CN107674875B - 棉花GbCaMBP基因在植物抗黄萎病中的应用 - Google Patents

棉花GbCaMBP基因在植物抗黄萎病中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107674875B
CN107674875B CN201711135399.4A CN201711135399A CN107674875B CN 107674875 B CN107674875 B CN 107674875B CN 201711135399 A CN201711135399 A CN 201711135399A CN 107674875 B CN107674875 B CN 107674875B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gbcambp
cotton
gene
plant
verticillium wilt
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711135399.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107674875A (zh
Inventor
蔡应繁
耿帅鹏
孙全
何琳
龙璐
高巍
张骁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan University
Original Assignee
Henan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan University filed Critical Henan University
Priority to CN201711135399.4A priority Critical patent/CN107674875B/zh
Publication of CN107674875A publication Critical patent/CN107674875A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107674875B publication Critical patent/CN107674875B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了棉花GbCaMBP基因在植物抗黄萎病中的应用。本发明棉花GbCaMBP基因核苷酸基序列如SEQ ID NO.1、氨基酸序列如SEQ ID NO.1；本发明GbCaMBP基因在棉花中被沉默后植物抗黄萎病能力降低，在拟南芥中超表达后植物抗黄萎病能力提高，表明其具有抗黄萎病的作用，可以应用于创制抗病新种质，从而进行植物品种改良。

Description

棉花GbCaMBP基因在植物抗黄萎病中的应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及棉花GbCaMBP基因在植物抗黄萎病中的应用。
背景技术
植物是一种多细胞真核生物，由于其特性被限制在特定的生存环境中而无法自由移动，因此会无法避免地时刻遭受到来自方方面面的不利因素的影响。以土壤为传播媒介的病原体大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)和黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum)是一种严重的真菌类维管束病害。由于能够导致植物叶片萎蔫且伴有黄化现象，剖杆检验维管组织发现有黄褐病变现象，因此将此病症称之为黄萎病。据统计，全球每年要有超过百万亩的棉花遭受黄萎病的侵害而损失惨重。棉花中的黄萎病主要由大丽轮枝菌导致，是棉花中分布范围广，非常严重又极难防治的病害，堪称棉花的“癌症”。棉花黄萎病致病菌在土壤中通过根系损伤部位进入到棉花中，通过植物蒸腾作用经维管束组织和木质部输导系统由根部向上运输。黄萎病菌在棉花的木质部及导管处不断增殖，产生的菌丝和孢子造成植物运输途径的堵塞，阻碍棉花各项生理活动所需营养物质的运输，造成棉花机体受损。随着棉花黄萎病菌对棉花生产损害的日益严重，科学家们开始把目光投向了对棉花抗黄萎病的研究，期望能够找到有效防治棉花黄萎病的相关措施。由于大丽轮枝菌在植物维管中独一无二的生态位，使得黄萎病很难通过杀菌剂、化学农药和栽培措施进行控制，且杀菌剂、化学农药还容易导致环境污染。随着分子生物学和生物信息学技术的迅猛发展，通过植物基因工程技术来提升植物对病害的抗性成为现目前棉花抗黄萎病研究的重要方法之一。
Ca2+是真核生物中普遍存在的第二信使，其在植物的生长发育以及应对环境刺激等生命进程中起着重要作用。Ca2+通过浓度变化调节细胞活动进而参与到各项反应进程中，这种调节作用首先通过Ca2+的感受器即钙调素(Calmodulin，CaM)蛋白分子对其结合的响应，即钙调素(CaMs)通过结合游离的Ca2+引发多种生理反应。在Ca2+/CaM信号传递通路中有一个重要的组成部分即钙调素结合蛋白(Calmodulin-binding proteins，CaMBPs)，它是CaM直接结合并作用的靶蛋白。CaMBPs通过其自身的钙调素结合域广义上能够与钙调素结合的蛋白均可称之为钙调素结合蛋白，因此钙调素结合蛋白是个大家族，成员众多，例如H+-ATPase、NAD激酶等。但现目前对钙调素结合蛋白基因的功能研究报道较少，主要为拟南芥在温度、渗透胁迫等非生物胁迫下少数钙调素结合蛋白基因的表达受影响，而在棉花中还未见报道。由于钙调素结合蛋白是Ca2+/CaM信号传递通路中的一个重要组成部分，因此对钙调素结合蛋白基因的鉴定及其功能研究对其在植物生长发育和植物对环境刺激反应中的作用具有重要意义。
