PT1292615E

PT1292615E - Proteínas v modificadas d morbillivirus

Info

Publication number: PT1292615E
Application number: PT01944623T
Authority: PT
Inventors: Christopher L Parks
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2000-06-23
Filing date: 2001-06-21
Publication date: 2007-01-31
Also published as: KR100885325B1; ES2273852T3; MXPA02012256A; CY1105842T1; CA2409432C; US20030206925A1; US6664066B2; EP1292615A2; WO2002000694A3; CA2409432A1; DE60124098D1; EP1292615B1; DK1292615T3; ATE343589T1; CN1437613A; AU2001267014B2; WO2002000694A2; BR0111827A; KR20030032971A; CN1298738C

Description

ΡΕ1292615 1 DESCRIÇÃO "PROTEÍNAS V MODIFICADAS DE Morbillivirus"

Campo do Invento

Este invento refere-se a vírus de ARN de cadeia simples, de sentido negativo, gerados de forma recombinante e isolados do género Morbillivirus possuindo uma ou mais mutações e/ou deleções que reduzem a repressão normalmente causada pela proteína V.

Antecedentes do Invento

Os vírus de ARN de cadeia simples, de sentido negativo, com envelope são organizados e expressos de forma única. 0 ARN genómico de vírus de cadeia simples de sentido negativo serve duas funções de molde no contexto de uma nucleocápside: como molde para a síntese de ARNs mensageiros (ARNms) e como molde para a síntese da cadeia antigenoma ( + ) . A replicação virai ocorre após a síntese dos ARNms e requer a síntese contínua de proteínas virais. A cadeia do antigenoma (+) sintetizada de novo serve como molde para a geração de mais cópias do ARN genómico de cadeia (-). 0 complexo ARN-polimerase dependente de ARN actua e consegue a transcrição e replicação através do 2 ΡΕ1292615 acoplamento dos sinais que actuam em cis na extremidade 3' do genoma, em particular, na região do promotor. Os genes virais são então transcritos unidireccionalmente a partir do molde do genoma da sua extremidade 3' para 5'.

Com base na reclassificação revista em 1993 pelo Internacional Committee on the Taxonomy of Viruses, foi estabelecida uma Ordem, designada Mononegavirales. Esta Ordem contém três famílias de vírus com envelope com genomas de ARN não segmentados e de cadeia simples de polaridade negativa (sentido negativo). Estas famílias são a Paramyxoviridae, Rhabdoviridae e Filovlrldae. A família Paramyxoviridae foi ainda dividida em duas subfamílias, Paramyxovirinae e Pneumovirinae. A subfamília Paramyxovi-rinae contém três géneros, Respirovirus (anteriormente Paramixovirus) , Rubulavirus e Morbillivirus. A subfamília Pneumovirinae contém o género Pneumovirus. A nova classificação é baseada em critérios morfológicos, na organização do genoma virai, nas actividades biológicas e no parentesco de sequência dos genes e produtos génicos. A actual classificação taxonómica dos Morbillivirus é como se segue:

Ordem Mononegavirales

Família Paramyxoviridae

Subfamília Paramyxovirinae 3 ΡΕ1292615 Género Morbillivirus Vírus do sarampo Morbillivirus do golfinho Vírus da esgana canina Vírus da peste dos pequenos ruminantes Vírus da esgana das focas Vírus da peste bovina

Para muitos destes vírus, não está disponível qualquer tipo de vacina. Assim, há a necessidade de desenvolver vacinas contra tais patogénios humanos e animais. Tais vacinas teriam que provocar uma resposta imunitária protectora no receptor. As características qualitativas e quantitativas de uma resposta tão favorável são extrapoladas a partir das observadas nos sobreviventes da infecção pelo vírus natural, que, em geral, estão protegidos de reinfecção pelo mesmo vírus ou vírus altamente aparentados durante um período significativo subsequente.

Na tentativa de desenvolver tais vacinas pode ser considerada uma variedade de abordagens, incluindo a utilização de: (1) vacinas de proteínas virais individuais purificadas (vacinas de subunidade); (2) preparações de vírus inteiros inactivados; e (3) vírus vivos atenuados.

As vacinas de subunidade têm a característica 4 ΡΕ1292615 desejável de serem puras, definíveis e produzidas em abundância de forma relativamente fácil através de vários meios, incluindo métodos de expressão de ADN recombinante. Até à data, com a excepção notável do antigénio de superfície da hepatite B, as vacinas de subunidade virais provocam geralmente apenas uma imunidade de curta duração e/ou inadequada, particularmente em receptores ingénuos.

Preparações de vírus inteiros inactivados com formalina da poliomielite (IPV) e da hepatite A provaram ser seguras e eficazes. Em contraste, a imunização com vírus inteiros inactivados de forma semelhante tais como vacinas do vírus sincicial respiratório e do vírus do sarampo provocaram respostas imunitárias desfavoráveis e/ou perfis de resposta que predispunham os vacinados a doença exagerada ou aberrante quando confrontados subsequentemente com o vírus natural ou de "tipo selvagem".

Os derivados vivos apropriadamente atenuados de vírus de tipo selvagem oferecem uma distinta vantagem como candidatos a vacinas. Como agentes vivos, que se replicam, eles iniciam a infecção nos receptores durante a qual os produtos dos genes virais são expressos, processados e apresentados no contexto das moléculas do MHC de classe I e II específicas dos vacinados, provocando respostas imunitárias humorais e mediadas por células, bem como padrões coordenados de citocinas e quimocinas, que se assemelham ao perfil imunitário protector dos sobreviventes da infecção natural. 5 ΡΕ1292615

Este padrão de resposta imunitária favorável contrasta com as respostas delimitadas provocadas pelas vacinas inactivadas ou de subunidade, que são tipicamente e amplamente restringidas ao braço de vigilância imunitária humoral. Mais, o perfil da resposta imunitária provocada por algumas vacinas de virus inteiros inactivados com formalina, p. ex., as vacinas do virus do sarampo e do virus sincicial respiratório desenvolvidas na década de 1960, não só não conseguiram proporcionar uma protecção sustentada, como de facto conduziram a uma predisposição a doença aberrante, exagerada e mesmo fatal, quando o receptor da vacina era confrontado mais tarde com o virus de tipo selvagem.

Embora os virus vivos atenuados tenham caracte-rísticas altamente desejáveis como candidatos a vacinas, provou-se que eram difíceis de desenvolver. As principais dificuldades residem na necessidade de isolar um derivado do vírus de tipo selvagem que tenha perdido o seu potencial de produção de doença (i.e. a virulência), ao mesmo tempo que mantém uma competência de replicação suficiente para infectar o receptor e provocar o perfil de resposta imunitária desejado numa abundância adequada.

Historicamente, este delicado equilíbrio entre virulência e atenuação foi conseguido através de passagem em série de um isolado virai de tipo selvagem através de diferentes tecidos ou células hospedeiros sob condições variáveis de crescimento (tais como temperatura). Este 6 ΡΕ1292615 processo favorece presumivelmente o crescimento de variantes virais (mutantes), algumas das quais possuem a caracteristica favorável de atenuação. Ocasionalmente, também é conseguida mais atenuação através de mutagénese quimica.

Este esquema de propagação/passagem conduz tipicamente à emergência de derivados de vírus que são sensíveis à temperatura, adaptados ao frio e/ou alterados no seu espectro de hospedeiros - cujo um ou todos são mudanças dos vírus de tipo selvagem, causadores de doença -i.e. mudanças que podem ser associadas a atenuação.

Diversas vacinas de virus vivos, incluindo aquelas para a prevenção do sarampo e da papeira (que são paramixovírus) , e para a protecção contra a poliomielite e a rubéola (que são vírus de ARN de cadeia positiva) , foram geradas através desta abordagem e proporcionam o pilar dos actuais regimes de imunização infantil em todo mundo. Não obstante, isto significa que gerar candidatos a vacinas de vírus vivos atenuados é demorado e, no melhor dos casos, imprevisível, assentando grandemente no crescimento selectivo desses mutantes genómicos de ocorrência aleatória com caracteristicas de atenuação desejáveis. Os vírus resultantes podem ter o fenótipo desejado in vitro, e parecem mesmo estar atenuados nos modelos animais. No entanto, demasiado frequentemente permanecem sob-atenuados ou sobre-atenuados no hospedeiro 7 ΡΕ1292615 humano ou animal para quem se pretende que sejam candidatos a vacinas.

Mesmo em relação às vacinas actuais em uso, há ainda a necessidade de vacinas mais eficazes. Por exemplo, as vacinas actuais do sarampo proporcionam uma protecção razoavelmente boa. No entanto, as recentes epidemias de sarampo sugerem deficiências na eficácia das vacinas actuais. Apesar da imunização materna, ocorreram taxas elevadas de infecção aguda de sarampo em crianças com idade inferior a um ano, reflectindo a incapacidade das vacinas para induzir niveis de anticorpos anti-sarampo comparáveis aos desenvolvidos após uma infecção de sarampo de tipo selvagem (entradas 1, 2 e 3 na Bibliografia) . Como resultado, as mães imunizadas com vacinas são menos capazes de proporcionar aos seus bebés anticorpos passivos derivados através da placenta suficientes para proteger os recém-nascidos para além dos primeiros meses de vida.

As infecções agudas de sarampo em adolescentes previamente imunizados e em adultos jovens apontam para um problema adicional. Estas falhas secundárias das vacinas indicam limitações na capacidade das vacinas actuais para induzirem e manterem uma protecção antiviral que seja abundante e de longa duração (4, 5 e 6) . Recentemente, foi revelado ainda um outro potencial problema. A proteina hemaglutinina do isolado de sarampo de tipo selvagem mostrou ao longo dos últimos 15 anos uma distância progressivamente crescente das estirpes de vacina (7). Esta ΡΕ1292615 "deriva antigénica" levanta preocupações legítimas de que as estirpes de vacina possam não conter o repertório antigénico ideal necessário para proporcionar uma protecção óptima. Assim, há a necessidade de vacinas melhoradas. A concepção racional de vacinas seria ajudada por uma melhor compreensão destes vírus, em particular, pela identificação dos determinantes de virulência viralmente codificados bem como das mudanças genómicas que são responsáveis pela atenuação.

Devido à sua significância como principal causa de morbilidade e mortalidade humanas, o vírus do sarampo foi estudado de forma bastante extensa. 0 vírus do sarampo é uma grande partícula relativamente esférica, com envelope composta por dois compartimentos, uma membrana lipoproteica e um núcleo de uma partícula ribonucleoproteica, possuindo cada um funções biológicas distintas (8) . 0 envelope do virião é uma membrana plasmática derivada da célula do hospedeiro modificada por três proteínas especificadas pelo vírus: A hemaglutinina (H; aproximadamente 80 quilodaltons (kD)) e as glicoproteínas de fusão (Fi^; aproximadamente 60 kD) projectam-se na superfície do virião e conferem à partícula virai capacidades de ligação e entrada na célula hospedeira (9). Os anticorpos para H e/ou F são considerados protectores uma vez que neutralizam a capacidade do vírus para iniciar a infecção (10, 11 e 12). A proteína da matriz (M; aproximadamente 37 kD) é a proteína anfipática que reveste a superfície interna da 9 ΡΕ1292615 membrana, que se pensa orquestrar a morfogénese do virião e consumar assim a reprodução do vírus (13) . 0 núcleo do virião contém o ARN genómico de 15894 nucleótidos de comprimento sobre o qual é conferida a actividade de molde através da sua íntima associação com aproximadamente 2600 moléculas da proteína da nucleocápside (N) de aproximadamente 60 kD (14, 15 e 16) . Frouxamente associados a esta partícula helicoidal de ribonucleoproteína com aproximadamente um micrómetro de comprimento estão níveis enzimá-ticos da ARN-polimerase dependente do ARN virai (L; aproximadamente 240 kD) que concertada com o cofactor da poli-merase (P; aproximadamente 70 kD) , e talvez ainda outras proteínas especificadas pelo vírus bem como codificadas pelo hospedeiro, transcreve e replica as sequências do genoma do vírus do sarampo (17).

As seis proteínas estruturais do virião do vírus do sarampo são codificadas por seis genes contíguos, que não se sobrepõem e que são alinhados como se segue: 3'-N-P-M-F-H-L-5'. Foram também identificados mais dois produtos génicos do vírus do sarampo com uma função até agora incerta. Estas duas proteínas não estruturais, conhecidas como C (aproximadamente 20 kD) e V (aproximadamente 45 kD), são ambas codificadas pelo gene P. A proteína C é codificada por um segundo enquadramento de leitura dentro do ARNm de P. A proteína V é codificada por um ARNm derivado do gene P editado co-transcricionalmente que codifica uma proteína híbrida possuindo as sequências amino-terminais de P e um domínio carboxi-terminal rico em 10 ΡΕ1292615 cisteína semelhante a um dedo de zinco que falta na proteína P (9) .

Todos os Morbillivirus produzem uma proteína V (18), incluindo o vírus do sarampo, o vírus da peste bovina, o vírus da esgana canina e o vírus da esgana das focas (19). A proteína V do vírus do sarampo é uma proteína não estrutural codificada pelo gene P (8) . Tal como a maioria dos paramixovírus, o vírus do sarampo codifica múltiplas proteínas a partir do gene P incluindo a proteína V, a proteína P e a proteína C (9). A tradução de ambas as proteínas P e V inicia-se no mesmo codão de metionina resultando em polipéptidos que são idênticos para os primeiros 230 aminoácidos. O terminal carboxilo (terminal C) da proteína V difere da proteína P porque a edição do ARN ocorre nalguns ARNms do gene P que causam uma mudança de enquadramento que resulta na tradução de um único terminal C da proteína V mais curto (18) . A sequência de aminoácidos da proteína C não se relaciona com a proteína V e P porque é traduzida inteiramente a partir de um enquadramento de leitura diferente que começa num codão de iniciação da tradução a jusante (20).

Os ARNms de P e V do vírus do sarampo partilham o mesmo codão de iniciação e os primeiros 230 aminoácidos das proteínas P e V são idênticos. O ARNm de V contém uma inserção do resíduo "G" que expande a sequência "GGG" nos nucleótidos 2496 a 2498 para incluir um quarto resíduo "G". A edição ocorre durante a transcrição quando um resíduo "G" 11 ΡΕ1292615 extra não dirigido pelo molde é inserido entre os nucleótidos 2495 e 2499, causando uma mudança no enquadramento de leitura, pela qual os 276 aminoácidos carboxi-terminais da proteína P são substituídos por um carboxi-terminal de 68 aminoácidos rico em cisterna da proteína V. A função da proteína V não é bem compreendida, mas todos os Morbillivirus codificam uma proteína V. Isto indica que a proteína V executa funções benéficas que tornaram vantajoso aos Morbillivirus conservar a capacidade de sintetizar a proteína V. Sabe-se que a expressão da proteína V não é essencial para a replicação virai em células em cultura (19, 21-25), mas em sistemas modelo animais a expressão da proteina V parece influenciar a gravidade da infecção. Por exemplo, o virus de Sendai (um paramixovirus não Morbillivirus) produz normalmente pneumonia em sistemas modelo de ratinho mas é menos virulento se a infecção for efectuada com um virus recombinante que seja deficiente para a expressão da proteína V (22 e 26) . 0 vírus da parainfluenza de tipo 3 humano recombinante (outro paramixovirus não Morbillivirus) exibe também um fenótipo atenuado em roedores e macacos se um defeito na expressão da proteína D for combinado com um defeito no enquadramento de leitura aberto da proteina V (23) .

De forma semelhante, os resultados dos estudos com sistemas modelo animais utilizados para o vírus do 12 ΡΕ1292615 sarampo sugerem também um papel para a proteína V na patogenicidade. A infecção do pulmão do rato do algodão pelo vírus do sarampo recombinante gera menos descendência virai se o vírus infectante for deficiente para a expressão da proteína V (27). Também, a sobrevivência de timócitos humanos em tecido transplantado em ratinhos SCID era menos susceptível à infecção com vírus do sarampo se o vírus infectante não expressasse a proteína V (28) . Finalmente, ratinhos CD46 transgénicos inoculados intracranialmente com vírus do sarampo tinham maiores taxas de sobrevivência se o vírus não expressasse a proteína V (29). A conclusão de que a proteína V do vírus do sarampo tem um papel na patogenicidade é também suportada pelas análises da sequência que verificaram mutações na região de codificação da proteína V nas variantes menos patogénicas ou nas estirpes de vacina (30 e 31) . Tomados em conjunto, estes resultados apoiam a hipótese de que a proteína V tem um papel importante na determinação da virulência do vírus do sarampo e de vários outros paramixovírus.

