KR20170034022A - 고스트 브루셀라 아보투스 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 브루셀라병 예방용 백신 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고스트 브루셀라 아보투스 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 브루셀라병 예방용 백신 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, T4 파지 라이소자임(Lysozyme) 유전자; 효소에 의한 절단서열; 및 PMAP-36 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체인 대장균 Bl21(DE3), 상기 균주로부터 발현 정제된 T4 파지 라이소자임-PMAP-36, 상기 정제된 T4 파지 라이소자임-PMAP-36로 브루셀라 아보투스 국내 분리주가 용균되어 제작된 고스트 브루셀라 아보투스 균주, 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 브루셀라병 예방 또는 치료용 백신 조성물, 및 브루셀라병 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 고스트 브루셀라 아보투스 균주는 생균백신과 유사한 면역원성 및 예방효과를 나타내면서 병원성 복귀 및 생태계 오염의 우려가 없으며, 항생제 내성 유전자가 수평 또는 수직 전달될 우려 없이 고스트화되기 때문에 생산비를 감소시킬 수 있으며, 브루셀라병에 대한 우수한 예방 효과를 가지고 있다.

Description

고스트 브루셀라 아보투스 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 브루셀라병 예방용 백신 조성물{Ghost Brucella abortus and Vaccine Composition for Preventing Brucellosis Comprising the Same}
본 발명은 고스트 브루셀라 아보투스 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 브루셀라병 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.
브루셀라병(Brucellosis)은 포유동물 특히 소를 포함한 반추동물, 돼지, 말, 산양, 면양, 개, 사슴 등에서 유산 및 불임을 일으키고, 사람에서는 몰타열 (Malta fever, Melitensis fever)을 포함한 열병(파상열), 관절염 및 오한을 유발하는 인수 공통의 전염병이다. 브루셀라병은 원인균으로 브루셀라 아보투스 (Brucella abortus, B. abortus), 브루셀라 멜리텐시스 (Brucella melitensis), 브루셀라 수이스 (Brucella suis) 및 브루셀라 캐니스 (Brucella canis) 등이 감염되어 유발되는 것으로 보고되어 있다. 이중 브루셀라 아보투스는 소에서 발견되는 병원균으로 양축 농가에 피해를 주어 국가 경제적으로 큰 문제가 되고 있다.
이러한 높은 사회경제적 영향 때문에, 인식 확산을 비롯한 위생 기준 개선 및 백신 이용과 같은 다수의 접근법을 실시하여 소의 브루셀라병의 확산을 방지하고 있다. 현재 약독화 생백신은 가축 브루셀라병의 예방에 사용할 수 있다. 그 중, B. abortus S19 균주 및 B. abortus RB51 균주는 이미 널리 이용되고 있다(Avila-Calderon et al., 2013; Olsen 2013). B. abortus 균주 S19는 성체 소의 낙태를 방지하고, 브루셀라병을 제어하는데 매우 효과적이다. 또한, 무리의 질병의 유병률을 감소하는 데 도움이 된다. 그러나, B. abortus S19 균주는 감염된 동물과 예방 접종된 동물을 구별하지 못한다. 또한, 가축에 있어 낮은 수준의 낙태 위험이 있다(Olsen et al., 2009; Avila-Calderon e al., 2013; Olsen 2013). 약독화된 균주 RB51는 B. abortus S19 균주의 대안이다. RB51 균주 백신은 덜 낙태되고 덜 치명적이다. 또한, 표준 혈청학적 진단 테스트에 대한 항체 반응을 유도하지 않는다. 또한, 3 개월 이상의 송아지에게 사용하는 것이 안전하다(Avila-Calderon e al., 2013; Olsen 2013; Olsen et al., 2009). 그러나, RB51 균주로 예방접종한 임신 소 는 낮은 수준의 유산이나 조산을 야기할 수 있다. 따라서, 임신한 소에게는 주의하여 이용하는 것이 추천된다(Olsen et al., 2009; Lin and He 2012; Avila-Calderon e al., 2013; Fluegel Dougherty et al., 2013; Olsen 2013; Kim et al., 2014). 약독화 생백신의 사용이 브루셀라 병을 예방하는 것이 일반적이지만, 그것은 또한 병원성 복귀 및 낙태 유발 가능성 때문에, 높은 위험성을 제시한다. 이에, 브루셀라병에 대하여 사백신, 서브유닛 백신, 재조합 단백질, 벡터 백신 외 많은 여러 가지 접근법이 시도되어왔다(Lin and He 2012; Avila-Calderon e al., 2013).
최근 몇 년 동안, 박테리아 고스트는 다양한 그람 음성 박테리아에 대하여 효과적인 불활성화 세균 예방 백신 후보자로서 연구되고 있다. 박테리아 고스트는, 핵산 성분을 포함한 모든 세포 내용물이 세포외부로 유출되고, 외막(outer membrane), 주변 세포질 공간(periplasmic space) 및 내막 (inner membrane)만이 남게 된다(Delvecchio et al., 2006; Langemann et al., 2010).
