JP2024504225A

JP2024504225A - Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２抗ウイルス薬としてのリポペプチド融合阻害物質

Info

Publication number: JP2024504225A
Application number: JP2023523609A
Authority: JP
Inventors: マッテオポーロット，; アンモスコーナー，; スワート，リックデ; ヴリーズ，ローリーデ; ブランカホーバット，; シリルマスユー，
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Erasmus University Medical Center
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Erasmus University Medical Center
Priority date: 2020-10-14
Filing date: 2021-10-13
Publication date: 2024-01-31
Also published as: IL302066A; WO2022081711A4; KR20240038643A; WO2022081711A1; EP4228673A1; TW202229316A; CA3195563A1

Abstract

脂質ペプチド融合抗ウイルス療法によってＣＯＶＩＤ－１９を予防する組成物及び方法が、ここに記載される。【選択図】図２１Ａ

Description

本出願は、２０２０年１０月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／０９１９１５号、２０２０年１０月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／１０７４２９号、２０２１年１月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／１３９３０２号及び第６３／１３９３０６号、２０２１年２月２日に出願された米国仮特許出願第６３／１４４６０６号並びに２０２１年２月３日に出願された米国仮特許出願第６３／１４５４５３号に対する優先権を主張し、それらの全てはそれらの全体において参照によってここに取り込まれる。

ここに引用されるすべての特許、特許出願及び刊行物は、それらの全体において参照によってここに取り込まれる。これらの刊行物のそれらの全体における開示は、参照によって本出願に取り込まれる。

本特許開示は、著作権保護の対象となる材料を含む。著作権所有者は、米国特許商標庁の特許出願又は記録に記載されている特許文書又は特許開示のいずれの者による複製にも異議はないが、それ以外の場合はあらゆる著作権を保有する。

政府支援
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金ＡＩ１１４７３６及びＡＩ１２１３４９下の政府支援により行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。

重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ）ウイルスを含むコロナウイルスによる感染は、ウイルスエンベロープと肺細胞膜の間の膜融合を必要とする。融合プロセスは、スパイクタンパク質又はＳとも呼ばれるウイルスのエンベロープ糖タンパク質によって媒介される。現在のところ、感染した個体の予防又は処置に利用可能な治療オプションはない。新たに出現した病原性ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９呼吸器疾患の原因）は、人間の健康状態及び社会秩序に対する世界的な脅威を表す。したがって、ＣＯＶＩＤ－１９の現在のパンデミックを考えると、これらのコロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する有効な抗ウイルス療法の開発は、国内だけでなく世界的にも最優先事項である。

ある態様では、本発明は、ペプチドを提供し、ペプチドのＣ末端部分は「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」であり、ペプチドのＮ末端部分は配列番号１及び配列番号２から選択される。ある態様では、本発明はペプチドを提供し、ペプチドのＣ末端部分は「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」であり、ペプチドのＮ末端部分は配列番号１及び配列番号２から選択される配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％を超えるが１００％未満の相同性を有する。

ある態様では、ＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合体は、脂質タグと、ペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択されるペプチド、又はペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択される配列に対して８０％以上、８５％、９０％、９５％を超えるが１００％未満の相同性を有するペプチドと、を含む。

いくつかの実施形態では、脂質タグは、コレステロール、トコフェロール又はパルミテートである。いくつかの実施形態では、脂質タグは、コレステロールである。

ある態様では、ＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合阻害物質は、脂質タグと、スペーサーと、ペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択されるペプチド、又はペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択される配列に対して８０％以上、８５％、９０％、９５％を超えるが１００％未満の相同性を有するペプチドと、を含む。

いくつかの実施形態では、スペーサーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＰＥＧ_４、ＰＥＧ_１１又はＰＥＧ_２４である。いくつかの実施形態では、脂質タグは、コレステロール、トコフェロール又はパルミテートである。いくつかの実施形態では、脂質タグはコレステロールである。

いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合阻害物質は、１つのペプチド部位、１つのスペーサー部位及び１つの脂質タグを有する。いくつかの実施形態では、阻害物質は、２つのペプチド部位、２つのスペーサー部位及び１つの脂質タグを有する。用語「リンカー」及び「スペーサー」は、本出願において互換可能に用いられる。

ある態様では、薬学的組成物は、ペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択されるペプチド、又はペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択される配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％を超えるが１００％未満の相同性を有するペプチドと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む。

ある態様では、薬学的組成物は、ペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択されるペプチド、又はペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択される配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％を超えるが１００％未満の相同性を有するペプチドと、脂質タグと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む。

いくつかの実施形態では、脂質タグは、コレステロール、トコフェロール又はパルミテートである。

ある態様では、薬学的組成物は、ペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択されるペプチド、又はペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択される配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％を超えるが１００％未満の相同性を有するペプチドと、脂質タグと、スペーサーと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む。

いくつかの実施形態では、スペーサーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＰＥＧ_４、ＰＥＧ_１１又はＰＥＧ_２４である。いくつかの実施形態では、脂質タグは、コレステロール、トコフェロール又はパルミテートである。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合阻害物質は、１つのペプチド部位、１つのスペーサー部位及び１つの脂質タグを有する。いくつかの実施形態では、阻害物質は、２つのペプチド部位、２つのスペーサー部位及び１つの脂質タグを有する。

ある態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含む。阻害物質は、配列番号１の２つの部位、２つのＰＥＧ_４部位、１つのコレステロールタグ及び薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、各ＰＥＧ_４は、一端を配列番号１及び他端をコレステロールタグによって隣接される。

ある態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含む。阻害物質は、配列番号１の１つの部位、１つのＰＥＧ_４部位、１つのコレステロールタグ及び薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ_４は、一端を配列番号１及び他端をコレステロールタグによって隣接される。

ある態様では、本発明は、抗ウイルス薬学的組成物を、必要とする被検体に投与するステップを含むＣＯＶＩＤ－１９を予防する方法を提供する。薬学的組成物は、ペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択されるペプチド、又はペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択される配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％を超えるが１００％未満の相同性を有するペプチドと、脂質タグと、スペーサーと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む。

ある態様では、本発明は、抗ウイルス薬学的組成物を、必要とする被検体に投与するステップを含むＣＯＶＩＤ－１９を予防する方法を提供する。薬学的組成物は、配列番号１の２つの部位、２つのＰＥＧ_４部位、１つのコレステロールタグ及び薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含み、各ＰＥＧ_４は一端を配列番号１及び他端をコレステロールによって隣接される。

ある態様では、本発明は、抗ウイルス薬学的組成物を、必要とする被検体に投与するステップを含むＣＯＶＩＤ－１９を予防する方法を提供する。薬学的組成物は、配列番号１の１つの部位、１つのＰＥＧ_２４部位、１つのコレステロールタグ及び薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含み、ＰＥＧ_２４は一端を配列番号１及び他端をコレステロールによって隣接される。

いくつかの実施形態では、抗ウイルス薬学的組成物は、経気道又は皮下投与される。いくつかの実施形態では、抗ウイルス薬学的組成物は鼻腔内投与される。いくつかの実施形態では、抗ウイルス薬学的組成物は、点鼻液又はスプレーとして投与される。いくつかの実施形態では、抗ウイルス薬学的組成物は、点鼻粉末として投与される。

いくつかの実施形態では、抗ウイルス薬学的組成物は、被検体に少なくとも２回投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の投与は、被検体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露される前に行われる。いくつかの実施形態では、すべての投与は、被検体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露される前に行われる。いくつかの実施形態では、抗ウイルス薬学的組成物は、毎日投与される。

いくつかの実施形態では、抗ウイルス薬学的組成物は、被検体に１回投与される。いくつかの実施形態では、投与は、被検体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露される前に行われる。

いくつかの実施形態では、抗ウイルス薬学的組成物は、その必要のある被検体に１以上の追加の抗ウイルス物質とともに投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の抗ウイルス物質は、ＳＡＲＳ_ＨＲＣペプチドとは異なる態様のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ライフサイクルを標的とする。

いくつかの実施形態では、ペプチドは、被検体の上気道及び下気道の双方において生物学的に有効な濃度に到達する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、被検体の肺において生物学的に有効な濃度に到達する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、被検体の血液において生物学的に有効な濃度に到達する。

いくつかの実施形態では、方法は、スパイクタンパク質を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオンによって引き起こされていたであろうＣＯＶＩＤ－１９を予防し、スパイクタンパク質の配列は配列番号３とは異なる。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ２４７Ｒ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＤ６１４Ｇ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ９４３Ｐ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＤ８３９Ｙからなる群から選択される。いくつかの他の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ及びラムダ変異体からなる群から選択される。

ある態様では、本発明は、被検体における細胞に感染するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリスクを低減する方法を提供する。本方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物の有効量を投与して細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害するステップを含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物は、配列番号１の２つの部位と、２つのＰＥＧ_４部位と、１つのコレステロールタグと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含む。各ＰＥＧ_４は、一端を配列番号１及び他端をコレステロールタグによって隣接され得る。あるいは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物は、配列番号１の１つの部位と、１つのＰＥＧ_２４部位と、１つのコレステロールタグと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含む。ＰＥＧ_２４は、一端を配列番号１及び他端をコレステロールによって隣接され得る。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物が配列番号１の２つの部位と、２つのＰＥＧ_４部位と、１つのコレステロールタグと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含むある態様では、その鼻腔内投与は、投与後１時間までに、被検体の鼻甲介及び肺において同等レベルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質をもたらす。例えば、脂質－ペプチド融合阻害物質の濃度の、双方のレベルが同程度の大きさであり、又は一方のレベルが他方のレベルの２５％以内であり、若しくは一方のレベルが他方のレベルの５０％以内である場合、２つのレベルは同等である。いくつかの実施形態では、同等レベルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質は、鼻腔内投与後８時間まで被検体の肺及び鼻甲介の双方で維持される。いくつかの実施形態では、同等レベルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質は、鼻腔内投与後２４時間まで被検体の肺及び鼻甲介の双方で維持される。いくつかの実施形態では、同等レベルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質は、鼻腔内投与後４８時間まで被検体の肺及び鼻甲介の双方で維持される。

ある態様では、本発明は、被検体におけるＣＯＶＩＤ－１９のリスクを低減する方法を提供する。本方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物の有効量を投与して細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害するステップを含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物は、配列番号１の２つの部位と、２つのＰＥＧ_４部位と、１つのコレステロールタグと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含む。各ＰＥＧ_４は、一端を配列番号１及び他端をコレステロールタグによって隣接され得る。あるいは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物は、配列番号１の１つの部位と、１つのＰＥＧ_２４部位と、１つのコレステロールタグと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含む。ＰＥＧ_２４は、一端を配列番号１及び他端をコレステロールによって隣接され得る。

ある態様では、本発明は、被検体におけるＣＯＶＩＤ－１９による死亡のリスクを低減する方法を提供する。本方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物の有効量を投与して細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害するステップを含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物は、配列番号１の２つの部位と、２つのＰＥＧ_４部位と、１つのコレステロールタグと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含む。各ＰＥＧ_４は、一端を配列番号１及び他端をコレステロールタグによって隣接され得る。あるいは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物は、配列番号１の１つの部位と、１つのＰＥＧ_２４部位と、１つのコレステロールタグと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含む。ＰＥＧ_２４は、一端を配列番号１及び他端をコレステロールによって隣接され得る。

いくつかの実施形態では、本方法は、スパイクタンパク質を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオンによって引き起こされていたであろうＣＯＶＩＤ－１９を予防し、スパイクタンパク質の配列は配列番号３とは異なる。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ２４７Ｒ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＤ６１４Ｇ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ９４３Ｐ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＤ８３９Ｙからなる群から選択される。いくつかの他の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＢアルファ、ベータ、ガンマ、デルタ及びラムダ変異体からなる群から選択される。

本出願は、色付きで作成された少なくとも１つの図面を含む。

図１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質ドメインの構成及び構造を示す。図２は、コロナウイルスによる感染及び細胞侵入を示す。図３は、脂質修飾されたＨＲＣペプチドの、初期及び後期コロナウイルスの双方のウイルス侵入のブロックを示す。図４は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＨＲＣ及びＨＲＮの結晶構造を示す。図５は、ＳＡＲＳ及びＳＡＲＳＭｏｄペプチドの配列を示す。図６Ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）媒介性融合を阻害するペプチド－脂質複合体を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の機能ドメインを示す。図６Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）媒介性融合を阻害するペプチド－脂質複合体を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのＨＲＣドメインに由来するペプチドの配列を示す。図６Ｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）媒介性融合を阻害するペプチド－脂質複合体を示す。脂質タグ付きＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害ペプチドの単量体及び２量体形態を示す。図７Ａは、複合体の同一性のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳによる検証を示す。ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４－ｃｈｏｌを示す。図７Ｂは、複合体の同一性のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳによる検証を示す。［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌを示す。図７Ｃは、複合体の同一性のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳによる検証を示す。［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ］_２－ＰＥＧ_１１を示す。図７Ｄは、複合体の同一性のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳによる検証を示す。ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ｃｈｏｌを示す。図７Ｅは、複合体の同一性のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳによる検証を示す。ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_２４－ｃｈｏｌを示す。図８Ａは、様々なＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合体のｉｎｖｉｔｒｏ効力を示す。様々な阻害ペプチドによる細胞間融合アッセイを示す。図８Ｂは、様々なＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合体のｉｎｖｉｔｒｏ効力を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶに対する［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドの融合阻害活性を示す。図８Ｃは、様々なＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合体のｉｎｖｉｔｒｏ効力を示す。追加の、近年新たに出現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶに対する［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドの融合阻害活性を示す。図９Ａは、細胞透過性ペプチド配列の追加によって増加しない［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの抗ウイルス活性を示す。ＶｅｒｏＥ６細胞を示す。図９Ｂは、細胞透過性ペプチド配列の追加によって増加しない［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの抗ウイルス活性を示す。ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞を示す。図１０Ａは、ウイルス－宿主細胞膜融合のメカニズムについてのモデルを示す。膜融合をもたらす、ウイルスエンベロープにおけるＳと宿主細胞膜におけるＡｃｅ２との間の相互作用のモデルの提案を示す。図１０Ｂは、ウイルス－宿主細胞膜融合のメカニズムについてのモデルを示す。２量体リポペプチドの宿主細胞膜における係留及びＳ媒介性融合を阻害するウイルスＳタンパク質との相互作用の提案を示す。図１１Ａは、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害の設計及び特異性を示す。［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの化学構造を示す。図１１Ｂは、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害の設計及び特異性を示す。［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌは特異的であることを証明した。図１１Ｃは、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害の設計及び特異性を示す。図１１Ｂにおいて評価されたそれぞれのペプチドの配列を示す。図１２Ａは、ｉｎｖｉｖｏ生体内分布評価を示す。［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの投与（ＳＱ）を示す。図１２Ｂは、ｉｎｖｉｖｏ生体内分布評価を示す。ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_２４の投与（ＳＱ）を示す。図１２Ｃは、ｉｎｖｉｖｏ生体内分布評価を示す。鼻腔内投与を示す。図１２Ｄは、ｉｎｖｉｖｏ生体内分布評価を示す。鼻腔内投与を示す。図１２Ｅは、ｉｎｖｉｖｏ生体内分布評価を示す。ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスにおける生体内分布実験の実験設計を示す。図１３Ａは、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ処置（又はビヒクル処置）マウスの接種後時間（ＨＰＩ）１、８、２４時間での肺切片を示す。肺タイルスキャン、スケールバー＝５００μｍである。図１３Ｂは、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ処置（又はビヒクル処置）マウスの接種後時間（ＨＰＩ）１、８、２４時間での肺切片を示す。４０倍画像、スケールバー＝５０μｍである。図１３Ｃは、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ処置マウスの肺切片を示す。抗体特異性試験を示す。図１４Ａは、ｉｎｖｉｖｏ生体内分布評価を示す。図１４Ｂは、ｉｎｖｉｖｏ生体内分布評価を示す。図１５は、ｅｘｖｉｖｏ細胞毒性評価を示す。図１６Ａは、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ及び［ＨＰＩＶ３_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドによる感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入の阻害を示す。ＤＭＳＯ処方ストックを示す。図１６Ｂは、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ及び［ＨＰＩＶ３_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドによる感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入の阻害を示す。スクロース処方ストックを示す。図１６Ｃは、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ及び［ＨＰＩＶ３_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドによる感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入の阻害を示す。図１６Ａ及びＢに示すデータを示す。図１７Ａは、ｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び懸念される変異体（ＶＯＣ）の侵入に対する阻害リポペプチド（ＦＩＰ）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はワクチン接種後血清の効力を示す。試験を、ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞において行った。図１７Ｂは、ｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び懸念される変異体（ＶＯＣ）の侵入に対する阻害リポペプチド（ＦＩＰ）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はワクチン接種後血清の効力を示す。試験を、Ｃａｌｕ３細胞において行った。図１８Ａは、ｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び懸念される変異体（ＶＯＣ）の侵入に対する阻害リポペプチド（ＦＩＰ）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はワクチン接種後血清の効力を示す。試験を、ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞において行った。図１８Ｂは、ｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び懸念される変異体（ＶＯＣ）の侵入に対する阻害リポペプチド（ＦＩＰ）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はワクチン接種後血清の効力を示す。試験を、Ｃａｌｕ３細胞において行った。図１９Ａは、融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はワクチン接種後血清によるｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＶＯＣ侵入の阻害を示す。ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞における侵入阻害割合を、ＦＩＰの濃度の増加について示す。図１９Ｂは、融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はワクチン接種後血清によるｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＶＯＣ侵入の阻害を示す。ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞における侵入阻害割合を、ｍＡｂの濃度の増加について示す。図１９Ｃは、融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はワクチン接種後血清によるｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＶＯＣ侵入の阻害を示す。ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞における侵入阻害割合を、ｍＡｂの濃度の増加について示す。図１９Ｄは、融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はワクチン接種後血清によるｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＶＯＣ侵入の阻害を示す。ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞における侵入阻害割合を、ｍＡｂの濃度の増加について示す。図１９Ｅは、融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はワクチン接種後血清によるｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＶＯＣ侵入の阻害を示す。ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞における侵入阻害割合を、ワクチン接種後血清の希釈化の増加について示す。図１９Ｆは、融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はワクチン接種後血清によるｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＶＯＣ侵入の阻害を示す。ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞における侵入阻害割合を、ワクチン接種後血清の希釈化の増加について示す。図１９Ｇは、融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はワクチン接種後血清によるｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＶＯＣ侵入の阻害を示す。ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞における侵入阻害割合を、ワクチン接種後血清の希釈化の増加について示す。図２０Ａは、新たに出現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ変異体に対する［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドの融合阻害活性を示す。β－ガラクトシダーゼ相補アッセイを示す。図２０Ｂは、新たに出現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ変異体に対する［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドの融合阻害活性を示す。パーセント阻害を計算した。図２１Ａは、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌによる、ｉｎｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播の予防を示す。実験設計を示す。図２１Ｂは、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌによる、ｉｎｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播の予防を示す。咽頭において検出されたウイルス量を示す。図２１Ｃは、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌによる、ｉｎｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播の予防を示す。鼻腔において検出されたウイルス量を示す。図２１Ｄは、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌによる、ｉｎｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播の予防を示す。ＡＵＣの比較を示す。図２１Ｅは、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌによる、ｉｎｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播の予防を示す。ＶｅｒｏＥ６における生ウイルス分離によって咽頭スワブにおいて検出されたウイルス量を示す。図２１Ｆは、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌによる、ｉｎｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播の予防を示す。ＲＴ－ｑＰＣＲ及び生ウイルス分離を介して検出された咽頭におけるウイルス量の間の相関を示す。図２１Ｇは、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌによる、ｉｎｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播の予防を示す。抗Ｓ抗体の存在を示す。図２１Ｈは、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌによる、ｉｎｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播の予防を示す。抗Ｎ抗体の存在を示す。図２１Ｉは、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌによる、ｉｎｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播の予防を示す。生ウイルス中和アッセイにおいて特定された中和抗体の存在を示す。図２１Ｊは、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌによる、ｉｎｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播の予防を示す。ペプチド処置又は模擬処置動物のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による直接接種を示す。図２２Ａは、フェレットにおいて用いられるペプチドストックのｉｎｖｉｔｒｏ効力を示す。ＶｅｒｏＥ６におけるＤＭＳＯ処方ストックを示す。図２２Ｂは、フェレットにおいて用いられるペプチドストックのｉｎｖｉｔｒｏ効力を示す。ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳにおけるＤＭＳＯ処方ストックを示す。図２２Ｃは、フェレットにおいて用いられるペプチドストックのｉｎｖｉｔｒｏ効力を示す。ＶｅｒｏＥ６におけるスクロース処方ストックを示す。図２２Ｄは、フェレットにおいて用いられるペプチドストックのｉｎｖｉｔｒｏ効力を示す。ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳにおけるスクロース処方ストックを示す。図２３Ａは、事前にペプチド処置した動物及び模擬処置した動物のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による攻撃感染を示す。咽頭スワブにおけるウイルス量を接種後７日までＲＴ－ｑＰＣＲによって毎日特定した。図２３Ｂは、事前にペプチド処置した動物及び模擬処置した動物のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による攻撃感染を示す。曲線下面積（ＡＵＣ）は、総ゲノム量が攻撃用量に対応してわずかに減少することを示す。図２４Ａは、ｉｎｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播に対する保護を提供する［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの単一用量を示す。実験設計を示す。図２４Ｂは、ｉｎｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播に対する保護を提供する［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの単一用量を示す。咽頭において検出されたウイルス量を示す。図２４Ｃは、ｉｎｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播に対する保護を提供する［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの単一用量を示す。鼻腔において検出されたウイルス量を示す。図２４Ｄは、ｉｎｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播に対する保護を提供する［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの単一用量を示す。［ＨＰＩＶ３_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ処置及び［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ処置センチネルについて図２４Ｂにおいて報告されたゲノム量による曲線下面積（ＡＵＣ）の比較を示す。図２４Ｅは、ｉｎｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播に対する保護を提供する［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの単一用量を示す。ＶｅｒｏＥ６における生ウイルス分離によって咽頭スワブにおいて検出されたウイルス量を示す。図２４Ｆは、ｉｎｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播に対する保護を提供する［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの単一用量を示す。ＲＴ－ｑＰＣＲ及び感染性ウイルス分離によって特定された咽頭におけるウイルス量の間の相関を示す。図２５Ａは、コントロール処置及びペプチド処置フェレットにおける、有意には異ならない体重減少を示す。ＤＭＳＯ処方ペプチドによる経時的なフェレットの体重を示す。図２５Ｂは、コントロール処置及びペプチド処置フェレットにおける、有意には異ならない体重減少を示す。スクロース処方ペプチドによる経時的なフェレットの体重を示す。図２６は、ヒトＡＣＥ２受容体を発現するトランスジェニックマウスにおけるＳＡＲＳペプチドのｉｎｖｉｖｏ有効性を示し、生存動物には中和血清が認められた。

