CN106755160B - 一种组氨酸解氨酶及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种组氨酸解氨酶及其用途，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，可用于生产L‑苯丙氨酸类化合物，该酶能够高效地催化肉桂酸类化合物和氨基供体转化成L‑苯丙氨酸类化合物，相比现有技术的苯丙氨酸解氨酶，本发明的组氨酸解氨酶具有更高的催化活性，降低了生产成本，具有工业化应用前景。

Description

一种组氨酸解氨酶及其用途
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，涉及一种组氨酸解氨酶及其用途，具体地说，涉及氨基酸序列为SEQ ID NO:1的组氨酸解氨酶在生产L-苯丙氨酸类化合物中的用途。
背景技术
L-苯丙氨酸是必需氨基酸之一，用作营养强化剂、氨基酸输液和复合氨基酸制剂的成分，食品工业上主要用作甜味剂阿斯巴甜的合成原料。L-苯丙氨酸类化合物比如3-溴苯基-L-丙氨酸和(S)-2-氯苯丙氨酸等是重要的药物中间体，其中(S)-2-氯苯丙氨酸是治疗高血压药物--血管紧张素I转化酶抑制剂(ACE)培哚普利的主要生产原料。
WO2006/069799A1公开了制备对映异构体苯丙氨酸化合物的工艺，其在一个特定的实施例中，使用来源于粘红酵母Rhodotorula glutinis的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)可催化3-(2-氯-苯基)丙烯酸与氨水反应，来制备(S)-2-氨基-3-(2-氯-苯基)-丙酸。WO2006/069799A1中所述工艺的缺点是会发生底物抑制，因此该工艺需要在低底物浓度下运行。如需大规模制备产物，则需要大体积或复杂的补料方案，使得从商业观点来看该工艺没有竞争力。
CN101517089A提供了一种用于制备苯丙氨酸类化合物的改进工艺，其通过使用来源于热液海源菌Idiomarina loihiensis的苯丙氨酸解氨酶催化相应的肉桂酸类化合物与氨基供体反应，不但底物抑制得以降低，而且与来自粘红酵母Rhodotorula glutinis的RgPAL相比具有更高的活性。然而，在实际生产应用中，来自热液海源菌Idiomarinaloihiensis的苯丙氨酸解氨酶(ilPAL)催化活性仍然较低，导致催化反应使用酶量很大，影响产物收率，并且生产成本依旧较高。
因此，本领域迫切需要开发一种具有高效催化活性的酶用以制备L-苯丙氨酸类化合物的方法来降低生产成本，满足工业化要求。
发明内容
为了克服现有L-苯丙氨酸类化合物生产技术的上述缺陷，得到酶活性更高的酶催化剂，本发明人对氨基酸解氨酶进行了大量筛选，意外地发现了一种来源于交替假单胞菌Pseudoalteromonas sp.P1-26的组氨酸解氨酶，其能够在存在氨基供体的条件下，催化肉桂酸类化合物生成L-苯丙氨酸类化合物，具有很高的催化活性。而且，该组氨酸解氨酶适合于在大肠杆菌中表达，从而方便通过微生物发酵法大量获得。
因此，本发明的目的在于提供一种用于生产L-苯丙氨酸类化合物的组氨酸解氨酶。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种组氨酸解氨酶在生产L-苯丙氨酸类化合物中的用途，所述组氨酸解氨酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1：
MSEHSTTVFGKQRLSIEDIVHIALEQGAVALTSDRQFANKIDSAVAFLDKLLEDDGVIYGVTTGYGDSVTVKVPLDLVNELPLHLTRFHGCGLGDVFNQAQGRAILATRLTSLSQGYSGVSWEMLNLLRDFLNHNIVPVIPQEGSVGASGDLTPLSYVAGAMVGERDVYYKGEIKNSLEVMQELGLKPLKLRPKEGLAVMNGTAVMTALACLAYDRADYLAKLTSRITALASLALKGNSHHFDDILFSVKPHPGQQQVAAWIRGDLNHVEHPRNADRLQDRYSIRCAPHVIGVLQDSLPWFRQMIENELNSANDNPIIDGEGEHVLHGGHFYGGHIAMVMDSMKTAVANLADLADRQIASLVDTRYNNGLPSNLSASNDERRYINHGFKAVQIGASAYTAEALKLTMPASVFSRSTECHNQDKVSMGTIAARDCLRILQLTEQVVASTLLASIQGLRLRINSGELEFASLTSDVQSMYQDISEFFPLLDEDRPLEAVLRFTVDAIQTKRWSLYA。
