CN106987592B

CN106987592B - 一种抑制梨种子赤霉素合成基因表达的方法

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Publication number: CN106987592B
Application number: CN201710224701.7A
Authority: CN
Inventors: 王春雷; 孙娅; 刘正阳; 张盼盼; 黄旭
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2017-04-07
Filing date: 2017-04-07
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2037-04-07
Also published as: CN106987592A

Abstract

本发明公开了一种抑制种子赤霉素合成基因表达的方法。涉及互补链的设计、脱脂棉包裹的种子的培养，属于发育生物学及细胞生物学领域。使用互补链抑制梨种子赤霉素合成基因表达的方法，可以更好了解到缺少赤霉素对种子萌芽率的影响，更好的研究赤霉素对解除种子休眠的作用。方法较简便，易于操作和实际应用。可以广泛用于不同植物种子其他基因表达的抑制。

Description

一种抑制梨种子赤霉素合成基因表达的方法

技术领域

本发明涉及一种抑制种子赤霉素合成基因表达的方法，涉及互补链的设计、脱脂棉包裹的种子的培养，属于发育生物学及细胞生物学领域。

背景技术

赤霉素(GA)能促进种子的萌发。GA20-氧化酶是重要的GA生物合成调控酶和限速酶。GA20-氧化酶属于可溶性的双加氧酶，它能够催化从GA12到GA9及GA53到GA20过程中的3步氧化反应，为多基因调控，是赤霉素合成关键酶中研究最多的一种酶。

目前利用一些技术调控相关基因的特异表达已经成为国际研究趋势。在信号传递、基因敲除、mRNA转录、蛋白翻译这四个阶段中进行调控基因的表达。然而这些技术要求繁复、耗时耗力，取得的效果也不尽如人意。在激活目的基因的抑制基因时，靶向性不准确；在加入抑制目的基因的蛋白时，蛋白易分解且效果差。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制种子赤霉素合成基因表达的方法，为进一步研究相关基因在种子中表达调控拓展思路。利用互补链抑制是这一方法的创新点。

为了更好掌握种子萌发过程中GA的调控作用，本发明利用互补链干扰GA20-氧化酶的合成，从而抑制GA的合成，并结合脱脂棉包裹种子以减少互补链的使用量。在这一方法中，我们可以观察到经由互补链处理的梨种子其萌发率低于未经处理的梨种子。这种抑制梨种子赤霉素合成基因表达的方法，对于研究种子其他基因的表达具有重要的意义。

实现上述发明目的技术方案是：

一种抑制种子赤霉素合成基因表达的方法。以梨种子为例，一种抑制梨种子赤霉素合成基因GA20-氧化酶表达的GA20ODNs，为GA20-ODN1、GA20-ODN2、GA20-ODN3、GA20-ODN4，其序列为：

GA20-ODN1：5′-GTGGGGAGGGAGGTTGTG-3′；

GA20-ODN2：5′-GTCATCCTCTTTGTGCTG-3′；

GA20-ODN3：5′-TCTGACACGGTGGGTAGT-3′；

GA20-ODN4：5′-GGCGGAGTAGCTGAACGA-3′；

根据实验，优选的，抑制梨种子赤霉素合成基因GA20-氧化酶表达的GA20ODNs为GA20-ODN3。

具体过程如下：

1)互补链GA20-ODN3的设计：

根据目的基因的序列，设计荧光定量PCR引物；并根据其二级结构、碱基互补配对原则设计18nt的GA20ODN3，GA20-ODN3序列：5′-TCTGACACGGTGGGTAGT-3′，所述目的基因为GA20-氧化酶基因序列；

2)种子准备：

用水选法挑选颗粒饱满的种子，然后放在滤纸上自然干燥，对种子消毒，消毒后的种子用水清洗，防止细菌侵染；

用水选法挑选颗粒饱满的种子，然后放在滤纸上自然干燥，用1％NaClO对种子消毒5分钟，消毒后的种子用水清洗1-3次，防止细菌侵染；

3)浸泡种子：

将消毒后的种子等量分为两批，分别放入盛有水的烧杯以及含有350μM GA20-ODN3的水溶液烧杯中浸泡24h，让种子吸足水分

4)包裹种子和浸湿：

用脱脂棉包裹在种皮表面，尽量包得薄一些，过厚种子容易发霉，然后分别均匀分散放入两个培养皿；对照组培养皿用移液枪吸水湿润脱脂棉，实验组用移液枪吸取含有350μM GA20-ODN3的水溶液湿润脱脂棉；脱脂棉湿润后用移液枪吸除脱脂棉周围水分，去除培养皿内积水，以防种子发霉；

