ES2890955T3 - Polipéptidos de fenilalanina amoníaco liasa modificados - Google Patents

Polipéptidos de fenilalanina amoníaco liasa modificados Download PDF

Info

Publication number
ES2890955T3
ES2890955T3 ES19163814T ES19163814T ES2890955T3 ES 2890955 T3 ES2890955 T3 ES 2890955T3 ES 19163814 T ES19163814 T ES 19163814T ES 19163814 T ES19163814 T ES 19163814T ES 2890955 T3 ES2890955 T3 ES 2890955T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
pal
seq
amino acid
sequence
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES19163814T
Other languages
English (en)
Inventor
Gjalt Huisman
Nicholas Agard
Benjamin Mijts
Jonathan Vroom
Xiyun Zhang
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Codexis Inc
Original Assignee
Codexis Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Codexis Inc filed Critical Codexis Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2890955T3 publication Critical patent/ES2890955T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y403/00—Carbon-nitrogen lyases (4.3)
    • C12Y403/01—Ammonia-lyases (4.3.1)
    • C12Y403/01005—Phenylalanine ammonia-lyase (4.3.1.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y403/00—Carbon-nitrogen lyases (4.3)
    • C12Y403/01—Ammonia-lyases (4.3.1)
    • C12Y403/01024—Phenylalanine ammonia-lyase (4.3.1.24)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)

Abstract

Un polipéptido modificado que tiene actividad de fenilalanina amoniaco liasa (PAL) que comprende: a) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 4 o un fragmento funcional de la misma; b) por lo menos una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 4 o el fragmento funcional de la misma en una o más posiciones de aminoácidos; y c) que muestra sensibilidad reducida a la proteólisis en comparación con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 4, en donde la diferencia de residuos de aminoácidos es R305L o R305M cuando se alinean con la SEQ ID NO: 4, y en donde las posiciones de los aminoácidos se numeran con referencia a la SEQ ID NO: 4.

