KR20220164711A - 최소화된 바이오매스 부산물을 갖는 식물 생산 방법 및 그의 연관 식물 - Google Patents

Abstract

본원에서는 폴리(아데노신 5'-디포스페이트 (ADP)-리보스) 폴리머라제 (PARP) 효소를 코딩하는 유전자의 유전자 변형에 의해 식물에서 식용 바이오매스의 비율을 증가시키는 방법 및 이러한 방법을 사용하여 생성된 식물을 제공한다.

Description

최소화된 바이오매스 부산물을 갖는 식물 생산 방법 및 그의 연관 식물

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2020년 3월 5일 출원된 미국 가출원 번호 62/985,778의 우선권 이익을 주장하며, 본 가출원은 그 전문이 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.

상업용 도시 농업은 주로 건물, 선적 컨테이너 또는 사용되지 않는 공간에서 환경 제어 농업을 통해 미국에서 증가하고 있다. 교통비 절감, 연중 신선한 식품의 현지 생산, 및 도시인을 위한 식품 접근성 증가 등 도심에서 식품을 재배하면 많은 이점이 있다. 종종 이러한 시스템은 발자국 크기를 줄이기 위해 식물 성장 영역이 수직으로 적층되도록 디자인된다. 이는 또한 식물이 성장하여야 하는 이용 가능한 높이를 감소시켜 궁극적으로 이러한 시스템에서 재배될 수 있는 작물의 크기를 제한한다.

확장된 우주 탐사에 있는 식물은 식품 및 영양소의 신선한 공급원, CO₂ 흡수 능력 및 승무원에게 행동 건강상의 이점을 제공할 수 있다. 유사한 물리적 공간 제약은 식물 재배를 위한 전용 영역이 심하게 제약받는 우주 비행 애플리케이션에서도 찾을 수 있다.

두 경우 모두에서 대부분의 과실 및 채소를 보유하는 식물은 이러한 건축 환경에서 생존하기에는 너무 크고, 비식용 바이오매스를 너무 많이 생산한다. 결과적으로 이러한 시스템 중 다수는 예컨대 상추와 같은 녹색 잎 채소와 같이 작고 빠르게 성장하는 제한된 품종의 작물만을 생산한다. 작물의 식용 성분과 비식용 성분 사이의 바이오매스의 상대적 분포를 설명하는 데 사용되는 식물 생산성 메트릭인 수확 지수 (Hay, 1995)를 극대화시켜야 한다. 식물은 이러한 건축 환경에서 성장에 최적화되어 있지 않기 때문에 이러한 새로운 제약 조건에 맞는 새로운 식물 형질을 개발할 수 있는 기회가 많이 존재한다.

본 발명은 적어도 부분적으로는 식물에서 효소 폴리(아데노신 5'-디포스페이트 (ADP)-리보스) 폴리머라제 (PARP), 예컨대, PARP2를 코딩하는 유전자를 파괴시키는 것이, 예를 들어, 예컨대 우주 비행 애플리케이션 또는 다른 환경에서 한정되고/거나, 제어되는 성장에 이상적인 방식으로 그의 발생 주기를 변경시킬 수 있다는 발견에 기초한다. 이러한 유전자 변형된 식물은 최소량의 잎을 갖고/거나, 빠른 진행으로 과실을 발생시킬 수 있다. 추가로, 식물은 야생형 식물과 비교할 때 예컨대 작물 관리 및/또는 수확을 위해 로보틱스를 구현하는 환경과 같이 한정된, 제어된, 수직, 종속영양성 및/또는 자동화된 환경에서의 재배에 이상적인 몇 가지 형질을 가질 수 있다: 1) 작은 크기, 2) 소량의 비식용 바이오매스 생산, 3) 과실을 더 빨리 생산할 수 있는 능력, 4) 각 식물의 수명 주기 전 기간 동안 다양한 수확 시간에 걸쳐 중량 및/또는 크기가 더욱 일관된 과실을 생산할 수 있는 능력, 5) 동일하거나, 거의 동일한 양의 과실을 수확할 수 있는 능력, 6) 예컨대, 상기 언급된 임의의 이유로 인한 보다 적은 물 및/또는 수직 및/또는 수평 공간 활용 및/또는 7) 더 많은 종자를 생산할 수 있는 능력.

이러한 바람직한 형질은 본원에서 "SPACE"로 지칭되며, 이는 "우주 탐사용 작은 식물(Small Plants for spACe Expeditions)" 또는 "한정된 환경에서의 농업용 작은 식물(Small Plants for Agriculture in Confined Environments)" 또는 "제어된 환경에서의 농업용 작은 식물(Small Plants for Agriculture in Controlled Environments)" 또는 "농업적으로 제어된 환경을 위한 작은 식물(Small Plants for Agriculturally Controlled Environments)"을 의미할 수 있다. 이러한 바람직한 형질을 갖는 특정 계통의 식물은 본원에서 "SPACE," "SPACE 토마토," "M#", 예컨대, "M3," 또는 "PARP2 돌연변이체"로 지칭된다. 이러한 SPACE 형질은 화학적 억제제의 첨가에 의해, 또는 일부 실시양태에서, 유전자 파괴에 의해 유도될 수 있다. 식물을 왜소하게 만드는 대부분의 다른 돌연변이는 식용 과실 대비 잎이 많은 비식용 물질의 비를 그대로 유지한다. NASA는 이전에 우주 비행 중 재배를 위해 여러 왜성 토마토를 조사했지만, 이처럼 극단적인 것은 없었다. 작은 것 이외에도, SPACE 형질을 통해 식물은 전체 식물을 발생시킬 필요 없이, 발생 주기 동안 계속해서 빠르게 과실을 생산할 수 있다. 그 결과로 그의 바이오매스의 높은 부분을 차지하는 과실을 생산하는 매우 작은 식물이 생성된다. 예컨대, 토마토, 감자, 시트러스, 딸기, 페퍼, 블루베리와 같은 식물에 SPACE 형질을 도입하면 제어된 환경의 농업 시스템에서 재배될 수 있는 신선한 농산물의 범위가 확장된다. 일부 실시양태에서, 예컨대, 유전자 변형된 토마토에서 식물은 더 적은 수의 잎과 꽃을 갖고, 더 빠른 진행으로 과실을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 식물은 추가로 야생형 식물과 비교하여 예컨대, 2 내지 3배 증가된 더 많은 개수의 종자를 생산한다.

따라서, 본원에서는 PARP2 유전자를 파괴하고, 단백질의 발현을 억제하도록 유전자 변형된 식물을 제공한다.

