CN109970868B

CN109970868B - 一种通过ptc基因操作提高藻类总磷和多聚磷酸含量的方法及应用

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Publication number: CN109970868B
Application number: CN201910247536.6A
Authority: CN
Inventors: 易可可; 王龙; 朱毅勇; 徐国超
Original assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Current assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2020-11-20
Anticipated expiration: 2039-03-29
Also published as: CN109970868A

Abstract

本发明公开了一种通过PTC基因操作提高藻类总磷和多聚磷酸含量的方法及应用。本发明提供的蛋白质，命名为ptc1蛋白，为序列表中序列1所示的蛋白质。编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种重组微藻，为抑制出发微藻中编码所述蛋白质的基因的表达得到的重组微藻。本发明还保护所述重组微藻在水体除磷中的应用或所述重组微藻在制备肥料中的应用。本发明的发明人从衣藻中发现一个和多聚磷酸平衡相关的蛋白质，将衣藻中编码该蛋白质的基因沉默后，导致多聚磷酸积累、总磷含量升高，且能高效分泌碱性磷酸酶，一方面可以促进衣藻对水体中磷的净化效果，另一方面高磷衣藻是很好的微藻肥料原料。

Description

一种通过PTC基因操作提高藻类总磷和多聚磷酸含量的方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过PTC基因操作提高藻类总磷和多聚磷酸含量的方法及应用。

背景技术

水体富营养化已经成为全球日益严重的环境问题。近年来，大量的氮磷钾等元素被排入各种水体的速度远远超过水体的自我净化速度，水体生态平衡被打破，赤潮等问题严重。磷是水体富营养化的关键元素，除去水体中的磷是水体修复的关键。目前除磷的方式主要有化学法、沉淀法、生物法等，生物法简单成本低，但是技术要求高。

衣藻是单细胞藻类，环境适应能力极强。衣藻能在水体和土壤中生存，且能通过分泌碱性磷酸酶分解环境中的有机磷，并吸收水体中的磷，合成多聚磷酸并储存在酸钙体中，从而降低水体和环境中的有机磷和无机磷含量，以达到净化污水的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过PTC基因操作提高藻类总磷和多聚磷酸含量的方法及应用。

本发明提供的蛋白质，获自莱茵衣藻(Chlamydomonas reintmrdtii)，命名为ptc1蛋白(又称PCT1蛋白)，为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；

(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(a3)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与微藻的多聚磷酸含量和/或总磷含量和/或碱性磷酸酶酶活相关的蛋白质；

(a4)来源于衣藻且与(a1)具有98％以上同一性且与衣藻的多聚磷酸含量和/或总磷含量和/或碱性磷酸酶酶活相关的蛋白质。

以上所述几个氨基酸残基为10个以下氨基酸残基。

标签具体如表1所示。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL
HA	9	YPYDVPDYA

蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)：

(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(b2)序列表中序列3所示的DNA分子；

(b3)序列表中序列4所示的DNA分子；

(b4)来源于衣藻且与(b1)或(b2)或(b3)具有75％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；

(b5)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

所述75％以上同一性，具体可为90％以上同一性，更具体可为95％以上同一性，更具体可为98％以上同一性。

术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

本发明还保护一种重组微藻，为抑制出发微藻中编码所述蛋白质的基因的表达得到的重组微藻。编码所述蛋白质的基因即以上任一所述核酸分子。

本发明还保护所述重组微藻在水体除磷中的应用或所述重组微藻在制备肥料(微藻肥料)中的应用。

本发明还保护一种制备重组微藻的方法，包括如下步骤：抑制出发微藻中编码所述蛋白质的基因的表达，得到多聚磷酸含量和/或总磷含量和/或碱性磷酸酶酶活增加的重组微藻。编码所述蛋白质的基因即以上任一所述核酸分子。

