CN112707953A - Ev71病毒样颗粒产品、其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种EV71病毒样颗粒产品、其制备方法及其应用。其中制备方法包括：将美国大速生生菜叶置于农杆菌的渗透液中进行渗透浸染，获得转化生菜，其中，农杆菌含有携带EV71病毒P1基因和3CD基因的质粒；对转化生菜进行光照培养，以使转化生菜表达质粒，从而获得EV71病毒样颗粒。通过选择美国大速生生菜作为宿主植物，进行农杆菌渗透浸染，并对转化后的生菜置于光照条件下进行培养，从而获得了不仅能够高效大量表达在转化系统，而且还能成功包装成病毒样颗粒，从而首次在植物表达系统中获得了EV71病毒样颗粒，为手足口病毒疫苗的研制奠定了基础。

Description

EV71病毒样颗粒产品、其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及疫苗生产领域，具体而言，涉及一种EV71病毒样颗粒产品、其制备方法及其应用。
背景技术
肠道病毒71型是引起婴幼儿手足口病(hand-foot and mouth disease；HFMD)的主要病原体。EV71是小核糖核酸病毒科的无包膜单链RNA病毒，其基因组由含有P1、P2和P3区的单个开放阅读框组成，P2和P3区域编码负责病毒负责和毒力的非结构蛋白(例如，3CD)，而P1区域编码P1前体(约97KD)，可被3CD蛋白切割成VP0、VP1和VP3，这三种蛋白质自发组装成二十面体衣壳体，包裹RNA基因，完成病毒装配。体外表达的P1前提也可以被3CD蛋白酶切割，并自发组装成二十面体衣壳，形成病毒样颗粒(VLP)。VLP不含病毒核酸，但引起的免疫应答强度与真实病毒刺激的差异很小，是较理想的一种免疫形式。其中，VP1是主要的保护性抗原，分子量约39KD。
目前全病毒灭活疫苗已经成功上市，但是其保护率不是百分之百，而且灭活疫苗的弊端无法避免，比如病毒培养复杂且设备要求高、灭活对蛋白结构的影响等。减毒活疫苗及各类基因工程疫苗研制为疫苗开发提供了新途径。
相对而言，病毒样颗粒(VLPs)不仅具有安全性好的优点，同时因包含主要的结构蛋白，所以能较好模拟天然病毒粒子的构象，从而刺激产生高效的免疫应答，是研制疫苗的理想对象。
虽然已有EV71病毒样颗粒异源表达的案例，但使用的昆虫细胞或酵母表达体系均存在成本高、操作复杂、技术条件要求高等弊端。而植物表达系统具有其独特的优势，比如，生产成本明显较低，便于进行大规模生产，制备方法简单等，并且该系统生产的疫苗不需要冷藏以及可以直接食用等优点。
但目前在植物中表达EV71VLP的报道较少，虽然也有报道能够在转化植物中检测到蛋白表达，但存在表达量低、无法检测到病毒样颗粒等问题，因此，如何能够在植物中成功高效表达EV71病毒蛋白并成功包装成VLP，便成为研制HFMD预防性植物口服疫苗一个亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种EV71病毒样颗粒产品、其制备方法及其应用，以解决现有技术中在植物系统中无法获得EV71病毒样颗粒的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种EV71病毒样颗粒的制备方法，该制备方法包括：将美国大速生生菜叶置于农杆菌的渗透液中进行渗透浸染，获得转化生菜，其中，农杆菌含有携带EV71病毒P1基因和3CD基因的质粒；对转化生菜进行光照培养，以使转化生菜表达质粒，从而获得EV71病毒样颗粒。
进一步地，渗透液包括：2～8g/L葡萄糖、1.5～2mg/L激动素、100～300mg/L水解酪素、100～300μmol/L乙酰丁香酮及10mmol/L的无菌MgCl2溶液；优选地，渗透液包括6g/L葡萄糖、2mg/L激动素、300mg/L水解酪素和200μmol/L乙酰丁香酮及10mmol/L的无菌MgCl2溶液。
进一步地，在渗透浸染之前，制备方法还包括：将含有农杆菌的渗透液调整至OD600为0.55～0.65，然后于20～30℃下静置2～3h。
进一步地，渗透浸染包括：将美国大速生生菜叶浸没于农杆菌的渗透液中；将渗透液置于0.045～0.050Mpa的真空压力下渗透浸染20～30min，得到转化生菜。
进一步地，对转化生菜进行光照培养包括：将转化生菜置于20～22℃的光照培养箱中培养3～4天，光照培养箱的光照强度为1800lx～2200lx，每条光照15～17h。
进一步地，在得到转化生菜之后，以及对转化生菜进行光照培养之前，制备方法还包括：对转化生菜依次进行无菌水漂洗、干燥以及保鲜膜包裹的步骤。
进一步地，农杆菌的菌株为AGL1。
进一步地，携带EV71病毒P1基因和3CD基因的质粒为pCAMBIA2301-3CD-P1。
根据本申请的第二个方面，提供了一种EV71病毒样颗粒产品，该EV71病毒样颗粒产品采用上述任一种制备方法制备而成。
进一步地，EV71病毒样颗粒产品为含有EV71病毒样颗粒的美国大速生生菜，或从美国大速生生菜中分离纯化得到的EV71病毒样颗粒的疫苗制剂。
根据本申请的第二个方面，提供了上述EV71病毒样颗粒的制备方法在疫苗研制中的应用。