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos de fenilalanina amoníaco liasa modificados
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a polipéptidos de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) modificados y composiciones de los mismos, así como polinucleótidos que codifican la polipéptidos de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) modificados. En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados se optimizan para proporcionar una actividad catalítica mejorada, así como una sensibilidad reducida a la proteólisis y una tolerancia incrementada a niveles de pH ácidos. En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados se desinmunizan. La invención también se refiere al uso de las composiciones que comprenden los polipéptidos PAL modificados para fines terapéuticos e industriales.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La fenilalanina amoníaco-liasa (PAL), junto con histidina amoníaco-liasa (HAL) y tirosina amoníaco-liasa (TAL) son miembros de la familia liasa de aminoácidos aromáticos (CE 4,3,1,23-1,25 y 4,3,1,3). Más específicamente, las enzimas que tienen actividad PAL (EC 4,3,1,23-1,25 y clasificadas previamente como EC4,3,1,5) catalizan la desaminación no oxidativa de L-fenilalanina en ácido (E)-cinámico. PAL es una enzima no mamífera que se distribuye ampliamente en las plantas y también se ha identificado en hongos y en un número limitado de bacterias. Las enzimas PAL pueden usarse como una proteína terapéutica para el tratamiento del trastorno metabólico, la fenilcetonuria (PKU). La PKU es un trastorno genético metabólico autosómico en el que la enzima hepática fenilalanina hidroxilasa (HAP) o una o más de las enzimas involucradas en la síntesis o el reciclaje del cofactor tetrahidrobiopterina no es funcional debido a una mutación en uno de los genes correspondientes. Esta falta de funcionalidad resulta en altos niveles de fenilalanina en el torrente sanguíneo. La fenilalanina se convierte en fenilpiruvato (fenilcetona) y otros derivados. En los seres humanos, si la PKU no se trata de manera temprana, los altos niveles de fenilalanina y algunos de sus productos de descomposición pueden causar problemas médicos importantes, como discapacidad intelectual, microcefalia y convulsiones. Numerosos estudios se han centrado en el uso de PAL en el tratamiento de la PKU mediante sustitución enzimática (Ambrus et al., Science 201: 837-839 [1978]; Bourget et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 10: 57-59 [1984] y Sarkissian y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 96: 2339-2344 [1999]).
Un método de desintoxicación de fenilalanina en la corriente de la sangre es el uso de PAL recombinante inyectable y variantes de PAL modificadas por pegilación (PEG-PAL). Se ha demostrado que la pegilación mejora la semivida de la enzima y reduce la respuesta antigénica del sujeto (ver, por ejemplo, los documentos WO 2008/153776, WO 2011/097335 y US 7.531.341). Las variantes de pAl útiles en las composiciones de PEG-PAL se han descrito como variantes de Nostoc punctiforme de tipo silvestre (NpPAL); Anabaena variabilis (AvPAL) y Rhodosporidium toruloides (RtPAL). En particular, se han descrito variantes de AvPAL de tipo silvestre en las que los residuos de cisteína en las posiciones 64, 318, 503 y 565 se han sustituido con serina (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Números: 7.790.433; 7.560.263; y 7.537.923).
Una vía alternativa de administración PAL como medio para reducir la concentración plasmática de L-fenilalanina en sujetos PKU es una formulación no invasiva tal como una formulación oral (Sarkissian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 96: 2339-2344 [1999]). Una ventaja clave de la administración oral de PAL es la reducción de la exposición de la enzima al sistema inmune, minimizando así la respuesta inmune que se observa con PEG-PAL inyectable. Sin embargo, una limitación importante para la formulación oral de PAL es la pérdida de actividad enzimática en el estómago y la luz intestinal. Para ser eficaz y funcional, PAL debe resistir la degradación por pH ácidos y proteasas como la tripsina, la quimotripsina, las carboxipeptidasas y la pepsina que normalmente degradan los alimentos proteínicos a oligopéptidos y aminoácidos. En algunos estudios previos (Sarkissian, supra) para lograr un efecto significativo para la administración oral de PAL, se requirió una gran cantidad de la enzima en parte debido a la degradación enzimática por las proteasas y en parte debido a una actividad específica relativamente baja a pH 7,0, Se han explorado diversos medios para suprimir la degradación de PAL en la digestión (Kim et al., Molec. Therap., 10: 220 - 224 [2004]; y Shah et al., Int. J. Pharmaceut., 356: 61-68 [2008]).
Un enfoque para aumentar la eficacia de PAL en las duras condiciones del tracto digestivo es proporcionar polipéptidos PAL modificados que son tolerantes a las duras condiciones inherentes. Kang et al. utilizó mutagénesis dirigida al sitio de un sitio de escisión de quimotripsina y pegilación de lisinas de superficie de un AvPAL para reducir la inactivación proteolítica (ver, Kang et al., Mol. Gen. Metabol., 99: 4-9 [2010]). En estos estudios, se mutaron específicamente diez sitios de escisión y todos menos dos de estos mutantes resultantes (F18A y R94G) perdieron más del 50% de la actividad enzimática original. Ninguno de los mutantes mostró mayor actividad y el mutante F18A mostró un ligero aumento en la resistencia a la tripsina (Kang et al., Supra). Otros estudios con PAL, aunque son efectivos, generalmente no han resultado en una enzima de vida más larga. Por lo tanto, la administración oral de los mutantes PAL descritos anteriormente y sus derivados no da como resultado un tratamiento efectivo de la PKU.
A pesar de los progresos realizados con diversas formulaciones de PAL sigue habiendo una necesidad de polipéptidos PAL que tienen propiedades mejoradas para la administración oral. Estas propiedades mejoradas incluyen, sin limitación, una vida media mayor, una actividad catalítica incrementada, una estabilidad mejorada de las condiciones en la vía digestiva y una agregación reducida.
Además de las aplicaciones terapéuticas, las enzimas PAL también se pueden usar en la síntesis industrial de L-fenilalanina y otros derivados de L-fenilalanina sustituidos. Estos derivados pueden ser utilizados como precursores farmacéuticos (Gloge et al., Chem., 6: 3386-3390 [2000]; Bartsch et al., Prot. Eng. Des. Sel., 23: 929­ 933 [2010]; y Turner, Curr. Opin. Chem. Biol., 234-240 [2011]).
Las enzimas PAL también se pueden usar en aplicaciones agrícolas. PAL juega un papel importante en la biosíntesis de fenilpropanoides (como los flavonoides y la lignina) en plantas, hongos y bacterias y puede actuar como una enzima relacionada con la defensa (Bate et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91: 7608-7612 [1994]). La modulación de la actividad PAL mediante el uso de polipéptidos recombinantes que tienen actividad PAL podría potencialmente conducir a herbicidas efectivos.
Kang et al. (Mol. Gen. and Metabol., 99:4-p [2010]) divulga estrategias para la administración oral de fenilalanina amoniaco liasa para la fenilcetonuria.
SUMARIO
La invención proporciona un polipéptido modificado que tiene actividad de fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) que comprende: a) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 4 o un fragmento funcional de la misma; b) por lo menos una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 4 o el fragmento funcional de la misma en una o más posiciones de aminoácidos; y c) que muestra sensibilidad reducida a la proteólisis en comparación con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 4, en donde la diferencia de residuos de aminoácidos es R305L o R305M cuando se alinea con la SEQ ID NO: 4, y en donde las posiciones de aminoácidos se numeran con referencia a la SEQ ID NO: 4.
La invención también proporciona una secuencia de polinucleótidos que codifica por lo menos un polipéptido modificado de la invención, opcionalmente en donde:
a) dicho polinucleótido está enlazado operativamente con una secuencia de control; y/o
b) dicho polinucleótido está optimizado con codones.
La invención proporciona además un vector de expresión que comprende por lo menos una secuencia de polinucleótidos de la invención, y por lo menos una secuencia de control, opcionalmente en donde dicha secuencia d control es un promotor, por ejemplo un promotor heterólogo.
La invención también proporciona una célula huésped transformada con por lo menos una secuencia de polinucleótidos de la invención y/o el vector de la invención, opcionalmente en donde dicha célula huésped es E. coli.
La invención proporciona además un método para producir un polipéptido de PAL modificado en una célula huésped que comprende cultivar una célula huésped que comprende por lo menos un polinucleótido que codifica por lo menos un polipéptido modificado que tiene actividad de fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) de la invención, y/o por lo menos una secuencia de polinucleótidos de la invención, y/o por lo menos un vector de la invención, en condiciones de cultivo adecuadas, de tal manera que se produce el por lo menos un polipéptido de PAL modificado, opcionalmente en donde dicho método comprende además recuperar por lo menos un polipéptido modificado que tiene fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) del cultivo y/o células huésped, por ejemplo en donde dicho método comprende además el paso de purificar dicho por lo menos un polipéptido modificado que ha producido fenilalanina amoniaco-liasa (PAL).
La invención también proporciona una composición que comprende por lo menos un polipéptido modificado que tiene actividad de fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) de la invención, opcionalmente en donde dicha composición es: a) una composición farmacéutica, preferiblemente en donde dicha composición farmacéutica comprende además por lo menos un excipiente y/o portador farmacéuticamente aceptable; y/o b) es adecuada para el tratamiento de fenilcetonuria.
La invención proporciona además un polipéptido modificado de acuerdo con la invención o una composición de la invención para su uso en terapia.
La invención también proporciona una composición farmacéutica de la invención para su uso en un método para tratar y/o prevenir los síntomas de fenilcetonuria en un sujeto, opcionalmente en donde: a) se mejoran dichos síntomas de fenilcetonuria; b) dicho sujeto puede comer una dieta menos restringida en el contenido metionina, fenilalanina y/o tirosina que las dietas requeridas por sujetos a los que no se les ha proporciona por lo menos una composición farmacéutica que comprende por lo menos un polipéptido modificado que tiene actividad de fenilalanina amoniaco liasa (PAL) de la invención; c) dicho sujeto es un bebé o niño; o d) dicho sujeto es un adulto o adulto joven.
La presente invención se refiere a péptidos de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) y composiciones de los mismos, así como polinucleótidos que codifican los polipéptidos de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) modificados. En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos PAL modificados se optimizan para proporcionar una actividad catalítica mejorada, así como una sensibilidad reducida a la proteólisis y una tolerancia incrementada a niveles de pH ácidos. En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados se desinmunizan. La invención también se refiere al uso de las composiciones que comprenden los polipéptidos PAL modificados para fines terapéuticos e industriales. En algunos aspectos, la presente divulgación se refiere a polipéptidos de fenilalanina amoniaco - liasa (PAL) y fragmentos biológicamente activos y análogos de los mismos que tienen propiedades mejoradas tales como tolerancia incrementada al pH ácido y/o sensibilidad reducida a la proteolisis.
Los polipéptidos PAL modificados y fragmentos biológicamente activos y análogos de los mismos pueden tener propiedades mejoradas cuando se comparan con un polipéptido PAL de referencia bajo esencialmente las mismas condiciones. También se describen métodos para usar los polipéptidos PAL modificados y fragmentos biológicamente activos y análogos de los mismos en composiciones terapéuticas e/o industriales y métodos para usar tales composiciones con propósitos terapéuticos y/o industriales.
En un primer aspecto, la divulgación proporciona polipéptidos de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) modificados en los que el polipéptido PAL modificado tiene una propiedad mejorada seleccionada del grupo de i) el aumento de la actividad catalítica, ii) sensibilidad a la proteolisis reducida, iii) mayor tolerancia al pH ácido, iv) agregación reducida, o una combinación de cualquiera de i), ii), iii) o iv) en comparación con la secuencia de referencia cuando se mide esencialmente en las mismas condiciones. En algunas realizaciones específicas, los polipéptidos PAL modificados tienen dos propiedades mejoradas. La propiedad mejorada puede ser una sensibilidad reducida a la proteólisis o la propiedad mejorada es una tolerancia al pH ácido aumentada.
En un segundo aspecto, los polipéptidos PAL modificados incluyen proteínas que comprenden al menos 85% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 4, o un fragmento funcional de la misma y una diferencia de residuo de aminoácido en una posición correspondiente a las posiciones X39; X91; X158; X180; X195; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X307; X308; X326; X349; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X522; X524; y X528, cuando se alinean de manera óptima con el polipéptido de la SEQ ID NO: 4.
En algunos casos específicos del primer y el segundo aspectos, los polipéptidos PAL modificados comprenden al menos una diferencia de residuos de aminoácidos de las posiciones de restos de uno o más aminoácidos correspondientes a A39; A91; Y158; S180; K195; T243; 1245; A256; L257; N270; N290; H307; E308; 1326; L349; L364; A394; S399; N400; P404; L407; F443; N453; Y459; T460; T463; N474; K522; T524; y P528, cuando se alinean de manera óptima con el polipéptido de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones específicas, los polipéptidos PAL modificados comprenden al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, y al menos 20 diferencias de residuos de aminoácidos del polipéptido de referencia que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.
Los polipéptidos PAL modificados pueden comprender por lo menos 90%, (por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%) identidad de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 4. En otras realizaciones específicas adicionales, los polipéptidos PAL modificados comprenden al menos el 90%, (al menos el 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%) identidad de secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 4, y comprende una o más de las siguientes sustituciones A39V; A91V; Y158H; S180A; K195E; T243I/L; I245L; A256G; L257W/A; N270K; N290G; H307G/Q/M; E308Q; I326F; L349M; L364Q; A394V; S399N; N400K; P404A; L407V; F443H; N453G; Y459F; T460G; T463N; N474Q; K522Y/F/N; T524S; y P528L.
En otras realizaciones específicas, los polipéptidos PAL modificados se derivan de uno de tipo silvestre Anabaena Variabilis PAL (como ATCC29413; secuencia de referencia proteína NCBI YP_324488,1; SEQ ID NO: 4).
En un tercer aspecto, los polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) dados a conocer en el presente documento comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10, o un fragmento funcional de la misma.
En un cuarto aspecto, los polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) se da a conocer en el presente documento comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10, o un fragmento funcional de la misma y que comprende además una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 10, en una, dos, tres, cuatro, cinco o seis posiciones de aminoácidos más.
En un quinto aspecto, se describe una secuencia de polinucleótido que codifica una cualquiera de los polipéptidos PAL modificados como se describe en el presente documento.
En un sexto aspecto, se describe una composición farmacéutica o una composición industrial que comprende uno cualquiera de los polipéptidos PAL modificados como se describe en el presente documento.
En algunos aspectos, se divulgan polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníacoliasa (PAL) que comprende a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia para hacer referencia a la secuencia de SEQ ID NO: 4 o un fragmento funcional de la misma; b) una diferencia de residuo de aminoácido en comparación con la SEQ ID NO: 4 o el fragmento funcional de la misma en una o más posiciones de aminoácidos; y c) que exhibe una propiedad mejorada seleccionada de i) actividad catalítica mejorada, ii) sensibilidad reducida a la proteólisis, iii) tolerancia incrementada al pH ácido, iv) agregación reducida o una combinación de cualquiera de i), ii), iii) o iv) en comparación con la secuencia de referencia. En algunas realizaciones, una o más posiciones de aminoácidos se seleccionan de X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364;
X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; X564;
y/o combinaciones de los mismos cuando se alinean de manera óptima con la secuencia de aminoácidos de la SEQ
ID NO: 4. En algunas realizaciones adicionales, la propiedad mejorada se selecciona de sensibilidad reducida a la proteólisis y/o tolerancia incrementada al pH ácido. En otras realizaciones adicionales, la secuencia de referencia es un PAL de tipo silvestre derivado de Anabaena variabilis. En algunas realizaciones adicionales, el residuo de aminoácido de la secuencia de referencia de la SEQ ID NO: 4 corresponde a A39; T54; G59, S73; A91; Y158; S180;
K195; A112; R134; Q240; T243; 1245; A256; L257; N270; N290; Y304; R305; H307; E308; 1326; L349; D353; L364;
A394; S399; N400; P404; L407; F443; N453; Y459; T460; T463; N474; E509; Q521; K522; T524; P528; S546; y/o P564. En algunas realizaciones, la diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 4 se selecciona de una o más de las siguientes sustituciones A39V; T54K; G59R; S73K; A112C; R134Q; A91V; Y158H;
S180A; K195E; Q240R/W; T243I/L; I245L; A256G; L257W/A; N270K; N290G; Y304H; R305M; H307G/Q/M; E308Q;
I326F; L349M; D353A/N; L364Q; A394V; S399N; N400K; P404A; L407V; F443H; N453G; Y459F; T460G; T463N;
N474Q; E509L; Q521K/S; K522Y/F/N; T524S; P528L; S546R; y P564 G/L/M; cuando se alinea de manera óptima con el polipéptido de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones adicionales, el polipéptido diseñado tiene al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99%, o aproximadamente el 100% de identidad de secuencia para hacer referencia a la secuencia SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones adicionales, el polipéptido diseñado tiene al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, a al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia a la secuencia de referencia SEQ ID NO: 4.
En algunas realizaciones adicionales, el polipéptido diseñado tiene al menos aproximadamente un 90% de identidad de secuencia para hacer referencia a la secuencia SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones adicionales, el polipéptido diseñado tiene al menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia para hacer referencia a la secuencia SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones adicionales, el polipéptido diseñado tiene al menos aproximadamente un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4; y una diferencia de residuo de aminoácido en la posición H307, En algunas realizaciones adicionales, el polipéptido diseñado tiene al menos un 90% de identidad de secuencia para hacer referencia a la secuencia SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones adicionales, el polipéptido diseñado tiene al menos un 95% de identidad de secuencia para hacer referencia a la secuencia SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones adicionales, el polipéptido diseñado tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4; y una diferencia de residuo de aminoácido en la posición H307. En algunas realizaciones adicionales, la diferencia de residuos de aminoácidos es H307G/Q/M. En algunas realizaciones adicionales, la diferencia de residuos de aminoácidos se selecciona de una combinación de uno o más de A39; A91; Q240; A256; N290; Y304; R305; H307; D353 A394; S399; P404; L407; Q521; K522; y T524,
También se describen polipéptidos modificados descritos que tienen actividad de fenilalanina amoniacoliasa (PAL) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o al menos aproximadamente 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 y/o 14, o un fragmento funcional de los mismos. En algunas realizaciones, los polipéptidos modificados que tienen actividad fenilalanina amoniacoliasa (PAL) comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 y/o 14, o un fragmento de la misma.
Los polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) pueden comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, y/o 14, o un fragmento funcional de la misma.
Los polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, o el 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 y/o 14, o un fragmento funcional de la misma. Los polipéptidos modificados que tienen actividad fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) pueden comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 y/o 14, o un fragmento de la misma. Los polipéptidos modificados que tienen actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) pueden comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 y/o 14, o un fragmento funcional de la misma. Los polipéptidos modificados que tienen actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) pueden comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 y/o 14, o un fragmento funcional de la misma. Los polipéptidos modificados que tienen actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) pueden comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 y/o 14, o un fragmento de la misma.
Se divulgan polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99%, o al menos aproximadamente el 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4, o un fragmento funcional de la misma, en donde el polipéptido diseñado se desinmuniza. Se divulgan polipéptidos modificados que tienen actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, o el 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4, o un fragmento funcional de la misma, en donde el polipéptido modificado se desinmuniza. En algunas realizaciones, los polipéptidos incorporados que tienen actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4, o un fragmento funcional de la misma, en donde el polipéptido diseñado se desinmuniza. En algunas realizaciones adicionales, el polipéptido diseñado que tiene actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) es una variante de PAL proporcionada en cualquiera de las Tablas 9-1 a 9-7. En algunas realizaciones, el polipéptido manipulado desinmunizado que tiene actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 y/o 14.
También se divulgan secuencias de polinucleótidos que codifican los polipéptidos modificados que tienen actividad PAL descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la secuencia de polinucleótidos está unida operativamente a una secuencia de control. Se divulgan además vectores que comprenden por lo menos una secuencia polinucleotídica que codifica al menos en un polipéptido diseñado que tiene actividad PAL. También se divulgan células huésped transformadas con al menos una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido diseñado que tiene actividad PAL, como se describe en este documento.
La presente invención proporciona además métodos para producir un polipéptido de PAL modificado en una célula huésped, que comprende cultivar una célula huésped que comprende al menos un polinucleótido que codifica al menos un polipéptido PAL modificado bajo condiciones de cultivo adecuadas. La presente invención proporciona además métodos adicionales para producir un polipéptido PAL modificado en una célula huésped, que comprende cultivar una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido PAL modificado en condiciones de cultivo adecuadas. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además recuperar el polipéptido PAL modificado del cultivo y/o células huésped.
La presente invención también proporciona composiciones que comprenden por lo menos un polipéptido modificado que tiene actividad de PAL, como se proporciona en la presente. En algunas realizaciones, la composición es una composición farmacéutica que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable. Hay más usos descritos de estas composiciones.
También se da a conocer polipéptidos modificados que tiene actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) que comprende: a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99%, o una mayor identidad de secuencia con una secuencia de referencia que tiene actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL), o un fragmento funcional de la misma; b) una secuencia polipeptídica que comprende al menos una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con una secuencia de referencia que tiene actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL), o el fragmento funcional de la misma en una o más posiciones de aminoácidos; y c) que exhibe una propiedad mejorada seleccionada de i) actividad catalítica mejorada, ii) sensibilidad reducida a la proteólisis, iii) tolerancia incrementada al pH ácido, iv) agregación reducida, v) inmunogenicidad reducida, o una combinación de cualquiera de i), ii), iii), iv) o v), en comparación con la secuencia de referencia que tiene actividad de fenilalanina amoniaco-liasa (PAL). En algunas realizaciones, la secuencia de referencia es una PAL procariótica, mientras que en algunas otras realizaciones, la secuencia de referencia es una PAL eucariótica. En algunas realizaciones, la secuencia de referencia es una PAL bacteriana (por ejemplo, Anabaena variabilis PAL), mientras que en algunas otras realizaciones es una PAL humana o de otro tipo. En algunas realizaciones adicionales, la secuencia de referencia es una secuencia de tipo silvestre (por ejemplo, A. variabilis PAL de tipo silvestre), mientras que en algunas realizaciones alternativas, la secuencia de referencia es una enzima variante (por ejemplo, un polipéptido diseñado que tiene actividad PAL).
En algunos aspectos, los polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) descritos aquí comprenden: a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente el 88%, al menos aproximadamente el 89%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99%, o una mayor identidad de secuencia con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 4 o un fragmento funcional de la misma; b) una secuencia polipeptídica que comprende al menos una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 4, o el fragmento funcional de la misma en una o más posiciones de aminoácidos; y c) que exhibe una propiedad mejorada seleccionada de i) actividad catalítica mejorada, ii) sensibilidad reducida a la proteólisis, iii) tolerancia incrementada al pH ácido, iv) agregación reducida, v) inmunogenicidad reducida, o una combinación de cualquiera de i), ii), iii), iv) o v), en comparación con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 4,
En algunos aspectos adicionales, los polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) comprenden: a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, a al menos el 99%, o mayor identidad de secuencia a la secuencia de referencia SEQ ID NO: 4 o un fragmento funcional de la misma; b) una secuencia polipeptídica que comprende al menos una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 4 o el fragmento funcional de la misma en una o más posiciones de aminoácidos; y c) que exhibe una propiedad mejorada seleccionada de i) actividad catalítica mejorada, ii) sensibilidad reducida a la proteólisis, iii) tolerancia incrementada al pH ácido, iv) agregación reducida, v) inmunogenicidad reducida, o una combinación de cualquiera de i), ii), iii), iv) o v), en comparación con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 4,
En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) comprenden al menos una sustitución en una o más de las siguientes posiciones de aminoácidos: 20, 24, 27, 39, 43, 45, 47, 54, 58, 59, 62, 70, 73, 80, 82, 91, 94, 98, 104, 105, 110, 112, 115, 117, 118, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 156, 157, 158, 159, 172, 174, 175, 176, 177, 178, 180, 187, 191, 195, 199, 205, 206, 210, 212, 213, 214, 232, 240, 243, 245, 247, 248, 250, 256, 257, 266, 270, 275, 278, 279, 285, 286, 289, 290, 292, 304, 305, 307, 308, 309, 319, 321, 326, 331, 332, 334, 349, 353, 355, 364, 365, 369, 370, 371, 372, 374, 375, 377, 378, 379, 381, 383, 384, 385, 387, 389, 394, 396, 399, 400, 403, 404, 407, 417, 418, 425, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 443, 446, 453, 456, 459, 460, 461, 463, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 482, 483, 503, 507, 509, 521, 524, 525, 528, 538, 546, 547, 551, 558, 560, 564, 565, y/o cualquiera de sus combinaciones, en donde las posiciones de los aminoácidos están numeradas con referencia a la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido de la secuencia de referencia de SEQ ID NO: 4 corresponde a A39, T54, G59, S73, A91, Y158, S180, K195, A112, R134, Q240, T243, 1245, A256, L257, N270, N290, Y304, R305, H307, E308, 1326, L349, D353, L364, A394, S399, N400, P404, L407, F443, N453, Y459, T460, T463, N474, E509, Q521, K521 P528, S546, y/o P564. En algunas realizaciones adicionales, la diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 4 se selecciona de una o más de las siguientes sustituciones A39V, T54K, G59R, S73K, A112C, R134Q, A91V, Y158H, S180A, K195E, Q240R/W, T243I/L, I245L, A256G, L257W/A, N270K, N290G, Y304H, R305M, H307G/Q/M, E308Q, I326F, I326F, L349M, N490, N290N, N290N, N290N, L464N, N270N, N290N, N490N, N490N, N420, N290N, L464Q F443H, N453G, Y459F, T460G, T463N, N474Q, E509L, Q521K/S, K522Y/F/N, T524S, P528L, S546R y P564 G/L/M, cuando se alinean de manera óptima con el polipéptido de SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones adicionales, el polipéptido diseñado tiene al menos aproximadamente un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4; y una diferencia de residuo de aminoácido en la posición H307. En algunas realizaciones, la diferencia de residuos de aminoácidos es H307G/Q/M. En algunas realizaciones adicionales, la diferencia de residuos de aminoácidos se selecciona de una combinación de uno o más de A39, A91, Q240, A256, N290, Y304, R305, H307, D353, A394, S399, P404, L407, Q521, K522, y T524. En algunas realizaciones adicionales, la propiedad mejorada de los polipéptidos modificados que tienen actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) se selecciona de sensibilidad reducida a la proteólisis y/o aumento de la tolerancia al pH ácido.
Se divulgan polipéptidos modificados que tienen actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) que comprende: a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 86%, al menos aproximadamente el 87%, al menos aproximadamente el 88%, al menos aproximadamente el 89%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99%, o mayor identidad de secuencia para hacer referencia a la secuencia SEQ ID NO: 10 o un fragmento funcional de la misma; b) una secuencia polipeptídica que comprende al menos una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 10 o el fragmento funcional de la misma en una o más posiciones de aminoácidos; y c) que exhibe una propiedad mejorada seleccionada de i) actividad catalítica mejorada, ii) sensibilidad reducida a la proteólisis, iii) tolerancia incrementada al pH ácido, iv) agregación reducida, v) inmunogenicidad reducida, o una combinación de cualquiera de i), ii), iii), iv) o v), en comparación con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 10.
Se divulgan polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) que comprenden: a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, o mayor identidad de secuencia a la secuencia de referencia SEQ ID NO: 10 o un fragmento funcional de la misma; b) una secuencia polipeptídica que comprende al menos una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 10 o el fragmento funcional de la misma en una o más posiciones de aminoácidos; y c) que exhibe una propiedad mejorada seleccionada de i) actividad catalítica mejorada, ii) sensibilidad reducida a la proteólisis, iii) tolerancia incrementada al pH ácido, iv) agregación reducida, v) inmunogenicidad reducida, o una combinación de cualquiera de i), ii), iii), iv) o v), en comparación con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 10.
Se divulgan polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) que comprende: a) una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de secuencia de al menos el 85% para hacer referencia a la secuencia de SEQ ID NO: 10 o un fragmento funcional de la misma; b) una secuencia polipeptídica que comprende al menos una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 10 o el fragmento funcional de la misma en una o más posiciones de aminoácidos; y c) que exhibe una propiedad mejorada seleccionada de i) actividad catalítica mejorada, ii) sensibilidad reducida a la proteólisis, iii) tolerancia incrementada al pH ácido, iv) agregación reducida, v) inmunogenicidad reducida, o una combinación de cualquiera de i), ii), iii), iv) o v), en comparación con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 10.
Se divulgan polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) que comprenden una secuencia de aminoácidos que tienen al menos 85% de identidad de secuencia para hacer referencia a la secuencia de SEQ ID NO: 10 y al menos una diferencia de residuo de aminoácido en comparación con la SEQ ID NO: 10 y que exhibe al menos una propiedad mejorada seleccionada de una actividad catalítica mejorada, sensibilidad reducida a la proteólisis, tolerancia incrementada al pH ácido, agregación reducida y/o inmunogenicidad reducida, en comparación con la SEQ ID NO: 10.
Se divulgan polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL), en donde la diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 10, se selecciona de una o más de las siguientes sustituciones o conjuntos de sustituciones:
I27E/V39A; I27E/V39A/R43L/V105C/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q;
I27E/V39A/R43L/L214E/A547D;
I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/A551D;
I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P210C/P266H/C503Q/A547D;
I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P266H/I285E/C503Q/A551D;
I27E/V39A/V105C/A112C/L214E/I285E/C503Q/A547D;
I27E/V39A/V105C/S131N/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/V105C/R134Q/A153R/P210C/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/P210C/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E;
I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E/A551D/C565N;
I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C;
I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E;
I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/I285E/A547D;
I27E/V39AN105C/RI34Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/L278D/A547D/A551D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q;
I27E/V39A/105C/R134Q/P266H/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/C503Q/C565N;
I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/I285E/C503Q;
I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/A551D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/I285E/A547D/A551D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D/A551D;
I27E/V39A/V105C/A153R/L214E;
I27E/V39A/V105C/A153R/I285E;
I27E/V39A/V105C/A153R/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/V105C/A153R/A551D/C565N;
I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L214E/L278D/A547D; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/C503Q;
I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/A547D;
I27E/39A/105C/Q205T/L214E/L278D/C503Q/A547D;
I27E/V39A/V105C/Q205T/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/P210C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/P210C/L214E/P266H/L278D; I27E/V39A/V105C/L214E/P266H/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/L214E/L278D/L309P/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/I285E/A547D;
I27E/V39A/V105C/C503Q/A551D;
I27E/V39A/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/R134Q/Q205T/P210C/L214E/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/P266H/A551D;
I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D;
I27E/V39A/A112C/R134Q/P266H/I285E; I27E/V39A/A112C/Q205T/L214E/P266H/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/Q205T/L278D/I285E;
I27E/V39A/A112C/L214E;
I27E/V39A/A112C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D;
I27E/V39A/A112C/I285E;
I27E/V39A/A112C/A547D;
I27E/V39A/R134Q;
I27E/V39A/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/C503Q;
I27E/V39A/R134Q/A153R/P210C/L214E/L278D/I285E/A547D/C565N;
I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/R134Q/A153G/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/C503Q/A547D;
I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D;
I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D/A547D/A551D;
I27E/V39A/R134Q/A153R/A547D; I27E/V39A/R134Q/Q205T/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/R134Q/Q205T/P266H/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V39A/R134Q/P210C/L214E/C503Q;
I27E/V39A/R134Q/P210C/C503Q/A551D;
I27E/V39A/R134Q/L214E/P266H/A551D;
I27E/V39A/R134Q/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D;
I27E/V39A/R134Q/L278D/C503Q/A547D;
I27E/V39A/R134Q/C503Q/A547D;
I27E/V39A/R134Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/Q205T/L214E/C503Q/C565N;
I27E/V39A/Q205T/P266H/I285E/A547D/A551D/C565N;
I27E/V39A/Q205T/P266H/A551D;
I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/C565N;
I27E/V39A/Q205T/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/P210C/T212S;
I27E/V39A/P210C/L214E/L278D/C503Q/A551D;
I27E/V39A/P210C/L214E/I285E/C503Q/A551D;
I27E/V39A/P210C/P266H/I285E/C503Q/A547D;
I27E/V39A/P210C/P266H/C503Q/A551D;
I27E/V39A/L214E;
I27E/V39A/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q;
I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/L214E/C503Q/A551D;
I27E/V39A/P266H; I27E/V39A/P266H/L278D;
I27E/V39A/L278D;
I27E/V39A/L278D/A547D;
I27E/V39A/L278D/I285E/C503Q/A547D;
I27E/V39A/L278D/C503Q/C565N;
I27E/V39A/C503Q;
I27E/G45D/Q205T/P266H/C565N;
I27E/V105C;
I27E/V105C/R134Q/A153R/P210C/L214E/C503Q/A547D;
I27E/V105C/R134Q/A153R/I285E/A547D;
I27E/V105C/R134Q/A153R/C503Q;
I27E/V105C/R134Q/Q205T/P210C/C503Q; I27E/V105C/R134Q/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/C565N; I27E/V105C/Q205T/P266H/C503Q;
I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/P266H/L278D/A551D/C565N;
I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V105C/R134Q/P210C/P266H/L278D/I285E/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D; I27E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/Q205T;
I27E/V105C/Q205T/L214E/P266H;
I27E/V105C/Q205T/L214E/P266H/A551D/C565N;
I27E/V105C/Q205T/L214E/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V105C/Q205T/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V105C/L214E;
I27E/V105C/L214E/P266H/C503Q;
I27E/V105C/L214E/I285E/A551D/C565N;
I27E/V105C/L214E/A547D/A551D/C565N;
I27EN105C/L214E/A551D/C565N;
I27E/V105C/P266H;
I27E/V105C/P266H/I285E/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V105C/L278D/A547D;
I27E/V105C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V105C/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/A112C/R134Q/A153R/L214E/P266H/C503Q; I27E/A112C/R134Q/L278D/I285E/C503Q/A551D/C565N;
I27E/A112C/R134Q/Q205T/L278D/C503Q;
I27E/A112C/R134Q/Q205T/I285E/C503Q;
I27E/A112C/Q205T/P266H/L278D/I285E/C503Q;
I27E/A112C/P210C/L214E/C503Q/A547D;
I27E/R134Q;
I27E/R134Q/A153R/I285E/C503Q/A547D;
I27E/R134Q/Q205T/I285E/C503Q/A551D;
I27E/R134Q/Q205T/P266H/L278D/A547D;
I27E/R134Q/P210C;
I27E/R134Q/L214E/C503Q;
I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D;
I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D;
I27E/R134Q/L214E/C503Q/C565N;
I27E/R134Q/L278D/I285E/A551D/C565N;
I27E/R134Q/I285E/C503Q;
I27E/A153R/L214E/L278D/I285E/A551D/C565N;
I27E/A153R/L214E/L278D/A551D;
I27E/Q205T;
I27E/Q205T/L214E/L278D/I285E/C503Q/C565N;
I27E/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N;
I27E/Q205T/P266H/L278D/I285E/A551D/C565N;
I27E/Q205T/L278D/A551D;
I27E/P210C;
I27E/P210C/L214E/C503Q/A547D;
I27E/P210C/L278D/C503Q;
I27E/P210C/C503Q;
I27E/P210C/C503Q/C565N;
I27E/P210C/A551D;
I27E/L214E;
I27E/L214E/P266H/L278D/I285E/A551D;
I27E/L214E/L278D;
I27E/L214E/L278D/C503Q;
I27E/L214E/C503Q;
I27E/L214E/C503Q/A547D;
I27E/L214E/C503Q/A547D/C565N;
I27E/L214E/A551D;
I27E/P266H/L278D/C503Q;
I27E/P266H/A547D/A551D;
I27E/L278D/C503Q/A551D;
I27E/L278D/C503Q/A551D/C565N;
I27E/A547D/C565N;
V39A/G45S/L278D/C503Q/A551D;
V39A/V105C/R134Q/A153R/Q205T/A551D;
V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/A551D;
V39A/V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D;
V39A/V105C/A153R/P266H/A547D/A551D;
V39A/V105C/Q205T/C503Q;
V39A/V105C/Q205T/A551D;
V39A/V105C/P210C/A547D;
V39A/V105C/L214E/P266H/A547D/C565N;
V39A/V105C/L214E/I285E/C503Q/A551D/C565N;
V39A/A112C/R134Q/Q205T/L214E/L278D;
V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D;
V39A/A112C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D;
V39A/R134Q;
V39A/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/C565N;
V39A/R134Q/P210C/L214E/A547D/C565N;
V39A/A153R/C503Q/A547D;
V39A/Q205T/L278D/A547D/A551D;
V39A/P210C/L214E/L278D/I285E/C503Q/A551D;
V39A/P266H;
V39A/P275R/L278D/C503Q/A551D; V39A/C503Q;
V39A/C503Q/A551D/C565N;
V105C;
V105C/A112C/R134Q/Q205T/L214E/Y492H/C503Q/A547D; V105C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/C503Q; V105C/R134Q/Q205T/L214E/A547D;
V105C/R134Q/Q205T/P266H/L278D;
V105C/R134Q/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N;
V105C/R134Q/L214E/L278D/C565N;
V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D;
V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D;
V105C/R134Q/C503Q;
V105C/R134Q/C503Q/A547D;
V105C/R134Q/C503Q/A547D/C565N;
V105C/A153R/Q205T/L214E/P266H/C503Q/A547D; V105C/A153R/Q205T/P266H/I285E/A547D/C565N; V105C/Q205T/P210C/L214E/C503Q/A547D;
V105C/Q205T/L214E/L278D;
V105C/Q205T/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
V105C/Q205T/C503Q/A551D;
V105C/L214E/P266H/L278D/A547D;
V105C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D;
V105C/L214E/I285E;
V105C/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
V105C/L214E/I285E/A547D/C565N;
V105C/L278D/C503Q/A551D;
V105C/I285E;
V105C/I285E/A547D;
V105C/C503Q;
V105C/A547D/A551D;
A112C/R134Q/A153R/L214E/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
A112C/L214E/L278D;
A112C/L278D/C503Q/A547D;
R134Q/Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D/C565N;
R134Q/Q205T/C503Q;
R134Q/P210C/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;
R134Q/P210C/L214E/C503Q/A547D/A551D;
R134Q/L214E; R134Q/L214E/L278D/C503Q;
R134Q/L214E/L278D/C503Q/A551D;
R134Q/L214E/I285E/C503Q;
R134Q/C503Q;
R134Q/C503Q/A547D/A551D;
A153R;
Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D;
Q205T/L214E/I285E/C503Q/C565N;
Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N;
Q205T/L278D/I285E/A547D/A551D;
P210C/L214E;
P210C/L214E/P266H;
L214E/P266H; L214E/P266H/C503Q/A547D/A551D/C565N;
L214E/C503Q/A547D;
L214E/A547D;
P266H/L278D/C503Q;
P266H/C565N;
L278D/A547D;
C503Q;
C503Q/A547D;
C503Q/A547D/A551D/C565N;
C503Q/A547D/C565N;
C503Q/A551D;
C503Q/A551D/C565N;
A547D; y/o C565N.
Se divulgan polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL), en donde la diferencia de residuo de aminoácido en comparación con la SEQ ID NO: 10, se selecciona de una o más de las siguientes sustituciones o conjuntos de sustituciones: V80I/R134C/P564Q; V121C; A123G; A124G; M125L; L126I/T; L126M/R134L; L127A; A129G/L; N130Q; N130C/M370I R134W; M133R; R134I; R134N/G307C; G135C/S; y/o G135A/A394E.
Se divulgan polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL), en donde la diferencia de residuo de aminoácido en comparación con la SEQ ID NO: 10, se selecciona de una o más de las siguientes sustituciones o conjuntos de sustitución: G20S/I144L; R43S; L47M/I144L; L47M/R146E; L47M/M147G/A383E; L47M/P157C;
Q58H/L143V; Q58K/P157D/G369C; A62S/M147V; S82I/G135C/P157F/W279L; R94C/I149E; T110I/I139R; L118M/L141H; A119E/T156H/A289D; I139M/V; R140D/G/M; R140N/A199E; R140E/A334S/A551D; L141K/Q/P/T; E142H/P/V; E142D/G371D; L143F/M; I144L/N/V; K145N/Q/R; K145G/P157T; R146H/L; R146W/D191Y; M147A; I149L/R; F150K/L/M; L151M; A153C/G; A153S/H250N; G154R; G154Y/L174M/Q321K/S456I/G483C; T156K/G483C; P157D/F/H/Y; Y158E; V159C/H/L/M; M247I; L319M; y/o Q389K.
Se divulgan polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL), en la que la diferencia de residuo de aminoácido en comparación con la SEQ ID NO: 10, se selecciona de una o más de las siguientes sustituciones o conjuntos de sustitución: P117T/Y176Q; V172I/C/L; L174M; S175G; Y176E/I/M/R/V; I177M/V; T178L/A477S; y/o S180C/T.
Se divulgan polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL), en la que la diferencia de residuo de aminoácido en comparación con la SEQ ID NO: 10, se selecciona de una o más de las siguientes sustituciones o conjuntos de sustituciones: R43S/H374K; R43S/H374R; A112S/M370A/A507E; M147I/H374S; S187R/L381V; D191Y/H385N;
A232S; Q240K/H374R; A256S/L381N; P275Q/M370S; P275T/H374R; Q332K/Y377M; A334S/H374V; L349M; Q355K/H374S; M370G/I/S; G371H/N/Q/S; M372A/V; H374A/D/G/L/N/R/S/T; H374Q/P396Q; H374R/G417C; L375I; L375M; Y377C/I/N; Y378C/D/E/I/L/N/S; Y378F/P404Q; I379C/H/L/M/N; L381G/V; L381M/Q560K; L382C/H/I/M/S; A383S/V; K384R; H385C/G/N; H385M/P403H; H385S/P403H; D387S; L418M; G425V; A447S; S461G; y/o S525L.
Se divulgan polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL), en la que la diferencia de residuo de aminoácido en comparación con la SEQ ID NO: 10, se selecciona de una o más de las siguientes sustituciones o conjuntos de sustitución: A24S/F434M; A62S/T433N; S98I; L213M/S438L; Q240K/T433Y; S286R/Y435T; A289S/L431E; S331I; L431C/E/G/P/S/V; L432C/V; T433A/I/L/N/P/Q/R/S/V/W; F434C; Y435L; Y435Q/H446N; G436M; G436D/T; N437E/G/Q; N437T/L538M; S438C/F/M/R/T; I439C/F/L/V; y/o A477S.
Se divulgan polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL), en la que la diferencia de residuo de aminoácido en comparación con la SEQ ID NO: 10, se selecciona de una o más de las siguientes sustituciones o conjuntos de sustitución: A24E; Q58R/Y475H; A70S/N474E; L104M/V476L; A119E/G365A; L206M; P275Q; G276V;
Q292H/A479G; Q355H/I478C; P404T/A477V; I471F/G/K/M/N/R/V/W; F472G; Q473H/K/M/R/S; Q473H/A507S; N474A/H/R/W; N474D/R490H; Y475C/F/L/Q; V476C/I/L; I478N/S; A479G/S; F482C/L; G483C/H/S; G483A/S524I; G483R/G537C; y/o A558S.
Se divulgan polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL), en la que la diferencia de residuo de aminoácido en comparación con la SEQ ID NO: 10, se selecciona de una o más de las siguientes sustituciones o conjuntos de sustituciones: V39A/K115E/M133R/C565N; V39A/M133R/F472G/C503Q/C565N;
V39A/M133R/F472G/C565N; V39A/M133R/C503Q; V39A/M133R/C503Q/C565N;
V39A/M147A/Y378E/C503Q/C565N; V39A/M147A/Y378E/C565N;
V39A/M147A/L381G/F472G/C503Q/C565N; V3A/M147A/L381G/C503Q/C565N;
V39A/M147A/F472G/C503Q/C565N; V39A/M147A/F472G/C565N; V39A/M147A/C565N;
V39A/G248C/L381G/F472G/C503Q/C565N; V39A/Y378E/C503Q/C565N; V39A/Y378E/C565N;
V39A/L381G; V39A/F472G/C503Q/C565N; V39A/C503Q/C565N; M133R/L381G/C565N;
M133R/C503Q; Y378D/C503Q; Y378E/F472G/C503Q/C565N; L381G/F472GC503Q/C565N;
y/o F472G/C503Q/C565N.
Se divulgan polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL), en donde la diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 10, se selecciona de una o más de las siguientes sustituciones o conjuntos de sustituciones: I27E/V39A;
I27E/V39A/R43L/V105C/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q; I27E/V39A/R43L/L214E/A547D;
I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/A551D;
I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P210C/P266H/C503Q/A547D;
I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P266H/I285E/C503Q/A551D;
I27E/V39A/V105C/A112C/L214E/I285E/C503Q/A547D;
I27E/V39A/V105C/S131N/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/V105C/R134Q/A153R/P210C/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/P210C/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E/A551D/C565N;
I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E;
I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/I285E/A547D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/L278D/A547D/A551D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q; I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q/A547D/A551D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/I285E/C503Q;
I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/I285E/A547D/A551D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/A153R/L214E;
I27E/V39A/V105C/A153R/I285E; I27E/V39A/V105C/A153R/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/V105C/A153R/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L214E/L278D/A547D;
I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/C503Q; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/A547D;
I27E/V39A/V105C/Q205T/L214E/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/Q205T/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/P210C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/P210C/L214E/P266H/L278D; I27E/V39A/V105C/L214E/P266H/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/V105C/L214E/L278D/L309P/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/I285E/A547D;
I27E/V39A/V105C/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V39A/A112C/R134Q/Q205T/P210C/L214E/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/P266H/A551D; I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D;
I27E/V39A/A112C/R134Q/P266H/I285E; I27E/V39A/A112C/Q205T/L214E/P266H/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/Q205T/L278D/I285E; I27E/V39A/A112C/L214E;
I27E/V39A/A112C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/A112C/I285E;
I27E/V39A/A112C/A547D; I27E/V39A/R134Q; I27E/V39A/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/C503Q;
I27E/V39A/R134Q/A153R/P210C/L214E/L278D/I285E/A547D/C565N;
I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/R134Q/A153G/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D;
I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D/A547D/A551D; I27E/V39A/R134Q/A153R/A547D;
I27E/V39A/R134Q/Q205T/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V39A/R134Q/Q205T/P266H/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/R134Q/P210C/L214E/C503Q;
I27E/V39A/R134Q/P210C/C503Q/A551D; I27E/V39A/R134Q/L214E/P266H/A551D;
I27E/V39A/R134Q/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/R134Q/L278D/C503Q/A547D;
I27E/V39A/R134Q/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/Q205T/L214E/C503Q/C565N; I27E/V39A/Q205T/P266H/I285E/A547D/A551D/C565N;
I27E/V39A/Q205T/P266H/A551D; I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/Q205T/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V39A/P210C/T212S; I27E/V39A/P210C/L214E/L278D/C503Q/A551D;
I27E/V39A/P210C/L214E/I285E/C503Q/A551D; I27E/V39A/P210C/P266H/I285E/C503Q/A547D;
I27E/V39A/P210C/P266H/C503Q/A551D; I27E/V39A/L214E;
I27E/V39A/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q; I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/L214E/C503Q/A551D; I27E/V39A/P266H;
I27E/V39A/P266H/L278D; I27E/V39A/L278D; I27E/V39A/L278D/A547D;
I27E/V39A/L278D/I285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/C503Q;
I27E/G45D/Q205T/P266H/C565N; I27E/V105C;
I27E/V105C/R134Q/A153R/P210C/L214E/C503Q/A547D; I27E/V105C/R134Q/A153R/I285E/A547D;
I27E/V105C/R134Q/A153R/C503Q; I27E/V105C/R134Q/Q205T/P210C/C503Q;
I27E/V105C/R134Q/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/C565N; I27E/V105C/Q205T/P266H/C503Q;
I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/P266H/L278D/A551D/C565N;
I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V105C/R134Q/P210C/P266H/L278D/I285E/C503Q/A551D/C565N;
I27E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D; I27E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/Q205T;
I27E/V105C/Q205T/L214E/P266H; I27E/V105C/Q205T/L214E/P266H/A551D/C565N;
I27E/V105C/Q205T/L214E/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
I27E/V105C/Q205T/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E;
I27E/V105C/L214E/P266H/C503Q; I27E/V105C/L214E/I285E/A551D/C565N;
I27E/V105C/L214E/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E/A551D/C565N; I27E/V105C/P266H;
I27E/V105C/P266H/I285E/C503Q/A547D/C565N; I27E/V105C/L278D/A547D;
I27E/V105C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/C503Q/A547D/C565N;
I27E/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/A112C/R134Q/A153R/L214E/P266H/C503Q;
I27E/A112C/R134Q/L278D/I285E/C503Q/A551D/C565N; I27E/A112C/R134Q/Q205T/L278D/C503Q;
I27E/A112C/R134Q/Q205T/I285E/C503Q; I27E/A112C/Q205T/P266H/L278D/I285E/C503Q;
I27E/A112C/P210C/L214E/C503Q/A547D; I27E/R134Q; I27E/R134Q/A153R/I285E/C503Q/A547D; I27E/R134Q/Q205T/I285E/C503Q/A551D; I27E/R134Q/Q205T/P266H/L278D/A547D;
I27E/R134Q/P210C; I27E/R134Q/L214E/C503Q; I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D;
I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; I27E/R134Q/L214E/C503Q/C565N;
I27E/R134Q/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/R134Q/I285E/C503Q; I27E/A153R/L214E/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/A153R/L214E/L278D/A551D;
I27E/Q205T; I27E/Q205T/L214E/L278D/I285E/C503Q/C565N;
I27E/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N; I27E/Q205T/P266H/L278D/I285E/A551D/C565N;
I27E/Q205T/L278D/A551D; I27E/P210C; I27E/P210C/L214E/C503Q/A547D;
I27E/P210C/L278D/C503Q; I27E/P210C/C503Q; I27E/P210C/C503Q/C565N; I27E/P210C/A551D;
I27E/L214E; I27E/L214E/P266H/L278D/I285E/A551D; I27E/L214E/L278D; I27E/L214E/L278D/C503Q;
I27E/L214E/C503Q; I27E/L214E/C503Q/A547D; I27E/L214E/C503Q/A547D/C565N;
I27E/L214E/A551D; I27E/P266H/L278D/C503Q;
I27E/P266H/A547D/A551D; I27E/L278D/C503Q/A551D; I27E/L278D/C503Q/A551D/C565N;
I27E/A547D/C565N; V39A/G45S/L278D/C503Q/A551D; V39A/V105C/R134Q/A153R/Q205T/A551D;
V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/A551D; V39A/V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D;
V39A/V105C/A153 R/P266H/A547D/A551D; V39A/V105C/Q205T/C503Q; V39A/V105C/Q205T/A551D;
V39A/V105C/P210C/A547D; V39A/V105C/L214E/P266H/A547D/C565N;
V39A/V105C/L214E/1285E/C503Q/A551D/C565N; V39A/A112C/R134Q/Q205T/L214E/L278D;
V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; V39A/A112C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D;
V39A/R134Q; V39A/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/C565N; V39A/R134Q/P210C/L214E/A547D/C565N;
V39A/A153R/C503Q/A547D; V39A/Q205T/L278D/A547D/A551D;
V39A/P210C/L214E/L278D/I285E/C503Q/A551D; V39A/P266H; V39A/P275R/L278D/C503Q/A551D;
V39A/C503Q; V39A/C503Q/A551D/C565N; V105C;
V105C/A112C/R134Q/Q205T/L214E/Y492H/C503Q/A547D; V105C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/C503Q; V105C/R134Q/Q205T/L214E/A547D;
V105C/R134Q/Q205T/P266H/L278D; V105C/R134Q/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N;
V105C/R134Q/L214F/L278D/C565N; V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D;
V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; V105C/R134Q/C503Q; V105C/R134Q/C503Q/A547D;
V105C/R134Q/C503Q/A547D/C565N; V105C/A153R/Q205T/L214E/P266H/C503Q/A547D;
V105C/A153R/Q205T/P266H/I285E/A547D/C565N; V105C/Q205T/P210C/L214E/C503Q/A547D;
V105C/Q205T/L214E/L278D; V105C/Q205T/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
V105C/Q205T/C503Q/A551D; V105C/L214E/P266H/L278D/A547D;
V105C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D; V105C/L214E/I285E;
V105C/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; V105C/L214E/I285E/A547D/C565N;
V105C/L278D/C503Q/A551D; V105C/I285E; V105C/I285E/A547D; V105C/C503Q;
V105C/A547D/A551D; A112C/R134Q/A153R/L214E/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N;
A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N; A112C/L214E/L278D;
A112C/L278D/C503Q/A547D; R134Q/Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D/C565N;
R134Q/Q205T/C503Q; R134Q/P210C/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N;
