CN111500627A - 来源于新疆野苹果的miRNA在抗旱中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了来源于新疆野苹果的miRNA在抗旱中的应用。本发明所要保护的一个技术方案是msi‑miR171i在调控植物抗旱性中的应用。本发明通过将编码成熟msi‑miR171i的前体的DNA分子转入拟南芥，来观察转基因拟南芥在土壤干旱实验中对干旱逆境胁迫的耐受性，发现与未转化的拟南芥对照植株相比，过表达msi‑miR171i前体DNA分子的转基因拟南芥植株对干旱逆境胁迫更敏感，说明msi‑miR171i参与调控植物抗旱性。

Description

来源于新疆野苹果的miRNA在抗旱中的应用

技术领域

本发明涉及植物非编码RNA的应用领域，具体涉及一种来源于新疆野苹果的miRNA在植物抗水分胁迫中的应用。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类长度为20-24(nucleotide)nt的内源非编码RNA。植物miRNA通过碱基互补配对识别并降解靶基因mRNA或抑制其翻译过程，负调控靶基因的表达。研究发现，miRNA参与调控植物生长发育、形态建成、逆境响应等过程。

苹果位列世界四大水果之首。截至2017年，我国苹果种植总面积3300万亩、总产量4139万吨，均占世界苹果栽培面积和产量的50％以上，居世界第一(联合国粮食及农业组织(FAO)网站(http://www.fao.org/home/en/)的公布数据)。苹果矮砧集约栽培模式是现代苹果产业发展的方向，在苹果矮砧密植栽培模式的推广过程中，引自国外的矮化砧木普遍存在适应性差、抗逆性弱等问题。干旱胁迫影响果树生长发育，严重时导致树体矮小、早衰，叶片过早脱落，进而造成苹果产量和品质下降。因此，揭示苹果响应干旱胁迫的分子机理，利用现代生物技术挖掘传统乔化砧木资源中的优势抗逆基因，改良、培育出综合抗性强的矮化砧木是目前苹果砧木抗逆育种的主要目标之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的抗旱性。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种miRNA的下述任一种应用：

H1、所述miRNA在调控植物抗旱性中的应用，

H2、所述miRNA在制备降低植物抗旱性的产品中的应用，

H3、所述miRNA在植物育种中的应用；

所述miRNA是如下A1)、A2)或A3)的miRNA：

A1)核苷酸序列为序列表中序列1的单链RNA分子，该miRNA的名称为msi-miR171i；

A2)将序列表中序列1所示的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)衍生的或与A1)所示的RNA分子具有90％以上的同一性且与植物抗逆或抗水分胁迫相关的miRNA；

上述miRNA可人工合成，也可先合成编码其前体的DNA，再进行生物表达得到。

上述miRNA中，同一性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastn作为程序进行检索，并对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述miRNA中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述应用中的所述调控植物抗旱性为提高植物对干旱的敏感性。

上述应用中所述植物为下述任一种：

C1)单子叶植物，

C2)木本植物，

C3)双子叶植物，

C4)蔷薇目植物，

C5)蔷薇科植物，

C6)苹果属植物，

C7)苹果；

E1)山柑目植物，

E2)十字花科植物，

E3)拟南芥属植物，

E4)拟南芥。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述应用中所述miRNA相关的生物材料的下述任一种应用：

Q1、所述生物材料在调控植物抗旱性中的应用，

Q2、所述生物材料在制备降低植物抗旱性的产品中的应用，

Q3、所述生物材料在植物育种中的应用；

上述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码权利要求1中所述miRNA的核酸分子或编码权利要求1中所述miRNA的前体的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)中的任一种：

b1)编码链的核苷酸序列是序列表中序列2的第1-907位核苷酸的DNA分子；

b2)将序列表中序列2所示的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由b1)衍生的或与b1)所示的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述miRNA的前体的DNA分子。

上述生物材料中，B2)所述的含有核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达编码上述应用中所述miRNA前体的DNA分子，该DNA不但可包括启动编码基因表达的启动子，还可包括终止编码基因表达的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的植物表达载体构建含有所述编码基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pWMB123、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。

