圖中一致(F中除外)。圖B、圖C及圖E中的折線圖為每個時間點的各別動物的中位值。藉由二因子變異數分析重複量測法(圖B及圖C)或曼-惠特尼測試(圖D)比較模擬處理組及肽處理組。(F)。總體上,相較於HPIV3脂肽對照組,SARS-CoV-2脂肽提供了顯著水準的保護,但保護不是絕對的,6只SARS-CoV-2肽處理動物中有2只發生突破性感染。用於施藥的脂肽的反滴定揭示,蔗糖調配的[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol脂肽以顯著低於DMSO調配的脂肽的實驗的濃度施用(
圖 17)。
圖 25 的 A 至 B :對照處理雪貂與肽處理雪貂的體重減輕無顯著差異。在用DMSO調配的肽進行的實驗(A,對應於圖
16 的 A中描述的實驗)及用蔗糖調配的肽進行的實驗(B,對應於
圖 19 的 A中描述的實驗)中,雪貂的體重隨時間保持穩定。供體動物以灰色顯示,對照處理動物以紅色顯示,[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol處理動物以綠色顯示。符號對應於
圖 16 的 A及
圖 19 的 A中描述的各別動物。折線圖為每個時間點的各別動物的中位值。藉由二因子變異數分析重複量測比較各組,未觀察到供體雪貂、模擬處理雪貂、[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol處理雪貂及[HPIV3
HRC-PEG
4]
2-chol處理雪貂之間的顯著差異(NS = 不顯著)。
圖 26 :在表達人 ACE2 受體的轉基因小鼠中 SARS 肽的體內效力。感染SARS-CoV-2病毒前,在細胞角蛋白K18(B6.Cg-Tg (K18-ACE2) 2Prlmn/J,傑克森(Jackson))啟動子的控制下,將SARS肽鼻內施於表達人ACE2受體的轉基因小鼠。用肽對小鼠進行預處理。在第21天用病毒激發動物,所有動物皆存活(資料未示出)。評估存活小鼠是否存在中和抗體,並在第14及21天顯示滴度。使用的SARS肽包括[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol(圖21)及SARS
HRC-PEG
24-chol(資料未示出)。
本發明涵蓋用於預防及治療COVID-19的脂肽分子。本發明使用設計的肽,所述肽阻斷SARS-CoV-2進入細胞並將可能預防及/或消除體內感染並防止傳播。設計的脂肽分子在抑制培養細胞及動物模型中的活SARS-CoV-2(COVID)病毒感染方面非常有效。
包括SARS-CoV-2(COVID)病毒在內的冠狀病毒造成的感染,需要病毒包膜與肺細胞膜之間的膜融合。融合過程由病毒的包膜糖蛋白(亦稱為刺突蛋白或S)介導。本發明的發明人設計了專一性脂肽構建體,藉由結合至刺突蛋白的過渡階段來抑制病毒融合及感染,從而阻止病毒的功能。重要的是,該些抗病毒劑可藉由氣道、滴鼻劑或其他鼻腔施藥方法(包括粉末)給藥,無毒,並在肺中具有良好的半衰期。它們可經鼻子及吸入施藥這一事實使得它們方便可行,便於廣泛使用。在動物模型中測試主要抗病毒劑將顯示其在預防及治療感染以及防止感染動物傳染給健康動物方面的效用,包括以滴鼻劑或噴霧劑形式治療以防止醫護人員感染。
在某些態樣中,本發明提供了一種肽;所述肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」,且所述肽的N-末端部分係選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。在某些態樣中,本發明提供了一種肽;所述肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」,且所述肽的N-末端部分與選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的序列具有大於80%、85%、90%、95%但小於100%的同源性。
在某些態樣中,SARS脂質-肽融合體包括脂質標籤;其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的肽;或其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分與選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的序列具有大於80%、85%、90%、95%但小於100%的同源性的肽。
在一些實施例中,脂質標籤為膽固醇、生育酚或棕櫚酸酯。在一些實施例中,脂質標籤為膽固醇。
在某些態樣中,SARS脂質-肽融合抑制劑包括脂質標籤;間隔;其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的肽;或其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分與選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的序列具有大於80%、85%、90%、95%但小於100%的同源性的肽。
在一些實施例中,間隔為聚乙二醇(PEG)。在一些實施例中,間隔為PEG
4、PEG
11或PEG
24。在一些實施例中,脂質標籤為膽固醇、生育酚或棕櫚酸酯。在一些實施例中,脂質標籤為膽固醇。
在一些實施例中,SARS脂質-肽融合抑制劑具有一個肽部分、一個間隔部分及一個脂質標籤。在一些實施例中,抑制劑具有二個肽部分、二個間隔部分及一個脂質標籤。術語「連接體」與「間隔」在本申請案中可互換使用。
在某些態樣中,藥物組成物包括其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的肽;或其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分與選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的序列具有大於80%、85%、90%、95%但小於100%的同源性的肽;及藥學上可接受的賦形劑。
在某些態樣中,藥物組成物包括其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的肽;或其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分與選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的序列具有大於80%、85%、90%、95%但小於100%的同源性的肽;脂質標籤;及藥學上可接受的賦形劑。
在一些實施例中,脂質標籤為膽固醇、生育酚或棕櫚酸酯。
在某些態樣中,藥物組成物包括其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的肽;或其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分與選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的序列具有大於80%、85%、90%、95%但小於100%的同源性的肽;脂質標籤;間隔;及藥學上可接受的賦形劑。
在一些實施例中,間隔為聚乙二醇(PEG)。在一些實施例中,間隔為PEG
4、PEG
11或PEG
24。在一些實施例中,脂質標籤為膽固醇、生育酚或棕櫚酸酯。
在一些實施例中,藥物組成物中的SARS脂質-肽融合抑制劑具有一個肽部分、一個間隔部分及一個脂質標籤。在一些實施例中,抑制劑具有二個肽部分、二個間隔部分及一個脂質標籤。
在某些態樣中,SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑。所述抑制劑更包括二個SEQ ID NO:1部分、二個PEG
4部分、一個膽固醇標籤及藥學上可接受的賦形劑。在一些實施例中,每個PEG
4在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接所述膽固醇標籤。
在某些態樣中,SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑。所述抑制劑更包括一個SEQ ID NO:1部分、一個PEG
4部分、一個膽固醇標籤及藥學上可接受的賦形劑。在一些實施例中,PEG
4在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇標籤。
在某些態樣中,本發明提供了一種預防COVID-19的方法,所述方法包括給需要的受試者施用抗病毒藥物組成物。所述藥物組成物包括其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的肽;或其中肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」且肽的N-末端部分與選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的序列具有大於80%、85%、90%、95%但小於100%的同源性的肽;脂質標籤;間隔;及藥學上可接受的賦形劑。
在一些實施例中,脂質標籤為膽固醇、生育酚或棕櫚酸酯。
在某些態樣中,本發明提供了一種預防COVID-19的方法,所述方法包括給需要的受試者施用抗病毒藥物組成物。所述藥物組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑更包括二個SEQ ID NO:1部分、二個PEG
4部分、一個膽固醇標籤,其中每個PEG
4在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇。
在某些態樣中,本發明提供了一種預防COVID-19的方法,所述方法包括給需要的受試者施用抗病毒藥物組成物。所述藥物組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑更包括一個SEQ ID NO:1部分、一個PEG
24部分、一個膽固醇標籤,其中PEG
24在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇。
在一些實施例中,抗病毒藥物組成物經氣道或皮下施用。在一些實施例中,抗病毒藥物組成物經鼻內施用。在一些實施例中,抗病毒藥物組成物以滴鼻劑或噴霧劑的形式施用。在一些實施例中,抗病毒藥物組成物以鼻用粉末形式施用。
在一些實施例中,抗病毒藥物組成物施用於受試者至少二次。在一些實施例中,在受試者暴露於SARS-CoV-2之前進行至少一次施用。在一些實施例中,所有施用皆在受試者暴露於SARS-CoV-2之前進行。在一些實施例中,抗病毒藥物組成物每天施用。
在一些實施例中,抗病毒藥物組成物施用於受試者一次。在一些實施例中,施用發生在受試者暴露於SARS-CoV-2之前。
在一些實施例中,抗病毒藥物組成物與一或多種另外的抗病毒物質一起施用於有此需要的受試者。在一些實施例中,至少一種另外的抗病毒物質靶向SARS-CoV-2生命週期的不同於SARS
HRC肽的態樣。
在一些實施例中,肽在受試者的上呼吸道及下呼吸道二者中皆達到生物有效濃度。在一些實施例中,肽在受試者的肺中達到生物有效濃度。在一些實施例中,肽在受試者血液中達到生物有效濃度。
在一些實施例中,所述方法防止由包含刺突蛋白的SARS-CoV-2病毒體引起的COVID-19,其中所述刺突蛋白的序列不同於SEQ ID No:3。在一些實施例中,SARS-CoV-2選自SARS-CoV-2 S247R、SARS-CoV-2 D614G、SARS-CoV-2 S943P及SARS-CoV-2 D839Y組成的群組。在一些其他實施例中,SARS-CoV-2選自SARS-CoV-2 α變體、β變體、γ變體、δ變體及λ變體組成的群組。
在某些態樣中,本發明提供了一種降低SARS-CoV-2感染受試者細胞的風險的方法。所述方法包括施用有效量的SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物以抑制細胞的SARS-CoV-2感染。SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑包含二個SEQ ID NO:1部分、二個PEG
4部分、一個膽固醇標籤。每個PEG
4可在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇標籤。作為另外一種選擇,SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑包括一個SEQ ID NO:1部分、一個PEG
24部分、一個膽固醇標籤。PEG
24可在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇。
在某些態樣中,本發明提供了一種降低受試者COVID-19風險的方法。所述方法包括施用有效量的SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物以抑制細胞的SARS-CoV-2感染。SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑包括二個SEQ ID NO:1部分、二個PEG
4部分、一個膽固醇標籤。每個PEG
4可在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇標籤。作為另外一種選擇,SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑包括一個SEQ ID NO:1部分、一個PEG