发明内容
鉴于此，在前期棉花抗黄萎病基因筛选基础上，本发明的目的之一是提供棉花GbCaMBP基因在植物抗黄萎病中的应用，所述GbCaMBP基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1的序列相似性在90％以上，所述GbCaMBP基因的氨基酸序列与SEQ ID NO.2的序列相似性在80％以上；
优选地，所述GbCaMBP基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1相同，所述GbCaMBP基因的氨基酸序列与SEQ ID NO.2相同；
优选地，所述植物为棉花。
本发明的目的之二是提供一种提高植物抗黄萎病能力的方法，所述方法包括将GbCaMBP基因核苷酸序列连入植物表达载体得到重组植物表达载体，所述GbCaMBP基因核苷酸序列与SEQ ID NO.1的序列相似性在90％以上，所述重组植物表达载体通过根癌农杆菌转化法转化入植物中得到转基因植物，所述转基因植物与未进行转基因的植物相比，具有更强的抗黄萎病能力；
优选地，所述GbCaMBP基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1相同。
优选地，所述植物为棉花或拟南芥。
本发明通过前期棉花抗黄萎病基因筛选，获得一个钙调素结合蛋白基因，该基因序列如SEQ ID NO.1，通过将棉花中的该基因进行沉默，植物抗黄萎病能力降低，通过在拟南芥中超表达该基因，植物抗黄萎病能力提高，表明该基因具有抗黄萎病的作用，可以应用于创制抗病新种质，从而进行植物品种改良。由于棉花物种较多，不同棉花中该基因的序列不会完全相同，因此与SEQ ID NO.1序列和SEQ ID NO.2序列相似性较高(相似性分别大于90％和80％)的基因也具有抗黄萎病能力。
附图说明
图1为本发明海岛棉GbCaMBP基因编码区序列PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为本发明海岛棉GbCaMBP蛋白与拟南芥中已知的部分CaMBPs蛋白家族成员的进化关系图；
图3为本发明GbCaMBP启动子序列生物信息学分析图；
图4为本发明GbCaMBP基因在棉花中的组织表达谱图；
图5为本发明GbCaMBP基因在拟南芥中表达的组织定位图；
图6为本发明在黄萎病菌处理下棉花中GbCaMBP基因的表达变化图；
图7为本发明棉花VIGS沉默基因体系验证图；
图8为本发明GbCaMBP基因在棉花中被沉默的表达量验证图；
图9为本发明GbCaMBP基因沉默的棉花与对照棉花间在黄萎病菌侵染下的叶片黄化、萎蔫水平比较图；
图10为本发明GbCaMBP基因沉默的棉花与对照棉花间在黄萎病菌侵染下的植株发病率与病情指数比较图；
图11为本发明GbCaMBP基因沉默的棉花与对照棉花间在黄萎病菌侵染后经剖杆处理下的褐化比较图；
图12为本发明GbCaMBP基因沉默的棉花与对照棉花间在黄萎病菌侵染后经黄萎病菌恢复培养下的黄萎病菌数量比较图；
图13为本发明GbCaMBP基因沉默的棉花与对照棉花间在黄萎病菌侵染后台盼蓝染色比较图；
图14为本发明转GbCaMBP基因拟南芥与野生型间GbCaMBP基因表达量比较图；
图15为本发明转GbCaMBP基因拟南芥与野生型间在黄萎病菌侵染下的叶片黄化、萎蔫水平比较图；
图16为本发明转GbCaMBP基因拟南芥与野生型间在黄萎病菌侵染下的植株发病率与病情指数比较图。
具体实施方式
下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。
实验例1：棉花钙调素结合蛋白基因GbCaMBP的克隆和生物信息学鉴定
1、海岛棉GbCaMBP基因的克隆
①按照Aidlab公司的EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒说明书上的提取步骤提取海岛棉新海15品种的总RNA并反转录为cDNA，将cDNA浓度稀释至50-60ng/μL。海岛棉新海15品种种子由中国农业科学院棉花研究所提供。
②通过转录组测序分析筛选出一个钙调素结合蛋白基因的EST序列，通过在华中农业大学的海岛棉数据库(http://cotton.cropdb.org/cotton/tools/blast.php)中进行序列比对，比对出一个完整的cDNA序列，用引物设计软件Primer Premier5.0设计一对扩增引物(F:ATGGGATTGTCTCTTTCATTGC；R:TTAGCCCACTGTTGCTATAG)，采用PCR技术，用高保真酶(TaKaRa)，以海岛棉新海15的cDNA为扩增模板进行序列扩增。PCR反应体系为：ddH2O8.6μL，高保真酶10μL，模板1μL，上下游引物各0.2μL。PCR程序为：94℃5min，94℃30s、60℃30s、72℃2min，28个循环；72℃延伸10min。PCR产物凝胶电泳结果如图1所示，产物大小与预期一致，即1626bp。
③对PCR扩增产物进行平末端加A反应，反应体系为：扩增产物14.5μL，10×PCRBuffer 2μL，Mix dNTP 3μL，rTaq酶0.5μL。在PCR仪中72℃加热20min。
④使用TIANGEN产品编号为DP209-02的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，并按照其操作说明书的步骤对平末端加A反应产物进行回收纯化。