Embora pareça claro que a proteína V pode influenciar o curso da infecção, o mecanismo por detrás deste fenómeno não é conhecido. Os resultados de vários estudos começaram a atribuir potenciais funções à proteína V. Por exemplo, mostrou-se que as sequências de aminoácidos partilhadas pela proteína V e pela proteína P medeiam a interacção com a proteína da nucleocápside (N) virai (27 e 32-39). Esta interacção entre a proteína V e a proteína N parece afectar a distribuição celular da proteína N (27, 13 ΡΕ1292615 40, 41) e tem provavelmente algumas funções adicionais não identificadas. Verificou-se também que algumas proteinas V interagem com proteinas celulares (42, 43), e no exemplo do vírus símio 5 (SV5) , é possível que a interacção com uma proteína celular seja responsável pela inibição da via de sinalização do interferão durante a infecção (44) . Para além das interacções proteína-proteína que envolvem a proteína V, vários estudos ligaram a proteína V a mecanismos de controlo que regulam a expressão e replicação génica virai. A expressão da proteína V do vírus de Sendai num sistema de expressão transiente inibe a replicação de uma partícula deficiente-de interferência (Dl) (45) e inibe de forma semelhante a replicação da partícula Dl numa reacção de transcrição in vitro (35). Consistente com estas observações que relacionam a proteína V com repressão, foi observado que diversos vírus deficientes para a expressão da proteína V produzem níveis elevados de ARN genómico, ARNm e de proteínas virais durante a infecção (21, 26, 27).

Para além das propriedades agora descritas, todas as proteínas V virais contêm um terminal C rico em cisteína. As proteínas V dos paramixovírus não partilham um grau elevado de semelhança de aminoácidos, mas todas contêm sete resíduos de cisteína posicionados de forma idêntica (46) . Esta característica impressionante conduziu à especulação (47) de que as proteínas V possam realmente ser proteínas de dedo de zinco ou que pelo menos formem algum tipo de estrutura secundária coordenada por zinco (48, 49, 50), e, de facto, verificou-se que várias proteínas V se 14 ΡΕ1292615 ligam a zinco (51, 52, 53) . A possibilidade da proteína V formar uma estrutura coordenada por zinco gera um interesse considerável porque estes tipos de estruturas formam frequentemente domínios proteicos que estão envolvidos na interacção de ácidos nucleicos ou na interacção proteína-proteína (48, 49, 50) . É também digno de nota que um vírus de Sendai recombinante que expresse uma proteína V truncada sem a região C-terminal única é também menos patogénico, sugerindo que o papel da proteína V na patogenicidade requer este domínio (24).

Para além das sequências que codificam as proteínas especificadas pelo vírus, o genoma do vírus do sarampo contém domínios não codificantes de proteína distintivos que se assemelham aos que dirigem as vias transcricional e replicativa de vírus aparentados (9, 54). Estes sinais reguladores encontram-se nas extremidades 3' e 5' do genoma do vírus do sarampo e em curtas regiões internas que abrangem cada fronteira intercistrónica. Os últimos codificam o putativo promotor e/ou elementos reguladores da sequência que dirigem a transcrição genómica, a encapsidação do genoma e do antigenoma e a replicação. Os últimos sinalizam a terminação da transcrição e a poliadenilação de cada ARNm virai monocistrónico e depois o reinicio da transcrição do gene seguinte. Em general, o complexo da polimerase do vírus do sarampo parece responder a estes sinais muito como as ARN-polimerases dependentes de ARN de outros vírus de ARN de cadeia negativa não segmentados (9, 54, 55, 56). A 54 15 ΡΕ1292615 transcrição inicia-se na extremidade 3' do genoma do virus do sarampo ou próximo desta e prossegue então no sentido 5' produzindo ARNms monocistrónicos (16, 54, 57). 0 virus do sarampo parece ter prolongado os seus domínios reguladores terminais para além dos limites das sequências líder e de codificação reboque (54) . Para o sarampo, estas regiões englobam os 107 nucleótidos genómicos a 3' (a "região genómica promotora 3'", também referida como o "promotor prolongado", que compreende 52 nucleótidos que codificam a região líder, seguidos de três nucleótidos intergénicos, e 52 nucleótidos que codificam a região não traduzida 5' do ARNm de N) e os 109 nucleótidos da extremidade 5' (69 codificam a região não traduzida 3' do ARNm de L, o trinucleótido intergénico e 37 nucleótidos que codificam o reboque). Dentro destes aproximadamente 100 nucleótidos 3'-terminais tanto do genoma como do antigenoma existem duas regiões curtas de sequência nucleotídica partilhada: 14 de 16 nucleótidos nas extremidades 3' absolutas do genoma e do antigenoma são idênticos. Interna a esses terminais, foi encontrada uma região adicional de 12 nucleótidos de absoluta identidade de sequência. A sua posição nos locais em que a transcrição do genoma do vírus do sarampo se deve iniciar e a replicação do antigenoma deve começar e próximo destes, sugere que estes curtos domínios únicos da sequência englobam uma região promotora prolongada.

Estes elementos discretos da sequência podem 16 ΡΕ1292615 ditar locais alternativos da iniciação da transcrição - o dominio interno exigindo a iniciação da transcrição no local de inicio do gene N, e o dominio 3'-terminal dirigindo a produção do antigenoma (54, 58, 59) . Para além do seu papel regulador como determinantes que actuam em cis da transcrição e da replicação, estas regiões promotoras genómicas e antigenómicas prolongadas a 3' codificam as extremidades 5' nascentes dos ARNs do antigenoma e do genoma, respectivamente. Dentro destes ARNs nascentes reside como sinais ainda não identificados para a nucleação da proteína N, outro elemento regulador chave necessário para a formação do molde da nucleocápside e consequentemente para a amplificação da transcrição e da replicação.

Em todos os Morbillivirus, os sinais de acção em cis necessários para funções virais essenciais, incluindo a replicação, a transcrição e a encapsidação estão contidos nos terminais genómicos não codificantes. Os elementos obrigatórios de acção em trans para a funcionalidade estão contidos nos genes N, P e L. Factores de acção em trans adicionais, tais como as proteínas V e C, podem modular a funcionalidade. Mutações em qualquer uma destas regiões podem resultar na alteração de funções vitais, incluindo atenuação da eficiência da transcrição/replicação virai. A aparente ligação entre a expressão da proteína V e a patogenicidade, e o interesse contínuo na atenuação de vacinas (30, 60) conduziram à necessidade de examinar 17 ΡΕ1292615 mais detalhadamente a função da proteína V do vírus do sarampo. Em particular, existe a necessidade de utilizar sistemas de expressão transiente para estudar diversas propriedades da proteína V incluindo a actividade de repressão da proteína V, a interacção da proteína V com a proteína N e a capacidade da proteína V para se ligar a ARN.

Sumário do Invento

Concordantemente, é um objecto deste invento identificar regiões dos genomas de Morbillivirus responsáveis pela repressão da expressão génica através da proteína V desses vírus. É outro objecto deste invento gerar versões mutantes da proteína V de Morbillivirus nas quais a repressão da expressão génica seja reduzida. É ainda outro objecto deste invento gerar Morbillivirus gerados de forma recombinante contendo uma ou mais dessas mutações. É ainda outro objecto deste invento formular vacinas ou composições imunogénicas contendo tais Morbillivirus gerados de forma recombinante. Numa concretização do invento, a proteína V é do vírus do sarampo.

Estes e outros objectos do invento tal como discutidos abaixo são alcançados para Morbillivirus através de um vírus de ARN de cadeia simples de sentido negativo não segmentado, gerado de forma recombinante, isolado do género Morbillivirus tal como definido na reivindicação 1. Numa concretização do invento, estes aminoácidos são 18 ΡΕ1292615 mutados para alanina.

Outra modificação da proteína V pode ser feita através da mutação ou deleção de pelo menos uma porção da região carboxi-terminal (C-terminal) da proteína V de Morbillivirus, correspondendo aos aminoácidos 231-299 da proteína V do vírus do sarampo, do vírus da esgana canina e do Morbillivirus do golfinho, e aos aminoácidos 231-303 do vírus da peste bovina.

Estas modificações têm o efeito de reduzir a repressão da expressão génica pela proteína V num sistema de mini-replicão. Os resultados são facilmente estendidos à recuperação de Morbillivirus infeccioso inteiro através da utilização do sistema de "recuperação" conhecido na arte e descrito abaixo. O mini-replicão do vírus do sarampo com expressão do gene repórter da cloranfenicol-acetiltransferase (CAT) em ensaios transientes foi fortemente reprimido pela proteína V. A actividade de repressão foi diminuída pela substituição de aminoácidos numa região situada no terço amino-terminal da proteína entre os aminoácidos 112-134, bem como através de mutação ou deleção pelo menos numa porção da região C-terminal rica em cisteína da proteína V (aminoácidos 231-299).

No caso do vírus do sarampo, as mutações descritas acima podem ainda ser combinadas com mutações que ΡΕ1292615 são atenuantes, como se segue: 1) pelo menos uma mutação atenuante na região promotora genómica 3' seleccionada a partir do grupo que consiste no nucleótido 26 (A -► T) , nucleótido 42 (A -► T ou A -► C) e no nucleótido 96 (G -► A) , onde estes nucleótidos são apresentados na cadeia positiva, antigenómica, no sentido da mensagem; 2) pelo menos uma mutação atenuante no gene da ARN-polimerase seleccionada a partir do grupo que consiste nas mudanças de nucleótidos que produzem mudanças num aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste nos resíduos 331 (isoleucina -► treonina) , 1409 (alanina -► treonina) , 1624 (treonina -► alanina), 1649 (arginina -► metionina) , 1717 (ácido aspártico -> alanina), 1936 (his- tidina -► tirosina) , 2074 (glutamina -► arginina) e 2114 (arginina -* lisina) ; 3) para o gene N, pelo menos uma mutação atenuante seleccionada a partir do grupo que consiste nas mudanças de nucleótidos que produzem mudanças num aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste nos resíduos 129 (glutamina -► lisina) , 148 (ácido glutâmico -► glicina) e 479 (serina -► treonina) ; 4) para o gene P, pelo menos uma mutação atenuante seleccionada a partir do grupo que consiste nas mudanças de nucleótidos que produzem mudanças num aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste nos resíduos 225 (ácido glutâmico -► glicina), 275 (cisteína -► tirosina) e 439 (leucina -► prolina) ; 5) para o gene C, pelo menos uma mutação 20 ΡΕ1292615 atenuante seleccionada a partir do grupo que consiste nas mudanças de nucleótidos que produzem mudanças num aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste nos resíduos 73 (alanina ->· valina) , 104 (metionina ->· treonina) e 134 (serina tirosina); e 6) para o sinal de terminação do gene F (sinal de terminação da transcrição que actua em cis), a mudança no nucleótido 7243 (T -► C) , onde estes nucleótidos são apresentados na cadeia positiva, antigenómica, isto é, no sentido da mensagem (codificação).

Noutra concretização deste invento, estes Morbillivirus mutantes são utilizados para preparar vacinas ou composições imunogénicas que provocam uma resposta imunitária protectora contra a forma de tipo selvagem de cada vírus.

Noutra concretização deste invento, é descrito um método para reduzir a repressão causada por uma proteína V de Morbillivirus que compreende a inserção de pelo menos uma mutação na proteína V de Morbillivirus, em que a referida mutação é seleccionada a partir do grupo que consiste na mutação dos aminoácidos 113 e 114.

Ainda noutra concretização deste invento, é descrita uma sequência nucleotídica isolada codificando uma proteína V de Morbillivirus que foi modificada através da inserção de pelo menos uma mutação na proteína V de Morbillivirus, em que a referida mutação é seleccionada a 21 ΡΕ1292615 partir do grupo que consiste na mutação dos aminoácidos 113 e 114 da proteina V do virus do sarampo ou dos aminoácidos de uma proteina V de Morbillivirus que correspondam a estes.

Ainda noutra concretização deste invento, é proporcionada uma composição que compreende um vector de transcrição compreendendo uma molécula de ácido nucleico isolada codificando um genoma ou antigenoma de um Morbillivirus, em que a porção da molécula de ácido nucleico isolada que codifica a proteina V é a sequência nucleotidica que foi modificada através da inserção de pelo menos uma mutação na proteina V de Morbillivirus, em que a referida mutação é seleccionada a partir do grupo que consiste na mutação dos aminoácidos 113 e 114 da proteina V do virus do sarampo ou dos aminoácidos de uma proteina V de Morbillivirus que correspondem a estes, juntamente com pelo menos um vector de expressão que compreenda pelo menos uma molécula de ácido nucleico isolada codificando as proteínas de acção em trans N, P e L necessárias para a encapsidação, transcrição e replicação, pelo que células hospedeiras são transformadas, infectadas ou transfectadas com estes vectores e cultivadas sob condições que permitam a co-expressão destes vectores para produzir o Morbillivirus desejado. Cada um desses vírus é então utilizado para preparar vacinas ou composições imunogénicas que provoquem uma resposta imunitária protectora contra a forma de tipo selvagem de cada vírus. 22 ΡΕ1292615

Breve Descrição das Figuras A Figura IA representa os quatro vectores plasmídicos de expressão utilizados para as transfecções. Os vectores de expressão dependentes da ARN-polimerase T7 (61) foram preparados para dirigir a expressão dos genes N, P, L ou V de tipo selvagem de Edmonston em células infectadas com MVA/T7 (62). A Figura 1B representa o mini-replicão que foi derivado de pMV107-CAT (63). A sequência lider da vacina do virus do sarampo de Edmonston em pMV107-CAT foi convertida na sequência de tipo selvagem (60) . A transcrição do ADN plasmidico do mini-replicão através da ARN-polimerase T7 gerou uma cópia do mini-replicão de ARN de sentido negativo em células transfectadas. A Figura 1C representa um ensaio de CAT que demonstra o efeito da expressão da proteína V na actividade do mini-replicão num ensaio de expressão transiente. A pista 1 foi o controlo positivo obtido a partir das células que foram transfectadas com todos os vectores plasmídicos (N, P e L) necessários para dirigir a expressão do mini-replicão. A pista 2 foi idêntica à pista 1, excepto que as células foram transfectadas com todos os plasmídeos excepto o vector da polimerase L. Nas pistas 3 a 7, foram incluídas na transfecção quantidades crescentes de vector de expressão da proteína V. A massa total de ADN transfectado foi mantida constante através da inclusão da quantidade 23 ΡΕ1292615 apropriada de ADN do vector sem qualquer inserção. A actividade relativa de CAT foi calculada com base na actividade de 100% na pista 1.

Figura 2 representa uma comparação das sequências de aminoácidos das proteinas V de quatro Morbillivirus diferentes. A sequência de aminoácidos da proteina V do virus do sarampo de tipo selvagem de Edmonston (número de acesso do GeneBank AF266288) (SEQ ID NO: 1) foi comparada com a do virus da esgana canina (AF014953) (SEQ ID NO: 4), a do virus da peste bovina (Z30697) (SEQ ID NO: 2) e a do Morbillivirus do golfinho (Z47758) (SEQ ID NO: 3). As regiões contendo niveis mais elevados de identidade estão sublinhadas com uma barra estriada e são designadas como regiões conservadas (CRI a CR6) . As sequências notáveis adicionais estão sublinhadas com uma barra preta. Estas incluem regiões envolvidas na interacção da proteina V (e P) com a proteina N (34), uma região envolvida na localização celular do complexo de proteínas V-N (27, 64), e a região rica em cisteína contendo o domínio de ligação a zinco (51) . Outras sequências de interesse incluem uma região básica entre 229-234, uma substituição de aminoácidos da vacina do vírus do sarampo (ácido glutâmico para glicina) na posição 225 (30), e uma região de repetição de leucina reminiscente de um fecho de leucina entre as posições 93-107 (65, 66). A região comum à proteína V e P prolonga-se do aminoácido 1-230 e as sequências únicas da proteína V (letras de aminoácidos a cheio) prolongam-se de 231-299. As posições de aminoácidos 24 ΡΕ1292615 dadas na Figura ao longo do topo das sequências alinhadas correspondem às da proteína V do vírus do sarampo. A Figura 3 representa um mapa dos vectores de expressão da proteína V do vírus do sarampo mutante. Os vectores de expressão da proteína V marcados com epitopo utilizados nestes estudos são mostrados de forma esquemática. Os vectores da proteína V mutante foram gerados numa estrutura do plasmídeo vector que expressava a proteína V com uma etiqueta HA do vírus da gripe (67) em vez da metionina iniciadora da proteína V. Os destaques da sequência são mostrados num mapa da proteína V no topo da Figura e são descritos mais completamente em relação à descrição da Figura 2 acima. As proteínas de tipo selvagem (haV-wt) e mutantes (haVl-11) são ilustradas abaixo do mapa da proteína V. A etiqueta HA é desenhada como uma caixa estriada no terminal amino e a restante sequência da proteína V é desenhada como uma caixa aberta. As substituições de aminoácidos estão indicadas como pontos pretos juntamente com as posições dos aminoácidos e as mudanças de aminoácidos. Os mutantes de deleção ou truncagem estão desenhados com um mapa da proteína V interrompido. A Figura 4A representa a repressão do mini-replicão por proteínas V de vírus do sarampo mutantes, na forma de um ensaio de CAT mostrando os resultados de uma experiência de expressão transiente testando a actividade das proteínas V mutantes (haV-1 a haV-8; ver a descrição para a Figura 3). A quantidade de vector de proteína V (200 ou 400 ng) e a identidade dos mutantes são mostradas na 25 ΡΕ1292615

Figura 4A por baixo do ensaio de CAT. A actividade relativa é calculada como uma percentagem da pista 2 que foi derivada de uma transfecção efectuada sem qualquer vector de expressão da proteína V. A pista 1 foi um controlo negativo efectuado sem a proteína L. A Figura 4B representa um "Western blot" efectuado para monitorizar a expressão da proteína V em experiências de expressão transiente. As pistas 1 e 2 são controlos negativos derivados de células transfectadas na ausência de um vector da proteína V (pista 1) ou transfectadas com um vector da proteína V que expressa uma proteína V sem uma etiqueta. 0 "Western blot" foi sondado com anticorpo anti-HA. A Figura 4C representa uma análise da repressão do mini-replicão através de haV-1 utilizando quantidades crescentes (100 ng a 1 yg) do vector de expressão.