上述组氨酸解氨酶是用作生物催化剂来催化化学反应的，其可以呈酶的形式或者微生物菌体形式。
上述微生物可以是任何表达组氨酸解氨酶SEQ ID NO:1的微生物，包括细菌和真菌，优选是大肠杆菌。
优选地，上述微生物可表达核苷酸序列为SEQ ID NO:2的基因，即编码组氨酸解氨酶SEQ ID NO:1的基因：
ATGAGCGAGCACAGCACCACCGTGTTCGGTAAACAGCGTCTGAGCATCGAGGACATTGTGCACATCGCGCTGGAACAAGGCGCGGTTGCGCTGACCAGCGATCGTCAGTTCGCGAACAAGATTGACAGCGCGGTTGCGTTTCTGGATAAACTGCTGGAGGACGATGGTGTTATCTACGGCGTGACCACCGGTTATGGCGACAGCGTGACCGTTAAGGTGCCGCTGGATCTGGTGAACGAACTGCCGCTGCACCTGACCCGTTTCCACGGTTGCGGCCTGGGTGACGTTTTTAACCAAGCGCAGGGTCGTGCGATCCTGGCGACCCGTCTGACCAGCCTGAGCCAAGGCTACAGCGGTGTGAGCTGGGAGATGCTGAACCTGCTGCGTGATTTTCTGAACCACAACATTGTTCCGGTGATCCCGCAGGAAGGCAGCGTTGGTGCGAGCGGTGACCTGACCCCGCTGAGCTATGTTGCGGGTGCGATGGTGGGCGAGCGTGATGTTTACTACAAGGGTGAAATCAAAAACAGCCTGGAAGTGATGCAGGAACTGGGCCTGAAGCCGCTGAAACTGCGTCCGAAAGAGGGTCTGGCGGTGATGAACGGTACCGCGGTTATGACCGCGCTGGCGTGCCTGGCGTACGACCGTGCGGATTATCTGGCGAAGCTGACCAGCCGTATCACCGCGCTGGCGAGCCTGGCGCTGAAGGGTAACAGCCACCACTTCGACGATATTCTGTTTAGCGTGAAGCCGCACCCGGGTCAGCAACAGGTTGCGGCGTGGATTCGTGGCGACCTGAACCACGTGGAACACCCGCGTAACGCGGACCGTCTGCAAGATCGTTACAGCATTCGTTGCGCGCCGCACGTTATCGGCGTGCTGCAAGATAGCCTGCCGTGGTTCCGTCAGATGATCGAGAACGAACTGAACAGCGCGAACGACAACCCGATCATTGATGGCGAGGGTGAACACGTTCTGCACGGTGGCCACTTTTACGGTGGCCACATTGCGATGGTGATGGACAGCATGAAAACCGCGGTTGCGAACCTGGCGGACCTGGCGGATCGTCAGATCGCGAGCCTGGTGGACACCCGTTATAACAACGGTCTGCCGAGCAACCTGAGCGCGAGCAACGATGAACGTCGTTACATTAACCACGGTTTCAAAGCGGTTCAAATCGGTGCGAGCGCGTATACCGCGGAGGCGCTGAAGCTGACCATGCCGGCGAGCGTGTTTAGCCGTAGCACCGAATGCCACAACCAGGACAAAGTTAGCATGGGTACCATTGCGGCGCGTGATTGCCTGCGTATCCTGCAACTGACCGAGCAGGTGGTTGCGAGCACCCTGCTGGCGAGCATTCAAGGTCTGCGTCTGCGTATCAACAGCGGCGAGCTGGAGTTCGCGAGCCTGACCAGCGACGTTCAAAGCATGTACCAGGATATTAGCGAGTTCTTCCCGCTGCTGGACGAGGATCGTCCGCTGGAAGCGGTGCTGCGTTTTACCGTTGACGCGATCCAGACCAAGCGTTGGAGCCTGTATGCGTAA。
当上述微生物是重组大肠杆菌时，其构建方法包括如下步骤：在SEQ ID NO:2两端设计酶切位点NdeI和BamHI，并亚克隆到载体pET24a上相应位点，从而获得重组质粒pET24a-psHAL；将构建好的重组质粒pET24a-psHAL转化大肠杆菌表达宿主，得到重组大肠杆菌。
优选地，所述重组大肠杆菌是T7表达系统，即以大肠杆菌T7噬箘体中的元件为核心构建的表达系统。