R134Q/P210C/L214E/C503Q/A547D/A551D; R134Q/L214E; R134Q/L214E/L278D/C503Q;
R134Q/L214E/L278D/C503Q/A551D; R134Q/L214E/I285E/C503Q; R134Q/C503Q;
R134Q/C503Q/A547D/A551D; A153R; Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D;
Q205T/L214E/I285E/C503Q/C565N; Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N;
Q205T/L278D/I285E/A547D/A551D; P210C/L214E; P210C/L214E/P266H; L214E/P266H;
L214E/P266H/C503Q/A547D/A551D/C565N; L214E/C503Q/A547D; L214E/A547D;
P266H/L278D/C503Q; P266H/C565N; L278D/A547D; C503Q; C503Q/A547D;
C503Q/A547D/A551D/C565N; C503Q/A547D/C565N; C503Q/A551D; C503Q/A551D/C565N; A547D;
C565N; V80I/R134C/P564Q; V121C; A123G; A124G; M125L; L126I/T; L126M/R134L; L127A; A129G/L;
N130Q; N130C/M370I R134W; M133R; R134I; R134N/G307C; G135C/S; G135A/A394E; G20S/I144L;
R43S; L47M/I144L; L47M/R146E; L47M/M147G/A383E; L47M/P157C; Q58H/L143V;
Q58K/P157D/G369C; A62S/M147V; S82I/G135C/P157F/W279L; R94C/I149E; T110I/I139R;
L118M/L141H; A119E/T156H/A289D; I139M/V; R140D/G/M; R140N/A199E; R140E/A334S/A551D;
L141K/Q/P/T; E142H/P/V; E142D/G371D; L143F/M; I144L/N/V; K145N/Q/R; K145G/P157T; R146H/L;
R146W/D191Y; M147A; I149L/R; F150K/L/M; L151M; A153C/G; A153S/H250N; G154R;
G154Y/L174M/Q321K/S456I/G483C; T156K/G483C; P157D/F/H/Y; Y158E; V159C/H/L/M; M247I;
L319M; Q389K; P117T/Y176Q; V172I/C/L; L174M; S175G; Y176E/I/M/R/V; I177M/V; T178L/A477S;
S180C/T; R43S/H374K; R43S/H374R; A112S/M370A/A507E; M147I/H374S; S187R/L381V;
D191Y/H385N; A232S; Q240K/H374R; A256S/L381N; P275Q/M370S; P275T/H374R; Q332K/Y377M;
A334S/H374V; L349M; Q355K/H374S; M370G/I/S; G371H/N/Q/S; M372A/V; H374A/D/G/L/N/R/S/T;
H374Q/P396Q; H374R/G417C; L375I; L375M; Y377C/I/N; Y378C/D/E/I/L/N/S; Y378F/P404Q;
I379C/H/L/M/N; L381G/V; L381M/Q560K; L382C/H/I/M/S; A383S/V; K384R; H385C/G/N;
H385M/P403H; H385S/P403H; D387S; L418M; G425V; A447S; S461G; S525L; A24S/F434M;
A62S/T433N; S98I; L213M/S438L; Q240K/T433Y; S286R/Y435T; A289S/L431E; S331I;
L431C/E/G/P/S/V; L432C/V; T433A/I/L/N/P/Q/R/S/V/W; F434C; Y435L; Y435Q/H446N; G436M;
G436D/T; N437E/G/Q; N437T/L538M; S438C/F/M/R/T; I439C/F/L/V; A477S; A24E; Q58R/Y475H;
A70S/N474E; L104M/V476L; A119E/G365A; L206M; P275Q; G276V; Q292H/A479G; Q355H/I478C;
P404T/A477V; I471F/G/K/M/N/R/V/W; F472G; Q473H/K/M/R/S; Q473H/A507S; N474A/H/R/W;
N474D/R490H; Y475C/F/L/Q; V476C/I/L; I478N/S; A479G/S;
F482C/L; G483C/H/S; G483A/S524I; G483R/G537C; A558S; V39A/K115E/M133R/C565N;
V39A/M133R/F472G/C503Q/C565N; V39A/M133R/F472G/C565N; V39A/M133R/C503Q;
V39A/M133R/C503Q/C565N; V39A/M147A/Y378E/C503Q/C565N; V39A/M147A/Y378E/C565N;
V39A/M147A/L381G/F472G/C503Q/C565N; V39A/M147A/L381G/C503Q/C565N;
V39A/M147A/F472G/C503Q/C565N; V39A/M147A/F472G/C565N; V39A/M147A/C565N;
V39A/G248C/L381G/F472G/C503Q/C565N; V39A/Y378E/C503Q/C565N; V39A/Y378E/C565N;
V39A/L381G; V39A/F472G/C503Q/C565N; V39A/C503Q/C565N; M133R/L381G/C565N;
M133R/C503Q; Y378D/C503Q; Y378E/F472G/C503Q/C565N; L381G/F472GC503Q/C565N;
y/o F472G/C503Q/C565N.
Se divulgan polipéptidos modificados que tienen la actividad de fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) que comprende: a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99%, o mayor identidad de secuencia con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 26 o un fragmento funcional de la misma; b) una secuencia polipeptídica que comprende al menos una diferencia de residuo de aminoácido en comparación con la SEQ ID NO: 26 o el fragmento funcional de la misma en una o más posiciones de aminoácidos; y c) que exhibe una propiedad mejorada seleccionada de i) actividad catalítica mejorada, ii) sensibilidad reducida a la proteólisis, iii) tolerancia incrementada al pH ácido, iv) agregación reducida, v) inmunogenicidad reducida, o una combinación de cualquiera de i), ii), iii), iv) o v), en comparación con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 26.
Se divulgan polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) que comprende: a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, o mayor identidad de secuencia a la secuencia de referencia SEQ ID NO: 26 o uno de sus fragmentos funcionales; b) una secuencia polipeptídica que comprende al menos una diferencia de residuo de aminoácido en comparación con la SEQ ID NO: 26 o el fragmento funcional de la misma en una o más posiciones de aminoácidos; y c) que exhibe una propiedad mejorada seleccionada de i) actividad catalítica mejorada, ii) sensibilidad reducida a la proteólisis, iii) tolerancia incrementada al pH ácido, iv) agregación reducida, v) inmunogenicidad reducida, o una combinación de cualquiera de i), ii), iii), iv) o v), en comparación con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 26.
Se divulgan polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) que comprende: a) una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de secuencia de al menos el 85% para hacer referencia a la secuencia de SEQ ID NO: 26 o un fragmento funcional de la misma; b) una secuencia polipeptídica que comprende al menos una diferencia de residuo de aminoácido en comparación con la SEQ ID NO: 26 o el fragmento funcional de la misma en una o más posiciones de aminoácidos; y c) que exhibe una propiedad mejorada seleccionada de i) actividad catalítica mejorada, ii) sensibilidad reducida a la proteólisis, iii) tolerancia incrementada al pH ácido, iv) agregación reducida, v) inmunogenicidad reducida, o una combinación de cualquiera de i), ii), iii), iv) o v), en comparación con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, los polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) de la divulgación comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 26, y al menos una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 26, y que exhiben al menos una propiedad mejorada seleccionada de una actividad catalítica mejorada, sensibilidad reducida a la proteólisis, tolerancia incrementada al pH ácido, agregación reducida y/o inmunogenicidad reducida, en comparación con la SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones de los polipéptidos modificados, la diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 26 se selecciona de una o más de las siguientes sustituciones o conjuntos de sustituciones A24E/G381L; L127V; A129I1V; S131C/T; H132L/S; R134C/F/H/K; R134H/Y378E/G381L; R134H/Y378E/G381L/V388T; R134H/V388T; A136K; A289S; M372L; H374G/M/Q; G381A/C/F/I/L/M/N/Q/S/T; A383C/M; V388C/T; L431M; y/o L563M.
En algunas realizaciones, la actividad del polipéptido modificado que tiene fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) de la divulgación tiene al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% de la identidad de secuencia a la secuencia de referencia SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el polipéptido modificado que tiene actividad fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) de la divulgación tiene al menos aproximadamente un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 4, mientras que en algunas realizaciones adicionales, el polipéptido modificado tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia para hacer referencia a la secuencia En algunas realizaciones, el polipéptido diseñado que tiene actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) de la divulgación tiene al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99% de identidad de secuencia para hacer referencia a la secuencia SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el polipéptido diseñado que tiene actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) de la divulgación tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 4, mientras que en algunas realizaciones adicionales, el polipéptido modificado tiene al menos un 95% de identidad de secuencia para hacer referencia a la secuencia SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones adicionales, los polipéptidos modificados comprenden fragmentos funcionales de polipéptidos (por ejemplo, cualquiera de las variantes proporcionadas en las Tablas, en este documento) que tienen actividad de fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) de la divulgación.
En algunas realizaciones, la actividad del polipéptido modificado que tiene fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) de la presente invención tiene al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% de la identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y/o 26. En algunas realizaciones, el polipéptido diseñado que tiene actividad de fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) de la divulgación tiene al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, a al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y/o 26. En algunas realizaciones, el polipéptido diseñado que tiene actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y/o 26. En alguna forma Por ejemplo, el polipéptido diseñado que tiene actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y/o 26. o un fragmento funcional de los mismos. En algunas realizaciones adicionales, los polipéptidos modificados comprenden fragmentos funcionales de polipéptidos (por ejemplo, fragmentos funcionales de SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y/o 26. también). como cualquiera de las variantes proporcionadas en las Tablas, que tienen actividad de fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) de la divulgación.
Se divulgan polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL), en la que los polipéptidos modificados son PAL variantes proporcionados en cualquiera de las Tablas 2-1 a 2-5 y/o las Tablas 9-1 a través de 9-7.
El polipéptido modificado que tiene actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) puede ser una enzima Anabaena variabilis. En algunas realizaciones adicionales, los polipéptidos modificados que tienen actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) son termoestables. En algunas realizaciones, los polipéptidos modificados que tienen actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) son resistentes a la proteólisis. En algunas realizaciones adicionales, los polipéptidos modificados que tienen actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) son resistentes a la proteólisis por al menos una enzima del tracto digestivo. En algunas realizaciones adicionales, los polipéptidos modificados que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) son resistentes a la proteolisis por quimotripsina, tripsina, carboxipeptidasas y/o elastasas. En algunas realizaciones adicionales, el polipéptido manipulado que tiene actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) es estable a los ácidos.
Los polipéptidos modificados descritos que tienen actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) pueden desinmunizarse. En algunas realizaciones, los polipéptidos modificados genéticamente desinmunizados comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99%, o mayor identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y/o 26. En algunas realizaciones adicionales, los polipéptidos modificados genéticamente desinmunizados comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de la identidad de secuencia de la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y/o 26. En algunas realizaciones, los polipéptidos modificados genéticamente desinmunizados comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y/o 26. En algunas realizaciones, los polipéptidos modificados genéticamente desinmunizados comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 95% con la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y/o 26.
Los polipéptidos modificados purificados que tienen actividad fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) pueden purificarse.
Se divulgan secuencias de polinucleótido que codifican al menos un polipéptido que tiene por fenilalanina amoníaco-liasa (PAL), tal como se expone en el presente documento. En algunas realizaciones, la secuencia de polinucleótidos está unida operativamente a una secuencia de control. En algunas realizaciones adicionales, la secuencia de polinucleótidos está optimizada por codones.
Se divulgan vectores de expresión que comprenden al menos una secuencia de polinucleótido que codifica al menos un polipéptido modificado que tiene actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL), como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el vector de expresión comprende además al menos una secuencia de control. En algunas realizaciones, la secuencia de control es un promotor. En algunas realizaciones adicionales, el promotor es un promotor heterólogo.
T Se divulgan células huésped transformadas con al menos una secuencia de polinucleótido que codifica al menos un polipéptidos modificados que tiene actividad de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL), y/o que comprende al menos un vector de expresión de al menos una secuencia de polinucleótidos que codifica al menos una polipéptido diseñado que tiene actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) y al menos una secuencia de control. En algunas realizaciones, las células huésped comprenden al menos un polipéptido diseñado que tiene actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) que está optimizada por codones. En algunas realizaciones, la célula huésped es E. coli.
Se divulgan métodos de producción de al menos un polipéptido PAL modificado en una célula huésped que comprende cultivar una célula huésped que comprende al menos un polinucleótido que codifica al menos un polipéptido que tiene actividad fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) modificado, y/o al menos un vector de expresión que comprende al menos una secuencia polinucleotídica que codifica al menos un polipéptido modificado que tiene actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) y al menos una secuencia de control, en condiciones de cultivo adecuadas, de manera que se produce el polipéptido PAL modificado. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además la etapa de recuperar al menos un polipéptido diseñado que tiene fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) del cultivo y/o células huésped. En algunas realizaciones adicionales, los métodos comprenden además la etapa de purificar al menos un polipéptido diseñado que tiene fenilalanina amoniaco-liasa (PAL).
Se divulgan composiciones que comprenden actividad de amoníaco-liasa al menos un polipéptido modificado que tiene fenilalanina (PAL) como se describe aquí. En algunas realizaciones, la composición es una composición farmacéutica. En algunas realizaciones, la composición es un suplemento dietético y/o nutricional. En algunas realizaciones adicionales, las composiciones farmacéuticas comprenden además al menos un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones adicionales, la composición es adecuada para el tratamiento de la fenilcetonuria. En algunas realizaciones adicionales, la composición farmacéutica es adecuada para la administración oral a un ser humano. En algunas realizaciones, la composición está en forma de píldora, tableta, cápsula, cápsula de gel, líquido o emulsión. En otras realizaciones adicionales, la píldora, tableta, cápsula o cápsula de gel comprende además un recubrimiento entérico. En algunas realizaciones adicionales, la composición farmacéutica es adecuada para inyección parenteral en un ser humano. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se coadministra con al menos un compuesto terapéuticamente eficaz adicional. En algunas realizaciones adicionales, la composición farmacéutica comprende al menos un compuesto terapéuticamente eficaz adicional. En algunas realizaciones adicionales, la composición farmacéutica está presente en un suplemento dietético y/o nutricional.
Se divulgan métodos para tratar y/o prevenir los síntomas de la fenilcetonuria en un sujeto, que comprende proporcionar un sujeto que tiene fenilcetonuria, y proporcionar al menos una composición según la invención al sujeto. En algunas realizaciones, la composición comprende una composición farmacéutica, mientras que en algunas realizaciones alternativas, la composición comprende un suplemento dietético/nutricional. En algunas realizaciones de los métodos, los síntomas de la fenilcetonuria se mejoran. El sujeto tratado puede comer una dieta que está menos restringida en su contenido de metionina, fenilalanina y/o tirosina que las dietas requeridas por los sujetos que muestran los síntomas de fenilalanina. En algunas realizaciones, el sujeto tratado (es decir, un sujeto que ha recibido al menos una composición que comprende al menos un polipéptido diseñado que tiene actividad de fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) como se describe en este documento) puede comer una dieta que está menos restringida en su contenido de metionina, fenilalanina y/o tirosina en comparación con las dietas requeridas por sujetos a los que no se les ha proporcionado al menos una composición como se describe en este documento. En algunas realizaciones, la composición proporcionada a los sujetos comprende una composición farmacéutica, mientras que en algunas realizaciones alternativas, la composición comprende un suplemento dietético/nutricional. También se describen sujetos tratados, en los que al sujeto se le ha administrado al menos una composición y/o composición farmacéutica que comprende al menos un polipéptido diseñado que tiene actividad fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) como se describe en este documento. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal seleccionado de primates, roedores y lagamorfos. En algunas realizaciones adicionales, el sujeto es un ratón. En algunas realizaciones adicionales, el sujeto es un humano. En todavía algunas realizaciones adicionales, el sujeto es un infante o niño humano, mientras que en algunas realizaciones alternativas, el sujeto es un adulto humano o adulto joven.
Se divulgan usos de las composiciones que comprenden al menos un polipéptido modificado (PAL) que tiene actividad de fenilalanina amoníaco-liasa descrita en el presente documento.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 proporciona una alineación de secuencias de proteínas PAL de tipo silvestre: Anabaena variabilis PAL (NCBI YP_324488,1 (SEQ ID NO: 4)); Nostoc punctiforme fenilalanina/histidina amoniaco liasa "NpPHAL" (NCBI YP_001865631,1 (SEQ ID NO: 30); Rivularia sp. Histidina amoníaco-liasa "RspHAL" (NCBI YP_007056096,1 (SEQ ID NO: 31); Oscil-lala). histidina amoniaco-liasa "Osp HAL" (NCBI Yp_07108482,1 (SEQ ID NO: 32); y Gloeocapsa sp. histidina amoníaco-liasa "GspHAL" (NCBI YP_007127054,1) (SEQ ID NO: 33).
La Figura 2A muestra la sensibilidad reducida a la proteólisis (expresada como tolerancia a la quimotripsina y la tripsina) en comparación con el AvPAL de tipo silvestre analizado a pH 7,0 para la Variante N° 22 (SEQ ID NO: 8), Variante N° 30 (SEQ ID NO: 6) y la Variante N° 36 (SEQ ID NO: 10) como se describe más detalladamente en el Ejemplo 4. La Figura 2B proporciona un gráfico que muestra una mayor tolerancia al pH ácido en comparación con el AvPAL de tipo silvestre probado a pH 4,0 a 5,2, para la Variante Nos 22, 30 y 36 como se describe adicionalmente en el Ejemplo 4.
La Figura 3 proporciona los resultados de KM para la PAL de tipo silvestre y la Variante N° 36.
La Figura 4 proporciona datos que muestran la especificidad de aminoácidos de la PAL de tipo silvestre y la Variante N° 36.
La Figura 5 proporciona resultados que muestran la estabilidad relativa de la PAL de tipo silvestre y Variante N° 36 expuesta a quimotripsina y tripsina humanas.
La Figura 6 proporciona resultados que muestran la estabilidad relativa de PAL de tipo silvestre y las Variantes Nos 36, 42 y 43 expuestas al extracto pancreático porcino.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a polipéptidos modificados PAL, mutantes, fragmentos biológicamente activos y análogos de los mismos, y composiciones farmacéuticas e industriales que comprenden los mismos.
La invención se refiere a polipéptidos de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) modificados y composiciones de los mismos, así como polinucleótidos que codifican polipéptidos de fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) modificados. En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados se optimizan para proporcionar una actividad catalítica mejorada, así como una sensibilidad reducida a la proteólisis y una tolerancia incrementada a niveles de pH ácidos. En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados se desinmunizan. La invención también se refiere al uso de las composiciones que comprenden los polipéptidos PAL modificados con fines terapéuticos e industriales.
Abreviaturas y definiciones:
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento generalmente tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. En general, la nomenclatura utilizada en este documento y los procedimientos de laboratorio de cultivo celular, genética molecular, microbiología, química orgánica, química analítica y química de ácidos nucleicos descritos a continuación son aquellos bien conocidos y comúnmente empleados en la técnica. Tales técnicas son bien conocidas y se describen en numerosos textos y trabajos de referencia bien conocidos por los expertos en la técnica. Las técnicas estándar, o modificaciones de las mismas, se utilizan para síntesis químicas y análisis químicos.
Aunque cualesquiera métodos y materiales adecuados similares o equivalentes a los descritos en el presente documento encuentran uso en la práctica de la presente invención, algunos métodos y materiales se describen en el presente documento. Debe entenderse que esta invención no está limitada a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos, ya que estos pueden variar, dependiendo del contexto en que los utilizan los expertos en la materia. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente a continuación se describen más detalladamente en referencia a la aplicación en su totalidad.
Además, como se utiliza aquí, el singular "un", "una", “el” y "ella" incluyen las referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Los intervalos numéricos son inclusive de los números que definen el rango. Por lo tanto, se pretende que cada rango numérico descrito en este documento abarque cada rango numérico más estrecho que se encuentre dentro de dicho rango numérico más amplio, como si dichos rangos numéricos más estrechos estuvieran expresamente escritos aquí. También se pretende que cada limitación numérica máxima (o mínima) descrita en este documento incluya todas las limitaciones numéricas más bajas (o más altas), como si dichas limitaciones numéricas más bajas (o más altas) estuvieran expresamente escritas en este documento.
El término "aproximadamente" significa un error aceptable para un valor particular. En algunos casos, "aproximadamente" significa dentro de 0,05%, 0,5%, 1,0% o 2,0%, de un rango de valores dado. En algunos casos, "aproximadamente" significa dentro de 1, 2, 3 o 4 desviaciones estándar de un valor dado.
Además, los encabezamientos proporcionados en este documento no son limitaciones de los diversos aspectos o realizaciones de la invención que pueden ser por referencia a la aplicación como un todo. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más completamente por referencia a la aplicación en su totalidad. No obstante, para facilitar la comprensión de la invención, a continuación se definen una serie de términos.
A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3'; Las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amino a carboxi, respectivamente.
Tal como se utiliza aquí, el término "que comprende" y sus afines se utiliza en su sentido inclusivo (es decir, equivalente al término "que incluye" y sus correspondientes cognados).
El número "CE" se refiere a la Nomenclatura Enzimática del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB). La clasificación bioquímica IUBMB es un sistema de clasificación numérica para enzimas basado en las reacciones químicas que catalizan.
"ATCC" se refiere a la American Type Culture Collection cuya colección de biorepositorios incluye genes y cepas.
"NCBI" se refiere al Centro Nacional de Información Biológica y las bases de datos de secuencias proporcionadas en el mismo.
Tal como se utiliza aquí, el término "polipéptido de fenilalanina amoníaco-liasa" se refiere a una clase de enzimas dentro de la familia de los aminoácidos de liasas aromáticos (EC 4,3,1,23, EC 4,3,1,24 y EC4,3,1,25) que también incluye histidina amoníaco liasa y tirosina amoníaco liasa. Los polipéptidos PAL también se denominan a veces fenilalanina/tirosina amoniaco-liasa debido a que algunas enzimas PAL pueden usar tirosina y fenilalanina como sustrato. Sin embargo, el AvPAL y las variantes descritas y reivindicadas en el presente documento no utilizan tirosina como sustrato. Los polipéptidos PAL catalizan la conversión de L-fenilalanina en ácido trans-cinámico y amoníaco. La actividad PAL se refiere a la actividad enzimática de los polipéptidos PAL. En algunas realizaciones preferidas, una enzima PAL también contiene el cofactor 3,5-dihidro-5-metiliden-4H-imidazol-4-ona (MIO). Este cofactor puede ser necesario para la actividad catalítica y se forma mediante la ciclación y deshidratación de un segmento activo conservado del segmento tripéptido Ala167-Ser168-Gly169, "Proteína", "polipéptido" y "péptido" se usan indistintamente en el presente documento para denotar un polímero de al menos dos aminoácidos unidos covalentemente por un enlace amida, independientemente de la longitud o modificación post-traduccional (por ejemplo, glicosilación o fosforilación).
"Aminoácidos" se hace referencia a este documento por cualquiera de sus símbolos comúnmente conocidos de tres letras o por los símbolos de una letra recomendados por la IUPAC-IUB Comisión de Nomenclatura Bioquímica. A los nucleótidos, igualmente, se les puede referir por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.
El término "modificado", "recombinante", "de origen no natural," y "variante", cuando se usa con referencia a una célula, un polinucleótido o un polipéptido se refiere a un material o de un material correspondiente al natural o forma nativa del material que se ha modificado de una manera que de otra manera no existiría en la naturaleza o es idéntica a la misma pero que se produce o deriva de materiales sintéticos y/o mediante manipulación utilizando técnicas recombinantes.
Como se usa en este documento, "de tipo silvestre" y "de origen natural" se refieren a la forma encontrada en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido de tipo silvestre es una secuencia presente en un organismo que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionalmente por la manipulación humana.
"Desinmunizado" como se usa en este documento, se refiere a la manipulación de una proteína para crear una variante que no es tan inmunogénica como la proteína de tipo silvestre o de referencia. En algunas realizaciones, la desinmunización es completa, ya que la proteína variante no estimula una respuesta inmune en pacientes a los que se administra la proteína variante. Esta respuesta puede medirse mediante diversos métodos, entre los que se incluyen, entre otros, la presencia o abundancia de neutralización (es decir, anticuerpos antidrogas), la presencia de una respuesta anafiláctica o la prevalencia o intensidad de la liberación de citoquinas tras la administración de la proteína. En algunas realizaciones, la proteína variante es menos inmunogénica que la proteína de tipo silvestre o de referencia. En algunas realizaciones, la desinmunización implica modificaciones a proteínas (por ejemplo, epítopos) que son reconocidas por los receptores de células T. En algunas realizaciones, los epítopos de células T se eliminan de una proteína de tipo silvestre o de referencia para producir una proteína variante desinmunizada. En algunas realizaciones, la proteína desinmunizada muestra niveles más bajos de respuesta en predictores bioquímicos y biológicos celulares de respuestas inmunológicas humanas que incluyen ensayos de activación de células T de células dendríticas, o ensayos de unión de péptidos antígeno leucocitario humano (HLA).
La "secuencia de codificación" se refiere a la parte de un ácido nucleico (por ejemplo, un gen) que codifica una secuencia de aminoácidos de una proteína.
El término "porcentaje (%) de identidad de secuencia" se utiliza aquí para referirse a las comparaciones entre polinucleótidos y polipéptidos, y se determinan mediante la comparación de dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, donde la porción de la secuencia de polinucleótido o polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje puede calcularse determinando el número de posiciones en las que se produce la base de ácido nucleico o aminoácido idéntico en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparar y multiplicar el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Alternativamente, el porcentaje puede calcularse determinando el número de posiciones en las cuales ocurre la misma base de ácido nucleico o el residuo de aminoácido en ambas secuencias o una base de ácido nucleico o un residuo de aminoácido se alinea con un hueco para producir el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Los expertos en la técnica aprecian que hay muchos algoritmos establecidos disponibles para alinear dos secuencias. La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482 [1981]), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443 [1970]), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85: 2444 [1988]), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (por ejemplo, GAP, BESTFIT, FASTA y t Fa STA en el paquete de software GCG Wisconsin), o mediante inspección visual, como se conoce en la técnica. Los ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia incluyen, entre otros, los algoritmos BLAST y BLAST 2,0 (ver, por ejemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 [1990], y Altschul et al., Nucleic Acids Res., 3389-3402 [1977]). El software para realizar los análisis de BLAST está disponible públicamente a través del sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica. Este algoritmo implica primero la identificación de pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud "W" en la secuencia de consulta, que coinciden con o satisfacen alguna puntuación de umbral de valor positivo "T", cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se conoce como el umbral de puntuación de la palabra vecina (Ver, Altschul et al, supra). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que los contengan. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde se puede aumentar la puntuación de alineación acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros "M" (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre >0) y "N" (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulada cae en la cantidad "X" desde su valor máximo alcanzado; el puntaje acumulativo llega a cero o por debajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntaje negativo; o se llega al final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como predeterminada una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como valor predeterminado una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase, por ejemplo, Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 10915 [1989]). La determinación ejemplar de alineación de secuencia y% de identidad de secuencia puede emplear los programas BESTFIT o GAP en el paquete de software GCG Wisconsin (Accelrys, Madison WI), usando los parámetros predeterminados proporcionados.
"Secuencia de referencia" se refiere a una secuencia definida utilizada como base para una comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, un segmento de un gen o secuencia polipeptídica de longitud completa. En general, una secuencia de referencia tiene una longitud de al menos 20 residuos de nucleótidos o aminoácidos, una longitud de al menos 25 residuos, una longitud de al menos 50 residuos, una longitud de al menos 100 residuos o la longitud completa del ácido nucleico o polipéptido. Dado que dos polinucleótidos o polipéptidos pueden cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una parte de la secuencia completa) que es similar entre las dos secuencias, y (2) puede comprender además una secuencia que es divergente entre las dos secuencias, comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos o polipéptidos se realizan típicamente comparando secuencias de los dos polinucleótidos o polipéptidos en una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. En algunas realizaciones, una "secuencia de referencia" puede basarse en una secuencia de aminoácidos primaria, donde la secuencia de referencia es una secuencia que puede tener uno o más cambios en la secuencia primaria. Por ejemplo, la frase "secuencia de referencia basada en la SEQ ID NO: 4 que tiene una valina en el residuo correspondiente a X39" se refiere a una secuencia de referencia en la que el residuo correspondiente en la posición X39 en la SEQ ID NO: 4 (por ejemplo, una alanina), se ha cambiado a valina.
La "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de al menos aproximadamente 20 posiciones de nucleótidos contiguas o residuos de aminoácidos en los que se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia de al menos 20 nucleótidos contiguos o aminoácidos y en donde la porción de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) de 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. La ventana de comparación puede tener más de 20 residuos contiguos e incluye, opcionalmente, 30, 40, 50, 100 o más ventanas.
"Correspondiente a", "con referencia a", y "con respecto a" cuando se usan en el contexto de la numeración de una secuencia de aminoácidos dada o polinucleótido se refieren a la numeración de los residuos de una secuencia de referencia especificada cuando el amino cuando una secuencia de ácido o polinucleótido se compara con la secuencia de referencia. En otras palabras, el número de residuo o la posición de residuo de un polímero dado se designa con respecto a la secuencia de referencia en lugar de por la posición numérica real del residuo dentro de la secuencia de aminoácidos o polinucleótido dada. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos dada, como la de un PAL modificada, puede alinearse con una secuencia de referencia introduciendo espacios para optimizar las coincidencias de residuos entre las dos secuencias. En estos casos, aunque los huecos están presentes, la numeración del residuo en la secuencia de aminoácidos o polinucleótidos dada se realiza con respecto a la secuencia de referencia con la que se ha alineado.
"Diferencia de aminoácidos" y "diferencia de residuos" se refieren a una diferencia en el residuo de aminoácido en una posición de una secuencia polipeptídica con respecto al residuo de aminoácido en una posición correspondiente en una secuencia de referencia. Las posiciones de las diferencias de aminoácidos generalmente se denominan en este documento "Xn", donde n se refiere a la posición correspondiente en la secuencia de referencia en la que se basa la diferencia de residuos. Por ejemplo, una "diferencia de residuos en la posición X91 en comparación con la SEQ ID NO: 4" se refiere a una diferencia del residuo de aminoácido en la posición del polipéptido correspondiente a la posición 91 de la SEQ ID NO: 4, Por lo tanto, si el polipéptido de referencia de la SEQ ID NO: 4 tiene una alanina en la posición 91, entonces una "diferencia de residuos en la posición X91 en comparación con la SEQ ID NO: 4" se refiere a una sustitución de aminoácidos de cualquier resto que no sea la alanina en la posición posición del polipéptido correspondiente a la posición 91 de la SEQ ID NO: 4. En la mayoría de los casos en este documento, la diferencia de residuos de aminoácidos específicos en una posición se indica como "XnY" donde "Xn" especificó el resto correspondiente y la posición del polipéptido de referencia (como se describió anteriormente), y "Y" es el identificador de una sola letra del aminoácido encontrado en el polipéptido diseñado (es decir, el resto diferente que en el polipéptido de referencia). En algunos casos (por ejemplo, en las Tablas de los Ejemplos), también se describen diferencias específicas de aminoácidos indicadas por la notación convencional "AnB", donde A es el identificador de una sola letra del residuo en la secuencia de referencia, "n" es el número de la posición del residuo en la secuencia de referencia, y B es el identificador de una sola letra de la sustitución del residuo en la secuencia del polipéptido diseñado. En algunos casos, un polipéptido de la presente divulgación puede incluir una o más diferencias de residuos de aminoácidos en relación con una secuencia de referencia, lo que se indica mediante una lista de las posiciones especificadas donde las diferencias de residuos están presentes en relación con la secuencia de referencia. En algunas realizaciones, cuando se puede usar más de un aminoácido en una posición de residuo específica de un polipéptido, los diversos residuos de aminoácidos que se pueden usar están separados por una "/" (por ejemplo, X307G/x 307Q o X307G/Q). La presente divulgación incluye secuencias de polipéptidos modificados que comprenden una o más diferencias de aminoácidos que incluyen sustituciones de aminoácidos conservativas y no conservativas.
Los términos "conjunto de sustitución de aminoácido" y "conjunto de sustitución" se refiere a un grupo de sustituciones de aminoácidos dentro de una secuencia de polipéptido. En algunas realizaciones, los conjuntos de sustitución comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, l2, 13, 14, 15 o más sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, un conjunto de sustitución se refiere al conjunto de sustituciones de aminoácidos que está presente en cualquiera de los polipéptidos AvPAL variantes enumerados en cualquiera de las Tablas en los Ejemplos. Por ejemplo, el conjunto de sustitución presente en la Variante 36 es A39V/A91V/N290G/H3o7G/L407V/T524S, en donde las posiciones de aminoácidos son relativas a la SEQ ID NO: 4.
"Sustitución de aminoácidos conservativa" se refiere a una sustitución de un residuo con un residuo diferente que tiene una cadena lateral similar y, por lo tanto, típicamente implica la sustitución del aminoácido en el polipéptido con aminoácidos dentro de la misma o similar clase definida de aminoácidos. A modo de ejemplo y no de limitación, un aminoácido con una cadena lateral alifática puede estar sustituido con otro aminoácido alifático (por ejemplo, alanina, valina, leucina e isoleucina); un aminoácido con cadena lateral hidroxilo está sustituido con otro aminoácido con una cadena lateral hidroxilo (por ejemplo, serina y treonina); un aminoácido que tiene cadenas laterales aromáticas está sustituido con otro aminoácido que tiene una cadena lateral aromática (por ejemplo, fenilalanina, tirosina, triptófano e histidina); un aminoácido con una cadena lateral básica está sustituido con otro aminoácido con una cadena lateral básica (por ejemplo, lisina y arginina); un aminoácido con una cadena lateral ácida está sustituido con otro aminoácido con una cadena lateral ácida (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico); y un aminoácido hidrófobo o hidrófilo se reemplaza con otro aminoácido hidrófobo o hidrófilo, respectivamente.
"Sustitución no conservativa" se refiere a la sustitución de un aminoácido en el polipéptido con un aminoácido con propiedades de cadena lateral significativamente diferentes. Las sustituciones no conservativas pueden usar aminoácidos entre, en lugar de dentro de los grupos definidos y afectar: (a) la estructura del esqueleto peptídico en el área de la sustitución (por ejemplo, prolina para glicina); (b) la carga o hidrofobicidad; y/o (c) la mayor parte de la cadena lateral. A modo de ejemplo y no de limitación, las sustituciones no conservativas a modo de ejemplo incluyen un aminoácido ácido sustituido con un aminoácido básico o alifático; un aminoácido aromático sustituido con un pequeño aminoácido; y un aminoácido hidrófilo sustituido con un aminoácido hidrófobo.
"Deleción" se refiere a la modificación del polipéptido mediante la eliminación de uno o más aminoácidos del polipéptido de referencia. Las eliminaciones pueden comprender la eliminación de 1 o más aminoácidos, 2 o más aminoácidos, 5 o más aminoácidos, 10 o más aminoácidos, 15 o más aminoácidos, o 20 o más aminoácidos, hasta el 10% del número total de aminoácidos, o hasta el 20% del número total de aminoácidos que constituyen la enzima de referencia, al tiempo que conserva la actividad enzimática y/o retiene las propiedades mejoradas de una enzima transaminasa modificada. Las eliminaciones pueden dirigirse a las porciones internas y/o porciones terminales del polipéptido. En diversas realizaciones, la eliminación puede comprender un segmento continuo o puede ser discontinua.
"Inserción" se refiere a la modificación del polipéptido mediante la adición de uno o más aminoácidos del polipéptido de referencia. Las inserciones pueden estar en las porciones internas del polipéptido, o en el extremo carboxi o amino. Las inserciones como se usan en este documento incluyen proteínas de fusión como se conoce en la técnica. La inserción puede ser un segmento contiguo de aminoácidos o separado por uno o más de los aminoácidos en el polipéptido natural.
Los términos "fragmento funcional" y "fragmento biológicamente activo" se usan indistintamente en este documento, para referirse a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxi-terminal(s) y/o deleciones internas, pero donde el la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia con la que se está comparando (por ejemplo, una PAL modificada de longitud completa de la presente invención) y que retiene sustancialmente toda la actividad del polipéptido de longitud completa.
"Polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido que está sustancialmente separado de otros contaminantes que naturalmente lo acompañan (por ejemplo, proteínas, lípidos y polinucleótidos). El término abarca polipéptidos que se han eliminado o purificado de su entorno o sistema de expresión natural (por ejemplo, célula huésped o síntesis in vitro). Los polipéptidos PAL recombinantes pueden estar presentes dentro de una célula, presentes en el medio celular, o preparados en diversas formas, tales como lisados o preparaciones aisladas. Como tal, en algunas realizaciones, los polipéptidos PAL recombinantes descritos en este documento son polipéptidos aislados.
"Polipéptido sustancialmente puro" se refiere a una composición en la que la especie polipeptídica es la especie predominante presente (es decir, en base molar o en peso, es más abundante que cualquier otra especie macromolecular individual en la composición), y es generalmente una composición sustancialmente purificada cuando la especie diana comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento de las especies macromoleculares presentes en moles o % en peso. En general, una composición de PAL sustancialmente pura comprenderá aproximadamente el 60% o más, aproximadamente el 70% o más, aproximadamente el 80% o más, aproximadamente el 90% o más, aproximadamente el 95% o más, y aproximadamente el 98% o más de todas las especies macromoleculares por Mole o % en peso presente en la composición. En algunas realizaciones, la especie diana se purifica hasta homogeneidad esencial (es decir, las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición mediante métodos de detección convencionales), en donde la composición consiste esencialmente en una sola especie macromolecular. Las especies solventes, las moléculas pequeñas (<500 Daltons) y las especies de iones elementales no se consideran especies macromoleculares. En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL recombinantes aislados son composiciones polipeptídicas sustancialmente puras.
"Propiedad enzimática mejorada" se refiere a un polipéptido PAL modificado que exhibe una mejora en cualquier propiedad enzimática en comparación con un polipéptido PAL de referencia, tal como un polipéptido PAL de tipo silvestre (por ejemplo, AvPAL de tipo silvestre que tiene la SEQ ID NO: 4) u otro polipéptido PAL modificado. Las propiedades mejoradas incluyen, entre otras, propiedades tales como aumento de la expresión de proteínas, mayor termoactividad, mayor termoestabilidad, mayor actividad del pH, mayor estabilidad, mayor actividad enzimática, mayor especificidad y/o afinidad del sustrato, mayor actividad específica, mayor resistencia al sustrato y/o inhibición del producto final, estabilidad química aumentada, quimioselectividad mejorada, estabilidad del solvente mejorada, tolerancia incrementada al pH ácido, tolerancia incrementada a la actividad proteolítica (es decir, sensibilidad reducida a la proteolisis), agregación reducida, solubilidad incrementada, inmunogenicidad reducida y perfil de temperatura alterado.
"Actividad enzimática aumentada" y "actividad catalítica mejorada" se refieren a una propiedad mejorada de polipéptidos PAL modificados, que pueden representarse por un aumento en la actividad específica (por ejemplo, producto producido/proteína de tiempo/peso) y/o un aumento en el porcentaje de conversión del sustrato al producto (por ejemplo, porcentaje de conversión de la cantidad de inicio del sustrato). al producto en un período de tiempo especificado utilizando una cantidad específica de PAL) en comparación con la enzima PAL de referencia (por ejemplo, AvPAL de tipo silvestre y/u otro AvPAL modificado). En los ejemplos se proporcionan métodos ejemplares para determinar la actividad de la enzima. Cualquier propiedad relacionada con la actividad enzimática puede verse afectada, incluidas las propiedades enzimáticas clásicas de Km, Vmax o kmax cuyos cambios pueden conducir a un aumento de la actividad enzimática. Las mejoras en la actividad enzimática pueden ser desde aproximadamente 1,1 veces la actividad enzimática de la enzima de tipo silvestre correspondiente, hasta 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces o más actividad enzimática que la PAL natural u otra PAL modificada a partir de la cual se derivaron los polipéptidos PAL.
En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados tienen un kcat de al menos 0,1/seg, al menos 0,2/seg, al menos 0,3/seg, al menos 0,5/seg, al menos 1,0/seg y en algunas realizaciones preferidas mayor que 1,0/seg. En algunas realizaciones, la Km está en el intervalo de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 mM; en el intervalo de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 2 mM; en el intervalo de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 2 mM; o en el intervalo de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 1 mM. En algunas realizaciones específicas, la enzima PAL modificada presenta una actividad enzimática mejorada en el rango de 1,5 a 10 veces, 1,5 a 25 veces, 1,5 a 50 veces, 1,5 a 100 veces o más, que la de la enzima PAL de referencia. La actividad de PAL se puede medir mediante cualquier ensayo estándar conocido en la técnica (por ejemplo, al monitorear los cambios en las propiedades espectrofotométricas de los reactivos o productos). En algunas realizaciones, la cantidad de productos producidos se mide por separación por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) combinada con absorbancia UV o detección fluorescente directamente o después de la derivatización de o-ftalialdehído (OPA). En algunas realizaciones, las comparaciones de las actividades enzimáticas se realizan utilizando una preparación definida de enzima, un ensayo definido en una condición establecida y uno o más sustratos definidos, como se describe con más detalle en este documento. Generalmente, cuando se comparan los lisados, se determinan los números de células y la cantidad de proteína analizada, así como el uso de sistemas de expresión idénticos y células huésped idénticas, para minimizar las variaciones en la cantidad de enzima producida por las células huésped y presente en el lisados
El término "tolerancia mejorada a pH ácido" significa que un PAL recombinante de acuerdo con la invención presenta una mayor estabilidad (es decir, mayor actividad retenida a aproximadamente pH 7,0, después de la exposición a pH ácido por un período de tiempo especificado [1 hora, hasta 24 horas]) en comparación con una referencia PAL.
"pH fisiológico" como se usa en este documento significa el rango de pH generalmente encontrado en el intestino delgado de un sujeto (por ejemplo, humano). Normalmente hay un gradiente de pH de la válvula pilórica al intestino grueso, en el rango de aproximadamente 6,0 a 7,5.
El término "pH ácido" se utiliza con referencia a una estabilidad mejorada a condiciones de pH ácido o una mayor tolerancia al pH ácido significa un intervalo de pH de aproximadamente 1,5 a 6,8.
Los términos "actividad proteolítica" y "proteólisis" usado de forma intercambiable aquí, se refieren a la ruptura de las proteínas en polipéptidos más pequeños o aminoácidos. La descomposición de las proteínas es generalmente el resultado de la hidrólisis del enlace peptídico por las enzimas proteasas (proteinasas). Las enzimas proteasas incluyen, entre otras, pepsina, tripsina, quimotripsina, elastasa; carboxipeptidasa A y B, y peptidasas (p. ej., amino peptidasa, dipeptidasa y enteropeptidasa).
Las frases "reducción de la sensibilidad a la proteolisis" y "reducir la sensibilidad proteolítica" se usan indistintamente en el presente documento significa que un polipéptido de PAL modificada de acuerdo con la invención tendrá una mayor actividad enzimática en comparación con una PAL de referencia en un ensayo estándar (por ejemplo, como se ha descrito en los Ejemplos) después del tratamiento con una o más proteasas.
"Agregación" significa agrupación o precipitación de un polipéptido PAL. La agregación puede conducir a la inactivación de la enzima. El término "agregación reducida" significa que un polipéptido PAL modificado será menos propenso a la agregación, en comparación con una PAL de referencia. Los métodos para evaluar la agregación son conocidos en la técnica, incluyendo, entre otros, el uso de microscopía fluorescente con colorantes apropiados (p. ej., Tioflavina T o Nilo Rojo), dispersión dinámica de la luz, citometría de flujo con colorantes apropiados (p. ej., Bodipy), filtración y análisis por SDS-PAGE y/o transferencia Western, espectroscopia de correlación fluorescente y microscopía electrónica. Hay kits disponibles en el mercado para evaluar la agregación (por ejemplo, el kit de ensayo de agregación de proteínas ProteoStat® [Enzo]).
"Conversión" se refiere a la conversión enzimática (o biotransformación) del (de los) sustrato(s) en el (los) producto(s) correspondiente(s). "Porcentaje de conversión" se refiere al porcentaje del sustrato que se convierte al producto dentro de un período de tiempo en condiciones específicas. Por lo tanto, la "actividad enzimática" o "actividad" de un polipéptido PAL puede expresarse como "porcentaje de conversión" del sustrato al producto en un período específico de tiempo.
La "rigurosidad de hibridación" se refiere a condiciones de hibridación, tales como condiciones de lavado, en la hibridación de ácidos nucleicos. En general, las reacciones de hibridación se realizan en condiciones de menor rigurosidad, seguidas de lavados de mayor rigor variable pero superior. El término "hibridación moderadamente rigurosa" se refiere a las condiciones que permiten que el ADN diana se una a un ácido nucleico complementario que tiene una identidad de aproximadamente el 60%, preferiblemente una identidad de aproximadamente el 75%, una identidad de aproximadamente el 85% con el ADN diana, con una identidad de más del 90% al polinucleótido diana. Los ejemplos de condiciones moderadamente rigurosas son condiciones equivalentes a la hibridación en 50% de formamida, 5 X solución de Denhart, 5 X SSPE, 0,2% de SDS a 42°C, seguido de lavado en 0,2 X SSPE, 0,2% SDS, a 42°C. "Alta hibridación de rigurosidad" generalmente se refiere a condiciones que son alrededor de 10°C o menos de la temperatura de fusión térmica Tm tal como se determina bajo la condición de solución para una secuencia de polinucleótido definida. En algunas realizaciones, una condición de rigurosidad alta se refiere a condiciones que permiten la hibridación de solo aquellas secuencias de ácido nucleico que forman híbridos estables en NaCl 0,018 M a 65°C (es decir, si un híbrido es no estable en 0,018 M NaCl a 65°C, no será estable en condiciones de alta rigurosidad, como se contempla en este documento). Se pueden proporcionar condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, mediante hibridación en condiciones equivalentes a 50% de formamida, 5 X solución de Denhart, 5 X Ss PE, 0,2% SDS a 42°C, seguido de lavado en 0,1 X SSPE y 0,1% SDS a 65°C. Otra condición de alta rigurosidad es la hibridación en condiciones equivalentes a la hibridación en 5X SSC que contiene 0,1% (p:v) SDS a 65°C y lavado en 0,1x SSC que contiene 0,1% SDS a 65°C. Otras condiciones de hibridación de alta rigurosidad, así como condiciones moderadamente rigurosas, se describen en las referencias citadas anteriormente.
"Codón optimizado" se refiere a cambios en los codones del polinucleótido que codifican una proteína a los utilizados preferentemente en un organismo particular, de modo que la proteína codificada se expresa de manera más eficiente en ese organismo. Aunque el código genético está degenerado, ya que la mayoría de los aminoácidos están representados por varios codones, llamados "sinónimos" o codones "sinónimos", es bien sabido que el uso de codones por parte de organismos particulares no es aleatorio y está sesgado hacia tripletes de codones particulares. Este sesgo de uso del codón puede ser mayor en referencia a un gen dado, genes de función común u origen ancestral, proteínas altamente expresadas versus proteínas de bajo número de copias, y las regiones codificantes de proteínas agregadas del genoma de un organismo. En algunas realizaciones, los polinucleótidos que codifican las enzimas PAL son codones optimizados para la producción óptima del organismo huésped seleccionado para la expresión.
"Secuencia de control" se refiere aquí para incluir todos los componentes, que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucleótido y/o polipéptido de la presente divulgación. Cada secuencia de control puede ser nativa o ajena a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Dichas secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, líderes, secuencias de poliadenilación, secuencias de propéptidos, secuencias promotoras, secuencias de péptidos de señal, secuencias de iniciación y terminadores de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada de transcripción y traducción. En algunas realizaciones, las secuencias de control están provistas de enlazadores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que facilitan la ligadura de las secuencias de control con la región codificante de la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido.
"Conectado operativamente" se define en el presente documento como una configuración en la que una secuencia de control se coloca adecuadamente (es decir, en una relación funcional) en una posición relativa a un polinucleótido de interés tal que la secuencia de control dirige o regula la expresión de polinucleótido que codifica un polipéptido de interés.
"Secuencia promotora" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que es reconocida por una célula huésped para la expresión de un polinucleótido de interés, tal como una secuencia de codificación. La secuencia del promotor contiene secuencias de control de la transcripción que median la expresión de un polinucleótido de interés. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección, incluidos los promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares, ya sea homólogos o heterólogos a la célula huésped.
"Condiciones de reacción adecuadas" se refiere a aquellas condiciones en la solución de reacción de conversión enzimática (por ejemplo, rangos de carga de enzimas, carga de sustrato, temperatura, pH, tampones, codisolventes, etc.) bajo los cuales un polipéptido PAL de la presente divulgación es capaz de convertir un sustrato en el compuesto del producto deseado. Las "condiciones de reacción adecuadas" ejemplares se describen en este documento (ver, los Ejemplos).
"Carga", como en "carga de compuesto" o "carga de enzima" se refiere a la concentración o cantidad de un componente en una mezcla de reacción al comienzo de la reacción. "Sustrato" en el contexto de un proceso de reacción de conversión enzimática se refiere al compuesto o molécula sobre la que actúa el polipéptido PAL. "Producto" en el contexto de un proceso de conversión enzimática se refiere al compuesto o molécula resultante de la acción del polipéptido PAL sobre el sustrato.