24部分、一個膽固醇標籤。PEG
24可在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇。
在某些態樣中,本發明提供了一種降低受試者死於COVID-19的風險的方法。所述方法包括施用有效量的SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物以抑制細胞的SARS-CoV-2感染。SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑包括二個SEQ ID NO:1部分、二個PEG
4部分、一個膽固醇標籤。每個PEG
4可在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇標籤。作為另外一種選擇,SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑包括一個SEQ ID NO:1部分、一個PEG
24部分、一個膽固醇標籤。PEG
24可在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇。
在一些實施例中,所述方法預防由包含刺突蛋白的SARS-CoV-2病毒體引起的COVID-19,其中所述刺突蛋白的序列不同於SEQ ID NO:3。在一些實施例中,SARS-CoV-2選自SARS-CoV-2 S247R、SARS-CoV-2 D614G、SARS-CoV-2 S943P及SARS-CoV-2 D839Y組成的群組。在一些其他實施例中,SARS-CoV-2選自SARS-CoV-2 α變體、β變體、γ變體、δ變體及λ變體組成的群組。
實例
下面提供的實例有助於更完整地理解本發明。以下實例例示得出及實施本發明的示例性模式。然而,本發明的範圍不限於該些實例中揭露的特定實施例,該些實施例僅用於說明的目的,因為可利用替代方法來獲得類似的結果。
實例 1 :一般概念 冠狀病毒感染
冠狀病毒(coronavirus,CoV)可導致危及生命的疾病。最新的疾病被世界衛生組織(World Health Organization)命名為COVID-19(coronavirus disease 2019)(縮寫為「COVID-19」)。COVID-19是由冠狀病毒株SARS-CoV-2引起的。與其前身SARS-CoV-1及中東呼吸綜合徵病毒MERS-CoV一樣,SARS-CoV-2是一種β冠狀病毒。然而,SARS-CoV-2及COVID-19顯著不同於其他冠狀病毒(如MERS)及其相應的疾病,2020年全世界都目睹了這一點。
冠狀病毒進入靶細胞的途徑
冠狀病毒利用I型融合機制以獲得進入宿主細胞的細胞質。採用I型融合機制的其他致病病毒包括人類免疫缺陷病毒(HIV)、副黏液病毒及肺病毒。病毒包膜與宿主細胞膜的合併是由三聚體病毒融合蛋白的深度結構重排驅動的;藉由抑制重排過程可阻止感染。
冠狀病毒感染需要病毒包膜與細胞膜之間的膜融合。根據細胞類型及冠狀病毒株,融合可發生在細胞表面膜處或內吞體膜中。融合過程由病毒包膜糖蛋白(S)介導,此為約1200個殘基、高度糖基化的I型整合膜蛋白,表現為大的同三聚體,每個單體具有幾個結構域(
圖 1 、圖 2)。病毒膜遠端的受體結合域(RBD)負責細胞表面附著。膜融合由近端細胞融合結構域(fusion domain,FD)介導。融合需要RBD與FD的一致行動。在病毒附著(以及某些情況下攝取)時,宿主因子(受體及蛋白酶)在FD中觸發大規模構象重排,這是由形成能量穩定的6-螺旋束(6-helix bundle,6HB)驅動的,所述6-螺旋束將蛋白質重折疊直接耦合到膜融合上。FD被認為形成由高度保守的三聚捲曲螺旋核心(coiled-coil core)組成的短暫性前髮卡(pre-hairpin)中間體,可被融合抑制肽(稱為C-末端七肽重複區、C-肽或HRC肽)靶向。
與流感HA一樣,S蛋白以三聚體形式存在於病毒體表面,並介導附著、受體結合及膜融合。到目前為止識別出的β冠狀病毒S蛋白的宿主細胞受體包括針對SARS-CoV-1的血管緊張素轉換酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)及針對MERS-CoV的二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-4,DPP4)。發現SARS-CoV-2利用人血管緊張素轉換酶2(human angiotensin-converting enzyme 2,hACE2)實施進入(且最有可能使用或可使用其他尚不清楚的受體)。S被宿主蛋白酶切割以產生S
1及S
2。受體啟動及裂解對於膜融合都是必要的。
病毒進入途徑及抑制策略
啟動融合蛋白中一系列構象變化導致膜融合的激活步驟因病毒進入細胞所用途徑而異。對於許多副黏液病毒,在受體結合時,附著糖蛋白激活融合蛋白,以使其在中性pH值下在細胞表面呈現融合就緒構象。我們及其他人已經表明,對於該些(融合在細胞膜上的)病毒,源自融合蛋白胞外結構域HRC區的C肽以不同的活性抑制病毒進入,並且脂質結合顯著增強了它們的抗病毒效力,並同時增加了它們的體內半衰期。藉由將脂質共軛的融合抑制肽靶向質膜,並藉由設計提高的HRN肽結合親和力,我們使抗病毒效力提高了幾個對數。細胞表面上脂質共軛的抑制肽直接靶向病毒融合的膜位點。藉由向脂質部分與肽之間的化合物中添加聚乙二醇(PEG)連接體(如PEG
4),我們進一步提高了共軛物的活性及效力。我們證明脂質共軛融合抑制肽對金黃地鼠及非人靈長類動物中致死性尼帕(Nipah)病毒感染、小鼠及棉鼠中麻疹病毒感染以及棉鼠中人副流感病毒3型感染的體內療效。
對於不在細胞膜上融合的病毒,通常認為C肽的靶是不可接近的。該些病毒的實例有流感病毒及埃博拉(Ebola)病毒。流感病毒的融合蛋白(血凝素蛋白;hemagglutinin protein,HA)及埃博拉病毒的融合蛋白(GP)只有在細胞內化後才被激活而融合。我們表明,我們自流感HA中獲得的脂質共軛肽可抑制流感感染,此表明基於脂質共軛的策略允許對融合在細胞內部的病毒使用融合抑制肽。我們針對流感採用的第二種策略是添加HIV-TAT(一種眾所周知的細胞穿透肽,cell-penetrating peptide,CPP),以增強對細胞內靶點的抑制作用。結合該二種策略,HA衍生肽在體內可有效對抗人流感病毒毒株。類似的策略亦產生了針對埃博拉感染的有效抗病毒C肽。
原理證明:融合脂肽
開發冠狀病毒的C肽融合抑制劑的一個主要挑戰可能是冠狀病毒的進入可遵循幾種進入途徑(
圖 2)。一些冠狀病毒株可在細胞表面融合,然而其他一些病毒株最初是內吞,且融合是在胞內體中觸發的。在某些情況下,取決於S切割位點及靶宿主細胞蛋白酶,同一菌株可經不同途徑進入。病毒可在細胞表面或細胞內部融合。
因此,冠狀病毒進入抑制劑的設計是一個挑戰。我們探索了添加促進胞內吞體定位的細胞穿透肽及脂質部分是否會增加抗病毒效力。
早期對脂質共軛抑制肽的研究表明,脂質將肽導向細胞膜,並增加抗病毒療效。在已發表的文獻中,該些結合的肽顯示出抑制冠狀病毒的早期及晚期進入株(
圖 3)。
實例 2 :源於 HRC 的 SARS
HRC (亦稱為 SARS )及 SARSMod 抗病毒肽的設計 SARSCoV-2 S 蛋白的 HRC 結構域序列
SARS-CoV-26HB組裝(
圖 4)為設計SARS-CoV-2膜融合抑制劑提供了優異的基礎。HRC結構域具有一個中心的五匝α-螺旋及在兩側側接螺旋的延伸區域。天然的HRC結構域對應於SARS-CoV-2 S蛋白的殘基1168至1203。
肽SARS(
圖 5)對應於SARS-CoV-2 HRC結構域(與SARS-CoV-1 HRC結構域相同);夏(Xia)等最近報道,在基於假病毒的細胞試驗中,肽SARS(亦稱為「D-1」或「肽D-1」)為SARS-CoV-2感染的適度抑制劑(IC
50為約1 μM)。顯示了形成中心α-螺旋的殘基。所提出的SARSMod含有7個相對於SARS的胺基酸變化(
圖 5中高亮示出),以提高溶解度。
SARS 及 SARSMod 脂質融合肽的設計
SARS-CoV-2感染需要病毒包膜與宿主細胞膜之間的膜融合,無論是在細胞表面還是在內吞體膜。融合過程由病毒包膜刺突糖蛋白S介導。病毒附著或攝取後,宿主因子會觸發S中大規模的構象重排,包括直接導致膜融合及病毒進入的重折疊步驟。與S蛋白C端高度保守的七肽重複區(HR)結構域相對應的肽(HRC肽)可阻止該種重折疊並抑制融合,從而防止感染。
我們最近闡述了一種抗SARS-CoV-2的單體SARS-CoV-2 HRC-脂肽融合抑制劑,其體外及離體療效優於先前描述的HRC衍生的融合抑制肽。我們基於SARS
HRC(亦稱SARS)及SARSMod肽序列設計了許多構建體。基本上,SARS及SARSMod肽是藉由在其C-末端連接一個甘胺酸-絲胺酸4-mer(GSGS)及一個半胱胺酸來修飾的。在構建體中進一步添加了PEG連接體(PEG
4、PEG
24或PEG
11)及膽固醇標籤。HRC肽與延伸的中間體形式S蛋白三聚體形成六螺旋束(6HB)樣組裝,從而破壞驅動膜融合的S結構重排。
[SARS HRC -PEG
4]-chol
(亦稱為「 SARS 單體」):SARS-
GSGS-C-PEG
4-Chol
[SARSMod- PEG
4]-chol
(亦稱為「 SARSMod 單體」):SARSMod-
GSGS-C-PEG
4-Chol
[SARS HRC - PEG
4]
2-chol
(亦稱為「 SARS 二聚體」):[SARS-
GSGS-C-PEG
4]
2-Chol
[SARSMod- PEG
4]
2-chol
(亦稱為「 SARSMod 二聚體」):[SARSMod-
GSGS-C-PEG
4]
2-Chol
我們還設計了另外的構建體作為上述構建體的變體。
圖 6 的 C顯示了肽的設計。如
圖 7所示,藉由MALDI-TOF MS驗證了共軛物的特性。
SARS
HRC-Chol:
SARS-Chol(無連接體)
[ SARS
HRC]
2- PEG
11 :無膽固醇、僅含PEG
11的SARS二聚體
SARS HRC– PEG
24-chol
:含PEG
24及膽固醇的SARS單體
我們先前已證明,HRC衍生抑制肽的脂質共軛顯著增加了抗病毒效力及體內半衰期,並成功利用這一策略創建了用於預防及/或治療人類副流感病毒3型、麻疹病毒、流感病毒及尼帕病毒感染的進入抑制劑。二聚化及肽整合到細胞膜二者被證明是確保呼吸道保護及防止全身脂肽播散的關鍵。鼻內施予動物的脂質共軛肽在上呼吸道及下呼吸道二者中皆達到了高且生物有效的(體內)濃度,且可設計脂質的特定性質以調節自肺至體循環及器官的轉運程度。脂質共軛亦能夠發揮抗病毒活性,該些病毒在經由內吞作用被吸收之前不會融合。在此,我們表明,SARS-CoV-2S專一性脂肽是一種有效的融合抑制劑,可防止病毒進入,且當鼻內施藥時,可完全防止SARS-CoV-2在雪貂中的直接接觸傳播。我們建議將此化合物作為候選抗病毒劑,用於人類中SARS-CoV-2傳播的暴露前或暴露後早期預防。
實例 3 : SARS 及 SARSMod 衍生的脂肽融合體的體外效力
為了提高先前評估的SARS-CoV-2 HRC-脂肽融合抑制劑的抗病毒效力,我們比較了SARS-CoV-2S衍生HRC-肽的單體及二聚體衍生物(
圖 8)。基於β-半乳糖苷酶(β-gal)的α互補作用,採用細胞-細胞融合分析法對SARS-CoV-2 HRC脂肽進行了初步功能評估,用於評定SARS-CoV-2S介導的融合體。
圖 8 的 A示出了在定量細胞-細胞融合分析中,無((SARS
HRC及[SARS
HRC]
2-PEG
11)或有附加膽固醇時,四種單體SARS-CoV-2S-衍生36-胺基酸及二種二聚體SARS-CoV-2S-衍生36-胺基酸(
圖 5 及圖 6)HRC-肽的抗病毒效力。抑制百分比對應於不存在任何抑制劑時觀察到的發光訊號抑制程度(即0%的抑制對應於最大發光訊號)。二聚化增加了非脂質化肽及其脂質化對應物二者的肽效力(
圖 8 的 A)。用作陰性對照的基於HPIV3 F蛋白HRC結構域的二聚膽固醇共軛脂肽在任何測試濃度下皆不抑制融合(
圖 8 的 A中的黑線,其他陰性對照參見
圖 11 的 B 至 C)。在單體脂肽中,含PEG
24的肽最強效。二聚體膽固醇共軛肽([SARS
HRC-PEG
4]
2-chol;
圖 8 的 A中的紅線)是在測試的圖中針對SARS-CoV-2的最有效的脂肽。
儘管SARS-CoV-2基因組總體上是穩定的,但帶有S突變的變體已經在全球範圍內傳播。該些S突變改變了細胞的傳染性(如D614G),或位於HRC肽的推定靶向結構域(如S943P)。為了確定[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol肽對一系列變異型SARS-CoV-2病毒的效力,我們檢測了由該些新出現的S蛋白突變體介導的融合抑制。此外,為了評估廣譜活性的可能性,我們評估了抗SARS-CoV及MERS-CoV(使用二肽基肽酶4(DPP4)受體攜帶細胞作為後者的靶點)的S的效力。二聚膽固醇共軛肽([SARS
HRC-PEG
4]
2-chol)亦對由幾種新出現的SARS-CoV-2變體(包括D614G)的S蛋白以及SARS-CoV及MERS-CoV的S蛋白介導的融合體產生穩健抑制(