이러한 고스트화 세포를 백신으로 이용하는 방법은 잘 알려져 있으나, 아직 실현화 되지 않았다. 그 요인으로, 고스트화를 충분히 완료시키려면 충분한 세포수가 되기 전에 고스트화 과정을 시작하여야 하기 때문에 최종 생산량이 충분하지 못하거나, 충분히 중식시킨 후 고스트화를 하면 생존 세포수를 무시할 수 없다는 문제점이 있다. 또한, 보통 특정 유전자 벡터 삽입을 위해 항생제 내성 유전자를 이용하기 때문에, 항생제 내성 유전자가 수평 또는 수직 전파될 우려를 완전히 배제할 수 없었다.
한편, HDP(Host defense peptide) 또는 AMP(antimicrobial peptide)은 선천적 면역 체계의 일부이다. 이것들은 그람 음성 박테리아, 기생충 및 바이러스뿐만 아니라 그람 양성 박테리아에 대해서도 다양한 활성을 갖는다(Kindrachuk et al., 2010; Takagi et al., 2014). HDP의 작용 메커니즘은 막의 모양을 훼손시키지 않고, 공극 형성 또는 막 투과성의 유도에 의한 막 장벽(membrane barrier) 기능의 장애를 유발하는 것이다(Kindrachuk et al., 2010; Takagi et al., 2014; Wilmes and Sahl 2014).
HDP의 주요 패밀리인 카텔리시딘(Cathelicidin)은 많은 종에서 확인되었다. 지금까지 11 개의 돼지 카텔리시딘이 발견되었다. 모든 돼지 카텔리시딘 중에서, PMAP-36(porcine myeloid antimicrobial peptide-36)은 가장 높은 총 양전하를 갖고, 가장 높은 총 전하는 박테리아 세포 막 표면에서 양전하 펩티드와 음전하 분자 간의 정전기적 상호작용을 통해 PMAP-36가 박테리아에 결합하는데 유리할 수 있다(Lv et al., 2014). PMAP-36의 N 말단은 전하가 풍부 도메인이다. 또한, 이러한 N-말단 부위의 구조적 분석은 고도의 양이온성 서열이 전형적인 양친매성 a-나선 형태를 한다는 것이 확인되었다. 이전의 연구들에서 24-잔기 펩티드(GI24)인 PMAP-36의 N-말단 a-나선 도메인이 그것의 활성 영역이고, 유도체 PMAP-36는 박테리아 세포막과 상호 작용 및 관통하는 능력을 가지고 있다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명자들은 항생제 내성 전자를 사용하지 않고 추가적인 불활화 처리 없이 충분한 양을 대상에 접종함으로 생균백신과 유사한 면역반응 및 만족스러운 방어력을 부여할 수 있는 백신의 개발을 개발하기 위하여, 항균성 펩티드인 파지 라이소자임-HDP(Host defense peptide)를 발현하도록 구축된 대장균으로부터 획득된 재조합 T4 파지 라이소자임-PMAP-36을 정제한 후 이를 이용하여 국내 소로부터 분리한 브루셀라 아보투스를 고스트화하여 브루셀라병 예방백신으로 개발하였다.
본 발명자는 우리 나라에서 사육되는 소의 브루셀라병 예방 또는 치료 백신을 개발하기 위하여, 우리 나라에서 브루셀라병에 대하여 양성으로 판정되어 살처분되는 소로부터 브루셀라 아보투스 바이오타입 1을 분리하고, 재조합 T4 파지 라이소자임-PMAP-36을 처리하여 상기 분리체의 용해(lysis)가 유발되도록 하였고, 이에 따라 획득된 신규한 브루셀라 아보투스 고스트 균주를 동물에 접종하여 면역성이 탁월함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 T4 파지(phage) 라이소자임(Lysozyme) 유전자 및 PMAP-36 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 균주를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주에 의해 발현되는 재조합 융합단백질을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규한 브루셀라 아보투스 고스트 균주를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규한 브루셀라 아보투스 고스트 균주 제작 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 브루셀라병 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 브루셀라병 예방 또는 치료 방법을 제공하는 데 있다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 T4 파지(phage) 라이소자임(Lysozyme) 유전자; 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 PMAP-36 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 T4 파지(phage) 라이소자임(Lysozyme) 유전자와 상기 PMAP-36 유전자의 사이에 효소에 의한 효소특이적 절단서열을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 효소에 의한 효소특이적 절단서열은 목적의 두 유전자를 연결하는 링커 역할일 수 있으며, 단백질분해효소가 인식하여 절단되는 절단서열 부위를 포함한다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 (His)6을 포함하는 N 말단 아미노산 서열을 포함한다.
즉, 본 발명의 재조합 벡터는 목적 유전자인 T4 파지 라이소자임 유전자와 PMAP-36 유전자의 사이에 부위 특이적 단백질분해효소, 예를 들면 트롬빈, 인식부위를 삽입시켜, 융합단백질의 정제 후 단백질과 융합파트너의 분리를 용이하게 하여 두 유전자에 의해 발현된 융합 단백질이 서로의 고유 활성을 방해 받지 않도록 할 수 있으며, 본 발명의 재조합 벡터는 T4 라이소자임의 N 말단에 6x His이 도입되어 쉽게 정제가 가능하도록 설계된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 절단서열을 인식하여 절단하는 절단효소는 트롬빈, TEV(tobacco etch virus) 프로테아제, 프리시션(PreScission) 프로테아제, 팩터(Factor) Xa 및 엔테로키나아제(Enterokinase)로 구성된 군에서 선택되며, 바람직하게는 트롬빈이다.