应用本发明的技术方案，通过选择美国大速生生菜作为宿主植物，进行农杆菌渗透浸染，并对转化后的生菜置于光照条件下进行培养，从而获得了不仅能够高效大量表达在转化系统，而且还能成功包装成病毒样颗粒，从而首次在植物表达系统中获得了EV71病毒样颗粒，为手足口病毒疫苗的研制奠定了基础。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了本发明的实施例1中转化的美国大速生生菜叶片中表达EV71P1蛋白的固相酶联斑点检测结果图；以及
图2示出了本发明的实施例1中在被感染生菜叶片中包装获得病毒样颗粒的电镜检测图；
图3A和图3B分别示出了本发明的实施例1中未感染的生菜与感染后的生菜中病毒样颗粒表达的免疫组织化学检测图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术部分所提到的，除了发明人之前在意大利生菜中试验过外，目前对EV71病毒蛋白在植物系统中表达的报道很少，然而发明人之前的研究表明，EV71病毒在意大利生菜中虽然能够检测到蛋白表达，但表达量太低，没有病毒样颗粒产出，更无法进行后续的免疫刺激性能的检测。因此，为了实现该病毒蛋白在植物系统中的高效表达，发明人进一步做了深入研究，以试图找出影响病毒蛋白在植物中的表达水平的影响因素。
之前在意大利生菜中表达的是可共表达P1和3CD的双元植物表达载体pCAMBIA2301-3CD-P1，并且在目的基因的两侧引入了限制性酶切位点，且在基因设计合成时，对P1基因(GenBank：EU812515.1)的密码子进行了优化，使其符合植物对密码子的偏好性，但未对EV71 3CD基因(GenBank:EU812515.1)进行优化，以期在植物体内优势表达EV71P1基因。
P1优化后的基因序列如下SEQ ID NO：1(编码区中大写字母为优化位点)
atgggttcacaggtgtcAacacagAgAtctggttctcacgaaaattcaaactcagcTactgagggttctacTatTaactacactacAattaaCtactataaagactcTtatgctgcAacagcaggTaagcagTCtctcaagcaAgatccagacaaatttgcaaatcctgttaaagacattttcactgaaatggcagcaccactgaagtctccatcAgctgaggcatgtggatactCAgatAgagtggcAcaattGactattggAaactcAacAatcacTacacaagaagcTgcaaacatcatTgtTggAtatggtgagtggccttcAtactgctcTgattctgacgctacagcagtggataaaccaacAAgAccAgatgtttcagtgaataggttttatacattggacactaaattgtgggagaaatcAtcTaagggatggtactggaagttcccAgatgtgttGactgaaacAggAgtttttggAcaaaatgcacaattccactacctctatAgatcaggAttctgtatccacgtgcaatgcaatgctTCtaaattccaccaaggagcactcttGgtTgctgtGTtGccagagtatgtTattggAacagtggcaggAggtacaggaacTgaagacattcacccAccttacaagcagactcaaccTggagcTgatggAttcgaattgcaacacccTtacgtgTtGgatgctggAatctcaatTtcacaattGacagtgtgcccacatcagtggattaatttgaggacAaacaattgtgctacaatTattgtgccatacattaacgcaTtgccatttgattctgcTttgaaccactgtaactttggATtgttGgttgtgcctattTCtccaTtGgattacgaccaaggagcaacTccagtgatccctatTactatcacattggctccaatgtgttctgaatttgcaggtTtgaggcaagcagttacTcaaggAtttccTactgagttgaaacctggAacaaaccaatttttGacAactgacgatggAgtttcagcacctattTtgccaaactttcaccctacTccAtgtatTcatatTcctggtgaagttaggaatttgctTgagctTtgccaggtggagacTattttggaggttaacaatgtTccTacTaatgcTactTcTttGatggagagactTAgGttcccTgtTtcagcacaagcaggAaaaggtgagctTtgtgcTgtgtttagagcTgatcctggaAgaaatggaccatggcaatcTacTttGTtgggtcagttgtgcggAtactacacTcaatggtcaggatcattggaagtGacTttcatgtttactggatcTttcatggctacTggAaagatgctcatTgcTtatacaccTccaggaggtcctTtgccTaaggacAgggcTacTgcTatgttgggAacTcacgtTatctgggattttggATtgcaatcTtctgttacTTtGgtTatTccatggatcTCTaacactcattatagagcacatgcTAgagatggagtgtttgactactacactacaggAttggtTtCtatTtggtatcagacaaattacgtggttccaatcggtgcTccTaacacagcttatatTatTgcaTtGgcTgcagcTcaaaagaacttcactatgaaattgtgcaaggatgctTCtgatatcTtgcagacTggaacTatccagggagatagggtggcagatgtTattgagTCttcTatTggtgacTCTgtgTCTagagcTTtGactcaagcAttGccTgcaccTacaggAcagaacacacaggtgTCTTCtcacAgattggacactggtaaggttccagcaTtGcaagctgctgaaattggagcatcatcaaatgctTCtgatgagTCtatgattgagacaAgAtgtgttTtGaactcTcacTCTacagctgagacTactctcgatTCtttcttcTCTagagcTggattGgttggagagatTgacctccctTtGgaaggAacaactaacccaaatggttatgctaactgggatatTgatatTacaggttacgcTcaaatgAgAagaaaggtggagTtGttcacTtacatgAgAtttgacgcagagttcacttttgttgcTtgcacaccTacTggAcaggttgtTccacaattgctccaatatatgtttgtTccacctggagcAcctaagccagattctagggaatcTctcgcatggcaaactgcTactaacccTtcagtttttgttaagTtgccagaccctccagcacaggtttcagtTccattcatgtcacctgcTTCtgcttatcaatggttttatgatggatatcctacattcggtgaacacaaacaggagaaagatTtGgaatatggAgcatgtcctaacaacatgatgggtacattctcagtgAggactgtTggaacTtctaagtcTaagtaccctttGgtggttaggatttacatgaggatgaagcacgtTagggcTtggatTcctAgAccaatgAgaaaccaaaactacTtGttcaaagcTaacccaaattatgctggAaactctattaagccaactggtgcTTCtAgAgcagcTatcacTactTtGtaa。
发明人首先对在意大利生菜中的表达条件进行了优化选择，包括：更换表达菌株、更换转化方法、优化转化条件、优化在意大利生菜中的表达时间、优化检测时间。在进行一系列的条件优化实验后，发现其表达量仍未有显著提高，且仍然检测不到病毒样颗粒。发明人又尝试从植物表达载体角度进行改进，进而又筛选了一批不同的宿主植物，包括但限于美国大速生(散叶生菜，一种已知的生菜品种，叶绿色，株形似鸡冠花，生长快，含苗期30-40天，单柱重300g左右，全国各地均有栽培)、结球甘蓝(京丰一号)、结球甘蓝(中甘十一号)、奶油生菜、结球生菜，并在不同的宿主植物中，进一步摸索和调整表达菌株、转化方式及转化条件等，终于发现了一种高效表达且成功包装成病毒样颗粒的植物表达系统。
在上述研究结果的基础上，申请人提出了本申请的技术方案。在一种典型的实施方式中，提供了一种EV71病毒样颗粒的制备方法，该制备方法包括：将美国大速生生菜叶置于农杆菌的渗透液中进行渗透浸染，获得转化生菜，其中，农杆菌含有携带EV71病毒P1基因和3CD基因的质粒；对转化生菜进行光照培养，以使转化生菜表达质粒，从而获得EV71病毒样颗粒。
本申请的上述制备方法，通过选择美国大速生生菜作为宿主植物，进行农杆菌渗透浸染，并对转化后的生菜置于光照条件下进行培养，从而获得了不仅能够高效大量表达在转化系统，而且还能成功包装成病毒样颗粒，从而首次在植物表达系统中获得了EV71病毒样颗粒，为手足口病毒疫苗的研制奠定了基础。
本申请通过大量的实验对不同的宿主植物进行筛选后得到了美国大速生生菜这一适宜的宿主植物，在该宿主植物下，为进一步提高农杆菌所携带的EV71病毒质粒的高效表达，发明人又对各种转化条件和培养条件进行了优化选择。基于农杆菌对植物的侵染力的不同会显著影响转化效果，因此选择了两种不同的农杆菌菌株LBA4404和AGL1对多个可生食的蔬菜品种进行侵染，寻找最适的农杆菌菌株及其侵染宿主。用携带EV71抗原基因P1和3CD的重组农杆菌菌株侵染不同蔬菜叶片后，对感染叶片总蛋白提取物与抗EV71VP1多克隆抗体结合活性进行检测，DOT-ELISA检测结果见表1。一抗为抗-VP1多克隆抗体，二抗为羊抗兔酶标抗体。
表1不同农杆菌菌株侵染结果
Figure BDA0002912075390000051
注：+表示显色反映呈阳性，+/-表示显色反映呈弱阳性，-表示显色反映呈阴性。其中，美国大速生生菜(Lactuca sativa var.capatata L.)购自青县青丰种业有限公司；结球甘蓝(京丰一号)购自邢台双环种业有限公司；结球甘蓝(中甘十一号)购自邢台市绿硕种业科技有限公司；奶油生菜购自北京派得伟业科技发展有限公司闲亭苑农业种植农业种植技术分公司；结球生菜购自北京派得伟业科技发展有限公司闲亭苑农业种植农业种植技术分公司。