圖 8 的 B)。最後,只要COVID-19(COVID-19)大流行仍在繼續,病原體SARS-CoV-2的基因組就在不斷進化。許多變化是短暫的,或者沒有流行病學或臨床影響,但出現了多種變體,被歸類為待觀察的變體(variant of interest,VOI))或引發關注的變體(variants of concern,VOC)。此處,為了具體研究二種VOC,即英國變體或α變體(B.1.1.7;英國)及南非變體或β變體(B.1.351;南非)(https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/more/science-and-research/scientific-brief-emerging-variants.html,繆可(Muik)2021,及吳(2021)。命名請參見https://www.who.int/en/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants/),對變體α(B.1.1.7)及β(B.1.351)重複進行了實驗(
圖 8 的 C)。我們的結論是,[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol肽對這二種變體的S蛋白介導的融合亦有很強的抑制作用。
HIV-TAT為一種已知的能增強對細胞內靶點抑制作用的細胞穿透肽(CPP)。我們之前已經表明,添加細胞穿透肽序列可增加針對靶向埃博拉病毒及流感病毒的二種肽的抗病毒活性。對於流感,僅TAT共軛肽顯示體內有效。令人驚訝的是,細胞穿透肽序列的添加並未增加[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol的抗病毒活性,如
圖 9所示。如
圖 9 的 A所示,添加TAT會降低VeroE6的療效,這是意外發現,因為在融合於胞內體的病毒中,預期TAT會增強,像埃博拉病毒一樣。在該些沒有TMPRSS2的細胞中,預期會出現胞內體途徑融合,且因此,TAT使療效變差是意料之外的。如
圖 9 的 B所示,TAT亦降低了VeroE6-TMPRSS2細胞中的療效,儘管我們並不期望它在這裡增強,因為在TMPRSS2存在的情況下,此病毒應當在細胞表面融合。這一令人驚訝的結果進一步強調了不同病毒之間的差異以及它們對肽抑制劑的反應。
圖 10 的 A 至 B示出了所提出的二聚體脂肽在宿主細胞膜中的錨定以及與病毒S蛋白的相互作用。我們的SARS-CoV-2S衍生HRC肽在體外表現出令人驚訝及出乎意料的高效力。總之,該些資料表明,特別是[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol脂肽具備抗擊不斷演變的大流行的能力。所述肽對SARS-CoV-2的抑制的設計及專一性在
圖 11中進一步詳細說明。
實例 4 : SARS 及 SARSMod 衍生的脂肽融合體的生物分佈、細胞毒性及病毒進入阻斷
對於其他有包膜的呼吸道病毒,我們先前表明,鼻內施藥的離體及體內二聚體脂肽在呼吸道中表現出不同的滯留,這取決於chol對toc的連接部分(菲蓋拉(Figueira)T. N.等人,病毒學雜誌(J Virol)91 (2017))。在此,我們比較了在人源化K18 hACE2小鼠中鼻內接種或皮下注射後1、8及24小時最強效的單體脂肽及二聚體脂肽(SARS
HRC-PEG
24-chol及[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol)的局部及全身生物分佈(
圖 12 至圖 14)。鼻內施藥後1小時,二種脂肽達到相似的肺濃度(約1至2 μM)。在第8及24小時,二聚體[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol脂肽在肺中保持高水準,極少進入血液,但單體肽進入循環,肺濃度降低(
圖 12)。在肺部達到的該些高水準是令人驚訝及意外的;它們在動物中是有效的並且預期在臨床上是有效的。鼻內施藥後,二聚體[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol脂肽分佈在整個肺中(
圖 13)。圖14進一步繪示了二種脂肽在不同組織中及在較長時間點(48小時)的分佈。
在原代HAE細胞中進行了融合體的離體毒性(MTT)分析。即使在最高測試濃度下6天後,分析仍顯示出極低毒性(<20%,100 μM),且在其IC
90進入抑制濃度(約35 nM)下無毒性(
圖 15)。[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol的呼吸道持久性更長,與其體外療效一致,這促使我們將這種二聚體脂肽進行進一步評定。
接下來,評估了前導肽[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol阻斷過表達蛋白酶TMPRSS2的VeroE6細胞或VeroE6細胞中活SARS-CoV-2病毒進入的能力,蛋白酶TMPRSS2是被認為有助於病毒進入細胞膜的宿主因子之一。儘管VeroE6細胞中的病毒融合主要發生在內吞後,但病毒藉由在細胞表面融合進入TMPRSS2過表達細胞,這反映了氣道細胞中的進入途徑。氯喹對Vero細胞中的SARS-CoV-2感染有效,但對表達TMPRSS2的Vero細胞及人肺無效,這突出了這種差異。溶於含2%二甲基亞碸(dimethylsulfoxide,DMSO)的水性緩衝液中的[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol肽在8小時後抑制病毒進入,在VeroE6細胞中IC
50為約300 nM,在VeroE6-TMPRSS2細胞中IC
50為約5 nM(
圖 16 的 A)。為了增強向人類使用的轉化潛力,在蔗糖而不是DMSO中重新調配脂肽,產生等效的效力(
圖 16 的 B)。針對HPIV3的對照二聚體融合抑制脂肽阻斷了HPIV3的感染(綠線),但未抑制SARS-CoV-2感染。體外療效資料匯總見
圖 16 的 C。
實例 5 :相較於單株抗體及接種後血清,融合抑制脂肽抗引發關注的 SARS-CoV-2 變體的效力
在此,我們測定並表徵了融合抑制脂肽抗二種VOC即α(B.1.1.7)變體及南非或β(B.1.35)變體的效力。對於該二種VOC,已描述了單株抗體的免疫逃逸,且據報告在中和測定中恢復期血清抗B.1.351的效力較低。
我們先前已經描述了融合抑制脂肽在體外及體內可有效地抑制野生型SARS-CoV-2感染。在此,我們評估了二種脂肽([SARS
HRC-PEG
4]
2-chol及SARS
HRC-PEG
24-chol)在傳染性病毒進入測定中對野生型、α變體(B.1.1.7)及β變體(B.1.351)SARS-CoV-2病毒的療效。我們直接將脂肽與一組11種先前描述的單株抗體(mAb)及8種接種後血清(BNT162b2,二次注射)進行比較。
我們進行了先前建立的傳染性病毒進入分析。簡言之,連續稀釋(分別為10倍、5倍或2倍)FIP、mAb及血清,並用固定量的病毒顆粒在37℃培養1小時。隨後將病毒-抑制劑混合物添加到過量表達TMPRSS2的VeroE6細胞(VeroE6-TMPRSS2)或Calu3細胞中,並在37℃下培養8小時。將細胞洗滌、固定並用原代小鼠抗SARS-CoV核衣殼(伯樂(Biorad))及繼發性山羊抗小鼠IgG/FITC抗體(英傑(Invitrogen))染色。記錄、計數螢光斑點,並以感染對照的百分比計算抑制作用。我們使用四參數劑量反應模型計算了IC50值,並基於對數轉換的IC50值定義了每一類中的效能(示於
圖 17 及圖 18,二者以不同格式描述了相同結果)。
我們檢測到二種脂肽對野生型、α變體(B.1.1.7)及β變體(B.1.351)的效力相當,與使用的細胞系無關。在VeroE6-TMPRSS2細胞上,11個mAb中有2個有效抑制了所有三種病毒的病毒進入(2-15,1-16);11個單株抗體中有4個不(或僅在高濃度下)抑制病毒進入;11個mAb中有2個有效抑制了野生型SARS-CoV-2進入,但未抑制α變體(B.1.1.7)或β變體(B.1.351)進入(1-21,1-22);11個mAb中有2個以類似水準阻斷了野生型及α變體(B.1.1.7)進入,但未阻斷β變體(B.1.351)進入(1-18,217);11個單株抗體中有1個對α變體(B.1.1.7)的療效略有提高(2-02)。儘管Calu3細胞上的IC50值一般較低,但我們觀察到了類似的趨勢。
多株接種後血清顯示出對所有變體的廣譜反應性。然而,相較於野生型SARS-CoV-2,我們測得對β變體(B.1.351)的滴度總體較低,且對α變體(B.1.1.7)的滴度相當或更高。
圖 19示出了VeroE6-TMPRSS細胞上脂肽(A)、mAb(B至D)及接種後血清(E至G)的進入抑制示圖。基於對不同變體的活性對mAb進行了分類(B:對所有三種病毒的活性相當,C:抗野生型SARS-CoV-2活性,D:無活性)。
圖 20進一步證明[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol肽對不同SARS-CoV-2S變體的融合抑制活性。該些變體包括α變體、β變體、γ變體、δ變體及λ變體。
總之,我們證實所評估的SARS-CoV-2專一性脂肽對野生型SARS-CoV-2及VOC α變體(B.1.1.7)及β變體(B.1.351)的療效相當。此外,我們證實了至少一種測試的VOC對多種明確特徵的mAb的免疫逃逸,以及抗β變體(B.1.351)的較低血清滴度。
實例 6 : [SARS-PEG
4]
2-chol
體內效力測試的實驗設計及方法
無論是經由直接接觸還是經由氣溶膠傳播,雪貂皆為評估呼吸道病毒傳播的理想模型。鼬類對SARS-CoV-2的感染高度敏感,水貂養殖場COVID-19的頻繁爆發亦說明瞭這一點。2003年證明瞭嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒(SARS-CoV)在雪貂中的直接接觸傳播,並且已證明瞭SARS-CoV-22在雪貂中的直接接觸及空氣傳播二者。在雪貂模型中,直接接觸傳播的再現性很高(自供體動物至受體動物100%傳播),但雪貂的臨床體徵有限。經由直接接種或傳播感染後,可在咽喉及鼻部輕易檢測到並分離出SARS-CoV-2,病毒複製導致血清轉化。
為了評估[SARS
HRC- PEG
4 ]
2 -chol預防SARS-CoV-2傳播的效果,在與SARS-CoV-2感染的雪貂合飼之前,對未感染雪貂預防性施用脂肽。在此種設置下,理論上可能會經由多種途徑傳播(氣溶膠、口糞及抓撓或啃咬),且雪貂在合飼期間會持續暴露於傳染性病毒,這為抗病毒療效提供了嚴格的檢驗。研究設計見
圖 21 的 A。3只供體雪貂(圖中灰色)在第0天經鼻接種5 x 105 TCID50 SARS-CoV-2。在供體動物接種後(DPI)第1天及第2天,用模擬製劑(紅色)或[SARS
HRC- PEG
4 ]
2 -chol肽(綠色)滴鼻劑對12只單獨飼養的受體雪貂進行了處理。將用於鼻內施藥的[SARS
HRC-PEG
4 ]
2 -chol肽溶解在含2% DMSO的水性緩衝液中,濃度為6毫克/毫升,向雪貂給予2.7毫克/千克的最終劑量(450微升,在二個鼻孔上等分)。肽母液及工作稀釋液具有相似的IC50,證實了肽處理的雪貂每天以相當的量用藥(
圖 12 的 A 至 B)。在接種後第2天第二次處理6小時後,將一隻受感染的供體雪貂(藉由RT-qPCR確定SARS-CoV-2高度陽性)與4只未感染的受體雪貂(2只模擬處理的、2只肽處理的)放在一起。在三個分開的、負壓HEPA過濾的ABSL3隔離籠中傳播24小時後,停止合飼,將供體雪貂、模擬處理雪貂及肽處理雪貂作為分開的組飼養。在接種後第3天及第4天對受體動物進行了額外的[SARS
HRC- PEG
4 ]
2 -chol肽處理。
圖 21 的 B 至 C示出了直接接種的供體動物(灰色)、模擬處理的受體動物(紅色)及脂肽處理的受體動物(綠色)的病毒負荷量(藉由RT-qPCR檢測病毒基因組)。所有直接接種的供體雪貂皆被有效感染,如在咽拭子及鼻拭子中進行的SARS-CoV-2基因組檢測所示,且高效且可再現地將病毒傳播給所有模擬處理的受體雪貂(
圖 21 的 B 至 C,紅色曲線)。在任何肽處理的受體動物的喉嚨或鼻子中未檢測到有效SARS-CoV-2感染(
圖 21 的 B 至 C,綠色曲線)。在接種後第3天採集的樣本中檢測到病毒負荷量輕微升高(在合飼結束時),證實肽處理動物暴露於SARS-CoV-2。在
圖 21 的 D中,曲線下面積(AUC)顯示了模擬治療動物與肽治療動物之間的顯著差異。從脂肽處理的雪貂中未分離出傳染性病毒,而在所有模擬處理的雪貂中皆檢測到傳染性病毒(
圖 21 的 E)。病毒分離資料與基因組檢測相關聯(
圖 21 的 F)。
接種後21天在供體雪貂及6/6模擬治療動物中發生血清轉化,但肽治療的受體動物中無一發生,如S-及N-專一性IgG酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)及病毒中和所示(
圖 21 的 G 至圖 21 的 I)。成功的激發感染證實,宿主內病毒複製已被[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol處理完全阻斷(
圖 21 的 J及
圖 23),沒有一隻肽-動物受到保護,而模擬處理的動物(已血清轉化)皆受到保護。總之,該些資料表明,令人驚訝及出乎意料的是,[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol肽的鼻內預防性施藥保護了6/6雪貂免於傳播及有效感染。
實例 7 :單次施用二聚體脂肽
鑒於二聚體脂肽在鼠肺中的持久性(
圖 12 及圖 13),我們評估了在合飼前2小時在雪貂傳播實驗中單次施用蔗糖調配的脂肽以預防或延遲感染的可能性。在此實驗中,我們使用二聚體HPIV3專一性脂肽作為模擬對照(
圖 24)。儘管蔗糖製劑在體外小規模產生了有希望的結果(