上述应用中，所述植物为下述任一种：

C1)单子叶植物，

C2)木本植物，

C3)双子叶植物，

C4)蔷薇目植物，

C5)蔷薇科植物，

C6)苹果属植物，

C7)苹果；

E1)山柑目植物，

E2)十字花科植物，

E3)拟南芥属植物，

E4)拟南芥。

上文中，所述降低植物抗旱性的产品可为植物抗逆调控剂。所述植物抗逆调控剂可含有所述miRNA或/和所述生物材料。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育干旱敏感植物的方法。

本发明所提供的培育干旱敏感植物的方法，包括提高目的植物中所述miRNA的含量或/和所述miRNA的前体的含量或/和所述miRNA基因表达量或/和所述miRNA的前体的基因表达量，得到对干旱敏感的植物；所述对干旱敏感的植物对干旱的敏感性高于所述目的植物。

上述方法中，所述提高目的植物中所述miRNA的含量或/和所述miRNA的前体的含量或/和所述miRNA基因表达量或/和所述miRNA的前体的基因的表达水平可通过将所述miRNA前体的编码基因导入所述目的植物实现。

上述方法中，其中所述miRNA前体的编码基因可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：

1)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

2)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

3)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述miRNA前体的编码基因可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for PlantMolecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

上述方法中，所述对逆境胁迫敏感植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上文中，所述所述调控植物抗旱性为提高植物对干旱的敏感性。

上文中，所述目的植物为下述任一种：

C1)单子叶植物，

C2)木本植物，

C3)双子叶植物，

C4)蔷薇目植物，

C5)蔷薇科植物，

C6)苹果属植物，

C7)苹果，

E1)山柑目植物，

E2)十字花科植物，

E3)拟南芥属植物，

E4)拟南芥。

本发明将来自新疆野苹果中的编码成熟msi-miR171i的前体的基因，导入拟南芥中得到msi-miR171i转基因植株；与未转化的拟南芥对照植株相比，过表达msi-miR171i则增加了转基因拟南芥对干旱等水分胁迫的敏感性。说明msi-miR171i参与植物对干旱相关逆境胁迫的调控与适应。

附图说明

图1为20％PEG 6000处理下新疆野苹果msi-miR171i的表达水平变化。

图2为pCAMBIA1302-pri-msi-miR171i重组质粒酶切验证及转基因拟南芥的PCR鉴定。左图中，泳道M为Marker，1号泳道是未经NcoI/BglII双酶切处理的pCAMBIA1302-pri-msi-miR171i重组质粒,2号泳道是经过NcoI/BglII双酶切处理的pCAMBIA1302-pri-msi-miR171i重组质粒，其中pri-msi-miR171i条带大小约为1000bp；右图中，泳道M为Marker，1、2、3、6、9、12分别为6个转基因植株。

图3为过表达msi-miR171i转基因拟南芥株系中msi-miR171i前体及成熟序列表达水平。

图4为土壤中各株系抗旱性鉴定。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、新疆野苹果miR171i在调控植物抗旱性中的应用

来源于新疆野苹果的MicroRNA msi-miR171i的为序列表中序列1。msi-miR171i前体(pri-miR171i)是核苷酸序列为序列表中序列3的单链RNA分子。

msi-miR171i前体的编码基因是编码链的核苷酸序列为序列表中序列2的双链DNA分子。克隆新疆野苹果(Malus Sieversii(ledeb.)Roem.)中的序列表中序列2所示的DNA分子构建过表达载体并转化拟南芥，检测msi-miR171i调控植物抗旱性的功能，具体方法如下：