図面の詳細な説明
図１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）糖タンパク質ドメインの構成及び構造
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳの簡略化された概略図を示す。Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、融合ペプチド（ＦＰ）ドメイン、Ｎ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＮ）ドメイン、Ｃ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ドメイン、膜貫通（ＴＭ）ドメイン及び細胞質テール（ＣＰ）ドメインを示す。両端のリピートセクションＨＲＮ及びＨＲＣは互いを認識し、ともにスナップして折り畳み構造を形成する。融合阻害ペプチドはリピートセクションに結合し、折り畳み構造の形成を予防し、したがってウイルスの融合及び侵入をブロックする。

図２：コロナウイルスによる感染及び細胞侵入

図３：脂質修飾されたＨＲＣペプチドの、初期及び後期コロナウイルスの双方のウイルス侵入をブロックする
これは、我々の脂質複合ＭＥＲＳ由来ペプチドを用いて得られた結果の概略図である。図は、Ｐａｒｋ及びＧａｌｌａｇｈｅｒ，Ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｅｓａｎｔｉｖｉｒａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｆｕｓｉｏｎ－ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２０１７年；５１１，ＧｒａｐｈｉｃＡｂｓｔｒａｃｔでの９～１８による。

図４：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質（ＰＤＢ６ＬＸＴ）のＨＲＣ（赤色）ドメイン及びＨＲＮ（青色）ドメインによって形成される６ＨＢアセンブリの結晶構造
ＨＲＣでは、中央のヘリックス及び両側の伸長セグメントに留意。

図５：ペプチドＳＡＲＳにおいて表されるように各端に番号を示すＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＨＲＣドメインの配列（上）
２つの「ｈ」記号は、ヘリカルセグメントの境界を示す。ペプチドＳＡＲＳと比較して、ペプチドＳＡＲＳＭｏｄは、７個のα－アミノ酸残基の変化を含む。

図６Ａ～Ｂ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）媒介性融合を阻害するペプチド－脂質複合体
（Ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の機能ドメイン：受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）及びヘプタッドリピート（ＨＲＮ及びＨＲＣ）を示す。（Ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳのＨＲＣドメインに由来するペプチドの配列である。（Ｃ）細胞間融合アッセイにおいて評価された脂質タグ付きＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害ペプチドの単量体及び２量体形態である。

図７Ａ～Ｅ：複合体の同一性をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳによって検証した
（Ａ）ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４－ｃｈｏｌのＭＡＬＤＩ。理論値：５１７０．８Ｄａ、観測値：５１７０．１Ｄａ。（Ｂ）［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌのＭＡＬＤＩ。理論上のｍ／ｚ：１０，３３５．４Ｄａ、観測値１０，３３９．１０Ｄａ。（Ｃ）［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ］_２－ＰＥＧ_１１のＭＡＬＤＩ。理論上のｍ／ｚ：９８４１．０Ｄａ、観測上のｍ／ｚ：９，８３９．４０Ｄａ。（Ｄ）ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ｃｈｏｌのＭＡＬＤＩ。理論上のｍ／ｚ：４９２３．６４Ｄａ、観測値：４９２３．７４Ｄａ。（Ｅ）ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_２４－ｃｈｏｌのＭＡＬＤＩ。理論上のｍ／ｚ：６０５１．３１Ｄａ、観測値：６０５３．４８Ｄａ。

図８Ａ～Ｃ：様々なＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合体のｉｎｖｉｔｒｏ効力
（Ａ）様々な阻害ペプチドによる細胞間融合アッセイ。阻害割合を、６個の異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ペプチド及びコントロールＨＰＩＶ３特異的ペプチドについて濃度を増加させて示す。パーセント阻害を、特定濃度の阻害物質の存在下での相対発光単位及び阻害物質の非存在下での相対発光単位の比として計算し、バックグラウンド発光について補正した。％阻害＝１００×［１－（Ｘでの発光－バックグラウンド）／（阻害物質の非存在下での発光－バックグラウンド）］。［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌリポペプチドとＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４－ｃｈｏｌリポペプチドとの結果の差は、統計的に有意であった（二元配置分散分析、ｐ＜０．０００１）。（Ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ２４７Ｒ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＤ６１４Ｇ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ９４３Ｐ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＤ８３９Ｙ）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶに対する［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドの融合阻害活性。（Ｃ）追加の、近年新たに出現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＤ６１４Ｇ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ（Ｂ１．１．７）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ベータ（Ｂ１．３５１））、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶに対する［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドの融合阻害活性。（Ａ、Ｂ及びＣ）のデータは、４パラメータ用量反応モデルを表す曲線での、３つの別個の実験による平均値±標準誤差（ＳＥＭ）である。

図９Ａ～Ｂ：細胞透過性ペプチド配列の追加は［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの抗ウイルス活性を増加させない
（Ａ）ＶｅｒｏＥ６細胞におけるＴＡＴ－ＳＡＲＳ比較－ペプチド有効性の比較。（Ｂ）ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞におけるＴＡＴ－ＳＡＲＳ比較－ペプチド有効性の比較。双方のパネルでは、感染の阻害割合を、ＶｅｒｏＥ６及びＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞において、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ（水色の線）及び［ＴＡＴ－ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ（紺色の線）の濃度を増加させて示す。

図１０Ａ～Ｂ：ウイルス－宿主細胞膜融合のメカニズムについてのモデル
（Ａ）膜融合をもたらす、ウイルスエンベロープにおけるＳと宿主細胞膜におけるＡｃｅ２との間の相互作用の提案されたモデル。（Ｂ）２量体リポペプチドの宿主細胞膜における係留及びＳ媒介性融合を阻害するウイルスＳタンパク質との提案された相互作用。

図１１Ａ～Ｃ：［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害の設計及び特異性
（Ａ）［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの化学構造である。（Ｂ）他のいくつかのヒト病原体によるＨＲＣドメインに基づくリポペプチドは、試験した濃度ではＳ媒介性融合を阻害しなかった（ヒトメタニューモウイルス＝ＨＭＰＶ、ウエストナイルウイルス＝ＷＮＶ、ヒトパラインフルエンザウイルス３型＝ＨＰＩＶ３）ので、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌは特異的であることを証明した。パーセント融合阻害を、特定濃度の阻害物質の存在下での相対発光単位及び阻害物質の非存在下での相対発光単位の比として計算し、バックグラウンド発光について補正した。データは、平均値±標準偏差（ＳＤ）である。（Ｃ）図１１Ｂにおいて評価されたそれぞれのペプチドの配列。

図１２Ａ～Ｅ：ｉｎｖｉｖｏ生体内分布評価
（Ａ、Ｂ）マウスに［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ及びＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_２４を皮下（ＳＱ）注入し、投薬後１、８及び２４時間で肺及び血液を収穫した。リポペプチドの濃度（ｙ軸）を、肺ホモジネート及び血漿サンプル（ペプチド処置ｎ＝３又は４）においてＥＬＩＳＡによって測定した。ｎ＝１の模擬処置マウスを陰性コントロールとして含めた。実験を、各ＥＬＩＳＡポイントについてトリプリケートで実施した。中央値を横棒によって示す。（Ｃ、Ｄ）鼻腔内投与後に行った同様の実験。（Ｅ）ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスにおける生体内分布実験の実験設計。マウスに［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ及びＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_２４を鼻腔内（ＩＮ）接種し、投薬後１、８及び２４時間で肺及び血液を収穫した。

図１３：抗ＳＡＲＳ－ＨＲＣ抗体（赤色）で染色し、核をＤＡＰＩ（青色）で対比染色した［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ処置（又はビヒクル処置）マウスの肺内分布
画像は、ビヒクルで処置したものと比較して、接種後時間（ＨＰＩ）１、８、２４時間において処置した動物の肺切片における［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの広い分布を確認した。（Ａ）肺タイルスキャン、スケールバー＝５００μｍ、（Ｂ）４０倍画像、スケールバー＝５０μｍ、（Ｃ）抗体特異性試験。二次抗体のみで染色した［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ処置マウスの肺切片は、交差反応シグナルを示さなかった。

図１４Ａ～Ｂ：ｉｎｖｉｖｏ生体内分布評価
マウスに（Ａ）［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ又は（Ｂ）ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_２４を鼻腔内注入（ＩＮ）した。臓器及び血液を、投薬後１、８、２４及び４８時間で収穫した（ｎ＝２～６匹のマウス）。リポペプチドの濃度（ｙ軸）を、肺ホモジネート、鼻甲介、血漿、脳、脾臓、腎臓及び肝臓のサンプルにおいてＥＬＩＳＡによって測定した。中央値を横棒によって示し、検出限界を点線によって示す。図から分かるように、鼻甲介及び肺における２量体脂質－ペプチド融合阻害物質の生体内分布は同等であり、同等の濃度が鼻腔内投与後１、８、２４及び４８時間で維持された。単量体脂質－ペプチド融合阻害物質の生体内分布は２量体とは著しく異なり、投与後１、８、２４及び４８時間で肺よりも鼻甲介においてより低いレベルの単量体が見られた。

図１５：ｅｘｖｉｖｏ細胞毒性評価
ＭＴＴ（３－［４，５－ジメチルチアゾール－２－イル］－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを用いて、ヒト気道上皮（ＨＡＥ）細胞における［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ、ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４－ｃｈｏｌ及びＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_２４－ｃｈｏｌの毒性を特定した。すべてのリポペプチドについて観察された毒性は、試験した最高濃度（１００μＭ）であっても３０％未満であった。用量反応の欠如及びこのｅｘｖｉｖｏモデルの本来の変動性に基づいて、我々は３０％をこの毒性アッセイの変動範囲であると考える。シクロヘキシミド（第２のｘ軸における０．１、１及び１０ｍｇ／ｍｌで、紫色のＣＨＥ）を陽性コントロールとして用いた。

図１６Ａ～Ｃ：［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ及び［ＨＰＩＶ３_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドによる感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入の阻害
（Ａ、Ｂ）感染の阻害割合を、ＶｅｒｏＥ６及びＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞において、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ（赤色の線）及び［ＨＰＩＶ３_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ（灰色の線）の濃度を増加させて示す。ＤＭＳＯ処方（Ａ）及びスクロース処方（Ｂ）のストックを比較して試験した。トリプリケートの平均値±ＳＥＭを示し、点線は５０％阻害及び９０％阻害を示す。さらに、［ＨＰＩＶ３_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの効力を、感染性ＨＰＩＶ３侵入の阻害（Ｖｅｒｏ細胞における緑色の点線）によって確認した。（Ｃ）［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ及び［ＨＰＩＶ３_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する５０％阻害濃度及び９０％阻害濃度を、図１６Ａ及びＢに示すデータに対して可変勾配を用いて４パラメータ非線形回帰を行うことによって計算した。９５％の信頼区間を括弧内に示す。

図１７Ａ～Ｂ：ｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び懸念される変異体（ＶＯＣ）の侵入に対する阻害リポペプチド（ＦＩＰ）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はワクチン接種後血清の効力
８時間の感染性ウイルス侵入アッセイにおいて、２個のＦＩＰ、１１個のｍＡｂ及び８個のワクチン接種後血清の有効性を、ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞（Ａ）及びＣａｌｕ３細胞（Ｂ）において試験した。ＩＣ５０値を、４パラメータ用量反応モデルを用いて計算し、（希釈系列を反映する）０～９の範囲に対数変換し、各阻害物質を、そのクラス（ＦＩＰ、ｍＡｂ、血清）内で相対的な異なる効力にランク付けした。阻害物質を効力に基づいて順序付け、ＩＣ５０値を、各阻害物質及びウイルスの組合せについて示す。ＩＣ５０値を、ＦＩＰ（オレンジ色）についてナノモル（ｎＭ）で、ｍＡｂ（黒色）についてｕｇ／ｍｌで、ワクチン接種後血清（紫色）について希釈に応じて示す。各クラスについて、線の下に示される１つの陰性コントロールを含む。

図１８Ａ～Ｂ：ｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び懸念される変異体（ＶＯＣ）の侵入に対する阻害リポペプチド（ＦＩＰ）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はワクチン接種後血清の効力
８時間の感染性ウイルス侵入アッセイにおいて、２個のＦＩＰ、１１個のｍＡｂ及び８個のワクチン接種後血清の有効性を、ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞（Ａ）及びＣａｌｕ３細胞（Ｂ）において試験した。ＩＣ_５０値を、４パラメータ用量反応モデルを用いて計算し、記号のサイズは相対的な反応ランクを表す。簡潔には、サンプルの種類（ＦＩＰ、ｍＡｂ、血清）ごと及び細胞の種類（ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２又はＣａｌｕ３）ごとに、対数変換された反応範囲（最強から最弱反応）を計算した。範囲を、同等の間隔を有する１０のランクに細分化し、各サンプルは、これらのランクの１つに割り当てられた。ＩＣ_５０値を、ＦＩＰ（オレンジ色）についてナノモル（ｎＭ）で、ｍＡｂ（黒色）についてｕｇ／ｍｌで、ワクチン接種後血清（紫色）について希釈として示す。各クラスについて、線の下に示される１つの陰性コントロールを含む。