圖 16 的 B),但較大規模的製劑導致不完全溶解。因此,蔗糖調配的[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol脂肽的施藥濃度顯著低於DMSO調配的脂肽的實驗濃度(
圖 22 的 C 至 D)。然而,令人驚訝且出乎意料的是,相較於HPIV3對照組,SARS-CoV-2脂肽提供了顯著水準的保護,6只SARS-CoV-2脂肽治療動物中有2只受到了抗感染保護。本實驗表明,單次施藥暴露前預防是有希望的,而最佳配方及給藥方案是正在進行的實驗領域。
本研究中介紹的鼻內[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol肽是在相關動物模型中首次成功預防SARS-CoV-2傳播的藥物,在24小時的強烈直接接觸期間提供了完全的保護。以S與ACE2之間的相互作用為靶標的預防傳播的平行方法在體外已顯示出希望(例如,「小蛋白」方法)。此處描述的脂肽在S1脫落後作用於S2結構域(
圖 10 的 A至
B),並且與靶向S1功能或使S保持其融合前構象的策略(例如合成奈米抗體)互補。融合抑制性脂肽可與該些策略結合使用,並與減少受治療感染個體中複製的治療(如核糖核苷類似物)聯合使用,用於暴露前及暴露後預防。針對病毒生命週期不同方面的藥物組合可能是應對這種快速進化病毒的理想選擇。[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol肽的架儲期長,不需要冷藏,施藥方便,特別適合治療難以接觸到的人群。這對於COVID-19來說至關重要,因為所述疾病已經影響到每個社區,負擔不成比例地落在低收入及其他邊緣化社區身上。這種HRC脂肽融合抑制劑用於人類使用是可行的,並應很容易轉化為安全有效的鼻噴霧劑或吸入給藥融合抑制劑,用於SARS-CoV-2預防,支持遏制正在發生的COVID-19大流行。
實例 8 :材料及方法
倫理聲明。流感病毒、SARS-CoV-2及阿留申病毒(Aleutian Disease Virus)血清反應陰性雌性(體重900克至1200克)及雄性(體重1000克至1500克)雪貂(地中海雪貂(
Mustela putorius furo))從商業繁殖場(美國賓夕法尼亞州三聯F農場(Triple F Farms))處獲得。按照荷蘭保護用於科學目的的動物的立法(2014年,執行歐盟指令(EU Directive)2010/63)飼養動物並進行實驗。研究是根據荷蘭主管當局的項目許可證(許可證號AVD1010020174312)進行的,研究方案經實驗動物福利機構(Animal Welfare Body)批準(伊拉斯謨(Erasmus)MC許可證號17-4312-07、-08及-09)。每天對動物福利進行監測。K18-hACE2小鼠[B6. Cg-Tg(K18-hACE2)2Prlmn/J](4至6周齡)購自傑克森實驗室(Jackson Laboratory),並在內部(美國紐約州CUIMC)繁殖。所有小鼠實驗皆按照哥倫比亞大學實驗動物護理及使用管理委員會(Columbia University Institutional Animal Care and Use Committee)(AC-AABG9559)批準的方案進行。哥倫比亞大學比較醫學研究所(Institute of Comparative Medicine,ICM)獲得了國際實驗動物保護評估與認證協會(Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International,AAALAC)的全面認證,並遵守動物福利法(Animal Welfare Act AWA,))、1985年健康研究擴充條例(Health Research Extension Act of 1985)及國家研究委員會(National Research Council,NRC)的規定。
SARS-CoV-2 S 蛋白介導的融合建模。使用Molecular Maya(https://clarafi.com/tools/mmaya/),利用分子力學力場的組合,對抑制性脂肽、全長SARS-CoV 2刺突(S)預融合、前髮卡及融合後結構進行建模及模擬。使用MMFF94 (
1)、CHARMM C36 (
2)、及Martini (
3)力場分別對聚乙二醇化膽固醇、抑制肽及S蛋白進行了參數化。使用Autodesk Maya的核求解程序(nucleus solver)運行模擬,並使用核求解程序固有的附加限制(nConstraints)在交互式操控期間穩定分子。
為了對初始全長預融合S蛋白進行建模,我們使用了來自UniProt進入P0DTC2的SARS-CoV 2 S蛋白序列、來自野生型SARS-CoV 2 S蛋白的PDB 6XR8
( 4 )及來自SARS-CoV S蛋白的2FXP
( 5 )。使用Molecular Maya的建模工具包(Modeling kit)對剩餘的結構間隙進行建模。
為了對S前髮卡中間體進行建模,我們將來自PDB 6XRA
( 4 )的融合後結構與全長融合前模型進行了比對,比對中僅考慮了中心螺旋(central helix,CH)區域(殘基968至1035)。然後進行模擬,逐步將HRN區域(殘基910至985)引向對齊的融合後結構,由HRN擴展CH捲曲螺旋。模型的其餘區域用彈性網絡或位置限制進行限制,以保留局部二級結構。然後,融合肽區域自彈性網絡中釋放出來,並導向宿主細胞膜,形成前髮卡模型。
融合後模型是藉由將HRC區域自前髮卡模型逐步轉向融合後結構,以獲得HRC-HRN 6螺旋束而得到的。在轉化過程中,S的C-末端跨膜結構域上的位置限制被翻譯以允許HRC到達導向靶,並且整個融合後結構靶被重新定向以避免與病毒膜代理(proxy)重疊。
最後,為了模擬抑制性脂肽與S蛋白的相互作用,將其胺基酸導向靶融合後結構中匹配的HRC殘基,而膽固醇部分位於宿主-細胞膜平面。在檢測到HRC與抑制肽之間的空間碰撞之前,S的前髮卡至融合後轉變被中斷。
脂肽合成。藉由固相肽合成(solid phase peptide synthesis,SPPS)製備了對應於SARS-CoV-2 S殘基1168至1203且帶有C-末端-GSGSGC間隔序列的肽(SARS
HRC)。SARS
HRC肽在N-末端被乙醯化,且在C-末端被醯胺化。藉由反相高效液相層析法(high-performance liquid chromatography,HPLC)純化粗肽,並用基質輔助雷射脫附遊離飛行時間質譜測定法(matrix-assisted laser desorption ionization−time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)進行表徵。SARS
HRC-chol、SARS
HRC-PEG
4-chol、SARS
HRC-PEG
24-chol、[SARS
HRC]
2-PEG
11及[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol係藉由肽半胱胺酸殘基上的末端巰基與溴乙醯基膽固醇(有或無指定的PEG連接體)、馬來醯亞胺功能性PEG連接體或PEG-膽固醇連接體之間的化學選擇性硫醇-邁克爾(Thiol-Michael)加成反應合成的,如前所述
( 6 )。藉由HPLC純化及凍乾得到白色粉末形式的肽-脂質共軛物。藉由MALDI-TOF MS驗證了共軛物的特性(
圖 7)。
溶解實驗中使用的脂肽。[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol以白色粉末形式以10毫克等分試樣提供。對於在雪貂中進行的體內實驗,將10毫克的[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol溶解在33.3微升DMSO中,隨後將其加入到1632.7微升去離子水中。由此得到得到含2% DMSO的以6毫克/毫升的濃度溶解的最終脂肽水溶液。為了獲得溶解在不含DMSO的水溶液中的肽,製備了DMSO中的100毫克/毫升的[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol或[HPIV3
HRC-PEG
4]
2-chol(10毫克肽於100微升DMSO中)及於無菌水中的1毫克/毫升蔗糖。將10微升的肽溶液(1毫克)加入100微升的蔗糖(0.1毫克)中。將肽溶液(DMSO + 蔗糖)凍乾過夜,並將乾粉重新懸浮於50微升去離子水中,在不含任何DMSO的水中最終濃度為20毫克/毫升。
質粒。將編碼與螢光蛋白Venus融合的hACE2、與螢光蛋白Venus融合的二肽基肽酶4(DPP4)、SARS-CoV-2S以及所示的S變體、SARS-CoV S及MERS-S的cDNA(針對哺乳動物表達進行了密碼子優化)選殖到經修飾的pCAGGS(具有嘌呤黴素抗性以供選擇)。
病毒。SARS-CoV-2(分離株BetaCoV/Munich/BavPat1/2020;由教授C. 德斯頓(Drosten)博士慷慨提供)在37℃下在補充有青黴素(10,000 IU/毫升,龍沙(Lonza))及鏈黴素(10,000 IU/毫升,龍沙)的OptiMEM I (1X) + GlutaMAX(基博科(Gibco))中在VeroE6細胞上增殖至傳代3。VeroE6細胞以0.01的感染複數(multiplicity of infection,MOI)接種。接種後72小時(HPI)收集上清液,藉由離心法潔淨並儲存在-80℃。所有活病毒檢測皆在II級生物安全櫃(Class II Biosafety Cabinet)中在Erasmus MC下在BSL-3條件下進行。HPIV3-GFP係自維若卓(Viratree)購得,在37℃下,在補充有10%胎牛血清(foetal bovine serum,FBS)、青黴素(10,000 IU/毫升,龍沙)及鏈黴素(10,000 IU/毫升,龍沙)的DMEM中在Vero細胞上增殖至傳代3代。
細胞。人胚胎腎(Human embryonic kidney,HEK)293T細胞及Vero(非洲綠猴腎)細胞在37℃下在5% CO
2中,生長於補充有10% FBS及抗生素的杜伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM;英傑;賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific))中。VeroE6(ATCC CRL-1586)及VeroE6-TMPRSS2細胞生長於添加10% FBS、2 mM L-穀胺醯胺(基博科)、10 mM Hepes(龍沙)、1.5毫克/毫升碳酸氫鈉(NaHCO
3,龍沙)、青黴素(10,000 IU/毫升)及鏈黴素(10,000 IU/毫升)的DMEM(基博科)中
( 7 )。
基於 β-Gal 互補的融合測定。我們先前採用了基於β-半乳糖苷酶(β-Gal)α互補的融合測定
( 8 )。在本測定中,表達β-Gal的ω肽的hACE2受體攜帶細胞(或對於MERS-CoV-2實驗為二肽基肽酶4(DPP4)受體攜帶細胞)與共表達SARS-CoV或SARS-CoV-2糖蛋白S及β-Gal的α肽的細胞混合,細胞融合導致α-ω互補。藉由裂解細胞終止融合,並在添加底物(®The Tropix Galacto-Star™化學發光報告分析系統,應用生物系統公司(Applied Biosystem))後,在Tecan M1000PRO微孔板讀數儀上定量發光。
HAE 培養物及毒性分析。EpiAirway AIR-100系統(馬泰克公司(MatTek Corporation))由正常人來源的氣管/支氣管上皮細胞組成,該些細胞已被培養形成假複層、高度分化的黏液纖毛上皮,與體內上皮組織非常相似
( 9 )。在存在或不存在1、10或100 μM濃度的不同肽的情況下,在37℃培養HAE培養物,每2天將所述肽加入到維持培養基中,持續7天。第7天測定細胞生存力。使用環己醯亞胺(CHE,真核生物中的一種蛋白質合成抑制劑)作為毒性的陽性對照。根據生產商指南,使用Vybrant MTT細胞增殖測定試劑盒在24小時後測定細胞生存力。使用Tecan M1000PRO微孔板讀數儀讀取540奈米處的吸光度。
抗 S 源性 HRC 肽( HRC
SARS )的抗體。在兔中產生了抗HRC
SARS線性表位的多株抗體(金斯瑞(Genscript)),並在我們的西方墨點法及ELISA分析中進行了驗證。金斯瑞提供了一份完整的報告,證實了ELISA法中抗體對表位的識別。將純化的血清等分並凍乾(10毫克至20毫克於密封瓶中)。將幾份等分的純化血清與生物素共軛。凍乾的等分試樣保持在-80℃。一旦等分試樣重新懸浮,則製備多個液體等分試樣(50微升至100微升)並重新冷凍(-80℃)。
小鼠生物分佈實驗。用氯胺酮/木聚嗪(分別為100毫克/千克及10毫克/千克)的混合物麻醉的鼻內接種(
圖 12)小鼠(n=3或4)藉由滴管接受溶於40微升水的脂肽(5微克/克)及2% DMSO(每個鼻孔20微升)的鼻內施藥。皮下注射(
圖 12 的 A ,圖 12 的 B):將溶解於100微升水的脂肽(5微克/克)及2% DMSO注射到用氯胺酮/木聚嗪(分別為100毫克/千克及10毫克/千克)的混合物麻醉的小鼠的肩胛骨之間的皮下組織中。在二個實驗中,使用耳標對小鼠進行了唯一識別。麻醉蘇醒後,將小鼠送回動物室,並在採集用於分析的組織(肺及血液)之前,在3個時間點(施藥後1、8及24小時)在異氟烷麻醉下藉由頸椎脫位人道地實施了安樂死。稱取肺,在PBS中混合(1:1,重量/體積),並使用BeadBug
TM微管勻漿器進行勻漿。隨後在4°C下用乙腈/1% TFA(1:4,體積/體積)在轉子上處理樣本過夜,並在8000 rpm下離心10分鐘。皮下施藥後,在肺中未檢測到脂肽(