在L-苯丙氨酸类化合物的生产中，以肉桂酸类化合物和氨基供体为原料生产L-苯丙氨酸类化合物。
优选地，所述L-苯丙氨酸类化合物选自L-苯丙氨酸、3-溴苯基-L-丙氨酸、2-溴苯基-L-丙氨酸或者(S)-2-氯苯丙氨酸。
更优选所述L-苯丙氨酸类化合物是L-苯丙氨酸、3-溴苯基-L-丙氨酸或者(S)-2-氯苯丙氨酸。
优选地，所述氨基供体是氨(NH3)或者氨水(NH4OH)，优选氨水。氨水也可称为氢氧化铵或者一水合氨(NH3.H2O)。
更优选所述氨基供体是氨水。氨水浓度可以为5-25wt％、优选7-20wt％、更优选8-18wt％、更优选10-15wt％。
相比已报道的苯丙氨酸解氨酶RgPAL和ilPAL的酶催化工艺，使用本发明的组氨酸解氨酶催化合成L-苯丙氨酸类化合物，能够降低生产成本，提高生产效率，具有工业化前景。
附图说明
图1为本发明实施例中三种菌株表达的组氨酸解氨酶产物的SDS凝胶电泳图，其中条带1为菌株BL21(DE3)/pET24a-psHAL；条带2为菌株BL21(DE3)/pET24a-ilPAL；条带3为菌株DH5α/pUC57-RgPAL；M为Marker(KDa)。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
组氨酸解氨酶histidine ammonia-lyase(HAL)也称组氨酸酶(histidase)或者组氨酸脱氨酶。未描述方便起见，本文中有时将本发明的组氨酸解氨酶简写为psHAL。作为参照物，本文中有时将来源于Rhodotorula glutinis的苯丙氨酸解氨酶简写为RgPAL(CN101517089A中的SEQ ID NO.10)，将来源于Idiomarina loihiensis的苯丙氨酸解氨酶简写为ilPAL(CN101517089A中的SEQ ID NO.4)。
本发明的组氨酸解氨酶结构明确，因此本领域技术人员能够容易地获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。
这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
上述转化体宿主可以使任何适合表达组氨酸解氨酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是细菌，尤其优选大肠杆菌。
当作为生物催化剂用于生产L-苯丙氨酸类化合物时，本发明的组氨酸解氨酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。
本发明的组氨酸解氨酶分离纯化、包括固定化酶制备技术也是本领域技术人员所熟知的。
实施例
材料和方法
本文中的全基因合成、引物合成及测序皆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
LB培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，pH7.2，121℃高温高压灭菌20min；
TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4.3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油，pH 7.0-7.5，121℃高温高压灭菌20min；
斜面培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、20g/L琼脂粉，混匀后按30-40mL装液量分装到茄子瓶，竖立放置于121℃高温高压灭菌20min，降温后加入100μg/mL硫酸卡那霉素或氨苄青霉素，摆放成斜面，待冷凝成固体即可。
实施例1 psHAL表达菌种的构建
对Pseudoalteromonas sp.P1-26来源的组氨酸解氨酶psHAL的蛋白序列(NCBI登录号：KPZ73722，SEQ ID NO:1)进行适于大肠杆菌表达的密码子优化，并全基因合成该基因序列(SEQ ID NO:2)。由南京金斯瑞公司将合成的基因连接到金斯瑞标准载体pUC57上，获得质粒pUC57-psHAL。
将冻干的质粒pUC57-psHAL(4μg)(得自金斯瑞)溶于40μl ddH2O中，作为模板用于扩增psHAL基因片段，使该基因两端带有酶切位点NdeI和BamHI。引物设计如下：
psHAL-NdeI-F：GGAATTCCATATGAGCGAGCACAGCACCAC；
psHAL-BamHI-R：CGGGATCCTTACGCATACAGGCTCCAAC。