Figura 5 representa a actividade de ligação ao ARN associada à proteína V do vírus do sarampo. Os extractos citoplasmáticos brutos preparados a partir de células transfectadas através de lise com NP40 foram analisados quanto à actividade de ligação ao ARN utilizando contas de agarose ligadas a homopolímeros de polir-ribonucleótidos. Um diagrama de fluxo ilustrando o procedimento é mostrado na Figura 5A. A Figura 5B representa "Western blots" utilizados para examinar proteínas capturadas nas resinas de polirribonucleótidos. As células 26 ΡΕ1292615 foram transfectadas utilizando as mesmas condições utilizadas para as experiências de mini-replicão (pistas 1-8), excepto que nalguns transfecções as células foram transfectadas apenas com o vector de expressão de haV (pistas 9-12). As pistas 1-4 representam uma análise da ligação da proteina N às quatro resinas de polinucleótidos diferentes. As pistas 5-12 representam uma análise da fracção ligada para a proteina haV. De forma semelhante, as pistas 9-16 representam uma análise da proteina V que se liga a poli(G) na presença de EGTA (EG), EDTA (ED) ou ARN de levedura (ARN). A Figura 6 representa a ligação ao ARN por proteínas V de virus do sarampo mutantes. 0 ensaio de ligação do homopolimero de polirribonucleótidos descrito na Figura 5 foi utilizado para análise de proteínas V de virus do sarampo mutantes (haV 1-11, pistas 3-13; ver a descrição para a Figura 3) . Nesta experiência, as células foram transfectadas apenas com vectores de expressão de V. 0 extracto celular examinado na pista 1 foi um controlo negativo que continha proteina V que não continha uma etiqueta de epitopo. Poli(G) foi utilizada para testar todas as proteínas mutantes. A Figura 7 representa uma comparação das sequências de aminoácidos em CR2 (aminoácidos 100-140) para a proteina V do virus do sarampo de tipo selvagem, designada haV (SEQ ID NO: 7); um mutante onde a tirosina no aminoácido 113 e o ácido aspártico no aminoácido 114 são 27 ΡΕ1292615 substituídos por alaninas, designado haV-5 (SEQ ID NO: 8); um mutante onde os aminoácidos 112-134 são suprimidos, designado haV-23 (SEQ ID NO: 9); um mutante onde o ácido aspártico no aminoácido 114 e a histidina no aminoácido 115 são substituídos por alaninas, designado haV-24 (SEQ ID NO: 10); e um mutante onde a tirosina no aminoácido 113, o ácido aspártico no aminoácido 114 e a histidina no aminoácido 115 são substituídos por alaninas, designado haV-25 (SEQ ID NO: 11). A Figura 8 descreve o efeito das mutações de CR2 descritas na Figura 7 num ensaio de CAT que demonstrou o efeito da expressão da proteína V na actividade do mini-replicão num ensaio de expressão transiente. A barra 1 era o controlo positivo obtido a partir de células que foram transfectadas com todos os vectores plasmídicos (N, P e L) necessários para dirigir a expressão do mini-replicão. A barra 2 era idêntica à barra 1, excepto que as células foram também transfectadas com um vector de expressão codificando haV; nas barras 3-6, as células foram transfectadas com vectores de expressão codificando as mutações de CR2 indicadas. A actividade relativa de CAT foi calculada com base na actividade de 100% na barra 1. A Figura 9 representa uma comparação das sequências de aminoácidos no terminal C (aminoácidos 220- 299) para a proteína V do vírus do sarampo de tipo

selvagem, designada haV (SEQ ID NO: 12); um mutante onde os aminoácidos 232-299 estão suprimidos, designado haV-Ι (SEQ 28 ΡΕ1292615 ID NO: 13); um mutante onde as cisteínas nos aminoácidos 251 e 255 são substituídas por alaninas, designado haV-12 (SEQ ID NO: 14); um mutante onde as cisteínas dos aminoácidos 269 e 272 são substituídas por alaninas, designado haV-13 (SEQ ID NO: 15); um mutante onde os aminoácidos 279-299 são suprimidos, designado haV-14 (SEQ ID NO: 16); um mutante onde os aminoácidos 267-299 são suprimidos, designado haV-15 (SEQ ID NO: 17); um mutante onde os aminoácidos 250-299 são suprimidos, designado haV-16 (SEQ ID NO: 18); um mutante onde os aminoácidos 243-299 são suprimidos, designado haV- 17 (SEQ ID NO: 19) ; um mutante onde os aminoácidos 236-299 são suprimidos, designado haV-18 (SEQ ID NO: 20); um mutante onde os aminoácidos 229-299 são suprimidos, designado haV-19 (SEQ ID NO: 21); um mutante onde as argininas dos aminoácidos 233 e 234 são substituídas por alaninas, designado haV-20 (SEQ ID NO: 22); um mutante onde as argininas dos aminoácidos 233 e 234 são cada uma substituídas por ácido aspártico, designado haV-21 (SEQ ID NO: 23); e um mutante onde os aminoácidos 229-237 são suprimidos, designado haV-22 (SEQ ID NO: 24). A Figura 10 representa o efeito das mutações C-terminais descritas na Figura 9 num ensaio de CAT que demonstrou o efeito da expressão da proteína V na actividade do mini-replicão num ensaio de expressão transiente. A barra 1 era o controlo positivo obtido a partir de células que foram transfectadas com todos os vectores plasmídicos (N, P e L) necessários para dirigir a 29 ΡΕ1292615 expressão do mini-replicão. A barra 2 era idêntica à barra 1, excepto que as células foram também transfectadas com um vector de expressão codificando haV; nas barras 3-14, as células foram transfectadas com vectores de expressão codificando as mutações C-terminais indicadas. A actividade relativa de CAT foi calculada com base na actividade de 100% na barra 1.

Descrição Detalhada do Invento

Embora exemplificado com o virus do sarampo, o invento é também aplicável a outros Morbillivirus, incluindo mas não se limitado ao virus da esgana canina e ao virus da peste bovina.

Uma consideração da potencial ligação entre a atenuação do virus do sarampo e os mecanismos envolvidos no controlo da expressão génica e da replicação (30, 60) conduziu à análise da proteína V. A expressão da proteína V foi ligada à patogenicidade virai (22, 23, 26-29) e também ao controlo da expressão génica e da replicação (21, 26, 27, 35, 45) . O objectivo foi o de analisar melhor o efeito da proteína V na expressão génica do vírus do sarampo.

Antes de construir vectores de expressão de proteínas V mutantes, a semelhança de aminoácidos entre as proteínas V de diversos Morbillivirus diferentes foi examinada (Figura 2) . As regiões de elevada identidade de aminoácidos podem conter domínios funcionais importantes, e 30 ΡΕ1292615 uma ou mais destas regiões conservadas (CR) podem participar na repressão do mini-replicão. O alinhamento das proteínas V do virus do sarampo de tipo selvagem de Edmonston, do virus da peste bovina, do Morbillivirus do golfinho e do virus da esgana canina revelou diversas regiões conservadas de notável identidade de sequência designadas CR1-6 (mostradas na Figura 2), para além de confirmar observações anteriores (46) de que o terminal C continha sete resíduos de cisteína espaçados de forma idêntica entre os Morbillivirus. Várias das CRs foram o alvo ao gerar vectores de proteínas V mutantes.

Para além da identificação de regiões contendo elevados níveis de identidade, foi utilizada análise de computador para pesquisar potenciais motivos funcionais e a literatura foi examinada quanto a indícios adicionais a respeito da possível posição dos potenciais domínios funcionais da proteína V do vírus do sarampo. Os resultados destas análises são ilustrados no alinhamento da Figura 2. Diversos estudos encontraram regiões da proteína V e P que influenciam a interacção com a proteína N. A ponta do terminal amino (terminal N) da proteína V e P, situado dentro de CRI, contém sequências que mediam a interacção com a proteína N (34) (Figura 2) num ensaio de dois híbridos. Sequências adicionais envolvidas na interacção proteína-proteína V-N foram localizadas entre os aminoácidos 204 a 230 (27, 64) que abrangem CR4. 0 domínio de ligação ao zinco da proteína V do vírus do sarampo (51) está no terminal C e requer provavelmente pelo menos vários 31 ΡΕ1292615 dos resíduos de cisteína verificados em CR5 e CR6. Na extremidade do terminal N do domínio rico em cisteína existe uma região bem conservada contendo aminoácidos básicos (229-234) que é parte de CR5. Próximo da mesma região (aminoácido 225) na proteína V do vírus do sarampo está uma substituição de aminoácidos verificada nas estirpes de vacina de Edmonston (ácido glutâmico do tipo selvagem para glicina (30)). Finalmente, na proteína V do vírus do sarampo havia uma repetição de leucina (aminoácidos 93-107) que era reminiscente de um motivo fecho de leucina (65, 66). Vários destes domínios e motivos eram candidatos atractivos para mais estudos utilizando o sistema de mini-replicão e os vectores de expressão de proteínas V mutantes.

Para além da preparação de um vector de expressão da proteína V (Figura IA) , foram preparados plasmídeos de expressão de T7 para os três componentes básicos do aparelho de replicação incluindo as proteínas N, P e L de tipo selvagem de Edmonston. Para eliminar qualquer potencial confusão devida à expressão da proteína C a partir do codão de iniciação da tradução a jusante nos vectores da proteína P e V, o enquadramento de leitura aberto da proteína C foi modificado para impedir a tradução da proteína C. 0 codão ATG da proteína C foi convertido em ACG e o segundo codão no enquadramento de leitura aberto da proteína C foi convertido num codão stop (TCA para TAA) . Estas modificações foram silenciosas em relação às proteínas P e V. 32 ΡΕ1292615

Indicações de que a proteína V pode estar envolvida na regulação da transcrição do ARNm do vírus do sarampo e da replicação do genoma (21, 26, 27, 35, 45) sugeriram uma experiência para testar se um sistema de mini-replicão responderia à expressão da proteína V. 0 sistema de mini-replicão foi preparado com componentes do tipo selvagem de Edmonston de modo a que as mutações do gene V que afectam a função da proteína V de tipo selvagem pudessem ser avaliadas, e para potencialmente aplicar estas descobertas a futuros estudos genéticos de atenuação do vírus utilizando virus de tipo selvagem recombinante. 0 mini-replicão do vírus do sarampo de tipo selvagem de

Edmonston (Figura 1B, pMVwtl07-CAT) foi derivado do mini-replicão de pl07MV-CAT (63) através da conversão da sequência líder da vacina em pMV107-CAT na sequência líder do tipo selvagem de Edmonston (60).

Para determinar se os componentes de tipo selvagem eram capazes de dirigir uma expressão detectável do mini-replicão, células HEp2 foram transfectadas com ADN do mini-replicão e os vectores de expressão das proteínas N, P e L infectando simultaneamente com MVA/T7 (62) para proporcionar a ARN-polimerase T7. 48 horas após a transfecção, as células foram colhidas e os extractos celulares foram analisados quanto à actividade de CAT. O sistema de mini-replicão de tipo selvagem de Edmonston produziu prontamente actividade de CAT acima dos níveis de fundo produzidos nos controlos negativos que foram transfectados com todos os DNAs excepto o vector de 33 ΡΕ1292615 expressão da proteína polimerase L (Figura 1C, pistas 1 e 2, e dados não mostrados). Isto indicou que a actividade de CAT produzida durante o ensaio de expressão transiente era específica e dependente de um aparelho de replicação intacto do vírus do sarampo. 0 sistema de mini-replicão foi então utilizado para determinar se a expressão da proteína V tinha um efeito detectável na expressão do mini-replicão num ensaio de expressão transiente. As transfecções do ensaio do mini-replicão foram executadas com quantidades crescentes de vector de expressão da proteína V. A massa total de ADN transfectado foi mantida constante através da inclusão da quantidade apropriada de vector de expressão sem qualquer inserção. 0 efeito do aumento da quantidade de vector de expressão da proteína V de 0 para 400 ng é mostrado na Figura 1C. O controlo positivo na pista 1 mostrou a quantidade de actividade de CAT obtida na ausência de expressão da proteína V (Figura 1C, pista 1). A pista 2 foi um controlo negativo que mostrou que a actividade de CAT era indetectável quando o vector de expressão da proteína L era omitido. As pistas 3-7 ilustram o efeito negativo de quantidades crescentes de expressão da proteína V. A repressão da actividade de CAT foi evidente mesmo nas quantidades mais baixas de vector de expressão da proteína V (pistas 3 e 4) e foi muito forte a quantidades mais elevadas, eliminando virtualmente a expressão detectável do mini-replicão quando foram transfectados 400 ng do plasmídeo de expressão da proteína V (pista 7). Os aumentos 34 ΡΕ1292615 de duas vezes no vector de expressão da proteína V utilizados nas pistas 3-7 também se correlacionaram bem com as diminuições observadas na actividade relativa de CAT. Estes resultados mostram claramente que um aspecto da função da proteína V pode ser observado com um ensaio de mini-replicão. Este efeito negativo facilmente detectável da expressão da proteína V num ensaio de mini-replicão proporcionou um formato conveniente para examinar melhor o fenótipo de repressão do mini-replicão de mutantes da proteína V.

Para começar a analisar mutantes da proteína V, o vector de expressão da proteína V (Figura IA) foi modificado para incluir uma etiqueta de epitopo no terminal amino da proteína V (pMV-haV-wt; Figura 3). Isto foi feito para facilitar a detecção por "Western blot" da proteína em lisados de células transfectadas e para permitir uma comparação relativa da estabilidade e dos níveis estacionários de proteínas V mutantes. 0 codão metionina iniciador do vector de expressão da proteína V de tipo selvagem foi substituído pela etiqueta de epitopo de hemaglutinina de influenza (HA) (67). Este vector de proteína V modificada (pMV-haV-wt) reteve também as substituições de bases que impedem a expressão da proteína C. 0 teste de pMV-haV-wt em experiências de mini-replicão revelou que a presença da etiqueta HA N-terminal não teve qualquer efeito detectável na capacidade da proteína V para reprimir a actividade do mini-replicão (Figura 4, pistas 1-4, e dados não mostrados). 35 ΡΕ1292615 A primeira série de mutações introduzidas em pMV-haV-wt foi dirigida a alguns dos motivos da sequência ilustrados na Figura 2. Uma destas mutações resultou numa proteina V truncada que não tinha o terminal C original da proteína V contendo os resíduos de cisteína (os aminoácidos 231-299 foram suprimidos) (Figura 3, pMV-haV-1). 0 plasmídeo pMV-haV-2 converteu a sequência de codificação de V de tipo selvagem na sequência da vacina de Edmonston (codão do aminoácido 225; ácido glutâmico para glicina). As seis mutações restantes (números 3-8 de pMV-haV) foram substituições de aminoácidos dirigidas a algumas das CRs. Inicialmente, foram introduzidas substituições de aminoácidos numa tentativa de alterar a função de domínios específicos na proteína V sem alterar grandemente a estrutura da proteína. Utilizando uma estratégia sugerida pela abordagem de carga-para-alanina (68, 69, 70), foram introduzidas mutações que tiveram como alvo primeiramente dois codões de aminoácidos consecutivos que especificavam resíduos de aminoácidos carregados ou polares e os converteram em codões codificando alanina.

Embora este invento seja exemplificado por mutantes possuindo alaninas em vez de resíduos de tipo selvagem, outras mutações não conservativas dos resíduos de tipo selvagem estão também dentro âmbito deste invento. Por exemplo, o ácido aspártico é uma molécula ácida (carregada negativamente). Consequentemente, uma mutação não conservativa será uma em que é feita uma substituição para um aminoácido à excepção de ácido glutâmico, que é também 36 ΡΕ1292615 uma molécula ácida. Aminoácidos alternativos adequados incluem os aminoácidos lisina, histidina e arginina que são moléculas básicas (carregadas positivamente). Aminoácidos alternativos adequados incluem ainda os aminoácidos com grupos funcionais apoiares tais como alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano e valina, e os aminoácidos com grupos funcionais polares não carregados tais como asparagina, cisteina, glutamina, glicina, serina, treonina e tirosina.