図１９Ａ～Ｇ：融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はワクチン接種後血清によるｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＶＯＣ侵入の阻害
８時間の感染性ウイルス侵入アッセイにおいて、２個のＦＩＰ、１１個のｍＡｂ及び８個のワクチン接種後血清の有効性を試験した。ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞における侵入阻害割合を、ＦＩＰ（Ａ）、ｍＡｂ（Ｂ～Ｄ）の濃度の増加又はワクチン接種後血清の希釈の増加（Ｅ～Ｇ）について示す。赤色の線はｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を示し、緑色の線はアルファ（Ｂ．１．１．７）を示し、青色の線はベータ（Ｂ．１．３５１）変異体を示す。すべてのＦＩＰ、ｍＡｂ及び血清をトリプリケートで比較して試験し、平均値をプロットし、曲線は４パラメータ用量反応モデルを表す。（Ａ）ＦＩＰを、０．０００５ｎＭ～５０００ｎＭまでの１０倍希釈系列において試験した。［ＨＰＩＶ３_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ（ＨＰＩＶ－３特異的リポペプチド）を陰性コントロールとして用いた。（Ｂ～Ｄ）ｍＡｂを、０．０００３ｕｇ／ｍｌ～２０ｕｇ／ｍｌまでの５倍希釈系列において試験した。ＭＡｂＣ２８－１０－８（麻疹ウイルス特異的モノクローナル）を陰性コントロールとして用いた。ＭＡｂを、様々なＶＯＣに対する活性により分類した（（Ｂ）試験した３つのウイルスすべてに対して活性、（Ｃ）ｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びアルファ（Ｂ．１．１．７）に対して活性、（Ｄ）非反応性）。（Ｅ～Ｇ）血清を、１：３２～１：４０９６の範囲の２倍希釈系列において試験した。血清を、ＢＮＴ１６２ｂ２ｍＲＮＡワクチンによる２回のワクチン接種の３週間後に得た。ワクチン接種前の対応するサンプルを陰性コントロールとして用いた。

図２０Ａ～Ｂ：新たに出現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ変異体に対する［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドの融合阻害活性
（Ａ）ｈＡＣＥ２受容体及びβ－ガラクトシダーゼのωサブユニットをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質及びβ－ガラクトシダーゼのα－サブユニットを、β－ガラクトシダーゼ相補アッセイによって、様々な希釈のペプチド［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの存在下で評価した。β－ガラクトシダーゼからもたらされる発光を、ＴｅｃａｎｉｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００ｐｒｏを用いて定量化した。値は、３回の実験による結果の平均値（±ＳＥＭ）である。（Ｂ）パーセント阻害を、特定濃度の阻害物質の存在下での相対発光単位及び阻害物質の非存在下での相対発光単位の比として計算し、バックグラウンド発光について、以下の、パーセント阻害＝１００×［１－（Ｘでの発光－バックグラウンド）／（阻害物質の非存在下での発光－バックグラウンド）］のように補正した。データは、３パラメータ用量反応モデルを表す曲線での、３回の別個の実験による平均値±標準誤差（ＳＥ）（エラーバー）である。

図２１Ａ～Ｊ：ｉｎｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播を予防する［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ
（Ａ）実験設計。（Ｂ、Ｃ）ＲＴ－ｑＰＣＲによって咽頭（Ｂ）及び鼻腔（Ｃ）スワブにおいて検出されたウイルス量。（Ｄ）模擬処置及びペプチド処置センチネルについてＢにおいて報告されたゲノム量による曲線下面積（ＡＵＣ）の比較。（Ｅ）ＶｅｒｏＥ６における生ウイルス分離によって咽頭スワブにおいて検出されたウイルス量。（Ｆ）ＲＴ－ｑＰＣＲ及び生ウイルス分離を介して検出されたような咽頭におけるウイルス量の間の相関。抗Ｓ（Ｇ）抗体又は抗Ｎ（Ｈ）抗体の存在を、ＩｇＧＥＬＩＳＡアッセイによって特定した。中和抗体の存在を、生ウイルス中和アッセイにおいて特定した。（Ｉ）ウイルス中和抗体を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製をブロックするエンドポイント血清希釈係数として示す。（Ｊ）ペプチド処置又は模擬処置動物のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の直接接種は、Ｓ特異的抗体、Ｎ特異的抗体及び中和抗体の非存在下で、事前にペプチド処置した動物においてのみ増殖性感染をもたらした。ドナー動物を灰色、模擬処置動物を赤色、ペプチド処置動物を緑色で示す。記号は、（Ａで定義される）個々の動物に対応し、図の全体を通して一貫している。パネルＢ、Ｃ、Ｅ及びＨ～Ｊの折れ線グラフは、時点ごとの個々の動物の中央値を接続している。模擬処置及びペプチド処置群を、二元配置分散分析反復測定（パネルＢ、Ｃ、Ｈ～Ｊ）又はマン－ホイットニー検定（パネルＤ）を介して比較した。

図２２Ａ～Ｄ：フェレットにおいて用いられるペプチドストックのｉｎｖｉｔｒｏ効力
（Ａ、Ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２接種後日数（ＤＰＩ）１～４日（図１６Ａ参照）でフェレットの鼻腔内接種に用いられるＤＭＳＯ処方ペプチド希釈物の効力を、生ウイルス感染アッセイで確認した。感染事象割合を（Ａ）ＶｅｒｏＥ６及び（Ｂ）ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳにおいて、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ（赤色）又は模擬物（青色）の濃度を増加させて示す。模擬調製物は、等モル量のＤＭＳＯを有するＤＩ水であった。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する５０％阻害濃度及び９０％阻害濃度は、可変勾配を有する４パラメータ非線形回帰を行うことによって計算され、すべての調製物について同等であった。データは、ペプチド投薬ストックについてトリプリケートによる平均値±標準誤差（ＳＥＭ）であり、模擬投薬ストックは１回反復として試験した。（Ｃ、Ｄ）接種後日数（ＤＰＩ）１日（図１９ａ参照）のフェレットの鼻腔内接種に使用したスクロース処方ペプチド希釈物の効力を生ウイルス感染アッセイで試験した。感染事象割合を、（Ｃ）ＶｅｒｏＥ６及び（Ｄ）ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳにおいて、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ（赤色）又は［ＨＰＩＶ３_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ（青色）の濃度を増加させて示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する５０％阻害濃度及び９０％阻害濃度を、可変勾配を用いて４パラメータ非線形回帰を行うことによって計算した。データは、トリプリケートによる平均値±標準誤差（ＳＥＭ）である。ＤＭＳＯ処方リポペプチドと比較して、１０ｍｇスケールで生成されたスクロース処方リポペプチドで得られた１０～１００倍高いＩＣ_５０及びＩＣ_９０（パネルＣ／ＤをパネルＡ／Ｂと比較）を、続けてｉｎｖｉｔｒｏ融合アッセイを用いて確認した（データ不図示）。

図２３Ａ～Ｂ：事前にペプチド処置した動物及び模擬処置した動物のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による攻撃感染
無菌防御の正確な測定として抗体の不在を確認するために、事前に模擬処置又は［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ処置したフェレットを感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で攻撃した（図１６ｊ参照）。フェレットを、同一処置スケジュールのペアにおいて６個のアイソレータに再収容し、（４５０μｌでの）５×１０^５、５×１０^４又は５×１０^３ＴＣＩＤ_５０／ｍｌのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で攻撃した。各用量について、２匹の模擬処置フェレット及び２匹のペプチド処置フェレットに鼻腔内接種した。咽頭スワブにおけるウイルス量を、実験を終了した接種後７日まで、ＲＴ－ｑＰＣＲによって毎日特定した（Ａ）。折れ線グラフは個々の動物を表し、記号は図１６Ａに記載される記号に対応し、赤色は模擬処置であり、緑色はペプチド処置である。（Ｂ）曲線下面積（ＡＵＣ）は、総ゲノム量が攻撃用量に対応してわずかに減少することを示す。２匹の動物のみが群ごとに含まれるため、統計処理を行わなかった。

図２４Ａ～Ｆ：ｉｎｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播に対する保護を提供する［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの単一用量
（Ａ）我々は、ＨＰＩＶ３特異的ペプチドを模擬コントロールとして用いて、共同収容の２時間前のスクロース処方リポペプチドの単回投与が感染を予防又は遅延させる可能性を評価した。（Ｂ、Ｃ）ＲＴ－ｑＰＣＲによって咽頭（Ｂ）及び鼻腔（Ｃ）スワブにおいて検出されたウイルス量。（Ｄ）［ＨＰＩＶ３_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ処置及び［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ処置センチネルについて図２４Ｂにおいて報告されたゲノム量による曲線下面積（ＡＵＣ）の比較。（Ｅ）ＶｅｒｏＥ６における生ウイルス分離によって咽頭スワブにおいて検出されたウイルス量。（Ｆ）ＲＴ－ｑＰＣＲ及び感染性ウイルス分離によって特定された咽頭におけるウイルス量の間の相関。感染性ウイルスは、４０－Ｃｔ＞１５での咽頭スワブにおいてのみ分離可能であった。ドナー動物を灰色、模擬処置動物を赤色、ペプチド処置動物を緑色で示す。記号は、（Ａで定義される）個々の動物に対応し、（図２４Ｆにおいて以外は）図の全体を通して一貫している。パネルＢ、Ｃ及びＥの折れ線グラフは、時点ごとの個々の動物の中央値である。模擬処置及びペプチド処置群を、二元配置分散分析反復測定（パネルＢ及びＣ）又はマン－ホイットニー検定（パネルＤ）によって比較した。（Ｆ）全体として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リポペプチドは、ＨＰＩＶ３リポペプチドコントロール群と比較して有意なレベルの保護を提供したが、保護は絶対ではなく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチド処置動物の６匹中２匹はブレークスルー感染を経験した。投薬に用いられたリポペプチドの逆滴定は、スクロース処方［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌリポペプチドが、ＤＭＳＯ処方リポペプチドによる実験よりも実質的に低い濃度で投与されていたことを明らかとした（図１７）。

図２５Ａ～Ｂ：コントロール処置及びペプチド処置フェレットにおける体重減少は有意には異ならない
フェレットの体重は、ＤＭＳＯ処方ペプチド（Ａ、図１６Ａに記載の実験に対応）及びスクロース処方ペプチド（Ｂ、図１９Ａに記載の実験に対応）による実験の双方で、経時的に安定を維持した。ドナー動物を灰色、コントロール処置動物を赤色、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ処置動物を緑色で示す。記号は、図１６Ａ及び図１９Ａに記載されるような個々の動物に対応する。折れ線グラフは、時点ごとの個々の動物の中央値である。群を、二元配置分散分析反復測定を介して比較し、ドナーフェレット、模擬処置フェレット、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ処置フェレット及び［ＨＰＩＶ３_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ処置フェレットの間の有意な差は観察されなかった（ＮＳ＝有意性なし）。

図２６ヒトＡＣＥ２受容体を発現するトランスジェニックマウスにおけるＳＡＲＳペプチドのｉｎｖｉｖｏ有効性
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の前に、ＳＡＲＳペプチドを、サイトケラチンＫ１８（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｋ１８－ＡＣＥ２）２Ｐｒｌｍｎ／Ｊ，Ｊａｃｋｓｏｎ）プロモーターの制御下でヒトＡＣＥ２受容体を発現するトランスジェニックマウスに鼻腔内投与した。マウスをペプチドで前処置した。動物は、２１日目にウイルスで攻撃され、すべてが生存した（データ不図示）。生存マウスを、中和抗体の存在について評価し、１４日目及び２１日目の力価を示す。用いたＳＡＲＳペプチドは、（図２１の）［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ及びＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_２４－ｃｈｏｌ（データ不図示）を含む。

発明の詳細な説明
本発明は、ＣＯＶＩＤ－１９の予防及び処置のための脂質－ペプチド分子を包含する。本発明は、細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入をブロックする設計されたペプチドを用い、ｉｎｖｉｖｏでの感染を予防及び／又は抑止し、伝播を予防する可能性がある。設計された脂質－ペプチド分子は、培養細胞及び動物モデルにおいて、生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ）ウイルス感染を阻害するのに非常に有効である。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ）ウイルスを含むコロナウイルスによる感染は、ウイルスエンベロープと肺細胞膜の間の膜融合を必要とする。融合プロセスは、スパイクタンパク質又はＳとも呼ばれるウイルスのエンベロープ糖タンパク質によって媒介される。本発明者らは、スパイクタンパク質の転移段階に結び付けることによってウイルスの融合及び感染を阻害し、したがってその機能を予防する、特異的な脂質－ペプチド構築物を人工設計した。重要なこととして、これらの抗ウイルス薬は、気道によって、点鼻液又は粉末を含む経鼻投与の他の方法によって付与可能であり、毒性がなく、肺における良好な半減期を有する。それらが鼻腔及び吸入を介して付与され得るということは、それらを、便利で、広範な使用について実現可能とする。リード抗ウイルス薬を動物モデルにおいて試験することは、医療従事者の感染を予防するための点鼻液又はスプレーとしての処置を含む、感染の予防及び処置並びに感染動物から健康な動物への伝染を予防するための有用性を示す。

ある態様では、本発明は、ペプチドを提供し、ペプチドのＣ末端部分は「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」であり、ペプチドのＮ末端部分は配列番号１及び配列番号２から選択される。ある態様では、本発明は、ペプチドを提供し、ペプチドのＣ末端部分は「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」であり、ペプチドのＮ末端部分は配列番号１及び配列番号２から選択される配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％を超えるが１００％未満の相同性を有する。

ある態様では、ＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合体は、脂質タグと、ペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択されるペプチド、又はペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択される配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％を超えるが１００％未満の相同性を有するペプチドと、を含む。

ある態様では、ＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合阻害物質は、脂質タグと、スペーサーと、ペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択されるペプチド、又はペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択される配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％を超えるが１００％未満の相同性を有するペプチドと、を含む。

いくつかの実施形態では、スペーサーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＰＥＧ_４、ＰＥＧ_１１、又はＰＥＧ_２４である。いくつかの実施形態では、脂質タグは、コレステロール、トコフェロール又はパルミテートである。いくつかの実施形態では、脂質タグはコレステロールである。

ある態様では、薬学的組成物は、ペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択されるペプチド、又はペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択される配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％を超えるが１００％未満の相同性を有するペプチド並びに薬学的に許容可能な賦形剤を含む。

ある態様では、薬学的組成物は、ペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択されるペプチド、又はペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択される配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％を超えるが１００％未満の相同性を有するペプチド、脂質タグ並びに薬学的に許容可能な賦形剤を含む。

ある態様では、薬学的組成物は、ペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択されるペプチド、又はペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択される配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％を超えるが１００％未満の相同性を有するペプチド、脂質タグ、スペーサー並びに薬学的に許容可能な賦形剤を含む。

いくつかの実施形態では、スペーサーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＰＥＧ_４、ＰＥＧ_１１、又はＰＥＧ_２４である。いくつかの実施形態では、脂質タグは、コレステロール、トコフェロール又はパルミテートである。

ある態様では、本発明は、抗ウイルス薬学的組成物を、必要とする被検体に投与するステップを含むＣＯＶＩＤ－１９を予防する方法を提供する。薬学的組成物は、ペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択されるペプチド、又はペプチドのＣ末端部分が「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」でありかつペプチドのＮ末端部分が配列番号１及び配列番号２から選択される配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％を超えるが１００％未満の相同性を有するペプチド、脂質タグ、スペーサー並びに薬学的に許容可能な賦形剤を含む。

ある態様では、本発明は、抗ウイルス薬学的組成物を、必要とする被検体に投与するステップを含むＣＯＶＩＤ－１９を予防する方法を提供する。薬学的組成物は、配列番号１の２つの部位、２つのＰＥＧ_４部位、１つのコレステロールタグ及び薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含み、各ＰＥＧ_４は、一端を配列番号１及び他端をコレステロールによって隣接される。

ある態様では、本発明は、抗ウイルス薬学的組成物を、必要とする被検体に投与するステップを含むＣＯＶＩＤ－１９を予防する方法を提供する。薬学的組成物は、配列番号１の１つの部位、１つのＰＥＧ_２４部位、１つのコレステロールタグ及び薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含み、ＰＥＧ_２４は、一端を配列番号１及び他端をコレステロールによって隣接される。

いくつかの実施形態では、方法は、スパイクタンパク質を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオンによって引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９を予防し、スパイクタンパク質の配列は配列番号３とは異なる。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ２４７Ｒ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＤ６１４Ｇ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ９４３Ｐ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＤ８３９Ｙからなる群から選択される。いくつかの他の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ及びラムダ変異体からなる群から選択される。

ある態様では、本発明は、被検体における細胞に感染するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリスクを低減する方法を提供する。本方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物の有効量を投与して細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害するステップを含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物は、配列番号１の２つの部位、２つのＰＥＧ_４部位、１つのコレステロールタグ及び薬学的に許容可能な賦形剤を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含む。各ＰＥＧ_４は、一端を配列番号１及び他端をコレステロールタグによって隣接され得る。あるいは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物は、配列番号１の１つの部位、１つのＰＥＧ_２４部位、１つのコレステロールタグ及び薬学的に許容可能な賦形剤を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含む。ＰＥＧ_２４は、一端を配列番号１及び他端をコレステロールによって隣接され得る。

ある態様では、本発明は、被検体におけるＣＯＶＩＤ－１９のリスクを低減する方法を提供する。本方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物の有効量を投与して細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害するステップを含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物は、配列番号１の２つの部位、２つのＰＥＧ_４部位、１つのコレステロールタグ及び薬学的に許容可能な賦形剤を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含む。各ＰＥＧ_４は、一端を配列番号１及び他端をコレステロールタグによって隣接され得る。あるいは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物は、配列番号１の１つの部位、１つのＰＥＧ_２４部位、１つのコレステロールタグ及び薬学的に許容可能な賦形剤を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含む。ＰＥＧ_２４は、一端を配列番号１及び他端をコレステロールによって隣接され得る。

ある態様では、本発明は、被検体におけるＣＯＶＩＤ－１９による死亡のリスクを低減する方法を提供する。本方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物の有効量を投与して細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害するステップを含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物は、配列番号１の２つの部位、２つのＰＥＧ_４部位、１つのコレステロールタグ及び薬学的に許容可能な賦形剤を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含む。各ＰＥＧ_４は、一端を配列番号１及び他端をコレステロールタグによって隣接され得る。あるいは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物は、配列番号１の１つの部位、１つのＰＥＧ_２４部位、１つのコレステロールタグ及び薬学的に許容可能な賦形剤を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含む。ＰＥＧ_２４は、一端を配列番号１及び他端をコレステロールによって隣接され得る。

