CN118139982A - 表达apmv hn和f蛋白的嵌合新城疫病毒 - Google Patents
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Abstract
在一个方面，本文描述了重组新城疫病毒(“NDV”)，所述重组NDV包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码除NDV以外的禽副粘病毒(APMV)的所述HN蛋白或所述非NDV‑APMV HN蛋白的变体的核苷酸序列，以及编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码除NDV以外的APMV的所述F蛋白或所述非NDV‑APMV F蛋白的变体的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述包装的基因组还包含转基因，所述转基因包含编码抗原的核苷酸序列。本文还描述了包含这种重组NDV的组合物以及这种重组NDV在受试者中诱导免疫反应的用途。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2022年1月24日提交的美国临时申请号63/302,434和2021年4月26日提交的美国临时申请号63/179,994的权益，这两份申请各自的公开内容全文以引用方式并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院颁发的AI097092号政府资助下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
序列表
本申请以引用方式按文本文件的形式并入了与本申请一起提交的序列表，该文本文件名为“06923-382-228_SEQ_LISTING.txt”，创建于2022年4月22日，并且大小为147,499字节。
技术领域
在一个方面，本文描述了重组新城疫病毒(“NDV”)，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码除NDV以外的禽副粘病毒(APMV)的HN蛋白或非NDV-APMV HN蛋白的变体的核苷酸序列，以及编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码除NDV以外的APMV的F蛋白或非NDV-APMV F蛋白的变体的核苷酸序列。在一些实施方案中，包装的基因组还包含转基因，该转基因包含编码抗原的核苷酸序列。本文还描述了包含这种重组NDV的组合物以及这种重组NDV在受试者中诱导免疫反应的用途。
背景技术
新城疫病毒(NDV)是副粘病毒(Paramyxoviridae)科禽腮腺炎病毒(Avulavirinae)亚科的一员，已被证明可感染许多禽类物种(Alexander,DJ(1988).Newcastle disease,Newcastle disease virus--an avian paramyxovirus.KluwerAcademic Publishers:Dordrecht,The Netherlands.第1-22页)。NDV拥有负义方向的单链RNA基因组，并且不与宿主基因组或其他病毒发生重组(Alexander,DJ(1988).Newcastledisease,Newcastle disease virus--an avian paramyxovirus.Kluwer AcademicPublishers:Dordrecht,The Netherlands.第1-22页)。基因组RNA含有顺序为3'-NP-P-M-F-HN-L-5’的基因，下面将进一步详细描述。NDV通过RNA编辑产生的替代mRNA，从P基因中产生另外两种蛋白V和W。基因组RNA在3’端也含有前导序列。
病毒粒子的结构成分包括病毒包膜，它是一种来源于细胞质膜的脂质双层。血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白从包膜突出，使病毒同时含有血凝素(例如，受体结合/促融合)和神经氨酸酶活性。融合糖蛋白(F)也与病毒膜相互作用，其首先作为无活性的前体产生，然后翻译后裂解产生两个二硫键连接的多肽。活性F蛋白通过促进病毒包膜与宿主细胞质膜的融合，参与NDV向宿主细胞的渗透。基质蛋白(M)参与病毒组装，并与病毒膜和核衣壳蛋白相互作用。
核衣壳的主要蛋白亚基是赋予衣壳螺旋对称性的核衣壳蛋白(NP)。与核衣壳相关的是P和L蛋白。磷蛋白(P)会发生磷酸化，它被认为在转录过程中起着调节作用，还可能参与甲基化、磷酸化和多聚腺苷酸化。编码RNA依赖的RNA聚合酶的L基因，与P蛋白一起是病毒RNA合成所必需的。L蛋白占病毒基因组的编码容量的近一半，它是最大的病毒蛋白，并在转录和复制中起着重要作用。V蛋白已被证明能抑制干扰素-α，并能促进NDV的毒力(Huang等人,(2003).Newcastledisease virus V protein is associated with viralpathogenesis and functions as an Alpha Interferon Antagonist.Journal ofVirology 77:8676-8685)。
发明内容
在一个方面，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV APMV HN蛋白编码序列之前和之后；以及(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV F蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV APMV F蛋白编码序列之前和之后。在具体实施方案中，术语“非NDV APMV”用于指代除NDV以外的APMV。在具体实施方案中，非NDV APMV F蛋白和非NDV APMV HN蛋白在免疫学上分别不同于NDF F蛋白和NDV HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白和非NDV APMV HN蛋白来自与NDV不同的属。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白和非APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科成员而不是NDV的F蛋白和HN蛋白。在一些实施方案中，非NDVAPMV F蛋白和非APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和偏禽腮腺炎病毒(metaavulavirus)属成员的F蛋白和HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白和非APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和副禽腮腺炎病毒(paraavulavirus)属成员的F蛋白和HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白和非APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和正禽腮腺炎病毒(orthoavulavirus)属成员而不是NDV的F蛋白和HN蛋白。在一些实施方案中，NDV基因组包含NDV LaSota株系的NP基因、P基因、M基因和L基因。
在一些实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元，以及(5)SEQ ID NO:1-14中任一者的核苷酸序列或与SEQ ID NO:1-14中任一者的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元，以及(5)对应于SEQ ID NO:1-14中任一者的核苷酸序列的负义RNA序列或对应于与SEQ ID NO:1-14中任一者的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列的负义RNA序列。在一些实施方案中，NDV核衣壳蛋白、NDV磷蛋白、NDV基质蛋白和NDV大聚合酶属于NDV LaSota株系。
在一些实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列或没有GFP编码序列的SEQ ID NO:44。在一些实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含与SEQ ID NO:44的核苷酸序列或没有GFP编码序列的SEQ ID NO:44至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含SEQ ID NO:45的核苷酸序列或没有GFP编码序列的SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含与SEQ ID NO:45的核苷酸序列或没有GFP编码序列的SEQ ID NO:45至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含对应于SEQ IDNO:44的核苷酸序列或没有GFP编码序列的SEQ ID NO:44的负义RNA序列。在一些实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含对应于与SEQ ID NO:44的核苷酸序列或没有GFP编码序列的SEQ ID NO:44至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列的负义RNA序列。在一些实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含对应于SEQ ID NO:45的核苷酸序列或没有GFP编码序列的SEQ ID NO:45的负义RNA序列。在一些实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含对应于与SEQ ID NO:45的核苷酸序列或没有GFP编码序列的SEQ ID NO:45至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列的负义RNA序列。
在一些实施方案中，该核酸序列还包含转基因。在一些实施方案中，该核酸序列还包含编码抗原的转基因。在一些实施方案中，该抗原是病毒、细菌、真菌或原生动物抗原。在一些实施方案中，该抗原包含SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段。在一些实施方案中，该片段包含SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合结构域。在一些实施方案中，该片段包含SARS-CoV-2刺突蛋白的胞外结构域。在一些实施方案中，该抗原包括MERS-CoV抗原、呼吸道合胞病毒抗原、人类偏肺病毒抗原、拉沙病毒抗原、埃博拉病毒抗原或尼帕病毒抗原。在一些实施方案中，该抗原是癌或肿瘤抗原。
在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白和非NDV APMV HN蛋白在免疫学上分别不同于NDF F蛋白和NDV HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN是APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75、APMV17/Antarctica/107/13、APMV9/duck/New York/22/78、APMV7/Dove/Tennessee/4/75、APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17、APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77、APMV11/common_snipe/France/100212/10、APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12、APMV8/Goose/Delaware/1053/76、APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56、APMV3/Turkey/Wisconsin/68、APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05、APMV5/budgerigar/Japan/TI/75或APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F是APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75、APMV17/Antarctica/107/13、APMV9/duck/New York/22/78、APMV7/Dove/Tennessee/4/75、APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17、APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77、APMV11/common_snipe/France/100212/10、APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12、APMV8/Goose/Delaware/1053/76、APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56、APMV3/Turkey/Wisconsin/68、APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05、APMV5/budgerigar/Japan/TI/75或APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07的F蛋白。
在一些实施方案中，该核酸序列是cDNA序列。在一些实施方案中，该核酸序列是负义链RNA序列。
在一些实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含本文所述的核酸序列。在一些实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含本文所述的非APMV F蛋白、本文所述的非APMV-HN蛋白或者本文所述的非APMV F蛋白和本文所述的非APMV-HN蛋白。在一些实施方案中，非APMV F蛋白由SEQ ID No:1-14中任一者的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，非APMV F蛋白由与SEQ ID No:1-14中任一者的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，非APMV HN蛋白由SEQ ID No:1-14中任一者的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，非APMV HN蛋白由与SEQ ID No:1-14中任一者的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列编码。
在另一个方面，本文提供了重组新城疫病毒(NDV)，该重组NDV包含包装的基因组，其中NDV F蛋白的编码序列已被替换为除NDV以外的禽副粘病毒(APMV)的F蛋白(非NDVAPMV F蛋白)或其变体的编码序列，并且/或者NDV HN蛋白的编码序列已被替换为除NDV以外的APMV的HN蛋白(非NDV APMV HN蛋白)或其变体的编码序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMVHN蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV AMPV HN蛋白编码序列之前和之后；以及(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV F蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV AMPV F蛋白编码序列之前和之后。在具体实施方案中，位于非NDVAPMV HN蛋白编码序列之前和之后的NDV基因间区是NDV HN基因间区。在具体实施方案中，位于非NDV APMV F蛋白编码序列之前和之后的NDV基因间区是NDV F基因间区。在具体实施方案中，非NDV APMV F蛋白和非NDV APMV HN蛋白在免疫学上分别不同于NDF F蛋白和NDVHN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白和非NDV APMV HN蛋白来自与NDV不同的属。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白和非APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科成员而不是NDV的F蛋白和HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白和非APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和偏禽腮腺炎病毒属成员的F蛋白和HN蛋白。在一些实施方案中，非NDVAPMV F蛋白和非APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和副禽腮腺炎病毒属成员的F蛋白和HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白和非APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和正禽腮腺炎病毒属成员而不是NDV的F蛋白和HN蛋白。在具体实施方案中，NDV基因组包含NDV LaSota的NP基因、P基因、M基因和L基因。在某些实施方案中，包装的基因组还包含转基因。在一些实施方案中，该转基因包含编码病毒、细菌、真菌或原生动物抗原的核苷酸序列。在具体实施方案中，该转基因包含编码SARS-CoV-2抗原的核苷酸序列。在具体实施方案中，SARS-CoV-2抗原是SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段。在具体实施方案中，SARS-CoV-2抗原包含SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段。在具体实施方案中，该片段包含SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合结构域。在一些实施方案中，SARS-CoV-2刺突蛋白的片段是SARS-CoV-2刺突蛋白的胞外结构域。在具体实施方案中，该转基因包含编码MERS-CoV抗原的核苷酸序列。在具体实施方案中，该转基因包含编码呼吸道合胞病毒抗原或人类偏肺病毒抗原的核苷酸序列。在具体实施方案中，该转基因包含编码拉沙病毒抗原、埃博拉病毒抗原或尼帕病毒抗原的核苷酸序列。在具体实施方案中，该转基因包含编码癌或肿瘤抗原的核苷酸序列。
在某些实施方案中，如果针对NDV F蛋白的抗体不与非NDV APMV F蛋白或其变体交叉反应，则非NDV APMV F蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV F蛋白。在一些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDV F蛋白的抗体与非NDVAPMV F蛋白或其变体的结合亲和力是与NDV F蛋白的结合亲和力的2倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更低，则非NDV APMV F蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV F蛋白。在某些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDV F蛋白的抗体与非NDVAPMV F蛋白或其变体的结合亲和力是与NDV F蛋白的结合亲和力的0.5log、1log、1.5log、2log、2.5log、3log或更低，则非NDV APMV F蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV F蛋白。在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或如本文所述的病毒中和测定法所评估，抗NDV F抗体不能实质上抑制表达非NDV APMV F蛋白或其变体的NDV的复制，则非NDV APMV F蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV F蛋白。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，抗NDV F抗体将表达非NDV APMV F蛋白或其变体的NDV的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log，则非NDV APMV F蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV F蛋白。
在某些实施方案中，如果针对NDV HN蛋白的抗体不与非NDV APMV HN蛋白或其变体交叉反应，则非NDV APMV HN蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在一些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDV HN蛋白的抗体与非NDV APMV HN蛋白或其变体的结合亲和力是与NDV HN蛋白的结合亲和力的2倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更低，则非NDV APMV HN蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在某些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDV HN蛋白的抗体与非NDV APMV HN蛋白或其变体的结合亲和力是与NDV HN蛋白的结合亲和力的0.5log、1log、1.5log、2log、2.5log、3log或更低，则非NDV APMV HN蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法所评估，抗NDV HN抗体不能实质上抑制表达非NDV APMV HN蛋白或其变体的NDV的复制，则非NDV APMVHN蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，抗NDV HN抗体将表达非NDV APMV HN蛋白或其变体的NDV的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log，则非NDV APMV HN蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV HN蛋白。
在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是来自与NDV不同的属的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科成员而不是NDV的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和偏禽腮腺炎病毒属成员的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和副禽腮腺炎病毒属成员的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和正禽腮腺炎病毒属成员而不是NDV的HN蛋白。
在具体实施方案中，非NDV APMV HN是APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75、APMV17/Antarctica/107/13、APMV9/duck/New York/22/78、APMV7/Dove/Tennessee/4/75、APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17、APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77、APMV11/common_snipe/France/100212/10、APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12、APMV8/Goose/Delaware/1053/76、APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56、APMV3/Turkey/Wisconsin/68、APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05、APMV5/budgerigar/Japan/TI/75或APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07的HN蛋白。在具体实施方案中，非NDV APMV F是APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75、APMV17/Antarctica/107/13、APMV9/duck/New York/22/78、APMV7/Dove/Tennessee/4/75、APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17、APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77、APMV11/common_snipe/France/100212/10、APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12、APMV8/Goose/Delaware/1053/76、APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56、APMV3/Turkey/Wisconsin/68、APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05、APMV5/budgerigar/Japan/TI/75或APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07的F蛋白。在具体实施方案中，非NDV APMV F蛋白和非NDV AMPV HN蛋白来自或来源于相同的APMV株系。在其他实施方案中，非NDV APMV F蛋白和非NDV AMPV HN蛋白来自或来源于不同的APMV株系。
在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组新城疫病毒(NDV)，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列被替换为包含从SEQ ID NO:1-14中任一者所示的cDNA序列转录的负义RNA序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组新城疫病毒(NDV)，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列被替换为包含从与SEQ ID NO:1-14中任一者所示的cDNA序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的cDNA序列转录的负义RNA序列的核苷酸序列。在具体实施方案中，NDV基因组包含NDV LaSota的NP基因、P基因、M基因和L基因。在某些实施方案中，包装的基因组还包含转基因。在一些实施方案中，该转基因包含编码病毒、细菌、真菌或原生动物抗原的核苷酸序列。在具体实施方案中，该转基因包含编码SARS-CoV-2抗原的核苷酸序列。在具体实施方案中，SARS-CoV-2抗原是SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段。在具体实施方案中，SARS-CoV-2抗原包含SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段。在具体实施方案中，该片段包含SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合结构域。在一些实施方案中，SARS-CoV-2刺突蛋白的片段是SARS-CoV-2刺突蛋白的胞外结构域。在具体实施方案中，该转基因包含编码MERS-CoV抗原的核苷酸序列。在具体实施方案中，该转基因包含编码呼吸道合胞病毒抗原或人类偏肺病毒抗原的核苷酸序列。在具体实施方案中，该转基因包含编码拉沙病毒抗原、埃博拉病毒抗原或尼帕病毒抗原的核苷酸序列。在具体实施方案中，该转基因包含编码癌或肿瘤抗原的核苷酸序列。
在另一个方面，本文提供了一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含本文所述的重组NDV。免疫原性组合物还可包含药学上可接受的载剂。该组合物可包含104至1012PFU的本文所述的重组NDV。
在另一个方面，本文提供了一种用于诱导对抗原的免疫反应的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或本文所述的免疫原性组合物。在另一个方面，本文提供了一种用于预防传染病的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或本文所述的免疫原性组合物。在另一个方面，本文提供了一种用于使受试者免疫以抵抗传染病的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或本文所述的免疫原性组合物。在另一个方面，本文提供了一种用于治疗癌症的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或本文所述的免疫原性组合物。在一些实施方案中，向受试者鼻内施用重组NDV或组合物。在某些实施方案中，该方法还包括施用包含包装的基因组的第二重组NDV，其中第二重组NDV的包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV AMPV HN蛋白编码序列之前和之后；以及(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMVF蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV AMPV F蛋白编码序列之前和之后，并且其中第二重组NDV在免疫学上不同于向受试者施用的第一重组NDV。在具体实施方案中，位于非NDV APMV HN蛋白编码序列之前和之后的NDV基因间区是NDV HN基因间区。在具体实施方案中，位于非NDV APMV F蛋白编码序列之前和之后的NDV基因间区是NDV F基因间区。在一些实施方案中，向先前已接种疫苗或施用了NDV组合物(例如，疫苗)的受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物。在某些实施方案中，向先前已接种疫苗或施用了基于APMV的组合物(例如，疫苗)的受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物。在一些实施方案中，向先前已接种疫苗或施用了NDV组合物(例如，疫苗)和基于APMV的组合物(例如，疫苗)的受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物。
在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述的病毒中和测定法所评估，第一重组NDV和第二重组NDV不能诱导实质上抑制另一者的复制的抗体，则第一重组NDV在免疫学上不同于第二重组NDV。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述的病毒中和测定法，第一重组NDV和第二重组NDV诱导将彼此的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log的抗体，则第一重组NDV被视为在免疫学上不同于第二重组NDV。
在另一个方面，本文提供了一种试剂盒，该试剂盒包含本文所述的重组NDV。在另一个方面，本文提供了一种体外或离体细胞，其包含重组NDV。在另一个方面，本文提供了一种细胞系或鸡孵化蛋，其包含本文所述的重组NDV。
在另一个方面，本文提供了一种试剂盒，该试剂盒包含核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV APMV HN蛋白编码序列之前和之后；以及(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV F蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV APMV F蛋白编码序列之前和之后。在一些实施方案中，NDV基因组包含NDV LaSota株系的NP基因、P基因、M基因和L基因。
在一些实施方案中，本文提供了一种试剂盒，该试剂盒包含核酸序列，该核酸序列包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元，以及(5)SEQ ID NO:1-14中任一者的核苷酸序列或与SEQ ID NO:1-14中任一者的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文提供了一种试剂盒，该试剂盒包含核酸序列，该核酸序列包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元，以及(5)对应于SEQ ID NO:1-14中任一者的核苷酸序列的负义RNA序列或对应于与SEQ ID NO:1-14中任一者的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列的负义RNA序列。在一些实施方案中，NDV核衣壳蛋白、NDV磷蛋白、NDV基质蛋白和NDV大聚合酶属于NDV LaSota株系。
在另一个方面，本文提供了一种用于繁殖本文所述的重组NDV的方法，该方法包括培养包含本文所述的重组NDV的细胞或孵化蛋。在一些实施方案中，该方法还包括从蛋或孵化蛋中分离重组NDV。
3.1术语
如本文所用，术语“约”或“大约”在与数字结合使用时是指在引用数字的的1％、5％或10％内的任何数字。
如本文所用，术语“抗体”是指含有抗原结合位点(例如，免疫球蛋白)的分子。抗体包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、多克隆抗体、单域抗体、驼源化抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫键连接的双特异性Fv(sdFv)、胞内抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如抗体的抗Id和抗抗Id抗体)以及上述任一者的表位结合片段。具体而言，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
如本文所用，术语“异源的”在NDV的上下文中是指自然界中未发现与天然存在的NDV相关联(例如，由其基因组编码、表达，或两者兼有)的实体。在一个具体实施方案中，异源序列编码一种未发现与天然存在的NDV相关联的蛋白质。
如本文所用，术语“异源的”在核酸或核苷酸序列或氨基酸序列的上下文中是指自然界中未发现与第一核酸或核苷酸序列或第一氨基酸序列相关联的第二核酸或核苷酸序列或第二氨基酸序列。
如本文所用，短语“IFN缺陷型系统”或“IFN缺陷型底物”指这样的系统(例如，细胞、细胞系和动物诸如小鼠、鸡、火鸡、兔、大鼠、马等)，其不产生一种、两种或更多种类型的干扰素(IFN)，或不产生任何类型的IFN，或产生低水平的一种、两种或更多种类型的IFN，或产生低水平的任何IFN(即，在相同条件下，当与能产生IFN(IFN-competent)的系统相比时，任何IFN表达降低5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％或更多)，对一种、两种或更多种类型的IFN不应答或以较低效率应答，或对任何类型的IFN不应答，对一种、两种或更多种类型的IFN具有延迟的应答，和/或由一种、两种或更多种类型的IFN诱导的或由任何类型的IFN诱导的抗病毒基因的活性有缺陷，或它们的任何组合。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”可互换使用。如本文所用，术语“受试者”是指动物。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，包括非灵长类动物(例如，骆驼、驴、斑马、牛、马、马、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类动物(例如，猴、黑猩猩和人类)。在一些实施方案中，受试者是非人哺乳动物。在某些实施方案中，受试者是宠物(例如，狗或猫)或农场动物(例如，马、猪或奶牛)。在具体实施方案中，受试者是人类。在其他具体实施方案中，受试者是牛。在某些实施方案中，哺乳动物(，人类)为4至6月龄、6至12月龄、1至5岁、5至10岁、10至15岁、15至20岁、20至25岁、25至30岁、30至35岁、35至40岁、40至45岁、45至50岁、50至55岁、55至60岁、60至65岁、65至70岁、70至75岁、75至80岁、80至85岁、85至90岁、90至95岁，或95至100岁。在具体实施方案中，受试者是非禽类的动物。
如本文所用，术语“联合”在向受试者施用(a)疗法的上下文中是指使用超过一种疗法。术语“联合”的使用不限制向受试者施用疗法的顺序。可在向受试者施用第二疗法之前(例如，之前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或之后(例如，之后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用第一疗法。例如，可在施用另一种疗法之前(例如，之前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或之后(例如，之后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用本文所述的重组NDV。
如本文所用，术语“野生型”在病毒核苷酸和氨基酸序列的上下文中是指自然界中发现的病毒株的核苷酸和氨基酸序列。具体而言，本文描述为野生型的序列是已在公共数据库中报告为来自天然病毒分离株的序列的序列。
附图说明
图1.用于构建重组嵌合NDV-APMV载体的策略。与新城疫病毒(NDV或APMV-1)相对应的序列以白色方框示出，并且与抗原性不同的禽副粘病毒(例如，APMV-4)相对应的序列以灰色方框示出。
图2A-2C.受体质粒pNDV-F-HNless的生成。拯救质粒pNDV-LaSota(图2A)的F和HN基因被含有2个独特限制性位点Pmel和NruI的短序列替换而生成受体质粒pNDV-F-HNless(图2B)。图2C示出了功能性拯救质粒，其中来自NDV的F和HN基因被重新插入到图2B的受体质粒中而生成功能性拯救质粒pNDV-LaSota。图2A-2C未按比例绘制。
图3A-3B.最大似然系统发育树。具有全基因组序列的所有禽副粘病毒(不包括NDV)的F和HN氨基酸序列的系统发育树分别示出在图3A和图3B中。被选择用于序列合成的14种病毒的F和HN蛋白以粗体显示。
图4A-4C.拯救质粒嵌合NDV-APMV的构建。使用为F和HN开放阅读框侧翼的NDV序列的无缝重建而设计的引物，通过PCR扩增含有来自不同APMV的F和HN编码序列及NDV非编码侧翼区的合成插入片段。图4A中的白色方框表示NDV非编码侧翼区，并且灰色方框表示来自不同APMV的F和HN编码序列(未按比例绘制)。图4B示出了受体质粒pNDV-F-HNless，并且图4C示出了拯救质粒嵌合NDV-APMV，其中合成插入片段被插入在受体质粒pNDV-F-HNless的M和L基因之间。
图5A-5H.通过qPCR对病毒复制和促炎基因的转录分析。以MOI为1感染癌细胞或模拟感染癌细胞，并在感染后8小时和16小时对癌细胞进行RNA提取。图5A-5D，按照N蛋白的mRNA表达来测量的病毒复制水平。条形表示三个独立生物样品的平均值±SD，按LS-L289A、APMV-4和rAPMV-4的顺序示出。图5E-5H，示出与图5A-5D相对应的每个独立生物样品(1、2、3)的IFN-b、ISG(STAT1、ISG15、MX、OAS-1)和促炎细胞因子(IL-6和IL-1B)的诱导水平的热图。每个单独基因的表达水平被计算为相对于模拟感染细胞的诱导倍数的Log10。双因素方差分析：*p<0.05；***p<0.001；****p<0.0001；ns：不显著。
图6A-6B.图6A描绘了禽副粘病毒的禽腮腺炎病毒亚科的系统发育树。该图改编自Rima等人,2019,J.Gen.Virol.100(12):1593-1594。图6B是示意图，其描绘了从NDV基因组序列中去除NDV F蛋白和NDV HN蛋白编码序列，将远缘禽副粘病毒的F蛋白和HN蛋白编码序列插入到NDV F蛋白和NDV HN蛋白编码序列已被去除的NDV基因组中，以及将转基因诸如编码绿色荧光蛋白(GFP)的转基因插入到NDV基因组中。
图7描绘了APMV-2和APMV-3在系统发育树中的位置以及NDV基因组的示意图，该NDV基因组具有编码GFP的转基因，并且NDV F蛋白和NDV HN蛋白编码序列被替换为APMV-2F蛋白和HN蛋白编码序列(嵌合NDV-APMV-2-GFP)或APMV-3F蛋白和HN蛋白编码序列(嵌合NDV-APMV-3-GFP)。还描绘了具有编码GFP的转基因的NDV基因组(NDV-GFP)的示意图。
图8A-8B.图8A示出了感染了嵌合NDV-APMV2-GFP和嵌合NDV-APMV3-GFP的鸡胚成纤维细胞(CEF)的GFP表达。图8B示出了使用针对野生型(WT)NDV病毒培养的兔血清进行的血凝抑制(HI)测定法的结果。与针对NDV-GFP的活性相比，针对嵌合NDV-APMV-2-GFP和嵌合NDV-APMV-3-GFP的兔血清HI活性显著降低。
具体实施方式
5.1重组新城疫病毒
在一个方面，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含第5.1.1节中描述的核酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含第5.1.1节中描述的核酸序列。
在另一个方面，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码除NDV以外的禽副粘病毒(APMV)的HN蛋白或非NDV-APMV HN蛋白的变体的核苷酸序列，或者编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码除NDV以外的APMV的F蛋白或非NDV-APMV F蛋白的变体的核苷酸序列。在本文的某些情况下，术语“非NDV APMV”用于指代除NDV以外的APMV。在一个实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白或其变体的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV APMV HN蛋白编码序列或变体HN蛋白编码序列之前和之后；或者(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV F蛋白或其变体的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV AMPV F蛋白编码序列或变体F蛋白编码序列之前和之后。在具体实施方案中，位于非NDV APMV HN蛋白编码序列之前和之后的NDV基因间区是NDV HN基因间区。在具体实施方案中，位于非NDV APMV F蛋白编码序列之前和之后的NDV基因间区是NDV F基因间区。在另一个实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV HN蛋白或其变体的核苷酸序列的转录单元；或者(2)编码NDV F蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV F蛋白或其变体的核苷酸序列的转录单元。在具体实施方案中，非NDV APMV F蛋白或其变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV APMV HN蛋白或其变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN蛋白的一种或多种或全部功能。NDV基因组通常包含N基因、P基因、L基因、M基因、HN基因和F基因。
在另一个实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV APMVHN蛋白编码序列之前和之后；或者(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDVAPMV F蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV APMV F蛋白编码序列之前和之后。在具体实施方案中，位于非NDV APMV HN蛋白编码序列之前和之后的NDV基因间区是NDV HN基因间区。在具体实施方案中，位于非NDV APMV F蛋白编码序列之前和之后的NDV基因间区是NDV F基因间区。在另一个实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV HN蛋白的核苷酸序列的转录单元；或者(2)编码NDV F蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV F蛋白的核苷酸序列的转录单元。在具体实施方案中，非NDV APMV F蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV APMV HN蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN蛋白的一种或多种或全部功能。
在另一个实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白的变体的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于变体HN蛋白编码序列之前和之后；或者(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDVAPMV F蛋白的变体的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于变体F蛋白编码序列之前和之后。在具体实施方案中，位于非NDV APMV HN蛋白编码序列的变体之前和之后的NDV基因间区是NDV HN基因间区。在具体实施方案中，位于非NDV APMV F蛋白编码序列的变体之前和之后的NDV基因间区是NDV F基因间区。在另一个实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV HN蛋白的变体的核苷酸序列的转录单元；或者(2)编码NDV F蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV F蛋白的变体的核苷酸序列的转录单元。在具体实施方案中，非NDV F蛋白的变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV HN蛋白的变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN蛋白的一种或多种或全部功能。
在另一个方面，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码除NDV以外的禽副粘病毒(APMV)的HN蛋白或非NDV-APMV HN蛋白的变体的核苷酸序列，以及编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码除NDV以外的APMV的F蛋白或非NDV-APMV F蛋白的变体的核苷酸序列。在一个实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白或其变体的核苷酸序列；以及(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV F蛋白或其变体的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV APMV HN和F蛋白编码序列或变体HN和F蛋白编码序列之前、之间和之后。在具体实施方案中，位于编码非NDV APMV HN蛋白或其变体的核苷酸序列之前和之后的NDV基因间区是NDV HN基因间区。在具体实施方案中，位于编码非NDVAPMV F蛋白或其变体的核苷酸序列之前和之后的NDV基因间区是NDV F基因间区。在另一个实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV HN蛋白或其变体的核苷酸序列的转录单元；以及(2)编码NDV F蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV F蛋白或其变体的核苷酸序列的转录单元。在具体实施方案中，非NDV F蛋白或其变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV HN蛋白或其变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN蛋白的一种或多种或全部功能。
在另一个实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白的核苷酸序列；以及(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV F蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV APMVHN和F蛋白编码序列之前、之间和之后。在具体实施方案中，位于编码非NDV APMV HN蛋白的核苷酸序列之前和之后的NDV基因间区是NDV HN基因间区。在具体实施方案中，位于编码非NDV APMV F蛋白的核苷酸序列之前和之后的NDV基因间区是NDV F基因间区。在另一个实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV HN蛋白的核苷酸序列的转录单元；以及(2)编码NDV F蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV F蛋白的核苷酸序列的转录单元。在具体实施方案中，非NDVAPMV HN和F蛋白在自然界中存在于相同APMV株系中。例如，非NDV APMV HN和F蛋白在自然界中可能都存在于相同APMV-15株系中。在其他实施方案中，非NDV APMV HN和F蛋白在自然界中存在于不同APMV株系中。在具体实施方案中，非NDV F蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV HN蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN蛋白的一种或多种或全部功能。
在另一个实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白的变体的核苷酸序列；以及(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV F蛋白的变体的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于变体HN和F蛋白编码序列之前、之间和之后。在具体实施方案中，位于编码非NDV APMV HN蛋白的变体的核苷酸序列之前和之后的NDV基因间区是NDV HN基因间区。在具体实施方案中，位于编码非NDV APMV F蛋白的变体的核苷酸序列之前和之后的NDV基因间区是NDV F基因间区。在另一个实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV HN蛋白的变体的核苷酸序列的转录单元；以及(2)编码NDV F蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV F蛋白的变体的核苷酸序列的转录单元。在具体实施方案中，变体HN和F蛋白来源于相同APMV株系。例如，变体HN和F蛋白可能都来源于相同APMV-15株系。在其他实施方案中，变体HN和F蛋白来源于不同APMV株系。在具体实施方案中，非NDV F蛋白的变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV HN蛋白的变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN蛋白的一种或多种或全部功能。
在另一个方面，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码嵌合HN蛋白的核苷酸序列，或者编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码嵌合F蛋白的核苷酸序列。关于用于产生嵌合F或嵌合HN蛋白的方法，参见例如Park等人,2006,PNAS,2006年5月23日,103(21)8203-8208、国际专利申请号WO 2007/064802和美国专利号9,387,242B2。在一个实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码嵌合HN蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于嵌合HN蛋白编码序列之前和之后；或者(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码嵌合F蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于嵌合F蛋白编码序列的之前和之后。在具体实施方案中，位于编码嵌合HN蛋白的核苷酸序列之前和之后的NDV基因间区是NDV HN基因间区。在具体实施方案中，位于编码嵌合F蛋白的核苷酸序列之前和之后的NDV基因间区是NDV F基因间区。在另一个实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的转录单元已被替换为包含编码嵌合HN蛋白的核苷酸序列的转录单元；或者(2)编码NDV F蛋白的转录单元已被替换为包含编码嵌合F蛋白的核苷酸序列的转录单元。在具体实施方案中，嵌合HN蛋白包含非NDV APMV HN蛋白胞外结构域及NDV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域。换句话讲，NDV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域替换了非NDV APMV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域，因此嵌合HN蛋白不包括非NDV APMV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域。可使用本领域技术人员已知的技术来确定非NDV APMV HN蛋白和NDV HN蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。例如，可使用公开的信息、GenBank或网址诸如VIPR病毒病原体网址(www.viprbrc.org)、DTU生物信息学领域网址(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)或可用于确定跨膜结构域的程序来确定非NDV HN蛋白和NDV HN蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合HN蛋白包含非NDV APMV HN蛋白的变体的胞外结构域及NDV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合HN蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，嵌合F蛋白包含非NDV APMV F蛋白胞外结构域及NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。换句话讲，NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域替换了非NDV APMV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域，因此嵌合F蛋白不包括非NDV APMV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。可使用本领域技术人员已知的技术来确定非NDV APMV F蛋白和NDV F蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。例如，可使用公开的信息、GenBank或网址诸如VIPR病毒病原体网址(www.viprbrc.org)、DTU生物信息学领域网址(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)或可用于确定跨膜结构域的程序来确定非NDV F蛋白和NDV F蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合F蛋白包含非NDV APMV F蛋白的变体的胞外结构域及NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合F蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。
在另一个方面，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码嵌合HN蛋白的核苷酸序列，以及编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码嵌合F蛋白的核苷酸序列。在一个实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码嵌合HN蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于嵌合HN蛋白编码序列之前和之后；以及(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码嵌合F蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于嵌合F蛋白编码序列的之前和之后。在具体实施方案中，位于编码嵌合HN蛋白的核苷酸序列之前和之后的NDV基因间区是NDV HN基因间区。在具体实施方案中，位于编码嵌合F蛋白的核苷酸序列之前和之后的NDV基因间区是NDV F基因间区。在另一个实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的转录单元已被替换为包含编码嵌合HN蛋白的核苷酸序列的转录单元；以及(2)编码NDV F蛋白的转录单元已被替换为包含编码嵌合F蛋白的核苷酸序列的转录单元。在具体实施方案中，嵌合HN蛋白包含非NDV APMV HN蛋白胞外结构域及NDV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域。换句话讲，NDV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域替换了非NDV APMV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域，因此嵌合HN蛋白不包括非NDV APMV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域。可使用本领域技术人员已知或本文所述的技术来确定非NDV APMV HN蛋白和NDV HN蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合HN蛋白包含非NDV APMV HN蛋白的变体的胞外结构域及NDV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合HN蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，嵌合F蛋白包含非NDV APMV F蛋白胞外结构域及NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。换句话讲，NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域替换了非NDV APMV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域，因此嵌合F蛋白不包括非NDV APMV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。可使用本领域技术人员已知或本文所述的技术来确定非NDV APMV F蛋白和NDV F蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合F蛋白包含非NDV APMV F蛋白的变体的胞外结构域及NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合F蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV APMV HN和F蛋白的胞外结构域在自然界中存在于相同APMV株系中。例如，非NDV APMV HN和F蛋白的胞外结构域在自然界中可能都存在于相同APMV-15株系中。在其他实施方案中，非NDV APMV HN和F蛋白的胞外结构域在自然界中存在于不同APMV株系中。
在另一个方面，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码NDV融合(F)蛋白的转录单元，(5)编码非NDVAPMV血凝素-神经氨酸酶(HN)或其变体的转录单元，以及(6)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。在另一个方面，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码非NDV APMV融合(F)蛋白或其变体的转录单元，(5)编码NDV血凝素-神经氨酸酶(HN)的转录单元，以及(6)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。在具体实施方案中，非NDV F蛋白或其变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV HN蛋白或其变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN蛋白的一种或多种或全部功能。