본 발명에서 상기 재조합 벡터는 T4 파지 라이소자임-PMAP-36 융합단백질이 발현되도록 T4 파지 라이소자임 유전자 및 PMAP-36 유전자를 재조합 벡터에 도입한 후 대장균 [E. coli BL21(DE3)]에 삽입하여 형질전환시킨다. 상기 균주로부터 수득된 융합단백질을 네이티브(native) 형으로 정제한 후 배양된 브루셀라 아보투스 균주에 첨가하여 브루셀라 아보투스의 고스트화(ghost)를 유도한다. 상기 고스트 브루셀라 아보투스 균주는 핵산 성분을 포함하는 세포질을 제외한 외각성분만을 남길 수 있도록 제작된 것으로, 다른 추가적인 화학적 또는 물리적 불활화 처리 없이 백신화하여 해당 대상에 적용할 시 브루셀라병을 예방할 수 있게 한다.
본 발명에 있어서, 사용될 수 있는 backbone 벡터는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터를 포함한 다양한 벡터들을 사용할 수 있다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는게 바람직하다. 그러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
본 발명에서 목적유전자의 발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 pET-His 벡터(Novagen)를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 pET-His 벡터를 사용하여 클로닝을 수행하면, 발현되는 단백질의 C- 또는 N-말단에 히스티딘기 tag이 결합되어 발현되므로, 상기 단백질을 효과적으로 정제할 수 있다. 클로닝된 유전자로부터 발현된 융합단백질을 분리하기 위해서는 당업계에 공지된 일반적인 방법이 이용될 수 있으며, 구체적으로, 본 발명에서는 Ni-NTA His-결합 레진(Novagen)을 사용하는 크로마토그래피 방법을 이용하여 분리할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 적절한 발현용 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli균주 BL21(DE3), E. coli균주 DH5a, E. coli균주 JM101, E. coli K12균주 294, E. coli균주 W3110, E. coli균주 X1776, E. coli XL-1Blue (Stratagene) 및 E. coli B 등을 포함한다. 그러나, FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속 (genera)등이 또한 사용될 수 있다. 전술한 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(Bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.
원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1: 841(1982))이 또한 이러한 세포들을 형질전환하는데 사용될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물 일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.
"발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고 프로모터 또는 인핸서(enhancer)는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포 내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다.
바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 재조합 벡터를 적절한 발현용 숙주세포 중 하나인 E. coli DE(3)에 도입시켜 T4 파지 라이소자임-PMAP-36 융합단백질을 발현시키도록 형질전환된 미생물 균주 및 상기 균주로부터 생성된 T4 파지 라이소자임-PMAP-36 융합단백질을 제공한다.
상기 균주를 Escherichia coli BL21(DE3)?MPA36과 endolysin 과발현균주라고 명명하고, 이를 2015년 07월 28일에 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호: KCTC18398P).
본 명세서에서 용어 "융합 단백질"은, 한 개 이상의 폴리펩타이드가 펩타이드 결합을 통하여 한가닥의 폴리펩타이드로 결합되어 있는 것을 의미하며, 목적 유전자를 포함하는 한 개 이상의 유전자가 재조합 방법에 의해 융합되어 하나의 폴리펩타이드로 번역되어 만들어진 융합 단백질을 의미한다.
본 발명의 목적상 T4 파지 라이소자임 유전자와 PMAP-36 유전자의 융합은 T4 파지 라이소자임 유전자를 코딩하는 핵산 서열과 PMAP-36 유전자를 코딩하는 서열 그리고 효소가 특이적으로 인지하여 절단할 수 있는 아미노산 절단 서열과의 융합을 의미한다.
즉, 본 발명에서 상기 융합단백질은 목적하는 단백질 또는 펩타이드 서열이 서로 융합되어 있으며, 목적하는 단백질 또는 펩타이드 서열 사이에 화학물질 또는 효소가 특이적으로 인지하여 절단할 수 있는 아미노산 절단 서열(화학물질 또는 효소 특이적 절단서열)을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "효소 특이적 절단 서열"이란 효소(예컨대, 단백질분해효소)가 특이적으로 인지하여 절단할 수 있는 한 개 또는 두 개 이상의 연속된 아미노산 서열을 의미한다.　예를 들면, 트립신은 단일 아르기닌이나 라이신 또는 두 개의 연속된 아르기닌-아르기닌, 라이신-라이신 아미노산 서열을 인지하여 절단한다고 보고되어 있다(미국특허 제6,010,883호). 또한, 엔테로키나아제(enterokinase)는 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys의 서열을 인지하여 라이신 위치의 펩타이드 체인을 절단하고, Xa 프로테아제 인자는 Ile-Glu-Asp-Gly-Arg↓ 서열을, 트롬빈은 Leu-Val-Pro-Arg↓Gly-Ser 서열을, TEV 프로테아제는 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly 서열을, PreScissionTM 프로테아제는 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln↓Gly-Pro 서열을 인지하여 절단한다(Raymond. C. stevens., structure, 2000, vol 8 No 9, 177-185). 여기에서, ↓ 기호는 절단 부위를 나타낸다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 균주로부터 생성된 T4 파지 라이소자임-PMAP-36 융합단백질을 이용하여 브루셀라 아보투스 균주를 고스트화하는 방법 및 상기 방법에 따라 제작된 고스트 브루셀라 아보투스 균주를 제공한다.