実施例が、以下に提供されて本発明のより完全な理解を容易にする。以下の実施例は、本発明を製造及び実施する例示的な様式を説明する。ただし、代替的な方法が利用されて同様の結果を得ることもあるため、本発明の範囲は、説明のみを目的とするこれらの実施例において開示される具体的な実施形態に限定されない。

実施例１：一般概念
コロナウイルス感染
コロナウイルス（ＣｏＶ）は生命を脅かす疾患を引き起こし得る。最新の疾患は、世界保健機関によってコロナウイルス感染症２０１９（略して「ＣＯＶＩＤ－１９」）と命名された。ＣＯＶＩＤ－１９は、コロナウイルス株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、その前身であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び中東呼吸器症候群ウイルスＭＥＲＳ－ＣｏＶと同様に、ベータコロナウイルスである。一方で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＣＯＶＩＤ－１９は、２０２０年に全世界によって目撃されたように、（ＭＥＲＳなどの）他のＣｏＶ及びそれらのそれぞれの疾患とは著しい態様で異なる。

標的細胞へのコロナウイルス侵入経路
コロナウイルスは、Ｉ型融合メカニズムを採用して宿主細胞の細胞質へのアクセスを得る。Ｉ型融合メカニズムを採用する他の病原性ウイルスは、ＨＩＶ、パラミクソウイルス及びニューモウイルスを含む。ウイルスエンベロープ及び宿主細胞膜の合併は、３量体ウイルス融合タンパク質の大規模な構造的な再配列によって促進され、感染は、再配列プロセスを阻害することによって阻止され得る。

コロナウイルスによる感染は、ウイルスエンベロープと細胞膜の間の膜融合を必要とする。細胞の種類及びコロナウイルス株に応じて、融合は、細胞表面膜において又はエンドソーム膜内のいずれかで引き起こされ得る。融合プロセスは、各単量体がいくつかのドメインを有する大きなホモ３量体として提示される約１２００残基の高グリコシル化Ｉ型内在性膜タンパク質であるウイルスエンベロープ糖タンパク質（Ｓ）によって媒介される（図１、２）。ウイルス膜の遠位にある受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、細胞表面付着に関与する。膜の合併は、近位細胞融合ドメイン（ＦＤ）によって媒介される。ＲＢＤ及びＦＤによる協調作用が、融合に必要とされる。ウイルス付着（及びある場合には取り込み）に応じて、宿主因子（受容体及びプロテアーゼ）は、タンパク質のリフォールディングを膜融合に直接結合する、エネルギー的に安定な６ヘリックスバンドル（６ＨＢ）の形成によって促進される、ＦＤにおける大規模な立体配座の再配列を引き起こす。ＦＤは、（Ｃ末端ヘプタッドリピート、Ｃペプチド又はＨＲＣペプチドといわれる）融合阻害ペプチドによって標的とされ得る、高度に保存された３量体コイルドコイルコアで構成される一過性プレヘアピン中間体を形成すると考えられている。

インフルエンザＨＡと同様に、Ｓタンパク質はビリオン表面に３量体として存在し、付着、受容体結合及び膜融合を媒介する。これまでに同定されたベータコロナウイルスＳタンパク質の宿主細胞受容体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対するアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）及びＭＥＲＳ－ＣｏＶに対するジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は侵入にヒトアンジオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）を用いることが分かった（かつ、まだ知られていない他の受容体を用いる可能性が最も高く、又は用いることが可能である）。Ｓは宿主プロテアーゼによって切断されて、Ｓ_１及びＳ_２を生成する。受容体によるプライミング及び切断は、双方とも膜合併に必要である。

ウイルス侵入の経路及び阻害の戦略
膜合併をもたらす融合タンパク質における一連の立体配座変化を開始する活性化ステップは、ウイルスが細胞に侵入するのに用いる経路に応じて異なる。多数のパラミクソウイルスについて、受容体が結合すると、付着糖タンパク質は、融合タンパク質を活性化して、中性ｐＨで細胞表面におけるその融合可能な立体配座となる。我々その他は、（細胞膜で融合する）これらのウイルスについて、融合タンパク質外部ドメインのＨＲＣ領域に由来するＣペプチドが様々な活性によりウイルス侵入を阻害すること、及び脂質複合体がそれらの抗ウイルス効力を著しく増強し、同時にそれらのｉｎｖｉｖｏ半減期を増加することを示した。我々は、脂質複合融合阻害ペプチドを原形質膜に標的化することによって、かつＨＲＮ－ペプチド結合親和性を増加する人工設計をすることによって、抗ウイルス効力を数対数分だけ増加させた。細胞表面の脂質複合阻害ペプチドは、ウイルス融合の膜部位を直接標的とする。化合物に（ＰＥＧ_４などの）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを脂質部位とペプチドの間で追加することによって、我々は、複合体の活性及び効力をさらに増加した。我々は、脂質複合融合阻害ペプチドのｉｎｖｉｖｏ有効性を、ゴールデンハムスター及び非ヒト類霊長類における致命的なニパウイルス感染、マウス及びコットンラットにおける麻疹ウイルス感染、並びにコットンラットにおけるヒトパラインフルエンザウイルス３型感染に対して実証した。

細胞膜で融合しないウイルスに対して、Ｃ－ペプチドへの標的は、一般にアクセス不能と考えられている。これらのウイルスの例は、インフルエンザウイルス及びエボラウイルスである。インフルエンザの融合タンパク質（ヘマグルチニンタンパク質、ＨＡ）及びエボラの融合タンパク質（ＧＰ）は、活性化されて細胞内内在化後にのみ融合する。我々は、インフルエンザＨＡに由来する我々の脂質複合ペプチドがインフルエンザによる感染を阻害することを示し、脂質複合体による戦略は、細胞内部で融合するウイルスに対して融合阻害ペプチドの使用を可能にすることを示唆する。インフルエンザに採用した２番目の戦略は、細胞内標的の阻害を強化するＨＩＶ－ＴＡＴ（周知の細胞透過性ペプチド、ＣＰＰ）の付加である。これらの２つの戦略の組合せにより、ＨＡ由来ペプチドは、インフルエンザウイルスのヒト株に対してｉｎｖｉｖｏで有効である。同様の戦略はまた、エボラ感染に対する有効な抗ウイルスＣ－ペプチドをもたらした。

原理の証明：融合脂質－ペプチド
コロナウイルスに対するＣペプチド融合阻害物質の開発における主要な課題は、コロナウイルスのウイルス侵入がいくつかの侵入経路をたどり得ることであり得る（図２）。一部のコロナウイルス株は細胞表面で融合することもあり、一方で他の一部は最初にエンドサイトーシスし、融合はエンドソームにおいて引き起こされる。場合によっては、同一株は、Ｓ切断部位及び標的宿主細胞のプロテアーゼに応じて、異なる経路を介して侵入し得る。ウイルスは、細胞表面又は細胞内で融合し得る。

この理由のため、コロナウイルスの侵入阻害物質の設計は課題となる。我々は、エンドソーム局在化を促進する細胞透過性ペプチド及び脂質部位の付加が抗ウイルス効力を増加させるか否かを探索した。

脂質複合阻害ペプチドにおける先行研究は、脂質がペプチドを細胞膜に指向させて抗ウイルス有効性を増加することを実証した。これらの複合ペプチドは、発表された研究において、コロナウイルスの初期侵入株及び後期侵入株の双方を阻害することを示した（図３）。

実施例２：（ＳＡＲＳとも命名される）ＨＲＣ由来のＳＡＲＳ_ＨＲＣ抗ウイルスペプチド及びＳＡＲＳＭｏｄ抗ウイルスペプチドの設計
ＳＡＲＳＣｏＶ－２のＳタンパク質のＨＲＣドメインの配列
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２６ＨＢアセンブリ（図４）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜融合の阻害物質の設計のための優れた基礎を提供する。ＨＲＣドメインは、中央の５回転のα－ヘリックス及び両側においてヘリックスに隣接する伸長領域を特徴とする。天然のＨＲＣドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の残基１１６８～１２０３に対応する。

ペプチドＳＡＲＳ（図５）は、（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ＨＲＣドメインと同一である）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＨＲＣドメインに対応し、Ｘｉａ他は近年、偽ウイルスによる細胞アッセイおいて（「Ｄ－１」又は「ペプチドＤ－１」とも命名される）ペプチドＳＡＲＳがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の中程度の阻害物質であることを報告した（ＩＣ_５０、約１μＭ）。中央のα－ヘリックスを形成する残基を示す。提案されたＳＡＲＳＭｏｄは、ＳＡＲＳに対して（図５において強調表示して示す）７個のアミノ酸変化を含み、溶解性を向上する。

ＳＡＲＳ脂質融合ペプチド及びＳＡＲＳＭｏｄ脂質融合ペプチドの設計
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染は、細胞表面又はエンドソーム膜のいずれかで、ウイルスエンベロープと宿主細胞膜の間の膜融合を必要とする。融合プロセスは、ウイルスエンベロープスパイク糖タンパク質Ｓによって媒介される。ウイルスの付着又は取り込みに応じて、宿主因子は、膜融合及びウイルス侵入に直接つながるリフォールディングするステップを含む、Ｓにおける大規模な立体配座の再配列を引き起こす。Ｓタンパク質のＣ末端で高度に保存されたヘプタッドリピート（ＨＲ）ドメインに対応するペプチド（ＨＲＣペプチド）は、このリフォールディングを予防し、融合を阻害し、それにより感染を予防し得る。

我々は近年、以前に説明されたＨＲＣ由来融合阻害ペプチドに勝るｉｎｖｉｔｒｏ及びｅｘｖｉｖｏ有効性を有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する単量体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＨＲＣ－リポペプチド融合阻害物質を説明した。我々は、（ＳＡＲＳとも命名される）ＳＡＲＳ_ＨＲＣペプチド配列及びＳＡＲＳＭｏｄペプチド配列に基づいて、多数の構築物を設計した。基本的に、ＳＡＲＳ及びＳＡＲＳＭｏｄペプチドを、グリシン－セリンの４量体のＧＳＧＳ及びシステインをそれらのＣ末端に付着することによって修飾した。ＰＥＧリンカー（ＰＥＧ_４、ＰＥＧ_２４又はＰＥＧ_１１）及びコレステロールタグを構築物にさらに追加した。ＨＲＣペプチドは、Ｓタンパク質３量体の伸長中間体とともに６ヘリックスバンドル（６ＨＢ）様のアセンブリを形成し、それにより膜融合を促進するＳの構造的再配列を妨害する。
（「ＳＡＲＳ単量体」とも命名される）［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］－ｃｈｏｌ：
ＳＡＲＳ－ＧＳＧＳ－Ｃ－ＰＥＧ_４－Ｃｈｏｌ
（「ＳＡＲＳＭｏｄ単量体」とも命名される）［ＳＡＲＳＭｏｄ－ＰＥＧ_４］－ｃｈｏｌ：
ＳＡＲＳＭｏｄ－ＧＳＧＳ－Ｃ－ＰＥＧ_４－Ｃｈｏｌ
（「ＳＡＲＳ２量体」とも命名される）［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ：
［ＳＡＲＳ－ＧＳＧＳ－Ｃ－ＰＥＧ_４］_２－Ｃｈｏｌ
（「ＳＡＲＳＭｏｄ２量体」とも命名される）［ＳＡＲＳＭｏｄ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ：
［ＳＡＲＳＭｏｄ－ＧＳＧＳ－Ｃ－ＰＥＧ_４］_２－Ｃｈｏｌ

我々はまた、上記の構築物による変形例として、追加の構築物を設計した。ペプチドの設計を、図６Ｃに示す。複合体の同一性を、図７に示すようにＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳによって検証した。
ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－Ｃｈｏｌ：ＳＡＲＳ－Ｃｈｏｌ（リンカーなし）
［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ］_２－ＰＥＧ_１１：コレステロールなし、ＰＥＧ_１１のみを有するＳＡＲＳの２量体、
ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_２４－ｃｈｏｌ：ＰＥＧ_２４及びコレステロールを有するＳＡＲＳの単量体

我々は以前に、ＨＲＣ由来阻害ペプチドの脂質複合体は抗ウイルス効力及びｉｎｖｉｖｏ半減期を著しく増加させることを実証し、この戦略を用いて、ヒトパラインフルエンザウイルス３型、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス及びニパウイルス感染の予防及び／又は処置のための侵入阻害物質を作成することに成功した。２量体化及び細胞膜へのペプチドの集積の双方が、気道保護を保証し、全身性リポペプチド播種を予防する鍵であることが証明された。動物に鼻腔内投与された脂質複合ペプチドは、上気道及び下気道の双方において、高くかつ（ｉｎｖｉｖｏで）生物学的に有効な濃度に到達し、脂質の具体的な性質は、肺から全身循環及び臓器への転移の程度を調節するように設計され得る。脂質複合体はまた、エンドサイトーシスを介して取り込まれるまで融合しないウイルスに対する活性を可能とした。ここで、我々は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ特異的リポペプチドが融合の有力な阻害物質であり、ウイルスの侵入を予防し、鼻腔内投与される場合、フェレットにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の直接接触伝播を完全に予防することを示す。我々は、この化合物を、ヒトにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播の暴露前又は暴露後の早期予防のための抗ウイルス薬の候補として提案する。

実施例３：ＳＡＲＳ及びＳＡＲＳＭｏｄ由来脂質－ペプチド融合体のｉｎｖｉｔｒｏ効力
以前に評価されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＨＲＣ－リポペプチド融合阻害物質の抗ウイルス効力を向上するために、我々は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ由来ＨＲＣ－ペプチドの単量体誘導体及び２量体誘導体を比較した（図８）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＨＲＣリポペプチドの初期機能評価を、我々がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ媒介性融合の評価について適合させた、β－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）のアルファ相補性に基づく細胞間融合アッセイで実施した。

図８Ａは、定量的細胞間融合アッセイにおける、付加コレステロール無し（ＳＡＲＳ_ＨＲＣ及び［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ］_２－ＰＥＧ_１１）又は有りの、４つの単量体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ由来３６アミノ酸ＨＲＣペプチド及び２つの２量体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ由来３６アミノ酸ＨＲＣペプチド（図５及び６）の抗ウイルス効力を示す。阻害割合は、阻害物質の非存在下で観察される発光シグナル抑制の程度に対応する（すなわち、０％阻害が、最大発光シグナルに対応する）。２量体化によって、非脂質付加ペプチド及びそれらの脂質付加ペプチドの双方についてペプチド効力が増加した（図８Ａ）。陰性コントロールとして用いたＨＰＩＶ３Ｆタンパク質ＨＲＣドメインに基づく２量体コレステロール複合リポペプチドは、試験した濃度では融合を阻害しなかった（図８Ａの黒色の線、追加の陰性コントロールについては図１１ｂ～ｃ参照）。単量体リポペプチドの中で、ＰＥＧ_２４を保有するペプチドが最も強力であった。２量体コレステロール複合ペプチド（［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ、図８Ａの赤色の線）は、試験パネルの中でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して最も強力なリポペプチドである。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの全体的な安定性にもかかわらず、Ｓに突然変異を有する変異体は、世界中に広まっている。Ｓにおけるこれらの突然変異は、細胞の感染性を変化させ（例えば、Ｄ６１４Ｇ）、又はＨＲＣペプチドの想定される標的ドメインに位置していた（例えば、Ｓ９４３Ｐ）。様々な変異体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスについての［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドの効力を特定するために、我々は、新たに出現したこれらのＳタンパク質突然変異体の各々によって媒介される融合阻害を調査した。さらに、広域スペクトル活性の可能性を評価するために、我々は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶのＳに対する効力を（後者についての標的としてジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）受容体保有細胞を用いて）評価した。２量体コレステロール複合ペプチド（［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ）は、いくつかの新たに出現した（Ｄ６１４Ｇを含む）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体のＳタンパク質並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶのＳタンパク質によって媒介される融合をも強力に阻害した（図８Ｂ）。最後に、コロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）のパンデミックが進行している限り、原因物質であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムは継続的に進化している。多くの変化は一過性であり、又は疫学的若しくは臨床的な影響はないが、関心のある変異体（ＶＯＩ）又は懸念される変異体（ＶＯＣ）として分類される複数の変異体が、新たに出現した。ここで、具体的に２つのＶＯＣ、イギリスの変異体すなわちアルファ変異体（Ｂ．１．１．７；ＵＫ）及び南アフリカの変異体すなわちベータ変異体（Ｂ．１．３５１；ＳＡ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ／２０１９－ｎｃｏｖ／ｍｏｒｅ／ｓｃｉｅｎｃｅ－ａｎｄ－ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－ｂｒｉｅｆ－ｅｍｅｒｇｉｎｇ－ｖａｒｉａｎｔｓ．ｈｔｍｌ，Ｍｕｉｋ、２０２１年及びＷｕ、２０２１年。命名についてはｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｅｎ／ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ／ｔｒａｃｋｉｎｇ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｖａｒｉａｎｔｓ／参照）に対処するために、実験を変異体アルファ（Ｂ．１．１．７）及び変異体ベータ（Ｂ．１．３５１）により繰り返した（図８Ｃ）。我々は、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドがこれら２つの変異体のＳタンパク質によって媒介される融合も強力に阻害することを結論付けた。

ＨＩＶ－ＴＡＴは、細胞内標的の阻害を増強する周知の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である。我々は、細胞透過性ペプチド配列の追加が、エボラウイルス及びインフルエンザウイルスを標的とする双方のペプチドについて抗ウイルス活性を増加し得ることを以前に示した。インフルエンザについて、ＴＡＴ複合ペプチドのみがｉｎｖｉｖｏで有効であることが示された。驚くべきことに、図９に示すように、細胞透過性ペプチド配列の追加は、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの抗ウイルス活性を増加させない。図９Ａに示すように、ＴＡＴの追加は、ＶｅｒｏＥ６における有効性を低下させ、それは、エンドソーム内で融合するウイルスでは、エボラに対するように、ＴＡＴが増強することが予期されるので、予想外の結果である。ＴＭＰＲＳＳ２無しのこれらの細胞では、エンドソーム経路融合が予想され、したがってＴＡＴが有効性を悪化させることは予想外である。図９Ｂに示すように、ＴＭＰＲＳＳ２の存在下ではこのウイルスは細胞表面で融合するはずであるため、我々はＴＡＴがここで増強するとは予想していなかったが、ＴＡＴはＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞においても有効性を低下させた。この驚くべき結果は、様々なウイルスの間の相違、及びそれらのペプチド阻害物質に対してどのように反応するかをさらに強調する。