一、新疆野苹果msi-miR171i受水分胁迫诱导表达的分析

首先，对新疆野苹果组培生根苗采用20％聚乙二醇6000进行模拟水分胁迫处理0h、2h、4h、12h、24h，将处理后的植物根、茎、叶用液氮速冻后保存，每个处理三次重复。其次，使用植物RNA提取试剂盒(艾德莱，RN40)提取各组织总RNA，以引物RT-miR171i“GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGAGTGATATT”为茎环特异反转录引物，得到cDNA，并以上游引物F：GCTGAGCCGAACCAATATCACTC和下游引物R:ATCCAGTGCAGGGTCCGAG组成的引物，进行实时荧光定量PCR实验检测新疆野苹果msi-miR171i在水分胁迫下的表达变化。结果如图1所示，正常条件下(聚乙二醇6000处理0h)，新疆野苹果msi-miR171i主要在根中富集表达，在茎和叶中表达很少；水分胁迫条件下(聚乙二醇6000处理2h后)，根中msi-miR171i的表达显著下降，茎、叶的表达水平虽受水分胁迫诱导表达，但上调倍数较低。

二、转基因拟南芥植株的获得及抗旱性鉴定

1、构建msi-miR171i过表达重组载体

以20％聚乙二醇6000模拟水分胁迫处理2h的新疆野苹果叶片为试材，提取叶片的总RNA，反转录为cDNA，然后以cDNA为模板，利用上游引物(F:CCATGGCATATATACCAACATTAATTTG)和下游引物(R:AGATCTGCTCAATATCCACATTTCC)组成的引物对，进行PCR扩增，得到PCR产物，该PCR产物含有序列表中的序列2所示的msi-miR171i前体的编码基因。

通过酶切连接的方式将得到的PCR产物插入表达载体pCAMBIA1302(BioVector质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心，40729425736)，得到重组载体pCAMBIA1302-pri-msi-miR171i。

经测序确认pCAMBIA1302-pri-msi-miR171i是将pCAMBIA1302的限制性内切酶NcoI的识别位点和限制性内切酶BglII的识别位点之间的片段(小片段)替换为编码链的核苷酸序列是序列2的核苷酸序列所示的双链DNA分子，保持pCAMBIA1302的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。

将携带pCAMBIA1302-pri-msi-miR171i重组质粒的大肠杆菌扩大培养，使用质粒小提试剂盒(天根，DP103-03)提取重组质粒，取5μl质粒，内切酶NcoI/BglII各1μl，酶切缓冲液2μl，加双蒸水补充至20μl体系，37℃孵育3-4h后，使用琼脂糖凝胶分离条带。结果如图2中左图所示，泳道M为Marker，1号泳道是未经双酶切处理的pCAMBIA1302-pri-msi-miR171i重组质粒，为单一条带；而2号泳道是内切酶NcoI/BglII处理后的pCAMBIA1302-pri-msi-miR171i重组质粒,含有目的条带即msi-miR171i前体的编码基因。

2、重组菌的获得

将上述重组质粒pCAMBIA1302-pri-msi-miR171i导入根癌农杆菌EHA105中，PCR鉴定得到阳性重组菌(导入pCAMBIA1302-pri-msi-miR171i的重组菌)，进行拟南芥遗传转化。

3、拟南芥遗传转化

采用蘸花法将过表达msi-miR171i的重组菌转化Col-0生态型拟南芥(拟南芥种子为本实验室保存)(以下也称为野生型拟南芥)。具体方法如下：

1)农杆菌侵染液的准备

将步骤2的阳性重组菌加入含有利福平(50ng/L)和卡那霉素(50ng/L)的LB液体培养基，28℃，200rpm，过夜培养。期间检测菌液浓度，在OD₆₀₀值达到1.2-1.5时，5000rpm，离心10min，收集菌体，重悬于拟南芥侵染缓冲液，调整OD₆₀₀至0.6左右，得到1L菌体重悬液(该菌体悬液包含：5g/100mL蔗糖，0.02％(体积比)silwet L-77，10mM MES，100μM乙酰丁香酮，菌体，余量为水，pH＝5.6)，备用。