De forma semelhante, a tirosina é uma molécula polar não carregada. Consequentemente, uma mutação não conservativa será uma na qual é feita uma substituição num aminoácido excepto asparagina, cisteina, glutamina, glicina, serina e treonina, que são também moléculas polares não carregadas. Aminoácidos alternativos adequados incluem os aminoácidos lisina, histidina e arginina que são moléculas básicas (carregadas positivamente). Aminoácidos alternativos adequados incluem ainda os aminoácidos com grupos funcionais apoiares tais como alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano e valina, e os aminoácidos com grupos funcionais ácidos (carregados negativamente) tais como ácido aspártico e ácido glutâmico. A análise dos vectores de proteínas V mutantes 1 a 8 num ensaio de mini-replicão é mostrada na Figura 4A. Os resultados indicam que dois vectores (pMV-haV-1 e pMV-haV-5) diminuíram a capacidade de reprimir a actividade do ΡΕ1292615 mini-replicão. Um mutante (haV-1) era um mutante de deleção que não tinha o terminal C original da proteina V (aminoácidos 231-299); o segundo mutante (haV-5) continha as mutações de substituição nos aminoácidos 113 e 114 (situados em CR2; ver Figura 2) . Isto sugeriu que esta função poderia ser parcialmente mediada independentemente por CR2 e pelo terminal C. Tal como o mutante de truncagem C-terminal, o mutante de CR2 manteve também uma actividade residual de repressão.

As pistas 1 e 2 na Figura 4A continham amostras de controlo. A transfecção analisada na Pista 1 não tinha o vector de expressão da proteina L e revelou um nivel baixo de actividade de CAT de fundo. 0 controlo positivo na pista 2 mostrou a actividade máxima observada na ausência de proteina V. A repressão mediada por 200 e 400 ng de vector de proteina V de tipo selvagem contendo a etiqueta HA (pMV-haV-wt) é mostrada nas pistas 3 e 4. Tal como descrito acima, a etiqueta HA N-terminal teve pouco efeito na capacidade da proteina V para reprimir o mini-replicão, e nesta experiência, 200 e 400 ng de vector haV-wt reprimiram a actividade do mini-replicão em cerca de 7 e 16 vezes, respectivamente. A maioria dos mutantes reprimiram a actividade de CAT quase tão eficazmente quanto o vector de haV-wt, reduzindo a actividade de CAT a 20% ou menos (pistas 3, 7, 9, 11, 15, 17, 19) da actividade de controlo (pista 2), quando foram transfectados 200 ng do vector de proteina V. Dois vectores de proteina V (pMV-haV-1, pistas 5 e 6; pMV-haV-5, pistas 13 e 14) eram visivelmente menos 38 ΡΕ1292615 eficazes a reprimir a actividade do mini-replicão nesta e em experiências repetidas. 0 plasmideo pMV-haV-1 não possuia o terminal C da proteina V rico em cisterna, enquanto que pMV-haV-5 continha uma dupla substituição de alanina em CR2 (aminoácidos 113-114).

Ambos os dominios implicados na repressão têm caracteristicas interessantes. 0 terminal C inclui o domínio de ligação ao zinco e contém também um domínio de ligação ao ARN (Figura 5) . A sequência primária de aminoácidos de CR2 é digna de nota porque os modelos computacionais preveem que um pequeno agrupamento de resíduos carregados pode ser posicionado ao longo de uma face de uma hélice alfa proposta (resíduos 114 D, 118 E, 121 K, 125 D) . Assim, CR2 é potencialmente uma hélice alfa anfipática semelhante às sequências que foram observadas nalguns factores de transcrição (71). A actividade de repressão associada a CR2 é também interessante porque esta sequência de aminoácidos está presente em ambas as proteínas V e P. Os papéis essenciais da proteína P como subunidade de polimerase e factor de montagem da nucleocápside (72) são bastante distintos do papel não essencial da proteína V na repressão. Contudo, estas duas proteínas partilham uma quantidade significativa da sequência de aminoácidos. CR2 pode ser um local de interacção proteína-proteína que funcione diferentemente no contexto de V e P. Sem estar limitado pela teoria, pode também ser possível que o 39 ΡΕ1292615 terminal C único da proteína V confira uma estrutura terciária à proteína V que expõe CR2, permitindo por sua vez que funcione como um domínio repressor, enquanto que na proteína P este domínio é sequestrado.

Para determinar se a redução na repressão causada pelo mutante haV-1 ou haV-5 se correlaciona simplesmente com fraca expressão da proteína, foi efectuado um "Western blot" utilizando anticorpo anti-HA para estimar a abundância relativa de proteína V em células transfectadas (Figura 4B). As células para esta experiência foram transfectadas exactamente como efectuado durante as experiências de mini-replicão, de modo a que as células contivessem as proteínas N, P e L bem como a proteína V. As proteínas V marcadas eram detectáveis em todos os extractos de células transfectadas à excepção de dois controlos negativos. Nenhum vector de proteína V foi transfectado nas células utilizadas para fazer o extracto analisado na pista 1, e na pista 2, as células foram transfectadas com o vector que codifica a proteína V que não inclui uma etiqueta de epitopo. A proteína detectada na pista 3 foi a proteína V de tipo selvagem marcada com HA. A proteína na pista 4 era o mutante de truncagem que não possuía o terminal C e a sua mobilidade foi notavelmente alterada. As restantes proteínas eram mutantes (tal como descrito acima) que continham substituições de aminoácidos (Figura 4B, pistas 5-11) . Várias destas proteínas tinham mudanças de mobilidade pequenas mas visíveis neste gel de poliacrilamida a 12% (por exemplo, pistas 10 e 11) . No 40 ΡΕ1292615 entanto, isto não era inesperado, uma vez que os resíduos carregados e polares foram substituídos por alaninas nestas proteínas. A abundância relativa de todas as proteínas foi julgada ser bastante semelhante, excepto que haV-1 (pista 4) era mais baixa nesta experiência e isto foi reprodutível em experiências repetidas. Isto sugere que a reduzida actividade de repressão de haV-1 pode resultar de níveis mais baixos das proteínas, enquanto que a reduzida actividade de repressão de haV-5 não foi causada por uma proteína instável.

Para examinar melhor a possibilidade de haV-1 reprimir fracamente simplesmente porque era instável, foi efectuado um ensaio de mini-replicão com quantidades crescentes de vector de proteína V para ajudar a suplementar a quantidade intracelular de proteína haV-1 (Figura 4C) . Esta experiência de mini-replicão foi efectuada tal como descrito acima, excepto que a quantidade máxima de vector de proteína V foi aumentada de 400 ng para 1 pg. A massa de ADN foi mantida constante em todas as transfecções através da inclusão da quantidade apropriada de ADN estrutural do vector (sem inserção) . A Figura 4C, pista 1, foi o controlo positivo que foi efectuado sem adição de vector de proteína V. As pistas 2 e 3 mostram o efeito da adição de vector ha-V de tipo selvagem a 100 ng (pista 2) e 400 ng (pista 3), que reduziu a actividade nesta experiência para 58% e 26%, respectivamente. A adição de quantidades crescentes de haV-1 teve pouco efeito na actividade de MV-CAT e não foi observada qualquer tendência 41 ΡΕ1292615 óbvia para correlacionar a massa crescente do vector haV-1 com maiores niveis de repressão. Isto sugeriu que a acti-vidade de repressão diminuída de haV-1 não era simplesmente devida a níveis intracelulares reduzidos da proteína e era em vez disso um efeito da perda do terminal C.

Uma região contendo um elevado teor de ami-noácidos básicos no terço N-terminal da proteína V de SV5 medeia a ligação do ARN (73) . Uma região homóloga não é aparente na proteína V do vírus do sarampo (73) , mas foi examinada a possibilidade de que a proteína V do vírus do sarampo possa também ligar-se ao ARN através das sequências semelhantes a dedos de zinco no terminal C (Figura 5).

Para avaliar a actividade de ligação ao ARN da proteína V, foi utilizado um ensaio de ligação de homopolímero de polirribonucleótidos (Figura 5A) que foi utilizado com sucesso para estudar diversas proteínas celulares de ligação ao ARN (74-77). Várias proteínas de ligação ao ARN apresentam uma afinidade característica para homopolimeros de polirribonucleótidos. Por exemplo, a proteína hnRNP U celular liga-se com uma afinidade relativamente elevada a poli(G) e poli(U,) mas liga-se pouco ou nada a poli(A) ou poli(C) (75). Este conceito foi utilizado para determinar se a proteína V em extractos de células transfectadas poderia ser capturada em resinas de homopolimeros. As células foram transfectadas com todos os vectores de expressão (N, P, L, V e mini-replicão) utilizados na transfecção do mini-replicão e foram então 42 ΡΕ1292615 infectadas com MVA/T7. Os lisados celulares citoplasmáticos foram preparados 48 horas depois e incubados durante 30-60 minutos a 4°C com contas de agarose ligadas a um dos quatro homopolimeros de polirribonucleótidos. As contas foram recolhidas através de centrifugação, a seguir ressuspensas e lavadas três vezes em tampão de lise celular. As proteinas ligadas foram eluidas a partir das contas fervendo em tampão de carga de SDS-gel.

Inicialmente, para testar o ensaio, foi examinada a capacidade de capturar uma proteina de ligação a ARN conhecida expressa a partir de um plasmideo transfectado. Concordantemente, as proteinas eluidas a partir das quatro resinas diferentes foram analisadas através de "Western blot" utilizando o anticorpo monoclonal especifico para a proteina N (Figura 5B). A proteina N foi facilmente detectada em amostras ligadas a poli(G) e poli(U) (pistas 2 e 4). A quantidade de proteina N ligada a poli(G) era geralmente superior neste ensaio e em diversas experiências repetidas. Pouca ou nenhuma proteina N foi capturada com poli(A) ou poli(C). A experiência foi repetida tal como descrito acima para analisar a capacidade da proteina haV para interagir com as resinas de homopolimeros (Figura 5B, pistas 5-8) . A análise de um "Western blot" com anticorpo anti-HA revelou resultados que eram semelhantes aos resultados obtidos após a análise da proteina N (Figura 5B, pistas 1-4). As resinas poli(G) e poli(U) mostraram ambas 43 ΡΕ1292615 afinidade para haV (pistas 6 e 8) . A proteína V ligou-se melhor a poli(G) e mais fracamente a poli(U), enquanto que se ligou fracamente a poli(A) ou poli(C). Nalgumas experiências, foi observada uma banda muito fraca, indicando uma interacção de baixa afinidade com poli(A); no entanto, esta interacção é geralmente indetectável. 0 facto da proteína V se ligar facilmente a poli (G) e poli (U) e mal a poli (A) e poli (C) indicou que o ensaio não media simplesmente a afinidade para resinas polianiónicas, e mostrou também que a proteína V demonstrou uma preferência para dois polinucleótidos. Tanto a proteína V como a proteína N preferiram poli(G) e poli(U) (Figura 5) ; esta é uma característica mostrada por várias proteínas celulares de ligação ao ARN (74, 76, 77). 0 facto do perfil de ligação da proteína haV ser bastante semelhante ao da proteína N levantou a possibilidade da proteína V ser capturada indirectamente em resinas de poli(G) e poli(U) através da interacção com a proteína N, em vez de uma interacção directa com o ARN. Para examinar esta possibilidade, foram transfectadas células apenas com o vector de expressão da proteína haV e foram preparados extractos celulares e tratados tal como descrito acima. A análise através de "Western blot" mostrou que a proteína haV (Figura 5B, pistas 9-12) estava novamente ligada a poli(G) e poli(U). Isto indicou que a interacção da proteína V com resinas de homopolímeros não requeria nenhuma outra proteína virai. De facto, na 44 ΡΕ1292615 ausência de outras proteínas virais, ligavam-se geralmente quantidades maiores de proteína V a poli(G) e poli(U) (comparar as pistas 6 a 10 e 8 a 12). Isto sugeriu que uma das outras proteínas virais pode interferir ligeiramente com a interacção entre a proteína V e os polirribo-nucleótidos.

Foi também efectuada uma análise limitada das condições que influenciam a ligação de haV a poli(G) (Figura 5B, pistas 13-16) . A adição de EGTA ou EDTA 10 mM (pistas 14 e 15) à reacção de ligação reduziu a quantidade de proteína V ligada a poli(G). A adição de ARN competidor de levedura (pista 16) à reacção de ligação (25 yg por ml) teve pouco efeito na ligação. No entanto, isto não foi especialmente surpreendentemente, porque os extractos citoplasmáticos continham já quantidades significativas de ARN celular e a adição de ARN de levedura teve provavelmente pouco impacto. Estes resultados sugerem que a ligação da proteína V a poli(G) é estimulada por catiões bivalentes e é uma interacção relativamente específica, porque a adição de um ARN não específico (ARN de levedura) não pareceu diminuir a quantidade de proteína V ligada à resina.

Para determinar se a ligação ao ARN se podia correlacionar com a capacidade para reprimir a actividade do mini-replicão, foi de seguida utilizado o ensaio de ligação a poli(G) para analisar a actividade de ligação ao ARN de proteínas haV mutantes. Os mutantes da proteína haV ΡΕ1292615 (Figura 3) foram expressas em células sem quaisquer outras proteínas virais. Extractos citoplasmáticos brutos foram preparados e ligados a resinas poli (G) tal como descrito acima, e as proteínas ligadas foram analisadas através de "Western blotting" (Figura 6). Tal como mostrado anterior-mente, a haV foi capturada por poli (G) e detectada pelo anticorpo anti-HA num "Western blot" (pista 2), enquanto que uma amostra contendo proteína V sem uma etiqueta HA (pista 1) não gerou qualquer sinal de fundo. A análise das proteínas mutantes revelou níveis semelhantes de actividade de ligação a poli(G) para a maioria das proteínas V (pistas 4-13). A excepção foi o mutante haV-Ι. Ligaram-se níveis muito baixos desta proteína mutante a poli(G). Isto indicou claramente que a proteína era deficiente para ligação (pista 3). Os níveis baixos mas detectáveis de ligação por haV-Ι indicaram que a actividade de ligação ao ARN foi substancialmente reduzida, mas não inteiramente eliminada. Estes resultados demonstraram que a maioria dos mutantes mantiveram uma actividade de ligação ao ARN quase equivalente à da haV de tipo selvagem. Um dos dois mutantes que era deficiente para repressão do mini-replicão (haV-5) ligou-se a poli (G) tão bem como haV de tipo selvagem, enquanto que o outro mutante (haV-Ι) exibiu uma actividade de ligação a poli(G) significativamente reduzida. Isto sugeriu que pode haver uma correlação entre a repressão do mini-replicão e a actividade de ligação ao ARN mediada pelo terminal C único da proteína V. Por sua vez, isto sugeriu que a actividade de ligação ao ARN da proteína V pode ter um papel regulador na expressão génica e replicação do 46 ΡΕ1292615 vírus do sarampo.

Uma potencial ligação entre a actividade de ligação ao ARN associada à proteína V e a repressão do mini-replicão poderia ser extraída dos resultados que mostraram que uma proteína V mutante sem a região C- terminal rica em cisterna se ligava fracamente ao ARN era também um repressor menos eficaz do mini-replicão.

Numa experiência separada, mostrou-se que a repressão do mini-replicão não se correlaciona com a capacidade da proteína V para se ligar à proteína N. A formação de um complexo de proteínas V-N não era necessária para a repressão do mini-replicão mediada pela proteína V; os mutantes da proteína V, haV-9 e haV-11 (Figura 3) não conseguiram interagir com a proteína N, mas mantiveram intacta a actividade de repressão (dados não mostrados). A análise dos mutantes da proteína V sugeriu que o terminal C era necessário para uma ligação de elevada afinidade ao ARN. A deleção desta região que inclui o domínio de ligação ao zinco (51) reduziu extremamente a quantidade de proteína que podia ser recolhida nas resinas poli (G), mas não eliminou inteiramente toda a ligação. Isto pode sugerir que há um segundo domínio de ligação ao ARN fraco na proteína V. Sem estar limitado pelo seguinte, uma possibilidade atractiva é que o domínio semelhante a um dedo de zinco no terminal C forme um componente importante de um domínio de ligação ao ácido nucleico, e um segundo 47 ΡΕ1292615 domínio na proteína V coopera com o terminal C para criar um local de ligação de afinidade mais elevada.

Estes estudos de ligação ao ARN mostraram também que a proteína V podia interagir com ARN sem quaisquer proteínas virais adicionais presentes nos extractos celulares brutos. Isto sugere que a proteína V se liga directamente ao ARN. Esta conclusão não é absoluta, porque permanece possível que a proteína V interaja com uma proteína celular que por sua vez seja responsável pela ligação ao ARN. Se este modelo for verdadeiro, os dados indicam que o terminal C pode mediar a interacção proteína-proteína responsável pela interacção com um factor celular. A proteína V recombinante purificada será importante para examinar melhor se a proteína V se liga directamente ao ARN.

Embora a proteína haV-5 mutante seja deficiente para a repressão do mini-replicão (Figura 4), liga-se ao ARN (Figura 6) tão bem como a proteína de tipo selvagem. Assim, a actividade de repressão do mini-replicão associada a CR2 não se correlacionou facilmente com as outras duas actividades analisadas (ligação ao ARN e interacção com a proteína N) . Para CR2 funcionar eficazmente como um motivo de repressão, pode requer um domínio de ligação ao ARN intacto no terminal C da proteína V. A proteína V pode ser semelhante a alguns factores de transcrição da ARN-polimerase II e possui uma estrutura modular (78). 48 ΡΕ1292615

Para testar melhor a possibilidade de CR2 estar directamente envolvido na repressão, este domínio (aminoácidos 112-134) foi suprimido para gerar haV-23 (Figura 7; SEQ ID NO: 9). Surpreendentemente, esta deleção não afectou grandemente a actividade de repressão (Figura 8) . 0 facto de CR2 poder ser suprimido sem afectar a repressão apoia que CR2 não contém um domínio que participe activamente na repressão. Em vez disso, parece que o defeito causado pela substituição dos aminoácidos 113 mais 114 verificados em haV-5 (Figuras 7 e 8) gerou um efeito negativo dominante (a análise "Western blot" precedente indicou que o defeito na repressão não foi causado pela instabilidade de haV-5).