도 1. 토양에서 성장하는 PARP2 유전자가 파괴된 90일령의 성숙한 토마토 식물의 T1 세대, 즉, 형질전환 후의 1세대.
도 2. 시험관내에서 성장하는 PARP2 유전자가 파괴된 토마토 식물.
도 3. 시험관내에서 성장하는 야생형 토마토 식물.
도 4. 토양에서 성장하는 T1 성숙한 야생형 토마토 식물.
도 5a-5c. 5a: PARP2 유전자가 파괴된 토마토 식물에서 Cas9 트랜스진의 PCR에 의한 T2 검출; 5b: PARP2 유전자가 파괴된 토마토 식물에서 NPTII 유전자 발현의 T2 RT-PCR 분석; 5c: PARP2 유전자가 파괴된 토마토 식물의 T2 유전자형 분석.
도 6a 및 도 6b. 6a: 야생형 토마토 식물의 T2 바이오매스 및 과실 생산 (수확 지수 = 0.60); 6b: 야생형 식물 (수확 지수 = 0.6) 및 PARP2 유전자가 파괴된 식물 (수확 지수 = 0.77)의 T2 바이오매스 및 과실 생산.
도 7. 상이한 식물 종에 존재하는 토마토 PARP2 유전자의 오솔로그.
도 8. PARP2 유전자가 파괴된 식물을 생산하는 데 사용된 pKEE401 바이너리 벡터의 물리적 지도.
도 9. 토마토 PARP2 유전자의 구조적 모티프.
도 10a-10c. 도 10a: 개화 및 결실 동안 PARP2 유전자가 파괴된 토마토 식물의 T2 집단; 도 10b: 개화 및 결실 동안 PARP2 유전자가 파괴된 성숙한 토마토 식물의 T3 집단의 상부 사시도; 도 10c: 개화 및 결실 동안 PARP2 유전자가 파괴된 성숙한 토마토 식물의 T3 집단의 측면 사시도.
도 11a-11c. 도 11a: T2 야생형 개화 토마토 식물; 도 11b: 조숙한 개화 및 결실을 나타내는 PARP2 유전자가 파괴된 T2 동형접합성 토마토 식물; 도 10b: 개화 및 결실 동안 PARP2 유전자가 파괴된 성숙한 토마토 식물의 T3 집단의 상부 사시도; 도 10c: 개화 및 결실 동안 PARP2 유전자가 파괴된 성숙한 토마토 식물의 T3 집단의 측면 사시도.
도 12a-12f. 12a: 성숙한 T3 야생형 토마토 식물 및 PARP2 유전자가 파괴된 토마토 식물의 줄기 높이; 12b: 성숙한 T3 야생형 토마토 식물 및 PARP2 유전자가 파괴된 토마토 식물의 수확량; 도 12c: 성숙한 T3 야생형 토마토 식물 및 PARP2 유전자가 파괴된 토마토 식물의 수확 지수; 12d: 성숙한 T3 야생형 토마토 식물 및 PARP2 유전자가 파괴된 토마토 식물의 토마토 중량 평균; 12e: 성숙한 T3 야생형 토마토 식물 및 PARP2 유전자가 파괴된 토마토 식물의 토마토 중량 표준 편차; 12f: 성숙한 T2 야생형 토마토 식물 및 PARP2 유전자가 파괴된 토마토 식물의 과실당 평균 종자.
도 13. T3 야생형 토마토 식물 및 PARP2 유전자가 파괴된 토마토 식물로부터의 토마토.
도 14. 시험관내에서 성장하는 PARP2 유전자가 파괴된 식물의 최신 세대.
도 15. T3 야생형 토마토 식물 및 PARP2 유전자가 파괴된 식물의 미각 검사.
도 16. T3 및 T4 야생형 토마토 식물 및 PARP2 유전자가 파괴된 식물의 써던 블롯 분석.

용어

본원에서 사용되는 바, 용어 "폴리(아데노신 5'-디포스페이트 (ADP)-리보스) 폴리머라제" 또는 "PARP" 유전자는 PARP 효소를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 폴리(ADP-리보실화)(PAR화)는 식물에서 DNA 수복, 유전자 전사, 스트레스 반응 및 발생 과정을 조절하는 중요한 번역 후 변형이다. 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP)는 NAD+로부터의 ADP-리보스 모이어티를 표적 단백질 상의 아미노산 수용체 잔기에 연속적으로 부가함으로써 PAR화를 촉매한다. 아라비돕시스(Arabidopsis)에는 3개의 정규 PARP 구성원이 있으며, 이들 구성원 중 2개인 AtPARP1 및 AtPARP2는 DNA 수복 및 스트레스 반응 과정을 조절하는 것으로 입증되었다. PARP2는 아라비돕시스에서 PARP 활동에 가장 크게 기여한다. PARP2 유사 단백질은 다양한 식물 분류군에 걸쳐 광범위하게 보존되는 반면, PARP1은 식물 및 동물에 걸쳐 광범위하게 보존된다. 식물 PARP2 효소는 전형적으로 DNA 결합 활성을 부여하는 N-말단 영역 중 하나 이상의 SAP 도메인, WGR 도메인, PARP 조절 도메인 및 PARP 촉매 도메인을 포함한다 (예컨대, 문헌 [Gu et al., BMC Plant Biol . 19:364, 2019] 참조). 아라비돕시스 PARP1 및 PARP2는 그의 촉매 코어에 전형적인 H-Y-E 촉매 트리아드를 가지고 있다. PARP2 유전자를 비롯한 식물의 내인성 PARP 유전자는 보존된 도메인과 PARP 시그니처 모티프의 존재에 기초하여 확인할 수 있다. PARP는 폴리펩티드의 C-말단에 촉매 도메인을 가지고 있는데, 이는 모든 PARP 단백질 패밀리의 공통된 특징이다. PARP는 또한 전형적으로 C-말단 촉매 도메인과 회합된 2개의 나선-루프-나선 구조 반복부로 이루어진 조절 도메인을 가지고 있다. WGR 도메인은 여러 PARP에 존재한다 (도 9).

유기체와 관련하여 사용되는 "내인성" 또는 "천연" 유전자 또는 단백질 서열은 유기체의 게놈에서 자연적으로 발생하는 유전자 또는 단백질 서열을 지칭한다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 외래 종에서 유래하거나, 동일한 종에서 유래한 경우, 그의 원래 형태에서 변형된 경우, 유기체 또는 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 "이종성"이다. 예를 들어, 프로모터가 이종성 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다고 하는 경우, 이는 코딩 서열이 한 종에서 유래되는 반면, 프로모터 서열은 또 다른 상이한 종에서 유래되거나; 또는 둘 모두 동일한 종에서 유래된 경우, 코딩 서열은 프로모터와 자연적으로 연관되지 않는다는 것 (예를 들어, 예컨대 동일한 종의 상이한 유전자로부터의 유전자 조작된 코딩 서열, 또는 상이한 생태형 또는 품종의 대립유전자이다)을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "프로모터"는 세포에서 코딩 서열의 전사를 유도할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 따라서, 프로모터는 시스-작용 전사 제어 요소 및 유전자 전사의 타이밍 및/또는 속도를 조절하거나, 또는 조정하는 데 관여하는 조절 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 전사 조절에 관여하는, 인핸서, 프로모터, 전사 종결인자, 복제 기점, 염색체 통합 서열, 5' 및 3' 비번역 영역, 또는 인트론 서열을 포함하는 시스-작용 전사 제어 요소일 수 있다. 이러한 시스-작용 서열은 전형적으로 단백질 또는 다른 생체분자와 상호작용하여 유전자 전사를 수행한다 (예컨대, 작동 개시/종료, 조절, 조정 등). "구성적 프로모터"는 거의 모든 조직 타입에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터인 반면, "조직-특이적 프로모터"는 하나 또는 소수의 특정 조직 타입에서만 전사를 개시한다.

"작동가능하게 연결된"이라는 용어는 핵산 발현 제어 서열 (예컨대, 프로모터, 또는 전사 인자 결합 부위 어레이)과 제2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 의미하며, 여기서 발현 제어 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지시한다.

용어 "식물"은 전체 식물, 새싹 영양 기관 및/또는 구조 (예컨대, 잎, 줄기 및 괴경), 뿌리, 꽃 및 꽃 기관 (예컨대, 포엽, 꽃받침, 꽃잎, 수술, 심피, 꽃밥), 배주 (난세포 및 중심 세포 포함), 종자 (접합자, 배, 배유 및 종피 포함), 과실 (예컨대, 성숙한 씨방), 묘목, 식물 조직 (예컨대, 관다발 조직, 지상 조직 등), 세포 (예컨대, 공변 세포, 난세포, 트리콤 등) 및 그의 자손을 포함한다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 식물 부류는 일반적으로 속씨식물 (단자엽 및 쌍자엽 식물), 겉씨식물, 양치류 및 다세포 조류를 비롯한, 형질전환 기술에 순응하는 고등 내지 하등 식물 부류만큼 광범위하다. 이는 이수체, 배수체, 이배체, 반수체 및 반접합체를 비롯한 다양한 배수체 수준의 식물을 포함한다. "유전자 변형된 식물"은 모체 식물로 조작된 유전자 변형을 갖는 식물의 자손을 포함한다.

"핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드 서열"이라는 어구는 5' 말단에서 3' 말단으로 판독되는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일 또는 이중 가닥 중합체를 지칭한다. 핵산은 또한 폴리머라제에 의한 정확한 판독 및/또는 이중 가닥 이중체의 형성을 허용하고, 해당 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현을 유의적으로 변경시키지 않는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

"~을 코딩하는 핵산 서열"이라는 어구는 RNA를 코딩하는 핵산으로서, 이는 차례로 비코딩 RNA (예컨대, gRNA), 또는 특정 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 예컨대, RNA 또는 mRNA일 수 있는 핵산을 지칭할 수 있다. 핵산 서열은 RNA로 전사되는 DNA 가닥 서열과 단백질로 번역되는 RNA 서열, 둘 모두를 포함한다. 핵산 서열은 전장 핵산 서열 뿐만 아니라, 전장 서열로부터 유래된 비-전장 서열 둘 모두를 포함한다. 서열은 특정 숙주 세포에서 코돈 선호도를 제공하기 위해 도입될 수 있는 천연 서열 또는 서열들의 축중성 코돈을 포함한다는 것을 추가로 이해하여야 한다.

둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 "동일한" 또는 "동일성"(%)이라는 용어는 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나, 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정된 바, 비교창에 걸쳐 최대 일치하도록 비교되고, 정렬되었을 때, 2개 이상의 서열 또는 하위서열이 동일하거나, 또는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 특정 백분율로 갖는다는 것을 지칭한다. 두 핵산 서열 또는 폴리펩티드는 두 서열에서 각각 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 서열이 하기 기술되는 바와 같이 최대 일치하도록 위해 정렬되었을 때 동일하다면, "동일하다"라고 일컬어진다. 서열 동일성(%)이 단백질 또는 펩티드와 관련하여 사용될 때, 동일하지 않은 잔기 위치는 종종, 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성 (예컨대, 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되어 분자의 기능적 특성이 변경되지 않는 보존적 아미노산 치환과는 상이한 것으로 이해된다. 보존적 치환에서 서열이 상이할 경우, 서열 동일성(%)은 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 조정을 위한 수단은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 전형적으로 이는 보존적 치환을 전체 미스매치보다는 부분으로 점수화하여 서열 동일성(%)을 증가시키는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 동일한 아미노산에는 점수 1이 주어지고, 비보존적 치환에는 점수 0이 주어지는 경우, 보존적 치환은 0 내지 1 사이의 점수를 받게 된다. 보존적 치환의 점수화는 예컨대, 프로그램 PC/GENE (인텔리제네틱스(Intelligenetics: 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰))에서 구현된 바와 같이, 예컨대, 문헌 [Meyers & Miller, Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17 (1988)]의 알고리즘에 따라 계산된다.

"발현 카세트"는 숙주 세포 내로 도입될 때, 각각 RNA 또는 폴리펩티드의 전사 및/또는 번역을 초래하는 핵산 구축물을 지칭한다.

"RNA-가이드된 뉴클레아제"는 sgRNA와 조합하여 절단을 위해 DNA 서열을 표적화하는 뉴클레아제를 지칭한다. 일반적으로, sgRNA 부재하에서 뉴클레아제는 불활성화이고, 표적 부위에서 DNA를 절단하지 않는다. 상기 뉴클레아제의 예로는 예를 들어, Cas9 및 본원 CRISPR의 맥락에서 논의된 다른 뉴클레아제를 포함한다.

게놈 편집

유전자의 발현을 억제시키기 위한 내인성 식물 PARP 유전자, 예컨대, PARP2 유전자의 변형은 핵산 서열을 변형, 결실 또는 게놈 DNA 내로 삽입하기 위한 임의의 수의 게놈 편집 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 방법의 예로는 서열 특이적 뉴클레아제의 사용이 포함된다. 일부 실시양태에서, 게놈 편집 방법은 문헌 [Sauer et al., Plant Physiol. 170: 917-1928, 2016]에 기술된 바와 같이, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 사용하여 식물 게놈에 정확한 염기쌍 변형을 도입할 수 있다.

일부 실시양태에서, 유전자 편집을 위한 뉴클레아제 시스템이 사용된다. 특정 게놈 서열에 표적화되어 서열-특이적 절단을 유도하고, 이로써, 표적화된 돌연변이유발을 허용할 수 있는 임의의 뉴클레아제가 사용될 수 있다. 본 발명에서 "가이드된 뉴클레아제"는 예를 들어, 별개의 소형 가이드 RNA (sgRNA) 또는 DNA 서열을 표적화하는 융합 단백질 서열에 의해 특정 게놈 DNA 서열을 표적화하는 DNA 뉴클레아제를 지칭한다. 뉴클레아제 및 가이드 분자를 전달하는 데 임의의 전달 방법이 사용될 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제 및 가이드 RNA는 동일한 기전에 의해 전달된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 한 기전에 의해 식물에 전달되고 sgRNA는 제2 기전에 의해 식물에 전달된다.

예시적인 뉴클레아제로는 예를 들어, 조작된 또는 천연 메가뉴클레아제, TALE 엔도뉴클레아제 (TALEN), 아연-핑거 단백질 (ZFP), 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), DNA-가이드된 폴리펩티드, 예컨대, 나트로노박테리움 그레고리(Natronobacterium gregoryi Argonaute: NgAgo), 및 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제, 예컨대, 예를 들어, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeat: CRISPR)/Cas9 시스템, CRISPR/Cpf1 시스템, CRISPR/CasX 시스템, CRISPR/CasY 시스템, CRISPR/캐스캐이드 시스템)을 포함한다. 다른 CRISPR/Cas RNA-가이드된 폴리펩티드 Cms1, MAD7 등.

CRISPR/Cas 시스템은 게놈 편집 및 전사 조절을 위해 원핵 및 진핵 시스템에서 사용하기 위해 변형되었다. "CRISPR/Cas" 시스템은 외래 핵산에 대한 방어를 위한 광범위한 부류의 박테리아 시스템을 지칭한다. CRISPR/Cas 시스템은 광범위한 유박테리아 및 고세균에서 발견된다. CRISPR/Cas 시스템은 타입 I, II 및 III 하위타입을 포함한다. 야생형 H CRISPR/Cas 시스템은 RNA 매개 뉴클레아제인 Cas9를 가이드 및 활성화 RNA와 복합체로 활용하여 외래 핵산을 인식하고, 절단한다. Cas9 상동체는 하기 분류학적 군의 박테리아를 포함하나, 이에 제한되지 않는 매우 다양한 유박테리아에서 발견된다: 악티노박테리아(Actinobacteria), 아퀴피카에(Aquificae), 박테로이데테스-클로로비(Bacteroidetes-Chlorobi), 클라미디아에-베루코마이크로비아(Chlamydiae-Verrucomicrobia), 클로로플렉시(Chloroflexi), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 피르미쿠테스(Firmicutes), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 스피로카에테스(Spirochaetes), 및 테르모토가에(Thermotogae). 예시적인 Cas9 단백질은 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9 단백질이다. Cas9 단백질 및 그의 상동체의 추가의 비제한적인 예는 문헌에 기술되어 있다. 일부 실시양태에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 Cpf1 뉴클레아제 또는 Cas9 뉴클레아제이다. 언급한 바와 같이, 이 시스템에서 뉴클레아제는 sgRNA에 의해 프로그래밍된 표적 영역에서 이중 가닥 파단을 생성하여 PARP 유전자, 예컨대, PARP2 유전자의 발현을 억제시키는 억제 돌연변이를 유도할 수 있는 수복을 초래한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 돌연변이는 예컨대, CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템을 사용하여 식물 내로 도입되어 프로모터를 돌연변이시킴으로써 PARP 유전자, 예컨대, PARP2 유전자의 발현을 파괴시킬 수 있다.