PCR反应体系包括：1X KOD neo plus buffer，0.2mM dNTP，25mM MgSO4，psHAL-NdeI-F和psHAL-BamHI-R各50pmol，pUC57-psHAL 50ng，KOD neo plus 1U，补水至总体系50μl。PCR扩增条件为：94℃2min，98℃10s，55℃30s，68℃1min，重复30个循环，68℃10min。
PCR反应结束后用琼脂糖凝胶电泳进行分析，检测到一条1.5kb左右的特异条带，为所需扩增产物。小量胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，用NdeI和BamHI于37℃双酶切6小时后，再次纯化回收。回收产物与同样酶切处理的表达载体pET24a(购自Novagen公司)用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，氯化钙法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取转化子进行测序验证，从而获得重组质粒pET24a-psHAL。该表达系统是T7表达系统。
将构建好的重组质粒pET24a-psHAL用氯化钙法转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到BL21(DE3)/pET24a-psHAL，即为表达组氨酸解氨酶psHAL的重组大肠杆菌。
实施例2 ilPAL表达菌种的构建
参照专利CN101517089A所披露的方法，构建Idiomarina loihiensis来源苯丙氨酸解氨酶ilPAL表达菌种，得到的菌种命名为Top10/pSE420-ilPAL。
实施例3 RgPAL表达菌种的构建
参照专利CN101517089A所披露的方法，构建R.glutinis来源苯丙氨酸解氨酶RgPAL表达菌种，得到的菌种命名为DH5α/pUC57-RgPAL。
实施例4 BL21(DE3)/pET24a-ilPAL表达菌种的构建
对CN101517089A中编码苯丙氨酸解氨酶ilPAL(CN101517089A中的SEQ ID NO.4)的基因序列(CN101517089A中的SEQ ID NO.3)进行适于大肠杆菌表达的密码子优化，并全基因合成该基因序列。由南京金斯瑞公司将合成的基因连接到金斯瑞标准载体pUC57上，获得质粒pUC57-ilPAL。
将冻干的质粒pUC57-ilPAL(4μg)(南京金斯瑞公司提供)溶于40μl ddH2O中，作为模板用于扩增ilPAL基因片段，使该基因两端带有酶切位点NdeI和BamHI。引物设计如下：
ilPAL-NdeI-F：GGAATTCCATATGACCACCAGCATCATTGC；
ilPAL-BamHI-R：CGGGATCCTTACGCCGGTTCCTGATACA。
PCR反应体系包括：1X KOD neo plus buffer，0.2mM dNTP，25mM MgSO4，ilPAL-NdeI-F和ilPAL-BamHI-R各50pmol，pUC57-ilPAL 50ng，KOD neo plus 1U，补水至总体系50μl。PCR扩增条件为：94℃2min，98℃10s，55℃30s，68℃1min，重复30个循环，68℃10min。
PCR反应结束后用琼脂糖凝胶电泳进行分析，检测到一条1.5kb左右的特异条带，为所需扩增产物。小量胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，用NdeI和BamHI于37℃双酶切6小时后，再次纯化回收。回收产物与同样酶切处理的表达载体pET24a(购自Novagen)用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，氯化钙法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取转化子进行测序验证，从而获得重组质粒pET24a-ilPAL。该表达系统是T7表达系统。
将构建好的重组质粒pET24a-ilPAL用氯化钙法转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到BL21(DE3)/pET24a-ilPAL。
实施例5菌株发酵
种子活化：分别取四种菌株BL21(DE3)/pET24a-psHAL、BL21(DE3)/pET24a-ilPAL、Top10/pSE420-ilPAL和DH5α/pUC57-RgPAL的种子甘油保藏管，各取100μL种子保藏液，用接种环均匀涂抹于茄子瓶斜面，然后置于37℃培养箱培养过夜(18h)；