Sem estar limitado pela teoria, a substituição de YD por AA em haV-5 gerou uma subtil alteração na estrutura terciária da proteína V que bloqueia parcialmente a actividade de repressão. Alternativamente, pode haver interacção entre a proteína V e outras proteínas virais ou proteínas celulares. A dupla substituição por alanina pode favorecer uma interacção proteína-proteína que iniba a actividade de repressão ou sequestre a proteína V num complexo proteico inactivo. 0 conceito de que o fenótipo de repressão fraco foi causado por um efeito negativo dominante criado pela dupla substituição de alanina foi ainda testado através da execução de substituições de aminoácidos adicionais que foram muito semelhantes mas distintas das mutações 49 ΡΕ1292615 verificadas em haV-5 (Figura 7) . A substituição de YD por AA original em haV-5 foi efectuada num motivo bem conservado consistindo em VYDH situado no limite amino de CR2 (Figura 2) . Este motivo era idêntico em sequências da proteina V do virus do sarampo, do virus da esgana canina, do virus da peste bovina e do Morbillivirus do golfinho. No mutante haV-24 (SEQ ID NO: 10), a sequência VYDH foi convertida em VYAA, e no mutante haV-25 (SEQ ID NO: 11), VYDH foi convertida em VAAA. Ambos estes mutantes reprimiram a expressão do gene MV do mini-replicão tão bem como a proteina haV de tipo selvagem (Figura 8) . Isto implica que o defeito de haV-5 é muito especifico para a substituição de VYDH por VAAH. A possibilidade de um dominio semelhante a um dedo de zinco C-terminal ter um papel na repressão foi ainda examinada através da introdução de substituições de aminoácidos em pares de residuos de cisteina no terminal C (Figura 9). A haV-12 mutante (SEQ ID NO: 14) foi gerada com os residuos de cisteina 1 e 2 (aminoácidos 251 e 255) convertidos em alaninas. De forma semelhante, a haV-13 mutante (SEQ ID NO: 15) foi gerada com os residuos de cisteina C-terminais 4 e 5 (aminoácidos 269 e 272) substituídos por alaninas. Os resíduos de cisteina foram mutados em pares esperando que isto alterasse significativamente uma estrutura semelhante a um dedo de zinco no terminal C e produzisse uma alteração facilmente detectável na actividade de repressão. 50 ΡΕ1292615

Surpreendentemente, os estudos de expressão da CAT destes mutantes (Figura 10) revelaram que esta era afectada apenas suavemente pelas substituições das cisteínas; tanto haV-12 como haV-13 retiveram uma proporção significativa da actividade de repressão da proteina haV de tipo selvagem (cerca de 65% do tipo selvagem). Este resultado era um tanto inesperado; previa-se que a substituição de residuos de cisteina coordenando o zinco abolisse a repressão. Possivelmente, a substituição de apenas dois dos sete residuos de cisteina não destruiu completamente a putativa estrutura de ligação ao ácido nucleico do dedo de zinco. Alternativamente, é possível que o putativo motivo de dedo de zinco tenha um papel menos proeminente na repressão do que o anteriormente previsto. Assim, foram preparadas duas séries adicionais de mutações para examinar melhor o papel do terminal C na repressão.

Num conjunto de mutações, foram feitas pequenas deleções incrementais a começar a partir do terminal C (de haV-14 a haV-19; ID SEQ NOS: 16-21). A deleção mais pequena (haV-14) removeu 21 aminoácidos do terminal C, enquanto que a maior deleção (haV-19) removeu 71 resíduos de aminoácidos. O mutante haV-19 foi construído embora fosse quase idêntico a haV-Ι (Figura 9; SEQ ID NO: 13), porque a deleção em haV-19 removeu diversos aminoácidos adicionais que faziam parte do pequeno motivo básico situado entre os aminoácidos 229-234, e o fenótipo de haV-19 podia ser visto como a verificação do fenótipo mutante mostrado por haV-1. 51 ΡΕ1292615 A análise dos mutantes C-terminais no ensaio do mini-replicão revelou que os mutantes de deleções grandes (haV-1 e haV-19) se comportavam de forma semelhante; reprimiram a expressão génica do mini-replicão apenas cerca de duas vezes ou menos em vez das 5-8 vezes de repressão induzidas pela haV de tipo selvagem (Figura 10) . De forma interessante, a actividade de repressão diminuida apresentada pelas deleções grandes foi reproduzida por todos os mutantes de truncagem menores. Mesmo a menor deleção do terminal C (haV-14) resultou numa proteina V que reprimia apenas cerca de duas vezes. Este resultado implicou que a integridade da ponta do terminal C é essencial para a actividade intacta de repressão.

Para além de analisar o efeito das mutações de deleção C-terminais, foram geradas diversas mutações adicionais para examinar a possibilidade do motivo básico (KKGHRR; aminoácidos 229-237, SEQ ID NO: 12) no inicio do terminal C único da proteina V ter tido algum papel na repressão. A conversão dos dois resíduos de arginina em alanina (haV-20; SEQ ID NO: 22) ou ácido aspártico (haV-21; SEQ ID NO: 23) teve um efeito que foi semelhante ao das mutações de deleção C-terminais. Os dois mutantes de substituição reprimiram a expressão do mini-replicão numa média de apenas 1,5 a 3 vezes enquanto que a repressão da proteína V de tipo selvagem variava normalmente de 5-8 vezes (Figura 10). Estes resultados implicaram que a perturbação do motivo básico destruiu também a função de repressão da proteína V normal. 52 ΡΕ1292615

Este resultado foi ainda examinado através da deleção do motivo básico (Figura 9, haV-22; SEQ ID NO: 24), enquanto se deixava o restante terminal C intacto. Surpreendentemente, uma experiência preliminar indicou que a deleção do motivo básico não teve qualquer efeito perceptivel na actividade de repressão; haV-22 reprimiu a actividade de CAT em cerca de nove vezes (Figura 10) . Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que as substituições de aminoácidos no motivo básico produzem um efeito negativo dominante na actividade de repressão causando possivelmente uma mudança desfavorável na estrutura terciária da proteína. Por outro lado, a deleção do motivo básico produziu pouca mudança na capacidade da proteína V para reprimir a expressão génica do mini-replicão. 0 mecanismo de repressão do mini-replicão da V do vírus do sarampo é desconhecido. Os

resultados sugerem que o mecanismo não requer interacção com a proteína N, mas envolve interacção com o ARN. A ligação ao ARN podia resultar em níveis reduzidos de CAT num ensaio do mini-replicão através de vários mecanismos diferentes. Por exemplo, a actividade de ligação ao ARN podia reprimir a tradução se a proteína V se ligar a ARNms virais. A proteína V podia também influenciar taxas de encapsidação se se ligar a ARNs virais nascentes e impedir a associação do ARN à proteína N. Inversamente, podia de algum modo estimular a montagem da nucleocápside, forçando desse modo o sistema do mini-replicão a sobreproduzir ARN 53 ΡΕ1292615 de comprimento genómico à custa de ARNm. A proteína V podia também ser considerada como análoga a um factor de transcrição que se ligue ao promotor ou próximo deste e reprima a transcrição. Se a proteína V for análoga a um factor de transcrição, pode ser um regulador do interruptor que equilibra a síntese do genoma e a síntese de ARNm. A dissecção das funções da proteína V proporciona uma base para a introdução de mutações atenuantes em estirpes de Morbillivirus candidatas para utilização em composições imunogénicas. Os estudos publicados mostraram que a eliminação da expressão da proteína V resulta em replicação virai atenuada (19, 22, 23, 26-29). Graus variáveis de atenuação são introduzidos tendo como alvo substituições de aminoácidos em domínios específicos da proteína V, em vez de eliminar a expressão. Por exemplo, a perda parcial da função de repressão da proteína V é alcançada através da mutação de um ou mais resíduos de cisteína no terminal C único. As substituições numa região partilhada por P e V são adequadas, tais como as substituições por alanina em CR2, se tiverem um efeito na função da proteína V sem muito efeito na proteína P. Estas mutações são avaliadas utilizando os sistemas genéticos inversos para "recuperação", tal como descritos na arte (19, 79, 80, 81) . O sistema genético inverso deve ser utilizado para gerar um Morbillivirus infeccioso contendo as mutações deste invento, porque o ARN genómico nu não pode servir 54 ΡΕ1292615 como molde para a transcrição e replicação. Em vez disso, estas sequências genómicas são reconhecidas apenas quando são inteiramente encapsidadas pela proteína N na estrutura da nucleocápside. É apenas nesse contexto que se reconhece que as sequências promotoras terminais genómicas e antigenómicas iniciam as vias da transcrição ou da replicação. A transcrição e replicação de genomas virais de ARN de cadeia simples de sentido negativo são alcançadas através da actividade enzimática de uma proteína multimérica que actua no núcleo da ribonucleoproteína (nucleocápside). Todos os Morbillivirus requerem as três proteínas virais, N, P e L, para que estas vias prossigam.

As mutações aqui descritas são introduzidas em estirpes de Morbillivirus utilizando mutagénese dirigida ao local. Um ou mais mutações tal como aqui definidas são introduzidas numa estirpe de Morbillivirus. Os efeitos cumulativos de diferentes combinações de mutações podem ser avaliados.

Este invento é exemplificado com o sistema de mini-replicão. As mudanças nas sequências nucleotídicas codificando as mutações em CR2 e no terminal C da proteína V de Morbillivirus (bem como na região promotora e na proteína L, nas proteínas N, P e/ou C e/ou no sinal de terminação do gene F do vírus do sarampo) podem ser facilmente inseridas em vírus inteiros utilizando técnicas 55 ΡΕ1292615 conhecidas na arte. As mutações são introduzidas através de métodos de ADN recombinante padrão numa cópia do ADN do genoma virai. Este pode ser um fundo de genoma virai de tipo selvagem ou modificado, gerando desse modo um novo virus. Os clones ou as partículas infecciosas contendo estas mutações são gerados utilizando o sistema de recuperação de ADNc, que foi aplicado a uma variedade de vírus de ARN de sentido negativo, incluindo o vírus de Sendai (82); o vírus do sarampo (83, 88); o vírus sincicial respiratório (84); PIV-3 (85); o vírus da raiva (86); da estomatite vesicular (VSV) (87); e o vírus da peste bovina (89); estas referências são aqui incorporadas por referência.

Resumidamente, todos os sistemas de recuperação de Morbillivirus podem ser resumidos como se segue: Cada um requer um DNA clonado equivalente ao genoma virai inteiro colocado entre um promotor de ARN-polimerase dependente de DNA apropriado (por exemplo, o promotor da ARN-polimerase T7) e uma sequência de ribozima auto-clivante (p. ex., a ribozima delta da hepatite) que é introduzida num plasmídeo bacteriano propagável. Este vector de transcrição proporciona o molde de ADN facilmente manipulável a partir do qual a ARN-polimerase (p. ex., a ARN-polimerase T7) pode fielmente transcrever uma cópia de ARN de cadeia simples do antigenoma (ou do genoma) virai com os terminais 3' e 5' exactos, ou quase exactos. A orientação da cópia do ADN genómico virai e das sequências promotora e da ribozima flanqueadoras determinam se os equivalentes do ARN do 56 ΡΕ1292615 antigenoma ou do genoma são transcritos. São também requeridas para a recuperação da descendência do novo virus as proteinas de acção em trans especificas do virus necessárias para encapsidar os transcritos de ARN nus de cadeia simples do antigenoma ou do genoma virai em moldes funcionais da nucleocápside: a proteina da nucleocápside (N) virai, a fosfoproteina (P) associada à polimerase e a proteina polimerase (L). Estas proteinas compreendem a ARN-polimerase dependente de ARN virai activa que se deve encaixar neste molde de nucleocápside para alcançar a transcrição e replicação.

Tipicamente, estas proteinas virais de acção em trans são geradas a partir de um ou mais vectores plasmidicos de expressão que codificam as proteinas requeridas, embora algumas ou todas as proteinas de acção em trans requeridas possam ser produzidas dentro de células de mamífero modificadas para conterem e expressarem estes genes e produtos génicos específicos do vírus como transformantes estáveis.

As circunstâncias típicas (embora não necessariamente exclusivas) para a recuperação incluem um meio celular de mamífero apropriado no qual a polimerase T7 está presente para dirigir a transcrição do ARN antigenómico (ou genómico) de cadeia simples do vector de transcrição contendo ADNc genómico virai. Na transcrição ou logo depois desta, este transcrito de ARN do antigenoma (ou genoma) virai é encapsidado em moldes funcionais pela proteína da 57 ΡΕ1292615 nucleocápside e acoplado pelos componentes requeridos da polimerase produzidos simultaneamente a partir de plasmideos de expressão co-transfectados codificando as proteínas de acção em trans específicas do vírus necessárias. Estes acontecimentos e processos conduzem à transcrição pré-requisito de ARNms virais, à replicação e à amplificação de novos genomas e, desse modo, à produção de nova descendência virai, i.e., à recuperação.

Para a recuperação do virus da raiva não Mor-billivirus, VSV e de Sendai, a polimerase T7 é proporcionada através do virus vaccínia recombinante VTF7-3. Este sistema, no entanto, requer que o vírus recuperado seja separado do vírus vaccínia através de meios físicos ou bioquímicos ou através de passagens repetidas em células ou tecidos que não sejam um bom hospedeiro para poxvirus. Para a recuperação do ADNc do vírus do sarampo (e presumivelmente para outros Morbillivirus), esta exigência é evitada através da criação de uma linha celular que expresse a polimerase T7, bem como as proteínas N e P virais. A recuperação é alcançada através da transfecção do vector de expressão do genoma e do vector de expressão do gene L na linha celular ajudante. As vantagens do mutante de amplo espectro de hospedeiros do virus vaccínia, MVA-T7, que expressa a ARN-polimerase T7, mas produz pouca ou nenhuma descendência infecciosa em células de mamífero, são exploradas para recuperar o vírus do sarampo e outros Morbillivirus. Após a expressão simultânea das proteínas de encapsidação necessárias, o ARN virai antigenómico inteiro 58 ΡΕ1292615 sintético é encapsidado, replicado e transcrito por proteínas polimerases virais e os genomas replicados são empacotados em viriões infecciosos. Para além de tais antigenomas, foram agora recuperados com sucesso análogos dos genomas para Sendai e PIV-3 (85, 90). O sistema de recuperação proporciona assim uma composição que compreende um vector de transcrição compreendendo uma molécula de ácido nucleico isolada codificando um genoma ou um antigenoma de um Morbillivirus. A molécula de ácido nucleico contém pelo menos uma mutação na região correspondente aos aminoácidos 112-134 da proteina V do virus do sarampo (e, opcionalmente, outras mutações aqui descritas), juntamente com pelo menos um vector de expressão que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucleico isolada codificando as proteínas de acção em trans necessárias para a encapsidação, transcrição e replicação (p. ex., N, P e L para um Morbillivirus) . As células hospedeiras são então transformadas, infectadas ou transfectadas com pelo menos dois vectores de expressão agora descritos. As células hospedeiras são cultivadas sob condições que permitem a co-expressão destes vectores para produzir o vírus infeccioso modificado. O vírus infeccioso recuperado é testado quanto ao seu fenótipo desejado (repressão reduzida pela proteína V, sensibilidade à temperatura, adaptação ao frio, morfologia das placas fágicas e atenuação da transcrição e da replicação), primeiro por meios in vitro. As mutações nos 59 ΡΕ1292615 genes N, P ou C ou no sinal de terminação do gene F do virus do sarampo são também testadas utilizando o sistema de mini-replicão onde as actividades de encapsidação de acção em trans e de polimerase requeridas são proporcionadas por virus ajudantes de tipo selvagem ou de vacina, ou por plasmideos que expressam os genes N, P e diferentes L ancorando mutações atenuantes especificas dos gene (63, 83) .

Se o fenótipo atenuado do vírus recuperado estiver presente, as experiências de confronto são conduzidas com um modelo animal apropriado. Os primatas não humanos proporcionam o modelo animal preferido para a patogénese da doença humana. Estes primatas são primeiro imunizados com o vírus atenuado, gerado de forma recom-binante, depois confrontados com a forma de tipo selvagem do vírus. Os macacos são infectados por várias vias, incluindo mas não se limitando às vias de inoculação intranasal, intratraqueal ou subcutânea (91). Os macacos rhesus e cinomólogos experimentalmente infectados serviram também como modelos animais para estudos de protecção induzida por vacina contra sarampo (92). A protecção é medida por critérios tais como sinais e sintomas de doença, sobrevivência, derramamento de vírus e títulos de anticorpo. Se os critérios desejados forem verificados, o vírus gerado de forma recombinante é considerado uma vacina candidata ou composição imunogénica viável para testes em seres humanos. 0 vírus "recuperado" é 60 ΡΕ1292615 considerado como sendo "gerado de forma recombinante", tal como o são a descendência e as gerações posteriores do virus, que também incorporem as mutações.