한 측면에서, 본원에서는 PARP 유전자, 예컨대, PARP2 유전자를 억제시키는 하나 이상의 변경을 도입하는, 조작된, 비자연적으로 발생된 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부(CRISPR)-CRISPR 연관 (Cas) (CRISPR-Cas) 시스템 뿐만 아니라, 가이드 핵산, 예컨대, RNA를 제공한다. 일부 실시양태에서, CRISPR-Cas 시스템은 (a) 표적 서열, 예컨대, 표적 PARP2 유전자 서열과 하이브리드화하는 CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA를 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 식물 세포에서 작동가능한 제1 조절 요소, 및 (b) 타입-II Cas9 또는 Cpf1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 식물 세포에서 작동가능한 제2 조절 요소를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하고, 여기서 성분 (a) 및 (b)는 시스템의 동일하거나, 또는 상이한 벡터 상에 위치하고, 이로써, 가이드 RNA는 PARP 유전자 서열을 표적화하고, Cas9 단백질은 DNA 분자를 절단한다.

뉴클레아제를 표적 PARP 게놈 서열로 가이드하는 가이드 핵산, 예컨대, 하나 이상의 sgRNA는 식물에서 발현될 수 있다. 가이드 RNA 서열 선택은 예컨대, PCT 공개 번호 WO2018107028에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.

일부 실시양태에서, 관심 유전자의 표적 서열은 sgRNA의 가이드 영역에 상보적일 수 있다. 일부 실시양태에서, sgRNA의 가이드 영역과 관심 유전자 중의 그의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 또는 동일성 정도는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있고, 오프-타겟 효과를 피하기 위해서는 더 높거나, 100%의 동일성이 가장 바람직하다. 일부 실시양태에서, sgRNA의 가이드 영역과 관심 유전자 중의 표적 영역은 100% 상보적이거나, 또는 동일할 수 있다. 다른 실시양태에서, sgRNA의 가이드 영역과 관심 유전자 중의 표적 영역은 적어도 하나의 미스매치를 포함할 수 있다. 예를 들어, sgRNA의 가이드 영역과 관심 유전자 중의 표적 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 미스매치를 포함할 수 있으며, 여기서 표적 서열의 총 길이는 적어도 약 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 염기쌍 길이이다. 일부 실시양태에서, sgRNA의 가이드 영역과 관심 유전자의 표적 영역은 1-6개의 미스매치를 포함할 수 있고, 여기서 가이드 서열은 적어도 약 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, sgRNA의 가이드 영역과 관심 유전자의 표적 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 미스매치를 포함할 수 있고, 여기서 가이드 서열은 약 20개의 뉴클레오티드를 포함한다. 5' 말단은 가이드 영역으로 간주되지 않는 (즉, Cas9 또는 또는 다른 뉴클레아제 단백질을 표적 핵산 (예컨대, 관심 유전자)으로 유도하는 기능을 하지 않는) 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

상기 제시된 바와 바와 같이, CRISPR-기반 뉴클레아제에 대한 대안이 또한 사용될 수 있다. ZFN, TALE 및 TALEN의 예는 예컨대, 문헌 [Lloyd et al., Frontiers in Immunology, 4(221), 1-7 (2013)]에 기술되어 있다.

일부 실시양태에서, DNA-표적화 분자는 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하고, 뉴클레아제에 융합되는 하나 이상의 아연-핑거 단백질(ZFP) 또는 그의 도메인을 포함한다. ZFP 또는 그의 도메인은 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화된 결합 도메인 내의 아미노산 서열 영역인 하나 이상의 아연 핑거를 통해 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 더 큰 단백질 내의 단백질 또는 도메인이다. 용어 "아연 핑거 DNA 결합 단백질"이라는 용어는 종종 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다.

ZFP 중에는 개별 핑거의 어셈블리에 의해 생성된, 전형적으로 9-18개 뉴클레오티드 길이인, 특정 DNA 서열을 표적화하는 인공 ZFP 도메인이 있다. ZFP는 단일 핑거 도메인의 길이가 대략 30개의 아미노산 길이이고, 단일 베타 선회부의 두 시스테인과 함께 아연을 통해 배위결합된 2개의 불변 히스티딘 잔기를 함유하고, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 핑거를 갖는 알파 나선을 포함하는 것을 포함한다. 일반적으로, ZFP의 서열-특이성은 아연 핑거 인식 나선 상의 4개의 나선 위치 (-1, 2, 3 및 6)에서 아미노산을 치환함으로써 변경될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, ZFP 또는 ZFP-함유 분자는 비자연적으로 발생된 것이고, 예컨대, 선택된 표적 부위에 결합하도록 조작된다. 예를 들어, 문헌 [Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141]; [Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340]; [Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660]; [Segal et al. (2001) Curr. Opin . Biotechnol . 12:632-637]; [Choo et al. (2000) Curr . Opin . Struct . Biol. 10:411-416]; 미국 특허 번호 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; 및 미국 특허 공개 번호 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061 (상기 문헌은 모두 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)을 참조한다.

일부 실시양태에서, DNA-표적화 분자는 아연-핑거 DNA 결합 도메인, TALEN, 또는 표적화된 뉴클레아제를 형성하기 위해 DNA 절단 도메인에 융합된 다른 DNA-표적화 단백질이거나, 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 타입 IIS 제한 효소 및 하나 이상의 DNA-표적화 단백질로부터의 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 도메인은 타입 IIS 제한 엔도뉴클레아제 Fok I로부터의 것이다. Fok I은 일반적으로 한 가닥에서는 그의 인식 부위로부터의 9개의 뉴클레오티드 및 나머지 다른 한 가닥 상에서는 그의 인식 부위로부터의 13개의 뉴클레오티드에서 DNA의 이중 가닥 절단을 촉매한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; 뿐만 아니라, 문헌 [Li et al. (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:4275-4279]; [Li et al. (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:2764-2768]; [Kim et al. (1994) Proc. Natl . Acad . Sci . USA 91:883-887]; [Kim et al. (1994) J. Biol . Chem. 269:31,978-31,982]를 참조한다.

일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제, 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 아르고노트 (아르고노트 단백질의 비제한적 예로는 써무스 써모필루스( Thermus thermophilus) 아르고노트 (TtAgo), 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 아르고노트 (PfAgo), 나트로노박테리움 그레고리 아르고노트 (NgAgo)를 포함한다), RNA-가이드된 뉴클레아제, 예컨대, CRISPR 연관된 뉴클레아제 (CRISPR 연관된 뉴클레아제의 비제한적 예로는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csn1 및 Csx12로도 공지), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, CasX, CasY, Mad7, 그의 상동체, 또는 그의 변형된 버전을 포함한다)로부터 선택된다.

뉴클레아제의 도입, 및 CRISPR 기반 방법 또는 별개의 가이드 분자를 필요로 하는 다른 방법의 경우, 뉴클레아제 및 별개의 가이드 분자의 도입은 원하는 대로 임의의 수의 방식으로 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제, 가이드 분자, 또는 둘 모두는 식물 게놈 내로 뉴클레아제 또는 가이드 핵산에 대한 코딩 서열의 도입을 초래하지 않는 일시적인 방법을 통해 식물에 도입된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제 및 가이드 분자는 동일한 기전에 의해 도입된다. 예를 들어, CRISPR 뉴클레아제 및 sgRNA는 리보핵단백질 복합체의 형태로 식물에 도입되거나, 식물에 도입된 DNA 또는 RNA에 의해 코딩될 수 있으며, 여기서 뉴클레아제 및 임의적으로 sgRNA는 도입된 DNA 또는 RNA로부터 발현된다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 뉴클레아제를 코딩하는 발현 카세트는 식물의 게놈 내로 도입될 수 있고, 사용된 뉴클레아제에 의해 필요한 경우 별개의 가이드 분자가 일시적으로 도입될 수 있다. 뉴클레아제 및 가이드 분자를 도입하기 위한 다수의 방법은 예를 들어, 문헌 [Cermak, T., et al., The Plant Cell, Vol. 29: 1196-1217 (June 2017)]에 기술되어 있다.

