KR20150143816A - 조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드 - Google Patents

조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조작된 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 폴리펩티드 및 이의 조성물을 비롯하여, 조작된 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

Description

조작된 페닐알라닌 암모니아 리아제 폴리펩티드{ENGINEERED PHENYLALANINE AMMONIA LYASE POLYPEPTIDES}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2013년 4월 18일 출원된 미국 가출원 제61/813,586호, 및 2013년 10월 31일 출원된 미국 가출원 제61/897,932호의 우선권을 청구하고, 이 둘을 모든 목적을 위해 그들 전체로 참조하여 편입시킨다.
ASCII 텍스트 파일로 제출된 "서열 목록", 표, 또는 컴퓨터 프로그램 목록 부록에 대한 참조
MS-윈도우 운영 체계의 IBM-PC 기계 형식에서 127,412 바이트로 2014년 4월 15일에 생성된, 파일명 CX7-131WO2_ST25.TXT로 작성된 서열 목록을 참조하여 본원에 편입시킨다.
발명의 분야
본 발명은 조작된 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 폴리펩티드 및 이의 조성물과, 조작된 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 향상된 촉매 활성을 비롯하여, 단백질분해(proteolysis)에 대한 감소된 감응성 및 산성 pH에 대한 증가된 내성도를 제공하도록 최적화되었다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 탈면역화된다. 본 발명은 또한 치료 및 산업 목적을 위한 조작된 PAL 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL)는 히스티딘 암모니아-리아제(HAL) 및 티로신 암모니아-리아제(TAL)와 함께 방향족 아미노산 리아제 패밀리(EC 4.3.1.23-1.25 및 4.3.1.3)의 구성원이다. 보다 상세하게, PAL 활성을 갖는 이 효소(EC 4.3.1.23-1.25이고, 이전에는 EC4.3.1.5로 분류)는 L-페닐알라닌의(E)-신남산으로의 비산화적 탈아미드화를 촉매한다. PAL은 식물에 광범위하게 분포하고 또한 진균과 한정된 수의 박테리아에서도 동정된 비포유동물 효소이다. PAL 효소는 대사 장애, 페닐케톤뇨증(PKU)의 치료를 위한 치료 단백질로서 사용될 수 있다. PKU는 간 효소 페닐알라닌 히드록실라아제(PAH) 또는 보조인자 테트라히드로비옵테린의 합성 또는 재순환에 관여하는 효소 중 1 이상이 해당 유전자 중 하나의 돌연변이에 기인해 비기능성인 상염색체 대사 유전자 장애이다. 이러한 기능의 결여는 혈류에 페닐알라닌의 고농도를 초래한다. 페닐알라닌은 페닐피루베이트(페닐케톤) 및 다른 유도체로 전환된다. 인간에서, PKU를 초기에 치료하지 않으면, 고농도의 페닐알라닌 및 일부 이의 분해 산물이 지적 장애, 소두증 및 발작을 포함한 유의한 의학적 문제를 야기할 수 있다. 수많은 연구들은 효소 치환에 의한 PKU의 치료에서 PAL의 용도에 초점을 맞추어왔다(Ambrus et al., Science 201:837-839 [1978]; Bourget et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 10:57-59 [1984]; 및 Sarkissian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2339-2344 [1999]).
혈류에서 페닐알라닌을 해독하는 한 방법은 PEG화로 개질시킨 주사가능한 재조합 PAL 및 PAL 변이체(PEG-PA)의 사용이다. PEG화는 효소 반감기를 개선시키고 피험체의 항원 반응을 감소시키는 것으로 확인되었다(예를 들면, WO 2008/153776, WO2011/097335, 및 미국 특허 제7,531,341호 참조). PEG-PAL 조성물에서 유용한 PAL 변이체는 야생형 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme)(NpPAL); 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis)(AvPAL) 및 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides)(RtPAL)의 변이체로서 기술되어 있다. 구체적으로, 야생형 AvPAL의 변이체는 위치 64, 318, 503 및 565의 시스테인 잔기가 세린으로 치환된 것으로 기술되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제7,790,433호; 제7,560,263호; 및 제7,537,923호 참조).
PKU 피험체에서 L-페닐알라닌의 혈장 농도를 감소시키는 수단으로서 PAL 투여의 대안적인 경로는 비침윤성 제제 예컨대 경구 제제이다(Sarkissian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2339-2344 [1999]). PAL의 경구 전달의 주요 장점은 면역계에 효소의 노출이 감소되어 주사가능한 PEG-PAL로 관찰되는 면역 반응을 최소화한다는 것이다. 그러나, PAL의 경구 제제에 대한 주요한 한계는 위 및 장내강에서의 효소 활성 손실이다. 효과적이고 기능적이기 위해서 PAL은 정상적으로 단백질성 식이를 올리고펩티드 및 아미노산으로 분해하는 프로테아제 예컨대 트립신, 키모트립신, 카르복시펩티다아제 및 펩신 그리고 산성 pH에 의한 분해에 내성이어야만 한다. PAL의 경구 투여에 대해 유의한 효과를 달성하기 위한 이전의 일부 연구(Sarkissian, 상동)에서는, 프로테아제에 의한 효소적 분해에 부분적으로 기인하고, pH 7.0에서 비교적 낮은 비활성에 부분적으로 기인하여 대량의 효소가 요구되었다. 소화시 PAL 분해를 억제하기 위한 다양한 수단이 조사되었다(Kim et al., Molec. Therap., 10:220 - 224 [2004]; 및 Shah et al., Int. J. Pharmaceut., 356:61-68 [2008]).
소화관(digestive tract)의 혹독한 조건 하에서 PAL의 효율을 증가시키기 위한 한 접근법은 고유한 혹독 조건에 내성인 조작된 PAL 폴리펩티드를 제공하는 것이다. Kang과 그 동료들은 단백질분해성 불활성화를 감소시키기 위해 키모트립신 절단 부위의 부위 지정 돌연변이유발 및 AvPAL의 표면 리신의 PEG화를 사용하였다(예를 들면, [Kang et al., Mol. Gen. Metabol., 99:4-9 [2010]]를 참조함). 이들 연구에서, 10개 절단 부위가 특이적으로 돌연변이되었고 이들 최종 돌연변이체 중 2개(F18A 및 R94G)를 제외하고 모두 원래 효소 활성의 50%가 넘게 손실되었다. 돌연변이체 중 어떠한 것도 높은 활성을 보이지 않았고 F18A 돌연변이체는 트립신 내성이 약간 증가된 것으로 나타났다(Kang et al., 상동). PAL를 사용한 추가 실험은 효과적이지만, 일반적으로 수명이 긴 효소를 얻지 못하였다. 따라서, 이전에 기술된 PAL 돌연변이체 및 이의 유도체의 경구 투여는 PKU의 효과적인 치료 결과를 얻지 못하였다.
다양한 PAL 제제의 진보에도 불구하고, 경구 투여를 위해 특성이 개선된 PAL 폴리펩티드에 대한 요구가 여전히 남아있다. 이러한 개선된 특성들에는 제한없이, 높은 반감기, 높은 촉매 활성, 소화관 환경에 대한 개선된 안정성 및 감소된 응집성(aggregation)이 포함된다.
치료적 용도이외에도, PAL 효소는 또한 L-페닐알라닌 및 다른 치환된 L-페닐알라닌 유도체의 산업적 합성에서도 사용될 수 있다. 이들 유도체는 약학 전구체로서 사용될 수 있다(Gloge et al., Chem., 6: 3386-3390 [2000]; Bartsch et al., Prot. Eng. Des. Sel., 23:929-933 [2010]; 및 Turner, Curr. Opin. Chem. Biol., 234-240 [2011]).
PAL 효소는 또한 농업 응용분야에서도 사용될 수 있다. PAL은 식물, 진균 및 박테리아에서 페닐프로파노이드(예컨대 플라보노이드 및 리그닌)의 생합성에서 중요한 역할을 하고 방어 관련 효소로서 작용할 수 있다(Bate et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7608-7612 [1994]). PAL 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드를 사용한 PAL 활성의 조정은 잠재적으로 효과적인 제초제로 이어질 수 있다.
본 발명은 조작된 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 폴리펩티드 및 이의 조성물을 비롯하여, 조작된 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 향상된 촉매 활성과, 단백질분해에 대한 감소된 감응성 및 산성 pH에 대한 증가된 내성도를 제공하도록 최적화된다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 탈면역화된다. 본 발명은 또한 치료 및 산업 목적을 위한 조작된 PAL 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개선된 특성 예컨대 산성 pH에 대한 증가된 내성 및/또는 단백질분해에 대한 감소된 감응성을 갖는 조작된 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 폴리펩티드 및 이의 생물학적 활성 단편 및 유사체에 관한 것이다.
본 발명은 본질적으로 동일한 조건 하에서 야생형 PAL 효소 또는 기준 PAL 폴리펩티드와 비교시 개선된 특성을 갖는 조작된 PAL 폴리펩티드 및 이의 생물학적 활성 단편 및 유사체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료적 및/또는 산업적 조성물에서 조작된 PAL 폴리펩티드 및 이의 생물학적 활성 단편 및 유사체를 사용하는 방법 및 치료적 및/또는 산업적 목적을 위해 이러한 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
제1 측면에서, 본 발명은 조작된 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 폴리펩티드에 관한 것이고, 여기서 조작된 PAL 폴리펩티드는 본질적으로 동일한 조건 하에서 측정시 기준 서열과 비교하여 i) 향상된 촉매 활성, ii) 단백질분해에 대한 감소된 감응성, iii) 산성 pH에 대한 증가된 내성, iv) 감소된 응집성, 또는 i), ii), iii) 또는 iv) 중 임의의 조합의 군에서 선택된 개선된 특성을 갖는다. 일부 특정 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 2종의 개선된 특성을 갖는다. 다른 특정 실시양태에서, 개선된 특성은 단백질분해에 대한 감소된 감응성이고 또 다른 특정 실시양태에서, 개선된 특성은 산성 pH에 대한 증가된 내성이다.
제2 측면에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 동일성을 포함하는 단백질 또는 이의 기능적 단편, 및 서열번호 4의 폴리펩티드와 최적으로 정렬시 위치 X39; X91; X158; X180; X195; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X307; X308; X326; X349; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X522; X524; 및 X528에 상응하는 위치에서 아미노산 잔기 차이를 포함한다.
제1 및 제2 측면의 일부 특정 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4의 폴리펩티드와 최적으로 정렬시, A39; A91; Y158; S180; K195; T243; I245; A256; L257; N270; N290; H307; E308; I326; L349; L364; A394; S399; N400; P404; L407; F443; N453; Y459; T460; T463; N474; K522; T524; 및 P528에 상응하는 1 이상의 아미노산 잔기 위치의 적어도 한 아미노산 잔기 차이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 기준 폴리펩티드와 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 및 적어도 20 아미노산의 잔기 차이를 포함한다.
제1 및 제2 측면의 다른 특정 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4에 대해 적어도 90%(적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%)의 아미노산 서열 동일성을 포함한다. 또 다른 추가의 특정 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4에 대해 적어도 90%(적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%)의 아미노산 서열 동일성을 포함하고, 다음의 치환 A39V; A91V; Y158H; S180A; K195E; T243I/L; I245L; A256G; L257W/A; N270K; N290G; H307G/Q/M; E308Q; I326F; L349M; L364Q; A394V; S399N; N400K; P404A; L407V; F443H; N453G; Y459F; T460G; T463N; N474Q; K522Y/F/N; T524S; 및 P528L 중 1 이상을 포함한다.
다른 특정 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 야생형 아나바에나 바리아빌리스 PAL(예컨대 ATCC29413; NCBI 단백질 기준 서열 YP_324488.1; 서열번호 4)에서 유래된다.
제3 측면에서, 본 발명에 포함되는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 서열번호 10에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
제4 측면에서, 본 발명에 포함되는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 서열번호 10에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함하며, 서열번호 10과 비교시, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 이상의 아미노산 위치에 아미노산 잔기 차이를 더 포함한다.
제5 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 조작된 PAL 폴리펩티드 중 어느 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
제6 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 조작된 PAL 폴리펩티드 중 어느 하나를 포함하는 약학 조성물 또는 산업적 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 서열번호 4의 기준 서열에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편; b) 서열번호 4 또는 이의 기능적 단편과 비교시 1 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 잔기 차이 을 포함하고; c) 기준 서열과 비교시 i) 향상된 촉매 활성, ii) 단백질분해에 대한 감소된 감응성, iii) 산성 pH에 대한 증가된 내성, iv) 감소된 응집성 또는 i), ii), iii) 또는 iv) 중 임의의 조합에서 선택된 개선된 특성을 나타내는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 1 이상의 아미노산 위치는 서열번호 4의 아미노산 서열과 최적으로 정렬시 X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; X564; 및/또는 이의 조합에서 선택된다. 일부 추가의 실시양태에서, 개선된 특성은 단백질분해에 대한 감소된 감응성 및/또는 산성 pH에 대한 증가된 내성에서 선택된다. 다른 추가의 실시양태에서, 기준 서열은 아나바에나 바리아빌리스에서 유래된 야생형 PAL이다. 일부 추가 실시양태에서, 서열번호 4의 기준 서열의 아미노산 잔기는 A39; T54; G59, S73; A91; Y158; S180; K195; A112; R134; Q240; T243; I245; A256; L257; N270; N290; Y304; R305; H307; E308; I326; L349; D353; L364; A394; S399; N400; P404; L407; F443; N453; Y459; T460; T463; N474; E509; Q521; K522; T524; P528; S546; 및/또는 P564에 상응한다. 일부 실시양태에서, 서열번호 4와 비교시 아미노산 잔기 차이는 서열번호 4의 폴리펩티드와 최적으로 정렬시, 다음의 치환 A39V; T54K; G59R; S73K; A112C; R134Q; A91V; Y158H; S180A; K195E; Q240R/W; T243I/L; I245L; A256G; L257W/A; N270K; N290G; Y304H; R305M; H307G/Q/M; E308Q; I326F; L349M; D353A/N; L364Q; A394V; S399N; N400K; P404A; L407V; F443H; N453G; Y459F; T460G; T463N; N474Q; E509L; Q521K/S; K522Y/F/N; T524S;P528L; S546R; 및 P564 G/L/M 중 1 이상에서 선택된다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 폴리펩티드는 서열번호 4의 기준 서열에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 폴리펩티드는 서열번호 4의 기준 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 추가의 실시양태에서, 조작된 폴리펩티드는 서열번호 4의 기준 서열에 대해 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 추가의 실시양태에서, 조작된 폴리펩티드는 서열번호 4의 기준 서열에 대해 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 폴리펩티드는 서열번호 4에 대해 적어도 약 90%의 서열 동일성, 및 위치 H307에서 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 폴리펩티드는 서열번호 4의 기준 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 추가의 실시양태에서, 조작된 폴리펩티드는 서열번호 4의 기준 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 폴리펩티드는 서열번호 4에 대해 적어도 90%의 서열 동일성; 및 위치 H307에 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 추가의 실시양태에서, 아미노산 잔기 차이는 H307G/Q/M이다. 일부 추가 실시양태에서, 아미노산 잔기 차이는 A39; A91; Q240; A256; N290; Y304; R305; H307; D353 A394; S399; P404; L407; Q521; K522; 및 T524 중 1 이상의 조합에서 선택된다.
본 발명은 서열번호 6, 8, 10, 12, 및/또는 14에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 서열번호 6, 8, 10, 12, 및/또는 14에 대해 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
일부 추가 실시양태에서, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 서열번호 6, 8, 10, 12, 및/또는 14에 대해 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
본 발명은 또한 서열번호 6, 8, 10, 12, 및/또는 14에 대해 적어도 약 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 서열번호 6, 8, 10, 12, 및/또는 14에 대해 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 서열번호 6, 8, 10, 12, 및/또는 14에 대해 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 서열번호 6, 8, 10, 12, 및/또는 14에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 서열번호 6, 8, 10, 12, 및/또는 14에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
본 발명은 또한 서열번호 4에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 조작된 폴리펩티드는 탈면역화된다. 본 발명은 또한 서열번호 4에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 조작된 폴리펩티드는 탈면역화된다. 일부 실시양태에서, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 서열번호 4에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하고, 여기서 조작된 폴리펩티드는 탈면역화된다. 일부 추가의 실시양태에서, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 임의의 표 9-1 내지 9-7에 제공된 변이체 PAL이다. 일부 실시양태에서, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 탈면역화된 조작된 폴리펩티드는 서열번호 6, 8, 10, 12, 및/또는 14에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에서 제공하는 PAL 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 본 발명은 또한 PAL 활성을 갖는 적어도 조작된 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 제공된 바와 같은 PAL 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 적합한 배양 조건 하에서 적어도 하나의 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 조작된 PAL 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 적합한 배양 조건 하에서 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 조작된 PAL 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 배양물 및/또는 숙주 세포로부터 조작된 PAL 폴리펩티드를 회수하는 단계를 더 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 제공된 바와 같은, PAL 활성을 갖는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 더 포함하는 약학 조성물이다. 본 발명은 또한 이들 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 a) 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 기준 서열에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편; b) 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 기준 서열, 또는 이의 기능적 단편과 비교하여 1 이상의 아미노산 위치에서 적어도 하나의 아미노산 잔기 차이를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하고; c) 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 기준 서열과 비교시, i) 향상된 촉매 활성, ii) 단백질분해에 대한 감소된 감응성, iii) 산성 pH에 대한 증가된 내성, iv) 감소된 응집성, v) 감소된 면역원성, 또는 i), ii), iii), iv), 또는 v) 중 임의의 조합에서 선택된 개선된 특성을 나타내는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 기준 서열은 원핵생물 PAL이지만, 일부 다른 실시양태에서, 기준 서열은 진핵생물 PAL이다. 일부 실시양태에서, 기준 서열은 박테리아 PAL(예를 들면, 아나바에나 바리아빌리스 PAL), 일부 다른 실시양태에서는, 인간 또는 다른 PAL이다. 일부 추가 실시양태에서, 기준 서열은 야생형 서열(예를 들면, 야생형 에이. 바리아빌리스 PAL)이지만, 일부 대안적인 실시양태에서, 기준 서열은 변이체 효소(e.g., PAL 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드)이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 a) 서열번호 4의 기준 서열에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편; b) 서열번호 4, 또는 이의 기능적 단편과 비교시, 1 이상의 아미노산 위치에서 적어도 하나의 아미노산 잔기 차이를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하고; c) 서열번호 4의 기준 서열과 비교시, i) 향상된 촉매 활성, ii) 단백질분해에 대한 감소된 감응성, iii) 산성 pH에 대한 증가된 내성, iv) 감소된 응집성, v) 감소된 면역원성, 또는 i), ii), iii), iv), 또는 v) 중 임의의 조합에서 선택된 개선된 특성을 나타낸다.
일부 추가의 실시양태에서, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 a) 서열번호 4의 기준 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상의 서열 동열성을 갖는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편; b) 서열번호 4 또는 이의 기능적 단편과 비교시 1 이상의 아미노산 위치에 적어도 하나의 아미노산 잔기 차이를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하고; c) 서열번호 4의 기준 서열과 비교시, i) 향상된 촉매 활성, ii) 단백질분해에 대한 감소된 감응성, iii) 산성 pH에 대한 증가된 내성, iv) 감소된 응집성, v) 감소된 면역원성, 또는 i), ii), iii), iv), 또는 v) 중 임의의 조합에서 선택된 개선된 특성을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성(PAL)을 갖는 조작된 폴리펩티드는 다음의 아미노산 위치: 20, 24, 27, 39, 43, 45, 47, 54, 58, 59, 62, 70, 73, 80, 82, 91, 94, 98, 104, 105, 110, 112, 115, 117, 118, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 156, 157, 158, 159, 172, 174, 175, 176, 177, 178, 180, 187, 191, 195, 199, 205, 206, 210, 212, 213, 214, 232, 240, 243, 245, 247, 248, 250, 256, 257, 266, 270, 275, 278, 279, 285, 286, 289, 290, 292, 304, 305, 307, 308, 309, 319, 321, 326, 331, 332, 334, 349, 353, 355, 364, 365, 369, 370, 371, 372, 374, 375, 377, 378, 379, 381, 382, 383, 384, 385, 387, 389, 394, 396, 399, 400, 403, 404, 407, 417, 418, 425, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 443, 446, 447, 453, 456, 459, 460, 461, 463, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 482, 483, 503, 507, 509, 521, 522, 524, 525, 528, 538, 546, 547, 551, 558, 560, 564, 565, 및/또는 이의 임의의 조합 중 1 이상에서 적어도 하나의 치환(들)을 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 4를 기준으로 번호매김된다. 일부 실시양태에서, 서열번호 4의 기준 서열의 아미노산 잔기는 A39, T54, G59, S73, A91, Y158, S180, K195, A112, R134, Q240, T243, I245, A256, L257, N270, N290, Y304, R305, H307, E308, I326, L349, D353, L364, A394, S399, N400, P404, L407, F443, N453, Y459, T460, T463, N474, E509, Q521, K522, T524, P528, S546, 및/또는 P564에 상응한다. 일부 추가의 실시양태에서, 서열번호 4와 비교시 아미노산 잔기 차이는 서열번호 4의 폴리펩티드와 최적으로 정렬시, 다음의 치환 A39V, T54K, G59R, S73K, A112C, R134Q, A91V, Y158H, S180A, K195E, Q240R/W, T243I/L, I245L, A256G, L257W/A, N270K, N290G, Y304H, R305M, H307G/Q/M, E308Q, I326F, L349M, D353A/N, L364Q, A394V, S399N, N400K, P404A, L407V, F443H, N453G, Y459F, T460G, T463N, N474Q, E509L, Q521K/S, K522Y/F/N, T524S,P528L, S546R, 및 P564 G/L/M 중 1 이상에서 선택된다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 폴리펩티드는 서열번호 4에 대해 적어도 약 90%의 서열 동일성, 및 위치 H307에서 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 아미노산 잔기 차이는 H307G/Q/M이다. 일부 여전히 추가의 실시양태에서, 아미노산 잔기 차이는 A39, A91, Q240, A256, N290, Y304, R305, H307, D353, A394, S399, P404, L407, Q521, K522, 및 T524 중 1 이상의 조합에서 선택된다. 일부 추가의 실시양태에서, 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성(PAL)을 갖는 조작된 폴리펩티드의 개선된 특성은 단백질분해에 대한 감소된 감응성 및/또는 산성 pH에 대한 증가된 내성에서 선택된다.
본 발명은 또한 a) 서열번호 10의 기준 서열에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편; b) 서열번호 10 또는 이의 기능적 단편과 비교시 1 이상의 아미노산 위치에서 적어도 하나의 아미노산 잔기 차이를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하고; c) 서열번호 10의 기준 서열과 비교시, i) 향상된 촉매 활성, ii) 단백질분해에 대한 감소된 감응성, iii) 산성 pH에 대한 증가된 내성, iv) 감소된 응집성, v) 감소된 면역원성, 또는 i), ii), iii), iv), 또는 v) 중 임의의 조합에서 선택된 개선된 특성을 나타내는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 서열번호 10의 기준 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편; b) 서열번호 10 또는 이의 기능적 단편과 비교시 1 이상의 아미노산 위치에서 적어도 하나의 아미노산 잔기 차이를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하고; c) 기준 서열 10과 비교시, i) 향상된 촉매 활성, ii) 단백질분해에 대한 감소된 감응성, iii) 산성 pH에 대한 증가된 내성, iv) 감소된 응집성, v) 감소된 면역원성, 또는 i), ii), iii), iv), 또는 v) 중 임의의 조합에서 선택된 개선된 특성을 나타내는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 a) 서열번호 10의 기준 서열에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편; b) 서열번호 10 또는 이의 기능적 단편과 비교시 1 이상의 아미노산 위치에서 적어도 하나의 아미노산 잔기 차이를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하고; c) 서열번호 10의 기준 서열과 비교시, i) 향상된 촉매 활성, ii) 단백질분해에 대한 감소된 감응성, iii) 산성 pH에 대한 증가된 내성, iv) 감소된 응집성, v) 감소된 면역원성, 또는 i), ii), iii), iv), 또는 v) 중 임의의 조합에서 선택된 개선된 특성을 나타내는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 10의 기준 서열에 대해 적어도 85%의 서열 동일성 및 서열번호 10과 비교시 적어도 하나의 아미노산 잔기 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 10과 비교시, 향상된 촉매 활성, 단백질분해에 대한 감소된 감응성, 산성 pH에 대한 증가된 내성, 감소된 응집성, 및/또는 감소된 면역원성에서 선택된 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 서열번호 10과 비교시 아미노산 잔기 차이는 다음의 치환들 또는 치환 세트 중 1 이상에서 선택된다: I27E/V39A; I27E/V39A/R43L/V105C/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q;
I27E/V39A/R43L/L214E/A547D;
I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/A551D;
I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P210C/P266H/C503Q/A547D;
I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P266H/I285E/C503Q/A551D;
I27E/V39A/V105C/A112C/L214E/I285E/C503Q/A547D;
I27E/V39A/V105C/S131N/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/V105C/R134Q/A153R/P210C/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/P210C/L278D/C503Q/A547D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E;
I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E/A551D/C565N;
I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E;
I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/I285E/A547D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/L278D/A547D/A551D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q;
I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q/A547D/A551D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/C503Q/C565N;
I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/I285E/C503Q;I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/A551D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/I285E/A547D/A551D;I27E/V39A/V105C/R134Q/C503Q/A551D;
I27E/V39A/V105C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D/A551D;
I27E/V39A/V105C/A153R/L214E; I27E/V39A/V105C/A153R/I285E;
I27E/V39A/V105C/A153R/C503Q/A547D/C565N;I27E/V39A/V105C/A153R/A551D/C565N;
I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L214E/L278D/A547D;
I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/C503Q;
I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/A547D;
I27E/V39A/V105C/Q205T/L214E/L278D/C503Q/A547D;
I27E/V39A/V105C/Q205T/L278D/C503Q/A547D;
I27E/V39A/V105C/P210C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V39A/V105C/P210C/L214E/P266H/L278D;
I27E/V39A/V105C/L214E/P266H/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/V105C/L214E/L278D/L309P/C503Q/A547D/A551D;
I27E/V39A/V105C/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/I285E/A547D;
I27E/V39A/V105C/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V39A/A112C/R134Q/Q205T/P210C/L214E/A551D/C565N;
I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/P266H/A551D;
I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D;I27E/V39A/A112C/R134Q/P266H/I285E;
I27E/V39A/A112C/Q205T/L214E/P266H/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V39A/A112C/Q205T/L278D/I285E; I27E/V39A/A112C/L214E;
I27E/V39A/A112C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/A112C/I285E;
I27E/V39A/A112C/A547D; I27E/V39A/R134Q;
I27E/V39A/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/C503Q;
I27E/V39A/R134Q/A153R/P210C/L214E/L278D/I285E/A547D/C565N;
I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/R134Q/A153G/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D;
I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D/A547D/A551D; I27E/V39A/R134Q/A153R/A547D;
I27E/V39A/R134Q/Q205T/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V39A/R134Q/Q205T/P266H/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V39A/R134Q/P210C/L214E/C503Q; I27E/V39A/R134Q/P210C/C503Q/A551D;
I27E/V39A/R134Q/L214E/P266H/A551D;
I27E/V39A/R134Q/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D;
I27E/V39A/R134Q/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/C503Q/A547D;
I27E/V39A/R134Q/A547D/C565N; I27E/V39A/Q205T/L214E/C503Q/C565N;
I27E/V39A/Q205T/P266H/I285E/A547D/A551D/C565N;I27E/V39A/Q205T/P266H/A551D;
I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/A551D/C565N;I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/C565N;
I27E/V39A/Q205T/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/P210C/T212S;
I27E/V39A/P210C/L214E/L278D/C503Q/A551D;I27E/V39A/P210C/L214E/I285E/C503Q/A551D;
I27E/V39A/P210C/P266H/I285E/C503Q/A547D;I27E/V39A/P210C/P266H/C503Q/A551D;
I27E/V39A/L214E; I27E/V39A/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q; I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/L214E/C503Q/A551D; I27E/V39A/P266H; I27E/V39A/P266H/L278D;
I27E/V39A/L278D;I27E/V39A/L278D/A547D;I27E/V39A/L278D/I285E/C503Q/A547D;
I27E/V39A/L278D/C503Q/C565N;I27E/V39A/C503Q;I27E/G45D/Q205T/P266H/C565N;
I27E/V105C; I27E/V105C/R134Q/A153R/P210C/L214E/C503Q/A547D;
I27E/V105C/R134Q/A153R/I285E/A547D; I27E/V105C/R134Q/A153R/C503Q;
I27E/V105C/R134Q/Q205T/P210C/C503Q;
I27E/V105C/R134Q/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/C565N;
I27E/V105C/Q205T/P266H/C503Q;
I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/P266H/L278D/A551D/C565N;
I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V105C/R134Q/P210C/P266H/L278D/I285E/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D;
I27E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/Q205T;
I27E/V105C/Q205T/L214E/P266H; I27E/V105C/Q205T/L214E/P266H/A551D/C565N;
I27E/V105C/Q205T/L214E/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V105C/Q205T/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E;
I27E/V105C/L214E/P266H/C503Q; I27E/V105C/L214E/I285E/A551D/C565N;
I27E/V105C/L214E/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E/A551D/C565N;
I27E/V105C/P266H; I27E/V105C/P266H/I285E/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V105C/L278D/A547D; I27E/V105C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V105C/C503Q/A547D/C565N; I27E/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/A112C/R134Q/A153R/L214E/P266H/C503Q;
I27E/A112C/R134Q/L278D/I285E/C503Q/A551D/C565N;
I27E/A112C/R134Q/Q205T/L278D/C503Q; I27E/A112C/R134Q/Q205T/I285E/C503Q;
I27E/A112C/Q205T/P266H/L278D/I285E/C503Q;I27E/A112C/P210C/L214E/C503Q/A547D;
I27E/R134Q; I27E/R134Q/A153R/I285E/C503Q/A547D;
I27E/R134Q/Q205T/I285E/C503Q/A551D; I27E/R134Q/Q205T/P266H/L278D/A547D;
I27E/R134Q/P210C; I27E/R134Q/L214E/C503Q; I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D;
I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; I27E/R134Q/L214E/C503Q/C565N;
I27E/R134Q/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/R134Q/I285E/C503Q;
I27E/A153R/L214E/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/A153R/L214E/L278D/A551D;
I27E/Q205T; I27E/Q205T/L214E/L278D/I285E/C503Q/C565N;
I27E/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N;I27E/Q205T/P266H/L278D/I285E/A551D/C565N;
I27E/Q205T/L278D/A551D; I27E/P210C; I27E/P210C/L214E/C503Q/A547D;
I27E/P210C/L278D/C503Q;I27E/P210C/C503Q;I27E/P210C/C503Q/C565N;I27E/P210C/A551D;
I27E/L214E; I27E/L214E/P266H/L278D/I285E/A551D; I27E/L214E/L278D;
I27E/L214E/L278D/C503Q; I27E/L214E/C503Q; I27E/L214E/C503Q/A547D;
I27E/L214E/C503Q/A547D/C565N; I27E/L214E/A551D; I27E/P266H/L278D/C503Q;
I27E/P266H/A547D/A551D;I27E/L278D/C503Q/A551D;I27E/L278D/C503Q/A551D/C565N;
I27E/A547D/C565N; V39A/G45S/L278D/C503Q/A551D;
V39A/V105C/R134Q/A153R/Q205T/A551D; V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/A551D;
V39A/V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D;V39A/V105C/A153R/P266H/A547D/A551D;
V39A/V105C/Q205T/C503Q; V39A/V105C/Q205T/A551D; V39A/V105C/P210C/A547D;
V39A/V105C/L214E/P266H/A547D/C565N;V39A/V105C/L214E/I285E/C503Q/A551D/C565N;
V39A/A112C/R134Q/Q205T/L214E/L278D;V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D;
V39A/A112C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D; V39A/R134Q;
V39A/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/C565N; V39A/R134Q/P210C/L214E/A547D/C565N;
V39A/A153R/C503Q/A547D; V39A/Q205T/L278D/A547D/A551D;
V39A/P210C/L214E/L278D/I285E/C503Q/A551D; V39A/P266H;
V39A/P275R/L278D/C503Q/A551D;V39A/C503Q; V39A/C503Q/A551D/C565N; V105C;
V105C/A112C/R134Q/Q205T/L214E/Y492H/C503Q/A547D;
V105C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/C503Q;V105C/R134Q/Q205T/L214E/A547D;
V105C/R134Q/Q205T/P266H/L278D;V105C/R134Q/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N;
V105C/R134Q/L214E/L278D/C565N; V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D;
V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; V105C/R134Q/C503Q;
V105C/R134Q/C503Q/A547D; V105C/R134Q/C503Q/A547D/C565N;
V105C/A153R/Q205T/L214E/P266H/C503Q/A547D;
V105C/A153R/Q205T/P266H/I285E/A547D/C565N;V105C/Q205T/P210C/L214E/C503Q/A547D;
V105C/Q205T/L214E/L278D; V105C/Q205T/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
V105C/Q205T/C503Q/A551D;V105C/L214E/P266H/L278D/A547D;
V105C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D; V105C/L214E/I285E;
V105C/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;V105C/L214E/I285E/A547D/C565N;
V105C/L278D/C503Q/A551D; V105C/I285E; V105C/I285E/A547D; V105C/C503Q;
V105C/A547D/A551D;A112C/R134Q/A153R/L214E/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N; A112C/L214E/L278D;
A112C/L278D/C503Q/A547D; R134Q/Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D/C565N;
R134Q/Q205T/C503Q; R134Q/P210C/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;
R134Q/P210C/L214E/C503Q/A547D/A551D;R134Q/L214E;R134Q/L214E/L278D/C503Q;
R134Q/L214E/L278D/C503Q/A551D; R134Q/L214E/I285E/C503Q; R134Q/C503Q;
R134Q/C503Q/A547D/A551D; A153R; Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D;
Q205T/L214E/I285E/C503Q/C565N; Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N;
Q205T/L278D/I285E/A547D/A551D;P210C/L214E;P210C/L214E/P266H;L214E/P266H;
L214E/P266H/C503Q/A547D/A551D/C565N; L214E/C503Q/A547D; L214E/A547D;
P266H/L278D/C503Q; P266H/C565N; L278D/A547D; C503Q; C503Q/A547D;
C503Q/A547D/A551D/C565N;C503Q/A547D/C565N;C503Q/A551D;C503Q/A551D/C565N;
A547D; 및/또는 C565N.