상기 방법은, 다음 단계를 포함하는 고스트 브루셀라 아보투스(Ghost Brucella abortus) 균주 제작 방법이다:
(a) 상술한 형질전환체인 미생물 균주(수탁번호: KCTC18398P)를 배양하여 T4 파지 라이소자임-PMAP-36 재조합 융합단백질을 생성 및 정제하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 T4 파지 라이소자임-PMAP-36 재조합 융합단백질을 브루셀라 아보투스 균주에 접촉시켜 고스트화시키는 단계.
본 고스트 브루셀라 아보투스 균주는 우리나라 소로부터 분리된 브루셀라 아보투스 바이오타입(biotype) 1에 첨가한 상기 T4 파지 라이소자임-PMAP-36 융합단백질로 인해 용균되어 고스트화되는 것을 특징으로 하고, '브루셀라 아보투스 고스트 균주' 또는 '브루셀라 고스트 균주' 또는 '고스트 브루셀라 균주'로 혼용된다.
즉, 본 방법은 상술한 T4 라이소자임(Lysozyme) 유전자, 효소에 의한 절단서열 및 PMAP-36 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작하여; 상기 제조한 재조합 벡터를 대장균[E, coli BL21(DE3)]에 형질전환시킨 형질전환체인 E, coli BL21(De3)-PMAP36과 endolysin 과발현 균주(수탁번호 KCTC18398P)를 제작하고; 상기 균주로부터 T4 파지 라이소자임-PMAP-36 융합단백질을 발현 정제하며; 상기 정제된 T4 파지 라이소자임-PMAP-36 융합단백질을 첨가하여 브루셀라 아보투스를 용균시킴으로써 고스트 브루셀라 아보투스를 제작하는 방법이다.
또한, 본 방법은 (a) 단계 이후, 절단효소를 처리하여 목적단백질을 분리하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 고스트 브루셀라 아보투스 균주를 유효성분으로 포함하는 브루셀라병 예방 또는 치료용 고스트 백신 조성물을 제공한다.
상기 고스트 브루셀라 아보투스 균주를 백신으로 사용할 때에는 세포 용해 과정을 수행한 상기 고스트 균주를 완충용액에 현탁하여 사용하였다. 상기 백신 제제는 고스트 브루셀라병에 감수성이 있는 동물의 예방 백신으로서 사용할 수 있다. 상기 백신의 효과를 측정하기 위하여, 마우스에 투여한 결과, 브루셀라병에 대해 우수한 방어 능력을 가진다는 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 고스트화 백신 조성물은 고스트화 세포를 유효성분으로 하여, 생균 백신과 유사한 면역원성 및 예방효과를 나타내면서, 병원성 복귀 및 생태계 오염의 우려가 없다. 또한, 항생제 내성 유전자를 이용하지 않고, 외부에서 첨가하여 고스트화 과정을 유도하기 때문에 고스트화 과정을 포함하여 항생제 내성 유전자가 수평 또는 수직 전달될 우려가 없을 뿐만 아니라 변이주 발생 없이 고스트화되므로 생산비를 감소시킬 수 있다.
상기 백신 조성물의 투여량은 일반적으로 개체당 고스트화 세포 1x102 내지 1x1010 cells가 투여될 수 있고, 바람직하게는 고스트화 세포 1x104 내지 1x106 cells가 투여될 수 있다.
면역 복용량은 투여 경로에 따라 변화하며 바람직하게는 경구, 복강 또는 비경구 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 고스트 균주를 포함하는 백신 조성물은 포유류 및 반추류 동물들을 브루셀라병 및 가능한 다른 질병들에 대항하여 면역화시키기에 매우 적합하며, 예컨대, 상기 포유류는 돼지, 개, 원숭이, 침팬지, 고릴라, 오랑우탄 및 인간으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 상기 반추류 동물은 소, 염소, 양, 아메리카 들소, 유럽 들소, 야크 및 물소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 백신 조성물을 해당 대상에게 접종하는 단계를 포함하는 브루셀라병 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 방법은 상술한 본 백신 조성물을 이용하므로, 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명에 따른 고스트 브루셀라 균주는 생균백신과 유사한 면역원성 및 예방효과를 나타내면서 병원성 복귀 및 생태계 오염의 우려가 없으며, 항생제 내성 유전자가 수평 또는 수직 전달될 우려 없이 고스트화되기 때문에 생산비를 감소시킬 수 있으며, 브루셀라병에 대한 우수한 예방 효과를 가지고 있다.
도 1은 T4 파지 라이소자임 유전자와 트롬빈 인식서열 그리고 PMAP-36 유전자가 삽입된 벡터를 보여준다.
도 2는 SDS-PAGE를 이용하여 T4 파지 라이소자임-PMAP-36 융합단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 3은 정재된 재조합 T4 파지 라이소자임-PMAP-36 융합단백질을 이용한 브루셀라 아보투스 용균 과정을 보여준다.
위: 대조군 (T4 파지 라이소자임-PMAP-36 융합단백질 미 처리군)
아래: 고스트 브루셀라아보투스 (T4 파지 라이소자임-PMAP-36 융합단백질 처리군)
도 4는 고스트 브루셀라 아보투스를 접종한 마우스에서의 혈청 IgG 및 vaginal IgA 역가를 확인한 결과이다. 그룹 A: 대조군 (PBS 접종 군), 그룹 B: Brucella abortus strain RB51 복강 접종 군, 그룹 C: 고스트 브루셀라 아보투스 복강 접종군, 그룹 D: 고스트 브루셀라 아보투스 경구 접종군
도 5는 마우스에 고스트 브루셀라 아보투스 접종 후 비장 (spleen)으로부터 획득된 spenocytes를 heat-inactivated Brucella abortus로 재 자극시킨 후 얻은 상청액에서의 다양한 싸이토카인들의 역가를 확인한 결과이다.
도 6은 마우스에서 고스트 부르셀라 아보투스로 예방접종 후 야외분리주로 도전감염 시킨 후 채취된 비장 (spleen)으로부터 도전감염 균수를 확인한 결과이다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. T4 라이소자임 - PMAP -36 단백질을 발현하는 재조합 벡터의 제조
1-1. 재조합 플라스미드의 제조
Pfu DNA 폴리머라아제는 솔젠트(Solgent, Korea), 제한효소는 NEB (MA, U.S.A.)로부터 구입하였고, T4 DNA 리가아제는 Promega (U.S.A.)로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오타이드는 코스모진텍(Cosmogenetech, Korea)로부터 구입하였다.
서열번호 1로 기재된 T4 파지 라이소자임 유전자는 박테리오파지(Bacteriophage) P22(GenBank: AF527608.1)로부터 수득한 게놈 DNA를 주형으로 PCR 방법으로 획득하였다. 이 때 PCR은 서열번호 2로 기재된 정방향 프라이머 5'- GCA CTC CAT ATG CAC CAT CAT CAC CAT CAC ATG CAA ATC AGC AGT AAC GG-3'와 서열번호 3으로 기재된 역방향 프라이머 5'- GCA CTC GGA TCC GGA TCC ACG CGG AAC CAG CGA TAA GAA CAG CGC TCT TTC-3'를 사용하여 유전자를 획득하였고, 이렇게 얻어진 T4 파지 라이소자임 유전자는 N-말단에 6-히스티딘 태그가 되어 있고, C-말단에 트롬빈 인식부위를 포함하고 있다. PCR은 Pfu 폴리머아아제를 사용하여 94℃에서 30초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 35 사이클을 수행하였다. PCR 산물을 정제 분리한 후 NdeI 및 BamHI으로 절단하고, E. coli 발현 벡터인 pET30a의 내부로 도입하였다. 서열번호 4로 기재된 PMAP-36 유전자는 화학합성을 통해 대장균 코돈에 적합하게 제작되었고, 이를 주형으로 하여 서열번호 5로 기재된 정방향 프라이머 5'-GCA CTC GGA TCC GGA CGA TTT AGA CGT TTA CG-3'와 서열번호 6으로 기재된 역방향 프라이머 5'-GCA CTC GCG GCC GCT TAT CCA CAA CCT AAG GGT ATT GAA C-3'를 사용하여 상기와 동일한 PCR 방법으로 유전자를 증폭하였다. 이렇게 증폭된 PCR 산물은 앞서 T4 파지 라이소자임을 연결한 pET30a 벡터에 BamHI 및 NotI 제한효소를 이용하여 도입하였다. 제작된 발현 벡터(도 1) 내에 도입된 인서트는 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다.
1-2. 대장균 형질전환체인 발현 균주의 제조
T4 파지 라이소자임에 연결된 PMAP-36 펩티드를 코딩하는 유전자를 포함한 벡터를 E. coli 균주 BL21(DE3)에 도입하였다. 먼저 CaCl2시약을 이용한 방법으로 E.coli 균주 BL21(DE3)의 수용능을 향상시켰고, 상기 재조합 벡터를 열충격 방법을 통해 형질전환시켰다. 상기 발현벡터에 포함된 항생제 내성 유전자에 적합한 항생제인 카나마이신 (Duchefa, Nedeland)을 최종농도 20 ㎍/㎖이 되도록 첨가한 LB 배지에 형질전환된 균주를 도말하여 콜로니를 형성시켰다.
상술한 T4 파지 라이소자임-PMAP-36 융합단백질을 발현시키는 형질전환된 균주를 Escherichia coli BL21(DE3)-PMPA36과 endolysin 과발현균주라고 명명하고, 이를 2015년 07월 28일에 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호: KCTC18398P).
1-3. 라이소자임 단백질과 연결된 HDP 펩티드의 발현 확인
상기 실시예 1-2에서 선별된 형질전환체를 밤샘 배양한 후 2L 플라스크내에서 카나마이신(20 ㎍/㎖)을 첨가한 1L의 LB에 1:100으로 희석하고, 35℃ 배양기에서 600 nm에서 0.6 흡광도 유닛이 될 때까지 배양하였다. 단백질을 얻기 위해, IPTG를 최종농도 0.5 mM로 첨가하고 배양기의 온도 및 진탕 속도를 28℃ 170rpm으로 낮춰서 단백질 발현을 유도하였다. 그런 다음, 6시간 후 세포들을 저속 원심분리로 회수하고 100 mM NaCl을 함유하는 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)에 재현탁하였다. 재현탁된 세포는 정제시까지 -80℃에 보관하였다.