⑤T载体连接反应，反应体系为：pMD18-T(TaKaRa)0.5μL，solution I 5μL，纯化产物3μL，ddH2O 1.5μL。放置在16℃恒温水浴锅中过夜连接，随后通过热激反应将连接产物转化进入大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，培养过后挑取单菌落获得GbCaMBP基因片段，单菌落送到华大公司测序获得海岛棉GbCaMBP基因序列，即SEQ ID NO.1。
2、海岛棉GbCaMBP基因的生物信息学鉴定
①利用(http://web.expasy.org/protparam/)网站上的软件在线分析GbCaMBP蛋白的理化性质，该蛋白含有541个氨基酸(即SEQ ID NO.2)，分子量为60.72216kD，等电点pI为9.36。利用(http://cn.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)软件对GbCaMBP蛋白进行亲/疏水性在线分析，结果显示GbCaMBP蛋白为疏水性蛋白。
②利用(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi？id＝index)软件对GbCaMBP蛋白的二级结构及三级结构进行在线预测，结果显示其二级结构中含有一个钙调素结合位点的IQ基序，其三级结构是由两个具有钙调素结合蛋白家族特征的α螺旋组成。表明GbCaMBP蛋白具有钙调素结合蛋白家族的显著特征，其属于钙调素结合蛋白基因家族，但其蛋白序列没有明显的保守结构域。利用(https://www.predictprotein.org/)软件在线预测GbCaMBP蛋白的亚细胞定位，预测结果显示定位在真核生物的细胞质中。
③将GbCaMBP蛋白与拟南芥中已知的部分CaMBPs蛋白家族成员利用DNAMAN软件进行序列比对并使用MEGA4软件进行序列的进化分析。结果如图2所示，GbCaMBP蛋白在进化关系上与AtMKP1、AtWRKY7和AtCAMTA3蛋白的亲缘性最近，但其对GbCaMBP蛋白与AtMKP1、AtWRKY7和AtCAMTA3蛋白在进化关系上亲缘性的支持率不高，而且GbCaMBP的蛋白序列缺少明显的保守结构域，因此暂时还不能将GbCaMBP蛋白明确划分到CaMBPs蛋白家族的某一亚族中，表明GbCaMBP蛋白是个未知蛋白。
实验例2：GbCaMBP的启动子序列克隆和生物信息学分析
利用(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！search？show＝BLAST)软件在线找出GbCaMBP的启动子序列，并从海岛棉新海15的基因组DNA中扩增GbCaMBP的启动子区域，得到了位于起始密码子(ATG)上游一段914bp的序列。利用启动子转录起始位点预测软件TSSP对这段序列进行分析，预测GbCaMBP的转录起始位点位ATG上游第44个碱基(+1，A)。
利用(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)软件在线预测分析启动子序列上的顺式作用元件，预测的结果如图3所示，GbCaMBP的启动子序列中除了含有核心启动子序列(TATA-box和CAAT-box)外，还含有光敏感元件(Box I，G-box)，真菌诱导应答元件(Box-W1)以及参与水杨酸(TCA-element)、赤霉素(GARE)、脱落酸(ABRE)和机械损伤诱导(WUN-motif)的作用元件，表明GbCaMB可能会参与激素和逆境反应途径中去。
实验例3：GbCaMBP基因与棉花抗黄萎病相关实验
1、GbCaMBP基因在棉花中的表达模式分析
种植海岛棉新海15品种的棉花，待棉花幼苗生长3周左右时间时取棉花的子叶、真叶、茎、茎尖和根作为样品对GbCaMBP基因进行组织表达模式分析。首先对已取的样品进行提取RNA操作，接着反转录成cDNA模板，并稀释至10-20ng/μL，利用qRT-PCR技术使用ABI7500Real Time PCR系统(Applied Biosystems，USA)对GbCaMBP基因进行组织表达模式分析，以海岛棉泛素蛋白7即Ubiquitin7(UBQ7)作为内参基因。
设计GbCaMBP基因上下游引物分别为：
F:GATTGGTTGCTCGTGATGG
R:GCTTGCCCGTATGAGTTGT；
设计Ubiquitin7基因上下游引物分别为：
F:GAAGGCATTCCACCTGACCAAC
R:CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG。
qRT-PCR反应体系为：2×SYBR Green PCR Master Mix 5μL，ROXⅡ0.2μL，cDNA模板4.2μL，上下游引物各0.3μL。qRT-PCR程序为：95℃1min，95℃5s、60℃40s，40个循环。反应结束后用溶解曲线分析来检测扩增产物的特异性。每个反应起码要包括三个生物学重复。通过将单一模板稀释至不同浓度，并将模板稀释倍数的log值对每个稀释样品的Ct值作，用以检测引物扩增效率。采用2-ΔCT法来计算目标基因的相对表达量。
分析结果如图4所示，GbCaMBP基因在根、真叶、子叶和茎中均有表达，其中在根中的表达量最高，表明该基因的主要表达场所在根部，这可能与黄萎病菌主要从植物根开始侵染相关。
2、GbCaMBP表达的组织定位
将GbCaMBP基因的启动子序列与载体pKGWFS7.0互相连接构建成GUS表达载体proGbCaMBP:GUS，将GUS表达载体proGbCaMBP:GUS使用花絮侵染法通过农杆菌介导转化到野生型拟南芥中。用卡那霉素筛选再生植株，对筛选植株进行GUS染色，选择成功染色并染色程度适中的再生植株种子播种于含卡那霉素的MS培养基表面继续筛选。通过GUS染色检测和筛选植株分离比检测，最后选择了GUS染色适中且稳定的转基因株系作为实验材料，进一步对GbCaMBP的表达场所进行组织定位探究，GUS染色结果如图5所示，拟南芥的叶片和根均着色，其中根部的着色最重，表明GbCaMBP的表达场所集中在根部，与该基因在棉花中的表达模式结果一致。