일부 추가의 실시양태에서, 본 발명은 또한 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 서열번호 10과 비교시 아미노산 잔기 차이는 다음의 치환들 또는 치환 세트 중 1 이상에서 선택된다: V80I/R134C/P564Q; V121C; A123G; A124G; M125L; L126I/T; L126M/R134L; L127A; A129G/L; N130Q; N130C/M370I R134W; M133R; R134I; R134N/G307C; G135C/S; 및/또는 G135A/A394E.
일부 추가의 실시양태에서, 본 발명은 또한 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 서열번호 10과 비교시 아미노산 잔기 차이는 다음의 치환들 또는 치환 세트 중 1 이상에서 선택된다: G20S/I144L; R43S; L47M/I144L; L47M/R146E; L47M/M147G/A383E; L47M/P157C; Q58H/L143V; Q58K/P157D/G369C; A62S/M147V; S82I/G135C/P157F/W279L; R94C/I149E; T110I/I139R; L118M/L141H; A119E/T156H/A289D; I139M/V; R140D/G/M; R140N/A199E; R140E/A334S/A551D; L141K/Q/P/T; E142H/P/V; E142D/G371D; L143F/M; I144L/N/V; K145N/Q/R; K145G/P157T; R146H/L; R146W/D191Y; M147A; I149L/R; F150K/L/M; L151M; A153C/G; A153S/H250N; G154R; G154Y/L174M/Q321K/S456I/G483C; T156K/G483C; P157D/F/H/Y; Y158E; V159C/H/L/M; M247I; L319M; 및/또는 Q389K.
여전히 일부 추가 실시양태에서, 본 발명은 또한 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 서열번호 10과 비교시 아미노산 잔기 차이는 다음의 치환들 또는 치환 세트 중 1 이상에서 선택된다: P117T/Y176Q; V172I/C/L; L174M; S175G; Y176E/I/M/R/V; I177M/V; T178L/A477S; 및/또는 S180C/T.
일부 추가의 실시양태에서, 본 발명은 또한 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 서열번호 10과 비교시 아미노산 잔기 차이는 다음의 치환들 또는 치환 세트 중 1 이상에서 선택된다: R43S/H374K; R43S/H374R; A112S/M370A/A507E; M147I/H374S; S187R/L381V; D191Y/H385N; A232S; Q240K/H374R; A256S/L381N; P275Q/M370S; P275T/H374R; Q332K/Y377M; A334S/H374V; L349M; Q355K/H374S; M370G/I/S; G371H/N/Q/S; M372A/V; H374A/D/G/L/N/R/S/T; H374Q/P396Q; H374R/G417C; L375I; L375M; Y377C/I/N; Y378C/D/E/I/L/N/S; Y378F/P404Q; I379C/H/L/M/N; L381G/V; L381M/Q560K; L382C/H/I/M/S; A383S/V; K384R; H385C/G/N; H385M/P403H; H385S/P403H; D387S; L418M; G425V; A447S; S461G; 및/또는 S525L.
일부 추가의 실시양태에서, 본 발명은 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 서열번호 10과 비교시 아미노산 잔기 차이는 다음의 치환들 또는 치환 세트 중 1 이상에서 선택된다: A24S/F434M; A62S/T433N; S98I; L213M/S438L; Q240K/T433Y; S286R/Y435T; A289S/L431E; S331I; L431C/E/G/P/S/V; L432C/V; T433A/I/L/N/P/Q/R/S/V/W; F434C; Y435L; Y435Q/H446N; G436M; G436D/T; N437E/G/Q; N437T/L538M; S438C/F/M/R/T; I439C/F/L/V; 및/또는 A477S.
일부 추가의 실시양태에서, 본 발명은 또한 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 서열번호 10과 비교시 아미노산 잔기 차이는 다음의 치환들 또는 치환 세트 중 1 이상에서 선택된다: A24E; Q58R/Y475H; A70S/N474E; L104M/V476L; A119E/G365A; L206M; P275Q; G276V; Q292H/A479G; Q355H/I478C; P404T/A477V; I471F/G/K/M/N/R/V/W; F472G; Q473H/K/M/R/S; Q473H/A507S; N474A/H/R/W; N474D/R490H; Y475C/F/L/Q; V476C/I/L; I478N/S; A479G/S; F482C/L; G483C/H/S; G483A/S524I; G483R/G537C; 및/또는 A558S.
일부 추가의 실시양태에서, 본 발명은 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 서열번호 10과 비교시 아미노산 잔기 차이는 다음의 치환들 또는 치환 세트 중 1 이상에서 선택된다: V39A/K115E/M133R/C565N; V39A/M133R/F472G/C503Q/C565N; V39A/M133R/F472G/C565N; V39A/M133R/C503Q;V39A/M133R/C503Q/C565N;V39A/M147A/Y378E/C503Q/C565N;V39A/M147A/Y378E/C565N;V39A/M147A/L381G/F472G/C503Q/C565N;V39A/M147A/L381G/C503Q/C565N;V39A/M147A/F472G/C503Q/C565N; V39A/M147A/F472G/C565N; V39A/M147A/C565N; V39A/G248C/L381G/F472G/C503Q/C565N; V39A/Y378E/C503Q/C565N; V39A/Y378E/C565N; V39A/L381G; V39A/F472G/C503Q/C565N; V39A/C503Q/C565N; M133R/L381G/C565N; M133R/C503Q; Y378D/C503Q; Y378E/F472G/C503Q/C565N; L381G/F472GC503Q/C565N; 및/또는 F472G/C503Q/C565N.
여전히 일부 추가의 실시양태에서, 본 발명은 또한 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 서열번호 10과 비교시 아미노산 잔기 차이는 다음의 치환들 또는 치환 세트 중 1 이상에서 선택된다: I27E/V39A; I27E/V39A/R43L/V105C/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q;
I27E/V39A/R43L/L214E/A547D; I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P210C/P266H/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P266H/I285E/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A112C/L214E/I285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/S131N/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/A153R/P210C/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/P210C/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C;I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/I285E/A547D; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/L278D/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q; I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/I285E/C503Q;I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/I285E/A547D/A551D;I27E/V39A/V105C/R134Q/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/A153R/L214E;I27E/V39A/V105C/A153R/I285E; I27E/V39A/V105C/A153R/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/A153R/A551D/C565N;
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L213M/S438L;Q240K/T433Y;S286R/Y435T;A289S/L431E;S331I;L431C/E/G/P/S/V;L432C/V;
T433A/I/L/N/P/Q/R/S/V/W;F434C; Y435L; Y435Q/H446N; G436M; G436D/T; N437E/G/Q;
N437T/L538M; S438C/F/M/R/T; I439C/F/L/V; A477S; A24E; Q58R/Y475H; A70S/N474E; L104M/V476L; A119E/G365A; L206M; P275Q; G276V; Q292H/A479G; Q355H/I478C; P404T/A477V;I471F/G/K/M/N/R/V/W;F472G;Q473H/K/M/R/S;Q473H/A507S; N474A/H/R/W;
N474D/R490H; Y475C/F/L/Q; V476C/I/L; I478N/S; A479G/S;
F482C/L; G483C/H/S; G483A/S524I; G483R/G537C; A558S; V39A/K115E/M133R/C565N; V39A/M133R/F472G/C503Q/C565N; V39A/M133R/F472G/C565N; V39A/M133R/C503Q; V39A/M133R/C503Q/C565N; V39A/M147A/Y378E/C503Q/C565N; V39A/M147A/Y378E/C565N; V39A/M147A/L381G/F472G/C503Q/C565N;V39A/M147A/L381G/C503Q/C565N; V39A/M147A/F472G/C503Q/C565N; V39A/M147A/F472G/C565N; V39A/M147A/C565N; V39A/G248C/L381G/F472G/C503Q/C565N; V39A/Y378E/C503Q/C565N; V39A/Y378E/C565N; V39A/L381G; V39A/F472G/C503Q/C565N; V39A/C503Q/C565N; M133R/L381G/C565N; M133R/C503Q; Y378D/C503Q; Y378E/F472G/C503Q/C565N; L381G/F472GC503Q/C565N; 및/또는 F472G/C503Q/C565N.
본 발명은 또한 a) 서열번호 26의 기준 서열에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편; b) 서열번호 26 또는 이의 기능적 단편과 비교시 1 이상의 아미노산 위치에 적어도 하나의 아미노산 잔기 차이를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하고; c) 서열번호 26의 기준 서열과 비교시 i) 향상된 촉매 활성, ii) 단백질분해에 대한 감소된 감응성, iii) 산성 pH에 대한 증가된 내성, iv) 감소된 응집성, v) 감소된 면역원성, 또는 i), ii), iii), iv), 또는 v) 중 임의의 조합에서 선택된 개선된 특성을 나타내는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 a) 서열번호 26의 기준 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편; b) 서열번호 26 또는 이의 기능적 단편과 비교시 1 이상의 아미노산 위치에 적어도 하나의 아미노산 잔기 차이를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하고; c) 서열번호 26의 기준 서열과 비교시 i) 향상된 촉매 활성, ii) 단백질분해에 대한 감소된 감응성, iii) 산성 pH에 대한 증가된 내성, iv) 감소된 응집성, v) 감소된 면역원성, 또는 i), ii), iii), iv), 또는 v) 중 임의의 조합에서 선택된 개선된 특성을 나타내는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공한다.
일부 추가의 실시양태에서, 본 발명은 a) 서열번호 26의 기준 서열에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편; b) 서열번호 26 또는 이의 기능적 단편과 비교시 1 이상의 아미노산 위치에서 적어도 하나의 아미노산 잔기 차이를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하고; c) 서열번호 26의 기준 서열과 비교시, i) 향상된 촉매 활성, ii) 단백질분해에 대한 감소된 감응성, iii) 산성 pH에 대한 증가된 내성, iv) 감소된 응집성, v) 감소된 면역원성, 또는 i), ii), iii), iv), 또는 v) 중 임의의 조합에서 선택된 개선된 특성을 나타내는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 서열번호 26의 기준 서열과 비교시 적어도 85%의 서열 동일성, 및 서열번호 126과 비교시 적어도 하나의 아미노산 잔기 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 26과 비교시, 향상된 촉매 활성, 단백질분해에 대한 감소된 감응성, 산성 pH에 대한 증가된 내성, 감소된 응집성, 및/또는 감소된 면역원성에서 선택된 적어도 하나의 개선된 특성을 나타낸다. 조작된 폴리펩티드의 일부 실시양태에서, 서열번호 26과 비교시 아미노산 잔기 차이는 다음의 치환들 또는 치환 세트에서 선택된다: A24E/G381L; L127V; A129I/V; S131C/T; H132L/S; R134C/F/H/K; R134H/Y378E/G381L; R134H/Y378E/G381L/V388T; R134H/V388T; A136K; A289S; M372L; H374G/M/Q; G381A/C/F/I/L/M/N/Q/S/T; A383C/M; V388C/T; L431M; 및/또는 L563M.
일부 실시양태에서, 본 발명의 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 서열번호 4의 기준 서열에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 서열번호 4의 기준 서열에 대해 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 한편, 일부 추가 실시양태에서, 조작된 폴리펩티드는 서열번호 4의 기준 서열에 대해 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 서열번호 4의 기준 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 서열번호 4의 기준 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 한편, 일부 추가 실시양태에서, 조작된 폴리펩티드는 서열번호 4의 기준 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 폴리펩티드는 본 발명의 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 활성을 갖는 폴리펩티드의 기능적 단편(예를 들면, 본원의 표들에서 제공된 임의의 변이체)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 및/또는 26에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 및/또는 26에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 및/또는 26에 대해 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 및/또는 26에 대해 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, 조작된 폴리펩티드는 본 발명의 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 활성을 갖는 폴리펩티드의 기능적 단편(예를 들면, 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 및/또는 26의 기능적 단편을 비롯하여, 본원의 표들에서 제공된 임의의 변이체)을 포함한다.
본 발명은 또한 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 조작된 폴리펩티드는 표 2-1 내지 2-5 및/또는 표 9-1 내지 9-7 중 어느 것에 제공된 변이체 PAL이다.
일부 실시양태에서, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 아나바에나 바리아빌리스 효소이다. 일부 추가의 실시양태에서,페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 열안정성이다. 일부 실시양태에서, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 단백질분해에 내성이다. 일부 추가의 실시양태에서, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 적어도 하나의 소화관 효소에 의한 단백질분해에 내성이다. 일부 추가 실시양태에서, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 키모트랩신, 트립신, 카르복시펩티다아제, 및/또는 엘라스타아제에 의한 단백질분해에 대해 내성이다. 일부 추가 실시양태에서,페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드는 산 안정성이다.
본 발명은 또한 탈면역화된 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 탈면역화된 조작된 폴리펩티드는 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 및/또는 26에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 추가의 실시양태에서, 탈면역화된 조작된 폴리펩티드는 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 및/또는 26에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 탈면역화된 조작된 폴리펩티드는 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 및/또는 26에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 탈면역화된 조작된 폴리펩티드는 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 및/또는 26에 대해 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
여전히 일부 추가의 실시양태에서, 본 발명은 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 활성을 갖는 정제된 조작된 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 기술한 바와 같은, 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 활성을 갖는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 추가의 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된다.
본 발명은 또한 본원에 제공된 바와 같은, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 적어도 하나의 제어 서열을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 제어 서열은 프로모터이다. 일부 추가의 실시양태에서, 프로모터는 이종성 프로모터이다.
본 발명은 또한 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 및/또는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 적어도 하나의 제어 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 코돈 최적화된 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 이.콜라이이다.
본 발명은 또한 조작된 PAL 폴리펩티드가 생산되도록, 적합한 배양 조건 하에서, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 적어도 하나의 제어 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 숙주 세포에서 적어도 하나의 조작된 PAL 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 배양물 및/또는 숙주 세포로부터 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 더 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, 이 방법은 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 정제하는 단계를 더 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 제공된 바와 같은 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL_ 활성을 갖는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약학 조성물이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 식이 및/또는 영양 보충물이다. 일부 추가 실시양태에서, 약학 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 담체를 더 포함한다. 일부 추가의 실시양태에서, 조성물은 페닐케톤뇨증의 치료에 적합하다. 일부 추가 실시양태에서, 약학 조성물은 인간에 경구 투여하기 적합하다. 일부 실시양태에서, 조성물은 알약, 정제, 캡슐, 젤캡, 액상, 또는 에멀션의 형태로 존재한다. 역시 일부 추가의 실시양태에서, 알약, 정제, 캡슐, 또는 젤캡은 장용성 코팅을 더 포함한다. 일부 추가의 실시양태에서, 약학 조성물은 인간에 비경구 주사하기에 적합하다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 적어도 하나의 추가적인 치료적으로 유효한 화합물과 공투여된다. 일부 추가 실시양태에서, 약학 조성물은 적어도 하나의 추가적인 치료적으로 유효한 화합물을 포함한다. 일부 추가의 실시양태에서, 약학 조성물은 식이 및/또는 영양 보충제로 존재한다.
본 발명은 또한 피험체에서 페닐케톤뇨증의 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하고, 이 방법은 페닐케톤뇨증을 갖는 피험체를 제공하는 단계, 및 피험체에게 본원에 제공된 적어도 하나의 조성물을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약학 조성물을 포함하는 한편, 일부 대안적인 실시양태에서, 조성물은 식이/영양 보충물을 포함한다. 방법의 일부 실시양태에서, 페닐케톤뇨증의 증상은 완화된다. 일부 추가의 실시양태에서, 치료되는 피험체는 페닐알라닌의 증상을 나타내는 피험체에게 요구되는 음식보다 그 메티오닌, 페닐알라닌, 및/또는 티로신 함량이 덜 제한적인 음식을 먹을 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료되는 피험체(즉, 본원에 제공된 바와 같은 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 포함하는 적어도 하나의 조성물이 제공되는 피험체)는 본원에 제공되는 바와 같은 적어도 하나의 조성물이 제공되지 않은 피험체에 요구되는 음식 보다 그 메티오닌, 페닐알라닌 및/또는 티로신이 덜 제한적인 음식을 먹을 수 있다. 일부 실시양태에서, 피험체에게 제공되는 조성물은 약학 조성물을 포함하는 한편, 일부 대안적인 실시양태에서, 조성물은 식이/영양 보충물을 포함한다. 본 발명은 또한 치료되는 피험체를 제공하고, 여기서 피험체는 본원에 제공되는 바와 같이 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 포함하는 적어도 하나의 조성물 및/또는 약학 조성물이 투여된다. 일부 실시양태에서, 피험체는 영장류, 설치류, 및 토끼목에서 선택된 동물이다. 일부 추가의 실시양태에서, 피험체는 마우스이다. 일부 추가 실시양태에서, 피험체는 인간이다. 여전히 일부 추가의 실시양태에서, 피험체는 인간 유아 또는 어린이인 한편, 일부 대안적인 실시양태에서, 피험체는 인간 성인 또는 청년이다.
본 발명은 또한 본원에 제공된 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 적어도 하나의 조작된 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
도 1은 야생형 PAL 단백질 서열: 아나바에나 바리아빌리스 PAL(NCBI YP_ 324488.1(서열번호 4)); 노스톡 펑티포르메 페닐알라닌/히스티딘 암모니아 리아제 "NpPHAL"(NCBI YP_001865631.1(서열번호 28); 리불라리아 종 히스티딘 암모니아-리아제 "RspHAL"(NCBI YP_007056096.1(서열번호 29); 오실라토리아 종 히스티딘 암모니아-리아제 "Osp HAL"(NCBI YP_07108482.1(서열번호 30); 및 글로에오캅사 종 히스티딘 암모니아-리아제 "GspHAL"(NCBI YP_007127054.1)(서열번호 31)의 서열 정렬을 도시한 도면이다.
도 2A는 실시예 4에 추가로 기술된 바와 같이 변이체 No. 22(서열번호 8), 변이체 No. 30(서열번호 6) 및 변이체 No. 36(서열번호 10)에 대해 pH 7.0에서 시험한 야생형 AvPAL과 비교해 단백질분해에 대한 감소된 감응성(키모트립신 및 트립신 내성으로 표시함)을 도시한 도면이다.
도 2B는 실시예 4에 추가로 기술된 바와 같이 변이체 No. 22, 30, 및 36에 대해 pH 4.0 내지 5.2에서 시험한 야생형 AvPAL과 비교해 산성 pH에 대한 증가된 내성을 도시한 그래프를 제공한다.
도 3은 야생형 PAl 및 변이체 No.36에 대한 K M 결과를 제공한다.
도 4는 야생형 PAL 및 변이체 No.36의 아미노산 특이성을 도시한 데이타를 제공한다.
도 5는 인간 키모트립신 및 트립신에 노출된 야생형 PAL 및 변이체 No.36의 상대적 안정성을 도시한 결과를 제공한다.
도 6은 돼지 췌장 추출물에 노출된 야생형 PAL, 및 변이체 No.36, 42, 및 43의 상대적 안정성을 도시한 결과를 제공한다.
도 7은 실시예 5에 대해 얻어진 결과를 도시한 그래프를 제공한다.
도 8은 실시예 8에 대해 얻어진 결과를 도시한 그래프를 제공한다.
본 발명은 조작된 PAL 폴리펩티드, 돌연변이체, 이의 생물학적 활성 단편 및 유사체, 및 이를 포함하는 약학 및 산업적 조성물을 제공한다.
본 발명은 조작된 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 폴리펩티드 및 이의 조성물을 비롯하여, 조작된 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드 향상된 촉매 활성을 비롯하여, 단백질분해에 대한 감소된 감응성 및 산성 pH에 대한 증가된 내성도를 제공하도록 최적화된다. 일부 실시양태에서 조작된 PAL 폴리펩티드는 탈면역화된다. 본 발명은 또한 치료적 및 산업적 목적을 위한 조작된 PAL 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
약어 및 정의:
달리 정의하지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 분야의 숙련가 중 한명이 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 갖는다. 대체로, 본원에서 사용되는 명명법 및 이하에 기술되는 세포 배양, 분자 유전자, 미생물학, 유기 화학, 분석 화학 및 핵산 화학의 실험실 과정은 당분야에서 잘알려져 있고 통상적으로 적용되는 것들이다. 이러한 기술은 당분야의 숙련가에게 잘 공지된 수많은 문서 및 참고서에 기술되어 있다. 표준 기술, 또는 이의 별법이 화학 합성 및 화학 분석에 사용된다. 위쪽과 아래쪽 모두에서 본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 논문 및 출판물은 참조하여 본원에 명확히 편입된다.
본원에 기술된 것들과 유사하거나 또는 균등한 임의의 적합한 방법 및 재료를 본원의 실시에서 사용할 수 있지만, 일부 방법 및 재료를 본원에 기술한다. 본 발명은 기술된 특정한 방법론, 프로토콜, 및 시약에 국한되는 것이 아니며, 이들은 당분야의 숙련가가 사용하는 내용에 따라서 다양할 수 있음을 이해한다. 따라서, 이하에 바로 정의된 용어들은 전체로서 출원에 참조하여 보다 완전하게 기술된다. 위쪽 및 아래쪽에서 본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 논문 및 출판물은 참조하여 본원에 명백하게 편입된다.
또한, 본원에서 사용하는 단수 관사는 본문에서 명확하게 언급하지 않으면, 복수 참조를 포함한다.
수치 범위는 그 범위를 정의하는 수치를 포함한다. 따라서, 본원에 개시된 모든 수치 범위는 협의의 수치 범위가 모두 본원에 명확하게 기재된 대로, 넓은 수치 범위에 속하는 모든 협의의 수치 범위를 포함하고자 한다. 또한 낮은(높은) 수치 한계가 본원에 명확하게 기재된 대로, 본원에 개시된 모든 최대(또는 최소) 수치 한계는 모든 낮은(또는 높은) 수치 한계를 포함하고자 한다.
용어 "약"은 특정 값에 대해 허용되는 오류를 의미한다. 일례에서, "약"은 소정 값 범위의 0.05%, 0.5%, 1.0%, 또는 2.0% 이내를 의미한다. 일례에서, "약"은 소정 값의 1, 2, 3, 또는 4 표준 편차 이내를 의미한다.
또한, 본원에 제공된 제목들은 전체로서 본원에 참조로 가질 수 있는 본원의 다양한 측면 또는 실시양태의 한정이 아니다. 따 라서, 이하에 바로 정의된 용어들은 전체로서 본원에 참조하여 보다 완전하게 정의된다. 그럼에도, 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해서, 다수의 용어들을 하기에서 정의한다.
달리 표시하지 않으면, 개별적으로, 핵산은 5'에서 3' 방향으로 좌측에서 우측으로 기재되고, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 좌측에서 우측으로 기재된다.
본원에서 사용되는 용어 "포함하는" 및 이의 동족어는 그들의 포괄적인 의미로 사용된다(즉, 용어 "포괄하는" 및 이의 상응하는 동족어와 균등).
"EC" 숫자는 생화학 및 분자 생물학의 국제 연맹의 명명 위원회(NC-IUBMB)의 효소 명명법을 의미한다. IUBMB 생화학 분류는 그들이 촉매하는 화학 반응을 기초로 하는 효소에 대한 숫자적 분류 체계이다.
"ATCC"는 그 생체시료저장 컬렉션이 유전자 및 균주를 포함하는 미국 유형 배양물 컬렉션(American Type Culture Collection)을 의미한다.
"NCBI"는 본원에서 제공되는 생물학 정보 및 서열 데이타베이스에 대한 미국립 센터를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 폴리펩티드"는 히스티딘 암모니아-리아제, 및 티로신 암모니아-리아제를 또한 포함하는 방향족 아미노산 리아제 패밀리에 속하는 효소 부류(EC 4.3.1.23, EC 4.3.1.24 및 EC4.3.1.25)를 의미한다. PAL 폴리펩티드는 또한 일부 PAL 효소가 기질로서 페닐알라닌뿐만 아니라 티로신을 사용할 수 있으므로 때때로 페닐알라닌/티로신 암모니아-리아제라고도 한다. 그러나, 본원에 개시되고 청구된 AvPAL 및 변이체는 기질로서 티로신을 사용하지 않는다. PAL 폴리펩티드는 L-페닐알라닌을 트랜스-신남산 및 암모니아로 전환시키는 것을 촉매한다. PAL 활성은 PAL 폴리펩티드의 효소 활성을 의미한다. 일부 바람직한 실시양태에서, PAL 효소는 또한 보조인자 3,5-디히드로-5-메틸리덴-4H-이미다졸-4-온(MIO)을 포함한다. 이러한 보조인자는 촉매 활성에 필수적일 수 있고 보존된 활성화 부위 Ala167-Ser168-Gly169 트리펩티드 절편의 환형화 및 탈수에 의해 형성된다.
"단백질", "폴리펩티드", 및 "펩티드"는 길이 또는 번역후 개질(예를 들면, 글리코실화 또는 인산화)과 무관하게, 아미드 결합에 의해 공유적으로 연결된 2 이상의 아미노산의 중합체를 의미하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
"아미노산"은 그들의 흔히 알려진 3글자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회가 추천하는 1글자 기호로 본원에서 언급된다. 유사하게, 뉴클레오티드도 그들의 일반적으로 허용되는 1글자 코드로 나타낼 수 있다.
세포, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 관하여 사용시, 용어 "조작된", "재조합", "비천연 발생", 및 "변이체"는 그렇지 않으면 자연계에 존재하지 않거나 또는 그와 동일하지만 합성 재료로부터 생산 또는 유도되고/되거나 재조합 기술을 사용해 조작되는 방식으로 개질되는 재료의 천연 형태 또는 천연에 상응하는 재료 또는 재료를 의미한다.
본원에서 사용하는 "야생형" 및 "천연 발생"은 자연계에서 발견되는 형태를 의미한다. 예를 들면, 야생형 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연계의 공급원으로부터 단리할 수 있고 인간 조작에 의해 의도적으로 개질되지 않은 유기체에 존재하는 서열이다.
본원에서 사용되는 "탈면역화"는 야생형 또는 기준 단백질만큼 면역원성이 아닌 변이체를 생성하기 위한 단백질의 조작을 의미한다. 일부 실시양태에서, 탈면역화는 변이체 단백질이 그 변이체 단백질이 투여된 환자에서 면역 반응을 자극하지 않는 점에서 완벽하다. 이러한 반응은 제한없이, 중성화(즉, 항-약물 항체)의 존재 또는 풍부, 과민성 반응의 존재, 또는 단백질의 투여시 사이토카인 방출의 강도 또는 보급을 포함하는 다양한 방법으로 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체 단백질은 야생형 또는 기준 단백질 보다 덜 면역원성이다. 일부 실시양태에서, 탈면역화는 T-세포 수용체에 의해 인식되는 단백질(예를 들면, 에피토프)의 개질을 포함한다. 일부 실시양태에서, T-세포 에피토프는 탈면역화된 변이체 단백질을 생산하기 위해 야생형 또는 기준 단백질로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 탈면역화된 수지상 세포 T-세포 활성화 어세이, 또는 인간 백혈구 항원(HLA) 펩티드 결합 어세이를 포함하는 인간 면역학적 반응의 생화학적 및 세포 생물학적 예측인자들에서 낮은 반응도를 보여준다.
"코딩 서열"은 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산의 일부분(예를 들면, 유전자)을 의미한다.
용어 "서열 동일성 백분율(%)"은 본원에서 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 간에 비교를 의미하고, 비교창에서 최적으로 정렬된 2종의 서열을 비교하여 결정되며, 여기서 비교창의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 부분은 2종 서열의 최적 정렬에 대해 기준 서열과 비교시 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 일치하는 위치의 수를 산출하기 위해 양 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 존재하는 위치의 수를 결정하고, 일치된 위치의 수를 비교창 내 총 위치 수로 나누고 그 결과에 100을 곱해서 서열 동일성의 백분율을 구한다. 다르게, 백분율은 일치되는 위치의 수를 산출하도록 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열에 존재하거나 또는 핵산 염기 또는 아미노산 잔기를 갭과 정렬시킨 위치의 수를 결정하고, 일치된 위치의 수를 비교창 내 위치의 총 수로 나누고 그 결과에 100을 곱해 서열 동일성 백분율을 구한다. 당분야의 숙련가는 2종의 서열을 정렬하는데 이용할 수 있는 많은 확립된 알고리즘이 존재함을 이해한다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들면 Smith 및 Waterman(Smith 및 Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981])의 국소 상동성 알고리즘, Needleman 및 Wunsch(Needleman 및 Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970])의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson 및 Lipman(Pearson 및 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988])의 유사성 방법을 위한 조사, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행(예를 들면, GCG 위스콘신 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 당분야에 공지된 육안 검사를 통해 수행될 수 있다. 서열 동일성 및 서열 유사성의 백분율을 결정하는데 적합한 알고리즘의 예에는 제한없이, BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘(예를 들면, 다음을 참조함: Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 [1990]; 및 Altschul et al., Nucleic Acids Res., 3389-3402 [1977])이 포함된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 생명공학 정보 웹사이트에 대한 미국립 센터를 통해 공개적으로 입수할 수 있다. 이러한 알고리즘은 데이타베이스 서열에서 동일 길이의 단어와 정렬시, 일부 양성값의 한계 점수 "T"와 일치하거나 또는 만족하는, 문의 서열 중 길이 "W"의 짧은 단어를 식별하여 높은 점수의 서열쌍(HSP)을 식별하는 것을 포함한다. T는 이웃 단어 점수 한계치(다음을 참조함: Altschul et al, 상동)를 의미한다. 이들 초기 이웃 단어 히트는 그들을 포함하는 보다 긴 HSP를 찾기 위해 검색을 개시하기 위한 씨드로서 작용한다. 다음으로 단어 히트는 누적 정렬 점수가 증가되는 한 각 서열을 따라 양 방향으로 확장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열의 경우, 변수 "M"(일치 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 "N"(미일치 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 < 0)을 사용해 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 점수 매트릭스를 사용해서 누적 점수를 계산한다. 각 방향으로 단어 히트의 확장은 누적 정렬 점수가 그 최대 획득값으로부터 "X"의 양 만큼 줄면 중지하고; 누적 점수는, 1 이상의 음성 점수화 잔기 정렬의 축적에 기인하거나, 또는 양 서열의 말단에 도달하면, 0 또는 그 이하가 된다. BLAST 알고리즘 변수 W, T, 및 X는 정렬 속도 및 민감도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 11의 단어 길이(W), 10의 기대치(E), M=5,사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어 길이(W), 10의 기대치(E), 및 BLOSUM62 점수 매트릭스(예를 들면, 다음을 참조함: Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989])를 사용한다. 서열 정렬 및 %의 서열 동일성의 예시적인 결정법은 제공된 디폴트 변수를 사용하는, GCG 위스콘신 소프트웨어 패키지(Accelrys, Madison WI)의 BESTFIT 또는 GAP 프로그램을 채택한다.
"기준 서열"은 서열 비교를 위한 기준으로서 사용되는 정해진 서열을 의미한다. 기준 서열은 큰 서열의 서브셋트, 예를 들면 전체 길이 유전자 또는 폴리펩티드 서열의 절편일 수 있다. 대체로, 기준 서열은 핵산 또는 폴리펩티드의 길이 또는 전체 길이가 적어도 20 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기, 적어도 25 잔기 길이, 적어도 50 잔기 길이, 적어도 100 잔기 길이이다. 2종의 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드는 각각 (1) 2종 서열 간에 유사한 서열(즉, 완전한 서열의 일부분)을 포함하고, (2) 2종 서열간 분기성인 서열을 더 포함할 수 있고, 2(또는 그 이상)종 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드간 서열 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국소 영역을 식별하고 비교하기 위한 "비교창"에서 2종의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열을 비교하여 수행된다. 일부 실시양태에서, "기준 서열"은 주요 아미노산 서열을 기반으로 할 수 있으며, 여기서 기준 서열은 주요 서열에 1 이상의 변화를 가지는 서열이다. 예를 들면, 어구 "X39에 상응하는 잔기에 발린을 갖는 서열번호 4를 기반으로 하는 기준 서열"은 서열번호 4의 위치 X39에 상응하는 잔기(예를 들면, 알라닌)가 발린으로 변화된 기준 서열을 의미한다.
"비교창"은 적어도 약 20개의 인접하는 뉴클레오티드 위치 또는 아미노산 잔기의 개념적인 절편을 의미하고 여기서 서열은 적어도 20개의 인접하는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 기준 서열과 비교되고, 비교창 내 서열의 일부분은 2종 서열의 최적 정렬을 위해 기준 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20% 또는 그 이하의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교창은 20보다 긴 인접하는 잔기일 수 있고, 경우에 따라 30, 40, 50, 100, 또는 이 보다 긴 창을 포함할 수 있다.
소정 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 번호매김 내용에서 사용시 "∼에 상응하는", "∼를 참조하여", 및 "∼에 대해서"는 소정 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 기준 서열과 비교시 특정 기준 서열의 잔기의 번호매김을 의미한다. 달리 말해서, 소정 중합체의 잔기 번호 또는 잔기 위치는 소정 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열 내 잔기의 실제 숫자적 위치라기 보다는 기준 서열에 대해 지정된다. 예를 들면, 소정 아미노산 서열, 예컨대 조작된 PAL의 경우, 2개 서열 간에 잔기 일치를 최적화하도록 갭을 도입하여 기준 서열에 대해 정렬시킬 수 있다. 이러한 경우들에서, 갭이 존재하더라도, 소정 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 내 장기의 번호매김은 정렬되는 기준 서열에 대해서 이루어진다.
"아미노산 차이" 및 "잔기 차이"는 기준 서열 내 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 대한 폴리펩티드 서열의 위치에서 아미노산 잔기의 차이를 의미한다. 아미노산 차이의 위치는 일반적으로, 본원에서 "Xn"이라고 하고, 여기서 n은 잔기 차이를 기초로 하는 기준 서열 내 상응하는 위치를 의미한다. 예를 들면, "서열번호 4와 비교시 위치 X91에서 잔기 차이"는 서열번호 4의 위치 91에 상응하는 폴리펩티듸 위치에서의 아미노산 잔기의 차이를 의미한다. 따라서, 서열번호 4의 기준 폴리펩티드가 위치 91에 알라닌을 가지면, "서열번호 4와 비교시 위치 X91에서 잔기 차이"는 서열번호 4의 위치 91에 상응하는 폴리펩티드의 위치에서 알라닌 이외의 임의 잔기의 아미노산 치환을 의미한다. 본원의 대부분의 예에서, 일정 위치에서 특정 아미노산 잔기 차이는 "XnY"로 표시되고 여기서 "Xn"은 기준 폴리펩티드(상기 기술한 바와 같음)의 상응하는 잔기 및 위치를 특정하고 "Y"는 조작된 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산의 단일 문자 식별자(즉, 기준 폴리펩티드에서와는 다른 잔기)이다. 일부 예(예를 들어, 실시예의 표)에서, 본원은 또한 통상적인 표기법 "AnB"으로 표시된 특정한 아미노산 차이를 제공하며, 여기서 A는 기준 서열 내 잔기의 단일 문자 식별자이고, "n"은 기준 서열 내 잔기 위치의 번호이며, B는 조작된 폴리펩티드의 서열 내 잔기 치환의 단일 문자 식별자이다. 일부 예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 잔기 차이가 기준 서열에 대해 존재하는 특정 위치의 목록으로 표시되는, 기준 서열에 대한 1 이상의 아미노산 잔기 차이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개가 넘는 아미노산이 폴리펩티드의 특정 잔기 위치에서 사용되는 경우, 사용될 수 있는 다양한 아미노산 잔기는 "/"에 의해 구분된다(예를 들면, X307G/X307Q 또는 X307G/Q). 본 발명은 보존성 또는 비보존성 아미노산 치환/ 또는 보존성 및 비보존성 아미노산 치환 둘 모두를 포함하는 1 이상의 아미노산 차이를 포함하는 조작된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
용어 "아미노산 치환 세트" 및 "치환 세트"는 폴리펩티드 서열 내 아미노산 치환 군을 의미한다. 일부 실시양태에서, 치환 세트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치환 세트는 실시예의 임의의 표에 열거된 임의의 변이체 AvPAL 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 치환 세트를 의미한다. 예를 들면, 변이체 36에 존재하는 치환 세트는 A39V/A91V/N290G/H307G/L407V/T524S이고, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 4에 대한 것이다.
"보존성 아미노산 치환"은 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 상이한 잔기로 치환하는 것을 의미하고, 따라서 전형적으로 같거나 또는 유사하게 정의된 아미노산 부류 내 아미노산으로 폴리펩티드의 아미노산 치환을 포함한다. 제한없이 예로서, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산은 다른 지방족 아미노산(예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신)으로 치환되고, 히드록실 측쇄를 갖는 아미노산은 히드록실 측쇄를 갖는 다른 아미노산(예를 들면, 세린 및 트레오닌)으로 치환되며, 방향족 측쇄를 갖는 아미노산은 방향족 측쇄를 갖는 다른 아미노산(예를 들면, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 및 히스티딘)으로 치환되고, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산은 염기성 측쇄를 갖는 다른 아미노산(예를 들면, 리신 및 아르기닌)으로 치환되며, 산성 측쇄를 갖는 아미노산은 산성 측쇄를 갖는 다른 아미노산(예를 들면, 아스파르트산, 또는 글루탐산)으로 치환되고, 소수성 또는 친수성 아미노산은 각각 다른 소수성 또는 친수성 아미노산으로 치환된다.
"비보존성 치환"은 유의하게 다른 측쇄 특성을 갖는 아미노산으로 폴리펩티드의 아미노산 치환을 의미한다. 비보존성 치환은 정의된 군에 속하기 보다는, 그들 사이의 아미노산을 사용할 수 있고, (a) 치환 영역 내 펩티드 골격의 구조(예를 들면, 글리신 대신 프롤린); (b) 전하 또는 소수성; 및/또는(c) 측쇄의 규모에 영향을 미칠 수 있다. 제한없이 예로서, 예시적인 비보존성 치환은 염기성 또는 지방족 아미노산으로 치환된 산성 아미노산; 소형 아미노산으로 치환된 방향족 아미노산; 및 소수성 아미노산으로 치환된 친수성 아미노산을 포함한다.
"결실"은 기준 폴리펩티드로부터 1 이상의 아미노산의 제거에 의한 폴리펩티드 개질을 의미한다. 결실은 조작된 트랜스아미나아제 효소의 개선된 특성을 유지하고/하거나 효소 활성을 유지하면서 기준 효소를 구성하는 아미노산의 총 개수의 1 또는 그 이상의 아미노산, 2 또는 그 이상의 아미노산, 5 또는 그 이상의 아미노산, 10 또는 그 이상의 아미노산, 15 또는 그 이상의 아미노산, 또는 20 또는 그 이상의 아미노산, 총 아미노산 개수의 최대 10%, 또는 총 아미노산 개수의 최대 20%의 제거를 포함할 수 있다. 결실은 폴리펩티드의 내부 영역 및/또는 말단 영역에 대한 것일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 결실은 연속되는 절편을 포함하거나 또는 비연속적일 수 있다.
"삽입"은 기준 폴리펩티드로부터 1 이상의 아미노산의 부가에 의한 폴리펩티드의 개질을 의미한다. 삽입은 폴리펩티드의 내부 영역에 있거나, 또는 카르복시 또는 아미노 말단에 있을 수 있다. 본원에서 사용되는 삽입은 당분야에 공지된 바와 같은 융합 단백질을 포함한다. 삽입은 아미노산의 인접하는 절편이거나 또는 천연 발생 폴리펩티드 내 1 이상의 아미노산에 의해 이격될 수 있다.
용어 "기능적 단편" 및 "생물학적 활성 단편"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단 결실(들) 및/또는 내부 결실을 갖지만, 나머지 아미노산 서열이 비교되는 서열(즉, 본 발명의 전체 길이의 조작된 PAL)의 상응하는 위치와 동일하고 전체 길이 폴리펩티드의 실질적으로 전체 활성을 보유하는 폴리펩티드를 의미한다.
"단리된 폴리펩티드"는 천연적으로 이와 수반되는 다른 오염물(예를 들면, 단백질, 지질, 및 폴리뉴클레오티드)로부터 실질적으로 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 이 용어는 그들의 천연 발생 환경 또는 발현계(예를 들면, 숙주 세포 또는 시험관내 합성)로부터 분리되거나 또는 정제된 폴리펩티드를 포함한다. 재조합 PAL 폴리펩티드는 세포 내에 존재하거나, 세포 배지에 존재하거나, 또는 다양한 형태, 예컨대 용균물 또는 단리된 조제물로서 준비될 수 있다. 이처럼, 일부 실시양태에서, 본원에 제공되는 재조합 PAL 폴리펩티드는 단리된 폴리펩티드이다.
"실질적으로 순수한 폴리펩티드"는 그 폴리펩티드 종이 존재하는 우세한 종(즉, 몰랄 또는 중량 기준으로 조성물 내 임의의 다른 개별 거대 분자 종 보다 더 풍부함)인 조성물을 의미하고, 대체로 대상 종이 몰 또는 중량% 기준으로 존재하는 거대 분자 종의 적어도 약 50%를 포함하는 경우 실질적으로 순수한 조성물이다. 대체로, 실질적으로 순수한 PAL 조성물은 몰 또는 중량% 기준으로 조성물에 존재하는 모든 존재하는 거대분자 종 중 약 60% 또는 그 이상, 약 70% 또는 그 이상, 약 80% 또는 그 이상, 약 90% 또는 그 이상, 약 95% 또는 그 이상, 및 약 98% 또는 그 이상을 포함하게 된다. 일부 실시양태에서, 대상 종은 본질적으로 균질하게 정제되고(즉, 오염 종이 통상의 검출 방법으로는 조성물에서 검출될 수 없음), 여기서 조성물은 본질적으로 단일한 거대분자 종으로 이루어진다. 용매 종, 소형 분자(< 500 달톤), 및 원소 이온 종은 거대분자 종으로 고려하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 재조합 PAL 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 폴리펩티드 조성물이다.
"개선된 효소 성질(특성)"은 기준 PAL 폴리펩티드, 예컨대 야생형 PAL 폴리펩티드(예를 들면, 서열번호 4를 갖는 AvPAL 야생형) 또는 다른 조작된 PAL 폴리펩티드와 비교시 임의의 효소 특성의 개선이 나타나는 조작된 PAL 폴리펩티드를 의미한다. 개선된 특성은 제한없이 증가된 단백질 발현, 증가된 열활성, 증가된 열안정성, 증가된 pH 활성, 증가된 안정성, 증가된 효소 활성, 증가된 기질 특이성 및/또는 친화성, 증가된 비활성, 증가된 기질에 대한 내성 및/또는 최종 산물 억제성, 증가된 화학적 안정성, 증가된 화학선택성, 개선된 용매 안정성, 산성 pH에 대한 증가된 내성, 단백질분해 활성에 대한 증가된 내성(즉, 단백질분해에 대한 감소된 감응성), 감소된 응집성, 증가된 가용성, 감소된 면역원성, 및 변경된 온도 프로파일 등과 같은 특성을 포함한다.
"증가된 효소 활성" 및 "향상된 촉매 활성"은 기준 PAL 효소(예를 들면, 야생형 AvPAL 및/또는 다른 조작된 AvPAL)와 비교시 비활성(예를 들면, 생산된 산물/시간/중량 단백질)의 증가 및/또는 기질의 산물로의 전환율(예를 들면, 특정량의 PAL을 사용하여 특정 기간에 기질의 출발량에서 산물로의 전환되는 비율) 증가로 대표될 수 있는 조작된 PAL 폴리펩티드의 개선된 특성을 의미한다. 효소 활성을 측정하는 예시적인 방법은 실시예에 제공한다. 효소 활성과 관련된 임의의 특성은 그 변화가 증가된 효소 활성을 일으킬 수 있는, K m , V max 또는 k cat 의 고전적인 효소 특성을 포함하여, 영향받을 수 있다. 효소 활성의 개선은 상응하는 야생형 효소의 효소 활성의 약 1.1배부터, 천연 발생 PAL 또는 PAL 폴리펩티드가 유도된 다른 조작된 PAL 보다 2배, 5배, 10배, 20배, 25배, 50배, 75배, 100배, 150배, 200배 또는 그 이상의 효소 활성일 수 있다.
일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 k cat 이 적어도 0.1/초, 적어도 0.2/초, 적어도 0.3/초, 적어도 0.5/초, 적어도 1.0/초이고, 일부 바람직한 실시양태에서는 1.0/초를 넘는다. 일부 실시양태에서, K m 은 약 1 μm 내지 약 5 mM의 범위; 약 5 μm 내지 약 2 mM 범위; 약10 μm 내지 약 2 mM 범위; 또는 약 10 μm 내지 약 1 mM 범위이다. 일부 특정 실시양태에서, 조작된 PAL 효소는 기준 PAL 효소 보다 1.5 내지 10배, 1.5 내지 25배, 1.5 내지 50배, 1.5 내지 100배 또는 그 이상의 범위의 개선된 효소 활성을 나타낸다. PAL 활성은 당분야에 공지된 임의의 표준 어세이를 통해 측정할 수 있다(예를 들면, 반응물 또는 산물의 분광광도 특성 변화를 모니터링하여 측정). 일부 실시양태에서, 생성되는 산물의 양은 UV 흡광 또는 직접 형광발광 검출 또는 후속 o-프탈디알데히드(OPA) 유도체화와 조합된 고성능 액상 크로마토그래피(HPLC) 분리법을 통해 측정된다. 일부 실시양태에서, 효소 활성의 비교는 본원에서 상사하게 더욱 기술되는 바와 같이, 효소의 확정된 조제물, 설정 조건 하에서 확정된 어세이, 및 1 이상의 정해진 기질을 사용해 수행된다. 대체로, 용균물을 비교하는 경우, 숙주 세포에 의해 생산되고 용균물에 존재하는 효소 양의 변동을 최소화하기 위해서, 동일한 발현계 및 동일한 숙주 세포의 사용을 비롯하여, 어세이되는 세포의 수 및 단백질의 양을 결정한다.
용어 "산성 pH에 대한 개선된 내성"은 본 발명에 따른 재조합 PAL이 기준 PAL과 비교시 증가된 안정성(즉, 특정 기간(1시간, 최대 24시간) 동안 산성 pH에 노출 후, 약 pH 7.0에서 높게 유지되는 활성)을 나타냄을 의미한다.
본원에서 사용되는 "생리적 pH"는 대체로 피험체(예를 들면, 인간) 소장에서 발견되는 pH 범위를 의미한다. 정상적으로 약 6.0 내지 7.5 범위의, 유문관에서 대장으로의 pH 구배가 존재한다.
산성 pH 조건에 대한 개선된 안정성 또는 산성 pH에 대한 증가된 내성과 관련되어 사용되는 용어 "산성 pH"는 약 1.5 내지 6.8의 pH 범위를 의미한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "단백질분해 활성" 및 "단백질분해"는 보다 작은 폴리펩티드 또는 아미노산으로 단백질의 분해를 의미한다. 단백질의 분해는 대체로 프로테아제(프로테이나아제) 효소에 의한 펩티드 결합의 가수분해 결 과이다. 프로테아제 효소는 제한없이, 펩신, 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제; 카르복시펩티다아제 A 및 B, 및 펩티다아제(예를 들면, 아미노 펩티다아제, 디펩티다아제 및 엔테로펩티다아제)를 포함한다.
어구 "단백질분해에 대한 감소된 감응성" 및 "감소된 단백질분해 감응성"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 본 발명에 따른 조작된 PAL 폴리펩티드가 1 이상의 프로테아제로 처리 후 표준 어세이(예를 들면, 실시예에 개시된 바와 같은 것)에서 기준 PAL과 비교하여 보다 높은 효소 활성을 가짐을 의미한다.
"응집"은 PAL 폴리펩티드의 덩어리화 또는 침전을 의미한다. 응집은 효소의 불활성화를 초래할 수 있다. 용어 "감소된 응집성"은 기준 PAL과 비교시, 조작된 PAL 폴리펩티드가 응집되는 경향이 덜함을 의미한다. 응집을 평가하기 위한 방법은 제한없이, 적절한 염료(예를 들면, 티오플라빈 T 또는 나일 레드)를 사용한 형광 현미경, 동적 광산란, 적절한 염료(예를 들면, 보디피)를 사용한 유세포측정, 여과 및 SDS-PAGE를 통한 분석, 및/또는 웨스턴 블랏팅, 형광발광 상관 분광법, 및 전자 현미경의 사용을 포함한다. 응집을 평가하는 시판 키트(예를 들면, ProteoStat® 단백질 응집 어세이 키트[Enzo])가 존재한다.
"전환"은 상응하는 산물(들)로 기질(들)의 효소적 전환(또는 생체변환)을 의미한다. "전환율"은 특정 조건 하에서 일정 기간 내에 산물로 전환되는 기질의 백분율을 의미한다. 따라서, PAL 폴리펩티드의 "효소적 활성" 또는 "활성"은 특정 기간 내 산물로의 기질의 "전환율"로서 표현될 수 있다.
"혼성화 엄격성"은 핵산의 혼성화 시, 세척 조건 등과 같은 혼성화 조건과 관련된다. 대체로, 혼성화 반응은 낮은 엄격성 조건 하에서 수행된 후 다양하지만 높은 엄격성의 세척이 후속된다. 용어 "중간 엄격 혼성화"는 표적 DNA와 약 60% 동일성, 바람직하게는 약 75% 동일성, 약 85% 동일성을 갖고, 표적-폴리뉴클레오티드에 대해 약 90% 넘는 동일성을 갖는, 상보적 핵산에 표적-DNA가 결합할 수 있게 하는 조건을 의미한다. 예시적인 중간 엄격 조건은 42℃에서 50% 포름아미드, 5× 덴하르트 용액, 5×SSPE, 0.2% SDS에서의 혼성화에 이어서, 42℃에서 0.24×SSPE, 0.2% SDS 중 세척이 후속되는 것과 균등한 조건이다. "고엄격 혼성화"는 대체로 정의된 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 용액 조건 하에서 결정된 열 용융 온도(T m )로부터 약 10℃ 또는 그 이하인 조건을 의미한다. 일부 실시양태에서, 고엄격 조건은 65℃에 0.018 M NaCl에서 안정한 하이브리드를 형성하는 핵산 서열만의 혼성화를 가능케하는 조건을 의미한다(즉, 하이브리드가 65℃에 0.018 M NaCl에서 안정하지 않으면, 본원에서 고려되는 고엄격 조건 하에서 안정하지 않음). 고엄격 조건은 예를 들면, 42℃에 50% 포름아미드, 5× 덴하르트 용액, 5×SSPE, 0.2% SDS와 균등한 조건에서의 혼성화에 이어서, 65℃에서 0.1×SSPE, 및 0.1% SDS 중에서의 세척이 후속되는 것에 의해 제공된다. 다른 고엄격 조건은 65℃에서 0.1%(w:v) SDS를 포함하는 5X SSC에서의 혼성화 및 65℃에서 0.1% SDS를 포함하는 0.1x SSC로 세척하는 것과 균등한 조건에서의 혼성화이다. 중간 엄격 조건을 비롯하여, 다른 고엄격 혼성화는 상기 인용된 참조문헌에 기술되어 있다.
"코돈 최적화"는 코딩된 단백질이 유기체에서 보다 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈을 변화시키는 것을 의미한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈이라고 하는, 몇몇 코돈에 의해 표시된다는 점에서, 유전자 코드가 축퇴적이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 용법은 임의적이지 않고 특정 코돈 트리플렛에 편향적이다. 이러한 코돈 용법 편향성은 소정 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 고도로 발현되는 단백질 대 낮은 복제수 단백질, 및 유기체 게놈의 집합적 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다. 일부 실시양태에서, PAL 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현을 위해 선택된 숙주 유기체로부터 최적 생산을 위해 코돈 최적화된다.
"제어 서열"은 본원에서 본원의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 발현에 필수적이거나 또는 유리한 모든 성분을 포함하는 것을 의미한다. 각각의 제어 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 대해 내생적이거나 또는 외생적일 수 있다. 이러한 제어 서열은 제한없이, 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터 서열, 신호 펩티드 서열, 개시 서열, 및 전사 종결인자를 포함한다. 최소한으로, 제어 서열은 프로모터, 및 전사 및 번역 중지 신호를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제어 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 코딩 영역과 제어 서열의 결찰을 용이하게 하는 특정 제한효소 부위를 도입하려는 목적의 링커가 제공된다.
"작동가능하게 연결된"은 제어 서열이 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 지정하거나 또는 조절하도록 관심 폴리뉴클레오티드에 대한 위치에 적절하게 위치(즉, 기능적 관련성으로)된 구성으로 본원에서 정의된다.
"프로모터 서열"은 관심 폴리뉴클레오티드, 예컨대 코딩 서열의 발현을 위해 숙주 세포에 의해 인식되는 핵산 서열을 의미한다. 프로모터 서열은 관심 폴리뉴클레오티드의 발현을 매개하는 전사 제어 서열을 포함한다. 프로모터는 숙주 세포에 대해 동종성이거나 또는 이종성인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 얻을 수 있고, 돌연변이체, 절두형 및 하이브리드 프로모터를 포함하여 선택 숙주 세포에서 전사 활성을 보이는 임의의 핵산 서열일 수 있다.
"적합한 반응 조건"은 본 발명의 PAL 폴리펩티드가 기질에서 바람직한 생성 화합물로 전환될 수 있는 효소 전환 반응 용액의 조건(예를 들면, 효소 적재, 기질 적재, 온도, pH, 완충액, 공용매 등의 범위)을 의미한다. 예시적인 "적합한 반응 조건"은 본원에서 제공한다(실시예를 참조한다).
"적재(loading)" 예컨대 "화합물 적재" 또는 "효소 적재"는 반응의 출발시 반응 혼합물 중 성분의 농도 또는 양을 의미한다. 효소 전환 반응 과정에서 "기질"은 PAL 폴리펩티드가 작용하는 화합물 또는 분자를 의미한다. 효소 전환 과정에서 "산물"은 기질에 대한 PAL 폴리펩티드의 작용 결과로 생성된 화합물 또는 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "배양하는"은 임의의 적합한 배지(예를 들면, 액체, 겔, 또는 고체)를 사용하는 적합한 조건 하에서 미생물 세포 개체군의 성장을 의미한다.
재조합 폴리펩티드(예를 들면, PAL 효소 변이체)는 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법으로 생산될 수 있다. 예를 들면, 당분야의 숙련가에에 충분히 알려진 광범위하게 다양한 돌연변이유발 기술이 존재한다. 또한, 돌연변이유발 키트는 많은 상업적 분자 생물학 공급자로부터 입수할 수도 있다. 정해진 아미노산에서 특정 치환(부위-지정), 유전자의 국소 영역내 특이적 또는 무작위 돌연변이(위치 특이적), 또는 전체 유전자에 대한 무작위 돌연변이유발(예를 들면, 포화 돌연변이유발)을 실시할 수 있는 방법이 이용가능하다. 제한없이, PCR을 사용한 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA의 부위 지정 돌연변이유발법, 카세트 돌연변이유발법, 유전자 합성법, 에러-프론 PCR, 셔플링, 및 화학적 포화 돌연변이 유발법, 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 적합한 방법을 포함하여, 효소 변이체를 생성하기 위한 수많은 적합한 방법들이 당분야에 알려져 있다. DNA 및 단백질 조작에 사용되는 방법들의 비제한적인 예들이 다음의 특허에 제공되어 있다: 미국 특허 제6,117,679호; 미국 특허 제6,420,175호; 미국 특허 제6,376,246호; 미국 특허 제6,586,182호; 미국 특허 제7,747,391호; 미국 특허 제7,747,393호; 미국 특허 제7,783,428호; 및 미국 특허 제8,383,346호. 변이체를 생산한 후, 그들은 임의의 바람직한 특성(예를 들면, 높거나 또는 증가된 활성, 또는 낮거나 감소된 활성, 증가된 열적 활성, 증가된 열 안정성, 및/또는 산성 pH 안정성 등)에 대해 스크리닝될 수 있다. 일부 실시양태에서, "재조합 PAL 폴리펩티드"(본원에서 또한 "조작된 PAL 폴리펩티드", "변이체 PAL 효소", 및 "PAL 변이체")가 사용된다.
본원에서 사용되는 "벡터"는 DNA 서열을 세포로 도입시키기 위한 DNA 구성체이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 적합한 숙주에서 DNA 서열에서 코딩되는 폴리펩티드의 발현을 실시할 수 있는 적합한 제어 서열에 작동가능하게 연결된 발현 벡터이다. 일부 실시양태에서, "발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현을 구동하기 위한 DNA 서열(예를 들면, 이식유전자)에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고, 일부 실시양태에서, 또한 전사 종결 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "발현"은 제한없이, 전사, 전사후 개질, 번역, 및 번역후 개질을 포함한 폴리펩티드의 생산에 관여되는 임의의 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서 이 용어는 세포로부터 폴리펩티드의 분비를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "생산하다"는 세포에 의한 단백질 및/또는 다른 화합물의 생산을 의미한다. 이 용어는 제한없이, 전사, 전사후 개질, 번역, 및 번역후 개질을 포함한, 폴리펩티드의 생산에 관여되는 임의의 단계를 포함하고자 한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 또한 세포로부터 폴리펩티드의 분비를 포함한다.
본원에서 사용되는, 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열(예를 들면, 프로모터 서열, 신호 펩티드, 종결 서열 등)은 2종의 서열이 자연계에서 회합되지 않았으면 작동가능하게 연결된 다른 서열에 대해 "이종성"이다.
본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포" 및 "숙주 균주"는 본원에서 제공하는 DNA(예를 들면, 1 이상의 AvPAL 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열)를 포함하는 발현 벡터에 적합한 숙주를 의미한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 당분야에 공지된 재조합 DNA 기술을 사용해 제작된 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 원핵생물 또는 진핵생물 세포이다.
용어 "유사체"는 기준 폴리펩티드에 대해 70%를 넘는 서열 동일성이지만 100% 보다 낮은 서열 동일성(예를 들면, 75%, 78%, 80%, 83%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%를 넘는 서열 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 일부 실시양태에서, 유사체는 제한없이, 천연 발생 아미노산을 비롯하여, 제한없이 호모아르기닌, 오리니틴 및 노르발린을 포함한 비천연 발생 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유사체는 또한 2 또는 그 이상의 아미노산 잔기 사이에 1 이상의 D-아미노산 잔기 및 비펩티드 연결부를 포함한다.
용어 "치료적"은 유리하거나 또는 바람직한 의학적 효과를 갖는 병변의 징후 또는 증상을 보이는 피험체에 투여되는 화합물을 의미한다.
용어 "약학 조성물"은 본 발명에 포함되는 조작된 PAL 폴리펩티드의 약학적 유효량 및 허용 담체를 포함하는 포유동물 피험체(예를 들면, 인간)에서 약학적 용도에 적합한 조성물을 의미한다.
용어 "유효량"은 바람직한 결과를 생성하기에 충분한 양을 의미한다. 당분야의 숙련가 중 한명은 통상적인 실험법을 사용해 유효량이 무엇인지 결정할 수 있다.
용어 "단리된" 및 "정제된"은 천연적으로 회합된 1 이상의 다른 성분이 제거된 분자(예를 들면, 단리된 핵산, 폴리펩티드 등) 또는 다른 성분을 의미한다. 용어 "정제된은 절대 순도를 요구하지 않으며, 그 보다는 상대적 정의를 의도하는 것이다.
용어 "피험체"는 포유류 예컨대 인간, 인간외 영장류, 가축, 반려 동물, 및 실험 동물(예를 들면, 설치류 및 토끼목)을 포함한다. 이 용어는 숫컷과 암컷을 포함하고자 한다.
본원에서 사용되는 용어 "환자는 질환을 평가하거나, 치료하거나, 또는 경험한 임의의 피험체를 의미한다.
용어 "유아"는 생후 첫달부터 대략 1세 기간의 아이를 의미한다. 본원에서 사용하는 "신생아"는 출생부터 28일째 시기의 아이를 의미한다. 용어 "미성숙아"는 완전한 20주의 임신기간 후이지만, 달이 차기 전에 태어난, 대체로 출생시 체중이 ∼500 내지 ∼2499 그램인 유아를 의미한다. "초저 체중 출생아"는 출생시 체중이 1500 g 미만인 유아이다.
본원에서 사용되는 "아동"은 치료 또는 연구 과정의 동의를 위한 법적 연령을 획득하지 않은 사람을 의미한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 출생시부터 청소년기 사이의 사람을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "성인"은 관련 사법권에 대해 법적 연령(예를 들어, 미국에서는 18세)을 획득한 사람을 의미한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 임의의 완전하게 성장, 성숙한 유기체를 의미한다. 일부 실시양태에서, 용어 "청년"은 18세 미만이지만 성적 성숙함에 도달한 사람을 의미한다.
본원에서 사용되는 "조성물" 및 "제제"는 임의의 적합한 용도를 의도하는, 본 발명의 1 이상의 조작된 PAL을 포함하는 생성물(예를 들면, 약학 조성물, 식이/영양 보충제, 사료 등)을 포함한다.
용어 조성물 "투여" 및 "투여하는"은 본 발명의 조성물을 피험체(예를 들면, PKU의 효과를 앓는 인물)에게 제공하는 것을 의미한다.
약학 조성물과 관련하여 사용시 용어 "담체"는 임의의 표준 약학 담체, 완충제, 부형제, 예컨대 안정화제, 보존제, 및 보조제를 의미한다.
용어 "약학적으로 허용가능한"은 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하거나 또는 함유된 임의의 성분들과 유해한 방식으로 상호작용하지 않고 피험체에 투여할 수 있으며 바람직한 생물학적 활성을 보유하는 물질을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "부형제"는 활성 약학 성분(API; 예를 들면, 본 발명의 조작된 PAL 폴리펩티드)보다는, 임의의 약학적으로 허용되는 부가제, 담체, 희석제, 보조제, 또는 다른 성분들을 의미한다.
질환/병태의 증상과 관련하여 사용시 용어 "치료적 유효량"은 질환/병태의 1 이상의 증상을 완화, 약화 또는 제거하거나 또는 증상(들)(예를 들면, PKU)의 개시를 방지 또는 지연시키는 화합물(예를 들면, 조작된 PAL 폴리펩티드)의 양 및/또는 농도를 의미한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 연구자, 의사, 수의사, 또는 다른 임상의가 추구하는 조직, 전신, 또는 동물 피험체에 의한 생물학적(예를 들면, 의학적) 반응을 유도하는 조성물의 양과 관련하여 사용된다.
질환/병태와 관련하여 사용시 용어 "치료적 유효량"은 질환/병태를 완화, 약화, 또는 제거하는 조성물의 양 및/또는 농도를 의미한다.
용어 "치료하는", "치료하다", 및 "치료"는 일시적 처치를 비롯하여, 방지적(예를 들면, 예방적) 처치를 포함한다.
조작된 PAL 폴리펩티드 :
본 발명의 조작된 PAL 폴리펩티드가 유래된 부모 PAL 폴리펩티드는 박테리아 균주 예컨대 아나바에나(Anabaena)(예를 들면, 에이. 바리아빌리스(A. variabilis)), 노스톡(Nostoc)(예를 들면, 엔. 펄티포르메(N. punctiforme)), 로도스포리디움(Rhodosporidium)(예를 들여, 알, 토룰로이데스(R. toruloides)), 스트렙토마이세스(Streptomyces)(예를 들면, 에스. 마리티무스(S. maritimus) 또는 에스. 베르티실라투스(S. verticillatus)), 오실라토리아 종(Oscillatoria sp.), 글로에오카프사 종(Gloeocapsa sp.), 및 리불라리아 종(Rivularia sp.)을 포함한다. 이들 균주 유래 PAL 효소들이 동정되었고 잘 알려져 있다. 아나바에나(에이. 바리아비리스) ATCC 29413 및 NCBI YP_324488.1; 노스톡(엔. 펑티포르메) ATCC 29133 및 NCBI YP_00186563.1; 오실라토리아 종 PCC 6506 및 NCBI ZP_ 07108482.1 및 글로에오카프사 종 PCC7428 및 NCBI YP_007127054.1에서 유래된 상동성 효소 서열은 도 1에 제공하였다. 노스톡 펑니포르메 페닐알라닌/히스티딘 암모니아 리아제 "NpPHAL"(NCBI YP_001865631.1(서열번호 30); 리불라리아 종 히스티딘 암모니아-리아제 "RspHAL"(NCBI YP_007056096.1(서열번호 31); 오실라토리아 종 히스티딘 암모니아-리아제 "Osp HAL"(NCBI YP_07108482.1(서열번호 32); 및 글로에오카프사 종 히스티딘 암모니아-리아제 "GspHAL"(NCBI YP_007127054.1)(서열번호 33)은 AvPAL(서열번호 4)와의 상동성이 70%를 넘는다.
또한, 특정 PAL 변이체(즉, 조작된 PAL 폴리펩티드)를 야생형 PAL 또는 기준 PAL의 서열 중 특정 아미노산 잔기의 개질과 관련하여 언급히 균등한 위치(들)(개별 아미노산 서열 간 최적 아미노산 서열 정렬로 결정시)에서 개질된 다른 PAL의 변이체는 본원에 포함됨을 이해한다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 상기 박테리아 균주(즉, 노스톡[엔. 펑티포르메], 로도스포리디움[알. 토룰로이데스], 스트렙토마이세스[에스. 마리티무스 또는 에스. 베르티실라투스], 오실라토리아 종, 글로에오카프사 종 및 리불라리아 종)에서 열거된 폴리펩티드 중 임의의 하나로부터 유도된다. 일부 추가의 실시양태에서, 본 발명의 조작된 PAL 폴리펩티드는 보존적 활성 부위 Ala167-Ser168-Gly169를 포함하고, 서열번호 4에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 PAL 활성을 포함할뿐만 아니라 티로신 및/또는 히스티딘 기질에 대해서도 활성이다.
일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 조작된 PAL 폴리펩티드를 생산하기에 좋은 조건 하에서 1 이상의 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 미생물을 길러서 생산된다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 이후 최종 배양 배지 및/또는 세포로부터 회수된다.
본 발명은 PAL 활성을 갖는 예시적인 조작된 PAL 폴리펩티드를 제공한다. 실시예들은 조작된 PAL 폴리펩티드의 기능적 활성과 특별한 아미노산 서열 특징을 상호관련짓는 서열 구조 정보를 보여주는 표들을 제공한다. 이러한 구조-기능 상호관련 정보는 예시적인 조작된 PAL 폴리펩티드에 대해 연관된 실험적으로 결정된 활성 데이타를 비롯하여, 서열번호 4의 기준 조작된 폴리펩티드에 대한 특정한 아미노산 잔기 차이의 형태로 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 PAL 활성을 갖는 조작된 PAL 폴리펩티드는 a) 서열번호 4의 기준 서열에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; b) 서열번호 4와 비교시 1 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 잔기 차이를 포함하고; c) 기준 서열과 비교시 i) 향상된 촉매 활성, ii) 감소된 단백질분해 감응성, iii) 산성 pH에 대한 증가된 내성, iv) 감소된 응집성 또는 i), ii), iii) 또는 iv) 중 임의의 조합에서 선택된 개선된 특성을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 1 이상의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4에 대해 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 서열번호 4와 비교시 1 이상의 아미노산 위치(예컨대 서열번호 4 또는 서열번호 4와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교시 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20 또는 그 이상의 아미노산 위치)에서 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 4와 비교시, 1 이상의 위치에서 잔기 차이는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 실시예에 제공된 표에 열거된 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 1 이상의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지며, 서열번호 4와 비교시 1 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 잔기 차이는 서열번호 4의 아미노산 서열과 최적으로 정렬시 X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; X564; 또는 이의 임의 조합에서 선택된다. 일부 실시양태에서 아미노산 차이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20 또는 이 이상의 아미노산 위치이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4에 대해 적어도 85%(적어도 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%)의 서열 동일성을 가지며, 위치 H307에서 아미노산 잔기 차이 및 경우에 따라 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 잔기 차이를 포함한다. 일부 실시양태에서 위치 307에서 아미노산 잔기 차이는 H307/G/Q/M이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4에 대해 적어도 85%(적어도 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%)의 서열 동일성을 가지며, A39; T54; G59, S73; A91; Y158; S180; K195; A112; R134; Q240; T243; I245; A256; L257; N270; N290; Y304; R305; H307; E308; I326; L349; D353; L364; A394; S399; N400; P404; L407; F443; N453; Y459; T460; T463; N474; E509; Q521; K522; T524; P528; S546; 및/또는 P564 중 1 이상의 조합에서 선택된 1 이상의 아미노산 잔기 차이를 포함한다. 일부 추가의 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 잔기 차이가 존재한다.
일부 실시양태에서, 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4에 대해 적어도 85%(적어도 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%)의 서열 동일성을 가지며, 서열번호 4와 최적으로 정렬시, A39V; T54K; G59R; S73K; A112C; R134Q; A91V; Y158H; S180A; K195E; Q240R/W; T243I/L; I245L; A256G; L257W/A; N270K; N290G; Y304H; R305M; H307G/Q/M; E308Q; I326F; L349M; D353A/N; L364Q; A394V; S399N; N400K; P404A; L407V; F443H; N453G; Y459F; T460G; T463N; N474Q; E509L; Q521K/S; K522Y/F/N; T524S;P528L; S546R; 및 P564 G/L/M 중 1 이상의 조합에서 선택되는 아미노산 잔기 차이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아미노산 잔기 차이는, 서열번호 4와 최적으로 정렬시, A39V; A91V; A256G; N290G; A394V; S399N; P404A; L407V; K522Y/F/N; 및/또는 T524S 중 1 이상의 조합에서 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 조작된 PAL 폴리펩티드의 기능적 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 기능적 단편은 이것이 유도된 조작된 PAL 폴리펩티드(즉, 부모의 조작된 PAL)의 활성의 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기능적 단편은 조작된 PAL의 부모 서열의 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기능적 단편은 5개 미만, 10개 미만, 15개 미만, 10개 미만, 25개 미만, 30개 미만, 35개 미만, 40개 미만, 45개 미만, 및 50개 미만의 아미노산이 절단된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 조작된 PAL 폴리펩티드의 기능적 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 기능적 단편은 그것이 유도된 조작된 PAL 폴리펩티드(즉, 부모 조작된 PAL)의 활성의 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기능적 단편은 조작된 PAL의 부모 서열의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함한다. 일부 실시양태에서 기능적 단편은 5개 미만, 10개 미만, 15개 미만, 10개 미만, 25개 미만, 30개 미만, 35개 미만, 40개 미만, 45개 미만, 50개 미만, 55개 미만, 60개 미만, 65개 미만, 또는 70개 미만의 아미노산이 절단된다.
일부 실시양태에서, 1 이상의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 6과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 서열번호 6과 비교시 1 이상의 아미노산 위치(예컨대 서열번호 6, 또는 서열번호 6과 비교시 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교시 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 또는 그 이상의 아미노산 위치)에서 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL는 서열번호 6에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하고, 서열번호 6과 비교시 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 차이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 6의 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 1 이상의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 10과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상의 아미노산 서열의 동일성 또는 이의 기능적 단편, 및 서열번호 10과 비교시 1 이상의 아미노산 위치(예컨대 서열번호 10, 또는 서열번호 10과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 또는 그 이상의 아미노산 위치)에서 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL는 서열번호 10에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하고, 서열번호 10과 비교시 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 차이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 10의 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 1 이상의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 12와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성 또는 이의 기능적 단편, 및 서열번호 12와 비교시 1 이상의 아미노산 위치(예컨대, 서열번호 12, 또는 서열번호 12와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교시 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 또는 그 이상의 아미노산 위치)에서 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL은 서열번호 12에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하고, 서열번호 12와 비교시, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 차이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 12의 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 1 이상의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 14와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성 또는 이의 기능적 단편, 및 서열번호 14와 비교시 1 이상의 아미노산 위치(예컨대 서열번호 14, 또는 서열번호 14와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교시 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 또는 그 이상의 아미노산 위치)에서 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL은 서열번호 14에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하고, 서열번호 14와 비교시, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 잔기 차이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 14의 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 1 이상의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 16과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성 또는 이의 기능적 단편, 및 서열번호 16과 비교시 1 이상의 아미노산 위치(예컨대 서열번호 16, 또는 서열번호 16과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교시 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 또는 그 이상의 아미노산 위치)에서 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL은 서열번호 16에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하고, 서열번호 16과 비교시, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 잔기 차이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 16의 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 1 이상의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 18과 비교시 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성 또는 이의 기능적 단편, 및 서열번호 18과 비교시 1 이상의 아미노산 위치(예컨대 서열번호 18, 또는 서열번호 18과 비교시 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교시 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 또는 그 이상의 아미노산 위치)에서 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL은 서열번호 18과 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하고, 서열번호 18과 비교시 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 차이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 18의 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 1 이상의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 20과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성 또는 이의 기능적 단편, 및 서열번호 20과 비교시 1 이상의 아미노산 위치(예컨대 서열번호 20, 또는 서열번호 20과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교시 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 또는 그 이상의 아미노산 위치)에서 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL은 서열번호 20과 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하고, 서열번호 20과 비교시 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 차이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 20의 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 1 이상의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 22와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성 또는 이의 기능적 단편, 및 서열번호 22와 비교시 1 이상의 아미노산 위치(예컨대 서열번호 22, 또는 서열번호 22와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교시 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 또는 그 이상의 아미노산 위치)에서 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL은 서열번호 22와 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하고, 서열번호 22와 비교시, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 차이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 22의 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 1 이상의 개선된 특성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 24와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성 또는 이의 기능적 단편, 및 서열번호 24와 비교시 1 이상의 아미노산 위치(예컨대 서열번호 24, 또는 서열번호 24와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교시 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 또는 그 이상의 아미노산 위치)에서 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL은 서열번호 24와 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하고, 서열번호 24와 비교시 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 차이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 24의 서열로 이루어진다.
단백질분해에 대한 감소된 감응성을 갖는 변이체 :
일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 PAL 폴리펩티드는 PAL 활성을 가지며, 단백질분해에 대한 감소된 감응성을 나타내고, a) 서열번호 4의 기준 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; b) 서열번호 4와 비교시 1 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 잔기 차이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질분해에 대한 감소된 감응성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 서열번호 4와 비교시 1 이상의 아미노산 위치(예컨대 서열번호 4 또는 서열번호 4와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교시 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20 또는 그 이상의 아미노산 위치)에서 아미노산 잔기 차이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 단백질분해에 대한 감소된 감응성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지며, 서열번호 4와 비교시 1 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 잔기 차이는, 서열번호 4의 아미노산 서열과 최적으로 정렬시, X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; X564; 또는 이의 임의 조합에서 선택된다. 일부 실시양태에서 아미노산 차이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20 또는 그 이상의 아미노산 위치이다.
일부 실시양태에서, 단백질분해에 대한 감소된 감응성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4와 적어도 85%, 적어도 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 가지며, 위치 X307; X326; X460; X307; 및/또는 X528에서 아미노산 잔기 차이, 및 경우에 따라 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 잔기 차이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 잔기 차이는 서열번호 4와 정렬시 Y304H/W; R305L/M; H307G/M/Q; I326F; Q240W; T460G; P528L; 및 이들 치환의 임의의 조합에서 선택된다.
일부 실시양태에서, 단백질분해에 대한 감소된 감응성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 및/또는 24 중 어느 것과 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성 또는 이의 기능적 단편, 및 서열번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 및/또는 24와 비교시 1 이상의 아미노산 위치(예컨대, 서열번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 및/또는 24, 또는 서열번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 및/또는 24와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교시, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 또는 그 이상의 아미노산 위치)에서 아미노산 잔기 차이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL은 서열번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 및/또는 24과 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하고, 서열번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 및/또는 24와 비교시, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 차이를 포함한다. 일부 실시양태에서, PAL은 서열번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 및/또는 24의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드의 단백질분해 감응성은 본질적으로 동일한 조건 하에서 기준 PAL 폴리펩티드 또는 야생형 PAL(예를 들면, 서열번호 4를 갖는 AvPAL)의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 만큼 감소된다. 단백질분해 활성은 제한없이, 실시예에 기술된 것을 포함하여, 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용해 측정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단백질분해에 대한 감소된 감응성을 갖는 조작된 PAL 폴리펩티드는 감소된 감응성을 갖는 조작된 PAL 및 기준 PAL 둘 모두를 본질적으로 동일한 조건 하에서 비교하고 본질적으로 동일한 양 및 유형의 프로테아제에 노출시 제한없이, 펩신, 트립신, 키모트립신, 카르복시펩티다아제 A 및 B, 펩티다아제(예를 들면, 아미노 펩티다아제, 디펩티다아제 및 엔테로펩티다아제)를 포함하여, 1 이상의 프로테아제를 포함하는 조성물에 대한 감응성이 감소되었다.
일부 실시양태에서, 단백질분해에 대한 감소된 감응성을 갖는 조작된 PAL 폴리펩티드는 기준 PAL(예를 들면, AvPAL)의 효소 활성의 약 1.0배, 2배, 5배, 10배, 20배, 25배, 50배, 75배, 100배, 150배, 200배 또는 그 이상인 효소 활성도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 폴리펩티드는 활성을 4.5 내지 7.5의 pH 범위에서 측정시; 활성을 4.5 내지 6.5의 pH 범위에서 측정시; 활성을 5.0 내지 7.5의 pH 범위에서 측정시; 활성을 5.0 내지 6.5의 pH 범위에서 측정시; 활성을 5.5 내지 7.5의 pH 범위에서 측정시; 및/또는 또한 활성을 5.5 내지 6.5의 pH 범위에서 측정시, 기준 PAL가 비교하여, 보다 더 효소 활성을 갖는다. 일부 다른 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 Km 값이 1 μM 내지 5 mM 범위이다.
산성 pH에 대한 증가된 내성을 갖는 변이체 :
일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 PAL 폴리펩티드는 PAL 활성을 가지며, 산성 pH 수준에 내성이고, a) 서열번호 4의 기준 서열, 또는 이의 단편과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 b) 서열번호 4와 비교시 1 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 잔기 차이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 야생형 AvPAL 및/또는 다른 기준 폴리펩티드와 비교시 산성 pH에 대한 증가된 내성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 서열번호 4와 비교시 1 이상의 아미노산 위치(예컨대, 서열번호 4, 또는 서열번호 4와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열과 비교시 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20 또는 그 이상의 아미노산 위치)에서 아미노산 잔기 차이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 야생형 AvPAL 및/또는 다른 기준 폴리펩티드와 비교시 산성 pH에 대한 증가된 내성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4와 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지며, 서열번호 4와 비교시, 1 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 잔기 차이는 서열번호 4의 아미노산 서열과 최적으로 정렬시, X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; X564; 또는 이의 임의 조합에서 선택된다. 일부 실시양태에서 아미노산 차이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20 또는 그 이상의 아미노산 위치이다.
일부 실시양태에서, 야생형 AvPAL 및/또는 다른 기준 폴리펩티드와 비교시 산성 pH에 대한 증가된 내성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4와 적어도 85%, 적어도 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 가지며, 위치 X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; X564; 또는 이의 임의 조합에서 아미노산 잔기 차이; 및 경우에 따라 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 잔기 차이를 포함한다. 일부 실시양태에서 아미노산 잔기 차이는 서열번호 4와 정렬시, A39; T54; G59, S73; A91; Y158; S180; K195; A112; R134; Q240; T243; I245; A256; L257; N270; N290; Y304; R305; H307; E308; I326; L349; D353; L364; A394; S399; N400; P404; L407; F443; N453; Y459; T460; T463; N474; E509; Q521; K522; T524; P528; S546; 및/또는 P564이다. 일부 실시양태에서, 산성 pH에 대한 증가된 내성을 나타내는 조작된 PAL 폴리펩티드는 서열번호 4와 적어도 85%, 적어도 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 가지며, 서열번호 4와 정렬시, 1 이상의 위치 A39V; T54K; G59R; S73K; A112C; R134Q; A91V; Y158H; S180A; K195E; Q240R/W; T243I/L; I245L; A256G; L257W/A; N270K; N290G; Y304H; R305M; H307G/Q/M; E308Q; I326F; L349M; D353A/N; L364Q; A394V; S399N; N400K; P404A; L407V; F443H; N453G; Y459F; T460G; T463N; N474Q; E509L; Q521K/S; K522Y/F/N; T524S;P528L; S546R; 및/또는 P564 G/L/M에서 아미노산 잔기 차이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 모든 다른 어세이 조건이 본질적으로 같은 경우, 기준 PAL과 비교시 산성 pH에 대한 증가된 내성을 갖는 조작된 PAL 폴리펩티드는 1.5 내지 6.5; 1.5 내지 5.0; 2.0 내지 5.5; 3.0 내지 6.8; 3.0 내지 5.5; 4.0 내지 6.5; 4.0 내지 4.5; 4.5 내지 5.0; 4.5 내지 5.5; 4.5 내지6.0; 4.5 내지 6.5; 5.0 내지 6.5; 5.0 내지 6.0; 5.0 내지 5.5; 5.5 내지 6.0; 6.0 내지 6.5; 및/또는 6.5 내지 7.0의 pH 범위에서 증가된 내성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 산성 pH에 대한 증가된 내성은 약 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 및/또는 6.5의 pH에서 나타난다.
일부 실시양태에서, 산성 pH에 대한 증가된 내성을 갖는 조작된 PAL 폴리펩티드는 또한 표준 어세이로 측정하는 경우 기준 PAL 과 비교하여 보다 높은 PAL 활성을 나타낸다. 임의의 적합한 어세이는 제한없이, 본원에 제공된 것들을 포함하여, 본 발명에서 사용된다.
임의의 조작된 폴리펩티드(즉, 변이체 No.1 - 변이체 No.1010)는 예를 들면, 본원에 기술된 다른 폴리펩티드 및 다른 잔기 위치와 다른 다양한 아미노산 차이의 새로운 조합을 부가하여 후속 진화 회차까지, 다른 조작된 PAL 폴리펩티드를 합성하기 위한 출발 아미노산 서열로서 사용을 더욱 고려한다. 일부 실시양태에서, 초기 진화 회차 전반에서 변하지 않고 유지된 잔기 위치에 아미노산 차이를 포함시켜 추가의 개선을 생성시킨다. 본 발명을 제한없이 본원에 제공된 방법들을 포함하여, 임의의 적합한 방법이 사용됨에 따라, 조작된 PAL 폴리펩티드를 생성하는 임의의 특정 방법에 국한시키려는 의도는 없다.
조작된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 및 숙주 세포 :
본 발명은 본원에 기술된 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 폴리뉴클레오티드를 생성하도록 유전자 발현을 제어하는 1 이상의 이종성 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드(들)를 코딩하는 1 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 구성체는 적절한 숙주 세포로 도입되어 상응하는 PAL 폴리펩티드를 발현한다.
숙련가에게 명확한 바와 같이, 다양한 아미노산에 상응하는 코돈에 대한 지식 및 단백질 서열의 이용가능성은 대상 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 모든 폴리뉴클레오티드의 설명을 제공한다. 동일 아미노산이 대안적이거나 또는 동의적인 코돈에 의해 코딩되는, 유전자 코드의 축퇴성은 모두 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는, 상당히 많은 수의 핵산을 만들 수 있게 한다. 따라서, 본 발명은 선택된 가능한 코돈 선택을 기반으로 조합을 선택하여 본원에 기술된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 만들수 있는 각각의 모든 가능한 PAL 폴리뉴클레오티드의 변이를 생성시키기 위한 방법 및 조성물을 제공하고, 이러한 모든 변이는 실시예에 제시한 아미노산 서열(예를 들면, 다양한 표에)을 포함하여, 본원에 기술된 임의의 폴리펩티드에 대해 구체적으로 개시된 것으로 간주한다.
일부 실시양태에서, 코돈은 바람직하게는 단백질 생산을 위해 선택된 숙주 세포가 이용하도록 최적화된다. 예를 들면, 박테리아에서 사용되는 바람직한 코돈은 전형적으로 박테리아에서의 발현을 위해 사용된다. 결과적으로, 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드는 전체 길이 코딩 영역 내 코돈 위치의 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상에서 바람직한 코돈을 포함한다.
일부 실시양태에서, PAL 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 특성의 PAL 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서 폴리펩티드는 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 및/또는 23에서 선택된 기준 서열, 또는 임의의 변이체의 아미노산 서열(예를 들면, 실시예에 제공된 것들)과 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및/또는 23의 기준 폴리뉴클레오티드, 또는 실시예에 개시된 바와 같은 임의 변이체의 아미노산 서열과 비교시 1 이상의 잔기(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상 아미노산 잔기 위치) 차이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기준 서열은 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 및/또는 23에서 선택된다.