Mesmo que um virus "recuperado" seja subatenuado ou sobre-atenuado relativamente aos niveis óptimos para utilização em vacina, esta é uma informação que é valiosa para desenvolver tais estirpes ideais.

De forma ideal, um codão contendo uma mutação pontual pode ser estabilizado através da introdução de uma segunda ou de uma segunda mais uma terceira mutação no codão sem mudar o aminoácido codificado pelo codão possuindo apenas a mutação pontual. Os clones do vírus infecciosos contendo as mutações estabilizantes são também gerados utilizando o sistema de "recuperação" de ADNc descrito acima.

Foi divulgado anteriormente, no pedido de patente internacional publicado WO 98/13501 (93), que é por este meio incorporado por referência, a criação e o isolamento de vírus de ARN de cadeia simples, de sentido negativo, não segmentados, atenuados, gerados de forma recombinante da Ordem Mononegavirales (tal como o vírus do sarampo) possuindo pelo menos uma mutação atenuante na região promotora genómica 3' e possuindo pelo menos uma mutação atenuante no gene da ARN-polimerase.

Especificamente, estas mutações compreenderam: 61 ΡΕ1292615 1) pelo menos uma mutação atenuante na região promotora genómica 3' seleccionada a partir do grupo que consiste no nucleótido 26 (A -► T) , no nucleótido 42 (A -► T ou A ->· C) e no nucleótido 96 (G ->· A) , onde estes nucle-ótidos são apresentados na cadeia positiva, antigenómica, no sentido da mensagem; e 2) pelo menos uma mutação atenuante no gene da ARN-polimerase seleccionada a partir do grupo que consiste nas mudanças de nucleótidos que produzem mudanças num aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste nos residuos 331 (isoleucina -> treonina) , 1409 (alanina -> treo-nina) , 1624 (treonina -► alanina) , 1649 (arginina -► meti- onina) , 1717 (ácido aspártico ->· alanina) , 1936 (histidina -► tirosina) , 2074 (glutamina -> arginina) e 2114 (arginina -► lisina).

Para além disso, foi divulgado no pedido de patente internacional publicado WO 99/49017 (94), que é por este meio incorporado por referência, a criação e o isolamento de virus do sarampo atenuados, gerados de forma recombinante possuindo pelo menos uma mutação atenuante nos genes N, P ou C, ou no sinal de terminação do gene F. Especificamente, estas mutações compreenderam: 1) para o gene N, pelo menos uma mutação atenuante seleccionada a partir do grupo que consiste nas mudanças de nucleótidos que produzem mudanças num aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste nos residuos 129 (glutamina -► lisina), 148 (ácido glutâmico -► 62 ΡΕ1292615 glicina) e 479 (serina -► treonina) ; 2) para o gene P, pelo menos uma mutação atenuante seleccionada a partir do grupo que consiste nas mudanças de nucleótidos que produzem mudanças num aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste nos resíduos 225 (ácido glutâmico -► glicina) , 275 (cisteína -► tirosina) e 439 (leucina -► prolina) ; 5) para o gene C, pelo menos uma mutação atenuante seleccionada a partir do grupo que consiste nas mudanças de nucleótidos que produzem mudanças num aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste nos resíduos 73 (alanina -► valina) , 104 (metionina -► treonina) e 134 (serina -► tirosina) ; e 6) para o sinal de terminação do gene F (sinal de terminação da transcrição de acção em cis) , a mudança no nucleótido 7243 (T -► C) , onde estes nucleótidos são apresentados na cadeia positiva, antigenómica, isto é, no sentido da mensagem (de codificação).

Mutações atenuantes individuais ou em combinações de qualquer um ou de ambos estes conjuntos de mutações podem ser incorporadas nos Morbillivlrus deste invento, incluindo especificamente as que têm pelo menos uma mutação na região correspondente aos aminoácidos 112-134 da proteína V, bem como as que contêm uma tal mutação nos aminoácidos 112-134 e uma mutação ou deleção em pelo menos uma porção da região C-terminal que começa no aminoácido 231. 63 ΡΕ1292615

Os vírus deste invento são utilizados para formular uma composição de vacina ou imunogénica. Para o fazer, o virus é ajustado a uma concentração apropriada e formulado com qualquer adjuvante, diluente ou transportador adequado. Os meios fisiologicamente aceitáveis podem ser utilizados como transportadores e/ou diluentes. Estes incluem, mas não se limitam a: água, um meio isotónico apropriado, glicerol, etanol e outros solventes convencionais, solução salina tamponada com fosfato e semelhantes. Adjuvantes adequados incluem, mas não se limitam a fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, MPL™ (mono-fosforil-lípido A 3-0-desacilado; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT, agora Corixa), análogos sintéticos de lípido A tais como 529 (Corixa), Stimulon™ QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Framingham, MA) e IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA).

Numa concretização deste invento, pretende-se que a formulação incluindo o Morbillivirus seja para utilização como vacina ou composição imunogénica. 0 vírus pode ser misturado com aditivos crioprotectores ou estabilizantes tais como proteínas (p. ex., albumina, gelatina), açúcares (p. ex., sacarose, lactose, sorbitol), aminoácidos (p. ex., glutamato de sódio), solução salina ou outros agentes protectores. Esta mistura é mantida num estado líquido, ou então é desidratada ou liofilizada para transporte e armazenamento e misturada com água imediatamente antes da administração. 64 ΡΕ1292615

As formulações compreendendo os Morbillivirus deste invento são úteis para imunizar um ser humano ou outro sujeito vertebrado para induzir protecção contra a infecção pelo correspondente virus de tipo selvagem. Assim, este invento proporciona ainda um método de imunização de um sujeito para induzir protecção contra infecção por um Morbillivirus através da administração ao sujeito de uma quantidade imunizante eficaz de uma formulação da vacina ou da composição imunogénica incorporando uma versão desse virus gerado tal como descrito acima.

Uma quantidade suficiente da vacina ou da composição imunogénica num número apropriado de doses é administrada ao sujeito para provocar uma resposta imunitária. Os peritos na arte serão prontamente capazes de determinar tais quantidades e dosagens. A administração pode ser através de qualquer forma eficaz convencional, tal como aplicada intranasalmente, parentericamente, oralmente ou topicamente a qualquer superfície mucosa tal como a superfície intranasal, oral, do olho, do pulmão, vaginal ou rectal, tal como através de um spray de aerossóis. 0 meio preferido de administração é através da administração intranasal.

Todas as patentes e publicações aqui citadas são incorporadas por este meio por referência.

Para que este invento possa ser melhor 65 ΡΕ1292615 compreendido, são expostos os seguintes exemplos. Os exemplos têm apenas a finalidade de ilustrar e não devem ser interpretados como limitantes do âmbito do invento.

Exemplos

Exemplo 1 Células e Virus Células HEp2 foram criadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro fetal bovino a 10%. Fibroblastos de embrião de galinha (CEFs; SPAFAS, Inc.) foram mantidos no mesmo meio. A estirpe atenuada do virus vaccinia que expressa a ARN-polimerase do fago T7 (MVA/T7; 62) foi criada em CEFs. Os ensaios de placas fágicas foram efectuados também em CEFs.

Exemplo 2 ADN Recombinante

Os clones de expressão das proteínas N, P e L do virus do sarampo (Figura IA) foram cada um preparado a partir de ARN total de células infectadas através de transcrição reversa e amplificação por PCR (RT/PCR) com iniciadores específicos do gene, seguido de clonagem num vector de expressão apropriado dependente da ARN-polimerase T7 (61). Células Vero foram infectadas com a estirpe de 66 ΡΕ1292615 tipo selvagem do vírus do sarampo de Edmonston e quando cerca de 70% ou mais das células exibiam um efeito citopático, o ARN foi preparado através do método de extracção de guanidínio-fenol (95). A RT/PCR foi efectuada com o vírus aviário de mioblastose RT e a polimerase Pwo contido no estojo de amplificação Titan de um só tubo (Roche Molecular Biology). 0 passo de RT foi efectuado durante 30-60 minutos a 47°C, seguido de 30-35 ciclos de amplificação por PCR. Os fragmentos de ADN amplificados foram clonados num plasmídeo de expressão T7 (Figura 1; (61, 83)) com o codão de iniciação da tradução colocado no local Ncol do vector. Os ADNs clonados foram verificados através de sequenciação por ciclos (96) e os erros de substituição de nucleótidos foram corrigidos através de mutagénese por oligonucleótidos utilizando o estojo Morph (5prime-3prime, Inc.) ou através da substituição de subfragmentos por fragmentos de ADN amplificados de novo tal como descrito anteriormente (96). O clone de expressão da proteína V inicial foi preparado através de amplificação por PCR a partir de um clone do ADNc inteiro de tipo selvagem de Edmonston utilizando iniciadores que flanqueiam a região de codificação da proteína V. O ADN amplificado foi clonado no vector de expressão T7 e o resíduo nucleotídico G adicional necessário para gerar a mudança de enquadramento do gene V foi adicionado no local de edição (18) através de mutagénese dirigida por oligonucleótidos. Os vectores de expressão da proteína V de tipo selvagem e mutante foram 67 ΡΕ1292615 também preparados com uma etiqueta de epitopo de hemaglutinina do vírus da gripe (etiqueta HA; (67)) no terminal amino. 0 vector plasmídico T7 foi modificado para incluir uma sequência que inclui um codão de iniciação e codifica a etiqueta de epitopo HA (CC ATG GCT TAT CCT TAT GAC GTG CCT GAC TAT GCC (SEQ ID NO: 5), seguida de um poliligador (plasmídeo pT7/HA). A região de codificação da proteína V foi clonada com a etiqueta HA no terminal amino. Isto serviu para substituir o codão iniciador de metionina da proteína V, resultando na criação de um plasmídeo designado pMV-haV-wt. Os mutantes da proteína V foram preparados na estrutura de pMV-haV-wt através de mutagénese dirigida por oligonucleótidos ou deleções. 0 iniciador desenhado para amplificar a extremidade 5' das regiões de codificação de P e V (CGGCCATGGCAGAAGAGACAGGCACGCCACGTAAAAAACGGAC) (SEQ ID NO: 6) continha duas mudanças de bases (sublinhadas) para destruir o enquadramento de leitura aberto da proteína C a jusante. Estas mudanças eram silenciosas em relação aos enquadramentos de leitura abertos de P e V. As mesmas mudanças de nucleótidos foram realizadas nas construções pT7MV-haV.

Para todas as construções de expressão de proteína, a inserção de ADNc foi clonada a 3' de um local interno de entrada no ribossoma (IRES) para facilitar a tradução do transcrito da ARN-polimerase T7. Um trecho de 50 resíduos de adenosina estava situado na extremidade 3', 68 ΡΕ1292615 seguido de um terminador da ARN-polimerase T7. Ambos os vectores de expressão de P e V continham substituições de bases desenhadas para destruir a iniciação da tradução do enquadramento de leitura aberto da proteína C a jusante. 0 mini-replicão do vírus do sarampo (pMVwtl07-CAT, Figura 1B) era um derivado de pMV107-CAT (63) . 0 plasmídeo pMV107-CAT continha a sequência líder verificada em estirpes de vacina do vírus do sarampo (60) e foi convertido no plasmídeo pMV107wt-CAT (que continha o líder de tipo selvagem) utilizando mutagénese dirigida por oligonucleótidos.

Exemplo 3

Experiências de Expressão Transiente A análise de expressão transiente do mini-replicão foi efectuada essencialmente tal como descrito anteriormente (96) utilizando quantidades variáveis de vectores virais de expressão da proteína (Figura 1B) e um mini-replicão do vírus do sarampo contendo o gene repórter CAT (Figura 1B). O mini-replicão do vírus do sarampo era um derivado de pMV107-CAT (63) contendo o gene repórter CAT e a sequência líder do sarampo da estirpe de tipo selvagem de Edmonston do vírus do sarampo (60). Células HEp2 em placas de seis poços foram utilizadas para transfecção quando as células eram aproximadamente 70-90% confluentes. As misturas de transfecção foram preparadas através da ΡΕ1292615 combinação de ADN do mini-replicão (50-200 ng de pMVwtl07-CAT) e plasmídeos de expressão (400 ng de pMVwt-N, 300 ng de pMVwt-P[C~], 100 ng de pMVwt-L) em 200 μΐ de OptiMEM isento de soro. Os plasmídeos de expressão da proteína V foram incluídos nesta mistura de acordo com quantidades que variaram de 25-400 ng, tal como especificado na Figura 1C. Foi adicionado Lipofectace (12-15 μΐ; Invitrogen/Life Technologies) à mistura ADN-meio e incubou-se durante 20 a 30 minutos à temperatura ambiente. Uma mistura MVA/T7 separada foi preparada em quantidade suficiente para proporcionar 0,8 ml de OptiMEM isento de soro contendo suficiente MVA/T7 para infectar cada poço de células a transfectar com cerca de 2 pfu por célula. Antes de iniciar a transfecção, a mistura de transfecção ADN-meio-Lipofectace foi combinada com 800 μΐ da mistura MVA/T7-meio e misturou-se suavemente através de pipetagem. Em seguida, os meios de cultura foram removidos das monocamadas celulares e foi adicionado às células 1 ml da mistura de transfecção combinada.

Após incubação de um dia para o outro, a mistura de transfecção e os meios foram substituídos por DMEM suplementado com FBS a 10% e as células foram incubadas mais um dia. Cerca de 48 horas após o início da transfecção, as células foram colhidas e os extractos preparados para análise da actividade de CAT tal como descrito anteriormente (96). A expressão de CAT é mostrada na Figura 1C. Nalgumas experiências, as proteínas nos extractos celulares brutos foram analisadas através de 70 ΡΕ1292615 "Western blotting" para monitorizar a expressão da proteína (97). As células transfectadas foram lisadas utilizando tampão TN (Tris [pH 7,4] 50 mM, NaCl 150 mM) suplementado com NP40 a 0,2%. Os extractos celulares foram clarificados através de centrifugação para remover os núcleos e foi adicionado ao extracto citoplasmático um volume igual de tampão de amostra de Laemmli (Tris [pH 6,8] 62,5 mM, glicerol a 25%, SDS a 2%, azul de bromofenol a 0,01%). As amostras foram ajustadas para conterem aproximadamente 2,5% de β-mercaptoetanol e depois fervidas. A electroforese em gel de SDS-poliacrilamida e a electrotransferência foram efectuadas utilizando protocolos padrão (97). A proteína V etiquetada com epitopo foi detectada utilizando o anticorpo monoclonal de ratinho 12CA5 (Roche Molecular Biology) ou o anticorpo monoclonal de rato 3F10 (Roche Molecular

Biology). A detecção foi efectuada com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase (Sigma) e reagentes de quimioluminescência (Roche Molecular Biology ou New England Biolabs).

Exemplo 4

Repressão da Expressão do Mini-replicão através de Proteínas V Mutantes do Vírus do Sarampo O ensaio de CAT de expressão transiente do mini-replicão descrito no Exemplo 3 foi repetido utilizando quantidades variáveis dos mutantes das proteínas V do vírus do sarampo haV-1 a haV-8, que têm as seguintes diferenças 71 ΡΕ1292615 da sequência de tipo selvagem (haV-wt) (ver Figura 3): haV-1 Deleção dos aminoácidos 231-299 haV-2 Mutação do ácido glutâmico no aminoácido 225 para glicina haV-3 Mutações das lisinas nos aminoácidos 229 e 230 para alaninas haV-4 Mutações da lisina e treonina nos aminoácidos 204 e 209 para alaninas haV-5 Mutações da tirosina e do ácido aspártico nos aminoácidos 113 e 114 para alaninas haV-6 Mutações da leucina e glutamina nos aminoácidos 100 e 101 para alaninas haV-7 Mutações do ácido glutâmico e da cisteina nos aminoácidos 14 e 15 para alaninas haV-8 Mutações do ácido glutâmico nos aminoácidos 3 e 4 para alaninas

Foram utilizados 200 ou 400 ng de cada plasmideo de V (codificando proteína V de tipo selvagem ou haV-1 a haV-8 V) e a actividade relativa de CAT foi medida como percentagem da actividade resultante de uma transfecção efectuada sem qualquer vector de expressão da proteína V (pista 2) . Os resultados estão representados na Figura 4A. Uma percentagem mais baixa correlaciona-se com um grau mais elevado de repressão da expressão de CAT. A expressão da proteína V foi monitorizada através de um "Western blot" que foi analisado com um anticorpo anti-HA (Figura 4B). O ensaio de CAT foi repetido utilizando 72 ΡΕ1292615 quantidades crescentes (100 ng a 1 yg) do plasmídeo de V codificando haV-1 e as actividades relativas estão representadas na Figura 4C.