宿主細胞膜での２量体リポペプチドの提案された係留及びウイルスＳタンパク質との相互作用を図１０Ａ～Ｂに示す。我々のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ由来ＨＲＣペプチドは、ｉｎｖｉｔｒｏで驚くべきかつ予想外に高い効力を示した。まとめると、これらのデータは、特に［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌリポペプチドは進化するパンデミックに対抗するように備えられていることを示唆する。このペプチドによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害の設計及び特異性を、図１１にさらに詳細に示す。

実施例４：ＳＡＲＳ由来脂質－ペプチド融合体及びＳＡＲＳＭｏｄ由来脂質－ペプチド融合体の生体内分布、細胞毒性及びウイルス侵入ブロッキング
他のエンベロープ型呼吸器ウイルスについて、我々は以前に、ｅｘｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｖｏの双方で、鼻腔内投与された２量体リポペプチドはｃｈｏｌの付着部位対ｔｏｃの付着部位に依存して異なる滞留を気道で示すことを示した（Ｆｉｇｕｅｉｒａ，Ｔ．Ｎ．他、ＪＶｉｒｏｌ９１（２０１７年））。ここで、我々は、我々の最も強力な単量体及び２量体リポペプチド（ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_２４－ｃｈｏｌ及び［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ）の、ヒト化Ｋ１８ｈＡＣＥ２マウスにおける鼻腔内接種又は皮下注入後１、８及び２４時間での、局所及び全身の生体内分布を比較した（図１２～１４）。２つのリポペプチドは、鼻腔内投与後１時間で同様の肺濃度に到達した（約１～２μＭ）。８時間及び２４時間で、２量体［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌリポペプチドは肺において高レベルを維持し、血液への侵入は最小限であったが、単量体ペプチドは体循環に侵入し、肺濃度は低下した（図１２）。これらの肺での高レベルは驚くべきことでありかつ予想外であり、それらは動物で有効であり、臨床的に有効であると期待される。２量体［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌリポペプチドは、鼻腔内投与後に肺全体にわたって分布した（図１３）。図１４は、様々な組織におけるより長い時点（４８時間）での双方のリポペプチドの分布をさらに示す。

初代ＨＡＥ細胞におけるｅｘｖｉｖｏ毒性（ＭＴＴ）アッセイを、融合体について実施した。アッセイは、試験した最高濃度で６日後でも最小限の毒性を示し（１００μＭで２０％未満）、そのＩＣ_９０侵入阻害濃度（約３５ｎＭ）では毒性を示さなかった（図１５）。そのｉｎｖｉｔｒｏ有効性と協調して、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌのより長い気道持続性によって、我々はこの２量体リポペプチドをさらなる評価に進めた。

次に、リードペプチドである［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌを、ＶｅｒｏＥ６細胞又は細胞膜でウイルス侵入を容易にすると考えられている宿主因子の１つであるプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２を過剰発現するＶｅｒｏＥ６細胞において、生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入をブロックするその能力について評価した。ＶｅｒｏＥ６細胞におけるウイルス融合は、主にエンドサイトーシス後に発生するが、ウイルスは、気道細胞での侵入経路を反映して、細胞表面での融合によってＴＭＰＲＳＳ２過剰発現細胞に侵入する。この相違は、クロロキンがＶｅｒｏ細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して有効性を有するがＴＭＰＲＳＳ２発現Ｖｅｒｏ細胞及びヒト肺では有効性がないことによって強調される。２％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する水性緩衝液に溶解した［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドは、８時間後のウイルス侵入を、ＶｅｒｏＥ６では約３００ｎＭのＩＣ_５０及びＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞では約５ｎＭのＩＣ_５０で阻害した（図１６Ａ）。ヒトでの使用に向けた転用の可能性を強化するために、リポペプチドを、ＤＭＳＯの代わりにスクロースで再処方し、同等の効力がもたらされた（図１６Ｂ）。ＨＰＩＶ３に対するコントロールの２量体融合阻害リポペプチドは、ＨＰＩＶ３による感染をブロックしたが（緑色の線）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害しなかった。ｉｎｖｉｔｒｏ有効性データを図１６Ｃにまとめる。

実施例５：モノクローナル抗体及びワクチン接種後血清と比較した、懸念されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体に対する融合阻害リポペプチドの効力
ここで、我々は、２つのＶＯＣ、アルファ（Ｂ．１．１．７）変異体及び南アフリカすなわちベータ（Ｂ．１．３５１）変異体に対する融合阻害リポペプチドの効力を特定し、特徴付けた。双方のＶＯＣについて、モノクローナル抗体からの免疫回避が説明されており、中和アッセイにおいて、回復期血清はＢ．１．３５１に対する効力が少ないことが報告されている。

我々は以前に、ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏで、ｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染は融合阻害リポペプチドによって効率的に阻害され得ることを説明した。ここで、我々は、２つのリポペプチド（［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ及びＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_２４－ｃｈｏｌ）の、野生型、アルファ変異体（Ｂ．１．１．７）及びベータ変異体（Ｂ．１．３５１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する有効性を、感染性ウイルス侵入アッセイにおいて評価した。我々は、リポペプチドを、以前に説明した１１個のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び８個のワクチン接種後血清（ＢＮＴ１６２ｂ２、２ショット）のセットと直接比較した。

我々は、以前に確立した感染性ウイルス侵入アッセイを行った。簡潔には、ＦＩＰ、ｍＡｂ及び血清を段階希釈し（それぞれ１０倍、５倍又は２倍）、一定量のウイルス粒子とともに３７℃で１時間インキュベーションした。続けて、ウイルス－阻害物質混合物を、ＴＭＰＲＳＳ２を過剰発現するＶｅｒｏＥ６細胞（ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２）又はＣａｌｕ３細胞に添加し、３７℃で８時間インキュベーションした。細胞を洗浄し、固定し、一次マウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶヌクレオカプシド（Ｂｉｏｒａｄ）及び二次ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＦＩＴＣ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。蛍光スポットを記録し、計数し、感染制御の割合で阻害を計算した。我々は、４パラメータ用量反応モデルを用いてＩＣ_５０値を計算し、対数変換されたＩＣ_５０値に基づいて各クラス内の効力を定義した（図１７及び１８に示し、双方とも同じ結果を異なる形式で示す）。

我々は、用いた細胞株に関係なく、双方のリポペプチドの、ｗｔ、アルファ変異体（Ｂ．１．１．７）及びベータ変異体（Ｂ．１．３５１）に対する同等の効力を検出した。ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞では、１１個のｍＡｂのうち２個は３つのウイルスすべてに対してウイルス侵入を効率的に阻害し（２－１５、１－１６）、１１個のｍＡｂのうち４個はウイルスの侵入を阻害せず（又は高濃度でのみ阻害した）、１１個のｍＡｂのうち２個はｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入を効率的に阻害したが、アルファ変異体（Ｂ．１．１．７）又はベータ変異体（Ｂ．１．３５１）の侵入は阻害せず（１－２１、１－２２）、１１個のｍＡｂのうち２個はｗｔ及びアルファ変異体（Ｂ．１．１．７）の侵入を同等のレベルでブロックしたが、ベータ変異体（Ｂ．１．３５１）の侵入はブロックせず（１－１８，２－１７）、１１個のｍＡｂのうち１個はアルファ変異体（Ｂ．１．１．７）に対してわずかに有効性が増加した（２－０２）。ＩＣ_５０値はＣａｌｕ３細胞において総じて低かったが、我々は同様の傾向を観察した。

ワクチン接種後ポリクローナル血清は、すべての変異体に対して広範囲の反応性を示した。ただし、ｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と比較して、我々は、ベータ変異体（Ｂ．１．３５１）に対して全体的により低い力価及びアルファ変異体（Ｂ．１．１．７）に対して同等以上の高い力価を測定した。図１９は、ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ細胞におけるリポペプチド（Ａ）、ｍＡｂ（Ｂ～Ｄ）及びワクチン接種後血清（Ｅ～Ｇ）についての侵入阻害プロットを示す。ｍＡｂを、様々な変異体についての活性に基づいて分類した（Ｂ：３つのウイルスすべてに同等の活性、Ｃ：ｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して活性、Ｄ：活性なし）。図２０は、様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ変異体に対する［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドの融合阻害活性をさらに示す。これらは、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ及びラムダの変異体を含む。

結論として、我々は、評価されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的リポペプチドの、ｗｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２並びにＶＯＣであるアルファ変異体（Ｂ．１．１．７）及びベータ変異体（Ｂ．１．３５１）に対する等しい有効性を示す。さらに、我々は、試験したＶＯＣのうちの少なくとも１つによる十分に特徴付けられた複数のｍＡｂからの免疫回避及びベータ変異体（Ｂ．１．３５１）に対するより低い血清力価を確認した。

実施例６：［ＳＡＲＳ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌのｉｎｖｉｖｏ効力試験の実験設計及び方法論
フェレットは、直接接触による又はエアロゾル伝播による呼吸器ウイルス伝播を評価するための理想的なモデルである。イタチ科は、ミンク農場における頻繁なＣＯＶＩＤ－１９の発生によっても示されるようにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染に対して非常に罹患性が高い。フェレットにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶの直接接触伝播は２００３年に実証され、直接接触及び空気感染の双方がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２２についてフェレットにおいて示された。フェレットモデルにおける直接接触伝播では非常に再現性が高いが（ドナーからアクセプター動物への１００％の伝播）、フェレットは限られた臨床的兆候しか示さない。直接の接種又は伝播を介した感染後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は咽頭及び鼻腔で容易に検出可能であり、そこから分離可能であり、ウイルス複製はセロコンバージョンをもたらす。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伝播を予防する際の［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの有効性を評価するために、未感作のフェレットに対してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染フェレットと共同収容される前にリポペプチドを予防的に投薬した。この設定では、複数の経路（エアロゾル、糞口、及び掻破又は咬創）を介した伝播が理論的に発生可能であり、フェレットは共同収容の期間中に感染性ウイルスに連続的に曝露され、抗ウイルス有効性の厳しい試験を提供する。研究設計を図２１Ａに示す。３匹のドナーフェレット（図では灰色）に対して、０日目に５×１０^５ＴＣＩＤ_５０ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を鼻腔内接種した。別個に収容した１２匹のレシピエントフェレットを、ドナー動物の接種後日数（ＤＰＩ）１日及び２日に模擬調製物（赤色）又は［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチド（緑色）で点鼻液によって処置した。鼻腔内投与のための［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドを、２％のＤＭＳＯを含有する水性緩衝液において６ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解し、フェレットに２．７ｍｇ／ｋｇの最終用量を投与した（４５０μＬ、両鼻腔に均等に分割した）。ペプチドストック及び作業希釈液は、同様のＩＣ５０を有し、ペプチド処置フェレットは毎日同等量投薬されたことを確認した（図１２Ａ～Ｂ）。２ＤＰＩの２回目の処置の６時間後に、１匹の感染ドナーフェレット（ＲＴ－ｑＰＣＲによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して高度に陽性）を４匹の未感作のレシピエントフェレット（２匹が模擬処置され、２匹がペプチド処置された）と共同収容した。３個の別個の負圧ＨＥＰＡ－フィルタ付きＡＢＳＬ３アイソレータケージにおいて２４時間伝播期間後に、共同収容を中止し、ドナーフェレット、模擬処置フェレット及びペプチド処置フェレットを別個の群として収容した。追加の［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチド処置を３及び４ＤＰＩにレシピエント動物に付与した。

直接接種ドナー動物（灰色）、模擬処置レシピエント動物（赤色）及びリポペプチド処置レシピエント動物（緑色）に対するウイルス量（ＲＴ－ｑＰＣＲを介したウイルスゲノムの検出）を図２１Ｂ～Ｃに示す。咽頭及び鼻腔スワブでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム検出によって示されるように、すべての直接接種ドナーフェレットは増殖的に感染し、ウイルスをすべての模擬処置アクセプターフェレットに効率的かつ再現的に伝播した（図２１Ｂ～Ｃ、赤色曲線）。増殖的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染は、ペプチド処置レシピエント動物のいずれの咽頭又は鼻腔からも検出されなかった（図２１Ｂ～Ｃ、緑色曲線）。３ＤＰＩで収集されたサンプル中のウイルス量のわずかな上昇が（共同収容に終了時に）検出され、ペプチド処置動物はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されたことを確認した。図２１Ｄの１６ｄにおいて、曲線下面積（ＡＵＣ）は、模擬処置動物とペプチド処置動物の間の顕著な差を示す。感染性ウイルスはリポペプチド処置フェレットから分離されなかったが、感染性ウイルスはすべての模擬処置フェレットから検出された（図２１Ｅ）。ウイルス分離データは、ゲノム検出と相関した（図２１Ｆ）。

Ｓ特異的及びＮ特異的ＩｇＧ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及びウイルス中和に示すように（図２１Ｇ～Ｉ）、セロコンバージョンは、２１ＤＰＩまでにドナーフェレット及び６匹中６匹の模擬処置動物に発生したが、ペプチド処置レシピエント動物のいずれにおいても発生しなかった。攻撃感染が成功したことによって、宿主内ウイルスの複製が［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ処置によって完全にブロックされること（図２１Ｊ及び図２３）及びペプチド動物のいずれも保護されなかったが模擬処置動物（セロコンバージョンされたもの）はすべて保護されることが確認された。まとめると、これらのデータは、驚くべきことにかつ予想外に、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドの鼻腔内予防的投与が６匹中６匹のフェレットを伝播及び増殖性感染から保護したことを示している。

実施例７：２量体リポペプチドの単回投与
マウス肺における２量体リポペプチドの持続性（図１２及び図１３）の観点で、我々は、感染を予防又は遅延させるために、フェレット伝播実験において共同収容する２時間前でのスクロース処方リポペプチドの単回投与の可能性を評価した。この実験では、我々は、模擬コントロールとして２量体ＨＰＩＶ３特異的リポペプチドを用いた（図２４）。スクロース処方は小規模のｉｎｖｉｔｒｏでは有望な結果をもたらしたが（図１６Ｂ）、大規模な処方は不完全な溶解をもたらした。結果として、スクロース処方［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌリポペプチドは、ＤＭＳＯ処方リポペプチドでの実験（図２２Ｃ～Ｄ）よりも実質的に低い濃度で投与された。それでもなお、驚くべきことにかつ予想外に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リポペプチドは、ＨＰＩＶ３コントロール群と比較して有意なレベルの保護を提供し、６匹のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リポペプチド処置動物のうちの４匹が感染に対して保護された。この実験は、単回投与の事前曝露予防法は有望であるが、最適な処方及び投薬レジメンは進行中の実験の領域であることを示唆している。

この研究において提示される鼻腔内［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドは、関連する動物モデルにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝播を予防し、２４時間の集中的な直接接触の期間中に完全な保護を提供する最初に成功した予防法である。ＳとＡＣＥ２の間の相互作用を標的とする伝播を予防する並行アプローチは、ｉｎｖｉｔｒｏでの可能性を示した（例えば、「ミニプロテイン」アプローチ）。ここに記載するリポペプチドは、Ｓ１の脱落後にＳ２ドメインに作用し（図１０Ａ～Ｂ）、その融合前立体配座、例えば、合成ナノボディにおいてＳ１の機能を標的とし又はＳを維持する戦略を補完する。融合阻害リポペプチドは、それらの戦略と組み合わせて、及び処置される感染した個体における複製を減少させる処置（例えば、リボヌクレオシド類似体）と併せて、曝露前及び曝露後の予防に使用され得る。異なる態様のウイルスのライフサイクルを標的とする薬剤の組合せは、この急速に進化するウイルスに対して理想的となる可能性がある。［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドは、長い保存期間を有し、冷蔵を必要とせず、容易に投与可能であり、到達困難な人口層を処置することに特に適するものとなる。これは、低所得であり、かつそうでなくても取り残されたコミュニティに対して不釣り合いにかかる負担によってすべてのコミュニティに到達してきたというＣＯＶＩＤ－１９の背景において鍵となる。このＨＲＣリポペプチド融合阻害物質は、人間の使用に対する発展に対して実現可能であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の予防のための安全かつ有効な点鼻スプレー又は吸入投与融合阻害物質に直ちに展開して、進行中のＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの収束を支援すべきである。

実施例８：材料及び方法
倫理規定
インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びアリューシャン病ウイルスの血清陰性の雌（体重９００～１２００ｇ）及び雄（体重１０００～１５００ｇ）フェレット（Ｍｕｓｔｅｌａｐｕｔｏｒｉｕｓｆｕｒｏ）を商業ブリーダー（ＴｒｉｐｌｅＦＦａｒｍｓ、ＰＡ、米国）から取得した。動物を収容し、科学的目的に使用される動物の保護に関するオランダの法律に準拠して実験を行った（２０１４年、ＥＵ指令２０１０／６３を実施）。オランダ所管官庁からのプロジェクトライセンス（ライセンス番号ＡＶＤ１０１００２０１７４３１２）の下で研究を行い、研究プロトコルは機関動物福祉団体（ＥｒａｓｍｕｓＭＣ許可番号１７－４３１２－０７、－０８及び－０９）によって認可された。動物福祉が、日ごとに監視された。Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウス［Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｋ１８－ｈＡＣＥ２）２Ｐｒｌｍｎ／Ｊ］（４～６週齢）をＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、屋内で（ＣＵＩＭＣ、ＮＹ、米国で）繁殖させた。すべてのマウス実験を、ＣｏｌｕｍｂｉａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＡＣ－ＡＡＢＧ９５５９）によって認可されたプロトコルに従って行った。コロンビア大学におけるＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅ（ＩＣＭ）は、ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔａｎｄＡｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＣａｒｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＡＡＡＬＡＣ）によって完全に認定され、ＡｎｉｍａｌＷｅｌｆａｒｅＡｃｔ（ＡＷＡ）、ＨｅａｌｔｈＲｅｓｅａｒｃｈＥｘｔｅｎｓｉｏｎＡｃｔｏｆ１９８５、及びＮａｔｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｕｎｃｉｌ（ＮＲＣ）の下の規制に準拠するものである。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質媒介融合モデル化
分子力学力場の合成を用いて阻害リポペプチド、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）融合前、プレヘアピン及び融合後の構造体をモデル化及びシミュレーションするのにＭｏｌｅｃｕｌａｒＭａｙａ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌａｒａｆｉ．ｃｏｍ／ｔｏｏｌｓ／ｍｍａｙａ／）を用いた。ペグ化コレステロール、阻害ペプチド及びＳタンパク質を、ＭＭＦＦ９４（１）、ＣＨＡＲＭＭＣ３６（２）及びＭａｒｔｉｎｉ（３）力場を用いてそれぞれパラメータ化した。ＡｕｔｏｄｅｓｋＭａｙａの核ソルバーを用いてシミュレーションを行い、核ソルバーに対して固有の追加の制約（ｎＣｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ）を用いて相互作用進行中に分子を安定化させた。