Tal como se utiliza aquí, el término "cultivo" se refiere al crecimiento de una población de células microbianas en condiciones adecuadas utilizando cualquier medio adecuado (por ejemplo, líquido, gel, o sólido).
Los polipéptidos recombinantes (por ejemplo, variantes de la enzima PAL) se pueden producir usando cualquiera de los métodos adecuados conocidos de la técnica. Por ejemplo, existe una amplia variedad de diferentes técnicas de mutagénesis bien conocidas por los expertos en la técnica. Además, muchos proveedores comerciales de biología molecular también ofrecen kits de mutagénesis. Hay métodos disponibles para realizar sustituciones específicas en aminoácidos definidos (dirigidos al sitio), mutaciones específicas o aleatorias en una región localizada del gen (regio-específica), o mutagénesis aleatoria sobre todo el gen (por ejemplo, mutagénesis de saturación). Los expertos en la materia conocen numerosos métodos adecuados para generar variantes enzimáticas, que incluyen, entre otras, mutagénesis dirigida de ADN monocatenario o ADN bicatenario mediante PCR, mutagénesis de casete, síntesis de genes, PCR propensa a errores, barajado y mutagénesis por saturación química, o cualquier otro método adecuado conocido en la técnica. Ejemplos no limitativos de los métodos utilizados para la ingeniería de ADN y proteínas se proporcionan en las siguientes patentes: Patente de EE.UU. N° 6.117.679; Patente de EE.UU. N° 6.420.175; Patente de EE.UU. N° 6.376.246; Patente de EE.UU. N° 6.586.182; Patente de EE.UU. N° 7.747.391; Patente de EE.UU. N° 7.747.393; Patente de EE.UU. N° 7.783.428; y la patente de EE.UU. N° 8.383.346. Después de que se produzcan las variantes, pueden seleccionarse para cualquier propiedad deseada (por ejemplo, actividad alta o aumentada, o actividad reducida, actividad térmica incrementada, estabilidad térmica incrementada y/o estabilidad del pH ácido, etc.). En algunas realizaciones, los "polipéptidos PAL recombinantes" (también denominados en el presente documento como "polipéptidos PAL modificados", "enzimas PAL variantes" y "variantes PAL") encuentran uso.
Como se usa en este documento, un "vector" es un constructo de ADN para la introducción de una secuencia de ADN en una célula. En algunas realizaciones, el vector es un vector de expresión que está unido operativamente a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar la expresión en un huésped adecuado del polipéptido codificado en la secuencia de ADN. En algunas realizaciones, un "vector de expresión" tiene una secuencia promotora unida operativamente a la secuencia de ADN (por ejemplo, transgén) para dirigir la expresión en una célula huésped, y en algunas realizaciones, también comprende una secuencia de terminación de la transcripción.
Tal como se utiliza aquí, el término "expresión" incluye cualquier fase implicada en la producción del polipéptido incluyendo, pero no limitado a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, y modificación post-traduccional. En algunas realizaciones, el término también abarca la secreción del polipéptido de una célula.
Tal como se utiliza aquí, el término "produce" se refiere a la producción de proteínas y/u otros compuestos por las células. Se pretende que el término abarque cualquier etapa involucrada en la producción de polipéptidos que incluye, entre otros, transcripción, modificación postranscripcional, traducción y modificación post-traduccional. En algunas realizaciones, el término también abarca la secreción del polipéptido de una célula.
Como se usa en el presente documento, un aminoácido o secuencia de nucleótidos (por ejemplo, una secuencia de promotor, péptido señal, secuencia de terminación, etc.) es "heterólogo" a otra secuencia con la que está unida operativamente si las dos secuencias no están asociadas en naturaleza.
Como se usa en el presente documento, los términos "célula huésped" y "cepa huésped" se refieren a huéspedes adecuados para los vectores de expresión que comprenden ADN descrita en este documento (por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos que codifican al menos una variante AvPAL). En algunas realizaciones, las células huesped son células procariotas o eucariotas que se han transformado o transfectado con vectores construidos utilizando técnicas de ADN recombinante como se conoce en la técnica.
El término "análogo" significa un polipéptido que tiene más de 70% de identidad de secuencia, pero menos de 100% de identidad de secuencia (por ejemplo, más de 75%, 78%, 80%, 83%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia) con un polipéptido de referencia. En algunas realizaciones, los análogos incluyen residuos de aminoácidos no naturales que incluyen, entre otros, homoarginina, ornitina y norvalina, así como aminoácidos naturales. En algunas realizaciones, los análogos también incluyen uno o más residuos de D-aminoácidos y enlaces no peptídicos entre dos o más residuos de aminoácidos.
El término "terapéutico" se refiere a un compuesto administrado a un sujeto que muestra signos o síntomas de la patología que tiene efectos médicos beneficiosos o deseables.
El término "composición farmacéutica" se refiere a una composición adecuada para uso farmacéutico en un sujeto mamífero (por ejemplo, humano) que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de un polipéptido pAl modificado abarcados por la invención y un vehículo aceptable.
El término "cantidad eficaz" significa una cantidad suficiente para producir el resultado deseado. Un experto en la técnica puede determinar cuál es la cantidad efectiva usando experimentación de rutina.
Los términos "aislado" y "purificado" se utilizan para referirse a una molécula (por ejemplo, un ácido nucleico aislado, polipéptido, etc.) u otro componente que se elimina de al menos otro componente con el que está naturalmente asociado. El término "purificado" no requiere pureza absoluta, sino que se pretende que sea una definición relativa.
El término "sujeto" abarca mamíferos tales como seres humanos, primates no humanos, animales de granja, animales de compañía, y animales de laboratorio (por ejemplo, roedores y lagamorfos). Se pretende que el término abarque tanto a las mujeres como a los hombres.
Tal como se utiliza aquí, el término "paciente" se refiere a cualquier sujeto que está siendo evaluado para, tratado o está experimentando enfermedad.
El término "infante" se refiere a un niño en el período del primer mes después del nacimiento hasta aproximadamente un (1) año de edad. Tal como se utiliza aquí, el término "recién nacido" se refiere a niño en el período desde el nacimiento hasta el 28° día de vida. El término "bebé prematuro" se refiere a un bebé nacido después de la vigésima semana de gestación, sin embargo, antes de término, por lo general un peso de ~ 500 a ~ 2499 gramos al nacer. Un "bebé de muy bajo peso al nacer" es un bebé que pesa menos de 1500 g al nacer.
Tal como se utiliza aquí, el término "niño" se refiere a una persona que no ha alcanzado la edad legal de consentimiento para los procedimientos de tratamiento o de investigación. En algunas realizaciones, el término se refiere a una persona entre el momento del nacimiento y la adolescencia.
Tal como se utiliza aquí, el término "adulto" se refiere a una persona que ha alcanzado la edad legal de la jurisdicción correspondiente (por ejemplo, de 18 años de edad en los Estados Unidos). En algunas realizaciones, el término se refiere a cualquier organismo maduro completamente desarrollado. En algunas realizaciones, el término "adulto joven" se refiere a una persona menor de 18 años, pero que ha alcanzado la madurez sexual.
Como se usa en el presente documento, "composición" y "formulación" abarcan productos comprende al menos una PAL modificada de la presente invención, destinados a cualquier uso adecuado (por ejemplo, composiciones farmacéuticas, los suplementos/nutricionales de la dieta, alimento, etc.).
Los términos "administración" y "administrar" una composición significan proporcionar una composición de la presente invención a un sujeto (por ejemplo, a una persona que sufre de los efectos de PKU).
El término "vehículo" cuando se usa en referencia a una composición farmacéutica significa cualquiera de la portadora estándar farmacéutica, tampones y excipientes, tales como estabilizantes, conservantes, y adyuvantes.
El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material que se puede administrar a un sujeto sin causar ningún efecto biológico indeseable o interactuar de manera perjudicial con cualquiera de los componentes en los que está contenido y que posee la actividad biológica deseada.
Tal como se utiliza aquí, el término "excipiente" se refiere a cualquier aditivo aceptable, vehículo, diluyente, adyuvante farmacéuticamente, u otro ingrediente, distinto del ingrediente farmacéutico activo (API; por ejemplo, los polipéptidos PAL modificados de la presente invención). Los excipientes se incluyen típicamente para propósitos de formulación y/o administración.
[0146El término "cantidad terapéuticamente eficaz" cuando se usa en referencia a los síntomas de enfermedad/condición se refiere a la cantidad y/o concentración de un compuesto (por ejemplo, polipéptidos PAL modificados genéticamente) que mejora, atenúa o elimina uno o más síntomas de una enfermedad/afección o previene o retrasa la aparición de síntomas (por ejemplo, PKU). En algunas realizaciones, el término se usa en referencia a la cantidad de una composición que provoca la respuesta biológica (por ejemplo, médica) por parte de un tejido, sistema o sujeto animal que es buscado por el investigador, médico, veterinario u otro clínico.
[0147] El término "cantidad terapéuticamente eficaz" cuando se usa en referencia a una enfermedad/condición se refiere a la cantidad y/o concentración de una composición que mejora, atenúa o elimina la enfermedad/estado.
Se pretende que los términos "tratar", "tratado" y "tratamiento" abarquen preventivos (por ejemplo, profilácticos), así como tratamiento paliativo.
Polipéptidos PAL modificados:
Los polipéptidos PAL parentales de los que los polipéptidos PAL modificados de la descripción se derivan incluyen cepas bacterianas tales como Anabaena (por ejemplo, A. variabilis), Nostoc (por ejemplo, N. punctiforme), Rhodosporidium (por ejemplo, R. toruloides), Streptomyces (p. ej., S. maritimus o S. verticillatus), Oscilatoria sp., Gloeocapsa sp. Y Rivularia sp. Las enzimas pAl de estas cepas se han identificado y son bien conocidas. Secuencias de enzimas homólogas de Anabaena (A. variabilis) ATCC 29413 y NCBI YP_324488,1; Nostoc (N. punctiforme) ATCC 29133 y NCBI YP_00186563,1; Oscillatoria sp. PCC 6506 y NCBI ZP_07108482,1 y Gloeocapsa sp. PCC7428 y NCBI YP_007127054,1 se proporcionan en la Figura 1, El Nostoc punctiforme fenilalanina/histidina amoníaco liasa "NpPHAL" (NCBI YP_001865631,1 (SEQ ID NO: 30); Rivularia sp. Histidina amoníaco-liasa "RspHAL" (NCBI YP_007056096, 1 (SEQ ID NO: 31); Oscillatoria sp. Histidina amoniaco-liasa "Osp HAL" (NCBI YP_07108482,1 (SEQ ID NO: 32); y Gloeocapsa sp. Histidina amoníaco-lyase "GspHAL" (NCBI YP_007127054,1) (SEQ ID NO: 33) tienen más de 70% de homología con AvPAL (SEQ ID NO: 4).
Además, cuando una variante particular PAL (es decir, un polipéptido PAL modificado) se denomina por referencia a la modificación de residuos de aminoácidos particulares en la secuencia de un PAL de tipo silvestre o PAL de referencia se debe entender que las variantes de otro PAL modificadas en la(s) posición(es) equivalente(s) (como se determina a partir de la alineación de secuencias de aminoácidos opcional entre las respectivas secuencias de aminoácidos) se incluyen aquí. En algunas realizaciones, el polipéptido PAL modificado se deriva de uno cualquiera de los polipéptidos enumerados de las cepas bacterianas anteriores (es decir, Nostoc [N. punctiforme], Rhodosporidium [R. toruloides], Streptomyces [S. maritimus o S. verticillatus], Oscillatoria sp., Gloeocapsa sp y Rivularia sp.). En algunas realizaciones adicionales, el polipéptido PAL de la divulgación comprende el sitio activo conservado Ala167-Ser168-Gly169 y comprende al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, a al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% de la identidad de la secuencia con la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados no solo comprenden actividad PAL sino que también son activos en sustratos de tirosina y/o histidina.
En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados se producen mediante el cultivo de un microorganismo que comprende al menos una secuencia de polinucleótido que codifica al menos un polipéptido PAL modificado bajo condiciones que son propicias para producir el polipéptido PAL modificado. En algunas realizaciones, el polipéptido PAL modificado se recupera posteriormente del medio de cultivo y/o células resultantes.
Se describen ejemplos de polipéptidos PAL modificados con actividad PAL. Los ejemplos proporcionan Tablas que muestran información estructural de secuencia que correlaciona características de secuencia de aminoácidos específicas con la actividad funcional de los polipéptidos PAL modificados. Esta información de correlación estructura-función se proporciona en forma de diferencias específicas de residuos de aminoácidos en relación con el polipéptido diseñado por referencia de la SEQ ID NO: 4, así como los datos de actividad asociados determinados experimentalmente para los polipéptidos PAL modificados de forma ejemplar.
En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados de la divulgación tienen actividad PAL comprenden a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia para hacer referencia a la secuencia de SEQ ID NO: 4; b) una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 4 en una o más posiciones de aminoácidos; y c) que exhibe una propiedad mejorada seleccionada de i) actividad catalítica mejorada, ii) sensibilidad proteolítica reducida, iii) tolerancia incrementada al pH ácido, iv) agregación reducida o una combinación de cualquiera de i), ii), iii) o iv) en comparación con la secuencia de referencia.
En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados que exhiben al menos una propiedad mejorada tienen al menos 85%, al menos 88%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 4, y una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 4, en una o más posiciones de aminoácidos (como en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20 o más posiciones de aminoácidos en comparación) según la SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tenga al menos el 85%, al menos el 88%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 4). En algunas realizaciones, la diferencia de residuos en comparación con la SEQ ID NO: 4, en una o más posiciones incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones de aminoácidos conservativas. En algunas realizaciones, el polipéptido PAL manipulado es un polipéptido enumerado en las Tablas proporcionadas en los Ejemplos.
En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados que exhiben al menos una propiedad mejorada tienen al menos 85%, al menos 88%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 4 y una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 4 en una o más posiciones de aminoácidos se seleccionan de X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; X564; o cualquier combinación de los mismos, cuando se alinean de manera óptima con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, la diferencia de aminoácidos es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 o más posiciones de aminoácidos.
En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados que exhiben al menos una propiedad mejorada tienen al menos 85% (por lo menos 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de la secuencia de identidad con la SEQ ID NO: 4 y comprenden una diferencia de residuos de aminoácidos en la posición H307 y, opcionalmente, una diferencia de residuos de aminoácidos en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más posiciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, la diferencia de residuos de aminoácidos en la posición 307 es H307/G/Q/M.
En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados que exhiben al menos una propiedad mejorada tienen al menos 85% (por lo menos 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de la identidad de la secuencia a la SEQ ID NO: 4 y comprende al menos una diferencia de residuo de aminoácido seleccionada de una combinación de uno o más de A39; T54; G59, S73; A91; Y158; S180; K195; A112; R134; Q240; T243; 1245; A256; L257; N270; N290; Y304; R305; H307 ; E308; 1326; L349; D353; L364; A394; S399; N400; P404; L407; F443; N453; Y459; T460; T463; N474; E509; Q521; K522; T524; P528; S546; y/o P564, En algunas realizaciones adicionales, existen diferencias de residuos de aminoácidos en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más posiciones de aminoácidos.
En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados que exhiben una propiedad mejorada tienen al menos 85% (por lo menos 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4 y comprende una diferencia de residuos de aminoácidos seleccionada de una combinación de uno o más de A39V; T54K; G59R; S73K; A112C; R134Q; A91V; Y158H; S180A; K195E; Q240R/W; T243I/L; I245L; A256G; L257W/A; N270K; N290G; Y304H; R305M; H307 G/Q/M; E308Q; I326F; L349M; D353A/N; L364Q; A394V; S399N; N400K; P404A; L407V; F443H; N453G; Y459F; T460G; T463N; N474Q; E509L; Q521K/S; K522Y/F/N; T524S; P528L; S546R; y P564 G/L/M, cuando se alinean de manera óptima con la SEQ ID NO: 4.
En algunas realizaciones, la diferencia residuo de aminoácido se selecciona de una combinación de uno o más de A39V; A91V; A256G; N290G; A394V; S399N; P404A; L407V; K522Y/F/N; y/o T524S, cuando se alinean de manera óptima con la SEQ ID NO: 4.
Se describen fragmentos funcionales de polipéptidos PAL modificados. En algunas realizaciones, los fragmentos funcionales comprenden al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% de la actividad del polipéptido PAL modificado del cual se derivó (es decir, el PAL modificado). En algunas realizaciones, los fragmentos funcionales comprenden al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, a al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% de la secuencia principal de la PAL modificada. En algunas realizaciones, el fragmento funcional se truncará por menos de 5, menos de 10, menos de 15, menos de 10, menos de 25, menos de 30, menos de 35, menos de 40, menos de 45 y menos de 50 aminoácidos.
Se describen fragmentos funcionales de polipéptidos PAL modificados. Los fragmentos funcionales pueden comprender al menos aproximadamente el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de la actividad del polipéptido PAL manipulado a partir del cual se derivó (es decir, el PAL modificado). Los fragmentos funcionales pueden comprender al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la secuencia original de la PAL modificada. En algunas realizaciones, el fragmento funcional se truncará por menos de 5, menos de 10, menos de 15, menos de 10, menos de 25, menos de 30, menos de 35, menos de 40, menos de 45, menos de 50, menos de 55, menos de 60, menos de 65 o menos de 70 aminoácidos.
En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos PAL modificados que exhiben al menos una propiedad mejorada tiene al menos 85%, al menos 88%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o mayor identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 6 y una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ. ID NO: 6, en una o más posiciones de aminoácidos (como en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 o más posiciones de aminoácidos) en comparación a la SEQ ID NO: 6, o una secuencia que tenga al menos el 85%, al menos el 88%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, las PAL modificadas comprenden al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6 y comprenden una diferencia de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 6 de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más posiciones de aminoácidos. En algunos aspectos de la divulgación, el polipéptido PAL modificado consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 6.
En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos PAL modificados que exhiben al menos una propiedad mejorada tienen al menos 85%, al menos 88%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o mayor identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 10, o un fragmento funcional de la misma y una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 10, en una o más posiciones de aminoácidos (como en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 o más posiciones de aminoácidos) en comparación con la SEQ ID NO: 10, o una secuencia que tenga al menos el 85%, al menos el 88%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, a al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de la identidad de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 10, En algunas realizaciones, los PAL modificadas comprenden al menos el 95% de la identidad de la secuencia con la SEQ ID NO: 10, y comprenden una diferencia de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 10, de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más posiciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido PAL modificado consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 10.
En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos PAL modificados que presentan al menos una propiedad mejorada tienen al menos 85%, al menos 88%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o más de aminoácidos de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 12 o un fragmento funcional de la misma y una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 12 en una o más posiciones de aminoácidos (como en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 o más posiciones de aminoácidos) en comparación con la SEQ ID NO: 12, o una secuencia que tenga al menos el 85%, al menos el 88%, al menos el 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de la secuencia de aminoácidos de la identidad con la SEQ. ID NO: 12. En algunas realizaciones, los PAL modificadas comprenden al menos un 95% de secuencia de identidad a la SEQ ID NO: 12, y comprenden una diferencia de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 12, de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más posiciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido PAL modificado consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 12.
En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos PAL modificados que presentan al menos una propiedad mejorada tienen al menos el 85%, al menos 88%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de aminoácidos identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 14 o un fragmento funcional de la misma y una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 14 en una o más posiciones de aminoácidos (como en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 o más posiciones de aminoácidos) en comparación con la SEQ ID NO: 14, o una secuencia que tenga al menos el 85%, al menos el 88%, al menos el 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de la secuencia de aminoácidos de la identidad con la SEQ. ID NO: 14. Los PAL modificados pueden comprender al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 14, y comprenden una diferencia de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 14, de al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más posiciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido PAL modificado consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 14.
En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos PAL modificados que presentan al menos una propiedad mejorada que tienen al menos 85%, al menos 88%, al menos 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de aminoácidos identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 16 o un fragmento funcional de la misma y una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 16 en una o más posiciones de aminoácidos (como en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 o más posiciones de aminoácidos) en comparación con la SEQ ID NO: 16, o una secuencia que tenga al menos el 85%, al menos el 88%, al menos el 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de la secuencia de aminoácidos de la identidad con la SEQ. ID NO: 16. En algunas realizaciones, los PAL modificadas comprenden al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 16, y comprenden una diferencia de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 16, de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más posiciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido PAL modificado consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 16.
En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos PAL modificados que exhiben al menos una propiedad mejorada tienen al menos 85%, al menos 88%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o mayor identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 18 o uno de sus fragmentos funcionales y una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 18 en una o más posiciones de aminoácidos (como en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 o más posiciones de aminoácidos) en comparación con la SEQ iD NO: 18, o una secuencia que tenga al menos el 85%, al menos el 88%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, los PAL modificadas comprenden al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 18, y comprenden una diferencia de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 18, de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más posiciones de aminoácidos. En algunos aspectos de la divulgación, el polipéptido PAL modificado consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 18.
En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos PAL modificados que exhiben al menos una propiedad mejorada tienen al menos 85%, al menos 88%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 20 o un fragmento funcional de la misma y una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 20 en una o más posiciones de aminoácidos (como en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 o más posiciones de aminoácidos) en comparación con la SEQ ID NO: 20, o una secuencia que tenga al menos el 85%, al menos el 88%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, a al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 20. En algunas realizaciones, los PAL modificadas comprenden al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 20, y comprenden una diferencia de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 20, de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más posiciones de aminoácidos. En algunos aspectos de la divulgación, el polipéptido PAL modificado consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 20.
En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos PAL modificados que exhiben al menos una propiedad mejorada tienen al menos 85%, al menos 88%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de la identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 22 o un fragmento funcional de la misma y una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 22 en una o más posiciones de aminoácidos (como en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 o más posiciones de aminoácidos) en comparación con la SEQ ID NO: 22, o una secuencia que tenga al menos el 85%, al menos el 88%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, a al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 22. En algunas realizaciones, los PAL modificadas comprenden al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 22, y comprenden una diferencia de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 22, de al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más posiciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido PAL modificado consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 22.
En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos PAL modificados que exhiben al menos una propiedad mejorada tienen al menos 85%, al menos 88%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o mayor identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 24 o un fragmento funcional de la misma y una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 24 en una o más posiciones de aminoácidos (como en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 o más posiciones de aminoácidos) en comparación con la SEQ iD NO: 24, o una secuencia que tenga al menos el 85%, al menos el 88%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, a al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, los PAL modificadas comprenden al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 24, y comprenden una diferencia de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 24, de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más posiciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido PAL modificado consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 24,
Variantes con sensibilidad reducida a la proteolisis:
En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados de la divulgación tienen actividad PAL, exhiben una sensibilidad reducida a la proteolisis, y comprenden: a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia para hacer referencia a la secuencia de SEQ ID NO: 4; y b) una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 4 en una o más posiciones de aminoácidos.
En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos PAL modificados que muestran una sensibilidad reducida a la proteólisis tienen al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o mayor identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 4 y una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ. ID NO: 4 en una o más posiciones de aminoácidos (como en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20 o más posiciones de aminoácidos en comparación) según la SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tenga al menos el 85%, al menos el 88%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 4).
En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos PAL modificados que presentan una reducción de la sensibilidad a la proteolisis tienen al menos 85%, al menos 88%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o mayor identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 4 y una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ. ID NO: 4, en una o más posiciones de aminoácidos se seleccionan de X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; X564; o cualquier combinación de los mismos, cuando se alinea de manera óptima con la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 4. La diferencia de aminoácidos puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, o 20 o más posiciones de aminoácidos.
En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos PAL modificados que muestran una sensibilidad reducida a la proteólisis tienen al menos 85%, al menos 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4, y comprenden una diferencia de residuo de aminoácido en la posición X307; X326; X460; X307; y/o X528 y opcionalmente una diferencia de residuo de aminoácido en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más posiciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, la diferencia de residuos de aminoácidos se selecciona de Y304H/W; R305L/M; H307 G/M/Q; I326F; Q240W; T460G; P528L; y cualquiera de estas sustituciones en combinación, cuando se alinean con la SEQ ID NO: 4.
En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos PAL modificados que presentan una reducción de la sensibilidad a la proteolisis tienen al menos 85%, al menos 88%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o mayor identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de las SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y/o 24, o un fragmento funcional del mismo y una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y/o 24, en una o más posiciones de aminoácidos (como en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 o más posiciones de aminoácidos) en comparación con las SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y/o 24, o una secuencia que tenga al menos el 85%, al menos el 88%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y/o 24. En algunas realizaciones, PAL modificada comprende al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y/o 24, y comprende una diferencia de aminoácidos en comparación con SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y/o 24, de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más posiciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, pAl comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, y/o 24.
En algunas realizaciones, la sensibilidad proteolítica de los polipéptidos PAL modificados se reducen en al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90% o al menos el 95% de la PAL de tipo silvestre (por ejemplo, AvPAL con la SEQ ID NO: 4) o en comparación con un polipéptido PAL de referencia en esencialmente las mismas condiciones. La actividad proteolítica se puede medir utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluidos, entre otros, los descritos en los Ejemplos.
En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados genéticamente que tienen una sensibilidad reducida a la proteólisis han reducido la sensibilidad a una composición que comprende una o más proteasas, que incluyen, entre otras, pepsina, tripsina, quimotripsina, carboxipeptidasa A y B, peptidasas (por ejemplo, peptidasa amino), dipeptidasa y enteropeptidasa) cuando tanto la PAL de referencia como la PAL modificada que tienen la sensibilidad reducida se comparan y exponen esencialmente a la misma cantidad y tipo de proteasa en las mismas condiciones.
En algunas realizaciones, el polipéptido PAL modificado que ha reducido la sensibilidad a la proteolisis tiene niveles de actividad enzimática que son aproximadamente 1,0 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces o más de la actividad enzimática de la referencia PAL (por ejemplo, AvPAL). En algunas realizaciones, los polipéptidos modificados tienen más actividad enzimática, en comparación con un PAL de referencia, cuando la actividad se mide en un rango de pH de 4,5 a 7,5; cuando la actividad se mide en un rango de pH de 4,5 a 6,5; cuando la actividad se mide en un rango de pH de 5,0 a 7,5; cuando la actividad se mide en un rango de pH de 5,0 a 6,5; cuando la actividad se mide en un rango de pH de 5,5 a 7,5; y/o también cuando la actividad se mide en un rango de pH de 5,5 a 6,5, En algunas otras realizaciones, los polipéptidos PAL modificados tienen valores de Km en el intervalo de 1 pm a 5 mM
Variantes con mayor tolerancia al nH ácido:
En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos PAL modificados de la divulgación tienen actividad PAL, son tolerantes a niveles de pH ácido y comprenden: a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 4, o un fragmento del mismo; y b) una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 4, en una o más posiciones de aminoácidos.
En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos PAL modificados que exhiben una mayor tolerancia al pH ácido en comparación con AvPAL de tipo silvestre y/u otro polipéptido de referencia tienen al menos el 85%, al menos el 88%, al menos el 90%, en al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o mayor identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 4 y una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 4, en una o más posiciones de aminoácidos (como en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20 o más posiciones de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 4, o una secuencia que tenga al menos el 85%, al menos el 88%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos el 99% o mayor identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 4,
En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos PAL modificados que exhiben una mayor tolerancia al pH ácido en comparación con AvPAL de tipo silvestre y/u otro polipéptido de referencia, tienen al menos el 85%, al menos el 88%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o mayor secuencia de aminoácidos identidad con la SEQ ID NO: 4, y una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 4, en una o más posiciones de aminoácidos se seleccionan de X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; X564; o cualquier combinación de los mismos cuando esté alineado de manera óptima con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, la diferencia de aminoácidos es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 o más posiciones de aminoácidos.
En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos PAL modificados que exhiben una mayor tolerancia al pH ácido en comparación con AvPAL de tipo silvestre y/u otro polipéptido de referencia tienen al menos el 85%, al menos el 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4, y comprenden una diferencia de residuos de aminoácidos en la posición X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; X564; o cualquier combinación de los mismos; y opcionalmente una diferencia de residuo de aminoácido en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más posiciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, la diferencia de residuos de aminoácidos es A39; T54; G59, S73; A91; Y158; S180; K195; A112; R134; Q240; T243; 1245; A256; L257; N270; N290; Y304; R305; H307 ; E308; 1326; L349; D353; L364; A394; S399; N400; P404; L407; F443; N453; Y459; T460; T463; N474; E509; Q521; K522; T524; P528; S546; y/o P564, cuando se alinean con la SEQ ID NO: 4. En algunos aspectos de la divulgación, los polipéptidos PAL modificados que exhiben una mayor tolerancia al pH ácido tienen al menos un 85%, al menos un 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4, y comprenden una diferencia de residuos de aminoácidos en una o más posiciones A39V; T54K; G59R; S73K; A112C; R134Q; A91V; Y158H; S180A; K195E; Q240R/W; T243I/L; I245L; A256G; L257W/A; N270K; N290G; Y304H; R305M; H307 G/Q/M; E308Q; I326F; L349M; D353A/N; L364Q; A394V; S399N; N400K; P404A; L407V; F443H; N453G; Y459F; T460G; T463N; N474Q; E509L; Q521K/S; K522Y/F/N; T524S; P528L; S546R; y/o P564 G/L/M; cuando se alinea con la SEQ ID NO: 4.
Cuando todas las demás condiciones de ensayo son esencialmente las mismas, los polipéptidos PAL modificados que tienen una mayor tolerancia al pH ácido, en comparación con un polipéptido PAL de referencia tienen una mayor tolerancia a un intervalo de pH entre 1,5 a 6,5; entre 1,5 y 5,0; entre 2,0 y 5,5; entre 3,0 y 6,8; entre 3,0 y 5,5; entre 4,0 y 6,5; entre 4,0 y 4,5; entre 4,5 y entre 5,0; entre 4,5 y 5,5, entre 4,5 y 6,0; entre 4,5 y 6,5; entre 5,0 y 6,5; entre 5,0 y 6,0; entre 5,0 y 5,5; entre 5,5 y 6,0; entre 6,0 y 6,5; y/o entre 6,5 y 7,0. En algunas realizaciones, la tolerancia incrementada al pH ácido se exhibe a un pH de aproximadamente 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 y/o 6,5.
Los polipéptidos PAL modificados que han incrementado la tolerancia a pH ácido también exhiben mayor actividad PAL en comparación con una PAL de referencia cuando medida mediante un ensayo estándar. Cualquier ensayo adecuado encuentra uso en la divulgación, incluidos, entre otros, los descritos en el presente documento.
[0185] Se contempla además que cualquiera de los polipéptidos modificados por ejemplo (es decir, Variante N° 1 -Variante N° 1010) encuentra uso como la secuencia de aminoácidos de partida para sintetizar otros polipéptidos PAL modificados, por ejemplo por rondas subsiguientes de evolución por añadiendo nuevas combinaciones de diversas diferencias de aminoácidos de otros polipéptidos y otras posiciones de residuos descritas en este documento. En algunas realizaciones, se generan mejoras adicionales al incluir las diferencias de aminoácidos en las posiciones de los residuos que se mantuvieron sin cambios durante las rondas anteriores de evolución. No se pretende que la presente invención se limite a ningún método en particular para producir polipéptidos PAL modificados, ya que cualquier método adecuado encuentra uso, incluidos, entre otros, los métodos descritos en el presente documento.
Polinucleótidos que codifican polipéptidos modificados. Vectores de expresión y células huésped:
Se divulgan polinucleótidos que codifican los polipéptidos PAL modificados descritos en la presente. En algunas realizaciones, los polinucleótidos están unidos operativamente a una o más secuencias reguladoras heterólogas que controlan la expresión génica para crear un polinucleótido recombinante capaz de expresar el polipéptido. En algunas realizaciones, las construcciones de expresión que contienen al menos un polinucleótido heterólogo que codifica el polipéptido PAL modificado se introducen en células huésped apropiadas para expresar el (los) polipéptido(s) PAL correspondiente(s).
Como será evidente para el experto en la técnica, la disponibilidad de una secuencia de proteína y el conocimiento de los codones correspondientes a los diferentes aminoácidos proporciona una descripción de todos los polinucleótidos capaces de codificar los polipéptidos en cuestión. La degeneración del código genético, donde los mismos aminoácidos están codificados por codones alternativos o sinónimo, permite que se produzca una gran cantidad de ácidos nucleicos, todos los cuales codifican un polipéptido PAL modificado. Por lo tanto, se describen métodos y composiciones para la producción de todas y cada una de las posibles variaciones de los polinucleótidos PAL que podrían crearse y codificar los polipéptidos pAl descritos en el presente documento mediante la selección de combinaciones basadas en las posibles opciones de codones, y todas estas variaciones deben considerarse específicamente descritas para cualquier polipéptido descrito en el presente documento, incluidas las secuencias de aminoácidos presentadas en los Ejemplos (por ejemplo, en las distintas Tablas).
En algunas realizaciones, los codones se optimizan preferentemente para la utilización por la célula huésped elegida para la producción de proteínas. Por ejemplo, los codones preferidos usados en bacterias se usan típicamente para la expresión en bacterias. En consecuencia, los polinucleótidos optimizados de codón que codifican los polipéptidos PAL modificados contienen codones preferidos en aproximadamente el 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o más del 90% de las posiciones del codón en la región de codificación de longitud completa.
En algunos aspectos, el polinucleótido PAL codifica un polipéptido modificado que tiene actividad de PAL con las propiedades descritas en este documento, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad con una secuencia de referencia seleccionada de las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y/o 23, o la secuencia de aminoácidos de cualquier variante (por ejemplo, las proporcionadas en los Ejemplos), y una o más diferencias de residuos en comparación con el polinucleótido de referencia de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y/o 23, o la secuencia de aminoácidos de cualquier variante como se describe en los Ejemplos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más posiciones de residuos de aminoácidos). La secuencia de referencia se selecciona de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y/o 23,
En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido PAL codifica un polipéptido modificado que tiene actividad de PAL con las propiedades descritas en este documento, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia a la secuencia de referencia SEQ ID NO: 4 y una o más diferencias de residuos en comparación con la SEQ ID NO: 4 en las posiciones de residuos de X39; x 54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; y/o X564; cuando se alinea de manera óptima con el polipéptido de la SEQ ID NO: 4,
En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica los polipéptidos PAL modificados comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de una secuencia de polinucleótido seleccionada de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y/o 23. En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica un polipéptido PAL modificado tiene al menos el 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de residuos de nucleótidos con la SEQ ID NO: 2. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, y/o 23.
En algunos aspectos de la divulgación, los polinucleótidos son capaces de hibridar en condiciones altamente rigurosas con una secuencia de polinucleótidos de referencia seleccionada de la SEQ ID NO: 2. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, y/o 23, o un complemento de los mismos, o una secuencia de polinucleótidos que codifica cualquiera de los polipéptidos PAL variantes descritos en este documento. En algunas realizaciones, el polinucleótido capaz de hibridar en condiciones altamente rigurosas codifica un polipéptido PAL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una o más diferencias de residuos en comparación con la s Eq ID NO: 4, en las posiciones de residuos seleccionadas de X39; X54; X59; X73; X91; X158; X112, X134, X180; X195; X240; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X304, X305; X307; X308; X326; X349; X353; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X509; X521; X522; X524; X528; X546; y/o X564.
Un polinucleótido aislado que codifica cualquiera de los polipéptidos PAL modificados en el presente documento puede manipularse en una variedad de formas para facilitar la expresión del polipéptido PAL. En algunas realizaciones, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos PAL comprenden vectores de expresión en los que está presente una o más secuencias de control para regular la expresión de los polinucleótidos y/o polipéptidos pAl . La manipulación del polinucleótido aislado antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión utilizado. Las técnicas para modificar polinucleótidos y secuencias de ácido nucleico que utilizan métodos de ADN recombinante son bien conocidas en la técnica. En algunas realizaciones, las secuencias de control incluyen, entre otros, promotores, secuencias líder, secuencias de poliadenilación, secuencias de propéptidos, secuencias de péptidos de señal y terminadores de la transcripción. En algunas realizaciones, los promotores adecuados se seleccionan basándose en la selección de células huesped. Para las células huesped bacterianas, los promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente divulgación incluyen, entre otros, promotores obtenidos del operón lac de E. coli, gen de la agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA), Bacillus subtilis levansucrase gen (sacB), Bacillus licheniformis gen de alfa-amilasa (amyL), Bacillus stearothermophilus gen de amilasa maltogénica (amyM), Bacillus Amyloliquefaciens gen de alfaamilasa (amyQ), Bacillus licheniformis gen de penicilinasa (penP), Bacillus subtilis xylA y xylB de genes y el gen de la betalactamasa procariótica (véase, por ejemplo, Villa-Kamaroff y otros, Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU., 75: 3727­ 3731 [1978]), así como el promotor tac (véase, por ejemplo, DeBoer y otros., Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU. 80: 21-25 [1983]). Promotores ejemplares para células huésped fúngicas filamentosas, incluyen, pero no se limitan a promotores obtenidos de los genes para la amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, Rhizomucor miehei proteinasa aspártica, Aspergillus niger alfa-amilasa neutral, Aspergillus niger ácido alfa-amylasa, ácido Aspergillus niger o Aspergillus awamori glucoamilasa (glaA), Rhizomucor miehei lipasa, Aspergillus oryzae proteasa alcalina, Aspergillus oryzae triosa fosfato isomerasa, Aspergillus nidulans acetamidasa, y Fusarium oxysporum proteasa similar a la tripsina (véase, por ejemplo, WO 96/00787), así como el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae), y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos. Promotores de células de levadura ejemplares pueden ser de los genes para Saccharomyces cerevisiae enolasa (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae galactoquinasa (GAL1), Saccharomyces cerevisiae deshidrogenasa alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato (ADH2/GAP), y Saccharomyces cerevisiae 3-fosfoglicerato cinasa. Otros promotores útiles para células huésped de levadura son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Romanos et al., Yeast 8: 423-488 [1992]).
En algunas realizaciones, la secuencia de control también es una secuencia de terminación de la transcripción adecuada (es decir, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción). En algunas realizaciones, la secuencia de terminación está unida operativamente al extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido PAL. Cualquier terminador adecuado que sea funcional en la célula huésped elegida encuentra uso en la divulgación. Ejemplos de terminadores de la transcripción para células huésped fúngicas filamentosas pueden obtenerse a partir de los genes para Aspergillus oryzae TAKA amilasa, Aspergillus niger glucoamilasa, Aspergillus nygiduss anthranilate sintasa, Aspergillus niger alfa-glucosidasa, y Fusarium antitilatosasasas de este producto. Se pueden obtener terminadores ejemplares de células huésped de levadura a partir de los genes para Saccharomyces cerevisiae enolasa, Saccharomyces cerevisiae citocromo C (CYC1) y Saccharomyces cerevisiae gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. Otros terminadores útiles para células huésped de levadura son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Romanos et al., Supra).
En algunas realizaciones, la secuencia de control también es una secuencia líder adecuada (es decir, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped). en algunas realizaciones, la secuencia líder está unida operativamente al extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido PAL. Cualquier secuencia líder adecuada que sea funcional en la célula huésped elegida puede usarse en la divulgación. Los líderes ejemplares para células huésped fúngicas filamentosas se obtienen a partir de los genes para la amilasa TAKA de Aspergillus oryzae y la isomerasa de fosfato de Aspergillus nidulans nidulans. Los líderes adecuados para las células huésped de levadura se obtienen de los genes para Saccharomyces cerevisiae enolasa (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae 3-fosfoglicerato cinasa, Saccharomyces cerevisiae alfa-factor, y Saccharomyces cerevisiae alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa (ADH2/GAP).
En algunas realizaciones, la secuencia de control es también una secuencia de poliadenilación (es decir, una secuencia unida operativamente al extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico y que, cuando se transcribe, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina a ARNm transcrito). Cualquier secuencia de poliadenilación adecuada que sea funcional en la célula huésped elegida encuentra uso en la divulgación. Las secuencias de poliadenilación ejemplares para células huésped fúngicas filamentosas incluyen, pero no se limitan a los genes para la amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, Aspergillus niger glucoamilasa, Aspergillus nidulans antranilato sintasa, Fusarium oxysporum tripsina de tipo proteasa, y Aspergillus niger alfaglucosidasa. Se conocen secuencias de poliadenilación útiles para células huésped de levadura (véase, por ejemplo, Guo y Sherman, Mol. Cell. Bio., 15: 5983-5990 [1995]).
En algunas realizaciones, la secuencia de control es también un péptido señal (es decir, una región de codificación que codifica para una secuencia de aminoácidos enlazada al término amino de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado en la vía secretora de la célula). En algunas realizaciones, el extremo 5' de la secuencia de codificación de la secuencia de ácido nucleico contiene inherentemente una región de codificación del péptido señal enlazada naturalmente en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región de codificación que codifica el polipéptido secretado. Alternativamente. En algunas realizaciones, el extremo 5' de la secuencia de codificación contiene una región de codificación del péptido señal que es ajena a la secuencia de codificación. Cualquier región codificante de péptido señal adecuada que dirige el polipéptido expresado a la ruta secretora de una célula huésped elegida encuentra uso para la expresión del polipéptido(s) modificado. Las regiones codificantes del péptido señal eficaz para las células huesped bacterianas son las regiones codificantes del péptido señal incluidas, pero no se limitan a las obtenidas a partir de los genes para la amilasa maltogénica Bacillus NClB 11837, Bacillus stearothermophilus alfa-amilasa, Bacillus licheniformis subtilisin, Bacillus licheniformis beta Proteasas neutrales de Bcillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), y Bacillus subtilis prsA. Otros péptidos señal son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Simonen y Palva, Microbiol. Rev., 57: 109-137 [1993]). En algunas realizaciones, regiones que codifican los péptidos señal efectivos para células huésped filamentosas incluyen, pero no se limitan a las regiones de péptido señal obtenidas de los genes para la codificación de Aspergillus oryzae TAKA amilasa, Aspergillus niger amilasa neutral, Aspergillus niger glucoamilasa, Rhizomucor miehei proteinasa aspártica, Humicola insolens celulasa y humicola lanuginosa lipasa. Péptidos señal útiles para células huéspedes de levadura incluyen, pero no se limitan a los de los genes para Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de y Saccharomyces cerevisiae invertasa.
En algunas realizaciones, la secuencia de control es también una región codificante de propéptido que codifica una secuencia de aminoácidos posicionada en el extremo amino de un polipéptido. El polipéptido resultante se denomina "proenzima", "propolipéptido" o "zimógeno". Un propolipéptido puede convertirse en un polipéptido activo maduro por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La región de codificación de propéptido puede obtenerse de cualquier fuente adecuada, incluyendo, pero no limitado a los genes de Bacillus subtilis de la proteasa alcalina (aprE), Bacillus subtilis proteasa neutra (nprT), Saccharomyces cerevisiae factor alfa, Rhizomucor miehei proteinasa aspártica, y Myceliophthora thermophila lactasa (véase, por ejemplo, el documento WO 95/33836). Cuando tanto el péptido de señal como las regiones de propéptido están presentes en el extremo amino de un polipéptido, la región de propéptido se coloca al lado del extremo amino de un polipéptido y la región de péptido de señal se coloca al lado del extremo amino de la región de propéptido.
En algunas realizaciones, también se utilizan secuencias reguladoras. Estas secuencias facilitan la regulación de la expresión del polipéptido con respecto al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que causan que la expresión del gen se active o desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluida la presencia de un compuesto regulador. En las células huesped procarióticas, las secuencias reguladoras adecuadas incluyen, pero no se limitan a, los sistemas operadores lac, tac y trp. En las células huésped de levadura, los sistemas reguladores adecuados incluyen, entre otros, el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, las secuencias reguladoras adecuadas incluyen, pero no se limitan al promotor de alfa-amilasa TAKA, el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae.
Un vector de expresión recombinante puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido de PAL modificada, y expresión de una o más regiones reguladoras tales como un promotor y un terminador, un origen de replicación, etc., dependiendo del tipo de huéspedes en que se van a introducir. En algunas realizaciones, las diversas secuencias de control y ácido nucleico descritas en el presente documento se unen para producir vectores de expresión recombinantes que incluyen uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido PAL en dichos sitios. Alternativamente. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de la divulgación se expresa insertando la secuencia de ácido nucleico o una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia en un vector apropiado para la expresión. En algunas realizaciones que implican la creación del vector de expresión, la secuencia de codificación se localiza en el vector de modo que la secuencia de codificación está unida operativamente con las secuencias de control apropiadas para la expresión.