일부 실시양태에서, PAL 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 특성의 PAL 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서 폴리펩티드는 서열번호 4의 기준 서열과 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 서열번호 4의 폴리펩티드와 최적으로 정렬하는 경우, 서열번호 4와 비교시 X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; 및/또는 X564로부터의 잔기 위치에서 1 이상의 잔기 차이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 및/또는 23에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 및/또는 23과 적어도 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 뉴클레오티드 잔기 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 고도의 엄격 조건 하에서 서열번호 2, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 및/또는 23, 또는 이의 상보체에서 선택된 기준 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 본원에서 제공하는 임의의 변이체 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 고도의 엄격 조건 하에서 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드는 X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; 및/또는 X564에서 선택된 잔기 위치에서, 서열번호 4와 비교시 1 이상의 잔기 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 PAL 폴리펩티드를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 본원의 임의의 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 PAL 폴리펩티드의 발현을 촉진하는 다양한 방식으로 조작된다. 일부 실시양태에서, PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 1 이상의 제어 서열이 존재하여 PAL 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 발현을 제어하는 발현 벡터를 포함한다. 벡터로 이의 삽입 전에 단리된 폴리뉴클레오티드의 조작은 이용되는 발현 벡터에 따라서 바람직하거나 또는 필수적일 수 있다. 재조합 DNA 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드 및 핵산 서열을 개질시키는 기술은 당분야에 공지이다. 일부 실시양태에서, 제어 서열은 다른 것들 중에서도, 프로모터, 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 신호 펩티드 서열, 및 전사 종결부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적합한 프로모터는 숙주 세포 선택을 기준으로 선택된다. 박테리아 숙주 세포의 경우, 본원의 핵산 구성체의 전사를 지정하기에 적합한 프로모터는 제한없이, 이. 콜라이(E. coli) lac 오페론, 스트렙토마이세스 코엘리콜러(Streptomyces coelicolor) 아가라아제 유전자(dagA), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 레반수크라아제 유전자(sacB), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 알파-아밀라아제 유전자(amyL), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 말토스형성성 아밀라아제 유전자(amyM), 바실러스 아밀로리커파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 알파-아밀라아제 유전자(amyQ), 바실러스 리체니포르미스 페니실리나아제 유전자(penP), 바실러스 서브틸리스 xylA 및 xylB 유전자, 원핵생물 베타-락타마아제 유전자(예를 들면, 다음을 참조함: Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 75: 3727-3731 [1978])에서 얻은 프로모터를 비롯하여, tac 프로모터에서 얻어지는 프로모터를 포함한다(예를 들면, 다음을 참조함: DeBoer et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 80: 21-25 [1983]). 사상균 숙주 세포에 대한 예시적인 프로모터는 제한없이, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라아제, 리조무코어 미에헤이(Rhizomucor miehei) 아스파르트산 프로테나아제, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 중성 알파-아밀라아제, 아스퍼질러스 나이거 산 안정성 알파-아밀라아제, 아스퍼질러스 나이거 또는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라알제(glaA), 리조무코어 미에헤이 리바아제, 아스퍼질러스 오리재 알칼리 프로테아제, 아스퍼질러스 오리제 트리오스 포스페이트 이소머라아제, 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 아세타미다아제, 및 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) 트립신-유사 프로테아제(예를 들면, WO 96/00787 참조)에 대한 유전자에서 얻은 프로모터를 비롯하여 NA2-tpi 프로모터(아스퍼질러스 나이거 중성 알파-아밀라아제 및 아스퍼질러스 오리재 트리오스 포스페이트 이소머라아제에 대한 유전자 유래 프로모터의 하이브리드), 및 이의 돌연변이체, 절두형, 및 하이브리드 프로모터를 포함한다. 예시적인 효모 세포 프로모터는 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae) 에놀라아제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비지아 갈락토키나아제(GAL1), 사카로마이세스 세레비지아 알콜 디히드로게나아제/글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나아자(ADH2/GAP), 및 사카로마이세스 세레비지아 3-포스포글리세레이트 키나아제에 대한 유전자에서 유래될 수 있다. 효모 숙주 세포에 유용한 다른 프로모터는 당분야에 알려져 있다(예를 들면, 다음을 참조함: Romanos et al., Yeast 8:423-488 [1992]).
일부 실시양태에서, 제어 서열은 또한 적합한 전사 종결 서열(즉, 전사 종결을 위해 숙주 세포가 인식하는 서열)이다. 일부 실시양태에서, 종결 서열은 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택한 숙주 세포에서 기능하는 임의의 적합한 종결부가 본 발명에서 사용된다. 사상균 수주 세포에 대한 예시적인 전사 종결부는 아스퍼질러스 오리제 TAKA 아밀라아제, 아스퍼질러스 나이커 글루코아밀라아제, 아스퍼질러스 니둘란스 안트라닐레이트 신타아제, 아스퍼질러스 나이거 알파-글루코시다아제, 및 푸사리움 옥시스포럼 트립신-유사 프로테아제에 대한 유전자로부터 얻는다. 효모 숙주 세포에 대한 예시적인 종결부는 사카로마이세스 세레비지아 에놀라아제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비지아 사이토크롬 C(CYC1), 및 사카로마이세스 세레비지아 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나아제에 대한 유전자로부터 얻는다. 효모 숙주 세포에 대해 유용한 다른 종결부는 당분야에 공지이다(예를 들면, 다음을 참조한다; Romanos et al., 상동).
일부 실시양태에서, 제어 서열은 또한 적합한 리더 서열(즉, 숙주 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 비번역 영역)이다. 일부 실시양태에서, 리더 서열은 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택 숙주 세포에서 기능적인 임의의 적합한 리더 서열이 본 발명에서 사용된다. 사상균 숙주 세포에 대한 예시적인 리더는 아스퍼질러스 오리재 TAKA 아밀라아제, 및 아스퍼질러스 니둘란스 트리오스 포스페이트 이소머라아제에 대한 유전자로부터 얻는다. 효모 숙주 세포에 적합한 리더는 사카로마이세스 세레비지아 에놀라아제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비지아 3-포스포글리세레이트 키나아제, 사카로마이세스 세레비지아 알파-인자, 및 사카로마이세스 세레비지아 알콜 디히드로게나아제/글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나아제(ADH2/GAP)에 대한 유전자로부터 얻는다.
일부 실시양태에서, 제어 서열은 또한 폴리아데틸화 서열(즉, 핵산 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된 서열이고, 전사시, 전사된 mRNA에 폴리아데노신 잔기를 부가하는 신호로서 숙주 세포에 의해 인식되는 서열)이다. 선택 숙주 세포에서 기능적인 임의의 적합한 폴리아데닐화 서열이 본 발명에서 사용된다. 사상균 숙주 세포에 대한 예시적인 아데닐화 서열은 제한없이, 아스퍼질러스 오리재 TAKA 아밀라아제, 아스퍼질러스 나이거 글루코아밀라아제, 아스퍼질러스 니둘란스 안트라닐레이트 신타아제, 푸사리움 옥시스포룸 트립신-유사 프로테아제, 및 아스퍼질러스 나이거 알파-글루코시다아제에 대한 유전자를 포함한다. 효소 숙주 세포에 대해 유용한 폴리아데닐화 서열이 공지되어 있다(예를 들면, 다음을 참조함: Guo and Sherman, Mol. Cell. Bio., 15:5983-5990 [1995]).
일부 실시양태에서, 제어 서열은 또한 신호 펩티드(즉, 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결된 아미노산 서열을 코딩하고, 세포의 분비 경로로 코딩된 폴리펩티드를 지정하는 코딩 영역)이다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열의 코딩 서열의 5' 말단은 고유하게 분비 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역의 절편과 번역 리딩 프레임으로 천연적으로 연결된 신호 펩티드 코딩 영역을 포함한다. 다르게, 일부 실시양태에서, 코딩 서열의 5' 말단은 코딩 서열에 대해 외생성인 신호 펩티드 코딩 영역을 포함한다. 선택된 숙주 세포의 분비 경로로 발현된 폴리펩티드를 지정하는 임의의 적합한 신호 펩티드 코딩 영역이 조작된 폴리펩티드(들)의 발현에 사용된다. 박테리아 숙주 세포에 대해 효과적인 신호 펩티드 코딩 영역은 제한없이, 바실러스 NClB 11837 말토스형성 아밀라아제, 바실러스 스테아로써모필러스 알파-아밀라아제, 바실러스 리체니포르미스 서브틸리신, 바실러스 리체니포르미스 베타-락타마아제, 바실러스 스테아로써모필러스 중성 프로테아제(nprT, nprS, nprM), 및 바실러스 서브틸리스 prsA에 대한 유전자에서 얻은 것들이 포함된다. 추가의 신호 펩티드가 당분야에 공지되어 있다(예를 들면, 다음을 참조함: Simonen and Palva, Microbiol. Rev., 57:109-137 [1993]). 일부 실시양태에서, 사상균 숙주 세포에 유효한 신호 펩티드 코딩 영역은 제한없이, 아스퍼질러스 오리재 TAKA 아밀라아제, 아스퍼질러스 나이거 중성 아밀라아제, 아스퍼질러스 나이거 글루코아밀라아제, 리조무코어 미에헤이 아스파르트산 프로테아제, 우미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 셀룰라아제, 및 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) 리파아제에 대한 유전자에서 얻은 신호 펩티드 코딩 영역을 포함한다. 효모 숙주 세포에 유용한 신호 펩티드는 제한없이, 사카로마이세스 세레비지아 알파-인자 및 사카로마이세스 세레비지아 인버타아제에 대한 유전자 유래의 것들을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제어 서열은 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치된 아미노산 서열을 코딩하는 프로펩티드 코딩 영역이다. 최종 폴리펩티드는 "프로효소", "프로폴리펩티드" 또는 "자이모겐"이라고 한다. 프로폴리펩티드는 프로폴리펩티드로부터 프로펩티드의 촉매적 또는 자가촉매적 절단에 의해 성숙한 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 이러한 프로펩티드 코딩 영역은 제한없이, 바실러스 서브틸리스 알칼리 프로테아제(aprE), 바실러스 서브틸리스 중성 프로테아제(nprT), 사카로마이세스 세레비지아 알파-인자, 리조무코어 미에헤이 아스파르트산 프로테이나아제, 및 바이셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila) 락타아제에 대한 유전자를 포함한, 임의의 적합한 공급원으로부터 얻을 수 있다(예를 들면, WO 95/33836을 참조함). 신호 펩티드 및 프로펩티드 영역 둘 모두가 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 경우, 프로펩티드 영역은 폴리펩티드의 아미노 말단 옆에 위치하고 신호 펩티드 영역이 프로펩티드 영역의 아미노 말단 옆에 위치된다.
일부 실시양태에서, 조절 서열이 또한 이용된다. 이들 서열은 숙주 세포의 성장에 대해 폴리펩티드의 발현 조절을 촉진한다. 조절 시스템의 예는 조절 화합물의 존재를 포함하여, 화학적 또는 물리적 자극에 대한 반응으로 유전자 발현의 켜짐 또는 꺼짐을 일으키는 것들이다. 원핵생물 숙주 세포에서, 적합한 조절 서열은 제한없이, lac, tac, 및 trp 오퍼레이터 시스템을 포함한다. 효모 숙주 세포에서, 적합한 조절 시스템은 제한없이, ADH2 시스템 또는 GAL1 시스템을 포함한다. 사상균에서, 적합한 조절 서열은 제한없이, TAKA 알파-아밀라아제 프로모터, 아스퍼질러스 나이거 글루코아밀라아제 프로모터, 및 아스퍼질러스 오리재 글루코아밀라아제 프로모터를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 1 이상의 발현 조절 영역 예컨대 도입되는 숙주 유형에 따른, 프로모터 및 종결부, 복제 기원 등을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 다양한 핵산 및 제어 서열은 1 이상의 편리한 제한효소 부위를 포함하여 그러한 부위에 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 삽입 또는 치환을 가능케하는 재조합 발현 벡터를 생산하도록 함께 연결된다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 서열은 발현에 적합한 벡터에 서열을 포함하는 핵산 구성체 또는 핵산 서열을 삽입하여 발현된다. 발현 벡터의 생성에 관여되는 일부 실시양태에서, 코딩 서열은 이 코딩 서열이 발현을 위해 적절한 제어 서열과 작동가능하게 연결되도록 벡터 내에 위치된다.
재조합 발현 벡터는 편리하게 재조합 DNA 과정을 수행할 수 있고 PAL 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 일으킬 수 있는, 임의의 적합한 벡터(예를 들면, 플라스미드 또는 바이러스)이다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터가 도입되는 숙주 세포와 벡터의 상용성에 따라 좌우된다. 벡터는 선형이거나 또는 폐쇄형 원형 플라스미드일 수 있다.
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 자가 복제 벡터(즉, 염색체외 독립체로서 존재하고, 그 복제가 염색체 복제와 독립적인 벡터, 예컨대 플라스미드, 염색체외 성분, 미니염색체, 또는 인공 염색체)이다. 벡터는 자가 복제를 보장하는 임의의 수단을 포함할 수 있다. 일부 대안적인 실시양태에서, 벡터는 숙주 세포에 도입되는 경우, 게놈에 통합되고 그것이 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것이다. 또한, 일부 실시양태에서, 숙주 세포의 게놈에 도입되는 전체 DNA를 함께 포함하는 단일 벡터 또는 플라스미드, 또는 2 이상의 벡터 또는 플라스미드, 및/또는 트랜스포존이 이용된다.
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 형질전환된 세포의 용이한 선별을 허용하는 1 이상의 선별 마커를 포함한다. "선별 마커"는 그 산물이 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속 내성, 영양요구체에 대한 원영양성 등을 제공하는 유전자이다. 박테리아 선별 마커의 예에는 제한없이, 바실러스 서브틸리스, 또는 바실러스 리체니포르미스 유래된 dal 유전자, 또는 항생제 내성 예컨대 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 내성을 부여하는 마커가 포함된다. 효모 숙주 세포에 적합한 마커는 제한없이, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3을 포함한다. 사상균 숙주 세포에 사용하기 위한 선별 마커는 제한없이, amdS(아세타미다아제; 예를 들어, 에이. 니둘란스 또는 에이. 오리재 유래), argB(오르니틴 카르바모일트랜스퍼라아제), bar(포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제; 예를 들면, 에스 히그로스코피쿠스(S. hygroscopicus) 유래), hph(히그로마이신 포스포트랜스퍼라아제), niaD(나이트레이트 리덕타아제), pyrG(오로티딘-5'-포스페이트 디카르복실라아제; 예를 들면, 에이. 니둘란스 또는 에이. 오리재 유래), sC(설페이트 아데닐트랜스퍼라아제), 및 trpC(안트라닐레이트 신타아제)와 이들의 균등물을 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 1 이상의 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공하고, 이러한 폴리뉴클레오티드(들)는 숙주 세포에서 조작된 PAL 효소(들)의 발현을 위한 1 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 발현 벡터에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현하는데 사용하기 적합한 숙주 세포는 당분야에 공지되어 있고, 제한없이, 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이, 비브리오 플루비알리스(Vibrio fluvialis), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 세포; 진균 세포, 예컨대 효모 세포(예를 들면, 사카로마이세스 세레비지아 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(ATCC 수탁 No. 201178)); 곤충 세포 예컨대 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9 세포; 동물 세포 예컨대 CHO, COS, BHK, 293, 및 바우스 흑색종 세포; 및 식물 세포를 포함한다. 예시적인 숙주 세포는 또한 다양한 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 균주(예를 들면, W3110(ΔfhuA) 및 BL21)를 포함한다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 조작된 PAL 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공하고, 여기서 이 방법은 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 본원에 기술된 대로, PAL 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계를 더 포함한다.
숙주 세포에 적절한 배양 배지 및 성장 조건은 당분야에 공지이다. 세포로 PAL 폴리펩티드의 발현을 위한 폴리뉴클레오티드의 도입에 적합한 임의의 방법을 본 발명에서 사용하게 됨을 고려한다. 적합한 기술은 제한없이, 전기천공, 생체탄도 입자 충돌법, 리포솜 매개 형질감염법, 염화칼슘 형질감염법, 및 원형질 융합법이 포함된다.
본원에 개시된 특성을 갖는 조작된 PAL 폴리펩티드는 천연 발생 또는 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 당분야에 공지되고/되거나 본원에 기술된 임의의 적합한 돌연변이유발법 및/또는 지정 진화 방법을 수행하여 얻을 수 있다. 예시적인 지정 진화 기술은 돌연변이유발법 및/또는 DNA 셔플링법이 있다(예를 들면, 다음을 참조함: Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 [1994]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767 및 미국 특허 제6,537,746호). 사용될 수 있는 다른 지정 진화 과정은 다른 것들 중에서도, 스태거드 연장법(StEP), 시험관내 재조합법(예를 들면, 다음을 참조함: Zhao et al., Nat. Biotechnol., 16:258-261 [1998]), 돌연변이 유발PCR(예를 들면, 다음을 참조함: Caldwell et al., PCR Methods Appl., 3:S136-S140 [1994]), 및 카세트 돌연변이유발법(예를 들면, 다음을 참조함: Black et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3525-3529 [1996])을 포함한다.
돌연변이유발법 및 지정 진화 방법은 발현, 스크리닝 및 어세이할 수 있는 변이체 라이브러리를 생성하기 위해 PAL-코딩 폴리뉴클레오티드에 쉽게 적용할 수 있다. 임의의 적합한 돌연변이유발법 및 지정 진화 방법을 본 발명에서 사용하며 당분야에 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,605,793호, 제5,830,721호, 제6,132,970호, 제6,420,175호, 제6,277,638호, 제6,365,408호, 제6,602,986호, 제7,288,375호, 제6,287,861호, 제6,297,053호, 제6,576,467호, 제6,444,468호, 제5,811238호, 제6,117,679호, 제6,165,793호, 제6,180,406호, 제6,291,242호, 제6,995,017호, 제6,395,547호, 제6,506,602호, 제6,519,065호, 제6,506,603호, 제6,413,774호, 제6,573,098호, 제6,323,030호, 제6,344,356호, 제6,372,497호, 제7,868,138호, 제5,834,252호, 제5,928,905호, 제6,489,146호, 제6,096,548호, 제6,387,702호, 제6,391,552호, 제6,358,742호, 제6,482,647호, 제6,335,160호, 제6,653,072호, 제6,355,484호, 제6,03,344호, 제6,319,713호, 제6,613,514호, 제6,455,253호, 제6,579,678호, 제6,586,182호, 제6,406,855호, 제6,946,296호, 제7,534,564호, 제7,776,598호, 제5,837,458호, 제6,391,640호, 제6,309,883호, 제7,105,297호, 제7,795,030호, 제6,326,204호, 제6,251,674호, 제6,716,631호, 제6,528,311호, 제6,287,862호, 제6,335,198호, 제6,352,859호, 제6,379,964호, 제7,148,054호, 제7,629,170호, 제7,620,500호, 제6,365,377호, 제6,358,740호, 제6,406,910호, 제6,413,745호, 제6,436,675호, 제6,961,664호, 제7,430,477호, 제7,873,499호, 제7,702,464호, 제7,783,428호, 제7,747,391호, 제7,747,393호, 제7,751,986호, 제6,376,246호, 제6,426,224호, 제6,423,542호, 제6,479,652호, 제6,319,714호, 제6,521,453호, 제6,368,861호, 제7,421,347호, 제7,058,515호, 제7,024,312호, 제7,620,502호, 제7,853,410호, 제7,957,912호, 제7,904,249호, 및 모든 관련 비US 대응물; Ling et al., Anal. Biochem., 254(2):157-78 [1997]; Dale et al., Meth. Mol. Biol., 57:369-74 [1996]; Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 [1985]; Botstein et al., Science, 229:1193-1201 [1985]; Carter, Biochem. J., 237:1-7 [1986]; Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984]; Wells et al., Gene, 34:315-323 [1985]; Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3:284-290 [1999]; Christians et al., Nat. Biotechnol., 17:259-264 [1999]; Crameri et al., Nature, 391:288-291 [1998]; Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997]; Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:4504-4509 [1997]; Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996]; Stemmer, Nature, 370:389-391 [1994]; Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767; WO 2009/152336, 및 미국 특허 제6,537,746호를 참조하고, 이들 전부를 참조하여 본원에 편입시킴).
일부 실시양태에서, 돌연변이유발 처리 후 얻은 효소 클론은 효소 조제물에 대해 정해진 온도(또는 다른 어세이 조건)를 가하고 열처리 또는 다른 적합한 어세이 조건 후 남은 효소 활성량을 측정하여 스크리닝한다. PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 클론을 이어서 유전자로부터 단리하고, 서열분석하여 뉴클레오티드 변화(있다면)를 확인하며, 숙주 세포에서 효소 발현을 위해 사용한다. 발현 라이브러리로부터 효소 활성의 측정은 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법(예를 들면, 표준 생화학 기술, 예컨대 HPLC 분석법)을 사용해 수행할 수 있다.
기지 서열의 조작된 폴리펩티드의 경우, 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공지된 합성 방법에 따라, 표준 고체상 방법을 통해 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 최대 약 100 염기의 단편을 개별적으로 합성한 후, 연결(예를 들면, 효소 또는 화학 결찰 방법, 또는 폴리머라아제 매개 방법에 의함)하여 임의의 바람직한 연속 서열을 형성시킨다. 예를 들면, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 자동 합성 방법으로 실시되므로, 고전적인 포스포르아미다이트 방법을 사용한 화학 합성으로 제조할 수 있다(예를 들면, 다음의 문헌을 참조함: Beaucage et al., Tet. Lett., 22:1859-69 [1981]; 및 Matthes et al., EMBO J., 3:801-05 [1984]). 포스포르아미다이트 방법에 따라서, 올리고뉴클레오티드를 합성한다(예를 들면, 자동 DNA 합성기에서, 정제, 어닐링, 결찰하고 적절한 벡터로 클로닝함).
따라서, 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드를 제조하는 방법은 (a) 본원에 기술된 바와 같은 임의 변이체의 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 합성하는 단계, 및 (b) 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 PAL 폴리펩티드를 발현시키는 단계를 포함한다. 이 방법의 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 경우에 따라서 하나 또는 몇몇(예를 들면, 최대 3, 4, 5, 또는 최대 10) 아미노산 잔기 결실, 삽입 및/또는 치환을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 경우에 따라 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-15, 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45, 또는 1-50 아미노산 잔기 결실, 삽입, 및/또는 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 경우에 따라 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 30, 35, 40, 45, 또는 50 아미노산 잔기 결실, 삽입 및/또는 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 경우에 따라 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 아미노산 잔기 결실, 삽입 및/또는 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 치환은 보존성 또는 비보존성 치환이다.
발현된 조작된 PAL 폴리펩티드는 제한없이, 본원에 기술된 어세이 및 조건을 포함하는, 당분야에 공지된 임의의 적합한 어세이를 사용해 임의의 바람직한 개선된 특성 또는 특성의 조합(예를 들면, 활성, 선택성, 안정성, 내산성, 프로테아제 감응성 등)에 대해 평가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포에서 발현된 임의의 조작된 PAL 폴리펩티드는 특히, 리소자임 처리, 초음파처리, 여과, 염석, 초원심분리, 및 크로마토그래피를 포함하는, 단백질 정제에 대해 잘알려진 기술 중 어느 하나 이상을 사용해 세포 및/또는 배양 배지로부터 회수된다.
PAL 폴리펩티드의 단리를 위한 크로마토그래피 기술은 특히, 역상 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성-상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 및 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 특정한 효소를 정제하는 조건은 부분적으로, 예컨대 순전하, 소수성, 친수성, 분자량, 분자 형상 등의 인자들에 의존적이고, 당분야의 기술을 갖는 이들에게 자명하다. 일부 실시양태에서, 친화성 기술은 개선된 PAL 효소를 단리하는데 사용될 수 있다. 친화성 크로마토그래피 정제의 경우, 관심 PAL 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 임의의 상체를 사용할 수 있다. 항체의 생산을 위해서, 제한없이, 토끼, 마우스, 래트 등을 포함한, 다양한 숙주 동물이 PAL 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 주사하여 면역화된다. 일부 실시양태에서, PAL 폴리펩티드 또는 단편은 측쇄 작용기 또는 측쇄 작용기에 부착된 링커를 통해, 적합한 담체, 예컨대 BSA에 부착된다.
일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 조작된 PAL 폴리펩티드의 생산에 좋은 조건 하에서 본원에 기술된 바와 같은 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포(예를 들면, 이.콜라이 균주)를 배양하는 단계 및 세포 및/또는 배양 배지로부터 조작된 PAL 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법을 통해 숙주 세포에서 생산된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 1 이상의 조작된 PAL 폴리펩티드를 생산한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 4의 기준 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성, 및 서열번호 4의 아미노산 서열과 최적으로 정렬한 경우 서열번호 4와 비교시 X39; X91; X158; X180; X195; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X307; X308; X326; X349; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X522; X524; 및 X528, 또는 이의 조합에서 선택된 1 이상의 아미노산 잔기 차이를 갖는 조작된 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 박테리아 세포를 조작된 PAL 폴리펩티드의 생산을 가능케하는 적합한 배양 조건 하에서 배양하는 단계, 및 경우에 따라 배양물 및/또는 배양된 박테리아 세포로부터 조작된 PAL 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 조작된 PAL 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 1 이상의 조작된 PAL 폴리펩티드를 생산한다.
일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드를 재조합 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 회수되면, 그들은 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법(들)에 의해 더욱 정제된다. 일부 추가의 실시양태에서, 정제된 PAL 폴리펩티드는 다른 성분 및 화합물과 배합되어 상이한 응용분야 및 용도에 적합한 조작된 PAL 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 제제(예를 들면, 약학 조성물)를 제공한다.
조성물 :
본 발명은 수많은 조성물에서 사용하기 적합한 조작된 PAL 폴리펩티드를 제공한다. 이들 조성물은 제한없이, 약학, 식이/영양 보충물, 식품, 사료, 및 정제 화학 생산물을 포함한, 다양한 분야에서 사용된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 본 발명은 1 이상의 조작된 PAL 변이체 및/또는 1 이상의 PAL 변이체를 코딩하는 1 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 식품 및/또는 사료를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 1 이상의 조작된 PAL 변이체를 포함하는 음료를 제공한다.
일부 실시양태에서, 식품, 사료, 및/또는 영양/식이 보충물 내 조작된 PAL 변이체는 글리코실화된다. 게다가, 조작된 PAL 변이체는 임의의 적합한 식용 효소 전달 매트리스에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 변이체는 변이체의 섭취시 동물의 소화관 내에서 PAL 변이체의 신속한 분산을 위해 디자인된 식용 효소 전달 매트릭스에 존재한다.
본 발명은 또한 정제 화학물 및 다른 산업적 중요 화합물의 생산에서 사용하기 적합한 조작된 PAL 폴리펩티드를 제공한다(예를 들면, 미국 특허 출원 제2013/0340119호, 제2013/0005012호, 및 제2005/0260724호, 및 WO 2012/122333을 참조함).
약학 및 다른 조성물
본 발명은 약학 및 다른 조성물, 예컨대 식이/영양 보충제에서 사용하기 적합한 조작된 PAL 폴리펩티드를 제공한다.
투여 방식에 의존적으로, 본 발명에 따른 조작된 PAL의 치료 유효량을 포함하는 조성물은 고상, 반고상, 또는 액상 형태이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 다른 약학적으로 허용가능한 성분 예컨대 희석제, 완충제, 부형제, 염, 유화제, 보존제, 안정화제, 충전제, 및 다른 성분들을 포함한다. 제제 및 투여 기술에 대한 상세사항은 당분야에 공지되어 있고 문헌에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 경구 약학 조성물로 사용하도록 제제화된다. 조작된 PAL 폴리펩티드를 전달하는데 사용하기 위한 임의의 적합한 형태는 제한없이, 알약, 정제, 겔 탭, 캡슐, 로젠지, 당의정, 분말, 연질겔, 졸-겔, 겔, 에멀션, 임플란트, 팻치, 스프레이, 연고, 도찰제, 크림, 베이스트, 젤리, 페이트, 에어로조, 츄잉검, 완화제, 스틱, 현탁제(제한없이, 유성계 현탁물, 수중유 에멀션 등), 슬러리, 시럽, 제어 방출 제제, 좌제 등을 포함하여, 본 발명에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 주사에 적합한 형태(즉, 주사가능 제제)로 제공된다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 실리카계(예를 들면, 옥시실란) 졸-겔을 포함하여, 졸-겔과 같은 생체적합성 매트릭스로 제공된다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 캡슐화된다. 일부 대안적인 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 나노구조물(예를 들면, 나노튜브, 나노세관, 나노캡슐, 미세캡슐, 미세구, 리포솜 등)에 캡슐화된다. 실제로, 본 발명은 임의의 특정 전달 제제 및/또는 전달 수단에 국한시키려는 의도가 없다. 조작된 폴리펩티드는 제한없이, 비경구, 경구, 국소, 경피, 비내, 안내, 척추강내, 임플란트 등을 포함하여, 당분야에 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 투여하고자 한다.
일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 글리코실화, PEG화(즉, 폴리에틸렌 글리콜[PEG] 또는 활성화된 PEG 등에 의한 개질) 또는 다른 화합물(예를 들면, 다음을 참조함: Ikeda, Amino Acids 29:283-287 [2005]; 미국 특허 제7,531,341호, 제7,534,595호, 제7,560,263호, 및 제7,53,653호; 미국 공개 특허 출원 제2013/0039898호, 제2012/0177722호 등)에 의해 화학적으로 개질된다. 실제로, 본 발명을 임의의 특정 전달 방식 및/또는 기전에 국한시키려는 의도가 없다.
일부 추가의 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 매트릭스-안정화 효소 결정을 포함하는 제제로 제공된다. 일부 실시양태에서, 제제는 가교된 결정성의 조작된 PAL 효소 및 효소 결정에 부착된 반응성 모이어티를 갖는 중합체를 포함한다. 본 발명은 또한 중합체 내 조작된 PAL 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 PAL 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 제한없이, 당(예를 들면, 락토스, 수크로스, 만니톨, 및/또는 솔비톨), 전분(예를 들면, 옥수수, 밀, 쌀, 감자, 또는 다른 식물성 전분), 셀룰로스(예를 들면, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로서, 나트륨 카르복시-메틸셀룰로스), 검(예를 들면, 아라빅, 트라가칸트, 구아 등), 및/또는 단백질(예를 들면, 젤라틴, 콜라겐 등)을 포함하여, 1 이상의 통용되는 담체 화합물을 포함한다. 경구 제제 내 추가 성분은 착색제 및 또는 감미제(예를 들면, 포도당, 수크로스, 및 만니톨), 및 윤활제(예를 들면, 스테아르산마그네슘)를 비롯하여 장용성 코팅(예를 들면, 메타크릴레이트 중합체, 히드록실 프로필 메틸 셀룰로스 프탈레이트, 및/또는 당분야에 공지된 임의의 적합한 장용성 제피)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 붕해제 또는 가용화제가 포함된다(예를 들면, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 알긴산, 또는 이의 염, 예컨대 알긴산나트륨). 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 특히 액상 제제에서, 제한없이 보존제, 현탁제, 증점제, 습윤제, 알콜, 지방산, 및/또는 유화제를 포함하여, 다양한 추가 성분들과 배합된다.
일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 특히 액상 제제에서, 제한없이 보존제, 현탁제, 증점제, 습윤제, 알콜, 지방산, 및/또는 유화제를 포함하여, 다양한 추가 성분과 배합된다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 제한없이, KUVAN® 테트라히드로비옵테린(BioMarin Pharmaceutical, Inc., Novato, CA), 안타시드(예를 들면, 오메프라졸, 에소메프라졸 및 다른 프라졸)와 임의의 다른 적합한 화합물을 포함하여, PKU의 치료에서 사용되는 다른 화합물과 병용하여 피험체에 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 유체 예컨대 혈액, 뇌척수액 등에서 페닐알라닌의 농도를 감소시키는데 사용하기 적합한 조작된 PAL 폴리펩티드를 제공한다. 동물에 투여되는 조작된 PAL 폴리펩티드(들)의 투여량은 병태 또는 질환, 동물의 전반적인 상태, 및 당분야에 공지된 다른 인자들에 따라 좌우된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 동물에 단일 또는 복수 투여하고자 한다. 일부 실시양태에서, 동물(예를 들면, PKU가 있는 인간)에 투여되는 조성물(들) 중 조작된 PAL 폴리펩티드(들)의 농도는 질환(예를 들면, PKU 및/또는 PKU-관련 병태, 질환 및/또는 증상)을 효과적으로 치료, 완화 및/도는 예방하는데 충분한 것을 고려하고, 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 다른 약학 및/또는 식이 조성물과 병용하여 투여된다.