2)拟南芥转化苗的准备

取野生型拟南芥种子，在EP管中用体积百分比为70％的乙醇水溶液消毒2-3min，10％次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗5-6次，平铺在1/2MS培养基上，4℃黑暗条件下春化4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、21℃、RH为60％条件下培养。一周后，选择生长健壮的幼苗移栽到培养土中。每周浇一次1/2MS培养液。当拟南芥幼苗抽苔出现花苞(尚未开花)时准备转化。转化前将已经开花授粉的花和种子去除干净。

3)拟南芥侵染过程

将准备好的用于转化的拟南芥幼苗花苞倒置于装有菌体悬液的合适大小的容器上侵染(即浸泡)1min，然后取出花苞用吸水纸尽量吸尽侵染液后置于黑暗中在21℃温度中继续培养。黑暗中培养24小时后将被侵染的拟南芥植株转移到光周期16h(白昼)/8h(黑夜)，温度21℃和湿度60％的环境中生长直到收获T₀代种子。

4)过表达msi-miR171i拟南芥阳性植株的筛选及获得

由于pCAMBIA1302-pri-msi-miR171i重组载体上带有潮霉素抗性基因，阳性拟南芥植株会在含有25mg/L潮霉素的1/2MS培养基上存活下来。基于此，将收获的拟南芥T₀代种子干燥后于4℃春化4天后均匀播种于含有25mg/L潮霉素的1/2MS培养基上，置于光周期16h(白昼)/8h(黑夜)，温度21℃和湿度60％的环境中萌发。两周后存活下来的幼苗为过表达msi-miR171i的T₁代阳性植株，单株移栽并收获T₁代植株所结的种子。用同样的方法继续筛选，取来源于同一T₁代植株且存活死亡比为3(活)：1(死)的株系继续培养并收获T₂代种子，继续筛选以获得T₃代纯合转基因株系。

5)过表达msi-miR171i拟南芥阳性植株的鉴定

对拟南芥T₃代纯合转基因株系先提取其基因组DNA，分别以上游引物F:CCATGGCATATATACCAACATTAATTTG和下游引物R:AGATCTGCTCAATATCCACATTTCC为引物，进行PCR扩增检测是否得到转入msi-miR171i的植株，结果得到5个PCR阳性植株(即PCR产物有约1000bp片段的转msi-miR171i植株，以下简称转msi-miR171i阳性植株)(图2中右图编号为1、2、6、9和12)。然后取这5个PCR阳性植株中编号分别为OE-2、OE-6和OE-12的3个PCR阳性植株，分别提取根和叶片的总RNA，反转录为cDNA，利用组成性表达的AtActin2(NM_180280)基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后以cDNA为模板，分别以pri-miR171-F和pri-miR171-R、msi-miR171i-F和R-Primer两对引物进行实时荧光定量检测pri-miR171i、msi-miR171i表达水平。

表1、引物序列

以野生型拟南芥的pri-miR171i和msi-miR171i基因表达水平为1，结果如图3所示，与野生型植株相比，转基因株系OE-2、OE-6、OE-12中pri-miR171i、msi-miR171i基因的表达量均显著增加，其中叶片的表达水平更明显。说明OE-2、OE-6、OE-12这三个植株为msi-miR171i的过表达植株。

4、转基因植株的抗旱性验证

土壤干旱处理实验：将转基因拟南芥株系选择T₃代纯合株系(OE-2、OE-6、OE-12)进行土壤干旱检测植株抗旱性。实验重复三次，每次实验处理条件相同。每次重复的具体方法是将在1/2MS固体培养基(1/2MS+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂粉)上生长(温度24℃，相对湿度45％，昼夜周期为16h光/8h暗)，10d的野生型拟南芥(WT)和转基因株系(OE-2、OE-6、OE-12)每个株系均80株，移栽至同一花盆内，适应生长两周后进行自然干旱(温度24℃，相对湿度45％，昼夜周期为16h光/8h暗)，干旱处理之前浇透水。自然干旱三周(温度24℃，相对湿度45％，昼夜周期为16h光/8h暗)至植株因缺水出现死亡表型后，进行观察记录统计植株死亡率。