El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector adecuado (por ejemplo, un plásmido o virus), que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinantes y provocar la expresión de la secuencia de polinucleótido PAL. La elección del vector generalmente depende de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que se va a introducir el vector. Los vectores pueden ser plásmidos circulares lineales o cerrados.
En algunas realizaciones, el vector de expresión es un vector de replicación autónoma (es decir, un vector que existe como una entidad extra-cromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, tal como un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial). El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. En algunas realizaciones alternativas, el vector es uno en el que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el (los) cromosoma(s) en el que se ha integrado. Además. En algunas realizaciones, un solo vector o plásmido, o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total para ser introducido en el genoma de la célula huésped, y/o se utiliza un transposón.
En algunas realizaciones, el vector de expresión contiene uno o más marcadores seleccionables, que permiten la selección de células transformadas. Un "marcador seleccionable" es un gen, cuyo producto proporciona biocida o resistencia viral, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares. Los ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos incluyen, pero no se limitan a, los genes dal de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis, o marcadores, que confieren resistencia a los antibióticos, como la resistencia a ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Los marcadores adecuados para células huésped de levadura incluyen, pero no se limitan a, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URa 3. Los marcadores seleccionables para uso en células huésped fúngicas filamentosas incluyen, pero no se limitan a, amdS (acetamidasa; por ejemplo, de A. nidulans o A. orzyae), argB (ornitina carbamoiltransferasas), bar (fosfinotricina acetiltransferasa) por ejemplo, de S. hygroscopicus), hph (hromromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilasa; p. ej., de A. nidulans o A. orzyae), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato) sintasa), así como sus equivalentes. En otro aspecto, se describe una célula huésped que comprende al menos un polinucleótido que codifica al menos un polipéptido PAL modificado de la divulgación, estando el polinucleótido o los polinucleótidos unidos operativamente a una o más secuencias de control para la expresión de la enzima(s) PAL modificada(s) en la célula huésped. Las células huesped adecuadas para usar en la expresión de los polipéptidos codificados por los vectores de expresión de la divulgación son bien conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas, tales como células de E. coli, Vibrio fluvialis, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris (N° de Acceso ATCC201178)); células de insecto tales como células Drosophila S2 y Spodoptera SFg; células animales tales como CHO, COS, BHK, 293 y células de melanoma de Bowes; y células vegetales. Células huésped ejemplares también incluyen diversas cepas Escherichia coli (por ejemplo, W3l10 (AfhuA) y BL21).
Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para producir los polipéptidos PAL modificados, en los que los métodos comprenden cultivar una célula huésped capaz de expresar un polinucleótido que codifica el polipéptido PAL modificado en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además los pasos de aislamiento y/o purificación de los polipéptidos PAL, como se describe en el presente documento.
Medios de cultivo apropiado y condiciones de crecimiento para las células huéspedes son bien conocidos en la técnica. Se contempla que cualquier método adecuado para introducir polinucleótidos para la expresión de los polipéptidos PAL en células encontrará uso en la presente invención. Las técnicas adecuadas incluyen, entre otras, electroporación, bombardeo de partículas biolísticas, transfección mediada por liposomas, transfección con cloruro de calcio y fusión de protoplastos.
Los polipéptidos PAL modificados con las propiedades descritas en el presente documento pueden obtenerse sometiendo el polinucleótido que codifica el polipéptido PAL natural o modificado a cualquier mutagénesis adecuada y/o métodos de evolución dirigida conocidos en la técnica, y/o como se describe en el presente documento. Una técnica de evolución dirigida ejemplar es la mutagénesis y/o la combinación de ADN (ver, por ejemplo, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91: 10747-10751 [1994]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767 y la Patente de Estados Unidos 6.537.746). Otros procedimientos de evolución dirigida que se pueden usar incluyen, entre otros, el proceso de extensión escalonada (StEP), la recombinación in vitro (véase, por ejemplo, Zhao et al., Nat. Biotechnol., 16: 258-261 [1998]), PCR mutagénica (Ver, por ejemplo, Caldwell y otros, PCR Methods Appl., 3: S136-S140 [1994]), y mutagénesis en casete (Ver, por ejemplo, Black y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 3525-3529 [1996]).
Los métodos de mutagénesis y evolución dirigida pueden aplicarse fácilmente a polinucleótidos que codifican PAL para generar bibliotecas de variantes que pueden expresarse, y analizarse. Cualquier mutagénesis adecuada y los métodos de evolución dirigida encuentran uso en la divulgación y son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos 5,605,793, 5,830,721, 6,132,970, 6,420,175, 6,277,638, 6,365,408, 6,602,986, 7,288,375, 6,287,861, 6,297,053, 6,576,467, 6,444,468, 5,811238, 6,117,679, 6,165,793, 6,180,406, 6,291,242, 6,995,017, 6,395,547, 6,506,602, 6,519,065, 6,506,603, 6,413,774, 6,573,098, 6,323,030, 6,344,356, 6,372,497, 7,868,138, 5,834,252, 5,928,905, 6,489,146, 6,096,548, 6,387,702, 6,391,552, 6,358,742, 6,482,647, 6,335,160, 6,653,072, 6,355,484, 6,03,344, 6,319,713, 6,613,514, 6,455,253, 6,579,678, 6,586,182, 6,406,855, 6,946,296, 7,534,564, 7,776,598, 5,837,458, 6,391,640, 6,309,883, 7,105,297, 7,795,030, 6,326,204, 6,251,674, 6,716,631, 6,528,311, 6,287,862, 6,335,198, 6,352,859, 6,379,964, 7,148,054, 7,629,170, 7,620,500, 6,365,377, 6,358,740, 6,406,910, 6,413,745, 6,436,675, 6,961,664, 7,430,477, 7,873,499, 7,702,464, 7,783,428, 7,747,391, 7,747,393, 7,751,986, 6,376,246, 6,426,224, 6,423,542, 6,479,652, 6,319,714, 6,521,453, 6,368,861, 7,421,347, 7,058,515, 7,024,312, 7,620,502, 7,853,410, 7,957,912, 7,904,249 y todos los equivalentes no estadounidenses; Ling et al., Anal. Biochem, 254 (2): 157-78 [1997]; Dale et al., Meth. Mol. Biol., 57: 369-74 [1996]; Smith, Ann. Rev. Genet., 19: 423-462 [1985]; Botstein et al., Science, 229: 1193-1201 [1985]; Carter, Biochem. J., 237: 1-7 [1986]; Kramer et al., Cell, 38: 879-887 [1984]; Wells et al., Gene, 34: 315-323 [1985]; Minshull y otros, Curr. Op. Chem. Biol., 3: 284-290 [1999]; Christians et al., Nat. Biotechnol., 17: 259-264 [1999]; Crameri et al., Nature, 391: 288-291 [1998]; Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 15: 436-438 [1997]; Zhang et al., Proc. Nat. Acad Sci. EE.UU., 94: 4504-4509 [1997]; Crameri y otros, Nat. Biotechnol., 14: 315-319 [1996]; Stemmer, Nature, 370: 389-391 [1994]; Madre, Proc. Nat. Acad Sci. EE.UU., 91: 10747-10751 [1994]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767; WO 2009/152336, y la patente de EE.UU. N° 6,537,746).
En algunas realizaciones, los clones de enzima obtenidos después del tratamiento de mutagénesis se criban sometiendo las preparaciones enzimáticas a una temperatura definida (u otras condiciones de ensayo) y midiendo la cantidad de actividad enzimática restante después de los tratamientos de calor u otras condiciones de ensayo adecuadas. Los clones que contienen un polinucleótido que codifica un polipéptido PAL se aíslan luego del gen, se secuencian para identificar los cambios en la secuencia de nucleótidos (si hay alguno) y se usan para expresar la enzima en una célula huésped. La medición de la actividad enzimática de las bibliotecas de expresión se puede realizar utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica (por ejemplo, técnicas de bioquímica estándar, como el análisis por HPLC).
Para polipéptidos modificados de secuencia conocida, los polinucleótidos que codifican la enzima pueden prepararse mediante métodos estándar en fase sólida, de acuerdo con métodos sintéticos conocidos. En algunas realizaciones, los fragmentos de hasta aproximadamente 100 bases pueden sintetizarse individualmente, luego unirse (por ejemplo, mediante métodos de litigación enzimáticos o químicos, o métodos mediados por polimerasa) para formar cualquier secuencia continua deseada. Por ejemplo, los polinucleótidos y oligonucleótidos descritos en el presente documento pueden prepararse mediante síntesis química utilizando el método clásico de fosforamidita (véase, por ejemplo, Beaucage y otros, Tet. Lett., 22: 1859-69 [1981]; y Matthes y otros, EMBO J., 3: 801-05 [1984]), ya que normalmente se practica en métodos sintéticos automatizados. De acuerdo con el método de la fosforamidita, los oligonucleótidos se sintetizan (por ejemplo, en un sintetizador automático de ADN, se purifican, se recocen, se ligan y se clonan en vectores apropiados).
Un método para preparar el polipéptido PAL modificado puede comprender: (a) sintetizar un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la secuencia de aminoácidos de cualquier variante como se describe en el presente documento, y) expresando el polipéptido PAL codificado por el polinucleótido. La secuencia de aminoácidos codificada por el polinucleótido puede tener opcionalmente una o varias (por ejemplo, hasta 3, 4, 5 o hasta 10) deleciones, inserciones y/o sustituciones de residuos de aminoácidos. Lla secuencia de aminoácidos tiene opcionalmente 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1­ 10, 1- 15, 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45, o 1-50 deleciones de residuos de aminoácidos, inserciones y/o sustituciones. La secuencia de aminoácidos tiene opcionalmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 30, 35, 40, 45 o 50 deleciones, inserciones y/o sustituciones de residuos de aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos tiene opcionalmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 eliminaciones, inserciones y/o sustituciones de residuos de aminoácidos. En algunas realizaciones, las sustituciones son sustituciones conservativas o no conservativas.
El polipéptido PAL modificado expresado se puede evaluar por cualquier propiedad mejorada deseada o combinación de propiedades (por ejemplo, actividad, selectividad, estabilidad, tolerancia al ácido, la sensibilidad de la proteasa, etc.) utilizando cualquier ensayo adecuado conocido en la técnica, incluyendo pero no limitado a los ensayos y condiciones aquí descritas.
En algunas realizaciones, cualquiera de los polipéptidos PAL manipulados expresados en una célula huésped se recuperan de las células y/o el medio de cultivo utilizando una o más de las técnicas bien conocidas para la purificación de proteínas, que incluyen, entre otras, el tratamiento de lisozima, sonicación, filtración, salado, ultra centrifugación y cromatografía.
Las técnicas cromatográficas para el aislamiento de los polipéptidos PAL incluyen, entre otras, cromatografía de fase inversa, cromatografía líquida de alto rendimiento, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de exclusión por tamaño, electroforesis en gel y cromatografía de afinidad. Las condiciones para purificar una enzima particular dependen, en parte, de factores tales como la carga neta, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad, el peso molecular, la forma molecular, etc., y serán evidentes para los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, se pueden usar técnicas de afinidad para aislar las enzimas pAl mejoradas. Para la purificación por cromatografía de afinidad, cualquier anticuerpo que se una específicamente a un polipéptido pAl de interés puede ser útil. Para la producción de anticuerpos, se inmunizan diversos animales hospedadores, incluidos, entre otros, conejos, ratones, ratas, etc., mediante inyección con un polipéptido PAL, o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el polipéptido o fragmento PAL se une a un vehículo adecuado, tal como BSA, por medio de un grupo funcional de cadena lateral o enlazadores unidos a un grupo funcional de cadena lateral.
En algunas realizaciones, el polipéptido PAL modificado se produce en una célula huésped mediante un método que comprende cultivar una célula huésped (por ejemplo, una cepa E. coli) que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido PAL modificada como se describe en el presente documento en condiciones que conducen a la producción del polipéptido PAL modificado y la recuperación del polipéptido PAL modificado de las células y/o el medio de cultivo. En algunas realizaciones, la célula huésped produce más de un polipéptido PAL modificado.
En algunas realizaciones, se describe un método de producción de un polipéptido de PAL modificada que comprende cultivar una célula bacteriana recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido PAL modificado que tiene al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a las secuencias de referencia SEQ ID NO: 4, y una o más diferencias de residuos de aminoácidos en comparación con SEQ ID NO: 4 seleccionada de X39; X91; X158; X180; X195; X243; X245; X256; X257; X270; X290; X307; X308; X326; X349; X364; X394; X399; X400; X404; X407; X443; X453; X459; X460; X463; X474; X522; X524; y X528, o combinaciones de los mismos, cuando se alinean de manera óptima con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 en condiciones de cultivo adecuadas para permitir la producción del polipéptido PAL modificado y, opcionalmente, recuperar el polipéptido PAL modificado del cultivo y/o células bacterianas cultivadas. En algunas realizaciones, la célula huésped produce más de un polipéptido PAL modificado.
En algunas realizaciones, una vez que los polipéptidos PAL modificados se recuperan de las células huésped recombinantes y/o medio de cultivo, que se purifican adicionalmente mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. En algunas realizaciones adicionales, los polipéptidos TAL purificados se combinan con otros ingredientes y compuestos para proporcionar composiciones y formulaciones que comprenden el polipéptido PAL modificado según sea apropiado para diferentes aplicaciones y usos (por ejemplo, composiciones farmacéuticas).
Composiciones:
Los polipéptidos PAL modificados son adecuados para su uso en numerosas composiciones. Estas composiciones encuentran uso en muchos campos, incluidos, entre otros, productos farmacéuticos, suplementos dietéticos/nutricionales, alimentos, piensos y producción química fina. Por ejemplo. En algunas realizaciones, se describen alimentos y/o piensos que comprenden al menos una variante PAL modificada y/o al menos una secuencia de polinucleótidos que codifica al menos una variante PAL. En algunas realizaciones, se describen bebidas que comprenden al menos una variante PAL modificada.
En algunas realizaciones, la variante PAL modificada en alimentos, piensos y/o suplementos nutricionales/dietéticos está glucosilada. Además, las variantes PAL modificadas se utilizan en cualquier matriz de suministro de enzimas comestibles adecuadas. En algunas realizaciones, las variantes de PAL modificadas están presentes en una matriz de suministro de enzimas comestibles diseñadas para una rápida dispersión de la variante de PAL dentro del tracto digestivo de un animal tras la ingestión de la variante.
Los polipéptidos PAL modificados pueden ser adecuados para uso en la producción de productos químicos finos y otros compuestos de importancia industrial (véanse, por ejemplo, las solicitudes de patente de EE.UU. Nos 2013/0340119, 2013/0005012 y 2005/0260724 y WO 2012/122333).
Composiciones farmacéuticas y otras
Los polipéptidos PAL modificados pueden ser adecuados para su uso en composiciones farmacéuticas y de otro tipo, tales como suplementos dietéticos/nutricionales.
Dependiendo del modo de administración, estas composiciones que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un PAL diseñado según la descripción están en forma de un sólido, semisólido o líquido. En algunas realizaciones, las composiciones incluyen otros componentes farmacéuticamente aceptables tales como diluyentes, tampones, excipientes, sales, emulsionantes, conservantes, estabilizantes, rellenos y otros ingredientes. Los detalles sobre las técnicas para la formulación y administración son bien conocidos en la técnica y se describen en la literatura.
En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL manipulados se formulan para su uso en composiciones farmacéuticas orales. Cualquier formato adecuado para su uso en la entrega de polipéptidos PAL modificados se encuentra en la divulgación, incluyendo, entre otros, píldoras, comprimidos, tabletas de gel, cápsulas, pastillas, grageas, polvos, geles blandos, geles sol, geles, emulsiones, implantes, parches, sprays, ungüentos, linimentos, cremas, pastas, jaleas, pinturas, aerosoles, chicles, demulcentes, barras, suspensiones (incluidas, entre otras, suspensiones a base de aceite, emulsiones de aceite en agua, etc.), lodos, jarabes, formulaciones de liberación controlada, supositorios, etc. En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados se proporcionan en un formato adecuado para inyección (es decir, en una formulación inyectable). En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados se proporcionan en matrices biocompatibles tales como geles sol, incluyendo geles sol a base de sílice (por ejemplo, oxisilano). En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados se encapsulan. En algunas realizaciones alternativas, los polipéptidos PAL modificados se encapsulan en nanoestructuras (por ejemplo, nanotubos, nanotúbulos, nanocápsulas o microcápsulas, microesferas, liposomas, etc.). De hecho, no se pretende que la divulgación se limite a ninguna formulación de entrega en particular y/o medios de entrega. Se pretende que los polipéptidos PAL modificados se administren por cualquier medio adecuado conocido en la técnica, incluidos, entre otros, parenteral, oral, tópico, transdérmico, intranasal, intraocular, intratecal, a través de implantes, etc.
En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados se modifican químicamente por glicosilación, pegilación (es decir, se modifican con polietilenglicol [PEG] o PEG activado, etc.) u otros compuestos (véase, por ejemplo, Ikeda, Amino Acids 29: 283- 287 [2005]; Patentes de EE.UU. Nos 7,531,341, 7,534,595, 7,560,263 y 7,533,653; Publicación de Patente de EE.UU. Nos 2013/0039898, 2012/0177722, etc.). De hecho, no se pretende que la divulgación se limite a ningún método o mecanismo de entrega en particular.
En algunas realizaciones adicionales, los polipéptidos PAL modificados están dentro de formulaciones que comprenden cristales de enzima de matriz estabilizada. En algunas realizaciones, la formulación comprende una enzima PAL modificada cristalina reticulada y un polímero con un resto reactivo que se adhiere a los cristales de enzima. Los polipéptidos PAL modificados pueden estar en polímeros.
En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden los polipéptidos PAL modificados genética de la descripción incluyen uno o más compuestos portadores más comúnmente usados, incluyendo, pero no limitado a, azúcares (por ejemplo, lactosa, sacarosa, manitol y/o sorbitol), almidones (por ejemplo, maíz, trigo, arroz, papa u otra planta (almidón), celulosa (por ejemplo, metil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, carboximetilcelulosa de sodio), gomas (por ejemplo, árabe, tragacanto, guar, etc.) y/o proteínas (por ejemplo, gelatina, colágeno, etc.). Los componentes adicionales en las formulaciones orales pueden incluir agentes colorantes y/o edulcorantes (por ejemplo, glucosa, sacarosa y manitol) y agentes lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio), así como recubrimientos entéricos (por ejemplo, polímeros de metacrilato, ftalato de hidroxilpropilmetilcelulosa) y/o cualquier otro recubrimiento entérico adecuado conocido en la técnica). En algunas realizaciones, se incluyen agentes disgregantes o solubilizantes (por ejemplo, polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico o sales de los mismos, tales como alginato de sodio). En algunas realizaciones, el polipéptido PAL modificado se combina con varios componentes adicionales, que incluyen, entre otros, conservantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, agentes humectantes, alcoholes, ácidos grasos y/o emulsionantes, particularmente en formulaciones líquidas.
En algunas realizaciones, el polipéptido PAL modificado se puede combinar con varios componentes adicionales, que incluyen, entre otros, conservantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, agentes humectantes, alcoholes, ácidos grasos y/o emulsionantes, particularmente en formulaciones líquidas. En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados se administran a sujetos en combinación con otros compuestos utilizados en el tratamiento de la PKU, incluidos, entre otros, tetrahidrobiopterina KUVAN® (BioMarin Pharmaceutical, Inc., Novato, CA), antiácidos (por ejemplo, omeprazol, esomeprazol y otros prazoles), así como cualquier otro compuesto adecuado.
En algunas realizaciones, se describen los polipéptidos PAL modificados para uso en la disminución de la concentración de fenilalanina en fluidos como la sangre, el líquido cefalorraquídeo, etc. La dosis del polipéptido(s) PAL administrado(s) a un animal depende sobre la condición o enfermedad, la condición general del animal y otros factores conocidos por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, las composiciones están destinadas a la administración única o múltiple a un animal. En algunas realizaciones, se contempla que la concentración de polipéptido(s) PAL manipulado(s) en la(s) composición(es) administrada(s) a un animal (por ejemplo, un ser humano con PKU) es suficiente para tratar, mejorar y/o prevenir la enfermedad (por ejemplo, PKU y/o afecciones relacionadas con PKU, enfermedades y/o síntomas). En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados se administran en combinación con otras composiciones farmacéuticas y/o dietéticas.
Composiciones industriales
Se contempla que los polipéptidos PAL modificados de la divulgación encontrarán uso en las composiciones industriales. En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados están formulados para su uso en las industrias de alimentos y/o piensos. En algunas realizaciones, los polipéptidos PAL modificados se formulan en productos granulados o granulados que se mezclan con componentes de alimentación animal tales como enzimas adicionales (por ejemplo, celulasas, lacasas y amilasas). En algunas realizaciones alternativas, los polipéptidos PAL modificados se usan en composiciones líquidas de alimento para animales (por ejemplo, suspensiones acuosas o basadas en aceite). Por lo tanto. En algunas realizaciones, las variantes de PAL de la divulgación son suficientemente tolerantes y termoestables para soportar el tratamiento utilizado para producir piensos y otros alimentos/alimentos procesados.
Las variantes de PAL modificadas de la divulgación también encuentran uso en la producción de fenilalanina y/o derivados de fenilalanina.
Los anteriores y otros aspectos de la invención se pueden entender mejor en relación con los siguientes ejemplos no limitativos. Los ejemplos se proporcionan solo con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.
EXPERIMENTAL
Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos y los resultados obtenidos, se proporcionan solamente con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitativos de la divulgación.
En la divulgación experimental siguiente, se aplican las siguientes abreviaturas: ppm (partes por millón); M (molar); mM (milimolar), uM y jM (micromolar); nM (nanomolar); mol (moles); gm y g (gramo); mg (miligramos); ug y |jg (microgramos); L y 1 (litro); ml y ml (mililitro); cm (centímetros); mm (milímetros); um y jm (micrómetros); seg. (segundos); minuto(s) (minuto(s)); h(s) y hr(s) (hora(s)); U (unidades); MW (peso molecular); rpm (rotaciones por minuto); psi y psi (libras por pulgada cuadrada);°C (grados centígrados); TA y ta (temperatura ambiente); CDS (secuencia codificante); ADN (ácido desoxirribonucleico); ARN (ácido ribonucleico); E. coli W3110 (cepa de E. coli de laboratorio comúnmente utilizada, disponible en el Centro de Inventario de Genética de Coli [CGSC], New Haven, CT); HTP (alto rendimiento); HPLC (cromatografía líquida de alta presión); CFSE (éster succinimidílico de carboxifluoresceína); IPTG (isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido); PES (polietersulfona); PHE y phe (fenilalanina); BSA (albúmina de suero bovino); PBMc (células mononucleares de sangre periférica); PKU (fenilcetonuria); MHC (complejo de histocompatibilidad mayor); HLA (antígeno leucocitario humano); HLA-DR (un receptor de superficie celular MHC Clase II codificado por el complejo HLA en el cromosoma # 6); FIOPC (mejoras de doblez sobre control positivo); LB (caldo Luria); Athens Research (Athens Research Technology, Athens, GA); ProSpec (ProSpec Tany Technogene, East Brunswick, NJ); Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); Ram Scientific (Ram Scientific, Inc., Yonkers, NY); Pall Corp. (Pall, Corp., Pt. Washington, NY); Millipore (Millipore, Corp., Billerica MA); Difco (Laboratorios Difco, BD Diagnostic Systems, Detroit, MI); Dispositivos moleculares (Dispositivos moleculares, LLC, Sunnyvale, CA); Kuhner (Adolf Kuhner, AG, Basilea, Suiza); Laboratorios de isótopos de Cambridge (Cambridge Isotope Laboratories, Inc., Tewksbury, MA); Applied Biosystems (Applied Biosystems, parte de Life Technologies, Corp., Grand Island, NY), Agilent (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA); Thermo Scientific (parte de Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA); Corning (Corning, Inc., Palo Alto, CA); Constant Systems (Constant Systems Ltd., Daventry, Reino Unido); Megazyme (Megazyme International, Wicklow, Irlanda); Enzo (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY); GE Healthcare (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ); Harlan (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN);A-B Sciex (AB Sciex, Framingham, MA); y Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
Las siguientes secuencias de polinucleótidos y polipéptidos encuentran uso en la divulgación. En algunos casos (como se muestra a continuación), la secuencia polinucleotídica es seguida por el polipéptido codificado.
Secuencia polinucleotídica del vector de expresión pET16b-AvPAL (SEQ ID NO: 1):
T CTC AT GTTT G AC AGCTT AT C AT CG AT A AGCTTT AATGCGGT AGTTT AT CAC AGTT A AATT
GCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCA
CCGTC ACCCT GGAT GCT GTAGGCATAGGCTT GGTT ATGCCGGT ACT GCCGGGCCTCTT GC
GGGATATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGC
CCC AAGGGGTTAT GCT AGTT ATT GCTCAGCGGT GGCAGCAGCC AACT CAGCTT CCTTTCG
GGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTTAATGCAGACACGGCAGAATGTCCTGAACGGCCTGA
ACAATAACACCACCGGCTGCAATATCTGCACTAATACGTGCAATATGTTCATCCAGACCC
TGTTCATTATCATTCCAAATATACGGACGATCTGAGGTCGGTTTCTGACCAACAACATGA
CG AACT GCGCT AT AC AGACGTTCGGTT GCCGGT GAC AGAC AGGC ACGT GC AT CAT A ATO
ACCGGTTTTTTTGTAGGTACGCAGATCAACTGCCTGAACACCAAACATCAGGGCAATGGC
AAC AT AATT CT GAA AAAT ATC AAC GCT ACG ACGTGCC AGGGTT GCGCTGGT AT AACCCT G
GCT GTT AAT ATT CTGGTT AA ACT GTT CGGC AT GGGTCGG AAAACG ATCT GC AAT ACT ATT
ACCATAAAAGGTCAGCAGCGGCAT AATGCT ATT ACCGCAAATCTGCAGACCTTTCAGAC
CCAT ATT AACTTT ACGTT CACGATT ACCC AGC AGACT CGGAGGCAGACC ATT GCT AA ATT
CCGGTGATGCCAGCAGTGCAATCTGAACATCCAGATGTTTTGCCAGCAGACCGATATAAT
AGCGCAGATGATCCATACCCATACCAACATACTGACCCAGAAAATTACCACCATGATAG
CTTGCCTGATTATCAACATCAATCAGCGGGTTATCGGTAACGCTGTTAATCTCAATTTCG
ATTTGTTT GGC AATCT GGCT AAT ACC ATCAACAATCGGACCCAG AT ACTGCGGCAGAC AA
CGCAGGCTATAACGATCCTGGATCAGTTCATGATCACGATAATCATGTTTACCATCCAGT
TCATCACGAACCAGCTGGCTATTGGCCAGCAGGCTAATCATCTGATCTGCTGCCCACAGC
T GACCCGG AT GCGGTTTGCTGTT ATGGATA AACGGAT GA AAGCTCT GATTTGTACCATTC AGTGCCT GAATATCC A G I GCATGAACACCCATT GCAATT GCGGTCAGAATCTGGGTATC A TAAACACAATTTGCTGCAATACCGGTCATAACGCTGGTGCCATTCATCATTGCCAGACCT T CTTTCGGC AGCAGGGT CAGCGGACT CAGATTCAGCT GACGCAGT GCGGTCGGT GCGTCC ATTTCTTTGCCATT A AA AT CAACTTT AA AGCT CGGGTCC AGGCCAAT C AGGCT ACCGGT A AT AT AGCT C AGCGGAACC AGATCACCGCT GGC ACCAATGCT AC C AAATT C A I AAAC AT A CGGGGTAACACCGGCATTCAGAAAGATTTCCATGCGTTTAATCAGTTCCAGACGAATACC GCTTGCACCACGCATGTGGCTATTTGCACGCAGCAGCATTGCTGCACGAACATCTGCCAG CGGCAGTTTATTACCTGCACCGGTTTTCAGAAACCAAACCAGATTGGTCTGCAGTTCGCT T GCCT GTT CACGGCT AATT GC AACATTT GCCATACCACC AAAACCGCT GGT AACACC ATA AATCGGTTCACCGCTTTCAACT GCATTATTGATAT AAT CACAGCTGGCCT GAATACCCT G CAGAATATCGGTATTATTGGTCAGGCTAACCAGGGTGCCATTACGGGCAACACGTGCAA CATCATTGATGGTCAGTTTCTGATTACCAATAATCACATTTGCGCTGCTATTGCCGGTAAA GCT AAACTGCT GGCTGCTGGTTTT GCTCT GTGCCTGGCTC AGGGTTTTCATATGACGACCT T C GAT AT GGCC GCT GCT GT G ATG AT G AT GAT G AT G AT G AT GAT G AT GGCCC AT GGT AT AT CTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGGGGAATTGTTATCCGCTCACAATTCC CCT AT AGT G AGTCGT ATT AATTT CGCGGG AT CG AG AT CTCG AT CCT CT ACGCCGG ACGC A T CGTGGCCGGCATCACCGGCGCCAC AGGT GCGGTT GCT GGCGCCT AT AT CGCCGAC AT CA CCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTA TGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCC TTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGT CGCATAAGGGAGAGCGTCGAGATCCCGGACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGG T ATGGCAT GAT AGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAAT GTGAAACCAGT AA CGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGA ACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGA GCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGA TT GGCGTT GCCACCT CCAGTCT GGCCCT GCACGCGCCGTCGCAAATT GTCGCGGC GAITA AATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGC GTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGAT CATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGT T CCGGCGTT ATTT CTT GAT GTCT CT GACC AG AC ACCC AT C AAC AGT ATT ATTTT CT CCCAT G A AG ACGGT ACGCGACTGGGCGTGGAGC AT CTGGT CGC ATTGGGT C ACCAGC AAAT CGC GCTGTT AGCGGGCCC ATT A AGTT CTGTCTCGGCGCGT CT GCGT CTGGCT GGCT GGC ATA A ATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCA TGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGC TGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTG CGCGTT GGTGCGG AT ATCTCGGT AGT GGGAT ACGACG AT ACCG A AG AC AGCT C AT GTT AT ATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGAC CGCTT GCT GC AACT CTCT C AGGG CC AGGCGGTGA AGGGC AAT CAGCT GTT GCCCGTCT CA CT GGT GAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCT CT CCCCGCGCGTT GGCCG ATTCATT AAT GCAGCTGGC ACG ACAGGTTTCCCG ACTGGAAAGCGGGC AGT GAG CGC AACGC AATTAATGTAAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCGGGATCTCGACCGATGCCC TT GAG AGCCTT C AACCC AGT C AGCTCCTT CCGGT GGGCGC GGGGCAT GACT AT CGTCGCC GCACTTAT GACT GTCTT CTTTAT CAT GCAACTCGTAGG ACAGGTGCCGGCAGCGCT CTGG GTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCG GT A?T c g g AAT CTT GCACGCCCTCGCT C A AGCCTTCGT CACT GGTCCCGCC ACC A A ACGT TTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTT GCT GGCGTTCGCGACGCG AGGCT GG ATGGCCTTCCCCATT AT G ATT CTT CT CGCTT CCGG CGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATC AGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGC TGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTG TAGGCGCCGCCCTATACCTT GTCT GCCTCCCCGCGTT GCGTCGCGGTGC AT GGAGCCGGG CCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAA TTGGAGCCAATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAAC AT ATCCATCGCGTCCGCCAT CTCC AGCAGCCGC ACGCGGCGCAT CT CGGGCAGCGTT GGG TCCTGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGG GGTTGCCTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTG CT GCT GC AAAACGT CTGCGACCT GAGC AACAACAT GAAT GGT CTT CGGTTT CCGTGTTT C GT AAAGT CT GGAAACGCGGA AGT C AGCGCCCTGC ACC ATT AT GTT CCGGAT CT GC AT CGC AGGATGCTGCTGGCTACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTG ACCCTGAGTGATTTTTCTCTGGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAA CGTTCC AGT AACCGGGC AT GTTCAT C AT C AGT AACCCGT ATCGT G AGCAT CCT CT CT CGTT TCATCGGTATCATTACCCCCATGAACAGAAATCCCCCTTACACGGAGGCATCAGTGACCA AACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTT ATCAGAAGCCAGACATT AACGCTT CTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCA CGACCACGCT G AT G AGCTTTACCGCAGCT GCCTCGCGCGTTTCGGT G AT GACGGT GAAAA CCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGA GC AGAC AAGCCCGTC AGGGCGC GT C AGCGGGT GTT GGCGGGT GT CGGGGCGCAGC C ATG ACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGT AT ACT GGCTT AACTATGCGGCATCAGAGCAG ATTGTACTGAGAGTGCACCATATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGA AAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTC GGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCA GGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTA AAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAA ATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTT CCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGT CCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAG TTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGA CCGCT GCGCCTT AT CCGGT AACT AT CGT CTT G AGT CC AACCCGGT AAG AC ACGACTT AT C GCC ACT GGC AGC AGCC ACTGGT A AC AGG ATT AGC AG AGCG AGGT AT GTAGGCG GT GCT A CAGAGTTCTT G AAGTGGTGGCCTAACTACGGCT AC ACT AG A AGGACAGT ATTT GGT AT CT GCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAAC AAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAA AAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAA ACT C AC GTT A AGGGATTTTGGT C AT GAGATT AT C A AAAAGGAT CTT C ACCT AG ATCCTTT TAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACA GTTACCAAT GCTTAATC AGT GAGGCACCTAT CTCAGCGATCT GT CTATTTCGTTCATCCAT AGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCC CAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAA ACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATC CAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGC A ACGTT GTT GCC ATT GCT GC AGGC AT CGTGGTGT C ACGCTCGT CGTTT GGT ATGGCTT C AT TCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAG CGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCAC TCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTC TGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTG
CTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCT
CATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATC
CAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCAICTTTTACTTTCACCAGC
GTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGA
CACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGG
TT ATT GTCTCATGAGCGGAT ACAIATTT G AATGT ATTT AGA A AAAT A AAC A A AT AGGGGT
T CCGCGC ACATTT C CCCG AAAAGT GCCACCTG ACGT CTAAGAAACC ATT ATTAT CAT GAC
ATT AACCT AT AAAAAT AGGCGT ATC ACGAGGCCCTTT CGTCTTC AAGAAT(SEQ ID NO: 1)
Secuencia polinucleotídica del ORP de AvPAL (SEQ ID NO: 2):
ATGAAAACCCTGAGCCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGG
CAATAGCAGCGCAAATGTGATTATTGGTAATCAGAAACTGACCATCAATGATGTTGCAC
GTGTT GCCCGT AATGGCACCCTGGTTAGCCT G ACCAAT AAT ACCG AT ATTCT GC AGGGT A
TT C AGGCCAGCT GT G ATT ATAT C AAT AAT GC AGTTGAAAGC GGT G AAC CG ATTT AT GGTG
TT ACC AGCGGTTTT GGTG GTAT GGC AA AT GTTGC AATTAGC CGTG AAC AG GCAAGC G AA
CTGCAGACCAATCTGGTTTGGTTTCTGAAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCA
GATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGCGTGCAAATAGCCACATGCGTGGTGCAAGCGGTATT
CGT CT GGA ACTG ATT AA ACGC AT GGA AAT CTTT CT G AAT GCCGGT GTT ACCCCGT ATGTT
TATGAATTTGGTAGCATTGGTGCGAGCGGTGATCTGGTTCCGCTGAGCTATATTACCGGT
AGCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAGTTGATTTTAATGGCAAAGAAATGGACGC
ACCGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTGCTGCCGAAAGAAGGTCT
GGCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCAGCAAATTGTGTTTATGATAC
CCAGATTCTGACCGCAATTGCAATGGGTGTTCATGCACTGGATATTCAGGCACTGAATGG
TACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAGCTGTG
GGC AGCAGATCAGATGATTAGCCTGCT GGCCAATAGCCAGCT GGTT CGT GATGAACT GG
ATGGTAAACATGATT ATCGT G ATCATGAACT GATCCAGGATCGTTAT AGCCT GCGTT GTC
TGCCGCAGT ATCTGGGT CCGATTGTTGAT GGTATT AGCCAGATT GCCAAACAAATCGAAA
TT G AG ATT AACAGCGTTACCG AT AACCCGCT G ATT G AT GTTGAT AAT CAGGC AAGCT ATC
ATGGTGGT AATTTTCTGGGTCAGT AT GTT GGTAT GGGT AT GGATCAT CTGCGCT ATT ATAT
CGGTCTGCT GGCAAAACAT CTGGAT GTT CAGATTGC ACT GCTGGC AT C ACCGG AATTTAG
C AATGGTCTGCCT CCGAGTCT GCT GGGT AATCGT GA ACGT A A AGTTA AT AT GGGT CTG A A
AGGTCTGCAGATTTGCGGTAATAGCATTATGCCGCTGCTGACCTTTTATGGTAATAGTAT
TGCAGATCGTTTTCCGACCCATGCCGAACAGTTTAACCAGAATATTAACAGCCAGGGTTA
TACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGTTGATATTTTTCAGAATTATGTTGCCATTGC
CCT GAT GTTT GGT GTTCAGGC AGTT G ATCT GCGT ACCT ACAAAAAAACCGGT C ATT AT GA
TGC ACGTGCCTGTCTGTC AC CGGCA ACCG AACGT CT GT AT AGCGC AGTT CGTCAT GTT GT
T GGT CAGA AAC CGACCT CAGAT CGTCCGT AT ATTT GGA AT GAT AAT GAAC AGGGTCT GG
ATGAACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTTATTGTTCAGGCCG
TT C AGG ACATT CT GCCGT GT CT GC AT (SEQ ID NO:2)
Secuencia polinucleotídica de WT AvPAL (SEQ ID NO: 3):
Figure imgf000044_0001
GT GTT GCCCGTAAT GGCACCCTGGTT AGCCT GACCAAT AAT ACCGAT ATT CT GC AGGGT A
TTC AGGCC AGCTGTGATT ATATC AAT AAT GC AGTT G AAAGCGGTGAACCGATTT ATGGT G
TTACCAGCGGTTTTGGTGGTATGGCAAATGTTGCAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAA
CTGCAGACCAATCTGGTTTGGTTTCTGAAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCA
GATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGCGTGCAAATAGCCACATGCGTGGTGCAAGCGGTATT
CGT CT GGAACT GATT AAACGCATGG AAATCTTTCTGAAT GCCGGTGTTACCC CGTATGTT
TATGAATTTGGTAGCATTGGTGCCAGCGGTGATCTGGTTCCGCTGAGCTATATTACCGGT
AGCCT GATTGGCCT GGACCCGAGCTTT AAAGTT GATTTT AAT GGCAAAGAA AT GGACGC
ACCGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTGCTGCCGAAAGAAGGTCT
GGC AAT G AT GAAT GGCACCAGCGTT AT G ACCGGT ATTGC AGC A AATT GT GTTT AT G AT AC
CCAGATT CT G ACCGC A ATT GC A AT GGGT GTTCATGC ACT GGAT ATT C AGGC ACT G A ATGG
TACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAGCTGTG
GGC AGCAG AT C AG ATG ATT AGCCT GCT GGCCAAT AG CCAGCT GGTT CGT GAT G AACT GG
AT GGTAAACATGATT AT CGT GAT C AT G AACT GAT CC AGGAT CGTT AT AGCCTGCGTT GT C
T GCCGC AGT ATCT GGGT CCGATT GTT GAT GGT ATT AGCCAGATT GCC AAAC AAAT CGA AA
TT GAGATT AACAGCGTTACCGATAACCCGCT GATTGAT GTT GATAATCAGGCAAGCT ATC
ATGGTGGTAATTTTCTGGGTCAGTATGTTGGTATGGGTATGGATCATCTGCGCTATTATAT
CGGTCTGCT GGC AA AAC AT CTGG AT GTTC AG ATT GC ACTGCTGGC AT CACCGGAATTT AG
CAATGGTCTGCCTCCGAGTCTGCTGGGTAATCGTGAACGTAAAGTTAATATGGGTCTGAA
AGGTCT GC AGATTT GCGGT AAT AGC ATT ATGCCGCTGCT G ACCTTTT ATGGT A ATAGT AT
TGCAGATCGTTTTCCGACCCATGCCGAACAGTTTAACCAGAATATTAACAGCCAGGGTTA
TACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGTTGATATTTTTCAGAATTATGTTGCCATTGC
CCTGAT GTTTGGT GTTCAGGCAGTT GATCTGCGTACCT AC AAAAAAACCGGT CATTATGA
TGCACGTGCCTGTCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGTATAGCGCAGTTCGTCATGTTGT
TGGTCAGAAACCGACCTCAGATCGTCCGTATATTTGGAATGATAATGAACAGGGTCTGG
ATGAACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTTATTGTTCAGGCCG
TTCAGGACATTCTGCCGTGTCTGCAT (SEQ ID NO:3)
Secuencia de polipéptidos de WT AvPAL (SEQ ID NO: 4):
MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVARVARNGTLVSLTNNTDILQGIQAS
CDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANVAISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVRAA
MLLRANSHMRGASGIRLEUKJRMElfLNAGVTPYVYEFGSlGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSF
KVDFNGKEMDAPTALRQLMLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGLAANCVYDTQILTAIAMGV
HALD1QALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLANSQLVRDELDGKHDYRDHELIQ
D R Y S LRC L PQY LG P! V DGISQIA KQIEIEIN S V TON P L1D V D N Q A S YHG G N F LGQ Y VGM G M D H
LRYYIGLLAKHLDVQULLASPEFSNGLPPSLLGNRERKVNMGLKGLQÍCGNSÍMPLLTFYGN
SIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIFQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHYD
ARACL SPATERL Y S A VRH V VGQKPTSDRP YIWM DN EQGLDEHIAR1SADJLA AGG VIVQ AV QD1
LPCLH (SEQ ID NO:4)
Secuencia polinucleotídica de la variante N° 30 de AvPAL (SEQ ID NO: 5):
ATGAAAACCCTGAGTCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGG
C AAT AGC AGC GC A AAT GT GATT ATT GGT AAT CAGAAACT G ACC AT C A AT GAT GTT GT ACG
TGTTGCCCGTAATGGCACCCTGGTTAGCCTGACCAATAAT ACCGAT ATTCTGCAGGGTAT
T CAGGCC AGCT GT G ATTAT ATC AAT A ATGC AGTTG AAAGCGGT G AACCG ATTTAT GGT GT
TACCAGCGGTTTTGGTGGTATGGCAAATGTTGTAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAACT
GCAGACCAATCTGGTTTGGTTTCTGAAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCAG
AT GTT CGT GC AGC AATGCT GCT GCGT GCAAATAGCC ACAT GCGT GGTGC AAGCGGT ATTC
GT CTGG AACT GATTAAACGC AT GG AAAT CTTTCT GAAT GCCGGTGTT ACCCCGTAT GTTT
A I GAATTT G G I AGC ATT GGT GCCAGCGGT GATCTGGTT CCGCT G AGCT AT ATT AC CGGT A
GCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAGTTGATTTTAATGGCAAAGAAATGGACGCAC
CGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTGCTGCCGAAAGAAGGTCTG
GC AAT GAT G AATGGC ACCAGCGTT AT G ACC GGT ATTGCAGC AAATTGT GTTT AT GAT ACC
CAG ATTCT GACCGCAATTGCAAT GGGTGTT C AT GCACTGGATATTC AGGGACT GAAT GGT
ACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAGCTGTGG
GC AGC AG AT C AGAT GATT AGCCT GCT GGCCGGT AGCC AGCT GGTT CGT GAT GAACT GGA
TGGTAAACATGATTATCGTGATCATGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTTGTCT
GC CGC A G I AT CT GGGTCCGATT GTT GAT GGT ATT AGCCAGATT GCC AAACAAATCGAAAT
TGAGATTAACAGCGTTACCGATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCAAGCTATCA
TGGT GGT A ATTTT CT GGGT C AGT AT GTT GGT AT GGGT ATGG ATC AT CTGCGCT ATT AT AT C
GGTCT GCT GGCAAAACAT CT GGAT GTT CAGATTGCACT GCT GGT ATC ACCGG AATTTAAC
AAT GGT CT GC CT GCGAGT CT GGT GGGT AAT CGT GAACGT AAAGTT AAT ATGGGT CT G A A A
GGTCT GC AGATTT GCGGTAATAGCATTAT GCCGCTGCT GACCTTTT ATGGTAATAGTATT
GCAGATCGTTTTCCGACCCATGCCGAACAGTTTAACCAGAATATTAACAGCCAGGGTTAT
ACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGTTGATATTTTTCAGAATTATGTTGCCATTGCC
CTG AT GTTT GGT GTT CAG GC AGTTG AT CT GCGT ACCT AC A AAA AAAC CGGT C ATT AT GAT
GCACGTGCCTGTCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGTATAGCGCAGTTCGTCATGTTGTT
GGTCAGTATCCGAGCTCAGATCGTCCGTATATTTGGAATGATAATGAACAGGGTCTGGAT
GAACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTTATTGTTCAGGCCGTT
CAGGACATTCTGCCGTGTCTGCAT (SEQ ID NO:5)
Secuencia de polipéptidos de la variante N° 30 de AvPAL (SEQ ID NO: 6):
MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVVRVARNGTLVSLTNNTDILQGIQAS
C D Y iN NA V ES GEPIY GVTSGF GGMAN V V1S R EQASELQTNL VW F LKTG AGN K LPLADV RAA
MLLRANSHMRGASGIRLELIKRME1FLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSF
KVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTA1AMGV
HALDIQGLNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLAGSQLVRDELDGKHDYRDHELIQ
DRYSLRCLPQYLGPIVDGÍSQÍAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDH
LRYYIGLLAKHLDVQIALLVSPEFNNGLPASLVGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFYG
NSIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIFQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHY
DARACLSPATERLYSAVRHVVGQYPSSDRPYIWNDNEQGLDEHIARISADIAAGGVIVQAVQ
DILPCLH (SEQ ID NO:6)
Secuencia polinucleotídica de la variante N° 22 de AvPAL (SEQ ID NO: 7):
AT GAAAACCCT GAGCCAGGC ACAGAGC A AA ACC AGCAGCC AGCAGTTT AGCTTT ACCGG
C AAT AGCAGCGC AAAT GTGATT ATT GGT AAT C AG AAACTG ACCAT CA ATG AT GTT GC AC
GT GTT GCCCGT AAT GGCACCCTGGTT AGCCT GACC AAT AAT ACCGAT ATTCTGC AGGGTA
TT C AGGCC AGCTGT GATT AT AT CAAT AAT GC AGTT GAAAGCGGT GAACCG ATTTAT GGT G
TTACCAGCGGTTTTGGTGGTATGGCAAATGTTGCAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAA
CT GC AGACC AAT CTGGTTT GGTTT CTGAA AACCGGT GC AGGTAAT A AACT GCCGCT GGC A
GATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGCGTGCAAATAGCCACATGCGTGGTGCAAGCGGTATT
C G I CT GGAACT GATT AAAC GC AT GG AAAT CTTT CT GAATGCCGGT GTT AC CC CGT AT GTT
T ATG AATTT GGTAGCATTGGTGCCAGCGGTGATCT GGTT CCGCT G AGCT AT ATT ACCGGT
AGCCT G ATTGGCCT GGACCCG AGCTTT AA AGTT G ATTTT AAT GGC AAAG AAAT GGAC GC
ACCGACCGC ACT GCGT CAGCTGAAT CT GAGT CC GCT GACCCTGCT GCCGAAAGAAGGTCT
GGCAAT GAT GAAT GGCACCAGCGTT ATGACCGGTATT GCAGCAAATTGTGTTTATG ATAC
CC AGATT CT G ACCG CA ATT GC AAT GGGT GTT C A I GC ACT GG AT ATT CAGGC ACT G AAT GG
T AC AAATC AG AGCTTTCAT CCGTTT ATCCAT AAC AGCA A ACCGCAT CCGGGT C AGCT GT G
GGCAGCAGATCAGATGATTAGCCTGCTGGCCAATAGCCAGCTGGTTCGTGATGAACTGG
AT G GT AAAC AT GATT ATCGTG AT GGTG AACT GAT CC AGGATCGTT AT AGCCT GCGTT GT C
TGCCGCAGTATCTGGGTCCGATTGTTGATGGTATTAGCCAGATTGCCAAACAAATCGAAA
TTG AGATTAACAGCGTT ACCG ATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCA AGCT ATC
AT GGT GGT AATTTTCT GGGT C AGT AT GTT GGT AT GGGT AT GGAT CAT CT GCGCT ATT AT AT
CGGT CT GCT GGC AAAAC AT CT GG AT GTT C AGATT GC ACT GCT GGC AT C ACCGGAATTT AG
C AAT GGTCT GCCT CCGAGT CT GCT GGGT A AT CGT G A ACGT AA AGTT AAT AT GGGTCT GAA
AGGT CT GC AG ATTT GCGGT AAT AGC ATT AT GCCGCT GCT GACCTTTT AT GGT AAT AGT AT
TGCAGATCGTTTTCCGACCCATGCCGAACAGTTTAACCAGAATATTAACAGCCAGGGTTA
T ACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGT AGCGTT GAT ATTTTT CAG AATT AT GTT GCCATTGC
CCT GAT GTTT GGT GTT CAGGC AGTT GAT CTGCGT ACCT ACAAAA A AACCGGT C ATTAT GA
T GC ACGT GCCTGTCTGT C ACCGGC AACC GAACGT CTGT AT AGCGC AGTTCGT CAT GTT GT
TGGT CAG AAACCGACCT CAGATCGT CCGTAT ATTT GGAATGAT AAT GAACAGGGT CT GG
AT GAACAT ATTGCACGT ATT AGTGCAGAT ATTGCAGCCGGT GGT GTT ATTGTTCAGGCCG
TTCAGGACATTCTGCCGTGTCTGCAT (SEQ ID NO:7)
Secuencia de polipéptidos de la variante N° 22 de AvPAL (SEQ ID NO: 8):
MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVARVARNGTLVSLTNNTDILQGIQAS
CDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANVA1SREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVRAA
MLLRANSHMRGASG1RLEUKRMEIFLNAGVTPYVYEFGS1GASGDLVPLSYITGSLIGLDPSF
KVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAMGV
HALDIQALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLANSQLVRDELDGKHDYRDGELIQ
DRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDH
LRYYIGLLAKHLDVQIALLASPEFSNGLPPSLLGNRERKVNMGLKGLQICGNS1MPLLTFYGN
SIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDÍFQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHYD
ARACLSPATERLYSAVRHWGQKPTSDRPYIWNDNEQGLDEHIARISADIAAGGVTVQAVQDI
LPCLH (SEQ ID NO:8)
Secuencia polinucleotídica de la variante n° 36 de AvPAL (SEQ ID NO: 9):
ATGAAAACCCTGAGTCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGG
C AAT AGCAGCGCAAATGTGATT ÁTTGGT AATCAGAAACTGACCATCAATGAT GTTGT ACG
T GTT GCCC GT AAT GGC ACCCT GGTTAGCCT GACC AAT AAT ACCGAT ATT CT GC AGGGT AT
TCAGGCC AGCTGT GATT AT AT C AAT AAT GC AGTT GAAAGCGGTG AACCGATTTAT GGT GT TACCAGCGGTTTTGGTGGTATGGCAAATGTTGTAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAACT
GC AGACCAAT CT GGTTT GGTTT CTGA AAACCGGT GC AGGT AAT AAACTGCCGCT GGC AG
AT GTTCGTGC AGC AATGCT GCTGCGT GCAAATAGCC ACAT GCGT GGT GC AAGCGGT ATT C
GTCTGGAACTGATTAAACGCATGGAAATCTTTCTGAATGCCGGTGTTACCCCGTATGTTT
AT GAATTT GGT AGC ATT GGT GCCAGC GGT G ATCT GGTT CCGCT GAGCTAT ATT ACCGGT A
GCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAGTTGATTTTAATGGCAAAGAAATGGACGCAC
CGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTGCTGCCGAAAGAAGGTCTG
GC AAT G AT GAATGG C ACCAGCGTT ATG ACCGGT ATT G C AGC AAATT GT GTTT AT G AT ACC C AGATTCT GACCGC AATTGC AAT GGGTGTT CAT GCACTGGAT ATTC AGGC ACT GAATGGT ACA AAT CAG AGCTTTC AT CCGTTT ATCC AT A AC AGCAAACCGCATCCGGGTC AGCT GTGG
GC AGCAG AT C AG AT GATT AGC CT GCT GGCCGGT AGC CAGCT GGTT C GT G AT G AACT GGA
TGGTAAACATGATTATCGTGATGGTGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTTGTCT
GCCGCAGTATCTGGGTCCGATTGTTGATGGTATTAGCCAGATTGCCAAACAAATCGAAAT TGAGATT AACAGCGTTACCGAT AACCCGCT GATT GAT GTTGAT AATCAGGCAAGCT ATCA TGGTGGT AATTTT CT GGGTC AGT AT GTTGGT ATGGGT AT GGATC AT CT GCGCT ATT AT AT C GGTCTGCTGGCAAAACATCTGGATGTTCAGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATTTAGC AATGGTCTGCCTCCGAGTCTGGTGGGTAATCGTGAACGTAAAGTTAATATGGGTCTGAAA
GGTCTGC AG ATTT GCGGT AATAGCATTATGCCGCTGCT G ACCTTTT ATGGT A AT AGT ATT
GCAGAT CGTTTTCCGACCCAT GCCGAACAGTTT AACCAGAAT ATT AACAGCCAGGGTTAT
ACCAGCGCAACCCT GGCACGT CGT AGCGTT GAT ATTTTTCAGAATTATGTTGCCATTGCC
CT GAT GTTT GGT GTTCAGGC AGTT GAT CT GCGT ACCT ACAA AA AAACCGGT C ATT AT GAT
GCACGTGCCT GT CTGTCACCGGCAACCGAACGT CT GT AT AGCGCAGTTCGTCAT GTT GTT
GGT CAG AAACCG AGCTCAG ATCGTCCGTAT ATTT GGA ATG AT AAT G AAC AGGGTCT GGA
TGAACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTTATTGTTCAGGCCGT
T C AGG AC ATT CT GCCGT GT CT GCAT (SEQ ID NO:9)
Secuencia polipeptídica de la variante n° 36 de AvPAL (SEQ ID NO: 10):
M KTLSQAQSKTSSGQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVVRVARNGTLVSLTNNTDILQGIQAS
CDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANWISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVRAA
M LLRANSHM RGASGIRLELIKRM EIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSF
KVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQ1LTAIAMGV HALDIQALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLAGSQLVRDELDGKHDYRDGELIQ DRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGM GM DH LRYYIGLLAKHLDVQIALLASPEFSNGLPPSLVGNRERKVNM GLKGLQICGNSIM PLLTFYGN
SIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDÍFQNYVAIALM FGVQAVDLRTYKKTGHYD
ARACLSPATERLYSAVRHVVGQKPSSDRPYÍWNDNEQGLDEHIARISADIAAGGVIVQAVQDI LPCLH (SEQ ID NO: 10)
Secuencia polinucleotídica de la Variante N° 42 de AvPAL (SEQ ID NO: 11):
ATGAAAACCCTGAGTCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGGC
A AT AGC AGCGC AAAT GT G ATT ATT GGT AAT C AG AA ACT G ACC AT C AAT GAT GTT GT ACGT
GTT GCCCGT AAT GGCAC CCT GGTT AG CCT G ACCA AT AAT AAAG AT ATTCT GC AGCGT ATT CAO C AGCT GT GATT AT AT CAAT AAT GC AGTT GA A AAAGGTGA ACCG ATTT AT GGT GTT ACC AGCGG TTGGTGGTATGGCAAATGTTGTAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAACTGCAGACCAATCTGC TT GGTTTCTG AAAACCGGT GCAGGT AATAAACT GCCGCT GGC AGAT GTT CGT GC AGC AAT GCT TGCGTGCAAATAGCCACATGCGTGGTGCAAGCGGTATTCGTCTGGAACTGATTAAACGCATGC AATCTTTCTGAAT GCCGGTGTT ACCCCGTAT GTTT AT GAATTT GGTAGCATTGGTGCC AGCGGT ATCTGGTTCCGCTGAGCTATATTACCGGTAGCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAGTTG/ TTT AAT GGC AAAG A AAT GG ACGCACCG ACCGC ACTGCGT C AGCT GA ATCTG AGTCCGCT G ACC TGCTGCCGAAAGAAGGTCTGGCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCAGCAi
TTGTGTTTAT GAT ACCC AG ATT CT G ACCGC AATT GC AAT GGGTGTT CATGC ACTGG AT ATTCAGG
CACTGAATGGTACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAG
CT GTGGGC AGCAG ATCAGATGATTAGCCT GCTGGCCGGTAGCCAGCT GGTTCGTGAT GAACT GG
AT GGT A A ACAT GATT AT AT GG AT GGT G A ACTGAT CC AGG AT GGTT AT AGCCT GCGTT GTCTGCCG
C AGTATCT GGGT CCGATT GTT G ATGGT ATTAGCC AG ATT GCCAA AC AAATCG A AATT G AG ATT AA
€ AGCGTT ACCGATAACC CGCT G ATTG ATGTT GATAAT C AGGC AAGCT ATC ATGGT GGTAATTTTC
TGGGT C AGT AT GTT GGT ATGGGT AT GGAT C ATCT GCGCT ATT ATAT CGGTCT GCT GGC AAAACAT
CTGGATGTTCAGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATTTAGCAATGGTCTGCCTCCGAGTCTGGT
GGGT AATCGTGAACGTAAAGTTAAT ATGGGTCTGAAAGGTCTGCAGATTTGCGGTAATAGCATT
ATGCCGCT GCT G ACCTTTT ATGGT A AT AGTATT GC AG AT CGTTTT CCG ACCCATGCCG A AC AGTT
TAACCAGAATATTAACAGCCAGGGTTATACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGTTGATATTT
TTCAGAATTATGTTGCCATTGCCCTGATGTTTGGTGTTCAGGCAGTTGATCTGCGTACCTACAAA
AAAACCGGT C ATT AT GAT GC ACGT GCCC AGCT GTCACCGGC A ACCGA ACGTCT GT AT AGCGC AG
TTCGTCATGTTGTTGGTAAAAAACCGAGCTCAGATCGTCCGTATATTTGGAATGATAATGAACAG
GGTCT GGAT GAAC ATATT GC ACGT ATT AGT GCAGAT ATT GCAGCCGGTGGT GTT ATTGTTCA
GGCCGTTC AGGACATTCTGCCGCCGCTGCAT (SEQ ID NO: 11)
Secuencia de polipéptidos de la variante N° 42 de AvPAL (SEQ ID NO: 12):
MKTLSQAQSKTSSGQFSFTGNSSANVIIGNQK.LT1NDVVRVARNGTLVSLTNNKD1LQRIQASCDY1N
NAVEKGEP1YGVTSGFGGMANVVISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVRAAMLLRANSHM
RGASGIRLELIKRMEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSFKVDFNGKEMDAPTA
LRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAMGVHALDIQALNGTNQSFHPFIH
NSKPHPGQLWAADQM1SLLAGSQLVRDELDGKHDYMDGEL1QDRYSLRCLP
QYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDHLRYYIGLLAKHLDV
QIALLASPEFSNGLPPSLVGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFYGNSIADRFPTHAEQFNQNINSQ
GYTSATLARRSVDIFQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHYDARAQLSPATERLYSAVRHVVGKKP
SSDRPYIWNDNEQGLDEHIARISADIAAGGVIVQAVQDILPPLH (SEQ ID NO: 12)
Secuencia polinucleotídica de la variante N° 43 de AvPAL (SEQ ID NO: 13):
ATGAAAACCCTGAGTCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGGCAATA
GC AGCGCAAAT GTGATTATTGGTAAT CAGAAACT GACCATCAATGATGTTGT ACGTGTTGCCCGT
AAT GGCACCCT GGTT AGCCT G ACC AAT AAT AAAG AT ATT CT GC AGCGT ATT C AGGCC AG CTGTG
ATT ATAT CAAT AATGCAGTT GAAAGCGGTGAACCGATTTAT GGT GTTACC AGCGGTTTT GGTGGT
AT GGCAAATGTTGTAATTAGCCGT GAACAGGCAAGCGAACT GCAGACCA ATCT GGTTT GGTTTCT
GA AA ACCGGT GCAGGT AAT A AACTGCCGCT GGC AG AT GTT CGT GCAGC A AT GCT GCT GCGT GC A
AAT AGCC AC AT GCGT GGT GC A AG CGGTATTCGT CTGGA ACT G ATT A AACGC AT GG AAAT CTTT CT
GAATGCCGGTGTTACCCCGTATGTTTATGAATTTGGTAGCATTGGTGCCAGCGGTGATCTGGTTC
CGCTGAGCTATATTACCGGTAGCCTGATTGGCC TGGACCCGAGCTTTAAAGTTGATTTTAATG
GCAAAGAAAT GGACGC ACCGACCGCACT GC
GTC AGCT GA AT CTGAGT CCGCTG ACCCTGCT GCCGA A AG A AGGTCT GGC AATG AT G AATGGC AC
C AGCGTT ATGACCGGT ATTGC AGC AAATTGTGTTT ATGAT ACCCAGATT CTG ACCGC AATT GC AA
TGGGTGTTCATGCACTGGATATTCAGGCACTGAATGGTACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATC
CATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAGCTGTGGGCAGCAGATCAGATGATTAGCCTGCTGGCCG
GTAGCCAGCTGGTTCGTGATGAACTGGATGGTAAACATGATTATATGGATGGTGAACTGATCCA
GG AT CGTT AT AGCCTGCGTT GTCTGCC GC AGT AT CTGGGTCC GATT GTT G AT GGT ATT AGCC AGA
TTGCCAAACAAATCGAAATTGAGATTAACAGCGTTACCGATAACCCGCTGATTGATGTTGATAAT
CAGGCAAGCTATCATGGTGGTAATTTTCTGGGTCAGTA
T GTT GGT ATGGGT ATGG AT CAT CTGCGCT ATT AT ATCGGTCT GCTGGC AA A A C ATCTGG ATGTTC
AGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATTTAGCAATGGTCTGCCTCCGAGTCTGGTGGGTAATCGT
GAACGTAAAGTTAATATGGGTCTGAAAGGTCTGCAGATTTGCGGTAATAGCATTATGCCGCTGCT
GACCTTTT AT GGT AAT AGT ATT GCAGATCGTTTT CCGACCCAT GCCG AACAGTTT AACC AG AAT A
TTAACAGCCAGGGTTATACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGTTGATATTTTTCAGAATTAT
GTTGCCATTGCCCTGATGTTTGGTGTTCAGGCAGTTGATCTGCGTACCTACAAAAAAACCGGTCA
TT AT G AT GCACGT GCCCAGCT GT C ACCGGC A ACCG AACGT CT GT AT AGCGC AGTT CGT CAT GTT G
TTGGTAAAAAACCGAGCT CAGATCGT CCGTATATTTGGAAT GATAATGAACAGGGT CTGGAT GA
ACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTTATTGTTCAGGCCGTTCAGGACA
TTCTGCCGAACCTGCAT (SEQ ID NO: 13)
Secuencia de polipéptidos de la variante N° 43 de AvPAL (SEQ ID NO: 14):
MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVVRVARNGTLVSLTNNKDILQRIQASCDYIN
N AV ESG EPIY G VT SG FGGM A NV VIS REQAS ELQTN LV WFLKTGAGN KL PL A DV RAAM L LRAN S H M
RGASGIRLELIKRMEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSFKVDFNGKEMDAPTA
LRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAMGVHALDIQALNCTNQSFHPFIH
NSKPHPGQLWAADQM1SLLAGSQLVRDELDGKHDYMDGELIQDRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQ ¡E1EFNSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDHLRYYIGLLAKHLDVQIALLASPEFSNGLPP
SLVGNRERKVNMGLKGLQICGNSMPLLTFYGNSIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIF
QN Y V AIAL M F G VQAV DLRT Y KJCFG HY DARAQ LSPAT ERL Y S AV RH V VGKKPS SDRP YIWN DN EQG
LDEHIARISADIAAGGVIVQAVQDILPNLH (SEQ ID NO: 14)
Secuencia polinucleotídica de la Variante N° 1002 de AvPAL (SEQ ID NO: 15):
ATGAAAACCCTGAGTCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGGCAATA
GCAGCGCAAATGTGATTATTGGTAATCAGAAACTGACCATCAATGATGTTGCGCGTGTTGCCCGT
AAT GGC ACCCTGGTT AGC CT G ACC AAT AATAC CG AT ATT CT GCAGGGTATT CAGGCC AGCT GT GA
TT AT ATC AAT A ATGCAGTT G AAAGCGGT G A ACCG ATTT AT GGT GTT ACC AGCGGTTTTGGT GGTA
TGGCAAATGTTGTAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAACTGCAGACCAATCTGGTTTGGTTTCTG
AAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCAGATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGCGTGCAA
ATAGCCACATGCATGGTGCAAGCGGTATTCGTCTGGAACTGATTAAACGCGCGGAAATCTTTCTG
AAT GCCGGT GTT ACCCCGT AT GTTT AT G A ATTT GGT AGC ATT GGTGC CAGCGGT G ATCT GGTTCC
GCIGAGCTATATT ACCGGTAGCCT GATTGGCCT GGACCCGAGCTTTAAAGTT GATTTT AAT GGCA
A AG AA ATGG ACGC ACCG ACCGC ACT GCGTCAGCT G A ATCT G AGT C CGCTGACCCTGCT GCCG A A
AG A AGGTCT GGCA ATG ATG A ATGGCACC AGCGTT AT G ACCGGTATT GCAGCAA ATT GT GTTT AT
G ATACCC AG ATTCT G ACCGC AATTGC AAT GGGT GTTC ATGC ACT GG ATATT C AGGC ACT G A AT GG
TACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAGCTGTGGGCAG
C AG ATC AG AT GATT AGCCT GCT GGCCGGT AGCC AGCT GGTT CGT G AT GAACTGGAT GGT AAAC A