在另一个方面，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码非NDV APMV融合(F)蛋白或其变体的转录单元，(5)编码非NDVAPMV血凝素-神经氨酸酶(HN)或其变体的转录单元，以及(6)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。在具体实施方案中，非NDV F蛋白或其变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV HN蛋白或其变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN蛋白的一种或多种或全部功能。
在一个实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码非NDV APMV融合(F)蛋白的转录单元，(5)编码非NDV APMV血凝素-神经氨酸酶(HN)的转录单元，以及(6)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。在具体实施方案中，非NDV APMV HN和F蛋白在自然界中存在于相同APMV株系中。例如，非NDV APMV HN和F蛋白在自然界中可能都存在于相同APMV-15株系中。在其他实施方案中，非NDV APMV HN和F蛋白在自然界中存在于不同APMV株系中。在具体实施方案中，非NDV F蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV HN蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN蛋白的一种或多种或全部功能。
在另一个实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码非NDV APMV融合(F)蛋白的变体的转录单元，(5)编码非NDV APMV血凝素-神经氨酸酶(HN)的变体的转录单元，以及(6)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。在具体实施方案中，非NDV APMV HN和F蛋白的变体来源于相同APMV株系。例如，非NDV APMV HN和F蛋白的变体可能都来源于相同APMV-15株系。在其他实施方案中，非NDV APMV HN和F蛋白的变体来源于不同APMV株系。在具体实施方案中，非NDVF蛋白的变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV HN蛋白的变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDVHN蛋白的一种或多种或全部功能。
在另一个方面，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码NDV融合(F)蛋白的转录单元，(5)编码嵌合血凝素-神经氨酸酶(HN)的转录单元，以及(6)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。在另一个方面，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码嵌合融合(F)蛋白的转录单元，(5)编码NDV血凝素-神经氨酸酶(HN)的转录单元，以及(6)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。在另一个方面，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码嵌合融合(F)蛋白的转录单元，(5)编码嵌合血凝素-神经氨酸酶(HN)的转录单元，以及(6)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。在具体实施方案中，嵌合HN蛋白包含非NDV APMVHN蛋白胞外结构域及NDV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域。换句话讲，NDV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域替换了非NDV APMV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域，因此嵌合HN蛋白不包括非NDV APMV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域。可使用本领域技术人员已知的技术来确定非NDV APMV HN蛋白和NDV HN蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。例如，可使用公开的信息、GenBank或网址诸如VIPR病毒病原体网址(www.viprbrc.org)、DTU生物信息学领域网址(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)或可用于确定跨膜结构域的程序来确定非NDV HN蛋白和NDV HN蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合HN蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，嵌合F蛋白包含非NDV APMV F蛋白胞外结构域及NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。换句话讲，NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域替换了非NDV APMV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域，因此嵌合F蛋白不包括非NDV APMV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。可使用本领域技术人员已知的技术来确定非NDV APMV F蛋白和NDV F蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。例如，可使用公开的信息、GenBank或网址诸如VIPR病毒病原体网址(www.viprbrc.org)、DTU生物信息学领域网址(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)或可用于确定跨膜结构域的程序来确定非NDV F蛋白和NDV F蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合F蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV APMV HN和F蛋白的胞外结构域在自然界中存在于相同APMV株系中。例如，非NDV APMV HN和F蛋白的胞外结构域在自然界中可能都存在于相同APMV-15株系中。在其他实施方案中，非NDV APMV HN和F蛋白的胞外结构域在自然界中存在于不同APMV株系中。
在具体实施方案中，非NDV APMV在免疫学上不同于NDV。在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,AvianDis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法所评估，非NDV APMV和NDV不能诱导实质上抑制另一者的复制的抗体，则非NDV APMV在免疫学上不同于NDV。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,AvianDis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，非NDV APMV和NDV诱导将彼此的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log的抗体，则非NDV APMV被视为在免疫学上不同于NDV。在一个具体实施方案中，如果在诸如下文所述(例如，在实施例3中)的HI测定法中，针对非NDV APMV的NDV抗血清HI活性显著降低，则非NDV APMV被视为在免疫学上不同于NDV。在一个具体实施方案中，如果在诸如下文所述(例如，在实施例3中)的HI测定法中，相对于针对NDV的NDV抗血清HI活性，针对非NDV APMV的NDV抗血清HI活性降低至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多，则非NDV APMV被视为在免疫学上不同于NDV。在某些实施方案中，非NDV APMV是AMPV-2、AMPV-3、AMPV-4、AMPV-5、AMPV-6、AMPV-7、AMPV-8、AMPV-9、AMPV-10、AMPV-11、AMPV-12、AMPV-13、AMPV-14、AMPV-15、AMPV-16、AMPV-17、AMPV-18、AMPV-19、AMPV-20或AMPV-21。在一些实施方案中，非NDV APMV是APMV-2，诸如例如Chicken/California/Yucaipa/56(登录号EU338414)。在某些实施方案中，非NDV APMV是APMV-3，诸如例如APMV3/Turkey/Wisconsin/68(登录号EU782025)。在一些实施方案中，非NDV APMV是APMV-4，诸如例如APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75(登录号FJ177514)、APMV4/Duck/China/G302/2012(GenBank号KC439346.1)、APMV4/mallard/Belgium/15129/07(GenBank号JN571485)、APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(GenBank号KU601399.1)、APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010(GenBank号JX133079.1)或APMV4/duck/Delaware/549227/2010(GenBank号JX987283.1)。在某些实施方案中，非NDV APMV是APMV-5，诸如例如APMV-5budgerigar/Kunitachi/74(登录号GU206351)或APMV5/budgerigar/Japan/TI/75(登录号LC168750)。在一些实施方案中，非NDV APMV是APMV-6，诸如例如APMV-6Goose/FarEast/4440/2003(登录号EF569970)或APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77(登录号EU622637)。在某些实施方案中，非NDV APMV是APMV-7，诸如例如APMV-7dove/Tennessee/4/75(登录号FJ231524)。在一些实施方案中，非NDV APMV是APMV-8，诸如例如APMV-8goose/Delaware/1053/76(登录号FJ215863)。在某些实施方案中，非NDV APMV是APMV-9，诸如例如APMV9/duck/New York/22/78(登录号EU910942)。在一些实施方案中，非NDV APMV是APMV-10，诸如例如APMV-10penguin/Falkland Islands/324/2007(登录号HM147142或NC_025349)。在某些实施方案中，非NDV APMV是APMV-11，诸如例如APMV-11common_snipe/France/100212/2010(登录号JQ886184)。在一些实施方案中，非NDV APMV是APMV-12，诸如例如APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(登录号KC333050)。在一些实施方案中，非NDV APMV是APMV-14，诸如例如APMV-14duck/Japan/11OG0352/2011(登录号KX258200)。在某些实施方案中，非NDV APMV是APMV-15，诸如例如APMV-15 calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(登录号KX932454)。在一些实施方案中，非NDV APMV是APMV-17，诸如例如APMV17/Antarctica/107/13(登录号MK167211)。在一些实施方案中，非NDV APMV是APMV-20，诸如例如APMV-20Gull/Kazakhstan/2014(登录号MF033136)。在某些实施方案中，非NDV APMV是APMV-21，诸如例如APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17(登录号MK67743)。
在一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75(登录号FJ177514)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV17/Antarctica/107/13(登录号MK167211)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV9/duck/New York/22/78(登录号EU910942)。在另一个具体实施方案中，非NDV是APMV7/dove/Tennessee/4/75(登录号FJ231524)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17(登录号MK67743)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77(登录号EU622637)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV11/common_snipe/France/100212/10(登录号JQ886184)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12(登录号NC_034968)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV8/Goose/Delaware/1053/76(登录号FJ215863)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56(登录号EU338414)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV3/Turkey/Wisconsin/68(登录号EU782025)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(登录号KC333050)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV5/budgerigar/Japan/TI/75(登录号LC168750)。在另一个具体实施方案中，非NDVAPMV是APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07(登录号NC_025349)。
在一些实施方案中，非NDV APMV是来自与NDV不同的属的禽腮腺炎病毒亚科成员。在一些实施方案中，非NDV APMV来自禽腮腺炎病毒亚科成员而不是NDV。在一些实施方案中，非NDV APMV是禽腮腺炎病毒亚科和偏禽腮腺炎病毒属的成员。在一些实施方案中，非NDV APMV是禽腮腺炎病毒亚科和副禽腮腺炎病毒属的成员。在一些实施方案中，非NDVAPMV是禽腮腺炎病毒亚科和正禽腮腺炎病毒属的成员而不是NDV。
在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白在免疫学上不同于NDV F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体在免疫学上不同于NDV F蛋白。在某些实施方案中，如果针对NDV F蛋白的抗体不与非NDV APMV F蛋白或其变体交叉反应，则非NDV APMV F蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV F蛋白。在一些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDV F蛋白的抗体与非NDV APMV F蛋白或其变体的结合亲和力是与NDV F蛋白的结合亲和力的2倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更低，则非NDV APMV F蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV F蛋白。在某些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDV F蛋白的抗体与非NDV APMV F蛋白或其变体的结合亲和力是与NDV F蛋白的结合亲和力的0.5log、1log、1.5log、2log、2.5log、3log或更低，则非NDVAPMV F蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV F蛋白。在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法所评估，抗NDV F抗体不能实质上抑制表达非NDV APMV F蛋白或其变体的NDV的复制，则非NDV APMV F蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV F蛋白。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，抗NDV F抗体将表达非NDV APMV F蛋白或其变体的NDV的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log，则非NDV APMV F蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV F蛋白。在一些实施方案中，非NDVAPMV F蛋白是来自与NDV不同的属的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是来自与NDV不同的属的禽腮腺炎病毒亚科成员的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科成员而不是NDV的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和偏禽腮腺炎病毒属成员的F蛋白。在一些实施方案中，非NDVAPMV F蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和副禽腮腺炎病毒属成员的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和正禽腮腺炎病毒属成员而不是NDV的F蛋白。
在某些实施方案中，嵌合F蛋白在免疫学上不同于NDV F蛋白。在某些实施方案中，如果针对NDV F蛋白的抗体不与嵌合F蛋白交叉反应，则嵌合F蛋白在免疫学上不同于NDV F蛋白。在一些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDVF蛋白的抗体与嵌合F蛋白的结合亲和力是与NDV F蛋白的结合亲和力的2倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更低，则嵌合F蛋白在免疫学上不同于NDV F蛋白。在某些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDV F蛋白的抗体与嵌合F蛋白的结合亲和力是与NDV F蛋白的结合亲和力的0.5log、1log、1.5log、2log、2.5log、3log或更低，则嵌合F蛋白在免疫学上不同于NDV F蛋白。在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法所评估，抗NDV F抗体不能实质上抑制表达非NDV APMV F蛋白或其变体的NDV的复制，则嵌合F蛋白在免疫学上不同于NDV F蛋白。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，抗NDV F抗体将表达嵌合F蛋白的NDV的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log，则嵌合F蛋白在免疫学上不同于NDV F蛋白。
在具体实施方案中，非NDV APMV F蛋白不含多碱性裂解位点。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白被例如一个或多个氨基酸取代修饰，使得非NDV APMV F蛋白不再含有多碱性裂解。在一些实施方案中，非NDVAPMV F蛋白的裂解位点的初始序列被例如一个或多个氨基酸取代修饰。例如，在与NDV F蛋白的氨基酸位置289相对应的非NDV APMV F蛋白的氨基酸位置处(按LaSota株系F蛋白计数)的亮氨酸可取代丙氨酸以消除多碱性裂解位点。
在具体实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体不含多碱性裂解位点。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体包括一个或多个氨基酸取代，使得非NDV APMV F蛋白不再含有多碱性裂解。在一些实施方案中，非NDVAPMV F蛋白的变体的裂解位点的初始序列被例如一个或多个氨基酸取代修饰。例如，非NDV APMV F蛋白的变体包括在与NDV F蛋白的氨基酸位置289相对应的非NDV APMV F蛋白的氨基酸位置处(按LaSota株系F蛋白计数)用丙氨酸取代亮氨酸的氨基酸取代。
在具体实施方案中，嵌合F蛋白不含多碱性裂解位点。在某些实施方案中，嵌合F蛋白包括氨基酸取代，使得非NDV APMV F蛋白的胞外结构域不再含有多碱性裂解。在一些实施方案中，非NDVAPMV F蛋白的胞外结构域的裂解位点的初始序列被例如一个或多个氨基酸取代修饰。例如，嵌合蛋白包括在与NDV F蛋白的氨基酸位置289相对应的非NDV APMV F蛋白的胞外结构域的氨基酸位置处(按LaSota株系F蛋白计数)用丙氨酸取代亮氨酸的氨基酸取代。
在具体实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体保留了非NDV APMV F蛋白的一种或多种功能。
在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体与非NDV AMPV F蛋白至少75％、至少80％或至少85％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体与非NDV APMVF蛋白至少90％、至少95％或至少99％的同一性。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体与非NDV AMPV F蛋白75％至90％、80％至95％或90％至99.5％的同一性。
在某个实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体含有相对于非NDV APMV F蛋白的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多、或2至5、2至10、5至10、5至15、5至20、10至15、或15至20个氨基酸突变(即，添加、缺失、取代或它们的任何组合)。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体包含非NDV APMV F蛋白的氨基酸序列，其中非NDVAPMV F蛋白的20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基被其他氨基酸取代(例如，保守取代)。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体包含非NDV APMV F蛋白的氨基酸序列，其具有多达约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个保守取代的氨基酸。保守氨基酸取代的实例包括例如将一种类别的氨基酸替换为相同类别的另一氨基酸。在一个特定实施方案中，保守取代不会改变多肽的结构或功能或两者。氨基酸类别可包括疏水性(Met、Ala、Val、Leu、Ile)、中性亲水性(Cys、Ser、Thr)、酸性(Asp、Glu)、碱性(Asn、Gln、His、Lys、Arg)、构象干扰物(Gly、Pro)和芳香族(Trp、Tyr、Phe)。
在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是由核酸序列编码的多肽，该核酸序列可在高、中等或典型严格性杂交条件下与编码非NDV APMV F蛋白的核酸序列杂交。杂交条件是本领域技术人员已知的(参见例如美国专利公开号2005/0048549的例如第72和73段)。
在一个具体实施方案中，非NDV APMV F蛋白是在免疫学上不同于NDV F蛋白的任何非NDV AMPV F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是图3A所示的APMV的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是图3A或图6A所示的属的成员的F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是AMPV-2、AMPV-3、AMPV-4、AMPV-5、AMPV-6、AMPV-7、AMPV-8、AMPV-9、AMPV-10、AMPV-11、AMPV-12、AMPV-13、AMPV-14、AMPV-15、AMPV-16、AMPV-17、AMPV-18、AMPV-19、AMPV-20或AMPV-21的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-2诸如例如Chicken/California/Yucaipa/56(登录号EU338414)的F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-2Yucaipa的F蛋白。在其他实施方案中，非NDV APMV F蛋白不是APMV-2Yucaipa的F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-3诸如例如APMV3/Turkey/Wisconsin/68(登录号EU782025)的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMVF蛋白是APMV-4诸如例如APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75(登录号FJ177514)、APMV4/Duck/China/G302/2012(GenBank号KC439346.1)、APMV4/mallard/Belgium/15129/07(GenBank号JN571485)、APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(GenBank号KU601399.1)、APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010(GenBank号JX133079.1)或APMV4/duck/Delaware/549227/2010(GenBank号JX987283.1)的F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-5诸如例如APMV-5budgerigar/Kunitachi/74(登录号GU206351)或APMV5/budgerigar/Japan/TI/75(登录号LC168750)的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-6诸如例如APMV-6Goose/FarEast/4440/2003(登录号EF569970)或APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77(登录号EU622637)的F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-7诸如例如APMV-7dove/Tennessee/4/75(登录号FJ231524)的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-8诸如例如APMV-8goose/Delaware/1053/76(登录号FJ215863)的F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-9诸如例如APMV9/duck/New York/22/78(登录号EU910942)的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-10诸如例如APMV-10penguin/Falkland Islands/324/2007(登录号HM147142或NC_025349)的F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-11诸如例如APMV-11common_snipe/France/100212/2010(登录号JQ886184)的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-12诸如例如APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(登录号KC333050)的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-14诸如例如APMV-14duck/Japan/11OG0352/2011(登录号KX258200)的F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-15诸如例如APMV-15calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(登录号KX932454)的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-17诸如例如APMV17/Antarctica/107/13(登录号MK167211)的F蛋白。在一些实施方案中，非NDVAPMV F蛋白是APMV-20诸如例如APMV-20Gull/Kazakhstan/2014(登录号MF033136)的F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-21诸如例如APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17(登录号MK67743)的F蛋白。
在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是AMPV-2、AMPV-3、AMPV-4、AMPV-5、AMPV-6、AMPV-7、AMPV-8、AMPV-9、AMPV-10、AMPV-11、AMPV-12、AMPV-13、AMPV-14、AMPV-15、AMPV-16、AMPV-17、AMPV-18、AMPV-19、AMPV-20或AMPV-21的F蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-2诸如例如Chicken/California/Yucaipa/56(登录号EU338414)的F蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-3诸如例如APMV3/Turkey/Wisconsin/68(登录号EU782025)的F蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-4诸如例如APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75(登录号FJ177514)、APMV4/Duck/China/G302/2012(GenBank号KC439346.1)、APMV4/mallard/Belgium/15129/07(GenBank号JN571485)、APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(GenBank号KU601399.1)、APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010(GenBank号JX133079.1)或APMV4/duck/Delaware/549227/2010(GenBank号JX987283.1)的F蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-5诸如例如APMV-5budgerigar/Kunitachi/74(登录号GU206351)或APMV5/budgerigar/Japan/TI/75(登录号LC168750)的F蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-6诸如例如APMV-6Goose/FarEast/4440/2003(登录号EF569970)或APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77(登录号EU622637)的F蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-7诸如例如APMV-7dove/Tennessee/4/75(登录号FJ231524)的F蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-8诸如例如APMV-8goose/Delaware/1053/76(登录号FJ215863)的F蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-9诸如例如APMV9/duck/New York/22/78(登录号EU910942)的F蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-10诸如例如APMV-10penguin/FalklandIslands/324/2007(登录号HM147142或NC_025349)的F蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-11诸如例如APMV-11common_snipe/France/100212/2010(登录号JQ886184)的F蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-12诸如例如APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(登录号KC333050)的F蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-14诸如例如APMV-14duck/Japan/11OG0352/2011(登录号KX258200)的F蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-15诸如例如APMV-15calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(登录号KX932454)的F蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-17诸如例如APMV17/Antarctica/107/13(登录号MK167211)的F蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-20诸如例如APMV-20Gull/Kazakhstan/2014(登录号MF033136)的F蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-21诸如例如APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17(登录号MK67743)的F蛋白的变体。
在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白与NDV F蛋白具有小于65％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白与NDV F蛋白具有小于60％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白与NDV F蛋白具有小于50％的同一性。在一些实施方案中，非NDVAPMV F蛋白与NDV F蛋白具有小于55％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白与NDV F蛋白具有小于50％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白与NDV F蛋白具有小于45％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白与NDV F蛋白具有小于40％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白与NDV F蛋白具有小于35％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白与NDV F蛋白具有至少20％或至少25％的同一性，但小于65％、小于60％、小于55％、小于50％或小于45％的同一性。在一些实施方案中，NDV F蛋白是NDV LaSota F蛋白。
在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在某些实施方案中，如果针对NDV HN蛋白的抗体不与非NDV APMV HN蛋白或其变体交叉反应，则非NDV APMV HN蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在一些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDV HN蛋白的抗体与变体的结合亲和力是与非NDVAPMV HN蛋白或其变体的结合亲和力的2倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更低，则非NDV APMV HN蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在某些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDV HN蛋白的抗体与非NDV APMV HN蛋白或其变体的结合亲和力是与NDV HN蛋白的结合亲和力的0.5log、1log、1.5log、2log、2.5log、3log或更低，则非NDV APMV HN蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,AvianDis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法所评估，抗NDV HN抗体不能实质上抑制表达非NDVAPMV HN蛋白或其变体的NDV的复制，则非NDV APMV HN蛋白或其变体在免疫学上不同于NDVHN蛋白。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，抗NDV HN抗体将表达非NDV APMV HN蛋白或其变体的NDV的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log，则非NDV APMV HN蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是来自与NDV不同的属的禽腮腺炎病毒亚科成员的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科成员而不是NDV的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和偏禽腮腺炎病毒属成员的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和副禽腮腺炎病毒属成员的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和正禽腮腺炎病毒属成员而不是NDV的HN蛋白。
在某些实施方案中，嵌合HN蛋白在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在某些实施方案中，如果针对NDV HN蛋白的抗体不与嵌合HN蛋白交叉反应，则嵌合HN蛋白在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在一些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDV HN蛋白的抗体与嵌合HN蛋白的结合亲和力是与NDV HN蛋白的结合亲和力的2倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更低，则嵌合HN蛋白在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在某些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDV HN蛋白的抗体与嵌合HN蛋白的结合亲和力是与NDV HN蛋白的结合亲和力的0.5log、1log、1.5log、2log、2.5log、3log或更低，则嵌合HN蛋白在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法所评估，抗NDV HN抗体不能实质上抑制表达非NDV APMV F蛋白或其变体的NDV的复制，则嵌合HN蛋白在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，抗NDV HN抗体将表达嵌合HN蛋白的NDV的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log，则嵌合HN蛋白在免疫学上不同于NDV HN蛋白。
在具体实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体保留了非NDV APMV HN蛋白的一种或多种功能。
在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体与非NDV AMPV HN蛋白至少75％、至少80％或至少85％的同一性。在一些实施方案中，非NDV HN蛋白的变体与非NDV APMV HN蛋白至少90％、至少95％或至少99％的同一性。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体与非NDV AMPV HN蛋白75％至90％、80％至95％或90％至99.5％的同一性。
在某个实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体含有相对于非NDV APMV HN蛋白的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多、或2至5、2至10、5至10、5至15、5至20、10至15、或15至20个氨基酸突变(即，添加、缺失、取代或它们的任何组合)。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体包含非NDV APMV HN蛋白的氨基酸序列，其中非NDV APMV HN蛋白的20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基被其他氨基酸取代(例如，保守取代)。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体包含非NDV APMV HN蛋白的氨基酸序列，其具有多达约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个保守取代的氨基酸。保守氨基酸取代的实例包括例如将一种类别的氨基酸替换为相同类别的另一氨基酸。在一个特定实施方案中，保守取代不会改变多肽的结构或功能或两者。氨基酸类别可包括疏水性(Met、Ala、Val、Leu、Ile)、中性亲水性(Cys、Ser、Thr)、酸性(Asp、Glu)、碱性(Asn、Gln、His、Lys、Arg)、构象干扰物(Gly、Pro)和芳香族(Trp、Tyr、Phe)。
在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是由核酸序列编码的多肽，该核酸序列可在高、中等或典型严格性杂交条件下与编码非NDV APMV HN蛋白的核酸序列杂交。杂交条件是本领域技术人员已知的(参见例如美国专利公开号2005/0048549的例如第72和73段)。
在一个具体实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是在免疫学上不同于NDV HN蛋白的任何非NDV AMPV HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是图3B所示的APMV的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是图3B或图6A所示的属的成员的HN蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是AMPV-2、AMPV-3、AMPV-4、AMPV-5、AMPV-6、AMPV-7、AMPV-8、AMPV-9、AMPV-10、AMPV-11、AMPV-12、AMPV-13、AMPV-14、AMPV-15、AMPV-16、AMPV-17、AMPV-18、AMPV-19、AMPV-20或AMPV-21的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-2诸如例如Chicken/California/Yucaipa/56(登录号EU338414)的HN蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-2Yucaipa的HN蛋白。在其他实施方案中，非NDVAPMV HN蛋白不是APMV-2Yucaipa的HN蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-3诸如例如APMV3/Turkey/Wisconsin/68(登录号EU782025)的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-4诸如例如APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75(登录号FJ177514)、APMV4/Duck/China/G302/2012(GenBank号KC439346.1)、APMV4/mallard/Belgium/15129/07(GenBank号JN571485)、APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(GenBank号KU601399.1)、APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010(GenBank号JX133079.1)或APMV4/duck/Delaware/549227/2010(GenBank号JX987283.1)的HN蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-5诸如例如APMV-5budgerigar/Kunitachi/74(登录号GU206351)或APMV5/budgerigar/Japan/TI/75(登录号LC168750)的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-6诸如例如APMV-6Goose/FarEast/4440/2003(登录号EF569970)或APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77(登录号EU622637)的HN蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-7诸如例如APMV-7dove/Tennessee/4/75(登录号FJ231524)的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-8诸如例如APMV-8goose/Delaware/1053/76(登录号FJ215863)的HN蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-9诸如例如APMV9/duck/New York/22/78(登录号EU910942)的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-10诸如例如APMV-10penguin/Falkland Islands/324/2007(登录号HM147142或NC_025349)的HN蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-11诸如例如APMV-11common_snipe/France/100212/2010(登录号JQ886184)的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-12诸如例如APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(登录号KC333050)的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-14诸如例如APMV-14duck/Japan/11OG0352/2011(登录号KX258200)的HN蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-15诸如例如APMV-15calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(登录号KX932454)的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-17诸如例如APMV17/Antarctica/107/13(登录号MK167211)的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-20诸如例如APMV-20Gull/Kazakhstan/2014(登录号MF033136)的HN蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-21诸如例如APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17(登录号MK67743)的HN蛋白。
在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是AMPV-2、AMPV-3、AMPV-4、AMPV-5、AMPV-6、AMPV-7、AMPV-8、AMPV-9、AMPV-10、AMPV-11、AMPV-12、AMPV-13、AMPV-14、AMPV-15、AMPV-16、AMPV-17、AMPV-18、AMPV-19、AMPV-20或AMPV-21的HN蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-2诸如例如Chicken/California/Yucaipa/56(登录号EU338414)的HN蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-3诸如例如APMV3/Turkey/Wisconsin/68(登录号EU782025)的HN蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-4诸如例如APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75(登录号FJ177514)、APMV4/Duck/China/G302/2012(GenBank号KC439346.1)、APMV4/mallard/Belgium/15129/07(GenBank号JN571485)、APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(GenBank号KU601399.1)、APMV-4/Egyptian goose/SouthAfrica/N1468/2010(GenBank号JX133079.1)或APMV4/duck/Delaware/549227/2010(GenBank号JX987283.1)的HN蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-5诸如例如APMV-5budgerigar/Kunitachi/74(登录号GU206351)或APMV5/budgerigar/Japan/TI/75(登录号LC168750)的HN蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDVAPMV HN蛋白的变体是APMV-6诸如例如APMV-6Goose/FarEast/4440/2003(登录号EF569970)或APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77(登录号EU622637)的HN蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-7诸如例如APMV-7dove/Tennessee/4/75(登录号FJ231524)的HN蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-8诸如例如APMV-8goose/Delaware/1053/76(登录号FJ215863)的HN蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-9诸如例如APMV9/duck/NewYork/22/78(登录号EU910942)的HN蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-10诸如例如APMV-10penguin/Falkland Islands/324/2007(登录号HM147142或NC_025349)的HN蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-11诸如例如APMV-11 common_snipe/France/100212/2010(登录号JQ886184)的HN蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-12诸如例如APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(登录号KC333050)的HN蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-14诸如例如APMV-14duck/Japan/11OG0352/2011(登录号KX258200)的HN蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-15诸如例如APMV-15calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(登录号KX932454)的HN蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-17诸如例如APMV17/Antarctica/107/13(登录号MK167211)的HN蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-20诸如例如APMV-20Gull/Kazakhstan/2014(登录号MF033136)的HN蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-21诸如例如APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17(登录号MK67743)的HN蛋白的变体。
在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白与NDV HN蛋白具有小于65％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白与NDV HN蛋白具有小于60％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白与NDV HN蛋白具有小于50％的同一性。在一些实施方案中，非NDVAPMV HN蛋白与NDV HN蛋白具有小于55％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白与NDV HN蛋白具有小于50％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白与NDV HN蛋白具有小于45％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白与NDV HN蛋白具有小于40％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白与NDV HN蛋白具有小于35％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白与NDV HN蛋白具有至少20％或至少25％的同一性，但小于65％、小于60％、小于55％、小于50％或小于45％的同一性。在一些实施方案中，NDV HN蛋白是NDV LaSota HN蛋白。
在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与SEQ ID NO:1中所示的cDNA序列的编码序列的负义链相对应的RNA序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与SEQ ID NO:2中所示的cDNA序列的编码序列的负义链相对应的RNA序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与SEQ ID NO:3中所示的cDNA序列的编码序列的负义链相对应的RNA序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与SEQ ID NO:4中所示的cDNA序列的编码序列的负义链相对应的RNA序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与SEQ ID NO:5中所示的cDNA序列的编码序列的负义链相对应的RNA序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与SEQ ID NO:6中所示的cDNA序列的编码序列的负义链相对应的RNA序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与SEQ ID NO:7中所示的cDNA序列的编码序列的负义链相对应的RNA序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与SEQID NO:8中所示的cDNA序列的编码序列的负义链相对应的RNA序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与SEQ IDNO:9中所示的cDNA序列的编码序列的负义链相对应的RNA序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与SEQ ID NO:10中所示的cDNA序列的编码序列的负义链相对应的RNA序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与SEQ ID NO:11中所示的cDNA序列的编码序列的负义链相对应的RNA序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与SEQ ID NO:12中所示的cDNA序列的编码序列的负义链相对应的RNA序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与SEQ ID NO:13中所示的cDNA序列的编码序列的负义链相对应的RNA序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与SEQ ID NO:14中所示的cDNA序列的编码序列的负义链相对应的RNA序列。在具体实施方案中，NDV基因组包含替换的NDV HN和F蛋白编码序列，以及(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，和(4)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。