土壤干旱处理实验结果如图4所示，从图片上看，正常生长条件下(适应两周)的野生型拟南芥WT和过表达msi-miR171i的拟南芥植株OE-2、OE-6、OE-12相比，不存在显著差异；干旱处理后(干旱三周)，过表达株系OE-2、OE-6、OE-12的死亡率明显高于野生型WT。从数据统计结果来看，自然干旱三周，野生型拟南芥WT和过表达msi-miR171i的拟南芥植株OE-2、OE-6、OE-12的死亡率分别为8.33±3.61％、83.33±3.61％、85.42±9.55％和87.50±6.25％，OE-2、OE-6、OE-12的死亡率显著高于WT，分别高出75.00％、77.02％和79.17％，表明转基因过表达株系对干旱胁迫更敏感。

上述实验结果说明过表达msi-miR171i的转基因株系在土壤干旱处理过程中，相比较于野生型对干旱导致的水分胁迫不耐受，表现出较高的死亡率，msi-miR171i的功能与植物抗逆境胁迫有关，过表达msi-miR171i可以提高拟南芥植株对干旱等水分胁迫的敏感性。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 来源于新疆野苹果的miRNA在抗旱中应用

<130> GNCSQ201368

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 新疆野苹果(Malus Sieversii (ledeb.) Roem.）