圖 12 的 A ,圖 12 的 B)。鼻內施藥後,[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol在呼吸道中表現出更好的滯留(
圖 12 的 C ,圖 12 的 D)。
用於半定量肽評估的 ELISA 法。在碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液(pH = 7.4,20微克/毫升)中用純化的兔抗HRC
SARS抗體包被96孔板Maxisorp(能肯(Nunc))過夜。將板在1倍PBS中洗滌二次,並在3% BSA/1X PBS中封閉30分鐘。用每份樣本在3% BSA/1X PBS中的2次稀釋液替換阻斷緩衝液(一式兩份),並在室溫(RT)下培養1.5小時。將孔在1X PBS中洗滌3次,並用與生物素共軛的純化兔抗HRC
SARS抗體在室溫下顯影1小時。將孔在1X PBS中洗滌3次,用與過氧化物酶共軛的鏈黴親和素在3% BSA/1X PBS中於室溫下顯影30′,然後洗滌5次並用Ultra TMB底物溶液(西格瑪奧德裡奇(Sigma-Aldrich))培養,並用硫酸(12%)終止。在450奈米處讀取吸光度。
免疫組織化學檢測。肺切片脫蠟,室溫下在PBS中用10%驢血清封閉1小時。加入兔抗HRC
SARS抗體,在4℃下培養12小時。室溫下將切片用驢抗兔二抗(英傑,#A31572)染色1小時。切片用DAPI處理,置於Vectashield封固劑(矢量實驗室有限公司(Vector Laboratories, Inc.),加利福尼亞州伯林蓋姆)中,蓋上蓋子,用DMi8(徠卡顯微系統(Leica Microsystems),伊利諾依州布法羅市)成像。
融合抑制脂肽的體外效力。在體外傳染性病毒融合測定中測定了[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol及[HPIV3
HRC-PEG
4]
2-chol的效力。在VeroE6細胞及VeroE6-TMPRSS2細胞中以0.06 nM至5 μM(5倍稀釋系列)的濃度對用於動物實驗的原始母液及工作稀釋液進行了三次試驗。將肽與細胞在37℃預培養1小時。預培養後,加入SARS-CoV-2(600 TCID
50/孔)。在37°C下培養8小時後,洗滌細胞,並在室溫下用4% PFA固定20分鐘。將平板浸入70%乙醇中,並在BSL-2實驗室進行染色。簡言之,用PBS洗滌細胞,並用10%正常山羊血清(normal goat serum,NGS)在室溫下封閉30分鐘。將原代小鼠抗SARS-CoV核衣殼抗體(伯樂)在10% NGS中室溫下培養1小時。洗滌後,將二級山羊抗小鼠IgG/FITC抗體(英傑)在10% NGS培養基中室溫培養45分鐘。使用Amersham Typhoon Biomolecular Imager(通用電氣醫療集團(GE Healthcare))對螢光斑點進行可視化處理,並使用ImageQuant TL 7.0軟體(通用電氣醫療集團)進行計數。使用類似試驗測定了[HPIV3
HRC-PEG
4]
2-chol抗HPIV3的活性。原始母液在相同濃度的Vero細胞中測試三次。預培養後,加入rHPIV3-GFP(300 TCID
50/孔)。37小時後,用2% PFA洗滌並固定細胞,並觀察螢光斑點並計數。
雪貂傳播實驗。對於DMSO調配的脂肽實驗:將3只供體雪貂鼻內接種450微升的5 x 10
5TCID
50/毫升SARS-CoV-2(225微升滴加到每個鼻孔中),並一起飼養在經HEPA過濾的負壓ABSL-3隔離籠中。這被認為是實驗的開始(接種後0天(DPI))。與此同時,12只直接接觸雪貂被分入另外3個隔離籠中。在接種後1至4天對雪貂進行模擬處理(媒液,去離子水中的2% DMSO)或用[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol處理。鼻內接種450微升肽(225微升滴加於每個鼻孔中),經HRC二聚體膽固醇處理的雪貂接受約2.7毫克/千克的肽劑量。剩餘批次儲存在-80°C下,供以後用於體外效力測定(
圖 22 的 A 、圖 22 的 B)。在接種後第2天,第二次處理6小時後,將一隻供體雪貂與2只模擬治療雪貂及2只肽治療雪貂置於相同的隔離籠中,在三個獨立的隔離籠中。現在,每個隔離籠包含五隻雪貂,有供體雪貂、模擬處理的受體雪貂及[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol處理的受體雪貂。在接種後3天,開始合飼18小時後,動物接受第三次模擬處理或肽處理。6小時後,即開始合飼24小時後,將供體動物移回到它們最初的隔離籠,將模擬處理及肽處理的雪貂按2組各6只動物飼養在清潔隔離籠中(
圖 21 的 A)。在接種後第0、1、2、3、4、5、6、7、14及21天自動物中採集咽拭子及鼻拭子。始終在模擬劑或肽施藥前採集樣本。將拭子儲存在-80°C的病毒運輸培養基(含亨克(Hank)氏BSS的極限必需培養基伊格爾(龍沙),5克/升乳清蛋白酶解物,10%甘油(西格瑪奧德裡奇),200 U/毫升青黴素、200毫克/毫升鏈黴素,100 U/毫升硫酸多黏菌素B(西格瑪奧德裡奇),及250毫克/毫升慶大黴素(生命科技(Life Technologies))中。在接種後0、7、14及21天時藉由腔靜脈穿刺自雪貂採集血液樣本。在血清分離管(格雷納(Greiner))中採集血液,進行處理、熱滅活,並將血清儲存在-80°C下。
為了評估雪貂對SARS-CoV-2處理後的易感性,將先前模擬處理或[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol處理的雪貂以相同處理時間表成對重新圈養到六個隔離籠中。使用5 x 10
3, 5 x 10
4or 5 x 10
5TCID
50/毫升(450微升)的SARS-CoV-2溶液以滴定方式對雪貂進行激發。對於每個劑量,對2只模擬處理的雪貂及2只肽處理的雪貂進行鼻內接種。每天從動物中採集咽喉及鼻拭子直至第7天。所有易感動物皆以劑量依賴方式有效感染SARS-CoV-2(
圖 23)。
類似於第一個實驗進行第二個雪貂傳播實驗(
圖 24),但有以下修改:[1] 3只供體雪貂接種4×10
5TCID
50/毫升(450微升)。[2] 在供體動物與直接接觸動物合飼前2小時,6只接觸動物接受了單劑量的5毫克/千克預期劑量的在蔗糖中調配的[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol處理。將剩餘批次儲存在-80℃下,以供以後在體外效力測定中測試,在此階段,我們觀察到調配在蔗糖中的脂肽(以10毫克規模而不是
圖 16所示的1毫克規模製備)的IC
50較預期高約20倍(
圖 22 的 C ,圖 22 的 D)。因此,在本實驗中,動物接受的劑量顯著低於使用DMSO調配肽的實驗。[3] 6只模擬處理雪貂接受了以蔗糖調配的單劑量[HPIV3
HRC-PEG
4]
2-chol(5毫克/千克)。在接種後3天(合飼後22小時),將供體動物移回其最初的隔離籠,並將[HPIV3
HRC-PEG
4]
2-chol處理的動物及[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol處理的動物分組安置,每組6只動物。在接種後0、1、2、3、4、5、6及7天自動物中採集咽拭子及鼻拭子,在接種後0及7天採集血液。在咽拭子或鼻拭子中檢測到SARS-CoV-2(Ct<30)後,將[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol處理的動物重新安置到單獨的隔離籠中。實驗在接種後7天停止。
所有動物處理皆在阿替帕唑(0.25毫克/千克)拮抗的氯胺酮/美托咪定(分別為10毫克/千克及0.05毫克/千克)混合物麻醉下進行。所有動物實驗皆在負壓ABSL3設備中在III類隔離籠中進行。每天對雪貂稱重。在使用DMSO調配的肽及蔗糖調配的肽二者的實驗中,所有雪貂的體重隨時間保持穩定(
圖 25)。
對咽拭子及鼻拭子進行 RNA 分離及 RT-qPCR 。將60微升樣本(儲存著拭子的病毒運輸培養基)加入到90微升MagNA Pure 96外部裂解緩衝液(瑞士羅氏(Roche))中。向樣本中加入已知濃度的海豹瘟熱病毒(phocine distemper virus,PDV),作為RNA提取的內部對照。將150微升的樣本/裂解緩衝液加入含有50微升磁珠(AMPure XP,貝克曼庫爾特(Beckman Coulter))的96孔板的孔中。充分混合後,將平板在室溫下培養15分鐘。然後將平板放在磁塊(DynaMag™-96側緣磁體(Side Skirted Magnet)(賽默飛世爾科技))上,培養3分鐘,使磁珠向磁體側移動。小心地除去上清液,並在室溫下用200微升/孔的70%乙醇洗滌磁珠三次,每次30秒。最後一次洗滌後,使用20微升多道移液管除去殘留的乙醇。將板在室溫下風乾2分鐘。從磁塊中取出板,並將50微升的PCR級水加入到每個孔中並混合。將平板在室溫下培養5分鐘,然後放回磁塊上2分鐘,以分離磁珠。用移液管將上清液移入一個新的平板中,並將RNA儲存在-80°C下。如前所述,將RNA直接用於RT-qPCR,使用靶向SARS-CoV-2的E基因的引物及探針。
咽拭子、鼻拭子病毒分離。使用測定組織培養物感染劑量-50(TCID
50/毫升)的感染中心分析法在VeroE6中分離出SARS-CoV-2。用50微升的樣本(儲存有拭子的病毒運輸培養基,第一次稀釋1:3)接種細胞,所述樣本以3倍稀釋系列稀釋,一式四份。培養6天後篩選VeroE6的細胞病變效應(cytopathic effect,CPE),計算以TCID
50/毫升表示的感染滴度。
雪貂血清中 SARS-CoV-2 專一性抗體的檢測。使用在接種後0、7、14及21天獲得的雪貂血清檢測雪貂的血清轉化。進行了S及核衣殼(N)ELISA檢測。在4°C下,在PBS中用20奈克重組His標記的S蛋白(義翹神州(SinoBiological))或100奈克重組His標記的N蛋白(義翹神州)包被高結合ELISA板過夜。隨後,用PBS-吐溫(Tween)洗滌板,接著在含有0.01%吐溫-20(Tween-20)的TBS(生命科技)中用封閉劑牛乳轉移技術優化液(blotto)進行封閉步驟(37°C,1小時)。血清以1:100的濃度在阻斷緩衝液中稀釋,一式兩份進行檢測。在37℃培養1小時後,清洗平板,並與山羊抗雪貂IgG H&L/HRP(艾博抗(Abcam))在37℃培養1小時。清洗後,將TMB底物(賽若凱爾(Seracare))在黑暗中培養5分鐘。使用硫酸停止反應,在450奈米處用Tecan M200孔板讀數儀量測吸光度。採用終點滴定法檢測病毒中和抗體。簡言之,在37°C下將雪貂血清複本與100 TCID
50的SARS-CoV-2按2倍稀釋系列培養1小時,以1:8的濃度開始培養。將病毒-血清混合物添加到VeroE6細胞中,並在37°C下培養5天。將CPE用作讀數,以測定抑制CPE所需的最低血清濃度。
統計學。藉由執行三參數非線性回歸計算融合分析中的抑制濃度50%及90%(分別為IC
50及IC
90)。採用二因子變異數分析比較IC
50間的差異。感染性病毒檢測中的IC
50及IC
90是藉由對標準化及轉換後的資料執行具有可變斜率的四參數非線性回歸來計算的。藉由二因子變異數分析重複量測比較了體內實驗中的所有折線圖。根據每只動物的曲線,使用GraphPad Prism計算曲線下面積,並藉由曼-惠特尼檢定進行比較。所有統計皆使用GraphPad Prism V9進行。
實例 8 :在轉基因小鼠模型中 [SARS- PEG4]2-chol 及 SARS
HRC-PEG
24-chol
的體內效力試驗
SARS-CoV-2是2019年自中國出現的一種β冠狀病毒。它導致了COVID-19(COVID-19)大流行,該病已在全球造成數百萬人死亡。儘管疫苗可用,但重要的是要有替代及補充預防措施,特別是對易受疫苗接種影響或難以接種的人群。
SARS-CoV-2藉由病毒包膜與宿主細胞質膜的附著及融合進入宿主細胞,並由病毒糖蛋白S介導。這種三聚體I類蛋白具有以6個反平行螺旋排列的N-及C-末端七肽重複區(HR)。我們自SARS-CoV-2的S蛋白C-末端位置的HR區域產生肽,與脂質耦合。該些肽藉由結合表面蛋白的N-末端七肽重複(HR)區域來抑制病毒進入。我們測試了它們在體外及離體二者抑制病毒進入細胞及防止病毒傳播的能力。還藉由體內研究對該些肽保護對SARS-CoV-2敏感的動物模型的能力亦進行了研究。
某些肽在小鼠中以奈莫耳範圍內的90%抑制濃度(IC90)抑制病毒融合,並隨後抑制感染及病毒傳播。然後在細胞角蛋白K18(B6.Cg-Tg (K18-ACE2) 2Prlmn/J,傑克森)啟動子的控制下,在感染SARS-CoV-2病毒前,將該些肽鼻內給予表達人ACE2受體的轉基因小鼠。儘管在K18-hACE2小鼠中,感染通常在感染後10天內100%致死,但相較於未處理的動物,分別有80%至100%用此2種肽處理的動物存活,感染後2天肺中的病毒負荷量顯著降低。
總之,該些結果證明,抑制病毒與其宿主細胞之間融合的肽亦在小鼠模型中體內阻斷SARS-CoV-2的呼吸道感染,從而構成藉由施用抑制肽開發的新的抗病毒方法,以對抗當前的COVID-19大流行。
參考文獻
李F. 冠狀病毒刺突蛋白的結構、功能及進化 病毒學年度評論3,237-261,doi:10.1146/annurev-virology-110615-042301 (2016) (Li, F. Structure, Function, and Evolution of Coronavirus Spike Proteins. Annu Rev Virol 3, 237- 261, doi:10.1146/annurev-virology-110615-042301 (2016).)