일부 실시양태에서, 뉴클레아제 및 임의적으로 가이드 분자는 구성적 또는 실질적으로 편재하는 프로모터로부터 발현될 수 있다. 예를 들어, 프로모터 또는 프로모터 단편은 식물의 모든 또는 실질적으로 모든 (예컨대, 많은 조직 및 싹 분열조직을 포함) 조직에서 뉴클레아제의 발현을 지시하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 프로모터는 본원에서 "구성적" 프로모터로 지칭되며, 대부분의 환경 조건 및 발생 또는 세포 분화 상태에서 활성을 나타낸다. 구성적 프로모터의 예로 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 전사 개시 영역, 아그로박테리움 투마파시엔스(Agrobacterium tumafaciens)의 T-DNA로부터 유래된 1'- 또는 2'- 프로모터, 파슬리 UBI 프로모터 (Kawalleck et al., Plant Mol Biol . (1993 Feb) 21(4):673-84), RPS5 (Hiroki Tsutsui et al. Plant and Cell Physiology (2016)); 2X35SΩ (Belhaj, Khaoula, et al. Plant methods 9.1 (2013): 39); AtUBI10 (Callis J, et al. Genetics 139: 921-939 (1995)); SlUBI10 (Dahan-Meir, Tal, et al. The Plant Journal (2018)); G10-90 (Ishige, Fumiharu, et al. The Plant Journal 18.4 (1999): 443-448) 및 통상의 기술자에게 공지된 다양한 식물 유전자로부터의 다른 전사 개시 영역을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 식물의 게놈을 변형시키는 것과 관련하여 "변형시키는"이라는 어구는 표적 게놈 영역에서 게놈 서열의 구조적 변화를 유도하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 변형시키는 것은 세포의 게놈으로부터 뉴클레오티드 서열을 결실시키는 형태를 취할 수 있다. 상기와 같이 변형시키는 것은 예를 들어, 표적 게놈 영역 내의 이중 가닥 파단, 또는 반대 가닥 상의 단일 가닥 닉의 쌍을 유도하고, 표적 게놈 영역을 플랭킹함으로써 수행될 수 있다.

생성된 DNA 파단은 세포의 DNA 수복 기전 (예컨대, 비-상동성 말단 연결을 통해)에 의해 수복될 수 있으며, 이는 파단에서 하나 이상의 삽입 또는 결실을 빈번하게 도입하여 코딩된 단백질 또는 RNA의 활성을 손상시키거나, 또는 그를 제거할 것이다. 일부 실시양태에서, 핵산 주형 분자는 핵산 주형 분자가 상동성-직접 수복 (HDR)을 통한 DNA 수복을 위한 상동성 주형으로서 세포에 의해 사용되도록 세포 내로 (가이드 RNA와 동일하거나 또는 별개의 벡터 상에) 도입될 수 있다. 핵산 주형 분자가 상동성이지만, 세포의 염색체 DNA로부터 하나 이상의 뉴클레오티드 변이를 포함하는 경우, 수복은 수복의 일부로서 상기 뉴클레오티드 변이를 도입하여 표적 DNA에 특정 표적화된 변이를 도입할 것이다.

뉴클레아제, 가이드 분자, 또는 둘 모두의 발현을 위한 발현 카세트는 식물 내로 도입되는 바이러스 레플리콘 또는 비-바이러스 벡터의 일부일 수 있다. 바이러스 레플리콘을 포함하거나, 또는 그 부재하의 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 예시적인 식물 바이러스 레플리콘 벡터는 예컨대, DNA 스 (예컨대, 콩 황색 왜성 바이러스, 밀 왜성 바이러스, 양배추 잎 말림 바이러스, 및 감자 바이러스 X (PVX)) 및 RNA 바이러스 (예컨대, 담배 얼룩 바이러스)로부터의 일부를 포함한다. 예컨대, 문헌 [Zaidi et al., Front Plant Sci. 2017; 8: 539 (2017)] 및 [Lacomme et al., Curr Protoc Microbiol. 2008 Feb; Chapter 16:Unit 16I]를 참조한다.

식물에 가이드 분자를 전달하는 임의의 추가 방법이 고려된다. 예를 들어, 바이러스 레플리콘 벡터를 사용하는 대신, 리보핵단백질 (RNP)로서 뉴클레아제와 RNA 복합체를 직접 전달할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 가이드 분자, 뉴클레아제, 또는 그 둘 모두, 또는 뉴클레아제 및/또는 가이드 분자를 코딩하는 핵산을 식물에 직접 도입하기 위해 입자 총 충격을 사용할 수 있다.

대안적으로, DNA 구축물은 적합한 T-DNA 플랭킹 영역과 조합될 수 있고, 통상의 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 숙주 벡터에 도입될 수 있다. 아그로박테리움 투메파시엔스 숙주의 독성 기능은 세포가 박테리아에 의해 감염되었을 때, T-DNA가 식물 세포로 전달되도록 지시할 것이다. 완화(disarming) 및 바이너리 벡터의 사용을 포함한 아그로박테리움 투메파시엔스 매개 형질전환 기술은 과학 문헌에 잘 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Horsch et al. Science 233:496-498 (1984)], 및 [Fraley et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 80:4803 (1983)]을 참조한다.

미세주입 기술이 또한 사용될 수 있다. 이러한 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 문헌에 철저히 기술되어 있다. 폴리에틸렌 글리콜 침전을 사용한 DNA 구축물의 도입은 예를 들어, 문헌 [Paszkowski et al. EMBO J. 3:2717-2722 (1984)]에 기술되어 있다. 전기천공 기술은 예를 들어, 문헌 [Fromm et al. Proc. Natl. Acad . Sci . USA 82:5824 (1985)]에 기술되어 있다. 탄도학적 형질전환 기술은 예를 들어, 문헌 [Klein et al. Nature 327:70-73 (1987)에 기술되어 있다. 일부 실시양태에서, 탄화규소 휘스커 매개 식물 형질전환이 사용된다 (예컨대, 문헌 [Asad and Arshad (2011). Silicon Carbide Whisker-mediated Plant Transformation, Properties and Applications of Silicon Carbide, Prof. Rosario Gerhardt (Ed.), ISBN: 978-953-307-201-2] 참조).

PARP 유전자의 발현을 파괴시키거나, 또는 다르게는 억제시키도록 디자인된 유전자 변형을 포함하는 식물은 공지된 기술을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 유전자의 존재가 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스크리닝은 표현형 변화에 기초하여 수행될 수 있으며, 예를 들어, 식물은 작은 크기, 예컨대, 대조군 야생형 식물과 비교할 때 크기가 더 작은 것으로; 대조군 야생형 식물과 비교할 때, 식용 바이오매스 대비 비식용 바이오매스 양의 감소에 대해 선택될 수 있고, 예컨대, 선택은 하기 기준에 기초하여 이루어질 수 있다: 수확 가능한 과실을 더 빨리 생산할 수 있는 각 식물; 토마토의 경우, 수확 지수는 0.60 내지 0.84 또는 그 이상 이내이고; 토마토의 경우, 과실 수확량은 28 g 이상이고; 토마토의 경우, 과실의 평균 중량은 3.79 g 이상이고, 크기는 더욱 일관되고; 토마토의 경우, 수확량은 39 g 이상이고/거나; 줄기 높이는 6 cm 이하이다. "대조군 야생형 식물"은 변형된 식물과 동일한 계통 또는 재배종의 PARP-파괴된 식물의 카운터파트로서, PARP 파괴는 없는 것을 지칭한다.