种子培养：各取100mL无菌水导入茄子瓶做成菌悬液，取菌悬液50μL接入装有50mLTB培养基的250mL摇瓶，30℃，220rpm培养16h；
发酵：将一级种子培养液接入装有1L TB培养基的5L摇瓶，37℃，220rpm培养4-6h后，加入0.3mM IPTG并降温至28℃，220rpm诱导培养12h。
菌体收集：收集各个菌株的发酵液，置于离心机4000rpm离心30min，弃上清后收集菌体，放置于-20℃冷冻备用，24小时内使用。
实施例6蛋白电泳检测表达产物
分别称取三种菌株BL21(DE3)/pET24a-psHAL、BL21(DE3)/pET24a-ilPAL和DH5α/pUC57-RgPAL的适量菌体重悬于去离子水中，制成浓度为20g/l的菌悬液，超声细胞破碎。取1mL破胞液于12000rpm离心3min，吸取15μl上清液与5μl 4XSDS蛋白上样缓冲液(TakaraCode：D621)混匀煮沸5min，离心后取10μl进行SDS-PAGE分析。采用5％浓缩胶和12％分离胶，电泳结束后凝胶用考马斯亮蓝R250染色。结果如图1所示。
实施例7三种酶对反式-2-氯肉桂酸的催化反应
分别称取2.5g反式-2-氯肉桂酸加入23mL 8wt％氨水溶液，搅拌均匀后用乙酸调pH至11，加热至35℃溶解，最后加入0.5g各菌体，密封瓶口，30℃150rpm振荡反应1小时，取500μL转化液与等体积10wt％盐酸混合终止反应，通过HPLC分析测定(S)-2-氯苯丙氨酸的含量。
表1三种PAL对反式-2氯肉桂酸的转化能力比较
酶表达菌株 产量(g/L)
BL21(DE3)/pET24a-psHAL 11.0
Top10/pSE420-ilPAL 6.9
DH5α/pUC57-RgPAL nd*
*nd：由于底物抑制，所以未检测到产物。
实验结果表明，本发明所筛选的组氨酸解氨酶psHAL催化肉桂酸类化合物反式-2-氯肉桂酸生成(S)-2-氯苯丙氨酸的催化活性明显高于现有技术报道的苯丙氨酸解氨酶RgPAL和ilPAL。
实施例8两种T7表达系统表达的酶对反式-2-氯肉桂酸的催化反应
称取2.5g反式-2-氯肉桂酸加入23mL 8wt％氨水溶液，搅拌均匀后用乙酸调pH至11，加热至35℃溶解，最后加入0.5g各菌体，密封瓶口，30℃150rpm振荡反应1小时，取500μl转化液与等体积10wt％盐酸混合终止反应，通过HPLC分析测定(S)-2-氯苯丙氨酸的含量。
表2两种T7表达系统表达的酶对反式-2-氯肉桂酸的转化能力比较
酶表达菌株 产量(g/L)
BL21(DE3)/pET24a-psHAL 15.7
BL21(DE3)/pET24a-ilPAL 6.8
实验结果表明，本发明所筛选的组氨酸解氨酶psHAL通过T7表达系统表达，其催化肉桂酸类化合物反式-2-氯肉桂酸生成(S)-2-氯苯丙氨酸的催化活性明显高于通过T7表达系统表达的苯丙氨酸解氨酶ilPAL。
实施例9两种T7表达系统表达的酶对反式肉桂酸的催化反应
分别称取2.5g反式肉桂酸加入23mL8wt％氨水溶液，搅拌均匀后用乙酸调pH至11，加热至35℃溶解，最后加入0.5g各菌体，密封瓶口，30℃150rpm振荡反应1小时，取500μL转化液与等体积10wt％盐酸混合终止反应，通过HPLC分析测定L-苯丙氨酸的含量。
表3两种T7表达系统表达的酶对反式肉桂酸的转化能力比较
酶表达菌株 产量(g/L)
BL21(DE3)/pET24a-psHAL 8.0
BL21(DE3)/pET24a-ilPAL 3.0
实验结果表明，本发明所筛选的组氨酸解氨酶psHAL催化反式肉桂酸生成L-苯丙氨酸的催化活性明显高于现有技术报道的苯丙氨酸解氨酶ilPAL。
实施例10两种T7表达系统的酶对L-3-溴苯丙酮酸的催化反应
分别称取0.5g L-3-溴苯丙酮酸加入23mL 8wt％氨水溶液，搅拌均匀后用乙酸调pH至11，加热至35℃溶解，最后加入0.5g各菌体，密封瓶口，30℃、150rpm振荡反应1小时，取500μL转化液与等体积10wt％盐酸混合终止反应，通过HPLC分析测定3-溴苯基-L-丙氨酸的含量。
表4两种T7表达系统的酶对L-3-溴苯丙酮酸的转化能力比较
酶表达菌株 产量(g/L)
BL21(DE3)/pET24a-psHAL 4.6
BL21(DE3)/pET24a-ilPAL 2.2