本发明还保护抑制微藻中编码所述蛋白质的基因的表达的物质的应用，为如下(c1)或(c2)：

(c1)提高微藻中的多聚磷酸含量和/或总磷含量和/或碱性磷酸酶酶活；

(c2)培育多聚磷酸含量和/或总磷含量和/或碱性磷酸酶酶活增加的重组微藻。

本发明还保护一种重组微藻，为在受体微藻中导入编码所述蛋白质的基因并使其表达，得到的重组微藻。编码所述蛋白质的基因即以上任一所述核酸分子。

本发明还保护一种制备重组微藻的方法，包括如下步骤：在受体微藻中导入编码所述蛋白质的基因并使其表达，得到多聚磷酸含量和/或总磷含量和/或碱性磷酸酶酶活降低的重组微藻。编码所述蛋白质的基因即以上任一所述核酸分子。

本发明还保护所述蛋白质的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)或(d5)或(d6)：

(d1)调控微藻的多聚磷酸含量；

(d2)调控微藻的总磷含量；

(d3)调控微藻的碱性磷酸酶酶活；

(d4)降低微藻的多聚磷酸含量；

(d5)降低微藻的总磷含量；

(d6)降低微藻的碱性磷酸酶酶活。

以上任一所述微藻可为衣藻，更具体可为莱茵衣藻。

本发明的发明人从衣藻中发现一个和多聚磷酸平衡相关的蛋白质，将衣藻中编码该蛋白质的基因沉默后，导致多聚磷酸积累、总磷含量升高，且能高效分泌碱性磷酸酶，一方面可以促进衣藻对水体中磷的净化效果，另一方面高磷衣藻是很好的微藻肥料原料。

附图说明

图1为引物设计原则以及PCR扩增产物电泳图。

图2为衣藻中多聚磷酸含量的检测的结果。

图3为衣藻中总磷含量的检测的结果。

图4为衣藻中碱性磷酸酶含量的检测的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例中所用的钼酸铵，均为仲钼酸铵，即(NH₄)₆Mo₇O₂₄。孔雀绿：生工生物工程股份有限公司，A600591-0050。中性红：生工生物工程股份有限公司，A600652-0025。TAP培养基：Harris EH(1989)The Chlamydomonas Sourcebook.Academic Press,San Diego。TA培养基：用等摩尔氯化钾代替TAP培养基中的磷酸二氢钾。

实施例1、重组衣藻的制备

衣藻CC-4533和衣藻突变体均购自https://www.chlamylibrary.org/。衣藻突变体即https://www.chlamylibrary.org/中的Mutant strain:LMJ.RY0402.181899，将其命名为衣藻突变体ptc1。

提取供试衣藻的基因组DNA，分别采用F1/R1引物对或F1/R2引物对进行PCR扩增(F1、R1和R2的引物设计原则见图1的A；引物F1:GGGCCGTACACCTAACTTGA；引物R1：ACCTCTACATTGGCCAGCAC；引物R2：GACGTTACAGCACACCCTTG；F1和R1的靶序列约为1410bp，F1和R2的靶序列约为800bp)，PCR扩增产物的电泳图见图1B。供试衣藻分别为：衣藻CC-4533和衣藻突变体ptc1。

将供试衣藻进行全基因组测序。供试衣藻分别为：衣藻CC-4533和衣藻突变体ptc1。测序结果表明，衣藻CC-4533的基因组DNA中具有编码序列表的序列1所示蛋白质的基因。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为ptc1蛋白。衣藻CC-4533的cDNA中，编码ptc1蛋白的开放阅读框如序列表的序列2所示。衣藻CC-4533的cDNA中，编码ptc1蛋白的基因如序列表的序列3所示。衣藻CC-4533的基因组DNA中，编码ptc1蛋白的基因如序列表的序列4所示。测序结果表明，与衣藻CC-4533的全基因组相比，衣藻突变体的ptc1的全基因组的差异仅在于在F1和R1靶序列中间插入了aphVIII基因。

用序列表的序列2所示的DNA分子替换质粒pJM43Ble的NdeⅠ和BamHⅠ酶切识别序列之间的小片段，得到重组质粒。将重组质粒导入衣藻突变体ptc1，得到重组衣藻，命名为衣藻JP13。提及质粒pJM43Ble的文献：Wenqiang Yang,etc,Alternative AcetateProduction Pathways in Chlamydomonas reinhardtii during Dark Anoxia and theDominant Role of Chloroplasts in Fermentative Acetate Production,The PlantCell,Vol.26:4499–4518。