5)层积：

将两个培养皿放入盒子内或者包裹上锡箔纸，再放入4℃冰箱内，隔3-4日浸湿脱脂棉，对照组培养皿每次用移液枪吸水湿润脱脂棉，实验组每次用移液枪吸取含有350μMGA20-ODN3的水溶液湿润脱脂棉。不同梨品种种子休眠程度不一样，以种子露白为信号结束层积；

6)萌芽测试：

将层积好的种子去除脱脂棉并洗净，分别放入垫有两层滤纸的培养皿内；对照组的滤纸用清水浸湿，实验组的滤纸用350μM GA20-ODN3的水溶液浸湿；将两个培养皿用锡箔纸包裹放入25℃恒温培养箱内，在黑暗的条件下进行萌芽测试；保持滤纸持续湿润(2-3日更换一次滤纸)并且每天统计一次发芽率，最后比较两组的发芽率；

7)RT-PCR检测：

取等量的对照组和实验组的发芽种子分别提取cDNA，再分别以转录的cDNA为模板，进行荧光定量PCR测定其GA20-氧化酶基因表达量。

进一步地，用1％NaClO对种子消毒5分钟，消毒后的种子用水清洗1-3次。

进一步地，所述互补核苷酸链是在所述目的基因发卡环、内部环、膨胀环和多分枝环等可能的结合位点上，设计出互补核苷酸链，并进行硫代硫酸酯修饰合成。

进一步地，RT-PCR检测中根据GenBank提供的梨属GA20-氧化酶(登录号：HQ833589)的基因序列设计：

GA20正向引物：5′-ATGGAACTTCTGGGACTG-3′；GA20反向引物：5′-GCGGCTTCACGACTTTAT-3′。

更进一步地，反应体系为：正向、反向引物(10μM)各0.5μL；模板0.5μL；SsoFastEvaGreen supermix 5μL；无酶水3.5μL。

本发明的有益效果：

1)使用互补链抑制梨种子赤霉素合成基因表达的方法，可以更好了解到缺少赤霉素对种子萌芽率的影响，更好的研究赤霉素对解除种子休眠的作用；

2)抑制种子赤霉素合成基因表达的方法还有RNAi技术和化学药剂处理，而使用互补链不但可以抑制种子赤霉素合成基因表达而且能收到更好的成效；

3)本发明具有坚实的理论基础，利用种子的吸胀作用使GA20ODN进入种子，通过碱基互补原则结合与GA20-氧化酶的mRNA上，封闭GA20-氧化酶的表达，从而抑制其赤霉素合成基因表达。方法较简便，易于操作和实际应用。可以广泛用于不同植物种子其他基因表达的抑制。

附图说明

图1是本发明所述方法的流程图。

图2是本发明种子萌芽测试图。从图中可以看出，GA20-ODN3处理的实验组萌芽受到了显著抑制。

图3是本发明GA20氧化酶相对表达量柱状图。

具体实施方式

以下实施例，仅为通过举例来更好理解本发明，不是对本发明保护范围的限制。

实施例1

本实例以梨种子为实验材料，过程如下(图1)：

1、互补链GA20-ODN3的设计：

根据GenBank提供的梨属GA20-氧化酶(登录号：HQ833589)的基因序列，将GA20-氧化酶mRNA全序列输入RNAdraw软件的新序列编辑窗口，选择计算结构，根据需要进行相关参数设置，程序按自由能最低原理产生出模拟的二级结构。创新性根据靶mRNA的一级结构与模拟的二级结构，挑选出发卡环、内部环、膨胀环和多分枝环等，根据碱基互补配对原则设计18nt的GA20ODN3。GA20-ODN3序列：5′-TCTGACACGGTGGGTAGT-3′，以硫代磷酸酯修饰合成；

2、种子准备用水选法挑选颗粒饱满。把种子放入盛有水的烧杯中，收集沉淀的种子，然后放在滤纸上自然干燥。用1％NaClO对种子消毒5分钟，消毒后的种子用水清洗1-3次，防止细菌侵染；

3、浸泡种子将消毒后的种子等量分为两批，分别放入盛有水的烧杯以及含有350μM GA20-ODN3的水溶液烧杯中浸泡24h，让种子吸足水分；

4、包裹种子和浸湿用脱脂棉包裹在种皮表面，尽量包得薄一些，过厚种子容易发霉，然后分别均匀分散放入两个培养皿。对照组培养皿用移液枪吸水湿润脱脂棉，实验组用移液枪吸取含有350μM GA20-ODN3的水溶液湿润脱脂棉。脱脂棉湿润后用移液枪吸除脱脂棉周围水分，去除培养皿内积水，以防种子发霉；

5、层积将两个培养皿放入盒子内或者包裹上锡箔纸，再放入4℃冰箱内，隔3-4日浸湿脱脂棉，对照组培养皿每次用移液枪吸水湿润脱脂棉，实验组每次用移液枪吸取含有350μM GA20-ODN3的水溶液湿润脱脂棉。不同梨品种种子休眠程度不一样，以种子露白为信号结束层积，大约需要40-50日不等；