3、GbCaMBP基因在生物胁迫下的表达模式分析
在超净工作台中将保存在-80℃环境中的黄萎病菌菌种放置室温自然溶化，然后将黄萎病菌菌液涂在PDA固体培养基，待晾干之后倒置在28℃环境下培养至长出明显菌落后用无菌水吹打菌落得到孢子液。采用伤根法接种黄萎病菌，即种植一批海岛棉新海15品种的棉花，将生长至两子叶平展并有一个真叶芽芯的棉花幼苗从种植的土壤中剥离，并将根部洗净，对洗净后的棉花幼苗进行伤根处理即用剪刀剪掉一些须根，然后将棉花根部浸入浓度为2×106spores/mL的黄萎病病原菌孢子液中，浸染1min，浸染过后，将棉花幼苗重新种植到土壤中。在接种后的0h、1h、4h、8h、12h、24h、36h、48h和72h取棉花幼苗的真叶作为样品。对经黄萎病菌接种处理的样品提取RNA，并反转录为cDNA模板，利用qRT-PCR技术对GbCaMBP基因进行黄萎病菌诱导表达模式分析，结果如图6所示，经黄萎病病原菌接种8h和12h后，GbCaMBP的表达量显著性下调，随后其表达量趋于稳定，表明GbCaMBP的表达受黄萎病的诱导调控。
4、VIGS技术沉默GbCaMBP对棉花抗黄萎病的影响
①通过与同源序列进行比对，找到GbCaMBP的非保守区域，设计引物扩增VIGS片段，且在VIGS片段的两端分别加上BamHI和KpnI酶切位点。上下游引物分别为：
F:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACGATTGGTTGCTCGTGATGG
R:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGGCTTGCCCGTATGAGTTGT
②通过VIGS片段和pTRV2载体的BamHI和KpnI双酶切与连接构建GbCaMBP的VIGS干涉载体TRV:GbCaMBP。
VIGS片段酶切体系：BamHI 1μL，KpnI 1.5μL，10×K Buffer 2.5μL，VIGS片段6μL，ddH 2O 39μL；pTRV2载体酶切体系：BamHI 1μL，KpnI 1.5μL，10×K Buffer 2.5μL，空载体片段15μL，ddH 2O 30μL。将两者均放置在37℃水浴锅中酶切过夜。
连接体系：VIGS酶切片段7μL，TRV2酶切空载体1μL，T4连接酶1μL，T4 Buffer 2μL。将其放置于16℃恒温水浴锅中进行过夜连接，最后将连接产物转化入农杆菌中。
③农杆菌介导的棉花遗传转化。首先将分别含有TRV:GbCaMBP和TRV:00(对照空载体)的农杆菌加入新鲜的含有抗生素的LB液体培养基中过夜小摇；接着对经过小摇过的TRV:GbCaMBP和TRV1:00的农杆菌进行过夜大摇，大摇时除了加抗生素以外还要加MES和AS，第二天测其OD值，OD值在0.6-0.8之间即可；将OD值符合要求的TRV:GbCaMBP和TRV1:00的农杆菌，进行离心，并加入相同体积的VIGS buffer来吹打悬浮混匀；将TRV:GbCaMBP和TRV1:00的悬浮菌液在28℃条件下，按120rpm振荡活化1-2h后用医用注射器对两片子叶平展并有一个真叶芽芯的棉花苗的子叶进行注射菌液，注射至抗病品种海岛棉新海(Xinhai)15和感病品种陆地棉冀棉(Jimian)11的棉花幼苗子叶中；注射后的苗子要在25℃条件下避光处理24h。得到TRV:00和TRV:GbCaMBP植株。同时将调控叶绿素合成基因GbCLA的VIGS载体同步注射入棉花幼苗子叶中去，以鉴定该VIGS体系的准确性。棉花植株生长两周左右，如图7所示，注射了GbCLA基因的VIGS载体的植株的子叶出现白化现象，表明该VIGS体系是准确的。提取TRV:00和TRV:GbCaMBP植株真叶的RNA反转录为cDNA模板进行GbCaMBP基因沉默效率的qRT-PCR表达检测，结果如图8所示TRV:GbCaMBP植株中GbCaMBP基因的表达显著降低，表明GbCaMBP基因被成功沉默。
④仍采用伤根法分别对抗病品种海岛棉新海15和感病品种陆地棉冀棉11的TRV:00和TRV:GbCaMBP棉花幼苗接种浓度为2×105spores/mL的黄萎病菌V991孢子液，同时用灭菌水接种作为空白对照来鉴定棉花对黄萎病抗性的变化，以探究GbCaMBP的表达对棉花对黄萎病抗性的影响。灭菌水接种的空白对照显示TRV:00植株和TRV:GbCaMBP植株的生长没有区别。在接种黄萎病菌后一星期左右开始观察棉花植株的发病情况，结果发现在接种16d后实验组棉花幼苗开始出现叶片黄化的现象而空白组棉花幼苗生长正常。发病状况如图9所示，TRV:GbCaMBP植株与TRV:00植株相比叶片黄化枯萎的数量更多，程度更严重，而且如果10所示，TRV:GbCaMBP植株的发病率与病情指数均高于TRV:00植株。由此可见，TRV:GbCaMBP植株对黄萎病菌的抗性低于TRV:00植株，表明当GbCaMBP被沉默之后，抗病品种和感病品种棉花对黄萎病菌的抗性均降低，表明GbCaMBP基因具有抗黄萎病的作用。