일부 실시양태에서, PARP 유전자, 예컨대, PARP2 유전자의 발현을 파괴시키거나, 또는 다르게는 억제시키는 변형을 갖는 식물은 동일한 시점에서, 예를 들어, 대조군 식물에 대한 최적의 성장 기간 동안 측정되었을 때, 대조군 야생형 식물보다 더 작을 수 있고, 예를 들어, 대조군 야생형 식물의 크기와 비교하여 75% 이하의 크기, 또는 일부 실시양태에서, 대조군 야생형 식물의 크기와 비교하여 70% 이하의 크기, 또는 65% 이하의 크기, 또는 60% 이하의 크기 또는 55% 이하의 크기, 또는 50% 이하의 크기인 크기를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, PARP 유전자, 예컨대, PARP2 유전자의 발현을 파괴시키거나, 또는 다르게는 억제시키는 변형을 갖는 식물은 대조군 야생형 식물보다 20% 이상인 수확 지수를 가질 수 있다.

식물 타입

임의의 식물 종은 PARP 유전자를 파괴시키는 데 표적이 될 수 있다. 도 7은 다양한 PARP2 오솔로그에 대한 수탁 번호가 요약되어 있다. 일부 실시양태에서, 식물은 과실 또는 채소를 생산한다. 일부 실시양태에서, 식물은 토마토, 캐놀라, 비트, 감자, 시트러스, 딸기, 페퍼, 블루베리, 벼, 밀, 또는 보리이다.

일부 실시양태에서, PARP 유전자를 파괴시키기 위해 유전자 변형된 식물은 왜소 (d) 유전자 또는 자가-가지치기 (sp) 유전자의 돌연변이와 같은 추가 돌연변이를 가질 수 있다. 예를 들어, PARP 유전자를 파괴하도록 변형된 식물, 예컨대, 토마토 식물은 또한 공지된 d 및/또는 sp 유전자 돌연변이 (예컨대, 문헌 [Kobayashi, et al., Plant & Cell Physiology 55: 445-54, 2014] 참조), 또는 다른 왜성화 유전자 또는 식물 성장에 관여하는 유전자를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물, 예컨대, 토마토 식물은 SIGLK2 유전자에 돌연변이를 가질 수 있다 (예컨대, 문헌 [Powell et al., Science 336:1711-1715, 2012] 참조). 다른 식물 중 예시적인 왜성 1 유전자는 벼 (Ashikari et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA 96:10284-10289, 1999), 보리 (Xu et al., BMC Plant Biology 17:2-10, 2017); 및 카놀라 (Muangprom and Osborn, Theor Appl Genet 108:1378-1384, 2004)를 포함한다.

일부 실시양태에서, 식물은 아벨모스쿠스(Abelmoschus) 속, 알리움(Allium) 속, 아마란투스(Amaranthus) 속, 아라키스(Arachis) 속, 아라비돕시스 속, 아스파라거스(Asparagus) 속, 아트로파(Atropa) 속, 아베나(Avena) 속, 베닌카사(Benincasa) 속, 베타(Beta) 속, 브로시카(Brassica) 속, 칸나비스(Cannabis) 속, 캡셀라(Capsella) 속, 시카(Cica) 속, 키코리움(Cichorium) 속, 시트러스(Citrus) 속, 시트룰루스(Citrullus) 속, 카프시쿰(Capsicum) 속, 칼타무스(Carthamus) 속, 코코스(Cocos) 속, 코페아(Coffea) 속, 쿠쿠미스(Cucumis) 속, 쿠쿠르비타(Cucurbita) 속, 사이나사(Cynasa) 속, 다우쿠스(Daucus) 속, 디플로탁시스(Diplotaxis) 속, 디오스코레아(Dioscorea) 속, 엘라이스(Elais) 속, 에루카(Eruca) 속, 포에니쿠룸(Foeniculum) 속, 프라가리아(Fragaria) 속, 글리키네(Glycine) 속, 고시피움(Gossypium) 속, 헬리안투스(Helianthus) 속, 헤테로칼리스(Heterocallis) 속, 홀데움(Hordeum) 속, 히오시아무스(Hyoscyamus) 속, 이포메아(Ipomea) 속, 락투카(Lactuca) 속, 라게나리아(Lagenaria) 속, 레피디움(Lepidium) 속, 리눔(Linum) 속, 로리움(Lolium) 속, 루파(Luffa) 속, 루줄라(Luzula) 속, 라이코페르시콘(Lycopersicon) 속, 말루스(Malus) 속, 마니호트(Manihot) 속, 마요라나(Majorana) 속, 메디카고(Medicago) 속, 모모디카(Momodica) 속, 무스(Musa) 속, 니코티아나(Nicotiana) 속, 올레아(Olea) 속, 오리자(Oryza) 속, 파니쿰(Panicum) 속, 파스티나카(Pastinaca) 속, 페니세툼(Pennisetum) 속, 페르세아(Persea) 속, 페트로셀리니움(Petroselinium) 속, 파세올루스(Phaseolus) 속, 피살리스(Physalis) 속, 피누스(Pinus) 속, 피숨(Pisum) 속, 포풀루스(Populus) 속, 피루스(Pyrus) 속, 프루누스(Prunus) 속, 라파누스(Raphanus) 속, 사카룸(Saccharum) 속, 세칼레(Secale) 속, 세네시오(Senecio) 속, 세사뭄(Sesamum) 속, 시나피스(Sinapis) 속, 솔라눔(Solanum) 속, 소르굼(Sorghum) 속, 스피나시아(Spinacia) 속, 테오브로마(Theobroma) 속, 트리코산테스(Trichosantes) 속, 트리고넬라(Trigonella) 속, 트리티쿰(Triticum) 속, 투리티스(Turritis) 속, 발레리아넬라(Valerianelle) 속, 비티스(Vitis) 속, 비그나(Vigna) 속, 또는 제아(Zea) 속 식물의 종이다. 일부 실시양태에서, 식물은 브로시카 나푸스(Brassica napus) 종, 쿠쿠미스 멜로(Cucumis melo) 종, 쿠쿠르비타 페포(Cucurbita pepo) 종, 다우쿠스 카로타(Daucus carota) 종, 고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum) 종, 글리키네 막스(Glycine max) 종, 헬리안투스 안누우스(Helianthus annuus) 종, 리눔 우시타티시뭄(Linum usitatissimum) 종, 파파베르 솜니페룸(Papaver somniferum) 종, 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 종, 솔라눔 라이코퍼시쿰(Solanum lycopersicum) 종, 스피나시아 올레라세아(Spinacia oleracea) 종, 또는 비그나 운구이쿨라타(Vigna unguiculata) 종으로부터 선택된다.

실시예

실시예 1. CRISPR-조작된 토마토 식물의 발생 속도 및 수확 지수 증가

본 실시예는 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 사용하여 효소 폴리(아데노신 5'-디포스페이트 (ADP)-리보스) 폴리머라제 (PARP)를 코딩하는 식물 성장 및 스트레스 반응에서 중요한 유전자를 불활성화시킨다 (Akhari, 2013). 본 실시예는 예컨대 PARP2 유전자의 돌연변이를 캐리오버하는 토마토 식물과 같은 식물은 그의 발생 주기를 통해 빠르게 진행되어 과실을 생산할 수 있다는 것을 예시한 것이다. 신속한 진행으로 인해 과실이 아닌 바이오매스의 생산은 거의 일어나지 않을 수 있다. 이들 식물은 또한 대조군 야생형 식물보다 더 많은 종자를 생산할 수 있고, 더 높은 수확 지수를 나타낼 수 있다. 예컨대, 도 1에서와 같이, 상기 유전자가 손상된 식물의 표현형은 예를 들어, SPACE 식물과 같이 건축 환경에서 재배되는 작물에 유용할 수 있다.