Exemplo 5

Ensaios de Ligação ao ARN

Foram efectuados ensaios de ligação ao ARN (74, 76, 77) para avaliar a ligação da proteína V do vírus do sarampo ao ARN, utilizando resinas de agarose ligadas a polirribonucleótidos (Sigma). As células transfectadas foram lisadas tal como descrito acima utilizando tampão TN suplementado com NP40 a 0,5%, glicerol a 5%, MgCl2 1 mM, ZnCl2 1 mM e uma mistura de inibidores de proteases (Roche Molecular Biology). As resinas de agarose contendo polirribonucleótidos (aproximadamente 25-50 μΐ do volume estabelecido de contas) foram adicionadas ao lisado celular clarificado e incubadas 30-60 minutos a 4°C com agitação. Após a incubação, as resinas foram lavadas três vezes para remover as proteínas não ligadas. As proteínas foram eluídas das resinas através da fervura em tampão de Laemmli suplementado com β-mercaptoetanol a 2,5%. O procedimento é resumido pelo fluxograma da Figura 5A. As proteínas capturadas pelas resinas de polinucleótidos foram analisadas através de "Western blotting" tal como descrito acima. O ensaio foi realizado primeiro com proteína V de tipo selvagem, e depois com haV-1 até haV-11. Os mutantes haV-1 a haV-8 são tal como descritos acima; os mutantes 73 ΡΕ1292615 haV-9 a haV-11 possuem as seguintes diferenças da sequência de tipo selvagem (haV-wt) (ver Figura 3): haV-9 Deleção dos aminoácidos 1-20 haV-10 Deleção dos aminoácidos 208-230 haV-11 Deleção dos aminoácidos 1-20 e 208-230

Os resultados estão representados nas Figuras 5B (tipo selvagem) e 6 (mutantes).

Exemplo 6

Repressão da Expressão do Mini-replicão através de Proteínas V Adicionais do Vírus do Sarampo Mutantes em CR2 O ensaio de CAT de expressão transiente do mini-replicão descrito nos Exemplos 3 e 4 foi repetido utilizando os mutantes de CR2 da proteína V do vírus do sarampo haV-5 e haV-23 até haV-25, que possuem as seguintes diferenças da sequência de tipo selvagem (haV) (SEQ ID NO: 7) em CR2 (aminoácidos 100-140; ver Figura 7): haV-5 Mutações da tirosina e do ácido aspártico nos aminoácidos 113 e 114 para alaninas (SEQ ID NO: 8)

haV-23 Deleção dos aminoácidos 112 a 134 (SEQ ID NO: 9) haV-24 Mutações do ácido aspártico e da histidina nos aminoácidos 114 e 115 para alaninas (SEQ ID NO: 10) haV-25 Mutações da tirosina, do ácido 74 ΡΕ1292615 aspártico e da histidina nos aminoácidos 113 a 155 (SEQ ID NO: 11)

Foram utilizados 400 nanogramas de cada plasmídeo de V (codificando proteína V de tipo selvagem, haV-5 ou haV-23 até haV-25) e a actividade relativa de CAT foi medida como uma percentagem da actividade resultante de uma transfecção efectuada sem qualquer vector de expressão de proteína V (barra 1). Os resultados estão representados na Figura 8. Uma percentagem mais baixa correlaciona-se com um grau mais elevado de repressão da expressão de CAT.

Exemplo 7

Repressão da Expressão do Mini-replicão através de Proteínas V Adicionais do Vírus do Sarampo Mutantes no Terminal C O ensaio de CAT de expressão transiente do mini-replicão descrito nos Exemplos 3 e 4 foi repetido utilizando os mutantes da proteína V do vírus do sarampo haV-1 e haV-12 até haV-22, que possuem as seguintes diferenças da sequência de tipo selvagem (haV) (SEQ ID NO: 7) no terminal C (aminoácidos 220-299; ver Figura 9):

haV-Ι Deleção dos aminoácidos 232 a 299 (SEQ ID NO: 13) haV-12 Mutações das cisteínas nos aminoácidos 251 e 255 para alaninas (SEQ ID NO: 14) haV-13 Mutações das cisteínas nos aminoácidos 75 ΡΕ1292615 269 ' e 272 para alaninas (SEQ ID NO: 15) haV-14 Deleção dos aminoácidos 279 a 299 (SEQ ID NO: 16) haV-15 Deleção dos aminoácidos 267 a 299 (SEQ ID NO: 17) haV-16 Deleção dos aminoácidos 250 a 299 (SEQ ID NO: 18) haV-17 Deleção dos aminoácidos 243 a 299 (SEQ ID NO: 19) haV-18 Deleção dos aminoácidos 236 a 299 (SEQ ID NO: 20) haV-19 Deleção dos aminoácidos 229 a 299 (SEQ ID NO: 21) haV-20 Mutações das argininas nos aminoácidos 233 e 234 para alaninas (SEQ ID NO: 22) haV-21 Mutações das argininas nos aminoácidos 233 e 234 para ácidc > aspártico (SEQ ID NO: 23) haV-22 Deleção dos aminoácidos 229 a 237 (SEQ ID NO: 24)

Foram utilizados 400 nanogramas de cada plasmídeo de V (codificando a proteína V de tipo selvagem, haV-1 ou haV-12 até haV-22) e a actividade relativa de CAT foi medida como uma percentagem da actividade resultante de uma transfecção efectuada sem qualquer vector de expressão de proteína V (barra 1). Os resultados estão representados na Figura 10. Uma percentagem mais baixa correlaciona-se com um grau mais elevado de repressão da expressão de CAT. 76 ΡΕ1292615

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LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> American Cyanamid Company <120> Proteínas V Modificadas de Morbillivirus

<130> AM100239PCT <140> <141> <150> US60/213655 <151> 2000-06-23 <160> 24 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 299 <212> PRT <213> Vírus do sarampo <400> 1

Met Ala GlU Glu Gin Ala Arg HÍS Vai Ly& Asn Gly Leu Glu Cye Ile 1 S 10 15 Arg Ala Leu Ly» Ala Olu Pro Ile Gly Ser Leu Ala Ile Glu Glu Ala 20 25 30 Met Ala Ala Trp Ser Glu Ile Ser Asp As» Fro Gly Gl» Glu Arg Ala 3$ 40 45 fhr Cys Arg Glu Glu Lys Ala Gly Ser Ser Gly Leu Ser Lys Pro Cye so SS 60 Leu Ser Ala lie Gly Ser Thx Glu Gly Gly Ala Pr© Arg Ile Arg Gly #5 70 75 80 gi» Qly Pró Gly Glu Ser Asp Asp Asp Ala Glu Thr Leu Gly Ile Pro m 90 9S Pro Arg Asn Leu Glu Ala Ser Ser Gly Leu Gin cys Tyr Tyr Val IOQ 105 110 fyr Asp Kis Ser Gly Glu Ala vai Lys Gly Ile Gls Asp Ala Asp Ser 115 120 125 Ile Mefc Vai Gin Ser Gly Leu Asp Gly Âsp Ser Thr Leu Ser Gly Gly 130 135 140 87 ΡΕ1292615 ASp Asja Glu Ser Asn Ser Asp val Asp Ile Gly Glu Pro Asp Thr U5 150 155 180 ©lu eiy Tyr Ala liê .Thr ASp Arg Gly Ser Ala Pro Ile Ser Met Gly 1<SS 170 175 Phe Arg Ma Ser Mp Val Glu Thr Ala Glu Gly Gly Olu Ile Ela GlU 180 185 190 Leu Leu Arg Leu Glu ser Arg Gly· Ase Asu Fhe Pro Lys Leu Glu Lys 195 200 205 Thr· Leu Asii Val Pro Pro Pro Pro Aep Pro Gly Arg Ala Ser Thr Ser 210 215 220 Glu. Thr Pro Ile Lys lys Gly Eis Arg Arg Glu Ile Ser Leu Ile Trp 225 230 235 240 &8Π Gly Asp Arg Val Fhe Ile Asp Arg Trp Cys Asa Pro Mae cys Ser 245 250 255 Lys val Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala Arg Cys Thr cys Gly Glu Cys aso 285 270 Pro Arg Val cys Glu Glu Cys Arg Thr Asp Thr Gly Val Asp Thr Arg 275 280 285 lie Trp Tyr His Mn Leu Pro Glu Ile Pro Glu 295

<210> 2 <211> 299 <212> PRT <213> Vírus da peste bovina <400> 2 ΡΕ1292615 88 rnt Ala Glu Glu Gin Ala Tyr Eis Vai Asa Lys Gly Leu Glu Cys Ile 1 5 10 15 Lys Ala Leu Arg Ala Arg Pro Leu Asp Pro Leu Vai Vai Glu 01« Ala < 20 25 30 Leu Ala Ala Trp Vai Glu Thr Ser 01« Gly GlU Tbr Leu Asp Arg Met 35 40 45 Ser Ser Asp Glu Ala Glu Ala Asp Eis Gin Asp Xle Ser SLys Pro Cys 50 55 60 Phe .Pro Ala Ala Gly Pro Gly hys Ser Ser «et Ser Axg Cys Eis Asp 65 70 75 80 Glu Qly Leu Arg Gly Ser Asn Ser Cys Asp Glu Glu Leu Gly Ala Phè 85 $o 55 Ile Gly ASp Ser Ser Hat Hís Ser Tfer Glu Vai Gin HÍS Tyr Eis Vai 100 10 S 110 Tyr Asp Kis Ser Gly Glu Lys Vai 01« Gly vai Glu Asp Ala Asp Ser 115 120 125 Ile Leu Vai Gla Ser Gly Ala Αβρ Asp Gly Vai Glu Vai Trp Gly Gly 130 135 140 Asp Glu Glu Ser Glu Asu Ser Asp Vai Asp Ser Gly Glu Pro Asp Pro 145 ISO 155 160 01« Gly ser Ala Pro Ala Aep Trp Gly Ser Ser Pro Ile Ser Pro Ala 165 170 175 Tfer Arg Ala Ser &SJ> Vai Qlu Ttor Vai Glu. Gly Asp Glu Ile Glu Lys 89 ΡΕ1292615 X8Q 105 190

Leu Leu Glu Asp Gin Ser Arg Xle Arg Lys Met Thr Lys AXã Glu Lys 195 200 205 Thr Leu Vai Val Pro Pro Ile Pro Sor Gin Glu Arg Pro Thr Ala Ser 210 215 220 Glu Lys Pro lie Lys Lys Gly His Arg Arg Glu XXe Asp Leu Xle Trp 225 230 235 240 Asn Asp Gly Arg Vai Fhe Xle Asp Arg Trp <^s Ma Pro Thr Cys Ser 345 250 255 Lys Vai Thr Val Gly Thr Val Arg Ala Lya Cys Xle cys Gly Glu Cys 2m 265 270 Pro Arg Val Cys Glu Gin Cys 2le Thr Asp Ser Gly 11« Glu Asn Arg 275 280 2S5 Xle Trp Tyr Bis Asn Leu Ala Asp Xle Pro Glu 290 295

<210> 3 <211> 303 <212> PRT <213> Morbillivirus do golfinho <400> 3 ΡΕ1292615 90 mt Ala Glu Glu Gin Ala Tyr Me lie Asa Lys Gly Leu Glu Cys Iís 1 s 10 , 15 lys Ser Leu Arg Glu Asa. Pro Pro Asp Ala Val Glu Ile Lys Glu À3 20 25 30 Gin II e lie Arg Ser Lys Ala Ala Cys Glu Glu Ser Ser Glu Ser Rj 35 40 45 His Gin Asp Asa Ser Glu. Lys Asp Thr Leu Asp Phe Asp Glu Ser 0¾ 50 55 60 Ser Ser Ala Xie Arg Pro Glu Thr Tyr Arg Met Leu Leu Gly Asp As 65 70 75 í 'Thr Gly Phe Arg Ala Fro Gly Tyr Ile Fro Asa Glu Gly Glu Pro 03 85 90 . 95 Pro fliy kBp ílÈ Gly Lys Glu Glu Pro Ala Val Arg Cys Tyr Ris V« 100 105 110 Τγτ Asp HÍS Gly Gly Gin. Ala Val Glu Gly Val Lys Asp Ala Asp L€ ns 120 12S Léu Val Val Pro Thr Gly Ser Asp Asp Asp Ala Glu Phe Arg Asp G3 ISO 135 MO Ola Ser Ser Leu Glu Ser Asp Gly Glu. Ser Gly Thr Val Asp TI 145 150 IBS 11 Arg oiy Asa Ser Ser Ser Asa Arg Gly Ser Ala Fro Arg Ile Lys Vá 165 170 175 Glu Arg Ser Ser ASp Val Glu Thr Ile Ser Ser < 31a C íiu Leu Glu Gly ISO 185 ISO Leu Ile Arg Ser Gin Ser Glu Lys His Asn Gly S Phe Gly I ?al Asp Arg 1:95 200 205 Phe Leis. Lys Val Pro Pro Ile Pro Thr Ser Val J ?ro Leu Asp Pro Ala 210 215 I 220 Pro Lys Ser Ile Lys Lys Gly Hís Arg Arg' Glu ; Ile Ser Leu Ile Trp 225 230 235 240 Asp Gly Asp Arg vai Phe Ile Asp Arg Trp Cys í teu Fro Thr Cys Ser 245 250 255 91 ΡΕ1292615

Arg lie Lys Het Gly He Vai Arg Vai Lys Cys Thr Cys Gly Glu Cys 2É0 265 270 Pro Fro Vai Cys Asp Glu Cys Ar g Glu Asp Pro Glu Thr Pro Thr Arg 275 280 285 Xle Trp Tyr His Ser Leu Frõ Gltt Ile Fro Glu Gla Trp Pro Phe .290 29S 300

<210> 4 <211> 299 <212> PRT <213> vírus da esgana canina <400> 4

Mtefc Ala Glu Glu GX.» Ma Tyr His Vai Ser Lys Gly Léu Glu Cy& Leu 15 10 15

Lys: Ala Leu Arg Glu Asn Pro Pro Asp XI® Glu Glu xlô Gin Glu Vai 20 25 30

Ser Ser Leu Arg Aap Glu Thr Cys Asn Fro Gly ©In Glu Asa Gly Thr 35 40 45

Thr Gly M®t Glu Glu Glu Glu. Asp S®r Gin Asn Leu Asp Glu Ser His 50 55 50

Glu Pro Thr Lys Gly Ser Asa Tyr Vai Gly His Vai Pro Gin Asn Asn. 65 70 75 80

Pro Gly Cys Gly Glu Arg Asa Thr Ala Leu Vai Glu Ala Glu Arg Pro 85 90 95

Pro Arg Glu Asp lie' Gin. Fro Gly Fro Gly IX® àrg Cys &sp His Vai 100 105 110

Tyr Asp His s$r Gly Glu Glu Vai Lys Gly Ile Glu Asp Ala Asp Ser 115 120 125

Leu Vai Vai Pro Ala Gly Thr Vai Gly Asa Arg Gly Phe Glu Arg Gly 130 135 140

Glu Gly Ser Leu Asp Asp Ser Thr Glu Asp Ser Gly Glu .Asp Tyr Ser 92 ΡΕ1292615

14 S

'ISO 155

16 G

Glu Gly As» Ala Ser Ser Asa Trp Gly Tyr Ser Phe Gly Leu Lys Pr o 165 170 175

Arg Ala Ma Asp Vai Ser Met Leu Met Glu Glu Glu Leu Ser Ala ISO 185 ISO

Leu I»ôu Arg Thr Ser Arg Asa Vai Gly ile Gin Lys Arg Asp Gly Lys 19S 200 205

Thr Leu Gin Phô Pr o His Aan Pro Glu Gly Lys Thr Arg Asp Pro Glu 210 215 220

Cye Gly Ser Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu Vai Ser Leu Thr Trp 225 230 235 240

Asa

Ser Cys Trp Ile Asp Lys Trp Cys Asa Fro Ile Cys Thr 245 250 2S5

Gin Vai Asa Trp Gly Ile Ile Arg Ala Lys Cys Phe Cys Gly Glu Cys 2ÊO 265 270

Pro Pro Thr Cys Asa Glu Cys Lys Asp Asp Pro Glu Met Gin Thr Arg 275 280 285 va 3. Trp His Ala Thr Pro Ser Gin Asp Leu Lys 230 298

<210> 5 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: etiqueta de epitopo <400> 5 35 43 ccatggctta tccttatgac gtgcctgact atgcc

<210> 6 <211> 43 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 6 cggccatggc agaagagaca ggcacgccac gtaaaaaacg gac 93 ΡΕ1292615

<210> 7 <211> 41 <212> PRT <213> Vírus do Sarampo <400> 7

Leu Gin Ala Ser Ser Thr Oly Leu Gin €ys Tyr Tyr Vai Tyr Asp His 1 S 16 15

Ser Glv Glu Ala Vai Lya Gly He Gin Asp Ala Asp Ser He Met Vai 20 25 20

Gin Ser Gly Leu Asp Gly Asp Ser Thr 35 40

<210> 8 <211> 41 <212> PRT <213> Vírus do sarampo <400> 8

Leu Glu Ala Ser Ser Thr Gly Leu Gin Cys Tyr Tyr Vai Ala Ala Hls 15 10 15

Ser Gly Glu Ala Vai Lys Gly Ile Gin Asp Ala Asp Ser He Pfêt Vai 20 25 30

Gin Ser Gly Leu Asp Gly Asp Ser Thr 35 40

<210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Vírus do sarampo <400> 9