⑤为了进一步验证上述表型结果的准确性，本研究继续做了黄萎病菌恢复培养实验、病植剖杆处理和台盼蓝染色实验。黄萎病菌恢复培养实验方法为：用剪刀将经黄萎病处理后的棉花幼苗的茎剪成1cm长的片段，接着用0.1％的HgCl 2溶液中消毒1min，然后用无菌水冲洗5次左右，最后将处理后的棉花茎片段放置于PDA培养基上培养，25℃条件下培养大约10-14d，即可观察黄萎病菌恢复培养的生长状况。病植剖杆处理方法为：取若干经黄萎病菌接种后的棉花茎秆，用刀对其进行横切或者纵切，暴露出其横切面或者纵切面，观察茎秆的维管束组织的表型，若茎秆维管束组织为褐色即表示已感染黄萎病菌并发病，若茎秆维管束组织无褐色而表型正常即表示未发病。台盼蓝染色实验方法：选取生长位置和大小一致的发病叶片各三片，分别放置50mL大小的离心管中，倒入适量的台盼蓝染液浸没叶片，放置真空抽滤器中进行抽真空操作30min(使染液进入细胞间隙中)，100℃水浴8min，放置常温6-8h染色，接着对叶片进行脱色至叶片透明为止(50％酒精85℃洗15min，75％酒精85℃洗15min，100％酒精常温洗至完全脱色)，将完成脱色的叶片放入含有双蒸水的皿中，在显微镜下拍照或者用照相机拍照。
实验结果如图11所示，TRV:GbCaMBP植株材料的剖杆材料褐化程度要高于TRV:00植株材料；如图12所示，TRV:GbCaMBP植株材料在PDA培养基中培养出来的黄萎病菌菌落要多于TRV:00植株材料；如图13所示，TRV:GbCaMBP植株材料的台盼蓝染色要比TRV:00植株材料的深。这些结果同样表明在沉默GbCaMBP后，无论是感病品种还是抗病品种的棉花，其对黄萎病菌的抗性都在降低，表明GbCaMBP基因具有抗黄萎病的作用。
5、GbCaMBP超量表达转基因拟南芥对黄萎病菌的抗性影响
利用Gateway技术完成GbCaMBP基因与PK7WG2.0超表达载体的连接。
GbCaMBP基因扩增引物为：
F:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACATGGGATTGTCTCTTTCA
R:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTAGCCCACTGTTGCTATAG
BP反应体系：pDONOR221载体0.5μL，TE8.0 1μL，GbCaMBP基因扩增产物0.5μL，BP酶0.5μL。将混合物放置在25℃的条件下1-2h，接着热激转入DH5α感受态细胞中，并进行鉴定。LR反应体系：PK7WG2.0载体0.5μL，TE8.0 1μL，中间载体质粒0.5μL，BP酶0.5μL。将混合物放置在25℃的条件下4-5h，接着热激转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并进行鉴定，最后热激转入农杆菌GV3101中即可，最后经过农杆菌的介导的花絮浸染法转化到野生型拟南芥中，并用卡那霉素筛选出纯合株系为止。取筛选植株并提RNA，对GbCaMBP的表达量进行分析，选择成功转化并且GbCaMBP的表达量高的再生植株种子继续播种于含卡那霉素的MS培养基中筛选。通过筛选植株分离比检测和GbCaMBP的表达量检测，如图14所示，单拷贝转基因株系OE13-6和OE14-3表达量较高，并作为后续实验材料。
为探究GbCaMBP的超量表达对拟南芥对黄萎病的抗性影响，用孢子液浓度为2×107spores/mL的黄萎病菌V991对野生型拟南芥和GbCaMBP拟南芥超量表达株系OE13-6、OE14-3进行伤根接种处理来鉴定拟南芥对黄萎病菌抗性的变化。在接种黄萎病菌后10d左右开始观察拟南芥植株的发病情况，接种20d后拟南芥出现叶片黄化，萎蔫等黄萎病典型症状，如图15所示，野生型拟南芥植株叶片黄化的较多(如图中白色箭头所指的颜色偏白的叶片)，表明野生型拟南芥植株比GbCaMBP超量表达植株发病更加严重，如图16所示，GbCaMBP超量表达植株的发病率与病情指数均低于野生型植株。结果表明，GbCaMBP超量表达时会增强拟南芥对黄萎病的抗性，同样表明CaMBP基因具有抗黄萎病的作用。
需要说明的是，上述实验例中所涉及的实验操作，部分实验操作具有一定的通用性，因而未加详细描述，未详细描述部分内容参考其它实验例中相关操作或参考现有技术，不再赘述。
序列表
<110> 河南大学
<120> 棉花GbCaMBP基因在植物抗黄萎病中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1626
<212> DNA
<213> 海岛棉(Gossypium barbadense)
<400> 1
atgggattgt ctctttcatt gcttctatca gcctggcaac aaattctaag ccacaggttt 60
ttcaatttag cctgcaacat cagtctccgt tcaaaagata gagaggtgac cttgagggta 120
aatagcttca agggaacaga ttcagaaacc ataatcaatt cagttgggtc agattctaag 180
attcaaagga aaaattcgaa aactttgaga aacggcaaag ctgactatta tcaagtactg 240
cttgaaaaaa ctcactcgtt caaggacctg gttcaagaca aaaggaaatc atcttcgaat 300
ggattaatac ataaaccaat gcccacactt tctctaccgg aaccaacgat tttgttctcg 360
ccgagacccg ttagtgagct tgatgcggct gctgttaagc ttcaaaaagt ctacaagagc 420
taccggactc gaagaaacct tgcagattgt gcagtggtga ttgaggagct atggtggaag 480
gtattagacc tagctgagct caagcaaaac tctgtgtcct tcttcgaggt tgagaaacca 540
