CN111849849A - 布鲁氏菌菌影菌株、布鲁氏菌菌影疫苗及制备方法 - Google Patents

布鲁氏菌菌影菌株、布鲁氏菌菌影疫苗及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种布鲁氏菌菌影菌株、布鲁氏菌菌影疫苗及制备方法，涉及生物技术领域，本发明提供的布鲁氏菌菌影菌株，包括含有噬菌体裂解蛋白E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因的布鲁氏菌菌株。其中，噬菌体裂解蛋白E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因在布鲁氏菌菌株内可分别表达噬菌体裂解蛋白E和金黄色葡萄球菌核酸酶A，二者均能够以生物灭活的方式得到布鲁氏菌抗原。与传统灭活方式相比，本发明提供的布鲁氏菌菌影菌株保留了细菌表面抗原决定簇的天然结构，接种后更能有效的激发机体的免疫反应。

Description

布鲁氏菌菌影菌株、布鲁氏菌菌影疫苗及制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种布鲁氏菌菌影菌株、布鲁氏菌菌影疫苗及制备方法。
背景技术
当前布鲁氏菌病仍处在历史流行的高峰期，人间、畜间流行状况都不容乐观，发病动物为主要传染源，尚无人用疫苗。近年来随着养殖密度的增加及区域动物流动性增加，布病疫情呈现出爆发式增长，处于历史高度流行时期。疫苗接种作为疫病防控的最有效手段，在布鲁氏菌病控制的过程中尤为如此。国内外主要使用的商品化疫苗多数为减毒活疫苗，主要分为S19、Rev1、A19、S2、M5，这些疫苗的具有效力高、保护周期长的优点，但也存在致命的不足，如毒力残留，对人员、动物仍具有感染风险，疫苗接种后存在排毒，疫苗免疫后无法区分疫苗免疫和野毒感染。这些缺点严重限制了布鲁氏菌病疫苗在布病防控过程中的作用。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种布鲁氏菌菌影菌株，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供上述布鲁氏菌菌影菌株的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供一种布鲁氏菌菌影疫苗。
本发明的第四个目的在于提供上述一种布鲁氏菌菌影疫苗的制备方法。
本发明提供了一种布鲁氏菌菌影菌株，所述布鲁氏菌菌影菌株包括含有噬菌体裂解蛋白E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因的布鲁氏菌菌株。
进一步的，所述噬菌体裂解蛋白E基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示序列90％以上同源性的序列；
优选地，所述金黄色葡萄球菌核酸酶A基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.2所示序列90％以上同源性的序列；
优选地，所述布鲁氏菌菌株为A19菌株。
进一步的，所述噬菌体裂解蛋白E基因表达噬菌体裂解蛋白E，所述金黄色葡萄球菌核酸酶A基因表达金黄色葡萄球菌核酸酶A；
所述噬菌体裂解蛋白E与所述金黄色葡萄球菌核酸酶A通过linker氨基酸相连接；
优选地，由氨基端至羧基端依次为噬菌体裂解蛋白E、linker氨基酸和金黄色葡萄球菌核酸酶A；
优选地，所述linker氨基酸具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
本发明还提供了上述的布鲁氏菌菌影菌株的制备方法，所述制备方法包括：
将含有噬菌体裂解蛋白E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因的质粒转化至布鲁氏菌菌株内，得到所述布鲁氏菌菌影菌株。
进一步的，所述质粒还包括功能性元件；
优选地，所述功能性元件包括温控元件。
进一步的，通过电转化的方式将质粒转化至布鲁氏菌菌株内。
本发明还提供了一种布鲁氏菌菌影疫苗，所述布鲁氏菌菌影疫苗包括佐剂和灭活的上述的布鲁氏菌菌影菌株的抗原。
进一步的，所述抗原的含量为每头份含灭活前布鲁氏菌菌影菌株的抗原300-600CFU；
优选地，所述佐剂包括201、206或铝胶；
优选地，所述佐剂为201，所述抗原和佐剂的质量比为1:1-2，优选为1:1；
优选地，所述佐剂为206，所述抗原和佐剂的质量比为1:1-2，优选为1:1；
优选地，所述佐剂为铝胶，所述抗原和佐剂的质量比为1:4-8，优选为1:5-6。