T G ATT AT CGT GATGGT G AACT G AT CC AGG AT CGTT AT AGCCT GCGTT GTCT GCCGC AGT ATCT GG
GT CCG ATT GTT G ATGGT ATTAGCC AG ATTGCCA AAC AAAT CG AAATT G AG ATT AAC AGCGTT ACC
GATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCAAGCTATCATGGTGGTAATTTTCTGGGTCAGTA
T GTTGGT AT GGGTAT GGATC AT CTGCGCTATTATAT CGGTGGCCTGGCAAAACATCTGGAT GTTC
AGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATTTAGCAATGGTCTGCCTCCGAGTCTGGTGGGTAATCGT
GAACGTAAAGTTAATAT GGGT CT GAAAGGTCTGCAGATTTGCGGTAATAGCATT ATGCCGCT GCT
GACCTTTTATGGTAATAGTATTGCAGATCGTTTTCCGACCCATGCCGAACAGTTTAACCAGAATA
TT A ACAGCC AGGGTT AT ACC AGCGCA ACCCT GGCACGTCGT AGCGTT G ATATTGGCC AG A ATT AT
GTTGCCATTGCCCTGATGTTTGGTGTTCAGGCAGTTGATCTGCGTACCTACAAAAAAACCGGTCA
TT AT GAT GCACGT GCCC AGCT GTC ACCGGCAACCGAACGT CT GT ATAGCGCAGTTCGT CAT GTTG
TTGGTCAGAAACCGAGCTCAGATCGTCCGTATATTTGGAATGATAATGAACAGGGTCTGGATGA
ACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTTATTGTTCAGGCCGTTCAGGACA
TT CT GCCG AACCT GC AT (SEQ ID NO: 15)
Secuencia polipeptídica de la variante AvPAL n° 1002 (SEQ ID NO: 16):
MKTLSQAQSKT S SQQFSFT GNS S ANVIIG NQKLTINDV ARVARNGTLV SLTNNTDILQGIQAS
C DYIN NAVES GEP1YG VT SGF GGM AN V VIS R EQ AS ELQTN L V W F LKT G AGN KLPLADV RAA
MLLRANSHMHGASGlRLELIKRAEÍFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYrTGSLiGLDPSF
KVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTALAMGV
H ALDIQ ALNGTNQS FH PFIHN SKPH PGQL W AADQM 1SLLAGSQLVRDELDGKHDYRDGELIQ
DRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDH
LRYYIGGLAKHLDVQIALLASPEFSNGLPPSLVGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFYGN
SIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIGQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHYD
A RAQLS P AT ERE Y S AVRHV V GQK P SS DRP YIWN DN EQGL DE HIARISADIAAGGVTVQAVQDILPNLH (SEQ ID NO: 16)
Secuencia polinucleotídica de la Variante N° 1008 de AvPAL (SEQ ID NO: 17):
ATGAAAACCCT GAGTCAGGCACAGAGC AAAACC AGCAGCCAGCAGTTT AGCTTTAC-CGGCAATA
GCAGCGCAAAT GTG ATT ATTGGTAAT CAGAAACTGACCATCAATGAT GTT GCGCGTGTTGCCCGT
AATGGCACCCTGGTTAGCCTGACCAATAATACCGATATTCTGCAGGGTATTCAGGCCAGCTGTGA
TT AT ATC AAT A AT GC AGTT G AA AGCGGT G AACCGATTT AT GGT GTT ACC AGCGGTTTT GGT GGT A
T GGCAAAT GTT GT A ATTAGCCGT G AACAGGCAAGCG AACT GC AGACC AAT CT GGTTTGGTTTCT G
AAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCAGATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGCGTGCAA
ATAGCCACATGCATGGTGCAAGCGGTATTCGTCTGGAACTGATTAAACGCGCGGAAATCTTTCTG
A ATGCCGGT GTT ACCCCGT AT GTTTATG AATTTGGT AGC ATT GGTGCCAGCGGT G ATCTGGTT CC
GCTG AGCT AT ATT ACCGGT AGCCTG ATTGGCCT GG ACCCG AGCTTT A AAGTT G ATTTTA AT GGC A
AAGAAATGGACGCACCGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTGCTGCCGAA
AGAAGGTCTGGCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCAGCAAATTGTGTTTAT
GATACCCAGATTCTGACCGCAATTGCAATGGGTGTTCATGCACTGGATATTCAGGCACTGAATGG
T AC.AAATC AGAGCTTTC AT CCGTTT AT CC ATAACAGCAAACCGC AT C CGGGT CAGCT GT GGGC AG
CAGA! CAG AT GATT AGCCT GCTGGCC GGTAGCCAGCT GGTT CGTG AT G AACTGG AT GGTAA AC A
TGATTATCGTGATGGTGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTTGTCTGCCGCAGTATCTGG
GTCCGATTGTTGATGGTATTAGCCAGATTGCCAAACAAATCGAAATTGAGATTAACAGCGTTACC
GATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCAAGCTATCATGGTGGTAATTTTCTGGGTCAGTA
TGTTGGTATGGGTATGGATCATCTGCGCTATTATATCGGTGGCCTGGCAAAACATCTGGATACCC
AGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATTTAGCAATGGTCTGCCTCCGAGTCTGGTGGGTAATCGT
GAACGTAAAGTTAATATGGGTCTGAAAGGTCTGCAGATTTGCGGTAATAGCATTATGCCGCTGCT
GAC CTTTT ATGGT AAT AGT ATT GC AG AT C GTTTT CCG ACCCATG CCG AAC AGTTT AACC AG AAT A
TTAACAGCCAGGGTTATACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGTTGATATTGGCCAGAATTAT
GTTGCCATTGCCCTGATGTTTGGTGTTCAGGCAGTTGATCTGCGTACCTACAAAAAAACCGGTCA
TTATGATGCACGTGCCCAGCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGTATAGCGCAGTTCGTCATGTTG
TT GGT CAGAAACCGAGCTC AG ATCGTCCGT ATATTTGGAATG ATAAT GAACAGGGT CTGG AT G A
ACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTTATTGTTCAGGCCGTTCAGGACA
TTCTGCCGAACCTGCAT (SEQ ID NO: 17)
Secuencia de polipéptidos de la variante AvPAL n° 1008 (SEQ ID NO: 18):
MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVARVARNGTLVSLTNNTDILQGI
QASCDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANVVISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVR
AAMLLRANSHMHGASGIRLELIK.RAEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDP
SFKVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAATSICVYDTQ1LTAIAM
GVHALDIQALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADGM1SLLAGSQLVRDELDGKHDYRDGE
LIQDRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDYDNQASYHGGNFLGQYVGMGM
DHLRYYIGGLAKHLDTQIALLASPEFSNGLPPSLVGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFY
GNSIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIGQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGH
YDARAQLSPATERLYSAVRHVVGQKPSSDRPYIWNDNEQGLDE HIARISAD1AAGGVIVQAVQDILPNLH (SEQ ID NO: 18)
Secuencia polinucleotídica de la Variante N° 1009 de AvPAL (SEQ ID NO: 19):
ATGAAAACCCTGAGTCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGGCAATA
GCAGCGCAAATGTGATTATTGGTAATCAGAAACTGACCATCAATGATGTTGCGCGTGTTGCCCGT
AATGGCACCCTGGTTAGCCTGACCAATAATACCGATATTCTGCAGGGTATTCAGGCCAGCTGTGA
TTAT ATCAAT A AT GC AGTTGA A AGCGGT GA ACCG ATTT AT GGT GTT ACC AGCGGTTTTGGTGGT A
TGGC AA AT GTT GT A ATT AGCCGT G A AC AGGC AAGCG A ACT GC AG ACC A ATCTGGTTT GGTTTCTG
A AAACCGGT GC AGGT A AT A AACT GCCGCT GGC AGAT GTTCGT GC AGC AAT GCT GCTGCGT GC AA
ATAGCCAC ATGC AT GGT GCAAGCGGT ATT CGTCT GGAACT G ATT AAACGCGCGG AAAT CTTT CTG
AAT GCCGGT GTT ACCCCGT AT GTTT ATG A ATTT GGT AGC ATT GGT GCCAGCGGTG ATCTGGTTCC
GCTGAGCTATATTACCGGTAGCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAGTTGATTTTAATGGCA
A AG A AATGG ACGC ACCG AC CGC ACT G CGT C AGCT G AAT CT G AGT CCGCT GACCCTGCTGCCGAA
AGAAGGTCTGGCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCAGCAAATTGTGTTTAT
GAT ACCCAGATTCT GACCGCAATTGCAAT GGGTGTTCATGC ACT GGATATTCAGGCACTGAAT GG
TACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAGCTGTGGGCAG
C AG ATCAG AT G ATT AGCCT GCT GGCCGGT AGCC AGCT GGTT CGT GAT G A ACTGG AT GGT AA ACA
TGATTATCGTGATGGTGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTTGTCTGCCGCAGTATCTGG
GTCCGATTGTTGATGGTATTAGCCAGATTGCCAAACAAATCGAAATTGAGATTAACAGCGTTACC
GATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCAAGCTATCATGGTGGTAATTTTCTGGGTCAGTA
T GTT GGTATGGGTAT GG ATC ATCTGCGCTATGAAATCGGT CT GCT GGCAAAAC AT CTGGATGTTC
AGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATTTAGCAATGGTCTGCCTCCGAGTCTGGTGGGTAATCGT
G AACGT AAAGTT AAT ATGGGTCT GAAAGGT CTGCAGATTT GC GGTAATAGC ATT AT GCCGCTGCT
GACCTTTTATGGTAATAGTATTGCAGATCGTTTTCCGACCCATGCCGAACAGTTTAACCAGAATA
TT A AC AGCC AGGGTT AT ACC AGCGCA ACCCTGGCACGT CGT AGCGTT GAT ATT GGCC AGA ATT AT
GTT GCC ATTGCCCTGAT GTTT GGTGTTCAGGCAGTT GAT CTGCGT ACCT ACAA A A A A ACCGGTC A
TTATGATGCACGTGCCCAGCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGTATAGCGCAGTTCGTCATGTTG
TT GGTCAGAAAC CGAGCT CAGATCGTCCGTATATTT GGAAT GAT AAT GAACAGGGT CTGGATG A
AC ATATT GC ACGTATT AGT GCAGAT ATT GC AGC CGGT GGT GTT ATTGTT C AGGCCGTTCAGGAC A
TTCTGCCGAACCTGCAT (SEQ ID NO: 19)
Secuencia de polipéptidos de la variante de AvPAL n° 1009 (SEQ ID NO: 20):
M K.TLSQ AQSK.TS SQQFSFT GN S SAN VIÍGN QK.LTIN DV ARV A RNGTLV SLTNNTDILQGI
QASCDYINNAV ESGEPIYG VTSGF GGM ANV VIS REQ AS ELQTN LV W FLKT G AGN KL P LA D VR
AAMLLRANSHMHGASGIRLELDCRAEIFLNAGVTPWYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDP
SFKVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAM
GVH A LDIQ ALNGTNQS F HPFIHN 8 KPH PGQLWA A DQM iS LL AGSQLV RDELDGKH DYRDGE
LIQDRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPL1DVDNQASYHGGNFLGQYVGMGM
DHLRYEIGLLAKHLDVQIALLASPEFSNGLPPSLVGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFY
GN SIA DRFPT H AEQFNQNINSQGYT SATLARRS VDIGQNY VAIALMF G VQ A V DLRT YKKT GH
YDARAQLSPATERLYSAVRHWGQKPSSDRPYIWNDNEQGLDEHIARISADIAAGGVJVQAV
QDILPNLH (SEQ ID NO:20)
Secuencia polinucleotídica de la variante N° 1010 de AvPAL (SEQ ID NO: 21):
ATGAAAACCCTGAGTCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTACCGGCAATA GC AGCGCA A AT GT G ATT ATT GGT A AT C A G A AACTG ACC AT C A ATG AT GTT GCGCGTGTTGCCCGT AATGGCACCCTGGTTAGCCTGACCAATAATACCGATATTCTGCAGGGTATTCAGGCCAGCTGTGA
TTATATCAATAATGCAGTTGAAAGCGGTGAACCGATTTATGGTGTTACCAGCGGTTTTGGTGGTA
TGGCAAATGTTGTAATTAGCCGTGAACAGGCAAGCGAACTGCAGACCAATCTGGTTTGGTTTCTG
AAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCAGATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGCGTGCAA
ATAGCC AC AT GCAT GGT GCAAGCGGT ATT CGT CTGGAACT GATT AAACGC GCGG AAATCTTTCT G
A AT GCCGGT GTT ACCCCGTAT GTTT ATG A ATTT GGT AGC ATTGGT GCCAGCGGT GAT CT GGTTCC
GCT GAGCTATATTACCGGT AGCCT GATTGGCCTGG ACCCGAGCTTT AAAGTT GATTTTAATGGCA
AAGAAATGGACGCACCGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTGCTGCCGAA
AGAAGGTCTGGCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCAGCAAATTGTGTTTAT
G AT ACCC AG ATT CTG AC CGC A ATTGC A ATGGGT GTT CAT GC ACT GG AT ATT C AGGC ACTGAAT GG TACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAGCTGTGGGCAG
CAGATCAGATGATTAGCCTGCTGGCCGGTAGCCAGCTGGTTCGTGATGAACTGGATGGTAAACA
TGATTATCGTGATGGTGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTTGTCTGCCGCAGTATCTGG
GT CCG ATT GTT GAT GGT ATT AGCC AG ATTGCC A AAC A A AT CGA A ATT GAG ATT A AC AGCGTT ACG
GATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCAAGCTATCATGGTGGTAATTTTCTGGGTCAGTA
TGTTGGTATGGGT ATGGATCATCTGCGCTATGAAATCGGTCTGCTGGCAAAACATCTGGATACCC
AGATTGCACTGCTGGCATCACCOGAATTTAGCAATGGTCTGCCTCCGAGTCTGGTGGGTAATCGT
GAACGT AAAGTT AATATGGGTCTGAAAGGTCTGCAGATTTGCGGTAATAGCATTATGCCGCTGCT
GACCTTTTATGGTAATAGTATTGCAGATCGTTTTCCGACCCATGCCGAACAGTTTAACCAGAATA
TTAACAGCC AGGGTTAT ACC AGCGCAACCCTGGCACGT CGT AGCGTT GATATT GGCC AGA ATT AT
GTT GCCATT GCCCT GAT GTTTGGTGTTCAGGCAGTTG AT CTGCGTACCT ACAAAAAAACCGGTCA
TTATGATGCACGTGCCCAGCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGTATAGCGCAGTTCGTCATGTTG
TTGGTCAGAAACCGAGCTCAGATCGTCCGTATATTTGGAATGATAATGAACAGGGTCTGGATGA
ACATATTGCACGTATTAGTGCAGATATTGCAGCCGGTGGTGTTATTGTTCAGGCCGTTCAGGACA
TTCTGCCGA ACCTGC AT (SEQ ID NO: 21)
Secuencia polipeptídica de la variante AvPAL n° 1010 (SEQ ID NO: 22):
MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVARVARNGTLVSLTNNTDILQGI
QASCDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANVVISREQASELQTNLVW FLKTGAGNKLPLADVR
AAMLLRANSHMHGASGIRLELIKRAEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLYPLSYUGSLIGLDP
SFKVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMTNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAM
GVHALDIQALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLAGSQLVRDELDGKHDYRDGE
LIQDRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGOYVGMGM
DHLRYEIGLLAKHLDTQIALLASPEFSNGLPPSLVGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFY
GNSIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIGQNYVAIALMFGVQAVDLR.TYK.KTGH
Y DARAQ LSPATERL Y SAVRH VVGQ KPS SD RPYIWNDN EQGLD E HIARISADIAAGGVTVQAVQDILPNLH (SEQ ID NO:22)
Secuencia polinucleotídica de la variante N° 1084 de AvPAL (SEQ ID NO: 23):
ATGAAAACCCTGAGTCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCCATACCGGCAAT
AGC AGCGCA AAT GT GATT ATT GGT AATC AGA AACT G ACC ATC AAT GAT GTTGT ACGT GTTGCCCG
TAATGGCACCGCGGTTAGCCTGACCAATAATAAAGATATTCTGCAGCGTATTCAGGCCAGCTGT
GATT AT AT CAATAATGCAGTTGAAAAAGGT GAACCGATTTATGGTGTT ACCAGCGGTTTTGGTGG T ATGGC A A ATGTTGT A ATT AGCCGT G A AC AGGC AAGCG A ACTGC AG ACC A ATCT GGTTT GGTTT C
TGAAAACCGGTGCAGGTAATAAACTGCCGCTGGCAGATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGCGTGC
A AAT AGC C AC AT GCGTGGT GCAAGCGGT ATT CGT CTGGAACT G ATT A AACG CAT GG A A AT CTTT
CTGAATGCCGGTGTTACCCCOTATGTTTATOAATTTGGTAGCATTGGTGCCAGCGGTGATCTGGT
TCCGCTGAGCT AT ATTACCGGT AGCCTG ATTGGCCT G GACCCG AGCTTT A A AGTT G ATTTT AAT G
GCAAAGAAATGGACGCACCGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTGCAGCC
GAAAGAAGGTCTGGCAATGATGAATGGCACCAGCGTTATGACCGGTATTGCAGCAAATTGTGTT
TATGATACCCAGATTCTGACCGCAATTGCAATGGGTGTTCATGCACTGGATATTCAGGCACTGAA
TGGTACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAGCTGTGGG
CAGCAGATCAGATGATTAGCCTGCTGGCCGGTAGCCAGCTGGTTCGTGATGAACTGGATGGTAA
ACATGATTATATGGATGGTGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTTGTCTGCCGCAGTATC
T GGGT CC G ATTGTT GAT GGTATTAGC CAG ATT GCCAAACAA AT C GAAATTG AGATTAACAGCGTT
ACCGATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCAAGCTATCATGGTGGTAATTTTCTGGGTCA
GTATGTTGGTATGGGTATGGATCATCTGCGCTATTATATCGGTCTGCTGGCAAAACATCTGGATG
TTCAGATTGCACTGCTGGCATCACCGGAATTTAGCAATGGTCTGCCTCCGAGTCTGGTGGGTAAT
CGTGAACGTAAAGTTAATATGGGTCTGAAAGGTCTGCAGATTTGCGGTAATAGCATTATGCCGCT
GCT G ACCTTTT AT GGT A AT AGTATT GCAG ATCGTTTT C CG ACCCAT GCC G A AC AGTTT AACC AG A
AT ATT A AC AGCC AGGGTTATACC AGCGCAAC CCT GGC ACGT CGTAGCGTT GAT ATTTTTC AG AAT
T AT GTT GCG ATTGCCCT GAT GTTTGGT GTTC AGGC AGTTGATCTGCGTACCT ACAA A A A A AGCGG
TCATTATGATGCACGTGCCCAGCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGTATAGCGCAGTTCGTCATG
TT GTT GGT AAAA AACCGAGCT CAG AT CGT CCGT AT ATTT GG A ATG AT AAT GA ACAGGGTCT GG A
T GAACATATTGCACGTATTAGTGCAGAT ATT GC AGCCGGT GGT GTT ATT GTTCAGGCCGTTCAGG
ACATTCTGCCGCCGCTGCAT
Secuencia de polipéptidos de la variante AvPAL n° 1084 (SEQ ID NO: 24):
MKTLSQAQSKTSSQQFSHTGNSSANVIIGNQKLTINDVVRVARNGTAVSLTNNKDILQRI
QASCDYINNAVEKGEPIYGVTSGFGGMANWISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADV
RAAMLLRANSHMRGASG1RLELIKRMEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSY1TGSLIGLD
PSFKVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLQPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIA
MGVHALDIQALN GTNQSFH PFIHN S K PFTPGQ LWAADQMISLL AGSQLV RDELDGKH DYM D
G ELIQDRY SL RCLPQYLGP! V DGISQIA KQIEIEINS VT DN PLIDVDNQ ASYHGGNFLGQYV GM
GMDHLRYYIGLLAKHLDVQIALLASPEFSNGLPPSLVGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLL
TFYGNSIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDEFQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKK
TGHYDARAQLSPATERLYSAVRHVVGKKPSSDRPYIWNDNEQGLDE HIARISADIAAGGVIVQAVQDILPPLH (SEQ ID NO:24)
Secuencia polinucleotídica de la variante N° 967 de AvPAL (SEQ ID NO: 25):
AT G AAAACCCT G AGT C AGGCAC AG AGC AÁAACC AG C AGCCAGCAGTTT AGCTTT ACCGG
CAATAGCAGCGCAAATGTGATTATTGGTAATCAGAAACTGACCATCAATGATGTTGCGC
GT GTT GCCCGT AAT GGC ACCCT GG TT AGCCT GACC AAT AAT ACCG AT ATT CT GC AGGGT A
TT C AGGC C AGCTGT GATT AT AT C AAT AAT GC AGTT GAAAGC GGT G AACC GATTT AT GGT G
TTACCAGCGGTTTTGGTGGT ATGGCAAAT GTTGT AATT AGCCGT GAACAGGCAAGCGAAC
TGCAGACC AAT CTGGTTT GGTTT CT G AAAACCGGTGCAGGTAATAAACT GCCGCT GGC AG
ATGTTCGTGCAGCAATGCTGCTGCGTGCAAATAGCCACATGCGTGGTGCAAGCGGTATTC
GT CT GGAACT GATT AAACGCGCGGAAATCTTT CT G AAT GC CGGTGTTACCCCGTAT GTTT
ATGAATTT GGT AGC ATT GGTGCCAGCGGT GATCT GGTT CCGCT GAGCTAT ATT ACCGGTA
GCCTGATTGGCCTGGACCCGAGCTTTAAAGTTGATTTTAATGGCAAAGAAATGGACGCAC
CGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTGCTGCCGAAAGAAGGTCTG
GC AAT GATGAAT GGC ACC AGC GTT AT GACCGGT ATT GCAGC AAATTGT GTTT AT G AT ACC
CAG ATTCT GACCGC AATTGCAAT GGGT GTTC AT GC ACT GG AT ATT C AGGC ACTGAAT GGT
ACAAAT CAG AGCTTT CATCCGTTTATCCAT AAC AGCAAACCGCATCCGGGT CAGCT GTGG
GC AGCAG AT CAG AT GATT AGCCT GCT GGCCGGTAGCCAGCT GGTTCGT G ATG AACT GGA
TGGTAAACATGATTATCGTGATGGTGAACTGATCCAGGATCGTTATAGCCTGCGTTGTCT
GCCGCAGTATCTGGGTCCGATTGTTGATGGTATTAGCCAGATTGCCAAACAAATCGAAAT
TGAGATTAACAGCGTTACCGATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCAAGCTATCA
TGGTGGTAATTTTCTGGGTCAGTATGTTGGTATGGGTATGGATCATCTGCGCTATTATATC
GGT GGCCT GGCAA A AC ATCT GGAT GTTC AGATT GCACTGCT GGCATC ACCGGA ATTT AGC
AAT GGT CTGCCT CCGAGTCTGGT GGGTA ATCGT GA ACGTAA AGTT A ATAT GGGT CTG A A A
GGT CT GCAGATTT GCGGTAATAGCATTATGCCGCTGCTGACCTTTTATGGT AAT AGT ATT
GCAGATCGTTTTCCGACCCATGCCGAACAGTTTAACCAGAATATTAACAGCCAGGGTTAT
ACC AGCGC A ACCCT GGC ACGT CGT AGCGTT G AT ATT GGCC AGA ATT AT GTT GCC ATT GCC
CTGATGTTTGGTGTTCAGGCAGTTGATCTGCGTACCTACAAAAAAACCGGTCATTATGAT
GCACGTGCCCAGCTGTCACCGGCAACCGAACGTCTGTATAGCGCAGTTCGTCATGTTGTT
GGTCAGAAACCGAGCTCAGATCGTCCGTATATTTGGAATGATAATGAACAGGGTCTGGA
TGAACATATT GCACGTATT AGTGCAGAT ATTGC AGCCGGT GGTGTT ATTGTT CAGGCCGT
TCAGGACATTCTGCCGAACCTGCAT (SEQ ID NO:25)
Secuencia polipeptídica de la variante N° 967 (SEQ ID NO: 26):
MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVARVARNGTLVSLTNNTDILQGIQAS
CDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANWISREQASELQTNLVWFLK.TGAGNKLPLADVRAA
MLLRANSHMRGASGIRLELIKRAEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSFK
VDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQ1LTAIAMGVH
ALDIQALNGTNQSFHPFIH'NSKPHPGGLWAADQMISLLAGSQLVRDELDGKHDYRDGELIQD
RYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDHL
RYYIGGLAKHLDVQIALLASPEFSNGLPPSLVGNRERKVNVIGLKGLQ1CGNSIMPLLTFYGNS
IADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIGQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHYDA
RAQLSP ATERLYS A V R H W GQKPS SDRPYIWNDNEQG LDE HIARISADIAAGGVIVQAVQDILPNLH (SEQ ID NO:26)
Vector de expresión pCK100900i:
TGGCCACCATCACCATCACCATTAGGGAAGAGCAGATGGGCAAGCTTGACCTGTGAAGT GAAAAATGGCGCACATTGTGCGACATTTTTTTTTGAATTCTACGTAAAAAGCAGCCGATA C A I CGGCT GCTTTTTTTTT GNNN G AGGTT CC A ACTT GT GGT AT A AT G A A AT AAG AT C ACT CCGGAGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAGGAACTAAAATGGA GAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTT T GAGGC ATTTC AGT C AGTTGCT CAAT GT ACCTAT AACCAGACCGTTC AGCT GGAT ATT AC GGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGITTTATCCGGCCTTTATTCACAT T CTTG CCCGCCT GAT GAAT GCT C AT C CGG AGTT CCGTAT GGC AAT G AAAG ACGGT GAGCT GGT GAT AT GG G AT AGTGTT CACCCTT GTT AC ACCGTTTT CC AT GAGC AAACT G AAACGTT TTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCA AGAT GT GGCGT GTT ACGGT GAAAACCT GGCCT ATTT CCCTAAAGGGTTT ATT GAG AAT AT GTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAAT AT GGAC AACTT CTTCGCCCCCGTTTT CACC AT GGGCAAAT ATT AT ACGC AAGGCG AC AAG GT GCT GAT GCCGCT GGCGATT CAGGTTCAT CAT GCCGT CTGT GAT GGCTTCC ATGTCGGC AGAAT GCTT AAT GAATTACAACAGTACTGCGATGAGT GGCAGGGCGGGGCGT AACT GCA TTGCTCTGAAAACGAAAAAACCGCCTTGCAGGGCGGTTTTICGAAGGTTCTCTGAGCTAC C A ACTCTTTG A ACCG AGGT A ACTGGCTT GGAGGAGCGCAGT CACC A AA ACTT GT CCTTTC AGTTTAGCCTTAACCGGCGCATGACTTCAAGACTAACTCCTCTAAATCAATTACCAGTGG CTGCTGCCAGTGGTGCTTTTGCATGTCTTTCCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTIACCGG ATAAGGCGCAGCGGTCGGACTGAACGGGGGGTTCGTGCATACAGTCCAGCTTGGAGCGA ACTGCCTACCCGGAACTGAGTGTCAGGCGTGGAATGAGACAAACGCGGCCATAACAGCG GAATGACACCGGTAAACCGAAAGGCAGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCCGCCAGG GGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCACTGATTTGAGCGTCA G ATTT CGT GATGCTT GT C AGGGGGGCGGAGCCT AT GGAA A AACGGCTTT GCCGCGGCCCT CTCACTTCCCTGTTAAGTATCTTCCTGGCATCTTCCAGGAAATCTCCGCCCCGTTCGTAAG CCATTTCCGCTCGCCGCAGTCGAACGACCGAGCGT AGCGAGT CAGT GAGCGAGGAAGCG GAAT AT ATCCTGTAT CACAT ATT CT GCT G ACGCACCGGTGC AGCCTITTTTCTCCT GCC AC ATGAAGCACTTCACTGACACCCTCATCAGTGAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTA GGCCT ATGGCCTTTTTTTTTTNT GNNAAACCTTTCGCGGT AT GGNATNAN AGCGCC CGG A AGAGAGTCAATTAAGAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGA GT AT GCCGGT GT CTCTT ATC AGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACC AGGCC AGCC ACGTTTC TGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACC GCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTC TGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGG GTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCG GT GCACAAT CTTCTCGCGCAACGCGT CAGT GGGCT GATCATTAACTATCCGCT GGATGAC CAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCT CTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCG T GG AGC AT CT GGT CGCATTGGGT C ACC AGC AAAT CGCGCT GTT AGCGGGCCC ATTAAGTT CTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCT GGCT G GCAT AAAT AT CTC ACT CGC A AT C AAATT C AGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATG CAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGC GCT GGGCGCAAT GCGCGCC ATT AGCGAGT CCGGGCT GCGCGTT GGTGCGGACATCT CGGT AGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCA AACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGG GCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACC CT GGCGCCC AAT ACGC AAACCGCCT CT CCCCGCGCGTT GGCCG ATT C ATT A AT GCAGCT G GC ACG AC AG GTTTCCCG ACT GG AAAGC GGGC AGT G AGCGGT ACCCG AT AAAAGCGGCTT C CT G AC AGG AGGCCGTTTT GTTT CTCGAGTT A ATT AAGGC AGT G AGCGC A ACGCA ATT A A T GT G AGTT AGCT CACTC ATT AGGC ACCCC AGGCTTT ACACTTT AT GCTT CCGGCT CGT AT G TTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC GGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAATCTAGAGGCCAGCCTGGCCATAAGGAGATATACAT AT GGGCCAT CATC ATCAT C AT C AT C AT C ATCATCACAGCAGCGGCC ATAT CG AAGGTCGT CATATGAAAACCCTGAGCCAGGCACAGAGCAAAACCAGCAGCCAGCAGTTTAGCTTTAC CGGC AAT AGC AGCGC AAATGT GATTATT GGT AATCAGA AACTGACCATC AATGAT GTT G CACGTGTTGCCCGTAATGGCACCCTGGTTAGCCTGACCAATAATACCGATATTCTGCAGG GT ATTCAGGCCAGCTGT GATT AT ATCAATAATGCAGTTGAAAGCGGT GAACCGATTT ATG GT GTT ACCAGCGGTTTTGGT GGT ATGGC AAATGTTGC AATTAGCCGT GAACAGGC AAGCG AACT GC AGACC AAT CTGGTTT GGTTT CTG AAAACCGGT GC AGGT AAT AAACT GCCGCT GG C AG AT GTTC GT GCAGCAAT GCT GCT GCGT GCAAAT AGCC AC ATGCGT GGT GCAAGC GGT ATT CGTCT GG AACT GATT AAACGC AT GG AAAT CTTTCT G AATGCCGGTGTT ACCCCGT AT GTTT AT GAATTT GGT AGCATT GGTGCC AGCGGT GAT CTGGTTCCGCTGAGCT AT ATT ACC GGT AGCCTGATT GGCCT GGACCCGAGCTTTAAAGTTGATTTT AATGGCAAAGAAATGGAC GCACCGACCGCACTGCGTCAGCTGAATCTGAGTCCGCTGACCCTGCTGCCGAAAGAAGG T CTGGC AAT GAT GAATGGC AC CAGCGTT AT GACCGGT ATT GC AGC AAATT GT GTTT AT GA TACCC AGATT CTG ACCGCAATT GCAAT GGGTGTT C ATGCACTGGATATT CAGGCACTGAA TGGTACAAATCAGAGCTTTCATCCGTTTATCCATAACAGCAAACCGCATCCGGGTCAGCT GT GGGC AGC AG ATC AGAT GATT AGCCT GCT GGCC AAT AGCCAGCT GGTT CGTG AT G AAC T GGATGGT AA AC AT GATT AT CGT GAT C AT GA ACT GATCC AGGATCGTT AT AGCCT GC GTT GT CT GCCGC AG T AT CTGGGT CCG ATT GTT G ATGGT ATT AGC CAGATT GCC A A ACA A ATCG AAATTGAGATTAACAGCGTTACCGATAACCCGCTGATTGATGTTGATAATCAGGCAAGCT ATCATGGTGGTAATTTTCTGGGTCAGTATGTTGGTATGGGTATGGATCATCTGCGCTATTA
T AT CGGTCT GCT GGCAAAACAT CT GG AT GTT CAGATT GCACTGCTGGCATC ACCGGAATT
TAGCAATGGTCTGCCTCCGAGTCTGCTGGGTAATCGTGAACGTAAAGTTAATATGGGTCT
GAAAGGTCTGCAGATTTGCGGTAATAGCATTATGCCGCTGCTGACCTTTTATGGTAATAG
TATT GCAG AT CGTTTTCCGACCCAT GCCGAACAGTTTAACCAG AAT ATTAACAGCCAGGG TTATACCAGCGCAACCCTGGCACGTCGTAGCGTTGATATTTTTCAGAATTATGTTGCCATT
GCCCT G AT GTTT GGTGTT C AGGC AGTT GAT CT GC GT ACCT AC AAAAAAACCGGT C ATT AT
GATGC ACGT GCCTGTCT GTC ACCGGC AACCGAACGT CT GT AT AGCGCAGTT CGT CAT GTT
GTT GGT C AGA A ACCG ACCT C AGATCGT CCGT AT ATTT GG A AT GAT AATGAAC AGGGT CTG
GAT GAACAT ATTGC ACGT ATT AGTGC AGAT ATT GCAGCCGGT GGT GTTATTGTT CAGGCC
GTT CAGG ACATT CTGCCGT GT CT GC ATT A AGGCC AA AC (SEQ ID NO:27)
EJEMPLO 1
Adquisición de genes PAL y construcción de vectores de expresión
Anabaena variabilis fenilalanina amoniaco-liasa (AvPAL) de ADN plasmídico se obtuvo y un gen sintético que codifica AvPAL fue codón optimizado para la expresión en E. coli y se clonó en el E. coli vector de expresión pET16b para proporcionar pET16b-AvPAL (SEQ ID No : 1). El marco de lectura abierto AvPAL (SEQ ID nO: 2) se amplificó mediante PCR utilizando los oligonucleótidos: PAL-pCK-F y PAL-pCK-R y se subclonó en el vector de expresión pCK100900i (SEQ ID NO: 27).
Figure imgf000059_0001
Esta construcción de plásmido se transformó en una Cepa de E. coli derivada de W3110. Se utilizaron técnicas de evolución dirigida generalmente conocidas por los expertos en la técnica para generar bibliotecas de variantes de genes a partir de esta construcción de plásmido (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 8,383,346 y WO2010/144103).
EJEMPLO 2
Crecimiento de alto rendimiento (HTP) y ensayos
Crecimiento de alto rendimiento (HTP) de PAL y variantes de PAL
Las células de E. coli transformadas se seleccionaron colocando placas en placas de agar LB que contenían un 1% de glucosa y 30 pg/ml de cloranfenicol. Después de la incubación durante la noche a 37°C, las colonias fueron colocadas en NUNCTM (Thermo-Scientific) los pocillos de placas de 96 pocillos de fondo plano poco profundo se llenaron de 180 pl/pocillo LB suplementado con 1% de glucosa y 30 pg/ml cloramfenicol. Los cultivos se dejaron crecer durante la noche durante 18-20 horas en un agitador (200 rpm, 30°C y 85% de humedad relativa; Kuhner). Muestras de crecimiento durante la noche (20 pL) se transfirieron a Costar placas de 96 pocillos profundos llenos de 380 pL de Terrific Broth suplementado con 30 pg/ml de cloranfenicol. Las placas se incubaron durante 135 minutos en un agitador (250 rpm, 30°C y 85% de humedad relativa; Kuhner). Luego se indujeron las células con 40 ml de IPTG 10 mM en agua estéril y se incubaron durante la noche durante 20-24 horas en un agitador (250 rpm, 30°C y 85% de humedad relativa; Kuhner). Se combinaron dos cultivos replicados, se sedimentaron las células (4000 rpm x 20 min), se descartaron los sobrenadantes y se congelaron las células a -80°C antes del análisis.
Lisis de gránulos HTP
En primer lugar, 500 pl de tampón de lisis (Tris 20 mM, pH 7,5, MgSO41 mM, 1 mg/ml de lisozima y 0,5 mg/ml de sulfato de polimixina B) se añadieron a los sedimentos celulares. La mezcla se agitó durante 1,5 h a temperatura ambiente y se sedimentó (4000 rpm x 5 min) antes del uso de los lisados clarificados en los diversos ensayos de HTP descritos en el presente documento. El análisis de estos lisados por SDS-PAGE reveló la presencia de una proteína sobreexpresada en un MW aparente de ~ 60 kDa, consistente con el MW esperado de PAL.
Análisis de lisados clarificados
La actividad de la variante de PAL se determinó midiendo la formación de ácido cinámico como se determina por el cambio en la absorbancia a 290 nm a lo largo del tiempo. Para este ensayo, se agregaron a los pozos de 100 |jl de Tris 200 mM/fenilalanina 50 mM, pH 7,5 o fosfato de sodio 200 mM/fenilalanina 50 mM pH 7,0, 80 j l de agua y 20 j l de lisado clarificado. Placa de 96 pocillos de poli-acrilato (Costar # 3635, Corning). Las reacciones se mezclaron brevemente y la actividad se determinó rastreando la absorbancia a 290 nm a lo largo del tiempo (cada 12-20s durante 5-20 min) utilizando un SpectraMax® Plus384 o un lector de microplacas absorbente SpectraMax® 190 (Molecular Devices).
Análisis HTP de lisados clarificados pretratados con proteasa
Las variantes de PAL fueron estimuladas con quimotripsina y tripsina para simular el ambiente del intestino inferior. Primero, 30 jL de la mezcla de proteasa (0,01 - 100 mg/ml de quimotripsina (C4129 Sigma Aldrich), 0,01 -100 mg/ml de tripsina (T7409 Sigma Aldrich), 1 mM CaCh y 1 mM HCl), 0- 30 jL a taurocolato sódico 20 mM en fosfato sódico 500 mM, pH 7,0, y se agregaron 90 -120 j l de lisado clarificado a los pocillos de una placa de fondo redondo de 96 pocillos (Costar # 3798, Corning). Las placas se sellaron e incubaron a 37°C, 400 rpm, 1 pulgada durante 1 hora antes del análisis. Para el ensayo, 100 jL de Tris 200 mM/fenilalanina 50 mM pH 7,5 o fosfato de sodio 200 mM/fenilalanina 50 mM pH 7,0 y 100 ml del lisado tratado con proteasa se agregaron a los pocillos de una placa de poli-acrilato de 96 pocillos (Costar # 3635, Corning). Las reacciones se mezclaron brevemente y la actividad se determinó siguiendo la absorbancia a 290 nm a lo largo del tiempo (cada 12-20s durante 5-20 min) utilizando un lector de microplacas de absorbancia SpectraMax® Plus384 o SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Los resultados se proporcionan en las siguientes tablas.
Análisis HTP de lisados clarificados pretratados con ácido
En este ensayo, las variantes PAL fueron desafiadas en condiciones ácidas, con el fin de simular el ambiente del estómago. Primero, se agregaron 20 j l de citrato de sodio 1 M (pH 3,7-4,5) y 30 j l de agua o 50 j l de citrato de sodio 400 mM, pH 3,7-4,8, y 50 j l de lisado clarificado a la placa de fondo redondo de 96 pocillos (Costar # 3798, Corning). La placa se selló e incubó a 37°C, 400 rpm, 1" tiro durante 1 hora antes del análisis. Para el ensayo, 100 jL de Tris 200 mM, fenilalanina 50 mM pH 7,5 y 80 jL Tris 1M pH 7,5 o fosfato de sodio 200 mM/fenilalanina 50 mM, pH 7,0 y 80 jL de fosfato de sodio 1,0 M, pH 7,0, y 20 jL del lisado tratado con ácido se agregaron a los pocillos de una placa de 96 pocillos de poli-acrilato (Costar # 3635, Corning). Las reacciones se mezclaron brevemente y la actividad se determinó siguiendo la absorbancia a 290 nm a lo largo del tiempo (cada 12-20 s durante 5-20 min) utilizando un SpectraMax® Plus384 o un lector de microplacas de absorbancia SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Los resultados se proporcionan en las siguientes tablas.
Análisis HTP de lisados clarificados pretratados con pepsina
En los ensayos adicionales, las variantes PAL son desafiadas con condiciones ácidas y pepsina para poner a prueba aún más las variantes en condiciones que imitan el entorno gástrico. Primero, se agregan 50 j l de 0,01­ 100 mg/ml de pepsina en citrato de sodio 400 mM, pH 1,5-4, y 50 j l de lisado clarificado a los pocillos de una placa de fondo redondo de 96 pocillos (Costar # 3798, Corning). La placa se sella y se incuba a 37°C, 400 rpm, 1” durante 1 a 12 h antes del análisis. Para el ensayo, 100 jL de Tris 200 mM/fenilalanina 50 mM pH 7,5 y 80 jL Tris 1M pH Se añaden 7,5 o 200 mM de fosfato de sodio/fenilalanina 50 mM a pH 7,0 y 20 j l de lisado tratado con ácido a los pocillos de una placa de 96 pocillos de poliacrilato (Costar # 3635, Corning). Las reacciones se mezclan brevemente. y la actividad se determina al rastrear la absorbancia a 290 nm a lo largo del tiempo (cada 12-20s durante 5-20 min) utilizando un lector de microplacas de absorbancia SpectraMax® Plus384 o SpectraMax® 190 (Molecular Devices).
Figure imgf000061_0001
Figure imgf000062_0001
Figure imgf000062_0002
Figure imgf000063_0001
Figure imgf000063_0002
(Continuado)
Figure imgf000064_0001
(Continuado)
Figure imgf000065_0001
EJEMPLO 3
Ensayos para determinar la agregación de proteínas de las variantes de PAL
La propensión de las variantes PAL a agregarse se determina usando la proteína ProteoStat® Protein Aggregation Assay kit (Enzo), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, la PAL purificada a 0­ 100 |jm se mezcla con el reactivo de detección ProteoStat® (1: 2000) y se analiza mediante citometría de flujo. Las muestras se evalúan para determinar la fluorescencia, de acuerdo con los estándares de agregación ProteoStat®, como se conoce en la técnica (ver, por ejemplo, Bershtein et al., Mol.Cell, 133-144 [2013]).
EJEMPLO 4
Lisados liofilizados de cultivos de frasco de agitación (SF)
Cultivos HTP seleccionados cultivados como se describe anteriormente se sembraron en placas de agar LB con 1% de glucosa y 30 jg/ml de cloranfenicol y se cultivó durante la noche a 37°C. Se transfirió una única colonia de cada cultivo a 50 ml de LB con 1% de glucosa y 30 jg/ml de cloranfenicol. Los cultivos se hicieron crecer durante 18 horas a 30°C, 250 rpm, y se subcultivaron a una dilución de aproximadamente 1:10 en 250 ml de Terrific Broth con 30 jg/ml de cloranfenicol, hasta una OD600 final de 0,2, Los cultivos se incubaron durante 135 minutos a 30°C, 250 rpm, a una OD600 de 0,6 y se indujeron con 1 mM de IPTG. Los cultivos inducidos se incubaron durante 20 horas a 30°C, 250 rpm. Después de este período de incubación, los cultivos se centrifugaron a 4000 rpm x 10 min. El sobrenadante se descartó y los sedimentos se resuspendieron en 30 ml de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5. Las células se sedimentaron (4000 rpm x 10 min), se resuspendieron en 12 ml de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, y se lisaron utilizando un sistema de interrupción de células One Shot (Constant Systems) a 17.000 psi. El lisado se sedimentó (10.000 rpm x 30 min) y el sobrenadante se congeló y se liofilizó para generar un polvo que contenía enzimas.
Purificación de PAL de cultivos de frasco de agitación
La variante PAL N° 42 se hizo crecer en cultivos de matraz agitado hasta saturación, como se describe anteriormente. Los cultivos saturados se sedimentaron por centrifugación (4000 rpm x 20 min) y los sedimentos celulares se almacenaron a -80°C antes de la purificación. Los sedimentos celulares se descongelaron a
Figure imgf000066_0001
D e s p u é s d e la f i lt ra c ió n , e l lis a d o re s u lta n te se c a le n tó a 70 -85 °C d u ra n te 1 ,5 -2 h o ra s en p re s e n c ia o a u s e n c ia d e P h e 10 m M . E l l is a d o se re t iró d e l c a lo r y s e a c la ró m e d ia n te c e n tr ifu g a c ió n a 10.000 rp m a 4 °C d u ra n te 1 h o ra . E l s o b re n a d a n te q u e c o n te n ía P A L s o lu b le se f ilt ró lu e g o a t ra v é s d e un f i lt ro P E S d e 0 ,2 j m a n te s d e c a rg a r lo e n u n a c o lu m n a d e c ro m a to g ra fía .
E l l is a d o f i lt ra d o tra ta d o té rm ic a m e n te , q u e c o n t ie n e 80 -100 m g d e p ro te ín a to ta l, se d ilu y ó d o s v e c e s u t il iz a n d o T r is 25 m M , pH 8 co n 1 ,2 M d e s u lfa to d e a m o n io . La m u e s tra s e c a rg ó e n u n a c o lu m n a H iP re p 16 /10 F e n il F F (h i s u b ) (G E H e a lth c a re ) p re v ia m e n te e q u ilib ra d a c o n T r is 25 m M , pH 8 c o n s u lfa to a m ó n ic o 0 ,6 M . D e s p u é s d e c a rg a r la m u e s tra , la c o lu m n a se la v ó co n t re s v o lú m e n e s d e c o lu m n a d e l m is m o ta m p ó n , s e g u id o d e un g ra d ie n te lin e a l d e s u lfa to d e a m o n io 0 ,6 M - 0 M en T r is 25 m M , pH 8 p a ra un v o lu m e n d e c o lu m n a . P A L u n id a f irm e m e n te se e lu y ó d e la c o lu m n a u s a n d o u n a e lu c ió n is o c rá t ic a c o n T r is 25 m M , pH 8 p a ra t re s v o lú m e n e s de c o lu m n a . L a s f ra c c io n e s q u e c o n te n ía n P A L a c t iv o y p u ra s e a g ru p a ro n .
P A L p u r if ic a d o d e la c o lu m n a d e fe n il e ra un in te rc a m b io d e ta m p ó n e n 0 ,5 M T ris , pH 8 ,5 y s e c o n c e n tró . E l P A L c o n c e n tra d o s e a n a liz ó m e d ia n te S D S -P A G E y s e e n c o n tró q u e e s ta b a p re s e n te e n u n a b a n d a a ~ 60 kD a . L a s m u e s tra s P A L p u r if ic a d a s se f i lt ra ro n u t il iz a n d o un f i lt r o P E S d e 0 ,45 m y se a lm a c e n a ro n a -80 ° C h a s ta q u e e s tu v ie ro n lis ta s p a ra su u so .
Ejemplo 5
Caracterización de PAL purificada y variantes PAL
E n e s te e je m p lo , s e d e s c r ib e n e n s a y o s re a liz a d o s p a ra c a ra c te r iz a r P A L d e t ip o s ilv e s tre y v a r ia n te s .
Tolerancia al nH ácido:
L o s p o lv o s l io f i l iz a d o s q u e c o n te n ía n v a r ia n te s d e P A L s e d is o lv ie ro n a 2 g /l e n fo s fa to d e s o d io 20 m M , pH 7.0 , L u e g o , 50 m l d e la s s o lu c io n e s d e e n z im a s se m e z c la ro n co n 50 m l d e á c id o c ítr ic o 400 m M (p H 4 ,0 -5 ,2 ) o fo s fa to d e s o d io 100 m M y la s re a c c io n e s se in c u b a ro n a 37 °C d u ra n te 1 h o ra a 400 rp m (1 "). L u e g o , 20 m l d e la s o lu c ió n se m e z c la ro n b re v e m e n te c o n 80 m l d e fo s fa to d e s o d io 1 M , pH 7 ,0 y 100 m l d e T r is 200 m M /fe n ila la n in a 50 m M , pH 7 ,5 , L a a c t iv id a d e n z im á t ic a e n c o n d ic io n e s á c id a s s e d e te rm in ó s ig u ie n d o la a b s o rb a n c ia a 290 °C . n m a lo la rg o d e l t ie m p o (c a d a 12 -20 s d u ra n te 5 -20 m in ) u t i l iz a n d o un le c to r d e m ic ro p la c a s d e a b s o rb a n c ia S p e c tra M a x ® P lu s 384 o S p e c tra M a x ® 190 (M o le c u la r D e v ic e s ) . L o s re s u lta d o s se m u e s tra n en la F ig u ra 2. C o m o s e in d ic a e n la F ig u ra 2 , V a r ia n te N os 30 y 36 m a n tu v ie ro n m á s a c tiv id a d d e s p u é s d e s e r in c u b a d o s a p H d e a p ro x im a d a m e n te 4 a 4 ,8 , e n c o m p a ra c ió n c o n e l P A L d e t ip o s ilv e s tre .
Determinación de K m :
P a ra e v a lu a r si la s m u ta c io n e s en las v a r ia n te s P A L h a b ía n a lte ra d o la a f in id a d d e la s v a r ia n te s P A L p a ra fe n ila la n in a , se d e te rm in ó la c o n s ta n te d e M ic h a e lis p a ra la e n z im a d e t ip o s i lv e s tre y la V a r ia n te 36 , P r im e ro , se a g re g a ro n 100 j L d e 15 jg / m l P A L en T r is 100 m M , pH 8 ,0 y 100 j L d e fe n ila la n in a 0 -32 m M e n T r is 100 m M , pH 8.0 , a lo s p o c illo s d e u n a P la c a d e a c r i la to d e 96 p o c illo s (C o s ta r # 3625 , C o rn in g ) . La re a c c ió n se m e z c ló b re v e m e n te y la s v e lo c id a d e s in ic ia le s s e d e te rm in a ro n s ig u ie n d o la a b s o rb a n c ia a 290 n m a lo la rg o d e l t ie m p o (c a d a 12 -20 s d u ra n te 5 -20 m in ) u t i l iz a n d o un S p e c tra M a x ® P lu s 384 o un S p e c tra M a x ® 190 (M o le c u la r D e v ic e s ) le c to r d e m ic ro p la c a s d e a b s o rb a n c ia . L a K m p a ra c a d a v a r ia n te P A L e n s a y a d a se d e te rm in ó a ju s ta n d o lo s d a to s a un d ia g ra m a d e L in e w e a v e r -B u rk e , c o m o s e c o n o c e e n la té c n ic a . L o s re s u lta d o s s e m u e s tra n e n la F ig u ra 3. C o m o se m u e s tra , la K m fu e d e 74 j m p a ra la e n z im a d e t ip o s ilv e s tre y 60 j m p a ra la V a r ia n te 36.
Especificidad de aminoácidos:
A lg u n a s lia s a s fe n ila la n in a a m o n ía c o d e m u e s tra n a c t iv id a d c o n tra la t ir o s in a y /o h is t id in a a d e m á s de fe n ila la n in a . P a ra e v a lu a r s i la s m u ta c io n e s p re s e n te s e n la s v a r ia n te s d e P A L h a b ía n a lte ra d o la e s p e c if ic id a d de la s v a r ia n te s d e P A L p a ra la fe n ila la n in a , s e e v a lu a ro n la s a c t iv id a d e s d e la e n z im a d e t ip o s ilv e s tre y la V a r ia n te 36 e n e s to s t r e s a m in o á c id o s . P r im e ro , s e a g re g a ro n a lo s p o c il lo s 100 j l d e 5 g /l d e p o lv o lio f i l iz a d o q u e c o n t ie n e P A L e n fo s fa to d e s o d io 10 m M , pH 7 ,0 , y 100 j l d e fe n ila la n in a o h is t id in a 50 m M o t iro s in a 2 ,5 m M en fo s fa to d e s o d io 200 m M a pH 7 ,5 u n a p la c a d e p o li-a c r ila to d e 96 p o c illo s (C o s ta r # 3635 , C o rn in g ) . L a s s o lu c io n e s se m e z c la ro n b re v e m e n te y la s ta s a s in ic ia le s se d e te rm in a ro n s ig u ie n d o la a b s o rb a n c ia a 290 n m a lo la rg o d e l t ie m p o (c a d a 12 ­ 20 s e g u n d o s d u ra n te 5 -20 m in u to s ) u t i l iz a n d o un S p e c tra M a x ® P lu s 384 o un S p e c tra M a x ® 190 (M o le c u la r D e v ic e s ) le c to r d e m ic ro p la c a s d e a b s o rb a n c ia . L o s re s u lta d o s s e m u e s tra n en la F ig u ra 4 , C o m o s e in d ic ó , no se o b s e rv ó a c t iv id a d d e te c ta b le p a ra la e n z im a W T o la V a r ia n te N ° 36 co n h is t id in a o t iro s in a , lo q u e in d ic a q u e e s ta s e n z im a s son específicas para la fenilalanina.
Resistencia a las proteasas porcinas y bovinas:
Las muestras de la variante de PAL preparadas como se describe en el Ejemplo 4, se disolvieron a 2 g/l en fosfato de sodio 100 mM, pH 7,0, La tripsina porcina y la quimotripsina bovina (100 mg cada una) se disolvieron en 2 |jl de fosfato de sodio 100 mM, pH 7,0, y se diluyeron en serie dos veces once veces en fosfato de sodio 100 mM. Luego, se mezclaron 80 j l de las soluciones de enzimas de la variante PAL con 20 j l de la solución de tripsina y quimotripsina. Las mezclas de reacción se incubaron a 37°C durante 1 hora a 400 rpm (1" tiro). Luego, se mezclaron 20 j l de reacción con 80 j l de agua y 100 j l de fosfato de sodio 100 mM, fenilalanina 50 mM pH 7,0, Cada solución se mezcló brevemente y la actividad se determinó siguiendo la absorbancia a 290 nm a lo largo del tiempo (cada 12-20s durante 5-20 min) utilizando una microplaca de absorbancia SpectraMax® Plus384 o SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Los resultados se muestran en la Figura 2. Como se indica en esta Figura, todas las variantes ensayadas mostraron una mejor resistencia a la proteasa, en comparación con la PAL de tipo silvestre, siendo la Variante N° 36 la más estable frente a la proteólisis.
Resistencia a las proteasas humanas:
Como se describió anteriormente, algunos evolucionaron variantes PAL se cribaron contra tripsina porcina y quimotripsina bovina para evaluar su resistencia a la proteolisis por las enzimas presentes en el tracto gastrointestinal. Algunas de las variantes de PAL evolucionadas también se ensayaron utilizando enzimas humanas, para confirmar que son resistentes a los homólogos humanos de las enzimas porcinas o bovinas. En estos ensayos, se incubaron polvos liofilizados de WT PAL y Variante N° 36 (2,4 g/L en fosfato de sodio 100 mM, pH 7,0) con quimotripsina humana (Athens Research) 0-80 unidades BTEE/ml o tripsina humana (ProSpec) (0-10.000 unidades BAEE/ml) a 37°C durante 2 h. Luego, se agregaron 100 j l de las mezclas a los pocillos de una placa de poli (acrilato) de 96 pocillos (Costar # 3635, Corning), seguido de la adición de 100 j l de fenilalanina 50 mM, fosfato de sodio 200 mM, pH 7,0, La solución se mezcló brevemente y las velocidades iniciales se determinaron siguiendo la absorbancia a 290 nm a lo largo del tiempo (cada 12-20s durante 5-20 min) utilizando un lector de microplacas de absorbancia SpectraMax® Plus384 o SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Los resultados se muestran en la Figura 5. Como se muestra en la Figura 5, la Variante N° 36 era más estable que la enzima PAL de tipo silvestre.
Resistencia al extracto pancreático crudo:
También se ensayaron Las variantes PAL evolucionado para determinar su resistencia a las enzimas pancreáticas. Polvos liofilizados de WT PAL, Variante N° 36, Variante N° 42 y Variante N° 43 Polvos liofilizados (preparados como se describe en el Ejemplo 4; 12 g/L en fosfato de potasio 50 mM, pH 6,8) se mezclaron 1: 1 con porcino pancreatina (4x Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e incubada a 37°C con agitación (400 rpm, 1” tiro) durante hasta 23 h. En los puntos de tiempo indicados, una alícuota de 10 jL de las reacciones se añadió a 190 j l de fenilalanina 50 mM, fosfato de sodio 190 mM, pH 7,0, en los pocillos de una placa de 96 pocillos de poliacrilato (Costar # 3635, Corning).La reacción se mezcló brevemente y las tasas iniciales se determinaron por seguimiento la absorbancia a 290 nm a lo largo del tiempo (cada 12-20s durante 5-20 min) usando un SpectraMax® Plus384 o un SpectraMax® 190 (Molecular Devices) lector de microplacas de absorbancia. Los resultados se muestran en la Figura 6, Como se muestra en la Figura 6 La variante N° 36, la variante N° 42 y la variante N° 43 mostraron una estabilidad significativa en estas condiciones de ensayo, en comparación con la enzima PAL de tipo silvestre.
Impacto de los detergentes intestinales:
Las variantes PAL evolucionadas también se ensayaron para su susceptibilidad a la proteolisis en la presencia o ausencia de los ácidos biliares intestinales y ácidos grasos, para evaluar si estos ácidos impacto que su estabilidad. Los polvos liofilizados que contenían la Variante N° 36 (preparados como se describe en el Ejemplo 4) se disolvieron a 50 jg/ml en taurocolato sódico 0-16 mM, fosfato sódico 100 mM, pH 7,0, La tripsina porcina y la quimotripsina bovina (80 mg cada una) se disolvieron en 2 j l de fosfato de sodio 100 mM, pH 7,0, y se diluyeron en serie 2 veces once veces en fosfato de sodio 100 mM. Para el ensayo, 50 jL de las soluciones PAL se mezclaron con 50 jL de la solución de proteasa. Las mezclas se incubaron a 37°C durante 1 hora a 400 rpm (1” tiro). Luego, se mezclaron 50 j l de las mezclas con 150 j l de fosfato de sodio 200 mM, fenilalanina 50 mM pH 7,0. Cada reacción se mezcló brevemente, y la actividad se determinó siguiendo la absorbancia a 290 nm a lo largo del tiempo (cada 12-20s durante 5-20 min) utilizando un lector de microplacas SpectraMax® Plus384 o SpectraMax® 190 (Molecular Devices). Los resultados se muestran en Figura 7. Como se muestra en esta Figura, el taurocolato sódico adicional aumenta la susceptibilidad de la Variante N° 36 a la proteólisis.
EJEMPLO 6
Estabilidad intestinal de variante PAL
Para evaluar la estabilidad y la actividad de PAL variantes ya que el tránsito a través de una tripa animal, los ratones fueron sometidos a sonda gástrica con variantes de la enzima purificada. Ratones C57B1/6 sanos, de 10 a 12 semanas de edad y con un peso de 20 a 26 g, se mantuvieron en una jaula metabólica y se mantuvieron en ayunas durante 15 h. El agua se proporcionó a voluntad. Después del ayuno nocturno, los animales fueron atacados usando una aguja de sonda de calibre 21 con una mezcla de 0,3 ml de Tris-HCl 0,5 M, pH 8,5, y 8 mg/ml en Tris-HCl 0,5 M, pH 8,5, WT PAL (preparado como se describe en el Ejemplo 4) o 8 mg/ml en Tris-HCl 0,5 M pH 8,5 Variante N° 42 (preparado como se describe en el Ejemplo 4). A las 0,5, 2 o 6 h después de la sonda, los animales se decapitaron, se recogió el plasma utilizando tubos de extracción de sangre capilar verde (Ram Scientific) y el contenido del estómago, duodeno (~ 1-8 cm del estómago), se recogieron yeyuno (~ 10-18 cm del estómago), íleon (~ 8 cm por encima del ciego) y colon (~ 5 cm por debajo del ciego). El peso de estos contenidos se registró y los contenidos se almacenaron a -80°C antes del análisis.
Los contenidos de estómago o intestinal se diluyeron 4X con pH 100 mM de fosfato de sodio 7,0, se mezclaron brevemente y se centrifugaron a 14.000 rpm x 2 min. Los sobrenadantes se transfirieron a una placa de filtro de 96 pocillos AcroPrep™ Advanced (Pall Corp) de 350 pL, 0,45 pm, y las partículas se eliminaron mediante filtración al vacío. El filtrado clarificado se evaluó para determinar la actividad enzimática como se describe en los ejemplos anteriores y la presencia de proteína PAL intacta por SDS-PAGE. Los resultados indicaron que la actividad enzimática en el duodeno y el yeyuno parecía ser mayor para las variantes PAL evolucionadas, en comparación con la enzima PAL de tipo silvestre y el control negativo.
EJEMPLO 7
Niveles de fenilalanina en plasma
Se evaluaron las muestras de plasma recogidas de los ratones descritos en el Ejemplo 6 para determinar la cantidad de fenilalanina presente en la sangre de los ratones ensayados. El plasma de ratón (50 pl) se combinó con 250 pl de acetontrilo que contenía 0,6 mM de dl-fenilalanina (anillo D5) (es decir, una versión etiquetada isotópicamente de fenilalanina que contiene deuterio en lugar de hidrógeno enlazado con los carbonos aromáticos del anillo; Laboratorios de Isótopos de Cambridge). Las muestras se mezclaron a temperatura ambiente durante 5 min, se centrifugaron a 3200 x g durante 10 min a 4°C y los sobrenadantes se transfirieron a una placa para el análisis de la muestra. Para el análisis, se inyectaron 10 pl de cada muestra en un sistema LC/MS/MS q TrAP® 3200 (AB Sciex) a través de una columna DIs Co VERY® C18 (150 x 2,1 mM, bolas de 5 pm) (Supelco, ahora Sigma Aldrich), eluyendo con ácido fórmico al 0,1% en agua (A) y acetonitrilo (B). Las muestras se eluyeron en un gradiente de 5 minutos (t = 0, 97% A; 3 minutos, 50% A; 3,5 minutos, 5% A; 4 minutos, 97% A; 5 minutos, 95% A) buscando una transición de 166 a 120 para fenilalanina endógena y 171 a 125 para el estándar marcado isotópicamente. Los resultados indicaron que los niveles de fenilalanina en plasma eran más bajos en el momento de 30 minutos en muestras de ratones a los que se les dio la variante PAL evolucionada (es decir, la Variante N° 42), en comparación con la enzima PAL de tipo silvestre y el control negativo.
EJEMPLO 8
Función terapéutica de la variante PAL
Para evaluar si las variantes de PAL reducen los niveles séricos de Phe in vivo, se utilizó un modelo de ratón de PKU. En estos experimentos, las proteínas PAL fueron atacadas en animales afectados. Primero, se estableció un nivel de Phe basal consistente en los ratones al eliminar Phe de sus dietas durante tres días, seguido de una inyección de una cantidad conocida de solución que contenía Phe. Se transfirieron ratones homocigotos de 3 a 6 meses de edad de PAH enu-2 con un fondo C57B1/6 (Ver, McDonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87: 1965-1967 [1990]) a una dieta libre de fenilalanina (TD.97152, Harlan) con 0,03 g/L de Phe suministrada en su agua de bebida durante 72 h. Antes de iniciar el tratamiento en el momento = 0 h, los ratones se inyectaron con 0,15 mg/g de Phe de peso corporal (de una solución de Phe en agua de 10 g/L). Cincuenta y cinco minutos después de la inyección, se recogieron aproximadamente 20 pl de sangre mediante punción de la vena de la cola y se colocaron sobre papel de filtro. Posteriormente, en los momentos 1 h, 3 h y 5 h post inyección, los ratones fueron atrapados con 0,3 pl de 50-100 g/l de WT AvPAL, WT AvPAL más aprotinina, BsA o variante N° 42, 6 h, 7 h y 9 h después de la inyección, se recogieron manchas de sangre adicionales en papel de filtro. Las manchas de sangre se secaron y se almacenaron a -20°C antes del análisis de LC-MS/MS para los niveles de Phe y Tyr utilizando métodos conocidos en la técnica (Ver, Chase et al., Clin. Chem, 39: 66-71 [1993]).
Los resultados se muestran en la Figura 8. Como se indica en esta figura, la alimentación forzada con proteína inactiva (bsA), condujo a un aumento de los niveles de Phe en suero. En contraste, el tratamiento con WT AvPAL proteolíticamente susceptible dio lugar a niveles constantes de Phe, mientras que la misma proteína, combinada con el inhibidor de la proteasa aprotinina, produjo una caída significativa en los niveles de Phe. Los resultados también muestran que la administración de la Variante N° 42 de la ingeniería genética dio como resultado una disminución de los niveles séricos de Phe en ausencia de inhibidores de la proteasa.
EJEMPLO 9
Desinmunización de PAL
En este ejemplo, se describen experimentos llevados a cabo para identificar la diversidad que eliminaría los epítopos de células T de PAL.
Identificación de la diversidad desinmunizante:
Para identificar los aminoácidos que, cuando estaban mutados, podían eliminar los epítopos de las células T, se usaron métodos computacionales para identificar las secuencias PAL que se predice que provocan una respuesta de las células T. Paralelamente, también se llevaron a cabo búsquedas experimentales de mutaciones no dañinas permisibles, en particular para los aminoácidos que mantienen la actividad de la proteína en un ensayo no cuestionado (por ejemplo, en los ensayos descritos en el Ejemplo 2). Las variantes activas se analizaron para determinar el efecto de las mutaciones en la inmunogenicidad predicha.
Identificación computacional de supuestos epítopos de células T en una variante AvPAL:
Los supuestos epítopos de células T en una variante AvPAL No. 36 se identificaron utilizando las herramientas de la base de datos de epítopos inmunes (IEDB; Base de datos de recursos y análisis de epítopos inmunes), como se conoce en la técnica y las herramientas de análisis estadístico patentadas (ver, por ejemplo, iedb.org y Vita et al., Nucl. Acids Res., 38 (Número de la base de datos): D854-62 [2010]. Epub 2009, 11 de noviembre]). La variante AvPAL se analizó en todos los marcos de análisis de 15 meros posibles, con cada marco superpuesto al último por 14 aminoácidos. Los marcos de análisis de 15 unidades se evaluaron para determinar su potencial inmunogénico al puntuar sus regiones centrales de 9 unidades para determinar la unión pronosticada a ocho alelos HLA-DR de clase II comunes (DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*0801, DRB1*1101, DRB1*1301 y DRB1*1501) que cubren colectivamente a casi el 95% de la población humana (ver, por ejemplo, Southwood et al., J. Immunol., 160: 3363-3373 [1998]), usando métodos recomendados en el sitio web del IEDB. Los grupos de epítopos de células T potenciales contenidos dentro de la variante AvPAL (es decir, las subregiones contenidas dentro de la variante AvPAL que tienen un potencial inusualmente alto de inmunogenicidad) se identificaron utilizando herramientas de análisis estadístico, como se conoce en la técnica. Los grupos de epítopos de células T identificados se analizaron contra la base de datos IEDB de epítopos conocidos y la base de datos de proteínas GenBank. Estos cribados identificaron 10 (diez) supuestos epítopos de células T en la variante AvPAL Variante N° 36, Estos epítopos se denominan TCE-I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX y X, abajo.
Diseño de Desinmunización de Bibliotecas:
En primer lugar, se desarrolló una biblioteca combinatoria que contiene todas las mutaciones neutrales y beneficiosas identificadas a partir de las rondas de evolución dirigida utilizadas para crear AvPAL variantes, en las 10 supuestas regiones de epítopo de células T identificadas como se describió anteriormente. Se analizaron los efectos de estas mutaciones en la unión predicha a los ocho alelos comunes HLA-DR de clase II. Se predijeron múltiples mutaciones para eliminar o reducir TCE-I, II, VI, VII. Estas mutaciones se combinaron en una biblioteca combinatoria. Luego se diseñaron bibliotecas utilizando mutagénesis de saturación para mutagenizar cada aminoácido individual dentro de los seis epítopos de células T restantes (es decir, TCE-III, IV, V, VIII, IX y X). Finalmente, se creó una biblioteca combinatoria que contenía una diversidad beneficiosa identificada a partir de múltiples rondas de evolución dirigidas a TCE-I, III, IV, VIII y X, junto con C503 y C565, dos aminoácidos informados que afectan el estado de agregación de las variantes de pAl . Los mejores éxitos de esta biblioteca se sometieron a mutagénesis de saturación adicional dirigida a TCE-III y VIII y mutagénesis dirigida adicional en unas pocas posiciones.
Construcción y selección de bibliotecas desinmunizantes:
Las bibliotecas de mutagénesis combinatoria y de saturación diseñadas como se describió anteriormente se construyeron mediante métodos conocidos en la técnica, y se ensayaron para determinar su actividad en un ensayo no cuestionado como se describe en el Ejemplo 2. Las variantes activas se identificaron y secuenciaron. Sus actividades y mutaciones con respecto a la Variante N° 36 de AvPAL y numerosas Variantes de AvPAL se proporcionan en las Tablas 9-1 a 9-7, a continuación.
Identificación de la diversidad desinmunizante:
Variantes activas se analizaron para sus niveles de inmunogenicidad mediante la evaluación de su unión a los ocho alelos HLA-DR Clase II común descritos anteriormente. La puntuación de inmunogenicidad total y el recuento de hits inmunogénicos se muestran en las Tablas 9-1 a 9-7. La puntuación de inmunogenicidad total refleja la inmunogenicidad general predicha de la variante (es decir, una puntuación más alta indica un nivel más alto de inmunogenicidad predicha). El "recuento de visitas" inmunogénico indica el número de cuadros de análisis de 15 unidades con un potencial inusualmente alto de inmunogenicidad (es decir, una cuenta de visitas mayor indica un potencial más alto de inmunogenicidad). Las mutaciones con un puntaje de inmunogenicidad predicho total más bajo y/o un conteo de golpes inmunogénicos menor que el de la variante de referencia se consideraron "mutaciones de desinmunización". Las mutaciones de desinmunización que se identificaron como las mejores fueron recombinadas para generar una serie de variantes que están activas y se predice que serán significativamente menos inmunogénicas que la variante de referencia inicial AvPAL. En las siguientes Tablas, los resultados de FIOP son del ensayo no cuestionado; para la puntuación de inmunogenicidad total (TIS) y el recuento de aciertos inmunogénicos (IHC), los resultados se indican para la proteína PAL completa (tablas 9-1, 9-8 y 9-9) o para el epítope indicado (tablas 9-2 a 9-7).
Figure imgf000071_0001
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000073_0001
Figure imgf000074_0001
Figure imgf000075_0001
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000077_0001
Figure imgf000078_0001
Figure imgf000079_0001
Figure imgf000080_0001
Figure imgf000081_0001
Figure imgf000082_0001
Figure imgf000083_0001
Figure imgf000083_0002
(Continuado)
Figure imgf000084_0001
(Continuado)
Figure imgf000085_0001
Tabla 9-4. hrOK. InnL-noge "lleuda J tota' (TlS|h, y conté o de bita nm - nc gámcoe ¡IHCI oara van antea que se d irigen a TCE-V f"-" = FIOP < 0,7; = FIOP O.T-í FIOPí I . Í ; "++" = FIOP> 1,4|
Figure imgf000085_0002
(Continuado)
Figure imgf000086_0002
Figure imgf000086_0001
(Continuado)
Figure imgf000087_0001
(Continuado)
Figure imgf000088_0002
Figure imgf000088_0001
(Continuado)
Figure imgf000089_0001
(Continuado)
Figure imgf000090_0003
9 -7. h lO P , in p iu r1 D g e n n tid a d to ta l [T lS l. y co n te o de h its in m u n a g é ru dirigen a T C E - X * FIOP e 6,7; V * FlOP «. ítFIOPei ,4;
Figure imgf000090_0001
Figure imgf000090_0002
(Continuado)
Figure imgf000091_0002
Figure imgf000091_0001
(Continuado)
Figure imgf000092_0002
Tabla 9 -4. H O P , IrunuriDgentuclad total (TlS) y c o rte o da hita inm une g á n e o s (IHC| para van a m es que se (tillen * TCE-rn y Vl*l,
Figure imgf000092_0001