霍夫曼等 SARS-CoV-2細胞的進入依賴於ACE2及TMPRSS2並且被臨床證實的蛋白酶抑制劑阻斷 細胞,doi:10.1016/j.cell.2020.02.052 (2020) (Hoffmann, M. et al. SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell, doi:10.1016/j.cell.2020.02.052 (2020).)
萬Y.,商J.,格雷漢姆R.,巴裡奇R. S.及李F. 武漢SARS-CoV-2對受體的識別:基於十年SARS冠狀病毒結構研究的分析 病毒學雜誌94,doi:10.1128/JVI.00127-20 (2020) (Wan, Y., Shang, J., Graham, R., Baric, R. S. & Li, F. Receptor Recognition by the Novel Coronavirus from Wuhan: an Analysis Based on Decade-Long Structural Studies of SARS Coronavirus. J Virol 94, doi:10.1128/JVI.00127-20 (2020).)
博世B. J.,凡德爾茲R.,德哈恩C. A.及羅蒂爾P. J. 冠狀病毒刺突蛋白是一種I類病毒融合蛋白:融合核心複合物的結構及功能表征 病毒學雜誌77,8801-8811,doi:10.1128/jvi.77.16.8801-8811.2003 (2003) (Bosch, B. J., van der Zee, R., de Haan, C. A. & Rottier, P. J. The coronavirus spike protein is a class I virus fusion protein: structural and functional characterization of the fusion core complex. J Virol 77, 8801-8811, doi:10.1128/jvi.77.16.8801-8811.2003 (2003).)
奧特洛V. K.等 來源於SARS-CoV-2刺突糖蛋白HRC結構域的脂質共軛肽對冠狀病毒體外及離體進入的抑制作用 分子生物技術11,doi:10.1128/mBio.01935-20 (2020) (Outlaw, V. K. et al. Inhibition of Coronavirus Entry In Vitro and Ex Vivo by a Lipid- Conjugated Peptide Derived from the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein HRC Domain. mBio 11, doi:10.1128/mBio.01935-20 (2020).)
夏S.,王Q.,劉S. W.,魯L.及薑S. B. [肽MERS-CoV進入抑制劑的開發] 藥學學報50,1513-1519 (2015) (Xia, S., Wang, Q., Liu, S. W., Lu, L. & Jiang, S. B. [Development of peptidic MERS-CoV entry inhibitors]. Yao Xue Xue Bao 50, 1513-1519 (2015).)
夏S.等 一種靶向人冠狀病毒刺突蛋白HR1結構域的泛冠狀病毒融合抑制劑 科學前沿5,eaav4580,doi:10.1126/sciadv.aav4580 (2019) (Xia, S. et al. A pan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1 domain of human coronavirus spike. Sci Adv 5, eaav4580, doi:10.1126/sciadv.aav4580 (2019).)
夏S.等 藉由靶向具有高介導膜融合能力的刺突蛋白的高效泛冠狀病毒融合抑制劑抑制SARS-CoV-2(先前為2019-nCoV)感染 細胞研究30,343-355,doi:10.1038/s41422-020-0305-x (2020) (Xia, S. et al. Inhibition of SARS-CoV-2 (previously 2019-nCoV) infection by a highly potent pan-coronavirus fusion inhibitor targeting its spike protein that harbors a high capacity to mediate membrane fusion. Cell Res 30, 343-355, doi:10.1038/s41422-020-0305-x (2020).)
朱Y.,於D.,閻H.,崇H.及何Y. 抗新發高融合活性冠狀病毒SARS-CoV-2的強效膜融合抑制劑的設計 病毒學雜誌94,doi:10.1128/JVI.00635-20 (2020). (Zhu, Y., Yu, D., Yan, H., Chong, H. & He, Y. Design of Potent Membrane Fusion Inhibitors against SARS-CoV-2, an Emerging Coronavirus with High Fusogenic Activity. J Virol 94, doi:10.1128/JVI.00635-20 (2020).)
王X.等 抗COVID-19及其他新發冠狀病毒病的廣譜冠狀病毒融合抑制劑 國際分子科學雜誌21,doi:10.3390/ijms 21113843(2020) (Wang, X. et al. Broad-Spectrum Coronavirus Fusion Inhibitors to Combat COVID-19 and Other Emerging Coronavirus Diseases. Int J Mol Sci 21, doi:10.3390/ijms21113843 (2020).)
波羅托M.等 靶向膜作用位點的病毒進入抑制劑 病毒學雜誌84,6760-6768,doi:10.1128/JVI.00135-10 (2010) (Porotto, M. et al. Viral entry inhibitors targeted to the membrane site of action. J Virol 84, 6760-6768, doi:10.1128/JVI.00135-10 (2010).)
波羅托M.等 體內抑制尼帕病毒感染:靶向病毒進入期間副黏液病毒融合激活的早期階段 公共科學圖書館·病原體6,e1001168,doi:10.1371/journal.ppat.1001168 (2010) (Porotto, M. et al. Inhibition of Nipah virus infection in vivo: targeting an early stage of paramyxovirus fusion activation during viral entry. PLoS Pathog 6, e1001168, doi:10.1371/journal.ppat.1001168 (2010).)
派思A.等 賦予天然融合蛋白衍生肽強效抗病毒活性的一般策略 公共科學圖書館·綜合7,e36833,doi:10.1371/journal.pone.0036833 (2012) (Pessi, A. et al. A general strategy to endow natural fusion-protein-derived peptides with potent antiviral activity. PLoS One 7, e36833, doi:10.1371/journal.pone.0036833 (2012).)
韋爾奇J. C.等 用腦滲透劑融合抑制劑預防致命性麻疹病毒感染 病毒學雜誌87,13785-13794,doi:10.1128/JVI.02436-13 (2013) (Welsch, J. C. et al. Fatal measles virus infection prevented by brain-penetrant fusion inhibitors. J Virol 87, 13785-13794, doi:10.1128/JVI.02436-13 (2013).)
奧特洛V. K.等 單藥對人副流感3型及呼吸道合胞病毒感染性的雙重抑制 美國化學會會志141,12648-12656,doi:10.1021/jacs.9b04615 (2019) (Outlaw, V. K. et al. Dual Inhibition of Human Parainfluenza Type 3 and Respiratory Syncytial Virus Infectivity with a Single Agent. J Am Chem Soc 141, 12648-12656, doi:10.1021/jacs.9b04615 (2019).)
菲蓋拉T. N.等 生育酚衍生肽奈米顆粒抗麻疹病毒作用中的結構-穩定性-功能機理聯繫 美國化學學會奈米期刊12,9855-9865,doi:10.1021/acsnano.8b01422 (2018) (Figueira, T. N. et al. Structure-Stability-Function Mechanistic Links in the Anti-Measles Virus Action of Tocopherol-Derivatized Peptide Nanoparticles. ACS Nano 12, 9855-9865, doi:10.1021/acsnano.8b01422 (2018).)
菲蓋拉T. N.等 藉由錨定於質膜的細胞穿透/融合抑制劑串聯肽實現有效體內靶向流感病毒 生物共軛化學29,3362-3376,doi:10.1021/acs.bioconjchem.8b00527 (2018) (Figueira, T. N. et al. Effective in Vivo Targeting of Influenza Virus through a Cell- Penetrating/Fusion Inhibitor Tandem Peptide Anchored to the Plasma Membrane. Bioconjug Chem 29, 3362-3376, doi:10.1021/acs.bioconjchem.8b00527 (2018).)
馬蒂厄C.等 副黏液病毒的廣譜抗病毒活性受融合抑制肽的生物物理特性調節 科學報告7,43610,doi:10.1038/srep43610 (2017) (Mathieu, C. et al. Broad spectrum antiviral activity for paramyxoviruses is modulated by biophysical properties of fusion inhibitory peptides. Sci Rep 7, 43610, doi:10.1038/srep43610 (2017).)
菲蓋拉T. N.等 麻疹病毒融合蛋白衍生肽的體內效力受自組裝及膜滯留特性的調節 病毒學雜誌91,doi:10.1128/JVI.01554-16 (2017) (Figueira, T. N. et al. In Vivo Efficacy of Measles Virus Fusion Protein-Derived Peptides Is Modulated by the Properties of Self-Assembly and Membrane Residence. J Virol 91, doi:10.1128/JVI.01554-16 (2017).)
馬蒂厄C.等 藉由鼻內遞送融合抑制肽預防麻疹病毒感染 病毒學雜誌89,1143-1155,doi:10.1128/JVI.02417-14 (2015) (Mathieu, C. et al. Prevention of measles virus infection by intranasal delivery of fusion inhibitor peptides. J Virol 89, 1143-1155, doi:10.1128/JVI.02417-14 (2015).)
張L.等 SARS-CoV-2刺突蛋白中的D614G突變會減少S1脫落並增加傳染性 生物檔案,doi:10.1101/2020.06.12.148726 (2020) (Zhang, L. et al. The D614G mutation in the SARS-CoV-2 spike protein reduces S1 shedding and increases infectivity. bioRxiv, doi:10.1101/2020.06.12.148726 (2020).)
繆可A.等 BNT162b2228疫苗引發的人血清對SARS-CoV-2譜系B.1.1.7假病毒的中和 科學,(2021) (Muik, A. et al., Neutralization of SARS-CoV-2 lineage B.1.1.7 pseudovirus by BNT162b2228 vaccine-elicited human sera. Science, (2021).)