在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与核苷酸序列编码序列的负义链相对应的RNA序列，该核苷酸序列编码序列与SEQ ID NO:1中所示的cDNA序列的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与核苷酸序列编码序列的负义链相对应的RNA序列，该核苷酸序列编码序列与SEQ ID NO:2中所示的cDNA序列的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与核苷酸序列编码序列的负义链相对应的RNA序列，该核苷酸序列编码序列与SEQ ID NO:3中所示的cDNA序列的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与核苷酸序列编码序列的负义链相对应的RNA序列，该核苷酸序列编码序列与SEQ ID NO:4中所示的cDNA序列的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与核苷酸序列编码序列的负义链相对应的RNA序列，该核苷酸序列编码序列与SEQ ID NO:5中所示的cDNA序列的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与核苷酸序列编码序列的负义链相对应的RNA序列，该核苷酸序列编码序列与SEQ IDNO:6中所示的cDNA序列的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与核苷酸序列编码序列的负义链相对应的RNA序列，该核苷酸序列编码序列与SEQ ID NO:7中所示的cDNA序列的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与核苷酸序列编码序列的负义链相对应的RNA序列，该核苷酸序列编码序列与SEQ ID NO:8中所示的cDNA序列的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与核苷酸序列编码序列的负义链相对应的RNA序列，该核苷酸序列编码序列与SEQ ID NO:9中所示的cDNA序列的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDVHN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与核苷酸序列编码序列的负义链相对应的RNA序列，该核苷酸序列编码序列与SEQ ID NO:10中所示的cDNA序列的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与核苷酸序列编码序列的负义链相对应的RNA序列，该核苷酸序列编码序列与SEQ ID NO:11中所示的cDNA序列的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与核苷酸序列编码序列的负义链相对应的RNA序列，该核苷酸序列编码序列与SEQ ID NO:12中所示的cDNA序列的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与核苷酸序列编码序列的负义链相对应的RNA序列，该核苷酸序列编码序列与SEQ ID NO:13中所示的cDNA序列的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为与核苷酸序列编码序列的负义链相对应的RNA序列，该核苷酸序列编码序列与SEQ IDNO:14中所示的cDNA序列的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在具体实施方案中，NDV基因组包含替换的NDV HN和F蛋白编码序列，以及(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，和(4)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。
本领域技术人员已知的技术可用于确定两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的同一性百分比。通常，为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，对序列进行比对以达到最佳比较的目的(例如，可在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入空位以便与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后比较对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的一个位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么这些分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是这些序列共有的相同位置数的函数(即，％同一性＝相同重叠位置数/位置总数×100％)。在一个实施方案中，两个序列的长度相同。在某个实施方案中，在氨基酸序列或核苷酸序列的全长上确定同一性百分比。在一些实施方案中，序列同一性比较的长度可超过被比较的两个序列的全长(例如，基因编码序列的全长或其片段)。在一些实施方案中，核苷酸序列的片段为至少25、至少50、至少75或至少100个核苷酸。类似地，可容易地确定蛋白质全长或其片段上的氨基酸序列的“序列同一性百分比”。在一些实施方案中，蛋白质的片段包含该蛋白质的至少20、至少30、至少40、至少50个或更多个连续氨基酸。在某些实施方案中，蛋白质的片段包含该蛋白质的至少75、至少100、至少125、至少150个或更多个连续氨基酸。
两个序列(例如，氨基酸序列或核酸序列)之间的同一性百分比的确定可使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的一个优选的非限制性实例是Karlin和Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:22642268的算法，并在Karlin和Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:58735877中做了改进。这种算法被并入Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序中。可使用例如分数＝100、字长＝12的NBLAST核苷酸程序参数集进行BLAST核苷酸搜索以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。可使用例如分数50、字长＝3的XBLAST程序参数集进行BLAST蛋白质搜索以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得空位比对以达到比较目的，可如Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:33893402所述的那样利用GappedBLAST。另选地，PSI BLAST可用于进行迭代搜索，该迭代搜索检测分子之间的远缘关系(出处同上)。当利用BLAST、Gapped BLAST和PSI Blast程序时，可使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见例如万维网ncbi.nlm.nih.gov上的国家生物技术信息中心(NCBI))。用于比较序列的数学算法的另一个优选的非限制性实例是Myers和Miller,1988,CABIOS 4:1117的算法。这种算法被并入ALIGN程序(2.0版)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残差表、空位长度罚分12和空位罚分4。
可使用与上述技术类似的技术在允许或不允许空位的情况下确定两个序列之间的同一性百分比。在计算同一性百分比时，通常只对精确匹配进行计数。
在另一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为与SEQ ID NO:1中所示的cDNA序列的负义链相对应的RNA序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为与SEQ ID NO:2中所示的cDNA序列的负义链相对应的RNA序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为与SEQ ID NO:3中所示的cDNA序列的负义链相对应的RNA序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为与SEQ ID NO:4中所示的cDNA序列的负义链相对应的RNA序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为与SEQ ID NO:5中所示的cDNA序列的负义链相对应的RNA序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为与SEQ ID NO:6中所示的cDNA序列的负义链相对应的RNA序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为包含与SEQ ID NO:7中所示的cDNA序列的负义链相对应的RNA序列的核苷酸序列的核苷酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为与SEQ ID NO:8中所示的cDNA序列的负义链相对应的RNA序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为与SEQ ID NO:9中所示的cDNA序列的负义链相对应的RNA序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为与SEQ ID NO:10中所示的cDNA序列的负义链相对应的RNA序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为与SEQ ID NO:11中所示的cDNA序列的负义链相对应的RNA序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为与SEQID NO:12中所示的cDNA序列的负义链相对应的RNA序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为与SEQ IDNO:13中所示的cDNA序列的负义链相对应的RNA序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为与SEQ ID NO:14中所示的cDNA序列的负义链相对应的RNA序列。在具体实施方案中，NDV基因组包含替换的NDV HN和F蛋白编码序列，以及(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，和(4)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。
本领域技术人员将理解，NDV基因组RNA序列是与编码NDV基因组的cDNA序列的负义链相对应的RNA序列。因此，任何将核苷酸序列转换为其反向互补序列的程序都可用于将编码NDV基因组的cDNA序列转换为基因组RNA序列(参见例如，www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html、www.fr33.net/seqedit.php和DNAStar)。因此，下文表1和表3中提供的核苷酸序列可容易地被本领域技术人员转换为NDV基因组的负义RNA序列。
在一些实施方案中，NDV基因组的核苷酸序列属于本领域技术人员已知的任何株系的NDV。关于示例性株系，参见例如第5.1.2节。在具体实施方案中，NDV基因组的核苷酸序列属于LaSota株系。在一些实施方案中，NDV基因组的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:15中所示的cDNA序列相对应的RNA序列。在某些实施方案中，NDV基因组的核苷酸序列属于弱毒型株系。在一些实施方案中，NDV基因组的核苷酸序列属于中毒型株系。在某些实施方案中，NDV基因组的核苷酸序列属于强毒型。NDV基因组的核苷酸序列可以是cDNA序列或RNA序列(例如，负义RNA或正义RNA)。
在一些实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含与SEQ ID NO:44的cDNA序列相对应的负义RNA序列。在一些实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含与没有GFP编码序列的SEQ ID NO:44的cDNA序列相对应的负义RNA序列。在一些实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含对应于与SEQ IDNO:44的cDNA序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列的负义RNA序列。在一些实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含对应于与没有GFP编码序列的SEQ IDNO:44的cDNA序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列的负义RNA序列。
在一些实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含与SEQ ID NO:45的cDNA序列相对应的负义RNA序列。在一些实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含与没有GFP编码序列的SEQ ID NO:45的cDNA序列相对应的负义RNA序列。在一些实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含对应于与SEQ IDNO:45的cDNA序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列的负义RNA序列。在一些实施方案中，本文提供了一种重组NDV，该重组NDV包含包装的基因组，其中包装的基因组包含对应于与没有GFP编码序列的SEQ IDNO:45的cDNA序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列的负义RNA序列。
在一些实施方案中，本文所述的核苷酸序列经过密码子优化。关于密码子优化信息和技术的描述，参见第5.1.4节。
在一个具体实施方案中，重组NDV是第6节中描述的重组NDV。
在某些实施方案中，本文所述的包装的基因组不包含编码除了非NDV APMV HN蛋白或其变体以外的异源蛋白的异源序列。在某些实施方案中，本文所述的包装的基因组不包含编码除了非NDV APMV F蛋白或其变体以外的异源蛋白的异源序列。在某些实施方案中，本文所述的包装的基因组不包含编码除了非NDV APMV HN蛋白或其变体和非NDV APMVF蛋白或其变体以外的异源蛋白的异源序列。
在某些实施方案中，本文所述的包装的基因组还包含转基因，该转基因包含编码异源序列的核苷酸序列。在某些实施方案中，本文所述的包装的基因组还包含转基因，该转基因包含编码抗原的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的包装的基因组还包含两个或更多个转基因，其中每个转基因包含编码抗原的核苷酸序列。关于可掺入到本文所述包装的基因组中的转基因的描述，参见第5.1.3节。在一些实施方案中，抗原是嵌合蛋白，诸如下文第5.1.3节中所述。在具体实施方案中，本文所述的重组NDV的病毒粒子包含由本文所述的转基因编码的抗原。
在一些实施方案中，本文所述的重组NDV的病毒粒子包含非NDV APMV F蛋白或其变体。在某些实施方案中，本文所述的重组NDV的病毒粒子包含非NDV APMV HN蛋白或其变体。在具体实施方案中，本文所述的重组NDV的病毒粒子包含非NDV APMV F蛋白或其变体和非NDV APMV HN蛋白或其变体。在一些实施方案中，本文所述的重组NDV的病毒粒子包含本文所述的嵌合F蛋白。在某些实施方案中，本文所述的重组NDV的病毒粒子包含本文所述的嵌合HN蛋白。在具体实施方案中，本文所述的重组NDV的病毒粒子包含本文所述的嵌合F蛋白和本文所述的嵌合HN蛋白。
在一些实施方案中，重组NDV的病毒粒子中非NDV APMV F蛋白或其变体(例如，APMV-4F蛋白)和/或非NDV APMV HN蛋白(例如，APMV-4HN蛋白)的存在赋予了功能性益处，诸如相对于没有非NDV APMV F蛋白或其变体和/或非NDV APMV HN蛋白的NDV(例如，下文第6节中描述的NDV株系)，在感染该病毒的细胞中增加了干扰素(1型干扰素)诱导。在一些实施方案中，重组NDV的病毒粒子中APMV-4F蛋白和APMV-4HN蛋白的存在赋予了功能性益处，诸如相对于没有APMV-4F蛋白和/或APMV-4HN蛋白的NDV(例如，下文第6节中描述的NDV株系)，在感染该病毒的细胞中增加了干扰素(1型干扰素)诱导。在某些实施方案中，在诸如本文所述(例如，下文第6节)或本领域技术人员已知的测定法中体外评估干扰素诱导。
5.1.1重组核酸序列
在一个方面，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码除NDV以外的禽副粘病毒(APMV)的HN蛋白或非NDV-APMV HN蛋白的变体的核苷酸序列，或者编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码除NDV以外的APMV的F蛋白或非NDV-APMV F蛋白的变体的核苷酸序列。在本文的某些情况下，术语“非NDV APMV”用于指代除NDV以外的APMV。在一个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白或其变体的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV APMV HN蛋白编码序列或变体HN蛋白编码序列之前和之后；或者(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV F蛋白或其变体的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV APMV F蛋白编码序列或变体F蛋白编码序列之前和之后。在具体实施方案中，位于非NDV APMV HN蛋白编码序列或变体非NDV APMV HN蛋白编码序列之前和之后的NDV基因间区是NDV HN基因间区。在具体实施方案中，位于非NDV APMV F蛋白编码序列或变体非NDV APMV F蛋白编码序列之前和之后的NDV基因间区是NDV F基因间区。在另一个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV HN蛋白或其变体的核苷酸序列的转录单元；或者(2)编码NDV F蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV F蛋白或其变体的核苷酸序列的转录单元。在具体实施方案中，非NDV APMV F蛋白或其变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV APMV HN蛋白或其变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN蛋白的一种或多种或全部功能。NDV基因组通常包含N基因、P基因、L基因、M基因、HN基因和F基因。
在另一个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV APMV HN蛋白编码序列之前和之后；或者(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV F蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV APMV F蛋白编码序列之前和之后。在具体实施方案中，位于非NDVAPMV HN蛋白编码序列之前和之后的NDV基因间区是NDV HN基因间区。在具体实施方案中，位于非NDV APMV F蛋白编码序列之前和之后的NDV基因间区是NDV F基因间区。在另一个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV HN蛋白的核苷酸序列的转录单元；或者(2)编码NDV F蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV F蛋白的核苷酸序列的转录单元。在具体实施方案中，非NDV APMV F蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV APMV HN蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN蛋白的一种或多种或全部功能。
在另一个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白的变体的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于变体HN蛋白编码序列之前和之后；或者(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV F蛋白的变体的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于变体F蛋白编码序列之前和之后。在具体实施方案中，位于非NDVAPMV HN蛋白编码序列的变体之前和之后的NDV基因间区是NDV HN基因间区。在具体实施方案中，位于非NDV APMV F蛋白编码序列的变体之前和之后的NDV基因间区是NDV F基因间区。在另一个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV HN蛋白的变体的核苷酸序列的转录单元；或者(2)编码NDV F蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV F蛋白的变体的核苷酸序列的转录单元。在具体实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN蛋白的一种或多种或全部功能。
在另一个方面，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码除NDV以外的禽副粘病毒(APMV)的HN蛋白或非NDV-APMV HN蛋白的变体的核苷酸序列，以及编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码除NDV以外的APMV的F蛋白或非NDV-APMV F蛋白的变体的核苷酸序列。在一个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白或其变体的核苷酸序列；以及(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV F蛋白或其变体的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV APMV HN和F蛋白编码序列或变体HN和F蛋白编码序列之前、之间和之后。在具体实施方案中，位于非NDV APMV HN蛋白编码序列或变体非NDV APMV HN蛋白编码序列之前和之后的NDV基因间区是NDV HN基因间区。在具体实施方案中，位于非NDV APMV F蛋白编码序列或变体非NDV APMV F蛋白编码序列之前和之后的NDV基因间区是NDV F基因间区。在另一个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV HN蛋白或其变体的核苷酸序列的转录单元；以及(2)编码NDV F蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV F蛋白或其变体的核苷酸序列的转录单元。在具体实施方案中，非NDV APMV F蛋白或其变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV APMV HN蛋白或其变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN蛋白的一种或多种或全部功能。
在另一个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白的核苷酸序列；以及(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV F蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV APMV HN和F蛋白编码序列之前、之间和之后。在具体实施方案中，位于编码非NDV APMV HN蛋白的核苷酸序列之前和之后的NDV基因间区是NDV HN基因间区。在具体实施方案中，位于编码非NDV APMV F蛋白的核苷酸序列之前和之后的NDV基因间区是NDV F基因间区。在另一个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV HN蛋白的核苷酸序列的转录单元；以及(2)编码NDV F蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV F蛋白的核苷酸序列的转录单元。在具体实施方案中，非NDV APMV HN和F蛋白在自然界中存在于相同APMV株系中。例如，非NDV APMVHN和F蛋白在自然界中可能都存在于相同APMV-15株系中。在其他实施方案中，非NDV APMVHN和F蛋白在自然界中存在于不同APMV株系中。在具体实施方案中，非NDV AMPV F蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV AMPV HN蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN蛋白的一种或多种或全部功能。
在另一个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白的变体的核苷酸序列；以及(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDVAPMV F蛋白的变体的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于变体HN和F蛋白编码序列之前、之间和之后。在具体实施方案中，位于编码非NDV APMV HN蛋白的变体的核苷酸序列之前和之后的NDV基因间区是NDV HN基因间区。在具体实施方案中，位于编码非NDV APMV F蛋白的变体的核苷酸序列之前和之后的NDV基因间区是NDV F基因间区。在另一个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDVHN蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV HN蛋白的变体的核苷酸序列的转录单元；以及(2)编码NDV F蛋白的转录单元已被替换为包含编码非NDV APMV F蛋白的变体的核苷酸序列的转录单元。在具体实施方案中，变体HN和F蛋白来源于相同APMV株系。例如，变体HN和F蛋白可能都来源于相同APMV-15株系。在其他实施方案中，变体HN和F蛋白来源于不同APMV株系。在具体实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN蛋白的一种或多种或全部功能。
在另一个方面，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码嵌合HN蛋白的核苷酸序列，或者编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码嵌合F蛋白的核苷酸序列。在一个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码嵌合HN蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于嵌合HN蛋白编码序列之前和之后；或者(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码嵌合F蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于嵌合F蛋白编码序列的之前和之后。在具体实施方案中，位于编码嵌合HN蛋白的核苷酸序列之前和之后的NDV基因间区是NDV HN基因间区。在具体实施方案中，位于编码嵌合F蛋白的核苷酸序列之前和之后的NDV基因间区是NDV F基因间区。在另一个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的转录单元已被替换为包含编码嵌合HN蛋白的核苷酸序列的转录单元；或者(2)编码NDV F蛋白的转录单元已被替换为包含编码嵌合F蛋白的核苷酸序列的转录单元。在具体实施方案中，嵌合HN蛋白包含非NDV APMV HN蛋白胞外结构域及NDV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域。换句话讲，NDV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域替换了非NDV APMV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域，因此嵌合HN蛋白不包括非NDV APMV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域。可使用本领域技术人员已知的技术来确定非NDV APMV HN蛋白和NDV HN蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。例如，可使用公开的信息、GenBank或网址诸如VIPR病毒病原体网址(www.viprbrc.org)、DTU生物信息学领域网址(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)或可用于确定跨膜结构域的程序来确定非NDV APMV HN蛋白和NDV HN蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合HN蛋白包含非NDV APMV HN蛋白的变体的胞外结构域及NDV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合HN蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，嵌合F蛋白包含非NDV APMV F蛋白胞外结构域及NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。换句话讲，NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域替换了非NDV APMV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域，因此嵌合F蛋白不包括非NDV APMV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。可使用本领域技术人员已知的技术来确定非NDV APMV F蛋白和NDV F蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。例如，可使用公开的信息、GenBank或网址诸如VIPR病毒病原体网址(www.viprbrc.org)、DTU生物信息学领域网址(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)或可用于确定跨膜结构域的程序来确定非NDV APMV F蛋白和NDV F蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合F蛋白包含非NDV APMV F蛋白的变体的胞外结构域及NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合F蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。
在另一个方面，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码嵌合HN蛋白的核苷酸序列，以及编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码嵌合F蛋白的核苷酸序列。在一个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码嵌合HN蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于嵌合HN蛋白编码序列之前和之后；以及(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码嵌合F蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于嵌合F蛋白编码序列的之前和之后。在具体实施方案中，位于编码嵌合HN蛋白的核苷酸序列之前和之后的NDV基因间区是NDV HN基因间区。在具体实施方案中，位于编码嵌合F蛋白的核苷酸序列之前和之后的NDV基因间区是NDV F基因间区。在另一个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的转录单元已被替换为包含编码嵌合HN蛋白的核苷酸序列的转录单元；以及(2)编码NDV F蛋白的转录单元已被替换为包含编码嵌合F蛋白的核苷酸序列的转录单元。在具体实施方案中，嵌合HN蛋白包含非NDV APMV HN蛋白胞外结构域及NDV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域。换句话讲，NDV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域替换了非NDV APMV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域，因此嵌合HN蛋白不包括非NDV APMV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域。可使用本领域技术人员已知或本文所述的技术来确定非NDV APMV HN蛋白和NDV HN蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合HN蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，嵌合HN蛋白包含非NDV APMV HN蛋白的变体的胞外结构域及NDV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合F蛋白包含非NDV APMV F蛋白胞外结构域及NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。换句话讲，NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域替换了非NDV APMV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域，因此嵌合F蛋白不包括非NDV APMV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。可使用本领域技术人员已知或本文所述的技术来确定非NDV APMV F蛋白和NDV F蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合F蛋白包含非NDV APMV F蛋白的变体的胞外结构域及NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合F蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDVAPMV HN和F蛋白的胞外结构域在自然界中存在于相同APMV株系中。例如，非NDV APMV HN和F蛋白的胞外结构域在自然界中可能都存在于相同APMV-15株系中。在其他实施方案中，非NDV APMV HN和F蛋白的胞外结构域在自然界中存在于不同APMV株系中。
在另一个方面，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码NDV融合(F)蛋白的转录单元，(5)编码非NDV APMV血凝素-神经氨酸酶(HN)或其变体的转录单元，以及(6)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。在另一个方面，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码非NDV APMV融合(F)蛋白或其变体的转录单元，(5)编码NDV血凝素-神经氨酸酶(HN)的转录单元，以及(6)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。在具体实施方案中，非NDV AMPV F蛋白或其变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV APMVHN蛋白或其变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN蛋白的一种或多种或全部功能。
在另一个方面，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码非NDV APMV融合(F)蛋白或其变体的转录单元，(5)编码非NDV APMV血凝素-神经氨酸酶(HN)或其变体的转录单元，以及(6)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。在具体实施方案中，非NDV AMPV F蛋白或其变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV APMV HN蛋白或其变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN蛋白的一种或多种或全部功能。
在一个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码非NDV APMV融合(F)蛋白的转录单元，(5)编码非NDV APMV血凝素-神经氨酸酶(HN)的转录单元，以及(6)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。在具体实施方案中，非NDVAPMV HN和F蛋白在自然界中存在于相同APMV株系中。例如，非NDV APMV HN和F蛋白在自然界中可能都存在于相同APMV-15株系中。在其他实施方案中，非NDV APMV HN和F蛋白在自然界中存在于不同APMV株系中。在具体实施方案中，非NDV APMV F蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV APMVHN蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN蛋白的一种或多种或全部功能。
在另一个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码非NDV APMV融合(F)蛋白的变体的转录单元，(5)编码非NDV APMV血凝素-神经氨酸酶(HN)的变体的转录单元，以及(6)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。在具体实施方案中，非NDV APMV HN和F蛋白的变体来源于相同APMV株系。例如，非NDV APMV HN和F蛋白的变体可能都来源于相同APMV-15株系。在其他实施方案中，非NDV APMV HN和F蛋白的变体来源于不同APMV株系。在具体实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV APMVHN蛋白的变体具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN蛋白的一种或多种或全部功能。
在另一个方面，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码NDV融合(F)蛋白的转录单元，(5)编码嵌合血凝素-神经氨酸酶(HN)的转录单元，以及(6)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。在另一个方面，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码嵌合融合(F)蛋白的转录单元，(5)编码NDV血凝素-神经氨酸酶(HN)的转录单元，以及(6)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。在另一个方面，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码嵌合融合(F)蛋白的转录单元，(5)编码嵌合血凝素-神经氨酸酶(HN)的转录单元，以及(6)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。在具体实施方案中，嵌合HN蛋白包含非NDV APMV HN蛋白胞外结构域及NDV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域。换句话讲，NDV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域替换了非NDV APMV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域，因此嵌合HN蛋白不包括非NDVAPMV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域。可使用本领域技术人员已知的技术来确定非NDVAPMV HN蛋白和NDV HN蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。例如，可使用公开的信息、GenBank或网址诸如VIPR病毒病原体网址(www.viprbrc.org)、DTU生物信息学领域网址(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)或可用于确定跨膜结构域的程序来确定非NDVAPMV HN蛋白和NDV HN蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合HN蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV HN的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，嵌合F蛋白包含非NDV APMV F蛋白胞外结构域及NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。换句话讲，NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域替换了非NDV APMV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域，因此嵌合F蛋白不包括非NDV APMV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。可使用本领域技术人员已知的技术来确定非NDV APMV F蛋白和NDV F蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。例如，可使用公开的信息、GenBank或网址诸如VIPR病毒病原体网址(www.viprbrc.org)、DTU生物信息学领域网址(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)或可用于确定跨膜结构域的程序来确定非NDV APMV F蛋白和NDV F蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在具体实施方案中，嵌合F蛋白具有NDV体外复制、体内复制或两者所需的NDV F蛋白的一种或多种或全部功能。在具体实施方案中，非NDV APMV HN和F蛋白的胞外结构域在自然界中存在于相同APMV株系中。例如，非NDV APMV HN和F蛋白的胞外结构域在自然界中可能都存在于相同APMV-15株系中。在其他实施方案中，非NDV APMV HN和F蛋白的胞外结构域在自然界中存在于不同APMV株系中。
在具体实施方案中，非NDV APMV在免疫学上不同于NDV。在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,AvianDis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法所评估，非NDV APMV和NDV不能诱导实质上抑制另一者的复制的抗体，则非NDV APMV在免疫学上不同于NDV。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,AvianDis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，非NDV APMV和NDV诱导将彼此的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log的抗体，则非NDV APMV被视为在免疫学上不同于NDV。在一个具体实施方案中，如果在诸如下文所述(例如，在实施例3中)的HI测定法中，针对非NDV APMV的NDV抗血清HI活性显著降低，则非NDV APMV被视为在免疫学上不同于NDV。在一个具体实施方案中，如果在诸如下文所述(例如，在实施例3中)的HI测定法中，相对于针对NDV的NDV抗血清HI活性，针对非NDV APMV的NDV抗血清HI活性降低至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多，则非NDV APMV被视为在免疫学上不同于NDV。在某些实施方案中，非NDV APMV是AMPV-2、AMPV-3、AMPV-4、AMPV-5、AMPV-6、AMPV-7、AMPV-8、AMPV-9、AMPV-10、AMPV-11、AMPV-12、AMPV-13、AMPV-14、AMPV-15、AMPV-16、AMPV-17、AMPV-18、AMPV-19、AMPV-20或AMPV-21。在一些实施方案中，非NDV APMV是APMV-2，诸如例如Chicken/California/Yucaipa/56(登录号EU338414)。在某些实施方案中，非NDV APMV是APMV-3，诸如例如APMV3/Turkey/Wisconsin/68(登录号EU782025)。在一些实施方案中，非NDV APMV是APMV-4，诸如例如APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75(登录号FJ177514)、APMV4/Duck/China/G302/2012(GenBank号KC439346.1)、APMV4/mallard/Belgium/15129/07(GenBank号JN571485)、APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(GenBank号KU601399.1)、APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010(GenBank号JX133079.1)或APMV4/duck/Delaware/549227/2010(GenBank号JX987283.1)。在某些实施方案中，非NDV APMV是APMV-5，诸如例如APMV-5budgerigar/Kunitachi/74(登录号GU206351)或APMV5/budgerigar/Japan/TI/75(登录号LC168750)。在一些实施方案中，非NDV APMV是APMV-6，诸如例如APMV-6Goose/FarEast/4440/2003(登录号EF569970)或APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77(登录号EU622637)。在某些实施方案中，非NDV APMV是APMV-7，诸如例如APMV-7dove/Tennessee/4/75(登录号FJ231524)。在一些实施方案中，非NDV APMV是APMV-8，诸如例如APMV-8goose/Delaware/1053/76(登录号FJ215863)。在某些实施方案中，非NDV APMV是APMV-9，诸如例如APMV9/duck/New York/22/78(登录号EU910942)。在一些实施方案中，非NDV APMV是APMV-10，诸如例如APMV-10penguin/Falkland Islands/324/2007(登录号HM147142或NC_025349)。在某些实施方案中，非NDV APMV是APMV-11，诸如例如APMV-11common_snipe/France/100212/2010(登录号JQ886184)。在一些实施方案中，非NDV APMV是APMV-12，诸如例如APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(登录号KC333050)。在一些实施方案中，非NDV APMV是APMV-14，诸如例如APMV-14duck/Japan/11OG0352/2011(登录号KX258200)。在某些实施方案中，非NDV APMV是APMV-15，诸如例如APMV-15calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(登录号KX932454)。在一些实施方案中，非NDV APMV是APMV-17，诸如例如APMV17/Antarctica/107/13(登录号MK167211)。在一些实施方案中，非NDV APMV是APMV-20，诸如例如APMV-20Gull/Kazakhstan/2014(登录号MF033136)。在某些实施方案中，非NDV APMV是APMV-21，诸如例如APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17(登录号MK67743)。
在一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75(登录号FJ177514)。在另一个具体实施方案中，非NDVAPMV是APMV17/Antarctica/107/13(登录号MK167211)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV9/duck/New York/22/78(登录号EU910942)。在另一个具体实施方案中，非NDV是APMV7/dove/Tennessee/4/75(登录号FJ231524)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17(登录号MK67743)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77(登录号EU622637)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV11/common_snipe/France/100212/10(登录号JQ886184)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12(登录号NC_034968)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV8/Goose/Delaware/1053/76(登录号FJ215863)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56(登录号EU338414)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV3/Turkey/Wisconsin/68(登录号EU782025)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(登录号KC333050)。在另一个具体实施方案中，非NDV APMV是APMV5/budgerigar/Japan/TI/75(登录号LC168750)。在另一个具体实施方案中，非NDVAPMV是APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07(登录号NC_025349)。
在一些实施方案中，非NDV APMV是来自与NDV不同的属的禽腮腺炎病毒亚科成员。在一些实施方案中，非NDV APMV来自禽腮腺炎病毒亚科成员而不是NDV。在一些实施方案中，非NDV APMV是禽腮腺炎病毒亚科和偏禽腮腺炎病毒属的成员。在一些实施方案中，非NDV APMV是禽腮腺炎病毒亚科和副禽腮腺炎病毒属的成员。在一些实施方案中，非NDVAPMV是禽腮腺炎病毒亚科和正禽腮腺炎病毒属的成员而不是NDV。
在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白在免疫学上不同于NDV F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体在免疫学上不同于NDV F蛋白。在某些实施方案中，如果针对NDV F蛋白的抗体不与非NDV APMV F蛋白或其变体交叉反应，则非NDV APMV F蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV F蛋白。在一些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDV F蛋白的抗体与非NDV APMV F蛋白或其变体的结合亲和力是与NDV F蛋白的结合亲和力的2倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更低，则非NDV APMV F蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV F蛋白。在某些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDV F蛋白的抗体与非NDV APMV F蛋白或其变体的结合亲和力是与NDV F蛋白的结合亲和力的0.5log、1log、1.5log、2log、2.5log、3log或更低，则非NDVAPMV F蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV F蛋白。在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法所评估，抗NDV F抗体不能实质上抑制表达非NDV APMV F蛋白或其变体的NDV的复制，则非NDV APMV F蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV F蛋白。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，抗NDV F抗体将表达非NDV APMV F蛋白或其变体的NDV的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log，则非NDV APMV F蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV F蛋白。
在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科成员而不是NDV的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和偏禽腮腺炎病毒属成员的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和副禽腮腺炎病毒属成员的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和正禽腮腺炎病毒属成员而不是NDV的F蛋白。
在某些实施方案中，嵌合F蛋白在免疫学上不同于NDV F蛋白。在某些实施方案中，如果针对NDV F蛋白的抗体不与嵌合F蛋白交叉反应，则嵌合F蛋白在免疫学上不同于NDV F蛋白。在一些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDVF蛋白的抗体与嵌合F蛋白的结合亲和力是与NDV F蛋白的结合亲和力的2倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更低，则嵌合F蛋白在免疫学上不同于NDV F蛋白。在某些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDV F蛋白的抗体与嵌合F蛋白的结合亲和力是与NDV F蛋白的结合亲和力的0.5log、1log、1.5log、2log、2.5log、3log或更低，则嵌合F蛋白在免疫学上不同于NDV F蛋白。在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法所评估，抗NDV F抗体不能实质上抑制表达非NDV APMV F蛋白或其变体的NDV的复制，则嵌合F蛋白在免疫学上不同于NDV F蛋白。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，抗NDV F抗体将表达嵌合F蛋白的NDV的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log，则嵌合F蛋白在免疫学上不同于NDV F蛋白。
在具体实施方案中，非NDV APMV F蛋白不含多碱性裂解位点。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白被例如一个或多个氨基酸取代修饰，使得非NDV APMV F蛋白不再含有多碱性裂解。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的裂解位点的初始序列被例如一个或多个氨基酸取代修饰。例如，在与NDV F蛋白的氨基酸位置289相对应的非NDV APMV F蛋白的氨基酸位置处(按LaSota株系F蛋白计数)的亮氨酸可取代丙氨酸以消除多碱性裂解位点。
在具体实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体不含多碱性裂解位点。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体包括一个或多个氨基酸取代，使得非NDV APMV F蛋白不再含有多碱性裂解。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体的裂解位点的初始序列被例如一个或多个氨基酸取代修饰。例如，非NDV APMV F蛋白的变体包括在与NDV F蛋白的氨基酸位置289相对应的非NDV APMV F蛋白的氨基酸位置处(按LaSota株系F蛋白计数)用丙氨酸取代亮氨酸的氨基酸取代。
在具体实施方案中，嵌合F蛋白不含多碱性裂解位点。在某些实施方案中，嵌合F蛋白包括一个或多个氨基酸取代，使得非NDV APMV F蛋白的胞外结构域不再含有多碱性裂解。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的胞外结构域的裂解位点的初始序列被例如一个或多个氨基酸取代修饰。例如，嵌合蛋白包括在与NDV F蛋白的氨基酸位置289相对应的非NDV APMV F蛋白的胞外结构域的氨基酸位置处(按LaSota株系F蛋白计数)用丙氨酸取代亮氨酸的氨基酸取代。
在具体实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体保留了非NDV APMV F蛋白的一种或多种功能。
在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体与非NDV AMPV F蛋白至少75％、至少80％或至少85％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体与非NDV APMVF蛋白至少90％、至少95％或至少99％的同一性。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体与非NDV AMPV F蛋白75％至90％、80％至95％或90％至99.5％的同一性。
在某个实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体含有相对于非NDV APMV F蛋白的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多、或2至5、2至10、5至10、5至15、5至20、10至15、或15至20个氨基酸突变(即，添加、缺失、取代或它们的任何组合)。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体包含非NDV APMV F蛋白的氨基酸序列，其中非NDVAPMV F蛋白的20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基被其他氨基酸取代(例如，保守取代)。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体包含非NDV APMV F蛋白的氨基酸序列，其具有多达约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个保守取代的氨基酸。保守氨基酸取代的实例包括例如将一种类别的氨基酸替换为相同类别的另一氨基酸。在一个特定实施方案中，保守取代不会改变多肽的结构或功能或两者。氨基酸类别可包括疏水性(Met、Ala、Val、Leu、Ile)、中性亲水性(Cys、Ser、Thr)、酸性(Asp、Glu)、碱性(Asn、Gln、His、Lys、Arg)、构象干扰物(Gly、Pro)和芳香族(Trp、Tyr、Phe)。
在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是由核酸序列编码的多肽，该核酸序列可在高、中等或典型严格性杂交条件下与编码非NDV APMV F蛋白的核酸序列杂交。杂交条件是本领域技术人员已知的(参见例如美国专利公开号2005/0048549的例如第72和73段)。