在一种优选的实施例中，渗透液包括：2～8g/L葡萄糖、1.5～2mg/L激动素、100～300mg/L水解酪素、100～300μmol/L乙酰丁香酮及10mmol/L的无菌MgCl2溶液；优选地，渗透液包括6g/L葡萄糖、2mg/L激动素、300mg/L水解酪素和200μmol/L乙酰丁香酮及10mmol/L的无菌MgCl2溶液。在渗透液中添加营养物质，如最易利用的碳源——葡萄糖、富含多种氨基酸的水解酪素，这些成分对于农杆菌和植物宿主的生理活性维持都有促进作用。激动素能够促进植物细胞分裂、分化和生长，并能诱导离体组织的细胞分裂和调节分化、延缓蛋白质和叶绿素的降解，因此能够延迟植物的衰老，使得外源基因有更充足的时间表达及表达产物的包装。
在意大利生菜中进行表达时，采用的转化方式是注射转化，采用的渗透液含200μmol/L乙酰丁香酮及10mmol/L的无菌MgCl2溶液，且添加的糖类为蔗糖，蔗糖浓度为6～12g/L。在本申请中，将蔗糖替换为葡萄糖，除保持一定的渗透压以外，更易被吸收利用，同时添加富含多种氨基酸的水解酪素，添加营养物质，对于农杆菌和植物宿主的生理活性维持都有促进作用；为了尽可能保持植物良好的生理状态，添加适量激动素，因该植物生长调节剂可以促进植物细胞分裂、分化和生长，并能诱导离体组织的细胞分裂和调节分化、延缓蛋白质和叶绿素的降解，因此能够延迟植物的衰老，使得外源基因有更充足的时间表达及表达产物的包装。
为了进一步提高转化效率，在一种优选的实施例中，在渗透浸染之前，上述制备方法还包括：将含有农杆菌的渗透液调整至OD600为0.55～0.65，然后于20～30℃下静置2～3h。
上述优选实施例中，将OD600控制在0.55～0.65之间，使得菌体浓度适中，易于感染叶片。但在渗透感染之前，在20～30℃的室温条件下静置2～3h的目的在于，使农杆菌中与植物转化相关的基因表达，从而有利于T-DNA向植物细胞的转移。
为了进一步提高转化效率，在一种优选的实施例中，渗透浸染包括：将美国大速生生菜叶浸没于农杆菌的渗透液中；将渗透液置于0.045～0.050Mpa的真空压力下渗透浸染20～30min，得到转化生菜。
通过在0.045～0.050Mpa的真空压力下进行渗透浸染，能够提高农杆菌和植物细胞接触的概率，又不至于对植物造成不可逆的损伤，而渗透浸染20～30min是为了尽可能地让农杆菌细胞进入植物体内。
为了使转化生菜中的农杆菌正常生长繁殖，进而提高农杆菌携带的质粒的大量繁殖表达，需要使得植物宿主能够提供正常的营养供应。在一种优选的实施例中，对转化生菜进行光照培养包括：将转化生菜置于20～22℃的光照培养箱中培养3～4天，光照培养箱的光照强度为1800lx～2200lx，每天光照16h。
上述光照培养条件下为生菜最适生长条件，在上述培养条件下培养能够使得被感染叶片完成外源基因的表达，且不至于因农杆菌感染时间过长而导致叶片死亡。
为避免生菜叶片上的其他杂质干扰或影响农杆菌的转化效率，在一种优选的实施例中，在得到转化生菜之后，以及对转化生菜进行光照培养之前，制备方法还包括：对转化生菜依次进行无菌水漂洗、干燥以及保鲜膜包裹的步骤。
本申请中，通过对多种农杆菌菌株对美国大速生生菜的转化效率进行筛选，发现采用AGL1菌株时的转化效率及表达效率最高。一种优选的实施例中，农杆菌的菌株为AGL1。
在一种优选的实施例中，携带EV71病毒P1基因和3CD基因的质粒为pCAMBIA2301-3CD-P1。该质粒与之前报道的质粒相同，都是使用了P1基因的植物偏好性密码子，而未优化3CD基因在植物中的偏好性密码子。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种EV71病毒样颗粒产品，EV71病毒样颗粒产品采用上述任一种制备方法制备而成。优选地，EV71病毒样颗粒产品为含有EV71病毒样颗粒的美国大速生生菜，或从美国大速生生菜中分离纯化得到的EV71病毒样颗粒的疫苗制剂。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了上述任一种EV71病毒样颗粒的制备方法在疫苗研制中的应用。本申请的方法能够在植物表达系统中成功包装得到病毒样颗粒，为手足口疫苗研制提供了理论和实践基础。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
需要说明的是，以下实施例中所使用的美国大速生生菜(Lactuca sativavar.capatata L.)购自青县青丰种业有限公司。
实施例1
1.渗透液的制备：农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株AGL1(携带pCAMBIA2301-3CD-P1重组质粒)，接种到含卡那霉素(工作浓度50mg/L)的液体2×YT培养基中，28℃摇床培养16h。12000rmp离心3min收集菌体，弃上清。10mmol/L的MgCl2溶液洗涤菌体1次。用添加有6g/L葡萄糖、2mg/L激动素、300mg/L水解酪素和200μmol/L乙酰丁香酮的无菌10mmol/L MgCl2溶液重悬菌体，并调整至OD600nm＝0.6，在室温下静置2～3h。
2.真空渗透：美国散叶大速生生菜叶片用自来水漂洗2～3次，再用无菌水漂洗后风干。将叶片浸没于上述渗透液后置于真空装置中，0.045～0.050Mpa渗透浸染25min。取出叶片用无菌水漂洗，滤干后放在无菌滤纸上用保鲜膜包裹，放在20～22℃的光照培养箱中培养3-4d，光照强度2000lx，光照周期16h/d。
3.DOT-ELISA检测：提取感染叶片的总蛋白样品(提取液pH 7.0的0.2mol/L Tris-HCl)，和EV71VP1抗原按照顺序点在NC膜上，进行DOT-ELISA检测。一抗为抗-VP1多克隆抗体，二抗为羊抗兔酶标抗体。
检测结果见图1，从左到右依次为A：抗原；B-D：含双元载体pCAMBIA2301-P1-3CD的农杆菌AGL1感染过的生菜叶片；E：未感染的生菜叶片。
从图1的DOT-ELISA实验的染色效果看，B、C、D样品有明显的显色反应，说明蛋白样品中含有可与抗EV71VP1特异性结合的蛋白质。
4.电镜检测：截取感染的生菜叶片2mm2，放入电镜固定液(2.5wt％的戊二醛)中，透射电镜检测被感染叶片。检测结果见图2，从图2电镜检测结果图中可以看出，检测到颗粒样物质形状规则，直径约为20-30nm，形态和大小与肠道病毒EV71一致。
5.石蜡切片免疫组化检测：
1)截取感染3d的生菜叶片石蜡包埋，制备石蜡切片。
依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-二甲苯III 15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。
2)切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育25min，将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3)在组化圈内滴加3％BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
4)轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS稀释的兔源性抗-VP1多克隆抗体，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。
5)玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
6)切片稍甩干后在圈内滴加HRP标记的山羊抗兔抗体覆盖组织，室温孵育50min。
7)玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
8)切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性出现棕黄色时，自来水冲洗切片终止显色。苏木素复染细胞核3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。将切片依次放入75％酒精5min-85％酒精5min--无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
9)显微镜镜检，图像采集分析。
检测结果见图3A和图3B，图3A为未感染的生菜叶片；图3B含双元载体pCAMBIA2301-P1-3CD的农杆菌AGL1感染过的生菜叶片。图3A中苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色(图3B中框起来的区域)。从图3A和图3B的检测结果可以看出，渗透感染3d的生菜叶片表达产物中，含有可与抗EV71 VP1特异性结合的抗原。
实施例2
1.渗透液的制备：农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株AGL1(携带pCAMBIA2301-3CD-P1重组质粒)，接种到含卡那霉素(工作浓度50mg/L)的液体2×YT培养基中，28℃摇床培养16h。12000rmp离心3min收集菌体，弃上清。10mmol/L的MgCl2溶液洗涤菌体1次。用添加有2、4、6、8或10g/L葡萄糖，200μmol/L乙酰丁香酮的无菌10mmol/L MgCl2溶液重悬菌体，并调整至OD600nm＝0.6，在室温下静置2～3h。
2.注射渗透：用注射器针头轻轻在美国散叶大速生生菜叶片下表面上划出伤口，形成注射位点，用无针头的一次性注射器将渗透液通过注射位点轻轻注射到生菜叶片中，每个注射位点的量以菌体渗透液在叶面无法继续扩散为止，注射后用记号笔标记注射范围，将植株置于20～22℃的光照培养箱中培养1～5d，光照强度2000lx，光照周期16h/d。
3.GUS染色：每日用打孔器取注射位点附近的叶片进行X-Gluc染色。将叶片置于染色液中37℃金属浴2～16h。之后用70％的乙醇脱色直至叶绿素完全除去。
检测结果见表2，表中“/”表示叶片枯萎，“-”表示显色阴性，“+”表示显色弱阳性，“++”表示显色阳性，“+++”表示显色强阳性。
表2：葡萄糖浓度筛选结果
Figure BDA0002912075390000081
渗透感染第3天染色结果见图3，从左到右依次为A：添加2g/L葡萄糖；B：添加4g/L葡萄糖；C：添加6g/L葡萄糖；D：添加8g/L葡萄糖；E：添加10g/L葡萄糖；F：添加0g/L葡萄糖。
从表2和图3的检测结果可以看出，添加2～8g/L葡萄糖可以增强转化效果，以添加6g/L葡萄糖效果最佳。
实施例3
1.渗透液的制备：农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株AGL1(携带pCAMBIA2301-3CD-P1重组质粒)，接种到含卡那霉素(工作浓度50mg/L)的液体2×YT培养基中，28℃摇床培养16h。12000rmp离心3min收集菌体，弃上清。10mmol/L的MgCl2溶液洗涤菌体1次。用添加有1、1.5、2或2.5mg/L激动素，200μmol/L乙酰丁香酮的无菌10mmol/L MgCl2溶液重悬菌体，并调整至OD600nm＝0.6，在室温下静置2～3h。
2.注射渗透：用注射器针头轻轻在美国散叶大速生生菜叶片下表面上划出伤口，形成注射位点，用无针头的一次性注射器将渗透液通过注射位点轻轻注射到生菜叶片中，每个注射位点的量以菌体渗透液在叶面无法继续扩散为止，注射后用记号笔标记注射范围，将植株置于20～22℃的光照培养箱中培养1～5d，光照强度2000lx，光照周期16h/d。
3.GUS染色：每日用打孔器取注射位点附近的叶片进行X-Gluc染色。将叶片置于染色液中37℃金属浴2～16h。后用70％的乙醇脱色直至叶绿素完全除去。
检测结果见表3，表中“-”表示显色阴性，“+”表示显色弱阳性，“++”表示显色阳性，“+++”表示显色强阳性。
表3激动素(KT)浓度筛选结果
Figure BDA0002912075390000091
从表3的检测结果可以看出，添加1.5～2mg/L激动素可以增强转化效果，以添加2mg/L激动素效果最佳。
实施例4
1.渗透液的制备：农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株AGL1(携带pCAMBIA2301-3CD-P1重组质粒)，接种到含卡那霉素(工作浓度50mg/L)的液体2×YT培养基中，28℃摇床培养16h。12000rmp离心3min收集菌体，弃上清。10mmol/L的MgCl2溶液洗涤菌体1次。用添加有100、200、300或400mg/L水解酪素，200μmol/L乙酰丁香酮的无菌10mmol/LMgCl2溶液重悬菌体，并调整至OD600nm＝0.6，在室温下静置2～3h。
2.注射渗透：用注射器针头轻轻在美国散叶大速生生菜叶片下表面上划出伤口，形成注射位点，用无针头的一次性注射器将渗透液通过注射位点轻轻注射到生菜叶片中，每个注射位点的量以菌体渗透液在叶面无法继续扩散为止，注射后用记号笔标记注射范围，将植株置于20～22℃的光照培养箱中培养1～5d，光照强度2000lx，光照周期16h/d。
3.GUS染色：每日用打孔器取注射位点附近的叶片进行X-Gluc染色。将叶片置于染色液中37℃金属浴2～16h。后用70％的乙醇脱色直至叶绿素完全除去。
检测结果见表4，表中“/”表示叶片枯萎，“-”表示显色阴性，“+”表示显色弱阳性，“++”表示显色阳性，“+++”表示显色强阳性。
表4水解酪素浓度筛选结果
Figure BDA0002912075390000101
从表4的检测结果可以看出，添加100～300mg/L水解酪素可以增强转化效果，以添加200mg/L水解酪素效果最佳。
实施例5
1.渗透液的制备：农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株AGL1(携带pCAMBIA2301-3CD-P1重组质粒)，接种到含卡那霉素(工作浓度50mg/L)的液体2×YT培养基中，28℃摇床培养16h。12000rmp离心3min收集菌体，弃上清。10mmol/L的MgCl2溶液洗涤菌体1次。用添加有100、200或300mg/L水解酪素，6g/L葡萄糖，2mg/L激动素，200μmol/L乙酰丁香酮的无菌10mmol/L MgCl2溶液重悬菌体，并调整至OD600nm＝0.6，在室温下静置2～3h。
2.注射渗透：用注射器针头轻轻在美国散叶大速生生菜叶片下表面上划出伤口，形成注射位点，用无针头的一次性注射器将渗透液通过注射位点轻轻注射到生菜叶片中，每个注射位点的量以菌体渗透液在叶面无法继续扩散为止，注射后用记号笔标记注射范围，将植株置于20～22℃的光照培养箱中培养3～5d，光照强度2000lx，光照周期16h/d。
3.GUS染色：每日用打孔器取注射位点附近的叶片进行X-Gluc染色。将叶片置于染色液中37℃金属浴2～16h。后用70％的乙醇脱色直至叶绿素完全除去。
检测结果见表5，表中“++”表示显色阳性，“+++”表示显色强阳性。
表5添加葡萄糖和激动素对水解酪素最佳作用浓度的影响
Figure BDA0002912075390000111
从表5的检测结果可以看出，同时添加6g/L葡萄糖显著增强了转化效果，2mg/L激动素有效延缓了叶片的衰老，在组合后以添加300mg/L水解酪素增强转化效果最佳。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：在较优的真空渗透感染条件下，以农杆菌AGL1携带EV71P1和3CD基因，感染美国散叶大速生生菜叶片，表达出有免疫反应性的表达产物，且在被感染生菜叶片中包装获得病毒样颗粒。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南昌师范学院
<120> EV71病毒样颗粒产品、其制备方法及其应用
<130> PN124495NCSF