Leu Gin Ala Ser Ser Thr Gly Leu Gin Cys Tyr Tyr Leu Asp Gly Asp 1 5 10 15

Ser Thr

<210> 10 <211> 41 <212> PRT <213> Vírus do sarampo <400> 10 94 ΡΕ1292615

<210> 11 <211> 41 <212> PRT <213> Vírus do sarampo <400> 11

Leu Gin Ala Ser Ser Thr Gly Leu Gin Cys Tyr Tyr Vai Ala Ala Ala l 5 10 is

Ser Gly Glu Ala Vai Lys Gly lie Gin Asp Ala Asp Ser Ile Met Vai 20 25 30

Gin ser Gly Leu Asp Gly Asp Ser Thr 35 40

<210> 12 <211> 80 <212> PRT 213> Vírus do sarampo <400> 12 Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro lie Lys Lys Gly lia Arg Arg Glu 1 $ 10 15 Ile Ser Leu Ile 20 Trp Asa Gly Asp Arg 25 Vai Phe Ile Asp Arg 30 Trp Cys Asn Are híst Cys Ser Lys Vai Thr Leu Gly Thr 11 a Arg Ala Arg Cys 35 40 45 Thr Cys Gly Glu Cys Pro Arg Vai Cys Glu Gin Cys Arg Thr Asp Thr 50 55 €0 Gly Vai Asp Thr Arg Xle Trp Tyr His Asa Leu Pro Glu Ile Pro Glu

65 70 ' 75 SG

<210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Vírus do sarampo <400> 13

Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Xle Lys Lys Gly 1 $ 10

<210> 14 <211> 80 <212> PRT <213> Vírus do sarampo 95 ΡΕ1292615 <4 Ο 0> 14

Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro He Lye Lys Gly Eis Arg Arg Glu. 1 5 10 15

Ile Ser 'Leu Ile Trp As» Gly Asp .Arg Vai Phe Ile Asp· Arg Trp Ala 20 25 30

Asn Pro Ket Ala ser Lys Vai Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala .Arg Cys SS 40 45

Thr Cys Gly Glu Cys Pro Arg Vai Cys Glu Glu Cys Arg Thr Asp Thr SQ 55 m

Gly Vai Asp Thr Arg Ile Trp Tyr Bis Asn Leu Pro Glu Ilê Pro Glu 65 70 75 80

<210> 15 <211> 80 <212> PRT <213> Vírus do sarampo <400> 15

Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu 1 5 10 15 ile Ser Leu Ile Trp As» Gly Asp Arg Vai Phe Ile Asp Arg Tlp cys 20 25 30 As». Pro Met Cys Ser Lys Vai Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala Arg Cys 35 40 45 Thr Ala Gly Glu Ala Pro Arg Vai Cys Glu Gltt Cys Arg Thr Asp Thr 50 55 60 Gly Vftl Asp Thr Arg Ile Trp Tyr Bis Asn Leu Pr© Glu Ile Pro Glu 65 70 75 SÓ

<210> 16 <211> 59 <212> PRT <213> Vírus do sarampo <400> 16

Arg Ala Ser Thr Ser· Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly Bis Arg .Arg Glu 1 ' 5 10 15

Ile Ser Leu Ile Trp Asm Gly Asp Arg Vai Phe Ile Asp Arg Trp Cys 20 25 30 .Ala Arg Cys &sn Pro· Mec Cys Ser Lys Vai Thr Leu Gly Thr Ile Arg 3S 40 45

Thr Cys Gly Glu Cys Pro Arg Vai Cys Glu Gin 50 55 96 ΡΕ1292615

<210> 17 <211> 47 <212> PRT <213> Vírus do sarampo <400> 17

Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro 11« Lys hys Gly Sis Arg Arg Glu 1 $ 10 15 11« S«r Leu Ile Trp Asa Gly Asp Arg Vai Phe lie Asp Arg Trp Cys 20 2S 30

Asn Pro Met Cys Ser Lys Vai Thr Leu Gly Thr lie Arg Ala Arg 35 40 45

<210> 18 <211> 30 <212> PRT <213> Vírus do sarampo <4 00> 18

Arg Ala. Ser Thr Ser Glu Thr Pro lie Lys Lys Gly His Arg Arg Glu 1 5 10 15 11« Ser Leu lie Trp As» Gly 20

Arg Vai Phe Xle Asp Arg 25 30

<210> 19 <211> 23 <212> PRT <213> Vírus do sarampo <400> 19

His Arg Axg Glu 15

Arg Alá Ser Thr Ser Glu Thr Pra Ile Lye Lys i 5 10 11« Ser Leu Ile Trp As» Gly 20

<210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Vírus do sarampo <400> 20

Arg Alã Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile hys Lys Gly His Arg Arg Glu " l $ 10 15 <210> 21 97 ΡΕ1292615 <211 > 9

<212> PRT <213> Vírus do sarampo <400> 21

Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile 1 s

<210> 22 <211> 80 <212> PRT <213> Vírus do sarampo <400> 22 &rg Ale Ser Thr Ser 01« Thr Pro Xle Lys Lys Gly Sis Ma Ala Olu 1 $ 10 15

Ile Ser Leu lie Trp Mn Gly Aep Arg Vai Phe Ile Asp Arg Trp Cys 20 25 10 &sn Prô Met Cys Ser Lys Vai. Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala Arg Cys 35 40 45

Thr Cye Gly Glu Cys Pro Arg Vai Cys Glu Gin Cys Arg Thr Asp Thr 50 55 60

Gly Vai Asp Thr Arg Ile Trp· Tyr His Asa Leu Pro Glu He Pro Glu S5 10 ?5 80

<210> 23 <211> 80 <212> PRT <213> Vírus do sarampo <400> 23

Arg Ala Ser Thr Ser Glu. Thr Fro Ile Lys Lys Gly Bis Asp Asp Glu 1 5 3.0 15 11« Ser Leu Ile Trp Asa Gly Asp Arg Vai Phe Ile Asp Arg Trp Cys 20 25 30 Asa Pro Kefc Cye Ser Lys Vai Thr Leu. Gly Thr Ile Arg Alá Arg Cys 35 40 45 Thr Cys Gly Glu Cys Pro Arg Vai. Cys Glu Gin Cys Arg Thr Asp Thr 50 55 50 Gly Vai Asp Thr Arg Ile Trp Tyr His Asn Leu Pro Glu Ile Pro Glu 55 70 75 80 98 ΡΕ1292615

<210> 24 <211> 71 <212> PRT <213> Vírus do sarampo <400> 24

Arg Ala Ser Thr Ser Slu Thr Pro Ile Lesa Ile Trp Asn <31y Asp Arg s 10 15 Vai Phs Ile ASp ATf Trp cys Asn Pro Met CVS Ser Lys Vai Thr La» 20 2S 30 õiy Thr Ile Arg Ala Arg Cys Thr Cve Gly Glu Cys Pro Arg val Cys 35 40 45 Gin Cys Arg Thr Asp Thr Gly Vai Aip Thr Arg Ile Trp Tyr His 50 S5 60 Leu Psro elw Ile Pro Giu

Lisboa, 29 de Dezembro de 2006

Claims

ΡΕ1292615 1 REIVINDICAÇÕES 1. Vírus de ARN de cadeia simples, de sentido negativo, não segmentado, gerado de forma recombinante e isolado do género Morbillivirus, em que o referido vírus compreende pelo menos uma mutação na sua proteína V de Morbillivirus caracterizada por pelo menos uma mutação ser seleccionada a partir do grupo que consiste nos aminoácidos 113 e 114 da proteína V do vírus do sarampo ou nos aminoácidos de uma proteína V de Morbillivirus correspondente a estes.
2. Morbillivirus da reivindicação 1, em que o vírus é seleccionado a partir do grupo que consiste em vírus do sarampo, vírus da esgana canina, vírus da peste bovina, vírus da peste dos pequenos ruminantes, Morbillivirus do golfinho e vírus da esgana das focas.
3. Morbillivirus da reivindicação 1, em que a mutação é no aminoácido 113 da proteína V do vírus do sarampo ou nos aminoácidos correspondentes a este.
4. Morbillivirus da reivindicação 3, em que a mutação no aminoácido 113 da proteína V do vírus do sarampo ou no aminoácido correspondente a este é de tirosina para alanina.
5. Morbillivirus da reivindicação 1, em que a 2 ΡΕ1292615 mutação é no aminoácido 114 da proteína V do vírus do sarampo ou no aminoácido correspondente a este.
6. Morbillivirus da reivindicação 5, em que a mutação no aminoácido 114 da proteína V do vírus do sarampo ou no aminoácido correspondente a este é de ácido aspártico para alanina.
7. Morbillivirus da reivindicação 1, em que existe uma mutação em ambos os aminoácidos 113 e 114 da proteína V do vírus do sarampo ou em ambos os aminoácidos correspondentes a estes.
8. Morbillivirus da reivindicação 7, em que a mutação no aminoácido 113 da proteína V do vírus do sarampo ou no aminoácido correspondente a este é de tirosina para alanina e a mutação no aminoácido 114 da proteína V do vírus do sarampo ou no aminoácido correspondente a este é de ácido aspártico para alanina.
9. Morbillivirus da reivindicação 2, em que o virus é o virus do sarampo.
10. Vírus do sarampo da reivindicação 9, que compreende ainda uma mutação ou uma deleção de pelo menos uma porção da região carboxi-terminal (C-terminal) compreendendo ou correspondendo aos aminoácidos 231-299 da proteína V do vírus do sarampo. 3 ΡΕ1292615
11. Vírus do sarampo da reivindicação 10, em que a mutação na região C-terminal é em cada um dos aminoácidos 233 e 234.
12. Vírus do sarampo da reivindicação 11, em que a mutação em cada um dos aminoácidos 233 e 234 é de arginina para alanina.
13. Vírus do sarampo da reivindicação 11, em que a mutação em cada um dos aminoácidos 233 e 234 é de arginina para ácido aspártico.
14. Vírus do sarampo da reivindicação 10, em que a deleção é seleccionada a partir do grupo que consiste na deleção dos aminoácidos 232 a 299, 279 a 299, 267 a 299, 250 a 299, 243 a 299 e 236 a 299.
15. Vírus do sarampo da reivindicação 14, em que a deleção é dos aminoácidos 232 a 299.
16. Vírus do sarampo da reivindicação 15, em que a deleção se prolonga para montante da região C-terminal e é dos aminoácidos 229 a 299.
17. Vírus do sarampo da reivindicação 9, que compreende ainda: a) pelo menos uma mutação atenuante na região promotora genómica 3' seleccionada a partir do grupo que consiste no nucleótido 26 (A ->· T) , no nucleótido 42 (A -> T 4 ΡΕ1292615 ou A -► C) e no nucleótido 96 (G -► A) , onde estes nucleótidos são apresentados na cadeia positiva, antigenómica, no sentido da mensagem; e b) pelo menos uma mutação atenuante no gene da ARN-polimerase seleccionada a partir do grupo que consiste nas mudanças de nucleótidos que produzem mudanças num aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste nos residuos 331 (isoleucina -► treonina) , 1409 (alanina -► treonina) , 1624 (treonina -> alanina), 1649 (arginina -> metionina) , 1717 (ácido aspártico -* alanina) , 1936 (histidina ->· tirosina) , 2074 (glutamina -► arginina) e 2114 (arginina -► lisina) .
18. Virus do sarampo da reivindicação 9, que compreende ainda pelo menos uma mutação atenuante seleccionada a partir do grupo que consiste em: a) para o gene N, mudanças de nucleótidos que produzem mudanças num aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste nos resíduos 129 (glutamina -► lisina), 148 (ácido glutâmico -► glicina) e 479 (serina -► treonina); b) para o gene P, mudanças de nucleótidos que produzem mudanças num aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste nos resíduos 225 (ácido glutâmico -► glicina) , 275 (cisteína -► tirosina) e 439 (leucina -► prolina); c) para o gene C, mudanças de nucleótidos que produzem mudanças num aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste nos resíduos 73 (alanina -► valina) , 104 (metionina -► treonina) e 134 (serina -► tirosina) ; e 5 ΡΕ1292615 d) para o sinal de terminação do gene F, a mudança no nucleótido 7243 (T -► C) , onde estes nucleótidos são apresentados na cadeia positiva, antigenómica, no sentido da mensagem.
19. Virus do sarampo da reivindicação 10, que compreende ainda: a) pelo menos uma mutação atenuante na região promotora genómica 3' seleccionada a partir do grupo que consiste no nucleótido 26 (A -► T) , no nucleótido 42 (A -> T ou A -» C) e no nucleótido 96 (G -► A) , onde estes nucleótidos são apresentados na cadeia positiva, antigenómica, no sentido da mensagem; e b) pelo menos uma mutação atenuante no gene da ARN-polimerase seleccionada a partir do grupo que consiste nas mudanças de nucleótidos que produzem mudanças num aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste nos resíduos 331 (isoleucina -► treonina) , 1409 (alanina -► treonina) , 1624 (treonina -► alanina), 1649 (arginina -► metionina) , 1717 (ácido aspártico -* alanina), 1936 (histidina -► tirosina) , 2074 (glutamina -*· arginina) e 2114 (arginina -» lisina) .
20. Vírus do sarampo da reivindicação 10, que compreende ainda pelo menos uma mutação atenuante seleccionada a partir do grupo que consiste em: a) para o gene N, mudanças de nucleótidos que produzem mudanças num aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste nos resíduos 129 (glutamina -► lisina) , 148 (ácido glutâmico -► glicina) e 479 (serina -► treonina); 6 ΡΕ1292615 b) para o gene P, mudanças de nucleótidos que produzem mudanças num aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste nos resíduos 225 (ácido glutâmico -> glicina) , 275 (cisteina -► tirosina) e 439 (leucina ->· prolina); c) para o gene C, mudanças de nucleótidos que produzem mudanças num aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste nos resíduos 73 (alanina -► valina), 104 (metionina -► treonina) e 134 (serina -► tirosina) ; e d) para o sinal de terminação do gene F, a mudança no nucleótido 7243 (T -> C) , onde estes nucleótidos são apresentados na cadeia positiva, antigenómica, no sentido da mensagem.
21. Morbillivirus da reivindicação 2, em que o vírus é o vírus da esgana canina.
22. Vírus da esgana canina da reivindicação 21, que compreende ainda uma mutação ou uma deleção de pelo menos uma porção da região C-terminal correspondente aos aminoácidos 231-299 da proteína V do vírus da esgana canina.
23. Morbillivirus da reivindicação 2, em que o vírus é o vírus da peste bovina.
24. Vírus da peste bovina da reivindicação 23 que compreende ainda uma mutação ou uma deleção de pelo menos uma porção da região C-terminal correspondente aos aminoácidos 231-299 da proteína V do vírus da peste bovina. 7 ΡΕ1292615
25. Morbillivirus da reivindicação 2, em que o virus é o Morbillivirus do golfinho.
26. Morbillivirus do golfinho da reivindicação 25 que compreende ainda uma mutação ou uma deleção de pelo menos uma porção da região C-terminal correspondente aos aminoácidos 231-299 da proteina V do Morbillivirus do golfinho.
27. Composição imunogénica compreendendo um virus isolado de acordo com a reivindicação 1.
28. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 27 na preparação de uma composição para imunização de um indivíduo contra um virus de ARN de cadeia simples, de sentido negativo, não segmentado, do género Morbillivirus.
29. Composição imunogénica da reivindicação 27 que compreende ainda um adjuvante.
30. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 29 na preparação de uma composição para imunização de um indivíduo contra um vírus de ARN de cadeia simples, de sentido negativo, não segmentado, do género Morbillivirus. 8 ΡΕ1292615
31. Método para redução da repressão causada por uma proteína V do género Morbillivirus que compreende a inserção de pelo menos uma mutação na proteína V de Morbillivirus, em que a referida mutação é seleccionada a partir do grupo que consiste na mutação dos aminoácidos 113 e 114 da proteína V do vírus do sarampo ou dos aminoácidos de uma proteína V de Morbillivirus correspondentes a estes.
32. Sequência nucleotídica isolada codificando uma proteína V de Morbillivirus que foi modificada através da inserção de pelo menos uma mutação na proteína V de Morbillivirus, em que a referida mutação é seleccionada a partir do grupo que consiste na mutação dos aminoácidos 113 e 114 da proteína V do vírus do sarampo ou dos aminoácidos de uma proteína V de Morbillivirus correspondentes a estes.
33. Composição que compreende: i) um vector de transcrição compreendendo uma molécula de ácido nucleico isolada codificando um genoma ou antigenoma de um Morbillivirus, em que a porção da molécula de ácido nucleico isolada que codifica a proteína V é a sequência nucleotídica da reivindicação 32, e ii) pelo menos um vector de expressão que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucleico isolada codificando as proteínas de acção em trans N, P e L necessárias para encapsidação, transcrição e replicação, através da qual após expressão é produzido um Morbillivirus infeccioso. 9 ΡΕ1292615 Morbillivirus infecção ou menos os dois das células co-expressão Morbillivirus
34. Método para produção de um infeccioso que compreende a transformação, transfecção de células hospedeiras com pelo vectores da reivindicação 33 e cultura hospedeiras sob condições que permitam a destes vectores de forma produzir o infeccioso. Lisboa, 29 de Dezembro de 2006