6、萌芽测试将层积好的种子去除脱脂棉并洗净，分别放入垫有两层滤纸的培养皿内。对照组的滤纸用清水浸湿，实验组的滤纸用350μM GA20-ODN3的水溶液浸湿。将两个培养皿用锡箔纸包裹放入25℃恒温培养箱内，在黑暗的条件下进行萌芽测试。保持滤纸持续湿润(2-3日更换一次滤纸)并且每天统计一次发芽率。最后比较两组的发芽率(图2)；

7、RT-PCR检测取等量的对照组和实验组的发芽种子分别提取cDNA，再分别以转录的cDNA为模板，进行荧光定量pcr。根据GenBank提供的梨属GA20-氧化酶(登录号：HQ833589)的基因序列设计：

GA20正向引物：5′-ATGGAACTTCTGGGACTG-3′；GA20反向引物：5′-GCGGCTTCACGACTTTAT-3′

反应体系为：正向、反向引物(10μM)各0.5μL；模板0.5μL；SsoFast EvaGreensupermix(荧光定量PCR测定的试剂盒名字)5μL；无酶水3.5μL。以此得到GA20氧化酶相对表达量，经由GA20-ODN3处理后的种子中GA20氧化酶的相对表达量降低(图3，ck是未作处理的空白试验)。

实施例2、例3、例4，方法同例1。

设计的互补链GA20-ODN1、GA20-ODN2、GA20-ODN4经实验证明，抑制GA20氧化酶的合成效果并不显著，过程这里不再赘述。

Claims

1.一种抑制梨种子赤霉素合成基因GA20-氧化酶表达的GA20 ODNs，其特征在于：所述GA20 ODNs为GA20-ODN3，其序列为：

GA20-ODN3：5′-TCTGACACGGTGGGTAGT-3′。

2.一种抑制梨种子赤霉素合成基因表达的方法，其特征在于，具体过程如下：

1)互补链GA20-ODN3的设计：

根据目的基因的序列，设计荧光定量PCR引物；并根据其二级结构、碱基互补配对原则设计18nt的GA20 ODN3，GA20-ODN3序列：

5′-TCTGACACGGTGGGTAGT-3′，所述目的基因为GA20-氧化酶基因序列；

2)种子准备：

3)浸泡种子：

将消毒后的种子等量分为两批，分别放入盛有水的烧杯以及含有350μM GA20-ODN3的水溶液烧杯中浸泡24h，让种子吸足水分；

4)包裹种子和浸湿：

用脱脂棉包裹在种皮表面，尽量包得薄一些，过厚种子容易发霉，然后分别均匀分散放入两个培养皿；对照组培养皿用移液枪吸水湿润脱脂棉，实验组用移液枪吸取含有350μMGA20-ODN3的水溶液湿润脱脂棉；脱脂棉湿润后用移液枪吸除脱脂棉周围水分，去除培养皿内积水，以防种子发霉；

5)层积：

将两个培养皿放入盒子内或者包裹上锡箔纸，再放入4℃冰箱内，隔3-4日浸湿脱脂棉，对照组培养皿每次用移液枪吸水湿润脱脂棉，实验组每次用移液枪吸取含有350μM GA20-ODN3的水溶液湿润脱脂棉，不同梨品种种子休眠程度不一样，以种子露白为信号结束层积；

6)萌芽测试：

将层积好的种子去除脱脂棉并洗净，分别放入垫有两层滤纸的培养皿内；对照组的滤纸用清水浸湿，实验组的滤纸用350μMGA20-ODN3的水溶液浸湿；将两个培养皿用锡箔纸包裹放入25℃恒温培养箱内，在黑暗的条件下进行萌芽测试；保持滤纸持续湿润，2-3日更换一次滤纸，并且每天统计一次发芽率，最后比较两组的发芽率；

7)RT-PCR检测：

3.根据权利要求2所述基因表达的方法，其特征在于，用1％NaClO对种子消毒5分钟，消毒后的种子用水清洗1-3次。

4.根据权利要求2所述基因表达的方法，其特征在于，所述互补链GA20-ODN3进一步进行硫代硫酸酯修饰合成。

5.根据权利要求2所述基因表达的方法，其特征在于，RT-PCR检测中根据GenBank提供的梨属GA20-氧化酶的基因序列设计：

GA20正向引物：5′-ATGGAACTTCTGGGACTG-3′；GA20反向引物：5′-GCGGCTTCACGACTTTAT-3′，

其中，GA20-氧化酶的登录号：HQ833589。

6.根据权利要求5所述基因表达的方法，其特征在于，反应体系为：10μM的正向、反向引物各0.5μL；模板0.5μL；SsoFast EvaGreen supermix 5μL；无酶水3.5μL。