实施例2、衣藻中多聚磷酸含量的检测

供试衣藻分别为衣藻CC-4533、衣藻突变体ptc1和衣藻JP13。

一、制备溶液

钼酸铵溶液：含28mM钼酸铵和2.1M H₂SO₄，余量为水。

孔雀绿溶液：含0.76mM孔雀绿和0.35g/100ml聚乙烯醇，余量为水。

中性红母液：含0.1g/100ml中性红，余量为水。

中性红溶液：60μl中性红母液和940μl Tris-HCl缓冲液(pH7.5、1M)，混匀。

NaI溶液：含6M NaI，余量为水，调pH至7.0。

Wash buffer：含50％(体积比)乙醇、1mM EDTA、100mM NaCl，余量为Tris-HCl缓冲液(pH7.5、10mM)。

二、制作标准曲线

用KH₂PO₄和水作为原料制备P母液。P母液中，磷含量为10μg/ml。

按照表2制备各个标准品溶液。

表2

标准品溶液编号	1	2	3	4	5	6	7	8
									P浓度(μg/ml)	0	0.5	0.75	1	1.5	2	3	4
P母液加入量(μl)	0	5	7.5	10	15	20	30	40
									水加入量(μl)	100	95	92.5	90	85	80	70	60

100μl标准品溶液中加入86μl钼酸铵溶液和64μl孔雀绿溶液，然后室温静置20-30min，然后测OD_595nm值。

标准曲线方程：Y＝0.4263X-0.0357；X为OD_595nm值，Y为磷浓度(单位为μg/ml)；R²＝0.9974。

三、培养

培养供试衣藻。培养方法：将供试衣藻接种至TAP培养基，24℃、12h光照(光照强度为150μmol m^-2s^-1)/12h黑暗、150rpm振荡培养，至供试衣藻在培养体系中的浓度为5×10⁷个细胞/ml。

取两份完成上述步骤的培养体系(每份0.5ml)，一份烘干至恒重(称重，即为干重)，另一份进行步骤四。

四、多聚磷酸的提取

1、取0.5ml培养体系，10000g离心2min，弃上清，收集沉淀。

2、在步骤1得到的沉淀中加入50μl 1M H₂SO₄水溶液，混匀，室温静置5min。

3、完成步骤2后，再加入50μl 2M NaOH水溶液和100μl中性红溶液，混匀，然后4℃、800g离心10min，收集上清液。

4、取150μl步骤3得到的上清液，调pH至7，然后加入450μl NaI溶液，混匀。

5、将步骤4得到的全部液相体系转移到吸附柱CA1中(吸附柱放入收集管中)，然后13000g离心1min，弃除收集管中的液体。

6、完成步骤5后，向吸附柱中加入400μl Wash buffer，13000g离心1min，弃除收集管中的液体。

7、完成步骤6后，向吸附柱中加入400μl Wash buffer，13000g离心1min，弃除收集管中的液体。

8、完成步骤7后，13000g离心1min，弃除收集管中的液体。

9、完成步骤7后，向吸附柱中加入50μl水，室温静置2min，13000g离心1min，收集收集管中的液体，作为步骤五中的样本液，-20℃保存。

吸附柱CA1和收集管均为超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN，目录号DP208)中的组件。

五、降解多聚磷酸并检测磷含量

取5μl样本液，加入5μl 2M HCl水溶液，95℃静置30min，然后加入90μl水，再加入86μl钼酸铵溶液和64μl孔雀绿溶液，然后室温静置30min，然后测OD_595nm值。

将OD_595nm值代入步骤二的标准曲线方程，得到磷含量。

衣藻中多聚磷酸含量(以磷含量计)＝步骤五得到的磷含量(μg)÷步骤三得到的干重(mg)。

结果见图2。与衣藻CC-4533相比，衣藻突变体ptc1的多聚磷酸含量显著增高。与衣藻突变体ptc1相比，衣藻JP13的多聚磷酸含量显著降低。

实施例3、衣藻中总磷含量的检测

供试衣藻分别为衣藻CC-4533、衣藻突变体ptc1和衣藻JP13。

取体积相等的两份完成上述步骤的培养体系，一份烘干至恒重(称重，即为干重)，另一份检测总磷含量。

检测总磷含量的方法见参考文献：Bajhaiya AK,Dean AP,Zeef LA,Webster RE,Pittman JK(2016)PSR1Is a Global Transcriptional Regulator of PhosphorusDeficiency Responses and Carbon Storage Metabolism in Chlamydomonasreinhardtii.Plant Physiol 170:1216-1234。

衣藻中总磷含量的检测结果见图3。与衣藻CC-4533相比，衣藻突变体ptc1的总磷含量显著增高。与衣藻突变体ptc1相比，衣藻JP13的总磷含量显著降低。

实施例4、衣藻中碱性磷酸酶含量的检测

供试衣藻分别为衣藻CC-4533、衣藻突变体ptc1和衣藻JP13。

PNP即对硝基酚。PNPP即对硝基苯磷酸酯。

一、标准曲线的绘制

用PNP和水作为原料，制备各个PNP标准品溶液。标准品溶液中，PNP的浓度分别为1000nmol/ml、800nmol/ml、600nmol/ml、400nmol/ml或200nmol/ml。水作为0浓度标准品溶液。

取200μl标准品溶液、500μl水和200μl Tris-HCl缓冲液(pH8.5、1M)，27℃静置反应1h，然后加入100μl 4M NaOH水溶液终止反应，然后测量A_410nm值。

标准曲线方程：Y＝0.0034X+0.0245；Y为A_410nm值，X为PNP浓度(单位为nmol/ml)；R²＝0.9913。

二、检测衣藻中碱性磷酸酶酶活

1、取供试衣藻，悬浮于50ml TAP培养基中，24℃、12h光照(光照强度为150μmol m^- ²s^-1)/12h黑暗、150rpm振荡培养，至浓度约为5×10⁷个细胞/ml。

2、完成步骤1后，离心弃上清，沉淀悬浮于50ml TA培养基中，24℃、12h光照(光照强度150μmol m^-2s^-1)/12h黑暗、150rpm振荡培养。培养时间分别为：6h、12h和24h。

3、完成步骤步骤2后，取两份培养体系(每份600μl)，一份烘干至恒重(称重，即为干重)，另一份检测碱性磷酸酶酶活。检测碱性磷酸酶酶活的方法：取600μl培养体系，加入200μl Tris-HCl缓冲液(pH8.5、1M)和100μl 36mM PNPP水溶液，27℃静置反应1h，然后加入100μl 4M NaOH水溶液终止反应，然后测量A_410nm值。设置用等体积水代替培养体系的空白对照。

将A_410nm值值代入步骤一的标准曲线方程，得到PNP含量。

衣藻中碱性磷酸酶酶活力(以PNP产量计)＝PNP含量(nmol)÷干重(μg)。

衣藻中碱性磷酸酶酶活力的检测结果见图4。与衣藻CC-4533相比，衣藻突变体ptc1的碱性磷酸酶酶活力显著增高。与衣藻突变体ptc1相比，衣藻JP13的碱性磷酸酶酶活力显著降低。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

<120> 一种通过PTC基因操作提高藻类总磷和多聚磷酸含量的方法及应用

<130> GNCYX190752

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 804

<212> PRT

<213> Chlamydomonas reintmrdtii

<400> 1

Met Lys Phe Thr His Gln Leu Lys Phe Asn Ser Val Pro Glu Trp Arg

1 5 10 15

Glu His Tyr Ile Gln Tyr Gly His Leu Lys Lys Tyr Ile Tyr Ala Leu

20 25 30

Ala Lys Lys Glu Ala Asp Leu Gln Ala Gly Gly Gln Asp Glu Glu Ala

35 40 45

Leu Leu Ala Pro Leu Leu Glu Ala Glu Arg Asp Gln Gly Pro Thr Glu

50 55 60

Glu Gly Phe Gln Arg Glu Leu Asp Ala Gln Leu Ala Ala Thr Leu Ser

65 70 75 80

Phe Phe Ala Val Lys Glu Ala Asp Leu Leu Ala Lys Val Ser Ala Leu

85 90 95

Glu Leu Asp Ile Gln Ser Leu Glu Lys Ile Pro Asn Arg Ala Glu Ala

100 105 110

Ser Thr Leu Ala Arg Met Gly Gly Ser Ala Ser Pro Gly Gly Pro Met

115 120 125

Ser Ser Pro Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala Met Ser Ala Met Ala Ser

130 135 140

Leu Val Ser His Ser Pro Ser Thr Leu Asp Leu Ala Arg Met Val Asn

145 150 155 160

Ser Thr Pro Pro Glu Asp His Arg Lys Ile Arg Val Lys Phe Trp Glu

165 170 175

Asn Pro Pro Arg His Leu Phe Ser Thr Asn Leu Asn Thr Arg Arg Ala

180 185 190

Lys Leu Gln Ala Arg Phe Gln Asp Leu Tyr Ile Ser Leu His Asp Leu

195 200 205

Arg Glu Phe Leu His Ile Asn Lys Glu Gly Phe Arg Lys Ile Ile Lys

210 215 220

Lys His Asp Lys Leu Thr Arg Ala Val Asp Leu Arg Ala Arg Trp Trp

225 230 235 240

Pro Asn Val Glu Ala His Leu Ala Pro Ala Ala Lys Gln Ala Glu Leu

245 250 255

Asp Gly Ala Ile Gly Ala Leu Thr Asp His Tyr Ala Val Leu Tyr Thr

260 265 270

Arg Gly Asp Val Ala Gln Ala Glu Glu Gln Leu Ser Arg Gly Leu Arg

275 280 285

Glu His Ile Thr Val Glu Arg Asn Thr Val Trp Arg Asp Met Ala Ala

290 295 300

Met Glu Arg Lys Tyr Ala Ala Val Ser Val Lys Gln Ala Ala Ala Pro

305 310 315 320

Gly Ala Arg Val Thr Trp Leu Arg Thr His Ala Arg Trp Leu Lys Leu

325 330 335

Ala Leu Ser Val Ala Val Phe Val Val Leu Ala Asn Val Glu Val Trp

340 345 350

Pro Gly Ala Glu Asn Glu Pro Arg Asn Asn Cys Leu Ala Leu Leu Val

355 360 365

Phe Ala Ser Leu Leu Trp Ser Leu Glu Ala Val Pro Leu Phe Val Thr

370 375 380

Ser Met Ala Leu Pro Leu Leu Ile Val Ala Leu Gly Val Leu Val Asp

385 390 395 400

Arg Ser Lys Asp Pro Pro Gln Arg Met Thr Pro Gln Gln Ala Ala Pro

405 410 415

Ala Ile Phe His Ala Met Phe Ser Gln Thr Ile Met Leu Leu Leu Gly

420 425 430

Gly Phe Ala Ile Ala Ala Ala Leu Ser Lys His Ala Ile Ala Lys Gln

435 440 445

Val Ala Val Ser Ile Leu Ser Arg Val Gly Arg Lys Pro Arg Asn Val

450 455 460

Leu Leu Ala Ala Met Phe Thr Ala Thr Phe Ala Ser Met Trp Ile Ser

465 470 475 480

Asn Val Ala Ala Pro Val Leu Cys Phe Gly Leu Ile Gln Pro Ile Leu

485 490 495

Arg Thr Leu Asp Pro Gly His Pro Phe Ala Lys Ala Leu Val Met Gly

500 505 510

Ile Ala Leu Ala Ser Asn Val Gly Gly Met Thr Ser Pro Ile Ser Ser

515 520 525

Pro Gln Asn Ile Phe Ala Ile Glu Arg Met Ser Leu Asp Gly Arg Pro

530 535 540

Pro Ser Trp Leu Ala Trp Phe Ala Val Ala Leu Pro Val Ala Val Ala

545 550 555 560

Cys Asn Phe Val Cys Trp Gly Leu Leu Leu Leu Cys Tyr Gln Pro Gly

565 570 575

Lys Ala Ile Ala Glu Val Arg Pro Ile Lys Pro Asn Thr Asp Pro Ile

580 585 590

Asn Gly Thr Gln Val Tyr Ile Ile Val Val Ser Leu Leu Thr Val Ala

595 600 605

Ala Trp Cys Ala Asn Thr Phe Leu Gln Arg Tyr Thr Gly Glu Met Gly

610 615 620

Val Ile Ala Val Val Pro Leu Val Ala Phe Phe Gly Phe Asp Val Leu

625 630 635 640

Asn Lys Asp Asp Phe Asn Ser Phe Leu Trp Asn Val Val Met Leu Ala

645 650 655

Met Gly Gly Leu Ser Leu Gly Glu Ala Val Lys Ser Ser Gly Leu Leu

660 665 670

Ala Ala Leu Ala Leu Thr Ile Ser Asp Leu Val Met Gly Leu Ser Leu

675 680 685

Trp Gln Val Ala Ala Ile Phe Cys Gly Met Val Leu Val Ala Thr Thr

690 695 700

Phe Ile Ser His Thr Val Gly Ala Met Val Ile Leu Pro Ile Val Gln

705 710 715 720

Ser Val Gly Glu Ala Met Ala Gly Thr Pro His Pro Lys Leu Leu Val

725 730 735

Met Ala Ala Ala Leu Met Cys Ser Gly Ala Met Gly Leu Pro Val Ser

740 745 750

Gly Phe Pro Asn Met Asn Ala Val Ser Leu Glu Asp Ser Thr Gly Asn

755 760 765

Ala Ile Val Gly Thr Gly Asp Phe Leu Ala Val Gly Val Pro Ser Ser

770 775 780

Val Phe Ala Tyr Gly Ile Ile Val Ser Leu Gly Tyr Val Leu Met Leu

785 790 795 800

Ala Val Gly Phe

<210> 2

<211> 2415

<212> DNA

<213> Chlamydomonas reintmrdtii

<400> 2

atgaagttta cgcaccagct gaagtttaat agtgtgccgg aatggagaga acactacata 60

cagtatggac atcttaagaa gtacatttat gcgctagcta agaaggaagc ggaccttcaa 120