산업적 조성물
본 발명의 조작된 PAL 폴리펩티드는 산업적 조성물에서 사용되는 것을 고려한다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 식품 및/또는 사료 산업에서 사용하도록 제제화된다. 일부 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 동물 사료 성분 예컨대 추가 효소(예를 들면, 셀룰라아제, 라카아제 및 아밀라아제)와 혼합된 과립형 또는 펠렛형 제품으로 제제화된다. 일부 대안적인 실시양태에서, 조작된 PAL 폴리펩티드는 액상 동물 사료 조성물(예를 들면, 수성계 또는 유성계 슬러리)에서 사용된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 PAL 변이체는 펠렛 및 다른 가공 사료/식품을 생산하는데 사용되는 처리를 견디도록 충분히 열내성 및 열안정성이다.
본 발명의 조작된 PAL 변이체는 또한 페닐알라닌 및/또는 페닐알라닌 유도체의 생산에서 사용된다.
본 발명의 전술한 측면 및 다른 측면들은 이하의 비제한적인 실시예와 연결하여 보다 더 이해할 수 있을 것이다. 실시예들은 단지 예시 목적으로 제공되며 임의의 방식으로 본 발명의 범주를 제한하려는 의도가 아니다.
실험
실험 및 획득한 결과를 포함하여, 다음의 실시예는 오직 예시적인 목적으로 제공되며 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.
이하의 실험 내용에서, 다음의 약어들이 적용된다: ppm(백만분율); M(몰랄); mM(밀리몰랄), uM 및 μM(마이크로몰랄); nM(나노몰랄); mol(몰); gm 및 g(그램); mg(밀리그램); ug 및 ㎍(마이크로그램); L 및 ℓ(리터); ㎖ 및 mL(밀리리터); cm(센티미터); mm(밀리미터); um 및 ㎛(마이크로미터); sec.(초); min(s)(분(들)); h(s) 및 hr(s)(시간(들)); U(유닛); MW(분자량); rpm(분당 회전수); psi 및 PSI(평방 인치당 파운드); ℃(섭씨도); RT 및 rt(실온); CDS(코딩 서열); DNA(데옥시리보핵산); RNA(리보핵산); 이. 콜라이 W3110(미국, 코네티컷, 뉴해븐 소재 콜라이 유전자 스톡 센터([CGSC]에서 입수한, 통용되는 실험실 이. 콜라이 균주); HTP(고수율); HPLC(고압 액상 크로마토그래피); CFSE(카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르); IPTG(이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드); PES(폴리에테르설폰); PHE 및 phe(페닐알라닌); BSA(소혈청 알부민); PBMC(말초 혈액 단핵 세포); PKU(페닐케톤뇨증); MHC(주요 조직적합성 복합체); HLA(인간 백혈구 항원); HLA-DR(염색체 #6 상의 HLA 복합체에 의해 코딩되는 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체); FIOPC(양성 대조군 대비 배수 향상); LB(루리아 액체배지); Athens Research(Athens Research Technology, Athens, GA); ProSpec(ProSpec Tany Technogene, East Brunswick, NJ); Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); Ram Scientific(Ram Scientific, Inc., Yonkers, NY); Pall Corp.(Pall, Corp., Pt. Washington, NY); Millipore(Millipore, Corp., Billerica MA); Difco(Difco Laboratories, BD Diagnostic Systems, Detroit, MI); Molecular Devices(Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA); Kuhner(Adolf Kuhner, AG, Basel, Switzerland); Cambridge Isotope Laboratories,(Cambridge Isotope Laboratories, Inc., Tewksbury, MA); Applied Biosystems(Applied Biosystems, part of Life Technologies, Corp., Grand Island, NY), Agilent(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA); Thermo Scientific(Thermo Fisher Scientific의 일부, Waltham, MA); Corning(Corning, Inc., Palo Alto, CA); Constant Systems(Constant Systems Ltd., Daventry, United Kingdom); Megazyme(Megazyme International, Wicklow, Ireland); Enzo(Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY); GE Healthcare(GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ); Harlan(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN); AB Sciex(AB Sciex, Framingham, MA); 및 Bio-Rad(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
다음의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 본 발명에서 사용한다. 일부 경우(이하 도시된 바와 같음)에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 코딩된 폴리펩티드가 후속된다.
pET16b-AvPAL 발현 벡터의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 1):
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
AvPAL ORF의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 2):
Figure pct00005
WT AvPAL의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 3):
Figure pct00006
Figure pct00007
WT AvPAL의 폴리펩티드 서열(서열번호 4):
Figure pct00008
AvPAL 변이체 No. 30의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 5):
Figure pct00009
Figure pct00010
AvPAL 변이체 No. 30의 폴리펩티드 서열(서열번호 6):
Figure pct00011
AvPAL 변이체 No. 22의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 7):
Figure pct00012
Figure pct00013
AvPAL 변이체 No. 22의 폴리펩티드 서열(서열번호 8):
Figure pct00014
AvPAL 변이체 No. 36의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 9):
Figure pct00015
Figure pct00016
AvPAL 변이체 No. 36의 폴리펩티드 서열(서열번호 10):
Figure pct00017
AvPAL 변이체 No. 42의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 11):
Figure pct00018
Figure pct00019
AvPAL 변이체 No. 42의 폴리펩티드 서열(서열번호 12):
Figure pct00020
AvPAL 변이체 No. 43의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 13):
Figure pct00021
Figure pct00022
AvPAL 변이체 No. 43의 폴리펩티드 서열(서열번호 14):
Figure pct00023
AvPAL 변이체 No. 1002의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 15):
Figure pct00024
AvPAL 변이체 No. 1002의 폴리펩티드 서열(서열번호 16):
Figure pct00025
AvPAL 변이체 No. 1008의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 17):
Figure pct00026
AvPAL 변이체 No. 1008의 폴리펩티드 서열(서열번호 18):
Figure pct00027
Figure pct00028
AvPAL 변이체 No. 1009의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 19):
Figure pct00029
AvPAL 변이체 No. 1009의 폴리펩티드 서열(서열번호 20):
Figure pct00030
AvPAL 변이체 No. 1010의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 21):
Figure pct00031
AvPAL 변이체 No. 1010의 폴리펩티드 서열(서열번호 22):
Figure pct00032
AvPAL 변이체 No. 1084의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 23):
Figure pct00033
Figure pct00034
AvPAL 변이체 No. 1084의 폴리펩티드 서열(서열번호 24):
Figure pct00035
AvPAL 변이체 No. 967의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 25):
Figure pct00036
Figure pct00037
변이체 No. 967의 폴리펩티드 서열(서열번호 26):
Figure pct00038
발현 벡터 pCK100900i:
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
실시예 1
PAL 유전자 획득 및 발현 벡터의 구축
아나바에나 바리아빌리스 페닐알라닌 암모니아 리아제(AvPAL) 플라스미드 DNA를 입수하였고 AvPAL을 코딩하는 합성 유전자는 이. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화시켜서 이. 콜라이 발현 벡터 pET16b로 클로닝하여 pET16b-AvPAL(서열번호 1)을 제공하였다. AvPAL 오픈 리딩 프레임(서열번호 2)은 올리고뉴클레오티드: PAL-pCK-F 및 PAL-pCK-R을 사용한 PCR을 통해 증폭시키고 발현 벡터 pCK100900i에 서브클로닝하였다(서열번호 27).
Figure pct00042
이 플라스미드 구성체를 W3110에서 유래된 이. 콜라이 균주에 형질전환시켰다. 당분야의 숙련가에게 일반적으로 알려져 있는 유도 진화법을 사용해 이 플라스미드 구성체로부터 유전자 변이체의 라이브러리를 생성시켰다(예를 들면, 미국 특허 제8,383,346호 및 WO2010/144103 참조).
실시예 2
고수율(HTP) 성장 및 어세이
PAL 및 PAL 변이체의 고수율(HTP) 성장
형질전환된 이. 콜라이 세포를 1% 포도당 및 30 ㎍/mL 클로람페니콜을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 플레이팅하여 선별하였다. 37℃에서 밤새 항온배양한 후, 콜로니를 NUNC™(Thermo-Scientific)의 1% 포도당 및 30 ㎍/mL 클로람페니콜이 보충된 180 ㎕/웰 LB가 채워진 96웰 얕은 평면 바닥 플레이트의 웰에 위치시켰다. 배양물을 진탕기(200 rpm, 30℃, 및 85% 상대 습도; Kuhner)에서 18-20시간 동안 밤새 성장시켰다.
밤샘 성장 샘플(20 ㎕)을 30 ㎍/mL 클로람페니콜이 보충된 380 ㎕의 테리픽 액체 배지가 채워진 Costar 96웰 깊은 플레이트로 옮겼다. 이 플레이트를 진탕기(250 rpm, 30℃, 및 85% 상대 습도; Kuhner)에서 135분간 항온배양시켰다. 이어서 세포를 40 ㎕의 멸균수 중 10 mM IPTG로 유도시키고 진탕기(250 rpm, 30℃, 및 85% 상대 습도; Kuhner)에서 20-24시간 동안 밤새 항온배양시켰다. 2개의 복제 배양물을 배합하고, 세포를 펠렛화(4000 rpm x 20분)시키고, 상등액을 버렸으며, 세 포를 분석 전까지 -80℃에 냉동시켰다.
HTP 펠렛의 용균
먼저 500 ㎕의 용균 완충액(20 mM Tris pH 7.5, 1 mM MgSO4, 1 ㎎/㎖ 리소자임, 및 0.5 ㎎/㎖ 폴리믹신 B 설페이트)을 세포 펠렛에 부가하였다. 혼합물을 실온에서 1.5 시간 동안 교반하고, 본원에 기술된 다양한 HTP 어세이에서 정화된 용균물을 사용하기 전에 펠렛화(4000 rpm x 5분)하였다. SDS-PAGE를 통한 이들 용균물의 분석은 PAL의 예상 MW와 일관되게, ∼60 kDa의 명확한 MW에서 과발현된 단백질의 존재를 확인시켜주었다.
정화된 용균물의 분석
PAL 변이체 활성은 시간 경과에 따라 290 nm에서의 흡광도 변화를 통해 측정된 신남산 형성을 측정하여 결정하였다. 이러한 어세이를 위해서, 100 ㎕의 200 mM Tris/50 mM 페닐알라닌, pH 7.5, 또는 200mM 인산나트륨/50mM 페닐알라닌 pH 7.0, 80 ㎕의 물, 및 20 ㎕의 정화된 용균물을 폴리아크릴레이트 96웰 플레이트(Costar #3635, Corning)의 웰에 부가하였다. 반응물을 간단히 혼합하고 SpectraMax® Plus384 또는 SpectraMax® 190(Molecular Devices) 흡광 마이크로플레이트 판독기를 이용해 시간 경과(5-20분간 12-20초 마다)에 따라 290 nm에서 흡광도를 추적하여 결정하였다.
프로테아제 사전처리된 정화 용균물의 HTP-분석
하부 장의 환경을 모방하기 위해 키모트립신 및 트립신으로 PAL 변이체를 공격하였다. 먼저, 30 ㎕의 프로테아제 믹스(0.01 - 100 ㎎/㎖ 키모트립신(C4129 Sigma Aldrich), 0.01 - 100 ㎎/㎖ 트립신(T7409 Sigma Aldrich), 1 mM CaCl2, 및 1 mM HCl), 0 - 30 ㎕의 500 mM 인산나트륨 pH 7.0 중 20 mM 나트륨 타우로콜레이트, 및 90 - 120 ㎕의 정화 용균물을 96웰 둥근 바닥 플레이트(Costar #3798, Corning)의 웰에 부가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 분석 전에 1시간 동안 37℃, 400 rpm, 1" 쓰로우에서 항온반응시켰다. 어세이를 위해서, 100 ㎕의 200 mM Tris/50 mM 페닐알라닌 pH 7.5 또는 200 mM 인산나트륨/50 mM 페닐알라닌 pH 7.0 및 100 ㎕의 프로테아제 처리된 용균물을 폴리아크릴레이트 96웰 플레이트(Costar #3635, Corning)의 웰에 부가하였다. 반응물을 간단히 혼합하였고, 활성은 SpectraMax® Plus384 또는 SpectraMax® 190(Molecular Devices) 흡광 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 시간 경과(5-20분간 12-20초 마다)에 따라 290 nm에서 흡광도를 추적하여 결정하였다. 결과는 하기 표에 제공한다.
산으로 사전처리된 정화 용균물의 HTP-분석
이 어세이에서, 위의 환경을 모방하기 위해서, 산성 조건 하에서 PAL 변이체를 공격하였다. 먼저, 20 ㎕의 1 M 시트르산나트륨(pH 3.7-4.5 ) 및 30 ㎕의 물 또는 50 ㎕의 400 mM 시트르산나트륨 pH 3.7-4.8, 및 50 ㎕의 정화된 용균물을 96웰 둥근 바닥 플레이트(Costar #3798, Corning)의 웰에 부가하였다. 플레이트를 밀봉하고 분석 전에 1시간 동안 37℃, 400 rpm, 1" 쓰로우에서 항온반응시켰다. 어세이를 위해서, 100 ㎕의 200 mM Tris, 50 mM 페닐알라닌 pH 7.5 및 80 ㎕의 1 M Tris pH 7.5 또는 200 mM 인산나트륨/50 mM 페닐알라닌 pH 7.0 및 80 ㎕의 1.0 M 인산나트륨 pH 7.0, 및 20 ㎕의 산처리된 용균물을 폴리아크릴레이트 96웰 플레이트(Costar #3635, Corning)의 웰에 부가하였다. 반응물을 간단히 혼합하였고 활성은 SpectraMax® Plus384 또는 SpectraMax® 190(Molecular Devices) 흡광 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 시간 경과(5-20분간 12-20초 마다)에 따라 290 nm에서 흡광도를 추적하여 결정하였다.
펩신으로 사전처리된 정화 용균물의 HTP 분석
추가의 어세이에서, 위 환경을 모방하는 조건 하에서 변이체를 더욱 조사하기 위해 펩신 및 산성 조건으로 PAL 변이체를 공격하였다. 먼저, 400 mM 시트르산나트륨 pH 1.5-4 중 50 ㎕의 0.01-100 ㎎/㎖ 펩신, 및 50 ㎕의 정화 용균물을 96웰 둥근 바닥 플레이트(Costar #3798, Corning)의 웰에 부가하였다. 플레이트를 밀봉하였고 분석 전에 1-12시간 동안 37℃, 400 rpm, 1" 쓰로우에서 항온반응시켰다. 어세이를 위해서, 100 ㎕의 200 mM Tris/50 mM 페닐알라닌 pH 7.5 및 80 ㎕의 1 M Tris pH 7.5 또는 200 mM 인산나트륨/50 mM 페닐알라닌 pH 7.0, 및 20 ㎕의 산처리된 용균물을 폴리아크릴레이트 96웰 플레이트(Costar #3635, Corning)의 웰에 부가하였다. 반응물을 간단히 혼합하고, 활성은 SpectraMax® Plus384 또는 SpectraMax® 190(Molecular Devices) 흡광 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 시간 경과(5-20분간 12-20초 마다)에 따라 290 nm에서 흡광도를 추적하여 결정하였다.
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
실시예 3
PAL 변이체의 단백질 응집을 측정하기 위한 어세이
응집되는 PAL 변이체의 경향은 제조하의 지시에 따라서, ProteoStat® 단백질 응집 어세이 키트(Enzo)를 사용해 측정하였다. 간단히, 0-100 μM의 정제된 PAL을 ProteoStat® 검출 시약(1:2000)과 혼합하고 유세포측정을 통해 분석하였다. 샘플은 당분야에 공지된 바와 같이, ProteoStat® 응집 표준과 일관되게, 형광발광성에 대해 평가하였다(다음의 문헌을 참조함: Bershtein et al., Mol.Cell,, 133-144 [2013]).
실시예 4
진탕 플라스크(SF) 배양물 유래의 동결건조 용균물
상기 기술된 대로 성장시킨 선별된 HTP 배양물을 1% 포도당 및 30 ㎍/mL 클로람페니콜이 있는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅하고 밤새 37℃에서 성장시켰다. 각 배양물로부터 단일 콜로니를 50 ㎖의 1% 포도당 및 30 ㎍/mL 클로람페니콜이 있는 LB로 옮겼다. 18시간 동안 30℃, 250 rpm에서 배양물을 성장시키고 최종 OD600이 0.2가 되도록 30 ㎍/mL의 클로람페니콜이 있는 250 ㎖의 테리픽 액체 배지에서 대략 1:10으로 희석하여 서브배양하였다. 이 배양물을 135분간 30℃, 250 rpm에서 OD600가 0.6이 될때까지 항온배양하고 1 mM의 IPTG로 유도시켰다. 유도된 배양물을 20시간 동안 30℃, 250 rpm에서 항온배양시켰다. 항온배양 기간 후, 배양물을 4000 rpm x 10분으로 원심분리하였다. 상등액을 버리고 펠렛을 30 ㎖의 50 mM 인산나트륨 pH 7.5에 재현탁시켰다. 세포를 펠렛화(4000 rpm x 10분)시키고 12 ㎖의 50 mM 인산나트륨 pH 7.5에 재현탁시키고 17,000 psi에서 원 샷 세포 파쇄 시스템(Constant Systems)을 사용해 용균시켰다. 용균물을 펠렛화(10,000 rpm x 30분)하고 상등액을 냉동 및 동결건조시켜서 효소 함유 분말을 생성시켰다.
진탕 플라스크 배양으로부터 PAL의 정제
PAL 변이체 No. 42를 상기 기술된 대로 포화까지 진탕 플라스크에서 성장시켰다. 포화된 배양물을 원심분리(4000 rpm x 20분)를 통해 펠렛화하고 세포 펠렛을 정제 전까지 -80℃에서 저장하였다. 세포 펠렛을 실온에서 해동하고 5 mL의 완충액 중 25 mM Tris, pH 8과 130 mM NaCl/세포 g에 재현탁시켰다. 샘플 슬러리는 110 psi의 압력 설정된 미세유동화기를 사용해 용균시켰다. 얻어진 용균물을 1시간 동안 10,000 rpm에서 원심분리하여 정화시킨 후, 0.2 ㎛ PES 필터(Millipore)를 통해 여과시켰다.
여과 후, 얻어진 용균물을 10 mM Phe 존재 또는 부재하에 1.5 내지 2시간 동안 70-85℃에서 가열하였다. 용균물에서 열을 제거하고 10,000 rpm에 4℃에서 1시간 동안 원심분리를 통해 정화시켰다. 가용성 PAL을 함유하는 상등액을 이어서 크로마토그래피 컬럼에 적재하기 전에 0.2 ㎛ PES 필터를 통해 여과시켰다.
80 - 100 ㎎의 총 단백질을 함유하는, 열 처리, 여과된 용균물을 25 mM Tris, pH 8과 1.2 M 황산암모늄을 사용해 2배로 희석시켰다. 샘플을 25 mM Tris, pH 8과 0.6 M 황산암모늄으로 사전평형화시킨 HiPrep 16/10 페닐 FF(hi sub) 컬럼(GE Healthcare) 상에 적재시켰다. 샘플을 적재 후, 컬럼을 동일 완충액의 3배 컬럼 부피로 세척한 후, 1 컬럼 부피로 25 mM Tris, pH 8 중 0.6 M - 0 M 황산암모늄의 선형 농도 구배를 후속하였다. 단단하게 결합된 PAL을 3배 컬럼 부피의 등용매 용리를 사용해 컬럼에서 용리시켰다. 활성 및 순수 PAL을 함유하는 분획을 모았다.
페닐 컬럼으로부터 정제된 PAL을 0.5 M Tris, pH 8.5로 완충액 교환시키고 농축시켰다. 농축된 PAL을 SDS-PAGE를 통해 분석하고 ∼60 kDa에서 밴드의 존재를 확인하였다. 정제된 PAL 샘플을 0.45 ㎛ PES 필터를 사용해 여과하고 사용 준비까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 5
정제된 PAL 및 PAL 변이체의 특징규명
이 실시예에서는, 야생형 및 변이체 PAL을 특징규명하기 위해 수행된 어세이를 기술한다.
산성 pH에 대한 내성 :
PAL 변이체를 함유하는 동결건조 분말을 20 mM 인산나트륨 pH 7.0에 2 g/L로 용해시켰다. 다음으로, 50 ㎕의 효소 용액을 50 ㎕의 400 mM 시트르산(pH 4.0-5.2) 또는 100 mM 인산나트륨과 혼합하고 반응물을 37℃에서 1시간 동안 400 rpm(1" 쓰로우)에서 항온반응시켰다. 이어서, 20 ㎕의 용액을 간단히 80 ㎕의 1 M 인산나트륨 pH 7.0 및 100 ㎕의 200 mM Tris/50 mM 페닐알라닌 pH 7.5와 혼합하였다. 산성 조건 하에서 효소 활성은 SpectraMax® Plus384 또는 SpectraMax® 190(Molecular Devices) 흡광 마이크로플레이트 판독시를 사용해 시간 경과(5-20분간 12-20초 마다)에 따라 290 nm에서 흡광도를 추적하여 결정하였다. 결과를 도 2에 도시하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 변이체 No. 30 및 36은 야생형 PAL과 비교하여 대략 4 내지 4.8의 pH에서 항온반응시킨 후에 보다 더 활성을 유지하였다.
K M 의 측정 :
변이체 PAL 내 돌연변이가 페닐알라닌에 대한 PAL 변이체의 친화성을 변경시켰는지 여부를 평가하기 위해서, 야생형 효소 및 변이체 36에 대한 미카엘리스 상수를 측정하였다. 먼저 100 ㎕의 100 mM Tris pH 8.0 중 15 ㎍/mL PAL, 및 100 ㎕의 100 mM Tris, pH 8.0 중 0-32 mM 페닐알라닌을 폴리아크릴레이트 96웰 플레이트(Costar #3625, Corning)의 웰에 부가하였다. 반응물을 간단히 혼합하였고, 초기 속도는 SpectraMax® Plus384 또는 SpectraMax® 190(Molecular Devices) 흡광 마이크로플레이트 판독기를 사용해 시간 경과(5-20분간 12-20초 마다)에 따라 290 nm에서 흡광도를 추적하여 결정하였다. 각 시험된 PAL 변이체에 대한 K M은 당분야에 공지된, 라인웨버-벌크 식에 데이타를 적합화시켜 결정하였다. 결과를 도 3에 도시하였다. 도시된 바와 같이, K M은 야생형 효소에 대해 74 μM이고 변이체 36에 대해 60 μM이었다.
아미노산 특이성 :
일부 페닐알라닌 암모니아 리아제는 페닐알라닌 이외에도 티로신 및/또는 히스티딘에 대한 활성이 검증되었다. PAL 변이체에 존재하는 돌연변이가 페닐알라닌에 대한 PAL 변이체의 특이성을 변경시켰는지 여부를 평가하기 위해서, 이들 3종 아미노산에 대한 야생형 효소 및 변이체 36의 활성을 평가하였다. 우선, 100 ㎕의 10 mM 인산나트륨 pH 7.0 중 5 g/L의 PAL-함유 동결건조 분말, 및 100 ㎕의 200 mM 인산나트륨 pH 7.5 중 50 mM 페닐알라닌 또는 히스티딘 또는 2.5 mM 티로신을 폴리아크릴레이트 96웰 플레이트(Costar #3635, Corning)의 웰에 부가하였다. 용액을 간단히 혼합하고 초기 속도는 SpectraMax® Plus384 또는 SpectraMax® 190(Molecular Devices) 흡광 마이크로플레이트 판독기를 사용해 시간 경과(5-20분 간 12-20초 마다)에 따라 290 nm에서 흡광도를 추적하여 결정하였다. 결과를 도 4에 도시하였다. 표시된 바와 같이, 히스티딘 또는 티로신을 사용시 WT 효소 또는 변이체 No.36에 대해 검출가능한 활성이 관찰되지 않아서, 이들 효소가 페닐알라닌에 특이적임을 시사하였다.
돼지 및 소 프로테아제에 대한 내성 :
실시예 4에 기술된 바와 같이 준비한 PAL 변이체 샘플을 2 g/L로 100 mM 인산나트륨 pH 7.0에 용해시켰다. 돼지 트립신 및 소 키모트립신(각각 100 mg)을 2 ㎖의 100 mM 인산나트륨 pH 7.0에 용해시키고, 100 mM 인산나트륨에 2배씩 11회 연속 희석하였다. 다음으로, 80 ㎕의 PAL 변이체 효소 용액을 20 ㎕의 트립신 및 키모트립신 용액과 혼합하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 400 rpm(1" 쓰로우)에서 항온반응시켰다. 이어서, 20 ㎕의 반응물을 80 ㎕의 물 및 100 ㎕의 100 mM 인산나트륨, 50 mM 페닐알라닌 pH 7.0과 혼합하였다. 각 용액을 간단히 혼합하고, 활성은 SpectraMax® Plus384 또는 SpectraMax® 190(Molecular Devices) 흡광 마이크로플레이트 판독기를 사용해 시간 경과(5-20분간 12-20초 마다)에 따라 290 nm에서 흡광도를 추적하여 결정하였다. 결과를 도 2에 도시하였다. 이 도면에 나타낸 바와 같이, 모든 시험한 변이체는 야생형 PAL과 비교시, 개선된 프로테아제 내성을 보였고, 변이체 No.36이 단백질분해에 대해 최고로 안정하였다.
인간 프로테아제에 대한 내성 :
상기 기술된 바와 같이, 일부 진화된 PAL 변이체를 돼지 트립신 및 소 키모트립신에 대해 스크리닝하여 위장관에 존재하는 효소에 의한 단백질분해에 대한 그들의 내성을 평가하였다. 진화된 PAL 변이체 중 일부를 또한 인간 효소를 사용하여 시험하여서, 돼지 또는 소 효소의 인간 상동체에 대해 그들이 내성임을 확인하였다. 이들 어세이에서, WT PAL 및 변이체 No. 36의 동결건조 분말(100 mM 인산나트륨, pH 7.0 중 2.4 g/L)을 37℃에서 2시간 동안 인간 키모트립신(Athens Research) 0-80 BTEE 유닛/㎖ 또는 인간 트립신(ProSpec)(0-10,000 BAEE 유닛/㎖)과 항온반응시켰다. 다음으로, 100 ㎕의 혼합물을 폴리아크릴레이트 96웰 플레이트(Costar #3635, Corning)의 웰에 부가한 후, 100 ㎕의 50 mM 페닐알라닌, 200 mM 인산나트륨 pH 7.0을 부가하였다. 용액을 간단히 혼합하였고, 초기 속도는 SpectraMax® Plus384 또는 SpectraMax® 190(Molecular Devices) 흡광 마이크로플레이트 판독기를 사용해 시간 경과(5-20분간 12-20초 마다)에 따라 290 nm에서 흡광도를 추적하여 결정하였다. 결과를 도 5에 도시하였다. 도 5에 도시한 바와 같이, 변이체 No.36은 야생형 PAL 효소 보다 더욱 안정하였다.
미정제 췌장 추출물에 대한 내성 :
진화된 PAL 변이체를 또한 췌장 효소에 대한 그들의 내성을 측정하기 위해 시험하였다. WT PAL, 변이체 No. 36, 변이체 No. 42, 및 변이체 No. 43의 동결건조 분말(실시예 4에 기술한 바와 같이 준비; 50 mM 인산칼륨 pH 6.8 중 12 g/L)을 돼지 판크레아틴(4x Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)과 1:1로 혼합하고, 최대 23시간 동안 진탕(400 rpm, 1" 쓰로우)하면서, 37℃에서 항온반응시켰다. 표시된 시점에, 10 ㎕의 반응 분취액을 폴리아크릴레이트 96웰 플레이트(Costar #3635, Corning) 중 190 ㎕의 50 mM 페닐알라닌, 190 mM 인산나트륨 pH 7.0에 부가하였다. 용액을 간단히 혼합하였고, 초기 속도는 SpectraMax® Plus384 또는 SpectraMax® 190(Molecular Devices) 흡광 마이크로플레이트 판독기를 사용해 시간 경과(5-20분간 12-20초 마다)에 따라 290 nm에서 흡광도를 추적하여 결정하였다. 결과를 도 6에 도시하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 변이체 No.36, 변이체 No.42, 및 변이체 No.43은 모두 야생형 PAL 효소와 비교하여, 이들 어세이 조건 하에서 유의한 안정성을 보였다.
장내 세제의 영향 :
진화된 PAL 변이체를 또한 장내 담즙산 및 지방산의 존재 또는 부재 하에서 단백질분해에 대한 그들의 감수성을 평가하여, 이들 산이 그들의 안정성에 영향을 미치는지 여부를 평가하였다. 변이체 No.36을 함유하는 동결건조 분말(실시예 4에 기술된 바와 같이 제조)을 50 ㎍/mL로 0-16 mM 나트륨 타우로콜레이트, 100 mM 인산나트륨, pH 7.0에 용해시켰다. 돼지 트립신 및 소 키모트립신(각각 80 mg)을 2 ㎖의 100 mM 인산나트륨 pH 7.0에 용해시키고, 100 mM 인산나트륨에 2배씩 11회 연속 희석하였다. 어세이를 위해서, 50 ㎕의 PAL 용액을 50 ㎕의 프로테아제 용액과 혼합하였다. 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 400 rpm(1" 쓰로우)에서 항온반응시켰다. 다음으로, 50 ㎕의 혼합물을 150 ㎕의 200 mM 인산나트륨, 50 mM 페닐알라닌 pH 7.0과 혼합하였다. 각각의 반응물을 간단히 혼합하였고, 활성은 SpectraMax® Plus384 또는 SpectraMax® 190(Molecular Devices) 흡광 마이크로플레이트 판독기를 사용해 시간 경과(5-20분간 12-20초 마다)에 따라 290 nm에서 흡광도를 추적하여 결정하였다. 결과는 도 7에 도시하였다. 이 도면에 도시한 바와 같이, 추가적인 나트륨 타우로콜레이트는 단백질분해에 대한 변이체 No.36의 감수성을 증가시켰다.
실시예 6
변이체 PAL의 장내 안정성
PAL 변이체가 동물 소화관을 통해 수송됨에 따른 그들의 활성 및 안정성을 평가하기 위해서, 마우스를 정제된 효소 변이체로 위관영양시켰다. 10-12주령인 체중 20-26 g의 건강한 C57Bl/6 마우스를 물질대사 케이지에서 유지시키고 15시간 동안 단식시켰다. 물은 임의로 제공하였다. 밤샘 단식 후, 동물들을 0.3 mL의 0.5 M Tris-HCl pH 8.5, 및 0.5 M Tris-HCl pH 8.5 중 8 ㎎/㎖, WT PAL(실시예 4에 기술된 대로 제조) 또는 0.5 M Tris-HCl pH 8.5 중 8 ㎎/㎖ 변이체 No.42(실시예 4에 기술된 대로 제조)의 혼합물이 있는 21-게이지 위관영양 바늘을 사용해 위관영양시켰다. 위관영양 후 0.5, 2, 또는 6시간에, 동물을 참수시키고, 그린-탑 모세 혈관 수집관(Ram Scientific)을 사용해 혈장을 채취하였고, 위, 십이지장(위로부터 ∼1-8 cm), 공장(위로부터 ∼10-18 cm), 회장(맹장 위 ∼8 cm), 및 결장(맹장 아래 ∼5 cm)의 내용물을 수집하였다. 이들 내용물의 중량을 기록하였고, 내용물을 분석 전에 -80℃에 저장하였다.
위 또는 장의 내용물을 100 mM 인산나트륨 pH 7.0으로 4X 희석하고, 간단히 혼합하였으며, 14,000 rpm x 2분에서 원심분리하였다. 상등액을 350 ㎕, 0.45 μM, AcroPrep™ Advanced 96웰 필터 플레이트(Pall Corp)로 옮기고, 미립자를 진공 여과를 통해 제거하였다. 정화된 여과물은 앞의 실시예에 기술된 대로 효소 활성에 대해 평가하였고, SDS-PAGE를 통해 온전한 PAL 단백질의 존재를 확인하였다. 결과는 십이지장 및 공장 내 효소 활성이 야생형 PAL 효소 및 음성 대조군과 비교하여, 진화된 PAL 변이체에 대해 보다 높게 나타나는 것으로 확인되었다.
실시예 7
혈장 페닐알라닌 농도
실시예 6에 기술된 마우스로부터 얻은 혈장 샘플은 시험된 마우스의 혈류에 존재하는 페닐알라닌의 양을 측정하기 위해 평가하였다. 마우스 혈장(50 ㎕)을 0.6 mM의 dl-페닐알라닌(고리 D5)(즉, 방향족 고리 탄소와 결합된 수소 보다는 중수소를 포함하는 페닐알라닌의 동위원소 표지된 형태; Cambridge Isotope Laboratories)을 함유하는 250 ㎕의 아세토니트릴과 배합하였다. 샘플을 5분간 RT에서 혼합하였고, 10분간 4℃에 3200 x g에서 원심분리하였으며 상등액은 샘플 분석용 플레이트로 옮겼다. 분석을 위해서, 10 ㎕의 각 샘플을 DISCOVERY® C18 컬럼(150 x 2.1 mM, 5 ㎛ 비드)(Supelco, 현재 Sigma-Aldrich)을 가로질러 a3200 QTRAP® LC/MS/MS 시스템(AB Sciex)에 주입하였고, 물(A) 및 아세토니트릴(B) 중 0.1% 포름산으로 용리하였다. 샘플은 동위원소 표지된 표준물에 대해 171에서 125, 그리고 내생성 페닐알라닌에 대해 166에서 120의 전이를 찾으면서 5분 구배(t=0, 97% A; 3분, 50% A; 3.5분, 5% A; 4분, 97%A; 5분, 95% A)에 따라 용리하였다. 결과는 혈장 페닐알라닌 농도가 야생형 PAL 효소 및 음성 대조군과 비교하여, 진화된 PAL 변이체(즉, 변이체 No.42)가 주어진 마우스 유래 샘플에서 30분 시점에서 낮아진 것으로 확인되었다.
실시예 8
변이체 PAL의 치료적 기능
PAL 변이체가 생체내 혈청 Phe 농도를 감소시키는지 여부를 평가하기 위해서, PKU의 마우스 모델을 사용하였다. 이들 실험에서, PAL 단백질을 영향받은 동물에게 위관영양시켰다. 먼저, 일관적인 기준 Phe 농도는 3일 동인 그들의 음식물로부터 Phe를 제거한 후 Phe 함유액의 기지량을 주사하여 마우스에서 확립하였다. C57Bl/6 배경의 3 내지 6월령 동형접합 PAH enu-2 마우스(다음 문헌 참조; McDonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1965-1967 [1990])를 72시간 동안 그들의 식수에 제공된 0.03 g/L의 Phe와 함께 페닐알라닌-무함유 음식물(TD.97152, Harlan)로 옮겼다. 0시의 치료 개시 전에, 마우스를 체중 1 g 당 0.15 mg의 Phe( 수중 10 g/L의 Phe 용액)을 주사하였다. 주사 후 55분 후, 대략 20 ㎕의 혈액을 꼬리 정맥 천자를 통해 수집하고 필터지에 스폿팅하였다. 이후, 주사 후 1시, 3시, 및 5시에, 마우스를 0.3 mL의 50-100 g/L의 WT AvPAL, WT AvPAL과 아프로티닌, BSA, 또는 변이체 No.42로 위관영양하였다. 주사 후 6시, 7시 및 9시에, 추가의 혈액 스폿을 여과지상에 수집하였다. 혈액 스폿을 건조시키고, 당분야에 공지된 방법을 사용한 Phe 및 Tyr 농도에 대한 LC-MS/MS 분석 전에 -20℃에 저장하였다(다음의 문헌을 참조함: Chase et al., Clin. Chem., 39:66-71 [1993]).
결과를 도 8에 도시하였다. 이 도면에 도시한 바와 같이, 불활성 단백질(BSA)를 사용한 위관영양은 높은 혈청 Phe 농도를 초래하였다. 대조적으로, 단백질분해 감응성 WT AvPAL 처리는 Phe-농도가 변함이 없었던데 반해, 프로테아제 억제제 아프로티닌과 배합된 동일 단백질은 Phe 농도가 유의하게 강하되었다. 이 결과는 또한 조작된 PAL 변이체 No.42의 투여가 프로테아제 억제제 부재시 혈청 Phe 농도를 감소시킴을 보여주었다.
실시예 9
PAL의 탈면역화
이 실시예에서, PAL로부터 T-세포 에피토프를 제거하는 다양성을 동정하기 위해 수행된 실험들을 기술한다.
탈면역화 다양성의 동정 :
돌연변이시, T-세포 에피토프를 제거할 수 있는 아미노산을 동정하기 위해서, 컴퓨터 방법을 사용하여 T-세포 반응을 유도하는 것으로 예상되는 PAL 서열을 동정하였다. 동시에, 허용되는, 비유해성 돌연변이에 대한 실험적 조사도 구체적으로 미공격 어세이(예를 들면, 실시예 2에 기술된 어세이)에서 단백질 활성을 유지한 아미노산에 대해 수행하였다. 이어서 활성 변이체를 예상되는 면역원성에 대한 돌연변이의 효과에 대해 분석하였다.
변이체 AvPAL에서 추정 T-세포 에피토프의 컴퓨터 동정 :
AvPAL 변이체 No.36에서 추정 T-세포 에피토프는 당분야에 공지된 면역 에피토프 데이타베이스(IEDB; 면역 에피토프 데이타베이스 및 분석 리소스 웹사이트) 도구 및 등록 통계 분석 도구(예를 들면, 다음을 참조함: iedb.org 및 Vita et al., Nucl. Acids Res., 38(Database issue):D854-62 [2010]. Epub 2009 Nov 11])를 사용해 동정하였다. AvPAL 변이체는 모든 가능한 15량체 분석 프레임으로 분석하였고, 각 프레임은 14개 아미노산 만큼 마지막이 중복된다. 15량체 분석 프레임은 IEDB 웹사이트 상에서 추천하는 방법을 사용하여, 인간 개체군의 거의 95%를 총체적으로 포괄하는(예를 들면, 다음의 문헌 참조함: Southwood et al., J. Immunol.,160:3363-3373 [1998]), 8종의 공통 클래스 II HLA-DR 대립유전자(DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*0801, DRB1*1101, DRB1*1301, 및 DRB1*1501)와의 예측되는 결합에 대해 그들 9량체 코어 영역을 점수화하여 면역원성 잠재성에 대해 평가하였다. 변이체 AvPAL 내 포함된 잠재적인 T-세포 에피토프 클러스터(즉, 면역원성에 대해 특이하게 높은 잠재성을 갖는 변이체 AvPAL 내 포함된 서브영역)는 당분야에 공지된 통계 분석 도구를 사용해 동정하였다. 동정된 T-세포 에피토프 클러스터는 기지 에피토프의 IEDB 데이타베이스 및 유전자은행 단백질 데이타베이스에 대해 스크리닝하였다. 이들 스크리닝은 변이체 AvPAL 변이체 No.36에서 10(십)종의 추정 T-세포 에피토프를 동정하였다. 이들 에피토프를 이하 TCE-I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, 및 X라고 한다.
탈면역화 라이브러리의 디자인 :
먼저, 상기 기술된 바와 같이 동정된 10종의 추정 T-세포 에피토프 영역에서, 변이체 AvPAL을 생성하기 위해 사용된 유도 진화법 회차들에서 동정된 모든 중성, 및 유용한 돌연변이를 포함하는 조합 라이브러리를 개발하였다. 8종의 공통 클래스 II HLA-DR 대립유전자와의 예상 결합에 대한 이들 돌연변이의 효과를 분석하였다. 다중 돌연변이는 TCE-I, II, VI, VII을 제거하거나 또는 감소시킬 것으로 예측되었다. 이들 돌연변이를 조합 라이브러리로 조합하였다. 이어서 라이브러리는 나머지 6종의 T-세포 에피토프(즉, TCE-III, IV, V, VIII, IX, 및 X) 내 모든 단일 아미노산을 돌연변이유발시키는 포화 돌연변이유발법을 사용해 디자인하였다. 마지막으로, PAL 변이체의 응집 상태에 영향을 주는 것으로 보고된 2종 아미노산, C503 및 C565와 함께, TCE-I, III, IV, VIII, 및 X를 표적화하는 복수의 진화 회차로부터 동정된 유용한 다양성을 함유하는 조합 라이브러리를 생성시켰다. 이 라이브러리로부터의 최고 히트에 대해 TCE-III 및 VIII을 표적화하는 추가의 포화 돌연변이유발법을 수행하였고 소수의 위치에서 부가적인 표적화 돌연변이유발을 수행하였다.
탈면역화 라이브러리의 제작 및 스크리닝 :
상기 기술된 바와 같이 디자인된 조합 및 포화 돌연변이유발 라이브러리는 당분야에 알려진 방법으로 제작하였고, 실시예 2에 기술된 바와 같은 미공격 어세이에서 활성을 시험하였다. 활성 변이체를 동정하였고 서열분석하였다. AvPAL 변이체 No.36 및 수많은 AvPAL 변이체에 대한 그들의 활성 및 돌연변이는 다음의 표 9-1 내지 9-7에 제공하였다.
탈면역화 다양성의 동정 :
활성 변이체는 상기 기술된 8종의 공통 클래스 II HLA-DR 대립유전자와 그들 결합에 대한 평가를 통해 그들의 면역원성 정도에 대해 분석하였다. 전체 면역원성 점수 및 면역원성 히트 계측치를 표 9-1 내지 9-7에 나타내었다. 총 면역원성 점수는 변이체의 총 예상 면역원성을 반영한다(즉, 보다 높은 점수는 보다 높은 수준의 예상 면역원성을 의미함). 면역원성 "히트 계측치"는 면역원성에 대해 특별히 높은 잠재성을 갖는 15량체 분석 프레임의 수를 의미한다(즉, 보다 높은 히트 계측치는 면역원성에 대한 보다 높은 잠재성을 의미함). 기준 변이체 보다 총 예상 면역원성 점수 및/또는 면역원성 히트 계측치가 낮은 돌연변이는 "탈면역화 돌연변이"로 간주한다. 최고로 동정된 탈면역화 돌연변이는 출발 기준 변이체 AvPAL 보다 유의하게 낮은 면역원성으로 예상되고 활성이 있는 다수의 변이체를 생성시키기 위해 재조합하였다. 하기 표에서, FIOP 결과는 미공격 어세이로부터 얻은 것이고; 총 면역원성 점수(TIS) 및 면역원성 히트 계측치(IHC)의 경우, 결과는 전체 PAL 단백질(표 9-1, 9-8, 및 9-9), 또는 표시된 에피토프(표 9-2 내지 9-7)에 대해 표시한다.
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탈면역화된 PAL 변이체의 시험관내 시험
탈면역화된 PAL 변이체는 T-세포 반응을 유도하는 그들의 능력을 경험적으로 시험하기 위해 수지상 T-세포 어세이로 시험하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 표준 기술을 사용해 인간 도너로부터 단리하였다. 이들 세포는 미성숙 수지상 세포를 생성하기 위한 제한 배지에서 배양된 단핵구의 공급원으로서 사용된다. 이들 미성숙 수지상 세포(DC)를 탈면역화된 PAL 변이체와 로딩한 후, 항원-프라이밍 CD를 제공하도록 제한 배지에서 더욱 배양하여 보다 성숙된 표현형으로 유도시켰다. DC와 동일한 도너 샘플에서 얻은 CD8+ T 세포-고갈된 도너 PBMC를 CFSE로 표지한 후, 7일 동안 항원-프라이밍된 DC와 배양하고난 후, 8개 복사물을 시험하였다. 각각의 DC-T 세포 배양물은 미처리 대조군(즉, 음성 대조군) 세트를 포함한다. 어세이는 또한 2종의 강력한 전체 단백질 항원을 포함하는, 기준 항원 대조군(즉, 양성 대조군)을 도입한다. 다양한 MHC 클래스 II 대립유전자를 갖는 50명의 인간 도너로부터 단리된 세포를 활용한 어세이는 T-세포 반응을 유도시키는 PAL 변이체의 능력에 대한 통계적으로 관련있는 평가 의견을 제공한다.
본 발명을 특정한 실시양태를 참조하여 기술하였지만, 다양한 변화가 가해질 수 있고, 특정한 상황, 재료, 물질 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들에 적합하도록 균등물을 치환하여, 청구된 범주를 벗어나지 않고 본 발명의 장점을 달성할 수 있다.
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SEQUENCE LISTING <110> Codexis, Inc. Huisman, Gjalt W. Agard, Nicholas J. 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ataaccagac cgttcagctg gatattacgg 360 cctttttaaa gaccgtaaag aaaaataagc acaagtttta tccggccttt attcacattc 420 ttgcccgcct gatgaatgct catccggagt tccgtatggc aatgaaagac ggtgagctgg 480 tgatatggga tagtgttcac ccttgttaca ccgttttcca tgagcaaact gaaacgtttt 540 catcgctctg gagtgaatac cacgacgatt tccggcagtt tctacacata tattcgcaag 600 atgtggcgtg ttacggtgaa aacctggcct atttccctaa agggtttatt gagaatatgt 660 ttttcgtctc agccaatccc tgggtgagtt tcaccagttt tgatttaaac gtggccaata 720 tggacaactt cttcgccccc gttttcacca tgggcaaata ttatacgcaa ggcgacaagg 780 tgctgatgcc gctggcgatt caggttcatc atgccgtctg tgatggcttc catgtcggca 840 gaatgcttaa tgaattacaa cagtactgcg atgagtggca gggcggggcg taactgcagg 900 agctcaaaca gcagcctgta ttcaggctgc ttttttcgtt ttggtctgcg cgtaatctct 960 tgctctgaaa acgaaaaaac cgccttgcag ggcggttttt cgaaggttct ctgagctacc 1020 aactctttga accgaggtaa ctggcttgga ggagcgcagt caccaaaact tgtcctttca 1080 gtttagcctt aaccggcgca tgacttcaag actaactcct ctaaatcaat taccagtggc 1140 tgctgccagt ggtgcttttg catgtctttc cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 1200 taaggcgcag cggtcggact gaacgggggg ttcgtgcata cagtccagct tggagcgaac 1260 tgcctacccg gaactgagtg tcaggcgtgg aatgagacaa acgcggccat aacagcggaa 1320 tgacaccggt aaaccgaaag gcaggaacag gagagcgcac gagggagccg ccagggggaa 1380 acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacca ctgatttgag cgtcagattt 1440 cgtgatgctt gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgg ctttgccgcg gccctctcac 1500 ttccctgtta agtatcttcc tggcatcttc caggaaatct ccgccccgtt cgtaagccat 1560 ttccgctcgc cgcagtcgaa cgaccgagcg tagcgagtca gtgagcgagg aagcggaata 1620 tatcctgtat cacatattct gctgacgcac cggtgcagcc ttttttctcc tgccacatga 1680 agcacttcac tgacaccctc atcagtgaac caccgctggt agcggtggtt tttttaggcc 1740 tatggccttt tttttttntg nnaaaccttt cgcggtatgg natnanagcg cccggaagag 1800 agtcaattaa gagggtggtg aatgtgaaac cagtaacgtt atacgatgtc gcagagtatg 1860 ccggtgtctc ttatcagacc gtttcccgcg tggtgaacca ggccagccac gtttctgcga 1920 aaacgcggga aaaagtggaa gcggcgatgg cggagctgaa ttacattccc aaccgcgtgg 1980 cacaacaact ggcgggcaaa cagtcgttgc tgattggcgt tgccacctcc agtctggccc 2040 tgcacgcgcc gtcgcaaatt gtcgcggcga ttaaatctcg cgccgatcaa ctgggtgcca 2100 gcgtggtggt gtcgatggta gaacgaagcg gcgtcgaagc ctgtaaagcg gcggtgcaca 2160 atcttctcgc gcaacgcgtc agtgggctga tcattaacta tccgctggat gaccaggatg 2220 ccattgctgt ggaagctgcc tgcactaatg ttccggcgtt atttcttgat gtctctgacc 2280 agacacccat caacagtatt attttctccc atgaagacgg tacgcgactg ggcgtggagc 2340 atctggtcgc attgggtcac cagcaaatcg cgctgttagc gggcccatta agttctgtct 2400 cggcgcgtct gcgtctggct ggctggcata aatatctcac tcgcaatcaa attcagccga 2460 tagcggaacg ggaaggcgac tggagtgcca tgtccggttt tcaacaaacc atgcaaatgc 2520 tgaatgaggg catcgttccc actgcgatgc tggttgccaa cgatcagatg gcgctgggcg 2580 caatgcgcgc cattaccgag tccgggctgc gcgttggtgc ggacatctcg gtagtgggat 2640 acgacgatac cgaagacagc tcatgttata tcccgccgtt aaccaccatc aaacaggatt 2700 ttcgcctgct ggggcaaacc agcgtggacc gcttgctgca actctctcag ggccaggcgg 2760 tgaagggcaa tcagctgttg cccgtctcac tggtgaaaag aaaaaccacc ctggcgccca 2820 atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg 2880 tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgg tacccgataa aagcggcttc ctgacaggag 2940 gccgttttgt ttctcgagtt aattaaggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 3000 tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 3060 ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac ggattcactg 3120 gccgtcgttt tacaatctag aggccagcct ggccataagg agatatacat atgggccatc 3180 atcatcatca tcatcatcat catcacagca gcggccatat cgaaggtcgt catatgaaaa 3240 ccctgagcca ggcacagagc aaaaccagca gccagcagtt tagctttacc ggcaatagca 3300 gcgcaaatgt gattattggt aatcagaaac tgaccatcaa tgatgttgca cgtgttgccc 3360 gtaatggcac cctggttagc ctgaccaata ataccgatat tctgcagggt attcaggcca 3420 gctgtgatta tatcaataat gcagttgaaa gcggtgaacc gatttatggt gttaccagcg 3480 gttttggtgg tatggcaaat gttgcaatta gccgtgaaca ggcaagcgaa ctgcagacca 3540 atctggtttg gtttctgaaa accggtgcag gtaataaact gccgctggca gatgttcgtg 3600 cagcaatgct gctgcgtgca aatagccaca tgcgtggtgc aagcggtatt cgtctggaac 3660 tgattaaacg catggaaatc tttctgaatg ccggtgttac cccgtatgtt tatgaatttg 3720 gtagcattgg tgccagcggt gatctggttc cgctgagcta tattaccggt agcctgattg 3780 gcctggaccc gagctttaaa gttgatttta atggcaaaga aatggacgca ccgaccgcac 3840 tgcgtcagct gaatctgagt ccgctgaccc tgctgccgaa agaaggtctg gcaatgatga 3900 atggcaccag cgttatgacc ggtattgcag caaattgtgt ttatgatacc cagattctga 3960 ccgcaattgc aatgggtgtt catgcactgg atattcaggc actgaatggt acaaatcaga 4020 gctttcatcc gtttatccat aacagcaaac cgcatccggg tcagctgtgg gcagcagatc 4080 agatgattag cctgctggcc aatagccagc tggttcgtga tgaactggat ggtaaacatg 4140 attatcgtga tcatgaactg atccaggatc gttatagcct gcgttgtctg ccgcagtatc 4200 tgggtccgat tgttgatggt attagccaga ttgccaaaca aatcgaaatt gagattaaca 4260 gcgttaccga taacccgctg attgatgttg ataatcaggc aagctatcat ggtggtaatt 4320 ttctgggtca gtatgttggt atgggtatgg atcatctgcg ctattatatc ggtctgctgg 4380 caaaacatct ggatgttcag attgcactgc tggcatcacc ggaatttagc aatggtctgc 4440 ctccgagtct gctgggtaat cgtgaacgta aagttaatat gggtctgaaa ggtctgcaga 4500 tttgcggtaa tagcattatg ccgctgctga ccttttatgg taatagtatt gcagatcgtt 4560 ttccgaccca tgccgaacag tttaaccaga atattaacag ccagggttat accagcgcaa 4620 ccctggcacg tcgtagcgtt gatatttttc agaattatgt tgccattgcc ctgatgtttg 4680 gtgttcaggc agttgatctg cgtacctaca aaaaaaccgg tcattatgat gcacgtgcct 4740 gtctgtcacc ggcaaccgaa cgtctgtata gcgcagttcg tcatgttgtt ggtcagaaac 4800 cgacctcaga tcgtccgtat atttggaatg ataatgaaca gggtctggat gaacatattg 4860 cacgtattag tgcagatatt gcagccggtg gtgttattgt tcaggccgtt caggacattc 4920 tgccgtgtct gcattaaggc caaac 4945 <210> 28 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 28 ctagaggcca gcctggccat aaggagatat acatatgaaa accctgagcc aggcac 56 <210> 29 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 29 gatggtgatg gtggccagtt tggccttaat gcagacacgg cagaatg 47 <210> 30 <211> 569 <212> PRT <213> Nostoc punctiforme <400> 30 Met Asn Ile Thr Ser Leu Gln Gln Asn Ile Thr Arg Ser Trp Gln Ile 1 5 10 15 Pro Phe Thr Asn Ser Ser Asp Ser Ile Val Thr Val Gly Asp Arg Asn 20 25 30 Leu Thr Ile Asp Glu Val Val Asn Val Ala Arg His Gly Thr Gln Val 35 40 45 Arg Leu Thr Asp Asn Ala Asp Val Ile Arg Gly Val Gln Ala Ser Cys 50 55 60 Asp Tyr Ile Asn Asn Ala Val Glu Thr Ala Gln Pro Ile Tyr Gly Val 65 70 75 80 Thr Ser Gly Phe Gly Gly Met Ala Asp Val Val Ile Ser Arg Glu Gln 85 90 95 Ala Ala Glu Leu Gln Thr Asn Leu Ile Trp Phe Leu Lys Ser Gly Ala 100 105 110 Gly Asn Lys Leu Ser Leu Ala Asp Val Arg Ala Ala Met Leu Leu Arg 115 120 125 Ala Asn Ser His Leu Tyr Gly Ala Ser Gly Ile Arg Leu Glu Leu Ile 130 135 140 Gln Arg Ile Glu Thr Phe Leu Asn Ala Gly Val Thr Pro His Val Tyr 145 150 155 160 Glu Phe Gly Ser Ile Gly Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro Leu Ser Tyr 165 170 175 Ile Thr Gly Ala Leu Ile Gly Leu Asp Pro Ser Phe Thr Val Asp Phe 180 185 190 Asp Gly Lys Glu Met Asp Ala Val Thr Ala Leu Ser Arg Leu Gly Leu 195 200 205 Pro Lys Leu Gln Leu Gln Pro Lys Glu Gly Leu Ala Met Met Asn Gly 210 215 220 Thr Ser Val Met Thr Gly Ile Ala Ala Asn Cys Val Tyr Asp Ala Lys 225 230 235 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PCC 7116 <400> 31 Met Asn Thr Val Arg Leu Thr Lys Asn Thr Val Ser Gln Lys Ser Phe 1 5 10 15 Ser Phe Leu Asn Asn Ser Asp Ala Ser Val Ile Val Gly Asp Arg Gln 20 25 30 Leu Thr Ile Glu Glu Val Val Ser Val Ala Arg Tyr Arg Ala Arg Val 35 40 45 Lys Leu Thr Glu Asn Leu Glu Lys Leu Ala Asn Val Gln Ala Ser Cys 50 55 60 Asp Phe Ile Arg Asp Ala Val Glu Ser Gly Glu Pro Ile Tyr Gly Val 65 70 75 80 Thr Thr Gly Phe Gly Gly Met Ala Asn Val Val Ile Ser Pro Glu Ser 85 90 95 Ala Thr Leu Leu Gln Asn Asn Leu Met Cys Tyr His Lys Val Gly Ala 100 105 110 Gly Asn Lys Leu Pro Leu Ala Asp Val Arg Ala Ala Met Leu Leu Arg 115 120 125 Ala Asn Ser His Val Ala Gly Ala Ser Gly Ile Arg Leu Glu Leu Ile 130 135 140 Lys Arg Met Leu Ile Phe Leu Asn Ala Gly Val Thr Pro His Val Pro 145 150 155 160 Glu Phe Gly Ser Ile Gly Ala Ser Gly Asp Leu Thr Pro Leu Ala Tyr 165 170 175 Ile Ser Gly Ala Leu Ile Gly Leu Asn Ser Ser Tyr Ile Val Asp Phe 180 185 190 Asp Gly Glu Glu Met Asp Ala Pro Thr Ala Leu Gln Lys Leu Gly Leu 195 200 205 Glu Pro Leu Gln Leu Leu Pro Lys Glu Gly Leu Ala Met Met Asn Gly 210 215 220 Thr Ser Val Met Thr Gly Ile Ala Ala Asn Cys Val Gln Asp Thr Arg 225 230 235 240 Ile Leu Leu Ala Leu Ser Val Ala Thr His Ala Leu Thr Ile Gln Gly 245 250 255 Leu Glu Gly Thr Asn Gln Ser Phe His Glu Tyr Ile His Lys Leu Lys 260 265 270 Pro His Ser Gly Gln Ile Trp Ala Ala Ser Gln Met Leu Glu Leu Leu 275 280 285 Ala Gly Ser Gly Leu Ile Arg Asp Glu Leu Asp Gly Ser His Asp Tyr 290 295 300 Arg Gly Lys Asn Pro Ile Gln Asp Arg Tyr Ser Leu Arg Cys Leu Pro 305 310 315 320 Gln Tyr Met Gly Pro Ile Val Asp Gly Ile Glu Asp Ile Ala Lys Gln 325 330 335 Val Glu Ile Glu Ile Asn Ser Val Thr Asp Asn Pro Leu Ile Asp Val 340 345 350 Glu Asn Gln Ala Ser Tyr His Gly Gly Asn Phe Leu Gly Gln Tyr Ile 355 360 365 Gly Val Gly Met Asp Arg Leu Arg Tyr His Ile Gly Met Leu Ala Lys 370 375 380 His Leu Asp Val Gln Ile Ala Tyr Leu Val Ala Pro Glu Phe Asn Asn 385 390 395 400 Gly Leu Ser Pro Ser Leu Val Gly Asn Gln Gln Arg Thr Val Asn Met 405 410 415 Gly Leu Lys Gly Leu Gln Ile Thr Gly Asn Ser Ile Met Pro Leu Leu 420 425 430 Thr Phe Tyr Gly Asn Ser Ile Ala Asp Arg Phe Pro Thr His Ala Glu 435 440 445 Gln Tyr Asn Gln Asn Ile Asn Ser Gln Gly Phe Ala Ser Ala Asn Leu 450 455 460 Ala Arg Thr Ser Val Glu Ile Phe Gln Gln Tyr Ile Ala Leu Ala Leu 465 470 475 480 Met Phe Gly Val Gln Ser Val Asp Leu Arg Thr Tyr Ala Ile Ala Gly 485 490 495 His Tyr Asp Ala Arg Ala Thr Leu Ser Pro Ala Thr Gln Asp Leu Tyr 500 505 510 Met Ala Val Arg Asn Val Val Gly Arg Pro Pro Ser Lys Glu Arg Ala 515 520 525 Tyr Ile Trp Asp Asp Asn Glu Gln Gly Leu Asp Ser His Ile Ser Lys 530 535 540 Ile Ala Asp Asp Ile Ala Tyr Gly Gly Gln Ile Val Thr Ala Ile Ser 545 550 555 560 Glu Val Leu Ser Ala Leu Lys Ser Val Asn Asn 565 570 <210> 32 <211> 565 <212> PRT <213> Oscillatoria sp. PCC 6506 <400> 32 Met Ser Thr Asn Leu Thr Glu Pro Ile Ser Gln Lys Leu Leu Gln Trp 1 5 10 15 Leu Glu Pro Asn Leu Ser Ala Val Ile Val Gly Asn Arg Arg Leu Ser 20 25 30 Val Glu Glu Val Ala Arg Val Ala Arg Cys Gly Thr Arg Val Arg Leu 35 40 45 Asn Asp Glu Ser Asp Val Ala Glu Arg Val Gln Ala Ser Cys Asp Tyr 50 55 60 Ile Thr Asp Ala Val Glu Ser Gly Lys Ala Ile Tyr Gly Val Thr Thr 65 70 75 80 Gly Phe Gly Gly Met Ala Asn Thr Glu Ile Ala Pro Glu Glu Ala Ala 85 90 95 Ser Leu Gln Asn Asn Leu Ile Trp Phe Leu Lys Ala Gly Ala Gly Gln 100 105 110 Lys Leu Pro Thr Ala Cys Val Arg Ala Ala Met Leu Leu Arg Ile Asn 115 120 125 Ser His Leu Gln Gly Ala Ser Gly Ile Arg Leu Glu Leu Ile Lys Arg 130 135 140 Met Ile Val Phe Leu Asn Ala Gly Val Thr Pro His Val Cys Glu Leu 145 150 155 160 Gly Ser Ile Gly Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro Leu Ala Gln Ile Thr 165 170 175 Gly Ala Leu Ile Gly Leu Asp Asp Ser Phe Thr Val Asp Phe Asn Gly 180 185 190 Arg Glu Met Ser Ala Ile Gln Ala Leu Glu Leu Leu Asp Leu Pro Lys 195 200 205 Ile Asp Leu Arg Pro Lys Glu Gly Leu Ala Met Val Asn Gly Thr Ser 210 215 220 Val Met Thr Gly Ile Ala Ala Asn Cys Val Arg Asp Ser Gln Val Met 225 230 235 240 Leu Ala Leu Ala Met Gly Thr His Ala Leu Met Ile Gln Gly Leu Gly 245 250 255 Ala Thr Asn Gln Ser Phe His Pro Phe Ile His Lys Leu Lys Pro His 260 265 270 Phe Gly Gln Val Trp Ala Ala Ser Gln Met Val Glu Leu Leu Ala Gly 275 280 285 Ser Cys Leu Asn Arg Asp Glu Leu Asp Gly Gln His Asp Ala Arg Gly 290 295 300 Glu His Pro Ile Gln Asp Arg Tyr Ser Leu Arg Cys Leu Pro Gln Tyr 305 310 315 320 Ile Gly Pro Ile Val Asp Gly Ile Ala Glu Ile Ala Gln Gln Ile Glu 325 330 335 Val Glu Val Asn Ser Val Thr Asp Asn Pro Leu Ile Asp Thr Glu Asn 340 345 350 Gln Ala Ser Tyr His Gly Gly Asn Phe Leu Gly Gln Tyr Val Gly Val 355 360 365 Gly Met Asp Arg Leu Arg Tyr Leu Leu Gly Leu Leu Ala Lys His Leu 370 375 380 Asp Val Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ala Pro Glu Phe Asn Asn Gly Leu 385 390 395 400 Ser Pro Ser Leu Val Gly Asn Thr Ser Arg Lys Val Asn Met Gly Leu 405 410 415 Lys Gly Leu Gln Ile Ala Gly Asn Ser Ile Met Pro Leu Leu Thr Phe 420 425 430 Tyr Gly Asn Ser Ile Ala Asp Arg Phe Pro Thr His Ala Glu Gln Phe 435 440 445 Asn Gln Asn Ile Asn Ser Gln Gly Phe Ala Ser Ala Asn Leu Ala Arg 450 455 460 Arg Ser Ile Glu Leu Phe Gln Gln Tyr Met Ala Ile Ser Leu Met Phe 465 470 475 480 Ala Val Gln Ala Val Asp Leu Arg Thr His Glu Val Ala Gly His Tyr 485 490 495 Asp Ala Arg Glu Cys Leu Ser Pro Leu Ser Leu Pro Leu Tyr Glu Ala 500 505 510 Val Arg Glu Val Val Gly Gln Pro Pro Asn Val Asp Arg Ser Tyr Ile 515 520 525 Trp Asn Asp Asn Glu Gln Ser Leu Asp Ile His Ile Ala Met Ile Ala 530 535 540 Ala Asp Ile Ala Gln Glu Gly Arg Ile Val Gln Ala Val Asn Gln Ile 545 550 555 560 Leu Ser Ser Leu Lys 565 <210> 33 <211> 559 <212> PRT <213> Gloeocapsa sp. PCC 7428 <400> 33 Met Asn Thr Ala Val Gln Thr Gln Ala Ser Thr Asn Leu Asn Ala Asp 1 5 10 15 Thr Ile Leu Leu Gly Asp Arg Asn Leu Thr Ile Asp Glu Val Val Ser 20 25 30 Val Ala Arg His Gly Ala Lys Val Asn Ile Ser Thr Ala Asp Asn Val 35 40 45 Ala Gln Arg Ile Gln Ala Ser Cys Asp Tyr Ile Ala Glu Ala Val Ala 50 55 60 Thr Gly Arg Pro Ile Tyr Gly Val Thr Ser Gly Phe Gly Gly Met Ala 65 70 75 80 Asn Val Val Ile Ser Arg Glu Tyr Ala Asp Leu Leu Gln His Asn Leu 85 90 95 Val Trp Tyr His Lys Val Gly Ala Gly Arg Lys Leu Pro Leu Thr Asp 100 105 110 Val Arg Ala Ala Met Leu Leu Arg Val Asn Ser His Leu His Gly Ala 115 120 125 Ser Gly Ile Arg Arg Glu Ile Val Gln Arg Met Glu Met Phe Leu Asn 130 135 140 Ala Arg Val Thr Pro His Val Pro Glu Tyr Gly Ser Ile Gly Ala Ser 145 150 155 160 Gly Asp Leu Thr Pro Leu Ser Tyr Ile Thr Gly Ala Leu Ile Gly Leu 165 170 175 Asp Asp Arg Tyr Lys Val Asp Phe Asp Gly Glu Glu Ile Asp Ala Ile 180 185 190 Thr Ala Leu Glu Arg Leu Gly Leu Pro Gln Leu Gln Leu Gln Ala Lys 195 200 205 Glu Gly Leu Ala Met Met Asn Gly Thr Ser Val Met Thr Gly Ile Ala 210 215 220 Ala Asn Cys Val Tyr Asp Thr Arg Leu Leu Met Ala Leu Thr Met Gly 225 230 235 240 Ala His Ala Leu Ile Leu Gln Gly Leu Asn Gly Thr Asn Gln Ser Phe 245 250 255 His Pro Phe Ile His Lys Leu Lys Pro His Pro Gly Gln Lys Trp Ala 260 265 270 Ala Ser Thr Met Leu Asp Leu Leu Ala Gly Ser Arg Leu Ile Arg Glu 275 280 285 Glu Leu Asp Gly Thr His Glu Tyr Arg Gly Gln Ala Pro Ile Gln Asp 290 295 300 Arg Tyr Ser Leu Arg Cys Leu Ala Gln Tyr Met Gly Pro Ile Val Asp 305 310 315 320 Gly Val Ser Gln Val Ala Gln Gln Val Glu Ile Glu Met Asn Ser Ala 325 330 335 Thr Asp Asn Pro Leu Ile Asp Val Glu Asn Gln Ala Ser Tyr His Gly 340 345 350 Gly Asn Phe Leu Gly Gln Tyr Ile Gly Met Gly Met Asp His Leu Arg 355 360 365 Tyr Tyr Ile Gly Met Met Ala Lys His Leu Asp Val Gln Ile Ala Tyr 370 375 380 Leu Val Ala Pro Glu Phe Asn Asn Gly Leu Pro Ala Ser Leu Val Gly 385 390 395 400 Asn Lys Glu Arg Ile Val Asn Met Gly Leu Lys Gly Leu Gln Ile Thr 405 410 415 Gly Asn Ser Ile Met Pro Leu Leu Ser Phe Tyr Gly Asn Ser Ile Ala 420 425 430 Asp Arg Tyr Pro Thr His Ala Glu Gln Tyr Asn Gln Asn Ile Asn Ser 435 440 445 Gln Gly Phe Ala Ala Ala Asn Leu Thr Arg Asn Ala Val Glu Ile Phe 450 455 460 Gln Gln Tyr Met Ala Ile Ala Leu Met Phe Gly Val Gln Ala Val Asp 465 470 475 480 Leu Arg Thr Tyr Ala Tyr Ala Gly His Tyr Asp Ala Ser Glu Cys Leu 485 490 495 Ser Pro Thr Thr Arg Arg Leu Tyr Gln Ala Val Arg Glu Val Val Gly 500 505 510 Gln Pro Ser Ser Ala Thr Arg Pro Tyr Ile Trp Asp Asp Arg Glu Gln 515 520 525 Pro Leu Asp Glu His Ile Ala Lys Ile Ala Ala Asp Ile Ala Ala Glu 530 535 540 Gly Val Ile Val Ala Ala Val Lys Asp Leu Leu Thr Ser Leu Lys 545 550 555