1-4. His- 태그된 단백질의 정제 및 분리
T4 파지 라이소자임-PMAP-36 단백질이 발현된 E. coli 세포들을 4℃에서 소니케이션(sonication)에 의해 용해(lysis)시키고, 고속 원심분리기(13,000 rpm, 25 min)로 세포 부스러기들과 세포막을 제거하였다. 상등액을 0.45 ㎛의 기공을 갖는 필터를 이용하여 불순물을 제거한 뒤 니켈이 포함된 비드가 연결된 FPLC 분석을 통해 순수 정제하였다. 이때 A 버퍼로 100 mM NaCl, 10 mM 이미다졸 및 10 mM Tris (pH 9.0)를 포함하는 용액을 사용하였고, 100 mM NaCl, 500 mM 이미다졸 및 10 mM Tris (pH 9.0)를 포함하는 B 버퍼로 단백질을 용출시켰다. 이를 통해 얻어진 단백질은 SDS-PAGE 방법으로 확인하였다(도 2).
실시예 2. 고스트 (ghost) 브루셀라 아보투스 균주의 제조
2-1. 균주 성장 조건과 펩티드
본 발명은 브루셀라병의 예방 균주로 사용될 수 있는 브루셀라 아보투스 고스트 균주를 얻기 위하여, 우리나라 소로부터 브루셀라 아보투스 바이오타입(biotype) 1을 분리하고 상기 실시예 1-4에서 발현 정제된 T4 파지 라이소자임-PMAP-36 융합단백질을 이용하여 백신 후보를 구축하는데 이용하였다. 브루셀라 아보투스 RB51 균주는 본 발명의 고스트 백신에 대한 비교 백신으로 이용하였다.
병원성 브루셀라 아보투스 바이오타입 1 균주인 브루셀라 아보투스 544 균주(ATCC 23448)를 병원성 도전 균주로 이용하였다. 상기 균주들을 37℃에서 브루셀라 배지 및 한천(Bevton Dickinson, Sparks, MD, USA)에서 배양하였다.
2-2. 브루셀라 아보투스 고스트 백신 후보의 구축
고체 배지에서 집락(colony) 하나를 브루셀라 배지에 접종하여 37℃에서 OD600(optical density)가 0.3이 될 때까지 느린 속도로 진탕 배양하였다. 상기 실시예 1-4에서 정제된 T4 파지 라이소자임-PMAP-36 (40 ㎍/㎖)을 배양 배지에 첨가하고, 37℃에서 배양하여 국내분리주인 브루셀라 아보투스 바이오타입 1 균주를 용해시켰다. 반응 30 시간 후, 생균 수를 카운트하여 용해 유도를 관찰하였다. 용해 과정 후, 박테리아 고스트 세포를 10 분 동안 4000 X g에서 원심분리하여 수집하였다. 마지막으로, 수집된 고스트 세포들을 PBS(phosphate-buffered saline)로 3 회 세척한 후, 약 1 X 105 세포/㎖로 재현탁하여 -20℃에서 보관하였다.
2-3. 브루셀라 아보투스 RB51 균주 제제의 제작
RB51 균주는 37℃에서 48 시간 동안 브루셀라 배지에서 배양하였다. 박테리아를 멸균 PBS로 3 회 세척하고, 약 1 X 105 CFU/㎖로 멸균 PBS에 재현탁하였다. 제작 당일 마우스에게 생백신을 접종하였다.
2-4. TEM (Transmission Electron Microscope)
브루셀라 아보투스 고스트 백신 후보 및 브루셀라 아보투스 RB51 균주 제제의 제작과 동일한 방식으로 박테리아 샘플을 제작하였다. 밤새 2.5% 글루타르 알데히드로 고정 후, 박테리아 펠릿을 PBS로 3 회 세척하고 2 시간 동안 PBS에 1% 사산화오스뮴으로 후-고정하였다. 고정된 박테리아 세포를 PBS로 3 회 세척하고 일련의 에탄올(50%, 70%, 90%, 100%)에 15 분 동안 탈수시켰다. 20 분 동안 무수 아세톤에 배치한 후, 이러한 샘플들을 각각 1 시간 동안 무수 아세톤 및 에폭시 수지의 1:1 및 1:3 혼합물에 옮기고, 밤새 순수 에폭시 수지에 옮겼다. 울트라마이크로톰(Ultramicrotome)를 이용하여 얻은 초박절편을 우라닐 아세테이트와 리드 시트레이트로 후-염색하였다. 표본을 투과전자현미경(Hitachi H-7650, Japan)으로 관찰하였다.
2-5. 예방 접종 및 샘플 수집
40 마리의 암컷 BALB/c 마우스를 네 그룹으로 똑같이 나누었다. 모든 마우스는 생후 6 주에 접종하였다[접종 후 0주(WPI)]. 10 마리 마우스의 A 그룹은 대조군으로서 멸균 PBS로 각각 복강 내(IP) 접종하였다. 또한, B 그룹과 C 그룹 마우스에게 약 104 CFU의 브루셀라 아보투스 RB51 균주 및 약 104 CFU의 브루셀라 고스트 백신 후보를 각각 복강 내로 접종하였다. D 그룹에게 약 106 브루셀라 고스트 세포를 경구 접종하였다. 면역 반응의 평가를 위해 백신 접종 후 0, 2, 4 및 6 주째에 각각 혈액 및 질 세척액 샘플을 채취하였다. 본 연구에서 언급된 동물 실험은 동물 관리에 대한 한국위원회의 지침에 따라 전북대학교 동물 윤리위원회의 윤리 승인(CBU 2011-0017)하에 실시하였다.
2-6. 효소결합 면역흡착측정법(enzyme linked immunosorbent assay)에 의한 면역 반응
혈청 및 분변 시료에서 브루셀라 LPS-특이 IgG와 IgA 역가를 조사하기 위해, B. 브루셀라 Ab ELISA 2.0 키트(BioNote, Hwaseongsi, Gyeonggido, Republic of Korea)를 사용하여 변형 ELISA를 실시하였다. 간단히 설명하면, 혈청을 PBS에 1:50으로 희석시키고, 분변 시료를 1:5로 희석하였다. 플레이트를 호올스래디쉬 퍼옥시다제-결합 고트 항-마우스 IgG 또는 IgA 항체(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, USA)로 처리하였다. o-페닐렌디아민(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 포함하는 기질을 추가하여 효소 반응을 일으켜서 자동화 ELISA 분광광도계(Thermo Scientific Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific Oy, Ratastie, Vantaa, Finland)를 사용하여 492 nm에서 측정하였다.
2-7. 비장 세포의 사이토카인 정량
접종 후 4 주째에 (Sanakkayala 외., 2005), 각 그룹에서 마우스 5 마리씩 희생시키고 비장을 무균적으로 제거하였다. 비장으로부터 단일 세포 현탁액을 균질화하여 얻었다. 비장 세포를 5 분 동안 1000 rpm에서 원심분리하여 수집하였다. RBC를 0.9% NH4Cl로 용해하고 완전 RPMI 배지로 3 회 세척하여 NH4Cl을 제거하였다. 비장 세포는 트리판 블루 염색법으로 생존율을 검사하였다. 비장 세포를 웰 당 2 X 106 세포로 24 웰 조직 배양 플레이트에 분주하였다. 비장 세포를 열-불활성화 브루셀라 아보투스 544 박테리아(108 세포/웰)로 그리고 양성 대조군으로는 콘카발린(Concavalin) A (0.5㎍/웰) 마지막으로 비자극 대조군으로는 배지로 각각 자극하고, 37℃, 5% CO2 및 95% 습도에서 반응시켰다. 72 시간 반응시킨 후 반응액 상층액을 수집하여 사이토카인 측정에 이용하기 전까지 -70℃에서 보관하였다.
2-8. ELISA에 의한 사이토카인 측정
제조사(eBioscience Inc., San Diego, CA, USA)의 지시에 따라 마우스 사이토카인 ELISA 레디-SET-GO 시약 세트를 이용하여 상기 실시예 2-7에서 준비한 상층액 내 IL-4, IL-10, IFN-r 및 TNF-a 같은 사이토카인의 농도를 ELISA로 측정하였다
2-9. 도전 실험
도전 실험을 위하여, 도전 균주 544를 준비하였다. 간략하게, 균주를 24 시간 동안 37℃에서 브루셀라 배지에서 배양하고, 약 1 X 105 CFU/㎖로 재현탁하였다. 모든 마우스에게 도전 균주 100 ㎕을 6백신 접종 후 6주 째에 복강으로 도전감염하였다. 도전감염 후 2주 째에 모든 마우스를 희생시킨 다음, 비장의 중량을 측정하고, 비장에서 544 균주의 생존수를 계수하였다. 간략하게, RB51 균주는 리팜피신(rifampicine)에 내성이 있기 때문에, 균질화 비장 샘플을 리팜피신(50 ㎍/㎖)이 첨가 또는 미첨가 브루셀라 한천 배지에 도말되었다.
2-10. 통계 분석
ELISA 데이터 값은 SPSS 버전 16.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 쌍대(pair-wise) 비교에 대한 후 hoc Tukey로 분산 분석을 실시함으로써 다른 백신 군 간의 차이를 분석하였다. 박테리아 도전 감염실험에 이어, 그룹 간의 차이에 대하여 변경된 student t-test를 실시하여 각 대조군과 각 마우스 백신 군으로부터 얻은 비장 내 로그 변환 CFU 값을 비교하였다. 통계적 유의성은 P <0.01로 결정하였다.
실시예 3. 고스트 (ghost) 브루셀라 아보투스 균주의 특성 확인
3-1. TEM
T4 파지 라이소자임-PMAP-36 융합단백질로 처리 전후의 브루셀라 아보투스의 막 보전성 및 세포 내 변화를 TEM으로 관찰하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 완전한 세포막 및 세포 내 내용물이 T4 파지 라이소자임-PMAP-36 융합단백질로 미처리된 브루셀라 아보투스 세포에서 관찰되었다. 한편, T4 파지 라이소자임-PMAP-36 융합단백질로 처리된 박테리아 세포는 세포질 성분이 빠져 나가 보다 투명한 상태임을 확인하였고, 브루셀라 아보투스 막은 기공이 형성되어 있음을 확인할 수 있었다.
3-2. 면역화된 마우스의 체액성 면역 반응
접종된 마우스의 혈청과 질 세척 샘플을 대상으로 브루셀라 아보투스의 LPS(Lipopolysaccharide)에 대한 항체 형성 여부는 도 4에 나타내었다. C 그룹 및 D 그룹의 브루셀라 아보투스 LBS에 대한 혈청 IgG 역가는 백신 접종 후 4 주 째부터 실험이 끝날 때까지 A 그룹에서의 것과 비교하여 유의하게 증가하였다(P <0.01). 또한, B, C 및 D 그룹의 B. 아보투스 LBS에 대한 질 IgA 역가는 백신 접종 4주 째부터 실험이 끝날 때까지A 그룹에서의 것과 비교하여 유의하게 상승하였다(P <0.01).