实验结果表明，本发明所筛选的组氨酸解氨酶psHAL催化L-3-溴苯丙酮酸生成3-溴苯基-L-丙氨酸的催化活性明显高于现有技术报道的苯丙氨酸解氨酶ilPAL。
综上所述，与两种苯丙氨酸解氨酶RgPAL和ilPAL相比，本发明所筛选的组氨酸解氨酶psHAL催化肉桂酸类化合物生成L-苯丙氨酸类化合物的酶催化活力有显著的提高，具有工业化应用潜力。
序列表
<110> 湖州颐辉生物科技有限公司
<120> 一种组氨酸解氨酶及其用途
<130> SHPI1600986
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 514
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ser Glu His Ser Thr Thr Val Phe Gly Lys Gln Arg Leu Ser Ile
1 5 10 15
Glu Asp Ile Val His Ile Ala Leu Glu Gln Gly Ala Val Ala Leu Thr
20 25 30
Ser Asp Arg Gln Phe Ala Asn Lys Ile Asp Ser Ala Val Ala Phe Leu
35 40 45
Asp Lys Leu Leu Glu Asp Asp Gly Val Ile Tyr Gly Val Thr Thr Gly
50 55 60
Tyr Gly Asp Ser Val Thr Val Lys Val Pro Leu Asp Leu Val Asn Glu
65 70 75 80
Leu Pro Leu His Leu Thr Arg Phe His Gly Cys Gly Leu Gly Asp Val
85 90 95
Phe Asn Gln Ala Gln Gly Arg Ala Ile Leu Ala Thr Arg Leu Thr Ser
100 105 110
Leu Ser Gln Gly Tyr Ser Gly Val Ser Trp Glu Met Leu Asn Leu Leu
115 120 125
Arg Asp Phe Leu Asn His Asn Ile Val Pro Val Ile Pro Gln Glu Gly
130 135 140
Ser Val Gly Ala Ser Gly Asp Leu Thr Pro Leu Ser Tyr Val Ala Gly
145 150 155 160
Ala Met Val Gly Glu Arg Asp Val Tyr Tyr Lys Gly Glu Ile Lys Asn
165 170 175
Ser Leu Glu Val Met Gln Glu Leu Gly Leu Lys Pro Leu Lys Leu Arg
180 185 190
Pro Lys Glu Gly Leu Ala Val Met Asn Gly Thr Ala Val Met Thr Ala
195 200 205
Leu Ala Cys Leu Ala Tyr Asp Arg Ala Asp Tyr Leu Ala Lys Leu Thr
210 215 220
Ser Arg Ile Thr Ala Leu Ala Ser Leu Ala Leu Lys Gly Asn Ser His
225 230 235 240
His Phe Asp Asp Ile Leu Phe Ser Val Lys Pro His Pro Gly Gln Gln
245 250 255
Gln Val Ala Ala Trp Ile Arg Gly Asp Leu Asn His Val Glu His Pro
260 265 270
Arg Asn Ala Asp Arg Leu Gln Asp Arg Tyr Ser Ile Arg Cys Ala Pro
275 280 285
His Val Ile Gly Val Leu Gln Asp Ser Leu Pro Trp Phe Arg Gln Met
290 295 300
Ile Glu Asn Glu Leu Asn Ser Ala Asn Asp Asn Pro Ile Ile Asp Gly
305 310 315 320
Glu Gly Glu His Val Leu His Gly Gly His Phe Tyr Gly Gly His Ile
325 330 335
Ala Met Val Met Asp Ser Met Lys Thr Ala Val Ala Asn Leu Ala Asp