<400> 1

ugagccgaac caauaucacu c 21

<210> 2

<211> 907

<212> DNA

<213> 新疆野苹果(Malus Sieversii (ledeb.) Roem.）

<400> 2

ccatggcata tataccaaca ttaatttgag tgaaatatta taattaatgc cacgtgtctg 60

tgactctgtg tttcgtatac ttactccacc acaatgacgt ccaagtcgaa cgacattgat 120

gccctggcat gcaatattgg tgatcttgat taatcacgtg cctccattat gttatgctac 180

tgctgatggg gttttattaa ttaaaaaagt tgatgagaga ggggatgaaa gggattatag 240

tgttagtggg attcctaaag atatgtttat gaaaaatgtt ccttccttat cctactgtgt 300

gctcccttac aggaaccatc tgtagattac ctaactaatc aagacgactg gcaagctaag 360

ctaagctcct acttgctctt ataaatagag gtggaagctc caattcagta tatcaaaaga 420

gcttaagcgt gtacgagtac gagccttaat acttgtttct gcaaaagcaa acatggtgtg 480

atattggttt tggctcatat ctctgataat tagcttatct tcgatcataa atcgtcatga 540

tgcacaacaa agactagtac tacgtactct ttgagatgag ccgaaccaat atcactcttg 600

tatgcttctt tgcatatata tatttgccta cctagcgtgg tcgtttgagt ttattaagca 660

agggccgcac catcactgag gttcgatgac tagggcttca tactctctct ctctctctct 720

ctctctctct ctcactctct ctctctctct ctacacacac acacacacac atatatctct 780

atctatctaa ttttccagta ctttagcaat atttcttttc gtttcagttt ttttattctc 840

taattatata tgttatctac gtacttacac gtctggtttt ctggaaatgt ggatattgag 900

cagatct 907

<210> 3

<211> 907

<212> RNA

<213> 新疆野苹果(Malus Sieversii (ledeb.) Roem.）

<400> 3

ccauggcaua uauaccaaca uuaauuugag ugaaauauua uaauuaaugc cacgugucug 60

ugacucugug uuucguauac uuacuccacc acaaugacgu ccaagucgaa cgacauugau 120

gcccuggcau gcaauauugg ugaucuugau uaaucacgug ccuccauuau guuaugcuac 180

ugcugauggg guuuuauuaa uuaaaaaagu ugaugagaga ggggaugaaa gggauuauag 240

uguuaguggg auuccuaaag auauguuuau gaaaaauguu ccuuccuuau ccuacugugu 300

gcucccuuac aggaaccauc uguagauuac cuaacuaauc aagacgacug gcaagcuaag 360

cuaagcuccu acuugcucuu auaaauagag guggaagcuc caauucagua uaucaaaaga 420

gcuuaagcgu guacgaguac gagccuuaau acuuguuucu gcaaaagcaa acauggugug 480

auauugguuu uggcucauau cucugauaau uagcuuaucu ucgaucauaa aucgucauga 540

ugcacaacaa agacuaguac uacguacucu uugagaugag ccgaaccaau aucacucuug 600

uaugcuucuu ugcauauaua uauuugccua ccuagcgugg ucguuugagu uuauuaagca 660

agggccgcac caucacugag guucgaugac uagggcuuca uacucucucu cucucucucu 720

cucucucucu cucacucucu cucucucucu cuacacacac acacacacac auauaucucu 780

aucuaucuaa uuuuccagua cuuuagcaau auuucuuuuc guuucaguuu uuuuauucuc 840

uaauuauaua uguuaucuac guacuuacac gucugguuuu cuggaaaugu ggauauugag 900

cagaucu 907

Claims (10)

1.miRNA的下述任一种应用：

H1、所述miRNA在调控植物抗旱性中的应用，

H2、所述miRNA在制备降低植物抗旱性的产品中的应用，

H3、所述miRNA在植物育种中的应用；

所述miRNA是如下A1)、A2)或A3)的miRNA：

A1)核苷酸序列为序列表中序列1的单链RNA分子，该miRNA的名称为msi-miR171i，

A2)将序列表中序列1所示的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)衍生的或与A1)所示的RNA分子具有90％以上的同一性且与植物抗逆或抗水分胁迫相关的miRNA。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控植物抗旱性为提高植物对干旱的敏感性。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述植物为下述任一种：

C1)单子叶植物，

C2)木本植物，

C3)双子叶植物，

C4)蔷薇目植物，

C5)蔷薇科植物，

C6)苹果属植物，

C7)苹果；

E1)山柑目植物，

E2)十字花科植物，

E3)拟南芥属植物，

E4)拟南芥。

4.与权利要求1中所述miRNA相关的生物材料下述任一种应用：

Q1、所述生物材料在调控植物抗旱性中的应用，

Q2、所述生物材料在制备降低植物抗旱性的产品中的应用，

Q3、所述生物材料在植物育种中的应用；

其中，所述生物材料为B1)-B7)中的任一种：

B1)编码权利要求1中所述miRNA的核酸分子或编码权利要求1中所述miRNA的前体的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述miRNA的前体的核苷酸序列为序列表中序列3的单链RNA分子。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下任一种：

b1)编码链的核苷酸序列是序列表中序列2的第1-907位核苷酸的DNA分子；

b2)将序列表中序列2所示的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由b1)衍生的或与b1)所示的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述miRNA的前体的DNA分子。

7.根据权利要求4-6中任一所述的应用，其特征在于：

所述植物为下述任一种：

C1)单子叶植物，

C2)木本植物，

C3)双子叶植物，

C4)蔷薇目植物，

C5)蔷薇科植物，

C6)苹果属植物，

C7)苹果；

E1)山柑目植物，

E2)十字花科植物，

E3)拟南芥属植物，

E4)拟南芥。

8.一种培育干旱敏感植物的方法，包括提高目的植物中权利要求1所述miRNA基因表达量或/和所述miRNA的前体的基因表达量或/和所述miRNA的含量或/和所述miRNA的前体的含量，得到干旱敏感的植物；所述干旱敏感植物对干旱的敏感性高于所述目的植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述提高目的植物中权利要求1所述miRNA的含量或/和所述miRNA的前体的含量或/和所述miRNA基因表达量或/和所述miRNA的前体的基因表达量是通过将权利要求4-6中任一所述的应用中所述的核酸分子导入所述目的植物实现的。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：

所述植物为下述任一种：

C1)单子叶植物，

C2)木本植物，

C3)双子叶植物，

C4)蔷薇目植物，

C5)蔷薇科植物，

C6)苹果属植物，

C7)苹果；

E1)山柑目植物，

E2)十字花科植物，

E3)拟南芥属植物，

E4)拟南芥。

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