在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是图3A所示的APMV的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是图3A或图6A所示的属的成员的F蛋白。在某些实施方案中，非NDVAPMV F蛋白是AMPV-2、AMPV-3、AMPV-4、AMPV-5、AMPV-6、AMPV-7、AMPV-8、AMPV-9、AMPV-10、AMPV-11、AMPV-12、AMPV-13、AMPV-14、AMPV-15、AMPV-16、AMPV-17、AMPV-18、AMPV-19、AMPV-20或AMPV-21的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-2诸如例如Chicken/California/Yucaipa/56(登录号EU338414)的F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-2Yucaipa的F蛋白。在其他实施方案中，非NDV APMV F蛋白不是APMV-2Yucaipa的F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-3诸如例如APMV3/Turkey/Wisconsin/68(登录号EU782025)的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-4诸如例如APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75(登录号FJ177514)、APMV4/Duck/China/G302/2012(GenBank号KC439346.1)、APMV4/mallard/Belgium/15129/07(GenBank号JN571485)、APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(GenBank号KU601399.1)、APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010(GenBank号JX133079.1)或APMV4/duck/Delaware/549227/2010(GenBank号JX987283.1)的F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-5诸如例如APMV-5budgerigar/Kunitachi/74(登录号GU206351)或APMV5/budgerigar/Japan/TI/75(登录号LC168750)的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-6诸如例如APMV-6Goose/FarEast/4440/2003(登录号EF569970)或APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77(登录号EU622637)的F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-7诸如例如APMV-7dove/Tennessee/4/75(登录号FJ231524)的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-8诸如例如APMV-8goose/Delaware/1053/76(登录号FJ215863)的F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-9诸如例如APMV9/duck/New York/22/78(登录号EU910942)的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-10诸如例如APMV-10penguin/Falkland Islands/324/2007(登录号HM147142或NC_025349)的F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-11诸如例如APMV-11common_snipe/France/100212/2010(登录号JQ886184)的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-12诸如例如APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(登录号KC333050)的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-14诸如例如APMV-14duck/Japan/11OG0352/2011(登录号KX258200)的F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-15诸如例如APMV-15calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(登录号KX932454)的F蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-17诸如例如APMV17/Antarctica/107/13(登录号MK167211)的F蛋白。在一些实施方案中，非NDVAPMV F蛋白是APMV-20诸如例如APMV-20Gull/Kazakhstan/2014(登录号MF033136)的F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白是APMV-21诸如例如APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17(登录号MK67743)的F蛋白。
在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是AMPV-2、AMPV-3、AMPV-4、AMPV-5、AMPV-6、AMPV-7、AMPV-8、AMPV-9、AMPV-10、AMPV-11、AMPV-12、AMPV-13、AMPV-14、AMPV-15、AMPV-16、AMPV-17、AMPV-18、AMPV-19、AMPV-20或AMPV-21的F蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-2诸如例如Chicken/California/Yucaipa/56(登录号EU338414)的F蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-3诸如例如APMV3/Turkey/Wisconsin/68(登录号EU782025)的F蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-4诸如例如APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75(登录号FJ177514)、APMV4/Duck/China/G302/2012(GenBank号KC439346.1)、APMV4/mallard/Belgium/15129/07(GenBank号JN571485)、APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(GenBank号KU601399.1)、APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010(GenBank号JX133079.1)或APMV4/duck/Delaware/549227/2010(GenBank号JX987283.1)的F蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-5诸如例如APMV-5budgerigar/Kunitachi/74(登录号GU206351)或APMV5/budgerigar/Japan/TI/75(登录号LC168750)的F蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-6诸如例如APMV-6Goose/FarEast/4440/2003(登录号EF569970)或APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77(登录号EU622637)的F蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-7诸如例如APMV-7dove/Tennessee/4/75(登录号FJ231524)的F蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-8诸如例如APMV-8goose/Delaware/1053/76(登录号FJ215863)的F蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-9诸如例如APMV9/duck/New York/22/78(登录号EU910942)的F蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-10诸如例如APMV-10penguin/FalklandIslands/324/2007(登录号HM147142或NC_025349)的F蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-11诸如例如APMV-11common_snipe/France/100212/2010(登录号JQ886184)的F蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-12诸如例如APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(登录号KC333050)的F蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-14诸如例如APMV-14duck/Japan/11OG0352/2011(登录号KX258200)的F蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-15诸如例如APMV-15calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(登录号KX932454)的F蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-17诸如例如APMV17/Antarctica/107/13(登录号MK167211)的F蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-20诸如例如APMV-20Gull/Kazakhstan/2014(登录号MF033136)的F蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV F蛋白的变体是APMV-21诸如例如APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17(登录号MK67743)的F蛋白的变体。
在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白与NDV F蛋白具有小于65％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白与NDV F蛋白具有小于60％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白与NDV F蛋白具有小于50％的同一性。在一些实施方案中，非NDVAPMV F蛋白与NDV F蛋白具有小于55％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白与NDV F蛋白具有小于50％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白与NDV F蛋白具有小于45％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白与NDV F蛋白具有小于40％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白与NDV F蛋白具有小于35％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV F蛋白与NDV F蛋白具有至少20％或至少25％的同一性，但小于65％、小于60％、小于55％、小于50％或小于45％的同一性。在一些实施方案中，NDV F蛋白是NDV LaSota HN蛋白。
在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在某些实施方案中，如果针对NDV HN蛋白的抗体不与非NDV APMV HN蛋白或其变体交叉反应，则非NDV APMV HN蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在一些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDV HN蛋白的抗体与变体的结合亲和力是与非NDV APMV HN蛋白或其变体的结合亲和力的2倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更低，则非NDV APMV HN蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在某些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDV HN蛋白的抗体与非NDV APMVHN蛋白或其变体的结合亲和力是与NDV HN蛋白的结合亲和力的0.5log、1log、1.5log、2log、2.5log、3log或更低，则非NDV APMV HN蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法所评估，抗NDV HN抗体不能实质上抑制表达非NDV APMV HN蛋白或其变体的NDV的复制，则非NDV APMV HN蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，抗NDV HN抗体将表达非NDV APMV HN蛋白或其变体的NDV的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log，则非NDV APMV HN蛋白或其变体在免疫学上不同于NDV HN蛋白。
在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科成员而不是NDV的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和偏禽腮腺炎病毒属成员的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和副禽腮腺炎病毒属成员的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和正禽腮腺炎病毒属成员而不是NDV的HN蛋白。
在某些实施方案中，嵌合HN蛋白在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在某些实施方案中，如果针对NDV HN蛋白的抗体不与嵌合HN蛋白交叉反应，则嵌合HN蛋白在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在一些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDV HN蛋白的抗体与嵌合HN蛋白的结合亲和力是与NDV HN蛋白的结合亲和力的2倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更低，则嵌合HN蛋白在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在某些实施方案中，如果在本领域技术人员已知的或本文所述的测定法中，针对NDV HN蛋白的抗体与嵌合HN蛋白的结合亲和力是与NDV HN蛋白的结合亲和力的0.5log、1log、1.5log、2log、2.5log、3log或更低，则嵌合HN蛋白在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法所评估，抗NDV HN抗体不能实质上抑制表达非NDV APMV F蛋白或其变体的NDV的复制，则嵌合HN蛋白在免疫学上不同于NDV HN蛋白。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，抗NDV HN抗体将表达嵌合HN蛋白的NDV的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log，则嵌合HN蛋白在免疫学上不同于NDV HN蛋白。
在具体实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体保留了非NDV APMV HN蛋白的一种或多种功能。
在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体与非NDV AMPV HN蛋白至少75％、至少80％或至少85％的同一性。在一些实施方案中，非NDV HN蛋白的变体与非NDV APMV HN蛋白至少90％、至少95％或至少99％的同一性。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体与非NDV AMPV HN蛋白75％至90％、80％至95％或90％至99.5％的同一性。
在某个实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体含有相对于非NDV APMV HN蛋白的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多、或2至5、2至10、5至10、5至15、5至20、10至15、或15至20个氨基酸突变(即，添加、缺失、取代或它们的任何组合)。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体包含非NDV APMV HN蛋白的氨基酸序列，其中非NDV APMV HN蛋白的20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基被其他氨基酸取代(例如，保守取代)。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体包含非NDV APMV HN蛋白的氨基酸序列，其具有多达约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个保守取代的氨基酸。保守氨基酸取代的实例包括例如将一种类别的氨基酸替换为相同类别的另一氨基酸。在一个特定实施方案中，保守取代不会改变多肽的结构或功能或两者。氨基酸类别可包括疏水性(Met、Ala、Val、Leu、Ile)、中性亲水性(Cys、Ser、Thr)、酸性(Asp、Glu)、碱性(Asn、Gln、His、Lys、Arg)、构象干扰物(Gly、Pro)和芳香族(Trp、Tyr、Phe)。
在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是由核酸序列编码的多肽，该核酸序列可在高、中等或典型严格性杂交条件下与编码非NDV APMV HN蛋白的核酸序列杂交。杂交条件是本领域技术人员已知的(参见例如美国专利公开号2005/0048549的例如第72和73段)。
在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是图3B所示的APMV的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是图3B或图6A所示的属的成员的F蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是AMPV-2、AMPV-3、AMPV-4、AMPV-5、AMPV-6、AMPV-7、AMPV-8、AMPV-9、AMPV-10、AMPV-11、AMPV-12、AMPV-13、AMPV-14、AMPV-15、AMPV-16、AMPV-17、AMPV-18、AMPV-19、AMPV-20或AMPV-21的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-2诸如例如Chicken/California/Yucaipa/56(登录号EU338414)的HN蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-2Yucaipa的HN蛋白。在其他实施方案中，非NDV APMV HN蛋白不是APMV-2Yucaipa的HN蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-3诸如例如APMV3/Turkey/Wisconsin/68(登录号EU782025)的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMVHN蛋白是APMV-4诸如例如APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75(登录号FJ177514)、APMV4/Duck/China/G302/2012(GenBank号KC439346.1)、APMV4/mallard/Belgium/15129/07(GenBank号JN571485)、APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(GenBank号KU601399.1)、APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010(GenBank号JX133079.1)或APMV4/duck/Delaware/549227/2010(GenBank号JX987283.1)的HN蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-5诸如例如APMV-5budgerigar/Kunitachi/74(登录号GU206351)或APMV5/budgerigar/Japan/TI/75(登录号LC168750)的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-6诸如例如APMV-6Goose/FarEast/4440/2003(登录号EF569970)或APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77(登录号EU622637)的HN蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-7诸如例如APMV-7dove/Tennessee/4/75(登录号FJ231524)的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-8诸如例如APMV-8goose/Delaware/1053/76(登录号FJ215863)的HN蛋白。在某些实施方案中，非NDVAPMV HN蛋白是APMV-9诸如例如APMV9/duck/New York/22/78(登录号EU910942)的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-10诸如例如APMV-10penguin/FalklandIslands/324/2007(登录号HM147142或NC_025349)的HN蛋白。在某些实施方案中，非NDVAPMV HN蛋白是APMV-11诸如例如APMV-11common_snipe/France/100212/2010(登录号JQ886184)的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-12诸如例如APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(登录号KC333050)的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-14诸如例如APMV-14duck/Japan/11OG0352/2011(登录号KX258200)的HN蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-15诸如例如APMV-15calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(登录号KX932454)的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-17诸如例如APMV17/Antarctica/107/13(登录号MK167211)的HN蛋白。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-20诸如例如APMV-20Gull/Kazakhstan/2014(登录号MF033136)的HN蛋白。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白是APMV-21诸如例如APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17(登录号MK67743)的HN蛋白。
在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是AMPV-2、AMPV-3、AMPV-4、AMPV-5、AMPV-6、AMPV-7、AMPV-8、AMPV-9、AMPV-10、AMPV-11、AMPV-12、AMPV-13、AMPV-14、AMPV-15、AMPV-16、AMPV-17、AMPV-18、AMPV-19、AMPV-20或AMPV-21的HN蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-2诸如例如Chicken/California/Yucaipa/56(登录号EU338414)的HN蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-3诸如例如APMV3/Turkey/Wisconsin/68(登录号EU782025)的HN蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-4诸如例如APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75(登录号FJ177514)、APMV4/Duck/China/G302/2012(GenBank号KC439346.1)、APMV4/mallard/Belgium/15129/07(GenBank号JN571485)、APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(GenBank号KU601399.1)、APMV-4/Egyptian goose/SouthAfrica/N1468/2010(GenBank号JX133079.1)或APMV4/duck/Delaware/549227/2010(GenBank号JX987283.1)的HN蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-5诸如例如APMV-5budgerigar/Kunitachi/74(登录号GU206351)或APMV5/budgerigar/Japan/TI/75(登录号LC168750)的HN蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDVAPMV HN蛋白的变体是APMV-6诸如例如APMV-6Goose/FarEast/4440/2003(登录号EF569970)或APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77(登录号EU622637)的HN蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-7诸如例如APMV-7dove/Tennessee/4/75(登录号FJ231524)的HN蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-8诸如例如APMV-8goose/Delaware/1053/76(登录号FJ215863)的HN蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-9诸如例如APMV9/duck/NewYork/22/78(登录号EU910942)的HN蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-10诸如例如APMV-10penguin/Falkland Islands/324/2007(登录号HM147142或NC_025349)的HN蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-11诸如例如APMV-11common_snipe/France/100212/2010(登录号JQ886184)的HN蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-12诸如例如APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(登录号KC333050)的HN蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-14诸如例如APMV-14duck/Japan/11OG0352/2011(登录号KX258200)的HN蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-15诸如例如APMV-15calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(登录号KX932454)的HN蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-17诸如例如APMV17/Antarctica/107/13(登录号MK167211)的HN蛋白的变体。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-20诸如例如APMV-20Gull/Kazakhstan/2014(登录号MF033136)的HN蛋白的变体。在某些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白的变体是APMV-21诸如例如APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17(登录号MK67743)的HN蛋白的变体。
在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白与NDV HN蛋白具有小于65％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白与NDV HN蛋白具有小于60％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白与NDV HN蛋白具有小于50％的同一性。在一些实施方案中，非NDVAPMV HN蛋白与NDV HN蛋白具有小于55％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白与NDV HN蛋白具有小于50％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白与NDV HN蛋白具有小于45％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白与NDV HN蛋白具有小于40％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白与NDV HN蛋白具有小于35％的同一性。在一些实施方案中，非NDV APMV HN蛋白与NDV HN蛋白具有至少20％或至少25％的同一性，但小于65％、小于60％、小于55％、小于50％或小于45％的同一性。在一些实施方案中，NDV HN蛋白是NDV LaSota HN蛋白。
在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含SEQ IDNO:1中所示的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含SEQ ID NO:2中所示的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含SEQ ID NO:3中所示的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含SEQ ID NO:4中所示的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含SEQ ID NO:5中所示的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDVF蛋白的编码序列已被替换为包含SEQ ID NO:6中所示的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含SEQ ID NO:7中所示的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含SEQID NO:8中所示的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含SEQ ID NO:9中所示的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDVHN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含SEQ ID NO:10中所示的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含SEQ ID NO:11中所示的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含SEQ ID NO:12中所示的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含SEQ ID NO:13中所示的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含SEQ ID NO:14中所示的编码序列的核苷酸序列。在具体实施方案中，NDV基因组包含替换的NDV HN和F蛋白编码序列，以及(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，和(4)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。
在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含与SEQ IDNO:1中所示的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含与SEQ ID NO:2中所示的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含与SEQ ID NO:3中所示的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含与SEQ ID NO:4中所示的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含与SEQ ID NO:5中所示的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDVF蛋白的编码序列已被替换为包含与SEQ ID NO:6中所示的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含与SEQ ID NO:7中所示的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含与SEQ ID NO:8中所示的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含与SEQ ID NO:9中所示的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含与SEQ ID NO:10中所示的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含与SEQ IDNO:11中所示的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含与SEQ ID NO:12中所示的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含与SEQ ID NO:13中所示的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的编码序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中NDV HN蛋白和NDV F蛋白的编码序列已被替换为包含与SEQ ID NO:14中所示的编码序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的编码序列的核苷酸序列。在具体实施方案中，NDV基因组包含替换的NDV HN和F蛋白编码序列，以及(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，和(4)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。
在另一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为包含SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列的核苷酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDVF蛋白的核苷酸序列已被替换为包含SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列的核苷酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为包含SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列的核苷酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为包含SEQ ID NO:4中所示的核苷酸序列的核苷酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为包含SEQ ID NO:5中所示的核苷酸序列的核苷酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为包含SEQ ID NO:6中所示的核苷酸序列的核苷酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDVHN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为包含SEQ ID NO:7中所示的核苷酸序列的核苷酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为包含SEQ ID NO:8中所示的核苷酸序列的核苷酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDVF蛋白的核苷酸序列已被替换为包含SEQ ID NO:9中所示的核苷酸序列的核苷酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为包含SEQ ID NO:10中所示的核苷酸序列的核苷酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为包含SEQ ID NO:11中所示的核苷酸序列的核苷酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为包含SEQ ID NO:12中所示的核苷酸序列的核苷酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为包含SEQ ID NO:13中所示的核苷酸序列的核苷酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为包含SEQ ID NO:14中所示的核苷酸序列的核苷酸序列。在具体实施方案中，NDV基因组包含替换的NDV HN和F蛋白编码序列，以及(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，和(4)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。
本领域技术人员将理解，NDV基因组RNA序列是与编码NDV基因组的cDNA序列的负义链相对应的RNA序列。因此，任何将核苷酸序列转换为其反向互补序列的程序都可用于将编码NDV基因组的cDNA序列转换为基因组RNA序列(参见例如，www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html、www.fr33.net/seqedit.php和DNAStar)。因此，下文表1和3中提供的核苷酸序列可容易地被本领域技术人员转换为NDV基因组的负义RNA序列。在一些实施方案中，NDV基因组的核苷酸序列属于本领域技术人员已知的任何株系的NDV。关于示例性株系，参见例如第5.1.2节。在具体实施方案中，NDV基因组的核苷酸序列属于LaSota株系。在某些实施方案中，NDV基因组的核苷酸序列属于弱毒型株系。在一些实施方案中，NDV基因组的核苷酸序列属于中毒型株系。在某些实施方案中，NDV基因组的核苷酸序列属于强毒型。NDV基因组的核苷酸序列可以是cDNA序列或RNA序列(例如，负义RNA或正义RNA)。
在一些实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含没有GFP编码序列的SEQ ID NO:44的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含与SEQ ID NO:44的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含与没有GFP编码序列的SEQ ID NO:44的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。在某个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含没有GFP编码序列的SEQ ID NO:44的核苷酸序列和编码异源序列诸如抗原的转基因。
在一些实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含SEQ ID NO:45的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含没有GFP编码序列的SEQ ID NO:45的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含与SEQ ID NO:45的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含与没有GFP编码序列的SEQ ID NO:45的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。在某个实施方案中，本文提供了一种核酸序列，该核酸序列包含没有GFP编码序列的SEQ ID NO:45的核苷酸序列和编码异源序列诸如抗原的转基因。
在一些实施方案中，本文所述的核酸序列或核苷酸序列经过密码子优化。关于密码子优化信息和技术的描述，参见第5.1.4节。
在某些实施方案中，本文所述的核酸序列不包含编码除了非NDV APMV HN蛋白或其变体以外的异源蛋白的异源序列。在某些实施方案中，本文所述的核酸序列不包含编码除了非NDV APMV F蛋白或其变体以外的异源蛋白的异源序列。在某些实施方案中，本文所述的核酸序列不包含编码除了非NDV APMV HN蛋白或其变体和非NDV APMV F蛋白或其变体以外的异源蛋白的异源序列。
在某些实施方案中，本文所述的核酸序列还包含转基因，该转基因包含编码异源序列(例如，异源蛋白)的核苷酸序列。在某些实施方案中，本文所述的核酸序列还包含转基因，该转基因包含编码抗原的核苷酸序列。关于可掺入到本文所述核酸序列中的转基因的描述，参见第5.1.3节。
在具体实施方案中，本文所述的核酸序列用于产生本文所述的重组NDV。在具体实施方案中，本文所述的核酸序列是本文所述的重组NDV的一部分。
在具体实施方案中，本文所述的核酸序列或核苷酸序列是重组核酸序列或重组核苷酸序列。在某些实施方案中，本文所述的核苷酸序列或核酸序列可以是DNA分子(例如，cDNA)、RNA分子或DNA和RNA分子的组合。在一些实施方案中，本文所述的核苷酸序列或核酸序列可包含DNA或RNA分子的类似物。此类类似物可使用例如核苷酸类似物产生，其包括但不限于肌苷、甲基胞嘧啶、假尿苷或三苯甲基化碱基。此类类似物还可包含含有修饰骨架的DNA或RNA分子，该修饰骨架向分子赋予有益的属性，例如核酸酶抗性或增加的跨越细胞膜的能力。核酸或核苷酸序列可以是单链的、双链的，可以含有单链和双链部分，并且可以含有三链部分。在一个具体实施方案中，本文所述的核苷酸序列或核酸序列是负义单链RNA。在另一个具体实施方案中，本文所述的核苷酸序列或核酸序列是正义单链RNA。在另一个具体实施方案中，本文所述的核苷酸序列或核酸序列是cDNA。
在具体实施方案中，核酸序列被分离。在某些实施方案中，“分离的”核酸序列是指与存在于该核酸的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。换句话讲，分离的核酸序列可包含在自然界中与其不相关的异源核酸。在其他实施方案中，“分离的”核酸序列诸如cDNA或RNA序列在通过重组技术产生时可基本上不含其他细胞物质或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。术语“基本上不含细胞物质”包括核酸序列的制备物，其中核酸序列与细胞的细胞组分分离，该核酸序列是从这些细胞中分离或重组产生的。因此，基本上不含细胞物质的核酸序列包括具有小于约30％、20％、10％或5％(以干重计)其他核酸的核酸序列制备物。术语“基本上不含培养基”包括核酸序列的制备物，其中培养基占制备物体积的小于约50％、20％、10％或5％。术语“基本上不含化学前体或其他化学物质”包括这样的制备物，其中核酸序列与参与核酸序列合成的化学前体或其他化学物质分离。在具体实施方案中，除了感兴趣的核酸序列以外，核酸序列的此类制备物具有小于约50％、30％、20％、10％、5％(以干重计)的化学前体或化合物。
5.1.2NDV骨架
任何NDV型或株系都可用作“骨架”，其中编码NDV F蛋白的核苷酸序列和/或编码NDV HN蛋白的核苷酸序列分别被替换为非NDV APMV F蛋白编码序列或其变体和/或非NDVHN编码序列或其变体。此外，任何NDV型或株系都可用作“骨架”，其中编码NDV F蛋白的核苷酸序列和/或编码NDV HN蛋白的核苷酸序列分别被替换为嵌合F蛋白编码序列和/或嵌合HN编码序列。例如，NDV可以是天然存在的株系、变体、突变体、诱变病毒和/或经基因工程改造的病毒。在一个具体实施方案中，NDV骨架是弱毒型NDV。在另一个具体实施方案中，NDV骨架是LaSota株系。可用作NDV骨架的NDV株系的其他实例包括NDV Fuller株系、NDV Ulster株系或NDV Hitchner B1株系。在一些实施方案中，除NDV Hitchner B1株系以外的弱毒型株系用作骨架。在一个具体实施方案中，NDV骨架是天然存在的株系。在某些实施方案中，NDV骨架是裂解性株系。在其他实施方案中，NDV骨架是非裂解性株系。在某些实施方案中，NDV骨架是弱毒型株系。在一些实施方案中，NDV骨架是中毒型株系。在其他实施方案中，NDV骨架是强毒型株系。NDV株系的具体实例包括但不限于73-T株系、NDV HUJ株系、Ulster株系(参见例如GenBank号U25837)、Fuller株系、MTH-68株系、Italien株系(参见例如GenBank号EU293914)、Hickman株系(参见例如GenBank号AF309418)、PV701株系、Hitchner B1株系(参见例如GenBank号AF309418或NC_002617)、La Sota株系(参见例如GenBank号AY845400、AF07761.1和JF950510.1及GI号56799463)、YG97株系(参见例如GenBank号AY351959或AY390310)、MET95株系(参见例如GenBank号AY143159)、Roakin株系(参见例如GenBank号AF124443)以及F48E9株系(参见例如GenBank号AF163440和U25837)。在一个具体实施方案中，NDV骨架是HitchnerB1株系。在另一个实施方案中，NDV骨架是由GenBank号AF309418或NC_002617标识的B1株系。在另一个具体实施方案中，NDV骨架是La Sota株系。在一个具体实施方案中，La Sota基因组的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:15中所示的cDNA序列的负义链相对应的RNA序列。在另一个实施方案中，NDV骨架是由GenBank号AY845400、AF07761.1或JF950510.1标识的LaSota株系。
本领域技术人员将理解，NDV基因组RNA序列是与编码NDV基因组的cDNA序列的负义链相对应的RNA序列。因此，任何将核苷酸序列转换为其反向互补序列的程序都可用于将编码NDV基因组的cDNA序列转换为基因组RNA序列(参见例如，www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html、www.fr33.net/seqedit.php和DNAStar)。
在具体实施方案中，如由技术人员已知的技术所评估，NDV骨架在鸟类中没有致病性。在某些具体实施方案中，如通过向1日龄小鸡颅内注射病毒并在8天内对疾病发展和死亡进行评分来评估，NDV骨架没有致病性。在一些实施方案中，NDV骨架的颅内致病指数小于0.7、小于0.6、小于0.5、小于0.4、小于0.3、小于0.2或小于0.1。在某些实施方案中，NDV骨架的颅内致病指数为零。关于该测定法的描述，参见例如OIE Terrestrial Manual 2012,第2.3.14章,标题为“Newcastle Disease(Infection With Newcastle Disease Virus)”，该文献可在以下网址找到：www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.03.14_NEWCASTL E_DIS.pdf，其全文以引用方式并入本文。
在某些实施方案中，NDV骨架是一种中毒型株系，其经过基因工程改造，使得如由本领域技术人员已知的技术所评估，其被认为在鸟类中没有致病性。在某些实施方案中，NDV骨架是一种强毒型株系，其经过基因工程改造，使得如由本领域技术人员已知的技术所评估，其被认为在鸟类中没有致病性。
在优选的实施方案中，NDV骨架在人类或牛中是非致病性的。在优选的实施方案中，NDV骨架在人类、牛和禽类中是非致病性的。在某些实施方案中，NDV骨架被减毒，使得NDV至少部分保持感染性，并可在体内复制，但仅产生低滴度，导致非致病性的亚临床感染水平(参见例如Khattar等人,2009,J.Virol.83:7779-7782)。这种减毒NDV可能特别适用于向受试者施用该病毒以充当免疫原(例如，活疫苗)的实施方案。这些病毒可通过本领域已知的任何方法减毒。在一个具体实施方案中，NDV基因组包含减毒病毒感染和复制所必需的序列，使得产生后代并且感染水平是亚临床的。
5.1.3转基因
在一个具体实施方案中，将包含编码抗原的核苷酸序列的转基因掺入到本文(例如，第5.1.1节或第6节)所述的核酸序列中，该核酸序列包含NDV基因组的核苷酸序列，其中NDV F蛋白编码序列和/或NDV HN蛋白编码序列已经如本文所述的那样被替换。可将转基因插入到任何NDV型或株系(例如，NDV LaSota株系)的NDV基因组的核苷酸序列中，其中NDV F蛋白编码序列和/或NDV HN蛋白编码序列已经如本文所述的那样被替换。本领域技术人员将能够使用抗原的序列信息产生转基因，以用于掺入到任何NDV型或株系的NDV基因组的核苷酸序列中，其中NDV F蛋白编码序列和/或NDV HN蛋白编码序列已经如本文所述的那样被替换。鉴于核酸密码的简并性，有许多不同的核酸序列可编码相同的抗原。在一个具体实施方案中，包含编码抗原的核苷酸序列的转基因经过密码子优化。在一个具体实施方案中，抗原的编码序列经过密码子优化。关于密码子优化的相关讨论，参见例如下文第5.1.4节。可将包含编码抗原的核苷酸序列的转基因掺入在任何两个NDV转录单元之间(例如，在NDV P和M转录单元之间，或者在HN和L转录单元之间)。被掺入到NDV基因组中的本文所述的转基因使得感染本文所述的重组NDV的细胞表达由转基因编码的抗原。
在另一个实施方案中，本文描述了转基因，该转基因包含编码嵌合抗原的核苷酸序列，其中嵌合抗原包含抗原胞外结构域及NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。换句话讲，NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域替换了抗原的跨膜结构域和胞质结构域，因此嵌合蛋白不包括抗原跨膜结构域和胞质结构域。在某些实施方案中，抗原的跨膜结构域的一个、两个或更多个氨基酸残基，但抗原的跨膜结构域的少于10个氨基酸残基是嵌合抗原的一部分。可使用本领域技术人员已知的技术来确定抗原和NDV F蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。例如，可使用公开的信息、GenBank或网址诸如VIPR病毒病原体网址(www.viprbrc.org)、DTU生物信息学领域网址(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)或可用于确定跨膜结构域的程序来确定抗原和NDV F蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。关于用于产生嵌合抗原的方法，参见例如Park等人,2006,PNAS,2006年5月23日,103(21)8203-8208、国际专利申请号WO2007/064802和U.S.9,387,242 B2。在一个具体实施方案中，本文描述了转基因，该转基因包含编码嵌合抗原的核苷酸序列，其中嵌合抗原包含I类蛋白抗原的胞外结构域及NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。
在另一个实施方案中，本文描述了转基因，该转基因包含编码嵌合抗原的核苷酸序列，其中嵌合抗原包含抗原胞外结构域及NDV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域。换句话讲，NDV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域替换了抗原的跨膜结构域和胞质结构域，因此嵌合蛋白不包括抗原跨膜结构域和胞质结构域。在某些实施方案中，抗原的跨膜结构域的一个、两个或更多个氨基酸残基，但抗原的跨膜结构域的少于10个氨基酸残基是嵌合抗原的一部分。可使用本领域技术人员已知的技术来确定抗原和NDV HN蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。例如，可使用公开的信息、GenBank或网址诸如VIPR病毒病原体网址(www.viprbrc.org)、DTU生物信息学领域网址(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)或可用于确定跨膜结构域的程序来确定抗原和NDV HN蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。关于用于产生嵌合抗原的方法，参见例如Park等人,2006,PNAS,2006年5月23日,103(21)8203-8208、国际专利申请号WO2007/064802和U.S.9,387,242B2。在一个具体实施方案中，本文描述了转基因，该转基因包含编码嵌合抗原的核苷酸序列，其中嵌合抗原包含II类蛋白抗原的胞外结构域及NDV HN蛋白跨膜结构域和胞质结构域。
在某些实施方案中，转基因包含编码嵌合抗原的核苷酸序列，其中嵌合抗原包含SARS-CoV-2刺突蛋白胞外结构域或其片段(例如，包含受体结合结构域的片段)及NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。在一些实施方案中，转基因包含编码嵌合抗原的核苷酸序列，其中嵌合抗原包含hMPV F蛋白胞外结构域或其片段及NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。在某些实施方案中，转基因包含编码嵌合抗原的核苷酸序列，其中嵌合抗原包含RSV F蛋白胞外结构域或其片段及NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域。
可将转基因插入到任何NDV型或株系(例如，NDV LaSota株系)的NDV基因组的核苷酸序列中，其中NDV F蛋白编码序列和/或NDV HN蛋白编码序列已经如本文所述的那样被替换。本领域技术人员将能够使用嵌合抗原的序列信息产生转基因，以用于掺入到任何NDV型或株系的NDV基因组的核苷酸序列中，其中NDV F蛋白编码序列和/或NDV HN蛋白编码序列已经如本文所述的那样被替换。鉴于核酸密码的简并性，有许多不同的核酸序列可编码相同的嵌合抗原。在一个具体实施方案中，包含编码嵌合抗原的核苷酸序列的转基因经过密码子优化。在一个具体实施方案中，本文描述了一种转基因，该转基因包含编码嵌合抗原的核苷酸序列，其中嵌合抗原包含抗原胞外结构域及NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域，并且其中抗原的胞外结构域由密码子优化的核酸序列编码。关于密码子优化的相关讨论，参见例如下文第5.1.4节。可将编码了编码嵌合抗原的核苷酸序列的转基因掺入在任何两个NDV转录单元之间(例如，在NDV P和M转录单元之间，或者在HN和L转录单元之间)。
在某些实施方案中，包含编码抗原或嵌合抗原的核苷酸序列的转基因包含NDV调节信号(例如，基因末端、基因间和基因起始序列)和Kozak序列。在一些实施方案中，包含编码抗原或嵌合抗原的核苷酸序列的转基因包含NDV调节信号(例如，基因末端、基因间和基因起始序列)、Kozak序列和便于克隆的限制性位点。在某些实施方案中，编码抗原或嵌合抗原的转基因包含NDV调节信号(基因末端、基因间和基因起始序列)、Kozak序列、便于克隆的限制性位点和非编码区中的附加核苷酸以确保符合六倍规则。在一个优选的实施方案中，转基因符合六倍规则。
在某些实施方案中，抗原是传染病抗原。传染病包括由病毒、细菌、真菌和原生动物引起的那些疾病。在一些实施方案中，抗原是病原体的抗原。在某些实施方案中，抗原是病毒、细菌、真菌或原生动物抗原。抗原可以是由病毒、细菌、真菌、原生动物或其他病原体表达的蛋白质的片段。在一个具体实施方案中，抗原是病毒抗原。病毒抗原可以是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)抗原、人类偏肺病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、埃博拉病毒抗原、拉沙病毒抗原、尼帕病毒抗原或中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)抗原。在一些实施方案中，病毒抗原是表面糖蛋白。病毒抗原可以是表面糖蛋白或包膜蛋白的片段。在一些实施方案中，本文使用的抗原与自然界中发现的抗原具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。例如，抗原可与天然存在的病毒抗原(例如，SARS-CoV-2抗原、RSV抗原、埃博拉病毒抗原、MERS-CoV抗原、hMPV抗原、拉沙病毒抗原或尼帕病毒抗原)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在某个实施方案中，抗原是来自或来源于引起大流行病或流行病的病原体(例如，病毒、细菌等)的抗原。
在一个实施方案中，病毒抗原是SARS-CoV-2抗原。在另一个实施方案中，病毒抗原是SARS-CoV-2核衣壳蛋白或其片段。如本文所用，术语“SARS-CoV-2核衣壳”是指本领域技术人员已知的SARS-CoV-2核衣壳。在某些实施方案中，核衣壳蛋白包含在GenBank登录号MT081068.1、MT081066.1或MN908947.3处找到的氨基酸或核酸序列。关于SARS-CoV-2核衣壳蛋白的氨基酸序列和编码SARS-CoV-2核衣壳蛋白的核苷酸序列的实例，也参见例如GenBank登录号MN908947.3、MT447160、MT44636、MT446360、MT444593、MT444529、MT370887和MT334558。
在另一个实施方案中，病毒抗原是SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段。在一些实施方案中，SARS-CoV-2刺突蛋白的片段包含该蛋白的受体结合结构域(或由其组成)。在某些实施方案中，SARS-CoV-2刺突蛋白的片段包含该蛋白的S1或S2结构域(或由其组成)。在一些实施方案中，SARS-CoV-2刺突蛋白的片段包含该蛋白的胞外结构域(或由其组成)。如本文所用，术语“SARS-CoV-2刺突蛋白”和“SARS-CoV-2的刺突蛋白”是指本领域技术人员已知的SARS-CoV-2刺突蛋白。关于SARS-CoV-2刺突蛋白的氨基酸序列和编码SARS-CoV-2刺突蛋白的核苷酸序列的实例，也参见例如GenBank登录号MN908947.3、MT447160、MT44636、MT446360、MT444593、MT444529、MT370887和MT334558。在某些实施方案中，刺突蛋白包含在GenBank登录号MN908947.3处找到的氨基酸或核酸序列。在某些实施方案中，刺突蛋白包含SARS-CoV-2变体的氨基酸或核酸序列。在一些实施方案中，刺突蛋白包含B.1.1.7的氨基酸或核酸序列。在具体实施方案中，刺突蛋白包含20I/501Y.V1(BEI参考分离株NR-54000)的氨基酸或核酸序列。在一些实施方案中，刺突蛋白包含P.1的氨基酸或核酸序列。在具体实施方案中，刺突蛋白包含20J/501Y.V3(BEI参考分离株NR-54982)的氨基酸或核酸序列。在一些实施方案中，刺突蛋白包含B.1.351的氨基酸或核酸序列。在具体实施方案中，刺突蛋白包含20H/501.V2(BEI参考分离株NR-54009)的氨基酸或核酸序列。在一些实施方案中，刺突蛋白包含B.1.4271的氨基酸或核酸序列。在具体实施方案中，刺突蛋白包含20C/S:452R的氨基酸或核酸序列。在一些实施方案中，刺突蛋白包含B.1.429的氨基酸或核酸序列。在具体实施方案中，刺突蛋白包含20C/S:452R的氨基酸或核酸序列。典型的刺突蛋白包含本领域技术人员已知的结构域，包括S1结构域、受体结合结构域、S2结构域、跨膜结构域和胞质结构域。关于SARS-CoV-2刺突蛋白(特别是这种蛋白的结构)的描述，参见例如Wrapp等人,2020,Science 367:1260-1263。刺突蛋白可被表征为具有信号肽(例如，GenBank登录号MN908947.3的氨基酸序列的1-14个氨基酸残基的信号肽)、受体结合结构域(例如，GenBank登录号MN908947.3的319-541个氨基酸残基的受体结合结构域)、胞外结构域(例如，GenBank登录号MN908947.3的15-1213个氨基酸残基的胞外结构域)以及跨膜和胞内结构域(例如，GenBank登录号MN908947.3的1214-1273个氨基酸残基的跨膜和胞内结构域)。在某些实施方案中，病毒抗原是SARS-CoV-2刺突蛋白的片段。该片段可包含SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合结构域。该片段可包含SARS-CoV-2刺突蛋白的S1结构域、S2结构域或胞外结构域。术语“SARS-CoV-2刺突蛋白”涵盖通过翻译后加工修饰的SARS-CoV-2刺突多肽，该翻译后加工诸如为信号肽裂解、二硫键形成、糖基化(例如，N-连接的糖基化)、蛋白酶裂解和脂质修饰(例如，S-棕榈酰化)。在一些实施方案中，SARS-CoV-2刺突蛋白包括信号序列。在其他实施方案中，SARS-CoV-2刺突蛋白不包括信号序列。信号序列可以是天然存在的信号肽序列或其变体。在一些实施方案中，信号肽是SARS-CoV-2刺突蛋白信号肽。在一些实施方案中，信号肽与SARS-CoV-2刺突蛋白信号肽是异源的。