当初の全長融合前Ｓタンパク質をモデル化するために、我々は、ＵｎｉＰｒｏｔｅｎｔｒｙＰ０ＤＴＣ２からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質配列、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質からのＰＤＢ６ＸＲ８（４）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶのＳタンパク質からの２ＦＸＰ（５）を用いた。残余の構造的ギャップを、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭａｙａ’ｓＭｏｄｅｌｉｎｇキットを用いてモデル化した。

Ｓプレヘアピン中間体をモデル化するために、我々は、融合後の構造体を、配列（残基９６８～１０３５）における中央ヘリックス（ＣＨ）領域のみを考慮して、ＰＤＢ６ＸＲＡ（４）から我々の全長融合前モデルまで配列した。その後、配列された融合後構造体に向かうＨＲＮ領域を累進的に進行させるようにシミュレーションを行い、ＨＲＮによってＣＨコイル化されたコイルの伸長をもたらした。モデルの残余領域を弾性ネットワーク又は位置制約によって制約して局所的な２次構造を保存した。その後、融合ペプチド領域を弾性ネットワークから放出して、宿主細胞膜に向けて進行させ、プレヘアピンモデルとした。

融合後モデルを、プレヘアピンモデルから融合後構造までのＨＲＣ領域を累進的に進行させてＨＲＣ－ＨＲＮ６－ヘリックスバンドルを得ることによって取得した。転移時に、ＳのＣ末端膜貫通ドメインに対する位置の制約を変換してＨＲＣを進行標的に到達させ、融合後構造標的の全体を再配向してウイルス膜プロキシとの重なりを回避した。

最後に、Ｓタンパク質との阻害リポペプチドの相互作用をモデル化するために、そのアミノ酸を標的融合後構造における一致するＨＲＣ残基に向けて進行させる一方で、コレステロール部位を宿主細胞膜平面に位置決めした。Ｓのプレヘアピンから融合後の転移は、ＨＲＣと阻害ペプチドの間の立体的衝突が検出される前に中断された。

リポペプチド合成
Ｃ末端－ＧＳＧＳＧＣスペーサー配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳの残基１１６８～１２０３に対応するペプチド（ＳＡＲＳ_ＨＲＣ）を、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって調製した。ＳＡＲＳ_ＨＲＣペプチドを、Ｎ末端においてアセチル化し、Ｃ末端においてアミド化した。粗ペプチドを、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法－飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ）によって特徴付けた。ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ｃｈｏｌ、ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４－ｃｈｏｌ、ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_２４－ｃｈｏｌ、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ］_２－ＰＥＧ_１１及び［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌを、前述したように、ペプチドシステイン残基上の末端チオール基と、ブロモアセチルｃｈｏｌ（示されるＰＥＧリンカーの有無にかかわらず）、マレイミド機能性ＰＥＧリンカー又はＰＥＧコレステロールリンカーのいずれかとの間の化学選択的なチオール－マイケル付加反応を介して合成した（６）。ＨＰＬＣによる精製及び凍結乾燥によって、ペプチド－脂質複合体を白色粉末として得た。その複合体の同一性をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳによって検証した（図７）。

実験での使用のためにリポペプチドを溶解する
［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌを１０ｍｇのアリコートで白色粉末として供給した。フェレットでのｉｎｖｉｖｏ実験のために、１０ｍｇの［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌを３３．３μｌのＤＭＳＯに溶解し、その後にそれを１６３２．７μｌの脱イオン化Ｈ_２Ｏに添加した。これにより、２％のＤＭＳＯを含有する６ｍｇ／ｍＬの濃度において溶解されたリポペプチドの最終水溶液が得られた。ＤＭＳＯなしの水溶液に溶解されたペプチドを得るために、ＤＭＳＯ中の１００ｍｇ／ｍｌの［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ又は［ＨＰＩＶ３_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ（１００μｌのＤＭＳＯ中に１０ｍｇのペプチド）及び滅菌水中の１ｍｇ／ｍｌのスクロースを調製した。１０μｌのペプチド溶液（１ｍｇ）を１００μｌのスクロース（０．１ｍｇ）に添加した。ペプチド溶液（ＤＭＳＯ＋スクロース）の凍結乾燥を一晩行い、乾燥粉末を５０μｌのＤＩ水に再懸濁して、ＤＭＳＯを有さない水で２０ｍｇ／ｍｌの最終濃度とした。

プラスミド
蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓに融合されたｈＡＣＥ２、蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓに融合されたジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ及び示されたＳの変異体、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのＳ並びにＭＥＲＳ－Ｓ（哺乳類発現のために最適化されたコドン）をコードするｃＤＮＡを（選択のためのピューロマイシン耐性を有する）修飾されたｐＣＡＧＧＳにおいてクローニングした。

ウイルス
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（単離体ＢｅｔａＣｏＶ／Ｍｕｎｉｃｈ／ＢａｖＰａｔｌ／２０２０；Ｃ．Ｄｒｏｓｔｅｎ教授の好意によって提供された）をＯｐｔｉＭＥＭＩ（ＩＸ）＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）においてＶｅｒｏＥ６細胞上で継代３まで増殖し、３７℃でペニシリン（１００００ＩＵ／ｍＬ、Ｌｏｎｚａ）及びストレプトマイシン（１００００ＩＵ／ｍＬ、Ｌｏｎｚａ）で補充した。ＶｅｒｏＥ６細胞を０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）において接種した。上澄み液を、接種後時間（ＨＰＩ）７２時間で収穫し、遠心分離によって清浄化し、－８０℃で保存した。すべての生ウイルスの作業を、ＥｒａｓｍｕｓＭＣにおいてＢＳＬ－３条件の下でクラスＩＩ安全キャビネット内で実行した。ＨＰＩＶ３－ＧＦＰをＶｉｒａｔｒｅｅから市場で取得し、３７℃で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００００ＩＵ／ｍＬ、Ｌｏｎｚａ）及びストレプトマイシン（１００００ＩＵ／ｍＬ、Ｌｏｎｚａ）で補充されたＤＭＥＭにおいてＶｅｒｏ細胞上で継代３まで増殖した。

細胞
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ及びＶｅｒｏ（アフリカミドリザルの腎臓）細胞を、３７℃で５％ＣＯ_２において１０％ＦＢＳ及び抗生物質で補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で増殖させた。ＶｅｒｏＥ６（ＡＴＣＣＣＲＬ－１５８６）及びＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｌｏｎｚａ）、１．５ｍｇ／ｍｌの炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３、Ｌｏｎｚａ）、ペニシリン（１００００ＩＵ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００００ＩＵ／ｍＬ）を有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた（７）。

β－Ｇａｌ相補性による融合アッセイ
我々は、以前にβ－ガラクトシダーゼ（β－Ｇａｌ）のアルファ相補性に基づいて融合アッセイを適合させた（８）。このアッセイでは、β－Ｇａｌのオメガペプチドを発現するｈＡＣＥ２受容体保有細胞（すなわち、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－２実験に対するジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）受容体保有細胞）が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質Ｓ及びβ－Ｇａｌのアルファペプチドを共発現する細胞と混合され、細胞融合はアルファ－オメガ相補性をもたらす。融合は、細胞を溶解することによって停止され、基質（ＴｈｅＴｒｏｐｉｘＧａｌａｃｔｏ－Ｓｔａｒ（登録商標）化学発光レポーターアッセイシステム、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）の添加の後に、発光がＴｅｃａｎＭ１０００ＰＲＯマイクロプレートリーダにおいて定量化される。

ＨＡＥ培養物及び毒性アッセイ
ＥｐｉＡｉｒｗａｙＡＩＲ－１００システム（ＭａｔＴｅｋＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、ｉｎｖｉｖｏ上皮組織のものと非常に類似する、偽重層の高度に分化した粘膜毛上皮を形成するように培養された正常ヒト由来気管／気管支上皮細胞からなる（９）。ＨＡＥ培養物を、１、１０又は１００μＭの濃度の異なるペプチドの存在下又は非存在下において３７℃でインキュベーションし、それらを７日間にわたって２日ごとに栄養培地に添加した。細胞生存率を、ＶｙｂｒａｎｔＭＴＴＣｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＡｓｓａｙＫｉｔを用いて製造業者のガイドラインに従って２４時間後に特定した。吸光度を、ＴｅｃａｎＭ１０００ＰＲＯマイクロプレートリーダを用いて５４０ｎｍにおいて読み取った。

Ｓ由来ＨＲＣペプチド（ＨＲＣ_ＳＡＲＳ）に対する抗体
ＨＲＣ_ＳＡＲＳの線状エピトープに対するポリクローナル抗体をウサギにおいて生成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、我々のウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡアッセイにおいて検証した。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔは、ＥＬＩＳＡにおける抗体によってエピトープ認識を確認する完全な報告を提供した。精製血清を等分して凍結乾燥した（封止ボトルに１０～２０ｍｇ）。いくつかのアリコートの精製血清は、ビオチンと複合した。凍結乾燥アリコートを－８０℃に維持した。アリコートを再懸濁すると、複数の液体アリコート（５０～１００μｌ）を作製して再冷凍した（－８０℃）。

マウス生体内分布実験
ケタミン／キシラジン（それぞれ１００ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物による麻酔下での鼻腔内接種（図１２）マウス（ｎ＝３又は４）に、点滴器によって４０μｌの水及び２％ＤＭＳＯに溶解したリポペプチド（５μｇ／ｇ）を鼻腔内滴下（各鼻腔に２０μｌ）した。皮下注入（図１２ａ、ｂ）：ケタミン／キシラジン（それぞれ１００ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物による麻酔下でのマウスに、肩甲骨間の皮下組織に、１００μｌの水及び２％ＤＭＳＯに溶解したリポペプチド（５μｇ／ｇ）を注入した。両実験において、マウスを、耳標を用いて固有に識別した。麻酔から回復後、マウスを動物舎に戻し、分析用の組織（肺及び血液）を収穫する前に、イソフルオラン麻酔下での頚椎脱臼によって３時点（投薬後１、８及び２４時間）で人道的に安楽死させた。肺を重量測定し、ＰＢＳ（１：１、ｗ／ｖｏｌ）に混合し、ＢｅａｄＢｕｇ（商標）マイクロ管ホモジナイザーを用いて均質化した。サンプルを、その後にアセトニトリル／１％ＴＦＡ（１：４、ｗｏｌ／ｖｏｌ）によって４℃でローター上で一晩処置し、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。リポペプチドは、皮下投与（図１２ａ、ｂ）後の肺には検出できなかった。鼻腔内投与後、［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌは、気道における優れた滞留を示した（図１２ｃ、ｄ）。

準定量的なペプチド評価のためのＥＬＩＳＡ
９６ウェルプレートＭａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）を、炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ＝７．４、２０μｇ／ｍｌ）中で精製ウサギ抗ＨＲＣ_ＳＡＲＳ抗体によって一晩コーティングした。プレートを１×ＰＢＳ中で２回洗浄し、３％ＢＳＡ／１×ＰＢＳにおいて３０分間ブロックした。ブロッキング緩衝液を、デュプリケートで３％ＢＳＡ／１×ＰＢＳにおける各サンプルの２つの希釈物によって置換され、室温（ＲＴ）において１．５時間インキュベーションした。ウェルを１×ＰＢＳ中で３回洗浄し、ＲＴで１時間にわたってビオチンに複合された精製ウサギ抗ＨＲＣ_ＳＡＲＳ抗体によって展開した。ウェルを１×ＰＢＳ中で３回洗浄し、ＲＴで３０分間にわたって３％ＢＳＡ／１ＸＰＢＳ中でペルオキシダーゼに複合されたストレプトアビジンを用いて展開し、続いて５回洗浄し、ＵｌｔｒａＴＭＢ基質溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とともにインキュベーションし、硫酸（１２％）によって停止した。吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。

免疫組織化学検出
肺切片を脱パラフィン化し、１０％ロバ血清によってＲＴで１時間ブロックした。ウサギ抗ＨＲＣ_ＳＡＲＳ抗体を添加し、４℃で１２時間インキュベーションした。切片を、ロバ抗ウサギ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ａ３１５７２）によってＲＴで１時間染色した。切片をＤＡＰＩによって処置し、ＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄＭｏｕｎｔｉｎｇＭｅｄｉｕｍ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，カナダ）にマウントし、ＤＭｉ８（ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＢｕｆｆａｌｏＧｒｏｖｅ，アイルランド）によって被覆及び撮像した。

融合阻害リポペプチドのｉｎｖｉｔｒｏ効力
［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ及び［ＨＰＩＶ３_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの効力を、ｉｎｖｉｔｒｏ感染性ウイルス融合アッセイにおいて特定した。動物実験のための当初のストック及び作業希釈液を、０．０６ｎＭ～５μＭ（５倍希釈系列）の濃度でＶｅｒｏＥ６及びＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞においてトリプリケートで試験した。ペプチドを、３７℃で１時間にわたって細胞とプレインキュベーションした。プレインキュベーション後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（６００ＴＣＩＤ_５０／ウェル）を添加した。３７℃で８時間後、細胞を洗浄し、４％のＰＦＡによってＲＴで２０分間定着させた。プレートを、７０％エタノールに浸漬し、ＢＳＬ－２研究室において染色した。要するに、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）によってＲＴで３０分間ブロックした。一次マウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶヌクレオカプシド抗体（Ｂｉｏｒａｄ）を１０％ＮＧＳにおいてＲＴで１時間インキュベーションした。洗浄後、二次ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＦＩＴＣ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１０％ＮＧＳにおいてＲＴで４５分間インキュベーションした。蛍光スポットをＡｍｅｒｓｈａｍＴｙｐｈｏｏｎＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって可視化し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＬ７．０ソフトウェア（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって計数した。ＨＰＩＶ３に対する［ＨＰＩＶ３_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌの活性を、同様のアッセイを用いて特定した。当初のストックを同じ濃度でＶｅｒｏ細胞においてトリプリケートで試験した。プレインキュベーションの後、ｒＨＰＩＶ３－ＧＦＰ（３００ＴＣＩＤ_５０／ウェル）を添加した。細胞を洗浄し、３７時間後に２％ＰＦＡによって定着させ、蛍光スポットを可視化及び計数した。

フェレット伝播実験
ＤＭＳＯ処方リポペプチドを用いた実験について：３匹のドナーフェレットに５×１０^５のＴＣＩＤ_５０／ｍｌのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を４５０μｌ（２２５μｌを各鼻腔に滴下）で鼻腔内接種し、負圧ＨＥＰＡフィルタ付きＡＢＳＬ３アイソレータにともに収容した。これを実験の開始とみなした（接種後日数ＤＰＩが０日）。同時に、１２匹の直接接触フェレットを３個の他のアイソレータに分割した。フェレットを、１～４ＤＰＩに、模擬処置し（ビヒクル、ＤＩ水に２％のＤＭＳＯ）又は［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌによって処置した。ペプチドを４５０μｌ（２２５μｌを各鼻腔に滴下）で鼻腔内接種し、ＨＲＣ２量体ｃｈｏｌ処置フェレットは約２．７ｍｇ／ｋｇのペプチド用量を受けた。残余のバッチを後のｉｎｖｉｔｒｏ効力アッセイでの使用のために－８０℃で保存した（図２２Ａ、Ｂ）。２ＤＰＩに、２回目の処置の６時間後に、３個の別個のアイソレータにおいて、１匹のドナーフェレットを２匹の模擬処置フェレット及び２匹のペプチド処置フェレットと同じアイソレータに配置した。ここで、各アイソレータは５匹のフェレット、すなわち、ドナーフェレット、模擬処置レシピエントフェレット及び［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ処置レシピエントフェレットを含んでいた。３ＤＰＩにおいて、共同収容の開始１８時間後、動物は３回目の模擬処置又はペプチド処置を受けた。６時間後、すなわち、共同収容の開始２４時間後、ドナー動物をそれらの当初のアイソレータに戻し、模擬処置フェレット及びペプチド処置フェレットを清浄なアイソレータにおいて６匹の動物の２つの群で収容した（図２１Ａ）。喉頭及び鼻腔スワブを０、１、２、３、４、５、６、７、１４及び２１ＤＰＩに動物から収集した。サンプルを常に模擬又はペプチドでの投薬の前に取得した。スワブをウイルス輸送媒体（ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅｗｉｔｈＨａｎｋ’ｓＢＳＳ（Ｌｏｎｚａ）、５ｇ／Ｌのラクトアルブミン酵素加水分解物、１０％のグリセロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２００Ｕ／ｍｌのペニシリン、２００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌの硫酸ポリミキシンＢ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び２５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））において－８０℃で保存した。血液サンプルを大静脈穿刺によって０、７、１４及び２１ＤＰＩにフェレットから取得した。血液を血清分離管（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に収集し、処理し、熱不活性化し、血清を－８０℃で保存した。

処置後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するフェレットの罹患性を評価するために、以前に模擬処置し又は［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ処置したフェレットを６個のアイソレータに同じ処置スケジュールのペアで再収容した。フェレットを、５×１０^３、５×１０^４又は５×１０^５のＴＣＩＤ_５０／ｍｌのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を（４５０μｌで）滴定的に攻撃投与した。各用量について、２匹の模擬処置フェレット及び２匹のペプチド処置フェレットに鼻腔内接種した。咽頭及び鼻腔スワブを７日目まで毎日その動物から収集した。すべての罹患動物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に用量依存的に増殖的に感染した（図２３）。