340 345 350
Leu Ala Asp Arg Gln Ile Ala Ser Leu Val Asp Thr Arg Tyr Asn Asn
355 360 365
Gly Leu Pro Ser Asn Leu Ser Ala Ser Asn Asp Glu Arg Arg Tyr Ile
370 375 380
Asn His Gly Phe Lys Ala Val Gln Ile Gly Ala Ser Ala Tyr Thr Ala
385 390 395 400
Glu Ala Leu Lys Leu Thr Met Pro Ala Ser Val Phe Ser Arg Ser Thr
405 410 415
Glu Cys His Asn Gln Asp Lys Val Ser Met Gly Thr Ile Ala Ala Arg
420 425 430
Asp Cys Leu Arg Ile Leu Gln Leu Thr Glu Gln Val Val Ala Ser Thr
435 440 445
Leu Leu Ala Ser Ile Gln Gly Leu Arg Leu Arg Ile Asn Ser Gly Glu
450 455 460
Leu Glu Phe Ala Ser Leu Thr Ser Asp Val Gln Ser Met Tyr Gln Asp
465 470 475 480
Ile Ser Glu Phe Phe Pro Leu Leu Asp Glu Asp Arg Pro Leu Glu Ala
485 490 495
Val Leu Arg Phe Thr Val Asp Ala Ile Gln Thr Lys Arg Trp Ser Leu
500 505 510
Tyr Ala
<210> 2
<211> 1545
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgagcgagc acagcaccac cgtgttcggt aaacagcgtc tgagcatcga ggacattgtg 60
cacatcgcgc tggaacaagg cgcggttgcg ctgaccagcg atcgtcagtt cgcgaacaag 120
attgacagcg cggttgcgtt tctggataaa ctgctggagg acgatggtgt tatctacggc 180
gtgaccaccg gttatggcga cagcgtgacc gttaaggtgc cgctggatct ggtgaacgaa 240
ctgccgctgc acctgacccg tttccacggt tgcggcctgg gtgacgtttt taaccaagcg 300
cagggtcgtg cgatcctggc gacccgtctg accagcctga gccaaggcta cagcggtgtg 360
agctgggaga tgctgaacct gctgcgtgat tttctgaacc acaacattgt tccggtgatc 420
ccgcaggaag gcagcgttgg tgcgagcggt gacctgaccc cgctgagcta tgttgcgggt 480
gcgatggtgg gcgagcgtga tgtttactac aagggtgaaa tcaaaaacag cctggaagtg 540
atgcaggaac tgggcctgaa gccgctgaaa ctgcgtccga aagagggtct ggcggtgatg 600
aacggtaccg cggttatgac cgcgctggcg tgcctggcgt acgaccgtgc ggattatctg 660
gcgaagctga ccagccgtat caccgcgctg gcgagcctgg cgctgaaggg taacagccac 720
cacttcgacg atattctgtt tagcgtgaag ccgcacccgg gtcagcaaca ggttgcggcg 780
tggattcgtg gcgacctgaa ccacgtggaa cacccgcgta acgcggaccg tctgcaagat 840
cgttacagca ttcgttgcgc gccgcacgtt atcggcgtgc tgcaagatag cctgccgtgg 900
ttccgtcaga tgatcgagaa cgaactgaac agcgcgaacg acaacccgat cattgatggc 960