gaatctgcag tttcacggtg ggtaagagcc aagaccaaag ctgcaaaggt aggaaaggga 600
ttgttcaagg atgaaaaagc taaaaaacta gcccttcaac actggcttga agctattgat 660
ccacgacatc ggtacggtca taacttacac atgtattatg acgtttggtt ctcaagcgaa 720
agcacacagc ctttcttcta ctggttggac gttggagatg ggaaagaagt aaatcttgag 780
aaatgtccaa ggaaaaaact acaacagcag tgcatcacat atcttggacc aaaagaaagg 840
gaagaatatg aagtaataat tgagaatggg cggcttgctt ataggcaaag tgggtcacct 900
gtggatacca caggtgaatc caaatggata tttgtcctta gcacaagtag agccttgtat 960
gtgggtcaaa agaaaaaggg caaatttcaa cattctagtt ttctagctgg cggtgccacc 1020
acggcagctg gaagattggt tgctcgtgat ggagttctcc aggctatatg gccatacagt 1080
ggtcattatc atccaacggt agaaaatttc atggaattca ttagcttcct cgaggaaaat 1140
aatgtaaatc tcacaaatgt taagaggtgt gccgttgatg atgacaactc atacgggcaa 1200
gctccgactc cagataaaga atccaaaccc aaacccgaat cagataaaat ccggaaagct 1260
gatgagaatg atgaaggtga cagcgtgagg ggggcaaaaa caagcagtga tgatgatcag 1320
aaagatgtaa agattgagac caatggcgca ggtggcaagg aagaagcagc agcgttcagc 1380
atggccaaga gattgtcatg caagtggacg acaggggttg gaccccgtat cgggtgcgtg 1440
cgagactacc ctagcgagct tcaatggaaa gcactggaac aggtaaacct atcaccaagg 1500
gtggctcctg gaatggtgaa gttgggtcca attccttcac cacgacccag tccaagaatc 1560
cacctttccc cacggattgc agctatgggt gtgccaagtc caaggtctat agcaacagtg 1620
ggctaa 1626
<210> 2
<211> 541
<212> PRT
<213> 海岛棉(Gossypium barbadense)
<400> 2
Met Gly Leu Ser Leu Ser Leu Leu Leu Ser Ala Trp Gln Gln Ile Leu
1 5 10 15
Ser His Arg Phe Phe Asn Leu Ala Cys Asn Ile Ser Leu Arg Ser Lys
20 25 30
Asp Arg Glu Val Thr Leu Arg Val Asn Ser Phe Lys Gly Thr Asp Ser
35 40 45
Glu Thr Ile Ile Asn Ser Val Gly Ser Asp Ser Lys Ile Gln Arg Lys
50 55 60
Asn Ser Lys Thr Leu Arg Asn Gly Lys Ala Asp Tyr Tyr Gln Val Leu
65 70 75 80
Leu Glu Lys Thr His Ser Phe Lys Asp Leu Val Gln Asp Lys Arg Lys
85 90 95
Ser Ser Ser Asn Gly Leu Ile His Lys Pro Met Pro Thr Leu Ser Leu
100 105 110
Pro Glu Pro Thr Ile Leu Phe Ser Pro Arg Pro Val Ser Glu Leu Asp
115 120 125
Ala Ala Ala Val Lys Leu Gln Lys Val Tyr Lys Ser Tyr Arg Thr Arg
130 135 140
Arg Asn Leu Ala Asp Cys Ala Val Val Ile Glu Glu Leu Trp Trp Lys
145 150 155 160
Val Leu Asp Leu Ala Glu Leu Lys Gln Asn Ser Val Ser Phe Phe Glu
165 170 175
Val Glu Lys Pro Glu Ser Ala Val Ser Arg Trp Val Arg Ala Lys Thr
180 185 190
Lys Ala Ala Lys Val Gly Lys Gly Leu Phe Lys Asp Glu Lys Ala Lys
195 200 205
Lys Leu Ala Leu Gln His Trp Leu Glu Ala Ile Asp Pro Arg His Arg
210 215 220
Tyr Gly His Asn Leu His Met Tyr Tyr Asp Val Trp Phe Ser Ser Glu