吳K.等,mRNA-1273疫苗引發抗來自230種全球SARS-CoV-2變體的中和抗體 生物檔案,(2021) (Wu K. et al., mRNA-1273 vaccine induces neutralizing antibodies against spike mutants from 230 global SARS-CoV-2 variants. bioRxiv, (2021))
梅克汀A. Z.等 SARS-CoV-2多鹼基切割位點促進早期絲胺酸蛋白酶介導的進入類器官來源的人氣道細胞 生物檔案,2020.2009.2007.286120,doi:10.1101/2020.09.07.286120 (2020) (Mykytyn, A. Z. et al. The SARS-CoV-2 multibasic cleavage site facilitates early serine protease-mediated entry into organoid-derived human airway cells. bioRxiv, 2020.2009.2007.286120, doi:10.1101/2020.09.07.286120 (2020))
霍夫曼M.等 氯喹不抑制人肺細胞感染SARS-CoV-2 自然585,588-590,doi:10.1038/s41586-020-2575-3 (2020) (Hoffmann, M. et al. Chloroquine does not inhibit infection of human lung cells with SARS-CoV-2. Nature 585, 588-590, doi:10.1038/s41586-020-2575-3 (2020).)
理查德M.等 SARS-CoV-2在雪貂間經由接觸及經由空氣傳播 自然通訊11,3496,doi:10.1038/s41467-020-17367-2 (2020) (Richard, M. et al. SARS-CoV-2 is transmitted via contact and via the air between ferrets. Nat Commun 11, 3496, doi:10.1038/s41467-020-17367-2 (2020))
蒙斯特V. J.等 雪貂中豬源2009 A(H1N1)流感病毒的發病機制及傳播 科學325,481-483,doi:10.1126/science.1177127 (2009) (Munster, V. J. et al. Pathogenesis and transmission of swine-origin 2009 A(H1N1) influenza virus in ferrets. Science 325, 481-483, doi:10.1126/science.1177127 (2009).)
瑪蒂娜B. E.等.病毒學:貓及雪貂的SARS病毒感染 自然425,915,doi:10.1038/425915a (2003) (Martina, B. E. et al. Virology: SARS virus infection of cats and ferrets. Nature 425, 915, doi:10.1038/425915a (2003).)
金姆Y. I.等 SARS-CoV-2在雪貂中的感染及快速傳播 細胞宿主微生物,doi:10.1016/j.chom.2020.03.023 (2020) (Kim, Y. I. et al. Infection and Rapid Transmission of SARS-CoV-2 in Ferrets. Cell Host Microbe, doi:10.1016/j.chom.2020.03.023 (2020).)
曹L.等 微微莫耳SARS-CoV-2小蛋白抑制劑的全新設計 科學370,426-431,doi:10.1126/science.abd9909 (2020) (Cao, L. et al. De novo design of picomolar SARS-CoV-2 miniprotein inhibitors. Science 370, 426-431, doi:10.1126/science.abd9909 (2020).)
司庫福M.等 一種超高親和力的合成奈米抗體藉由將刺突蛋白鎖定在非活性構象中來阻斷SARS-CoV-2感染 生物檔案,doi:10.1101/2020.08.08.238469 (2020) (Schoof, M. et al. An ultra-high affinity synthetic nanobody blocks SARS-CoV-2 infection by locking Spike into an inactive conformation. bioRxiv, doi:10.1101/2020.08.08.238469 (2020).)
司庫福M.等 一種超強效合成奈米抗體藉由穩定非活性刺突蛋白來中和SARS-CoV-2 科學370,1473-1479,doi:10.1126/science.abe3255 (2020) (Schoof, M. et al. An ultrapotent synthetic nanobody neutralizes SARS-CoV-2 by stabilizing inactive Spike. Science 370, 1473-1479, doi:10.1126/science.abe3255 (2020).)
考克斯R. M.,沃爾夫J. D.及泊萊姆泊R. K 治療性施用核糖核苷類似物MK-4482/EIDD-2801阻斷SARS-CoV-2在雪貂中的傳播 自然微生物,doi:10.1038/s41564-020-00835-2 (2020) (Cox, R. M., Wolf, J. D. & Plemper, R. K. Therapeutically administered ribonucleoside analogue MK-4482/EIDD-2801 blocks SARS-CoV-2 transmission in ferrets. Nat Microbiol, doi:10.1038/s41564-020-00835-2 (2020).)
T.A.哈爾格倫,B. L.布什,默克分子力場(MMFF94),擴展及應用 美國化學學會論文摘要212,2-Comp (1996) (T. A. Halgren, B. L. Bush, The Merck molecular force field (MMFF94). Extension and application. Abstr Pap Am Chem S 212, 2-Comp (1996).)
R.B.百斯特等,優化目標為改進主鏈φ、ψ以及側鏈χ(1)及χ(2)二面角的採樣的加性CHARMM全原子蛋白質力場 化學理論與計算雜誌8,3257-3273 (2012) (R. B. Best et al., Optimization of the Additive CHARMM All-Atom Protein Force Field Targeting Improved Sampling of the Backbone phi, psi and Side-Chain chi(1) and chi(2) Dihedral Angles. J Chem Theory Comput 8, 3257-3273 (2012).)
S. J.馬林科,H. J.瑞斯萊達,S.耶菲莫夫,D. P.蒂德曼,A. H.德弗裡斯,MARTINI力場:生物分子模擬的粗粒度模型 物理化學雜誌B 111,7812-7824 (2007) (S. J. Marrink, H. J. Risselada, S. Yefimov, D. P. Tieleman, A. H. de Vries, The MARTINI force field: Coarse grained model for biomolecular simulations. J Phys Chem B 111, 7812-7824 (2007).)
Y.蔡等,SARS-CoV-2刺突蛋白的不同構象態 科學369,1586 - 1592 (2020) (Y. Cai et al., Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science 369, 1586- 1592 (2020).)
S. 哈克遜-麥克雷諾茲,S.薑,L.榮,M. 卡弗裡,嚴重急性呼吸綜合征-冠狀病毒七肽重複2結構域在預灌注狀態下的溶液結構 生物化學雜誌281,11965-11971 (2006) (S. Hakansson-McReynolds, S. Jiang, L. Rong, M. Caffrey, Solution structure of the severe acute respiratory syndrome-coronavirus heptad repeat 2 domain in the prefusion state. J Biol Chem 281, 11965-11971 (2006).)
T. N.菲蓋拉等,麻疹病毒融合蛋白衍生肽的體內療效受自組裝及膜滯留特性的調節 病毒學雜誌91(1). pii: e01554-16. (2016) (T. N. Figueira et al., In Vivo Efficacy of Measles Virus Fusion Protein-Derived Peptides Is Modulated by the Properties of Self-Assembly and Membrane Residence. J Virol 91(1). pii: e01554-16. (2016).)
A. Z.梅克汀等,SARS-CoV-2多鹼基切割位點促進早期絲胺酸蛋白酶介導的進入類器官來源的人氣道細胞 生物檔案,2020.2009.2007.286120 (2020) (A. Z. Mykytyn et al., The SARS-CoV-2 multibasic cleavage site facilitates early serine protease- mediated entry into organoid-derived human airway cells. bioRxiv, 2020.2009.2007.286120 (2020).)
M.波羅托等,體內抑制尼帕病毒感染:靶向病毒進入期間副黏液病毒融合激活的早期階段 公共科學圖書館·病原體6,e1001168 (2010) (M. Porotto et al., Inhibition of Nipah virus infection in vivo: targeting an early stage of paramyxovirus fusion activation during viral entry. PLoS Pathog 6, e1001168 (2010).)
V. K.奧特洛等,源自SARS-CoV-2刺突糖蛋白HRC結構域的脂質共軛肽對冠狀病毒體外及離體進入的抑制作用 分子生物技術11(5):e01935- 20. (2020) (V. K. Outlaw et al., Inhibition of Coronavirus Entry In Vitro and Ex Vivo by a Lipid-Conjugated Peptide Derived from the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein HRC Domain. mBio 11(5):e01935- 20. (2020))
G. J.範多倫姆,M.沙騰,J.沃曼斯,G. J.古德美斯特,H. G. 內斯特斯,相較於各種臨床標本快速培養,用於檢測腸道病毒感染的實時核酸擴增的開發及實施 醫學病毒學雜誌79,1868- 1876 (2007) (G. J. van Doornum, M. Schutten, J. Voermans, G. J. Guldemeester, H. G. Niesters, Development and implementation of real-time nucleic acid amplification for the detection of enterovirus infections in comparison to rapid culture of various clinical specimens. J Med Virol 79, 1868- 1876 (2007).)
V. M.科爾曼等,藉由實時RT-PCR檢測2019SARS-CoV-2(2019-nCoV) 歐洲監測25 (3):2000045 (2020) (V. M. Corman et al., Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill 25 (3):2000045 (2020).)
J.帕克及T.加拉格爾,脂質化增加冠狀病毒融合抑制肽的抗病毒活性,病毒學2017;511,9-18 (J. Park and T. Gallagher, Lipidation increases antiviral activities of coronavirus fusion-inhibiting peptides, Virology 2017; 511, 9-18)
無
本申請案至少包含一個彩色圖示。
圖1:SARS-CoV-2刺突(S)糖蛋白結構域架構及結構。
圖2:冠狀病毒感染及細胞進入。
圖3:脂質修飾的HRC肽阻斷早期及潛伏性二者的冠狀病毒進入。
圖4:SARS-CoV-2 S蛋白HRC及HRN的晶體結構。
圖5:SARS及SARSMod肽序列。
圖6的A至C:抑制SARS-CoV-2刺突蛋白(S)介導的融合的肽-脂質共軛物。(A)SARS-CoV-2 S蛋白的功能結構域。(B)源自SARS-CoV-2 S的HRC結構域的肽序列。(C)脂質標記的SARS-CoV-2抑制肽的單體及二聚體形式。
圖7的A至E:藉由MALDI-TOF MS驗證共軛物的特性。(A)SARS
HRC-PEG
4-chol。(B)[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol。(C)[SARS
HRC]
2-PEG
11。(D)SARS
HRC-chol。(E)SARS
HRC-PEG
24-chol。
圖8的A至C:不同SARS脂質-肽融合體的體外效力。(A)使用不同抑制肽的細胞-細胞融合分析。(B)[SARS
HRC- PEG
4]
2-chol肽對各SARS-CoV-2變體、MERS-CoV-2及SARS-CoV的融合抑制活性。(C)[SARS
HRC- PEG
4]
2-chol肽對另外最近出現的各SARS-CoV-2變體、MERS-CoV-2及SARS-CoV的融合抑制活性。
圖9的A至B:添加細胞穿透肽序列不會增加[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol的抗病毒活性。(A)VeroE6細胞。(B)VeroE6-TMPRSS2細胞。
圖10的A至B:病毒-宿主細胞膜融合機制的模型。(A)所提出的病毒包膜上的S與宿主細胞膜上的Ace2之間相互作用導致膜融合的模型。(B)所提出的二聚體脂肽錨定在宿主細胞膜中,並與病毒S蛋白相互作用,從而抑制S介導的融合。
圖11的A至C:[SARS
HRC- PEG
4]
2-chol對SARS-CoV-2抑制的設計及專一性。(A)[SARS
HRC- PEG
4]
2-chol的化學結構。(B)證實[SARS
HRC- PEG
4]
2-chol具有專一性。(C)圖11的B中評估的相應肽的序列。
圖12的A至E:體內生物分佈評定。(A,B)[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol及SARS
HRC-PEG
24施藥(皮下(SQ))。(C,D)鼻內施藥。(E)hACE2轉基因小鼠體內生物分佈實驗的實驗設計。
圖13:接種後( post-inoculation,HPI)1、8、24小時,[SARS
HRC- PEG
4]
2-chol處理(或媒液(vehicle)處理)小鼠的肺切片。(A)肺切片掃描,比例尺 = 500微米(µm);(B)40X影像,比例尺 = 50微米;(C)抗體專一性測試。
圖14的A至B:體內生物分佈評定。
圖15:離體細胞毒性評定。
圖16的A至C:[SARS
HRC- PEG
4]
2-chol及[HPIV3
HRC- PEG
4]
2-chol肽對感染性SARS-CoV-2進入的抑制。(A)DMSO調配的母液;(B)蔗糖調配的母液;(C)A及B中所示資料。
圖17的A至B及圖18的A至B:抑制性脂肽(inhibitory lipopeptide,FIP)、單株抗體(monoclonal antibody,mAb)或接種後血清對抗野生型(wt)SARS-CoV-2及引發關注的變體(variants of concern,VOC)進入的效力。在VeroE6-TMPRSS2細胞(A)及Calu3細胞(B)中進行了測試。
圖19的A至G:融合抑制肽(FIP)、單株抗體(mAb)或接種後血清對野生型SARS-CoV-2及VOC進入的抑制。顯示了FIP(A)、mAb(B至D)濃度增加或接種後血清(E至G)稀釋度增加下,VeroE6-TMPRSS2細胞中的進入抑制百分比。
圖20的A至B:[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol肽對新出現的SARS-CoV-2 S變體的融合抑制活性。(A)β-半乳糖苷酶互補分析。(B)計算抑制百分比。
圖21的A至J:[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol防止體內SARS-CoV-2傳播。(A)實驗設計。(B)在咽喉中檢測到的病毒負荷量。(C)在鼻中檢測到的病毒負荷量。(D)AUC比較。(E)VeroE6上藉由活病毒分離在咽拭子中檢測到的病毒負荷量。(F)藉由RT-qPCR與活病毒分離檢測到的喉部病毒負荷量之間的相關性。(G)存在抗S抗體;(H)存在抗N抗體;(I)存在中和抗體(在活病毒中和分析中測定)。(J)用SARS-CoV-2直接接種經肽處理動物或模擬處理動物。
圖22的A至D:在雪貂中使用的肽母液的體外效力。(A)DMSO調配母液於VeroE6上。(B)DMSO調配母液於VeroE6-TMPRSS上。(C)蔗糖調配母液於VeroE6上。(D)蔗糖調配母液於VeroE6- TMPRSS上。
圖23的A至B:先前進行過肽處理的動物及模擬處理的動物用SARS-CoV-2的激發感染。(A)每天藉由RT-qPCR測定咽拭子中的病毒負荷量,直至接種後7天。(B)曲線下面積(area under the curves,AUC)表明,響應於激發劑量,總基因組負荷量略有下降。
圖24的A至F:單劑量[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol可在體內提供抗SARS-CoV-2傳播的保護。(A)實驗設計。(B)咽喉中檢測到的病毒負荷量。(C)鼻中檢測到的病毒負荷量。(D)B中報告的[HPIV3
HRC-PEG
4]
2-chol處理警哨動物(sentinel)及[SARS
HRC-PEG
4]
2-chol處理警哨動物的基因組負荷量的曲線下面積(AUC)比較。(E)VeroE6上藉由活病毒分離在咽拭子中檢測到的病毒負荷量。(F)藉由RT-qPCR或傳染性病毒分離測定的咽喉中病毒負荷量之間的相關性。
圖25的A至B:對照處理雪貂及肽處理雪貂的體重減輕無顯著差異。(A)使用DMSO調配的肽時雪貂隨時間推移的體重。(B)使用蔗糖調配的肽時雪貂隨時間推移的體重。
圖26:在表達人ACE2受體的轉基因小鼠中SARS肽的體內效力:存活的動物產生中和血清。
序列表 SEQ ID NO:1(SARS肽,亦稱為SARSHRC) DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL SEQ ID NO:2(SARSMod肽) DISQINASVVNIEYEIKKLEEVAKKLEESLIDLQEL SEQ ID NO:3(>sp|P0DTC2|SPIKE_SARS2刺突糖蛋白OS=嚴重急性) ]]> <br/><![CDATA[MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPF FSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQS LLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQP FLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIG INITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVD CALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFA SVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDE VRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPF ERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPA TVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQ TLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYST GSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYT MSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLL QYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKP SKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMI AQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFN SAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDK VEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCG KGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHW FVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHT SPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWL GFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
Claims (56)
- 一種肽,其中所述肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」,且其中所述肽的N-末端部分選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。
- 一種肽,其中所述肽的C-末端部分為「Gly-Ser-Gly-Ser-Cys」,且其中所述肽的N-末端部分與選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的序列具有大於80%、85%、90%、95%但小於100%的同源性。
- 一種SARS脂質-肽融合體,包含如請求項1或2所述的肽及脂質標籤。
- 如請求項3所述的SARS脂質-肽融合體,其中所述脂質標籤為膽固醇、生育酚或棕櫚酸酯。
- 如請求項4所述的SARS脂質-肽融合體,其中所述脂質標籤為膽固醇。
- 一種SARS脂質-肽融合抑制劑,包含如請求項1或2所述的肽、脂質標籤及間隔(spacer)。
- 如請求項6所述的SARS脂質-肽融合抑制劑,其中所述間隔為聚乙二醇(PEG)。
- 如請求項7所述的SARS脂質-肽融合抑制劑,其中所述間隔選自PEG 4、PEG 11及PEG 24組成的群組。
- 如請求項6至8中任一項所述的SARS脂質-肽融合抑制劑,其中所述脂質標籤為膽固醇、生育酚或棕櫚酸酯。
- 如請求項9所述的SARS脂質-肽融合抑制劑,其中所述脂質標籤為膽固醇。
- 如請求項6至10中任一項所述的SARS脂質-肽融合抑制劑,其中所述SARS脂質-肽融合抑制劑具有一個肽部分、一個間隔部分及一個脂質標籤。
- 如請求項6至10中任一項所述的SARS脂質-肽融合抑制劑,其中所述SARS脂質-肽融合抑制劑具有二個肽部分、二個間隔部分及一個脂質標籤。
- 一種藥物組成物,包含如請求項1或2所述的肽及藥學上可接受的賦形劑。
- 一種藥物組成物,包含如請求項1或2所述的肽、脂質標籤及藥學上可接受的賦形劑。
- 如請求項12所述的藥物組成物,其中所述脂質標籤為膽固醇、生育酚或棕櫚酸酯。
- 一種藥物組成物,包含如請求項1或2所述的肽、脂質標籤、間隔及藥學上可接受的賦形劑。
- 如請求項16所述的藥物組成物,其中所述間隔為聚乙二醇(PEG)。
- 如請求項17所述的藥物組成物,其中所述間隔選自PEG 4、PEG 11及PEG 24組成的群組。
- 如請求項16至18中任一項所述的藥物組成物,其中所述脂質標籤為膽固醇、生育酚或棕櫚酸酯。
- 如請求項16至19中任一項所述的藥物組成物,其中所述抑制劑具有一個肽部分、一個間隔部分及一個脂質標籤。
- 如請求項16至19中任一項所述的藥物組成物,其中所述抑制劑具有二個肽部分、二個間隔部分及一個脂質標籤。
- 一種SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物,包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑包括二個SEQ ID NO:1部分、二個PEG 4部分及一個膽固醇標籤。
- 如請求項22所述的SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物,其中每個PEG 4在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接所述膽固醇標籤。
- 一種SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物,包含SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述SARS-CoV-2(COVID-19)脂質-肽融合抑制劑包括一個SEQ ID NO:1部分、一個PEG 24部分及一個膽固醇標籤。
- 如請求項24所述的SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物,其中PEG 24在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇。
- 一種在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,包括向所述受試者施用抗病毒藥物組成物,所述抗病毒藥物組成物包含如請求項1或2所述的肽、脂質標籤、間隔及藥學上可接受的賦形劑。
- 如請求項26所述的在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,其中所述脂質標籤為膽固醇、生育酚或棕櫚酸酯。
- 一種在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,包括向所述受試者施用抗病毒藥物組成物,所述抗病毒藥物組成物包含COVID-19脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述COVID-19脂質-肽融合抑制劑包括二個SEQ ID NO:1部分、二個PEG 4部分及一個膽固醇標籤,其中每個PEG 4在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇。
- 一種在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,包括向所述受試者施用抗病毒藥物組成物,所述抗病毒藥物組成物包含COVID-19脂質-肽融合抑制劑及藥學上可接受的賦形劑,所述COVID-19脂質-肽融合抑制劑包括一個SEQ ID NO:1部分、一個PEG 24部分及一個膽固醇標籤,其中PEG 24在一端側接SEQ ID NO:1,且在另一端側接膽固醇。
- 如請求項26至29中任一項所述的在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,其中所述抗病毒藥物組成物經氣道或皮下施用。
- 如請求項26至29中任一項所述的在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,其中所述抗病毒藥物組成物經鼻內施用。
- 如請求項31所述的在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,其中所述抗病毒藥物組成物以滴鼻劑或噴霧劑的形式施用。
- 如請求項31所述的在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,其中所述抗病毒藥物組成物以鼻用粉末形式施用。
- 如請求項26至33中任一項所述的在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,其中向所述受試者施用至少二次所述抗病毒藥物組成物。
- 如請求項34所述的在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,其中在所述受試者暴露於SARS-CoV-2之前進行至少一次施用。
- 如請求項34所述的在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,其中所有施用皆在所述受試者暴露於SARS-CoV-2之前進行。
- 如請求項34至36中任一項所述的在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,其中每天進行施用。
- 如請求項26至33中任一項所述的在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,其中向所述受試者施用一次所述抗病毒藥物組成物。
- 如請求項38所述的在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,其中在所述受試者暴露於SARS-CoV-2之前進行施用。
- 如請求項26至39中任一項所述的在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,更包括向有此需要的所述受試者施用一種或多種另外的抗病毒物質。
- 如請求項40所述的在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,其中至少一種另外的抗病毒物質靶向SARS-CoV-2生命週期的不同於SARS HRC肽的態樣。
- 如請求項26至41中任一項所述的在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,其中所述肽在所述受試者的上呼吸道及下呼吸道二者中皆達到生物有效濃度。
- 如請求項26至42中任一項所述的在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,其中所述肽在所述受試者的肺中達到生物有效濃度。
- 如請求項26至43中任一項所述的在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,其中所述肽在所述受試者的血液中達到生物有效濃度。
- 如請求項26至43中任一項所述的在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,其中防止由包含刺突蛋白的SARS-CoV-2的病毒體引起的COVID-19,其中所述刺突蛋白的序列不同於SEQ ID NO:3。
- 如請求項45所述的在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,其中SARS-CoV-2選自SARS-CoV-2 S247R、SARS-CoV-2 D614G、SARS-CoV-2 S943P及SARS-CoV-2 D839Y組成的群組。
- 如請求項45所述的在有此需要的受試者中預防COVID-19的方法,其中SARS-CoV-2選自SARS-CoV-2α變體、β變體、γ變體、δ變體及λ變體組成的群組。
- 一種降低SARS-CoV-2感染受試者細胞的風險的方法,包括施用有效量的如請求項22至25中任一項所述的組成物以抑制細胞的SARS-CoV-2感染。
- 一種降低受試者中COVID-19風險的方法,包括向所述受試者施用有效量的如請求項22至25中任一項所述的SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物以抑制細胞的SARS-CoV-2感染。
- 一種降低受試者死於COVID-19的風險的方法,包括向所述受試者施用有效量的如請求項22至25中任一項所述的SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物以抑制所述受試者細胞的SARS-CoV-2感染,其中所述受試者死於COVID-19的風險降低。
- 一種在有此需要的受試者中預防或降低COVID-19風險的方法,包括向所述受試者施用有效量的如請求項22至25中任一項所述的SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物以抑制所述受試者中細胞的SARS-CoV-2的病毒性感染,其中產生針對SARS-CoV-2的中和抗體。
- 如請求項51所述的在有此需要的受試者中預防或降低COVID-19風險的方法,其中所述受試者已經暴露於SARS-CoV-2。
- 如請求項52所述的在有此需要的受試者中預防或降低COVID-19風險的方法,其中至少一些有效量的所述SARS-CoV-2(COVID-19)抗病毒組成物在所述受試者暴露於SARS-CoV-2期間施用於所述受試者。
- 如請求項48至53中任一項所述的在有此需要的受試者中預防或降低COVID-19風險的方法,其中COVID-19將由包含刺突蛋白的SARS-CoV-2的病毒體引起,其中所述刺突蛋白的序列不同於SEQ ID NO:3。
- 如請求項54所述的在有此需要的受試者中預防或降低COVID-19風險的方法,其中SARS-CoV-2選自SARS-CoV-2 S247R、SARS-CoV-2 D614G、SARS-CoV-2 S943P及SARS-CoV-2 D839Y組成的群組。
- 如請求項54所述的在有此需要的受試者中預防或降低COVID-19風險的方法,其中SARS-CoV-2選自SARS-CoV-2α變體、β變體、γ變體、δ變體及λ變體組成的群組。
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