在一些实施方案中，本文提供了一种SARS-CoV-2抗原，其包含衍生SARS-CoV-2刺突蛋白胞外结构域及NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域，其中该衍生物包含SARS-CoV-2刺突蛋白胞外结构域，其中：(1)与在GenBank登录号MN908947.3处找到的SARS-CoV-2刺突蛋白的氨基酸残基817、892、899、942、986和987相对应的氨基酸残基被脯氨酸取代，以及(2)与氨基酸残基682至685相对应的氨基酸残基被取代，使得多碱性裂解位点失活。在具体实施方案中，如果多碱性裂解位点不能被例如弗林蛋白酶裂解，则该位点失活。在一个具体实施方案中，与在GenBank登录号MN908947.3处找到的SARS-CoV-2刺突蛋白的多碱性裂解位点的氨基酸残基682至685相对应的氨基酸残基被单个丙氨酸取代。在某些实施方案中，NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域通过接头序列(例如，GGGGS(SEQ ID NO:46))与SARS-CoV-2刺突蛋白胞外结构域的衍生物融合。在一些实施方案中，接头是甘氨酸(G)接头或甘氨酸和丝氨酸(GS)接头。例如，接头可包含(GGGGS)n的序列，其中n是1、2、3、4、5或更多(SEQID NO:47)。在另一个实例中，接头可包含(G)n，其中n是2、3、4、5、6、7、8或更大。在一个具体实施方案中，接头包含序列GGGGS(SEQ ID NO:46)。在一些实施方案中，NDV F蛋白跨膜结构域和胞质结构域直接与SARS-CoV-2刺突蛋白胞外结构域的衍生物融合。在一个具体实施方案中，NDV F蛋白和嵌合F蛋白被掺入到NDV病毒粒子中。
在一个实施方案中，病毒抗原是人类偏肺病毒抗原。在另一个实施方案中，病毒抗原是人类偏肺病毒G蛋白或其片段。“人类偏肺病毒G蛋白”和“hMPV G蛋白”是指本领域技术人员已知的任何人类偏肺病毒G蛋白。在另一个实施方案中，病毒抗原是人类偏肺病毒F蛋白或其片段。“人类偏肺病毒F蛋白”和“hMPV F蛋白”是指本领域技术人员已知的任何人类偏肺病毒F蛋白。hMPV F蛋白被合成为F0非活性前体。F0非活性前体在细胞内成熟过程中需要裂解。hMPV F被裂解形成F1和F2。hMPV F蛋白在融合前和融合后以两种构象存在。GenBankTM登录号AY145301.1和KJ627437.1提供了编码hMPV F蛋白的示例性核酸序列。GenBankTM登录号AAN52915.1、AHV79975.1、AGJ74035.1和AGZ48845.1提供了示例性hMPV F蛋白氨基酸序列。术语“hMPV F蛋白”和“人类偏肺病毒F蛋白”涵盖通过翻译后加工修饰的hMPV F多肽，该翻译后加工诸如为信号肽裂解、二硫键形成、糖基化(例如，N-连接的糖基化)、蛋白酶裂解和脂质修饰(例如，S-棕榈酰化)。在一些实施方案中，hMPV F蛋白包括信号序列。在其他实施方案中，hMPV F蛋白不包括信号序列。信号序列可以是天然存在的信号肽序列或其变体。hMPV F蛋白信号序列的长度通常为18个氨基酸。在一些实施方案中，信号肽是hMPV F蛋白信号肽。在一些实施方案中，信号肽与hMPV F蛋白信号肽是异源的。
在一个实施方案中，病毒抗原是RSV G蛋白或其片段。“RSV G蛋白”和“呼吸道合胞病毒G蛋白”是指本领域技术人员已知的任何呼吸道合胞病毒G蛋白。在一个实施方案中，病毒抗原是RSV F蛋白或其片段。“RSV F蛋白”和“呼吸道合胞病毒F蛋白”是指本领域技术人员已知的任何呼吸道合胞病毒F蛋白。RSV F蛋白通常以同源三聚体的形式存在。RSV F蛋白被合成为高度N-糖基化的F0非活性前体。F0非活性前体需要在细胞内成熟过程中由弗林蛋白酶样蛋白酶裂解。RSV F含有两个弗林蛋白酶位点，并且弗林蛋白酶样蛋白酶裂解产生三种多肽：F2、p27和F1，后者在其N端含有疏水融合肽。RSV F蛋白在融合前和融合后以两种构象存在。RSV F蛋白可以是人RSV F蛋白或牛F蛋白。GenBankTM登录号KJ155694.1、KU950686.1、KJ672481.1、KP119747和AF035006.1提供了编码人RSV F蛋白的示例性核酸序列。GenBankTM登录号AHL84194.1、AMT79817.1、AHX57603.1、AIY70220.1和AAC14902.1提供了示例性人RSV F蛋白氨基酸序列。GenBankTM登录号AF295543.1、AF092942.1和Y17970.1提供了编码牛RSV F蛋白的示例性核酸序列。GenBankTM登录号AAL49399.1、NP_048055.1、AAC96308.1和CAA76980.1提供了示例性牛RSV F蛋白氨基酸序列。术语“RSV F蛋白”和“呼吸道合胞病毒F蛋白”涵盖通过翻译后加工修饰的RSV F多肽，该翻译后加工诸如为信号肽裂解、二硫键形成、糖基化(例如，N-连接的糖基化)、蛋白酶裂解和脂质修饰(例如，S-棕榈酰化)。在一些实施方案中，RSV F蛋白包括信号序列。在其他实施方案中，RSV F蛋白不包括信号序列。信号序列可以是天然存在的信号肽序列或其变体。RSV F蛋白信号序列的长度通常为25个氨基酸。在一些实施方案中，信号肽是RSV F蛋白信号肽。在一些实施方案中，信号肽与RSV F蛋白信号肽是异源的。
在一个实施方案中，抗原是埃博拉病毒抗原(例如，埃博拉病毒糖蛋白GP或其片段，或埃博拉病毒核衣壳或其片段)。在另一个实施方案中，抗原是拉沙病毒抗原(例如，拉沙病毒包膜糖蛋白GP1或其片段，或拉沙病毒包膜糖蛋白GP2或其片段)。在另一个实施方案中，抗原是尼帕病毒抗原(例如，尼帕病毒F或其片段，或尼帕病毒G蛋白或其片段)。在另一个实施方案中，抗原是MERS-CoV抗原(例如，MERS-CoV刺突蛋白或其片段，或核衣壳蛋白或其片段)。
在某些实施方案中，蛋白质的片段包含该蛋白质的至少8、至少10、至少12、至少15个或更多个连续氨基酸。在一些实施方案中，蛋白质的片段包含该蛋白质的至少20、至少30、至少40、至少50个或更多个连续氨基酸。在某些实施方案中，蛋白质的片段包含该蛋白质的至少75、至少100、至少125、至少150个或更多个连续氨基酸。在一些实施方案中，蛋白质的片段包含该蛋白质的至少175、至少200、至少250、至少300个、至少350个或更多个连续氨基酸。
在一些实施方案中，抗原是癌或肿瘤抗原或肿瘤抗原(例如，肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原)。肿瘤抗原特有的抗原可来源于肿瘤组织细胞的细胞表面、细胞质、细胞核、细胞器等。实例包括肿瘤蛋白特有的抗原，包括由突变癌基因编码的蛋白、与肿瘤相关的病毒蛋白和糖蛋白。肿瘤包括但不限于来源于以下癌症类型的肿瘤：唇、鼻咽、咽和口腔、食道、胃、结肠、直肠、肝、胆囊、胰腺、喉、肺和支气管、皮肤黑色素瘤、乳房、子宫颈、子宫、卵巢、膀胱、肾、子宫、脑和神经系统其他部分、甲状腺、前列腺、睾丸、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。在一些实施方案中，癌抗原或肿瘤抗原是HER2、EGFR、VEGF、CD33、CD20、ErbB2、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、APO-1或MUC-1。
5.1.4密码子优化
本领域技术人员已知的任何密码子优化技术都可用于对本文所述的核酸序列或核苷酸序列进行密码子优化。密码子优化的方法是本领域已知的，例如OptimumGeneTM 方案和/>方案，其全部内容以引用方式并入本文。关于用于密码子优化的方法，也参见美国专利号8,326,547，其全部内容以引用方式并入本文。
作为用于密码子优化的示例性方法，本文所述的核酸序列或核苷酸序列的开放框架中的每个密码子被哺乳动物蛋白质中最常用的密码子替换。这可使用基于网络的程序(www.encorbio.com/protocols/Codon.htm)来完成，该程序使用由Department ofPlantGene Research(Kazusa,Japan)维护的密码子用法数据库(Codon Usage Database)。可检查为哺乳动物表达而优化的核酸序列或核苷酸序列的以下方面：(1)可充当转录终止子的5xA或更长的片段的存在；(2)可干扰亚克隆的限制性位点的存在；(3)符合六倍规则。在检查之后，(1)可充当转录终止子的5xA或更长的片段可通过同义突变来替换；(2)可干扰亚克隆的限制性位点可通过同义突变来替换；(3)可添加NDV调节信号(基因末端、基因间和基因起始序列)和用于最佳蛋白质表达的Kozak序列；以及(4)可在非编码区中添加核苷酸以确保符合六倍规则。同义突变通常是不改变编码的氨基酸的核苷酸变化。例如，在6As(AAAAAA)片段(该序列编码Lys-Lys)的情况下，同义序列将是AAGAAG(该序列也编码Lys-Lys)。
5.2NDV的构建
可使用反向遗传学技术产生本文所述的重组NDV(参见例如第5.1和6节)。反向遗传学技术涉及合成重组病毒RNA的制备，该合成重组病毒RNA含有负链病毒RNA的非编码区，该非编码区对于病毒聚合酶的识别和产生成熟病毒粒子所需的包装信号是必需的。重组RNA由重组DNA模板合成，并在体外用纯化的病毒聚合酶复合物重建以形成可用于转染细胞的重组核糖核蛋白(RNP)。如果在体外或体内转录合成RNA期间存在病毒聚合酶蛋白，则可实现更有效的转染。合成的重组RNP可被拯救到感染性病毒粒子中。前述技术在以下文献中有所描述：1992年11月24日发布的美国专利号5,166,057；1998年12月29日发布的美国专利号5,854,037；2000年11月14日发布的美国专利号6,146,642；1996年2月20日公布的欧洲专利公开EP 0702085A1；美国专利申请序列号09/152,845；1997年4月3日公布的国际专利公开PCT WO97/12032；1996年11月7日公布的WO96/34625；欧洲专利公开EP A780475；1999年1月21日公布的WO 99/02657；1998年11月26日公布的WO 98/53078；1998年1月22日公布的WO98/02530；1999年4月1日公布的WO 99/15672；1998年4月2日公布的WO 98/13501；1997年2月20日公布的WO 97/06270；以及1997年6月25日公布的EPO 780475A1，这些文献中的每一篇都全文以引入方式并入本文。
也可利用无辅助质粒技术对本文所述的NDV进行工程化改造。简而言之，构建NDV(例如，Hitchner B1株系或LaSota株系)的完整cDNA，将其插入到质粒载体中并进行工程化改造以在两个转录单元(例如，NDV P和M基因；或者NDV·HN和L基因)之间含有独特限制性位点。编码异源氨基酸序列的核苷酸序列(例如，本文所述的转基因或其他序列，诸如例如编码SARS-CoV-2刺突蛋白的核苷酸序列，编码RSV F蛋白、嵌合F蛋白、hMPV F蛋白的核苷酸序列)可在独特限制性位点处插入到病毒基因组中。另选地，编码异源氨基酸序列的核苷酸序列(例如，转基因或本文所述的其他序列，诸如例如编码SARS-CoV-2刺突蛋白的核苷酸序列，编码RSV F蛋白、嵌合F蛋白、hMPV F蛋白的核苷酸序列)可被工程化改造到NDV转录单元中，只要该插入片段不影响该病毒感染和复制的能力即可。该单一片段位于T7启动子和丁型肝炎病毒核酶之间，以从T7聚合酶产生精确的阴性或阳性转录物。将包含必需病毒蛋白的质粒载体和表达载体转染进细胞中，从而产生重组病毒粒子(参见例如国际公开号WO01/04333；美国专利号7,442,379、6,146,642、6,649,372、6,544,785和7,384,774；Swayne等人(2003).Avian Dis.47:1047-1050；以及Swayne等人(2001).J.Virol.11868-11873，这些文献中的每一篇都全文以引入方式并入)。
从单一mRNA产生多种蛋白质的双顺反子技术是本领域技术人员已知的。双顺反子技术允许通过使用IRES序列将多种蛋白质的编码序列工程化改造到单一mRNA中。IRES序列指导核糖体内部募集到RNA分子，并允许以非帽依赖性方式进行下游翻译。简而言之，一种蛋白质的编码区被插入在第二种蛋白质的ORF的下游。该插入片段的侧翼是IRES以及任何正确表达和/或功能所必需的非翻译信号序列。该插入片段必须不破坏第二种蛋白质的开放阅读框、多聚腺苷酸化或转录启动子(参见例如García-Sastre等人,1994,J.Virol.68:6254-6261和García-Sastre等人,1994Dev.Biol.Stand.82:237-246，这些文献中的每一篇都全文以引入方式并入本文)。
用于克隆重组NDV以编码转基因并表达由转基因编码的异源蛋白(例如，编码SARS-CoV-2刺突蛋白、RSV F蛋白、嵌合F蛋白、hMPV F蛋白的转基因)的方法是本领域技术人员已知的，诸如例如将转基因插入到已被工程化改造到NDV基因组中的限制性位点中，在转基因中添加适当的信号以便被NDV RNA依赖性RNA聚合酶识别(例如，允许NDV聚合酶识别前一基因的末端和转基因的起始的转基因开放阅读框上游的序列，其可例如由单个核苷酸基因间序列隔开)，添加有效的Kozak序列(例如，以改善真核核糖体翻译)；掺入满足NDV克隆“六倍规则”的转基因；以及添加沉默突变以去除转基因内的外来基因末端和/或基因起始序列。关于六倍规则，本领域技术人员将理解NDV(更一般地，副粘病毒科的大多数成员)的有效复制依赖于基因组长度是六的倍数，称为“六倍规则”(参见例如Calain,P.和Roux,L.The rule of six,a basic feature of efficient replication of Sendai virusdefective interfering RNA.J.Virol.67,4822-4830(1993))。因此，当构建本文所述的重组NDV时，应注意满足NDV克隆的“六倍规则”。可使用本领域技术人员已知的满足NDV克隆六倍规则的方法，诸如例如在转基因下游添加核苷酸。关于用于克隆和拯救NDV(例如，重组NDV)的方法的讨论，参见例如Ayllon等人,Rescue of Recombinant Newcastle DiseaseVirus from cDNA.J.Vis.Exp.(80),e50830,doi:10.3791/50830(2013)，该文献全文以引用方式并入本文。
在一个具体实施方案中，可根据下文第6节所述的方法产生本文所述的NDV(参见例如第5.1和6节)。
5.3NDV的增殖
本文(例如，第5.1和6节)所述的重组NDV可在使该病毒生长至允许使用本文所述病毒的滴度的任何底物中繁殖。在一个实施方案中，底物允许本文所述的重组NDV生长至与对应野生型病毒所确定的滴度相当的滴度。
本文(例如，第5.1节和6节)所述的重组NDV可在易受该病毒感染的细胞(例如，禽类细胞、鸡细胞等)、孵化蛋(例如，鸡蛋或鹌鹑蛋)或动物(例如，鸟类)中生长。这些方法是本领域技术人员熟知的。在一个具体实施方案中，本文所述的重组NDV可在癌细胞(cancercell)例如上皮癌细胞(carcinoma cell)(例如，乳腺癌细胞和前列腺癌细胞)、肉瘤细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞和生殖细胞肿瘤细胞(例如，睾丸癌细胞和卵巢癌细胞)中增殖。在另一个具体实施方案中，本文所述的重组NDV可在细胞系例如癌细胞系诸如HeLa细胞、MCF7细胞、THP-1细胞、U87细胞、DU145细胞、Lncap细胞和T47D细胞中增殖。在某些实施方案中，细胞或细胞系(例如，癌细胞或癌细胞系)是从人获得、衍生或者获得并衍生的。在另一个实施方案中，本文所述的重组NDV在干扰素缺陷系统或干扰素(IFN)缺陷底物诸如例如IFN缺陷细胞(例如，IFN缺陷细胞系)或IFN缺陷孵化蛋中增殖。在另一个实施方案中，本文所述的重组NDV在鸡细胞或孵化鸡蛋中繁殖。代表性的鸡细胞包括但不限于鸡胚成纤维细胞和鸡胚肾细胞。在一个具体实施方案中，本文所述的重组NDV在Vero细胞中增殖。在另一个具体实施方案中，本文所述的重组NDV在鸡蛋或鹌鹑蛋中繁殖。在某些实施方案中，本文所述的重组NDV病毒首先在孵化蛋中繁殖，然后在细胞(例如，细胞系)中繁殖。
本文所述的重组NDV可在例如6至14日龄、6至12日龄、6至10日龄、6至9日龄、6至8日龄、8至10日龄或10至12日龄的孵化蛋中繁殖。在一个具体实施方案中，10日龄孵化鸡蛋用于繁殖本文所述的重组NDV。幼龄或不成熟的孵化蛋可用于繁殖本文所述的重组NDV。不成熟的孵化蛋涵盖小于十日龄的蛋，例如6至9日龄或6至8日龄的IFN缺陷蛋。不成熟的孵化蛋还涵盖由于以下原因而人工模拟至多但不到十日龄的不成熟蛋的蛋：生长条件改变，例如孵化温度改变；用药物处理；或导致蛋发育迟缓的任何其他改变，使得与十至十二日龄蛋相比，IFN系统没有完全发育。本文所述的重组NDV可在孵化蛋的不同位置(例如，尿囊腔)中繁殖。关于生长和繁殖病毒的详细讨论，参见例如美国专利号6,852,522和美国专利号7,494,808，这两份专利据此全文以引用方式并入。
对于病毒分离，本文所述的重组NDV可从孵化蛋或细胞培养物中取出，并与细胞组分分离，通常通过熟知的澄清程序，例如诸如离心、深层过滤和微量过滤，并可根据需要使用本领域技术人员熟知的程序例如切向流过滤(TFF)、密度梯度离心、差异提取或色谱法进一步纯化。
在一个具体实施方案中，从受感染的蛋(例如，鸡蛋)的尿囊液中分离病毒从收获尿囊液开始，使用过滤系统来澄清该尿囊液，以除去细胞和其他大的碎片，具体地，该过滤系统包括具有净正电荷的膜，使得宿主细胞DNA明显减少。随后通过切向流过滤对澄清的物料进行处理。然后将浓缩的澄清物料用四倍透析体积的高盐缓冲液渗滤，接着用四倍透析体积的低盐制剂缓冲液渗滤，随后浓缩大约10倍。因此，残留的卵蛋白(例如，主要是卵清蛋白)和残留的DNA被减少到可接受的水平，并且缓冲液被更换为适合将重组NDV配制成将向受试者施用的组合物的缓冲液。然后将所得产物通过过滤器(例如，0.2μm过滤器)进行无菌过滤，分配到合适的无菌储存容器中，冷冻，并储存在-70摄氏度。
在一个具体实施方案中，根据第6节所述的方法繁殖、分离和/或纯化本文所述的重组NDV(参见例如第5.1和6节)。在一个具体实施方案中，本文所述的重组NDV(参见例如第5.1和6节)被增殖、分离或纯化，或者前述的任何两种或全部。
在一个具体实施方案中，本文提供了一种细胞(例如，细胞系)或孵化蛋(例如，鸡孵化蛋)，其包含本文所述的重组NDV。在一些实施方案中，该细胞是体外的或离体的。该细胞可以是原代细胞或细胞系。该细胞可以是哺乳动物(例如，人)细胞或细胞系。在一些实施方案中，该细胞是本文所述的细胞或细胞系。在一些实施方案中，孵化蛋是IFN缺陷型底物。在一些实施方案中，孵化蛋是本文所述的孵化蛋。在另一个具体实施方案中，本文提供了一种用于繁殖本文所述的重组NDV的方法，该方法包括培养感染了重组NDV的细胞(例如，细胞系)或孵化蛋(例如，鸡孵化蛋)。在一些实施方案中，该方法还可包括从细胞或孵化蛋中分离或纯化重组NDV。在一个具体实施方案中，本文提供了一种繁殖本文所述的重组NDV的方法，该方法包括(a)培养感染了本文所述的重组NDV的细胞(例如，细胞系)或孵化蛋；以及(b)从细胞或孵化蛋中分离重组NDV。细胞或孵化蛋可以是本文所述的或本领域技术人员已知的细胞或孵化蛋。在一些实施方案中，细胞或孵化蛋是IFN缺陷型的。
在一个具体实施方案中，本文提供了一种用于生产包含本文所述的重组NDV的药物组合物(例如，免疫原性组合物)的方法，该方法包括(a)在细胞(例如，细胞系)或孵化蛋中繁殖本文所述的重组NDV；以及(b)从细胞或孵化蛋中分离重组NDV。该方法还可包括将重组NDV与药学上可接受的载剂一起添加到容器中。
5.4组合物和施用途径
本文提供了包含本文(例如，第5.1或6节)所述的重组NDV的组合物。在一个具体实施方案中，组合物是药物组合物，诸如免疫原性组合物(例如，疫苗组合物)。在一个具体实施方案中，本文提供了包含本文(例如，第5.1或6节)所述的重组NDV的免疫原性组合物。组合物可用于诱导对诸如本文(例如，第5.1.3节)所述的抗原的免疫反应的方法中。组合物可用于针对抗原(例如，本文(例如，第5.1.3节)所述的抗原)进行免疫的方法中。组合物可用于针对与抗原(例如，本文(例如，第5.1.3节)所述的抗原)相关的疾病进行免疫的方法中。组合物可用于预防与抗原(诸如本文所述的抗原)相关的疾病的方法中。
在一个实施方案中，药物组合物(例如，免疫原性组合物)包含与药学上可接受的载剂混合的本文(例如，第5.1或6节)所述的重组NDV。该组合物可包含104至1012PFU的本文所述的重组NDV。在一些实施方案中，药物组合物还包含诸如下文第5.5.2节所述的一种或多种附加预防或治疗剂。在一个具体实施方案中，药物组合物包含在药学上可接受的载剂中的有效量的本文(例如，第5.1或6节)所述的重组NDV，以及任选的一种或多种附加预防或治疗剂。在某些实施方案中，本文所述的药物组合物包含本文所述的两种重组NDV，其中本文所述的两种重组NDV在免疫学上彼此不同。在一些实施方案中，重组NDV(例如，第5.1或6节)是药物组合物中包含的唯一活性成分。在具体实施方案中，药物组合物中包含两种或更多种重组NDV。在一个特定实施方案中，药物组合物是免疫原性组合物。
在一个具体实施方案中，本文所述的药物组合物中包含的重组NDV是活病毒。在特定实施方案中，本文所述的药物组合物中包含的重组NDV是减毒活病毒。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物中包含的重组NDV是失活的。本领域技术人员已知的技术可用于灭活重组NDV。
本文提供的药物组合物可以是允许组合物施用给受试者的任何形式。在一个具体实施方案中，药物组合物适用于兽医施用、人类施用或两者都适用。如本文所用，术语“药学上可接受的”是指已经过联邦或州政府的监管机构批准，或已列入美国药典或其他公认的药典，可用于动物，更具体地可用于人类。术语“载剂”是指与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或溶媒。盐溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可用作液体载剂，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。在E.W.Martin所著“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中描述了合适的药物载剂的实例。制剂应适合施用模式。
在一个具体的实施方案中，药物组合物被配制成适用于受试者的预期施用途径。例如，药物组合物可被配制成适用于肠胃外、静脉内、动脉内、胸膜内、吸入、鼻内、腹膜内、口服、皮内、结肠直肠、腹膜内、颅内和瘤内施用。在一个实施方案中，药物组合物可被配制用于静脉内、动脉内、口服、腹膜内、鼻内、气管内、胸膜内、颅内、皮下、肌内、局部、肺部或瘤内施用。在一个具体实施方案中，药物组合物可被配制用于鼻内施用。
在一个具体实施方案中，包含本文所述的重组NDV(参见例如第5.1或6节)的药物组合物被配制成适用于向受试者(例如，人类受试者)鼻内施用。
5.5重组NDV的用途
在另一个方面，本文提供了用于在受试者(例如，人类受试者)中诱导免疫反应的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或其组合物。在一个实施方案中，本文提供了一种用于在受试者(例如，人类受试者)中诱导免疫反应的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用有效量的本文所述的重组NDV。关于重组NDV，参见例如第5.1和6节。在一个具体实施方案中，诱导的免疫反应是对抗原(例如，传染病抗原或者癌或肿瘤抗原)的免疫反应。可通过任何施用途径向受试者施用重组NDV。在另一个具体实施方案中，向受试者鼻内施用重组NDV。在一些实施方案中，向受试者肌内施用重组NDV。
在一些实施方案中，本文提供了用于在受试者中诱导抗体的方法。在一些实施方案中，本文提供了用于在受试者中诱导抗体的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的重组NDV或本文所述的组合物。在某些实施方案中，受试者是非人受试者(例如，小鼠、豚鼠、狗、猫、兔、猴、黑猩猩等)。在其他实施方案中，受试者是人类。产生的抗体可被分离和克隆以及重组工程化改造，以例如改善抗体的一种或多种特性。在一些实施方案中，诱导的抗体与重组NDV表达的抗原结合。
在另一个方面，本文提供了用于针对与抗原(例如，传染病抗原或者癌或肿瘤抗原)相关的疾病进行免疫的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或其组合物，其中重组NDV包含含有转基因的包装的基因组，其中转基因包含编码与疾病相关的抗原(例如，传染病抗原或者癌或肿瘤抗原)的核苷酸序列。在一个实施方案中，本文提供了一种用于在受试者(例如，人类受试者)中针对与抗原(例如，传染病抗原或者癌或肿瘤抗原)相关的疾病进行免疫的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用有效量的本文所述的重组NDV，其中重组NDV包含包装的基因组，该包装的基因组包含编码与疾病相关的抗原(例如，传染病抗原或者癌或肿瘤抗原)的转基因。关于重组NDV，参见例如第5.1和6节。在一个具体实施方案中，抗原由感染重组NDV的细胞表达。可通过任何施用途径向受试者施用重组NDV。在另一个具体实施方案中，向受试者鼻内施用重组NDV。在一些实施方案中，向受试者肌内施用重组NDV。
在一个具体实施方案中，本文提供了用于针对SARS-CoV-2疾病(例如，COVID-19)进行免疫的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或其组合物，其中重组NDV包含含有转基因的包装的基因组，并且其中转基因包含编码SARS-CoV-2抗原(例如，SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段，诸如包含受体结合结构域的片段)的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，SARS-CoV-2抗原由感染重组NDV的细胞表达。可通过任何施用途径向受试者施用重组NDV。在另一个具体实施方案中，向受试者鼻内施用重组NDV。在一些实施方案中，向受试者肌内施用重组NDV。
在一个具体实施方案中，本文提供了用于针对埃博拉病毒疾病进行免疫的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或其组合物，其中重组NDV包含含有转基因的包装的基因组，并且其中转基因包含编码埃博拉病毒疾病抗原的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，埃博拉病毒抗原由感染重组NDV的细胞表达。可通过任何施用途径向受试者施用重组NDV。在另一个具体实施方案中，向受试者鼻内施用重组NDV。在一些实施方案中，向受试者肌内施用重组NDV。
在一个具体实施方案中，本文提供了用于针对尼帕病毒疾病进行免疫的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或其组合物，其中重组NDV包含含有转基因的包装的基因组，并且其中转基因包含编码尼帕病毒疾病抗原的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，尼帕病毒抗原由感染重组NDV的细胞表达。可通过任何施用途径向受试者施用重组NDV。在另一个具体实施方案中，向受试者鼻内施用重组NDV。在一些实施方案中，向受试者肌内施用重组NDV。
在一个具体实施方案中，本文提供了用于针对MERS-CoV疾病进行免疫的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或其组合物，其中重组NDV包含含有转基因的包装的基因组，并且其中转基因包含编码MERS-CoV疾病抗原的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，MERS-CoV抗原由感染重组NDV的细胞表达。可通过任何施用途径向受试者施用重组NDV。在另一个具体实施方案中，向受试者鼻内施用重组NDV。在一些实施方案中，向受试者肌内施用重组NDV。
在一个具体实施方案中，本文提供了用于针对拉沙病毒疾病进行免疫的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或其组合物，其中重组NDV包含含有转基因的包装的基因组，并且其中转基因包含编码拉沙病毒疾病抗原的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，拉沙病毒抗原由感染重组NDV的细胞表达。可通过任何施用途径向受试者施用重组NDV。在另一个具体实施方案中，向受试者鼻内施用重组NDV。在一些实施方案中，向受试者肌内施用重组NDV。
在另一个方面，本文提供了用于使受试者(例如，人类受试者)免疫以抵抗传染病的方法，该方法包括向受试者施用第一重组NDV或其组合物，并向受试者施用第二重组NDV或其组合物，其中第一重组NDV和第二重组NDV在免疫学上彼此不同。在一个实施方案中，本文提供了用于顺序地使受试者(例如，人类受试者)免疫以抵抗传染病的方法，该方法包括向受试者施用第一重组NDV或其组合物，并向受试者施用第二重组NDV或其组合物，其中第一重组NDV和第二重组NDV在免疫学上彼此不同。在某些实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV可间隔2周、3周、4周、6周、1个月、3个月、6个月、9个月或1年施用。在一些实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV可间隔2至4周、4至6周、1至3个月、3至6个月、3至9个月、6个月至1年或1至2年施用。可通过相同的施用途径或不同的施用途径施用第一重组NDV和第二重组NDV或其组合物。在一个具体实施方案中，由于将NDV F蛋白和/或HN蛋白替换为了彼此不同的非NDV APMV F蛋白和/或不同的非NDV APMV HN蛋白，第一重组NDV和第二重组NDV在免疫学上彼此不同。例如，第一重组NDV可包含APMV-15的F和HN蛋白，并且第二重组NDV可包含APMV-21的F和HN蛋白。在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,VirologyJournal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法所评估，第一重组NDV和第二重组NDV不能诱导实质上抑制另一者的复制的抗体，则第一重组NDV在免疫学上不同于第二重组NDV。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，第一重组NDV和第二重组NDV诱导将彼此的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log的抗体，则第一重组NDV被视为在免疫学上不同于第二重组NDV。在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第三重组NDV或其组合物，其中第三重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV、第二重组NDV或第一重组NDV和第二重组NDV。在某些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第三重组NDV或其组合物和第四重组NDV或其组合物，其中第三重组NDV和第四重组NDV在免疫学上彼此不同，并且第三重组NDV和第四重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV、第二重组NDV或第一重组NDV和第二重组NDV。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，重组NDV诱导将另一种重组NDV的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log的抗体，则重组NDV被视为在免疫学上不同于另一种重组NDV。
在一个实施方案中，本文提供了用于顺序地使受试者(例如，人类受试者)免疫以抵抗传染病的方法，该方法包括向受试者施用第一重组NDV，向受试者施用第二重组NDV，以及向受试者施用第三重组NDV，其中第一重组NDV、第二重组NDV和第三重组NDV在免疫学上彼此不同。在某些实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV可间隔2周、3周、4周、6周、1个月、3个月、6个月、9个月或1年施用。在一些实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV可间隔2至4周、4至6周、1至3个月、3至6个月、3至9个月、6个月至1年或1至2年施用。在一个具体实施方案中，由于将NDV F蛋白和/或HN蛋白替换为了彼此不同的非NDV APMV F蛋白和/或不同的非NDV APMV HN蛋白，第一重组NDV、第二重组NDV和第三重组NDV在免疫学上彼此不同。例如，第一重组NDV可包含APMV-15的F和HN蛋白，第二重组NDV可包含APMV-21的F和HN蛋白，并且第三重组NDV可包含APMV-10的F和HN蛋白。
在一个具体实施方案中，本文所述的两种或更多种在免疫学上彼此不同的重组NDV可用于使受试者(例如，人类)免疫以抵抗传染病。在另一个具体实施方案中，本文所述的两种或更多种在免疫学上彼此不同的重组NDV可用于使受试者(例如，人类)免疫以抵抗癌症。在具体实施方案中，使用其中NDV F蛋白和/或NDV HN蛋白被替换为彼此不同的非NDVAPMV F蛋白或其变体和/或不同的非NDV APMV HN蛋白或其变体的两种或更多种重组NDV，允许向受试者(例如，人类)多次施用抗原，以诱导针对抗原的强免疫反应。
在另一个方面，本文提供了用于在受试者(例如，人类受试者)中诱导对传染病抗原的免疫反应的方法，该方法包括向受试者施用第一重组NDV或其组合物，并向受试者施用第二重组NDV或其组合物，其中第一重组NDV和第二重组NDV在免疫学上彼此不同。在某些实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV可间隔2周、3周、4周、6周、1个月、3个月、6个月、9个月或1年施用。在一些实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV可间隔2至4周、4至6周、1至3个月、3至6个月、3至9个月、6个月至1年或1至2年施用。可通过相同的施用途径或不同的施用途径施用第一重组NDV和第二重组NDV或其组合物。在一些实施方案中，由第一重组NDV表达的抗原和由第二重组NDV表达的抗原来自或来源于不同的病原体。在其他实施方案中，由第一重组NDV表达的抗原和由第二重组NDV表达的抗原来自或来源于相同的病原体。由第一重组NDV和第二重组NDV表达的抗原可以是相同的，或者由第二重组NDV表达的抗原可以是其变体。例如，由第一重组NDV表达的抗原可以是来自一种株系的SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段(例如，包含受体结合结构域的片段)，并且由第二重组NDV表达的抗原可以是来自SARS-CoV-2变体株系的SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段(例如，包含受体结合结构域的片段)。在一个具体实施方案中，由于将NDV F蛋白和/或HN蛋白替换为了彼此不同的非NDVAPMV F蛋白和/或不同的非NDV APMV HN蛋白，第一重组NDV和第二重组NDV在免疫学上彼此不同。例如，第一重组NDV可包含APMV-15的F和HN蛋白，并且第二重组NDV可包含APMV-21的F和HN蛋白。在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法所评估，第一重组NDV和第二重组NDV不能诱导实质上抑制另一者的复制的抗体，则第一重组NDV在免疫学上不同于第二重组NDV。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,VirologyJournal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，第一重组NDV和第二重组NDV诱导将彼此的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log的抗体，则第一重组NDV被视为在免疫学上不同于第二重组NDV。在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第三重组NDV或其组合物，其中第三重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV、第二重组NDV或第一重组NDV和第二重组NDV。在某些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第三重组NDV或其组合物和第四重组NDV或其组合物，其中第三重组NDV和第四重组NDV在免疫学上彼此不同，并且第三重组NDV和第四重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV、第二重组NDV或第一重组NDV和第二重组NDV。
在另一个方面，本文提供了用于使受试者(例如，人类受试者)免疫以抵抗癌症的方法，该方法包括向受试者施用第一重组NDV或其组合物，并向受试者施用第二重组NDV或其组合物，其中第一重组NDV和第二重组NDV在免疫学上彼此不同。在一个实施方案中，本文提供了用于顺序地使受试者(例如，人类受试者)免疫以抵抗癌症的方法，该方法包括向受试者施用第一重组NDV或其组合物，并向受试者施用第二重组NDV或其组合物，其中第一重组NDV和第二重组NDV在免疫学上彼此不同。在某些实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV可间隔2周、3周、4周、6周、1个月、3个月、6个月、9个月或1年施用。在一些实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV可间隔2至4周、4至6周、1至3个月、3至6个月、3至9个月、6个月至1年或1至2年施用。可通过相同的施用途径或不同的施用途径施用第一重组NDV和第二重组NDV或其组合物。在一个具体实施方案中，由于将NDV F蛋白和/或HN蛋白替换为了彼此不同的非NDV APMV F蛋白和/或不同的非NDV APMV HN蛋白，第一重组NDV和第二重组NDV在免疫学上彼此不同。例如，第一重组NDV可包含APMV-15的F和HN蛋白，并且第二重组NDV可包含APMV-21的F和HN蛋白。在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,VirologyJournal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法所评估，第一重组NDV和第二重组NDV不能诱导实质上抑制另一者的复制的抗体，则第一重组NDV在免疫学上不同于第二重组NDV。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，第一重组NDV和第二重组NDV诱导将彼此的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log的抗体，则第一重组NDV被视为在免疫学上不同于第二重组NDV。在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第三重组NDV或其组合物，其中第三重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV、第二重组NDV或第一重组NDV和第二重组NDV。在某些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第三重组NDV或其组合物和第四重组NDV或其组合物，其中第三重组NDV和第四重组NDV在免疫学上彼此不同，并且第三重组NDV和第四重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV、第二重组NDV或第一重组NDV和第二重组NDV。
在另一个方面，本文提供了用于在受试者(例如，人类受试者)中诱导对癌或肿瘤抗原的免疫反应的方法，该方法包括向受试者施用第一重组NDV或其组合物，并向受试者施用第二重组NDV或其组合物，其中第一重组NDV和第二重组NDV在免疫学上彼此不同。在某些实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV可间隔2周、3周、4周、6周、1个月、3个月、6个月、9个月或1年施用。在一些实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV可间隔2至4周、4至6周、1至3个月、3至6个月、3至9个月、6个月至1年或1至2年施用。在一些实施方案中，由第一重组NDV表达的癌或肿瘤抗原和由第二重组NDV表达的癌或肿瘤抗原是不同的。在某些实施方案中，由第一重组NDV表达的癌或肿瘤抗原和由第二重组NDV表达的癌或肿瘤抗原来自或来源于相同类型的癌或肿瘤。由第一重组NDV和第二重组NDV表达的癌或肿瘤抗原可以是相同的，或者由第二重组NDV表达的癌或肿瘤抗原可以是其变体。在一个具体实施方案中，由于将NDV F蛋白和/或HN蛋白替换为了彼此不同的非NDV APMV F蛋白和/或不同的非NDV APMVHN蛋白，第一重组NDV和第二重组NDV在免疫学上彼此不同。例如，第一重组NDV可包含APMV-15的F和HN蛋白，并且第二重组NDV可包含APMV-21的F和HN蛋白。在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法所评估，第一重组NDV和第二重组NDV不能诱导实质上抑制另一者的复制的抗体，则第一重组NDV在免疫学上不同于第二重组NDV。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，第一重组NDV和第二重组NDV诱导将彼此的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log的抗体，则第一重组NDV被视为在免疫学上不同于第二重组NDV。在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第三重组NDV或其组合物，其中第三重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV、第二重组NDV或第一重组NDV和第二重组NDV。在某些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第三重组NDV或其组合物和第四重组NDV或其组合物，其中第三重组NDV和第四重组NDV在免疫学上彼此不同，并且第三重组NDV和第四重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV、第二重组NDV或第一重组NDV和第二重组NDV。
在另一个方面，本文提供了用于预防传染病的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或其组合物，其中重组NDV包含包装的基因组，该包装的基因组包含编码与传染病相关的抗原的转基因。在一个实施方案中，本文提供了一种用于预防传染病的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用有效量的本文所述的重组NDV，其中重组NDV包含包装的基因组，该包装的基因组包含编码与传染病相关的抗原的转基因。关于重组NDV，参见例如第5.1和6节。可通过任何施用途径向受试者施用重组NDV。在另一个具体实施方案中，向受试者鼻内施用重组NDV。在一些实施方案中，向受试者肌内施用重组NDV。在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第二重组NDV或其组合物，其中第二重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV。在某些实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV可间隔2周、3周、4周、6周、1个月、3个月、6个月、9个月或1年施用。在一些实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV可间隔2至4周、4至6周、1至3个月、3至6个月、3至9个月、6个月至1年或1至2年施用。可通过相同的施用途径或不同的施用途径施用第一重组NDV和第二重组NDV或其组合物。在一个具体实施方案中，由于将NDV F蛋白和/或HN蛋白替换为了彼此不同的非NDV APMV F蛋白和/或不同的非NDV APMV HN蛋白，第一重组NDV和第二重组NDV在免疫学上彼此不同。例如，第一重组NDV可包含APMV-15的F和HN蛋白，并且第二重组NDV可包含APMV-21的F和HN蛋白。在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法所评估，第一重组NDV和第二重组NDV不能诱导实质上抑制另一者的复制的抗体，则第一重组NDV在免疫学上不同于第二重组NDV。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，第一重组NDV和第二重组NDV诱导将彼此的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log的抗体，则第一重组NDV被视为在免疫学上不同于第二重组NDV。在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第三重组NDV或其组合物，其中第三重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV、第二重组NDV或第一重组NDV和第二重组NDV。在某些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第三重组NDV或其组合物和第四重组NDV或其组合物，其中第三重组NDV和第四重组NDV在免疫学上彼此不同，并且第三重组NDV和第四重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV、第二重组NDV或第一重组NDV和第二重组NDV。
在一个具体实施方案中，本文提供了用于预防RSV疾病的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或其组合物，其中重组NDV包含含有转基因的包装的基因组，并且其中转基因包含编码RSV抗原的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，RSV抗原由感染重组NDV的细胞表达。可通过任何施用途径向受试者施用重组NDV。在另一个具体实施方案中，向受试者鼻内施用重组NDV。在一些实施方案中，向受试者肌内施用重组NDV。在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第二重组NDV或其组合物，其中第二重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV。第二重组NDV可包含转基因，该转基因包含编码相同RSV抗原或不同RSV抗原的核苷酸序列。
在一个具体实施方案中，本文提供了用于预防人类偏肺病毒疾病的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或其组合物，其中重组NDV包含含有转基因的包装的基因组，并且其中转基因包含编码人类偏肺病毒抗原的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，人类偏肺病毒抗原由感染重组NDV的细胞表达。可通过任何施用途径向受试者施用重组NDV。在另一个具体实施方案中，向受试者鼻内施用重组NDV。在一些实施方案中，向受试者肌内施用重组NDV。在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第二重组NDV或其组合物，其中第二重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV。第二重组NDV可包含转基因，该转基因包含编码相同hMPV抗原或不同hMPV抗原的核苷酸序列。
在一个具体实施方案中，本文提供了用于预防COVID-19的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或其组合物，其中重组NDV包含含有转基因的包装的基因组，并且其中转基因包含编码SARS-CoV-2抗原(例如，SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段，诸如包含受体结合结构域的片段)的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，SARS-CoV-2抗原由感染重组NDV的细胞表达。可通过任何施用途径向受试者施用重组NDV。在另一个具体实施方案中，向受试者鼻内施用重组NDV。在一些实施方案中，向受试者肌内施用重组NDV。在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第二重组NDV或其组合物，其中第二重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV。第二重组NDV可包含转基因，该转基因包含编码相同SARS-CoV-2抗原或不同SARS-CoV-2抗原的核苷酸序列。
在一个具体实施方案中，本文提供了用于预防埃博拉病毒疾病的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或其组合物，其中重组NDV包含含有转基因的包装的基因组，并且其中转基因包含埃博拉病毒疾病抗原。在一个具体实施方案中，埃博拉病毒抗原由感染重组NDV的细胞表达。可通过任何施用途径向受试者施用重组NDV。在另一个具体实施方案中，向受试者鼻内施用重组NDV。在一些实施方案中，向受试者肌内施用重组NDV。在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第二重组NDV或其组合物，其中第二重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV。第二重组NDV可包含转基因，该转基因包含编码相同埃博拉病毒抗原或不同埃博拉病毒抗原的核苷酸序列。
在一个具体实施方案中，本文提供了用于预防尼帕病毒疾病的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或其组合物，其中重组NDV包含含有转基因的包装的基因组，并且其中转基因包含尼帕病毒疾病抗原。在一个具体实施方案中，尼帕病毒抗原由感染重组NDV的细胞表达。可通过任何施用途径向受试者施用重组NDV。在另一个具体实施方案中，向受试者鼻内施用重组NDV。在一些实施方案中，向受试者肌内施用重组NDV。在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第二重组NDV或其组合物，其中第二重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV。第二重组NDV可包含转基因，该转基因包含编码相同尼帕病毒抗原或不同尼帕病毒抗原的核苷酸序列。
在一个具体实施方案中，本文提供了用于预防MERS-CoV疾病的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或其组合物，其中重组NDV包含含有转基因的包装的基因组，并且其中转基因包含MERS-CoV疾病抗原。在一个具体实施方案中，MERS-CoV抗原由感染重组NDV的细胞表达。可通过任何施用途径向受试者施用重组NDV。在另一个具体实施方案中，向受试者鼻内施用重组NDV。在一些实施方案中，向受试者肌内施用重组NDV。在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第二重组NDV或其组合物，其中第二重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV。第二重组NDV可包含转基因，该转基因包含编码相同MERS-CoV抗原或不同MERS-CoV抗原的核苷酸序列。
在一个具体实施方案中，本文提供了用于预防拉沙病毒疾病的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或其组合物，其中重组NDV包含含有转基因的包装的基因组，并且其中转基因包含拉沙病毒疾病抗原。在一个具体实施方案中，拉沙病毒抗原由感染重组NDV的细胞表达。可通过任何施用途径向受试者施用重组NDV。在另一个具体实施方案中，向受试者鼻内施用重组NDV。在一些实施方案中，向受试者肌内施用重组NDV。在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第二重组NDV或其组合物，其中第二重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV。第二重组NDV可包含转基因，该转基因包含编码相同拉沙病毒抗原或不同拉沙病毒抗原的核苷酸序列。
在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，第一重组NDV和第二重组NDV诱导将彼此的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log的抗体，则第一重组NDV被视为在免疫学上不同于第二重组NDV。
在另一个方面，本文提供了用于治疗癌症的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或其组合物。关于重组NDV，参见例如第5.1和6节。可通过任何施用途径向受试者施用重组NDV。在另一个具体实施方案中，向受试者鼻内施用重组NDV。在一些实施方案中，向受试者肌内施用重组NDV。在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第二重组NDV或其组合物，其中第二重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV。在某些实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV可间隔2周、3周、4周、6周、1个月、3个月、6个月、9个月或1年施用。在一些实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV可间隔2至4周、4至6周、1至3个月、3至6个月、3至9个月、6个月至1年或1至2年施用。可通过相同的施用途径或不同的施用途径施用第一重组NDV和第二重组NDV或其组合物。在一个具体实施方案中，由于将NDV F蛋白和/或HN蛋白替换为了彼此不同的非NDV APMV F蛋白和/或不同的非NDV APMVHN蛋白，第一重组NDV和第二重组NDV在免疫学上彼此不同。例如，第一重组NDV可包含APMV-15的F和HN蛋白，并且第二重组NDV可包含APMV-21的F和HN蛋白。在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法所评估，第一重组NDV和第二重组NDV不能诱导实质上抑制另一者的复制的抗体，则第一重组NDV在免疫学上不同于第二重组NDV。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，第一重组NDV和第二重组NDV诱导将彼此的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log的抗体，则第一重组NDV被视为在免疫学上不同于第二重组NDV。在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第三重组NDV或其组合物，其中第三重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV、第二重组NDV或第一重组NDV和第二重组NDV。在某些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第三重组NDV或其组合物和第四重组NDV或其组合物，其中第三重组NDV和第四重组NDV在免疫学上彼此不同，并且第三重组NDV和第四重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV、第二重组NDV或第一重组NDV和第二重组NDV。
在另一个方面，本文提供了用于治疗癌症的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用本文所述的重组NDV或其组合物，其中重组NDV包含含有转基因的包装的基因组，其中转基因包含编码癌或肿瘤抗原的核苷酸序列。在一个实施方案中，本文提供了一种用于治疗癌症的方法，该方法包括向受试者(例如，人类受试者)施用有效量的本文所述的重组NDV，其中重组NDV包含含有转基因的包装的基因组，并且其中转基因包含编码与癌症相关的癌或肿瘤抗原的核苷酸序列。关于重组NDV，参见例如第5.1和6节。可通过任何施用途径向受试者施用重组NDV。在另一个具体实施方案中，向受试者鼻内施用重组NDV。在一些实施方案中，向受试者肌内施用重组NDV。在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第二重组NDV或其组合物，其中第二重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV。在某些实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV可间隔2周、3周、4周、6周、1个月、3个月、6个月、9个月或1年施用。在一些实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV可间隔2至4周、4至6周、1至3个月、3至6个月、3至9个月、6个月至1年或1至2年施用。由第一重组NDV表达的癌或肿瘤抗原可与由第二重组NDV表达的癌或肿瘤抗原相同或不同。可通过相同的施用途径或不同的施用途径施用第一重组NDV和第二重组NDV或其组合物。在一个具体实施方案中，由于将NDV F蛋白和/或HN蛋白替换为了彼此不同的非NDV APMV F蛋白和/或不同的非NDV APMV HN蛋白，第一重组NDV和第二重组NDV在免疫学上彼此不同。例如，第一重组NDV可包含APMV-15的F和HN蛋白，并且第二重组NDV可包含APMV-21的F和HN蛋白。在某些实施方案中，如果如诸如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,Avian Dis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法所评估，第一重组NDV和第二重组NDV不能诱导实质上抑制另一者的复制的抗体，则第一重组NDV在免疫学上不同于第二重组NDV。在一个具体实施方案中，如果在诸如例如Chumbe等人,2017,Virology Journal 14:232和Reynolds等人,1999,AvianDis.143:564-71，Sun等人,2020,EBioMedicine 62:103132，或Sun等人,2020,Vaccines 8:771所述或本文所述的病毒中和测定法中，第一重组NDV和第二重组NDV诱导将彼此的复制抑制小于约0.5log、小于约1log、小于约1.5log或小于约2log的抗体，则第一重组NDV被视为在免疫学上不同于第二重组NDV。在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第三重组NDV或其组合物，其中第三重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV、第二重组NDV或第一重组NDV和第二重组NDV。在某些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第三重组NDV或其组合物和第四重组NDV或其组合物，其中第三重组NDV和第四重组NDV在免疫学上彼此不同，并且第三重组NDV和第四重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV、第二重组NDV或第一重组NDV和第二重组NDV。
本文所述的重组NDV可与一种或多种其他疗法联合施用给受试者。重组NDV和一种或多种其他疗法可通过相同或不同的施用途径施用给受试者。在一个具体实施方案中，向受试者鼻内施用重组NDV。例如，关于重组NDV的相关信息，参见下文第5.1和6节，关于其他疗法的相关信息，参见第5.5.2节，并且关于组合物和施用途径的相关信息，参见下文第5.4节。
重组NDV和一种或多种附加疗法可同时或顺序地施用给受试者。在某些实施方案中，重组NDV和一种或多种附加疗法在相同组合物中施用。在其他实施方案中，重组NDV和一种或多种附加疗法在不同组合物中施用。重组NDV和一种或多种其他疗法可通过相同或不同的施用途径施用给受试者。本领域技术人员已知的或本文所述的任何途径都可用于施用重组NDV和一种或多种其他疗法。在一个具体实施方案中，鼻内施用重组NDV，并且静脉内施用一种或多种其他疗法。
在一些实施方案中，向先前已接种疫苗或施用了NDV组合物(例如，疫苗)的受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法。在某些实施方案中，向先前已接种疫苗或施用了基于APMV的组合物(例如，疫苗)的受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法。在一些实施方案中，向先前已接种疫苗或施用了NDV组合物(例如，疫苗)和基于APMV的组合物(例如，疫苗)的受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法。在具体实施方案中，基于APMV的组合物是非NDV APMV。
在一些实施方案中，向患者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法，以预防传染病的一种、两种或更多种症状的发作(这样的患者可能有发生感染的风险)。在一个具体实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可预防传染病的一种、两种或更多种症状的发作或发展，降低传染病的一种、两种或更多种症状的严重性，或预防传染病的一种、两种或更多种症状的发作或发展，并降低传染病的一种、两种或更多种症状的严重性。
在一些实施方案中，向患者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法，以预防RSV疾病的一种、两种或更多种症状的发作。在一个具体实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可预防RSV疾病的一种、两种或更多种症状的发作或发展，降低RSV疾病的一种、两种或更多种症状的严重性，或预防RSV疾病的一种、两种或更多种症状的发作或发展，并降低RSV疾病的一种、两种或更多种症状的严重性。RSV疾病的症状包括鼻塞或流鼻涕、咳嗽、发烧、喉咙痛、头痛、喘息、呼吸急促或短促或呼吸困难、皮肤因缺氧而发青、食欲不振、嗜睡和易怒。在另一个具体实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可预防由RSV感染引起的中耳炎。在另一个具体实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可预防由RSV感染引起的细支气管炎。在另一个具体实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可预防由RSV感染引起的肺炎。
在一些实施方案中，向患者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法，以预防埃博拉病毒疾病的一种、两种或更多种症状的发作。在一个具体实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可预防埃博拉病毒疾病的一种、两种或更多种症状的发作或发展，降低埃博拉病毒疾病的一种、两种或更多种症状的严重性，或预防埃博拉病毒疾病的一种、两种或更多种症状的发作或发展，并降低埃博拉病毒疾病的一种、两种或更多种症状的严重性。埃博拉病毒疾病的症状包括发烧、疼痛(例如，严重头痛、肌肉和关节痛以及腹(胃)痛)、虚弱和疲乏、胃肠道症状(例如，腹泻和呕吐)、腹(胃)痛以及不明原因的溢血、出血或瘀伤。
在一些实施方案中，向患者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法，以预防hMPV疾病的一种、两种或更多种症状的发作(例如，这样的患者有发生hMPV感染的风险)。在一个具体实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可预防hMPV疾病的一种、两种或更多种症状的发作或发展，降低hMPV疾病的一种、两种或更多种症状的严重性，或预防hMPV疾病的一种、两种或更多种症状的发作或发展，并降低hMPV疾病的一种、两种或更多种症状的严重性。hMPV疾病的症状包括鼻塞、流鼻涕、发烧、咳嗽、喉咙痛、喘息、呼吸困难、食欲不振、嗜睡和易怒。在另一个具体实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可预防由hMPV感染引起的细支气管炎。在另一个具体实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可预防由hMPV感染引起的肺炎。
在一些实施方案中，向患者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法，以预防拉沙病毒疾病的一种、两种或更多种症状的发作。在一个具体实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可预防拉沙病毒疾病的一种、两种或更多种症状的发作或发展，降低拉沙病毒疾病的一种、两种或更多种症状的严重性，或预防拉沙病毒疾病的一种、两种或更多种症状的发作或发展，并降低拉沙病毒疾病的一种、两种或更多种症状的严重性。拉沙病毒疾病的症状包括轻度发热、全身不适和虚弱、头痛、溢血、呼吸窘迫、反复呕吐、面部肿胀、胸部、背部和腹部疼痛、休克、听力丧失、震颤和脑炎。
在一些实施方案中，向患者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法，以预防MERS-CoV疾病的一种、两种或更多种症状的发作。在一个具体实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可预防MERS-CoV疾病的一种、两种或更多种症状的发作或发展，降低MERS-CoV疾病的一种、两种或更多种症状的严重性，或预防MERS-CoV疾病的一种、两种或更多种症状的发作或发展，并降低MERS-CoV疾病的一种、两种或更多种症状的严重性。MERS-CoV疾病的症状包括发烧、咳嗽和呼吸短促。
在一些实施方案中，向患者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法，以预防尼帕病毒疾病的一种、两种或更多种症状的发作。在一个具体实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可预防尼帕病毒疾病的一种、两种或更多种症状的发作或发展，降低尼帕病毒疾病的一种、两种或更多种症状的严重性，或预防尼帕病毒疾病的一种、两种或更多种症状的发作或发展，并降低尼帕病毒疾病的一种、两种或更多种症状的严重性。尼帕病毒疾病的症状包括定向障碍、嗜睡、意识模糊、癫痫发作、昏迷和脑肿胀(脑炎)。
在一些实施方案中，向患者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法，以预防COVID-19的一种、两种或更多种症状的发作。在一个具体实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可预防COVID-19的一种、两种或更多种症状的发作或发展，降低COVID-19的一种、两种或更多种症状的严重性，或预防COVID-19的一种、两种或更多种症状的发作或发展，并降低COVID-19的一种、两种或更多种症状的严重性。COVID-19的症状包括鼻塞或流鼻涕、咳嗽、发烧、喉咙痛、头痛、喘息、呼吸急促或短促或呼吸困难、皮肤因缺氧而发青、寒颤、肌肉疼痛、味觉和/或嗅觉丧失、恶心、呕吐和腹泻。在另一个具体实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可预防由SARS-CoV-2感染引起的肺炎。
在一个具体实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可防止感染的传播。在另一个具体实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可防止住院治疗。在另一个具体实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可防止反复感染。
在一些实施方案中，向患有传染病的受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法。在其他实施方案中，向有传染病倾向或易患传染病的受试者施用本文所述的NDV(例如，重组NDV)或其组合物或本文所述的联合疗法。在一些实施方案中，向被诊断为患有传染病的受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法。在一些实施方案中，向对于抗病原体的抗体(例如，抗SARS-CoV-2抗原、RSV抗原、人类偏肺病毒抗原、尼帕病毒抗原、MERS-CoV抗原、拉沙病毒抗原或埃博拉病毒抗原的抗体)呈血清阴性的受试者施用NDV(例如，重组NDV)或其组合物或本文所述的联合疗法。在一些实施方案中，向对于抗病原体的抗体(例如，抗SARS-CoV-2抗原、RSV抗原、人类偏肺病毒抗原、尼帕病毒抗原、MERS-CoV抗原、拉沙病毒抗原或埃博拉病毒抗原的抗体)呈血清阳性的受试者施用NDV(例如，重组NDV)或其组合物或本文所述的联合疗法。在某些实施方案中，在施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法之前，对受试者进行抗体评估。在其他实施方案中，在施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法之前，不对受试者进行抗体评估。
在一个具体实施方案中，本文所述的治疗癌症的方法可对受试者产生有益的效果，诸如减少、降低、减弱、消退、稳定、缓解、阻抑、抑制或阻止癌症或其症状的发展或进展。在某些实施方案中，本文所述的治疗癌症的方法产生以下至少一种、两种或更多种效果：(i)癌症和/或与之相关的症状的严重性降低或改善；(ii)癌症相关症状的持续时间缩短；(iii)癌症相关症状的复发得到预防；(iv)癌症和/或与之相关的症状消退；(v)受试者住院治疗减少；(vi)住院时间缩短；(vii)受试者生存率增加；(viii)癌症和/或与之相关的症状的进展受到抑制；(ix)另一种疗法的治疗效果增强或改善；(x)癌细胞群减少或消除；(xi)肿瘤或赘生物生长减少；(xii)肿瘤尺寸减小；(xiii)肿瘤形成减少；(xiv)原发性、区域性和/或转移性癌症得以根除、摘除或控制；(xv)转移瘤的数量减少或尺寸减小；(xvi)死亡率降低；(xvii)患者的无癌生存率增加；(xviii)无复发生存率增加；(xix)病情缓解的患者人数增加；(xx)住院率降低；(xxi)通过本领域技术人员可获得的常规方法诸如MRI、X射线、CT扫描和PET扫描测得，在施用疗法后，肿瘤的尺寸保持不变并且尺寸不增加或者肿瘤尺寸增加小于5％或10％；(xxii)癌症和/或与之相关的症状的发展或发作得到预防；(xxiii)患者缓解期延长；(xxiv)癌症相关症状的数量减少；(xxv)癌症患者的无症状生存率增加；(xxvi)转移受到限制或减少；(xxvii)总生存率；(xxviii)无进展生存率(根据例如RECISTv1.1评估)；(xxix)总缓解率；和/或(xxx)缓解持续时间延长。在一些实施方案中，受试者接受的治疗/疗法不能治愈癌症，但能防止疾病的进展或恶化。在某些实施方案中，本文所述的治疗癌症的方法不能预防癌症的发作/发展，但可预防癌症症状的发作。技术人员已知的任何方法都可用于评价受试者接受的治疗/疗法。在一个具体实施方案中，根据实体瘤疗效评价标准(“RECIST”)公布的规则来评价治疗/疗法的疗效。在一个具体实施方案中，根据2000年2月公布的RECIST规则(也称为“RECIST1”)来评价治疗/疗法的疗效(参见例如Therasse等人,2000,Journal of National Cancer Institute,92(3):205-216，该文献全文以引用方式并入本文)。在一个具体实施方案中，根据2009年1月公布的RECIST规则(也称为“RECIST 1.1”)来评价治疗/疗法的疗效(参见例如Eisenhauer等人,2009,EuropeanJournal ofCancer,45:228-247，该文献全文以引用方式并入本文)。在一个具体实施方案中，根据技术人员在评价时使用的RECIST规则来评价治疗/疗法的疗效。在一个具体实施方案中，根据免疫相关RECIST(“irRECIST”)公布的规则(参见例如Bohnsack等人,2014,ESMOAbstract4958，该文献全文以引用方式并入本文)来评价疗效。
在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可增加以下一种、两种或所有细胞类型向肿瘤中的浸润：(i)T细胞，(ii)自然杀伤(NK)细胞，和(iii)树突细胞。在某些实施方案中，向本文所述的受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可增加淋巴细胞向肿瘤中的浸润。在一个具体实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可增加T细胞向肿瘤中的浸润(CD4+T细胞浸润和/或CD8+T细胞浸润)。在某些实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或联合疗法可增加肿瘤中细胞因子的产生(例如，可增加INFγ、IL-2和/或TNF的产生)。
在另一个具体实施方案中，施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可诱导针对抗原(例如，传染病抗原或者癌或肿瘤抗原)的抗体。在另一个具体实施方案中，施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可诱导针对抗原(例如，传染病抗原或者癌或肿瘤抗原)的粘膜和全身抗体，诸如例如中和抗体。在另一个具体实施方案中，向受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法可诱导针对抗原(例如，传染病抗原或者癌或肿瘤抗原)的中和抗体。
在一些实施方案中，向患有癌症的受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法。在其他实施方案中，向有癌症倾向或易患癌症的受试者施用本文所述的NDV(例如，重组NDV)或其组合物或本文所述的联合疗法。在一些实施方案中，向被诊断为患有癌症的受试者施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法。
在具体实施方案中，向人类施用本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法。
5.5.1剂量和频率
重组NDV或其组合物在预防疾病、针对病原体的免疫或治疗癌症中有效的量将取决于施用途径、受试者的总体健康状况等。用于施用的重组NDV的合适剂量范围通常为约104至约1012，并且可根据所需频率的间隔向受试者施用一次、两次、三次、四次或更多次。在某些实施方案中，向受试者施用与当前在NDV临床试验中使用的剂量类似的剂量。
在某些实施方案中，将重组NDV或其组合物作为单剂量施用给受试者，随后在1至6周、1至5周、1至4周、1至3周、1至2周、6至12周、3至6个月、6至9个月、6至12个月或6至9个月后施用第二剂量。根据这些实施方案，可在第二次接种后的3至6个月或6至12个月间隔向受试者施用加强接种。
在某些实施方案中，可重复施用相同的重组NDV或其组合物，并且这些施用可间隔至少1天、2天、3天、5天、6天、7天、10天、14天、15天、21天、28天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。在其他实施方案中，可重复施用相同的重组NDV或其组合物，并且这些施用可间隔1至14天、1至7天、7至14天、1至30天、15至30天、15至45天、15至75天、15至90天、1至3个月、3至6个月、3至12个月或6至12个月。在一些实施方案中，向受试者施用第一重组NDV或其组合物，随后施用第二重组NDV或其组合物。在一些实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV彼此不同。例如，第一重组NDV可包含编码第一类型非NDV APMV(例如，APMV-12)的F和HN蛋白的核苷酸序列，并且第二重组NDV可包含编码第二类型非NDV APMV(例如，APMV-10)的F和HN蛋白的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV在免疫学上彼此不同。在某些实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV或其组合物可间隔至少1天、2天、3天、5天、6天、7天、10天、14天、15天、21天、28天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。在其他实施方案中，第一重组NDV和第二重组NDV或其组合物可间隔1至14天、1至7天、7至14天、1至30天、15至30天、15至45天、15至75天、15至90天、1至3个月、3至6个月、3至12个月或6至12个月。
在某些实施方案中，将重组NDV或其组合物与一种或多种附加疗法(诸如在下文第5.5.2节中描述的疗法)联合施用给受试者。其他一种或多种附加疗法的剂量将取决于各种因素，包括例如疗法、施用途径、受试者的总体健康状况等，并且应该根据医生的判断来决定。在具体实施方案中，另一种疗法的剂量是根据本文所公开的方法，作为单一药剂使用的疗法的推荐疗法剂量和/或施用频率。批准的疗法的推荐剂量可在《医师案头参考》(Physician’s Desk Reference)中找到。
在某些实施方案中，将重组NDV或其组合物与一种或多种附加疗法同时施用给受试者。在某些实施方案中，在彼此间隔的1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时内，向受试者施用重组NDV和/或其组合物以及一种或多种附加疗法。在某些实施方案中，在彼此间隔的12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周或12周内，向受试者施用重组NDV和/或其组合物以及一种或多种附加疗法。在某些实施方案中，在彼此间隔的3-6个月、6-9个月、6-12个月或3个月、4个月、6个月、9个月或12个月内，向受试者施用重组NDV和/或其组合物以及一种或多种附加疗法。
在某些实施方案中，将第一药物组合物作为初次剂量施用给受试者，并在一定时间段(例如，1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1-6个月)后，施用第二药物组合物的加强剂量。在一些实施方案中，第二药物组合物包含与第一药物组合物相同的重组NDV。在其他实施方案中，第二药物组合物包含与第一药物组合物的重组NDV在免疫学上不同的重组NDV。在具体实施方案中，第二药物组合物包含与第一药物组合物相同的重组NDV，不同的是F蛋白和/或HN蛋白来自不同的非NDV APMV F蛋白或其变体和/或不同的非NDV APMVHN蛋白或其变体。
5.5.2附加疗法
可与本文所述的重组NDV或其组合物联合使用的附加疗法包括但不限于对乙酰氨基酚、化学治疗剂、检查点抑制剂、免疫疗法、布洛芬、咽喉锭剂、止咳药、吸入剂、抗生素和氧气。在一个具体实施方案中，附加疗法是本文所述的第二重组NDV。
5.6生物测定法
在一个具体实施方案中，使用本领域技术人员已知的生物测定法来表征本文所述的重组NDV或抗原。在具体实施方案中，使用本领域技术人员已知的或本文所述的微量中和测定法来评估结合本文所述重组NDV的抗体。在一些实施方案中，可通过本领域技术人员已知的任何方法(例如，免疫测定法)来评估抗NDV F抗体结合非NDV APMV F蛋白或其变体的能力。在某些实施方案中，可通过本领域技术人员已知的任何方法(例如，免疫测定法)来评估抗NDV HN抗体结合非NDV APMV HN蛋白或其变体的能力。在一些实施方案中，可使用本领域技术人员已知的或本文所述的血凝素抑制测定法来评估本文所述的两种重组NDV或者NDV和非NDV APMV是否在免疫学上不同。
5.6.1体外病毒测定法
病毒测定法包括使用本领域熟知的方法在体外培养的细胞中间接测量病毒复制(如例如通过空斑形成来确定)或者病毒蛋白质(如例如通过蛋白质印迹分析来确定)或病毒RNA的产生(如例如通过RT-PCR或RNA印迹分析来确定)。
可通过本领域已知的或本文所述的任何方法(例如，在细胞培养物(例如，鸡胚肾细胞培养物或鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物)中)评估本文所述的重组NDV的生长。可通过将本文所述的重组NDV的系列稀释液接种到细胞培养物(例如，CEF、MDCK、EFK-2细胞、Vero细胞、原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、H292人上皮细胞系或HeLa细胞)、鸡胚或活动物(例如，禽类)中来确定病毒滴度。病毒孵育指定时间后，使用标准方法分离病毒。可使用应用于病毒上清液的PCR(Quinn和Trevor,1997；Morgan等人,1990)、血凝测定法、组织培养感染剂量(TCID50)或鸡胚感染剂量(EID50)进行病毒滴度的物理定量。
可通过本领域已知的或本文所述的任何方法(例如，在细胞培养物、动物模型或孵化蛋中的病毒培养物中)评估编码异源肽或蛋白质的核苷酸序列(例如，转基因)向本文所述的重组NDV的基因组中的掺入。例如，可通过蔗糖缓冲层离心来纯化来自孵化蛋的尿囊液的细胞培养物的病毒粒子，随后使用本领域熟知的方法通过蛋白质印迹对其进行蛋白质表达分析。可使用其他免疫测定法(诸如ELISA)检测蛋白质表达。
也可使用基于免疫荧光的方法检测病毒并评估病毒生长。这些方法是本领域技术人员熟知的，例如荧光显微术和流式细胞术。用于流式细胞术的方法(包括荧光激活细胞分选(FACS))是可用的(参见例如Owens等人(1994)Flow Cytometry Principles forClinical Laboratory Practice,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001)FlowCytometry,第2版；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)。适合修饰核酸(包括核酸引物和探针)、多肽和抗体的用作例如诊断试剂的荧光试剂是可用的(Molecular Probesy(2003)Catalogue,MolecularProbes,Inc.,Eugene,OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO)。
描述了免疫系统的组织学的标准方法(参见例如Muller-Harmelink(编辑)(1986)Human Thymus:Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt等人(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams和Wilkins,Phila,PA；Louis等人(2002)Basic Histology:Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。
5.6.2干扰素测定法
可使用本领域技术人员已知的技术来确定本文所述的重组NDV对IFN的诱导和释放。例如，可使用免疫测定法(例如，ELISA或蛋白质印迹测定法)来确定在感染本文所述的重组NDV后在细胞中诱导的IFN的量，以测量IFN表达或测量其表达被IFN诱导的蛋白质的表达。另选地，可通过本领域技术人员已知的测定法(诸如RNA印迹和定量RT-PCR)在RNA水平上测量诱导的IFN的量。在具体实施方案中，可使用ELISPOT测定法测量释放的IFN的量。此外，可通过例如蛋白质水平的免疫测定法或ELISPOT测定法和/或RNA水平的定量RT-PCR或RNA印迹来确定细胞因子和/或干扰素刺激基因的诱导和释放。
5.6.3激活标记物测定法和免疫细胞浸润测定法
用于评估免疫细胞对T细胞标记物、B细胞标记物、激活标记物、共刺激分子、配体或抑制分子的表达的技术是本领域技术人员已知的。例如，可通过流式细胞术来评估免疫细胞对T细胞标记物、B细胞标记物、激活标记物、共刺激分子、配体或抑制分子的表达。
5.6.4毒性研究
在一些实施方案中，测试本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法在哺乳动物(优选人类)细胞系中的细胞毒性。在某些实施方案中，在以下一个或多个细胞系非限制性实例中评估细胞毒性：U937(一种人单核细胞系)；原代外周血单核细胞(PBMC)；Huh7(一种人肝母细胞瘤细胞系)；HL60细胞、HT1080、HEK 293T和293H、MLPC细胞、人胚肾细胞系；人黑色素瘤细胞系，诸如SkMel2、SkMel-119和SkMel-197；THP-1单核细胞；HeLa细胞系；以及神经母细胞瘤细胞系，诸如MC-IXC、SK-N-MC、SK-N-MC、SK-N-DZ、SH-SY5Y和BE(2)-C。在一些实施方案中，使用ToxLite测定法评估细胞毒性。
可使用本领域熟知的许多测定法评估感染本文所述的重组NDV或其组合物后的细胞或细胞系的活力，从而确定重组NDV或其组合物的细胞毒性。例如，可通过测量溴脱氧尿苷(BrdU)掺入、(3H)胸苷掺入、通过直接细胞计数或通过检测已知基因诸如原癌基因(例如，fos、myc)或细胞周期标记物(Rb、cdc2、细胞周期蛋白A、D1、D2、D3、E等)的转录、翻译或活性的变化来测定细胞增殖。可通过本领域熟知的任何方法来确定这种蛋白质和mRNA的水平和活性。例如，可通过已知的免疫诊断方法诸如ELISA、蛋白质印迹或使用抗体(包括可商购获得的抗体)的免疫沉淀来定量蛋白质。可使用本领域熟知的常规方法(例如使用northern分析、RNA酶保护或与逆转录相关的聚合酶链式反应)来定量mRNA。可通过使用台盼蓝染色或本领域已知的其他细胞死亡或活力标记物来评估细胞活力。在一个具体实施方案中，测量细胞ATP的水平以确定细胞活力。在优选的实施方案中，本文所述的重组NDV或其组合物不杀死健康(即，非癌性)细胞。
在具体实施方案中，可使用本领域的测定标准，诸如测量细胞内ATP水平的CellTiter-Glo测定试剂盒(Promega)，在三天和七天的时间段内测量细胞活力。细胞ATP的减少指示细胞毒性作用。在另一个具体实施方案中，可在中性红摄取测定法中测量细胞活力。在其他实施方案中，形态变化的视觉观察可包括增大、颗粒度、具有粗糙边缘的细胞、薄膜状外观、变圆、从孔表面脱离或其他变化。
可在动物模型中测试本文所述的重组NDV或其组合物或联合疗法的体内毒性。例如，本领域已知的用于测试化合物对RSV感染或hMPV感染的作用的动物模型也可用于确定本文所述的重组NDV或其组合物或联合疗法的体内毒性。例如，向动物施用一定范围pfu的本文所述的重组NDV，随后随时间推移监测动物的各种参数，诸如以下一种、两种或更多种参数：致死率、体重减轻或体重增加失败，以及可指示组织损伤的血清标记物水平(例如，作为一般组织损伤指标的肌酸磷酸激酶水平，作为可能肝损伤指标的谷氨酸草酸转氨酶或丙酮酸转氨酶水平)。除了剂量之外，这些体内测定法也可适于测试各种施用模式和方案的毒性。
可通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序(例如，用于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(对50％群体治疗有效的剂量))来确定本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法的毒性、疗效或两者。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且它可表示为LD50/ED50的比率。表现出大治疗指数的疗法是优选的。
从细胞培养测定法和动物研究中获得的数据可用于制定用于受试者的疗法的剂量范围。这些药剂的剂量优选位于包括ED50的循环浓度范围内，有很少或没有毒性。剂量可在该范围内变化，这取决于所采用的剂型和所利用的施用途径。对于本文所述的任何疗法，可通过细胞培养测定法初步估算治疗有效剂量。
5.6.5生物活性测定法
可使用动物模型测试本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法对于抑制传染病或癌症、对重组NDV的抗体反应等的生物活性。此类动物模型系统包括但不限于大鼠、小鼠、仓鼠、棉大鼠、鸡、奶牛、猴(例如，非洲绿猴)、猪、狗、兔等。
在一个具体实施方案中，可使用动物模型测试本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法诱导一定几何平均滴度的与抗原结合的抗体的能力。在另一个具体实施方案中，可使用动物模型测试本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法诱导在微量中和测定法中具有针对抗原的中和活性的抗体的能力。在一些实施方案中，可使用动物模型测试本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法诱导一定几何平均滴度的抗体的能力，该抗体与抗原(例如，SARS-CoV-2抗原、埃博拉病毒抗原、MERS-CoV抗原、拉沙病毒抗原、RSV抗原或人类偏肺病毒抗原)结合，并在微量中和测定法中中和与抗原相关的病毒。在一个具体实施方案中，可使用动物模型测试本文所述的重组NDV或其组合物或本文所述的联合疗法在用本文所述的重组NDV或其组合物免疫后诱导与抗原结合的抗体水平相对于免疫前此类抗体水平一定倍数增加的能力。例如，用本文所述的重组NDV或其组合物免疫后，与抗原结合的抗体水平相对于免疫前的此类抗体水平增加了3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或更多。
5.6.6转基因的表达
用于测试非NDV APMV F蛋白、非NDV APMV HN蛋白、嵌合F蛋白、嵌合HN蛋白、抗原(包括嵌合抗原)在感染本文所述的重组NDV的细胞中的表达的测定法可使用本领域已知的任何测定法进行，诸如例如蛋白质印迹、免疫荧光和ELISA或本文所述的任何测定法。
在一个具体方面，利用ELISA检测非NDV APMV F蛋白、非NDV APMV HN蛋白、嵌合F蛋白、嵌合HN蛋白、抗原(包括嵌合抗原)在感染本文所述的重组NDV的细胞中的表达。
在一个实施方案中，通过使用本领域已知的任何抗体-抗原相互作用测定法测试其特异性结合抗体的能力，测定由本文所述的重组NDV的包装的基因组编码的非NDV APMVF蛋白、非NDV APMV HN蛋白、嵌合F蛋白、嵌合HN蛋白、抗原(包括嵌合抗原)的正确折叠。在另一个实施方案中，通过使用本领域已知的任何方法(诸如例如NMR、X射线晶体学方法或二级结构预测方法例如圆二色谱)确定非NDV APMV F蛋白、非NDV APMV HN蛋白、嵌合F蛋白、嵌合HN蛋白、抗原(包括嵌合抗原)的结构或构象，测定由本文所述的重组NDV的包装的基因组编码的蛋白的正确折叠。可使用评估非NDV APMV F蛋白、非NDV APMV HN蛋白、嵌合F蛋白、嵌合HN蛋白、抗原(包括嵌合抗原)的构象和抗原性的附加测定法，包括例如免疫荧光显微术、流式细胞术、蛋白质印迹和ELISA。动物模型(诸如棉大鼠或小鼠)中的体内免疫也可用于评估非NDV APMV F蛋白、非NDV APMV HN蛋白、嵌合F蛋白、嵌合HN蛋白、抗原(包括嵌合抗原)的抗原性。
用于测试非NDV APMV F蛋白、非NDV APMV HN蛋白、嵌合F蛋白、嵌合HN蛋白、抗原(包括嵌合抗原)在感染本文所述的重组NDV的细胞中的功能的测定法可使用本领域已知的任何测定法进行。例如，可评估HN蛋白的受体结合和神经氨酸酶活性。也可评估病毒与宿主细胞的融合。
5.7试剂盒
在一个方面，本文提供了一种药物包装或试剂盒，该药物包装或试剂盒包含一个或多个容器，该一个或多个容器装有本文所述的组合物(例如，药物组合物)的一种或多种成分。在一个具体实施方案中，本文提供了一种药物包装或试剂盒，该药物包装或试剂盒包含容器，其中该容器包含本文所述的重组NDV或含重组NDV的药物组合物。在某些实施方案中，药物包装或试剂盒还包含第二重组NDV或含第二重组NDV的药物组合物。在具体实施方案中，也就是说，第二重组NDV在免疫学上不同于第一重组NDV。在一些实施方案中，本文提供了药物包装或试剂盒，该药物包装或试剂盒包含第6节中描述的pNDV-F-HNless受体质粒。在某些实施方案中，包装或试剂盒还包含核酸序列，该核酸序列包含SEQ ID NO:1-14中任一者的核苷酸。在某些实施方案中，本文提供了一种药物包装或试剂盒，该药物包装或试剂盒包含核酸序列，该核酸序列包含SEQ ID NO:1-14中任一者的核苷酸序列，或与SEQ IDNO:1-14中任一者的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列。任选地，与这种容器相关联的可以是由监管药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定形式的通知，该通知反映了该机构已批准为用于人类施用而进行的制造、使用或销售。
在一些实施方案中，本文提供了一种药物包装或试剂盒，该药物包装或试剂盒包含核酸序列，该核酸序列包含与SEQ ID NO:1-14中任一者的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，包装或试剂盒还包含核酸序列，其包含(或由以下组成)：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，和(4)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元。在一些实施方案中，NDV属于LaSota株系。
在一些实施方案中，本文提供了药物包装或试剂盒，该药物包装或试剂盒包含核酸序列，该核酸序列包含SEQ ID NO:44或45。在一些实施方案中，本文提供了药物包装或试剂盒，该药物包装或试剂盒包含核酸序列，该核酸序列包含没有GFP编码序列的SEQ ID NO:44或45。在一些实施方案中，包装或试剂盒还包含核酸序列，该核酸序列包含SEQ ID NO:1-14中任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，包装或试剂盒还包含核酸序列，该核酸序列包含与SEQ ID NO:1-14中任一者的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列。任选地，与这种容器相关联的可以是由监管药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定形式的通知，该通知反映了该机构已批准为用于人类施用而进行的制造、使用或销售。
5.8序列
本节中公开的序列可用于生产本文所述的重组NDV。
表1：用于生成嵌合NDV-APMV拯救质粒的合成序列和NDVLaSota序列
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5.9实施方案
下文提供了示例性实施方案。
1.一种核酸序列，所述核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV APMV HN蛋白编码序列之前和之后；以及(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV F蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV APMV F蛋白编码序列之前和之后，并且其中所述非NDV APMV HN蛋白和所述非NDV APMV F蛋白分别不是NDV HN蛋白和F蛋白。
2.根据实施方案1所述的核酸序列，其中所述非NDV APMV F蛋白和所述非NDVAPMV HN蛋白在免疫学上分别不同于所述NDF F蛋白和所述NDV HN蛋白。
3.根据实施方案1所述的核酸序列，其中所述非NDV APMV HN是APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75、APMV17/Antarctica/107/13、APMV9/duck/New York/22/78、APMV7/Dove/Tennessee/4/75、APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17、APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77、APMV11/common_snipe/France/100212/10、APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12、APMV8/Goose/Delaware/1053/76、APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56、APMV3/Turkey/Wisconsin/68、APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05、APMV5/budgerigar/Japan/TI/75或APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07的所述HN蛋白。
4.根据实施方案1或3所述的核酸序列，其中所述非NDV APMV F是APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75、APMV17/Antarctica/107/13、APMV9/duck/New York/22/78、APMV7/Dove/Tennessee/4/75、APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17、APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77、APMV11/common_snipe/France/100212/10、APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12、APMV8/Goose/Delaware/1053/76、APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56、APMV3/Turkey/Wisconsin/68、APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05、APMV5/budgerigar/Japan/TI/75或APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07的所述F蛋白。
5.根据实施方案1所述的核酸序列，其中所述非NDV APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和正禽腮腺炎病毒属、偏禽腮腺炎病毒属或副禽腮腺炎病毒属的HN蛋白。
6.根据实施方案1或5所述的核酸序列，其中所述非NDV APMV F蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和正禽腮腺炎病毒属、偏禽腮腺炎病毒属或副禽腮腺炎病毒属的F蛋白。
7.根据实施方案1至6中任一项所述的核酸序列，其中所述NDV基因组包含NDVLaSota株系的NP基因、P基因、M基因和L基因。
8.一种核酸序列，所述核酸序列包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元，以及(5)SEQ ID NO:1-14中任一者的核苷酸序列或与SEQ ID NO:1-14中任一者的所述核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列。
9.根据实施方案8所述的核酸序列，其中所述NDV核衣壳蛋白、所述NDV磷蛋白、所述NDV基质蛋白和所述NDV大聚合酶属于所述NDVLaSota株系。
10.一种核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列或没有GFP编码序列的SEQ ID NO:44。
11.一种核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:44的核苷酸序列或没有GFP编码序列的SEQ ID NO:44至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列。
12.一种核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO:45的核苷酸序列或没有GFP编码序列的SEQ ID NO:45。
13.一种核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:45的核苷酸序列或没有GFP编码序列的SEQ ID NO:45至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列。
14.根据实施方案1至13中任一项所述的核酸序列，所述核酸序列还包含转基因。
15.根据实施方案1至13中任一项所述的核酸序列，所述核酸序列还包含编码抗原的转基因。
16.根据实施方案14所述的核酸序列，其中所述抗原是病毒、细菌、真菌或原生动物抗原。
17.根据实施方案14所述的核酸序列，其中所述抗原包含SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段。
18.根据实施方案17所述的核酸序列，其中所述片段包含所述SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合结构域。
19.根据实施方案17所述的核酸序列，其中所述片段包含所述SARS-CoV-2刺突蛋白的胞外结构域。
20.根据实施方案15所述的核酸序列，其中所述抗原是MERS-CoV抗原、呼吸道合胞病毒抗原、人类偏肺病毒抗原、拉沙病毒抗原、埃博拉病毒抗原或尼帕病毒抗原。
21.根据实施方案15所述的核酸序列，其中所述抗原是癌或肿瘤抗原。
22.一种重组新城疫病毒(NDV)，所述重组NDV包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于所述非NDV AMPV HN蛋白编码序列之前和之后；以及(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDVAPMV F蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于所述非NDVAMPV F蛋白编码序列之前和之后，并且其中所述非NDV APMV HN蛋白和所述非NDV APMV F蛋白分别不是NDV HN蛋白和F蛋白。
23.根据实施方案22所述的重组NDV，其中所述非NDV APMV F蛋白和所述非NDVAPMV HN蛋白在免疫学上分别不同于所述NDF F蛋白和所述NDV HN蛋白。
24.根据实施方案22所述的重组NDV，其中所述非NDV APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和正禽腮腺炎病毒属、偏禽腮腺炎病毒属或副禽腮腺炎病毒属的HN蛋白。
25.根据实施方案22或23所述的重组NDV，其中所述非NDV APMVF蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和正禽腮腺炎病毒属、偏禽腮腺炎病毒属或副禽腮腺炎病毒属的F蛋白。
26.根据实施方案22所述的重组NDV，其中所述非NDV APMV HN是APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75、APMV17/Antarctica/107/13、APMV9/duck/New York/22/78、APMV7/Dove/Tennessee/4/75、APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17、APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77、APMV11/common_snipe/France/100212/10、APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12、APMV8/Goose/Delaware/1053/76、APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56、APMV3/Turkey/Wisconsin/68、APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05、APMV5/budgerigar/Japan/TI/75或APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07的所述HN蛋白。
27.根据实施方案22或26所述的重组NDV，其中所述非NDV APMVF是APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75、APMV17/Antarctica/107/13、APMV9/duck/New York/22/78、APMV7/Dove/Tennessee/4/75、APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17、APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77、APMV11/common_snipe/France/100212/10、APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12、APMV8/Goose/Delaware/1053/76、APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56、APMV3/Turkey/Wisconsin/68、APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05、APMV5/budgerigar/Japan/TI/75或APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07的所述F蛋白。
28.一种重组新城疫病毒(NDV)，所述重组NDV包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列被替换为包含从SEQ ID NO:1-14中任一者所示的cDNA序列转录的负义RNA序列的核苷酸序列。
29.一种重组新城疫病毒(NDV)，所述重组NDV包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列被替换为包含从与SEQ ID NO:1-14中任一者的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列转录的负义RNA序列的核苷酸序列。
30.根据实施方案22至29中任一项所述的重组NDV，其中所述NDV基因组包含NDVLaSota的NP基因、P基因、M基因和L基因。
31.根据实施方案22至30中任一项所述的重组NDV，其中所述包装的基因组还包含转基因。
32.根据实施方案31所述的重组NDV，其中所述转基因包含编码病毒、细菌、真菌或原生动物抗原的核苷酸序列。
33.根据实施方案31所述的重组NDV，其中所述转基因包含编码SARS-CoV-2抗原的核苷酸序列。
34.根据实施方案33所述的重组NDV，其中所述SARS-CoV-2抗原包含所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段。
35.根据实施方案34所述的重组NDV，其中所述片段包含所述SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合结构域。
36.根据实施方案31所述的重组NDV，其中所述转基因包含编码MERS-CoV抗原的核苷酸序列。
37.根据实施方案31所述的重组NDV，其中所述转基因包含编码呼吸道合胞病毒抗原或人类偏肺病毒抗原的核苷酸序列。
38.根据实施方案31所述的重组NDV，其中所述转基因包含编码拉沙病毒抗原、埃博拉病毒抗原或尼帕病毒抗原的核苷酸序列。
39.根据实施方案31所述的重组NDV，其中所述转基因包含编码癌或肿瘤抗原的核苷酸序列。
40.一种包含第一重组NDV的免疫原性组合物，所述第一重组NDV是根据实施方案22至31中任一项所述的重组NDV。
41.一种包含第一重组NDV的免疫原性组合物，所述第一重组NDV是根据实施方案32至38中任一项所述的重组NDV。
42.一种包含第一重组NDV的免疫原性组合物，所述第一重组NDV是根据实施方案39所述的重组NDV。
43.一种用于诱导对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用根据实施方案40、41或42所述的免疫原性组合物。
44.一种用于预防传染病的方法，所述方法包括向受试者施用根据实施方案40或41所述的免疫原性组合物。
45.一种用于使受试者免疫以抵抗传染病的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方案40或41所述的免疫原性组合物。
46.一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用根据实施方案40或42所述的免疫原性组合物。
47.根据实施方案43至46中任一项所述的方法，其中向所述受试者鼻内施用所述组合物。
48.根据实施方案43至47中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用包含包装的基因组的第二重组NDV，其中所述第二重组NDV的所述包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDVHN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于所述非NDV AMPV HN蛋白编码序列之前和之后；以及(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDVAPMV F蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于所述非NDV AMPVF蛋白编码序列之前和之后，并且其中所述第二重组NDV在免疫学上不同于所述第一重组NDV。
49.根据实施方案43至48中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
50.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据实施方案22至39中任一项所述的重组NDV。
51.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据实施方案1至21中任一项所述的核酸序列。
52.一种体外或离体细胞，所述体外或离体细胞包含根据实施方案22至39中任一项所述的重组NDV。
53.一种细胞系或鸡孵化蛋，所述细胞系或鸡孵化蛋包含根据实施方案22至39中任一项所述的重组NDV。
54.一种用于繁殖根据实施方案22至39中任一项所述的重组NDV的方法，所述方法包括培养根据实施方案52或53所述的细胞或孵化蛋。
55.根据实施方案54所述的方法，其中所述方法还包括从所述细胞或孵化蛋中分离所述重组NDV。
6.实施例
6.1实施例1：嵌合新城疫病毒(NDV)-禽副粘病毒(APMV)构建体
本实施例描述了嵌合NDV-APMV构建体的制备。在本实施例中，NDV(禽副粘病毒1)的病毒糖蛋白F和HN的编码区被替换为来自另一种禽副粘病毒(APMV)的同源糖蛋白(即，F和HN)的编码区，以产生重组嵌合NDV-APMV载体(图1)。
6.1.1材料和方法
使用例如以下文献中描述的方案通过反向遗传学产生嵌合NDV-APMV载体：Ayllon等人,Rescue of recombinant Newcastledisease virus from cDNA.J Vis Exp.2013年10月11日；(80):50830.doi:10.3791/50830。
6.1.1.1受体质粒pNDV-F-HNless的生成
简而言之，在含有在T7 RNA聚合酶启动子控制下的NDV基因组全长cDNA的拯救质粒pNDV-LaSota中，将含有F和HN编码序列的3.7Kb区域去除并替换为含有两个新的独特限制性位点(Pmel和Nrul)的短序列，以产生受体质粒pNDV-F-HNless(图2A-2B)。然后将编码其他APMV的F和HN蛋白的合成插入片段插入在受体质粒pNDV-F-HNless的M和L基因之间。为了证实将F和HN序列插入到受体质粒(pNDV-F-HNless)中产生了功能性质粒，将编码NDV的F和HN蛋白的序列插入在受体质粒pNDV-F-HNless的cDNA中的M和L基因之间，以产生功能性拯救质粒pNDV-LaSota，如图2C所示。这种功能性拯救质粒pNDV-LaSota成功拯救了活病毒(数据未示出)。
6.1.1.2APMV F和HN序列插入片段的设计
使用来自GenBank中可获得的所有APMV全基因组的F和HN序列的系统发育树用于选择要克隆到pNDV-F-HNless受体质粒中的F和HN序列(图3A和3B)。从系统发育树中选择了十四(14)个候选物来代表整个树的遗传多样性。例如，选择了来自具有GenBank登录号FJ177514、MK167211、EU910942、FJ231524、MK677433、EU622637、JQ886184、NC_034968、FJ215863、EU338414、EU782025、KC333050、LC168750和NC_025349的AMPV全基因组的F和HN序列。
为了合成AMPV F-HN序列，在F和HN开放阅读框之前、之间和之后添加了NDV基因间区。检查APMV F序列(指示毒力)的多碱性裂解位点，并且如果需要，将该序列替换为可用的最近无毒裂解位点。通过沉默点突变去除APMV-F-HN序列中的任何SacII限制性位点，这是由于独特的SacII限制性位点用于克隆附加基因。此外，由于任何副粘病毒基因组的完整核苷酸大小必须是六的倍数，因此检查APMV-F-HN序列是否符合六倍规则，并且如果需要，在F开放阅读框后添加第二终止密码子，以符合这一要求。
由Genewiz(www.genewiz.com)合成AMPV F-HN序列，并且AMPV F-HN序列可以是例如SEQ ID NO:1-14中的任一者。参见表1。由于所有的APMV F和HN序列插入片段在两端都有共同的NDV衍生序列，因此可以用相同的引物扩增和克隆这些插入片段。简而言之，通过PCR扩增AMPV F-HN序列，所用的PCR引物是为重建F和HN开放阅读框侧翼的NDV序列而设计的(图4A-4C)。然后将每个AMPV F-HN序列(或PCR产物)克隆到pNDV-F-HNless受体质粒中的M和L基因之间，以产生嵌合NDV-APMV质粒。已将表1中的每个序列克隆到pNDV-F-HNless受体质粒中的M和L基因之间，以产生嵌合NDV-APMV质粒。
6.1.1.3活力评估
通过例如空斑测定法来评估拯救的嵌合NDV-APMV的活力。使用例如微量中和测定法来测试嵌合NDV-APMV，以确认它们不被预先存在的NDV特异性体液免疫所中和。
6.1.2结果
本实施例描述了嵌合载体的制备。由于F和HN是中和抗体反应的主要靶标，并且不同的APMV在抗原性上是不同的，因此嵌合载体在抗原性上是不同的，从而不会被预先存在的NDV特异性体液免疫所中和。另一方面，由于生长特性由所有病毒蛋白的组合功能决定，并且由于所有禽副粘病毒共享通用的复制策略，因此嵌合载体具有完全活力，并且以与亲代NDV载体类似的方式复制。
6.2实施例2：APMV-4
本实施例提供的数据表明，发现APMV-4是比NDV更强效的免疫刺激剂。
6.2.1材料和方法
细胞系、抗体和其他试剂
将鼠癌细胞系B16-F10(小鼠皮肤黑色素瘤细胞；ATCC目录号CRL-6475)和CT26.WT(小鼠结肠癌细胞；ATCC目录号CRL-2638)维持在补充有10％FBS(胎牛血清)及2％青霉素和链霉素的RPMI培养基中。使用ATCC配制的Eagle最低必需培养基繁殖人黑素瘤SK-MEL-2(ATCC目录号HTB-68TM)和结肠癌RKO-E6细胞(ATCC目录号CRL-2578TM)。购买后建立主癌细胞库，并在每个实验步骤中解冻早期传代细胞。培养后，细胞维持不超过8周，以保证基因型的稳定性，并通过显微镜进行常规监测。我们体内实验中涉及的癌细胞的所需IMPACT测试由西奈山伊坎医学院(Mount Sinai Hospital,New York,NY)的比较医学和外科中心进行。减血清培养基Opti-MEMTM(GibcoTM)用于体外病毒感染培养基。
病毒
先前已经描述了修饰的新城疫病毒LaSota-L289A(Vijayakumar G,Palese P,Goff PH.Oncolytic Newcastledisease virus expressing a checkpoint inhibitor asa radioenhancing agent for murine melanoma.EBioMedicine 2019；49:96-105)。APMV-4Duck/Hong Kong/D3/1975(175ADV0601)分离株获自美国农业部国家兽医服务实验室(USDA,Ames,IA)。病毒原液在9日龄孵化鸡蛋中繁殖，并通过不连续蔗糖密度梯度超速离心从尿囊液中洁净纯化，以便在PBS中重悬并储存。通过Vero细胞上的间接免疫荧光来计算病毒滴度。
通过RT-qPCR的转录分析
在250μl OptiMEM-I中对癌细胞进行模拟处理或以MOI为1PFU/细胞的指定病毒感染癌细胞。在让病毒吸附1小时后，将细胞与另外750μl补充培养基一起孵育。在感染后的指示时间，使用Qiagen RNeasy Minikit(目录号74106，Qiagen)分离总RNA。使用用于RT-qPCR的Maxima第一链cDNA合成试剂盒(目录号K1671，Thermo Scientific)进行cDNA合成。根据2-ΔΔCT方法(Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PCR and the 2(-Delta C(T))Method.Methods 2001；25:402-8)，将来自三个单独生物样品的cDNA的平均n倍表达水平归一化为18S rRNA水平，并校准至模拟处理的样品。使用Morpheus(https://software.broadinstitute.org/morpheus)创建热图。人类和鼠的引物序列已汇编于表2中。
表2：RT-qPCR引物序列
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统计分析
使用GraphPad Prism 9进行数据分析。单因素方差分析或双因素方差分析分别用于比较具有一个或两个独立变量的多个组。结果以所指示的平均值±SEM或±SD表示。使用对数秩(Mantel-Cox)检验进行生存曲线的比较。p值>0.05被认为在统计学上不显著(ns)；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
6.2.2结果
APMV-4(重组APMV-4)的感染性克隆是通过设计基于质粒的拯救策略而产生的，该策略模仿了已经建立的用于NDV和其他副粘病毒的系统(Ayllon J,Garcia-Sastre A,Martinez-Sobrido L.Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA.JVis Exp 2013)。
在感染后8小时和16小时评价由APMV-4或重组APMV-4(rAPMV-4)感染的癌症引发的促炎反应(图5E-5H)。通过qPCR进行的mRNA表达分析显示，与感染后8小时LS-L289A诱导的表达水平相比，APMV-4感染的细胞增加了INF-β、STAT-1、ISG15、OAS1和MX1基因的上调。所有癌细胞系都显示出了这种更早和更强的I型干扰素特征，而与它们的来源无关，并且这种特征通过rAPMV-4感染来复制。在8小时或16小时，发现APMV-4病毒和NDV在ISG-15和MX-1的表达上存在显著差异。IL-6在鼠癌细胞中的上调尤为明显，而OAS1则在人类癌细胞中显著上调。对病毒核蛋白N的mRNA表达水平的分析(图5A-5D)没有显示病毒复制活性和早期免疫信号之间的直接联系，其中B16-F10(图5A、5E)和SK-MEL-2黑色素瘤癌细胞(图5C、5G)显示LS-L289A病毒的N mRNA水平较高，但对APMV-4和rAPMV-4的免疫刺激较强。
6.2.3讨论
APMV-4Duck/Hong Kong/D3/1975是第一个鉴定的APMV-4病毒，并被认为是副禽腮腺炎病毒物种的原型株系(Gogoi P,Ganar K,Kumar S.Avian Paramyxovirus:ABriefReview.Transbound Emerg Dis 2017；64:53-67；Shortridge KF,AlexanderDJ.Incidence and preliminary characterisation of a hitherto unreported,serologically distinct,avian paramyxovirus isolated in Hong Kong.Res Vet Sci1978；25:128-30)。这种分离株通常从世界各地的野生水禽中发现，偶尔也从家鸭、鹅和鸡中发现，但这些受感染的动物中从未报告过疾病的临床症状(Alexander DJ.Newcastledisease and other avian paramyxoviruses.Rev Sci Tech 2000；19:443-62；Warke A,Stallknecht D,Williams SM,Pritchard N,Mundt E.Comparative study on thepathogenicity and immunogenicity of wild bird isolates of avian paramyxovirus2,4,and 6in chickens.Avian Pathol 2008；37:429-34)。这种无毒表型已被鸟类和哺乳动物的实验接种所证实(Samuel AS,Subbiah M,Shive H,Collins PL,SamalSK.Experimental infection of hamsters with avian paramyxovirus serotypes 1to9.Vet Res 2011；42:38)。高剂量APMV-4(107PFU)的鼻内施用没有损害接种小鼠的健康(数据未示出)。先前已经报道了Duck/Hong Kong/D3/1975株系的完整基因组序列和分子特征(Nayak B,Kumar S,Collins PL,Samal SK.Molecular characterization and completegenome sequence of avian paramyxovirus type 4prototype strain duck/Hong Kong/D3/75.Virol J 2008；5:124)。APMV-4的RBP HN蛋白具有血凝素和神经氨酸酶活性，并被预测能识别唾液酸。它的F蛋白有一个单碱性裂解位点(DIPQR↓F)，虽然与无毒性弱毒型NDV株系中的裂解位点相似，但已被认为能使APMV-4在体外的某些细胞系中进行多周期复制，尽管没有显示出典型的弗林蛋白酶裂解位点。在本发明人对癌细胞进行的复制研究中，只有在感染培养基中加入外源TPCK-胰蛋白酶后才能进行多周期复制。然而，观察到APMV-4能够达到比LS-L289A病毒更高的滴度，同时表现出相似的生长动力学(数据未示出)。考虑到上述所有情况，APMV4的F蛋白对内源性或分泌性蛋白酶的蛋白水解激活的不同依赖性可以支持病毒适应性的这些差异。
此外，APMV-4已经证明了其在受感染的癌细胞中触发促炎和死亡应答的能力(参见图5A-5H)。当与NDV比较时，发现APMV-4是对于宿主更强效的免疫刺激剂(出处同上)。当与NDV比较时，发现APMV-4是更强效的免疫刺激剂，导致I型干扰素反应更早和更强上调。有趣的是，这种效应在测试的不同癌细胞中得以保留(图5E-5H)，并且不依赖于病毒复制的水平(图5A-5D)。
6.3实施例3：嵌合新城疫病毒(NDV)-禽副粘病毒(APMV)构建体NDV-APMV2和NDV- APMV3
禽副粘病毒(APMV)属于禽腮腺炎病毒亚科。APMV包含抗原性不同的高度多样性的成员。APMV被进一步分类为偏禽腮腺炎病毒属、正禽腮腺炎病毒属和副禽腮腺炎病毒属。新城疫病毒(NDV)属于正禽腮腺炎病毒属，也称为AMPV血清型-1(APMV-1)(图6A)。为了挖掘NDV作为不同病毒病原体的疫苗载体的潜力，并克服由基于NDV的疫苗引入的预先存在的免疫性，本实施例描述了嵌合NDV-APMV2和NDV-APMV3病毒的生成，并提供了证明这些病毒在抗原性上不同于野生型NDV的数据。在本实施例中，NDV(禽副粘病毒1)的病毒糖蛋白F和HN的编码区被替换为来自另一种禽副粘病毒(APMV)的同源糖蛋白(即，F和HN)的编码区，以产生重组嵌合NDV-APMV病毒(图6B)。
6.3.1材料和方法
病毒
如实施例1中所述的那样制备嵌合NDV-APMV载体。简而言之，将来自APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56的F和HN序列克隆到pNDV-F-HNless受体质粒中以制备嵌合NDV-APMV2载体。将来自APMV3/Turkey/Wisconsin/68的F和HN序列克隆到pNDV-F-HNless受体质粒中以制备嵌合NDV-APMV3。如系统发育树(图6A)所示，APMV2属于偏禽腮腺炎病毒，并且AMPV3属于副禽腮腺炎病毒属。APMV2和APMV3不仅在抗原性上不同于NDV(正禽腮腺炎病毒)，而且彼此在抗原性上也不同(图7)。
作为生物标记物并为了成像目的，将绿色荧光蛋白(GFP)基因插入在嵌合NDV-APMV2的P和M基因之间以产生嵌合NDV-APMV2-GFP构建体。关于嵌合NDV-APMV2-GFP的核苷酸序列，参见SEQ ID NO:44。类似地，将GFP基因插入在嵌合NDV-APMV3的P和M基因之间以产生嵌合NDV-APMV3-GFP构建体(图7)。关于嵌合NDV-APMV3的核苷酸序列，参见SEQ ID NO:45。使用标准技术进行重组病毒拯救(参见例如J.Ayllon,A.Garcia-Sastre,L.Martinez-Sobrido,Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA.J Vis Exp,(2013))。
转基因表达和抗原性
为了证明转基因的表达，分别用嵌合NDV-APMV2-GFP和嵌合NDV-APMV3-GFP的病毒感染鸡胚成纤维细胞(CEF)。通过使用荧光显微镜检查感染后18小时的GFP表达来验证转基因的表达。为了研究嵌合NDV-APMV2-GFP和嵌合NDV-APMV3-GFP病毒在抗原性上是否不同于NDV病毒，使用了血凝抑制(HI)测定法，因为APMV的HN蛋白可使红细胞凝集。在针对野生型(WT)NDV病毒培养的兔血清中进行HI测定法。
6.3.2结果
荧光显微镜下观察到的GFP表达证明了转基因的表达。如图8A所示，在感染后18小时，在嵌合NDV-APMV2-GFP和嵌合NDV-APMV3-GFP病毒感染的CEF细胞中都观察到GFP表达信号。结果表明嵌合NDV-APMV2-GFP和嵌合NDV-APMV3-GFP病毒都能表达转基因。
通过HI测定法评估嵌合NDV-APMV病毒和WT NDV之间的抗原差异。图8B中的结果显示，与针对NDV-GFP构建体的活性相比，针对嵌合NDV-APMV-2-GFP和嵌合NDV-APMV-3-GFP构建体的兔血清HI活性显著降低。结果表明，两种嵌合NDV-APMV病毒在抗原性上都不同于野生型NDV。
表3：NDV-APMV2-GFP:APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56和NDV-APMV3-GFP:APMV3/Turkey/Wisconsin/68的核苷酸序列
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本发明的范围不受本文所述的具体实施方案的限制。实际上，根据前面的描述和附图，除了所描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文引用的所有参考文献全文以引用方式并入本文，并且用于所有目的，其程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请都被具体且单独地指示全文以引用方式并入以用于所有目的。
序列表
<110> 西奈山伊坎医学院(ICAHN SCHOOL OF MEDICINE AT MOUNT SINAI)
<120> 表达APMV HN和F蛋白的嵌合新城疫病毒
<130> 6923-382-228
<140>
<141>
<150> US 63/302,434
<151> 2022-01-24
<150> US 63/179,994
<151> 2021-04-26
<160> 47
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 3774
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APMV4/duck/Hongkong (China)/D3/75
<400> 1
atttacagtt agtttacctg tctatcaagt tagaaaaaac acgggtagaa gattctggat 60
cccggttggc gccctccagg tgcaagatga ggctatcaaa cacaatcttg accttgattc 120
tcatcatact taccggctat ttgataggtg tccactccac cgatgtgaat gagaaaccaa 180
agtccgaagg gattaggggt gatcttacac caggtgcggg tattttcgta actcaagtcc 240
gacagctcca gatctaccaa cagtctgggt accatgatct tgtcatcaga ttgttacctc 300
ttctaccaac agagcttaat gattgtcaaa gggaagttgt cacagagtac aataacactg 360
tatcacagct gttgcagcct atcaaaacca acctggatac tttgttggca gatggtagca 420
caagggatgt tgatatacag ccgcgattca ttggggcaat aatagccaca ggtgccctgg 480
ctgtagcaac ggtagctgag gtaactgcag ctcaagcact atctcagtca aaaacgaatg 540
ctcaaaatat tctcaagttg agagatagta ttcaggccac caaccaagca gtttttgaaa 600
tttcacaggg actcgaagca actgcaaccg tgctatcaaa actgcaaact gagctcaatg 660
agaatatcat cccaagtctg aacaacttgt cctgtgctgc catggggaat cgccttggtg 720
tatcactctc actctatttg accttaatga ccactctatt tggggaccag atcacaaacc 780
cagtgctgac gccaatctct tacagcaccc tatcggcaat ggcgggtggt cacattggtc 840
cagtgatgag taagatatta gccggatctg tcacaagtca gttgggggca gaacaactga 900
ttgctagtgg cttaatacag tcacaggtag taggttatga ttcccagtat cagctgttgg 960
ttatcagggt caaccttgta cggattcagg aagtccagaa tactagggtt gtatcactaa 1020
gaacactagc agtcaatagg gatggtggac tttacagagc ccaggtgcca cccgaggtag 1080
ttgagcgatc tggcattgca gagcggtttt atgcagatga ttgtgttcta actacaactg 1140
attacatctg ctcatcgatc cgatcttctc ggcttaatcc agagttagtc aagtgtctca 1200
gtggggcact tgattcatgc acatttgaga gggaaagtgc attactgtca actcccttct 1260
ttgtatacaa caaggcagtc gtcgcaaatt gtaaagcagc gacatgtaga tgtaataaac 1320
cgccatctat cattgcccaa tactctgcat cagctctagt aaccatcacc accgacactt 1380
gtgctgacct tgaaattgag ggttatcgtt tcaacataca gactgaatcc aactcatggg 1440
ttgcaccaaa cttcacggtc tcaacctcac aaatagtatc ggttgatcca atagacatat 1500
cctctgacat tgccaaaatt aacaattcta tcgaggctgc gcgagagcag ctggaactga 1560
gcaaccagat cctttcccga atcaacccac ggattgtgaa cgacgaatca ctaatagcta 1620
ttatcgtgac aattgttgtg cttagtctcc ttgtaattgg tcttattatt gttctcggtg 1680
tgatgtacaa gaatcttaag aaagtccaac gagctcaagc tgctatgatg atgcagcaaa 1740
tgagctcatc acagcctgtg accaccaaat tggggacacc cttctgatga acacagatga 1800
ggaacgaagg tttccctaat agtaatttgt gtgaaagttc tggtagtctg tcagttcaga 1860
gagttaagaa aaaactaccg gttgtagatg accaaaggac gatatacggg tagaacggta 1920
agagaggccg cccctcaatt gcgagccagg cttcacaacc tccgttctac cgcttcaccg 1980
acaacagtcc tcaatcatgc agggcgacat ggagggtagc cgtgataacc tcacagtaga 2040
tgatgaatta aagacaacat ggaggttagc ttatagagtt gtatccctcc tattgatggt 2100
gagtgccttg ataatctcta tagtaatcct gacgagagat aacagccaaa gcataatcac 2160
ggcgatcaac cagtcgtatg acgcagactc aaagtggcaa acagggatag aagggaaaat 2220
cacctcaatc atgactgata cgctcgatac caggaatgca gctcttctcc acattccact 2280
ccagctcaat acacttgagg caaacctgtt gtccgccctc ggaggttaca cgggaattgg 2340
ccccggagat ctagagcact gtcgttatcc ggttcatgac tccgcttacc tgcatggagt 2400
caatcgatta ctcatcaatc aaacagctga ctacacagca gaaggccccc tggatcatgt 2460
gaacttcatt ccggcaccag ttacgactac tggatgcaca aggatcccat ccttttctgt 2520
atcatcatcc atttggtgct atacacacaa tgtgattgaa acaggttgca atgaccactc 2580
aggtagtaat caatatatca gtatgggggt gattaagagg gctggcaacg gcttacctta 2640
cttctcaaca gtcgtgagta agtatctgac cgatgggttg aatagaaaaa gctgttccgt 2700
agctgcggga tccgggcatt gttacctcct ttgtagccta gtgtcagagc ccgaacctga 2760
tgactatgtg tcaccagatc ccacaccgat gaggttaggg gtgctaacaa gggatgggtc 2820
ttacactgaa caggtggtac ccgaaagaat atttaagaac atatggagcg caaactaccc 2880
tggggtaggg tcaggtgcta tagcaggaaa taaggtgtta ttcccatttt acggcggagt 2940
gaagaatgga tcaacccctg aggtgatgaa taggggaaga tattactaca tccaggatcc 3000
aaatgactat tgccctgacc cgctgcaaga tcagatctta agggcagaac aatcgtatta 3060
tcctactcga tttggtagga ggatggtaat gcagggagtc ctaacatgtc cagtatccaa 3120
caattcaaca atagccagcc aatgccaatc ttactatttc aacaactcat taggattcat 3180
cggggcggaa tctaggatct attacctcaa tggtaacatt tacctttatc aaagaagctc 3240
gagctggtgg cctcaccccc aaatttacct acttgattcc aggattgcaa gtccgggtac 3300
gcagaacatt gactcaggcg ttaacctcaa gatgttaaat gttactgtca ttacacgacc 3360
atcatctggc ttttgtaata gtcagtcaag atgccctaat gactgcttat tcggggttta 3420
ttcagatgtc tggcctctta gccttacctc agacagcata tttgcattta caatgtactt 3480
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gcatgaggct cgtttgttca acaaggaggt tagtgctgct tattctacca ccacttgttt 3600
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cttgggggca ttcaagatag tgccattcct ctatcgtgtc ttatagttga gtcaattata 3720
aaggagttgg aaagatggca ttgtatcacc tatcttctgc gacatcaaga atca 3774
<210> 2
<211> 3720
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APMV17/Antarctica/107/13
<400> 2
atttacagtt agtttacctg tctatcaagt tagaaaaaac acgggtagaa gattctggat 60
cccggttggc gccctccagg tgcaagatgc aattgtactc agtcctggct ctggccttac 120
tggcagttca agcggagctc ggtataatcc cctccctgag caacacacac tcaatagatg 180
caggatttgt gttccagtct gagcgagcag tcaatatcta caccaattca ttaaccggga 240
gtgtggtagt taaactgctc cctaacttac cagatcacct caaaagctgc caccttgatg 300
tcctaagcag ttacaaccgc acccttacat ctatcttcca accgctaggt gagagtataa 360
agcatatatg gggtaacact acaggagggt cagccgcagg aggaatccag tctcggatag 420
tgggtgccat acttggaggt gtagccttag gtgtagcaac atcagcacag attacagcag 480
gagttgcctt agcacaatcc aggcagaatg cagagaatat cttaaagttg aaacagtcta 540
ttgctgcaac aaatgatgct gtgcaagagg ttattgcagg acaacgagag cttgtgattg 600
caataggtaa aatgcaggat tacatcaatc aagcgcttaa cagcactatc cagcaaatcg 660
actgtgttac tgctgcaaat cggctcggag tggaacttag cttgtatctg actcagctta 720
ccaccgcctt cagtaatcaa atccagaacc ctgcactcac tccgttgtct attcaggcgt 780
tatataacct agctggaggt aatttggata ggttcctcaa tcgcattgga gctaccacat 840
ctaatctaca gtccatcata tcaagtgggc taattcaggg gcaacctatt ggctacgact 900
ctgagaagca gctattgatc ctgtctgtat ctgtaccaag cataaatgca gtggataatt 960
tgcgcatggc gcagctgacc cccatagtgg tgtccactag ccaggggctg ggagctgtag 1020
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catgtagatg cattgatccc cccaaaatca tatcacaatt tgccgggaag ccgctcacca 1320
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taccggttgt agatgaccaa aggacgatat acgggtagaa cggtaagaga ggccgcccct 1860
caattgcgag ccaggcttca caacctccgt tctaccgctt caccgacaac agtcctcaat 1920
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catcctatct atcaagttag atcccggtct agggaaggat actacacttc acatttcatc 3120
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caatgcaact aatgtctcca caccccccgt aggtgctgca tacactacat ccacatgttt 3540
caaaatgacc tcaaccggac ggcggtactg catatcaata gcagaaatta ggaacaccat 3600
tttcggggaa tacagaattg tgcctctcct tgttgaaata gaacaggtgt agttgagtca 3660
attataaagg agttggaaag atggcattgt atcacctatc ttctgcgaca tcaagaatca 3720
<210> 3
<211> 3756
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APMV9/duck/New York/22/78
<400> 3
atttacagtt agtttacctg tctatcaagt tagaaaaaac acgggtagaa gattctggat 60
cccggttggc gccctccagg tgcaagatgg ggtacttcca cctattactt atactaacag 120
cgattgccat atctgcgcac ctctgctata ccacgacatt ggatggtaga aaactgcttg 180
gtgcaggcat agtgataaca gaagagaagc aagttagggt gtacacagct gcgcaatcag 240
gaacaattgt cttaaggtct ttccgtgtgg tctccttaga cagatactcg tgcatggaat 300
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tccgccgaat acaggcaagt ggtgtatcgg ttgagcgtat ccgagagggc cgcatatttg 420
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aatctcaaat attggcactg caagtgtcac taccctccat tagtgactta aggggagtga 960
gagcgacata cttagacacg ttggctgtca acactgcagc aggacttgca tctgctatga 1020
ttccaaaggt agtaatccaa tctaataata tagttgaaga attagatact acagcatgta 1080
tagcagcaga agctgactta tactgtacga ggattactac attccccatt gcgtcggctg 1140
tatcagcctg cattcttggg gatgtatcgc aatgccttta ttcaaagact aatggcgtct 1200
taaccactcc atatgtagca gtaaagggga aaattgtagc caattgtaag catgtcacat 1260
gtaggtgtgt agatcctaca tccatcatat ctcaaaatta cggtgaagca gcgactctta 1320
tcgatgatca gctatgcaag gtaatcaact tagatggtgt gtccatacag ctgagcggca 1380
catttgaatc gacttatgtg cgcaacgtct cgataagtgc aaacaaggtc attgtctcaa 1440
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gaacacagat gaggaacgaa ggtttcccta atagtaattt gtgtgaaagt tctggtagtc 1800
tgtcagttca gagagttaag aaaaaactac cggttgtaga tgaccaaagg acgatatacg 1860
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gagtagagtg actagggtta gcagtagcag cacgaaggca gcttacacta caaatacatg 3540
ctttaaggtt gtcaaaacaa agagagtata ctgcttgagc attgccgaga tagagaatac 3600
actgtttgga gaattcagaa taaccccttt actctccgag ataatatttg acccaaacct 3660
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<210> 4
<211> 3690
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APMV7/Dove/Tennessee/4/75
<400> 4
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ttttagtgtt gctgtggtta aatattctac ccgtaattgg cttagacaat tcaaagattg 180
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aggatttaat caacacatac aatacaacga ttcaaaacat attctcacca attcaggatc 360
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caggagataa cctgatgcaa tttcttacca ggtatggcta tggagagaca agtgttagca 840
gtattctcga gtcaggacta atatcagcac aaattgtatc ttttgataaa cagacaggca 900
ttgcaatatt gtatgtcaca ttaccatcaa ttgcgactct ttccggttct agagttacca 960
aattgatgtc agttagtgtc caaactggag ttggagaggg ttctgctatt gtaccatcat 1020
acgttattca gcagggaaca gtaatagaag aatttattcc tgacagttgc atcttcacaa 1080
gatcagatgt ttattgtact caattgtaca gtaaattatt gcctgatagc atattgcaat 1140
gcctccaggg atcaatggca gattgccaat ttactcgctc attgggttca tttgcaaaca 1200
gattcatgac cgttgcaggt ggggtgatag caaattgtca gacagtcctg tgccgatgct 1260
ataatccagt tatgattatt ccccagaaca atggaattgc tgtcactctg atagatggta 1320
gtttatgtaa agaacttgaa ttggagggga taagactaac aatggcagac ccagtatttg 1380
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ttatattact atttgtatta gtatcaatct cattagtgat aggatgtatc tccatttatt 1620
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atccttatat acagaaagct aattgaacac agatgaggaa cgaaggtttc cctaatagta 1740
atttgtgtga aagttctggt agtctgtcag ttcagagagt taagaaaaaa ctaccggttg 1800
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cgatattcag gcaaaagtca gcagcatata tcggagcaac ttgctaagta tcccactaca 2160
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tagtggatgt caggatcatt caaccagtag tgaatacata tcgatggggg ttgttgaagt 2520
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aaacagaaag tcatgtagca ttgcagcaac tgggttcggg tgtgatatat tatgtagtgt 2640
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aagattattt tttaatggca catattcaga gatgtcattg aatgtgaacc aaatgttcgc 2760
agattgggtt gcaaattatc cagcagttgg atcaggagta gagttagcag attttgtcat 2820
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ttatcaacga tctagttcgt attggccagt gggaattata tataaattag atctacaaga 3180
attgacaaca ttttcatcaa atcaattgct gtcaacaata ccaattccat ttgagaaatt 3240
ccctagacct gcatctactg ctggtgtatg ttcaaaacca aatgtgtgtc ctgcagtatg 3300
ccagactggt gtttatcaag atctctgggt actatatgat cttggcaaat tagaaaatac 3360
cacagcagta ggattgtatc taaactcagc agtaggccga atgaaccctt ttattgggat 3420
tgcaaatacg ctatcttggt ataatacaac tagattattc gcacagggta ctccagcatc 3480
atattcaaca acgacctgct tcaaaaatac taagattgac acggcatact gcttatcaat 3540
attagaatta agtgattctt tgttaggatc atggagaatt acaccattat tgtacaatat 3600
cactttaagt attatgagct agttgagtca attataaagg agttggaaag atggcattgt 3660
atcacctatc ttctgcgaca tcaagaatca 3690
<210> 5
<211> 3702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APMV21/pigeon/Taiwan (China)/AHRI128/17
<400> 5
atttacagtt agtttacctg tctatcaagt tagaaaaaac acgggtagaa gattctggat 60
cccggttggc gccctccagg tgcaagatga caaagaggat caatctaacg ttgtccttat 120
atatactggt cacaatctca gtgtgtctcc caacaactcg atgtctagac aatagcaaat 180
tggctcgagc cgggataata agttcagccg aatatgcagt gagtgtgtat gctcagacaa 240
atgaagcata catagcactt agaaccattc catatttacc agccaatccg aataattgct 300
tcacaccaac tataaccaca tataacacta caatacaatc tattttctca cctattgtct 360
cacagattaa tgcaattact tcgagcacct cgacccaaca agagagactc ttcggagtga 420
tcataggtac tgttgctttg ggagtggcca ctgcagcaca agtgactgct gcagttgcgc 480
taacacaagc tcaaagcaat gcaaaagcaa tcctacaact caaatcatca atacaaaata 540
ctattgctgc tgtgtcagaa gtgaaagacg ggttaagcac aattgggatt gctctaggaa 600
aaatccaagt ttatgtcaat gaagtgataa atccccaact tgctaacctg acttgccaaa 660
cagctgctgc gaatttagga gtccaactta gtctatatct aacagaattg acaactgtgt 720
ttgggcccca aatcacaaac cctgcattat caccactgac tattcaagca ctttataatc 780
tggcaggatc gaacttagat acattctttg agaaatatgg ttataagcaa gcaactgcaa 840
caagtgtgct agaggctgga ctagtaactg gccagattgt atcttttgat ccagctacag 900
gtattggaat tattcgagtt tcccttccta gcatagcaac actatcttct gctcgtgtca 960
ccaaacttga aactgtgagt gttagtacct caacaggaga agctgtagcc attgtcccgt 1020
cattcataat acagcaaggg acagttatag aagaattcat aattgacggc tgtataagaa 1080
caagtgctga tatatattgc actcggctgt ttacaaaaat actgcctgat agcgtactga 1140
attgcttgca aggattagtt aatgagtgtc aatttacccg tggcttaggg acctatgcaa 1200
ataggtttgt aacaatcaat ggtggaattg ttgcaaattg tcaaacatta ctctgccgct 1260
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tcaaccaagc aacaaaagat gtcactgcta tatcaattaa taagtcagca gcagacataa 1560
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cgaatccata cgttacaaat gccaagtgat gaacacagat gaggaacgaa ggtttcccta 1740
atagtaattt gtgtgaaagt tctggtagtc tgtcagttca gagagttaag aaaaaactac 1800
cggttgtaga tgaccaaagg acgatatacg ggtagaacgg taagagaggc cgcccctcaa 1860
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cctgcctcta cagttggatg atatccagac agccatagtg tcttcttcaa ggcaattagc 2220
tgacactata aatagcttct tagcaatcaa tggttcatct gcagtgctat acacaacagg 2280
tcccgagttc tcaaacggat ttaataagga gctttatccc aactttaatc agactcgaga 2340
ttctatatca attgggcagc tagttgagtt cacaaacttc ataccaacac caacaactaa 2400
gccggggtgc ataagaatac ccacatttgc tgcaggacaa tctcattggt gttatagtca 2460
caatataatt gcatccggat gtcaagacca ttcaacaagt agtcagtaca tagccatggg 2520
agtaatcatc attaatcaac aacaatcacc tgacttcaga acaacaactt ctatcaccct 2580
gtcggataat aagaatagaa aatcatgtag tgtcggagtg tcggaatacg gatgtgatct 2640
tttgtgcagt gtggtaacag aaacagagaa tgaagattac aagtcagaac ccccgacaga 2700
catgatatac gggaggttat tctttaacgg gacatacagt gaagttgatc tccctgtgtc 2760
tacactgttc tctgaatggg ttgcgaatta cccaggagta gggtcagggg ttgtgtatcg 2820
caggaagatg tatttcccta tttatggagg aattaagatt tcctctaatt tgggaaacta 2880
cttgtctcac ttttactata taccacaagt tcccactgtc aattgtacag acagtgatga 2940
gatacagatt accaatgcaa aggcgtcata ctctcctcct aaagttgctc cgaatttatg 3000
ggggcaagca ttgcttgctt gtaatatcag cgttaatttg ccgagttcct gtagattact 3060
agtcttcaat acgtcatcaa tgatgatggg tgctgaaggt agaatatata acatcaatga 3120
gcagtattat ttctaccaaa gatcaagcag ttattggcca gtgggcctca tctataggct 3180
ggaaatgaca agccttgaca gcatgactga ttcaggtatt atcaacacta ctcccatccc 3240
ctttgagaaa ttcccacggc cagcatcaca ggctggtgtg tgctcaattc caagcgtttg 3300
tcctcgagtc tgtcaaactg gcgtttatca ggacatctgg gtgttatcac aaccaagtgt 3360
tgaaatgaat actacagcaa taggtatcta tcttaactca gctgtcggta ggacaaatcc 3420
gaaaattggc gttgcaaata ccttaagctg gatagacgct gttcaattgt ttcaaccaac 3480
tactcctgct agttactcca caactacttg ttttaagaat acagcaagag atatatctta 3540
ttgtctgtca atcctggaac taagcgattc actacttggt tcttggagga tagctccatt 3600
gctgtataat cttacactgg ttcctaattc atagttgagt caattataaa ggagttggaa 3660
agatggcatt gtatcaccta tcttctgcga catcaagaat ca 3702
<210> 6
<211> 3870
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APMV6/duck/Hongkong (China)/18/199/77
<400> 6
atttacagtt agtttacctg tctatcaagt tagaaaaaac acgggtagaa gattctggat 60
cccggttggc gccctccagg tgcaagatgg gagcccgact ggggcccttt acaatggcac 120
ccggccggta tgtgattatt ttcaacctca tccttctcca caaggttgtg tcactagaca 180
attcaagatt actacagcag gggattatga gtgcaaccga aagagaaatc aaagtgtaca 240
caaactccat aactggaagc attgctgtga gattgattcc caacctacct caagaagtgc 300
ttaaatgttc tgctgggcag atcaaatcat acaatgacac ccttaatcga attttcacac 360
ctatcaaggc gaatcttgag aggttactgg ctacaccgag tatgcttgaa cacaaccaga 420
accctgcccc agaacctcgc ctgattggag caattatagg cacagcagca ctggggctgg 480
caacagcagc tcaggttaca gctgcactcg cccttaacca ggcccaggat aatgctaagg 540
ccatcttaaa cctcaaagag tccataacaa aaacaaatga agctgtgctt gagcttaagg 600
atgcaacagg gcaaattgcg atagcgctag ataagactca aagattcata aatgacaata 660
tcttaccggc aatcaataat ctgacatgtg aagtagcagg tgctaaagta ggtgtggaac 720
tatcattata cttgaccgag ttaagcactg tgtttgggtc gcagataacc aatccagcac 780
tctccactct atccattcaa gccctcatgt cactctgcgg taatgatttt aattacctcc 840
tgaacctaat gggggccaaa cactccgatc tgggtgcact ttatgaggca aacttaatca 900
atggcagaat cattcaatat gaccaagcaa gccaaatcat ggttatccag gtctccgtgc 960
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ttagaacaaa accattgcca gaactagtcg cacaatgtct ccgaggggat gagtctagat 1200
gccaatatac gactggaatc ggtatgcttg aatctcgatt tggggtattt gatggacttg 1260
ttattgctaa ttgtaaggcc accatctgcc gatgtctagc ccctgagatg ataataactc 1320
aaaacaaggg actccccctt acagtcatat cacaagaaac ttgcaagaga atcctgatag 1380
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tcgggaacag ccaaattgcc ccatctggac cccttgacat ctcaagcgaa ctcggaaagg 1500
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gggtgaatcc aaacatagta aacaacaccg caattatagt cacaatagta ttgctagtta 1620
tcctggtatt atggtgtttg gccctaacga ttagtatctt gtatgtatca aaacatgctg 1680
tgcgaatgat aaagacagtt ccgaatccgt atgtaatgca agcaaagtcg ccgggaagtg 1740
ccacacagtt ctgaacacag atgaggaacg aaggtttccc taatagtaat ttgtgtgaaa 1800
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ggacgatata cgggtagaac ggtaagagag gccgcccctc aattgcgagc caggcttcac 1920
aacctccgtt ctaccgcttc accgacaaca gtcctcaatc atggcttcct caggcgatat 1980
gagacagagt caggcaactc tatatgaggg tgaccctaac agcaaaagga catggaggac 2040
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gtaccgtcat tggtgttata gtcacaacac gatagagtct ggttgtcacg atgcaggaga 2580
aagcattatg tacgtatcca tgggtgcggt aggggtcggc catcgcggga aacctgtgtt 2640
tacgacaagt gcagcgacaa tcctagatga tggaaggaac aggaaaagtt gtagcatcat 2700
agcaaaccct aatgggtgtg atgtcttatg cagcttggtt aagcagacag aaaatgaagg 2760
ctacgctgac cctacaccga ccccaatgat ccacggtagg ctccacttca atggcacata 2820
cactgagtct gaacttgacc ctggcctatt taataaccat tgggtcgctc aatatccagc 2880
agttggtagc ggtgtcgtca gccacagaaa actatttttc ccgctctacg gagggatatc 2940
accgaagtca aaactgttca atgagctcaa gtcatttgct tactttactc ataatgctga 3000
attgaaatgt gagaacctga cagagagaca gaaggaagac ctttataacg catataggcc 3060
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gttacagctt gtgcaagata agattgtctt ctaccaaaga tcctcatcat ggtggccagt 3240
cctaatatat tatgatatcc ctattagtga ccttatcagt gccgatcatt tagggatagt 3300
gaactggact ccgtatccac agtctaagtt tccgaggccc acctggacaa agggcgtatg 3360
tgagaaaccg gcgatatgcc ccgctgtatg tgtaacgggt gtttaccaag atgtttgggt 3420
agttagtata gggtcacaga gcaatgagac tgttgtggtt ggcgggtact tagatgctgc 3480
agcagcccgt caggatccat ggattgcagc agctaaccag tacaactggc tggttaggcg 3540
tcgcctcttt acatcccaaa ctaaagcagc atactcatca accacttgct tcagaaacac 3600
gaagcaggat agagtgttct gcctgactat aatggaagtc acagacaacc tactcggaga 3660
ctggaggatc gccccgctgt tgtatgaagt tactgtggct gataagcagc agggcaatcg 3720
caattacgtg cctatgggga gggtggggac agataagttc caatattata ccccaggtga 3780
cagatatact cctcagcatt agttgagtca attataaagg agttggaaag atggcattgt 3840
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<210> 7
<211> 3804
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<210> 8
<211> 3732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12
<400> 8
atttacagtt agtttacctg tctatcaagt tagaaaaaac acgggtagaa gattctggat 60
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<211> 3726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APMV8/Goose/Delaware/1053/76
<400> 9
atttacagtt agtttacctg tctatcaagt tagaaaaaac acgggtagaa gattctggat 60
cccggttggc gccctccagg tgcaagatgg gtaaaatatc aatatatcta attaatagcg 120
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gaatca 3726
<210> 10
<211> 3714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56
<400> 10
atttacagtt agtttacctg tctatcaagt tagaaaaaac acgggtagaa gattctggat 60
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tccttgcaaa ctgcagagca attgtgtgta agtgtgtctc acccccgcat ataataccac 1260
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ctgtgaaccc ccgccttgtg aacaatacga gcatcatagt cctctgtgtc cttgccgccc 1560
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cacaacctcc gttctaccgc ttcaccgaca acagtcctca atcatggatt tcccatctag 1920
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<210> 12
<211> 3846
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05
<400> 12
atttacagtt agtttacctg tctatcaagt tagaaaaaac acgggtagaa gattctggat 60
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cacagctagg ctccttaatc aacagcggat tgataaaagg cagaccaatc atgtatgatg 900
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cgccagttca cggtgcccta acgtatgcgt cacaggggtt tatacggatg cctatccact 3360
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taggatagtg ccactattaa tcgaagtaca aaagactcct ctcactagga gaagcgagct 3660
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gaatca 3846
<210> 13
<211> 3720
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APMV5/budgerigar/Japan/TI/75
<400> 13
atttacagtt agtttacctg tctatcaagt tagaaaaaac acgggtagaa gattctggat 60
cccggttggc gccctccagg tgcaagatgt tccaacttcc tttgaccatt cttcttagca 120
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cagtattcgg caatcaactg acaaacccag cccttaccac actgtcatta caagccttgt 780
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attataaagg agttggaaag atggcattgt atcacctatc ttctgcgaca tcaagaatca 3720
<210> 14
<211> 3702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07
<400> 14
atttacagtt agtttacctg tctatcaagt tagaaaaaac acgggtagaa gattctggat 60
cccggttggc gccctccagg tgcaagatga ctcgtactcg gttgctcttt ctcctcactt 120
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aagacgccga taagccatcc caacgaatta ttggggctat cataggatca gtagcgctag 420
gcgtagcaac aactgcacaa gtgactgcag cccttgcaat gacgcaggca caacaaaatg 480
cacgaaatat atggaagttg aaagagtcta tcaaaaatac aaatcaagca gtattggaac 540
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cggaaatatt acctcaaata aatcagttag gatgcgaggt tgcagcaaac aaattgggaa 660
tatttctatc tctctaccta actgaaatca ctacagtgtt caaaaatcaa atcacgaatc 720
ccgctctttc cacattatca taccaagccc tttataattt gtgtgggggc aatatggctg 780
ctttaacaaa acaaatagga attaaagata cagaaattaa ctcattatat gaagcagaat 840
tgatcacagg acaagttata gggtatgatt cagcagacca gatactgttg attcaagtat 900
catatccaag tgtttcaagg gtccaagggg ttagggcagt agaactcttg acagtcagtg 960
tggcaacacc aaaaggtgag gggaaagcaa ttgctccaag ctttatagct cagagcaata 1020
taattgctga agagttagat acacaaccat gtaagtttag taagacaaca ctctactgta 1080
gacaagttaa cactaggaca ttaccagtta gggtagcaaa ctgccttaaa ggcaaatata 1140
atgactgcca atataccaca gaaataggtg cattggcatc acgatatgtc acgattacaa 1200
atggggttgt tgccaactgc agatctatca tctgtaggtg cctggacccg gagggaatag 1260
ttgcccaaaa ttctgacgca gcaatcactg ttattgatag gtccacttgc aagttgatcc 1320
agttaggtga tattaccctc agattagaag gcaaattatc ctcatcatac tcaaagaata 1380
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ctggtattgt cgttatctgg ttagttataa tcacaatact atcgtattat atactcataa 1620
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accaaaggac gatatacggg tagaacggta agagaggccg cccctcaatt gcgagccagg 1860
cttcacaacc tccgttctac cgcttcaccg acaacagtcc tcaatcatgg actcatcaca 1920
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<210> 15
<211> 15186
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NDV株系LaSota的基因组序列的cDNA
<400> 15
accaaacaga gaatccgtga gttacgataa aaggcgaagg agcaattgaa gtcgcacggg 60
tagaaggtgt gaatctcgag tgcgagcccg aagcacaaac tcgagaaagc cttctgccaa 120
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acatagacta gatgatggta taactcagat gacattcacc cctgcatctc tctacagggt 12240
gtcaccttac attcacatat ccaatgattc tcaaaggctg ttcactgaag aaggagtcaa 12300
agaggggaat gtggtttacc aacagatcat gctcttgggt ttatctctaa tcgaatcgat 12360
ctttccaatg acaacaacca ggacatatga tgagatcaca ctgcacctac atagtaaatt 12420
tagttgctgt atcagagaag cacctgttgc ggttcctttc gagctacttg gggtggtacc 12480
ggaactgagg acagtgacct caaataagtt tatgtatgat cctagccctg tatcggaggg 12540
agactttgcg agacttgact tagctatctt caagagttat gagcttaatc tggagtcata 12600
tcccacgata gagctaatga acattctttc aatatccagc gggaagttga ttggccagtc 12660
tgtggtttct tatgatgaag atacctccat aaagaatgac gccataatag tgtatgacaa 12720
tacccgaaat tggatcagtg aagctcagaa ttcagatgtg gtccgcctat ttgaatatgc 12780
agcacttgaa gtgctcctcg actgttctta ccaactctat tacctgagag taagaggcct 12840
ggacaatatt gtcttatata tgggtgattt atacaagaat atgccaggaa ttctactttc 12900
caacattgca gctacaatat ctcatcccgt cattcattca aggttacatg cagtgggcct 12960
ggtcaaccat gacggatcac accaacttgc agatacggat tttatcgaaa tgtctgcaaa 13020
actattagta tcttgcaccc gacgtgtgat ctccggctta tattcaggaa ataagtatga 13080
tctgctgttc ccatctgtct tagatgataa cctgaatgag aagatgcttc agctgatatc 13140
ccggttatgc tgtctgtaca cggtactctt tgctacaaca agagaaatcc cgaaaataag 13200
aggcttaact gcagaagaga aatgttcaat actcactgag tatttactgt cggatgctgt 13260
gaaaccatta cttagccccg atcaagtgag ctctatcatg tctcctaaca taattacatt 13320
cccagctaat ctgtactaca tgtctcggaa gagcctcaat ttgatcaggg aaagggagga 13380
cagggatact atcctggcgt tgttgttccc ccaagagcca ttattagagt tcccttctgt 13440
gcaagatatt ggtgctcgag tgaaagatcc attcacccga caacctgcgg catttttgca 13500
agagttagat ttgagtgctc cagcaaggta tgacgcattc acacttagtc agattcatcc 13560
tgaactcaca tctccaaatc cggaggaaga ctacttagta cgatacttgt tcagagggat 13620
agggactgca tcttcctctt ggtataaggc atctcatctc ctttctgtac ccgaggtaag 13680
atgtgcaaga cacgggaact ccttatactt agctgaaggg agcggagcca tcatgagtct 13740
tctcgaactg catgtaccac atgaaactat ctattacaat acgctctttt caaatgagat 13800
gaaccccccg caacgacatt tcgggccgac cccaactcag tttttgaatt cggttgttta 13860
taggaatcta caggcggagg taacatgcaa agatggattt gtccaagagt tccgtccatt 13920
atggagagaa aatacagagg aaagcgacct gacctcagat aaagtagtgg ggtatattac 13980
atctgcagtg ccctacagat ctgtatcatt gctgcattgt gacattgaaa ttcctccagg 14040
gtccaatcaa agcttactag atcaactagc tatcaattta tctctgattg ccatgcattc 14100
tgtaagggag ggcggggtag taatcatcaa agtgttgtat gcaatgggat actactttca 14160
tctactcatg aacttgtttg ctccgtgttc cacaaaagga tatattctct ctaatggtta 14220
tgcatgtcga ggagatatgg agtgttacct ggtatttgtc atgggttacc tgggcgggcc 14280
tacatttgta catgaggtgg tgaggatggc gaaaactctg gtgcagcggc acggtacgct 14340
tttgtctaaa tcagatgaga tcacactgac caggttattc acctcacagc ggcagcgtgt 14400
gacagacatc ctatccagtc ctttaccaag attaataaag tacttgagga agaatattga 14460
cactgcgctg attgaagccg ggggacagcc cgtccgtcca ttctgtgcgg agagtctggt 14520
gagcacgcta gcgaacataa ctcagataac ccagatcatc gctagtcaca ttgacacagt 14580
tatccggtct gtgatatata tggaagctga gggtgatctc gctgacacag tatttctatt 14640
taccccttac aatctctcta ctgacgggaa aaagaggaca tcacttaaac agtgcacgag 14700
acagatccta gaggttacaa tactaggtct tagagtcgaa aatctcaata aaataggcga 14760
tataatcagc ctagtgctta aaggcatgat ctccatggag gaccttatcc cactaaggac 14820
atacttgaag catagtacct gccctaaata tttgaaggct gtcctaggta ttaccaaact 14880
caaagaaatg tttacagaca cttctgtact gtacttgact cgtgctcaac aaaaattcta 14940
catgaaaact ataggcaatg cagtcaaagg atattacagt aactgtgact cttaacgaaa 15000
atcacatatt aataggctcc ttttttggcc aattgtattc ttgttgattt aatcatatta 15060
tgttagaaaa aagttgaacc ctgactcctt aggactcgaa ttcgaactca aataaatgtc 15120
ttaaaaaaag gttgcgcaca attattcttg agtgtagtct cgtcattcac caaatctttg 15180
tttggt 15186
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<223> 小鼠IFN-B正向引物序列
<400> 16
cagctccaag aaaggacgaa c 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<223> 小鼠IFN-B反向引物序列
<400> 17
ggcagtgtaa ctcttctgca t 21
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 人类IFN-B正向引物序列
<400> 18
tctggcacaa caggtagtag gc 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人类IFN-B反向引物序列
<400> 19
gagaagcaca acaggagagc aa 22
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠属(Mus)
<220>
<223> 小鼠IL-6正向引物序列
<400> 20
ctgcaagaga cttccatcca g 21
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 小鼠属
<220>
<223> 小鼠IL-6反向引物序列
<400> 21
agtggtatag acaggtctgt tgg 23
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人类IL-6正向引物序列
<400> 22
agaggcactg gcagaaaaca ac 22
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人类IL-6反向引物序列
<400> 23
aggcaagtct cctcattgaa tcc 23
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人类IL-1B正向引物序列
<400> 24
ctcgccagtg aaatgatggc t 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人类IL-1B反向引物序列
<400> 25
gtcggagatt cgtagctgga t 21
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 小鼠属
<220>
<223> 小鼠IL-1B正向引物序列
<400> 26
tgggctggac tgtttctaat gc 22
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠属
<220>
<223> 小鼠IL-1B反向引物序列
<400> 27
tgtcttggcc gaggactaag g 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠属
<220>
<223> 小鼠ISG-15正向引物序列
<400> 28
ggtgtccgtg actaactcca t 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠属
<220>
<223> 小鼠ISG-15反向引物序列
<400> 29
tggaaagggt aagaccgtcc t 21
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人类ISG-15正向引物序列
<400> 30
tcctggtgag gaataacaag gg 22
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人类ISG-15反向引物序列
<400> 31
gtcagccaga acaggtcgtc 20
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠属
<220>
<223> 小鼠MX1正向引物序列
<400> 32
gaccataggg gtcttgacca a 21
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 小鼠属
<220>
<223> 小鼠MX1反向引物序列
<400> 33
agacttgctc tttctgaaaa gcc 23
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人类MX1正向引物序列
<400> 34
gtttccgaag tggacatcgc a 21
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人类MX1反向引物序列
<400> 35
gaagggcaac tcctgacagt 20
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠属
<220>
<223> 小鼠STAT-1正向引物序列
<400> 36
tcacagtggt tcgagcttca g 21
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠属
<220>
<223> 小鼠STAT-1反向引物序列
<400> 37
gcaaacgaga catcataggc a 21
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人类STAT-1正向引物序列
<400> 38
atgtctcagt ggtacgaact tca 23
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人类STAT-1反向引物序列
<400> 39
tgtgccaggt actgtctgat t 21
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LS-L289A N正向引物序列
<400> 40
gaaccatgtt gcccttgcag 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LS-L289A N反向引物序列
<400> 41
cctctccagg gtatcggtga 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APMV-4 N正向引物序列
<400> 42
atcggtcctt agcaggagga 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APMV-4 N反向引物序列
<400> 43
gggtccagtc gttgacactt 20
<210> 44
<211> 19395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NDV-APMV2-GFP: APMV2/Chicken/California/ Yucaipa/56
<400> 44
tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 60
tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 120
aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 180
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 240
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 300
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 360
agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 420
tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 480
aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 540
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 600
cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 660
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 720
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 780
ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 840
gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 900
aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 960
gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 1020
gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 1080
cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 1140
gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 1200
gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 1260
ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 1320
tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 1380
ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 1440
cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 1500
accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 1560
cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 1620
tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 1680
cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 1740
acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 1800
atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 1860
tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 1920
aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 1980
cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 2040
atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 2100
cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca 2160
gagcagattg tactgagagt gcaccataaa attgtaaacg ttaatatttt gttaaaattc 2220
gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc 2280
ccttataaat caaaagaata gcccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag 2340
agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc 2400
gatggcccac tacgtgaacc atcacccaaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa 2460
gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg 2520
aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt 2580
gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc 2640
gcgtactatg gttgctttga cgtatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa 2700
aataccgcat caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg 2760
tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa 2820
gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc 2880
tttaatacga ctcactatag ggagattggt ctgatgagtc cgtgaggacg aaacggagtc 2940
tagactccgt caccaaacag agaatccgtg agttacgata aaaggcgaag gagcaattga 3000
agtcgcacgg gtagaaggtg tgaatctcga gtgcgagccc gaagcacaaa ctcgagaaag 3060
ccttctgcca acatgtcttc cgtatttgat gagtacgaac agctcctcgc ggctcagact 3120
cgccccaatg gagctcatgg agggggagaa aaagggagta ccttaaaagt agacgtcccg 3180
gtattcactc ttaacagtga tgacccagaa gatagatgga gctttgtggt attctgcctc 3240
cggattgctg ttagcgaaga tgccaacaaa ccactcaggc aaggtgctct catatctctt 3300
ttatgctccc actcacaggt aatgaggaac catgttgccc ttgcagggaa acagaatgaa 3360
gccacattgg ccgtgcttga gattgatggc tttgccaacg gcacgcccca gttcaacaat 3420
aggagtggag tgtctgaaga gagagcacag agatttgcga tgatagcagg atctctccct 3480
cgggcatgca gcaacggaac cccgttcgtc acagccgggg ccgaagatga tgcaccagaa 3540
gacatcaccg ataccctgga gaggatcctc tctatccagg ctcaagtatg ggtcacagta 3600
gcaaaagcca tgactgcgta tgagactgca gatgagtcgg aaacaaggcg aatcaataag 3660
tatatgcagc aaggcagggt ccaaaagaaa tacatcctct accccgtatg caggagcaca 3720
atccaactca cgatcagaca gtctcttgca gtccgcatct ttttggttag cgagctcaag 3780
agaggccgca acacggcagg tggtacctct acttattata acctggtagg ggacgtagac 3840
tcatacatca ggaataccgg gcttactgca ttcttcttga cactcaagta cggaatcaac 3900
accaagacat cagcccttgc acttagtagc ctctcaggcg acatccagaa gatgaagcag 3960
ctcatgcgtt tgtatcggat gaaaggagat aatgcgccgt acatgacatt acttggtgat 4020
agtgaccaga tgagctttgc gcctgccgag tatgcacaac tttactcctt tgccatgggt 4080
atggcatcag tcctagataa aggtactggg aaataccaat ttgccaggga ctttatgagc 4140
acatcattct ggagacttgg agtagagtac gctcaggctc agggaagtag cattaacgag 4200
gatatggctg ccgagctaaa gctaacccca gcagcaagga ggggcctggc agctgctgcc 4260
caacgggtct ccgaggagac cagcagcata gacatgccta ctcaacaagt cggagtcctc 4320
actgggctta gcgagggggg gtcccaagct ctacaaggcg gatcgaatag atcgcaaggg 4380
caaccagaag ccggggatgg ggagacccaa ttcctggatc tgatgagagc ggtagcaaat 4440
agcatgaggg aggcgccaaa ctctgcacag ggcactcccc aatcggggcc tcccccaact 4500
cctgggccat cccaagataa cgacaccgac tgggggtatt gatggacaaa acccagcctg 4560
cttccacaaa aacatcccaa tgccctcacc cgtagtcgac ccctcgattt gcggctctat 4620
atgaccacac cctcaaacaa acatccccct ctttcctccc tccccctgct gtacaactac 4680
gtacgcccta gataccacag gcacaatgcg gctcactaac aatcaaaaca gagccgaggg 4740
aattagaaaa aagtacgggt agaagaggga tattcagaga tcagggcaag tctcccgagt 4800
ctctgctctc tcctctacct gatagaccag gacaaacatg gccaccttta cagatgcaga 4860
gatcgacgag ctatttgaga caagtggaac tgtcattgac aacataatta cagcccaggg 4920
taaaccagca gagactgttg gaaggagtgc aatcccacaa ggcaagacca aggtgctgag 4980
cgcagcatgg gagaagcatg ggagcatcca gccaccggcc agtcaagaca accccgatcg 5040
acaggacaga tctgacaaac aaccatccac acccgagcaa acgaccccgc atgacagccc 5100
gccggccaca tccgccgacc agccccccac ccaggccaca gacgaagccg tcgacacaca 5160
gctcaggacc ggagcaagca actctctgct gttgatgctt gacaagctca gcaataaatc 5220
gtccaatgct aaaaagggcc catggtcgag cccccaagag gggaatcacc aacgtccgac 5280
tcaacagcag gggagtcaac ccagtcgcgg aaacagtcag gaaagaccgc agaaccaagt 5340
caaggccgcc cctggaaacc agggcacaga cgtgaacaca gcatatcatg gacaatggga 5400
ggagtcacaa ctatcagctg gtgcaacccc tcatgctctc cgatcaaggc agagccaaga 5460
caataccctt gtatctgcgg atcatgtcca gccacctgta gactttgtgc aagcgatgat 5520
gtctatgatg gaggcgatat cacagagagt aagtaaggtt gactatcagc tagatcttgt 5580
cttgaaacag acatcctcca tccctatgat gcggtccgaa atccaacagc tgaaaacatc 5640
tgttgcagtc atggaagcca acttgggaat gatgaagatt ctggatcccg gttgtgccaa 5700
catttcatct ctgagtgatc tacgggcagt tgcccgatct cacccggttt tagtttcagg 5760
ccctggagac ccctctccct atgtgacaca aggaggcgaa atggcactta ataaactttc 5820
gcaaccagtg ccacatccat ctgaattgat taaacccgcc actgcatgcg ggcctgatat 5880
aggagtggaa aaggacactg tccgtgcatt gatcatgtca cgcccaatgc acccgagttc 5940
ttcagccaag ctcctaagca agttagatgc agccgggtcg atcgaggaaa tcaggaaaat 6000
caagcgcctt gctctaaatg gctaattact actgccacac gtagcgggtc cctgtccact 6060
cggcatcaca cggaatctgc accgagttcc cccccgcggt tagaaaaaat acgggtagaa 6120
ccgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg 6180
agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg 6240
ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct 6300
ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc 6360
acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca 6420
ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg 6480
acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc 6540
tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc 6600
agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc 6660
agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg 6720
acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc 6780
acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt 6840
acaagtgacc cgcggaccca aggtccaact ctccaagcgg caatcctctc tcgcttcctc 6900
agccccactg aatgatcgcg taaccgtaat taatctagct acatttaaga ttaagaaaaa 6960
atacgggtag aattggagtg ccccaattgt gccaagatgg actcatctag gacaattggg 7020
ctgtactttg attctgccca ttcttctagc aacctgttag catttccgat cgtcctacaa 7080
gacacaggag atgggaagaa gcaaatcgcc ccgcaatata ggatccagcg ccttgacttg 7140
tggactgata gtaaggagga ctcagtattc atcaccacct atggattcat ctttcaagtt 7200
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gctgcgatgc tctgcctagg aagcgtccca aataccggag accttattga gctggcaagg 7320
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actattaatg tggaggtaga cccgaggagt cctttggtta aatctctgtc taagtctgac 7680
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gggaagaaag tgacatttga caagctggaa aagaaaataa ggagccttga tctatctgtc 7800
gggctcagtg atgtgctcgg gccttccgtg ttggtaaaag caagaggtgc acggactaag 7860
cttttggcac ctttcttctc tagcagtggg acagcctgct atcccatagc aaatgcttct 7920
cctcaggtgg ccaagatact ctggagtcaa accgcgtgcc tgcggagcgt taaaatcatt 7980
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tttatcccgg tcctgcctgg gaacctatca acatgtgcac aggagacgct gcaggaatat 8460
aatagaactg tgactaatat cttaggcccg ttgagagaga acttggatgc tctcctatct 8520
gacttcgata aacctgcatc gaggttcgtg ggcgccatca ttgggtcggt ggccttgggg 8580
gtagcaacag ctgcacaaat cacagccgcc gtggctctca atcaagcaca agagaatgcc 8640
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gatattatac cacagattaa ggacattgac tgccaggtag ttgcaaataa attaggcgtc 8820
tacctctcct tatacttaac agagcttaca actgtatttg gttctcagat cactaatcct 8880
gcattatcaa cgctctctta ccaggcgctg tacagcttat gtggagggga tatgggaaag 8940
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tcagctaagt caaaacagat gaggggcgct atgacaggga tcgataatcc atatgtaata 9840
cagagtgcaa ctaagatgtg aacacagatg aggaacgaag gtttccctaa tagtaatttg 9900
tgtgaaagtt ctggtagtct gtcagttcag agagttaaga aaaaactacc ggttgtagat 9960
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cactcaaaat ggtccacagc caagtttgca tggctccata taaaacagat ccagaggcat 12600
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ttgcgtattg ggcgc 19395
<210> 45
<211> 19395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NDV-APMV3-GFP: APMV3/Turkey/Wisconsin/68
<400> 45
tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 60
tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 120
aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 180
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 240
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aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 540
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 600
cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 660
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 720
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 780
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gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 900
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tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 1380
ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 1440
cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 1500
accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 1560
cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 1620
tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 1680
cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 1740
acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 1800
atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 1860
tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 1920
aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 1980
cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 2040
atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 2100
cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca 2160
gagcagattg tactgagagt gcaccataaa attgtaaacg ttaatatttt gttaaaattc 2220
gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc 2280
ccttataaat caaaagaata gcccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag 2340
agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc 2400
gatggcccac tacgtgaacc atcacccaaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa 2460
gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg 2520
aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt 2580
gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc 2640
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tttaatacga ctcactatag ggagattggt ctgatgagtc cgtgaggacg aaacggagtc 2940
tagactccgt caccaaacag agaatccgtg agttacgata aaaggcgaag gagcaattga 3000
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cggattgctg ttagcgaaga tgccaacaaa ccactcaggc aaggtgctct catatctctt 3300
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atccaactca cgatcagaca gtctcttgca gtccgcatct ttttggttag cgagctcaag 3780
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tcatacatca ggaataccgg gcttactgca ttcttcttga cactcaagta cggaatcaac 3900
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ctcatgcgtt tgtatcggat gaaaggagat aatgcgccgt acatgacatt acttggtgat 4020
agtgaccaga tgagctttgc gcctgccgag tatgcacaac tttactcctt tgccatgggt 4080
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caacgggtct ccgaggagac cagcagcata gacatgccta ctcaacaagt cggagtcctc 4320
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caaccagaag ccggggatgg ggagacccaa ttcctggatc tgatgagagc ggtagcaaat 4440
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ctctgctctc tcctctacct gatagaccag gacaaacatg gccaccttta cagatgcaga 4860
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agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg 6720
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tcatcagtga atgcagtcaa gcacgtgaaa gcgccagaga agattcccgg gagtggaacc 7500
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actattaatg tggaggtaga cccgaggagt cctttggtta aatctctgtc taagtctgac 7680
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gggctcagtg atgtgctcgg gccttccgtg ttggtaaaag caagaggtgc acggactaag 7860
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cctcaggtgg ccaagatact ctggagtcaa accgcgtgcc tgcggagcgt taaaatcatt 7980
atccaagcag gtacccaacg cgctgtcgca gtgaccgccg accacgaggt tacctctact 8040
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atgaattacg tgagattcga cgtgatacag gcataaatat tcctatccaa attgacaaca 10380
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tttgatatga tccttcaggt actgtctttc ttcaagggaa caatcatcaa cgggtacaga 13260
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gggcaactac atgcagattc agcagagatt tcacacgata tcatgttgag agagtataag 13380
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cggaaccttc tctccgaaga ccagaagaaa catgtaaaag aagcaacttc gactaatcgc 13560
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gaagtgaaag ttaatggacg gatcttcgct aagctgacaa agaagttaag gaactgtcag 13740
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attcaggata gcatatcctt gaccaagagt atgctagcga tgagtcaact gtcttttaac 13860
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ttagtctctt ctaatatgtg ttctctgaca ctggcagact atgcacggaa tagaagctgg 15420
tcacctttga cgggaggcag gaaaatactg ggtgtatcta atcctgatac gatagaactc 15480
gtagagggtg agattcttag tgtaagcgga gggtgtacaa gatgtgacag cggagatgaa 15540
caatttactt ggttccatct tccaagcaat atagaattga ccgatgacac cagcaagaat 15600
cctccgatga gggtaccata tctcgggtca aagacacagg agaggagagc tgcctcactt 15660
gcaaaaatag ctcatatgtc gccacatgta aaggctgccc taagggcatc atccgtgttg 15720
atctgggctt atggggataa tgaagtaaat tggactgctg ctcttacgat tgcaaaatct 15780
cggtgtaatg taaacttaga gtatcttcgg ttactgtccc ctttacccac ggctgggaat 15840
cttcaacata gactagatga tggtataact cagatgacat tcacccctgc atctctctac 15900
agggtgtcac cttacattca catatccaat gattctcaaa ggctgttcac tgaagaagga 15960
gtcaaagagg ggaatgtggt ttaccaacag atcatgctct tgggtttatc tctaatcgaa 16020
tcgatctttc caatgacaac aaccaggaca tatgatgaga tcacactgca cctacatagt 16080
aaatttagtt gctgtatcag agaagcacct gttgcggttc ctttcgagct acttggggtg 16140
gtaccggaac tgaggacagt gacctcaaat aagtttatgt atgatcctag ccctgtatcg 16200
gagggagact ttgcgagact tgacttagct atcttcaaga gttatgagct taatctggag 16260
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cagtctgtgg tttcttatga tgaagatacc tccataaaga atgacgccat aatagtgtat 16380
gacaataccc gaaattggat cagtgaagct cagaattcag atgtggtccg cctatttgaa 16440
tatgcagcac ttgaagtgct cctcgactgt tcttaccaac tctattacct gagagtaaga 16500
ggcctggaca atattgtctt atatatgggt gatttataca agaatatgcc aggaattcta 16560
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ggcctggtca accatgacgg atcacaccaa cttgcagata cggattttat cgaaatgtct 16680
gcaaaactat tagtatcttg cacccgacgt gtgatctccg gcttatattc aggaaataag 16740
tatgatctgc tgttcccatc tgtcttagat gataacctga atgagaagat gcttcagctg 16800
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ataagaggct taactgcaga agagaaatgt tcaatactca ctgagtattt actgtcggat 16920
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gaggacaggg atactatcct ggcgttgttg ttcccccaag agccattatt agagttccct 17100
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ttgcaagagt tagatttgag tgctccagca aggtatgacg cattcacact tagtcagatt 17220
catcctgaac tcacatctcc aaatccggag gaagactact tagtacgata cttgttcaga 17280
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gtaagatgtg caagacacgg gaactcctta tacttagctg aagggagcgg agccatcatg 17400
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ccagggtcca atcaaagctt actagatcaa ctagctatca atttatctct gattgccatg 17760
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ttgcgtattg ggcgc 19395
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 46
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> GGGGS可重复n次，其中n为1、2、3、4、5或更多
<400> 47
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
Claims (55)
1.一种核酸序列，所述核酸序列包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV APMV HN蛋白编码序列之前和之后；以及(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV F蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于非NDV APMV F蛋白编码序列之前和之后，并且其中所述非NDV APMV HN蛋白和非NDV APMV F蛋白分别不是NDV HN蛋白和F蛋白。
2.根据权利要求1所述的核酸序列，其中所述非NDV APMV F蛋白和所述非NDV APMV HN蛋白在免疫学上分别不同于所述NDF F蛋白和所述NDV HN蛋白。
3.根据权利要求1所述的核酸序列，其中所述非NDV APMV HN是APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75、APMV17/Antarctica/107/13、APMV9/duck/New York/22/78、APMV7/Dove/Tennessee/4/75、APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17、APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77、APMV11/common_snipe/France/100212/10、APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12、
APMV8/Goose/Delaware/1053/76、APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56、APMV3/Turkey/Wisconsin/68、APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05、APMV5/budgerigar/Japan/TI/75或APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07的所述HN蛋白。
4.根据权利要求1或3所述的核酸序列，其中所述非NDV APMV F是APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75、APMV17/Antarctica/107/13、APMV9/duck/New York/22/78、APMV7/Dove/Tennessee/4/75、APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17、APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77、APMV11/common_snipe/France/100212/10、APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12、
APMV8/Goose/Delaware/1053/76、APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56、APMV3/Turkey/Wisconsin/68、APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05、APMV5/budgerigar/Japan/TI/75或APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07的所述F蛋白。
5.根据权利要求1所述的核酸序列，其中所述非NDV APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和正禽腮腺炎病毒属、偏禽腮腺炎病毒属或副禽腮腺炎病毒属的HN蛋白。
6.根据权利要求1或5所述的核酸序列，其中所述非NDV APMV F蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和正禽腮腺炎病毒属、偏禽腮腺炎病毒属或副禽腮腺炎病毒属的F蛋白。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸序列，其中所述NDV基因组包含NDV LaSota株系的NP基因、P基因、M基因和L基因。
8.一种核酸序列，所述核酸序列包含：(1)编码NDV核衣壳(N)蛋白的转录单元，(2)编码NDV磷蛋白(P)的转录单元，(3)编码NDV基质(M)蛋白的转录单元，(4)编码NDV大聚合酶(L)的转录单元，以及(5)SEQ ID NO:1-14中任一者的核苷酸序列或与SEQ ID NO:1-14中任一者的所述核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的核酸序列，其中所述NDV核衣壳蛋白、所述NDV磷蛋白、所述NDV基质蛋白和所述NDV大聚合酶属于所述NDV LaSota株系。
10.一种核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列或没有GFP编码序列的SEQ ID NO:44的核苷酸序列。
11.一种核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:44的核苷酸序列或没有GFP编码序列的SEQ ID NO:44的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列。
12.一种核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO:45的核苷酸序列或没有GFP编码序列的SEQ ID NO:45的核苷酸序列。
13.一种核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:45的核苷酸序列或没有GFP编码序列的SEQ ID NO:45的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的核酸序列，所述核酸序列还包含转基因。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的核酸序列，所述核酸序列还包含编码抗原的转基因。
16.根据权利要求14所述的核酸序列，其中所述抗原是病毒、细菌、真菌或原生动物抗原。
17.根据权利要求14所述的核酸序列，其中所述抗原包含SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段。
18.根据权利要求17所述的核酸序列，其中所述片段包含所述SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合结构域。
19.根据权利要求17所述的核酸序列，其中所述片段包含所述SARS-CoV-2刺突蛋白的胞外结构域。
20.根据权利要求15所述的核酸序列，其中所述抗原是MERS-CoV抗原、呼吸道合胞病毒抗原、人类偏肺病毒抗原、拉沙病毒抗原、埃博拉病毒抗原或尼帕病毒抗原。
21.根据权利要求15所述的核酸序列，其中所述抗原是癌或肿瘤抗原。
22.一种重组新城疫病毒(NDV)，所述重组NDV包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于所述非NDV AMPV HN蛋白编码序列之前和之后；以及(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV F蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于所述非NDV AMPV F蛋白编码序列之前和之后，并且其中所述非NDV APMV HN蛋白和所述非NDV APMV F蛋白分别不是NDV HN蛋白和F蛋白。
23.根据权利要求22所述的重组NDV，其中所述非NDV APMV F蛋白和所述非NDV APMVHN蛋白在免疫学上分别不同于所述NDF F蛋白和所述NDV HN蛋白。
24.根据权利要求22所述的重组NDV，其中所述非NDV APMV HN蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和正禽腮腺炎病毒属、偏禽腮腺炎病毒属或副禽腮腺炎病毒属的HN蛋白。
25.根据权利要求22或23所述的重组NDV，其中所述非NDV APMV F蛋白是来自禽腮腺炎病毒亚科和正禽腮腺炎病毒属、偏禽腮腺炎病毒属或副禽腮腺炎病毒属的F蛋白。
26.根据权利要求22所述的重组NDV，其中所述非NDV APMV HN是APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75、APMV17/Antarctica/107/13、APMV9/duck/New York/22/78、APMV7/Dove/Tennessee/4/75、APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17、APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77、APMV11/common_snipe/France/100212/10、APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12、
APMV8/Goose/Delaware/1053/76、APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56、APMV3/Turkey/Wisconsin/68、APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05、APMV5/budgerigar/Japan/TI/75或APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07的所述HN蛋白。
27.根据权利要求22或26所述的重组NDV，其中所述非NDV APMV F是APMV4/duck/Hongkong(China)/D3/75、APMV17/Antarctica/107/13、APMV9/duck/New York/22/78、APMV7/Dove/Tennessee/4/75、APMV21/pigeon/Taiwan(China)/AHRI128/17、APMV6/duck/HongKong(China)/18/199/77、APMV11/common_snipe/France/100212/10、APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12、
APMV8/Goose/Delaware/1053/76、APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56、APMV3/Turkey/Wisconsin/68、APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05、APMV5/budgerigar/Japan/TI/75或APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07的所述F蛋白。
28.一种重组新城疫病毒(NDV)，所述重组NDV包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列被替换为包含从SEQ ID NO:1-14中任一者所示的cDNA序列转录的负义RNA序列的核苷酸序列。
29.一种重组新城疫病毒(NDV)，所述重组NDV包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中编码NDV HN蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列被替换为包含从与SEQ ID NO:1-14中任一者的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列转录的负义RNA序列的核苷酸序列。
30.根据权利要求22至29中任一项所述的重组NDV，其中所述NDV基因组包含NDVLaSota的NP基因、P基因、M基因和L基因。
31.根据权利要求22至30中任一项所述的重组NDV，其中所述包装的基因组还包含转基因。
32.根据权利要求31所述的重组NDV，其中所述转基因包含编码病毒、细菌、真菌或原生动物抗原的核苷酸序列。
33.根据权利要求31所述的重组NDV，其中所述转基因包含编码SARS-CoV-2抗原的核苷酸序列。
34.根据权利要求33所述的重组NDV，其中所述SARS-CoV-2抗原包含所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段。
35.根据权利要求34所述的重组NDV，其中所述片段包含所述SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合结构域。
36.根据权利要求31所述的重组NDV，其中所述转基因包含编码MERS-CoV抗原的核苷酸序列。
37.根据权利要求31所述的重组NDV，其中所述转基因包含编码呼吸道合胞病毒抗原或人类偏肺病毒抗原的核苷酸序列。
38.根据权利要求31所述的重组NDV，其中所述转基因包含编码拉沙病毒抗原、埃博拉病毒抗原或尼帕病毒抗原的核苷酸序列。
39.根据权利要求31所述的重组NDV，其中所述转基因包含编码癌或肿瘤抗原的核苷酸序列。
40.一种包含第一重组NDV的免疫原性组合物，所述第一重组NDV是根据权利要求22至31中任一项所述的重组NDV。
41.一种包含第一重组NDV的免疫原性组合物，所述第一重组NDV是根据权利要求32至38中任一项所述的重组NDV。
42.一种包含第一重组NDV的免疫原性组合物，所述第一重组NDV是根据权利要求39所述的重组NDV。
43.一种用于诱导对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用根据权利要求40、41或42所述的免疫原性组合物。
44.一种用于预防传染病的方法，所述方法包括向受试者施用根据权利要求40或41所述的免疫原性组合物。
45.一种用于使受试者免疫以抵抗传染病的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求40或41所述的免疫原性组合物。
46.一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用根据权利要求40或42所述的免疫原性组合物。
47.根据权利要求43至46中任一项所述的方法，其中向所述受试者鼻内施用所述组合物。
48.根据权利要求43至47中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用包含包装的基因组的第二重组NDV，其中所述第二重组NDV的所述包装的基因组包含新城疫病毒基因组的核苷酸序列，其中(1)编码NDV HN蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV HN蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于所述非NDV AMPV HN蛋白编码序列之前和之后；以及(2)编码NDV F蛋白的核苷酸序列已被替换为编码非NDV APMV F蛋白的核苷酸序列，其中NDV基因间区位于所述非NDV AMPV F蛋白编码序列之前和之后，并且其中所述第二重组NDV在免疫学上不同于所述第一重组NDV。
49.根据权利要求43至48中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
50.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求22至39中任一项所述的重组NDV。
51.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至21中任一项所述的核酸序列。
52.一种体外或离体细胞，所述体外或离体细胞包含根据权利要求22至39中任一项所述的重组NDV。
53.一种细胞系或鸡孵化蛋，所述细胞系或鸡孵化蛋包含根据权利要求22至39中任一项所述的重组NDV。
54.一种用于繁殖根据权利要求22至39中任一项所述的重组NDV的方法，所述方法包括培养根据权利要求52或53所述的细胞或孵化蛋。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述方法还包括从所述细胞或孵化蛋中分离所述重组NDV。
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