第２のフェレット伝播実験（図２４）を、以下の変更とともに第１の実験と同様に行った。［１］３匹のドナーフェレットに４×１０^５のＴＣＩＤ_５０／ｍｌを（４５０μｌで）接種した。［２］ドナー動物及び直接接触動物の共同収容の２時間前に、６匹の接触動物を５ｍｇ／ｋｇの意図する用量におけるスクロースにおいて処方した単一用量の［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌで処置した。残余のバッチを後のｉｎｖｉｔｒｏ効力アッセイでの試験のために－８０℃で保存し、この段階で、我々は（図１６に示す１ｍｇスケールの代わりに１０ｍｇスケールで調製した）スクロースにおいて処方したリポペプチドのＩＣ_５０が意図したものよりも約２０倍高いことを確認した（図２２Ｃ、Ｄ）。したがって、この実験では、動物は、ＤＭＳＯ処方ペプチドを用いた実験よりも実質的に低い用量を受けている。［３］６匹の模擬処置フェレットは、スクロースにおいて処方した単一用量の［ＨＰＩＶ３_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ（５ｍｇ／ｋｇ）を受けた。３ＤＰＩにおいて、共同収容の２２時間後に、ドナー動物を、それらの当初のアイソレータに戻し、［ＨＰＩＶ３_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ処置動物及び［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ処置動物を６匹の群に収容した。咽頭及び鼻腔スワブを０、１、２、３、４、５、６及び７ＤＰＩに動物から収集し、血液を０及び７ＤＰＩに収集した。［ＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_４］_２－ｃｈｏｌ処置動物を、咽頭及び鼻腔スワブ（Ｃｔ＜３０）におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に応じて別個のアイソレータに再収容した。実験を７ＤＰＩに停止した。

すべての動物の取り扱いを、アチパメゾール（０．２５ｍｇ／ｋｇ）で拮抗したケタミン／メデトミジン（それぞれ１０ｍｇ／ｋｇ及び０．０５ｍｇ／ｋｇ）の混合物による麻酔下で行った。すべての動物実験を、負圧ＡＢＳＬ３設備内でクラスＩＩＩアイソレータにおいて行った。フェレットを日ごとに重量測定した。すべてのフェレットの体重は、ＤＭＳＯ処方ペプチド及びスクロース処方ペプチドの双方の実験において常時安定していた（図２５）。

咽頭及び鼻腔スワブのＲＮＡ分離及びＲＴ－ｑＰＣＲ
６０μｌのサンプル（スワブが保存されるウイルス輸送媒体）を９０μｌのＭａｇＮＡＰｕｒｅ９６ＥｘｔｅｒｎａｌＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）に添加した。既知の濃度のアザラシジステンパーウイルス（ＰＤＶ）を、ＲＮＡ抽出物に対する内部コントロールとしてサンプルに添加した。１５０μｌのサンプル／溶解緩衝液を、５０μｌの磁気ビーズ（ＡＭＰｕｒｅＸＰ、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を含む９６ウェルプレートのウェルに添加した。完全な混合後に、プレートを室温で１５分間インキュベーションした。その後、プレートを磁気ブロック（ＤｙｎａＭａｇ（商標）－９６ＳｉｄｅＳｋｉｒｔｅｄＭａｇｎｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に配置し、３分間インキュベーションして、ビーズを磁石側に向けてずらした。上澄みを注意深く除去し、ビーズを７０％エタノールの２００μｌ／ウェルによって室温で３０秒間で３回洗浄した。最後の洗浄後に、２０μｌのマルチチャネルピペットを用いて残留エタノールを除去した。プレートを、室温で２分間空気乾燥させた。プレートを磁気ブロックから除去し、５０μｌのＰＣＲ用水を各ウェルに添加して混合した。プレートを室温で５分間インキュベーションした後に磁気ブロック上に２分間再配置してビーズを分離させた。上澄みを新たなプレートにピペットで移し、ＲＮＡを－８０℃で保存した。ＲＮＡを、前述したように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥ遺伝子を標的化するプライマー及びプローブを用いてＲＴ－ｑＰＣＲに直接使用した。

咽頭及び鼻腔スワブからのウイルス分離
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、組織培養感染性用量－５０（ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）を特定する感染中心アッセイを用いてＶｅｒｏＥ６において分離した。細胞に５０μｌのサンプル（スワブが保存されるウイルス輸送媒体、最初の希釈１：３）を接種し、それを３倍希釈系列においてクワドロプリケートで希釈した。ＶｅｒｏＥ６を、培養の６日後に細胞変性効果（ＣＰＥ）についてスクリーニングし、ＴＣＩＤ_５０／ｍｌでの感染力価を計算した。

フェレット血清におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的抗体の検出
フェレットのセロコンバージョンを、０、７、１４及び２１ＤＰＩにおいて得られたフェレット血清を用いて試験した。Ｓ及びヌクレオカプシド（Ｎ）ＥＬＩＳＡを実行した。高結合ＥＬＩＳＡプレートを、４℃で一晩にわたってＰＢＳ中で２０ｎｇの組換えＨｉｓタグ付きＳタンパク質（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）又は１００ｎｇの組換えＨｉｓタグ付きＮタンパク質（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）でコーティングした。その後、プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＴＢＳ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でブロッカーブロットを用いるブロッキングステップ（３７℃、１時間）が続いた。ブロッキング緩衝液に１：１００の濃度で希釈した血清をデュプリケートで試験した。３７℃における１時間のインキュベーション後に、プレートをヤギ抗フェレットＩｇＧＨ＆Ｌ／ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ）によって洗浄して３７℃で１時間インキュベーションした。洗浄後、ＴＭＢ基質（Ｓｅｒａｃａｒｅ）を暗所で５分間インキュベーションした。硫酸を用いて反応を停止させ、吸光度をＴｅｃａｎＭ２００プレートリーダにおいて４５０ｎｍで測定した。ウイルス中和抗体をエンドポイント滴定アッセイによって検出した。簡潔には、フェレット血清をデュプリケートで１：８の濃度で開始する２倍希釈系列において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１００ＴＣＩＤ_５０とともに３７℃で１時間インキュベーションした。ウイルス－血清混合物をＶｅｒｏＥ６細胞に添加して３７℃で５日間インキュベーションした。ＣＰＥを読取り値として用いて、ＣＰＥを阻害するのに必要な最小血清濃度を特定した。

統計
融合アッセイにおける５０％阻害濃度及び９０％阻害濃度（それぞれＩＣ_５０及びＩＣ_９０）を、３個のパラメータ非線形回帰を実行することによって計算した。ＩＣ_５０間の差を二元配置分散分析によって比較した。感染ウイルスアッセイにおけるＩＣ_５０及びＩＣ_９０を、正規化及び変換データにおける可変勾配を用いて４個のパラメータ非線形回帰を実行することによって計算した。ｉｎｖｉｖｏ実験でのすべての折れ線グラフを二元配置分散分析反復測定によって比較した。曲線下面積を動物ごとの曲線に基づいてＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを用いて計算し、マン－ホイットニー検定によって比較した。すべての統計処理を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍＶ９を用いて実行した。

実施例９：トランスジェニックマウスモデルにおける［ＳＡＲＳ－ＰＥＧ４］２－ｃｈｏｌ及びＳＡＲＳ_ＨＲＣ－ＰＥＧ_２４－ｃｈｏｌのｉｎｖｉｖｏ効力試験
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０１９年に中国から新たに出現したベータコロナウイルスである。それは、すでに全世界で膨大な死者をもたらしたＣＯＶＩＤ－１９（コロナウイルス感染症２０１９）パンデミックの原因である。ワクチンが入手可能であるが、特にワクチン接種に対して脆弱又は難治性の人々に対して、代替的かつ補完的予防法を有することが重要である。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入は、宿主細胞の原形質膜とのウイルスエンベロープの付着及び融合を介して発生し、ウイルス糖タンパク質Ｓによって媒介される。この３量体クラスＩタンパク質は、６個の逆平行ヘリックスにおいて組織化されたＮ及びＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲ）を有する。我々は、脂質に結合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＣ末端位置においてＨＲ領域からペプチドを生成した。これらのペプチドは、表面タンパク質のＮ末端ヘプタッドリピート（ＨＲ）領域を結合することによってウイルスの侵入を阻害する。我々は、ｉｎｖｉｔｒｏ及びｅｘｖｉｖｏの双方において細胞へのウイルスの侵入を阻害するとともにウイルスの伝播を予防するそれらの能力を試験した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感受性を有する動物モデルを保護するこれらのペプチドの能力も、ｉｎｖｉｖｏの研究を通じて調査した。

あるペプチドは、マウスにおいて、ナノモルの範囲で９０％阻害濃度（ＩＣ９０）でのウイルス融合を阻害し、その後に感染及びウイルスの播種を阻害する。そして、これらのペプチドを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染の前に、サイトケラチンＫ１８（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｋ１８－ＡＣＥ２）２Ｐｒｌｍｎ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ）プロモーターの制御下で、ヒトＡＣＥ２受容体を発現するトランスジェニックマウスに鼻腔内投与した。感染は、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスにおいて感染後１０日以内で概ね致死率１００％であったが、これらの２つのペプチドで処置した動物の８０～１００％は、未処置の動物と比較して、感染後２日の肺内のウイルス量の有意な低下でそれぞれ生存した。

結論として、これらの結果は、ウイルスとその宿主細胞との間の融合を阻害するペプチドはマウスモデルにおけるｉｎｖｉｖｏでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の呼吸器感染もブロックし、それにより、現在のｃｏｖｉｄ－１９パンデミックを克服するために阻害ペプチドの投与を通じて開発されるべき新たな抗ウイルスアプローチを構成することを実証した。

配列表
配列番号１（ＳＡＲＳペプチド、ＳＡＲＳＨＲＣとも命名される）
ＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬ
配列番号２（ＳＡＲＳＭｏｄペプチド）
ＤＩＳＱＩＮＡＳＶＶＮＩＥＹＥＩＫＫＬＥＥＶＡＫＫＬＥＥＳＬＩＤＬＱＥＬ
配列番号３（＞ｓｐ｜Ｐ０ＤＴＣ２｜ＳＰＩＫＥ＿ＳＡＲＳ２スパイク糖タンパク質ＯＳ＝重症急性）
ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＲＲＡＲＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＫＶＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱＹＩＫＷＰＷＹＩＷＬＧＦＩＡＧＬＩＡＩＶＭＶＴＩＭＬＣＣＭＴＳＣＣＳＣＬＫＧＣＣＳＣＧＳＣＣＫＦＤＥＤＤＳＥＰＶＬＫＧＶＫＬＨＹＴ