另外，本发明还提供了上述的布鲁氏菌菌影疫苗的制备方法，将佐剂和灭活的上述的布鲁氏菌菌影菌株的抗原进行乳化，制备得到所述布鲁氏菌菌影疫苗。
进一步的，当所述佐剂为201或206时，乳化的条件满足如下条件中的至少一种：
乳化温度30～34℃，300～500转/min，乳化时间10～15min；
当所述佐剂为铝胶时，乳化的条件满足如下条件中的至少一种：
乳化温度25～30℃，120～150转/min，乳化时间1～2小时。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的布鲁氏菌菌影菌株，包括含有噬菌体裂解蛋白E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因的布鲁氏菌菌株。其中，噬菌体裂解蛋白E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因在布鲁氏菌菌株内可分别表达噬菌体裂解蛋白E和金黄色葡萄球菌核酸酶A，二者均能够以生物灭活的方式得到布鲁氏菌抗原。与传统灭活方式相比，本发明提供的布鲁氏菌菌影菌株保留了细菌表面抗原决定簇的天然结构，接种后更能有效的激发机体的免疫反应。
以本发明提供的布鲁氏菌菌影菌株作为灭活抗原，在保证疫苗效力高、保护周期长的基础上，能够避免毒力残留，同时便于区分疫苗免疫和野毒感染，为布病防控提供有力支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实验例1提供的攻毒保护结果图；
图2为本发明实验例1提供的鉴别诊断ELISA检测结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
根据本发明的一个方面，提供了一种布鲁氏菌菌影菌株，所述布鲁氏菌菌影菌株包括含有噬菌体裂解蛋白E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因的布鲁氏菌菌株。
其中，噬菌体裂解蛋白E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因在布鲁氏菌菌株内可分别表达噬菌体裂解蛋白E和金黄色葡萄球菌核酸酶A，二者均能够以生物灭活的方式得到布鲁氏菌抗原。裂解蛋白E能作用于细菌细胞壁，在细胞壁上形成一定大小的孔洞，在渗透压的作用下使其细胞质，核酸流出，使细菌死亡；核酸酶A可作用于细菌核酸，使其降解为一定大小的片段，失去活性，进而灭活细菌；两种灭活方式联合使用可提高灭活效率，降解细菌核酸具有更高的生物安全性。与传统灭活方式相比，本发明提供的布鲁氏菌菌影菌株保留了细菌表面抗原决定簇的天然结构，接种后更能有效的激发机体的免疫反应。
在一些优选的实施方式中，所述噬菌体裂解蛋白E基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示序列90％以上同源性的序列。SEQ ID NO.1核苷酸序列：
ATGGTACGATGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGTTTATTGCTGCCGTCATTGCTTATTATGTTCATCCCGTCAACATTCAAACGGCCTGTCTCATCATGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAATTGTTCGCGTTTACCTTGCGTGTACGCGCAGGAAACACTGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAAAACGTGCGTCAAAAATTACGTGCGGAAAGAG。
通过优化噬菌体裂解蛋白E的基因序列，能够使得其在布鲁氏菌中的表达效率更高。
所述金黄色葡萄球菌核酸酶A基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.2所示序列90％以上同源性的序列。
SEQ ID NO.2核苷酸序列：
ATGACAGAATACTTATTAAGTGCTGGCATATGTATGGCAATTGTTTCAATATTACTTATAGGGATGGCTATCAGTAATGTTTCGAAAGGGCAATACGCAAAGAGGTTTTTCTTTTTCGCTACTAGTTGCTTAGTGTTAACTTTAGTTGTAGTTTCAAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAGAAGTGGTTCTGAAGATCCAACAGTATATAGTGCAACTTCAACTAAAAAATTACATAAAGAACCTGCGACATTAATTAAAGCGATTGATGGTGACACGGTTAAATTAATGTACAAAGGTCAACCAATGACATTCAGACTATTATTAGTTGATACACCTGAAACAAAGCATCCTAAAAAAGGTGTAGAGAAATATGGCCCTGAAGCAAGTGCATTTACGAAAAAAATGGTAGAAAATGCAAATAAAATTGAAGTCGAGTTTGACAAAGGTCAAAGAACTGATAAATATGGACGAGGCTTAGCGTATATTTATGCTGATGGAAAAATGGTAAACGAAGCTTTAGTTCGTCAAGGCTTGGCTAAAGTTGCTTATGTTTATAAACCTAACAATACACATGAACAACTTTTAAGAAAAAGTGAAGCACAAGCGAAAAAAGAGAAATTAAATATTTGGAGCGAAGACAACGCTGATTCAGGTCAATAA。
本实施方式中，金黄色葡萄球菌核酸酶A的基因序列为完整的经优化的序列，通过优化金黄色葡萄球菌核酸酶A的基因序列，能够使得其在布鲁氏菌中的表达效率更高。
需要说明的是，在本发明中，“同一性”指的是核苷酸序列间的相似性，包括与本发明所述的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少90％(例如可以为，但不限于90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或者更高)同一性、并且具有相同功能的核苷酸序列。当选择SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列作为本发明提供的优化后的噬菌体裂解蛋白E基因技金黄色葡萄球菌核酸酶A基因序列时，其在布鲁氏菌中的具有更高的表达效率。
在一些优选的实施方式中，选择A19菌株作为布鲁氏菌菌影菌株。
疫苗菌株A19为当下奶牛布病防控的主要疫苗菌株，其市场需求较大，且牛布病适合用牛种布鲁氏菌(如疫苗菌株A19)进行防控。需要说明的是，本发明不限制对布鲁氏菌菌株的选择，其他疫苗菌株也可作为制备本发明布鲁氏菌菌影的菌株。
在本发明中，所述噬菌体裂解蛋白E基因能够表达噬菌体裂解蛋白E，所述金黄色葡萄球菌核酸酶A基因能够表达金黄色葡萄球菌核酸酶A，表达得到的噬菌体裂解蛋白E和金黄色葡萄球菌核酸酶A优选通过linker氨基酸相连接，形成融合蛋白。
优选地，由氨基端至羧基端依次为噬菌体裂解蛋白E、linker氨基酸和金黄色葡萄球菌核酸酶A。
通过linker氨基酸相连，可以降低蛋白质构象改变的可能。E蛋白在前可保证核酸酶A的充分表达。
其中，用于连接噬菌体裂解蛋白E和金黄色葡萄球菌核酸酶A的linker氨基酸具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO.3：
GSGQGSGQGS。
通过特定氨基酸序列的Linker进行连接，可以进一步提高融合蛋白的稳定性、表达量和生物活性。
根据本发明的第二个方面还提供了上述的布鲁氏菌菌影菌株的制备方法，所述制备方法包括：
将含有噬菌体裂解蛋白E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因的质粒转化至布鲁氏菌菌株内，得到所述布鲁氏菌菌影菌株。
本发明提供的布鲁氏菌菌影菌株的制备方法工艺简单，通过常规的转染操作即可得到布鲁氏菌菌影菌株，对设备及实验人员的要求均较低，适合推广应用。
在一些优选的实施方式中，所述质粒还包括功能性元件。
在质粒中连接功能性元件能够给质粒提供相应的功能，例如，当选择温控元件作为质粒的功能性元件时，在特定的温度下即可使其中的噬菌体裂解蛋白E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因大量表达噬菌体裂解蛋白E和金黄色葡萄球菌核酸酶A，从而进一步实现布鲁氏菌菌影菌株的制备。
在一些优选的实施方式中，通过电转化的方式将质粒转化至布鲁氏菌菌株内。
使用电转化的方式转化质粒，具有转化效率高的优点。
根据本发明的第三个方面，本发明还提供了一种布鲁氏菌菌影疫苗，所述布鲁氏菌菌影疫苗包括佐剂和灭活的上述的布鲁氏菌菌影菌株的抗原。
基于本发明提供的布鲁氏菌菌影菌株的有益效果，以本发明提供的布鲁氏菌菌影菌株作为灭活抗原，在保证疫苗效力高、保护周期长的基础上，能够避免毒力残留，同时便于区分疫苗免疫和野毒感染，为布病防控提供有力支持。
在一些优选的实施方式中，所述抗原的含量为每头份含灭活前布鲁氏菌菌影菌株的抗原300-600CFU，例如可以为，但不限于300CFU、350CFU、400CFU、450CFU、500CFU、550CFU或600CFU。
其中，所述佐剂优选包括201、206或铝胶。
当所述佐剂为201时，所述抗原和佐剂的质量比为1:1-2，例如可以为，但不限于1:1、1:1.5或1:2，优选为1:1；
当所述佐剂为206时，所述抗原和佐剂的质量比为1:1-2，例如可以为，但不限于1:1、1:1.5或1:2，优选为1:1；
当所述佐剂为铝胶时，所述抗原和佐剂的质量比为1:4-8，例如可以为，但不限于1:4、1:5、1:6、1:7或1:8，优选为1:5-6。
通过针对不同佐剂和抗原的用量进行进一步的限定，能够使得制备得到的疫苗在满足免疫效力的基础上，避免原材料的浪费，有效节约成本。
另外，本发明还提供了上述的布鲁氏菌菌影疫苗的制备方法，将佐剂和灭活的上述的布鲁氏菌菌影菌株的抗原进行乳化，制备得到所述布鲁氏菌菌影疫苗。
在一些优选的实施方式中，当所述佐剂为201或206时，乳化的条件满足如下条件中的至少一种：
乳化温度30～34℃，例如可以为，但不限于30℃、31℃、32℃、33℃或34℃；300～500转/min，例如可以为，但不限于300转/min、350转/min、400转/min、450转/min或500转/min；乳化时间10～15min，例如可以为，但不限于10min、11min、12min、13min、14min或15min。
当所述佐剂为铝胶时，乳化的条件满足如下条件中的至少一种：
乳化温度25～30℃，例如可以为，但不限于25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃；120～150转/min，例如可以为，但不限于120转/min、130转/min、140转/min或150转/min；乳化时间1～2小时，例如可以为，但不限于1小时、1.2小时、1.5小时、1.8小时或2小时。
通过对应用不同佐剂时的乳化条件进行限定，能够保证乳化更完全，同时有效控制温度、时间等制备成本。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明实施例中用到的主要试剂信息如下：
限制性内切酶EcoR I、BamH I、Xba I、Xho I和T4 DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；胰蛋白大豆肉汤培养基(TSB)、胰蛋白大豆肉汤琼脂培养基(TSA)购自美国BD公司；氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)购自美国sigma公司；质粒提取试剂盒、核酸凝胶回收试剂盒、基因组提取试剂盒均购自天根生化科技有限公司。
实施例1布鲁氏菌菌影菌株的制备及培养
1.布鲁氏菌菌影菌株的制备
1.1构建布鲁氏菌菌影菌株是通过电转化方式将含有噬菌体裂解蛋白E基因、金黄色葡萄球菌核酸酶A基因(SNA)、温控原件的质粒转化至A19菌株内构成。
1.2噬菌体E基因扩增及克隆
1.2.1 E基因扩增
以pUC57-E质粒为模板，用E基因扩增引物E-F，E-R进行扩增，反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环，72℃延伸10分钟。采用50μl反应体系，具体成份如下：
E基因扩增PCR反应体系表
Figure BDA0002606914070000101
1.2.2 E基因克隆
用琼脂糖胶回收试剂盒回收E基因，4℃过夜将E基因与pMD18-T Simple载体连接，转化至DH5α感受态细胞中，取100μl感受态细胞与载体混合液涂布于取含Amp(100μg/ml)TSA平皿上，36～38℃培养24小时。
连接体系信息
Figure BDA0002606914070000111
1.2.3 E基因阳性克隆的鉴定
挑取单克隆菌落，以其为模板，用E-F，E-R引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落经DNA测序进一步鉴定。
1.2.4 PBV220-E质粒的构建及鉴定
对测序正确PMD18-T-E和PBV220质粒用内切酶EcoR I，BamH I分别进行双酶切，琼脂糖胶回收试剂盒分别回收E基因和PBV220载体序列，4℃过夜将E基因与PBV220载体连接，连接产物转化至DH5α感受态细胞中。取100μl感受态细胞与载体混合液涂布于取含Amp(100μg/ml)TSA平皿上，27～29℃培养24小时。挑取单克隆菌落，以其为模板，用E-F，E-R引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落经DNA测序进一步鉴定。
1.3 pBBR1MCS-2-TC/E质粒的构建及鉴定
1.3.1 TC/E序列扩增
以正确构建的PBV220-E质粒为模板，用引物TC/E-F，TC/E-E进行扩增，反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸2分钟，30个循环，72℃延伸10分钟。采用50μl反应体系，具体成份如下：
TC/E基因序列扩增PCR反应体系表
Figure BDA0002606914070000121
按照2.2中方法将TC/E序列连接至PMD18-T simple载体，对PMD18-T-TC/E质粒进行测序鉴定。
1.3.2 TC/E序列与pBBR1MCS-2载体连接
将鉴定正确的PMD18-T-TC/E质粒和pBBR1MCS-2载体用内切酶Xba I，Xho I分别进行双酶切，回收TC/E序列和PBBR1MCS-2载体序列，用T4连接酶连接后转化入DH5α感受态细胞中。取100μl感受态细胞与载体混合液涂布于取含Kan(100μg/ml)TSA平皿上，27～29℃培养24小时。挑取电转化后单克隆菌落，以其为模板，用TC/E-F，TC/E-R引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落经DNA测序进一步鉴定，测序无误后置-80℃备用。
1.4布鲁氏菌A19株感受态细胞的制备
将布鲁氏菌A19株划线接种于TSA平皿，36～38℃培养72小时，挑取单菌落接种于10ml TSB培养基，以200r/min，36～38℃培养48小时，按照2％的比例将菌液接种于200mlTSB培养基，以200r/min，36～38℃培养18～24小时，以8000r/min离心20分钟收取菌体，用预冷的蒸馏水洗涤菌体2次，用预冷的15％甘油洗涤2次，尽量弃去上清，沉淀用2ml预冷的15％甘油重悬，分装为100μl/管，置-80℃备用。
1.5重组pBBR1MCS-2-TC/E质粒的电转化
将布鲁氏菌感受态细胞从-80℃取出置冰上备用，吸取重组pBBR1MCS-2-TC/E质粒10μl缓慢加入到感受态细胞中，轻轻混匀。吸取100μl混合液贴壁加入直径为0.1cm的电转杯中，盖紧橡胶盖。擦去电转杯外壁多余的水分，放入电转仪中，以1.8kV，400Ω进行电转。电转完成后立即向电转杯中加入1ml TSB培养基，以160r/min，27～29℃培养4小时，吸取200μl菌液涂布于含Kan(100μg/ml)TSA平皿，27～29℃培养3～7日。
1.6布鲁氏菌A19-BG株的鉴定
挑取单菌落以引物TC/E-F，TC/E-R进行鉴定，阳性克隆即为布鲁氏菌A19-BG株。
2.布鲁氏菌菌影菌株的培养工艺
2.1种子制备为：布鲁氏菌菌影菌株原始种子划线接种于含卡那抗生素(终浓度50μg/ml)的TSA琼脂平皿，25～30℃培养24～36小时，挑取2～5个菌落接种于10～20mL含有卡那抗生素(终浓度50μg/ml)的TSB肉汤培养基，25～30℃，以120～160转/min培养24～36小时，即为种子液。
2.2抗原菌液制备为：将种子液以1％～2％的比例接种于1～2L含有卡那抗生素(终浓度50μg/ml)的TSB肉汤培养基中，25～30℃培养24～36小时，活菌计数后升高温度至41～43℃培养48～72小时进行灭活，即为灭活抗原菌液。
2.3菌液浓缩为：将灭活后布鲁氏菌菌影抗原菌液以8000～10000转/min，离心20～30min，收集沉淀，用无菌水重悬洗涤抗原，重复3～4次，调整抗原浓度至1000～2000CFU/mL(灭活前)，即为浓缩后抗原。
2.4灭活检验为：吸取灭活后抗原菌液涂布于3个TSA平皿，每皿100μL；吸取灭活后抗原菌液，分别接种于3只TSB肉汤试管，接种比例为1％～2％。将平皿和试管放置于36～37℃恒温培养箱，培养3～5日，均无菌生长即为灭活完全。
实施例2布鲁氏菌菌影疫苗的制备
1.选择201为疫苗佐剂
应用本发明实施例1提供的布鲁氏菌菌影灭活抗原与201佐剂为原料，通过乳化，制成布鲁氏菌菌影疫苗。
其中，抗原含量为每头份含灭活前布鲁氏菌菌影抗原300～600CFU，抗原和佐剂的质量比为1:1。
乳化条件为：温度30～34℃，300～500转/min，时间10～15min。
2.选择206为疫苗佐剂
应用本发明实施例1提供的布鲁氏菌菌影灭活抗原与206佐剂为原料，通过乳化，制成布鲁氏菌菌影疫苗。
其中，抗原含量为每头份含灭活前布鲁氏菌菌影抗原300～600CFU，抗原和佐剂的质量比为1:1。
乳化条件为：温度30～34℃，300～500转/min，时间10～15min。
3.选择铝胶为疫苗佐剂
应用本发明实施例1提供的布鲁氏菌菌影灭活抗原与铝胶佐剂为原料，通过乳化，制成布鲁氏菌菌影疫苗。
其中，抗原含量为每头份含灭活前布鲁氏菌菌影抗原300～600CFU，抗原和佐剂的质量比为1:5。
乳化条件为：温度25～30℃，120～150转/min，时间1～2小时。