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2589
<212> DNA
<213> 肠道病毒71型(Human enterovirus 71)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2589)
<223> 肠道病毒E71型的P1基因的植物密码子优化后序列
<400> 1
atgggttcac aggtgtcaac acagagatct ggttctcacg aaaattcaaa ctcagctact 60
gagggttcta ctattaacta cactacaatt aactactata aagactctta tgctgcaaca 120
gcaggtaagc agtctctcaa gcaagatcca gacaaatttg caaatcctgt taaagacatt 180
ttcactgaaa tggcagcacc actgaagtct ccatcagctg aggcatgtgg atactcagat 240
agagtggcac aattgactat tggaaactca acaatcacta cacaagaagc tgcaaacatc 300
attgttggat atggtgagtg gccttcatac tgctctgatt ctgacgctac agcagtggat 360
aaaccaacaa gaccagatgt ttcagtgaat aggttttata cattggacac taaattgtgg 420
gagaaatcat ctaagggatg gtactggaag ttcccagatg tgttgactga aacaggagtt 480
tttggacaaa atgcacaatt ccactacctc tatagatcag gattctgtat ccacgtgcaa 540
tgcaatgctt ctaaattcca ccaaggagca ctcttggttg ctgtgttgcc agagtatgtt 600
attggaacag tggcaggagg tacaggaact gaagacattc acccacctta caagcagact 660
caacctggag ctgatggatt cgaattgcaa cacccttacg tgttggatgc tggaatctca 720
atttcacaat tgacagtgtg cccacatcag tggattaatt tgaggacaaa caattgtgct 780
acaattattg tgccatacat taacgcattg ccatttgatt ctgctttgaa ccactgtaac 840
tttggattgt tggttgtgcc tatttctcca ttggattacg accaaggagc aactccagtg 900
atccctatta ctatcacatt ggctccaatg tgttctgaat ttgcaggttt gaggcaagca 960
gttactcaag gatttcctac tgagttgaaa cctggaacaa accaattttt gacaactgac 1020
gatggagttt cagcacctat tttgccaaac tttcacccta ctccatgtat tcatattcct 1080
ggtgaagtta ggaatttgct tgagctttgc caggtggaga ctattttgga ggttaacaat 1140
gttcctacta atgctacttc tttgatggag agacttaggt tccctgtttc agcacaagca 1200
ggaaaaggtg agctttgtgc tgtgtttaga gctgatcctg gaagaaatgg accatggcaa 1260
tctactttgt tgggtcagtt gtgcggatac tacactcaat ggtcaggatc attggaagtg 1320
actttcatgt ttactggatc tttcatggct actggaaaga tgctcattgc ttatacacct 1380
ccaggaggtc ctttgcctaa ggacagggct actgctatgt tgggaactca cgttatctgg 1440
gattttggat tgcaatcttc tgttactttg gttattccat ggatctctaa cactcattat 1500
agagcacatg ctagagatgg agtgtttgac tactacacta caggattggt ttctatttgg 1560
tatcagacaa attacgtggt tccaatcggt gctcctaaca cagcttatat tattgcattg 1620
gctgcagctc aaaagaactt cactatgaaa ttgtgcaagg atgcttctga tatcttgcag 1680
actggaacta tccagggaga tagggtggca gatgttattg agtcttctat tggtgactct 1740
gtgtctagag ctttgactca agcattgcct gcacctacag gacagaacac acaggtgtct 1800