방법. CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 비기능성 PARP2 유전자를 캐리오버하는 토마토 식물을 생성하였다. 유전자 변형에 사용되는 재배종은 마이크로-톰(Micro-Tom) 재배종이다. 종자는 볼시드(Ballseed), 로트 번호 2018230301로부터 수득하였다. PARP 유전자 중의 표적 부위는 https 사이트 crispr.dbcls.jp에서 이용 가능한 CRISPRdirect 프로그램을 사용하여 선택하였다. 선택된 sgRNA 표적 서열은, U6 폴리머라제 프로모터 제어하의 gRNA, 및 카나마이신 내성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (NPTII) 선별가능한 마커 유전자와 함께, 고등 식물에 대해 코돈 최적화되고, CaMV 35S 프로모터에 의해 구동되는 Cas9 엔도뉴클레아제 유전자를 함유하는 플라스미드 pKEE401의 T-DNA에 어셈블리되었다 (문헌 [Wang et al., Genome Biol . 16:144, 2015]; 애드진(Addgene)으로부터 입수, 도 8에 도시; 벡터는 pCambia 백본을 갖고, Cas9 유전자, 공 gRNA 스캐폴드, 및 박테리아 및 식물에서 카나마이신 내성 선별을 위한 nptII 유전자를 함유한다) (도 5b). 골든 게이트(Golden gate) 방법을 사용하여 구축물 어셈블리를 수행하였다 (Weber et al. 2011). 본 발명자들의 실험실에서 통상적으로 사용되는 아그로박테리움 매개 형질전환 프로토콜을 사용하여 CRISPR/Cas9-gRNA 발현 카세트를 토마토로 형질전환시켰다 (Garcia et al., 2015).

간략하면, 종피로부터 막 나온 자엽을 해부하고, 2일 동안 미리 배양한 후, 관심 CRISPR/Cas9 구축물을 함유하는 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 GV3101을 접종하였다. 2일 간의 공동 재배 후, 자엽 세그먼트를 100 mg/l 카나마이신, 250 mg/l 세포탁심 및 500 mg/l 카르베니실린으로 보충된 선택적 재생 배지로 옮겼다. 새싹 키가 0.5 cm일 때, 50 mg/l의 카나마이신 또한 함유한 선택적 발근 배지로 옮기고, 발근된 식물만 온실로 옮겼다 (Garcia et al., 2015).

표준 세틸-트리메틸-암모늄 브로마이드 프로토콜 및 RN이지 플랜트 미니(RNeasy Plant Mini) 키트 (퀴아젠(QIAGEN))를 사용하여 총 RNA 및 게놈 DNA를 추출하였다. 35S 프로모터의 3' 말단 내지 Cas9의 5' 말단에 걸쳐 있는 영역을 증폭시키도록 디자인된 프라이머를 사용하여 Cas9-sgRNA 구축물의 존재에 대해 각 식물의 유전자형을 분석하였다. RT-PCR을 이용하여 PARP2 유전자 발현 분석도 수행하였다. PARP2 유전자 중 CRISPR/Cas9 표적 영역에 플랭킹하는 프라이머를 이용하여 앰플리콘을 또한 생성하였다. 프라이머 서열은 표 1에 제시되어 있다. 모든 PCR 생성물을 1%(w/v) 아가로스 겔에서 분해하였다. pSC-A-amp/kan 벡터 (스트라테진(Strategene))로의 클로닝을 위해 선택된 PCR 생성물을 절제하고 정제하였다. M13F 및 M13R 프라이머를 사용하여 PCR 생성물당 최소 3개의 클론을 시퀀싱하였다. MacVector 소프트웨어 패키지의 ClustalW를 사용하여 정렬을 수행하였다. 생식계열 전달 및 유전성을 시험하기 위해, T1 및 T2 식물의 종자를 시험관내에서 100 mg/l의 카나마이신을 함유하는 선별 배지에서 발아시키고, DNA를 추출하였다. PCR에 의해 Cas9의 존재 및 돌연변이의 유전에 대해 각 묘목의 유전자형을 분석하였다.

결과. CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 파괴된 PARP2 유전자를 캐리오버하는 트랜스제닉 토마토 식물을 생성하였다. 아그로박테리움 매개 형질전환을 통해 Cas9-sgRNA 유전자를 형질전환시켰다. 말단-PCR 및 RT-PCR 분석을 사용하여 T0 1차 형질전환체 뿐만 아니라, 선택된 형질전환체의 T1 및 T2 세대에서 트랜스진의 존재를 결정하였다 (도 5a-b). PARP2 유전자 중 표적 영역의 시퀀싱 결과, 단일 또는 이중 뉴클레오티드 결실이 존재하는 것으로 나타났고, 이는 말단절단된 비기능성 단백질의 생산으로 이어지는 번역 프레임 쉬프트를 야기할 것이다. 예컨대, 도 1 및 4 비교에서와 같이, 돌연변이를 보유하는 식물은 야생형보다 현저히 작았다. 추가로, PARP2 유전자 중 돌연변이를 갖는 식물은 야생형보다 10일 일찍 개화하고, 과실을 맺었으며 (도 11a-b), 야생형 식물보다 과실당 더 많은 종자를 생산하였다 (도 12f).

수확 지수는 작물의 식용 성분과 비식용 성분 사이의 바이오매스의 상대적 분포를 설명하는 데 사용되는 식물 생산성 메트릭이다 (Hay, 1995). 도 6a-b에 도시되어 있는 바와 같이, 야생형 식물과 비교할 때 PARP 돌연변이체는 과실 대비 더 많은 바이오매스를 유도하였다. T2 실험의 경우, 평균 수확 지수는 야생형의 경우 0.60인 반면 (도 6a 및 11a), PARP2 파괴 유전자를 캐리오버하는 식물의 경우, 0.77이었다 (도 6b 및 11b).

줄기 높이, 즉, 1차 줄기 높이는 PARP2 유전자가 파괴된 모든 토마토 식물 계통에 걸쳐 유의적으로 더 짧았다 (도 11c 및 12a). 이러한 형질을 통해 PARP2 유전자가 파괴된 토마토 식물은 야생형 토마토 식물과 비교할 때 동일하거나 더 많은 수확량의 과실을 생산하면서 (도 12b), 수직 공간을 더욱 잘 활용할 수 있으며 (도 1, 10b-c, 11a-c, 12a), 이는 선반, 예컨대, 선반 하나 (도 10b-c) 및/또는 식물로 채워진 수직 재배 타워를 사용하는 수직 농장을 통해 작물을 재배할 때 특히 가치가 있다. 효율적인 수직 및 수평 공간 활용의 극단적인 예는 시험관내에서 재배된 PARP2 유전자가 파괴된 외식편에 의해 입증되었다 (도 2 및 14). 추가로, PARP2 유전자가 파괴된 모든 토마토 식물 계통은 야생형 토마토 식물의 것과 비교하였을 때, 토마토의 크기가 유의적으로 더 일정하고 더 빨리 성숙되었고, 즉, 토마토 중량의 표준 편차는 더 작고, 평균 토마토 중량은 동일하였다 (도 12d-e, 13). PARP 돌연변이체는 그의 과실의 더욱 빠른 성장과 성숙, 및 그의 과실의 더욱 균일한 크기를 가능하게 하면서, 비식용 바이오매스 대비 식용 바이오매스로 더 많은 자원을 유도할 수 있는 것으로 보인다. 이러한 형질은 중요한데, 그 이유는 첫 수확 이후의 후속 수확은 더 작은 과실을 생산하며, 종종 다른 더 적은 소득 생성 생성물, 예컨대, 동물 사료, 소스 등의 일부로 판매되어야 하는 바, 토마토 재배자들은 첫 수확을 그의 소비자 시장성이 가장 큰 것으로 하는 데 익숙하기 때문이다.

도 15를 참조하면, 야생형 토마토 식물과 SPACE 형질을 갖는 토마토 식물 사이의 맛 특징에는 통계적으로 유의적인 차이는 없었다.

도 16을 참조하면, 써던 블롯 분석 결과, 유전자, 예컨대, nptII 유전자가 있는 마커를 포함하는 T-DNA 삽입, 및 예컨대, CRISPR/Cas9 시스템의 유전자 편집을 통해 SPACE 형질을 보이는 식물의 형질전환 동안 생성에 사용된 CRISPR/Cas9 시스템은 예컨대, T3 및 T4 세대에 의해 분리될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

표 1을 참조하면, 영양 분석 결과, 다양한 성장 환경에서 야생형 토마토 식물과 SPACE 형질을 갖는 토마토 식물 사이의 영양 특성 간에 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났다.