实验例1
3～10月龄布鲁氏菌阴性犊牛150头，分为3组，其中50头免疫本发明实施例2提供的布鲁氏菌菌影201佐剂疫苗，每头牛臀部肌肉接种1头份，14日后以相同方式进行加强免疫；50头免疫接种布鲁氏菌病活疫苗(A19株)，每头牛皮下接种1头份；50头为攻毒对照。在布鲁氏菌菌影疫苗加强免疫后28日，每个试验组分别随机选取5头试验牛用野生型布鲁氏菌2308株进行攻击，每头牛点眼接种1×108CFU，攻毒后45日宰杀所有试验牛只，进行分菌检测评价其保护效率。布鲁氏菌菌影疫苗加强免疫后28日、攻毒后30日采集所有试验牛血清，用于鉴别诊断。
具体结果：
免疫后28日用野毒2308株进行攻击，攻击后45日宰杀，检测组织中2308的含菌量，若组织中分离到2308菌株则认为未保护，详见图1。
以布鲁氏菌菌影抗原未含有，野毒菌株含有的差异蛋白50s核糖体蛋白L32为靶蛋白，构建血清学检测ELISA，对试验过程中所收集的血清进鉴别，详见图2。
包被：L32蛋白以0.5μg/ml的浓度包被酶标板，每孔100μl，分别4℃过夜、37℃2小时包被。
洗涤：弃去板内包被液，350μl/孔PBST洗涤3遍。
封闭：含8％兔血清PBST溶液，200μl/孔，37℃孵育2h。
洗涤：弃去板内封闭液，350μl/孔PBST洗涤3遍。
加样：血清样品1:50倍稀释，100μl/孔，振摇30s，37℃静置孵育1h。
洗涤：弃去板内样品，350μl/孔PBST洗涤3遍。
酶标二抗：兔抗牛IgG 1∶8000倍稀释，每孔加入100μl，振摇30s，37℃静置30min。
洗涤：弃去板内酶标二抗，350μl/孔PBST洗涤4遍。
底物显色液：每孔加TMB 100μl，室温反应5min，观察阳性对照孔产生明显颜色变化。
终止：各反应孔中加入2mol/L硫酸50μl。
读值：650波长读值。
由以上攻毒保护和鉴别诊断结果可以得出以下结论：
本发明所提供的布鲁氏菌菌影疫苗可以为机体提供有效的保护力，抵御野生型布鲁氏菌2308的攻击，其效力与布鲁氏菌病活疫苗(A19株)一致；布鲁氏菌菌影疫苗接种后不能诱导差异蛋白L32的抗体，而布鲁氏菌病活疫苗(A19株)接种和野毒感染的血清中均可检测出差异蛋白L32的抗体，两者之间的L32抗体差异极显著(P﹤0.001)，进而说明布鲁氏菌菌影疫苗免疫后可以做到疫苗免疫和野毒感染之间的区分，本发明所提供的布鲁氏菌菌影疫苗解决的当前布鲁氏菌病防控的难题，补充了现有活疫苗的不足，为布鲁氏菌的防控和净化提供有利的武器。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天康生物股份有限公司
<120> 布鲁氏菌菌影菌株、布鲁氏菌菌影疫苗及制备方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 273
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggtacgat ggactttgtg ggataccctc gctttcctgc tcctgttgag tttattgctg 60
ccgtcattgc ttattatgtt catcccgtca acattcaaac ggcctgtctc atcatggaag 120
gcgctgaatt tacggaaaac attattaatg gcgtcgagcg tccggttaaa gccgctgaat 180
tgttcgcgtt taccttgcgt gtacgcgcag gaaacactga cgttcttact gacgcagaag 240
aaaacgtgcg tcaaaaatta cgtgcggaaa gag 273
<210> 2
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgacagaat acttattaag tgctggcata tgtatggcaa ttgtttcaat attacttata 60
gggatggcta tcagtaatgt ttcgaaaggg caatacgcaa agaggttttt ctttttcgct 120
actagttgct tagtgttaac tttagttgta gtttcaagtc taagtagctc agcaaatgca 180
tcacaaacag ataacggcgt aaatagaagt ggttctgaag atccaacagt atatagtgca 240
acttcaacta aaaaattaca taaagaacct gcgacattaa ttaaagcgat tgatggtgac 300