225 230 235 240
Ser Thr Gln Pro Phe Phe Tyr Trp Leu Asp Val Gly Asp Gly Lys Glu
245 250 255
Val Asn Leu Glu Lys Cys Pro Arg Lys Lys Leu Gln Gln Gln Cys Ile
260 265 270
Thr Tyr Leu Gly Pro Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Glu Val Ile Ile Glu
275 280 285
Asn Gly Arg Leu Ala Tyr Arg Gln Ser Gly Ser Pro Val Asp Thr Thr
290 295 300
Gly Glu Ser Lys Trp Ile Phe Val Leu Ser Thr Ser Arg Ala Leu Tyr
305 310 315 320
Val Gly Gln Lys Lys Lys Gly Lys Phe Gln His Ser Ser Phe Leu Ala
325 330 335
Gly Gly Ala Thr Thr Ala Ala Gly Arg Leu Val Ala Arg Asp Gly Val
340 345 350
Leu Gln Ala Ile Trp Pro Tyr Ser Gly His Tyr His Pro Thr Val Glu
355 360 365
Asn Phe Met Glu Phe Ile Ser Phe Leu Glu Glu Asn Asn Val Asn Leu
370 375 380
Thr Asn Val Lys Arg Cys Ala Val Asp Asp Asp Asn Ser Tyr Gly Gln
385 390 395 400
Ala Pro Thr Pro Asp Lys Glu Ser Lys Pro Lys Pro Glu Ser Asp Lys
405 410 415
Ile Arg Lys Ala Asp Glu Asn Asp Glu Gly Asp Ser Val Arg Gly Ala
420 425 430
Lys Thr Ser Ser Asp Asp Asp Gln Lys Asp Val Lys Ile Glu Thr Asn
435 440 445
Gly Ala Gly Gly Lys Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ser Met Ala Lys Arg
450 455 460
Leu Ser Cys Lys Trp Thr Thr Gly Val Gly Pro Arg Ile Gly Cys Val
465 470 475 480
Arg Asp Tyr Pro Ser Glu Leu Gln Trp Lys Ala Leu Glu Gln Val Asn
485 490 495
Leu Ser Pro Arg Val Ala Pro Gly Met Val Lys Leu Gly Pro Ile Pro
500 505 510
Ser Pro Arg Pro Ser Pro Arg Ile His Leu Ser Pro Arg Ile Ala Ala
515 520 525
Met Gly Val Pro Ser Pro Arg Ser Ile Ala Thr Val Gly
530 535 540

Claims (4)

1.棉花GbCaMBP基因在植物抗黄萎病中的应用，所述GbCaMBP基因的核苷酸序列与SEQID NO.1相同或所述GbCaMBP基因编码的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.2相同。
2.如权利要求1所述棉花GbCaMBP基因在植物抗黄萎病中的应用，所述植物为棉花或拟南芥。
3.一种提高植物抗黄萎病能力的方法，其特征在于，所述方法包括将GbCaMBP基因核苷酸序列连入植物表达载体得到重组植物表达载体，所述GbCaMBP基因核苷酸序列与SEQ IDNO.1的序列相同，所述重组植物表达载体通过根癌农杆菌转化法转化入植物中得到转基因植物，所述转基因植物与未进行转基因的植物相比，具有更强的抗黄萎病能力。
4.如权利要求3所述的提高植物抗黄萎病能力的方法，其特征在于，所述植物为棉花或拟南芥。
CN201711135399.4A 2017-11-16 2017-11-16 棉花GbCaMBP基因在植物抗黄萎病中的应用 Active CN107674875B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711135399.4A CN107674875B (zh) 2017-11-16 2017-11-16 棉花GbCaMBP基因在植物抗黄萎病中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711135399.4A CN107674875B (zh) 2017-11-16 2017-11-16 棉花GbCaMBP基因在植物抗黄萎病中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107674875A CN107674875A (zh) 2018-02-09
CN107674875B true CN107674875B (zh) 2021-01-29

Family

ID=61149533