Claims (63)

  1. a) 기준 서열 서열번호 4와 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 서열번호 4의 기능적 단편; b) 1 이상의 아미노산 위치에서 서열번호 4 또는 이의 기능적 단편에 비해 1 이상의 아미노산 잔기 차이를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하고; c) 기준 서열 서열번호 4와 비교시, i) 향상된 촉매 활성, ii) 단백질분해에 대한 감소된 감응성, iii) 산성 pH에 대한 증가된 내성, iv) 감소된 응집성, v) 감소된 면역원성, 또는 i), ii), iii), iv), 또는 v)의 임의의 조합에서 선택되는 개선된 성질을 나타내는, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된(engineered) 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 1 이상의 아미노산 위치는 20, 24, 27, 39, 43, 45, 47, 54, 58, 59, 62, 70, 73, 80, 82, 91, 94, 98, 104, 105, 110, 112, 115, 117, 118, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 156, 157, 158, 159, 172, 174, 175, 176, 177, 178, 180, 187, 191, 195, 199, 205, 206, 210, 212, 213, 214, 232, 240, 243, 245, 247, 248, 250, 256, 257, 266, 270, 275, 278, 279, 285, 286, 289, 290, 292, 304, 305, 307, 308, 309, 319, 321, 326, 331, 332, 334, 349, 353, 355, 364, 365, 369, 370, 371, 372, 374, 375, 377, 378, 379, 381, 382, 383, 384, 385, 387, 389, 394, 396, 399, 400, 403, 404, 407, 417, 418, 425, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 443, 446, 447, 453, 456, 459, 460, 461, 463, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 482, 483, 503, 507, 509, 521, 522, 524, 525, 528, 538, 546, 547, 551, 558, 560, 564, 565, 및/또는 이의 임의의 조합에서 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 서열번호 4에 대해 번호매김된 것인 조작된 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 4의 기준 서열의 아미노산 잔기는 A39, T54, G59, S73, A91, Y158, S180, K195, A112, R134, Q240, T243, I245, A256, L257, N270, N290, Y304, R305, H307, E308, I326, L349, D353, L364, A394, S399, N400, P404, L407, F443, N453, Y459, T460, T463, N474, E509, Q521, K522, T524, P528, S546, 및/또는 P564에 상응하는 것인 조작된 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 4와 비교시 아미노산 잔기 차이는, 서열번호 4의 폴리펩티드와 최적으로 정렬한 경우, 다음의 치환 A39V, T54K, G59R, S73K, A112C, R134Q, A91V, Y158H, S180A, K195E, Q240R/W, T243I/L, I245L, A256G, L257W/A, N270K, N290G, Y304H, R305M, H307G/Q/M, E308Q, I326F, L349M, D353A/N, L364Q, A394V, S399N, N400K, P404A, L407V, F443H, N453G, Y459F, T460G, T463N, N474Q, E509L, Q521K/S, K522Y/F/N, T524S, P528L, S546R, 및 P564 G/L/M 중 1 이상에서 선택되는 것인 조작된 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 잔기 차이는 A39, A91, Q240, A256, N290, Y304, R305, H307, D353, A394, S399, P404, L407, Q521, K522, 및 T524 중 1 이상의 조합에서 선택되는 것인 조작된 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 폴리펩티드는 서열번호 4와 약 90% 이상의 서열 동일성; 및 위치 H307에서 아미노산 잔기 차이를 갖는 것인 조작된 폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서, 아미노산 잔기 차이는 H307G/Q/M인 조작된 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 개선된 성질은 단백질분해에 대한 감소된 감응성 및/또는 산성 pH에 대한 증가된 내성에서 선택되는 것인 조작된 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 서열은 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis)에서 유래된 야생형 PAL인 조작된 폴리펩티드.
  10. a) 기준 서열 서열번호 10과 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 서열번호 10의 기능적 단편; b) 1 이상의 아미노산 위치에서 서열번호 10 또는 이의 기능적 단편에 비해 1 이상의 아미노산 잔기 차이를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하고; c) 기준 서열 서열번호 10과 비교시, i) 향상된 촉매 활성, ii) 단백질분해에 대한 감소된 감응성, iii) 산성 pH에 대한 증가된 내성, iv) 감소된 응집성, v) 감소된 면역원성, 또는 i), ii), iii), iv), 또는 v)의 임의의 조합에서 선택되는 개선된 성질을 나타내는, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드.
  11. 기준 서열 서열번호 10과 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 서열번호 10과 비교시 1 이상의 아미노산 잔기 차이를 포함하고, 서열번호 10과 비교시, 향상된 촉매 활성, 단백질분해에 대한 감소된 감응성, 산성 pH에 대한 증가된 내성, 감소된 응집성, 및/또는 감소된 면역원성에서 선택되는 1 이상의 개선된 성질을 나타내는, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 서열번호 10과 비교시 아미노산 잔기 차이는 하기의 치환 또는 치환 세트 중 1 이상에서 선택되는 것인 조작된 폴리펩티드: I27E/V39A;I27E/V39A/R43L/V105C/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q; I27E/V39A/R43L/L214E/A547D; I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P210C/P266H/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P266H/I285E/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A112C/L214E/I285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/S131N/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/A153R/P210C/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/P210C/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C;I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/I285E/A547D; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/L278D/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q; I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/I285E/C503Q;I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/I285E/A547D/A551D;I27E/V39A/V105C/R134Q/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/A153R/L214E;I27E/V39A/V105C/A153R/I285E; I27E/V39A/V105C/A153R/C503Q/A547D/C565N;I27E/V39A/V105C/A153R/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L214E/L278D/A547D; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/C503Q; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/A547D; I27E/V39A/V105C/Q205T/L214E/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/Q205T/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/P210C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/P210C/L214E/P266H/L278D; I27E/V39A/V105C/L214E/P266H/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/L214E/L278D/L309P/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/L278D/C503Q/A547D/C565N;I27E/V39A/V105C/I285E/A547D;
    I27E/V39A/V105C/C503Q/A551D;I27E/V39A/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/R134Q/Q205T/P210C/L214E/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/P266H/A551D; I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D;I27E/V39A/A112C/R134Q/P266H/I285E; I27E/V39A/A112C/Q205T/L214E/P266H/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/Q205T/L278D/I285E;I27E/V39A/A112C/L214E; I27E/V39A/A112C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D;I27E/V39A/A112C/I285E; I27E/V39A/A112C/A547D;I27E/V39A/R134Q; I27E/V39A/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/C503Q; I27E/V39A/R134Q/A153R/P210C/L214E/L278D/I285E/A547D/C565N; I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/R134Q/A153G/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/C503Q/A547D;I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D; I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D/A547D/A551D;I27E/V39A/R134Q/A153R/A547D; I27E/V39A/R134Q/Q205T/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/R134Q/Q205T/P266H/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/R134Q/P210C/L214E/C503Q;I27E/V39A/R134Q/P210C/C503Q/A551D; I27E/V39A/R134Q/L214E/P266H/A551D; I27E/V39A/R134Q/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/R134Q/L278D/C503Q/A547D;I27E/V39A/R134Q/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/A547D/C565N;I27E/V39A/Q205T/L214E/C503Q/C565N; I27E/V39A/Q205T/P266H/I285E/A547D/A551D/C565N;I27E/V39A/Q205T/P266H/A551D; I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/A551D/C565N;I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/Q205T/C503Q/A547D/C565N;I27E/V39A/P210C/T212S; I27E/V39A/P210C/L214E/L278D/C503Q/A551D;I27E/V39A/P210C/L214E/I285E/C503Q/A551D;
    I27E/V39A/P210C/P266H/I285E/C503Q/A547D;I27E/V39A/P210C/P266H/C503Q/A551D; I27E/V39A/L214E;I27E/V39A/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q;I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/L214E/C503Q/A551D;I27E/V39A/P266H;I27E/V39A/P266H/L278D; I27E/V39A/L278D;I27E/V39A/L278D/A547D;I27E/V39A/L278D/I285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/L278D/C503Q/C565N;I27E/V39A/C503Q;I27E/G45D/Q205T/P266H/C565N; I27E/V105C;I27E/V105C/R134Q/A153R/P210C/L214E/C503Q/A547D; I27E/V105C/R134Q/A153R/I285E/A547D;I27E/V105C/R134Q/A153R/C503Q; I27E/V105C/R134Q/Q205T/P210C/C503Q; I27E/V105C/R134Q/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/C565N; I27E/V105C/Q205T/P266H/C503Q; I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/P266H/L278D/A551D/C565N;
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    V39A/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/C565N;V39A/R134Q/P210C/L214E/A547D/C565N; V39A/A153R/C503Q/A547D;V39A/Q205T/L278D/A547D/A551D; V39A/P210C/L214E/L278D/I285E/C503Q/A551D;V39A/P266H; V39A/P275R/L278D/C503Q/A551D;V39A/C503Q;V39A/C503Q/A551D/C565N;V105C; V105C/A112C/R134Q/Q205T/L214E/Y492H/C503Q/A547D; V105C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/C503Q;V105C/R134Q/Q205T/L214E/A547D; V105C/R134Q/Q205T/P266H/L278D;V105C/R134Q/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N;
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    V105C/Q205T/L214E/L278D;V105C/Q205T/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N; V105C/Q205T/C503Q/A551D;V105C/L214E/P266H/L278D/A547D; V105C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D;V105C/L214E/I285E; V105C/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;V105C/L214E/I285E/A547D/C565N; V105C/L278D/C503Q/A551D;V105C/I285E;V105C/I285E/A547D;V105C/C503Q; V105C/A547D/A551D;A112C/R134Q/A153R/L214E/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
    A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N;A112C/L214E/L278D; A112C/L278D/C503Q/A547D;R134Q/Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D/C565N; R134Q/Q205T/C503Q;R134Q/P210C/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N; R134Q/P210C/L214E/C503Q/A547D/A551D;R134Q/L214E;R134Q/L214E/L278D/C503Q; R134Q/L214E/L278D/C503Q/A551D;R134Q/L214E/I285E/C503Q;R134Q/C503Q; R134Q/C503Q/A547D/A551D;A153R;Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D; Q205T/L214E/I285E/C503Q/C565N;Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N; Q205T/L278D/I285E/A547D/A551D;P210C/L214E;P210C/L214E/P266H;L214E/P266H; L214E/P266H/C503Q/A547D/A551D/C565N;L214E/C503Q/A547D;L214E/A547D; P266H/L278D/C503Q;P266H/C565N;L278D/A547D;C503Q;C503Q/A547D; C503Q/A547D/A551D/C565N;C503Q/A547D/C565N;C503Q/A551D;C503Q/A551D/C565N; A547D; 및/또는 C565N.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서, 서열번호 10과 비교시 아미노산 잔기 차이는 하기의 치환 또는 치환 세트 중 1 이상에서 선택되는 것인 조작된 폴리펩티드: V80I/R134C/P564Q; V121C; A123G; A124G; M125L; L126I/T; L126M/R134L; L127A; A129G/L; N130Q; N130C/M370I R134W; M133R; R134I; R134N/G307C; G135C/S; 및/또는 G135A/A394E.
  14. 제10항 또는 제11항에 있어서, 서열번호 10과 비교시 아미노산 잔기 차이는 하기의 치환 또는 치환 세트 중 1 이상에서 선택되는 것인 조작된 폴리펩티드: G20S/I144L; R43S; L47M/I144L; L47M/R146E; L47M/M147G/A383E; L47M/P157C; Q58H/L143V; Q58K/P157D/G369C; A62S/M147V; S82I/G135C/P157F/W279L; R94C/I149E; T110I/I139R; L118M/L141H; A119E/T156H/A289D; I139M/V; R140D/G/M; R140N/A199E; R140E/A334S/A551D; L141K/Q/P/T; E142H/P/V; E142D/G371D; L143F/M; I144L/N/V; K145N/Q/R; K145G/P157T; R146H/L; R146W/D191Y; M147A; I149L/R; F150K/L/M; L151M; A153C/G; A153S/H250N; G154R; G154Y/L174M/Q321K/S456I/G483C; T156K/G483C; P157D/F/H/Y; Y158E; V159C/H/L/M; M247I; L319M; 및/또는 Q389K.
  15. 제10항 또는 제11항에 있어서, 서열번호 10과 비교시 아미노산 잔기 차이는 하기의 치환 또는 치환 세트 중 1 이상에서 선택되는 것인 조작된 폴리펩티드: P117T/Y176Q; V172I/C/L; L174M; S175G; Y176E/I/M/R/V; I177M/V; T178L/A477S; 및/또는 S180C/T.
  16. 제10항 또는 제11항에 있어서, 서열번호 10과 비교시 아미노산 잔기 차이는 하기의 치환 또는 치환 세트 중 1 이상에서 선택되는 것인 조작된 폴리펩티드: R43S/H374K; R43S/H374R; A112S/M370A/A507E; M147I/H374S; S187R/L381V; D191Y/H385N; A232S; Q240K/H374R; A256S/L381N; P275Q/M370S; P275T/H374R; Q332K/Y377M; A334S/H374V; L349M; Q355K/H374S; M370G/I/S; G371H/N/Q/S; M372A/V; H374A/D/G/L/N/R/S/T; H374Q/P396Q; H374R/G417C; L375I; L375M; Y377C/I/N; Y378C/D/E/I/L/N/S; Y378F/P404Q; I379C/H/L/M/N; L381G/V; L381M/Q560K; L382C/H/I/M/S; A383S/V; K384R; H385C/G/N; H385M/P403H; H385S/P403H; D387S; L418M; G425V; A447S; S461G; 및/또는 S525L.
  17. 제10항 또는 제11항에 있어서, 서열번호 10과 비교시 아미노산 잔기 차이는 하기의 치환 또는 치환 세트 중 1 이상에서 선택되는 것인 조작된 폴리펩티드: A24S/F434M; A62S/T433N; S98I; L213M/S438L; Q240K/T433Y; S286R/Y435T; A289S/L431E; S331I; L431C/E/G/P/S/V; L432C/V; T433A/I/L/N/P/Q/R/S/V/W; F434C; Y435L; Y435Q/H446N; G436M; G436D/T; N437E/G/Q; N437T/L538M; S438C/F/M/R/T; I439C/F/L/V; 및/또는 A477S.
  18. 제10항 또는 제11항에 있어서, 서열번호 10과 비교시 아미노산 잔기 차이는 하기의 치환 또는 치환 세트 중 1 이상에서 선택되는 것인 조작된 폴리펩티드: A24E; Q58R/Y475H; A70S/N474E; L104M/V476L; A119E/G365A; L206M; P275Q; G276V; Q292H/A479G; Q355H/I478C; P404T/A477V; I471F/G/K/M/N/R/V/W; F472G; Q473H/K/M/R/S; Q473H/A507S; N474A/H/R/W; N474D/R490H; Y475C/F/L/Q; V476C/I/L; I478N/S; A479G/S; F482C/L; G483C/H/S; G483A/S524I; G483R/G537C; 및/또는 A558S.
  19. 제10항 또는 제11항에 있어서, 서열번호 10과 비교시 아미노산 잔기 차이는 하기의 치환 또는 치환 세트 중 1 이상에서 선택되는 것인 조작된 폴리펩티드: V39A/K115E/M133R/C565N;V39A/M133R/F472G/C503Q/C565N; V39A/M133R/F472G/C565N;V39A/M133R/C503Q;V39A/M133R/C503Q/C565N;V39A/M147A/Y378E/C503Q/C565N;V39A/M147A/Y378E/C565N;V39A/M147A/L381G/F472G/C503Q/C565N;V39A/M147A/L381G/C503Q/C565N;V39A/M147A/F472G/C503Q/C565N;V39A/M147A/F472G/C565N;V39A/M147A/C565N; V39A/G248C/L381G/F472G/C503Q/C565N; V39A/Y378E/C503Q/C565N; V39A/Y378E/C565N; V39A/L381G; V39A/F472G/C503Q/C565N; V39A/C503Q/C565N; M133R/L381G/C565N; M133R/C503Q; Y378D/C503Q; Y378E/F472G/C503Q/C565N; L381G/F472GC503Q/C565N; 및/또는 F472G/C503Q/C565N.
  20. a) 기준 서열 서열번호 26과 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 서열번호 26의 기능적 단편; b) 1 이상의 아미노산 위치에서 서열번호 26 또는 이의 기능적 단편에 비해 1 이상의 아미노산 잔기 차이를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하고; c) 기준 서열 서열번호 26과 비교시, i) 향상된 촉매 활성, ii) 단백질분해에 대한 감소된 감응성, iii) 산성 pH에 대한 증가된 내성, iv) 감소된 응집성, v) 감소된 면역원성, 또는 i), ii), iii), iv), 또는 v)의 임의의 조합에서 선택되는 개선된 성질을 나타내는, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드.
  21. 기준서열 서열번호 26과 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 서열번호 26에 비해 1 이상의 아미노산 잔기 차이를 포함하고, 서열번호 26과 비교시, 향상된 촉매 활성, 단백질분해에 대한 감소된 감응성, 산성 pH에 대한 증가된 내성, 감소된 응집성, 및/또는 감소된 면역원성에서 선택되는 1 이상의 개선된 성질을 나타내는, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 서열번호 26과 비교시 아미노산 잔기 차이는 하기의 치환 또는 치환 세트 중 1 이상에서 선택되는 것인 조작된 폴리펩티드: A24E/G381L; L127V; A129I/V; S131C/T; H132L/S; R134C/F/H/K; R134H/Y378E/G381L; R134H/Y378E/G381L/V388T; R134H/V388T; A136K; A289S; M372L; H374G/M/Q; G381A/C/F/I/L/M/N/Q/S/T; A383C/M; V388C/T; L431M; 및/또는 L563M.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 폴리펩티드는 기준 서열 서열번호 4와 약 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 조작된 폴리펩티드.
  24. 제23항에 있어서, 조작된 폴리펩티드는 기준 서열 서열번호 4와 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 조작된 폴리펩티드.
  25. 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 및/또는 26과 약 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드.
  26. 제25항에 있어서, 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 및/또는 26과 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 조작된 폴리펩티드.
  27. 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 조작된 폴리펩티드로서, 상기 조작된 폴리펩티드는 표 2-1 내지 2-5 및/또는 표 9-1 내지 9-7 중 어느 하나에 제공된 변이체 PAL인 조작된 폴리펩티드.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 폴리펩티드는 아나바에나 바리아빌리스 효소인 조작된 폴리펩티드.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 폴리펩티드는 열안정성인 조작된 폴리펩티드.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 폴리펩티드는 단백질분해에 내성인 조작된 폴리펩티드.
  31. 제30항에 있어서, 상기 조작된 폴리펩티드는 1 이상의 소화관 효소에 의한 단백질분해에 내성인 조작된 폴리펩티드.
  32. 제31항에 있어서, 상기 조작된 폴리펩티드는 키모트립신, 트립신, 카르복시펩티다아제, 및/또는 엘라스타아제에 의한 단백질분해에 내성인 조작된 폴리펩티드.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 폴리펩티드는 산 안정성인 조작된 폴리펩티드.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 폴리펩티드는 탈면역화된 것인 조작된 폴리펩티드.
  35. 제34항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 및/또는 26과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조작된 폴리펩티드.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 정제된 것인 조작된 폴리펩티드.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 1 이상의 조작된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  38. 제37항에 있어서, 상기 서열은 제어 서열에 작동가능하게 연결된 것인 폴리뉴클레오티드 서열.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈-최적화된 것인 폴리뉴클레오티드 서열.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항의 1 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 및 1 이상의 제어 서열을 포함하는 발현 벡터.
  41. 제40항에 있어서, 상기 제어 서열은 프로모터인 발현 벡터.
  42. 제41항에 있어서, 상기 프로모터는 이종성 프로모터인 발현 벡터.
  43. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항의 1 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 및/또는 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  44. 제43항에 있어서, 상기 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli)인 숙주 세포.
  45. 조작된 PAL 폴리펩티드를 숙주 세포에서 생산하는 방법으로서, 1 이상의 조작된 PAL 폴리펩티드가 생산되도록 적합한 배양 조건 하에서 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 1 이상의 조작된 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 제37항 또는 제39항의 1 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 및/또는 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항의 1 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 생산 방법.
  46. 제45항에 있어서, 배양물 및/또는 숙주 세포로부터 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL)를 갖는 1 이상의 조작된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 더 포함하는 생산 방법.
  47. 제46항에 있어서, 생산된 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL)를 갖는 상기 1 이상의 조작된 폴리펩티드를 정제하는 단계를 더 포함하는 생산 방법.
  48. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 갖는 1 이상의 조작된 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물인 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 1 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 담체를 더 포함하는 조성물.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 페닐케톤뇨증의 치료에 적합한 것인 조성물.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 인간에 경구 투여를 위해 적합한 것인 조성물.
  53. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 알약, 정제, 캡슐, 젤캡(gelcap), 액상, 또는 에멀션의 형태인 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 상기 알약, 정제, 캡슐 또는 젤캡은 장용성 코팅을 더 포함하는 것인 조성물.
  55. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 인간에 비경구 주입을 위해 적합한 것인 조성물.
  56. 제49항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 1 이상의 부가의 치료적으로 유효한 화합물과 공투여되는 것인 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 상기 조성물은 1 이상의 부가의 치료적으로 유효한 화합물을 포함하는 것인 조성물.
  58. 피험체에서 페닐케톤뇨증의 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 페닐케톤뇨증을 갖는 피험체를 제공하는 단계, 및 제49항 내지 제57항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 상기 피험체에게 제공하는 단계를 포함하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 페닐케톤뇨증의 증상이 완화되는 것인 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 피험체는 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 활성을 갖는 1 이상의 조작된 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 약학 조성물이 제공되지 않은 피험체가 요구하는 식이(diet)보다 메티오닌, 페닐알라닌 및/또는 티로신 함량이 덜 제한적인 식이를 섭취할 수 있는 것인 방법.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험체는 유아 또는 아동인 방법.
  62. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험체는 성인 또는 청년인 방법.
  63. 제48항 내지 제57항 중 어느 한 항에서 제공되는 조성물의 용도.
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