본원에서 인용된 간행물, 수탁 번호, 특허 출원 및 특허를 비롯한 모든 참고 문헌은 마치 각각의 참고 문헌이 개별적으로 및 구체적으로 참조로 포함되는 것으로 명시된 것과 동일한 정도로 인용된 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다.

예시적인 서열

S. 라이코퍼시쿰 ( S. lycopersicum ) PARP2 ( Solyc08g074730 ) 코딩 서열 (가이드 RNA에 대한 서열은 밑줄로 표시되어 있다)

pHEE401E PARP2 (한 sg RNA는 밑줄로 표시)

SEQUENCE LISTING <110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA <120> A METHOD FOR PRODUCING PLANTS WITH MINIMIZED BIOMASS BYPRODUCT AND ASSOCIATED PLANTS THEREOF <130> 1238807 <140> PCT/US2021/021194 <141> 2021-03-05 <150> 62/985,778 <151> 2020-03-05 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1693 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 1 atggccacca ttaccaattt taatgtcgat gaatttgact caatgaatgt tgtggaggag 60 tataagaaga taagtgttaa tgatccggtg aacttttata cttggtcgaa gaaaaaattt 120 gttgacaggc tttgtgctgt tgctaattta cagattgacg atcatctacc agttggagat 180 gaaggcaaga cagagaaatt ggtcacagca acaaagaagg gtgcagctgt tttggatcaa 240 tatctgtcag atgaaatcaa ggcattatac catgtcctgc atcaaggaaa tgatatttat 300 gaggccacat tgaaccaaac aaatgttgag aacaacgata acgaatttta tatcattcaa 360 gttctagaga atgattgtgg tgggaatttc cttctttaca ctagatgggg tagagttggt 420 gaaaagggag aaacgaagat cagtggtccc tatacgtatg ccggtgatgc cacatctgag 480 tttgagcgta aattctatga gaagaccaag aactgttggt ctaaccgcaa agattttttt 540 tgtcaaccaa agcaatatgc ttggttggaa atggactatg atgaaaatgg ggaatactca 600 tcaatccaag gacagtccat tctagtacca agaagtcgac ctcgtgagac taagctggag 660 gccccgattg caaagttcat atctcttatt tgtgacatca atatgatgag gcagcaaatg 720 atggaaatag gttacaatgc taacaagttg ccactcggta aattgagcaa gaaaactatt 780 ttaaagggct atgatgtctt gaaaaatatt gctgtgttat aggccagttc aacaggacac 840 tgcttgaaga tttgagcagt caattctata cagtcattcc tcatgatttt ggattccaga 900 agatggaatt tgtcattgac acccttccaa agttaaaacg caaaattgaa atggtgaaag 960 ctcttgctga aattgaagtc acaactaagt tatcggagga taacacagat atacaggagg 1020 atcccttgtt ttatcaatat gaacaacttg gttgcaaact tgttccagtt gaagtcggtt 1080 cccaggaata tctcatgatt gagaattaca tgaagaatac ccatgcaaaa tacattctgg 1140 ttatgctgtc gatattgttc aagtatttag ggcatcaaga aatggtgaaa atgaaagatt 1200 tcagaagttc tctgatacga gtaataggat gcttttatgg cacggttctc ggctgacaaa 1260 ctgggctggc attctttcac agggtttaag aattgctcct ccagaagcac cttcgacagg 1320 gtacatgttt gggaaaggtg tttactttgc tgatatgttc tccgagagtg caatttattg 1380 ctatgcctca tcggctgcta agaatggtgt gcttttgttg tgcgaggttg ctctcggcga 1440 catgaatgag ctattgtcag ccaactccga tgctgataag ttgcctttgg gaaagctaag 1500 cacaaaagca gtcggtgcca tggccccaga ttttaaagaa gctcaaatac ttgaagatgg 1560 tgtcatcgtt cctctgggaa atccaaagga gcgaccaaaa cagggtaatt tgttgcataa 1620 tgagtacatt gtttacaatg tggaacaatt aaggatgcgc tatgttatcc aggttgagtt 1680 caattatgaa ata 1693 <210> 2 <211> 1286 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 cgacttgcct tccgcacaat acatcatttc ttcttagctt tttttcttct tcttcgttca 60 tacagttttt ttttgtttat cagcttacat tttcttgaac cgtagctttc gttttcttct 120 ttttaacttt ccattcggag tttttgtatc ttgtttcata gtttgtccca ggattagaat 180 gattaggcat cgaaccttca agaatttgat tgaataaaac atcttcattc ttaagatatg 240 aagataatct tcaaaaggcc cctgggaatc tgaaagaaga gaagcaggcc catttatatg 300 ggaaagaaca atagtatttc ttatataggc ccatttaagt tgaaaacaat cttcaaaagt 360 cccacatcgc ttagataaga aaacgaagct gagtttatat acagctagag tcgaagtagt 420 gattgatacg tatgccggtg atgcctttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct 480 agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc ttttttttgc aaaattttcc 540 agatcgattt cttcttcctc tgttcttcgg cgttcaattt ctggggtttt ctcttcgttt 600 tctgtaactg aaacctaaaa tttgacctaa aaaaaatctc aaataatatg attcagtggt 660 tttgtacttt tcagttagtt gagttttgca gttccgatga gataaaccaa tattaatcca 720 aactactgca gcctgacaga caaatgagga tgcaaacaat tttaaagttt atctaacgct 780 agctgttttg tttcttctct ctggtgcacc aacgacggcg ttttctcaat cataaagagg 840 cttgttttac ttaaggccaa taatgttgat ggatcgaaag aagagggctt ttaataaacg 900 agcccgttta agctgtaaac gatgtcaaaa acatcccaca tcgttcagtt gaaaatagaa 960 gctctgttta tatattggta gagtcgacta agagattgag aagtcgacct cgtgagacgt 1020 tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg 1080 caccgagtcg gtgctttttt ttgcaaaatt ttccagatcg atttcttctt cctctgttct 1140 tcggcgttca atttctgggg ttttctcttc gttttctgta actgaaacct aaaatttgac 1200 ctaaaaaaaa tctcaaataa tatgattcag tggttttgta cttttcagtt agttgagttt 1260 tgcagttccg atgagataaa ccaata 1286 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 atacgtatgc cggtgatgcc 20 <210> 4 <211> 55 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 4 gagaaacgaa gatcagtggt ccctatacgt atgccggtga tgccacatct gagtt 55 <210> 5 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 5 gagaaacgaa gatcagtggt ccctacgtat gccggtgatg ccacatctga gtt 53 <210> 6 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 6 gagaaacgaa gatcagtggt ccctatagta tgccggtgat gccacatctg agtt 54

Claims (8)

1. 식물의 내인성 PARP 유전자의 발현을 파괴시키는 단계; 및
   카운터파트 대조군 식물과 비교하여 비식용 바이오매스의 비율이 감소된 식물을 선별하는 단계를 포함하는,
   카운터파트 대조군 식물과 비교하여 감소된 비식용 바이오매스를 갖는 식물을 수득하는 방법.
2. 제1항에 있어서, PARP 유전자가 PARP2 유전자인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 식물이 토마토 식물, 감자 식물, 시트러스 식물, 딸기 식물, 페퍼 식물, 또는 블루베리 식물인 방법.
4. 제3항에 있어서, 식물이 토마토 식물인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, PARP 유전자의 발현을 파괴시키는 단계가 RNA-가이드된 뉴클레아제를 식물 내로 도입하는 것을 포함하고, 여기서 RNA 가이드가 PARP 유전자를 표적화하는 것인 방법.
6. 제5항에 있어서, RNA-가이드된 뉴클레아제가 Cas 폴리펩티드인 방법.
7. 제6항에 있어서, RNA 가이드 뉴클레아제가 Cas9 폴리펩티드인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 식물.

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