gctggcggcc aagatgagga ggcgctgctc gccccgctgt tggaagcgga gcgtgatcag 180

ggccccacgg aggagggctt ccagcgggag ttagacgcgc agcttgcggc cacgctaagc 240

ttcttcgcgg tgaaggaggc ggacctgctc gccaaggtgt ccgcactgga gctggacatt 300

caaagcctgg agaagatccc caaccgcgcc gaggcgtcca cactggcgcg catgggcggc 360

agcgccagcc ccggcggccc catgagcagc ccgcgcgccg ccgccgccgc cgccatgtcg 420

gccatggcct cgctggtcag ccacagcccc tccacactgg acctggcgcg catggtcaac 480

agcacgccgc cagaggacca ccgcaagatc cgggtcaagt tctgggagaa cccgccccgc 540

cacctgttca gcaccaacct caacacgcgc agggccaagc tgcaggcgcg cttccaggac 600

ctgtacatct cgctgcacga cctgcgcgag ttcttgcaca tcaacaagga gggcttccgc 660

aagatcatca agaagcacga caagctgacc cgcgccgtgg acctgcgcgc ccgctggtgg 720

cccaacgtgg aggcgcacct ggcgcccgcc gccaagcagg ccgagctgga cggcgccatc 780

ggggcgctga ccgaccacta cgcagtgctg tacacgcgcg gtgacgtggc tcaggcggag 840

gagcagctgt cgcgggggct gcgcgagcac atcaccgtgg agcgaaacac cgtgtggcga 900

gacatggcgg ccatggagcg caagtacgcg gcggtgtcgg tgaagcaggc ggccgcgccc 960

ggggcgcgcg tcacgtggct gcgcacgcac gcgcgctggc tgaagctggc cctgagtgtg 1020

gcggtgttcg tggtgctggc caatgtagag gtgtggccgg gcgccgagaa cgagccgcgc 1080

aacaactgcc tggcgctgct agtgttcgcg tcgctgctgt ggagcctgga ggctgtgccg 1140

ctgttcgtga ccagcatggc gctgccgctg ctgattgtgg cgctgggggt gctggtggac 1200

cgctccaagg acccgccgca gcgcatgacc ccgcagcagg cggcgccggc catcttccac 1260

gccatgttct cgcagaccat catgctgctg ctgggcggct tcgccatcgc cgccgccctg 1320

tccaaacacg ccatcgccaa gcaggtggcg gtgtccatcc tgtcccgtgt gggccgcaag 1380

ccgcgcaatg tgctgctggc ggccatgttc acagccacct tcgccagcat gtggatcagc 1440

aacgtggcgg cgcccgtgct gtgcttcgga ctcatacagc ccatcctcag gacgctggac 1500

cccggccacc cgttcgccaa ggcgctggtg atgggcattg cgctggcgtc caacgtgggc 1560

ggcatgacca gccccatcag cagcccgcag aacatcttcg ccatcgagcg catgagcctg 1620

gacggccgcc cgccctcgtg gctggcctgg ttcgcggtgg cgctgcccgt ggcggtcgca 1680

tgtaactttg tgtgctgggg tctgctgctg ctgtgctacc agcccggcaa ggccatcgcc 1740

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<212> DNA

<213> Chlamydomonas reintmrdtii

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cgacccccgc tccccctccc ctcctcccct cctccccacc cgcccccctt ccaacacaca 9600

cacacataca cgcacacgcg tgcaggcgcc atgggcctgc ctgtgagcgg cttccccaac 9660

atgaacgccg tgagcctgga ggacagcacc ggcaacgcca tcgtgggcac cggcgacttc 9720

ctggcggtgg gcgtgcccag ctccgtgttc gcgtacggca tcattgtctc gctgggctac 9780

gtgctcatgc tggcggtggg cttctagggc gggggcgcgt aggcgggcgg ggacacgtag 9840

gggagatgct atatcctatc aggagggagc ggtggagcac agggaaaggt tcaggcgggt 9900

tgctgtctgg atggcgctgg caggccggcg ggaagccagg ggcggtgggg tgcaccgcgc 9960

ccgtcaggca taaggccaat gccaatgaag tgtcacatgc gatgtatggc catgttgaag 10020

gccggggtgc gacgggtcta gttgtgaggt cagggcgttt cattacacac acgccgacgc 10080

gccacggcct actgggccca ccccacatct ggacgtggag cccgcgtggc gatacgcgca 10140

cagcttcgct ggtggccagg ggacgcgggg gtgacgcgag tgaaaagccg agtgggcggc 10200

acgcggtgtg agcgatcagg aatggaccgg cgctgtggct gaggtgcact gtgatgcgtg 10260

tgagctgtgt gagcatgacg gtgcggggag atgcgacgaa cggacgaacg ctgaggtcga 10320

ggagagctgc tgggggcgtg ctagtcgtag ctaccataca gcggaagagc gcgggttgtt 10380

agtataccat gcagcggaag agcgcgggtt acacaactaa cacaaggagc tccccctaga 10440

ggcggactgg ggagctggct agtcagtagg ctgcgaacgt cacaatctgc tgtggcctgc 10500

aaaccgtttg cggcgtgtac cggtatatga ctggtgctgc cggagtaccg ggaacttgct 10560

tcgcatcacc ctctgctctt gtttgtacaa ggaattcagt ggt 10603

Claims

1.PCT1蛋白的应用，为如下（d1）或（d2）或（d3）：

（d1）调控莱茵衣藻的多聚磷酸含量；

（d2）调控莱茵衣藻的总磷含量；

（d3）调控莱茵衣藻的碱性磷酸酶酶活；

所述PCT1蛋白为序列表中序列1所示的蛋白质。