tctcacagat tggacactgg taaggttcca gcattgcaag ctgctgaaat tggagcatca 1860
tcaaatgctt ctgatgagtc tatgattgag acaagatgtg ttttgaactc tcactctaca 1920
gctgagacta ctctcgattc tttcttctct agagctggat tggttggaga gattgacctc 1980
cctttggaag gaacaactaa cccaaatggt tatgctaact gggatattga tattacaggt 2040
tacgctcaaa tgagaagaaa ggtggagttg ttcacttaca tgagatttga cgcagagttc 2100
acttttgttg cttgcacacc tactggacag gttgttccac aattgctcca atatatgttt 2160
gttccacctg gagcacctaa gccagattct agggaatctc tcgcatggca aactgctact 2220
aacccttcag tttttgttaa gttgccagac cctccagcac aggtttcagt tccattcatg 2280
tcacctgctt ctgcttatca atggttttat gatggatatc ctacattcgg tgaacacaaa 2340
caggagaaag atttggaata tggagcatgt cctaacaaca tgatgggtac attctcagtg 2400
aggactgttg gaacttctaa gtctaagtac cctttggtgg ttaggattta catgaggatg 2460
aagcacgtta gggcttggat tcctagacca atgagaaacc aaaactactt gttcaaagct 2520
aacccaaatt atgctggaaa ctctattaag ccaactggtg cttctagagc agctatcact 2580
actttgtaa 2589

Claims (11)

1.一种EV71病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将美国大速生生菜叶置于农杆菌的渗透液中进行渗透浸染，获得转化生菜，其中，所述农杆菌含有携带EV71病毒P1基因和3CD基因的质粒；
对所述转化生菜进行光照培养，以使所述转化生菜表达所述质粒，从而获得所述EV71病毒样颗粒。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述渗透液包括：2～8g/L葡萄糖、1.5～2mg/L激动素、100～300mg/L水解酪素、100～300μmol/L乙酰丁香酮及10mmol/L的无菌MgCl2溶液；
优选地，所述渗透液包括6g/L葡萄糖、2mg/L激动素、300mg/L水解酪素和200μmol/L乙酰丁香酮及10mmol/L的无菌MgCl2溶液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述渗透浸染之前，所述制备方法还包括：将含有农杆菌的渗透液调整至OD600为0.55～0.65，然后于20～30℃下静置2～3h。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述渗透浸染包括：
将所述美国大速生生菜叶浸没于所述农杆菌的所述渗透液中；
将所述渗透液置于0.045～0.050Mpa的真空压力下渗透浸染20～30min，得到所述转化生菜。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，对所述转化生菜进行光照培养包括：
将所述转化生菜置于20～22℃的光照培养箱中培养3～4天，所述光照培养箱的光照强度为1800lx～2200lx，每条光照15～17h。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在得到所述转化生菜之后，以及对所述转化生菜进行光照培养之前，所述制备方法还包括：对所述转化生菜依次进行无菌水漂洗、干燥以及保鲜膜包裹的步骤。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述农杆菌的菌株为AGL1。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述携带EV71病毒P1基因和3CD基因的质粒为pCAMBIA2301-3CD-P1。
9.一种EV71病毒样颗粒产品，其特征在于，所述EV71病毒样颗粒产品采用权利要求1至8中任一项所述的制备方法制备而成。
10.根据权利要求9所述的EV71病毒样颗粒产品，其特征在于，所述EV71病毒样颗粒产品为含有所述EV71病毒样颗粒的美国大速生生菜，或从所述美国大速生生菜中分离纯化得到的所述EV71病毒样颗粒的疫苗制剂。
11.权利要求1至8中任一项所述的EV71病毒样颗粒的制备方法在疫苗研制中的应用。
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