gagggtgaac acgttctgca cggtggccac ttttacggtg gccacattgc gatggtgatg 1020
gacagcatga aaaccgcggt tgcgaacctg gcggacctgg cggatcgtca gatcgcgagc 1080
ctggtggaca cccgttataa caacggtctg ccgagcaacc tgagcgcgag caacgatgaa 1140
cgtcgttaca ttaaccacgg tttcaaagcg gttcaaatcg gtgcgagcgc gtataccgcg 1200
gaggcgctga agctgaccat gccggcgagc gtgtttagcc gtagcaccga atgccacaac 1260
caggacaaag ttagcatggg taccattgcg gcgcgtgatt gcctgcgtat cctgcaactg 1320
accgagcagg tggttgcgag caccctgctg gcgagcattc aaggtctgcg tctgcgtatc 1380
aacagcggcg agctggagtt cgcgagcctg accagcgacg ttcaaagcat gtaccaggat 1440
attagcgagt tcttcccgct gctggacgag gatcgtccgc tggaagcggt gctgcgtttt 1500
accgttgacg cgatccagac caagcgttgg agcctgtatg cgtaa 1545

Claims (8)

1.一种组氨酸解氨酶在生产L-苯丙氨酸类化合物中的用途，所述组氨酸解氨酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其通过在重组大肠杆菌中表达得到；其中
以肉桂酸类化合物和氨基供体为原料生产L-苯丙氨酸类化合物；
所述L-苯丙氨酸类化合物选自L-苯丙氨酸、3-溴苯基-L-丙氨酸或者(S)-2-氯苯丙氨酸。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组氨酸解氨酶呈酶的形式或微生物菌体形式。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述重组大肠杆菌是T7表达系统。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述重组大肠杆菌可表达核苷酸序列为SEQID NO:2的基因。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述重组大肠杆菌的构建方法包括如下步骤：在SEQ ID NO:2两端设计酶切位点NdeI和BamHI，并亚克隆到载体pET24a上相应位点，从而获得重组质粒pET24a-psHAL；将构建好的重组质粒pET24a-psHAL转化大肠杆菌表达宿主，得到重组大肠杆菌。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述L-苯丙氨酸类化合物是L-苯丙氨酸或者(S)-2-氯苯丙氨酸。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述氨基供体是氨或氨水。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述氨基供体是氨水。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN105324483A (zh) * 2013-04-18 2016-02-10 科德克希思公司 工程化苯丙氨酸解氨酶多肽

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101517089A (zh) * 2006-09-12 2009-08-26 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 使用源自Idiomarina loihiensis的苯丙氨酸解氨酶从肉桂酸衍生物生产光学活性苯丙氨酸化合物的方法
CN105324483A (zh) * 2013-04-18 2016-02-10 科德克希思公司 工程化苯丙氨酸解氨酶多肽

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