acggttaaat taatgtacaa aggtcaacca atgacattca gactattatt agttgataca 360
cctgaaacaa agcatcctaa aaaaggtgta gagaaatatg gccctgaagc aagtgcattt 420
acgaaaaaaa tggtagaaaa tgcaaataaa attgaagtcg agtttgacaa aggtcaaaga 480
actgataaat atggacgagg cttagcgtat atttatgctg atggaaaaat ggtaaacgaa 540
gctttagttc gtcaaggctt ggctaaagtt gcttatgttt ataaacctaa caatacacat 600
gaacaacttt taagaaaaag tgaagcacaa gcgaaaaaag agaaattaaa tatttggagc 660
gaagacaacg ctgattcagg tcaataa 687
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gly Ser Gly Gln Gly Ser Gly Gln Gly Ser
1 5 10

Claims (10)

1.一种布鲁氏菌菌影菌株，其特征在于，所述布鲁氏菌菌影菌株包括含有噬菌体裂解蛋白E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因的布鲁氏菌菌株。
2.根据权利要求1所述的布鲁氏菌菌影菌株，其特征在于，所述噬菌体裂解蛋白E基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示序列90％以上同源性的序列；
优选地，所述金黄色葡萄球菌核酸酶A基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.2所示序列90％以上同源性的序列；
优选地，所述布鲁氏菌菌株为A19菌株。
3.根据权利要求1或2所述的布鲁氏菌菌影菌株，其特征在于，所述噬菌体裂解蛋白E基因表达噬菌体裂解蛋白E，所述金黄色葡萄球菌核酸酶A基因表达金黄色葡萄球菌核酸酶A；
所述噬菌体裂解蛋白E与所述金黄色葡萄球菌核酸酶A通过linker氨基酸相连接；
优选地，由氨基端至羧基端依次为噬菌体裂解蛋白E、linker氨基酸和金黄色葡萄球菌核酸酶A；
优选地，所述linker氨基酸具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3任一项所述的布鲁氏菌菌影菌株的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将含有噬菌体裂解蛋白E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因的质粒转化至布鲁氏菌菌株内，得到所述布鲁氏菌菌影菌株。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述质粒还包括功能性元件；
优选地，所述功能性元件包括温控元件。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，通过电转化的方式将质粒转化至布鲁氏菌菌株内。
7.一种布鲁氏菌菌影疫苗，其特征在于，所述布鲁氏菌菌影疫苗包括佐剂和灭活的权利要求1-3任一项所述的布鲁氏菌菌影菌株的抗原。
8.根据权利要求7所述的布鲁氏菌菌影疫苗，其特征在于，所述抗原的含量为每头份含灭活前布鲁氏菌菌影菌株的抗原300-600CFU；
优选地，所述佐剂包括201、206或铝胶；
优选地，所述佐剂为201，所述抗原和佐剂的质量比为1:1-2，优选为1:1；
优选地，所述佐剂为206，所述抗原和佐剂的质量比为1:1-2，优选为1:1；
优选地，所述佐剂为铝胶，所述抗原和佐剂的质量比为1:4-8，优选为1:5-6。
9.权利要求7所述的布鲁氏菌菌影疫苗的制备方法，其特征在于，将佐剂和灭活的权利要求1-3任一项所述的布鲁氏菌菌影菌株的抗原进行乳化，制备得到所述布鲁氏菌菌影疫苗。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，当所述佐剂为201或206时，乳化的条件满足如下条件中的至少一种：
乳化温度30～34℃，300～500转/min，乳化时间10～15min；
当所述佐剂为铝胶时，乳化的条件满足如下条件中的至少一种：
乳化温度25～30℃，120～150转/min，乳化时间1～2小时。
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