参照文献
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Ｘｉａ，Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｌｉｕ，Ｓ．Ｗ．，Ｌｕ，Ｌ．及びＪｉａｎｇ，Ｓ．Ｂ．［ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｐｅｐｔｉｄｉｃＭＥＲＳ－ＣｏＶｅｎｔｒｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ］，ＹａｏＸｕｅＸｕｅＢａｏ５０，１５１３－１５１９（２０１５）
Ｘｉａ，Ｓ．他Ａｐａｎ－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｆｕｓｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｈｅＨＲ１ｄｏｍａｉｎｏｆｈｕｍａｎｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｓｐｉｋｅ．ＳｃｉＡｄｖ５，ｅａａｖ４５８０，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉａｄｖ．ａａｖ４５８０（２０１９）
Ｘｉａ，Ｓ．他ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ２０１９－ｎＣｏＶ）ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｂｙａｈｉｇｈｌｙｐｏｔｅｎｔｐａｎ－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｆｕｓｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｔａｒｇｅｔｉｎｇｉｔｓｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｔｈａｔｈａｒｂｏｒｓａｈｉｇｈｃａｐａｃｉｔｙｔｏｍｅｄｉａｔｅｍｅｍｂｒａｎｅｆｕｓｉｏｎ．ＣｅｌｌＲｅｓ３０，３４３－３５５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４２２－０２０－０３０５－ｘ（２０２０）
Ｚｈｕ，Ｙ．，Ｙｕ，Ｄ．，Ｙａｎ，Ｈ．，Ｃｈｏｎｇ，Ｈ．及びＨｅ，Ｙ．ＤｅｓｉｇｎｏｆＰｏｔｅｎｔＭｅｍｂｒａｎｅＦｕｓｉｏｎＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓａｇａｉｎｓｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２，ａｎＥｍｅｒｇｉｎｇＣｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｗｉｔｈＨｉｇｈＦｕｓｏｇｅｎｉｃＡｃｔｉｖｉｔｙ．ＪＶｉｒｏｌ９４，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００６３５－２０（２０２０）
Ｗａｎｇ，Ｘ．他Ｂｒｏａｄ－ＳｐｅｃｔｒｕｍＣｏｒｏｎａｖｉｒｕｓＦｕｓｉｏｎＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓｔｏＣｏｍｂａｔＣＯＶＩＤ－１９ａｎｄＯｔｈｅｒＥｍｅｒｇｉｎｇＣｏｒｏｎａｖｉｒｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ．ＩｎｔＪＭｏｌＳｃｉ２１，ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ２１１１３８４３（２０２０）
Ｐｏｒｏｔｔｏ，Ｍ．他Ｖｉｒａｌｅｎｔｒｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｔａｒｇｅｔｅｄｔｏｔｈｅｍｅｍｂｒａｎｅｓｉｔｅｏｆａｃｔｉｏｎ．ＪＶｉｒｏｌ８４，６７６０－６７６８，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００１３５－１０（２０１０）
Ｐｏｒｏｔｔｏ，Ｍ．他ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＮｉｐａｈｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｖｉｖｏ：ｔａｒｇｅｔｉｎｇａｎｅａｒｌｙｓｔａｇｅｏｆｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｆｕｓｉｏｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｖｉｒａｌｅｎｔｒｙ．ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇ６，ｅ１００１１６８，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．ｌ００１１６８（２０１０）
Ｐｅｓｓｉ，Ａ．他Ａｇｅｎｅｒａｌｓｔｒａｔｅｇｙｔｏｅｎｄｏｗｎａｔｕｒａｌｆｕｓｉｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄｐｅｐｔｉｄｅｓｗｉｔｈｐｏｔｅｎｔａｎｔｉｖｉｒａｌａｃｔｉｖｉｔｙ．ＰＬｏＳＯｎｅ７，ｅ３６８３３，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３６８３３（２０１２）
Ｗｅｌｓｃｈ，Ｊ．Ｃ．他Ｆａｔａｌｍｅａｓｌｅｓｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｐｒｅｖｅｎｔｅｄｂｙｂｒａｉｎ－ｐｅｎｅｔｒａｎｔｆｕｓｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．ＪＶｉｒｏｌ８７，１３７８５－１３７９４，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２４３６－１３（２０１３）
Ｏｕｔｌａｗ，Ｖ．Ｋ．他ＤｕａｌＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＰａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａＴｙｐｅ３ａｎｄＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｙｎｃｙｔｉａｌＶｉｒｕｓＩｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙｗｉｔｈａＳｉｎｇｌｅＡｇｅｎｔ．ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ１４１，１２６４８－１２６５６，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａｃｓ．９ｂ０４６１５（２０１９）
Ｆｉｇｕｅｉｒａ，Ｔ．Ｎ．他Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ－ＦｕｎｃｔｉｏｎＭｅｃｈａｎｉｓｔｉｃＬｉｎｋｓｉｎｔｈｅＡｎｔｉ－ＭｅａｓｌｅｓＶｉｒｕｓＡｃｔｉｏｎｏｆＴｏｃｏｐｈｅｒｏｌ－ＤｅｒｉｖａｔｉｚｅｄＰｅｐｔｉｄｅＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．ＡＣＳＮａｎｏ１２，９８５５－９８６５，ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｎａｎｏ．８ｂ０１４２２（２０１８）
Ｆｉｇｕｅｉｒａ，Ｔ．Ｎ．他ＥｆｆｅｃｔｉｖｅｉｎＶｉｖｏＴａｒｇｅｔｉｎｇｏｆＩｎｆｌｕｅｎｚａＶｉｒｕｓｔｈｒｏｕｇｈａＣｅｌｌ－Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ／ＦｕｓｉｏｎＩｎｈｉｂｉｔｏｒＴａｎｄｅｍＰｅｐｔｉｄｅＡｎｃｈｏｒｅｄｔｏｔｈｅＰｌａｓｍａＭｅｍｂｒａｎｅ．ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ２９，３３６２－３３７６，ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｂｉｏｃｏｎｊｃｈｅｍ．８ｂ００５２７（２０１８）
Ｍａｔｈｉｅｕ，Ｃ．他Ｂｒｏａｄｓｐｅｃｔｒｕｍａｎｔｉｖｉｒａｌａｃｔｉｖｉｔｙｆｏｒｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓｉｓｍｏｄｕｌａｔｅｄｂｙｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｆｕｓｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＳｃｉＲｅｐ７，４３６１０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ４３６１０（２０１７）
Ｆｉｇｕｅｉｒａ，Ｔ．Ｎ．他ＩｎＶｉｖｏＥｆｆｉｃａｃｙｏｆＭｅａｓｌｅｓＶｉｒｕｓＦｕｓｉｏｎＰｒｏｔｅｉｎ－ＤｅｒｉｖｅｄＰｅｐｔｉｄｅｓＩｓＭｏｄｕｌａｔｅｄｂｙｔｈｅＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＳｅｌｆ－ＡｓｓｅｍｂｌｙａｎｄＭｅｍｂｒａｎｅＲｅｓｉｄｅｎｃｅ．ＪＶｉｒｏｌ９１，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０１５５４－１６（２０１７）
Ｍａｔｈｉｅｕ，Ｃ．他Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｍｅａｓｌｅｓｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｂｙｉｎｔｒａｎａｓａｌｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｆｕｓｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＪＶｉｒｏｌ８９，１１４３－１１５５，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２４１７－１４（２０１５）
Ｚｈａｎｇ，Ｌ．他ＴｈｅＤ６１４ＧｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｒｅｄｕｃｅｓＳＩｓｈｅｄｄｉｎｇａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｓｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ．ｂｉｏＲｘｉｖ．ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．０６．１２．１４８７２６（２０２０）
Ｍｕｉｋ，Ａ．他，ＮｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｌｉｎｅａｇｅＢ．１．１．７ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓｂｙＢＮＴ１６２ｂ２２２８ｖａｃｃｉｎｅ－ｅｌｉｃｉｔｅｄｈｕｍａｎｓｅｒａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０２１）
ＷｕＫ．他，ｍＲＮＡ－１２７３ｖａｃｃｉｎｅｉｎｄｕｃｅｓｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔｓｐｉｋｅｍｕｔａｎｔｓｆｒｏｍ２３０ｇｌｏｂａｌＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｖａｒｉａｎｔｓ．ｂｉｏＲｘｉｖ，（２０２１）
Ｍｙｋｙｔｙｎ，Ａ．Ｚ．他ＴｈｅＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍｕｌｔｉｂａｓｉｃｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓｅａｒｌｙｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄｅｎｔｒｙｉｎｔｏｏｒｇａｎｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄｈｕｍａｎａｉｒｗａｙｃｅｌｌｓ．ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．２００９．２００７．２８６１２０，ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．０９．０７．２８６１２０（２０２０）
Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｍ．他ＣｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅｄｏｅｓｎｏｔｉｎｈｉｂｉｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｌｕｎｇｃｅｌｌｓｗｉｔｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．Ｎａｔｕｒｅ５８５，５８８－５９０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２５７５－３（２０２０）
Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｍ．他ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｉｓｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄｖｉａｃｏｎｔａｃｔａｎｄｖｉａｔｈｅａｉｒｂｅｔｗｅｅｎｆｅｒｒｅｔｓ．ＮａｔＣｏｍｍｕｎ１１，３４９６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１７３６７－２（２０２０）
Ｍｕｎｓｔｅｒ，Ｖ．Ｊ．他Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆｓｗｉｎｅ－ｏｒｉｇｉｎ２００９Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｉｎｆｅｒｒｅｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３２５，４８１－４８３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７７１２７（２００９）
Ｍａｒｔｉｎａ，Ｂ．Ｅ．他Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：ＳＡＲＳｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆｃａｔｓａｎｄｆｅｒｒｅｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ４２５，９１５，ｄｏｉ：１０．１０３８／４２５９１５ａ（２００３）
Ｋｉｍ，Ｙ．Ｉ．他ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＲａｐｉｄＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｉｎＦｅｒｒｅｔｓ．ＣｅｌｌＨｏｓｔＭｉｃｒｏｂｅ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｏｍ．２０２０．０３．０２３（２０２０）
Ｃａｏ，Ｌ．他ＤｅｎｏｖｏｄｅｓｉｇｎｏｆｐｉｃｏｍｏｌａｒＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍｉｎｉｐｒｏｔｅｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３７０，４２６－４３１，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｄ９９０９（２０２０）
Ｓｃｈｏｏｆ，Ｍ．他Ａｎｕｌｔｒａ－ｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙｓｙｎｔｈｅｔｉｃｎａｎｏｂｏｄｙｂｌｏｃｋｓＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｂｙｌｏｃｋｉｎｇＳｐｉｋｅｉｎｔｏａｎｉｎａｃｔｉｖｅｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ｂｉｏＲｘｉｖ，ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．０８．０８．２３８４６９（２０２０）
Ｓｃｈｏｏｆ，Ｍ．他ＡｎｕｌｔｒａｐｏｔｅｎｔｓｙｎｔｈｅｔｉｃｎａｎｏｂｏｄｙｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｓＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｂｙｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇｉｎａｃｔｉｖｅＳｐｉｋｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３７０，１４７３－１４７９，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｅ３２５５（２０２０）
Ｃｏｘ，Ｒ．Ｍ．，Ｗｏｌｆ，Ｊ．Ｄ．及びＰｌｅｍｐｅｒ，Ｒ．Ｋ．ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅａｎａｌｏｇｕｅＭＫ－４４８２／ＥＩＤＤ－２８０１ｂｌｏｃｋｓＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｉｎｆｅｒｒｅｔｓ．ＮａｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５６４－０２０－００８３５－２（２０２０）
Ｔ．Ａ．Ｈａｌｇｒｅｎ，Ｂ．Ｌ．Ｂｕｓｈ，ＴｈｅＭｅｒｃｋｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｏｒｃｅｆｉｅｌｄ（ＭＭＦＦ９４）．Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．ＡｂｓｔｒＰａｐＡｍＣｈｅｍＳ２１２，２－Ｃｏｍｐ（１９９６）
Ｒ．Ｂ．Ｂｅｓｔ他，ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡｄｄｉｔｉｖｅＣＨＡＲＭＭＡｌｌ－ＡｔｏｍＰｒｏｔｅｉｎＦｏｒｃｅＦｉｅｌｄＴａｒｇｅｔｉｎｇＩｍｐｒｏｖｅｄＳａｍｐｌｉｎｇｏｆｔｈｅＢａｃｋｂｏｎｅｐｈｉ，ｐｓｉａｎｄＳｉｄｅ－Ｃｈａｉｎｃｈｉ（ｌ）ａｎｄｃｈｉ（２）ＤｉｈｅｄｒａｌＡｎｇｌｅｓ．ＪＣｈｅｍＴｈｅｏｒｙＣｏｍｐｕｔ８，３２５７－３２７３（２０１２）
Ｓ．Ｊ．Ｍａｒｒｉｎｋ，Ｈ．Ｊ．Ｒｉｓｓｅｌａｄａ，Ｓ．Ｙｅｆｉｍｏｖ，Ｄ．Ｐ．Ｔｉｅｌｅｍａｎ，Ａ．Ｈ．ｄｅＶｒｉｅｓ，ＴｈｅＭＡＲＴＩＮＩｆｏｒｃｅｆｉｅｌｄ：Ｃｏａｒｓｅｇｒａｉｎｅｄｍｏｄｅｌｆｏｒｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ．ＪＰｈｙｓＣｈｅｍＢ１１１，７８１２－７８２４（２００７）
Ｙ．Ｃａｉ他，ＤｉｓｔｉｎｃｔｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｓｔａｔｅｓｏｆＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３６９，１５８６－１５９２（２０２０）
Ｓ．Ｈａｋａｎｓｓｏｎ－ＭｃＲｅｙｎｏｌｄｓ，Ｓ．Ｊｉａｎｇ，Ｌ．Ｒｏｎｇ，Ｍ．Ｃａｆｆｒｅｙ，Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｓｅｖｅｒｅａｃｕｔｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅ－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｈｅｐｔａｄｒｅｐｅａｔ２ｄｏｍａｉｎｉｎｔｈｅｐｒｅｆｕｓｉｏｎｓｔａｔｅ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２８１，１１９６５－１１９７１（２００６）
Ｔ．Ｎ．Ｆｉｇｕｅｉｒａ他，ＩｎＶｉｖｏＥｆｆｉｃａｃｙｏｆＭｅａｓｌｅｓＶｉｒｕｓＦｕｓｉｏｎＰｒｏｔｅｉｎ－ＤｅｒｉｖｅｄＰｅｐｔｉｄｅｓＩｓＭｏｄｕｌａｔｅｄｂｙｔｈｅＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＳｅｌｆ－ＡｓｓｅｍｂｌｙａｎｄＭｅｍｂｒａｎｅＲｅｓｉｄｅｎｃｅ．ＪＶｉｒｏｌ９１（１）．ｐｉｉ：ｅ０１５５４－１６．（２０１６）
Ａ．Ｚ．Ｍｙｋｙｔｙｎ他，ＴｈｅＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍｕｌｔｉｂａｓｉｃｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓｅａｒｌｙｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄｅｎｔｒｙｉｎｔｏｏｒｇａｎｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄｈｕｍａｎａｉｒｗａｙｃｅｌｌｓ．ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０．２００９．２００７．２８６１２０（２０２０）
Ｍ．Ｐｏｒｏｔｔｏ他，ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＮｉｐａｈｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｖｉｖｏ：ｔａｒｇｅｔｉｎｇａｎｅａｒｌｙｓｔａｇｅｏｆｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｆｕｓｉｏｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｖｉｒａｌｅｎｔｒｙ．ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇ６，ｅ１００１１６８（２０１０）
Ｖ．Ｋ．Ｏｕｔｌａｗ他，ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＣｏｒｏｎａｖｉｒｕｓＥｎｔｒｙＩｎＶｉｔｒｏａｎｄＥｘＶｉｖｏｂｙａＬｉｐｉｄ－ＣｏｎｊｕｇａｔｅｄＰｅｐｔｉｄｅＤｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｔｈｅＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＳｐｉｋｅＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＨＲＣＤｏｍａｉｎ．ｍＢｉｏ１ｌ（５）：ｅ０１９３５－２０．（２０２０）
Ｇ．Ｊ．ｖａｎＤｏｏｒｎｕｍ，Ｍ．Ｓｃｈｕｔｔｅｎ，Ｊ．Ｖｏｅｒｍａｎｓ，Ｇ．Ｊ．Ｇｕｌｄｅｍｅｅｓｔｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｎｉｅｓｔｅｒｓ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｒｅａｌ－ｔｉｍｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｔｏｒａｐｉｄｃｕｌｔｕｒｅｏｆｖａｒｉｏｕｓｃｌｉｎｉｃａｌｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．ＪＭｅｄＶｉｒｏｌ７９，１８６８－１８７６（２００７）
Ｖ．Ｍ．Ｃｏｒｍａｎ他，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ２０１９ｎｏｖｅｌｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（２０１９－ｎＣｏＶ）ｂｙｒｅａｌ－ｔｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ．ＥｕｒｏＳｕｒｖｅｉｌｌ２５（３）：２００００４５（２０２０）
Ｊ．Ｐａｒｋ及びＴ．Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｅｓａｎｔｉｖｉｒａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｆｕｓｉｏｎ－ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２０１７；５１１，９－１８

Claims

ペプチドであって、該ペプチドのＣ末端部分は「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」であり、前記ペプチドのＮ末端部分は、配列番号１及び配列番号２から選択される、ペプチド。
ペプチドであって、該ペプチドのＣ末端部分は「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ」であり、前記ペプチドのＮ末端部分は、配列番号１及び配列番号２から選択される配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％を超えるが１００％未満の相同性を有する、ペプチド。
請求項１又は２に記載のペプチドと、脂質タグと、を含むＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合体。
前記脂質タグは、コレステロール、トコフェロール又はパルミテートである、請求項３に記載のＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合体。
前記脂質タグは、コレステロールである、請求項４に記載のＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合体。
請求項１又は２に記載のペプチドと、脂質タグと、スペーサーと、を含むＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合阻害物質。
前記スペーサーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項６に記載のＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合阻害物質。
前記スペーサーは、ＰＥＧ_４、ＰＥＧ_１１及びＰＥＧ_２４からなる群から選択される、請求項７に記載のＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合阻害物質。
前記脂質タグは、コレステロール、トコフェロール又はパルミテートである、請求項６から８のいずれか一項に記載のＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合阻害物質。
前記脂質タグは、コレステロールである、請求項９に記載のＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合阻害物質。
前記阻害物質は、１つのペプチド部位、１つのスペーサー部位及び１つの脂質タグを有する、請求項６から１０のいずれか一項に記載のＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合阻害物質。
前記阻害物質は、２つのペプチド部位、２つのスペーサー部位及び１つの脂質タグを有する、請求項６から１０のいずれか一項に記載のＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合阻害物質。
請求項１又は２に記載のペプチドと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む薬学的組成物。
請求項１又は２に記載のペプチドと、脂質タグと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む薬学的組成物。
前記脂質タグは、コレステロール、トコフェロール又はパルミテートである、請求項１２に記載の薬学的組成物。
請求項１又は２に記載のペプチドと、脂質タグと、スペーサーと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む薬学的組成物。
前記スペーサーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１６に記載の薬学的組成物。
前記スペーサーは、ＰＥＧ_４、ＰＥＧ_１１及びＰＥＧ_２４からなる群から選択される、請求項１７に記載の薬学的組成物。
前記脂質タグは、コレステロール、トコフェロール又はパルミテートである、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
前記阻害物質は、１つのペプチド部位、１つのスペーサー部位及び１つの脂質タグを有する、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
前記阻害物質は、２つのペプチド部位、２つのスペーサー部位及び１つの脂質タグを有する、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
各々が配列番号１を含む２つの部位と、２つのＰＥＧ_４部位と、１つのコレステロールタグと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物。
各ＰＥＧ_４は、一端を配列番号１及び他端を前記コレステロールタグによって隣接される、請求項２２に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物。
配列番号１の１つの部位と、１つのＰＥＧ_２４部位と、１つのコレステロールタグと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物。
前記ＰＥＧ_２４は、一端を配列番号１及び他端をコレステロールによって隣接される、請求項２４に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物。
請求項１又は２に記載のペプチドと、脂質タグと、スペーサーと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む抗ウイルス薬学的組成物を被検体に投与するステップを備える、その必要のある前記被検体においてＣＯＶＩＤ－１９を予防する方法。
前記脂質タグは、コレステロール、トコフェロール又はパルミテートである、請求項２６に記載の方法。
各々が配列番号１を含む２つの部位と、２つのＰＥＧ_４部位と、１つのコレステロールタグと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含む抗ウイルス薬学的組成物を被検体に投与するステップを備える、その必要のある前記被検体においてＣＯＶＩＤ－１９を予防する方法であって、各ＰＥＧ_４は、一端に配列番号１及び他端にコレステロールを含む配列によって隣接される、方法。
配列番号１の１つの部位と、１つのＰＥＧ_２４部位と、１つのコレステロールタグと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含む抗ウイルス薬学的組成物を被検体に投与するステップを備える、その必要のある前記被検体においてＣＯＶＩＤ－１９を予防する方法であって、前記ＰＥＧ_２４は、一端を配列番号１及び他端をコレステロールによって隣接される、方法。
前記抗ウイルス薬学的組成物は、経気道又は皮下投与される、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
前記抗ウイルス薬学的組成物は、鼻腔内投与される、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
前記抗ウイルス薬学的組成物は、点鼻液又はスプレーとして投与される、請求項３１に記載の方法。
前記抗ウイルス薬学的組成物は、点鼻粉末として投与される、請求項３１に記載の方法。
前記抗ウイルス薬学的組成物は、前記被検体に少なくとも２回投与される、請求項２６から３３のいずれか一項に記載の方法。
少なくとも１回の投与は、前記被検体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露される前に行われる、請求項３４に記載の方法。
すべての投与は、前記被検体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露される前に行われる、請求項３４に記載の方法。
前記投与は毎日行われる、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
前記抗ウイルス薬学的組成物は、前記被検体に１回投与される、請求項２６から３３のいずれか一項に記載の方法。
前記投与は、前記被検体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露される前に行われる、請求項３８に記載の方法。
１以上の追加の抗ウイルス物質を、その必要のある前記被検体に投与するステップをさらに備える請求項２６から３９のいずれか一項に記載の方法。
少なくとも１つの追加の抗ウイルス物質は、ＳＡＲＳ_ＨＲＣペプチドとは異なる態様のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ライフサイクルを標的とする、請求項４０に記載の方法。
前記ペプチドは、前記被検体の上気道及び下気道の双方において生物学的に有効な濃度に到達する、請求項２６から４１のいずれか一項に記載の方法。
前記ペプチドは、前記被検体の肺において生物学的に有効な濃度に到達する、請求項２６から４２のいずれか一項に記載の方法。
前記ペプチドは、前記被検体の血液において生物学的に有効な濃度に到達する、請求項２６から４３のいずれか一項に記載の方法。
前記方法はスパイクタンパク質を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオンによって引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９を予防し、前記スパイクタンパク質の配列は配列番号３とは異なる、請求項２６から４３のいずれか一項に記載の方法。
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ２４７Ｒ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＤ６１４Ｇ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ９４３Ｐ及びＳＡＲＳＣｏＶ－２のＤ８３９Ｙからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ及びラムダ変異体からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
請求項２２から２５のいずれか一項に記載の組成物の有効量を投与して細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害するステップを備える、被検体における細胞を感染させるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリスクを低減する方法。
請求項２２から２５のいずれか一項に記載の組成物の有効量を被検体に投与して細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害するステップを備える、前記被検体におけるＣＯＶＩＤ－１９のリスクを低減する方法。
請求項２２から２５のいずれか一項に記載の組成物の有効量を被検体に投与して該被検体の細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害するステップを備える、前記被検体におけるＣＯＶＩＤ－１９による死亡のリスクを低減する方法であって、ＣＯＶＩＤ－１９による前記被検体の死亡のリスクは低減される、方法。
ＣＯＶＩＤ－１９のリスクを、その必要のある被検体において予防又は低減する方法であって、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の組成物の有効量を前記被検体に投与して該被検体における細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの感染を阻害するステップを備え、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する中和抗体が生成される、方法。
前記被検体は、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに曝露されている、請求項５１に記載の方法。
前記組成物の前記有効量の少なくとも一部は、前記被検体が前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに曝露される期間中に前記被検体に投与される、請求項５２に記載の方法。
前記ＣＯＶＩＤ－１９はスパイクタンパク質を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオンによって引き起こされていたものであり、前記スパイクタンパク質の配列は配列番号３とは異なる、請求項４８から５３のいずれか一項に記載の方法。
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ２４７Ｒ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＤ６１４Ｇ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ９４３Ｐ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＤ８３９Ｙからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ及びラムダ変異体からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
ＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬ－ＧＳＧＳＧ－Ｃを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）脂質－ペプチド融合阻害物質を含む請求項２２に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗ウイルス組成物。
脂質タグに結合されたＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬ－ＧＳＧＳＧ－Ｃの２量体を含むＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合体。
ＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬ－ＧＳＧＳＧ－Ｃは、ＰＥＧスペーサーを介して前記脂質タグに結合される、請求項５８に記載のＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合体。
前記脂質タグは、コレステロールタグである、請求項５８又は５９に記載のＳＡＲＳ脂質－ペプチド融合体。