3-3. 사이토카인 분석
B, C 및 D 그룹 마우스 비장 세포를 열-불활성 브루셀라 아보투스 세포로 재자극 후 IL-4, TNF-a 및 IFN-r 평균 농도는 A 그룹에서의 것에 비해 유의하게 높았다(P <0.05)(도 5). 그러나, IL-10 농도는 A 그룹의 것과 비교했을 때 C 및 D 그룹만이 유의하게 증가하였다(도 5)(P <0.01).
3-4. 도전 감염 실험에 대한 마우스의 방어 여부
모든 마우스에게 백신 접종 후 6 주째에 약 4 X 104 CFU의 병독성 브루셀라 아보투스 544를 도전 균주로서 복강내 접종하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 도전감염 2 주 후에 모든 마우스의 비장으로부터 생존 균수를 측정한 결과, A그룹의 5 마리 모두에서 도전 균주가 분리되었고, 분리 균수는 11,437 CFU/비장 ± 1,767.6이었다. B 그룹의 모든 마우스로부터 도전감염 균주가 분리되었고 그 수는 1,924 CFU/g ± 922.9이었다. 그러나, C 그룹에서 도전 감염 균주는 5 마리 중 3 마리에서 분리되었고, 그 수는 겨우 256 CFU/비장 ± 293.6이었다. D 그룹의 경우에는 5 마리 중 4 마리에서 야생형 브루셀라 아보투스 균주가 분리되었고 그 수는 2,693 CFU/비장 ± 2,678.5이었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC18398P 20150728
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Ghost Brucella abortus and Vaccine Composition for Preventing Brucellosis Comprising the Same <130> CHONBUK1-170p <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 441 <212> DNA <213> T4 phage Lysozyme <400> 1 atgatgcaaa tcagcagtaa cggaatcacc agattaaaac gtgaagaagg tgagagacta 60 aaagcctatt cagatagcag ggggatacca accattgggg ttgggcatac cggaaaagtg 120 gatggtaatt ctgtcgcatc agggatgaca atcaccgccg aaaaatcttc tgaactgctt 180 aaagaggatt tgcagtgggt tgaagatgcg ataagtagtc ttgttcgcgt cccgctaaat 240 cagaaccagt atgatgcgct atgtagcctg atattcaaca taggtaaatc agcatttgcc 300 ggctctaccg ttcttcgcca gttgaattta aagaattacc aggcagcagc agatgctttc 360 ctgttatgga aaaaagctgg taaagaccct gatattctcc ttccacggag gcggcgagaa 420 agagcgctgt tcttatcgtg a 441 <210> 2 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 gcactccata tgcaccatca tcaccatcac atgcaaatca gcagtaacgg 50 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 3 gcactcggat ccggatccac gcggaaccag cgataagaac agcgctcttt c 51 <210> 4 <211> 111 <212> DNA <213> PMAP-36 <400> 4 ggacgattta gacgtttacg taaaaaaacc cggaaacgtc tgaaaaagat tgggaaagtg 60 ttgaaatgga ttcctcctat tgtcggttca atacccttag gttgtggata a 111 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 gcactcggat ccggacgatt tagacgttta cg 32 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 gcactcgcgg ccgcttatcc acaacctaag ggtattgaac 40

Claims (10)

  1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 T4 파지(phage) 라이소자임(Lysozyme) 유전자; 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 PMAP-36 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 T4 파지(phage) 라이소자임(Lysozyme) 유전자와 상기 PMAP-36 유전자의 사이에 효소특이적 절단서열을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 절단서열을 절단하는 절단효소는 트롬빈, TEV(tobacco etch virus) 프로테아제, 프리시션(PreScission) 프로테아제, 팩터(Factor) Xa 및 엔테로키나아제(Enterokinase)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물 형질전환체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 형질전환체는 수탁번호 KCTC18398P로 기탁된 대장균 균주인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  6. 제4항 또는 제5항의 형질전환체로부터 획득된 T4 파지 라이소자임-PMAP-36 재조합 융합단백질.
  7. 제6항의 재조합 융합단백질을 브루셀라 아보투스(Brucella abortus) 균주에 처리하여 고스트화시킨 고스트 브루셀라 아보투스(Ghost Brucella abortus) 균주.
  8. 다음 단계를 포함하는 고스트 브루셀라 아보투스(Ghost Brucella abortus) 균주 제작 방법:
    (a) 제5항 또는 제6항의 형질전환체를 배양하여 T4 파지 라이소자임-PMAP-36 재조합 융합단백질을 생성 및 정제하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 T4 파지 라이소자임-PMAP-36 재조합 융합단백질을 브루셀라 아보투스 균주에 접촉시켜 고스트화시키는 단계.
  9. 제8항 또는 제9항의 고스트 브루셀라 아보투스 균주를 유효성분으로 포함하는 브루셀라병 예방 또는 치료용 고스트 백신 조성물.
  10. 제9항의 백신 조성물을 해당 대상에게 접종하는 단계를 포함하는 브루셀라병 예방 또는 치료 방법.
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CN108690823A (zh) * 2018-04-25 2018-10-23 内蒙古华希生物科技有限公司 一种装载dna的布鲁氏菌菌蜕复合疫苗

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