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido modificado que tiene actividad de fenilalanina amoniaco liasa (PAL) que comprende: a) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 4 o un fragmento funcional de la misma; b) por lo menos una diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 4 o el fragmento funcional de la misma en una o más posiciones de aminoácidos; y c) que muestra sensibilidad reducida a la proteólisis en comparación con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 4, en donde la diferencia de residuos de aminoácidos es R305L o R305M cuando se alinean con la SEQ ID NO: 4, y en donde las posiciones de los aminoácidos se numeran con referencia a la SEQ ID NO: 4.
2. El polipéptido modificado de la reivindicación 1, en el que la diferencia de residuos de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 4 es R305M, cuando se alinea de manera óptima con el polipéptido de la SEQ ID NO: 4.
3. El polipéptido modificado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además una o más diferencias de residuos de aminoácidos seleccionadas de A39, A91, Q240, a 256, N290, Y304, H307, D353, A394, S399, P404, L407, Q521, K522 y T524.
4. El polipéptido modificado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido modificado genética tiene por lo menos aproximadamente el 90%, o por lo menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 4.
5. El polipéptido modificado que tiene actividad de fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho polipéptido modificado es:
a) termoestable;
b) resistente a la proteólisis, opcionalmente en donde dicho polipéptido modificado es resistente a la proteólisis por al menos una enzima del tracto digestivo, por ejemplo en donde dicho polipéptido modificado es resistente a la proteólisis por quimotripsina, tripsina, carboxipeptidasas y/o elastasas;
c) es estable a los ácidos; y/o
d) está purificado.
6. Una secuencia de polinucleótidos que codifica por lo menos un polipéptido modificado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde opcionalmente:
a) dicho polinucleótido está operativamente enlazado a una secuencia de control; y/o
b) dicho polinucleótido está optimizado con codones.
7. Un vector de expresión que comprende por lo menos una secuencia de polinucleótidos de la reivindicación 6, y por lo menos una secuencia de control, en donde opcionalmente dicha secuencia de control es un promotor, por ejemplo, un promotor heterólogo.
8. Una célula huésped transformada con por lo menos una secuencia de polinucleótidos de la reivindicación 6, y/o el vector de la reivindicación 7, en donde opcionalmente dicha célula huésped es E. coli.
9. Un método para producir un polipéptido PAL modificado en una célula huésped que comprende cultivar una célula huésped que comprende por lo menos un polinucleótido que codifica por lo menos un polipéptido modificado que tiene actividad de fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y/o por lo menos una secuencia de polinucleótidos de la reivindicación 6, y/o por lo menos un vector de la reivindicación 7, en condiciones de cultivo adecuadas, de tal manera que se produzca por lo menos un polipéptido PAL modificado, opcionalmente en donde dicho método comprende además recuperar por lo menos un polipéptido modificado que tiene fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) del cultivo y/o las células huésped, por ejemplo, en donde dicho método comprende además el paso de purificar dicho por lo menos un polipéptido modificado que tiene fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) producida.
10. Una composición que comprende por lo menos un polipéptido modificado que tiene actividad de fenilalanina amoniaco liasa (PAL) de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde opcionalmente dicha composición es: a) una composición farmacéutica, preferiblemente en donde dicha composición farmacéutica comprende además por lo menos un excipiente y/o portador farmacéuticamente aceptable; y/o
b) es adecuado para el tratamiento de la fenilcetonuria.
11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, en donde dicha composición:
a) es adecuado para la administración oral a un humano;
b) está en forma de píldora, comprimido, cápsula, cápsula de gel, líquido o emulsión, opcionalmente en donde dicha píldora, comprimido, cápsula o cápsula de gel comprende además un recubrimiento entérico; y/o c) se coadministra con por lo menos un compuesto terapéuticamente eficaz adicional, en donde opcionalmente dicha composición comprende por lo menos un compuesto terapéuticamente eficaz adicional.
12. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 u 11 (c), en donde dicha composición es adecuada para inyección parenteral en un humano.
13. El polipéptido modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-12 para su uso en terapia.
14. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 para su uso en un método para tratar y/o prevenir los síntomas de fenilcetonuria en un sujeto, opcionalmente en donde:
a) se mejoran dichos síntomas de fenilcetonuria;
b) dicho sujeto es capaz de comer una dieta que está menos restringida en su contenido de metionina, fenilalanina y/o tirosina que las dietas requeridas por sujetos a los que no se les ha proporcionado por lo menos una composición farmacéutica que comprende por lo menos un polipéptido modificado que tiene actividad de fenilalanina amoniaco-liasa ( PAL) como se expone en cualquiera de las reivindicaciones 1-5;
c) dicho sujeto es un infante o un niño; o
d) dicho sujeto es un adulto o un adulto joven.
ES19163814T 2013-04-18 2014-04-17 Polipéptidos de fenilalanina amoníaco liasa modificados Active ES2890955T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361813586P 2013-04-18 2013-04-18
US201361897932P 2013-10-31 2013-10-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2890955T3 true ES2890955T3 (es) 2022-01-25

Family

ID=51729192

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14784792T Active ES2729048T3 (es) 2013-04-18 2014-04-17 Polipéptidos de fenilalanina amoníaco-liasa modificados
ES19163814T Active ES2890955T3 (es) 2013-04-18 2014-04-17 Polipéptidos de fenilalanina amoníaco liasa modificados

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14784792T Active ES2729048T3 (es) 2013-04-18 2014-04-17 Polipéptidos de fenilalanina amoníaco-liasa modificados

Country Status (26)

Country Link
US (17) US9611468B2 (es)
EP (3) EP3971288A1 (es)
JP (5) JP6637410B2 (es)
KR (1) KR102218930B1 (es)
CN (2) CN105324483B (es)
AU (2) AU2014253900C1 (es)
CA (1) CA2909719C (es)
CY (1) CY1121891T1 (es)
DK (2) DK3521423T3 (es)
EA (1) EA034034B1 (es)
ES (2) ES2729048T3 (es)
HR (1) HRP20190928T1 (es)
HU (2) HUE043549T2 (es)
IL (1) IL242067B (es)
LT (1) LT2986722T (es)
MX (1) MX366196B (es)
MY (1) MY193198A (es)
NZ (1) NZ713396A (es)
PE (1) PE20151775A1 (es)
PH (1) PH12015502412B1 (es)
PL (1) PL2986722T3 (es)
PT (1) PT2986722T (es)
RS (1) RS58802B1 (es)
SG (1) SG11201508598YA (es)
SI (1) SI2986722T1 (es)
WO (1) WO2014172541A2 (es)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE043549T2 (hu) 2013-04-18 2019-08-28 Codexis Inc Átszerkesztett fenilalanin-ammónia-liáz polipeptidek
WO2015161019A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Codexis, Inc. Engineered tyrosine ammonia lyase
CN106636048A (zh) * 2016-12-14 2017-05-10 江南大学 一株酶活提高的苯丙氨酸脱氨酶突变体
CN106755160B (zh) * 2017-01-17 2019-08-02 湖州颐辉生物科技有限公司 一种组氨酸解氨酶及其用途
SG11201906880VA (en) * 2017-02-13 2019-08-27 Codexis Inc Engineered phenylalanine ammonia lyase polypeptides
US11274287B2 (en) * 2017-05-27 2022-03-15 Enzymaster (Ningbo) Bio-Engineering Co., Ltd Engineered aldolase polypeptides and uses thereof
CA3102968A1 (en) 2018-06-12 2019-12-19 Codexis, Inc. Engineered tyrosine ammonia lyase
EP3820833A4 (en) * 2018-07-12 2022-08-03 Codexis, Inc. MODIFIED AMMONIA-LYASE PHENYLALANINE POLYPEPTIDES
SG11202103639SA (en) * 2018-10-29 2021-05-28 Codexis Inc Engineered dna polymerase variants
SG11202105668PA (en) * 2018-12-14 2021-06-29 Codexis Inc Engineered tyrosine ammonia lyase
IL295353A (en) 2020-03-20 2022-10-01 Synlogic Operating Co Inc Genetically engineered microorganisms to reduce hyperphenylalaninemia
CN116847860A (zh) * 2020-12-31 2023-10-03 同生运营公司 经工程化以减轻高苯丙氨酸血症的微生物
CN114015636B (zh) * 2021-12-08 2023-09-29 天地壹号饮料股份有限公司 重组醋酸菌及其制备方法和应用
CN117417925A (zh) * 2022-07-18 2024-01-19 浙江泽科塔生物医药有限公司 Pal变体、包含该pal变体的药物组合物以及用于制备该pal变体的方法
CN115518691B (zh) * 2022-10-14 2023-11-21 天津大学 一种具有类漆酶活性的人工酶及制备方法和应用
CN116478975B (zh) * 2023-06-16 2023-09-01 苏州优信合生技术有限公司 高活性苯丙氨酸解氨酶突变体及其表达菌株

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US603344A (en) 1898-05-03 Trough for well-curbs
US753653A (en) 1903-09-14 1904-03-01 American Car & Foundry Co Hopper-bottom car.
DK75593D0 (es) * 1993-06-25 1993-06-25 Novo Nordisk As
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US6309883B1 (en) 1994-02-17 2001-10-30 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6406855B1 (en) 1994-02-17 2002-06-18 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6165793A (en) 1996-03-25 2000-12-26 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US6395547B1 (en) 1994-02-17 2002-05-28 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US20060257890A1 (en) 1996-05-20 2006-11-16 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6995017B1 (en) 1994-02-17 2006-02-07 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5928905A (en) 1995-04-18 1999-07-27 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
AU694954B2 (en) 1994-06-03 1998-08-06 Novo Nordisk A/S Purified myceliophthora laccases and nucleic acids encoding same
CN1151762A (zh) 1994-06-30 1997-06-11 诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司 非毒性、非产毒性、非致病性镰孢属表达系统及所用启动子和终止子
FI104465B (fi) 1995-06-14 2000-02-15 Valio Oy Proteiinihydrolysaatteja allergioiden hoitamiseksi tai estämiseksi, niiden valmistus ja käyttö
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
US6506602B1 (en) 1996-03-25 2003-01-14 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
DE69835360T2 (de) 1997-01-17 2007-08-16 Maxygen, Inc., Redwood City EVOLUTION Prokaryotischer GANZER ZELLEN DURCH REKURSIVE SEQUENZREKOMBINATION
US6326204B1 (en) 1997-01-17 2001-12-04 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
US7148054B2 (en) 1997-01-17 2006-12-12 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
DK2270234T3 (da) 1997-12-08 2013-06-03 California Inst Of Techn Fremgangsmåde til fremstilling af polynukleotid- og polypeptidsekvenser
US6365408B1 (en) 1998-06-19 2002-04-02 Maxygen, Inc. Methods of evolving a polynucleotides by mutagenesis and recombination
JP4221100B2 (ja) 1999-01-13 2009-02-12 エルピーダメモリ株式会社 半導体装置
US6917882B2 (en) 1999-01-19 2005-07-12 Maxygen, Inc. Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides having desired characteristics
US6368861B1 (en) 1999-01-19 2002-04-09 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
US6436675B1 (en) 1999-09-28 2002-08-20 Maxygen, Inc. Use of codon-varied oligonucleotide synthesis for synthetic shuffling
US6376246B1 (en) 1999-02-05 2002-04-23 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
US7024312B1 (en) 1999-01-19 2006-04-04 Maxygen, Inc. Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides having desired characteristics
EP1108783A3 (en) 1999-01-19 2001-09-05 Maxygen, Inc. Oligonucleotide-mediated nucleic acid recombination
US7702464B1 (en) 2001-08-21 2010-04-20 Maxygen, Inc. Method and apparatus for codon determining
US6961664B2 (en) 1999-01-19 2005-11-01 Maxygen Methods of populating data structures for use in evolutionary simulations
AU3391900A (en) 1999-03-05 2000-09-21 Maxygen, Inc. Encryption of traits using split gene sequences
US7430477B2 (en) 1999-10-12 2008-09-30 Maxygen, Inc. Methods of populating data structures for use in evolutionary simulations
US6519065B1 (en) 1999-11-05 2003-02-11 Jds Fitel Inc. Chromatic dispersion compensation device
EP1272967A2 (en) 2000-03-30 2003-01-08 Maxygen, Inc. In silico cross-over site selection
US6967097B2 (en) * 2000-07-24 2005-11-22 Pcbu Services, Inc. Phenylalainine ammonia lyase polypeptide and polynucleotide sequences and methods of obtaining and using same
US20050084907A1 (en) 2002-03-01 2005-04-21 Maxygen, Inc. Methods, systems, and software for identifying functional biomolecules
US7747391B2 (en) 2002-03-01 2010-06-29 Maxygen, Inc. Methods, systems, and software for identifying functional biomolecules
ES2564570T3 (es) 2002-03-01 2016-03-23 Codexis Mayflower Holdings, Llc Métodos, sistemas y software para la identificación de biomoléculas funcionales
JP4851687B2 (ja) 2002-03-09 2012-01-11 マキシジェン， インコーポレイテッド 定向進化のための交叉点の最適化
US8003356B2 (en) 2004-04-20 2011-08-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Methods for the preparation of para-hydroxycinnamic acid and cinnamic acid at alkaline pH
CA2580679A1 (en) * 2004-09-17 2006-03-30 Biomarin Pharmaceutical Inc. Variants and chemically-modified variants of phenylalanine ammonia-lyase
EP1869174B1 (en) 2005-03-10 2015-02-18 BASF Enzymes LLC Lyase enzymes, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US7534595B2 (en) * 2006-06-12 2009-05-19 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase and methods of using compositions thereof
US7531341B1 (en) 2006-06-12 2009-05-12 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase and methods of using compositions thereof
US20090011400A1 (en) * 2006-12-01 2009-01-08 The Salk Institute for Biological Studies and The Regents of the University of California Substrate switched ammonia lyases and mutases
US7537923B2 (en) 2007-08-17 2009-05-26 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase and methods of treating cancer using compositions thereof
EP2285958B1 (en) 2008-06-13 2016-03-09 Codexis, Inc. Method of synthesizing polynucleotide variants
US8383346B2 (en) 2008-06-13 2013-02-26 Codexis, Inc. Combined automated parallel synthesis of polynucleotide variants
US20090312196A1 (en) 2008-06-13 2009-12-17 Codexis, Inc. Method of synthesizing polynucleotide variants
ES2582459T3 (es) 2010-02-04 2016-09-13 Biomarin Pharmaceutical Inc. Composiciones de variantes de fenilalanina amoníaco-liasa de procariotas y métodos de uso de sus composiciones
MX2013004944A (es) 2010-11-05 2013-06-28 Basf Plant Science Co Gmbh Metodo para aumentar el rendimiento y la produccion de quimicos finos en las plantas.
WO2012122333A1 (en) 2011-03-08 2012-09-13 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona, Acting For And On Behalf Of Arizona State University Microbial conversion of glucose to styrene and its derivatives
US20130005012A1 (en) 2011-06-23 2013-01-03 Phytogene, Inc. Enzymatic system for monomer synthesis
HUE043549T2 (hu) 2013-04-18 2019-08-28 Codexis Inc Átszerkesztett fenilalanin-ammónia-liáz polipeptidek

Also Published As

Publication number Publication date
JP7129715B2 (ja) 2022-09-02
MY193198A (en) 2022-09-26
US20200231959A1 (en) 2020-07-23
US10144924B2 (en) 2018-12-04
EA034034B1 (ru) 2019-12-20
US10487319B2 (en) 2019-11-26
US20200032234A1 (en) 2020-01-30
US10160963B2 (en) 2018-12-25
US20140314843A1 (en) 2014-10-23
US20200032233A1 (en) 2020-01-30
US20200040325A1 (en) 2020-02-06
EP3971288A1 (en) 2022-03-23
WO2014172541A2 (en) 2014-10-23
MX2015014662A (es) 2016-03-03
JP2020185017A (ja) 2020-11-19
US10294468B2 (en) 2019-05-21
US11401515B2 (en) 2022-08-02
HRP20190928T1 (hr) 2019-07-26
US10358639B2 (en) 2019-07-23
US11913045B2 (en) 2024-02-27
JP2020185016A (ja) 2020-11-19
EP2986722A2 (en) 2016-02-24
US10870843B2 (en) 2020-12-22
PT2986722T (pt) 2019-06-21
US9611468B2 (en) 2017-04-04
EP2986722A4 (en) 2017-02-22
EA201591995A1 (ru) 2016-04-29
US10640759B2 (en) 2020-05-05
US20210222146A1 (en) 2021-07-22
JP2018166524A (ja) 2018-11-01
EP3521423B1 (en) 2021-07-21
CN109486803B (zh) 2022-10-25
US11136571B2 (en) 2021-10-05
KR102218930B1 (ko) 2021-02-23
IL242067B (en) 2018-03-29
US20190241882A1 (en) 2019-08-08
HUE043549T2 (hu) 2019-08-28
US20180037880A1 (en) 2018-02-08
MX366196B (es) 2019-07-01
AU2019272057B2 (en) 2021-05-27
DK2986722T3 (da) 2019-05-13
AU2014253900A1 (en) 2015-11-12
US11130947B2 (en) 2021-09-28
JP2016516428A (ja) 2016-06-09
JP6637410B2 (ja) 2020-01-29
CA2909719A1 (en) 2014-10-23
PH12015502412A1 (en) 2016-02-22
PE20151775A1 (es) 2015-12-02
US20190055535A1 (en) 2019-02-21
RS58802B1 (sr) 2019-07-31
US20180016568A1 (en) 2018-01-18
LT2986722T (lt) 2019-09-10
CA2909719C (en) 2022-09-27
AU2014253900C1 (en) 2020-04-02
KR20150143816A (ko) 2015-12-23
US10494623B2 (en) 2019-12-03
US20200032236A1 (en) 2020-01-30
PL2986722T3 (pl) 2019-10-31
US20170191050A1 (en) 2017-07-06
HUE055899T2 (hu) 2022-01-28
NZ713396A (en) 2020-06-26
BR112015026160A2 (pt) 2017-10-10
US20190055536A1 (en) 2019-02-21
CN105324483B (zh) 2018-11-30
AU2014253900B2 (en) 2019-09-19
US20200032235A1 (en) 2020-01-30
US20190040377A1 (en) 2019-02-07
JP2022183356A (ja) 2022-12-08
US10975367B2 (en) 2021-04-13
ES2729048T3 (es) 2019-10-30
PH12015502412B1 (en) 2016-02-22
US10717974B2 (en) 2020-07-21
SG11201508598YA (en) 2015-11-27
EP2986722B1 (en) 2019-04-03
WO2014172541A3 (en) 2015-02-19
AU2019272057A1 (en) 2019-12-19
SI2986722T1 (sl) 2019-07-31
EP3521423A1 (en) 2019-08-07
DK3521423T3 (da) 2021-09-06
US20200199566A1 (en) 2020-06-25
CY1121891T1 (el) 2020-10-14
US10941391B2 (en) 2021-03-09
CN109486803A (zh) 2019-03-19
US20200399627A1 (en) 2020-12-24
CN105324483A (zh) 2016-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2890955T3 (es) Polipéptidos de fenilalanina amoníaco liasa modificados
US20200071688A1 (en) Engineered tyrosine ammonia lyase
BR112015026160B1 (pt) Polipeptídeo engenheirado com atividade de fenilalanina amônia-liase,sequência de polinucleotídeo, vetor de expressão, célula hospedeira transformada, método para produzir um polipeptídeo de pal engenheirado em uma célula hospedeira, composição, e, uso de uma composição