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711135399.4A Active CN107674875B (zh) 2017-11-16 2017-11-16 棉花GbCaMBP基因在植物抗黄萎病中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107674875B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108165558B (zh) * 2018-03-22 2021-01-19 中国农业大学 一种提高棉花抗黄萎病相关蛋白CkSYP71及其编码的基因和应用
CN110387378A (zh) * 2018-04-18 2019-10-29 新疆农业大学 具有抗枯萎病功能的基因及其应用
CN110004156A (zh) * 2019-04-04 2019-07-12 中国农业科学院植物保护研究所 与黄萎病抗性相关的GhCML20基因及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9074005B2 (en) * 2009-01-02 2015-07-07 Washington State University Compositions and methods for modulating plant disease resistance and immunity
CN102925442B (zh) * 2012-10-19 2014-06-04 清华大学 来源于棉花的miRNA-GhmiRnC及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107674875A (zh) 2018-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. Island cotton Gbve1 gene encoding a receptor-like protein confers resistance to both defoliating and non-defoliating isolates of Verticillium dahliae
CN105441460B (zh) 一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY1及应用
ES2373318T3 (es) Modificación del desarrollo y morfología de una planta.
CN107653258B (zh) 棉花GhLecRK1基因在植物抗黄萎病中的应用
CN110747202B (zh) 一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY11及应用
Chen et al. Overexpression of OsPGIP1 enhances rice resistance to sheath blight
CN109797157B (zh) 一种抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92及其引物、编码的蛋白和应用
CN107090464B (zh) 抗虫抗除草剂玉米转化事件及其创制方法和检测方法
Chen et al. A Ve homologous gene from Gossypium barbadense, Gbvdr3, enhances the defense response against Verticillium dahliae
CN107674875B (zh) 棉花GbCaMBP基因在植物抗黄萎病中的应用
CN112225788B (zh) 茄子SmWRKY转录因子及其在提高茄子青枯病抗性方面的应用
CN107459565A (zh) 大豆抗旱相关蛋白在调控大豆抗旱性中的应用
CN106554964B (zh) 棉花GbABR1基因在抗黄萎病中的应用
EA037614B1 (ru) Получение растений маиса с повышенной устойчивостью к северной пятнистости листьев
CN110862996B (zh) 一段分离的大豆基因在提高大豆孢囊线虫抗性中的应用
CN107937417A (zh) 一种来自棉花抗病耐旱蛋白基因GhSNAP33及其应用
CN111454972A (zh) 枳抗寒基因PtrBADH及其在植物抗寒遗传改良中的应用
CN113717265B (zh) 一种提高植物非生物胁迫耐受性的基因PalZAT10-1及其应用
CN102732553B (zh) 提高植物产量的基因工程方法及材料
US8173868B2 (en) Transgenic plants exhibiting increased tolerance to stress and methods of generating same
CN109293758B (zh) 抗黄萎病相关蛋白GbVIP1及其编码基因与应用
CN114790449B (zh) 钙依赖蛋白激酶基因GhCPK4在植物抗黄萎病中的应用
CN106434694B (zh) 棉花GbDREB基因在抗黄萎病中的应用
CN114574492B (zh) 一种来自甘蔗杆状病毒的组成型启动子pscbv-chn1及其应用
CN115838738B (zh) 一种凤丹PoWRKY71基因及其在植物耐旱方面的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant